KR20110005862A - 변형된 제ｉｘ인자 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변형된 제IX인자 폴리펩티드, 예컨대 하나 이상의 글리코실화 부위가 도입된 제IX인자 폴리펩티드에 관한 것이다. 변형된 제IX인자 폴리펩티드는 증가된 시험관내 또는 생체내 안정성, 예컨대 더 긴 혈장 반감기를 나타낼 수 있다. 또한 본 발명은 변형된 제IX인자 폴리펩티드의 제조 방법, 및 변형된 제IX인자 폴리펩티드의 사용 방법, 예를 들어, B형 혈우병에 걸린 환자를 치료하기 위해 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 출원은 미국 가출원 제61/124,567호 (2008년 4월 16일 출원), 및 미국 가출원 제61/045,961호 (2008년 4월 17일 출원)을 우선권으로 청구하고, 이들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 변형된 제IX인자 폴리펩티드, 예컨대 하나 이상의 글리코실화 부위가 도입된 제IX인자 폴리펩티드에 관한 것이다. 변형된 제IX인자 폴리펩티드는 증가된 시험관내 또는 생체내 안정성, 예컨대 더 긴 혈장 반감기를 나타낼 수 있다. 또한 본 발명은 변형된 제IX인자 폴리펩티드의 제조 방법, 및 변형된 제IX인자 폴리펩티드의 사용 방법, 예를 들어, B형 혈우병에 걸린 환자를 치료하기 위해 사용하는 방법에 관한 것이다.
B형 혈우병은 34,500명의 남성 중 1명에서 초래되고, 혈액 내의 낮은 또는 검출불가능한 제IX 응고 인자 (FIX) 단백질을 초래하는 FIX를 코딩하는 유전자에서의 다양한 유전적 결함에 의해 야기된다 ([Kurachi, et al., Hematol. Oncol. Clin. North Am. 6:991-997, 1992]; [Lillicrap, Haemophilia 4:350-357, 1998]). 불충분한 수준의 FIX는 결함이 있는 응고, 및 제어되지 않은 출혈로부터 초래되는 증상에 이른다. B형 혈우병은 이미 시작된 출혈을 정지시키거나 출혈이 발생하는 것을 방지 (예방)하기 위한 혈장-유래 또는 재조합 FIX 단백질의 정맥내 주입에 의해 효과적으로 치료된다 ([Dargaud, et al., Expert Opin. Biol. Ther. 7:651-663]; [Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6:1517-1524, 2005]). 효과적인 예방은 정상 수준의 약 1％인 최소 저점 수준의 FIX를 유지하는 것을 필요로 한다 ([Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6:1517-1524, 2005]). 천연 FIX (혈장-유래 또는 재조합)의 약 18시간 내지 24시간의 반감기로 인해, FIX 수준이 볼루스(bolus) 주사 후 3일 내지 4일 이내에 정상 수준의 1％ 미만으로 떨어지고, 이는 효과적인 예방을 달성하기 위해 평균적으로 3일마다 주사를 반복하는 것을 필요로 한다 ([Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6:1517-1524, 2005]). 이같은 빈번한 정맥내 주사는 환자에게 문제가 되고, 효과적인 예방 달성에 대한 장애물이며 ([Petrini, Haemophilia 13 Suppl 2:16-22, 2007]), 특히 어린이에서 그러하다. 반감기가 더 긴 FIX 단백질은 덜 빈번한 투여를 가능하게 할 것이고, 따라서 상당한 의학적 이점이 있을 것이다.
발명의 개요
본 출원은 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입함으로써 변형된 아미노산 서열을 포함하는 FIX 폴리펩티드 (변형된 FIX 폴리펩티드, FIX 뮤테인(mutein), 또는 FIX 변이체로 또한 지칭됨)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 글리코실화 부위는 N-연결 글리코실화 부위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 응고 활성을 지닌다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 R338A 및 V86A와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 1개 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 R338A 및 V86A 치환 양쪽 모두를 포함할 수 있다.
본 출원은 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입함으로써 변형된 아미노산 서열을 포함하는 FIX 폴리펩티드를 또한 제공한다. FIX 폴리펩티드는 하나 이상의 도입된 글리코실화 부위에 부착된 탄수화물 사슬을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 탄수화물 사슬은 N-연결 탄수화물 사슬일 수 있다. 일부 실시양태에서, 탄수화물 사슬은 포유류 탄수화물 사슬 구조를 지닐 수 있다. 일부 실시양태에서, 탄수화물 사슬은 인간 탄수화물 사슬 구조를 지닐 수 있다. 일부 실시양태에서, 도입된 글리코실화 부위들 중 하나 이상에서의 탄수화물 사슬의 부착은 폴리펩티드의 혈청 반감기를, 예를 들어, 도입된 글리코실화 부위가 없는 폴리펩티드에 비해 30％ 이상만큼 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 도입된 글리코실화 부위들 중 하나 이상에서의 탄수화물 사슬의 부착은 폴리펩티드의 분비량을, 예를 들어, 도입된 글리코실화 부위가 없는 폴리펩티드의 분비량에 비해 50％를 초과하는 만큼 감소시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 도입된 글리코실화 부위들 중 하나 이상에서의 탄수화물 사슬의 부착은 폴리펩티드와 제VIII인자 (FVIII), 제XI인자 (FXI) 또는 제X인자 (FX) 중 하나 이상의 상호작용을, 예를 들어, 도입된 글리코실화 부위에 탄수화물 사슬이 없는 폴리펩티드와 FVIII, FXI 또는 FX의 상호작용에 비해 50％를 초과하는 만큼 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드의 비활성은, 예를 들어, 폴리펩티드 ㎎ 당 적어도 100 유닛(unit)일 수 있다.
하나 이상의 글리코실화 부위는 하나 이상의 아미노산 치환을 통해 도입될 수 있다. 치환은 표면에 노출된 잔기에서의 치환일 수 있고/있거나 B형 혈우병과 관련된 것으로 공지된 돌연변이를 도입하지 않는 치환에 한정될 수 있다. 예시적인 실시양태에는 하기와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 포함된다:
(a) G4T; E33N; E36T; E36N; R37N; F75N; F77T; E83T; D85N; V86A; K91T; A103T; V107T; K122N; K122T; S138N; A146N; T148N; F150T; P151N; T159N; A161T; A161N; T169N; Q170N; T172N; D177N; D177E; F178T; K201N; K201T; K214T; V223N; G226N; Y226T; K228N; K228T; E239N; E242N; I251T; A262T; E294N; R338A; R338N; K341N; F353N; H354V; H354I; E355T; V370N; T371V; T371I; E372T; E374N; M391N; K392V; G393T; E410N; K413N; L414I;
(b) Y1N 및 S3T; S3N 및 K5T; G4N 및 L6T; K5N 및 E7T; L6N 및 E8T; E7N 및 F9T; F9N 및 Q11T; V10N 및 G12T; Q11N 및 N13T; G12N 및 L14T; N13 및 E15T; L14N 및 R16T; E15N 및 E17T; M19N 및 E21T; E20N 및 K22T; S24N 및 E26T; F25N 및 E27T; E26N 및 A28T; E27N 및 R29T; A28N 및 E30T; R29N 및 V31T; E30N 및 F32T; V31N 및 E33T; F32N 및 N34T; T35N 및 R37T; T38N 및 E40T; T39N 및 F41T; E40N 및 W42T; F41N 및 K43T; W42N 및 Q44T; K43N 및 Y45T; Q44N 및 V46T; Y45N 및 D47T; V46N 및 G48T; E52N 및 N54T; S53N 및 P55T; G59N 및 S61T; K63N 및 D65T; I66N 및 S68T; S68N 및 E70T; G76N 및 E78T; E78N 및 K80T; E83N 및 D85T; L84N 및 V86T; I90N 및 N92T; K100N 및 S102T; S102N 및 D104T; A103N 및 N105T; D104N 및 K106T; K106N 및 V108T; R116N 및 A118T; E119N 및 Q121T; Q121N 및 S123T; A127N 및 P129T; V135N 및 V137T; S136N 및 S138T; V137N 및 Q139T; Q139N 및 S141T; T140N 및 K142T; S141N 및 L143T; E147N 및 V149T; T148N 및 F150T; V149N 및 P151T; P151N 및 V153T; D152N 및 D154T; V153N 및 Y155T; D154N 및 V156T; Y155N 및 N157T; V156N 및 S158T; S158N 및 E160T; T159N 및 A161T; E160N 및 E162T; E162N 및 I164T; T163N 및 L165T; I164N 및 D166T; L165N 및 N167T; D166N 및 I168T; I168N 및 Q170T; T169N 및 S171T; S171N 및 Q173T; T172N 및 S174T; Q173N 및 F175T; S174N 및 N176T; G184N 및 D186T; E185N 및 A187T; D186N 및 K188T; A187N 및 P189T; P189N 및 Q191T; G200N 및 V202T; K201N 및 D203T; V202N 및 A204T; E224N 및 G226T; T225N 및 V227T; G226N 및 K228T; V227N 및 I229T; H236N 및 I238T; I238N 및 E240T; E240N 및 E242T; T241N 및 H243T; H243N 및 E245T; K247N 및 N249T; V250N 및 R252T; I251N 및 I253T; I253N 및 P255T; A261N 및 I263T; A262N 및 N264T; D276N 및 P278T; V280N 및 N282T; F302N 및 S304T; S304N 및 Y306T; R312N 및 F314T; V313N 및 H315T; F314N 및 K316T; H315N 및 G317T; K316N 및 R318T; G317N 및 S319T; S319N 및 L321T; A320N 및 V322T; R327N 및 P329T; P329N 및 V331T; D332N 및 A334T; L337N 및 S339T; S339N 및 K341T; T340N 및 F342T; T343N 및 Y345T; G352N 및 H354T; F353N 및 E355T; H354N 및 G356T; E355N 및 G357T; G356N 및 R358T; G357N 및 D359T; E372N 및 E374T; W385N 및 E387T; G386N 및 E388T; A390N 및 K392T;
(c) D85N, K122T, 및 I251T; D85N, K122T, 및 E242N; E125N, P126A, 및 A127T; P126N, V128T, 및 P129A; T148N, F150T, 및 P151A; F150N, P151A, 및 D152T; P151N, V153T, 및 A161N; P151N, V153T, 및 t172n; V153N, Y155T, 및 E294N; T172N, G226N, 및 K228T; F353N, H354V, 및 E355T; F353N, H354I, 및 E355T; V370N, T371V, 및 E372T; V370N, T371I, 및 E372T; M391N, K392V, 및 G393T; D85N, P151N, V153T, 및 K228N; D85N, P151N, V153T, 및 E242N; K122T, P151N, V153T, 및 K228N; K122T, P151N, V153T, 및 E242N; K122T, P151N, V153T, 및 I251T; T148N, F150T, G226N, 및 K228T; P151N, V153T, T172N, 및 R338A; P151N, V153T, D177E, 및 F178T; P151N, V153T, G226N, 및 K228T; T172N, G226N, K228T, 및 R338A; D85N, K122T, P151N, V153T, 및 E242N; D85N, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; K122T, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; S138N, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; T148N, F150T, G226N, K228T, 및 R338A; P151N, V153T, T172N, G226N, 및 K228T; P151N, V153T, D177E, F178T, 및 R338A; P151N, V153T, G226N, K228T, 및 R338A; 및 P151N, V153T, T172N, G226N, K228T, 및 R338A; 및 이들의 임의의 조합.
하나 이상의 글리코실화 부위는 FIX의 촉매 도메인 또는 활성화 펩티드 내로 도입될 수 있다. 예시적인 실시양태에는 하기와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 포함된다: R37N; D85N; K122T; S138N; A146N; A161N; Q170N; T172N; D177N; F178T; K201N; K228N; E239N; E242N; I251T; A262T; E294N; E374N; 및 E410N. 또다른 실시양태는 하나 이상의 하기와 같은 치환을 포함하는 하기 FIX 폴리펩티드를 포함할 수 있다: G59N 및 S61T; K63N 및 D65T; G76N 및 E78T; S102N 및 D104T; A103N 및 N105T; D104N 및 K106T; E119N 및 Q121T; Q121N 및 S123T; S136N 및 S138T; Q139N 및 S141T; T140N 및 K142T; T148N 및 F150T; V149N 및 P151T; P151N 및 V153T; D152N 및 D154T; V153N 및 Y155T; D154N 및 V156T; V156N 및 S158T; S158N 및 E160T; E160N 및 E162T; E162N 및 I164T; T163N 및 L165T; I164N 및 D166T; D166N 및 I168T; I168N 및 Q170T; S171N 및 Q173T; T172N 및 S174T; Q173N 및 F175T; S174N 및 N176T; K201N 및 D203T; V202N 및 A204T; E224N 및 G226T; T225N 및 V227T; G226N 및 K228T; T241N 및 H243T; I251N 및 I253T; I253N 및 P255T; A262N 및 N264T; V280N 및 N282T; T343N 및 Y345T; 및 E372N 및 E374T; F150N, P151A, 및 D152T. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는, 예를 들어, R338A 및 V86A와 같은 1개 이상의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 R338A 및 V86A 치환 양쪽 모두를 추가로 포함할 수 있다.
O-연결 글리코실화 부위를 N-연결 글리코실화 부위로 변환시킴으로써 하나 이상의 글리코실화 부위가 도입될 수 있다. 예시적인 실시양태에는 T169N; T172N; T148N 및 F150T; 및 T159N 및 A161T와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 치환이 포함된다. 일부 실시양태에서, 치환은 T172N; T148N 및 F150T; 및 T159N 및 A161T일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 R338A 및 V86A와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 1개 이상의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 R338A 및 V86A 치환 양쪽 모두를 추가로 포함할 수 있다.
1개 내지 12개 사이의 아미노산 잔기를 아미노산 잔기 160-164 사이에 삽입함으로써 하나 이상의 글리코실화 부위가 도입될 수 있다. 아미노산 잔기 160-161 사이, 아미노산 잔기 161-162 사이, 아미노산 잔기 162-163 사이, 또는 아미노산 잔기 163-164 사이에 글리코실화 부위가 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 2가 아미노산 잔기 160-161 사이, 아미노산 잔기 161-162 사이, 아미노산 잔기 162-163 사이, 또는 아미노산 잔기 163-164 사이에 도입될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 1개 내지 12개 사이의 아미노산 잔기를 FIX 폴리펩티드의 C-말단에 부가함으로써 글리코실화 부위가 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 4, 5, 6, 또는 7이 FIX 폴리펩티드의 C-말단에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노산 치환 D177E 및 F178T를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노산 치환 P151N 및 V153T를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노산 치환 T172N을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노산 치환 P151N, V153T, 및 T172N을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노산 치환 T148N 및 F150T를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노산 치환 G226N 및 K228T를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 R338A 및 V86A와 같은 치환을 1개 이상 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 R338A 및 V86A 치환 양쪽 모두를 추가로 포함할 수 있다.
예시적인 실시양태에서, 하나 이상의 하기와 같은 치환을 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다: D85N; K122T; S138N; T172N; K201N; K228N; E239N; E242N; I251T; A262T; E294N; G59N 및 S61T; G76N 및 E78T; S102N 및 D104T; A103N 및 N105T; D104N 및 K106T; E119N 및 Q121T; Q121N 및 S123T; S136N 및 S138T; Q139N 및 S141T; T140N 및 K142T; T148N 및 F150T; V149N 및 P151T; P151N 및 V153T; D152N 및 D154T; S158N 및 E160T; E162N 및 I164T; T163N 및 L165T; T172N 및 S174T; Q173N 및 F175T; K201N 및 D203T; T225N 및 V227T; G226N 및 K228T; I253N 및 P255T; A262N 및 N264T; V280N 및 N282T; E372N 및 E374T; F150N, P151A, 및 D152T; A161과 E162 사이의 서열 2의 삽입; 및 G226N, K228T, 및 A161과 E162 사이의 서열 2의 삽입. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는, 예를 들어, R338A 및 V86A와 같은 치환을 1개 이상 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 R338A 및 V86A 치환 양쪽 모두를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원은 R338A 치환 및 V86A 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드를 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 비활성이 폴리펩티드 ㎎ 당 적어도 700 유닛일 수 있다.
본 출원은 변형된 FIX 폴리펩티드 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 제제를 또한 제공한다.
본 출원은 B형 혈우병의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본원에 기술된 제약 제제를 투여하는 단계를 포함하는, B형 혈우병을 치료하는 방법을 또한 제공한다.
본 출원은 변형된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 뿐만 아니라 이러한 DNA 서열로 형질감염된 진핵 숙주 세포를 또한 제공한다.
본 출원은 (i) 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입함으로써 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형시키는 단계; (ii) 폴리펩티드를 하나 이상의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 허용하는 방식으로 발현시키는 단계; 및 (iii) 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하는, 변형된 FIX 폴리펩티드의 제조 방법을 또한 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 8가지 종으로부터의 활성화 펩티드 내의 FIX 서열의 다중 서열 정렬을 나타낸다.
도 2는 FIX의 글리코실화 부위 뮤테인으로 형질감염된 HKB11 세포로부터의 배지의 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석을 나타낸다. 항-FIX-HRP 항체를 사용하여 FIX 단백질을 검출하였다.
도 3은 HKB11 세포에서의 FIX 글리코실화 부위 뮤테인의 발현 및 활성의 표를 나타낸다. ELISA에 의해 발현을 결정하였고, aPTT 분석법에 의해 활성을 결정하였다. 비활성은 FIX 단백질 ㎎ 당 국제 유닛으로 계산된다. 동일한 형질감염 실험에서 실행된 FIX-R338A의 백분율로서 값들을 변환시켰다. (없음): 이동성에서의 변화 없음, (+): 이동성 감소 (+의 개수는 정도를 가리킴), (-): 이동성 증가.
도 4는 HKB11 세포에서의 FIX 글리코실화 부위 뮤테인의 발현 수준, 응고 활성, 및 비활성을 나타낸다. 값들은 FIX-R338A 뮤테인의 백분율로서 표현된다. 도 3에 구축물들이 기술되어 있다.
도 5는 FIX의 G226N, K228T 글리코실화 부위 뮤테인으로 형질감염된 HKB11 세포로부터의 배지의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 항-FIX-HRP 항체를 사용하여 FIX 단백질을 검출하였다.
도 1은 8가지 종으로부터의 활성화 펩티드 내의 FIX 서열의 다중 서열 정렬을 나타낸다.
도 2는 FIX의 글리코실화 부위 뮤테인으로 형질감염된 HKB11 세포로부터의 배지의 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석을 나타낸다. 항-FIX-HRP 항체를 사용하여 FIX 단백질을 검출하였다.
도 3은 HKB11 세포에서의 FIX 글리코실화 부위 뮤테인의 발현 및 활성의 표를 나타낸다. ELISA에 의해 발현을 결정하였고, aPTT 분석법에 의해 활성을 결정하였다. 비활성은 FIX 단백질 ㎎ 당 국제 유닛으로 계산된다. 동일한 형질감염 실험에서 실행된 FIX-R338A의 백분율로서 값들을 변환시켰다. (없음): 이동성에서의 변화 없음, (+): 이동성 감소 (+의 개수는 정도를 가리킴), (-): 이동성 증가.
도 4는 HKB11 세포에서의 FIX 글리코실화 부위 뮤테인의 발현 수준, 응고 활성, 및 비활성을 나타낸다. 값들은 FIX-R338A 뮤테인의 백분율로서 표현된다. 도 3에 구축물들이 기술되어 있다.
도 5는 FIX의 G226N, K228T 글리코실화 부위 뮤테인으로 형질감염된 HKB11 세포로부터의 배지의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 항-FIX-HRP 항체를 사용하여 FIX 단백질을 검출하였다.
발명의 상세한 설명
본 출원은 하나 이상의 O- 또는 N-연결 글리코실화 부위를 포함하는 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 치료용 단백질의 증가된 글리코실화는 1) 감소된 면역원성; 2) 단백질의 덜 빈번한 투여; 3) 증가된 단백질 안정성, 예컨대 증가된 혈청 반감기; 및 4) 불리한 부작용, 예컨대 염증의 감소를 달성하는데 사용될 수 있다.
본 출원은 하나 이상의 추가적인 글리코실화 부위가 있는 인간 FIX의 변이체를 제공한다. 변형된 FIX 폴리펩티드는 또한 혈장 반감기가 증가될 수 있고, 이는, 예를 들어, B형 혈우병 환자에서의 출혈에 대한 보호 기간 연장을 제공할 것이다. 변형된 FIX 폴리펩티드는 야생형 FIX 단백질의 현재 이용가능한 치료법으로 가능한 것보다 더 적은 FIX 주사로 B형 혈우병 환자가 출혈에 대한 보호를 달성할 수 있게 할 것이다.
본 출원은 촉매 도메인 및 활성화 펩티드 양쪽 모두 내에 기능성 글리코실화 부위가 생성된 다수의 예시적인 FIX 변이체를 제공한다. 또한, 본 출원은 이러한 변이체들이 포유류 세포에서 발현될 수 있고, 증가된 글리코실화를 가리키는 증가된 겉보기 분자량을 지니며, 응고 분석법에서 50％ 내지 100％ 사이의 활성을 유지한다는 것을 실연한다. 마지막으로, 이러한 변형 부위들이 R338A 치환 및/또는 V86A 치환을 포함하지만 이에 한정되지 않는, FIX의 비활성을 강화하는 변형과 조합될 수 있다 ([Chang, et al., J. Biol. Chem. 273:12089-12094, 1998] 및 [Chang, et al., J. Biol. Chem. 277:25393-25399, 2002]). R338A 및 V86A 치환 중 하나 또는 양쪽 모두와의 조합은 변형된 폴리펩티드의 비활성이 야생형 FIX의 비활성과 유사하거나 이보다 더 높을 수 있도록 글리코실화 부위의 부가로부터 초래되는 임의의 활성 감소를 보상한다.
일단 발현되면, 야생형 FIX는 약 55,000 돌턴의 단일쇄 당단백질이다. 구조적으로 이는 4개의 도메인이 있는 것으로 간주될 수 있다: Gla 또는 감마 카르복시글루타메이트-풍부 도메인; EGF-유사 영역; 활성화 펩티드; 및 활성 부위를 함유하는 촉매 도메인 ([Thomson, Blood 67:565-572, 1986]). FIX는 간에서 아미노산 461개의 단일쇄 폴리펩티드로 합성되고, 골지 및 세포질세망을 통과하는 동안 광범위한 번역후 변형을 겪는다 ([Nemerson, et al., CRC Crit. Rev. Biochem. 9:45-48, 1980]; [Stenflo, et al., Annu. Rev. Biochem. 46:157-172, 1977]). 신호 서열 및 프로펩티드(propeptide) 양쪽 모두가 제거되어, 아미노산 415개 (서열 1)의 성숙형 단백질이 초래된다 ([Choo, et al., Nature 299:178-180, 1982]; [Kurachi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6461-6464, 1982]). 효율적인 감마 카르복실화가 FIX의 응고 활성에 필수적이고, 인간의 경우 12개의 Gla 잔기가 N-말단 Gla 도메인 내에 생성되지만, Gla36 및 Gla40 상에서의 감마 카르복실화는 기능에 요구되지 않는다 ([DiScipio, et al., Biochemistry 18:899-904, 1979]; [Gillis, et al., Protein Sci. 6:185-196, 1997]). 또한, FIX는 2개의 N-연결 글리코실화 부위 (N157, N167), 6개의 O-연결 글리코실화 부위 (S53, S61, T159, T169, T172, T179), 및 Ser 인산화 (S158), 타이로신 황산화 (Y155) 및 β-하이드록실화 (D64)를 위한 각각 1개의 부위를 함유한다 ([McMullen, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 115:8-14, 1983]).
활성화된 제VII인자 (FVII)는 혈관벽에 대한 손상의 결과로서 노출된 조직 인자 (TF)와 복합체를 형성함으로써 정상적인 지혈 프로세스를 개시시킨다. 이어서 복합체가 FIX를 활성화시킨다; 활성 형태는 FIXa로 지칭된다. FIX의 활성화 펩티드가 제XIa인자 (FXIa) 또는 조직 인자 (TF)/제VIIa인자 복합체에 의해 2개의 부위에서 단백질분해성 절단에 의해 제거되어, 촉매적으로 활성인 분자인 제IXa인자 (FIXa)가 생성된다. FIXa 및 제VIIIa인자 (FVIIIa)가 FX를 제Xa인자 (FXa)로 변환시키고, 차례로 이는 프로트롬빈을 트롬빈으로 변환시킨다. 그후, 트롬빈이 피브리노겐을 피브린으로 변환시켜, 피브린 응괴의 형성이 초래된다.
야생형 FIX에 다수의 번역후 변형이 있고 이들 중 일부는 생체내 약동학 프로파일에서 역할을 하는 것으로 제안되기 때문에, 이러한 다른 변형들에 영향을 미치지 않는 위치에서 이소성 글리코실화 부위가 도입될 수 있다. 일단 생산되면, B형 혈우병에 대한 효과적인 치료이기 위하여 FIX는 효소 활성을 유지하여야 하고 FVIII, FXI, 및 FX와 상호작용하여야 한다. 도입된 글리코실화 부위는 이러한 상호작용 및 기능을 교란하지 않아야 한다. 본 출원은, 부분적으로, 기능을 최소로 교란하면서 글리코실화 부위의 개수 증가를 초래할 것이고 따라서 FIX의 생체이용률을 증가시키는데 유용할 FIX 변형을 제공한다. 마지막으로, 이러한 변형 부위들이 R338A 치환 및/또는 V86A 치환을 포함하지만 이에 한정되지 않는, FIX의 비활성을 강화하는 변경과 조합될 수 있다. FIX의 비활성을 강화하는 변경은 응고 활성의 잠재적인 손실을 보상할 수 있고, 또한 더 낮은 단백질 수준에서 효능을 부여함으로써 변형된 분자의 효능을 잠재적으로 연장시킬 수 있다.
변형된
FIX
폴리펩티드
본 출원은 하나 이상의 도입된 글리코실화 부위를 포함하는 FIX 폴리펩티드, 즉, 변형된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 본원에서 사용된 "제IX인자"는 내인성 응고 경로의 구성원이고 혈액 응고에 필수적인 인간 혈장 FIX 당단백질을 지칭한다. 이러한 정의는 천연 형태, 뿐만 아니라 재조합 형태의 인간 혈장 FIX 당단백질을 포함하는 것으로 이해된다. 달리 상술되거나 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 FIX는 응고에서 자신의 정상적인 역할을 하는 임의의 기능성 인간 FIX 단백질 분자를 의미하고, 이의 임의의 단편, 유사체, 변이체 및 유도체를 포함한다. 용어 "단편", "유도체", "유사체", "뮤테인", 및 "변이체"는, 본 출원의 폴리펩티드를 지칭하는 경우에, 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 유지하는 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체, 뮤테인 및 변이체를 의미한다.
FIX 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 FIX, FIXa, 및 FIX 활성이 있는 FIX의 말단절단(truncated) 버젼이 포함된다. 어느 정도 이상의 FIX 활성을 유지하는 상기 물질들 중 임의의 것의 생물학적으로 활성인 단편, 결실 변이체, 치환 변이체, 또는 부가 변이체가 또한 FIX 폴리펩티드의 구실을 할 수 있다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 서열 1에 대해 적어도 약 70, 80, 90, 또는 95％ 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 생물학적으로 활성이다. 생물학적 활성은, 예를 들어, 본원에 기술된 응고 분석법에 의해 결정될 수 있다.
변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산의 보존적 치환을 또한 함유할 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산이 성질이 유사한 또다른 아미노산을 치환하는 것으로 당업계에서 인지되고, 예를 들어, 알라닌 → 세린; 아르기닌 → 라이신; 아스파라긴 → 글루타민 또는 히스티딘; 아스파르테이트 → 글루타메이트; 시스테인 → 세린; 글루타민 → 아스파라긴; 글루타메이트 → 아스파르테이트; 글리신 → 프롤린; 히스티딘 → 아스파라긴 또는 글루타민; 이소류신 → 류신 또는 발린; 류신 → 발린 또는 이소류신; 라이신 → 아르기닌; 메티오닌 → 류신 또는 이소류신; 페닐알라닌 → 타이로신, 류신 또는 메티오닌; 세린 → 트레오닌; 트레오닌 → 세린; 트립토판 → 타이로신; 타이로신 → 트립토판 또는 페닐알라닌; 및 발린 → 이소류신 또는 류신의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 1의 FIX 폴리펩티드는 하나 이상의 글리코실화 부위의 도입에 더하여 1-30개, 1-20개, 또는 1-10개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
특정 아미노산에 대한 단일 문자 약어, 이의 상응하는 아미노산, 및 3문자 약어는 하기와 같다: A, 알라닌 (Ala); C, 시스테인 (Cys); D, 아스파르트산 (Asp); E, 글루탐산 (Glu); F, 페닐알라닌 (Phe); G, 글리신 (Gly); H, 히스티딘 (His); I, 이소류신 (Ile); K, 라이신 (Lys); L, 류신 (Leu); M, 메티오닌 (Met); N, 아스파라긴 (Asn); P, 프롤린 (Pro); Q, 글루타민 (Gln); R, 아르기닌 (Arg); S, 세린 (Ser); T, 트레오닌 (Thr); V, 발린 (Val); W, 트립토판 (Trp); Y, 타이로신 (Tyr); 및 노르류신 (Nle).
폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티(moiety)가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser 및 Asn-X-Thr (식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 Asn 측쇄에 탄수화물 모이어티가 효소에 의해 부착되는 것에 대한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내에 이러한 트리펩티드 서열들 중 어느 하나가 존재하는 것은 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위를 생성시킨다. 본 발명에 유용한 예시적인 N-연결 글리코실화 부위는 또한 하기와 같이 표시될 수 있다: X1-Asn-X2-X3-X4 (식 중 X1은 임의적으로 Asp, Val, Glu, Gly, 또는 Ile이고; X2는 Pro를 제외한 임의의 아미노산이고; X3은 Ser 또는 Thr이고; X4는 임의적으로 Val, Glu, Gly, Gln, 또는 Ile임). 일부 실시양태에서, X1은 임의적으로 Asp이고; X2는 Ser이고; X3은 Thr이고; X4는 Gln이다. 일부 실시양태에서, X1은 Asp이고; X2는 Ile이고; X3은 Thr이고; X4는 Gln이다. 상기 기술된 트리펩티드 서열 중 하나 이상이 도입되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 FIX 폴리펩티드에 N-연결 글리코실화 부위를 부가하는 것이 달성된다.
O-연결 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나가 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신에 부착되는 것 또한 가능하다. O-연결 글리코실화 부위를 FIX 폴리펩티드에 부가하는 것은 하나 이상의 Ser 또는 Thr 잔기가 도입되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실시킴으로써, 하나 이상의 내인성 FIX 아미노산 잔기를 또다른 아미노산(들)로 치환함으로써, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 부가함으로써, 글리코실화 부위가 도입될 수 있다. 아미노산 잔기는 2개의 현존하는 아미노산 잔기 사이에서 또는 천연 FIX 분자의 N- 또는 C-말단 끝부분에서 부가될 수 있다.
사용된 아미노산 치환에 대한 용어법은 하기와 같다. 첫번째 문자는 인간 FIX의 소정의 위치에 본래 존재하는 아미노산 잔기를 나타낸다. 이어지는 숫자는 성숙형 인간 FIX 아미노산 서열 (서열 1)에서의 위치를 나타낸다. 두번째 문자는 천연 아미노산을 치환 (교체/치환)하는 상이한 아미노산을 나타낸다. 예로서, R338A는 서열 1의 위치 338의 Arg 잔기가 Ala 잔기로 교체되었음을 표시한다. 인간 FIX 폴리펩티드의 추가적인 5' 아미노산 서열 (46개의 아미노산)을 포함하는 서열 26에 관하여, 서열 1의 위치 338은 서열 26의 위치 384에 상응한다.
본원에서 사용된 FIX 잔기 번호 시스템은 성숙형 인간 FIX 단백질의 시스템을 지칭하고, 이때 잔기 1은 신호 서열 및 프로펩티드 양쪽 모두의 제거 후의 성숙형 FIX 폴리펩티드의 첫번째 아미노산을 나타낸다. 천연 또는 야생형 FIX는 서열 1에 제시된 바와 같은 전장 성숙형 인간 FIX 분자이다.
일부 실시양태에서, 단백질의 기능 또는 세포에서의 이의 발현을 폐지하지 않을 위치에서 글리코실화 부위가 FIX에서 조작된다. 하나 이상의 도입된 글리코실화 부위를 포함하는 FIX 폴리펩티드를 디자인하기 위해, 여러 기준이 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 도입된 글리코실화 부위는 표면에 노출된다. 표면 노출은 [Autin, et al., J. Thromb. Haemost. 3:2044-56, 2005]에서 결정된 바와 같이 용매 접근가능 표면적을 기초로 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 도입된 글리코실화 부위는 B형 혈우병과 관련된 것으로 공지된 돌연변이를 도입하지 않는다. 공지된 돌연변이들을 kcl.ac.uk/ip/petergreen/haemBdatabase.html의 월드와이드웹 및 표 1에서 확인할 수 있다.
[표 1]
하나 이상의 글리코실화 부위가 도입된 변형된 FIX 폴리펩티드의 성질을 대조군 폴리펩티드와 비교하는 것이 바람직할 수 있다. 비교용 성질에는, 예를 들어, 용해도, 활성, 혈장 반감기, 글리코실화 상태, 및 결합 성질이 포함된다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드가 글리코실화될 수 있다. 비교를 위한 가장 적합한 대조군 폴리펩티드를 선택하는 것은 당업자의 영역 내에 속한다. 일부 실시양태에서, 대조군 폴리펩티드는 하나 이상의 도입된 글리코실화 부위를 제외하고는 변형된 폴리펩티드와 동일할 수 있다. 예시적인 폴리펩티드에는 야생형 FIX 폴리펩티드 및 하나 이상의 활성화 치환, 예컨대 R338A 및/또는 V86A를 포함하는 FIX 폴리펩티드가 포함된다.
본 출원의 한 양상은 대조군 폴리펩티드에 비해 시험관내 또는 생체내 안정성이 증가된 변형된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 강화된 혈청 반감기 및 생체내 안정성은 치료 효과를 달성하는데 필요한 투약 빈도를 감소시키는데 바람직할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 글리코실화 FIX 폴리펩티드의 혈청 반감기가 대조군 단백질에 비해 약 20, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000％만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드의 혈청 반감기는 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 10일, 또는 적어도 20일 또는 그 초과일 수 있다.
폴리펩티드 약물을 환자에게 투여하는 정황에서 본원에서 사용된 용어 "반감기"는 환자 내의 약물의 혈장 농도가 1/2로 감소되는데 필요한 시간으로 정의된다. 약동학 분석 및 반감기 및 생체내 안정성 결정을 위한 방법이 당업자에게 익숙할 것이다. [Kenneth, et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists] 및 [Peters, et al., Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)]에서 상세사항을 확인할 수 있다. t-알파 및 t-베타 반감기 및 곡선하 면적 (AUC)과 같은 약동학 파라메터가 기술되어 있는 ["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)]를 또한 참조한다.
변형된 FIX 폴리펩티드의 활성은 절대값으로, 예컨대 유닛으로, 또는 대조군 폴리펩티드의 활성의 백분율로서 기술될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비활성이 대조군 단백질에 비해 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80％를 초과하여 감소되지 않을 수 있다. 예를 들어, 변형된 폴리펩티드가 대조군의 비활성과 비교하여 약 20％ 이상의 비활성을 유지한다면, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대조군 FIX 폴리펩티드에 비해 약 80％를 초과하여 감소되지 않은 비활성을 지닐 수 있다. FIX 비활성은 응고 케스케이드에서 기능하거나, 활성화된 혈소판 상에서 FVIIIa와의 상호작용을 통해 FXa의 형성을 유도하거나, 또는 혈병의 형성을 지지하는 능력으로 정의될 수 있다. [McCarthy, et al., Thromb. Haemost. 87:824-830,2002]에 예를 들어 기술된 바와 같은 혈병 분석과 같은 기술, 및 당업자에게 공지된 기타 기술에 의해 시험관 내에서 활성을 평가할 수 있다. 계통으로부터 생성된 동물이 FIX에 대해 결핍성이도록 B형 혈우병에 대한 유전 돌연변이가 있는 의도적으로 사육된 여러 동물 계통들 중 하나를 사용하여 생체 내에서 활성을 또한 평가할 수 있다. 이같은 계통들은 <Division of Laboratories and Research, New York Department of Public Health, Albany, N.Y.> 및 <Department of Pathology, University of North Carolina, Chapel Hill, N.C.>와 같은 비제한적인 다양한 공급원으로부터 입수가능하다. 예를 들어, 이러한 공급원 양쪽 모두 개 B형 혈우병을 앓고 있는 개를 제공한다. 별법적으로, FIX가 결핍성인 마우스가 또한 입수가능하다 ([Sabatino, et al., Blood 104:2767-2774, 2005]). FIX 활성에 대해 테스트하기 위해, 테스트 폴리펩티드를 병에 걸린 동물에게 주사하고, 작게 절개하고, 출혈 시간을 건강한 대조군과 비교한다.
인간 야생형 FIX는 비활성이 약 200 유닛/㎎이다. FIX 1 유닛은 1 ㎖의 정상 (풀링됨(pooled)) 인간 혈장 내에 존재하는 FIX의 양으로 정의되었다 (100％의 FIX 수준에 상응함). 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비활성이 FIX 폴리펩티드 ㎎ 당 적어도 약 100 유닛일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비활성이 FIX 폴리펩티드 ㎎ 당 적어도 약 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260 유닛이거나, 또는 이를 초과할 수 있다. 일부 실시양태에서, FIX의 비활성을 APTT 또는 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간 분석법 (예를 들어, [Proctor, et al., Am. J. Clin. Pathol. 36:212, 1961]에 기술되어 있고, 실시예를 참조한다)을 사용하여 측정할 수 있다.
세포, 예컨대 간 또는 신장 세포에서 발현될 때, FIX 폴리펩티드는 세포 기계에 의해 합성될 수 있고, 번역후 변형을 겪은 후, 세포에 의해 세포외 환경 내로 분비된다. 따라서, 세포로부터 분비되는 FIX 폴리펩티드의 양은 단백질 번역 프로세스 및 세포외 분비 프로세스 양쪽 모두에 좌우된다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대조군 단백질의 분비량에 비해 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80％를 초과하여 감소되지 않은 양으로 분비될 수 있다. 예를 들어, 변형된 폴리펩티드가 대조군과 비교하여 약 20％ 이상의 양으로 분비된다면, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대조군 FIX 폴리펩티드에 비해 약 80％를 초과하여 감소되지 않은 양으로 분비될 수 있다. 예를 들어, 임의의 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포외 배지 내의 단백질 수준을 결정함으로써, FIX 폴리펩티드의 분비량을 측정할 수 있다. 전통적인 단백질 정량 방법에는 2-D 겔 전기영동, 질량 분광법, 및 항체 결합이 포함된다. 생물학적 샘플 내의 단백질 수준을 분석하기 위한 예시적인 방법에는 항체-기반 기술, 예컨대 면역블롯팅 (웨스턴 블롯팅), 면역조직화학적 분석법, 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 또는 방사성면역분석법 (RIA)이 포함된다.
일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 FVIII, FXI, 또는 FX 중 하나 이상과 대조군 단백질의 상호작용에 비해 약 40, 50, 60, 70, 또는 80％를 초과하여 감소되지 않은 수준으로 FVIII, FXI, 또는 FX 중 하나 이상과 상호작용한다. 예를 들어, 변형된 폴리펩티드가 대조군과 비교하여 약 20％ 이상의 수준으로 FVIII, FXI, 또는 FX 중 하나 이상과 상호작용한다면, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대조군 FIX 폴리펩티드에 비해 약 80％를 초과하여 감소되지 않은 수준으로 FVIII, FXI, 또는 FX 중 하나 이상과 상호작용할 수 있다. [Chang, et al., J. Biol. Chem. 273:12089-12094, 1998]에 기술된 방법이 예를 들어 포함되는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 응고 케스케이드의 다른 구성원에 대한 FIX의 결합을 결정할 수 있다.
앞서 기술된 바와 같이, FIX는 생물학적 기능들이 상이한 4개의 구조 도메인으로 구성된다. 본 발명의 한 양상은 특정 도메인, 예컨대 활성화 펩티드 및 촉매 도메인에서 변형된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 본 출원은, 부분적으로, FIX의 활성화 펩티드 내로 도입된 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 FIX 폴리펩티드를 제공한다. FIX 내의 천연 글리코실화 부위는 EGF1 도메인 (Ser53 및 Ser61 상의 2개의 O-연결 부위) 및 활성화 펩티드 (Thr159, Thr169, Thr172, 및 Thr179에서의 4개의 O-연결 부위 및 Asn157 및 Asn167에서의 2개의 N-연결 부위) 내에 위치한다. 따라서, 8개의 천연 글리코실화 부위 중 6개가 활성화 펩티드 내에 위치한다. 도입된 글리코실화 부위는 천연 글리코실화 부위가 있는 FIX의 영역, 예컨대 활성화 펩티드 내로 도입되는 경우에 활성 또는 발현에 대한 부정적인 영향이 거의 없을 수 있다. 또한, 활성화 펩티드는 FIX가 활성화될 때 절단되고, 따라서 FIXa의 촉매 활성에 요구되지 않는다. 그러나, 활성화 펩티드는 효소원(zymogen) 내에 존재하여, 효소원의 순환 반감기를 개선하기 위해 글리코실화 부위를 도입하기 위한 매력적인 영역이게 한다.
본 출원은, 부분적으로, 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 FIX 폴리펩티드를 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, G4T; E33N; E36T; E36N; R37N; F75N; F77T; E83T; D85N; V86A; K91T; A103T; V107T; K122N; K122T; S138N; A146N; T148N; F150T; P151N; T159N; A161T; A161N; T169N; Q170N; T172N; D177N; D177E; F178T; K201N; K201T; K214T; V223N; G226N; Y226T; K228N; K228T; E239N; E242N; I251T; A262T; E294N; R338A; R338N; K341N; F353N; H354V; H354I; E355T; V370N; T371V; T371I; E372T; E374N; M391N; K392V; G393T; E410N; K413N; L414I; 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, Y1N 및 S3T; S3N 및 K5T; G4N 및 L6T; K5N 및 E7T; L6N 및 E8T; E7N 및 F9T; F9N 및 Q11T; V10N 및 G12T; Q11N 및 N13T; G12N 및 L14T; N13 및 E15T; L14N 및 R16T; E15N 및 E17T; M19N 및 E21T; E20N 및 K22T; S24N 및 E26T; F25N 및 E27T; E26N 및 A28T; E27N 및 R29T; A28N 및 E30T; R29N 및 V31T; E30N 및 F32T; V31N 및 E33T; F32N 및 N34T; T35N 및 R37T; T38N 및 E40T; T39N 및 F41T; E40N 및 W42T; F41N 및 K43T; W42N 및 Q44T; K43N 및 Y45T; Q44N 및 V46T; Y45N 및 D47T; V46N 및 G48T; E52N 및 N54T; S53N 및 P55T; G59N 및 S61T; K63N 및 D65T; I66N 및 S68T; S68N 및 E70T; G76N 및 E78T; E78N 및 K80T; E83N 및 D85T; L84N 및 V86T; I90N 및 N92T; K100N 및 S102T; S102N 및 D104T; A103N 및 N105T; D104N 및 K106T; K106N 및 V108T; R116N 및 A118T; E119N 및 Q121T; Q121N 및 S123T; A127N 및 P129T; V135N 및 V137T; S136N 및 S138T; V137N 및 Q139T; Q139N 및 S141T; T140N 및 K142T; S141N 및 L143T; E147N 및 V149T; T148N 및 F150T; V149N 및 P151T; P151N 및 V153T; D152N 및 D154T; V153N 및 Y155T; D154N 및 V156T; Y155N 및 N157T; V156N 및 S158T; S158N 및 E160T; T159N 및 A161T; E160N 및 E162T; E162N 및 I164T; T163N 및 L165T; I164N 및 D166T; L165N 및 N167T; D166N 및 I168T; I168N 및 Q170T; T169N 및 S171T; S171N 및 Q173T; T172N 및 S174T; Q173N 및 F175T; S174N 및 N176T; G184N 및 D186T; E185N 및 A187T; D186N 및 K188T; A187N 및 P189T; P189N 및 Q191T; G200N 및 V202T; K201N 및 D203T; V202N 및 A204T; E224N 및 G226T; T225N 및 V227T; G226N 및 K228T; V227N 및 I229T; H236N 및 I238T; I238N 및 E240T; E240N 및 E242T; T241N 및 H243T; H243N 및 E245T; K247N 및 N249T; V250N 및 R252T; I251N 및 I253T; I253N 및 P255T; A261N 및 I263T; A262N 및 N264T; D276N 및 P278T; V280N 및 N282T; F302N 및 S304T; S304N 및 Y306T; R312N 및 F314T; V313N 및 H315T; F314N 및 K316T; H315N 및 G317T; K316N 및 R318T; G317N 및 S319T; S319N 및 L321T; A320N 및 V322T; R327N 및 P329T; P329N 및 V331T; D332N 및 A334T; L337N 및 S339T; S339N 및 K341T; T340N 및 F342T; T343N 및 Y345T; G352N 및 H354T; F353N 및 E355T; H354N 및 G356T; E355N 및 G357T; G356N 및 R358T; G357N 및 D359T; E372N 및 E374T; W385N 및 E387T; G386N 및 E388T; A390N 및 K392T 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, D85N, K122T, 및 I251T; D85N, K122T, 및 E242N; E125N, P126A, 및 A127T; P126N, V128T, 및 P129A; T148N, F150T, 및 P151A; F150N, P151A, 및 D152T; P151N, V153T, 및 A161N; P151N, V153T, 및 t172n; V153N, Y155T, 및 E294N; T172N, G226N, 및 K228T; F353N, H354V, 및 E355T; F353N, H354I, 및 E355T; V370N, T371V, 및 E372T; V370N, T371I, 및 E372T; M391N, K392V, 및 G393T; D85N, P151N, V153T, 및 K228N; D85N, P151N, V153T, 및 E242N; K122T, P151N, V153T, 및 K228N; K122T, P151N, V153T, 및 E242N; K122T, P151N, V153T, 및 I251T; T148N, F150T, G226N, 및 K228T; P151N, V153T, T172N, 및 R338A; P151N, V153T, D177E, 및 F178T; P151N, V153T, G226N, 및 K228T; T172N, G226N, K228T, 및 R338A; D85N, K122T, P151N, V153T, 및 E242N; D85N, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; K122T, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; S138N, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; T148N, F150T, G226N, K228T, 및 R338A; P151N, V153T, T172N, G226N, 및 K228T; P151N, V153T, D177E, F178T, 및 R338A; P151N, V153T, G226N, K228T, 및 R338A; 및 P151N, V153T, T172N, G226N, K228T, 및 R338A; 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, 하기로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다:
(a) G4T; E33N; E36T; E36N; R37N; F75N; F77T; E83T; D85N; V86A; K91T; A103T; V107T; K122N; K122T; S138N; A146N; T148N; F150T; P151N; T159N; A161T; A161N; T169N; Q170N; T172N; D177N; D177E; F178T; K201N; K201T; K214T; V223N; G226N; Y226T; K228N; K228T; E239N; E242N; I251T; A262T; E294N; R338A; R338N; K341N; F353N; H354V; H354I; E355T; V370N; T371V; T371I; E372T; E374N; M391N; K392V; G393T; E410N; K413N; L414I;
(b) Y1N 및 S3T; S3N 및 K5T; G4N 및 L6T; K5N 및 E7T; L6N 및 E8T; E7N 및 F9T; F9N 및 Q11T; V10N 및 G12T; Q11N 및 N13T; G12N 및 L14T; N13 및 E15T; L14N 및 R16T; E15N 및 E17T; M19N 및 E21T; E20N 및 K22T; S24N 및 E26T; F25N 및 E27T; E26N 및 A28T; E27N 및 R29T; A28N 및 E30T; R29N 및 V31T; E30N 및 F32T; V31N 및 E33T; F32N 및 N34T; T35N 및 R37T; T38N 및 E40T; T39N 및 F41T; E40N 및 W42T; F41N 및 K43T; W42N 및 Q44T; K43N 및 Y45T; Q44N 및 V46T; Y45N 및 D47T; V46N 및 G48T; E52N 및 N54T; S53N 및 P55T; G59N 및 S61T; K63N 및 D65T; I66N 및 S68T; S68N 및 E70T; G76N 및 E78T; E78N 및 K80T; E83N 및 D85T; L84N 및 V86T; I90N 및 N92T; K100N 및 S102T; S102N 및 D104T; A103N 및 N105T; D104N 및 K106T; K106N 및 V108T; R116N 및 A118T; E119N 및 Q121T; Q121N 및 S123T; A127N 및 P129T; V135N 및 V137T; S136N 및 S138T; V137N 및 Q139T; Q139N 및 S141T; T140N 및 K142T; S141N 및 L143T; E147N 및 V149T; T148N 및 F150T; V149N 및 P151T; P151N 및 V153T; D152N 및 D154T; V153N 및 Y155T; D154N 및 V156T; Y155N 및 N157T; V156N 및 S158T; S158N 및 E160T; T159N 및 A161T; E160N 및 E162T; E162N 및 I164T; T163N 및 L165T; I164N 및 D166T; L165N 및 N167T; D166N 및 I168T; I168N 및 Q170T; T169N 및 S171T; S171N 및 Q173T; T172N 및 S174T; Q173N 및 F175T; S174N 및 N176T; G184N 및 D186T; E185N 및 A187T; D186N 및 K188T; A187N 및 P189T; P189N 및 Q191T; G200N 및 V202T; K201N 및 D203T; V202N 및 A204T; E224N 및 G226T; T225N 및 V227T; G226N 및 K228T; V227N 및 I229T; H236N 및 I238T; I238N 및 E240T; E240N 및 E242T; T241N 및 H243T; H243N 및 E245T; K247N 및 N249T; V250N 및 R252T; I251N 및 I253T; I253N 및 P255T; A261N 및 I263T; A262N 및 N264T; D276N 및 P278T; V280N 및 N282T; F302N 및 S304T; S304N 및 Y306T; R312N 및 F314T; V313N 및 H315T; F314N 및 K316T; H315N 및 G317T; K316N 및 R318T; G317N 및 S319T; S319N 및 L321T; A320N 및 V322T; R327N 및 P329T; P329N 및 V331T; D332N 및 A334T; L337N 및 S339T; S339N 및 K341T; T340N 및 F342T; T343N 및 Y345T; G352N 및 H354T; F353N 및 E355T; H354N 및 G356T; E355N 및 G357T; G356N 및 R358T; G357N 및 D359T; E372N 및 E374T; W385N 및 E387T; G386N 및 E388T; A390N 및 K392T;
(c) D85N, K122T, 및 I251T; D85N, K122T, 및 E242N; E125N, P126A, 및 A127T; P126N, V128T, 및 P129A; T148N, F150T, 및 P151A; F150N, P151A, 및 D152T; P151N, V153T, 및 A161N; P151N, V153T, 및 t172n; V153N, Y155T, 및 E294N; T172N, G226N, 및 K228T; F353N, H354V, 및 E355T; F353N, H354I, 및 E355T; V370N, T371V, 및 E372T; V370N, T371I, 및 E372T; M391N, K392V, 및 G393T; D85N, P151N, V153T, 및 K228N; D85N, P151N, V153T, 및 E242N; K122T, P151N, V153T, 및 K228N; K122T, P151N, V153T, 및 E242N; K122T, P151N, V153T, 및 I251T; T148N, F150T, G226N, 및 K228T; P151N, V153T, T172N, 및 R338A; P151N, V153T, D177E, 및 F178T; P151N, V153T, G226N, 및 K228T; T172N, G226N, K228T, 및 R338A; D85N, K122T, P151N, V153T, 및 E242N; D85N, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; K122T, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; S138N, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; T148N, F150T, G226N, K228T, 및 R338A; P151N, V153T, T172N, G226N, 및 K228T; P151N, V153T, D177E, F178T, 및 R338A; P151N, V153T, G226N, K228T, 및 R338A; 및 P151N, V153T, T172N, G226N, K228T, 및 R338A; 및 이의 임의의 조합.
본 출원은, 부분적으로, 내인성 O-연결 글리코실화 부위를 N-연결 글리코실화 부위로 변환시킴으로써 도입된 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 FIX 폴리펩티드를 제공한다. N-연결 글리코실화 부위가 O-연결 글리코실화 부위보다 더욱 시알릴화되기 쉽다는 것이 보고되었고, 더 높은 시알산 함량이 증가된 단백질 반감기를 부여한다는 증거가 있다. 추가적인 N-연결 글리코실화에 의해 제공되는 증가된 시알산 함량이 증가된 혈액 내 반감기를 책임질 수 있는 것으로 일반적으로 여겨진다 ([White, et al., Thromb. Haemost. 78:261-265, 1997]). 이같은 변형된 FIX 폴리펩티드의 예시적인 실시양태는 하기와 같다. 일부 실시양태에서, T169N 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, T172N 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, T148N 치환 및 F150T 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, T159N 치환 및 A161T 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
본 발명의 또다른 양상은 하나 이상의 글리코실화 부위를 생성시키기 위한 활성화 펩티드 내로의 아미노산의 삽입을 제공한다. 본 출원은, 부분적으로, 인간 FIX의 아미노산 잔기 160 내지 164 사이에 도입된 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 도입된 아미노산 잔기는 글리코실화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 도입된 아미노산 잔기는 야생형 FIX 아미노산 잔기와 함께 글리코실화 부위를 형성한다. 8가지 종으로부터의 FIX 서열의 다중 서열 정렬은 마우스, 래트 및 기니피그 서열 모두에 다른 종 (인간, 붉은털 원숭이, 개, 토끼, 돼지)에서는 발견되지 않는 추가적인 아미노산 (7개 내지 10개 사이의 잔기)이 활성화 펩티드 내에 있음을 나타냈다 (도 1). 이러한 추가적인 서열은 인간 FIX의 E160과 E162 사이에 위치한다. 이는 10개 이상의 아미노산 잔기의 삽입이 이러한 부위에서 FIX 구조 내에서 허용된다는 것을 시사한다. 이러한 영역을 추가적인 아미노산의 도입에 대해 표적화하였고, 이는 활성이 유의하게 감소되지 않았기 때문에 양호한 위치인 것으로 확인되었다. 일부 실시양태에서, 30개, 25개, 20개, 18개, 16개, 14개, 또는 12개까지의 아미노산 잔기가 인간 FIX의 아미노산 잔기 160 내지 164 사이에서 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 10개까지의 아미노산이 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 9개까지의 아미노산이 삽입될 수 있다.
8가지 종으로부터의 FIX 사이의 다중 서열 정렬을 수행하는데 사용된 기준에 따라, 래트, 마우스 및 기니피그 내의 추가적인 아미노산이 발견되는 명확한 부위는 인간 FIX의 E160과 A161 사이, A161과 E162 사이, E162와 T163 사이, 또는 T163과 I164 사이에 이러한 부위가 있을 수 있도록 바뀔 수 있다. 일부 실시양태에서, E160과 A161 사이에 삽입된 아미노산 서열은 서열 2일 수 있다. 일부 실시양태에서, A161과 E162 사이에 삽입된 아미노산 서열은 서열 2일 수 있다. 일부 실시양태에서, E162와 T163 사이에 삽입된 아미노산 서열은 서열 2일 수 있다. 일부 실시양태에서, T163과 I164 사이에 삽입된 아미노산 서열은 서열 2일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산이 E160과 A161 사이에 삽입될 수 있고, 하나 이상의 아미노산이 A161과 E162 사이에 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산이 E160과 A161 사이에 삽입될 수 있고, 하나 이상의 아미노산이 E162와 T163 사이에 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산이 A161과 E162 사이에 삽입될 수 있고, 하나 이상의 아미노산이 E162와 T163 사이에 삽입될 수 있다. 상기 기술된 실시양태들 중 일부에서, 하나 이상의 아미노산이 T163과 I164 사이에 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 약 30개, 25개, 20개, 18개, 16개, 14개, 또는 12개까지의 아미노산 잔기가 인간 FIX의 아미노산 잔기 160 내지 164 사이에서 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 약 10개까지의 아미노산이 인간 FIX의 아미노산 잔기 160 내지 164 사이에서 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 약 9개까지의 아미노산이 인간 FIX의 아미노산 잔기 160 내지 164 사이에서 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개, 2개, 3개 또는 4개의 글리코실화 부위가 도입될 수 있다.
본 출원은 본원에 개시된 도입된 글리코실화 부위들을 1개를 초과하여 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드를 추가로 제공한다. 촉매 도메인 내에 하나 이상의 도입된 글리코실화 부위를 포함하고 활성화 펩티드 내에 하나 이상의 도입된 글리코실화 부위를 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 촉매 도메인 내에 2개 이상의 도입된 글리코실화 부위를 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 활성화 펩티드 내에 2개 이상의 도입된 글리코실화 부위를 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 하기의 치환들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: R37N; D85N; K122T; S138N; A146N; A161N; Q170N; T172N; D177N; F178T; K201N; K228N; E239N; E242N; I251T; A262T; E294N; E374N; 및 E410N. 또다른 실시양태는 하기의 치환들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: G59N 및 S61T; K63N 및 D65T; G76N 및 E78T; S102N 및 D104T; A103N 및 N105T; D104N 및 K106T; E119N 및 Q121T; Q121N 및 S123T; S136N 및 S138T; Q139N 및 S141T; T140N 및 K142T; T148N 및 F150T; V149N 및 P151T; P151N 및 V153T; D152N 및 D154T; V153N 및 Y155T; D154N 및 V156T; V156N 및 S158T; S158N 및 E160T; E160N 및 E162T; E162N 및 I164T; T163N 및 L165T; I164N 및 D166T; D166N 및 I168T; I168N 및 Q170T; S171N 및 Q173T; T172N 및 S174T; Q173N 및 F175T; S174N 및 N176T; K201N 및 D203T; V202N 및 A204T; E224N 및 G226T; T225N 및 V227T; G226N 및 K228T; T241N 및 H243T; I251N 및 I253T; I253N 및 P255T; A262N 및 N264T; V280N 및 N282T; T343N 및 Y345T; E372N 및 E374T; F150N, P151A, 및 D152T; 및 A161과 E162 사이에서의 서열 2의 삽입. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 예를 들어 R338A 및 V86A와 같은 1개 이상의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 R338A 및 V86A 치환 양쪽 모두를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원은 FIX 폴리펩티드의 C-말단에 (즉, FIX 폴리펩티드의 아미노산 잔기 415에 이어서) 1개 이상의 도입된 글리코실화 부위를 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드를 추가로 제공한다. FIX 폴리펩티드의 C-말단에 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 이를 초과하는 개수의 글리코실화 부위를 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 FIX 폴리펩티드의 C-말단에 서열 4의 아미노산 서열의 부가를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 FIX 폴리펩티드의 C-말단에 서열 5의 아미노산 서열의 부가를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 FIX 폴리펩티드의 C-말단에 서열 6의 아미노산 서열의 부가를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 FIX 폴리펩티드의 C-말단에 서열 7의 아미노산 서열의 부가를 포함할 수 있다.
본 출원의 한 양상은 적어도 하나 이상의 글리코실화 부위 및 하나 이상의 FIX의 활성을 증가시키는 치환을 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 활성화 치환의 예로는 R338A 및 V86A 치환이 포함된다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 R338A 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 V86A 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 R338A 및 V86A 치환 양쪽 모두를 포함할 수 있다.
본 출원의 추가적인 양상은 비활성이 증가된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 R338A 치환 및 V86A 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 비활성이 폴리펩티드 ㎎ 당 적어도 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1400, 1600, 1800, 또는 2000 유닛일 수 있다. 기존에 기술된 바와 같이, 예를 들어, APTT 분석법을 사용하여, 비활성을 결정할 수 있다. 이러한 폴리펩티드들은, 특히 B형 혈우병에 걸린 환자에서, 치료제로서 유용하다. 이러한 폴리펩티드들은 추가적인 치환 또는 변형, 예컨대 본원에 기술된 글리코실화 부위를 포함할 수 있다.
본 출원의 한 양상은 하기의 아미노산 서열을 포함하고, 이때 FIX 폴리펩티드가 서열 1의 FIX 폴리펩티드와 비교하여 1개 이상의 도입된 글리코실화 부위를 포함하는, 변형된 제IX인자 폴리펩티드를 제공한다:
(식 중,
X85는 D 및 E로부터 선택되고;
X86은 A, E, P, S, 및 V로부터 선택되고;
X104는 D, N, 및 T로부터 선택되고;
X121은 N, Q, 및 T로부터 선택되고;
X138은 N, S, 및 T로부터 선택되고;
X148 및 X150은 하기로부터 선택되고:
(i) X148은 T이고 X150은 F임;
(ii) X148은 N이고 X150은 T임;
(iii) X148은 N이고 X150은 S임;
X151은 A, P, 및 T로부터 선택되고;
X151 및 X153은 하기로부터 선택되고:
(i) X151은 P이고 X153은 V임;
(ii) X151은 N이고 X153은 T임; 및
(iii) X151은 N이고 X153은 S임;
Z1, Z2, Z3, 및 Z4는 독립적으로 하기로부터 선택되고:
(i) 0개 내지 12개의 아미노산 잔기 및
(ii) 서열 2;
X152는 D, N, 및 T로부터 선택되고;
X159 및 X161은 하기로부터 선택되고:
(i) X159는 T이고 X161은 A임;
(ii) X159는 N이고 X161은 T임; 및
(iii) X159는 N이고 X161은 S임;
X169는 T 및 N으로부터 선택되고;
X172는 T 및 N으로부터 선택되고;
X174는 S 및 T로부터 선택되고;
X177 및 X178은 하기로부터 선택되고:
(i) X177은 D이고 X178은 F임;
(ii) X177은 E이고 X178은 T임; 및
(iii) X177은 E 또는 D이고 X178은 S임;
X226 및 X228은 하기로부터 선택되고:
(i) X226은 G이고 X228은 K임;
(ii) X226은 N이고 X228은 T임; 및
(iii) X226은 N이고 X228은 S임;
X338은 R 및 A로부터 선택되고;
X353, X354, 및 X355는 하기로부터 선택되고:
(i) X353은 F이고, X354는 H이고, X355는 E임;
(ii) X353은 N이고, X354는 V이고, X355는 T임;
(iii) X353은 N이고, X354는 I이고, X355는 T임; 및
(iv) X353은 N이고, X354는 H, V, 또는 I이고, X355는 S임;
X370, X371, 및 X372는 하기로부터 선택되고:
(i) X370은 V이고, X371은 T이고, X372는 E임;
(ii) X370은 N이고, X371은 V이고, X372는 T임;
(iii) X370은 N이고, X371은 I이고, X372는 T임; 및
(iv) X370은 N이고, X371은 T, V, 또는 I이고, X372는 S임;
X391, X392, 및 X393은 하기로부터 선택되고:
(i) X391은 M이고, X392는 K이고, X393은 G임;
(ii) X391은 N이고, X392는 K이고, X393은 T임;
(iii) X391은 N이고, X392는 V이고, X393은 T임; 및
(iv) X391은 N이고, X392는 V 또는 K이고, X393은 S임;
X413 및 X414는 하기로부터 선택된다:
(i) X413은 K이고 X414는 L임;
(ii) X413은 N이고 X414는 L임; 및
(iii) X413은 N이고 X414는 I임).
1개 이상의 글리코실화 부위의 도입은 X 위치들 중 1개 이상에서의 치환 또는 Z 위치들 중 1개 이상에서의 삽입의 결과이다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 약 1-30개 사이, 1-20개 사이, 또는 1-10개 사이의 보존적 아미노산 변화를 추가적으로 포함하고, FIX 활성을 유지한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 서열 1과 적어도 약 80, 85, 90, 95, 또는 99％ 동일하고, FIX 활성을 유지한다.
변형된
FIX
폴리펩티드의 생산
비-천연 글리코실화 부위를 도입하기 위해 아미노산 잔기들이 삽입, 결실, 또는 치환될 수 있다. 예를 들어, FIX의 아미노산 서열을 변경시킴으로써 글리코실화 부위가 도입될 수 있다. 아미노산 서열 변경은 다양한 기술에 의해, 예를 들어, 상응하는 핵산 서열을 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 부위-특이적 돌연변이유발을 위한 기술은 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, [Zoller et al., DNA 3:479-488, 1984] 또는 [Horton, et al., Gene 77:61-68, 1989, pp. 61-68]에 기술되어 있다. 따라서, FIX의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 사용하여, 선택한 변경(들)을 도입할 수 있다. 유사하게, 특이적 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 DNA 구축물을 제조하기 위한 절차가 당업자에게 주지되어 있다 (예를 들어, [PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA] 참조).
FIX 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 구축물을 확립된 표준 방법, 예를 들어, [Beaucage, et al., Gene Amplif. Anal. 3:1-26, 1983]에 기술된 포스포르아미다이트 방법에 의해 합성적으로 또한 제조할 수 있다. 포스포르아미다이트 방법에 따르면, 올리고뉴클레오티드가, 예를 들어, 자동 DNA 합성기에서, 합성되고, 정제되고, 어닐링(annealing)되고, 결찰되며, 적절한 벡터 내에 클로닝된다. 인간 FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,683,202; 또는 [Saiki, et al., Science 239:487-491, 1988]에 기술된 바와 같이, 특이적 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의해 또한 제조할 수 있다. 또한, 핵산 구축물은, 표준 기술에 따라, 전체 핵산 구축물의 다양한 부분에 상응하는 합성, 게놈 또는 cDNA 기원의 단편들을 (적합하게) 결찰시킴으로써 제조된 혼합형 합성 및 게놈, 혼합형 합성 및 cDNA, 또는 혼합형 게놈 및 cDNA 기원일 수 있다.
FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 재조합 DNA 절차를 사용하여 재조합 벡터 내로 삽입할 수 있다. 벡터의 선택은 벡터가 내부로 도입될 숙주 세포에 종종 좌우될 것이다. 벡터는 자가 복제 벡터 또는 통합 벡터일 수 있다. 자가 복제 벡터는 염색체외 개체로서 존재하고, 이의 복제는 염색체 복제와 관계없으며, 예를 들어, 플라스미드이다. 통합 벡터는 숙주 세포 게놈 내로 통합되어, 자신이 내부로 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 벡터이다.
벡터는 변형된 FIX를 코딩하는 DNA 서열이 DNA의 전사, 번역 또는 프로세싱에 필요한 추가적인 절편들, 예컨대 프로모터, 종결인자 및 폴리아데닐화 부위에 작동가능하게 연결된 발현 벡터일 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래될 수 있거나, 또는 양쪽 모두로부터의 요소들을 함유할 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 절편들이 협력하여 자신들의 의도된 목적을 위해 기능하도록, 예를 들어, 전사가 프로모터에서 시작되어 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 지나 진행되도록 절편들이 배열되는 것을 가리킨다.
FIX 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용하기 위한 발현 벡터는 클로닝된 유전자 또는 cDNA의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 DNA 서열일 수 있고, 숙주 세포에 대해 동종성 또는 이종성인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래될 수 있다.
포유류 세포에서 FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사를 지시하기 위한 적절한 프로모터의 예는, 예를 들어, SV40 프로모터 ([Subramani, et al., Mol. Cell Biol. 1:854-864, 1981]), MT-I (메탈로티오네인 유전자) 프로모터 ([Palmiter, et al., Science 222:809-814, 1983]), CMV 프로모터 ([Boshart, et al., Cell 41:521-530, 1985]), 또는 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터 ([Kaufman et al., Mol. Cell Biol, 2:1304-1319, 1982])이다.
또한 FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은, 필요하다면, 적절한 종결인자, 예컨대 인간 성장 호르몬 종결인자 ([Palmiter, et al., Science 222:809-814, 1983]) 또는 TPIl ([Alber et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:419-434, 1982]) 또는 ADH3 ([McKnight, et al., EMBO J. 4:2093-2099, 1985]) 종결인자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 발현 벡터는 삽입 부위의 하류에 위치하는 폴리아데닐화 신호를 또한 함유할 수 있다. 폴리아데닐화 신호에는 SV40으로부터의 초기 또는 후기 폴리아데닐화 신호, 아데노바이러스 5 EIb 영역으로부터의 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬 유전자 종결인자 ([DeNoto, et al., Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981]), 또는 인간 FIX 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호가 포함된다. 발현 벡터는 인핸서 서열, 예컨대 SV40 인핸서를 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 FIX 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로 내로 지시하기 위해, 천연 FIX 분비 신호 서열을 사용할 수 있다. 별법적으로, 분비 신호 서열 (리더(leader) 서열, 프리프로(prepro) 서열 또는 프리(pre) 서열로 또한 알려짐)이 재조합 벡터 내에 제공될 수 있다. 정확한 리딩 프레임 내의 FIX 유사체를 코딩하는 DNA 서열에 분비 신호 서열이 연결될 수 있다. 통상적으로 분비 신호 서열은 펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 대해 5'에 위치한다. 예시적인 신호 서열에는, 예를 들어, MPIF-1 신호 서열 및 스타니오칼신 신호 서열이 포함된다.
FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 프로모터, 및 임의적으로 종결인자 및/또는 분비 신호 서열을 결찰시키고, 이들을 복제에 필요한 정보를 함유하는 적절한 벡터 내로 삽입하기 위해 사용되는 절차는 당업자에게 주지되어 있다 (예를 들어, [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 참조).
포유류 세포를 형질감염시키고 세포 내로 도입된 DNA 서열을 발현시키는 방법이, 예를 들어, [Kaufman, et al., J. Mol. Biol. 159:601-621, 1982]; [Southern, et al., J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341, 1982]; [Loyter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:422-426, 1982]; [Wigler, et al., Cell 14:725-731, 1978]; [Corsaro, et al., Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981], [Graham, et al., Virology 52:456-467, 1973]; 및 [Neumann, et al., EMBO J. 1:841-845, 1982]에 기술되어 있다. 클로닝된 DNA 서열을 배양된 포유류 세포 내로, 예를 들어, 리포펙션(lipofection), DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 미세주입, 원형질체 융합, 인산칼슘 침전, 레트로바이러스 전달, 전기천공, 초음파천공, 레이저 조사, 마그네토펙션(magnetofection), 천연 형질전환, 및 생체탄도(biolistic) 형질전환에 의해 도입할 수 있다 (예를 들어, [Mehier-Humbert, et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 57:733-753, 2005] 참조). 외인성 DNA를 발현하는 세포를 확인 및 선별하기 위해, 선별성 표현형을 부여하는 유전자 (선별성 마커)가 관심 유전자 또는 cDNA와 함께 세포 내로 일반적으로 도입된다. 선별성 마커에는, 예를 들어, 약물, 예컨대 네오마이신, 푸로마이신, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 유전자가 포함된다. 선별성 마커는 서열들이 연결된 경우 마커 및 외인성 DNA의 증폭을 허용하는 증폭성 선별성 마커일 수 있다. 예시적인 증폭성 선별성 마커에는 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 및 아데노신 탈아미노효소가 포함된다. 적절한 선별성 마커를 선택하는 것은 당업자의 영역 내에 속한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,238,820 참조).
세포들을 DNA로 형질감염시킨 후, 이들을 관심 유전자를 발현하도록 적합한 성장 배지에서 성장시킨다. 본원에서 사용된 용어 "적합한 성장 배지"는 세포의 성장 및 활성 FIX 폴리펩티드의 발현에 요구되는 영양소 및 기타 성분을 함유하는 배지를 의미한다.
일반적으로 배지는, 예를 들어, 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 필수 당, 비타민, 염, 인지질, 단백질 및 성장 인자를 포함하고, FIX와 같은 비타민 K 의존적 단백질의 경우에는, 비타민 K가 또한 제공될 수 있다. 그후, 안정적인 방식으로 선별성 마커를 발현하는 세포의 성장에 대해 선별하기 위해 약물 선별을 적용한다. 증폭성 선별성 마커로 형질감염된 세포에 대해, 클로닝된 서열의 증가된 카피수에 대해 선별하기 위해 약물 농도를 증가시킬 수 있고, 이에 의해 발현 수준이 증가된다. 그후, 안정적으로 형질감염된 세포의 클론을 FIX 폴리펩티드의 발현에 대해 스크리닝한다.
본 발명에서 사용하기 위한 포유류 세포주의 예는 COS-1 (ATCC CRL 1650), 베이비 햄스터 신장 (BHK), HKB11 세포 ([Cho, et al., J. Biomed. Sci, 9:631-638, 2002]), 및 HEK-293 (ATCC CRL 1573; [Graham, et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977]) 세포주이다. 또한, 래트 Hep I (래트 간세포암; ATCC CRL 1600), 래트 Hep II (래트 간세포암; ATCC CRL 1548), TCMK-1 (ATCC CCL 139), Hep-G2 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 및 CHO-DUKX 세포 ([Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980])이 포함되는 다수의 또다른 세포주가 본 발명에서 사용될 수 있다.
FIX 폴리펩티드를 세포 배양 배지로부터 회수할 수 있고, 그후 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 배제), 전기영동 절차 (예를 들어, 분취용 등전 포커싱 (IEF), 차등 용해도 (예를 들어, 황산암모늄 침전)), 추출 (예를 들어, [Protein Purification, Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989] 참조), 또는 이들의 다양한 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 이를 정제할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 폴리펩티드를 항-FIX 항체 칼럼 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 통상적인 화학적 정제 수단, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가적인 정제가 달성될 수 있다. 또다른 정제 방법들이 당업계에 공지되어 있고, 변형된 FIX 폴리펩티드의 정제에 적용될 수 있다 (예를 들어, [Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982] 참조).
일반적으로, "정제된"은 다양한 다른 성분들을 제거하기 위해 분획화에 적용되었고, 자신의 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 유지하는 단백질 또는 펩티드 조성물을 지칭할 것이다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이러한 지시는 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주성분을 형성하는, 예컨대 조성물 내의 단백질의 약 50％, 약 60％, 약 70％, 약 80％, 약 90％, 약 95％, 약 99％, 또는 그 초과를 구성하는 조성물을 지칭할 것이다.
폴리펩티드의 정제 정도를 정량하기 위한 다양한 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 활성 분획의 비활성을 결정하는 것, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하기 위한 예시적인 방법은 본원에서 "정제 배수"에 의해 평가되는, 분획의 비활성을 계산하고, 이러한 활성을 초기 추출물의 비활성과 비교하여, 순도의 정도를 계산하는 것이다. 물론, 활성의 양을 나타내도록 사용되는 실제 단위는 특정 분석법 기술에 좌우될 것이다.
일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 조직 배양 세포에서 재조합적으로 발현되고, 글리코실화는 숙주 세포, 예컨대 포유류 세포의 정상적인 번역후 세포 기능의 결과이다.
별법적으로, 화학적 또는 효소적 변형을 통해 글리코실화가 달성될 수 있다. 예를 들어, 알파-(2,6)-연결 시알산을 단백질에 부가하는 효소를 사용함으로써 FIX 폴리펩티드가 글리코실화될 수 있다. 예를 들어, 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 결핍성 CHO 세포가 재조합 당단백질 생산을 위한 통상적으로 사용되는 숙주 세포이다. CHO 세포는 2,6 연결의 시알산을 만노스 알파-1,3 분지 상의 갈락토스에 부가하는데 사용되는 베타-갈락토시드 알파-2,6 시알릴트랜스퍼레이스 효소를 내인성으로 발현하지 않는다. 이러한 연결의 시알산을 CHO 세포에서 생산된 단백질에 부가하기 위해, CHO 세포를 기능성 베타-갈락토시데이스 알파-2,6 시알릴트랜스퍼레이스 유전자로 형질감염시켜 원하는 대로 갈락토스에 2,6 연결의 시알산이 혼입되도록 할 수 있다 (예를 들어, [Lee, et al., J. Biol. Chem. 264:13848-13855, 1989] 참조).
유사하게, 양분화(bisecting) N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 이러한 올리고당 연결을 내인성으로 생산하지 않는 숙주 세포를 양분화 GlcNAc 구조의 형성을 촉매하는 것으로 보고된 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼레이스 효소에 대한 기능성 유전자로 형질감염시킴으로써 FIX에 부가할 수 있다. 포유류 글리코실화 패턴을 지니는 단백질을 생산하는 식물 세포에서 단백질을 발현하는 시스템이 또한 확립되었다 (예를 들어, 선태류식물 세포, WO 2004/057002).
N-연결 글리코실화를 위해, N-글리칸의 최종 구조는 폴리펩티드가 생산되는 생물에 전형적으로 좌우된다. 일반적으로, 박테리아에서 생산된 폴리펩티드는 완전히 비-글리코실화된다. 곤충 세포에서 발현된 폴리펩티드는 고농도의 만노스 및 포시-만노스(pauci-mannose) N-연결 올리고당 사슬을 특히 함유한다. 일반적으로, 포유류 세포 배양에서 생산된 폴리펩티드는, 예를 들어, 종 및 세포 배양 조건에 따라 상이하게 글리코실화된다. 추가로, 식물 세포에서 생산된 폴리펩티드는 동물 세포에서 생산된 것과 상당히 상이한 글리칸 구조를 포함한다. 재조합 폴리펩티드 생산 분야에서의 목적은, 특히 폴리펩티드가 치료제로서 사용되는 경우에, 정확하게 글리코실화된 폴리펩티드를 생성시킬 수 있는 것, 즉 천연 발생 형태의 폴리펩티드 상에 존재하는 것과 유사하거나 동일한 글리칸 구조를 지니는 폴리펩티드를 생성시킬 수 있는 것이다.
폴리펩티드의 글리코실화 패턴을 주문제작하기 위해 다양한 방법이 당업계에서 제안되었다 (예를 들어, WO 99/22764; WO 98/58964; WO 99/54342; 미국 공개 번호 2008/0050772; 및 미국 특허 번호 5,047,335 참조). 본질적으로, 폴리펩티드의 시험관내 글리코실화에 요구되는 다수의 효소가 클로닝 및 서열분석되었다. 일부 예에서, 특정 당을 폴리펩티드 상의 불완전한 글리칸 분자에 부가하기 위해 이러한 효소들이 시험관 내에서 사용되었다. 또다른 예에서, 발현된 폴리펩티드에 원하는 당 모이어티를 부가하는 것이 세포 내에서 발생하도록 효소들 및 원하는 폴리펩티드들의 조합을 발현하도록 세포가 유전자 조작되었다.
O-연결 글리코실화를 위해, O-글리칸이 먼저 세린 및 트레오닌 잔기에 연결되고, 뉴클레오티드 당으로부터의 당의 단계적 부가에 의해 형성된다 ([Tanner, et al., Biochim. Biophys. Acta. 906:81-99, 1987]; [Hounsell, et al., Glycoconj. J. 13:19-26, 1996]). 존재하는 O-연결 글리칸의 구조에 의해 폴리펩티드 기능이 영향을 받을 수 있다. O-연결 글리칸 구조의 리뷰를 위해, 예를 들어, [Schachter and Brockhausen, The Biosynthesis of Branched O-Linked Glycans, 1989, Society for Experimental Biology, pp. 1-26 (Great Britain)] 참조.
FIX 폴리펩티드에 N-연결 및/또는 O-연결 글리코실화가 있는지 여부를 표준 기술을 사용하여 결정할 수 있다 (예를 들어, [Techniques in Glycobiology, R. Townsend and A. Hotchkiss, eds. (1997) Marcel Dekker]; 및 [Glycoanalysis Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 76), E. Hounsell, ed. (1998) Humana Press] 참조). 화학적 또는 효소적 탈글리코실화 처리 (예를 들어, 엔도글리코시데이스 및/또는 엑소글리코시데이스를 사용함) 전후의 단백질의 전기영동 이동성 변화가 단백질의 글리코실화 상태를 결정하는데 일상적으로 사용된다. 펩티드-N4-(N-아세틸-베타-D-글리코사미닐) 아스파라긴 아미데이스 (PNGase F), 엔도글리코시데이스 F1, 엔도글리코시데이스 F2, 엔도글리코시데이스 F3 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 효소들 중 임의의 것을 사용하여 효소적 탈글리코실화가 수행될 수 있다. 예를 들어, PNGaseF로 예비처리된 또는 PNGaseF로 처리되지 않은 단백질의 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 분석을 수행할 수 있다. PNGaseF 처리 후의 밴드 폭에서의 현저한 감소 및 이동 위치에서의 변화는 N-연결 글리코실화를 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 단백질 블롯 (예를 들어, SDS-PAGE에 의해 분리되고, 지지체, 예컨대 나일론 막으로 옮겨진 단백질)의 렉틴 분석을 사용하여 글리코실화 단백질의 탄수화물 함량을 또한 검출할 수 있다. 다양한 식물 조직으로부터의 탄수화물 결합 단백질인 렉틴은 당단백질 글리칸 상에서 발견되는 광범위한 명확한 당 에피토프들에 대한 높은 친화력 및 좁은 특이성 양쪽 모두를 지닌다 ([Cummings, Methods Enzymol. 230:66-86, 1994]). 글리코실화 단백질 상의 탄수화물에 대한 렉틴의 결합의 검출을 허용하도록 렉틴이 표지될 수 있다 (직접적으로 또는 간접적으로). 예를 들어, 비오틴 또는 디곡시제닌과 접합된 경우, 검출가능한 생성물이 산출되도록 알칼리성 포스파테이스, 베타-갈락토시데이스, 루시퍼레이스 또는 양고추냉이 과산화효소와 같은 효소에 접합된 아비딘 또는 항-디곡시제닌 항체를 사용하는 반응을 통해 글리코실화 단백질에 결합된 렉틴을 막 블롯 상에서 쉽게 확인할 수 있다. 뚜렷한 특이성이 있는 렉틴들의 패널로 스크리닝하는 것은 당단백질의 탄수화물 보체에 관한 상당한 정보를 제공한다. 변형된 FIX 폴리펩티드의 전기영동 이동성을 기준 단백질의 이동성과 또한 비교할 수 있다.
본 출원은, 부분적으로, 글리코실화 부위에 부착된 탄수화물 사슬이 포유류 탄수화물 사슬 구조, 즉, 포유류 글리코실화 패턴을 지닐 수 있는, 글리코실화 부위가 도입된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 탄수화물 사슬은 인간 글리코실화 패턴을 지닌다. 본원에서 사용된 글리코실화 패턴은 FIX 폴리펩티드의 소정의 집단 내의 특정 올리고당 구조들의 표시를 지칭한다. 이같은 패턴의 비제한적인 예로는 (i) 1개 이상의 시알산 잔기가 있거나; (ii) 어떠한 시알산 잔기도 없거나 (즉, 전하 면에서 중성임); (iii) 1개 이상의 말단 갈락토스 잔기가 있거나; (iv) 1개 이상의 말단 N-아세틸갈락토사민 잔기가 있거나; (v) 1개 이상의 "캡이 없는(uncapped)" 안테나가 있거나, 즉 1개 이상의 말단 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기가 있거나; 또는 (vi) 안테나 N-아세틸글루코사민 잔기에 알파1->3 연결된 1개 이상의 푸코스가 있는 올리고당 사슬의 상대적인 비율이 포함된다.
글리코실화 패턴을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC); 모세관 전기영동 (CE); 핵 자기 공명 (NMR); 고속 원자 포격, 정전분무, 또는 매트릭스-보조 레이터 탈착 (MALDI)과 같은 이온화 기술을 사용하는 질량 분광법 (MS); 기체 크로마토그래피 (GC); 및 음이온-교환 (AIE)-HPLC, 크기-배제 크로마토그래피 (SEC), 또는 MS와 함께 엑소글리코시데이스로 처리하는 것이 비제한적으로 포함되는, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정할 수 있다 (예를 들어, [Weber, et al., Anal. Biochem. 225:135-142, 1995]; [Klausen, et al., J. Chromatog. 718:195-202, 1995]; [Morris, et al., in Mass Spectrometry of Biological Materials, McEwen et al., eds., Marcel Dekker, (1990), pp 137-167]; [Conboy et al., Biol. Mass Spectrom. 21:397-407, 1992]; [Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193:554-573, 1990]; [Sutton, et al., Anal. Biochem. 218:34-46, 1994]; [Harvey, et al., Organic Mass Spectrometry 29:753-766, 1994] 참조).
제약 조성물
포유동물에서 상기 확인된 용태들의 치료에 대한 효능을 결정하는데 사용되는 주지된 분석법을 기초로, 그리고 이러한 결과들을 이러한 용태들을 치료하는데 사용되는 공지된 의약의 결과와 비교함으로써, 각각의 원하는 적응증의 치료에 대해 본 발명의 폴리펩티드의 유효 투여량을 쉽게 결정할 수 있다. 이러한 용태들 중 하나의 치료에서 투여되는 활성 성분의 양은 사용된 특정 폴리펩티드 및 투여량 단위, 투여 방식, 치료 기간, 치료되는 환자의 연령 및 성별, 및 치료되는 용태의 성질 및 정도와 같은 고려사항들에 따라 광범위하게 변할 수 있다.
본 출원은, 부분적으로, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 글리코실화 부위가 도입된 FIX 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 생체내 투여에 적절할 수 있고, 발열원이 없다. 조성물은 제약상 허용가능한 담체를 또한 포함할 수 있다. "제약상 또는 약리학상 허용가능한"이라는 구절은 동물 또는 인간에게 투여되었을 때 유해 반응, 알러지 반응 또는 기타 부작용을 일으키지 않는 분자 본체 및 조성물을 지칭한다. 본원에서 사용된 "제약상 허용가능한 담체"에는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균 작용제, 등장성 및 흡수 지연 작용제 등이 포함된다. 제약상 활성인 물질을 위해 이같은 매질 및 작용제를 사용하는 것은 당업계에 주지되어 있다. 보완적인 활성 성분이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.
본 발명의 조성물에는 고전적인 제약 제제가 포함된다. 이러한 본 발명에 따른 조성물은 임의의 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다. 제약 조성물은 임의의 관례적인 방법에 의해, 예를 들어, 정맥내, 피내, 근육내, 피하, 유선내, 복강내, 수막강내, 눈뒤, 폐내, 경구, 설하, 비강내, 항문, 질 또는 경피 전달에 의해, 또는 특정 부위에서의 수술 이식에 의해 대상 내로 도입될 수 있다. 치료는 단일 투약 또는 일정 기간에 걸친 다중 투약으로 구성될 수 있다.
계면활성제, 예컨대 하이드록시프로필셀룰로스와 적절하게 혼합되어, 물 내의 유리 염기 또는 약리학상 허용가능한 염의 용액으로서 활성 화합물이 투여용으로 제조될 수 있다. 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 내에서, 및 오일 내에서 분산액이 또한 제조될 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건 하에, 이러한 제제들은 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 함유한다.
주사 용도에 적절한 제약 제형에는 무균성 수성 용액 또는 분산액 및 무균성 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균성 분말이 포함된다. 제형은 무균성이어야 하고, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이는 제작 및 보관 조건 하에 안정적이어야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보호되어야 한다. 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 수크로스, L-히스티딘, 폴리소르베이트 80, 또는 이들의 적절한 혼합물, 및 식물성 오일을 예를 들어 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 코팅물, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 적합한 유동성이 유지될 수 있다. 다양한 항균 및 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 미생물 작용의 방지가 초래될 수 있다. 주사용 조성물은 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에서 사용함으로써 주사용 조성물의 장기 흡수가 초래될 수 있다.
필요한 대로 상기 열거된 다양한 기타 성분과 함께 적합한 용매 내에 필요한 양의 활성 화합물 (예를 들어, FIX 폴리펩티드)을 혼입시킨 후, 멸균 여과함으로써 무균성 주사용 용액이 제조될 수 있다.
일반적으로, 다양한 멸균 활성 성분들을 기본적인 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 무균성 비히클 내로 혼입시킴으로써 분산액이 제조될 수 있다. 무균성 주사 용액의 제조를 위한 무균성 분말의 경우, 제조 방법은 활성 성분 + 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말이 이의 앞서 무균성-여과된 용액으로부터 산출되는 진공 건조 및 동결 건조 기술을 예를 들어 포함한다.
제형 시, 투약 제형과 상용성인 방식으로, 그리고 치료적 유효량으로 용액이 투여될 수 있다. "치료적 유효량"은 혈류 또는 표적 조직 내에 원하는 수준의 폴리펩티드를 제공하는데 필요한 폴리펩티드의 양을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 정확한 양은 다수의 요인, 예를 들어, 특정 FIX 폴리펩티드, 치료 조성물의 성분 및 물리적 특성, 의도되는 환자 집단, 전달 방식, 개별적인 환자 고려사항 등에 좌우될 것이고, 본원에서 제공된 정보를 기초로 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
다양한 투약 형태, 예컨대 주사 용액 등으로 제형이 쉽게 투여될 수 있다. 수용액의 경구 투여를 위해, 예를 들어, 필요하다면 용액이 적절하게 완충되어야 하고, 먼저 액체 희석제가 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이 되어야 한다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적절하다.
FIX의 투여량은 일반적으로 유닛으로 표현된다. 체중 ㎏ 당 1 유닛의 FIX는 혈장 수준을 0.01 U/㎖, 즉 1％만큼 상승시킬 수 있다. 다르게는, 건강한 환자에는 혈장 ㎖ 당 1 유닛의 FIX, 즉 100％가 있다. B형 혈우병의 경도 사례는 6-60％ 사이의 FIX 혈장 농도로 정의되고, 중도 사례는 1-5％ 사이로 정의되며, B형 혈우병 사례의 약 절반을 차지하는 고도 사례는 FIX가 1％ 미만이다. 예방 치료 또는 경증 출혈의 치료는 일반적으로 FIX 수준을 15-30％ 사이로 상승시키는 것을 필요로 한다. 중등도 출혈의 치료는 일반적으로 수준을 30-50％ 사이로 상승시키는 것을 필요로 하는 한편, 중증 외상의 치료는 수준을 50 내지 100％로 상승시키는 것을 요구할 수 있다. 환자의 혈액 수준을 상승시키는데 필요한 유닛의 총수를 하기와 같이 결정할 수 있다: 1.0 유닛/㎏ × 체중 (㎏) × 원하는 백분율 증가 (정상의 ％). 최초의 볼루스에 이어지는 약물 제품의 치료적 순환 수준을 유지하기 위한 연속 주입으로 비경구 투여가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 15 내지 150 유닛/㎏의 FIX 폴리펩티드가 투여될 수 있다. 당업자는 좋은 진료(good medical practice) 및 개별적인 환자의 임상 상태에 의해 결정되는 바와 같이 효과적인 투여량 및 투여 계획을 쉽게 최적화할 것이다.
투약 빈도는 작용제의 약동학 파라메터 및 투여 경로에 좌우될 것이다. 투여 경로 및 원하는 투여량에 따라 당업자는 최적의 제약 제형을 결정할 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함된 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20th edition, 2000] 참조). 이같은 제형은 투여된 작용제의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 소거 속도에 영향을 미칠 수 있다. 투여 경로에 따라, 적절한 용량을 체중, 체표면적 또는 기관 크기에 따라 계산할 수 있다. 특히 본원에 개시된 투여량 정보 및 분석법, 뿐만 아니라 동물 또는 인간 임상 시험에서 관찰되는 약동학 데이터의 견지에서, 적합한 치료 용량을 결정하기 위해 필요한 계산의 추가적인 개량이 과도한 실험 없이 당업자에 의해 일상적으로 이루어진다. 예시적인 투약 스케줄에는 1일 5회, 1일 4회, 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 매주 3회, 매주 2회, 매주 1회, 매월 2회, 매월 1회, 및 이의 임의의 조합으로 투여하는 것이 비제한적으로 포함된다.
관련된 용량 응답 데이터와 함께 혈액 응고 수준을 결정하기 위한 확립된 분석법을 사용하여 적합한 투여량을 확인할 수 있다. 약물의 작용을 변형시키는 요인, 예를 들어, 약물의 비활성, 손상의 중증도, 및 환자의 응답, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간, 및 기타 임상 요인을 고려하여, 주치의가 최종 투여량 계획을 결정할 수 있다.
조성물은 미생물 성장을 방지 또는 방해하기 위한 항균제를 또한 포함할 수 있다. 본 발명에 적절한 항균제의 비제한적인 예로는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 질산페닐수은, 티메로솔, 및 이들의 조합물이 포함된다.
항산화제가 또한 조성물 내에 존재할 수 있다. 산화를 방지함으로써 제제의 열화를 방지하기 위해 항산화제가 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 적절한 항산화제에는, 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 차아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 중아황산나트륨, 소듐 포름알데하이드 설폭실레이트, 메타중아황산나트륨, 및 이들의 조합물이 포함된다.
계면활성제가 부형제로서 존재할 수 있다. 예시적인 계면활성제에는 폴리소르베이트, 예컨대 트윈(Tween)®-20 (폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트) 및 트윈®-80 (폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레에이트) 및 플루로닉(pluronic), 예컨대 F68 및 F88 (양쪽 모두 BASF (Mount Olive, N.J.)에서 입수가능); 소르비탄 에스테르; 지질, 예컨대 인지질, 예컨대 레시틴 및 기타 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 지방산 및 지방산 에스테르; 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤; 및 킬레이팅제, 예컨대 EDTA, 아연 및 기타 적절한 양이온이 포함된다.
산 또는 염기가 조성물 내에 부형제로서 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 산의 비-제한적인 예로는 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산 및 이들의 조합물이 포함된다. 적절한 염기의 예로는 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 포름산나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸메르산칼륨 및 이들의 조합물이 포함된다.
조성물 내의 임의의 개별적인 부형제의 양은 부형제의 활성 및 조성물의 특정 요구사항에 따라 변할 수 있다. 전형적으로, 일상적인 실험을 통해, 즉 다양한 양의 부형제 (낮은 양 내지 높은 양 범위)를 함유하는 조성물을 제조하고, 안정성 및 기타 파라메터를 시험한 후, 유의한 유해 효과 없이 최적의 성능이 달성되는 범위를 결정함으로써 임의의 개별적인 부형제의 최적량을 결정할 수 있다. 일반적으로, 부형제는 약 1 내지 약 99 중량％, 약 5 내지 약 98 중량％, 약 15 내지 약 95 중량％의 양으로 30 중량％ 미만의 농도로 조성물 내에 존재할 수 있다. 이러한 상기 제약 부형제들이 기타 부형제들과 함께 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19 ed., Williams & Williams, (1995)]; ["Physician's Desk Reference", 52 ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998)]; 및 [Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipents, 3 Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000]에 기술되어 있다.
예시적인 용도
본원에 기술된 조성물은 FIX의 기능 결함 또는 FIX의 결핍, 예컨대 FIX의 짧아진 생체내 반감기, FIX의 변경된 결합 성질, FIX의 유전적 결함, 및 FIX의 감소된 혈장 농도와 관련된 임의의 출혈 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. FIX의 유전적 결함은, 예를 들어, FIX를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내의 염기의 결실, 부가 및/또는 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 출혈 장애는 B형 혈우병일 수 있다. 이같은 출혈 장애의 증상에는, 예를 들어, 심한 코피, 구강 점막 출혈, 출혈관절증, 혈종, 지속적인 혈뇨, 위장관 출혈, 복막뒤 출혈, 혀/인두뒤 출혈, 두개내 출혈, 및 외상-관련 출혈이 포함된다.
본 발명의 조성물은 예방 용도를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대상 자신의 응고 능력을 강화하기 위해 질환 상태 또는 손상의 여지가 있거나 다른 방식으로 질환 상태 또는 손상의 위험에 있는 대상에게 투여될 수 있다. 이같은 양은 "예방적 유효 용량"으로 정의될 수 있다. 예방을 위한 변형된 FIX 폴리펩티드의 투여는 B형 혈우병을 앓고 있는 환자가 수술을 받을 예정이고 폴리펩티드가 수술 1시간 내지 4시간 전에 투여되는 상황을 포함한다. 또한, 임의적으로는 혈우병을 앓고 있지 않는 환자에서, 폴리펩티드는 제어되지 않는 출혈에 대한 예방제로서 사용하기에 적합하다. 따라서, 예를 들어, 폴리펩티드가 수술 전에 제어되지 않는 출혈에 대한 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다.
본원에 기술된 폴리펩티드, 물질, 조성물 및 방법은 본 발명의 대표적인 예인 것으로 의도되고, 본 발명의 범주가 예의 범주에 의해 한정되지 않는 것으로 이해될 것이다. 당업자는 개시된 폴리펩티드, 물질, 조성물 및 방법이 변동되면서 본 발명이 실행될 수 있고 이같은 변동이 본 발명의 영역 내인 것으로 간주된다는 것을 인지할 것이다.
하기의 실시예들은 본원에 기술된 본 발명을 설명하기 위해 제시되지만, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
본 발명이 더 잘 이해될 수 있기 위하여, 하기의 예들이 기재된다. 이러한 예들은 오직 설명의 목적만을 위한 것이고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
1: 인
실리코
(
in
Silico
) 분석
새로운 N-글리코실화 부위 컨센서스(consensus) 서열의 부가를 위한 가능한 부위를 확인하기 위해, 용매 접근성, 공지된 2차 구조, 공지된 B형 혈우병 돌연변이의 위치, FVIII 및 FX 양쪽 모두와의 상호작용의 예상 부위에 대한 근접성, 및 FIX 단백질 안정성에 대한 소정의 돌연변이의 예상 효과에 대한 FIX 서열의 인 실리코 분석을 수행하였다.
이러한 분석을 기초로, 5개의 부위가 새로운 N-연결 글리코실화 부위의 생성을 위해 촉매 도메인 내에서 확인되었다. 선택된 부위 및 디자인된 변경된 아미노산 서열이 표 2에서 제시된다.
[표 2]
실시예
2: 활성화 펩티드의 서열 정렬
활성화 펩티드 내의 보존 잔기 및 비-보존 잔기가 도 1에 제시된 바와 같은 여러 종의 서열 정렬에 의해 확인되었다.
N-연결 글리코실화 부위의 컨센서스 서열은 Asn-X-Ser/Thr (식중 X는 프롤린 또는 가능하게는 아스파르트산 (또한 바람직하지 않음)을 제외한 임의의 아미노산이다)이다. FIX의 활성화 펩티드 내에 새로운 N-연결 글리코실화 부위를 디자인하기 위해, 종들 간에 보존된 활성화 펩티드 내의 아미노산, 뿐만 아니라 또다른 N-연결 부위에 대한 컨센서스 서열 및 타이로신 황산화에 대한 컨센서스 서열은 이러한 번역후 변형을 파괴하지 않도록 회피되었는데, 이는 이들이 FIX의 약동학에 중요할 수 있기 때문이었다. 이러한 기준을 사용하여, 활성화 펩티드 내에 새로운 N-연결 글리코실화 부위를 부가하기 위한 3개의 부위가 표 3에 나타난 바와 같이 확인되었다.
[표 3]
실시예
3: N-연결
글리코실화
부위를 생성시키기 위한 아미노산의 삽입
다중 서열 정렬 (도 1)은 인간, 붉은털 원숭이, 돼지, 개 및 토끼 FIX에 비해 마우스, 래트, 및 기니피그에 잔기 A161과 E162 사이에 추가적인 아미노산이 있음을 또한 드러냈다. 이러한 추가적인 아미노산들은 3가지 종 간에 크기가 7개 내지 10개로 다양하고, Asp의 과잉 표시 및 어느 정도의 Ile 잔기를 함유한다. 이러한 관찰은 7개 내지 10개 사이의 추가적인 잔기가 FIX 활성에 대한 유의한 효과 없이 래트, 마우스, 및 기니피그에서 이러한 부위에서 허용된다는 것을 실연한다. 8가지 종으로부터의 FIX 간의 다중 서열 정렬을 수행하기 위해 사용된 기준에 따라, 래트, 마우스, 및 기니피그에서의 추가적인 아미노산이 발견되는 명백한 위치는 이러한 부위가 인간 FIX의 E160과 A161 사이, A161과 E162 사이, E162와 T163 사이, 또는 T163과 I164 사이일 수 있도록 변할 수 있다.
서열 
의 9개의 여분의 아미노산을 A161과 E162 사이에서 활성화 펩티드 내에 삽입하였다. 서열 "N-S-T" 및 "N-I-T"는 천연 FIX 활성화 펩티드로부터의 N-연결 컨센서스 서열이다. 양쪽 모두의 경우에, 천연 FIX 서열에서 이들에 글루타민 (Q)가 이어지고, 아스파르트산 (D)이 선행한다. 따라서, 천연 부위를 모방하기 위해 글루타민, 뿐만 아니라 아스파르트산이 포함되었다. N-글리코실화 부위에 대한 1개 내지 3개 사이의 컨센서스 서열 (N-X-S/T)을 함유하는 추가적인 서열이 A161과 E162 사이에 또한 삽입될 수 있는 것으로 구현된다.
변형된 FIX 폴리펩티드의 추가적인 예들이 표 4a, 4b, 및 4c에 기술된다.
[표 4a]
[표 4b]
[표 4c]
실시예
4: O-연결을 N-연결
글리코실화
부위로 변환시키기 위한 치환
표 5는 O-연결 글리코실화 부위를 N-연결 글리코실화 부위로 변환시키기 위해 디자인된 치환을 나타낸다.
[표 5]
실시예
5:
HKB11
세포에서의
FIX
변이체의
발현
단백질 서열이 변경된 FIX 유전자가 포유류 세포로부터 발현되어 분비될 수 있는지를 결정하고, FIX 응고 활성에 대한 이러한 치환의 효과를 결정하기 위해, 이러한 FIX 변이체들을 코딩하는 발현 플라스미드를 HKB11 세포 내로 형질감염시켰다. HKB11은 HEK293 세포와 B 세포 림프종의 융합에 의해 생성된 인간 세포주이다. 이러한 예에서, 각각의 글리코실화 부위 치환을 도 3에서 HG1 내지 HG8에 대해 제시된 바와 같이 제2 치환인 R338A와 조합하였다. R338A 치환은 aPTT 분석법에 의해 측정된 바와 같이 3배 내지 4배만큼 FIX의 비활성을 증가시킨다. 2개의 글리코실화 부위 뮤테인과 R338A의 추가적인 조합을 또한 생성시켜 테스트하였다 (도 3).
형질감염 3일 후, 세포로부터의 배지를 수집하고, FIX에 대해 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 FIX 발현에 대해 분석하였다. 결과는 테스트된 FIX 뮤테인들이 야생형 FIX 또는 R338A 치환만 있는 FIX와 유사한 수준으로 발현되어 배지 내로 분비되었음을 나타냈다 (도 2).
FIX 뮤테인들의 활성을 aPPT 분석법을 사용하여 또한 테스트하였다. 결과는 제IX인자 뮤테인들이 야생형 FIX와 유사하거나 이와 비교하여 증가된 활성을 지닌다는 것을 나타냈다 (도 3 및 4). R338A와 비교하여, 뮤테인들의 활성은 14％ 내지 109％ 사이에서 변하였다. 특히, 뮤테인 HG1, HG3, HG4, HG5, HG6, HG7, HG8, 및 HG3 + HG8의 응고 활성은 R338A의 응고 활성의 55％ 이상이고 야생형 FIX의 300％ 이상이었다.
실시예
6:
HKB11
세포에서의 제
IX
인자
변이체의
글리코실화
뮤테인 HG1 내지 HG8 (도 3) 및 HG9 (도 5)의 초기 분석은 HG2, HG3, HG5, HG6, HG8, 및 HG9에서 SDS-PAGE 겔 상에서의 겉보기 분자량의 증가에 의해 증명되는 바와 같이 글리코실화가 증가되었음을 나타냈다. HG2, HG3, HG5, HG6, 및 HG8에 존재하는 치환들의 다양한 조합을 함유하는 추가적인 FIX 폴리펩티드를 생성시켰다. 예를 들어, 하기의 조합들이 생성되었다: HG2/HG3, HG8/HG2, HG8/HG3, HG8/HG2/HG3. 또다른 가능한 조합에는 HG3/HG5, HG5/HG8, HG3/HG5/HG8. HG3/HG6, HG5/HG6, HG8/HG6, HG3/HG5/HG6, HG3/HG6/HG8, HG5/HG6/HG8, 및 HG3/HG5/HG6/HG8이 예를 들어 포함된다. HG9와의 조합 또한 생성될 수 있다.
글리코실화는 단백질의 분자량을 증가시키고, 이는 SDS-PAGE 겔에서의 감소된 이동성으로서 가시화될 수 있다. 도 2 및 3에 나타난 바와 같이, HG2, HG3, HG5, HG6, HG8, 및 HG9에서 이루어진 치환은 SDS-PAGE 겔 상에서의 이동성 감소를 초래하였다. 이러한 8가지 단일 뮤테인 중에서, 2개의 추가적인 N-연결 컨센서스 서열이 A161과 E162 사이에 삽입된 HG8이 겉보기 분자량에서 가장 큰 증가를 나타냈고, 이는 양쪽 N-연결 부위 모두가 기능성이었음을 시사한다. O-연결 부위가 N-연결 부위로 돌연변이된 4개의 뮤테인 (HG4 내지 HG7) 중에서, HG4는 겔 상에서 이동성 증가를 나타냈고, 이는 이러한 치환이 O-연결 부위를 파괴하였지만 (따라서 FIX 단백질의 분자량이 감소됨), 기능성 N-연결 부위를 생성시키지는 못했음을 나타낸다. 대조적으로, HG5 및 HG6은 겔 상에서 이동성 감소를 나타냈고, 이는 이러한 클론들에서의 치환이 기능성 N-연결 글리코실화 부위를 생성시켰음을 나타낸다. O-연결 부위가 또한 N-연결 부위로 돌연변이된 뮤테인 HG7은 야생형 FIX 또는 FIX-R338A와 비교하여 겔 상에서 이동성 변화를 나타내지 않았다. HG7에서의 치환이 O-연결 부위를 제거하고 따라서 겔 상에서의 이동성을 증가시킬 것으로 예상된다는 사실을 고려하여, 이동성 변화가 없었다는 발견은 도입된 N-연결 부위가 기능성일 수 있음을 시사한다.
HG2/HG3, HG8/HG2, HG8/HG3, 및 HG8/HG2/HG3에 존재하는 치환들의 조합은 개별적인 뮤테인들과 비교하여 이동성에서의 더욱 유의한 감소를 초래하였고, 이는 이러한 조합에 존재하는 다양한 새로운 글리코실화 부위들이 단일 FIX 분자 내에서 조합되었을 때 기능성이었음을 가리킨다. 총 4개의 새로운 N-연결 부위를 함유하는 HG8/HG2/HG3 뮤테인이 가장 큰 이동성 감소를 나타냈다.
실시예
7:
R338A
및
V86A
치환의 조합
야생형 FIX (WT-FIX) 또는 FIX-R338A의 정황에서 부위 지정 돌연변이유발에 의해 FIX의 아미노산 V86이 알라닌으로 변화되었다. 이러한 구축물을 함유하는 발현 벡터들을 HKB11 세포 내로 형질감염시키고, 배지를 3일 후 수집하여, ELISA에 의해 FIX 단백질 수준에 대해, aPTT 분석법에 의해 FIX 응고 활성에 대해 분석하였다. 양쪽 뮤테인 모두 WT-FIX 및 FIX-R338A와 유사한 수준으로 발현되었다. 단일 실험으로부터의 데이터가 표 6a에서 요약된다. 표 6b에는 3회의 실험의 평균이 요약된다.
[표 6a]
[표 6b]
결과는 V86A 치환 단독은 비활성에서의 약 1.8배 증가를 초래하는 한편, R338A 단독은 비활성에서의 4.5배 증가를 초래하였음을 나타낸다. R338A와 V86A의 조합은 야생형 FIX와 비교하여 비활성에서의 8.1배 증가를 초래하였다. 이러한 결과들은 R338A 및 V86A 치환의 양성 효과가 부가적이고, WT-FIX에 비교하여 비활성이 8배 증가된 제IX인자 뮤테인을 초래한다는 것을 나타낸다. R338A-V86A 뮤테인은 8배 더 낮은 용량의 단백질이 현재 이용가능한 재조합 WT-IX와 동일한 치료 효과를 달성하도록 할 것이기 때문에 B형 혈우병 환자에 대한 치료 이점이 개선되었을 것이다. 또한, R338A-V86A의 증가된 비활성은 글리코실화로부터 활성 감소가 초래될 수 있는 글리코실화 형태의 FIX를 생성시키는 경우에 이롭다 .
실시예
8: 인간
FIX
cDNA
의
클로닝
인간 FIX cDNA의 코딩 영역의 5' 및 3' 끝부분의 서열에 상보적인 한 쌍의 PCR 프라이머를 공개된 cDNA 서열 (NM_000133)로부터 디자인하였다. 5' 프라이머 
, FIX의 시작 코돈은 볼드체)는 컨센서스 코작(Kozak) 서열 (밑줄) 및 HindIII 제한 부위가 선행하는 ATG 시작 코돈을 포함하는 FIX 코딩 영역의 최초의 18개의 뉴클레오티드를 함유하였다. 3' 프라이머 
는 HindIII 부위가 선행하는 FIX 코딩 영역의 끝부분의 45개 뉴클레오티드 3'에 있는 FIX 서열의 22개의 뉴클레오티드를 함유하였다. 이러한 프라이머들 및 고-충실도 프루프리딩(proofreading) 중합효소 (Invitrogen (Carlsbad, CA))를 사용한 정상인 간으로부터의 제1 가닥 cDNA (Stratagene (San Diego CA))의 증폭으로 인간 FIX cDNA에 대한 예상 크기 (1464 bp)의 단일 밴드가 생성되었다. HindIII로의 소화 후, PCR 생성물을 겔 정제하고 나서, 플라스미드 pAGE16의 HindIII 부위 내로 클로닝하였다. 벡터 내의 CMV 프로모터에 대해 전방향 배향으로 FIX cDNA가 삽입된 클론이 제한 소화에 의해 확인되었다. 여러 클론의 삽입물에 대해 이중 가닥 DNA 서열분석을 수행하였고, 공개된 FIX 서열에 대한 유래된 서열의 정렬은 cDNA가 성숙형 단백질의 아미노산 148에 트레오닌이 있는 인간 FIX를 코딩한다는 것을 나타냈다. 이러한 플라스미드를 pAGE16-제IX인자 (pAGE16-FIX)로 지정하였다.
실시예
9: 변형된
FIX
폴리펩티드의 생성
인간 FIX 서열 내의 다양한 아미노산을 변화시키기 위해, 한 쌍의 프라이머를 스트라타진(Stratagene)으로부터 입수가능한 퀵체인지(Quickchange)™ 프라이머 디자인 프로그램을 사용하여 디자인하였다. 이러한 프라이머들을 사용하여, 퀵체인지™ II XL 부위 지정 돌연변이유발 키트 (Stratagene (San Diego, CA))를 제조사의 설명서에 따라 사용하여 pAGE16-FIX 플라스미드 내에 돌연변이를 생성시켰다. 원하는 치환을 함유하는 클론이 전체 FIX 코딩 영역의 DNA 서열분석에 의해 확인되었다. 하기의 표 7은 치환을 생성시키는데 사용된 센스 가닥 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타낸다.
[표 7]
상기 기술된 치환들에 더하여, N-글리코실화에 대한 컨센서스 서열 2개를 함유하는 아미노산 9개의 서열을 잔기 A161과 E162 사이에서 활성화 펩티드 내로 삽입하였다. FIX의 이러한 변이체를 생성시키기 위해, 프라이머 t8216c_g8218a 및 t8188c (표 8)로의 부위 지정 돌연변이유발에 의해 아미노산 서열을 변경시키지 않으면서 Y155 및 I164에 SnaB1 및 XbaI에 대한 독특한 제한 부위가 생성되었다. 생성된 플라스미드를 SnaB1 및 XbaI로 소화시켜 잔기 V156 내지 I164에 상응하는 27 bp 단편을 제거한 후, 올리고뉴클레오티드 2프라이머F 및 2프라이머R (표 8)의 어닐링에 의해 생성된 이중 가닥 단편에 결찰시켰다. 생성된 플라스미드의 서열은 N-연결 글리코실화에 대한 컨센서스 서열 (NXT) 2개를 함유하는 서열 NSTQDNITQ (서열 2)의 9개의 아미노산을 코딩하는 27 bp의 삽입이 있는 것으로 이중 가닥 DNA 서열분석에 의해 결정되었다.
[표 8]
실시예
10: 세포 배양 및 일시적인 형질감염
HKB11 세포 (HEK293 및 버킷(Burkitt) B세포 림프종 세포주 2B8의 하이브리드)를 10 ng/㎖ 가용성 비타민 K3 (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO))가 보충된 무혈청 배지 (RF#277) 내에서 37℃의 CO2 (5％) 인큐베이터 내의 궤도형 진탕기 (100-125 rpm) 상에서 현탁 배양으로 성장시키고, 0.25 내지 1.5×106개의 세포/㎖의 밀도로 유지시켰다.
형질감염용 세포를 1000 rpm에서 5분 동안의 원심분리에 의해 수집한 후, 프리스타일(FreeStyle)™ 293 발현 배지 (Invitrogen (Carlsbad, CA)) 내에 1.1×106개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 세포를 6웰 플레이트에 파종하고 (4.6 ㎖/웰), 37℃ CO2 인큐베이터 내의 궤도형 회전기 (125 rpm) 상에서 인큐베이션하였다. 각각의 웰에 대해, 5 ㎍ 플라스미드 DNA를 0.2 ㎖ Opti-MEM® I 배지 (Invitrogen)와 혼합하였다. 각각의 웰에 대해, 7 ㎕ 293펙틴(fectin)™ 시약 (Invitrogen)을 0.2 ㎖ Opti-MEM® I 배지와 서서히 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 희석된 293펙틴™을 희석된 DNA 용액에 첨가하고, 서서히 혼합하고, 실온에서 20-30분 동안 인큐베이션한 후, 5×106개 (4.6 ㎖)의 HKB11 세포가 파종되어 있는 각각의 웰에 첨가하였다. 그후, 세포를 37℃의 CO2 인큐베이터 내의 궤도형 회전기 (125 rpm) 상에서 3일 동안 인큐베이션하고 나서, 1000 rpm에서 5분 동안의 원심분리에 의해 세포를 펠렛화하고, 상등액을 수집하고, 4℃에서 보관하였다.
일부 경우에, HEK293 세포를 표준 리포펙션 프로토콜 및 시판되는 시약을 사용하여 384웰 플레이트에서 FIX 변이체에 대한 발현 구축물로 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 후 72시간 동안 배양하고, 이러한 시점에 추후의 분석을 위해 상등액을 수확하였다.
실시예
11:
FIX
에 대한
웨스턴
블롯
세포 배양 상등액 (50 ㎕)을 20 ㎕ 4× SDS-PAGE 로딩 염료와 혼합하고, 95℃에서 5분 동안 가열하고, NuPAGE® 4-12％ SDS PAGE 겔 상에 로딩한 후, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 5％ 분유로 30분 동안 차단한 후, 막을 인간 FIX에 대한 HRP-표지 염소 폴리클로날 항체 (US Biological (Swampscott, Massachusetts), 카탈로그 번호 F0017-07B)와 함께 60분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 포스페이트-완충 염수 + 0.1％ 트윈®-20 완충제로 세정한 후, 수퍼시그널(SuperSignal)® 피코(Pico) (Pierce (Rockford, IL)) 및 x선 필름에의 노출을 사용하여 HRP로부터의 신호를 검출하였다.
실시예
12:
FIX
ELISA
세포 배양 상등액 내의 FIX 항원 수준을 FIX ELISA 키트 (Hyphen Biomed/Aniara (Mason, OH))를 사용하여 결정하였다. 표준 곡선의 범위 내의 신호를 달성하도록 세포 배양 상등액을 샘플 희석 완충제 (키트에서 공급됨)에서 희석하였다. 샘플 희석제 내에 희석된 인간 혈장으로부터 정제된 FIX 단백질 (Hyphen Biomed/Aniara, 카탈로그 번호 RK032A, 비활성 196 U/㎎)을 사용하여 100 ng/㎖ 내지 0.2 ng/㎖의 표준 곡선이 생성되었다. 희석된 샘플 및 표준물을 폴리클로날 항-FIX 포획 항체로 미리 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 폴리클로날 검출 항체를 첨가한 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 광범위하게 세정하고, 키트 제조사가 기술한 바와 같이 TMB 기질 (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 사용하여 발색시키고, 신호를 450 nM에서 스펙트라맥스(SpectraMax)® 플레이트 판독기 (Molecular Devices (Sunnyvale, CA))를 사용하여 측정하였다. 표준 곡선을 2-성분 플롯에 맞추고, 미지물의 값을 곡선으로부터 외삽하였다.
시판되는 FIX ELISA 시약 (Haemochrom Diagnostica GmbH (Essen, Germany))을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 FIX 발현 수준을 또한 정량하였다. 밀 배아 응집소 (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO))를 384웰 맥시소프(MaxiSorp)™ 플레이트 (Nunc™ (Rochester, NY)) 상에 코팅하였다. 웰을 차단하고, 세정한 후, 상등액을 첨가하였다. 추가적인 세정 후, HRP가 커플링된 폴리클로날 항-FIX 항체 (Haemochrom Diagnostica GmbH (Essen, Germany))를 사용하여 검출하였다.
실시예
13:
FIX
응고 분석법
일렉트라(Electra)™ 1800C 자동 응고 분석기 (Beckman Coulter (Fullerton, CA)) 상에서 실행된 FIX 결핍 인간 혈장에서의 aPTT 분석법을 사용하여 FIX 응고 활성을 결정하였다. 간략하게, 응고 희석제 내의 상등액 샘플의 3가지 희석물을 장치에 의해 생성시킨 후, 100 ㎕를 100 ㎕ FIX 결핍 혈장 (Aniara (Mason, OH)) 및 100 ㎕ 자동 aPTT 시약 (토끼 뇌 인지질 및 미분화 실리카 (bioMerieux, Inc. (Durham, NC))과 혼합하였다. 100 ㎕의 25 mM CaCl2 용액을 첨가한 후, 응괴 형성 시간을 기록하였다. ELISA 분석법에서 표준물로 사용된 동일한 정제된 인간 FIX (Hyphen Biomed/Aniara)의 단계 희석물을 사용하여 각각의 실행에 대해 표준 곡선이 생성되었다. 표준 곡선은 일상적으로 상관 계수가 0.95 이상인 직선이었고, 이를 사용하여 미지 샘플의 FIX 활성을 결정하였다.
실시예
14: 순환
FIX
의 측정
FIX 폴리펩티드의 순환 반감기를 시험관내 분석법을 사용하여 측정하였다. 이러한 분석법은 간세포 내의 아데노바이러스 (Ad) 축적을 매개하는 FIX의 생체내 및 시험관내 능력을 기초로 한다. 간략하게, FIX가 Ad 피버 놉(fiber knob) 도메인에 결합할 수 있고 세포 표면 헤파린 설페이트 프로테오글리칸 (HSPG)을 통한 바이러스 흡수에 대한 다리를 제공할 수 있는 것으로 나타났다 ([Shayakhmetov, et al., J. Virol 79:7478-7491, 2005]). 피버 놉 도메인 내에 돌연변이를 함유하는 아데노바이러스 벡터 돌연변이체인 Ad5mut는 FIX에 결합하지 않는다. Ad5mut는 상당히 감소된 간 세포 감염 능력 및 생체내 간 독성을 지니는데, 이는 FIX가 Ad 벡터를 간 세포로 표적화하는 것에서 주요 역할을 한다는 것을 나타낸다 ([Shayakhmetov, et al., 2005]). Ad 벡터를 간 세포로 표적화하는 FIX의 능력을 단백질-HSPG 상호작용의 억제제에 의해 차단할 수 있다 ([Shayakhmetov, et al., 2005]).
또한, FIX의 HSPG-매개 흡수는 FIX 소거에 상당히 기여하고, 결과적으로, HSPG 상호작용을 방해하는 것은 FIX의 반감기를 증가시킬 것으로 예상된다. 따라서, 간세포에서의 FIX 및/또는 FIX 변이체의 시험관내 흡수를 측정하였고, 흡수가 감소된 변이체는 생체내 반감기가 증가된 것으로 예상되었다.
시험관 내에서 FIX 반감기를 측정하기 위해, 포유류 세포를 FIX 또는 FIX 변이체의 존재 또는 부재 하에 아데노바이러스와 함께 인큐베이션하였다. 바이러스 흡수가 야생형 FIX에 의해 매개되었고, 바이러스 게놈 내에 코딩된 리포터 유전자, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현 또는 루시퍼레이스 발현에 의해 측정되었다. FIX 변이체의 존재 하에서의 아데노바이러스 흡수 감소가 야생형 FIX에 비교하여 감소된 리포터 유전자 발현, 예를 들어, 감소된 GFP 형광 또는 감소된 루시퍼레이스 효소 활성으로서 측정되었다.
당업자에게 주지된 표준 기술을 사용하여 생체 내에서 FIX 순환 반감기를 측정하였다. 간략하게, 각각의 용량의 FIX 또는 FIX 변이체를 정맥내 주사에 의해 대상에게 투여하였다. 주사 후 다수의 시점에 혈액 샘플을 취하고, FIX 농도를 적합한 분석법 (예를 들어, ELISA)에 의해 결정하였다. 반감기, 즉 FIX의 농도가 투약 직후의 FIX 농도의 절반인 시간을 결정하기 위해, 다양한 시점의 FIX 농도를 FIX 용량의 투여 직후 예상되거나 측정된 FIX 농도와 비교하였다. 시험관내 분석법에서의 감소된 세포 흡수와 생체내 분석법에서의 증가된 반감기 간의 상관관계가 예상된다.
상기 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 본원에 참조로 포함된다. 기술된 본 발명의 방법의 다양한 변형 및 변동이 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명이 특정 실시양태들과 관련하여 기술되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명이 이같은 특정 실시양태들에 과도하게 한정되지 않아야 함을 이해하여야 한다. 실제로, 생화학 분야 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 상기 기술된 방식들의 다양한 변형이 하기의 청구항의 범주 내인 것으로 의도된다. 당업자는 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 다수의 등가물을 인지하거나, 또는 이를 단지 일상적인 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 이같은 등가물들은 하기의 청구항에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Bayer HealthCare LLC
Bayer HealthCare AG
Brooks, Alan
Murphy, John E.
Seto, Marian
Jiang, Xiaoqiao
Patel, Chandra
Gritzan, Uwe
Kirchner, Kornelia
Haupts, Ulrich
<120> MODIFIED FACTOR IX POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
<130> MSB-7324
<150> US 61/124,567
<151> 2008-04-16
<150> US 61/045,961
<151> 2008-04-17
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 415
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg
1 5 10 15
Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe
20 25 30
Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly
35 40 45
Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp
50 55 60
Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys
65 70 75 80
Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu
85 90 95
Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr
100 105 110
Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val
115 120 125
Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr
130 135 140
Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu
145 150 155 160
Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn
165 170 175
Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe
180 185 190
Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly
195 200 205
Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu
210 215 220
Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu
225 230 235 240
Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His
245 250 255
His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu
260 265 270
Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile
275 280 285
Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser
290 295 300
Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala
305 310 315 320
Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys
325 330 335
Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly
340 345 350
Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro
355 360 365
His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser
370 375 380
Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys
385 390 395 400
Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
405 410 415
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insertion sequence
<400> 2
Asn Ser Thr Gln Asp Asn Ile Thr Gln
1 5
<210> 3
<211> 415
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide variant
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> X is selected from D and E.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> X is selected from A, E, P, S, and V.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (104)..(104)
<223> X is selected from D, N, and T.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (121)..(121)
<223> X is selected from N, Q, and T.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (138)..(138)
<223> X is selected from N, S, and T.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (148)..(148)
<223> (i) X148 is T and X150 is F;
(ii) X148 is N and X150 is T; and
(iii) X148 is N and X150 is S;
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (150)..(150)
<223> (i) X148 is T and X150 is F;
(ii) X148 is N and X150 is T; and
(iii) X148 is N and X150 is S;
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (151)..(151)
<223> X is selected from A, P, and T.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (151)..(151)
<223> (i) X151 is P and X153 is V;
(ii) X151 is N and X153 is T; and
(iii) X151 is N and X153 is S.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (152)..(152)
<223> X is selected from D, N, and T.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (153)..(153)
<223> (i) X151 is P and X153 is V;
(ii) X151 is N and X153 is T; and
(iii) X151 is N and X153 is S.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (159)..(159)
<223> (i) X159 is T and X161 is A;
(ii) X159 is N and X161 is T; and
(iii) X159 is N and X161 is S.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (160)..(164)
<223> Z1, Z2, Z3, and Z4 are independently selected from
(i) zero to twelve amino acid residues and
(ii) SEQ ID NO: 2;
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (161)..(161)
<223> (i) X159 is T and X161 is A;
(ii) X159 is N and X161 is T; and
(iii) X159 is N and X161 is S.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (169)..(169)
<223> X is selected from T and N.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (172)..(172)
<223> X is selected from C, T, and N.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (174)..(174)
<223> X is selected from S and T.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (177)..(177)
<223> (i) X177 is D and X178 is F;
(ii) X177 is E and X178 is T; and
(iii) X177 is E or D and X178 is S.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (178)..(178)
<223> (i) X177 is D and X178 is F;
(ii) X177 is E and X178 is T; and
(iii) X177 is E or D and X178 is S.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (226)..(226)
<223> (i) X226 is G and X228 is K;
(ii) X226 is N and X228 is T; and
(iii) X226 is N and X228 is S.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (228)..(228)
<223> (i) X226 is G and X228 is K;
(ii) X226 is N and X228 is T; and
(iii) X226 is N and X228 is S.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (338)..(338)
<223> X is selected from R and A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (353)..(355)
<223> (i) X353 is F, X354 is H, X355 is E;
(ii) X353 is N, X354 is V, X355 is T;
(iii) X353 is N, X354 is I, X355 is T; and
(iv) X353 is N, X354 is H, V, or I, X355 is S.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (370)..(372)
<223> (i) X370 is V, X371 is T, X372 is E;
(ii) X370 is N, X371 is V, X372 is T;
(iii) X370 is N, X371 is I, X372 is T; and
(iv) X370 is N, X371 is T, V, or I, X372 is S.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (391)..(393)
<223> (i) X391 is M, X392 is K, X393 is G;
(ii) X391 is N, X392 is K, X393 is T;
(iii) X391 is N, X392 is V, X393 is T; and
(iv) X391 is N, X392 is V or K, X393 is S.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (413)..(414)
<223> (i) X413 is K and X414 is L;
(ii) X413 is N and X414 is L; and
(iii) X413 is N and X414 is I.
<400> 3
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg
1 5 10 15
Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe
20 25 30
Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly
35 40 45
Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp
50 55 60
Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys
65 70 75 80
Asn Cys Glu Leu Xaa Xaa Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu
85 90 95
Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Xaa Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr
100 105 110
Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Xaa Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val
115 120 125
Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Xaa Gln Thr Ser Lys Leu Thr
130 135 140
Arg Ala Glu Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Asn Ser Xaa Glu
145 150 155 160
Xaa Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Xaa Gln Ser Xaa Gln Xaa Phe Asn
165 170 175
Xaa Xaa Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe
180 185 190
Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly
195 200 205
Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu
210 215 220
Thr Xaa Val Xaa Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu
225 230 235 240
Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His
245 250 255
His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu
260 265 270
Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile
275 280 285
Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser
290 295 300
Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala
305 310 315 320
Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys
325 330 335
Leu Xaa Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly
340 345 350
Xaa Xaa Xaa Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro
355 360 365
His Xaa Xaa Xaa Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser
370 375 380
Trp Gly Glu Glu Cys Ala Xaa Xaa Xaa Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys
385 390 395 400
Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Xaa Xaa Thr
405 410 415
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insertion sequence
<400> 4
Thr Asn Ser Thr Thr
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insertion sequence
<400> 5
Thr Asn Ser Thr Gln Asn Ile Thr Thr
1 5
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insertion sequence
<400> 6
Thr Asn Ser Thr Gln Asn Ile Thr Gly Asn Asp Thr Glu Lys Thr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insertion sequence
<400> 7
Thr Asn Ser Thr Gln Asn Ile Thr Gly Asn Asp Thr Glu Asn Gly Thr
1 5 10 15
Lys Thr
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIXF1 - 5' primer
<400> 8
atcataagct tgccaccatg cagcgcgtga acatg 35
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIXR3- 3' primer
<400> 9
atcataagct tgattagtta gtgagaggcc ctg 33
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 10
ctgctgccca ctgtgttgaa actaacgtta ccattacagt tgtcgcaggt gaac 54
<210> 11
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 11
caccatctat aacaacatgt tctgtgctgg caacgtgacc ggaggtagag attcatgtca 60
aggagatagt g 71
<210> 12
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 12
gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc cataacgtga ccgtggaagg gaccagtttc 60
ttaactggaa tta 73
<210> 13
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 13
ggaattatta gctggggtga agagtgtgca aacgtgacca aatatggaat atataccaag 60
gtatcccgg 69
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 14
tcaactggat taaggaaaaa acaaacctca cttaatgaaa gatggatttc 50
<210> 15
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 15
ctgatgtgga ctatgtaaat tctactgaaa atgaaaccat tttggataac atcac 55
<210> 16
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 16
actcaaagca cccaatcatt taatgagacc actcgggttg ttggtgg 47
<210> 17
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 17
acttctaagc tcacccgtgc tgagactgtt tttaatgata cggactatgt aaattctact 60
g 61
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 18
gaagctgaaa ccattttgga taacatcaat caaagcaccc aatc 44
<210> 19
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 19
attttggata acatcactca aagcaaccaa tcatttaatg acttcac 47
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 20
acttctaagc tcacccgtgc tgagaatgtt actcctgatg tggac 45
<210> 21
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 21
gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct aatgaaactg aaaccatttt ggataac 57
<210> 22
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer T8216c_g8212a
<400> 22
ttctactgaa gctgaaacca ttctagataa catcactcaa agcaccc 47
<210> 23
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer T8188c
<400> 23
ctgtttttcc tgatgtggac tacgtaaatt ctactgaagc tgaaa 45
<210> 24
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2PrimerF
<400> 24
gtaaattcta ctgaagctaa ctccacacag gataatatca cacaagaaac catt 54
<210> 25
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2PrimerR
<400> 25
ctagaatggt ttcttgtgtg atattatcct gtgtggagtt agcttcagta gaatttac 58
<210> 26
<211> 461
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
65 70 75 80
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe
210 215 220
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn
290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
450 455 460
Claims (23)
- 하나 이상의 아미노산 치환 또는 삽입을 도입함으로써 변형된 아미노산 서열을 포함하는 제IX인자 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 아미노산 서열이 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입함으로써 변형된 폴리펩티드.
- 제2항에 있어서, 하나 이상의 글리코실화 부위가 N-연결 글리코실화 부위 및 O-연결 글리코실화 부위로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 하나 이상의 도입된 글리코실화 부위에 부착된 탄수화물 사슬을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 G4T; E33N; E36T; E36N; R37N; F75N; F77T; E83T; D85N; V86A; K91T; A103T; V107T; K122N; K122T; S138N; A146N; T148N; F150T; P151N; T159N; A161T; A161N; T169N; Q170N; T172N; D177N; D177E; F178T; K201N; K201T; K214T; V223N; G226N; Y226T; K228N; K228T; E239N; E242N; I251T; A262T; E294N; R338A; R338N; K341N; F353N; H354V; H354I; E355T; V370N; T371V; T371I; E372T; E374N; M391N; K392V; G393T; E410N; K413N; L414I; Y1N 및 S3T; S3N 및 K5T; G4N 및 L6T; K5N 및 E7T; L6N 및 E8T; E7N 및 F9T; F9N 및 Q11T; V10N 및 G12T; Q11N 및 N13T; G12N 및 L14T; N13 및 E15T; L14N 및 R16T; E15N 및 E17T; M19N 및 E21T; E20N 및 K22T; S24N 및 E26T; F25N 및 E27T; E26N 및 A28T; E27N 및 R29T; A28N 및 E30T; R29N 및 V31T; E30N 및 F32T; V31N 및 E33T; F32N 및 N34T; T35N 및 R37T; T38N 및 E40T; T39N 및 F41T; E40N 및 W42T; F41N 및 K43T; W42N 및 Q44T; K43N 및 Y45T; Q44N 및 V46T; Y45N 및 D47T; V46N 및 G48T; E52N 및 N54T; S53N 및 P55T; G59N 및 S61T; K63N 및 D65T; I66N 및 S68T; S68N 및 E70T; G76N 및 E78T; E78N 및 K80T; E83N 및 D85T; L84N 및 V86T; I90N 및 N92T; K100N 및 S102T; S102N 및 D104T; A103N 및 N105T; D104N 및 K106T; K106N 및 V108T; R116N 및 A118T; E119N 및 Q121T; Q121N 및 S123T; A127N 및 P129T; V135N 및 V137T; S136N 및 S138T; V137N 및 Q139T; Q139N 및 S141T; T140N 및 K142T; S141N 및 L143T; E147N 및 V149T; T148N 및 F150T; V149N 및 P151T; P151N 및 V153T; D152N 및 D154T; V153N 및 Y155T; D154N 및 V156T; Y155N 및 N157T; V156N 및 S158T; S158N 및 E160T; T159N 및 A161T; E160N 및 E162T; E162N 및 I164T; T163N 및 L165T; I164N 및 D166T; L165N 및 N167T; D166N 및 I168T; I168N 및 Q170T; T169N 및 S171T; S171N 및 Q173T; T172N 및 S174T; Q173N 및 F175T; S174N 및 N176T; G184N 및 D186T; E185N 및 A187T; D186N 및 K188T; A187N 및 P189T; P189N 및 Q191T; G200N 및 V202T; K201N 및 D203T; V202N 및 A204T; E224N 및 G226T; T225N 및 V227T; G226N 및 K228T; V227N 및 I229T; H236N 및 I238T; I238N 및 E240T; E240N 및 E242T; T241N 및 H243T; H243N 및 E245T; K247N 및 N249T; V250N 및 R252T; I251N 및 I253T; I253N 및 P255T; A261N 및 I263T; A262N 및 N264T; D276N 및 P278T; V280N 및 N282T; F302N 및 S304T; S304N 및 Y306T; R312N 및 F314T; V313N 및 H315T; F314N 및 K316T; H315N 및 G317T; K316N 및 R318T; G317N 및 S319T; S319N 및 L321T; A320N 및 V322T; R327N 및 P329T; P329N 및 V331T; D332N 및 A334T; L337N 및 S339T; S339N 및 K341T; T340N 및 F342T; T343N 및 Y345T; G352N 및 H354T; F353N 및 E355T; H354N 및 G356T; E355N 및 G357T; G356N 및 R358T; G357N 및 D359T; E372N 및 E374T; W385N 및 E387T; G386N 및 E388T; A390N 및 K392T; D85N, K122T, 및 I251T; D85N, K122T, 및 E242N; E125N, P126A, 및 A127T; P126N, V128T, 및 P129A; T148N, F150T, 및 P151A; F150N, P151A, 및 D152T; P151N, V153T, 및 A161N; P151N, V153T, 및 t172n; V153N, Y155T, 및 E294N; T172N, G226N, 및 K228T; F353N, H354V, 및 E355T; F353N, H354I, 및 E355T; V370N, T371V, 및 E372T; V370N, T371I, 및 E372T; M391N, K392V, 및 G393T; D85N, P151N, V153T, 및 K228N; D85N, P151N, V153T, 및 E242N; K122T, P151N, V153T, 및 K228N; K122T, P151N, V153T, 및 E242N; K122T, P151N, V153T, 및 I251T; T148N, F150T, G226N, 및 K228T; P151N, V153T, T172N, 및 R338A; P151N, V153T, D177E, 및 F178T; P151N, V153T, G226N, 및 K228T; T172N, G226N, K228T, 및 R338A; D85N, K122T, P151N, V153T, 및 E242N; D85N, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; K122T, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; S138N, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; T148N, F150T, G226N, K228T, 및 R338A; P151N, V153T, T172N, G226N, 및 K228T; P151N, V153T, D177E, F178T, 및 R338A; P151N, V153T, G226N, K228T, 및 R338A; 및 P151N, V153T, T172N, G226N, K228T, 및 R338A; 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 R37N; D85N; K122T; S138N; A146N; A161N; Q170N; T172N; D177N; F178T; K201N; K228N; E239N; E242N; I251T; A262T; E294N; E374N; E410N; G59N 및 S61T; K63N 및 D65T; G76N 및 E78T; S102N 및 D104T; A103N 및 N105T; D104N 및 K106T; E119N 및 Q121T; Q121N 및 S123T; S136N 및 S138T; Q139N 및 S141T; T140N 및 K142T; T148N 및 F150T; V149N 및 P151T; P151N 및 V153T; D152N 및 D154T; V153N 및 Y155T; D154N 및 V156T; V156N 및 S158T; S158N 및 E160T; E160N 및 E162T; E162N 및 I164T; T163N 및 L165T; I164N 및 D166T; D166N 및 I168T; I168N 및 Q170T; S171N 및 Q173T; T172N 및 S174T; Q173N 및 F175T; S174N 및 N176T; K201N 및 D203T; V202N 및 A204T; E224N 및 G226T; T225N 및 V227T; G226N 및 K228T; T241N 및 H243T; I251N 및 I253T; I253N 및 P255T; A262N 및 N264T; V280N 및 N282T; T343N 및 Y345T; E372N 및 E374T; D85N, K122T, 및 E242N; D85N, K122T, 및 I251T; F150N, P151A, 및 D152T; T172N, G226N, 및 K228T; D85N, P151N, V153T, 및 K228N; D85N, P151N, V153T, 및 E242N; K122T, P151N, V153T, 및 K228N; K122T, P151N, V153T, 및 E242N; K122T, P151N, V153T, 및 I251T; P151, V153T, G226N, 및 K228T; D85N, K122T, P151N, V153T, 및 E242N; D85N, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; S138N, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; P151N, V153T, T172N, G226N, 및 K228T로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 D85N; K122T; S138N; T172N; K201N; K228N; E239N; E242N; I251T; A262T; E294N; G59N 및 S61T; G76N 및 E78T; S102N 및 D104T; A103N 및 N105T; D104N 및 K106T; E119N 및 Q121T; Q121N 및 S123T; S136N 및 S138T; Q139N 및 S141T; T140N 및 K142T; T148N 및 F150T; V149N 및 P151T; P151N 및 V153T; D152N 및 D154T; S158N 및 E160T; E162N 및 I164T; T163N 및 L165T; T172N 및 S174T; Q173N 및 F175T; K201N 및 D203T; T225N 및 V227T; G226N 및 K228T; I253N 및 P255T; A262N 및 N264T; V280N 및 N282T; E372N 및 E374T; 및 D85N, K122T, 및 E242N; D85N, K122T, 및 I251T; F150N, P151A, 및 D152T; T172N, G226N, 및 K228T; D85N, P151N, V153T, 및 K228N; D85N, P151N, V153T, 및 E242N; K122T, P151N, V153T, 및 K228N; K122T, P151N, V153T, 및 E242N; K122T, P151N, V153T, 및 I251T; P151, V153T, G226N, 및 K228T; D85N, K122T, P151N, V153T, 및 E242N; D85N, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; S138N, P151N, V153T, G226N, 및 K228T; P151N, V153T, T172N, G226N, 및 K228T로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
- 하기의 아미노산 서열을 포함하고, 이때 FIX 폴리펩티드가 서열 1의 FIX 폴리펩티드와 비교하여 1개 이상의 도입된 글리코실화 부위를 포함하는 제IX인자 폴리펩티드:
(식 중,
X85는 D 및 E로부터 선택되고;
X86은 A, E, P, S, 및 V로부터 선택되고;
X104는 D, N, 및 T로부터 선택되고;
X121은 N, Q, 및 T로부터 선택되고;
X138은 N, S, 및 T로부터 선택되고;
X148 및 X150은 하기로부터 선택되고:
(i) X148은 T이고 X150은 F임;
(ii) X148은 N이고 X150은 T임;
(iii) X148은 N이고 X150은 S임;
X151은 A, P, 및 T로부터 선택되고;
X151 및 X153은 하기로부터 선택되고:
(i) X151은 P이고 X153은 V임;
(ii) X151은 N이고 X153은 T임; 및
(iii) X151은 N이고 X153은 S임;
Z1, Z2, Z3, 및 Z4는 독립적으로 하기로부터 선택되고:
(i) 0개 내지 12개의 아미노산 잔기 및
(ii) 서열 2;
X152는 D, N, 및 T로부터 선택되고;
X159 및 X161은 하기로부터 선택되고:
(i) X159는 T이고 X161은 A임;
(ii) X159는 N이고 X161은 T임; 및
(iii) X159는 N이고 X161은 S임;
X169는 T 및 N으로부터 선택되고;
X172는 T 및 N으로부터 선택되고;
X174는 S 및 T로부터 선택되고;
X177 및 X178은 하기로부터 선택되고:
(i) X177은 D이고 X178은 F임;
(ii) X177은 E이고 X178은 T임; 및
(iii) X177은 E 또는 D이고 X178은 S임;
X226 및 X228은 하기로부터 선택되고:
(i) X226은 G이고 X228은 K임;
(ii) X226은 N이고 X228은 T임; 및
(iii) X226은 N이고 X228은 S임;
X338은 R 및 A로부터 선택되고;
X353, X354, 및 X355는 하기로부터 선택되고:
(i) X353은 F이고, X354는 H이고, X355는 E임;
(ii) X353은 N이고, X354는 V이고, X355는 T임;
(iii) X353은 N이고, X354는 I이고, X355는 T임; 및
(iv) X353은 N이고, X354는 H, V, 또는 I이고, X355는 S임;
X370, X371, 및 X372는 하기로부터 선택되고:
(i) X370은 V이고, X371은 T이고, X372는 E임;
(ii) X370은 N이고, X371은 V이고, X372는 T임;
(iii) X370은 N이고, X371은 I이고, X372는 T임; 및
(iv) X370은 N이고, X371은 T, V, 또는 I이고, X372는 S임;
X391, X392, 및 X393은 하기로부터 선택되고:
(i) X391은 M이고, X392는 K이고, X393은 G임;
(ii) X391은 N이고, X392는 K이고, X393은 T임;
(iii) X391은 N이고, X392는 V이고, X393은 T임; 및
(iv) X391은 N이고, X392는 V 또는 K이고, X393은 S임;
X413 및 X414는 하기로부터 선택된다:
(i) X413은 K이고 X414는 L임;
(ii) X413은 N이고 X414는 L임; 및
(iii) X413은 N이고 X414는 I임). - 제6항 또는 제7항에 있어서, R338A 및 V86A로부터 선택된 아미노산 치환을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 내지 10개 사이의 아미노산 잔기를 인간 제IX인자의 아미노산 잔기 160-164 사이에 도입함으로써 아미노산 서열이 변형되어 하나 이상의 글리코실화 부위의 도입이 초래되는 폴리펩티드.
- 제10항에 있어서, 아미노산 잔기가 아미노산 잔기 160-161 사이, 아미노산 잔기 161-162 사이, 아미노산 잔기 162-163 사이, 또는 아미노산 잔기 163-164 사이에 삽입되는 폴리펩티드.
- 제11항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 아미노산 잔기 160-161 사이, 아미노산 잔기 161-162 사이, 아미노산 잔기 162-163 사이, 또는 아미노산 잔기 163-164 사이에 도입되는 폴리펩티드.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, V86A; R338A; V86A 및 R338A; T148N 및 F150T; D177E 및 F178T; P151N 및 V153T; P151N, V153T, 및 T172N; G226N 및 K228T로부터 선택된 아미노산 치환을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 내지 10개 사이의 아미노산 잔기를 제IX인자 폴리펩티드의 C-말단에 도입함으로써 아미노산 서열이 변형되어 하나 이상의 글리코실화 부위의 도입이 초래되는 폴리펩티드.
- 제14항에 있어서, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 및 서열 7로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제IX인자 폴리펩티드의 C-말단에 도입되는 폴리펩티드.
- R338A 치환 및 V86A 치환을 포함하는 제IX인자 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 도입된 글리코실화 부위들 중 하나 이상에서의 탄수화물 사슬의 부착이 폴리펩티드의 혈청 반감기를 도입된 글리코실화 부위가 없는 폴리펩티드에 비해 30％ 이상만큼 증가시키는 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 비활성이 폴리펩티드 ㎎ 당 적어도 100 유닛(unit)인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 제IX인자 폴리펩티드 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 제제.
- B형 혈우병의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 제19항의 제약 제제를 투여하는 단계를 포함하는, B형 혈우병을 치료하는 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열.
- 숙주 세포가 제IX인자 폴리펩티드를 발현하도록 하는 방식으로 제20항에 따른 DNA 서열로 형질감염된 진핵 숙주 세포.
- (i) 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입함으로써 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형시키는 단계; (ii) 폴리펩티드를 하나 이상의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 허용하는 방식으로 발현시키는 단계; 및 (iii) 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하는, 제IX인자 폴리펩티드의 제조 방법.
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