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KR20110025863A - Hsp27을 표적화하는 rna 길항제 - Google Patents

Hsp27을 표적화하는 rna 길항제 Download PDF

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Publication number
KR20110025863A
KR20110025863A KR1020117002343A KR20117002343A KR20110025863A KR 20110025863 A KR20110025863 A KR 20110025863A KR 1020117002343 A KR1020117002343 A KR 1020117002343A KR 20117002343 A KR20117002343 A KR 20117002343A KR 20110025863 A KR20110025863 A KR 20110025863A
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KR
South Korea
Prior art keywords
oligomer
sequence
monomers
seq
hsp27
Prior art date
Application number
KR1020117002343A
Other languages
English (en)
Inventor
제스퍼 웜
Original Assignee
산타리스 팔마 에이/에스
엔즌 파마슈티칼스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 산타리스 팔마 에이/에스, 엔즌 파마슈티칼스, 인코포레이티드 filed Critical 산타리스 팔마 에이/에스
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Abstract

본 발명은 Hsp27 mRNA를 표적으로 하고, Hsp27의 발현을 감소시키는, 올리고머성 화합물(올리고머)에 관한 것이다. Hsp27 발현의 감소는 암과 같은, 특정 질병의 치료에 유용하다. 본 발명은 올리고머를 포함하는 치료적 조성물 및 치료 방법을 포함하는, 상기 올리고머를 이용한 Hsp27의 발현을 조절하는 방법을 제공한다.

Description

HSP27을 표적화하는 RNA 길항제{RNA ANTAGONISTS TARGETING HSP27}
본 발명은 Hsp27의 발현 조절용 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 세포에서 Hsp27 mRNA를 표적화하여 Hsp27의 감소된 발현을 유도하는 올리고머성 화합물(올리고머)과 관련된 것이다. Hsp27 발현의 감소는 암과 같은, 다양한 질병에 유용하다.
관련 사례
본 출원은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합되는 2008년 7월 2일 제출된 미국 가출원 번호 61/077,588의 35 U.S.C. §119(e)에 따라 우선권을 주장한다. 또한, 본 출원은 2008년 7월 2일 제출된 EP 08104612의 우선권을 주장한다.
Hsp27은 특별히 병증을 제외한 여러 포유류 세포에서 본질적으로 발현된다. 게다가, 이런 단백질은 항-세포사멸적 특성을 공유하고 암세포에서 과발현될 때 종양형성적이다. Hsp27 발현은 백혈병, 유방암, 위암, 간암 및 전립선암, 및 골육종과 같은 사실상 모든 암 형성에서 나쁜 예후와 관련된다. 증가된 Hsp27 발현은 일부 항암 치료에 대한 반응을 예측할 수 있다. 예를 들면, Hsp27의 발현은 유방암에서 화학요법에 대한 내성과 관련되었음을 보여주며, 백혈병 환자에서 화학요법에 대한 나쁜 반응을 예측한다.
또한, 암 조절 외에, Hsp27 단백질의 발현은 근병증(myopathies) 및 천식의 치료를 위해 중요성이 있는 것이 고려되고 있다.
온코제넥스(OncoGenex)는 OGX-427 안티센스 화합물로 나타내어지는 Hsp27 mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 개발하고 있다. WO2007/025229 및 US 7,101,991는 Hsp27를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 기재한다.
Hsp27를 표적화하는 안티센스 올리고머를 개발할 필요성이 있다.
발명의 개요
본 발명은 10 - 30 모노머(monomers)와 같은, 10 - 50 모노머로 구성된 올리고머로서, 이는 10 - 30 모노머와 같은, 10 - 50 모노머의 연속된 서열(첫번째 부위)를 포함하며, 여기서 상기 연속된 서열(첫번째 부위)은 서열번호: 137로 기재된 서열을 갖는 핵산, 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체와 같은, 포유류 Hsp27 유전자 또는 mRNA, 또는 포유류 Hsp27 유전자 또는 포유류 Hsp27을 암호화하는 핵산의 표적 부위의 역상보에 상응하는 부위에 적어도 80%(예를 들면, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%) 동일한(상동적인), 올리고머를 제공한다. 따라서, 예를 들면, 상기 올리고머는 서열번호: 137로 기재된 서열을 갖는 단일가닥 핵산 분자의 부위에 혼성화한다.
본 발명은 10 - 30 모노머와 같은, 10 - 50 모노머로 구성된 올리고머로서, 이는 10 - 30 모노머와 같은, 10 - 50 모노머의 연속된 서열(첫번째 부위)를 포함하며, 여기서 상기 연속된 서열(첫번째 부위)은 서열번호: 137로 기재된 서열을 갖는 핵산, 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체와 같은, 포유류 Hsp27 유전자 또는 mRNA, 또는 포유류 Hsp27 유전자 또는 포유류 Hsp27을 암호화하는 핵산의 표적 부위의 역상보에 상응하는 부위에 적어도 80%(예를 들면, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%) 동일(상동적)이며; 그리고 여기서 첫번째 부위에서 적어도 하나의 모노머는 뉴클레오시드 유사체이고, 여기서 상기 뉴클레오시드 유사체는 잠금핵산(Locked Nucleic Acid; LNA) 모노머인, 올리고머를 제공한다. 따라서, 예를 들면, 상기 올리고머는 서열번호: 137로 기재된 서열을 갖는 단일가닥 핵산 분자의 부위에 혼성화한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머를 포함하고, 상기 올리고머에 공유적으로 접합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분이 부착된, 결합체(conjugate)를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체를, 암 또는 다른 과증식 질환과 같은, 과증식 질환과 같은, 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애의 치료를 위한 것과 같은, 약제로서의 용도를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체를, 암과 같은, 과증식 질환과 같은, 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명은 예를 들면 유효한 양의 본 발명에 따른 올리고머, 결합체 또는 약학적 조성물을 질환 또는 장애로부터 고통받거나 질환 또는 장애가 의심되는 동물 (질환 또는 장애로부터 고통받거나 질환 또는 장애가 의심되는 환자와 같은)에게 투여하는 것을 포함하는, 암과 같은, 과증식 질환과 같은, 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애의 치료방법을 제공한다.
한가지 실시예에서, 질환 또는 장애 또는 증상은 Hsp27 유전자 또는 mRNA의 발현과 관련된 것이다.
본 발명은 Hsp27을 발현하는 세포에서 Hsp27 발현의 억제하기 위해 (예를 들면, Hsp27 발현에 억제 효과를 야기하기 위해) 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 Hsp27을 발현하는 세포에서 Hsp27을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 10 - 50 연속적인 모노머의 첫번째 부위를 포함하는 10 - 50 모노머의 올리고머로서, 여기서 상기 첫번째 부위의 서열은 포유류 Hsp27 유전자 또는 포유류 Hsp27을 암호화하는 핵산의 표적 부위의 역상보에 상응하는 부위에 적어도 80% 동일한, 올리고머를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 올리고머를 포함하고, 본 발명의 올리고머에 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분 ("접합된 부분")이 공유적으로 부착된, 결합체(conjugate)를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 올리고머 또는 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제로 사용을 위한, 본 발명에 따른 올리고머를 제공한다.
또한, 본 발명은 암, 근병증 및 천식으로 구성된 군으로부터 선택된 질환과 같은, 본 명세서에 기재된 하나 또는 그 이상의 질환의 치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명의 올리고머의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 암, 근병증 및 천식으로 구성된 군으로부터 선택된 질환과 같은, 본 명세서에 기재된 하나 또는 그 이상의 질환의 치료를 위해 사용하기 위한, 본 발명에 따른 올리고머를 제공한다.
본 발명의 올리고머를 포함하는 약학적 및 다른 조성물이 제공된다. 또한, 유효한 양의 본 발명의 올리고머, 결합체 또는 조성물을 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 세포 또는 조직과 접촉시키는 것을 포함하는 상기 세포 또는 조직에서 Hsp27의 발현을 감소(down-regulating)시키는 방법이 제공된다.
또한, 치료적 또는 예방적으로 유효한 양의 본 발명의 올리고머, 결합체 또는 약학적 조성물을 Hsp27의 발현, 또는 과발현과 관련된 질환 또는 증상을 갖는 것으로 의심되거나, 또는 의심될 수 있는 동물 (비-인간 동물 또는 인간)에 투여함에 의해, 상기 비-인간 동물 또는 인간의 치료하는 방법이 기재되어 있다.
본 발명은 유효한 양의 하나 또는 그 이상의 올리고머, 결합체 또는 약학적 조성물을 이것이 필요한 동물 (이것이 필요한 환자와 같은)에게 투여하는 것을 포함하는, 암, 근병증 및 천식으로 구성된 군으로부터 선택된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 Hsp27의 발현을 감소시키는 효과를 위해, 유효한 양의 본 발명의 올리고머, 결합체 또는 약학적 조성물을 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 세포 또는 조직에서 Hsp27의 발현을 억제 (예를 들면, 감소시킴에 의해)하는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
올리고머( The Oligomer )
본 발명은 올리고머성 화합물(본 발명에서 올리고머로서 기재됨)을, 서열번호: 137으로 나타낸 Hsp27 핵산과 같은, 포유류 Hsp27을 암호화하는 핵산 분자, 및 포유류 Hsp27을 암호화하는 핵산 분자의 자연적으로 발생하는 변이체(variants)의 기능을 조절하는 용도로 사용한다. 본 발명의 문맥에서 용어 "올리고머(oligomer)"는, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오염기(즉, 올리고뉴클레오티드)의 공유 결합에 의해 형성된 분자를 나타낸다. 일부 실시예에서, 올리고머는 10 - 16 공유적으로 연결된 모노머들과 같은, 10 - 18 공유적으로 연결된 모노머들과 같은, 10 - 24 공유적으로 연결된 모노머들과 같은, 10 - 30 공유적으로 연결된 모노머들과 같은, 10 - 50 공유적으로 연결된 모노머들을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 실시예에서, 용어 "뉴클레오시드(nucleoside)", "뉴클레오티드(ucleotide)", "유닛(unit)" 및 "모노머(monomer)"는 상호 교환적으로 사용된다. 뉴클레오티드 또는 모노머의 서열을 나타낼 때, A, T, G, C 또는 U와 같은 염기 서열로 나타내어지는 것이 인지될 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 당 부분, 염기 부분 및 포스페이트(phosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 인터뉴클레오티드 연결기(internucleotide linkage group)와 같은 공유적으로 연결된 기(연결기)를 포함하는 글리코시드를 의미하고, 이는 DNA 또는 RNA와 같은 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드, 및 본 발명에서 "뉴클레오티드 유사체"로 나타내는 변형된 당 및/또는 염기 부분을 포함하는 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 모두를 포함한다. 여기서, 단일 뉴클레오티드(유닛)은 또한 모노머 또는 핵산 유닛으로 나타낼 수 있다.
생화학 분야에서, 용어 "뉴클레오시드(nucleoside)"는 당 부분 및 염기 부분을 포함하는 글리코시드를 나타내며, 올리고머의 뉴클레오티드들 사이 인터뉴클레오티드 연결에 의해 공유적으로 연결되는 "뉴클레오티드" 유닛을 나타낼 때 사용될 수 있다. 생화학 분야에서, 용어 "뉴클레오티드"는 종종 핵산 모노머 또는 유닛을 나타내는데 사용되고, 그런 올리고뉴클레오티드의 문맥에서 전형적으로 뉴클레오염기 서열 (즉, 당 골격 및 뉴클레오시드 사이 연결의 존재가 암시하는)을 나타내는 "뉴클레오티드 서열"과 같은, 염기를 나타낼 수 있다. 유사하게, 하나 또는 그 이상의 인터뉴클레오시드 연결기가 변형되는 올리고뉴클레오티드의 경우에 특히, 용어 "뉴클레오티드"는 용어 "뉴클레오티드"가 인터뉴클레오시드 연결의 존재 또는 특성을 명시할 때도 사용될 수 있는, "뉴클레오시드"를 나타낼 수 있다.
당업자는 본 발명의 문맥에서, 5' 말단기를 포함하거나 포함하지 않음에도 불구하고, 올리고뉴클레오티드(올리고머)의 5' 말단 뉴클레오티드가 5' 뉴클레오티드 사이 연결기를 포함하지 않는다는 것을 이해할 수 있다.
용어 "모노머(monomer)"는 핵산에서 자연적으로 발생하는 뉴클레오시드 및 디옥시뉴클레오시드 (총괄적으로, "뉴클레오시드")를 포함하고, 이는 변형된 당 또는 변형된 뉴클레오염기 중 어느 하나, 즉, 자연적으로 발생하는 비변형된 뉴클레오염기 (염기) 부분 (즉, 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실) 및 핵산에서 자연적으로 발생하거나 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오시드인 "뉴클레오시드 유사체"에 공유적으로 결합하는 리보스 당(ribose sugar) 또는 디옥시리보스 당(deoxyribose sugar)이고, 여기서 당 부분은 리보스 또는 디옥시리보스 당, 또는 둘 모두와 다른 것(2' 치환 당과 같은, 두 고리의 당 또는 2' 변형된 당과 같은)인, 화합물 중 어느 하나를 포함하지 않는다.
"RNA 모노머"는 리보스 당 및 비변형된 뉴클레오염기를 포함하는 뉴클레오시드이다.
"DNA 모노머"는 디옥시리보스 당 및 비변형된 뉴클레오염기를 포함하는 뉴클레오시드이다.
"잠김 핵산 모노머", "잠김 모노머" 또는 "LNA 모노머"는 하기 더 기재되어 있는, 두 고리의 당을 갖는 뉴클레오시드 유사체이다.
용어 "상응하는" 및 "상응하다"는 올리고머 또는 인접한 뉴클레오티드/뉴클레오시드 서열 (첫번째 부위)의 뉴클레오티드/뉴클레오시드 서열 (즉, 뉴클레오염기 또는 염기 서열, 및 i) 핵산 표적의 역상보의 서브-서열(sub-sequence), 및/또는 ii) 본 발명에서 제공되는 뉴클레오티드/뉴클레오시드의 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 추가적인 서열의 동등한 연속적인 뉴클레오티드/뉴클레오시드 서열 사이 비교를 나타낸다. 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체는 그들의 동등하거나 상응하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드에 직접적으로 비교된다. 전형적으로 i) 또는 ii) 하에 추가적인 서열에 상응하는 첫번째 부위는 첫번째 부위의 길이 이상의 서열 (연속적인 뉴클레오티드/뉴클레오시드 서열)에 동일한 것이나, 본 발명에서 기재된 바와 같이, 일부 실시예에서는, 상응하는 서열에 대해 100% 상동성 (동일한)와 같은, 적어도 85% 상동성, 적어도 90% 상동성, 적어도 91% 상동성, 적어도 92% 상동성, 적어도 93% 상동성, 적어도 94% 상동성, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 적어도 99% 상동성과 같은, 적어도 80% 상동성이 될 수 있다.
용어 "상응하는 뉴클레오시드 유사체" 및 "상응하는 뉴클레오시드"는 뉴클레오티드 유사체에서의 염기 부분 및 뉴클레오시드에서 염기 부분이 동일한 것을 나타낸다. 예를 들면, "뉴클레오시드"는 아데닌에 연결된 2' 디옥시리보스 당을 포함하고, "상응하는 뉴클레오시드 유사체"는 예를 들면 아데닌 염기 부분에 연결된 변형된 당을 포함한다.
용어 "올리고머", "올리고머 화합물" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본 발명의 문맥에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 예를 들면 포스페이트 기 (뉴클레오시드 사이 인산디에스테르 연결을 형성하는) 또는 포스포로티오에이트 기 (뉴클레오시드 사이 포스포로티오에이트 연결을 형성하는) 둘 또는 그 이상의 모노머의 공유 연결에 의해 형성되는 분자를 나타낸다. 올리고머는 10 - 16 모노머와 같은, 10 - 18 모노머와 같은, 10 - 24 모노머와 같은, 10 - 30 모노머와 같은, 10 - 50 모노머로 구성되거나 포함한다. 올리고머는 예를 들면, 9 - 16 모노머와 같은, 9 - 18 모노머와 같은, 9 - 24 모노머와 같은, 9 - 30 연속적인 모노머로 구성되는, 첫번째 부위 (연속적인 서열)로 구성되거나 포함한다.
일부 실시예에서, 용어 "연속적인 서열", "연속적인 모노머" 및 "부위"는 상호교환적이다.
일부 실시예에서, 올리고머는 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오시드 유사체, 또는 본 발명에 기재된 이의 혼합물을 포함한다. "LNA 올리고머" 또는 "LNA 올리고뉴클레오티드"는 하나 또는 그 이상의 LNA 모노머를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
올리고머 내에 선택적으로 포함된 뉴클레오시드 유사체는 상응하는 뉴클레오시드에 유사하게 기능하거나, 또는 특이적인 개선된 기능을 가질 수 있다. 일부 또는 모든 모노머가 뉴클레오시드 유사체인, 올리고머는 세포막을 투과하는 활성, 세포 외부 및/또는 내부의 뉴클레아제에 대한 좋은 저항성 및 핵산 표적에 대한 높은 친화성 및 특이성과 같은, 상기 올리고머의 다양한 요구하는 특성 때문에 천연의 형태 보다 종종 바람직하다. LNA 모노머는, 예를 들면 하나 또는 그 이상의 상기 언급된 특성을 제공하는 특히 바람직하다.
다양한 실시예에서, 올리고머 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드 유사체는, 즉, 올리고머가 표적 유전자 발현을 억제하는 기능을 하는 중에 기능적인 효과를 가지지 않는, 상응하는 천연의 뉴클레오시드에 대한 기능에서 "침묵" 또는 "동등한" 것이다. 그럼에도 불구하고, 상기 "동등한" 뉴클레오시드 유사체는, 예를 들면 제조에 보다 용이하거나 저렴하고, 또는 저장 또는 제조 조건 하에 더 안정적인 경우 유용하고, 이는 태그 또는 라벨을 포함할 수 있다. 그러나, 전형적으로, 유사체는 올리고머가 발현을 억제하는 기능을 하는 중에; 예를 들면, 표적 핵산의 표적 부위에 대한 증가된 결합 친화성 및/또는 세포내 뉴클레아제와 같은, 뉴클레아제에 대한 증가된 저항성, 및/또는 세포내로의 이동의 증가된 용이성을 제공함에 의해; 기능적인 효과를 가질 수 있다.
따라서, 다양한 실시예에서, 본 발명에 따른 올리고머는 뉴클레오시드 모노머, 및 LNA 모노머와 같은 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체 모노머 또는 그 외 뉴클레오시드 유사체 모노머를 포함한다.
용어 "적어도 하나"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등과 같이, 1 이상 또는 1과 같은 정수를 포함한다. 다양한 실시예에 있어서, 본 발명의 올리고머의 표적 핵산 또는 단백질을 나타내는 경우, 용어 "적어도 하나"는 용어 "적어도 두 개" 및 "적어도 세 개" 및 "적어도 네 개"를 포함한다. 마찬가지로 일부 실시예에서, 용어 "적어도 두 개"는 용어 "적어도 세 개" 및 "적어도 네 개"를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 올리고머는 첫번째 부위에서 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 연속적인 모노머로 구성되거나 포함한다.
일부 실시예에서, 올리고머는 13, 14, 15, 16 또는 24 연속적인 모노머와 같은, 13 - 17 또는 12 - 16 연속적인 모노머와 같은, 12 - 18 연속적인 모노머와 같은, 10 - 16 연속적인 모노머와 같은, 10 - 18 연속적인 모노머와 같은, 10 - 22 연속적인 모노머와 같은, 10 - 24 연속적인 모노머를 포함하거나 구성한다. 부위가 올리고머로 제공될 때, 연속적인 뉴클레오티드 서열 길이는 예를 들면, 10 및 30 모두를 포함하는 10 - 30으로부터 (또는 사이) 부위에서 제공되는 하위 및 상위 길이를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
특정 실시예에서, 올리고머는 10, 11, 12, 13, 또는 14 연속적인 모노머를 포함하거나 구성한다.
다양한 실시예에서, 본 발명에 따른 올리고머는 15, 16 또는 17 모노머와 같은, 18 모노머 이하와 같은, 20 모노머 이하와 같은, 22 모노머 이하와 같은, 24 모노머 이하로 구성된다. 예를 들면, 본 발명의 올리고머는 20 모노머 이하를 포함한다.
다양한 실시예에서, 본 발명에 따른 올리고머는 RNA 모노머를 포함하지 않는다.
다양한 실시예에서, 본 발명에 따른 올리고머는 선형 분자이거나 또는 선형 분자로서 합성된 것이다. 일부 실시예에서, 올리고머는 단일 가닥 분자이고, 예를 들면, 올리고머가 내부 듀플렉스(duplexes)를 형성하는 것과 같은 동일한 올리고머 내의 또다른 부분과 상보적인, 적어도 3, 4 또는 5개의 연속적인 모노머의 짧은 부위를 전형적으로 포함하지 않는다. 일부 실시예에서는 올리고머가, 즉, siRNA가 아닌 것과 같은, 본질적으로 이중 가닥이 아니다.
일부 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 연속적으로 신장된 모노머 (첫번째 부위)로 구성되고, 이의 서열은 본 발명에서 기재된 서열번호에 의해 확인된 것이다 (예를 들면, 표 1 - 3 참조). 다른 실시예에서, 올리고머는 표적을 암호화하는 핵산 분자의 연속적으로 신장된 모노머로 구성되고, 하나 또는 그 이상의 추가적인 부위는 적어도 하나의 추가적인 모노머로 구성된다. 일부 실시예에서, 첫번째 부위의 서열은 본 발명에 기재된 서열번호에 의해 확인된 것이다.
갭머 고안( Gapmer Design )
전형적으로, 본 발명의 상기 올리고머는 갭머(gapmer)이다.
"갭머"는 본 발명에 기재된 부위 B와 같은, 적어도 6 또는 7 DNA 모노머의 부위와 같은, 하기 본 발명에 추가적으로 기재된 바와 같은, RNase를 모을 수 있는 모노머 (RNaseH와 같은)의 연속적인 신장을 포함하는 올리고머이다. 부위 B는 부위 A 및 C로 각각 나타내는 부위에 의해 5' 및 3'에서 모두 플랭크되고, 상기 부위 A 및 부위 C는 각각 1 - 6 사이의 뉴클레오시드 유사체와 같은, 친화성-증진 뉴클레오시드 유사체와 같은, 뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 구성한다. RNase는 바람직하게 대장균(E. coli) 또는 인간 RNaseH와 같은 RNaseH이다. RNaseH를 모으는 올리고머의 능력은 올리고머가 상보적인 RNA 분자 (mRNA 표적과 같은)와 듀플렉스를 형성할 때 결정된다.
일부 실시예에서, RNAse를 수집할 수 있는 모노머는 DNA 모노머, 알파-L-LNA(alpha-L-LNA) 모노머, C4' 알킬화 DNA (C4' alkylated DNA) 모노머 (본 발명에 참고문헌으로 통합되는, PCT/EP2009/050349 및 Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300 참조), 및 UNA (unlocked nucleic acid) 뉴클레오티드 (본 발명에 참고문헌으로 통합되는, Fluiter et al ., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 참조)로 구성되는 군으로부터 선택된다. UNA는 전형적으로, 당의 C2' - C3' 결합 (즉, C2' 및 C3' 결합 사이 공유의 탄소-탄소 결합)이 제거되어, 비잠금 "당" 잔기를 형성하는, 비잠금 핵산이다.
전형적으로, 갭머는 5'에서 3', A-B-C, 또는 선택적으로는 A-B-C-D 또는 D-A-B-C인 부위를 포함하고, 여기서: 부위 A (A)는 LNA 모노머와 같은, 1 - 6 뉴클레오시드 유사체와 같은, 적어도 하나의 LNA 모노머와 같은, 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체로 구성되거나 또는 포함하고; 부위 B (B)는 DNA 모노머와 같은, RNAse(mRNA 표적과 같은, 상보적인 RNA 분자로 이루어진 듀플렉스에서 형성될 때)를 수집할 수 있는 적어도 5개의 연속적인 모노머로 구성되거나 또는 포함하고; 부위 C (C)는 LNA 모노머와 같은, 1 - 6 뉴클레오시드 유사체와 같은, 적어도 하나의 LNA 모노머와 같은, 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체로 구성되거나 또는 포함하고; 존재하는 경우, 부위 D (D)는 DNA 모노머와 같은, 1, 2 또는 3 모노머로 구성되거나 또는 포함한다.
다양한 실시예에서, 부위 A는 3 또는 4 LNA 모노머와 같은, 3 또는 4 뉴클레오시드 유사체와 같은, 2 - 5 LNA 모노머와 같은, 2 ~ 5 사이의 뉴클레오시드 유사체와 같은, LNA 모노머와 같은, 뉴클레오시드 유사체로 구성되고; 및/또는 부위 C는 3 또는 4 LNA 모노머와 같은, 3 또는 4 뉴클레오시드 유사체와 같은, 2 - 5 LNA 모노머와 같은, LNA 모노머와 같은, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 뉴클레오시드 유사체로 구성된다.
특정 실시예에서, 부위 B는 RNAse를 수집할 수 있는 10 또는 9 또는 8 연속적인 모노머와 같은, RNaseH, 또는 6-10, 또는 7-9 연속적인 모노머와 같은, RNAse를 수집할 수 있는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 연속적인 모노머 (예를 들면, 연속적인 뉴클레오티드)로 구성하거나 포함한다. 특정 실시예에서, 부위 B는 1 - 12 DNA 모노머와 같은, 바람직하게는 4 - 12 DNA 모노머, 더욱 바람직하게는 7 - 10 DNA 모노머와 같은, 6 - 10 사이의 DNA 모노머, 가장 바람직하게는 8, 9 또는 10 DNA 모노머와 같은, 적어도 하나의 DNA 모노머로 구성되거나 포함한다.
다양한 실시예서, 부위 A는 LNA 모노머와 같은, 3 또는 4 뉴클레오시드 유사체로 구성되고, 부위 B는 7, 8, 9 또는 10 DNA 모노머로 구성되며, 부위 C는 LNA 모노머와 같은, 3 또는 4 뉴클레오시드 유사체로 구성된다. 이러한 고안은 (A-B-C) 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3을 포함하고, DNA 모노머와 같은, 하나 또는 2 모노머를 가질 수 있는 부위 D를 추가적으로 포함할 수 있다.
추가적인 갭머 고안은 WO2004/046160에 기재되어 있고, 이는 참조로서 본 발명에 통합된다.
본 발명에 참조로서 통합되는, US 가출원 60/977409로부터 우선권을 주장하는 WO2008/113832는 '쇼트머(shortmer)' 갭머 올리고머로 나타낸다. 일부 실시예에서, 본 발명에 존재하는 올리고머는 쇼트머 갭머일 수 있다.
특정 실시예에서,올리고머는 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 모노머로 구성되고, 여기서 올리고머의 부위는 패턴 (5' - 3'), A-B-C, 또는 선택적으로는 A-B-C-D 또는 D-A-B-C이고, 여기서 부위 A는 LNA 모노머와 같은, 1, 2 또는 3 뉴클레오시드 유사체로 구성되고; 부위 B는 RNaseH와 같은 RNAse를 수집할 수 있는 7, 8, 9 또는 10 연속적인 모노머로 구성되고; 부위 C는 LNA 모노머와 같은, 1, 2 또는 3 뉴클레오시드 유사체로 구성된다. 존재하는 경우, 부위 D는 단일 DNA 모노머로 구성된다.
특정 실시예에서, 부위 A는 1개의 LNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 A는 2개의 LNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 A는 3개의 LNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 C는 1개의 LNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 C는 2개의 LNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 C는 3개의 LNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 B는 7개의 뉴클레오시드 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 B는 8개의 뉴클레오시드 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 B는 9개의 뉴클레오시드 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 B는 10개의 뉴클레오시드 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 B는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 DNA 모노머와 같은, 1 - 10 DNA 모노머를 포함한다. 특정 실시예에서, 부위 B는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 DNA 모노머와 같은, 1 - 9 DNA 모노머를 포함한다. 특정 실시예에서, 부위 B는 DNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 부위 B는 알파-L-배열(alpha-L-configuration)에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 LNA 모노머와 같은, 적어도 하나의 LNA 모노머가 알파-L-배열에 존재하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 알파-L-배열에 있는 부위 B에서 LNA 모노머는 알파-L-옥시 LNA 유닛이다. 특정 실시예에서, A-B-C 부위에 존재하는 모노머의 수는 (뉴클레오시드 유사체 모노머 - 부위 B - 뉴클레오시드 유사체 모노머): 1-8-1, 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, 또는; 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 3-9-3, 4-9-1, 1-9-4, 또는; 1-10-1, 1-10-2, 2-10-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 2-10-3, 3-10-2, 또는 3-10-3로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, A-B-C 부위에 존재하는 모노머의 수는 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4, 및 4-7-3으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, A 및 C는 각각 3 LNA 모노머로 구성되고, 부위 B는 8 또는 9 또는 10 뉴클레오시드 모노머, 바람직하게는 DNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, A 및 C는 각각 2 LNA 모노머로 구성되고, 부위 B는 8 또는 9 뉴클레오시드 모노머, 바람직하게는 DNA 모노머로 구성된다.
다양한 실시예에서, 다른 갭머 고안은 2'-O-메톡시에틸-리보스 당(2'-O-methoxyethyl-ribose sugar, 2'MOE)를 포함하는 모노머 또는 2'-플루오로(fluoro)- 디옥시리보스 당을 포함하는 모노머와 같은, 3, 4, 5 또는 6 뉴클레오시드 유사체로 구성되는 부위 A 및/또는 C, 및 3-9-3, 3-10-3, 5-10-5 또는 4-12-4 모노머를 갖는 A-B-C 부위를 포함한다. 또 다른 갭머 고안은 본 발명에 참조로서 통합되는 WO 2007/146511A2에 기재되어 있다.
인터뉴클레오시드 연결( Internucleoside Linkages )
본 발명에 기재된 올리고머의 모노머는 연결기(linkage group)를 통해 결합된다. 적절하게, 각 모노머는 연결기를 통해 3' 인접한 모노머에 연결된다.
당업자는 본 발명의 문맥에서, 올리고머의 말단의 5' 모노머는, 5' 말단기를 포함하거나 포함하지 않음에도 불구하고, 5' 연결기를 포함하지 않는다.
용어 "연결기" 및 "인터뉴클레오시드 연결"는 두 연속적인 모노머를 서로 공유적으로 결합할 수 있는 기(group)를 나타낸다. 특히 바람직한 실시예는 포스페이트 기(phosphate groups)(인접한 뉴클레오시드 모노머 사이 포스포디에스테르를 형성하는) 및 포스포로티오에이트 기(phosphorothioate group)(인접한 뉴클레오시드 모노머 사이 포스포로티오에이트 연결을 형성하는)를 포함한다.
적절한 연결기는 WO2007/031091에 기재된 것을 포함하고, 예를 들면, 상기 결합기는 WO2007/031091(본 발명에 참조로서 통합된)의 34쪽의 첫 번째 단락에 목록으로 포함한다.
다양한 실시예에서, 정상적인 포스포디에스테르(phosphodiester)로부터, RNase H에 의해 절단되어, 표적 유전자의 발현의 RNase-매개 안티센스 억제를 허용하는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate)와 같은, 뉴클레아제(nuclease) 공격에 더욱 저항성 있는 것으로 결합기를 변형하는 것이 바람직하다.
일부 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 연결기를 포함하는 적절한 황(sulphur; S)이 바람직할 수 있다. 다양한 실시예에서, 포스포로티오에이트 연결기는 특히 갭머의 갭 부위 (B)를 위한 것이 바람직하다. 특정 실시예에서, 포스포로티오에이트 연결기는 플랭킹 부위 (A 및 C)에서 모노머들이 함께 연결되기 위해 사용된다. 다양한 실시예에서, 포스포로티오에이트 연결기는 부위 A 또는 C를 부위 D에 연결하기 위해, 및 부위 D 내에 모노머들을 함께 연결하기 위해 사용된다.
다양한 실시예에서, 부위 A, B 및 C는, 특히 예를 들면, 부위 A 및 C가 LNA 모노머를 포함하는 경우와 같이, 뉴클레오시드 유사체의 사용이 엔도 뉴클레아제 분해로부터 부위 A 및 C 내에 연결기를 보호하는 경우, 포스포디에스테르 연결과 같은, 포스포로티오에이트와 다른 연결기를 포함할 수 있다.
다양한 실시예에서, 올리고머의 인접한 모노머는 포스포로티오에이트 기에 의해 서로 연결된다.
뉴클레오시드 유사체 모노머들 사이 또는 인접 부위 (전형적으로 부위 A 및/또는 C 내)에서 포스포로티오에이트 골격(backbone), 특히 포스포로티오에이트 연결기로 올리고머내로 한 개 또는 두 개의 연결과 같은, 포스포디에스테르 연결의 삽입은, 올리고머의 생물학적 이용 가능성 및/또는 생물학적 분배를 변형시킬 수 있는 것을 알 수 있다 - 본 발명에 참조로서 통합되는 WO2008/053314 참조.
상기에 언급된 실시예와 같은, 일부 실시예에서, 적절하고 특이적이지 않은 것을 나타내는 경우, 모든 잔여 연결기는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트, 또는 이들의 혼합물이다.
일부 실시예에서, 모든 인터뉴클레오티드 연결기는 포스포로티오에이트이다.
본 발명에 제공되는 바와 같이, 특이적 갭머 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내는 경우, 다양한 실시예에서 상기 연결기는 포스포로티오에이트 연결, 본 발명에 기재된 것과 같은 대체적인 연결이며, 상기 대체적인 연결은, 예를 들면, 특히 LNA 모노머와 같은 뉴클레오시드 유사체들 사이 연결을 위해, 포스페이트 (포스포디에스테르) 연결이 사용될 수 있다. 유사하게, 다양한 실시예에서, 본 발명에 기재된 바와 같이, 특이적 갭머 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내는 경우, LNA 모노머와 같은, 부위 A 또는 C에서 하나 또는 그 이상의 모노머는 5-메틸시토신 염기(5-methylcytosine base)를 포함하고, 상기 부위의 다른 모노머는 변형되지 않은 시토신 염기를 포함할 수 있다.
표적 핵산( Target Nucleic Acid )
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본 발명에서 상호교환적으로 사용되고, 상기 기재된 바와 같이, 2 또는 그 이상의 모노머의 공유 연결에 의해 형성되는 분자로 정의된다. 2 또는 그 이상의 모노머를 포함하는 "핵산"은 특정 길이로 될 수 있으며, 용어는 본 발명에 기재된 길이를 갖는 "올리고머"로 총칭된다. 용어 "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 단일 가닥, 이중 가닥, 부분적 이중 가닥 및 환 분자(circular molecule)를 포함한다.
본 발명에 사용된, 용어 "표적 핵산"은 서열번호: 137로 나타내는 서열을 갖는 핵산, 및 상기 핵산의 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이와 같은, 인간 Hsp27과 같은, 포유류 Hsp27 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 또는 RNA(예를 들면, mRNA 또는 pre-mRNA)를 나타낸다. 특정 실시예에서, 포유류 Hsp27은 마우스 Hsp27이다. 일부 실시예에서, 예를 들면 연구 또는 진단에 사용하는 경우, "표적 핵산"은 cDNA, 또는 DNA 또는 RNA 핵산 표적으로부터 유래된 합성 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명에 따른 올리고머는 전형적으로 표적 핵산에 혼성화(hybridising)될 수 있다.
예시적인 표적 핵산은 하기 표에 나타낸 유전자은행 등록번호(GenBank Accession numbers)을 갖는 포유류 Hsp27을 암호화하는 핵산, 더하여 이의 상응하는 단백질 서열을 포함한다.
GenBank Accession Number
핵산 (mRNA/cDNA 서열)
GenBank Accession Number
폴리펩티드 (추론된)
인간 M_001540 (서열번호 137) NP_001531
마우스 M_024441 NP_077761
핵산에 대한 상기 기재된 유전자은행 등록번호는 cDNA 서열이고 mRNA 서열 자체가 아닌 것이 인지된다. 성숙 mRNA의 서열은 유라실 염기 (U)로 대체되는 티미딘 염기 (T)를 갖는 상응하는 cDNA 서열로부터 직접 유래될 수 있다.
용어 "그의 자연적으로 발생하는 변이"는 마우스, 원숭이 및 바람직하게 인간 Hsp27와 같은, 포유류와 같은, 정의된 분류군내에 자연적으로 존재하는 Hsp27 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 변이를 나타낸다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드의 "자연적으로 발생하는 변이"를 나타내는 경우, 용어는 염색체 전좌(translocation) 또는 중복(duplication)에 의해 크로모좀(Chromosome) Chr 7: 75.77 - 75.77 Mb에서 발견되는 게놈 DNA를 암호화하는 Hsp27의 대립유전자 변이, 및 이로부터 유래된 mRNA와 같은 RNA를 포함한다. 또한, "자연적으로 발생하는 변이"는 Hsp27 mRNA의 대체적인 스플라이싱(splicing)으로부터 유래된 변이를 포함할 수 있다. 특이적인 폴리펩티드 서열과 관련되는 경우, 예를 들면, 용어는 신호 펩티드 절단, 단백질 가수분해의 절단, 당화 등과 같은 공동(co)- 또는 후(post)- 번역 변형에 의해, 공정될 수 있는 단백질의 자연적으로 발생하는 형태를 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명에 기재된 올리고머는 올리고머의 단랭체와 표적 핵산의 모노머 사이, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍, 후그스틴(Hoogsteen) 수소결합 또는 역 후그스틴 수소결합 중 어느 하나에 의해 표적 핵산의 부위 ("표적 부위")에 결합한다. 또한, 상기 결합은 "혼성화(hybridisation)"로 나타낸다. 다른 기재가 없으면, 결합은 상보적인 염기들(즉, 티민 (DNA) 또는 유라실 (RNA)을 갖는 아데닌, 및 시토신을 갖는 구아닌)의 왓슨-크릭 염기쌍에 의한 것이며, 올리고머는 상기 올리고머의 서열이 표적 부위에 역상보의 서열에 동일하거나 부분적으로 동일하기 때문에 표적 부위에 결합하며; 본 발명의 목적을 위해, 상기 올리고머는 표적 부위에 "상보적인" 또는 "부분적으로 상보적인"인 것으로 나타내어지고, 상기 표적 부위에 대한 올리고머의 "상보성"의 백분율은 표적 부위의 서열의 역상보에 "동일한" (상동성) 백분율이다.
본 발명에서 사용되는, 용어 "역상보(reverse complement)", "역상보적인" 및 "역상보성"은 "상보", "상보적인" 및 "상보성"과 상호교환적인 것이다.
본 발명의 문맥에서 명확히 하지 않는 경우, 본 발명에서 "표적 부위"는 하기 본 발명에 기재된 정렬 프로그램 및 파라미터를 이용하여, 특정 올리고머 (또는 이의 부위)의 서열의 역상보와 최적으로 정렬하는 서열을 갖는 표적 핵산의 부위일 수 있다.
본 발명의 올리고머 (또는 이의 부위) 및 본 발명에 기재된 바와 같은, 포유류 Hsp27을 암호화하는 핵산의 표적 부위 사이 "상보성"의 정도를 결정하는데 있어서, "상보성" (또는 "상동성" 또는 "동일성")의 정도는 올리고머 (또는 이의 부위) 및 이와 최적으로 정렬하는 표적 부위 (또는 표적 부위에 역상보)의 서열 사이 동일성 백분율 (또는 상동성 백분율)로 발현된다. 백분율은 올리고머에서 연속적인 모노머의 총수에 의해 나누고, 100으로 곱하여, 2 서열 사이 동일한 것을 정렬된 염기의 수를 계산함으로써 산출된다. 이런 비교에서, 만약 갭(gap)이 존재하는 경우, 이런 갭은 갭내에 모노머의 수가 본 발명의 올리고머 및 표적 부위 사이 다른 부분 보다 다소 미스매치하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "상동적인" 및 "상동성"은 "동일성" 및 "동일한"과 상호교환적인 것이다.
아미노산 및 폴리뉴클레오티드 정렬, 백분율 서열 동일성 및 상보성의 정도는 표준 세팅을 이용하여 ClustalW 알고리즘을 이용하여 본 발명의 목적을 위해 결정될 수 있다: http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html, 방법: Blosum 62 (단백질), 또는 뉴클레오티드/뉴클레오염기를 위한 DNAfull을 이용한, EMBOSS::물 (국소의): 갭 개방 = 10.0, 갭 연장 = 0.5.
본 발명의 문맥에 따라 이해될 수 있는 바와 같이, "미스매치(mismatch)"는 서열에서 비-동일성 (예를 들면, 올리고머와 그것이 결합하는 표적 부위의 역 상보 사이와 같은; 예를 들면, 2개의 정렬된 Hsp27를 암호화하는 핵산의 염기 서열 사이와 같은), 또는 서열에서 비상보성 (예를 들면, 올리고머와 그것이 결합하는 표적 부위 사이와 같은)을 나타낸다.
일부 실시예에서, 본 발명을 암호화하는 올리고머는 Hsp27 표적 유전자를 발현하는 세포에서 하나 또는 그 이상의 Hsp27 표적 유전자의 발현을 억제 (다운-레귤레이팅에 의한 것과 같은)할 수 있거나, 또는 Hsp27 표적 유전자를 발현 (즉, 세포에 Hsp27 표적 유전자의 Hsp27 억압을 완화함에 의해)할 수 있다.
Hsp27 mRNA를 표적화하는 올리고머는, 5' 비번역 리더, 엑손, 인트론 및 3' 비번역 테일과 같은, 표적 mRNA 핵산에 따르는 특정 부위에 혼성화될 수 있다. 그러나, Hsp27 mRNA를 표적화하는 올리고머는 표적 핵산의 성숙한 mRNA 형태에 혼성화하는 것이 바람직하다.
적절하게, 본 발명의 올리고머 또는 이의 결합체는 Hsp27 유전자의 발현을 다운-레귤레이팅 (예를 들면, 감소 또는 제거)할 수 있다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머 (또는 결합체)는 전형적으로 인간 세포와 같은, 포유류 세포에서 Hsp27을 억제하는 효과가 있을 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명의 올리고머, 또는 이의 결합체는, 표적 핵산에 결합하고, 올리고머 또는 이의 결합체의 부재하의 Hsp27 mRNA 발현 수준과 비교하여 적어도 10% 또는 20%, 더욱 바람직하게는 올리고머 또는 이의 결합체의 부재하의 발현 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 Hsp27 mRNA 발현 억제에 영향을 준다. 일부 실시예에서, 상기 억제는 올리고머 또는 이의 결합체의 약 0.8 nM 내지 약 20 nM과 같은, 약 0.04 nM 내지 약 25 nM으로 이용될 때 보여진다. 본 발명에 기재된 바와 같은, 세포 유형은 인간 폐암 세포 또는 인간 전립선암 세포 (예를 들면, 시험관내 형질전환된 세포)와 같은, 암세포와 같은, 인간 세포이다. 사용된 올리고머 농도는 일부 실시예에서 5 nM이다. 사용된 올리고머 농도는 일부 실시예에서 25 nM이다. 사용된 올리고머 농도는 일부 실시예에서 1 nM이다. 세포를 처리하는데 사용되는 올리고머의 농도는 실시예에 기재된 바와 같이, 형질전환 (리포펙톤)을 이용한 시험관내 세포 분석에서 수행되는 다양한 전형적인 실시예 내에 있는 것으로 지시될 수 있다. 형질전환 시약의 존재하에, 표적의 다운-레귤레이션을 확득하기 위해 요구되는 올리고머 농도는 전형적으로 5 mM과 같은, 1 및 25 mM 사이이다.
다양한 실시시예에서, mRNA 발현의 억제는 70% 억제 이하와 같은, 80% 억제 이하, 90% 억제 이하, 95% 억제 이하, 98% 억제 이하와 같은, 100% 이하(즉, 발현의 완전한 억제 이하)이다. 다양한 실시예에서 유전자 발현의 조절은, 예를 들면, 표적 단백질에 대하여 고조된 적절한 항체를 이용한 웨스턴 블랏(Western blot)에 의해 따르는 SDS-PAGE와 같은 방법을 통해, 단백질 수준을 측정함에 의해 결정될 수 있다. 대체적으로, 발현 수준의 조절은, 예를 들면, 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 정량적 RT-PCR을 통해 mRNA의 수준을 측정함에 의해 결정될 수 있다. mRNA 수준을 통해 측정하는 경우, 약 0.8 nM 내지 약 20 nM 사이와 같은, 약 0.04 nM 내지 약 25 nM 사이와 같은, 적절한 투여량을 이용하는 경우 다운-레귤레이션의 수준은, 다양한 실시예에서, 전형적으로, 본 발명의 올리고머, 결합체 또는 조성물의 부재하에서 정상 수준의 10 - 20% 사이의 수준이다.
따라서 본 발명은 Hsp27 단백질 및/또는 mRNA를 발현하는 세포에서 Hsp27 단백질 및/또는 mRNA의 발현의 다운-레귤레이션 또는 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포에서 Hsp27 단밸질 및/또는 mRNA의 발현을 다운-레귤레이션 또는 억제하기 위해, 유효한 양의 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체를 상기 세포와 접촉하는 것을 포함한다. 적절하게는 세포는 인간 세포와 같은 포유류 세포이다. 접촉은, 다양한 실시예에서, 시험관내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 접촉은, 다양한 실시예에서, 생체내(in vivo)에서 일어날 수 있다.
올리고머 서열( Oligomer Sequences )
일부 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 서열번호: 1 내지 128로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 동일한 서열을 갖는다.
또한, 하나 또는 그 이상의 본 발명의 올리고머에 (완전히 또는 완벽하게) 상보적이거나 부분적으로 상보적인 표적 부위를 포함하는 표적 핵산 (예를 들면, Hsp27을 암호화하는 DNA 또는 mRNA)을 제공한다. 특정 실시예에서, 올리고머는 대립유전자 변이 (Hsp27 유전자가 유전자 좌 크로모좀 7: 75.77 - 75.77 Mb와 같은)와 같은, Hsp27 표적 부위의 변이에 결합한다. 일부 실시예에서, Hsp27 표적 부위의 변이는 서열번호: 137로 기재되는 서열을 갖는 표적 부위에 적어도 60%, 더 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더 바람직하게 적어도 85%, 더 바람직하게 적어도 90%, 더 바람직하게 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 가진다. 따라서, 다른 실시예에서, 본 발명의 몰리고머는 서열번호: 1 내지 128로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 비교하는 경우 1, 2 또는 3개의 염기에서 다른 서열을 가진다. 전형적으로, Hsp27 표적 부위의 변이에 결합하는 본 발명의 올리고머는 Hsp27를 억제 (예를 들면, 다운-레귤레이팅함에 의해)할 수 있다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는, 예를 들면, 서열번호: 129 - 136로 보여진 서열을 갖는 올리고머와 같은, LNA 올리고머이다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 Hsp27 mRNA 및 단백질 발현의 잠재적 억제제이다. 일부 실시예에서, 어구 "잠재적 억제제"는 실시예 5의 리포펙타민 형질전환 분석에 의해 결정되는 바와 같이 5 nM 이하의 IC50을 갖는 올리고머를 나타낸다. 일부 실시예에서, IC50은 2 nM 이하와 같은, 4 nM 이하이다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 서열번호: 131 또는 서열번호: 135의 서열을 갖는 LNA 올리고머이다.
다양한 실시예에서, 올리고머는 서열번호: 137에서 표적 부위의 역상보의 서열에 일치하거나 부분적으로 일치하는 염기 서열을 갖는 첫번째 부위를 포함하거나 구성한다. 다양한 실시예에서, 올리고머는 서열번호: 1 - 128로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 첫번째 부위를 포함하거나 구성한다.
특정 실시예에서, 올리고머는 포유류 Hsp27를 암호화하는 핵산의 표적 부위의 서열에 완전히 상보적인 (완벽하게 상보적인) 염기 서열을 갖는 첫번째 부위를 포함하거나 구성한다.
그러나, 일부 실시예에서, 올리고머는 Hsp27 표적 핵산의 최적으로 정렬된 표적 부위에 비교하여 1, 2, 3, 또는 4 (또는 그 이상) 미스매치를 포함하고, Hsp27 mRNA 또는 단백질 발현의 억제 효과를 위해, 표적 부위에 충분히 결합한다. 왓슨-크릭 수소결합된 듀플렉스에서 미스매치의 불안정성 효과는, 예를 들면, 올리고머의 증가된 길이 및/또는 올리고머 내에 존재하는, LNA 모노머와 같은, 뉴클레오시드 유사체의 증가된 수에 의해 보상될 수 있다.
다양한 실시예에서, 상기 올리고머 염기 서열은, 예를 들면 포유류 Hsp27을 암호화하는 표적 핵산의 최적으로 정렬된 표적 부위의 염기 서열에 비교하여 2 또는 그 이상의 미스매치와 같은, 3 이하를 포함한다.
일부 실시예에서, 올리고머 염기 서열은 포유류 Hsp27을 암호화하는 핵산의 최적으로 정렬된 표적 부위의 염기 서열에 비교하는 경우, 하나 이하의 미스매치를 포함한다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머, 또는 이의 첫번째 부위의 염기 서열은, 서열번호: 1 - 15 및 121, 16 - 30 및 122, 31 - 45 및 123, 46 - 60 및 124, 61 - 75 및 125, 76 - 90 및 126, 91 - 105, 및 127, 및 106 - 120 및 128로 구성된 군으로부터 선택된 염기 서열에 대해, 100% 동일한 것과 같은, 적어도 99% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 85% 동일한 것과 같은, 적어도 80% 동일한 것이 바람직하다.
특정 실시예에서, 본 발명의 올리고머 또는 이의 첫번째 부위의 염기 서열은 서열번호: 137에 존재하는 표적 부위의 역상보의 염기 서열에 대해, 100% 동일한 것과 같은, 적어도 99% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 85% 동일한 것과 같은, 적어도 80% 동일한 것이다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머 또는 이의 첫번째 부위의 염기 서열은 서열번호: 137의 표적 부위에 대해, 100% 상보적인 (완벽하게 상보적인) 것과 같은, 적어도 99% 상보적인, 적어도 98% 상보적인, 적어도 97% 상보적인, 적어도 96% 상보적인, 적어도 95% 상보적인, 적어도 94% 상보적인, 적어도 93% 상보적인, 적어도 92% 상보적인, 적어도 91% 상보적인, 적어도 90% 상보적인, 적어도 85% 상보적인 것과 같은, 적어도 80% 상보적인 것이 바람직하다.
일부 실시예에서 올리고머 (또는 이의 첫번째 부위)는 서열번호: 1, 16, 31, 46, 61, 76, 91, 및 106로 구성된 군으로부터 선택되는 염기 서열을 가지거나, 또는 서열번호: 1, 16, 31, 46, 61, 76, 91, 및 106의 적어도 9 또는 10 연속적인 모노머로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다. 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머 또는 이의 첫번째 부위는, 선택된 서열 또는 이의 부위로 선택적으로 정렬하는 경우, 서열번호: 1, 16, 31, 46, 61, 76, 91, 및 106의 서열, 또는 이의 적어도 9 또는 10 연속적인 모노머의 서열을 갖는 올리고머에서 이로부터 다른 (예를 들면, 미스매치인) 하나, 둘 또는 세개의 염기 부분을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 발명에서 사용되는 용어 "첫번째 부위(first region)"은 올리고머의 일부 (서브-서열)을 나타낸다. 예를 들면, 서열번호: 1로 기재되는 16 모노머 서열은, 즉 서열번호: 1로 기재되는 서열을 포함하는 서열번호: 121로 기재되는 서열인, 서열번호: 121로 기재되는 24 모노머 서열의 서브서열이다.
일부 실시예에서 올리고머 (또는 이의 첫번째 부위)는 서열번호: 121 - 128로 구성되는 군으로부터 선택되는 염기 서열, 또는 이의 적어도 9 또는 10 연속적인 모노머의 서열을 갖는다. 다른 실시예에서, 올리고머 (또는 이의 첫번째 부위)의 서열은 선택된 서열 또는 이의 부위로 선택적으로 정렬하는 경우, 서열번호: 121 - 128로 구성되는 군으로부터 선택되는 염기 서열, 또는 이의 적어도 9 또는 10 연속적인 모노머의 서열로부터 다른 하나, 둘 또는 세 개의 염기 부분을 포함한다.
다양한 실시예에서, 올리고머는 서열번호 1, 16, 31, 46, 61, 76, 91, 및 106으로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 동일하게 존재하는 염기 서열을 갖는, 12 - 16과 같은, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머의 부위를 포함한다. 다른 실시예에서, 올리고머는 서열번호: 1, 16, 31, 46, 61, 76, 91, 및 106의 서열을 갖는 올리고머로부터 다른 하나, 둘 또는 세 개의 염기 부분을 포함하는 부위를 포함한다.
일부 실시예에서 첫번째 부위는 12 - 16 모노머와 같은, 12 - 18 모노머와 같은, 12 - 22 모노머와 같은, 12 - 24 모노머와 같은, 9 - 22 모노머와 같은, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29 연속적인 모노머로 구성된다. 적절하게, 일부 실시예에서, 첫번째 부위는 본 발명의 올리고머와 동일한 길이로 구성된다.
일부 실시예에서 올리고머는 올리고머의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5 추가적인 모노머와 같은, 첫번째 부위의 5' 및/또는 3' 말단에 추가적인 모노머를 포함하며, 이는 표적 부위에 비상보적이다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 표적에 상보적인 첫번째 부위를 포함하며, 이는 표적 부위에 상보적인 추가적인 모노머에 의해 플랭크된 5' 및/또는 3'이다. 일부 실시예에서 추가적인 5' 또는 3' 모노머는 DNA 또는 RNA 모노머와 같은, 뉴클레오시드이다. 다양한 실시예에서, 5' 또는 3' 모노머는 본 발명의 갭머 올리고머의 문맥에서 기재된 바와 같은 부위 D를 나타낸다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 121에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 1 - 15와 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 122에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 16 - 30과 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 123에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 31 - 45와 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 124에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 46 - 60과 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 125에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 61 - 75와 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 126에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 76 - 90과 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 127에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 91 - 105와 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명에 따른 올리고머는 서열번호: 128에 따른 뉴클레오염기 서열을 갖는 연속적인 모노머 (첫번째 부위), 또는 서열번호 106 - 120과 같은, 상기 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머와 같은, 상기 서열의 적어도 9 연속적인 모노머로 구성하거나 포함한다.
뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 유사체( Nucleosides and Nucleoside analogues )
일부 실시예에서, 용어 "뉴클레오시드 유사체" 및 "뉴클레오티드 유사체"는 상호교환적으로 사용된다.
다양한 실시예에서, 올리고머에 존재하는 적어도 하나의 모노머는 5-메틸시토신(5-methylcytosine), 이소시토신(isocytosine), 슈도이소시토신(pseudoisocytosine), 5-브로모유라실(5-bromouracil), 5-프로피닐유라실(5-propynyluracil), 6-아미노퓨린(6-aminopurine), 2-아미노퓨린(2-aminopurine), 이노신(inosine), 디아미노퓨린(diaminopurine), 2-클로로-6-아미노퓨린(2-chloro-6-aminopurine), 크산틴(xanthine) 및 하이포크산틴(hypoxanthine)으로부터 선택되는 염기와 같은, 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오시드 유사체이다.
다양한 실시예에서, 올리고머에 존재하는 적어도 하나의 모노머는 변형된 당을 포함하는 뉴클레오시드 유사체이다.
일부 실시예에서, 올리고머의 적어도 2 연속적인 모노머 사이 연결은 포스포디에스테르 연결과는 다른 것이다.
특정 실시예에서, 올리고머는 변형된 염기를 갖는 적어도 하나의 모노머, 변형된 당을 갖는 적어도 하나의 모노머 (동일한 모노머일 수 있는), 및 비-자연적으로 발생하는 적어도 하나의 모노머 사이 연결을 포함한다.
뉴클레오시드 유사체의 특정 예로는, 예를 들면 Freier & Altmann; Nucl . Acid Res ., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr . Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213에 의해 기재되고, 도식(Scheme) 1 (뉴클레오티드로 보여지는 일부 뉴클레오시드 유사체)에 기재되어 있다.
Figure pct00001
도식 1
따라서 올리고머는 자연적으로 발생하는 뉴클레오시드의 단순한 서열 - 바람직하게는 DNA 모노머 뿐만 아니라, RNA 모노머, 또는 뉴클레오시드 및 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드 유사체의 조합을 포함 또는 구성할 수 있다. 일부 실시예에서, 이런 뉴클레오시드 유사체는 표적 핵산의 표적 부위에 대한 올리고머의 친화성을 적절하게 증진시킨다.
적절하고 바람직한 뉴클레오시드 유사체의 예로는 WO2007/031091에 기재되어 있고, 이는 본 발명에 참조된다.
일부 실시예에서, 뉴클레오시드 유사체는 2'-O-알킬-리보스 당(2'-O-alkyl-ribose sugars), 2'-아미노-디옥시리보스 당(2'-amino-deoxyribose sugars), 및 2'-플루오로-디옥시리보스 당(2'-fluoro-deoxyribose sugars)와 같은, 2' 치환기를 제공하기 위해, 변형된 당 부분을 포함한다.
일부 실시예에서, 뉴클레오시드 유사체는 결합 친화성을 증진시키는 두 고리의 당(bicyclic sugar)(LNA)을 포함하고, 또한 일부 증가된 뉴클레아제 저항성을 제공할 수 있다. 다양한 실시예에서, LNA 모노머는 옥시(oxy)-LNA(베타-D-옥시-LNA, 및 알파-L-옥시-LNA과 같은), 및/또는 아미노(amino)-LNA(베타-D-아미노-LNA 및 알파-L-아미노-LNA과 같은) 및/또는 티오(thio)-LNA(베타-D-티오-LNA 및 알파-L-티오-LNA과 같은) 및/또는 ENA(베타-D-ENA 및 알파-L-ENA와 같은)로부터 선택된다. 특정 실시예에서, LNA 모노머는 beta-D-oxy-LNA이다. LNA 모노머는 추가적으로 하기 기재된다.
다양한 실시예에서, LNA 모노머 또는 2' 치환된 당을 포함하는 모노머와 같은, 올리고머에서 친화성을 증가시키는 뉴클레오시드 유사체의 통합, 또는 변형된 연결기의 통합은 증가된 뉴클레아제 저항성을 제공한다. 다양한 실시예에서, 친화성을 증가시키는 뉴클레오시드 유사체의 통합은 올리고머의 크기를 줄이고, 또한 표적 서열의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 올리고머의 크기를 줄인다.
일부 실시예에서, 올리고머는 적어도 1개의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 실시예에서, 올리고머는 적어도 2개의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 실시예에서, 올리고머는, 예를 들면 6 또는 7개의 뉴클레오시드 유사체인, 적어도 3 - 8개의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 다양한 실시예에서, 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체는 잠금핵산 (LNA) 모노머; 예를 들면 적어도 3 또는 적어도 4, 또는 적어도 5, 또는 적어도 6, 또는 적어도 7 또는 8, 뉴클레오시드 유사체는 LNA 모노머이다. 일부 실시예에서, 모든 뉴클레오시드 유사체는 LNA 모노머이다.
바람직한 올리고머 염기 서열을 나타내는 경우, 특정 실시예에서, 올리고머는 올리고머/표적 부위 듀플렉스의 듀플렉스 안정성 (Tm)을 증가시키는, LNA 모노머 또는 다른 상응하는 뉴클레오시드 유사체와 같은 (즉, 친화성 증진시키는 뉴클레오시드 유사체), 상응하는 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 것으로 인지될 것이다.
다양한 실시예에서, 올리고머의 염기서열과 표적 부위의 염기서열 사이 특정 미스매치 (즉, 비-상보성)이 존재하는 경우, 이는 본 발명에 기재된 바와 같은 부위 B 내에, 및/또는 본 발명에 기재된 바와 같은 부위 D 내에, 및/또는 움 모노머로 구성된 부위에, 및/또는 표적 부위에 상보적인 올리고머의 부위에 5' 또는 3' 부위에서와 같은, 친화성을 증진시키는 뉴클레오시드 유사체 (예를 들면, 부위 A 또는 C)를 포함하는 올리고머의 부위에서와 다르게 위치되는 것이 바람직하다.
일부 실시에서 본 발명의 올리고머 내에 존재하는 뉴클레오시드 유사체 (본 발명에 기재된 부위 A 및 C와 같은)는, 예를 들면: 2'-O-알킬-리보스 당(2'-O-alkyl-ribose sugars)을 포함하는 모노머, 2'-아미노-디옥시리보스 당(2'-amino-deoxyribose sugars)을 포함하는 모노머, 2'-플루오로-디옥시리보스 당(2'-fluoro-deoxyribose sugars)을 포함하는 모노머, LNA 모노머, 아라비노스 당(rabinose sugars)을 포함하는 모노머("ANA 모노머"), 2'-플루오로-아라비노스 당(2'-fluoro-arabinose sugars)을 포함하는 모노머, d-아라비노-헥시톨 당(d-arabino-hexitol sugars)을 포함하는 모노머("HNA 모노머"), 본 발명에 참조로서 통합되는 Christensen, 2002. Nucl . Acids . Res. 2002 30: 4918-4925로 정의되는 바와 같은 인터칼레이팅 모노머(intercalating monomers), 및 2'-O-메톡시에틸 리보스(2'-O-methoxyethyl-ribose, 2'MOE) 당으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 올리고머에 존재하는 뉴클레오시드 유사체의 상기 형태 중 오직 하나, 또는 이의 부위가 있다.
특정 실시예에서, 뉴클레오시드 유사체는 2'MOE 당, 2'-플루오로-디옥시리보스 당, 또는 LNA 당을 포함하고, 이러한 본 발명의 올리고머는 이러한 3가지 형태로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 특정 올리고머 실시예에서, 적어도 하나의 상기 뉴클레오시드 유사체는 2'-MOE-리보스 당을 포함하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 뉴클레오시드 유사체와 같은, 2'-MOE-리보스 당을 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체는 2'-플루오로-DNA 뉴클레오티드 당을 포함하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 뉴클레오시드 유사체와 같은, 2'-플루오로-디옥시리보스 당을 포함한다.
다양한 실시예에서, 본 발명에 따른 올리고머는 3 - 7 또는 4 내지 8 LNA 모노머, 또는 3, 4, 5, 6 또는 7 LNA 모노머와 같은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 LNA 모노머와 같은, 적어도 하나의 잠금핵산(LNA) 모노머를 포함한다. 다양한 실시예에서, 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA 모노머이다. 특정 실시예에서, 올리고머는 베타-D-옥시-LNA 모노머, 및 하나 또는 그 이상의 하기 LNA 모노머: 베타-D 또는 알파-L의 구성 또는 이의 조합 중 어느 하나의 티오-LNA 모노머, 아미노-LNA 모노머, 옥시-LNA 모노머, 및/또는 ENA 모노머를 포함할 수 있다. 다양한 실시태양에 있어서 모든 LNA 시토신 유닛은 5'메틸-시토신(5'methyl-Cytosine)이다. 특정 실시예에서, 올리고머에 모든 LNA 모노머의 시토신 염기 부분은 5-메틸시토신(5-methylcytosines)이다. 본 발명의 특정 실시예에서, 올리고머는 LNA 및 DNA 모두를 포함한다. 전형적으로, LNA 및 DNA 모노머의 조합된 전체는 10 - 25, 바람직하게는 10 - 24, 바람직하게는 10 - 20, 바람직하게는 10 - 18, 더욱 바람직하게는 12 - 16이다. 본 발명의 일부 실시예에서, 올리고머 또는 이의 부위는 적어도 하나의 LNA 모노머, 및 나머지 모노머는 DNA 모노머로 구성된다. 특정 실시예에서, 올리고머는 선택적으로 포스포로티오에이트(phosphorothioate)와 같은 변형된 연결기(linkage group)를 갖는 오직 LNA 모노머 및 뉴클레오시드 (RNA 또는 DNA, 가장 바람직하게는 DNA 모노머와 같은)를 포함한다.
다양한 실시예에서, 올리고머에 존재하는 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체는 5-메틸시토신(5-methylcytosine), 이소시토신(isocytosine), 슈도이소시토신(pseudoisocytosine), 5-브로모우라실(5-bromouracil), 5-프로피닐우라실(5-propynyluracil), 6-아미노퓨린(6-aminopurine), 2-아미노퓨린(2-aminopurine), 이노신(inosine), 디아미노퓨린(diaminopurine), 및 2-클로로-6-아미노퓨린(2-chloro-6-aminopurine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 변형된 염기를 가진다.
LNA
용어 "LNA" 또는 "LNA 모노머"는 잠금핵산(Locked Nucleic Acid)으로 알려진, 두 고리의 뉴클레오시드 유사체를 나타낸다. "LNA 올리고뉴클레오티드"의 문맥에서 사용되는 경우, LNA는 하나 또는 그 이상의 이런 두 고리의 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. LNA 뉴클레오시드는 두 고리의 시스템을 형성하기 위해 리보스 당의 C2' 및 C4' 사이에 - 예를 들면, 하기 기재된 바와 같은 R4 * 및 R2 * 기 사이에, 연결기(가교와 같은)의 존재에 의해 특정된다
본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물 (올리고머)에 사용되는 LNA는 일반적인 화학식 I의 구조를 가지는 것이 바람직하다
Figure pct00002
화학식 I
여기서 모든 키랄 중심(chiral centers)을 위해, 비대칭기(asymmetric groups)는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다;
여기서 X는 -O-, -S-, -N(RN *)-, -C(R6R6 *)-으로부터 선택되는 것이고, 바람직하게 -O-이다;
B는 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -4 알콕시(alkoxy), 선택적으로 치환된 C1 -4 알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C1 -4 아실옥시(acyloxy), 자연적으로 발생하는 것을 포함하는 뉴클레오염기 및 뉴클레오염기 유사체, DNA 인터칼레이터(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 선택되는 것이고, B는 뉴클레오염기 또는 뉴클레오염기 유사체이다;
P는 인터뉴클레오티드 연결, 또는 치환된 R5를 선택적으로 포함하거나 치환된 R5 *를 동일하게 적용가능한 5'-말단기와 같은, 인접한 모노머에 대한 인터뉴클레오티드 연결, 또는 5'-말단기를 나타낸다;
P*은 인접한 모노머에 대한 인터뉴클레오티드 연결, 또는 3'-말단기를 나타낸다;
R4 * 및 R2 *은 각각 모두 예를 들면, C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 >C=Z로부터 각 독립적으로 선택되는 1 - 4 그룹/원자로 구성되는 이가라디칼(biradical)과 같은 이가 연결기를 형성하며, 여기서 Z는 -O-, -S-, 및 -N(Ra)-로부터 선택되는 것이고, Ra 및 Rb는 각각 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2 -12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2 -12 알키닐(alkynyl), 하이드록시(hydroxy), C1 -12-알콕시(alkoxy), C2 -12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2 -12-알케닐옥시(alkenyloxy), 카복시(carboxy), C1 -12-알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1 -12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino}, 카르바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐{amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, C1 -6-알킬-카보닐아미노(C1 -6-alkyl-carbonylamino), 카바미노(carbamido), C1 -6-알카노일옥시(C1 -6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1 -6-알킬설포닐옥시(C1 -6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오(C1 -6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 인터칼레이터, 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 독립적으로 선택되는 것이며, 여기서 각 아릴(aryl) 및 헤테로아릴(heteroaryl)은 선택적으로 치환되고 두 이중의 치환기 Ra 및 Rb는 모두 선택적으로 치환된 메틸렌(=CH2)을 형성할 수 있으며, 여기서 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다.
각각의 치환기 R1 *, R2, R3, R5, R5 *, R6 및 R6 *는 각각 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2 -12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2 -12 알키닐(alkynyl), 하이드옥시(hydroxy), C1 -12-알콕시(alkoxy), C2 -12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2 -12-알케닐옥시(alkenyloxy), 카르복시(carboxy), C1 -12-(알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1 -12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1-6-alkyl)amino}, 카르바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{amino-C1-6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, C1 -6-알킬-카보닐아미노(C1 -6-alkyl-carbonylamino), 카르바미노(carbamido), C1 -6-알카노일옥시(C1 -6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1 -6-알킬설포닐옥시(C1 -6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오(C1 -6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 삽입물질(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands), 여기서 각 아릴(aryl) 및 헤테로아릴(heteroaryl)은 선택적으로 치환되고 두 이중의 치환기 모두는 옥소(oxo), 티옥소(thioxo), 이미노(imino), 또는 선택적으로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있으며; 여기서 RN은 수소 및 C1 -4 알킬(alkyl)로부터 선택되고, 여기서 두 인접한(비-이중의) 치환기는 이중 결합에 따르는 추가적인 결합을 나타낼 수 있으며; 이의 염기성염(basic salts) 및 산부가염(acid addition salts)으로부터 독립적으로 선택된다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다.
본 발명에서 사용된 정의가 치환된 C1 -4-알킬, 치환된 C1 -6 알킬, 치환된 C1 -12-알킬, 치환된 C2 -12-알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -12-알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, 치환된 C1 -12-알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -4-알콕시, 치환된 C1 -4-아실옥시, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 치환된 메틸렌, 치환된 아실, 치환된 C1 -6 아미노알킬 또는 치환된 아마이드인 경우, 적절한 치환기는 하나 또는 그 이상의 Rg 기를 포함하고, 여기서 각 Rg는 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, CN, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, COOJ1, C(=X)J1, C(=X)NJ1J2, CN, O-C(=O)NJ1J2, O-C(=X)J1, NJ1C(=NH)NJ1J2 및 NJ1C(=X)NJ1J2로부터 독립적으로 선택되는 것이며, 여기서 X는 O 또는 S이고; J1 및 J2 각각은 H, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2-6 알키닐, C1 -6 아미노알킬, 치환된 C1 -6 아미노알킬 및 보호기(protecting group)로부터 독립적으로 선택되는 것이다. 적절한 보호기는 heodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)에 의해 "유기합성에서 보호시"에 기재되어 있다.
일부 실시예에서, 연결기를 형성하는 R4 * 및 R2 * 모두는 C(RaRb)-C(RaRb)-, C(RaRb)-O-, C(RaRb)-NRa-, C(RaRb)-S-, 및 C(RaRb)-C(RaRb)-O-로부터 선택되고, 여기서 여기서 Ra 및 Rb는 하기 정의된 바와 같다. 일부 실시예에서, Ra 및 Rb는 각각 수소 및 C1 - 6알킬로부터 독랍적으로 선택되는 것이고, 이는 각각 수소 및 메틸로부터 독랍적으로 선택되는 것이 더 바람직하다.
일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 각각 수소, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬, 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택된 것이다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다.
일부 바람직한 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 모두 수소이다.
일부 바람직한 실시예에서, R1 *, R2, R3는 각각 수소, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬, 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택된 것이다.
일부 바람직한 실시예에서, R1 *, R2, R3는 모두 수소이다.
일부 실시예에서, R5 및 R5 *는 각각 H, -CH3, -CH2-CH3,- CH2-O-CH3, 및 -CH=CH2로부터 독립적으로 선택되는 것이다. 바람직하게, 일부 실시예에서, R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 수소이고, 나머지 기(R5 또는 R5* 각각)은 C1 -5 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C1 -6 알킬, 치환된 C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알키닐 및 치환된 아실 (-C(=O)-)로부터 선택되는 것이고; 여기서 각 치환된 기는 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, COOJ1, CN, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 및 N(H)C(=X)N(H)J2로부터 독립적으로 선택된 치환기로, 모노 또는 폴리 치환된 것이며; 여기서 X는 O 또는 S이고, J1 및 J2 각각은 H, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 아미노알킬, 치환된 C1 -6 아미노알킬 및 보호기(protecting group)로부터 독립적으로 선택되는 것이다. 일부 실시예에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 치환된 C1 -6 알킬이다. 일부 실시예에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 치환된 메틸렌이고, 여기서 바람직한 치환기는 F, NJ1J2, N3, CN, OJ1, SJ1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 및 N(H)C(O)N(H)J2로부터 독립적으로 선택되는 하나 또는 그 이상의 기를 포함한다. 일부 실시예에서 각 J1 및 J2는 독립적으로 H 또는 C1 -6 알킬이다. 일부 실시예에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 메틸, 에틸 또는 메톡시메틸이다. 일부 실시예에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 에틸레닐(ethylenyl)이다. 일부 실시예에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 치환된 아실이다. 일부 실시예에서 R5 또는 R5 * 중 어느 하나는 C(=O)NJ1J2이다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다. 상기 5' 변형된 두 고리의 부분의 예로는, 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합되는, WO 2007/134181에 기재되어 있다.
일부 실시예에서 B는 퓨린 또는 피리미딘, 또는 치환된 퓨린 또는 치환된 피리미딘과 같은, 뉴클레오염기 유사체 및 자연적으로 발생하는 뉴클레오염기, 또는 아데닌, 시토신, 티민, 아데닌, 유라실로부터 선택되는 뉴클레오염기, 및/또는 5-티아졸로-유라실(5-thiazolo-uracil), 2-티오-유리실(2-thio-uracil), 5-프로피닐-유라실(5-propynyl-uracil), 2'티오-티민(2'thio-thymine), 5-메틸-시토신(5-methyl cytosine), 5-티오놀로-시토신(5-thiozolo-cytosine), 5-프로피닐-시토신(5-propynyl-cytosine) 및 2,6-디아미노퓨린(2,6-diaminopurine)과 같은, 변형되거나 치환된 뉴클레오염기를 포함하는, 뉴클레오염기이다.
일부 실시예에서 R4 * 및 R2 *는 모두 -C(RaRb)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-, -C(RaRb)-O-C(RcRd)-, -C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-, C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-N(Rc)-, -C(RaRb)-C(RcRd)- N(Re)-, -C(RaRb)-N(Rc)-O-, -C(RaRb)-S- 및 -C(RaRb)-C(RcRd)-S-로부터 선택되는 연결기를 형성하고, 여기서 Ra, Rb, Rc, Rd, Re, 및 Rf는 각각 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2 -12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2 -12 알키닐(alkynyl), 하이드록시(hydroxy), C1 -12-알콕시(alkoxy), C2 -12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2 -12-알케닐옥시(alkenyloxy), 카복시(carboxy), C1 -12-알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1 -12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino}, 카르바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, C1 -6-알킬-카보닐아미노(C1 -6-alkyl-carbonylamino), 카바미노(carbamido), C1 -6-알카노일옥시(C1 -6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1 -6-알킬설포닐옥시(C1 -6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오(C1 -6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 인터칼레이터, 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 선택적으로 치환되고, 여기서 두 이중의 치환기 Ra 및 Rb는 모두 선택적으로 치환된 메틸렌(=CH2)을 나타낼 수 있다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다.
일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-N(CH3)-, -CH2-CH2-O-, -CH2-CH(CH3)-, -CH2-CH2-S-, -CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -CH2-CH2-CH(CH3)-, -CH=CH-CH2-, -CH2-O-CH2-O-, -CH2-NH-O-, -CH2-N(CH3)-O-, -CH2-O-CH2-, -CH(CH3)-O-, -CH(CH2-O-CH3)-O-, -CH2-CH2- 및 -CH=CH-로부터 선택되는 연결기를 나타낸다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다.
일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 연결기 C(RaRb)-N(Rc)-O-를 형성하고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택되는 것이고, 보다 바람직하게 Ra 및 Rb는 수소이며; 및 여기서 Rc는 수소, 할로겐, C1-6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 선택된 것이며, 보다 바람직하게 Rc는 수소이다.
일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 연결기 C(RaRb)-O-C(RcRd) -O-를 형성하고, 여기서 Ra, Rb, Rc, 및 Rd는 각각 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택되는 것이고, 보다 바람직하게 Ra, Rb, Rc, 및 Rd는 수소이다.
일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 연결기 -CH(Z)-O-를 형성하고, 여기서 Z는 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올 및 치환된 티올로부터 선택되는 것이고; 여기서 각각의 치환기는 할로겐, oxo, hydroxyl, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN로부터 독립적으로 선택된 선택적으로 보호된 치환기로 독립적으로 모노 또는 폴리 치환된 것이며, 여기서 J1, J2 및 J3는 독립적으로 H 또는 C1 -6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다. 일부 실시예에서, Z는 C1 -6 알킬 또는 치환된 C1 -6 알킬이다. 일부 실시예에서 Z는 메틸이다. 일부 실시예에서 Z는 치환된 C1 -6 알킬이다. 일부 실시예에서 상기 치환기는 C1 -6 알콕시이다. 일부 실시예에서 Z는 CH3OCH2-이다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다. 이런 두 고리의 뉴클레오시드의 예로는 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합되는 US 7,399,845에 기재되어 있다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 모두 수소이다. 일부 실시예에서, 상기 및 WO 2007/134181에 나타낸 바와 같이, R1 *, R2, R3 *는 수소이고, R5, R5 * 중 어느 하나 도는 둘 모두는 수소와 다를 수 있다.
일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 치환된 아미노기를 포함하는 연결기를 형성하고, 예를 들면, R4 * 및 R2 *는 모두 기 -CH2-N(Rc)-로 구성되거나 포함하며, 여기서 Rc는 C1 - 12 알킬옥시이다. 일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 연결기 -Cq3q4-NOR-를 형성하고, 여기서 q3 q4는 각각 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택되는 것이고; 여기서 각 치환기는 할로겐, OJ1, SJ1, NJ1J2, COOJ1, CN, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)N J1J2 및 N(H)C(=X=N(H)J2로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 모노 또는 폴리 치환된 것이며, 여기서 X는 O 또는 S이고; 및 여기서 J1 및 J2는 각각 H, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C1 -6 아미노알킬 및 보호시로부터 독립적으로 선택된다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다. 이런 두 고리의 뉴클레오티드의 예로는 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합되는 WO2008/150729에 기재되어 있다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 각각 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택되는 것이다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 모두 수소이다. 일부 실시예에서, 상기 및 WO 2007/134181에 기재된 바와 같이, R1 *, R2, R3는 모두 수소이고, R5, R5 * 중 어느 하나 또는 둘 모두는 수소와 다른 것일 수 있다. 일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 모두 연결기 C(RaRb)-O-를 형성하고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕시, 치환된 C1-C12 알콕시, OJ1 SJ1, SOJ1, SO2J1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)NJ1J2, C(=O)J1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 및 N(H)C(=S)NJ1J2로부터 선택된 것이고; 또는 Ra 및 Rb는 모두 =C(q3)(q4)이며; q3 및 q4는 각각 H, 할로겐, C1-C12 알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이고; 각 치환기는 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2- C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C2-C6 알키닐, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)NJ1J2, C(=O)J1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 및 N(H)C(=S)NJ1J2로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 모노 또는 폴리 치환된 것이며; J1 및 J2는 각각 H, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 아미노알킬, 치환된 C1 -6 아미노알킬 및 보호기로부터 독립적으로 선택된 것이다. 이런 화합물은 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합되는 WO2009/006478에 기재된다.
일부 실시예에서, R4 * 및 R2 *는 연결기 -Q-를 형성하고, 여기서 Q는 C(q1)(q2)C(q3)(q4), C(q1)=C(q3), C[=C(q1)(q2)]-C(q3)(q4) 또는 C(q1)(q2)-C[=C(q3)(q4)]이고; q1, q2, q3, q4는 각각 H, 할로겐, C1 -12 알킬, 치환된 C1 -12 alkyl, C2-12 알케닐, 치환된 C1 -12 알콕시, OJ1, SJ1, SOJ1, SO2J1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)-NJ1J2, C(=O) J1, -C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 및 N(H)C(=S)NJ1J2로부터 독립적으로 선택되며; J1 및 J2는 각각 H, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C1 -6 아미노알킬 및 보호기로부터 독립적으로 선택되는 것이고; 및 선택적으로 여기서 Q는 C(q1)(q2)(q3)(q4)이고 q3 또는 q4 중 어느 하나는 CH3이며 q3 또는 q4 중 적어도 다른 하나 또는 q1 및 q2 중 하나는 H와 다른 것이다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 모두 수소이다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다. 이런 두 고리의 뉴클레오티드의 예로는 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합되는 WO2008/154401에 기재되어 있다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 각각 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, 치환된 C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 치환된 C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 치환된 C2 -6 알키닐, C1 -6 알콕시, 치환된 C1 -6 알콕시, 아실, 치환된 아실, C1 -6 아미노알킬 및 치환된 C1 -6 아미노알킬로부터 독립적으로 선택되는 것이다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3, R5, R5 *는 모두 수소이다. 일부 실시예에서, R1 *, R2, R3는 모두 수소이고 R5, R5 * 중 어느 하나 또는 둘 모두는 상기 및 WO 2007/134181 또는 WO2009/067647에 나타낸 바와 같이 수소와 다른 것일 수 있다 {알파-L-두 고리 핵산 유사체(alpha-L-bicyclic nucleic acids analogs)}.
일부 바람직한 실시예에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물에 존재하는 LNA 모노머는 바람직하게 일반적인 화학식 II의 구조를 가진다:
Figure pct00003
화학식 II
여기서 Y는 -O-, -CH2O-, -S-, -NH-, N(Re) 및 CH2-로부터 선택되는 것이고; Z 및 Z*는 인터뉴클레오티드 연결, RH, 말단기 및 보호기로부터 독립적으로 선택되는 것이며; B는 자연적 또는 비자연적 뉴클레오염기 부분 (뉴클레오염기)를 구성하고, RH는 수소 및 C1 -4-알킬로부터 선택되며; Ra, Rb Rc, Rd 및 Re는 각각 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2 -12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2 -12 알키닐(alkynyl), 하이드옥시(hydroxy), C1 -12-알콕시(alkoxy), C2 -12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2 -12-알케닐옥시(alkenyloxy), 카르복시(carboxy), C1 -12-(알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1 -12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino}, 카르바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1-6-alkyl)amino-C1-6-alkyl-aminocarbonyl}, C1 -6-알킬-카보닐아미노(C1 -6-alkyl-carbonylamino), 카르바미노(carbamido), C1 -6-알카노일옥시(C1 -6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1 -6-알킬설포닐옥시(C1 -6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오(C1 -6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 삽입물질(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands), 여기서 각 아릴(aryl) 및 헤테로아릴(heteroaryl)은 선택적으로 치환되고, 여기서 두 이중의 치환기 Ra 및 Rb 모두는 선택적으로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있으며; 여기서 RN은 수소 및 C1 -4 알킬(alkyl)로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시예에서 Ra, Rb Rc, Rd 및 Re는 각각 수소 및 C1 -6 알킬(alkyl)로부터 독립적으로 선택되고, 더욱 바람직하게 메틸이다. 모든 키랄 중심을 위해, 비대칭기는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있으며, 예를 들면, 두 예시적인 입체화학적 이성질체는 베타-D 및 알파-L 아형을 포함하며, 이는 하기와 같이 기재될 수 있다:
Figure pct00004
구체적인 예시적 LNA 유닛은 하기에 보여진다 (도식 2에서):
Figure pct00005
Figure pct00006
도식 2
용어 "티오(thio)-LNA"는 상기 일반적인 화학식에서 Y가 S 또는 -CH2-S-로부터 선택되는 잠금 뉴클레오시드를 포함한다. 티오-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 모두에 있을 수 있다.
용어 "아미노(amino)-LNA"는 상기 일반적인 화학식에서 Y가 -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, 및 -CH2-N(R)-로부터 선택되는 잠금 뉴클레오시드를 포함하고, 여기서 R은 수소 및 C1 -4-알킬(alkyl)로부터 선택된다. 아미노-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 모두에 있을 수 있다.
용어 "옥시(oxy)-LNA는 상기 일반적인 화학식에서 Y가 -O-로 나타내는 잠금 뉴클레오시드를 포함한다. 옥시-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 모두에 있을 수 있다.
용어 "ENA"는 상기 일반적인 화학식에서 Y가 -CH2-O-(-CH2-O-의 산소 원자는 염기 B에 관하여 2'-위치에 접합된)인 잠금 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 예시적인 실시예에서 LNA는 베타-D-옥시-LNA(beta-D-oxy-LNA), 알파-L-옥시-LNA(alpha-L-oxy-LNA), 베타-D-아미노-LNA(beta-D-amino-LNA) 및 베타-D-티오-LNA(beta-D-thio-LNA)로부터 선택되는 것이고, 특히 베타-D-옥시-LNA(beta-D-oxy-LNA)이다.
리보핵산분해효소 H 수집( RNAse H recruitment )
일부 실시예에서, 올리고머는 번역, 또는 다른 기작의 입체적 방해와 같은, 표적 mRNA의 비-리보핵산분해효소(non-RNase) 매개 분해를 통하여 기능한다; 그러나, 다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 리보핵산분해효소 H(RNase H)와 같은, 엔도-리보핵산분해효소(RNase)와 같은, 하나 또는 그 이상의 RNAse 효소 또는 복합체를 선별할 수 있다.
전형적으로, 올리고머는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 연속적인 모노머를 포함하는, 적어도 8 또는 적어도 9 연속적인 모노머와 같은, 적어도 7 연속적인 모노머와 같은, 적어도 6 부위를 포함하고, 이는 표적 RNA의 표적 부위와 듀플렉스(duplex)를 형성하는 경우, RNase를 수집할 수 있다. RNase를 수집할 수 있는 올리고머의 부위는 본 발명에 기재된 갭머(gapmer)의 문맥에서 나타낸 바와 같은, 부위 B일 수 있다. 일부 실시예에서, 부위 B와 같은, RNase를 수집할 수 있는 올리고머의 부위는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 모노머로 구성된다.
EP 1 222 309는 시험관 내(in vitro)에서 RNase H 활성을 결정하는 방법을 제공하고, 이는 RNase H를 수집하는 본 발명의 올리고머의 활성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 올리고머는 RNA 표적의 상보적인 부위와 접촉되는 경우, RNase H를 수집할 수 있는 것으로 여겨지고, 본 발명에 참조로서 통합되는 EP 1 222 309의 실시예에 의해 제공되는 방법을 이용하여, 2' 치환기를 가지지 않고, 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 모노머들 사이에 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 연결기(linkage groups)를 갖는, DNA 모노머들만을 포함하는 동일한 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 결정되는 초기속도(initial rate)는, 적어도 10% 또는 20% 이상과 같은, 적어도 5%와 같은, 적어도 1%와 같은, pmol/ℓ/min으로 측정되는 바와 같은, 초기 속도를 갖는다.
일부 실시예에서, 올리고머는 RNA 표적의 상보적인 표적 부위를 RNaseH와 접촉시키는 경우, RNase H를 수집할 수 있는 것으로 여겨지고, pmol/ℓ/min로 측정되는 RNaseH 초기속도는, EP 1 222 309의 실시예 91 ~ 95에 의해 제공되는 방법을 이용하여, 2' 치환기를 가지지 않고, 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 모노머들 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖는, DNA 모노머들만을 포함하는 동일한 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 결정되는 바와 같은, 적어도 10% 이하 또는 20% 이하와 같은, 적어도 5% 이하와 같은, 적어도 1% 이하이다.
다른 실시예에서, 올리고머는 RNA 표적의 상보적인 표적 부위를 RNaseH와 접촉시키는 경우, RNase H를 수집할 수 있는 것으로 여겨지고, pmol/ℓ/min로 측정되는 RNaseH 초기속도는, EP 1 222 309의 실시예 91 ~ 95에 의해 제공되는 방법을 이용하여, 2' 치환기를 가지지 않고, 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 모노머들 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖는, DNA 모노머들만을 포함하는 동일한 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 결정되는 바와 같은, 적어도 80%와 같은, 적어도 60%와 같은, 적어도 40%와 같은, 적어도 20%이다.
전형적으로, 표적 RNA의 상보적인 표적 부위와 듀플렉스를 형성하고 RNase를 수집할 수 있는, 올리고머의 부위는 DNA 모노머 및 선택적으로 LNA 모노머를 포함하고, 표적 부위와 DNA/RNA-유사 듀플렉스를 형성한다. LNA 모노머는 바람직하게 알파-L-배열(alpha-L configuration)에 있고, 특히 바람직하게 알파-L-옥시-LNA(alpha-L-oxy LNA)일 수 있다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 유사체 모두를 포함하고, 갭머(gapmer), 헤드머(headmer) 또는 믹스머(mixmer)의 형태일 수 있다.
"헤드머(headmer)"는 부위 X의 3'-대부분의 모노머에 연결된 부위 Y의 5'-대부분의 모노머를 갖는, 부위 X 및 이에 연속적인 부위 Y를 포함하는 올리고머로 정의된다. 부위 X는 비-RNase를 수집하는 뉴클레오시드 유사체의 연속적인 신장을 포함하고 부위 Y는 RNase에 의해 인식 및 절단되는 DNA 모노머 또는 뉴클레오시드 유사체 모노머 (적어도 7 연속적인 모노머)의 연속적인 신장를 포함한다.
"테일머(tailmer)"는 부위 X의 3'-대부분의 모노머에 연결된 부위 Y의 5'-대부분의 모노머를 갖는, 부위 X 및 이에 연속적인 부위 Y를 포함하는 올리고머로 정의된다. 부위 X는 RNase에 의해 인식 및 절단되는 DNA 모노머 또는 뉴클레오시드 유사체 모노머 (적어도 7 연속적인 모노머)의 연속적인 신장를 포함하고, 부위 Y는 비-RNase를 수집하는 뉴클레오시드 유사체의 연속적인 신장을 포함한다.
그 외 "키메릭(chemeric)" 올리고머는 (i) RNase에 의해 인식 및 절단되는 DNA 모노머 또는 변형된 뉴클레오시드 유사체 모노머, 및 (ii) 비-RNase를 수집하는 뉴클레오시드 유사체 모노머의 대체 조성물로 구성되는 "믹스머(mixmers)"라고 불린다.
일부 실시예에서, 표적 부위에 대한 올리고머의 친화성을 증진시키는 것에 더하여, 일부 뉴클레오티드 유사체는 RNase (예를 들면, RNase H) 결합 및 절단을 매개한다. α-L-LNA 모노머가 특정 확장에 대해 RNase 활성을 수집하기 때문에, 일부 실시예에서, α-L-LNA 모노머를 포함하는 올리고머의 갭머 부위 (예를 들면, 본 발명에 언급된 부위 B)는 RNaseH에 의해 인식 및 절단되는 몇몇의 모노머로 구성되고, 믹스머 컨스트럭션(construction)에 더욱 높은 유연성이 도입된다.
결합체( Conjugates )
본 발명의 문맥에서, 용어 "결합체"는 핵산 또는 모노머 ("접합된 부분(conjugated moieties)") 자체가 아닌 하나 또는 그 이상의 부분에 대해, 본 발명에 기재된 바와 같은 올리고머의 공유 접합("접합(conjugation)")에 의해 형성되는 화합물을 나타낸다. 이런 접합된 부분의 예로는 단백질, 지방산 사슬, 당 잔기, 당단백질, 폴리머, 또는 이의 조합을 포함한다. 전형적으로 단백질은 표적 단백질에 대한 항체일 수 있다. 전형적인 폴리머는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)일 수 있다.
따라서, 본 발명에 제공되는 것은, 본 발명에 기재된 바와 같은, 올리고머를 포함하는 결합체, 상기 올리고머에 공유적으로 접합된, 핵산 또는 모노머가 아닌 적어도 하나의 접합된 부분이다. 그러므로, 특정 실시예에서 본 발명의 올리고머는 본 발명에 기재된 바와 같은 특정된 염기의 서열을 가지는 연속적인 모노머로 구성되고, 상기 결합체는 올리고머에 공유적으로 접합된 적어도 하나의 접합된 부분을 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예서, 올리고머는 올리고머성 화합물의 세포의 흡수를 증가시키는 부분에 접합된다. WO2007/031091은 적절한 리간드 및 결합체 (부분)을 제공하고, 이는 참조로서 본 발명에 통합된다.
다양한 실시예에서, 접합 (접합된 부분에 대해)은 본 발명의 올리고머의 활성, 세포의 분배 또는 세포의 흡수를 증가시킬 수 있다. 이러한 부분은 항체, 폴리펩티드, 콜레스테롤 부분과 같은 지질 부분, 콜린산, 티오에스터(thioester), 예를 들면, 헥실-s-트리틸티올(Hexyl-s-tritylthiol), 티오콜레스테롤(thiocholesterol), 지방족 사슬(aliphatic chain), 예를 들면, 도데칸디올(dodecandiol) 또는 언데실 잔기(undecyl residues), 인지질(phospholipids), 예를 들면, 디-헥사데실-랙-글리세롤(di-hexadecyl-rac-glycerol) 또는 트리에틸암모늄 1, 2-디-o-헥사데실-랙-글리세로-3-h-포스포네이트(triethylammonium 1,2-di-o-hexadecyl-rac-glycero-3-h-phosphonate), 폴리아민(polyamine) 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(polyethylene glycol chain), 아다만탄 아세트산(adamantane acetic acid), 팔미틸 부분(palmityl moiety), 옥타데실아민(octadecylamine) 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 부분(hexylamino-carbonyl-oxycholesterol moiety)을 포함하나 이에 한정하지 아니다.
특정 실시예에서, 본 발명의 올리고머는, 예를 들면, 아스피린, 이부프로펜, 설파제, 항당뇨제, 항박테리아 또는 항생제와 같은, 활성 약제 물질에 접합될 수 있다.
특정 실시예에서 접합된 부분은 콜레스테롤과 같은, 스테롤이다.
다양한 실시예에서, 접합된 부분은, 길이에 있어서 3 - 10 아미노산 잔기와 같은, 2 - 20과 같은, 1 - 50의 양전하 펩티드와 같은, 양전하 폴리머, 및/또는 폴리에틸글리콜(polyethylglycol, PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol)과 같은 폴리알킬렌옥사이드(polyalkylene oxide)를 포함 또는 구성한다 - 본 발명에서 참조로서 통합되는 WO 2008/034123 참조. 적절하게는 폴리알킬렌옥사이드와 같은, 양전하 폴리머는 WO 2008/034123에 기재된 방출가능한 링커(linker)와 같은 링커를 통해 본 발명의 올리고머에 접합될 수 있다.
실시예 중에, 하기 부분은 본 발명의 결합체에 사용될 수 있다:
Figure pct00007
활성화된 올리고머( Activated oligomers )
본 발명에서 사용되는, 용어 "활성화된 올리고머(Activated oligomer)"는 본 발명에 기재된 결합체를 형성하기 위해, 올리고머를 하나 또는 그 이상의 접합된 부분, 즉, 핵산 또는 모노머 자체가 아닌 부분에 공유 결합할 수 있게 하는, 적어도 하나의 기능적 부분(functional moiety)에 공유적으로 결합되는 본 발명의 올리고머를 나타낸다. 전형적으로는, 기능적 부분은 예를 들면, 아데닌(adenine) 염기의 3'-하이드록실(hydroxyl)기 또는 엑소사이클릭(exocyclic) NH2기를 통해 올리고머에 공유적으로 결합할 수 있는 화학기(chemical group), 바람직하게는 친수성인 스페이서(spacer), 및 결합된 부분에 결합할 수 있는 말단기 (예를 들면, 아미노(amino), 설피드릴(sulphydryl) 또는 하이드록실(hydroxyl)기)를 포함할 것이다. 일부 실시예에서, 이런 말단기는 보호되지 않으며, 예를 들면 NH2 기이다. 다른 실시예에서, 말단기는 예를 들면, Theodora W Greene 및 Peter G M Wuts에 의한 "Protective Groups in Organic Synthesis" 3판(John Wiley & Sons, 1999)에 기재된 것과 같은 임의의 적절한 보호기에 의해 보호된다. 적절한 하이드록실 보호기의 예로는 아세테이트 에스터(acetate ester)와 같은 에스터, 벤질(benzyl), 디페닐메틸(diphenylmethyl), 또는 트리페닐메틸(triphenylmethyl)과 같은 아랄킬(aralkyl)기, 및 테트라하이드로피라닐(tetrahydropyranyl)을 포함한다. 적절한 아미노 보호기의 예로는 벤질(benzyl), 알파-메틸벤질(alpha-methylbenzyl), 디페닐메틸(diphenylmethyl), 트리페닐메틸(triphenylmethyl), 벤질옥시카보닐(benzyloxycarbonyl), 터트- 부트옥시카모닐(tert-butoxycarbonyl), 및 트리콜로아세틸(trichloroacetyl) 또는 트리플루오로아세틸(trifluoroacetyl)과 같은 아실(acyl)기를 포함한다.
일부 실시예에서, 기능적 부분은 자가절단(self-cleaving)된다. 다른 실시예에서, 기능적 부분은 생물 분해성이다. 예를 들면, 미국 특허 제 7,087,229호를 참조하고, 이는 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합된다.
일부 실시예서, 본 발명의 올리고머는 올리고머의 5' 말단에서 접합된 부분의 공유 결합을 하기 위해 5' 말단에서 활성화 (즉, 기능화)된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 3' 말단에서 기능화될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 백본(backbone)을 따라 또는 이종고리(heterocyclic) 염기 부분에서 기능화될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 5' 말단, 3' 말단, 백본 및 염기로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 위치에서 기능화될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 기능적 부분에 공유적으로 접합되는 하나 또는 그 이상의 모노머가 합성되는 동안 통합됨으로써 합성된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 기능화되지 않는 모노머로 합성되고, 상기 올리고머는 합성의 완결에 따라 기능화된다.
일부 실시예에서, 올리고머는 아미노알킬(aminoalkyl) 링커를 포함하는 방해된 에스터로 기능화되고, 여기서 알킬 부분은 화학식 (CH2)w를 갖고, 여기서 w는 1 내지 10 범위의 정수, 바람직하게는 약 6이고, 여기서 알킬아미노기의 알킬 부분은 직쇄(straight chain) 또는 분지쇄(branched chain)일 수 있으며, 여기서 기능기는 에스터기 (-O-C(O)-(CH2)wNH)를 통해 올리고머에 접합된다.
다른 실시예에서, 올리고머는 (CH2)w-설피드릴 (SH) 링커를 포함하는 방해된 에스터로 기능화되고, 여기서 w는 1 내지 10 범위의 정수, 바람직하게는 약 6이고, 여기서 알킬아미노기의 알킬 부분은 직쇄(straight chain) 또는 분지쇄(branched chain)일 수 있으며, 여기서 기능기는 에스터기(-O-C(O)-(CH2)wSH)를 통해 올리고머에 접합된다. 일부 실시예에서, 설피드릴로 활성화된 올리고뉴클레오티드는 폴리에틸렌글리콜 또는 펩티드 (다이설파이드 결합의 형성을 통해)와 같은 폴리머 부분으로 접합된다.
상기 기재된 바와 같은 방해된 에스터를 포함하는 활성화된 올리고머는 당업계에 공지된 임의의 방법, 및 특히, PCT 출원번호 WO 2008/034122 및 이의 실시예에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있고, 이는 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합된다.
적어도 하나의 기능적 부분에 공유적으로 연결된 활성화된 올리고머는 당업계에 공지된 임의의 방법, 및 특히, 미국 출원번호 2004/0235773, 이는 그 전체가 본 발명에 참조로서 통합되고, Zhao et al . (2007) J. Controlled Release 119:143-152; 및 Zhao et al . (2005) Bioconjugate Chem. 16:758-766에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 미국 특허번호 4,962,029 및 4,914,210에 기재된 것과 같이 실질적으로 기능화 시약(reagent), 즉, 보호된 또는 비보호된 설피드릴, 아미노 또는 하이드록실기를 포함하는 반대편 말단에 친수성 스페이서(spacer) 사슬을 통해 연결된 하나의 말단에 포스포라미다이트(phosphoramidite)를 갖는 사실상 선형 시약의 수단으로 설피드릴, 아미노 또는 하이드록실기의 올리고머로의 도입을 통해 기능화된다. 이러한 시약은 일차적으로 올리고머의 하이드록실기와 반응한다. 일부 실시예에서, 이러한 활성화된 올리고머는 올리고머의 5'-하이드록실기에 결합되는 기능화 시약을 가진다. 다른 실시예에서, 활성화된 올리고머는 3'-하이드록실기에 결합하는 기능화 시약을 가진다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 올리고머의 백본에 있는 하이드록실기에 결합되는 기능화 시약을 가진다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머는, 그 전체에 있어서 본 발명에 참조로서 통합되는 미국 특허번호 4,962,029 및 4,914,210에 기재된 바와 같은, 하나 이상의 기능화 시약으로 기능화된다. 이러한 기능화 시약 및 모노머 또는 올리고머로의 통합의 합성 방법은 미국 특허번호 4,962,029 및 4,914,210에 기재되어 있다.
일부 실시예에서, 고체상 결합(solid-phase bound) 올리고머의 5'-말단은, 비보호된 올리고머와 예를 들면, Diels-Alder Cycloaddition reaction을 통한 아미노산 또는 펩티드의 접합에 의한, 디에닐 포스포라미다이트(dienyl phosphoramidite) 유도체로 기능화된다.
다양한 실시예에서, 2'-카바메이트(carbamate) 치환된 당 또는 2'-(O-펜틸-N-프탈리미도)-디옥시리보오스{2'-(O-pentyl-N-phthalimido)-deoxyribose}당과 같은, 2'-당 변이체를 포함하는 모노머의 올리고머로의 통합은 올리고머의 당에 접합된 부분의 공유 접합을 촉진한다. 다른 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 모노머의 2'-부분에 아미노를 포함하는 링커를 갖는 올리고머는, 예를 들면, 5'-디메톡시트리틸-2'-O-(e-프탈리미딜아미노펜틸)-2'-디옥시아데노신-3'-N,N-디이소프로필-시아노에톡시 포스포라미다이트{5'-dimethoxytrityl-2'-O-(e-phthalimidylaminopentyl)-2'-deoxyadenosine-3'--N,N-diisopropyl-cyanoethoxy phosphoramidite}와 같은, 시약을 이용하여 제조된다. 예를 들어, Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171을 참조해라.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 N6 퓨린(purine) 아미노기, 구아닌(guanine)의 엑소사이클릭 N2, 또는 시토신(cytosine)의 N4 또는 5 부분에 포함된, 뉴클레오염기에 아민(amine)을 포함하는 기능 부분을 가진다. 다양한 실시예에서, 이러한 기능화는 올리고머 합성에서 이미 기능화된 상업적인 시약을 이용하여 수득할 수 있다.
일부 기능적 부분은 상업적으로 이용가능하고, 예를 들면, 헤테로이중기능성 및 호모이중기능성 연결 부분은 Pierce Co.(Rockford, IⅡ)로부터 이용 가능하다. 다른 상업적으로 이용가능한 연결기는 5'-아미노-개질제(modifier) C6 및 3'-아미노-개질제 시약이고, 이들은 모두 Glen Research Corporation (Sterling, Va.)으로부터 이용가능하다. 5'-아미노-개질제 C6은 또한 Aminolink-2로서 ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.)로부터 이용가능하고, 3'-아미노-개질제는 또한 Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.)로부터 이용가능하다.
조성물( Compositions )
본 발명의 올리고머는 약학적 제형 및 조성물에 사용된다. 적절하게, 이러한 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함한다. WO2007/031091은 적절하고 바람직한 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및 보조제를 제공하고, 이는 참조로서 본 발명에 통합된다. 적절한 투여량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 형태, 다른 치료제와의 조합, 전구약물(pro-drug) 제형은 또한 WO2007/031091에서 제공되고, 이는 또한 참조로서 본 발명에 통합된다. 제형 및 투여에 관한 기술에 대한 상세한 설명은 또한 "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES" (Maack Publishing Co, Easton Pa.)의 최신판에서 발견될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 세포 막을 통과하는 올리고머의 전달에 도움을 주기 위해 접합된 부분에 공유적으로 연결된 것이다. 세포 막을 통과하는 올리고머의 전달에 도움을 주는 접합된 부분의 예로는 콜레스테롤과 같은 친유성 부분(lipophilic moiety)이다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 Invitrogen으로부터 상업적으로 이용가능한 Lipofectamine 2000 또는 Lipofectamine RNAiMAX와 같은, 리포좀을 형성하는 지질 제형으로 제형화된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 올리고머는 하나 이상의 지질 유사 비-자연적으로 발생하는 작은 분자 ("리피도이드(lipidoid)")의 혼합물로 제형화된다. 리피도이드의 라이브러리는 기존의 합성 화학법에 의해 합성화될 수 있고 리피도이드의 다양한 양 및 조합은 선택된 투여 경로에 의해 표적 조직에 특정 크기의 올리고머의 효율적인 전달을 위한 담체를 개발하기 위해 분석될 수 있다. 적절한 리피도이드 라이브러리 및 조성물은, 예를 들면 http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/abs/nbt1402.html에서 이용가능한 Akinc et al . (2008) Nature Biotechnol.에서 발견될 수 있으며, 이는 참조로서 본 발명에 통합된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 본 발명에서 나타낸 올리고머의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 원하지 않는 독성 효과의 허용가능한 수준을 보이는 염을 나타낸다. 이러한 염의 비-한정적인 예로는 아연(zinc), 칼슘(calcium), 비스무트(bismuth), 바륨(barium), 마그네슘(magnesium), 알루미늄(aluminum), 구리(copper), 코발트(cobalt), 니켈(nickel), 카드뮴(cadmium), 나트륨(sodium), 칼륨(potassium) 등과 같은 금속 양이온으로 형성된 유기 아미노산 및 염기 추가 염으로; 암모니아, N,N'-디벤질에틸렌-디아민(N,N'-dibenzylethylene-diamine), D-글루코사민(D-glucosamine), 테트라에틸암모늄(tetraethylammonium), 또는 에티렌디아민(ethylenediamine)으로부터 형성된 양이온으로; 또는 (a) 및 (b)의 (c) 조합; 예를 들면, 아연 타닌산염 또는 이와 같은 것으로부터 형성될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 암(cancer), 근병증(myopathies) 및/또는 천식(asthma)의 치료에 유용한 활성제를 포함하는, 본 발명의 올리고머 또는 결합체에 추가로 다른 활성 성분을 포함한다.
일부 실시예에서, 추가적인 활성 성분은 도스탁셀(docetaxel), 빈크리스틴(vincristine), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 트레일(TRAIL), 이리노테칸(irinotecan), 17-AAG, 플라틴(platin) 화합물, 및 방사선 조사(irradiation)로 구성된 군으로부터 선택된 것이다.
일부 실시예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 조성물, 및 추가적인 활성 성분 (예를 들면, 도스탁셀)을 투여하는 단계를 포함하는 치료법이라는 특징이 있는 결합된 치료법을 제공하고, 이는 특정 실시예에서 본 발명의 약학적 조성물의 투여 이전, 투여 동안 또는 투여에 이어서 투여된다.
본 발명은 또한 첫 번째 부분이 본 발명에 따른 적어도 하나의 올리고머, 결합체 및/또는 약학적 조성물을 포함하고, 추가적인 부분이 암(cancer), 근병증(myopathies) 및/또는 천식(asthma)의 치료에 유용한 하나 이상의 활성 성분 (예를 들면, 도스탁셀)을 포함하는, 부분들의 키트를 제공한다. 그러므로, 본 발명에 나타낸 바와 같이, 부분들의 키트는 치료 방법에서 사용될 수 있는 것으로 고려되며, 여기서 방법은 첫 번째 부분 및 추가적인 부분 모두, 동시적으로 또는 순서대로 중 어느 하나로 투여되는 것을 포함한다.
적용( Application )
본 발명에서 사용된 용어 "치료"는 기존의 질환 (예를 들면, 하기 본 발명에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애) 또는 질환의 방지, 즉, 예방을 나타낸다. 그러므로, 특정 실시예에서, "치료"는 예방을 포함하는 것으로 인식될 것이다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 올리고머는, 예를 들면, 진단, 치료 및 예방을 위한 연구 시약으로서 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 이런 올리고머는 세포 및 실험적 동물에서 Hsp27 단백질의 발현을 특이적으로 억제 (전형적으로 Hsp27 mRNA를 분해 또는 억제 함으로써 단백질 형성을 막음으로써)함으로써, 치료적 중재(therapeutic intervention)를 위한 표적으로서 표적의 기능적 분석 또는 그것의 유용성의 평가를 촉진한다.
특정 실시예에서, 올리고머는 진단에 있어서 노던 블랏팅(northern blotting), 인사이츄 하이브리다이제이션(in-situ hybridization) 또는 유사한 기술에 의해 세포 또는 조직에서 Hsp27 발현을 탐지 및/또는 정량하는데 사용될 수 있다.
다양한 치료적 실시예에서, Hsp27의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 가진 것으로 의심되는 비-인간 동물 또는 인간은 본 발명에 따른 유효한 양의 올리고머를 투여함으로써 치료될 수 있다. 또한 본 발명의 치료적 또는 예방적으로 유효한 양의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 올리고머, 결합체 또는 조성물을 투여함으로써 Hsp27 발현과 관련된, 질환 또는 상태를 가지거나 가지기 쉽다고 의심되는, 인간을 치료하는 것과 같은, 포유류를 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시예에서, 본 발명은 또한 본 발명에 기재된 바와 같은 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 기재된 바와 같은 본 발명의 올리고머 또는 결합체의 용도, 또는 본 발명에 기재된 질환의 치료 방법을 제공한다.
다양한 실시예에서, 본 발명은 또한, 본 발명에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 올리고머, 및/또는 본 발명에 따른 결합체, 및/또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 이것이 필요한 동물 (이것이 필요한 환자와 같은)에 투여하는 것을 포함하는, 본 발명에 기재된 바와 같은 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
의학적 적응증( Medical Indications )
특정 치료학적 실시예에서, 치료되는 장애는 전립선암, 폐암, 백혈병, 위암, 유방암, 난소암, 방광암, 신장암, 췌장암, 다발성 골수종, 뇌종양, 섬유육종, 골육종 및 간암과 같은, 과증식성 장애 (예를 들면 암)이다. 다양한 실시예에서, 본 발명에 따른 이런 질환 또는 상태의 치료는 방사선요법, 화학요법 또는 면역치료요법과 같은, 하나 또는 그 이상의 다른 항암 치료와 조합될 수 있다.
특정 다른 실시예에서, 치료되는 장애는 근육병 및/또는 천식이다.
다양한 실시예에서, 질환 또는 장애는 Hsp27 유전자 또는 Hsp27와 관련되거나 상호작용하는 단백질 산물의 유전자의 조절과 관련된다. 그러므로, 다양한 실시예에서, 표적 mRNA는, 예를 들면 하나 또는 그 이상의 한점 돌염변이(single point mutations) 또는 3자암호반복(triplet repeat)을 포함하는, Hsp27 서열의 돌연변이된 형태이다.
다양한 실시예에서, 질환 또는 장애는 Hsp27의 비정상적인 수준과 관련된다.
본 발명에 사용된 용어 "비정상적인"은 세포에서 Hsp27 유전자가 본 발명에서 언급된 질환, 장애 또는 상태를 가지지 않는 동물의 세포에서 발현 수준에 비해 과발현 (예를 들면, 업-레귤레이트)을 나타낸다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 올리고머, 결합체 또는 조성물은 Hsp27 유전자의 과발현 (예를 들면, 업-레귤레이트)와 관련된 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 질환 또는 장애는 Hsp27의 돌연변이 형태의 비정상적인 수준과 관련된다.
본 발명에 사용된 용어 "돌연변이" 및 "돌연변이 형태"는 서열번호: 137로 나타내는 Hsp27 핵산의 변이를 나타낸다. 상기 변이는 본 발명에 기재된 바와 같은 질환, 장애 또는 상태와 관련될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명에서 사용된 용어 "변이(variant)"는 서열번호: 137에 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 첨가 및/또는 치환 및/또는 결실에 의해 다른 염기 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 일부 실시예에서, 변이는 서열번호: 137과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 상동성 (동일성)을 가진다. 일부 또는 다른 실시예에서, 변이는 서열번호: 137의 전체에서 15 이하의 추가적인 뉴클레오티드 및/또는 치환된 뉴클레오티드 및/또는 결실된 뉴클레오티드와 같은; 30 이하의 추가적인 뉴클레오티드 및/또는 치환된 뉴클레오티드 및/또는 결실된 뉴클레오티드와 같은; 60 이하의 추가적인 뉴클레오티드 및/또는 치환된 뉴클레오티드 및/또는 결실된 뉴클레오티드를 가진다.
Hsp27은 수많은 폴리펩티드의 결합 파트너이다. Hsp27은 재접힘 경로 또는 세포성 분해 경로 중 어느 하나에서 트래피킹(trafficking)을 위한 비접힘 단백질을 결합함으로써 샤페론(chaperone)으로 작용할 수 있다. Hsp27이 결합할 수 있는 폴리펩티드의 예로는 아넥신 II(annexin II), DAXX, F-액틴(F-actin), 사이토크롬 c(cytochrome c), 카스파제-3(caspase-3), Akt1, AR, IkBa, FAS 및 MDM2를 포함한다. 다양한 실시예에서, 본 발명은 Hsp27에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시예에서, 본 발명은 Hsp27에 결합할 수 있는 폴리펩티드의 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드에 대한 Hsp27의 결합은 Hsp27에 결합되는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 증가된 발현 또는 활성을 야기한다. 다른 실시예에서, 폴리펩티드에 대한 Hsp27의 결합은 Hsp27에 결합되는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 감소된 발현을 야기한다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드에 대한 Hsp27의 결합은 Hsp27에 결합되는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 증가된 활성을 야기한다. 다른 실시예에서, 폴리펩티드에 대한 Hsp27의 결합은 Hsp27에 결합되는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 감소된 활성을 야기한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 기재된 특정 및 모든 상태의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 올리고머의 용도를 제공한다.
다양한 실시예에서, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의, 하나 또는 그 이상의 LNA 모노머를 포함하는, 본 발명의 올리고머 또는 이의 결합체를 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, Hsp27 mRNA 또는 단백질의 비정상적인 수준과 관련된 상태로부터 고통받거나 이로 의심되는 포유류를 치료하는 방법을 제시한다.
본 발명의 흥미있는 측면은 상기 본 발명에 기재된 바와 같은 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위해 본 발명에 정의된 바와 같은 올리고머 (화합물) 또는 본 발명에 정의된 바와 같은 결합체의 용도를 제시한다.
다양한 실시예에서, 본 발명은 이런 치료가 필요한 비-인간 동물 또는 인간에게, 치료학적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 올리고머, 또는 이의 결합체를 투여하는 것을 포함하는, 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 LNA 올리고머, 또는 이의 결합체는 연속적으로 보다는 짧은 기간 동안 투여된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 예를 들면, 상기 올리고머의 세포의 흡수를 증가시키기 위해, 올리고머 (화합물)는 접합된 부분에 연결된다. 한가지 실시예에서 접합된 부분은 콜레스테롤과 같은, 스테롤이다.
다양한 실시예에서, 본 발명은 이런 치료가 필요한 동물 (환자와 같은)에, 본 발명의 올리고머, 또는 이의 결합체 또는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것을 포함하고, 선택적으로 추가적인 화학요법제를 투여하는 것을 추가적으로 포함하는, Hsp27의 비정상적인 수준을 치료하는 방법을 제시한다. 일부 실시예에서, 화학요법제는 올리고머에 접합되거나, 약학적 조성물에 존재하거나, 또는 분리된 제형으로 투여된다.
또한, 본 발명은 약제로서 용도를 위한 본 발명에 정의된 올리고머, 조성물 또는 결합체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 Hsp27의 비정상적인 수준 또는 Hsp27의 돌연변이 형태의 발현 (본 발명에 나타낸 질환 중 하나와 관련된 것들과 같은, 대립유전자 변이와 같은)의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 정의된 바와 같은 올리고머, 조성물 또는 결합체의 용도에 관한 것이다.
게다가, 다양한 실시예에서, 본 발명은 이런 치료가 필요한 동물 (환자와 같은)에 본 발명에서 정의된 바와 같은, 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암, 근병증성 및 천식으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환 또는 상태로부터 고통받는 동물 (환자와 같은)을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 Hsp27의 비정상적인 수준에 의해 야기되는 질환에 대한 치료 또는 예방을 위해 적용된다.
일부 실시예에서, 본 발명은 이런 치료가 필요한 동물 (환자와 같은)에 본 발명의 올리고머, 또는 본 발명의 결합체 또는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, Hsp27의 비정상적인 수준을 치료하는 방법을 제시한다.
게다가, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 질환 또는 상태로부터 고통받는 동물 (환자와 같은)을 치료하는 방법에 관한 것이다.
치료가 필요한 동물 (환자와 같은)은 질환 또는 장애로부터 고통받거나 고통받을 동물 (환자와 같은)이다.
적절한 동물은 인간 및 비-인간 동물을 포함한다.
일부 실시예에서, 동물은 포유류이다. 예로는 인간, 설치류 (랫트 및 마우스와 같은), 래빗, 영장류, 비-인간 영장류 (침팬지 및 원숭이와 같은), 말, 소, 양, 돼지, 개 및 고양이를 포함한다.
적절한 투여량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 제형, 다른 치료제와 조합, 전구 약물 제형은 또한 WO2007/031091에서 제공되고 - 이는 참조로서 본 발명에 통합된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 기재된 바와 같은 올리고머 또는 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. WO2007/031091은 적절하고 바람직한 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 보조제를 제공하고, 이것은 참조로서 본 발명에 통합된다.
실시예( EMBODIMENTS )
본 발명의 하기 실시예는 본 발명의 기재된 다른 실시예와 조합으로 사용될 수 있다.
1. 총 10 ~ 30 모노머 사이의 연속된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 10 ~ 30 모노머 사이의 길이의 올리고머로서, 여기서 상기 연속된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 137, 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체와 같은, 포유류 Hsp27 유전자 또는 mRNA의 역상보에 상응하는 부위에 적어도 80% 상동적인 올리고머.
2. 실시예 1에 따른 올리고머로서, 여기서 연속된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 91 - 105 및 127, 1 - 15 및 121, 16 - 30 및 122, 31 - 45 및 123, 46 - 60 및 124, 61 - 75 및 125, 76 - 90 및 126, 및 106 - 120 및 128 중 어느 서열에 상응하는 부위에 적어도 80%, 바람직하게 적어도 90% 상동적인 올리고머.
3. 실시예 1 또는 2에 따른 올리고머로서, 여기서 연속된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 137에 상응하는 부위의 역상보와 미스매치가 없거나 오직 1개 또는 2개의 미스매치를 포함하는 올리고머.
4. 실시예 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 올리고머로서, 여기서 올리고머의 뉴클레오티드 서열은 연속된 뉴클레오티드 서열로 구성된 올리고머.
5. 실시예 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 올리고머로서, 여기서 연속된 뉴클레오티드 서열은 10 ~ 18 모노머 사이의 길이인 올리고머.
6. 실시예 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 올리고머로서, 여기서 연속된 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 올리고머.
7. 실시예 6에 따른 올리고머로서, 여기서 뉴클레오티드 유사체는 잠금핵산(Locked Nucleic Acid, LNA) 유닛; 2'-O-알킬-RNA(2'-O-alkyl-RNA) 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA(2'-amino-DNA) 유닛, 및 2'-플루오로-DNA(2'-fluoro-DNA) 유닛으로 구성된 군으로부터 선택되는 당 변형된 뉴클레오티드(sugar modified nucleotide)와 같은, 당 변형된 뉴클레오티드인 올리고머.
8. 실시예 6에 따른 올리고머로서, 여기서 뉴클레오티드 유사체는 LNA인 올리고머.
9. 실시예 6 내지 8 중 어느 하나에 따른 올리고머로서, 갭머(gapmer)인 올리고머.
10. 실시예 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 올리고머로서, Hsp27 유전자 또는 mRNA를 발현하는 세포에서 Hsp27 유전자 또는 mRNA의 발현을 억제하는 올리고머.
11. 실시예 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 올리고머로서, 서열번호 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 및 136로 구성된 군으로부터 선택된 올리고머.
12. 실시예 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 올리고머, 및 상기 올리고머에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 결합체(conjugate).
13. 실시예 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 올리고머, 또는 실시예 12에 따른 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물.
14. 암, 근병증 및 천식의 치료와 같은, 약제로서 용도를 위한, 실시예 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 올리고머, 또는 실시예 12에 따른 결합체.
15. 암, 근병증 및 천식의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 실시예 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 올리고머, 또는 실시예 12에 정의된 바와 같은 결합체의 용도.
16. 실시예 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 올리고머, 또는 실시예 12에 따른 결합체, 또는 실시예 13에 따른 약학적 조성물을, 암, 근병증 및 천식으로부터 고통받거나, 또는 고통받을 것 같은 환자에게, 투여하는 것을 포함하는, 암, 근병증 및 천식의 치료 방법.
17. 실시예 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 올리고머, 또는 실시예 12에 따른 결합체를 Hsp27을 발현하는 세포에서 Hsp27을 억제하기 위하여 상기 세포로 투여하는 것을 포함하는, Hsp27을 발현하는 세포에서 Hsp27의 억제 방법.
도 1. 표시된 올리고뉴클레오티드로 PC3 세포의 형질전환(transfection) 후 24 h에, GAPDH로 표준화된 Hsp27 mRNA을 보여주는 실시간 정량적 PCR(Real-time Quantitative PCR).
도 2. 표시된 올리고뉴클레오티드로 PC3 세포의 형질전환 후 MTS 세포 증식.
도 3. Hsp27 cDNA (mRNA) 서열 - 인간 - 서열번호 137. 유전자은행 등록번호(GenBank accession number) NM_001540.
도 4. A549 세포에서 올리고머의 IC 50 결정. Hsp27 올리고머(올리고스(oligos)로 나타내어질 수 있는)로 형질전환 후 24 h에 A549 세포로부터 유래된 QPCR 데이타. 데이타는 GAPDH mRNA 발현으로 표준화되고 목(mock)에서 발현을 표적화 (100%)하는 것에 비교된다. 목으로 형질전환된 세포는 단지 형질전환 시약으로 형질전환된 것이다 (음성 대조군).
도 5. PC3 세포에서 올리고머의 IC 50 결정. Hsp27 올리고머로 형질전환 후 24 h에 PC53 세포로부터 유래된 QPCR 데이타. 데이타는 GAPDH mRNA 발현으로 표준화되고 목(mock)에서 발현을 표적화 (100%)하는 것에 비교된다. 목으로 형질전환된 세포는 단지 형질전환 시약으로 형질전환된 것이다 (음성 대조군).
도 6. 0, 24, 48 및 120 h에 획득된 부분 표본으로 37℃에서 분해에 대한 혈청 안정성 분석. 결과는 PAGE에서 겔 전기영동에 의해 시각화된다. DNA 포스포티오에이트(phosphorothioate)는 양성 대조군으로 사용된다.
도 7. Hsp27 올리고머로 처리된 마우스의 마우스 간에서 Hsp27 mRNA 발현 감소(down-regulation).
도 8. Hsp27 올리고머로 처리된 마우스의 마우스 혈청에서 ALT 수준.
도 9. Hsp27 올리고머로 처리된 마우스의 마우스 혈청에서 AST 수준.
도 10. 서열번호: 135로 기재되는 서열을 갖는 올리고머로 장기간 배양.
도 11. Hsp27 mRNA 및 단백질을 감소시키는 서열번호: 135로 기재되는 서열을 갖는 올리고머로 장기간 배양.
도 12. 항-Hsp27 LNA-근거로 하는 올리고뉴클레오티드와 세포독성제(cytotoxic agent)의 조합 효과의 예: 세포 성장에서 TNFα와 조합의 효과
도 13. PC3 이종이식에서 서열번호: 135로 기재되는 서열을 갖는 올리고머의 항-암 효과.
도 14. 동물 모델에서 항-Hsp27 올리고뉴클레오티드에 의한 종양의 표적 녹다운. 마커에서 밴드의 크기는 43KDa, 34KDa 및 23 KDa이다.
실시예 1: 모노머 합성
LNA 모노머 구조 재료(building block) 및 유도체는 공개된 절차 및 이에 언급된 참조에 따라 제조되었다 - WO07/031081 및 이에 언급된 참조를 참조해라.
실시예 2: 올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드 (올리고머)는 WO07/031081에 기재된 방법에 따라 합성되었다. 표 1은 안티센스 올리고뉴클레오티드 부분 및 본 발명의 실시예를 나타낸다.
실시예 3: 올리고뉴클레오티드의 고안
본 발명에 따른, 일련의 올리고뉴클레오티드 (올리고머)는 본 발명에서 서열번호: 137로 나타낸, 공개된 서열 GenBank accession number NM_001540를 이용한 인간 Hsp27 mRNA의 다른 부분를 표적으로 하는 것으로 고안되었다(도 3).
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열. 서열번호: 1-120 및 서열번호: 121-128 (표 2에서 나타낸)은 인간 Hsp27 mRNA을 표적으로 하는 것으로 고안된 올리고머 서열이다.
서열번호 서열 (5' - 3') 길이 (염기)
서열번호: 1 gagatgtagccatgct 16
서열번호: 2 gagatgtagccatgc 15
서열번호: 3 agatgtagccatgct 15
서열번호: 4 gagatgtagccatg 14
서열번호: 5 agatgtagccatgc 14
서열번호: 6 gatgtagccatgct 14
서열번호: 7 gagatgtagccat 13
서열번호: 8 agatgtagccatg 13
서열번호: 9 gatgtagccatgc 13
서열번호: 10 atgtagccatgct 13
서열번호: 11 gagatgtagcca 12
서열번호: 12 agatgtagccat 12
서열번호: 13 gatgtagccatg 12
서열번호: 14 atgtagccatgc 12
서열번호: 15 tgtagccatgct 12
서열번호: 16 ACGGTCAGTGTGCCCT 16
서열번호: 17 ACGGTCAGTGTGCCC 15
서열번호: 18 CGGTCAGTGTGCCCT 15
서열번호: 19 ACGGTCAGTGTGCC 14
서열번호: 20 CGGTCAGTGTGCCC 14
서열번호: 21 GGTCAGTGTGCCCT 14
서열번호: 22 GTCAGTGTGCCCT 13
서열번호: 23 GGTCAGTGTGCCC 13
서열번호: 24 CGGTCAGTGTGCC 13
서열번호: 25 ACGGTCAGTGTGC 13
서열번호: 26 ACGGTCAGTGTG 12
서열번호: 27 CGGTCAGTGTGC 12
서열번호: 28 GGTCAGTGTGCC 12
서열번호: 29 GTCAGTGTGCCC 12
서열번호: 30 TCAGTGTGCCCT 12
서열번호: 31 cgtgtatttccgcgtg 16
서열번호: 32 cgtgtatttccgcgt 15
서열번호: 33 gtgtatttccgcgtg 15
서열번호: 34 cgtgtatttccgcg 14
서열번호: 35 gtgtatttccgcgt 14
서열번호: 36 tgtatttccgcgtg 14
서열번호: 37 cgtgtatttccgc 13
서열번호: 38 gtgtatttccgcg 13
서열번호: 39 tgtatttccgcgt 13
서열번호: 40 gtatttccgcgtg 13
서열번호: 41 cgtgtatttccg 12
서열번호: 42 gtgtatttccgc 12
서열번호: 43 tgtatttccgcg 12
서열번호: 44 gtatttccgcgt 12
서열번호: 45 tatttccgcgtg 12
서열번호: 46 tgcgtggctagcttgg 16
서열번호: 47 tgcgtggctagcttg 15
서열번호: 48 gcgtggctagcttgg 15
서열번호: 49 tgcgtggctagctt 14
서열번호: 50 gcgtggctagcttg 14
서열번호: 51 cgtggctagcttgg 14
서열번호: 52 tgcgtggctagct 13
서열번호: 53 gcgtggctagctt 13
서열번호: 54 cgtggctagcttg 13
서열번호: 55 gtggctagcttgg 13
서열번호: 56 tgcgtggctagc 12
서열번호: 57 gcgtggctagct 12
서열번호: 58 cgtggctagctt 12
서열번호: 59 gtggctagcttg 12
서열번호: 60 tggctagcttgg 12
서열번호: 61 atggtgatctcgttgg 16
서열번호: 62 atggtgatctcgttg 15
서열번호: 63 tggtgatctcgttgg 15
서열번호: 64 atggtgatctcgtt 14
서열번호: 65 tggtgatctcgttg 14
서열번호: 66 ggtgatctcgttgg 14
서열번호: 67 atggtgatctcgt 13
서열번호: 68 tggtgatctcgtt 13
서열번호: 69 ggtgatctcgttg 13
서열번호: 70 gtgatctcgttgg 13
서열번호: 71 atggtgatctcg 12
서열번호: 72 tggtgatctcgt 12
서열번호: 73 ggtgatctcgtt 12
서열번호: 74 gtgatctcgttg 12
서열번호: 75 tgatctcgttgg 12
서열번호: 76 attttgcagcttctgg 16
서열번호: 77 attttgcagcttctg 15
서열번호: 78 ttttgcagcttctgg 15
서열번호: 79 attttgcagcttct 14
서열번호: 80 ttttgcagcttctg 14
서열번호: 81 tttgcagcttctgg 14
서열번호: 82 attttgcagcttc 13
서열번호: 83 ttttgcagcttct 13
서열번호: 84 tttgcagcttctg 13
서열번호: 85 ttgcagcttctgg 13
서열번호: 86 attttgcagctt 12
서열번호: 87 ttttgcagcttc 12
서열번호: 88 tttgcagcttct 12
서열번호: 89 ttgcagcttctg 12
서열번호: 90 tgcagcttctgg 12
서열번호: 91 ggcacagccagtggcg 16
서열번호: 92 ggcacagccagtggc 15
서열번호: 93 gcacagccagtggcg 15
서열번호: 94 ggcacagccagtgg 14
서열번호: 95 gcacagccagtggc 14
서열번호: 96 cacagccagtggcg 14
서열번호: 97 ggcacagccagtg 13
서열번호: 98 gcacagccagtgg 13
서열번호: 99 cacagccagtggc 13
서열번호: 100 acagccagtggcg 13
서열번호: 101 ggcacagccagt 12
서열번호: 102 gcacagccagtg 12
서열번호: 103 cacagccagtgg 12
서열번호: 104 acagccagtggc 12
서열번호: 105 cagccagtggcg 12
서열번호: 106 tatcaaaagaacacac 16
서열번호: 107 tatcaaaagaacaca 15
서열번호: 108 atcaaaagaacacac 15
서열번호: 109 tatcaaaagaacac 14
서열번호: 110 atcaaaagaacaca 14
서열번호: 111 tcaaaagaacacac 14
서열번호: 112 tatcaaaagaaca 13
서열번호: 113 atcaaaagaacac 13
서열번호: 114 tcaaaagaacaca 13
서열번호: 115 caaaagaacacac 13
서열번호: 116 tatcaaaagaac 12
서열번호: 117 atcaaaagaaca 12
서열번호: 118 tcaaaagaacac 12
서열번호: 119 caaaagaacaca 12
서열번호: 120 aaaagaacacac 12
표 2는 본 발명의 올리고머가 고안될 수 있는 24머 서열 부분을 나타낸다 - 굵은 글씨체는 표 1에 나타낸 바와 같은 16머 서열 부분을 나타낸다.
표 2 - 24머 서열 부분
16머 서열번호 16머를 포함하는 상응하는 24머 서열 24머 서열번호
서열번호: 1 ccgggagatgtagccatgctcgtc 서열번호: 121
서열번호: 16 ctccacggtgcagtgtgccctcagg 서열번호: 122
서열번호: 31 gcagcgtgtatttccgcgtgaagc 서열번호: 123
서열번호: 46 ggactgcgtggctagcttgggcat 서열번호: 124
서열번호: 61 tgggatggtgatctcgttggactg 서열번호: 125
서열번호: 76 tcggattttgcagcttctgggccc 서열번호: 126
서열번호: 91 gggaggcacagccagtggcggcag 서열번호: 127
서열번호: 106 aatgtatcaaaagaacacacaggt 서열번호: 128
본 발명의 올리고뉴클레오티드 고안
표 3 - 올리고머 고안
서열번호 서열 (5'-3')
서열번호: 129 G s A s G s astsgstsasgscscsasts G s C s T
서열번호: 130 A s C s G s gstscsasgstsgstsgscs C s C s T
서열번호: 131 C s G s T s gstsastststscscsgscs G s T s G
서열번호: 132 T s G s C s gstsgsgscstsasgscsts T s G s G
서열번호: 133 A s T s G s gstsgsastscstscsgsts T s G s G
서열번호: 134 A s T s T s tstsgscsasgscststscs T s G s G
서열번호: 135 G s G s C s ascsasgscscsasgstsgs G s C s G
서열번호: 136 T s A s T s csasasasasgsasascsas C s A s C
서열번호: 129 - 136에서, 대문자는 뉴클레오티드 (뉴클레오시드) 유사체 모노머 (예를 들면, β-D-옥시 LNA 모노머)를 나타내고, 소문자 "s"는 모노머들 사이 포스포로티오에이트 연결기를 나타낸다. 일부 실시예에서, LNA 모노머에서 모든 사이토카인 염기는 5-메틸시토신이다. 소문자는 뉴클레오티드 (DNA) 모노머를 나타낸다. "s"는 본 명세서에 기재된 바와 같은, 특정의 다른 인터뉴클레오시드 연결로 치환될 수 있다.
실시예 4: 시험관 내( in vitro ) 모델: 세포 배양
표적 핵산 발현에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과는 표적 핵산이 측정가능한 수준으로 존재한다면 임의의 다양한 세포 형태에서 시험될 수 있다. 표적은 내생적으로 또는 상기 표적 핵산을 암호화하는 핵산의 일시적 또는 안정적인 형질전환에 의해 발현될 수 있다. 표적 핵산의 발현 수준은 일반적으로 예를 들면, 노던 블랏(Northern blot) 분석, 실시간 PCR(Real-Time PCR), 리보뉴클레아제 보호(Ribonuclease pretection) 분석을 이용하여 측정할 수 있다. 하기 세포 형태는 실례의 목적을 위해 제공되나, 표적이 선택된 세포 형태에서 발현된다면, 다른 세포 형태도 일반적으로 사용될 수 있다. 세포는 하기 기재된 바와 같은 적절한 배지에서 배양되었고 37℃에서 95 ~ 98% 습도 및 5% CO2에서 유지되었다. 세포는 일반적으로 매주에 2 ~ 3회 계대배양하였다.
A549 인간 폐암 세포주 A549은 DMEM (Sigma) + 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) + 2 mM 글루타맥스 I(Glutamax I) + 겐타마이신(gentamicin) (25 ㎍/ml)에서 배양되었다.
PC3 인간 전립선암 세포주 PC3은 DMEM (Sigma) + 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) + 2 mM 글루타맥스 I(Glutamax I) + 겐타마이신(gentamicin) (25 ㎍/ml)에서 배양되었다.
실시예 5: 시험관 내( in vitro ) 모델: 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리
세포를 형질전환 운반체로서 양이온성 리포솜 제형 LipofectAMINE 2000 (Gibco)을 사용하여 올리고머로 처리하였다. 세포는 6-웰 세포 배양 플레이트 (NUNC)에 분주하여 75 ~ 90% 밀도가 되었을 때 처리하였다. 올리고뉴클레오티드 농도는 최종 농도 1 nM 내지 16 nM 범위로 사용하였다. 올리고뉴클레오티드-지질 복합체의 제형은 혈청이 없는 OptiMEM (Gibco) 및 5 ㎍/㎖의 최종 지질 농도의 LipofectAMINE 2000을 사용하여 제조사가 지시한 방법에 따라 실시하였다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 배양하였고 올리고뉴클레오티드를 함유하는 배양 배지를 제거함으로써 처리를 중지시켰다. 세포를 세척하여 혈청을 함유하는 배지를 첨가하였다. 올리고뉴클레오티드 처리 후, 세포는 RNA 분석을 위해 수득하기 전에 20시간 동안 회복시켜다.
실시예 6: 시험관 내( in vitro ) 모델: RNA 추출 및 cDNA 합성
세포주로부터 RNA를 분리하기 위해, 제조사에 의해 제공한 프로토콜에 따라 RNeasy mini kit(Qiagen cat. no. 74104)를 사용하였다. 첫 번째 가닥 합성은 제조사의 지시에 따라 Ambion으로부터 입수한 역전사효소(Reverse Transcriptase) 시약을 사용하여 수행하였다.
각 시료를 위해, 0.5 ㎍의 총 RNA를 RNase가 없는 H2O로 조절하였고(10.8 ㎕) 2 ㎕의 랜덤 데카머(random decamers)(50 μM) 및 4 ㎕의 dNTP mix(각 dNTP는 2.5 mM)를 혼합하여 70℃에서 3분간 가열한 후, 각 시료를 즉시 얼음에서 냉각하였다. 시료를 얼음에서 냉각한 후, 2 ㎕ 10×완충용액 RT, 1 ㎕ MMLV 역전사효소(100 U/㎕) 및 0.25 ㎕ RNase 저해제(inhibitor)(10 U/㎕)를 각 시료에 첨가하여 42℃에서 60분 동안 배양하였고, 95℃에서 10분 동안 효소를 열 비활성화하였고, 그런 다음 시료를 4℃에서 냉각하였다.
실시예 7: 시험관 내( in vitro ): 실시간 PCR ( Real - time PCR )에 의한 Hsp27 발현의 올리고뉴클레오티드 억제의 분석
Hsp27 mRNA 발현의 안티센스 조절은 당업계에 공지된 여러 가지 방법으로 분석할 수 있다. 예를 들면, Hsp27 mRNA 수준은 예를 들면, 노던 블랏(Northern blot) 분석, 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive polymerase chain reactin, PCR), 또는 실시간 PCR(real-time PCR)을 통해 정량할 수 있다. 실시간 정량적 PCR이 바람직하다. RNA 분석은 총 세포의 RNA 또는 mRNA에서 수행될 수 있다. RNA 분리 및 노던 블랏 분석과 같은 RNA 분석의 방법은 당업계에서 일반적이고 예를 들면, Molecular biology, John Wiley 및 Sons에 현행하는 프로토콜에서 알 수 있다. 실시간 정량적 PCR은 Applied Biosystem으로부터 이용가능한, 상업적으로 이용가능한 Multi-Color Real time PCR Detection System을 이용하여 편리하게 수행될 수 있다.
Hsp27 mRNA 수준의 실시간 정량적 PCR 분석
인간 Hsp27 mRNA의 시료 조성은 제조사의 지시에 따라 인간 베타-카테닌 ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems cat no. Hs00170025_m1)를 사용하여 정량하였다.
글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) mRNA 정량은 시료 제조에서 어떠한 편차를 표준화하기 위한 내생적 대조군으로서 사용하였다. 인간 GAPDH mRNA의 시료 조성은 제조사의 지시에 따라 인간 GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent (Applied Biosystems cat no. 4310884E)를 사용하여 정량하였다.
실시간 정량적 PCR은 당업계에 공지된 기술이고 예를 들면 Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6:986-994에서 알 수 있다.
실시간 PCR
실시예 6에 기재된 바와 같이 수행된 첫 번째 가닥 합성으로부터 유래된 cDNA를 2 - 20배 희석하였고, Applied Biosystems의 Taqman 7500 FAST를 사용하여 실시간 정량적 PCR을 통해 분석하였다. 프라이머 및 탐침은 2×Taqman Fast Universal PCR master mix (2×) (Applied Biosystems Cat.# 4364103)로 혼합하였고 최종 부피 10 ml에 4 ml의 cDNA를 첨가하였다. 각 시료는 3회 분석하였다. cDNA의 2배 희석의 분석은 분석을 위해 제작된 표준곡선(standard curve)의 RNA를 발현하는 세포주로부터 정제된 물질로 제조되었다. 멸균 H20는 주형(template)이 없는 대조군을 위해 cDNA 대신에 사용하였다. PCR 프로그램은: 30초 동안 95℃, 그런 다음 95℃에서 3초, 60℃에서 30초가 40 사이클이었다. 표적 mRNA 서열의 상대적인 정량은 Applied Biosystems Fast System SDS Software Version 1.3.1.21.을 사용하여 산출된 임계 사이클(Thresold cycle)로부터 측정하였다.
실시예 8: 시험관 내( in vitro ): 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 Hsp27 발현의 안티센스 억제
표 4에 제시된 올리고뉴클레오티드는 PC3 세포에서 1, 4 및 16 nM의 농도에서 Hsp27 mRNA 녹다운(knockdown)에 대한 가능성을 위해 측정되었다 (도 1 참조). 데이타는 4 nM에서 모의(mock) 형질전환된 세포에 대해 상대적으로 Hsp27 mRNA의 다운-레귤레이트 퍼센트로서 표 4에 나타냈다. 모의(mock) 형질전환된 세포는 올리고 없이 지질로 형질전환된 것이다 (음성 대조군). 소문자는 DNA 유닛을 나타내고, 굵은 대문자는 β-D-옥시-LNA(β-D-oxy-LNA) 유닛을 나타낸다. LNA 모노머에서 모든 시토신 염기는 5'-메틸시토신이다. 아래에 기입한 "s"는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
특이적 화합물
서열번호
올리고머
서열번호:
서열 (5'-3') Hsp27 mRNA (% inhib .)
서열번호:138 서열번호:129 G s A s G s astsgstsasgscscsasts G s C s T 78%
서열번호:139 서열번호:130 A s C s G s gstscsasgstsgstsgscs C s C s T 79%
서열번호:140 서열번호:131 C s G s T s gstsastststscscsgscs G s T s G 78%
서열번호:141 서열번호:132 T s G s C s gstsgsgscstsasgscsts T s G s G 93%
서열번호:142 서열번호:133 A s T s G s gstsgsastscstsgscsts T s G s G 79%
서열번호:143 서열번호:134 A s T s T s tstsgscsasgscststscs T s G s G 79%
서열번호:144 서열번호:135 G s G s C s ascsasgscscsasgstsgs G s C s G 94%
서열번호:145 서열번호:136 T s A s T s csasasasasgsasascsas C s A s C 78%
표 4에 나타낸 바와 같이, 서열번호: 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 및 136의 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 있어서 4 nM에서 Hsp27 mRNA 발현의 약 75% 또는 더 높은 억제를 나타내었다. 또한, 바람직하게는, 예를 들면 길이 (더 짧거나 더 긴) 및/또는 뉴클레오염기 조성 (예를 들면, 유사체 유닛의 형태 및/또는 비율)을 변화시키는, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 기초한 올리고뉴클레오티드이고, 이는 또한 Hsp27 mRNA 발현의 효과적인 억제를 제공한다.
실시예 9: 생존가능한 세포의 증식하는 측정( MTS 분석)
PC3 세포를 6 웰 플레이트의 웰 당 200,000 세포수의 농도로 2 ml DMEM 배지 (Sigma D5671) + 2 mM 글루타맥스 I(Glutamax I) (Gibco 35050-038) + 10% FBS (Brochrom #193575010) + 25 ㎍/㎕ 겐타마이신(Gentamicin) (Sigma G1397 50 mg/ml)에서 형질전환하기 하루 전까지 배양하였다. 다음날에 세포를 실시예 5에 기재된 바와 같이 형질전환하였다. 최종 올리고뉴클레오티드의 농도는 4 및 16 nM이었다. 처리한 뒤 4시간 후, 배지를 제거하였고 세포를 트립신 처리하여 깨끗한 96 웰 플레이트 (Scientific Orange no. 1472030100)의 웰 당 5000 세포의 밀도로 100 ㎕ DMEM 배지 (Sigma D5671) + 2 mM 글루타맥스 I(Glutamax I) (Gibco 35050-038) + 10% FBS (Brochrom #193575010) + 25 ㎍/㎕ 겐타마이신(Gentamicin) (Sigma G1397 50 mg/ml)에서 배양하였다. 생존가능한 세포를 10 ㎕의 테트라졸리움 화합물[3-(4,5-dimethyl-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS] 및 전자 커플링 시약(electron coupling reagent)(phenazine ethosulfate; PES) (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)을 첨가하여 지정된 시간에서 측정하였다. 생존가능한 세포는 490 ㎚에서 Powerwave(Biotek Instruments)로 측정하였다. OD490 ㎚는 시간/h에 대하여 작성하였다(도 2 참조).
실시예 10: 서열번호: 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 및 136 및 폴리에틸렌글리콜( polyethylene glycol )의 결합체의 제조
올리고머는 5' 말단에 일반적인 포스포라미다이트 케미스트리(phosphoramidite chemistry)를 이용한 올리고머의 5' 인산기에 대한 Fmoc와 같은 보호기(blocking group)로 보호된 헥산-1(hexan-1) 아민과 같은, 아미노알킬기(aminoalkyl group)의 접합에 의해 기능화되고, 화학식 (1)을 가지는 기능화된 올리고머 (활성화된 올리고머)를 수득하기 위해 결과 화합물의 산화, 그것을 탈보호 및 정제한다:
Figure pct00008
(I)
화학식 (I) 또는 (III)에서 용어 올리고머는 서열번호: 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 및 136로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고머와 같은, 본 발명의 올리고머를 나타낸다.
화학식 (II)에 나타낸 바와 같은, 활성화된 PEG 용액:
Figure pct00009
(II)
여기서 PEG 부분은 12,000의 평균 분자량을 가지고, PBS 완충용액에 있는 화학식 (I)의 화합물은 12시간 동안 실온에서 혼합하였다. 반응 용액을 메틸렌클로라이드(methylene chloride)로 3회 추출하였고 결합된 유기물층을 마그네슘설페이트(magnesium sulphate)로 건조시켜 여과하였고 감압하에서 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이차 증류수에 녹인 후 음이온 교환 컬럼에 통과시켰다. 반응하지 않은 PEG 링커(linker)를 물로 녹여 분리하였고 산물은 NH4HCO3 용액으로 녹여 분리하였다. 순수한 산물을 포함하는 분획을 모아 화학식 (III)의 결합체를 생산하기 위해 친지질화하였다:
Figure pct00010
(III)
여기서 올리고머 (예를 들면, 서열번호: 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 및 136)는 방출가능한 링커를 통해 12,000의 평균 분자량을 가지는 PEG 폴리머에 접합된다.
실시예 11: IC 50 결정
사용된 실험적 절차는 실시예 4, 5, 6 및 7에서 상기 기재된 바와 같다. 시험된 모든 6개의 Hsp27 올리고머 (올리고스)는 세포주 A549 (도 4) 및 PC3 (도 5) 모두에서 IC50 = 4 nM이다.
실시예 12: 혈장 안정성( Plasma Stability)
Hsp27 올리고머의 안정성은 24 h (1 일), 48 h (2 일) 및 120 h (5일) 동안 37℃에서 마우스 혈장에서 인큐베이션한 후 조사하였다. 모든 올리고머는 37℃에서 마우스 혈장으로 인큐베이션할 때 24시간 후 남는 활성 화합물의 90% 이상인 시험관내(in - vitro) 안정성을 보였다. 올리고머 131 및 132에 대하여, 약한 밴드는 120 h 후 특히 두드러지는 24 - 48 h 후 나타내었다. 방법론: 마우스 혈장 (BomTac:NMRI 마우스 유래 리튬 헤파린 혈장, 14-09-05 수집된, Taconic Europe)을 해동한 후, 45 ㎕ 혈장/튜브로 튜브내로 분취하였다. 다음으로, 5 ㎕ 올리고머 (200 uM)를 최종 농도 20 uM을 위해 45 ㎕ 혈장/튜브에 첨가하였다. 철저히 혼합한 후, 시료를 0 - 120 시간 동안 37℃에서 인큐베이트하였다. 다른 시간점(0 h, 24 h, 48 h 및 120 h)에서 시료를 수집한 후, 반응을 액체질소에서 시료를 급속 냉동함으로서 정지시켰다. 분석을 위해, 시료를 적재 완충용액에 첨가한 후 변성 조건 하에서 PAGE-시퀀싱 겔에서 전기영동함으로써 분석하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.
실시예 13: T m 결정
LNAfmf 포함하는 올리고머/RNA 듀플렉스의 녹는 온도는 UV-광도계(UV-spectrometry system)와 상응하는 소프트웨어 (Perkin Elmer, Fremont, USA)를 이용하여 결정하였다. LNA 올리고머 및 이의 상보적인 RNA는 Tm-완충용액 (200 nM NaCl, 0.2 nM EDTA, 20 mM NaP, pH 7.0)에 대해 최종 농도 1.5 uM으로 첨가하였다. 듀플렉스 형성은 시료를 3분 동안 95℃에 가열한 후, 30분 동안 실온에서 냉각함으로써 제조되었다. 녹는 온도 (Tm)값은 Lambda 25 UV/VIS 분광계 (Perkin Elmer)에서 측정하였고 데이타는 TempLab 소프트웨어 (Perkin Elmer)를 이용하여 분석하였다. 장비는 20 - 95℃로부터 올리고머 듀플렉스 시료를 가열한 후 25℃까지 냉각하는 것으로 프로그램화하였다. 이런 과정 동안 260 nm에서 흡광도를 기록하였다. 녹는 곡선은 Tm값을 산출하는데 사용하였다. RNA에 대한 올리고머의 Tm값을 결정하였다 (표 5). 서열번호 129, 130, 131, 132 및 135은 70℃ 근처의 Tm을 가진다. 서열번호 136은 44.4℃의 Tm을 가진다.
상보적인 RNA 에 대한 Tm 결정.
올리고 Tm/RNA ℃
129 67.6 ℃
130 78.1 ℃
131 68.1 ℃
132 73.8 ℃
135 76.4 ℃
136 44.4 ℃
실시예 14: 생체내 ( In vivo ) 분석: HSP27 올리고뉴클레오티드의 생체내 ( in vivo , i.v. ) 투여 후 마우스 간에서 마우스 HSP27 의 다운- 레귤레이션 .
암컷 NMRI 마우스에 25 mg/kg의 투여량으로 3일 연속으로 서열번호: 129, 130, 131, 132 및 135의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 정맥(i.v.) 주사를 놓았다. 동물을 투여 24시간 후에 희생시켰다. 간을 사용할 때까지 RNAlater 안정화 용액에 저장하였다. 총 RNA를 간조직으로부터 추출한 후, Hsp27 mRNA 수준을 qPCR (정량적 PCR)로 분석하였다. 데이타는 식염수로 처리된 대조군 동물에서 Hsp27 발현과 비교하였다. 그 결과는 도 7에서 보여준다.
실시예 15: 생체내 ( In vivo ) 분석: HSP27 올리고뉴클레오티드의 i.v. 투여 후 마우스 간에서 ALT AST 결정.
암컷 NMRI 마우스에 10 mg/kg의 투여량으로 0, 3, 6 및 9일에 서열번호: 129, 130, 131, 132 및 135의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 정맥(i.v.) 주사를 놓았다. 동물을 투여 24시간 후에 희생시켰다. ALT 및 AST 수준을 희생 직후 마우스로부터 획득된, 적혈구로부터 제거된, 혈청에서 결정하였다. 마우스 혈청에서 알라닌-아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스팔테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)의 활성은 96-웰 판에 적용되는 제조사의 지시에 따라 효소적 ALT 분석 (ABX Pentra A11A01627 (ALT) 또는 A11A01629 (AST), Horiba ABX Diagnostics, France)을 이용하여 결정하였다. 요컨데, 혈청 시료는 H2O로 2.5배 희석하였고 2번 분석하였다. 각 웰에 50 ㎕ 희석된 시료 또는 표준 (multical from ABX Pentra, A11A01652)의 첨가 후, 200 ㎕의 37℃ ALT 시약 혼합물은 각 웰에 첨가하였다. 단백질 상호작용 분석(Kinetic measurement)은 30초 간격으로 5분 동안 340 nm 및 37℃에서 수행하였다. 데이타는 2배 희석된 표준 곡선에 대해 관련성을 보이며 그 결과는 U/L에서 ALT 활성으로 나타낸다. 그 결과는 도 8 및 9에서 보여준다.
실시예 16. 리포펙타민 없이 장기간 세포 배양
리포펙타민 또는 그외 형질전환 시약의 부재 하 장기간 배양에서 세포 증식의 억제를 나타낸기 위해 서열번호: 135로 기재되는 서열을 갖는 항-HSP27 올리고뉴클레오티드의 능력을 조사하였다. 20 이상의 세포주를 1 내지 7일의 기간 동안 올리고뉴클레오티드에 대해, 0, 0.32, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10, 및 20 마이크로몰랄(micromolar) 투여량 범위를 갖는 표준 성장 배지에 배양하였다. 전형적 배지 및 세포증식 분석 방법은 실시예 9에 기재되어 있다.
리포펙타민의 부재 하에, 다음의 세포주는 특정 올리고뉴클레오티드 농도에서 유의적인 억제를 보이지 않았다: 15PC3 (전립선암 세포주), PC3 (인간 전립선암 세포주), A549 (인간 폐암 세포주), DLD-1 (인간 대장암 세포주), SW480 (인간 결장선암 세포주), 518A2 (인간 흑색종 세포주), Calu-6 (인간 폐암 세포주), 22RV1 (인간 전립선암 세포주), 및 Hep3B (인간 간암 세포주). 다음의 세포주는 2.5 내지 20 마이크로몰랄 농도의 서열번호: 135에서 20% 내지 70% 억제를 나타내었다: H1581 (대세포암 세포주), U87MG (인간 교모세포종-별세포, 상피-유사 세포주), A427 (인간 폐선암 세포주), LNCaP (인간 전립선 선암 세포주), BxPC3 (인간 췌장암 세포주), HCC827 (인간 식도 편평세포암 세포주), DU-145 (인간 전립선암 세포주), H1975 (비-인간 세포 폐암 세포주), SKBR3 (인간 유방암 세포주), Huh7 (인간 간암 세포주), HT1080 (인간 섬유육종 세포주), Jimt (인간 유방암 세포주), MB231 (인간 유방암 선암 세포주), HCC827R (폐암 세포주 HCC827로부터 파생된), 및 786-O (인간 신세포암 세포주). 세포 배양 7일 후 실시예 데이타는 도 10에 보여준다. 서열번호: 135를 갖는 올리고머에 노출되지 않은 대조군 세포 배양은 100% 세포 성장에 상응한다. 시험된 대장암 세포주는 모두 반응하지 않은 반면에, 시험된 세 개의 유방암 세포주는 모두 성장 억제에 반응하였다. HT1080 세포와 서열번호: 135 및 131로 적정 실험은 서열번호: 135로 기재되는 서열을 갖는 올리고머에 대한 2 마이크로몰랄 및 서열번호: 131에 대한 0.6 마이크로몰랄의 성장 억제에 대한 IC50 값을 보여주었다. 결론적으로, 서열번호: 135의 서열을 갖는 올리고머는 시험된 성장 조건 하에서 모두가 아닌 일부 세포주에서 성장 억제를 조절하는 것을 보여주었다.
실시예 17. 서열번호: 135의 서열을 가지는 올리고머로의 장기 배양은 HSP27 mRNA 및 단백질을 다운 조절한다.
세포 배양배지에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 인큐베이션의 생물학적 효과를 검사하였다. 리포펙타민 방법 (나노몰랄)에 비해 더 높은 올리고뉴클레오티드 농도 (마이크로몰랄)를 이용하여, 우리는 데이타를 정상화하기 위해 GAPDH와 같은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)의 측정을 포함하는 표준 실시간 정량 중합효소 연쇄 반응 방법으로 표적 HSP27 mRNA의 상대적인 수준을 측정함으로써 표적 다운-조절과 관련된 이런 화합물로 세포의 처리를 평가하였다. 세포주를 다양한 투여량의 올리고뉴클레오티드를 첨가한 권장된 상업적 배지 (ATCC)를 이용하여 6-웰 마이크로웰 디쉬에 플레이트하였다. RT-PCR 분석을 ABI 7500 시스템에서 수행하였고 데이타를 ABI 7500 Fast System SDS 소프트웨어로 분석하였다. 유전자-특이적 탐침-프라이머를 ABI 소프트웨어를 이용하여 고안하였다. PCR 예시적인 프로그램은 다음과 같다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 이어서 95℃ 15초, 60℃ 1분의 40 사이클. 웨스턴 블랏 분석을 항-HSP27 항체 시약, 항-튜불린 항체 (R&D Systems)로 화학발광의 정량을 위한 Fuji Film LAS-1000로 분석하였다. 여러 세포주는 실시예 15에서 기재된 바와 같은 리포펙타민 또는 그외 형질전환 시약의 부재 하에 장기간 인큐베이션의 조건 하에서 표적 mRNA 및 단백질 수준을 다운-조절하기 위해 항-HSP27 올리고뉴클레오티드의 능력에 대해 조사하였다. 0 내지 5 마이크로몰랄 투여량 범위에서 서열번호: 135의 서열을 갖는 올리고머로의 세포 배양한 후 1 내지 7일 후, HSP27 mRNA 수준을 실시예 7에 기재된 바와 같이 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. HSP27 단백질을 상업적인 항체 호르세라디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 접합체 대비 HSP27 또는 알파-튜불린를 이용하여 웨스턴 블랏 면역분석에 의해 측정하였다. 서열번호: 135의 서열을 갖는 올리고머에 의한 HSP27의 다운-조절의 특이성 평가는 스크램블된 또는 미스매치된 올리고뉴클레오티드의 효과를측정함으로써 수행하였다.
도 11은 HSP27 mRNA (도 11A) 또는 HSP27 단백질 (도 11B) 중 어느 하나의 투여량 의존적인 다운-조절을 보여준다. 표적 다운-조절에 대한 대략적인 IC50은 6일 후 세포주 15PC3 (전립선암 세포주)에서 HSP27 mRNA 또는 HSP27 단백질에 대한 300 나노몰랄이다. 유사한 결과를 HT1080 (인간 섬유육종 세포주)를 포함하는 추가적인 세포주에 대해, 3 - 4일 후 2 - 5 마이크로몰랄 투여량에서 HSP27 mRNA 또는 HSP27 단백질의 10배 녹다운을 보이는 것을 획득하였다. HSP27 mRNA에 대한 효과는 HER3에 대한 안티센스가 HSP27 mRNA을 녹다운 하지 못하기 때문에 특이적인 것임을 나타내었다. 결론적으로, 종양 세포주의 세포 배양에서 LNA-기초 안티센스 올리고뉴클레오티드의 인큐베이션은 표적 HSP27 mRNA 또는 단백질의 수준을 투여량 의존적이고 서열-특이적인 감소를 나타낼 수 있다.
실시예 18. 세포 성장에 대해 항- HSP27 LNA -기초 올리고뉴클레오티드와 TNFa 의 조합 효과
여러 세포주를 리포펙타민 또는 그외 형질전환 시약의 부재 하에 장기간 인큐베이션의 조건 하에서 또 다른 세포독성제와 결합하는 경우 세포 성장을 억제하기 위한 항-HSP27 올리고뉴클레오티드의 능력을 조사하였다.
5일 동안 10 마이크로몰랄의 서열번호: 135의 서열을 갖는 올리고머로 15PC3 세포 (전립선암 세포주)의 장기간 배양 후, 투여량 범위 (0 - 50 ng/mL)의 TNF-알파로 3일 동안 인큐베이션은 두 시약의 상가적 효과를 야기하였다 (도 12, 상부). 5일 동안 10 마이크로몰랄의 서열번호: 135의 서열을 갖는 올리고머로 BxPC3 세포 (인간 췌장암 세포주)의 장기간 배양 후, 투여량 범위의 TNF-알파로 3일 동안 인큐베이션은 세포증식에 대한 효과를 상가적으로, 또는 상가적 이상을 야기하였다 (도 12, 하부). 유사한 결과는 세포를 7일 동안 TNF-α 및 서열번호: 135의 서열을 갖는 올리고머를 동시에 처리하는 경우 획득하였다. HSP27는 사멸 수용체 경로에 참여하는 것으로 보고되고 이런 결과는 이런 경로의 조절에서 HSP27의 제안된 역할을 지지한다.
이런 이유로, 항-HSP27 올리고뉴클레오티드는 다양한 기존의 세포독성 - 예를 들면 트레일(TRAIL), 5-플루오르유라실(5-fluoruracil), 빈크리스틴(vincristine), 독소루비신(doxorubicin), 및 캄토테신(camptothecin)과 조합으로 치료학적으로 사용될 수 있다. 다른 조합은 방사선 감작제로서 항-HSP27 올리고뉴클레오티드, 또는 특히 이런 약제에 대한 내성이 있는 경우, 다양한 항암 항체 또는 소분자와 조합으로 사용하는 것을 포함할 수 있다.
결론적으로, HSP27의 샤페론 기능은 많은 치료법의 세포독성 활성에 대한 내성에 역할을 할 수 있고 HSP27 안티센스 분자는 이런 약제의 조합의 전체적인 치료적 효능의 증진에 대한 유의적인 대응 활성을 제공할 수 있다.
실시예 19. 동물 모델에서 항- HSP27 올리고뉴클레오티드의 항-종양 효과
두 인간 종양 모델, PC3 (인간 전립선암 세포주) 및 DU-145 (인간 전립선암 세포주)는 마우스의 이종이식 연구에서 종양 성장 억제 (TGI)를 보여주기 위한 항-HSP27 올리고뉴클레오티드의 능력을 조사하였다. 첫 번째 연구에서, PC3의 피하의 종양을 비흉선 누드 마우스에 확립한 후 종양 부피를 대략 100 mm3에 도달하였으며, 마우스를 5개의 올리고뉴클레오티드, 서열번호: 129, 130, 131, 132, 및 135 중 하나를 3, 10, 30, 또는 100 mg/kg 중 어느 하나의 정맥주사 투여량으로 투여하였다. 식이요법 투여는 4번의 총 투여량을 위해 3일 마다 수행하였다. 항종양 효과는 26% - 66% TGI를 나타내는, 평균 종양 부피 (군 당 5 마우스)를 기초로, 10일에 종양 성장 억제로, 서열번호: 130, 131, 및 135에서 관찰하였다. 마우스에서 PC3 또는 DU-145 종양 이종이식으로의 두 번째 연구는 총 10번의 투여량 동안 3일 마다 3 mg/kg의 서열번호: 135를 이용하여 수행하였다. 30% TGI는 29일에 이런 투여량에서 PC3 및 DU-145 모델 모두에서 관찰되었다. 3일째는 10번의 투여량 동안 3일 마다 60 mg/kg의 i.v. 투여량에서 PC3 이종이식 모델에서 서열번호: 135의 TGI 효과를 검사하였다. 40% TGI는 이런 연구에서 통계학적 유의성을 달성하지 않는 평균 종양 부피 (군 당 6 마우스)를 기초로, 29일에 관찰하였다.
실시예 20. 동물 모델에서 항- HSP27 올리고뉴클레오티드에 의한 종양에서 표적 녹다운
인간 종양 모델 PC3 (인간 전립선암 세포주)를 마우스의 이종이식 연구에서 표적 mRNA 및 단백질 녹다운을 보여주기 위한 항-HSP27 올리고뉴클레오티드의 능력을 조사하였다. 이런 연구에서, PC3의 피하 종양을 비흉선 누드 마우스에 확립한 후 종양 부피를 대략 100 mm3에 도달하였으며, 마우스를 5개의 올리고뉴클레오티드, 서열번호: 129, 130, 131, 132, 및 135 중 하나를 3, 10, 30, 또는 100 mg/kg 중 어느 하나의 정맥주사 투여량으로 투여하였다 (서열번호: 129, 130 및 132로 기재되는 서열을 가지는 올리고머에 대한 데이타는 보여주지 않는다). 식이요법 투여는 4번의 총 투여량을 위해 3일 마다 수행하였다. 이런 연구로부터 유래된 종양 조직은 mRNA 분석을 위한 RNA레이터(RNAlater) 또는 단백질 분석을 위한 플래쉬-프로즌(flash-frozen) 중 어느 하나로 수집하였다. PC3 종양 절편은 올리고뉴클레오티드의 최종 투여량 24시간 후에 가공하였다. 정량적 실시간 PCR을 실시예 14에 기재된 바와 같이 수행하였고 면역분석에 의한 단백질 정량은 실시예 17에 기재된 바와 같이 수행하였다.
종양 조직에서 HSP27 mRNA는 서열번호: 131 및 서열번호: 135 각각의 서열을 갖는 올리고머에 대한 30 mg/kg 또는 100 mg/kg 중 어느 하나의 각 화합물에 대한 최대 용인 투여량 (MTD)에서 서열번호: 131 및 서열번호: 135로 기재되는 서열을 갖는 올리고머에 의해 다운-조절되었다 (도 14 참조). 또한 HSP27 단백질 다운-조절은 대략 3배 감소의 다중 종양 시료에서 평균 HSP27 단백질 녹다운으로 올리고머 (서열번호: 131 및 서열번호: 135로 기재되는 서열을 갖는) 모두에 대해 관찰되었다. 서열번호: 135의 서열을 갖는 올리고머로의 mRNA 녹다운은 MTD에서 대략 10배였다. 결론적으로, LNA를 기초로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 대비 HSP27은 식이요법 투여에서 종양 조직에서 표적 특이적 mRNA 및 단백질 다운-조절을 나타내었다.
상기 명세서에 언급된 모든 공개는 참조로서 본 발명에 통합된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변이는 본 발명의 범위 및 사상으로부터 떨어지지 않은 당업자에게 자명할 수 있다. 본 발명이 구체적인 바람직한 실시예와 관련되는 것으로 기재되어 있음에도 불구하고, 청구된 발명은 이런 구체적인 실시예로 지나치게 한정되지 않는 것이 이해될 것이다. 정말로, 생화학 및 분자 생물학 또는 관련 분야의 기술자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 모델의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
<110> Enzon Pharmaceuticals, Inc. Santaris Pharma A/S <120> RNA ANTAGONISTS TARGETING HSP27 <130> 10fpi-12-08 <150> PCT/IB2009/052860 <151> 2009-07-01 <150> EP08104612 <151> 2008-07-02 <150> US61/077588 <151> 2008-07-02 <160> 145 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 1 gagatgtagc catgct 16 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 2 gagatgtagc catgc 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 3 agatgtagcc atgct 15 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 4 gagatgtagc catg 14 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 5 agatgtagcc atgc 14 <210> 6 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<210> 103 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 103 cacagccagt gg 12 <210> 104 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 104 acagccagtg gc 12 <210> 105 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 105 cagccagtgg cg 12 <210> 106 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 106 tatcaaaaga acacac 16 <210> 107 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 107 tatcaaaaga acaca 15 <210> 108 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 108 atcaaaagaa cacac 15 <210> 109 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 109 tatcaaaaga acac 14 <210> 110 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 110 atcaaaagaa caca 14 <210> 111 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 111 tcaaaagaac acac 14 <210> 112 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 112 tatcaaaaga aca 13 <210> 113 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 113 atcaaaagaa cac 13 <210> 114 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 114 tcaaaagaac aca 13 <210> 115 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 115 caaaagaaca cac 13 <210> 116 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 116 tatcaaaaga ac 12 <210> 117 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 117 atcaaaagaa ca 12 <210> 118 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 118 tcaaaagaac ac 12 <210> 119 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 119 caaaagaaca ca 12 <210> 120 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 120 aaaagaacac ac 12 <210> 121 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 121 ccgggagatg tagccatgct cgtc 24 <210> 122 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 122 ctccacggtg cagtgtgccc tcagg 25 <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 123 gcagcgtgta tttccgcgtg aagc 24 <210> 124 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 124 ggactgcgtg gctagcttgg gcat 24 <210> 125 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 125 tgggatggtg atctcgttgg actg 24 <210> 126 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 126 tcggattttg cagcttctgg gccc 24 <210> 127 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 127 gggaggcaca gccagtggcg gcag 24 <210> 128 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer sequence motif - sequence of monomers (nucleotides) <400> 128 aatgtatcaa aagaacacac aggt 24 <210> 129 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 129 gagatgtagc catgct 16 <210> 130 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 130 acggtcagtg tgccct 16 <210> 131 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 131 cgtgtatttc cgcgtg 16 <210> 132 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 132 tgcgtggcta gcttgg 16 <210> 133 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 133 atggtgatct cgttgg 16 <210> 134 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 134 attttgcagc ttctgg 16 <210> 135 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 135 ggcacagcca gtggcg 16 <210> 136 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer design or LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Internucleoside linkage, preferably phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Nucleotide analogue, such as LNA, such as beta-D-oxy LNA <400> 136 tatcaaaaga acacac 16 <210> 137 <211> 865 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 137 ctcaaacacc gcctgctaaa aatacccgac tggaggagca taaaagcgca gccgagccca 60 gcgccccgca cttttctgag cagacgtcca gagcagagtc agccagcatg accgagcgcc 120 gcgtcccctt ctcgctcctg cggggcccca gctgggaccc cttccgcgac tggtacccgc 180 atagccgcct cttcgaccag gccttcgggc tgccccggct gccggaggag tggtcgcagt 240 ggttaggcgg cagcagctgg ccaggctacg tgcgccccct gccccccgcc gccatcgaga 300 gccccgcagt ggccgcgccc gcctacagcc gcgcgctcag ccggcaactc agcagcgggg 360 tctcggagat ccggcacact gcggaccgct ggcgcgtgtc cctggatgtc aaccacttcg 420 ccccggacga gctgacggtc aagaccaagg atggcgtggt ggagatcacc ggcaagcacg 480 aggagcggca ggacgagcat ggctacatct cccggtgctt cacgcggaaa tacacgctgc 540 cccccggtgt ggaccccacc caagtttcct cctccctgtc ccctgagggc acactgaccg 600 tggaggcccc catgcccaag ctagccacgc agtccaacga gatcaccatc ccagtcacct 660 tcgagtcgcg ggcccagctt gggggcccag aagctgcaaa atccgatgag actgccgcca 720 agtaaagcct tagcctggat gcccacccct gctgccgcca ctggctgtgc ctcccccgcc 780 acctgtgtgt tcttttgata catttatctt ctgtttttct caaataaagt tcaaagcaac 840 cacctgtaaa aaaaaaaaaa aaaaa 865 <210> 138 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <400> 138 gagatgtagc catgct 16 <210> 139 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <400> 139 acggtcagtg tgccct 16 <210> 140 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <400> 140 cgtgtatttc cgcgtg 16 <210> 141 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <400> 141 tgcgtggcta gcttgg 16 <210> 142 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <400> 142 atggtgatct cgttgg 16 <210> 143 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <400> 143 attttgcagc ttctgg 16 <210> 144 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <400> 144 ggcacagcca gtggcg 16 <210> 145 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Beta-D-oxy LNA, all LNA cytosines 5methyl cytosine <400> 145 tatcaaaaga acacac 16

Claims (15)

  1. 총 10 ~ 30 모노머 사이의 연속된 서열의 첫번째 부위를 포함하는 10 ~ 30 모노머 사이의 길이이고, 상기 연속된 서열은 서열번호 137로 기재된 서열을 갖는 핵산, 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체와 같은, 포유류 Hsp27 유전자 또는 mRNA, 또는 포유류 Hsp27 유전자 또는 포유류 Hsp27을 암호화하는 핵산의 표적 부위의 역상보에 상응하는 부위에 적어도 80% 상동적인, 올리고머.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 연속된 서열은 서열번호 91 - 105 및 127, 1 - 15 및 121, 16 - 30 및 122, 31 - 45 및 123, 46 - 60 및 124, 61 - 75 및 125, 76 - 90 및 126, 및 106 - 120 및 128 중 어느 서열에 상응하는 부위에 적어도 80%, 바람직하게 적어도 90% 상동적인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 연속된 서열은 서열번호 137에 상응하는 부위의 역상보와 미스매치가 없거나 오직 1개 또는 2개의 미스매치를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고머.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속된 서열은 10 ~ 18 모노머 사이의 길이인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속된 서열은 뉴클레오시드 유사체(analogues)를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고머.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 잠금핵산(Locked Nucleic Acid, LNA) 유닛; 2'-O-알킬-RNA(2'-O-alkyl-RNA) 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA(2'-amino-DNA) 유닛, 및 2'-플루오로-DNA(2'-fluoro-DNA) 유닛으로 구성된 군으로부터 선택되는 당 변형된 뉴클레오시드; 바람직하게 상기 뉴클레오시드 유사체는 LNA와 같은, 당 변형된 뉴클레오시드인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 갭머(gapmer)인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, Hsp27 유전자 또는 mRNA를 발현하는 세포에서 Hsp27 유전자 또는 mRNA의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 올리고머.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머는 서열번호 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 및 136로 구성된 군으로부터 선택되는; 바람직하게 상기 올리고머는 서열번호 131 또는 서열번호 135인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 올리고머, 및 상기 올리고머에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 결합체(conjugate).
  11. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 10항의 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물.
  12. 암, 근병증(myopathies) 및 천식의 치료와 같은, 약제로서 사용을 위한, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 10항의 결합체.
  13. 암, 근병증 및 천식의 치료용 약제의 제조를 위한, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 올리고머 또는 제 10항에서 정의된 결합체의 용도.
  14. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 10항의 결합체, 또는 제 11항의 약학적 조성물을 암, 근병증 및 천식으로부터 고통받거나, 또는 고통받을 것 같은 동물에게, 투여하는 단계를 포함하는, 암, 근병증 및 천식의 치료 방법.
  15. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 10항의 결합체를 Hsp27을 발현하는 세포에서 Hsp27을 억제하기 위하여 상기 세포로 투여하는 단계를 포함하는, Hsp27을 발현하는 세포에서 Hsp27의 억제 방법.
KR1020117002343A 2008-07-02 2009-07-01 Hsp27을 표적화하는 rna 길항제 KR20110025863A (ko)

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