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KR20100118126A - Ｋｌｏｔｈｏ-ｆｇｆ 융합 폴리펩티드를 사용하는 방법 및 조성물 - Google Patents

Ｋｌｏｔｈｏ-ｆｇｆ 융합 폴리펩티드를 사용하는 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20100118126A
KR20100118126A KR1020107019047A KR20107019047A KR20100118126A KR 20100118126 A KR20100118126 A KR 20100118126A KR 1020107019047 A KR1020107019047 A KR 1020107019047A KR 20107019047 A KR20107019047 A KR 20107019047A KR 20100118126 A KR20100118126 A KR 20100118126A
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Application number
KR1020107019047A
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Inventor
데이비드 글라스
쇼우-이 후
Original Assignee
노파르티스 아게
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Filing date
Publication date
Application filed by 노파르티스 아게 filed Critical 노파르티스 아게
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Abstract

본 발명은 노화-관련 병태 또는 대사 장애를 예방 또는 치료하기 위한 방법, 키트 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 적어도 Klotho 단백질 또는 그의 활성 단편을 포함한다. Klotho 융합 단백질은 다양한 노화-관련 병태 및 대사 장애의 치료 및 예방에서 유용하다.

Description

ＫＬＯＴＨＯ-ＦＧＦ 융합 폴리펩티드를 사용하는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS USING KLOTHO-FGF FUSION POLYPEPTIDES}
알파-Klotho 유전자는 세포외 도메인 및 짧은 세포질 도메인을 갖는 130 kDa 단일 통과형 I 막횡단 단백질을 코딩한다. 알파-Klotho 단백질의 세포외 도메인은 KL-D1 및 KL-D2로 불리는 2개의 하위도메인을 포함한다. 이들 2개의 하위도메인은 세균 및 식물의 β-글루코시다제에 대해 서열 상동성을 공유한다. 알파-Klotho 단백질의 세포외 도메인은 막횡단 도메인에 의해 세포 표면에 결합될 수 있거나, 절단되어 세포외 환경으로 방출될 수 있다. 세포외 도메인의 절단은 국소의 낮은 세포외 Ca2 + 농도에 의해 촉진되는 것으로 보인다.
알파-Klotho에 추가로, 알파-Klotho의 상동체인 베타-Klotho가 확인되었다 (Ito et al., Mech. Dev. 98:115-9 (2000)). 베타-Klotho도 또한 세포외 KL-D1 및 KL-D2 하위도메인을 갖는 단일 통과형 I 막횡단 단백질이다.
알파-Klotho 발현의 조정은 포유동물에서 노화 관련 특징을 생성시키는 것으로 입증되었다. 알파-Klotho 유전자에서의 기능 손실 돌연변이에 동종접합성인 마우스는 수명 단축, 피부 위축, 근육 쇠약, 동맥경화증, 폐기종 및 골다공증을 포함한 인간 노화를 닮은 특징을 나타낸다 (Kuro-o et al., Nature, 390:45-51 (1997)). 이와 반대로, 마우스에서 알파-Klotho 유전자의 과다발현은 야생형 마우스에 비해 수명을 연장시키고 스트레스에 대한 내성을 증가시킨다 ([Kurosu et al., Science 309:1829-1833 (2005)]; [Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 280:38029-38034 (2005)]).
섬유모세포 성장 인자 (FGF)는 많은 유기체에서 발현되는 상동성 폴리펩티드 성장 인자의 패밀리를 구성한다 (Ornitz and Itoh, Genome Biol. 2: reviews, 3005.1-3005.12 (2001)). 척추동물 종 사이에서, FGF는 유전자 구조 및 아미노산 서열 모두에 있어서 고도로 보존되어, 서로 13-71%의 아미노산 동일성을 갖는다. 인간에 있어서, FGF 패밀리의 22개의 공지의 구성원이 존재한다 (FGF15는 인간 FGF19의 마우스 오르토로그 (ortholog)이고, 따라서 인간 FGF15는 존재하지 않는다). 초기 발생 동안, FGF는 세포 증식, 이동, 및 분화를 조절하지만, 성체 유기체에서, FGF는 항상성을 유지하고, 조직 수복에서 기능을 하고, 손상에 대해 반응한다.
FGF는 세포-표면 FGF 수용체에 결합하여 그를 활성화시킴으로써 성장 인자로서 기능을 한다. FGF 수용체 (FGFR)는 FGFR의 자가인산화, FRS2 (FGF 수용체 기질 2) 및 ERK1/2 (세포외 신호-조절된 단백질 키나제 1/2)의 인산화를 통해 신호 전달을 활성화시키고, Egr-1 (초기 성장 반응-1)을 활성화시키는 티로신 키나제 수용체이다. FGF는 또한 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 대해 높은 친화도를 갖는다. FGF에 결합될 때, 헤파린 술페이트는 FGFR의 활성화를 향상시킨다.
최근의 연구는 FGF23-결핍 마우스 및 알파-Klotho-결핍 마우스 사이의 놀랍게도 유사한 생물학적 특징을 입증하였고 ([Shimada et al., J. Clin. Invest. 113:561-568 (2004)]; [Yoshida et al. Endocrinology 143:683-689 (2002)]), 이는 FGF23과 알파-Klotho 사이의 기능적 상호교류를 나타낸다. 이들 연구는 그의 동족 (cognate) FGF 수용체를 통한 결합 및 신호전달 모두의 측면에서 FGF23의 필연적인 파트너로서 알파-Klotho의 확인을 이끌었다 (Urakawa et al., Nature 22:1524-6 (2007)). 알파-Klotho 유전자는 신장, 부갑상선 및 맥락얼기에서 주로 발현된다. 알파-Klotho의 조직-특이적 발현은 FGF23 신호전달의 활성화를 이들 조직에 제한하는 것으로 가정되었다.
FGF23/알파-Klotho에 유사하게, 베타-Klotho는 그들의 각각의 동족 FGF 수용체를 통한 결합 및 신호전달 모두에서 FGF19 및 FGF21의 필연적인 파트너이다 ([Ogawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7432-7 (2007)]; [Lin et al., J. Biol Chem. 282:27227-84 (2007)]; 및 [Wu et al., J. Biol. Chem. 282:29069-72 (2007)]). 상기 연구에서는 또한 조직-특이적 대사 활성을 조절하는데 있어서 베타-Klotho의 관련을 입증하였다. 베타-Klotho는 초기에 지방 조직에서 탄수화물 및 지질 대사를 조절하기 위해 보조인자로서 FGF21과 함께 작용하는 것으로 나타났다. 베타-Klotho는 FGF19와 함께 간에서 담즙산 대사를 조절하고, 따라서 베타-Klotho 결핍 마우스에서 상승된 담즙 합성을 설명한다 (Ito et al., J Clin Invest. 2005 Aug;115(8):2202-8).
미국 특허 6,579,850에서는 알파-Klotho 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 및 조성물을 설명한다. 인간 및 마우스 알파-Klotho 폴리펩티드가 개시되어 있다. 상기 특허에서는 또한 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 조로증을 닮은 증후군을 치료하고, 성인병을 치료하고, 노화를 억제하는데 있어서 유용함을 개시하고 있다.
미국 특허 7,223,563에서는 FGF23 폴리펩티드 서열을 코딩하는 단리된 핵산 또는 그러한 단리된 핵산을 포함하는 재조합 세포를 설명한다. 상기 특허는 추가로 저인산혈성 및 고인산혈성 질환, 골다공증, 피부근육염, 및 관상동맥 질환을 진단 및 치료하는 방법에 관한 것이다.
미국 특허 7,259,248에서는 FGF21 폴리펩티드 서열을 코딩하는 단리된 핵산을 설명한다. 상기 특허는 추가로 간 질병, 흉선 기능에 관련된 병태를 진단 및 치료하는 방법, 및 고환의 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
<발명의 개요>
본 발명은 Klotho 융합 폴리펩티드 또는 가용성 Klotho 폴리펩티드를 사용하여 노화-관련 병태 또는 대사 장애를 예방 또는 치료하기 위한 방법, 키트 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 Klotho 단백질 또는 그의 활성 단편 (예를 들어, sKlotho)으로 형성된다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 Klotho 단백질 또는 그의 활성 단편 및 섬유모세포 성장 인자 또는 그의 활성 단편을 포함하는 Klotho 융합 폴리펩티드를 제공한다.
제1 측면에서, 본 발명은 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자 또는 그의 활성 단편을 갖는 융합 폴리펩티드를 제공한다. Klotho 세포외 도메인은 알파 또는 베타 Klotho 이소형으로부터 유래될 수 있다. 추가로, Klotho 융합 폴리펩티드의 FGF 성분은 주로 섬유모세포 성장 인자-19, 섬유모세포 성장 인자-21 및 섬유모세포 성장 인자-23을 참조로 설명되지만, 임의의 23개의 공지의 FGF가 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 본원의 내용을 통해, 알파 또는 베타 세포외 도메인과 각각의 인간 FGF 단백질 또는 그의 활성 단편과의 모든 조합이 각각 개별적으로 및 구체적으로 고려되는 것으로 추정할 수 있다.
본 발명에 따라, Klotho 단백질의 세포외 도메인은 Klotho 단백질의 KL-D1 및 KL-D2 도메인 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 Klotho 단백질의 적어도 2개의 세포외 하위도메인을 갖는다. 예를 들어, 2개의 세포외 하위도메인은 직렬 반복 (tandem repeat)되는 2개의 KL-D1 도메인, 직렬 반복되는 2개의 KL-D2 도메인, 또는 하나의 KL-D1 도메인과 하나의 KL-D2 도메인일 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 전장 알파 Klotho 단백질의 아미노산 28-292를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 전장 베타 Klotho 단백질의 아미노산 52-997을 포함한다.
본 발명에 따라, Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 FGF 또는 그의 활성 단편을 포함하는 폴리펩티드는 함께 공유 방식으로 연결될 수 있고, 예를 들어, 펩티드 결합에 의해 인 프레임 (in frame)으로 화학적으로 연결되거나 융합될 수 있다. 이들은 또한 링커를 통해 연결될 수 있다. 폴리펩티드 링커의 비제한적인 예는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 및 18이다. 그러한 링커는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18 중 적어도 하나 내지 약 30개 이하의 반복체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라, Klotho 단백질의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자는 다양한 배향 및 방식으로 서로 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, Klotho 단백질의 세포외 하위도메인은 섬유모세포 성장 인자의 N-말단에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 별법으로 섬유모세포 성장 인자는 Klotho 단백질의 세포외 하위도메인의 N-말단에 작동가능하게 연결될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명은 Klotho 단백질의 sKlotho, 및 링커를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 알파 Klotho 단백질의 sKlotho, 및 링커를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 베타 Klotho 단백질의 sKlotho, 및 링커를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 인간 FGF 단백질 또는 그의 활성 단편 (예를 들어, 신호 펩티드가 없는) 및 링커를 제공한다. 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물, 및 노화-관련 병태 또는 대사 장애를 치료 또는 예방하기 위한 그들의 용도가 또한 본 발명에 포함된다.
한 실시태양에서, 본 발명은 FGF-23에 (직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로) 융합된 신호 펩티드가 있는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 FGF-23에 (직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로) 융합된 신호 펩티드가 없는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 신호 펩티드가 없는 FGF-23에 (직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로) 융합된 신호 펩티드가 있는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 신호 펩티드가 없는 FGF-23에 (직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로) 융합된 신호 펩티드가 없는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 FGF-23 (R179Q) 변이체에 (직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로) 융합된 신호 펩티드가 있는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 FGF-23 (R179Q) 변이체에 (직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로) 융합된 신호 펩티드가 없는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 신호 펩티드가 없는 FGF-23 (R179Q) 변이체에 (직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로) 융합된 신호 펩티드가 있는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 신호 펩티드가 없는 FGF-23 (R179Q) 변이체에 (직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로) 융합된 신호 펩티드가 없는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 (1) 신호 펩티드가 있는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho; (2) 링커; 및 (3) 신호 펩티드가 없는 FGF-23 (R179Q) 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 (1) 신호 펩티드가 없는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho; (2) 링커; 및 (3) 신호 펩티드가 없는 FGF-23 (R179Q) 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 글리코실화된다.
한 실시태양에서, 본 발명은 (1) 신호 펩티드가 있는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho (서열 44 또는 서열 45); (2) 서열 11을 포함하는 링커; 및 (3) 신호 펩티드가 없는 FGF-23 (R179Q) 변이체 (서열 43)를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 (1) 신호 펩티드가 없는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho (서열 7); (2) 서열 11을 포함하는 링커; 및 (3) 신호 펩티드가 없는 FGF-23 (R179Q) 변이체 (서열 43)를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 서열 19, 20, 40, 또는 41의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 글리코실화된다.
한 실시태양에서, 본 발명은 신호 펩티드가 있는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho (서열 44 또는 서열 45); 및 서열 11을 포함하는 링커를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 신호 펩티드가 없는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho (서열 7); 및 서열 11을 포함하는 링커를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 글리코실화된다.
한 실시태양에서, 본 발명은 인간 FGF 단백질 또는 그의 활성 단편 (예를 들어, 신호 펩티드가 없는); 및 서열 11을 포함하는 링커를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 글리코실화된다.
한 실시태양에서, 본 발명은 (예를 들어, 유일한 제약 활성 성분으로서) (1) 신호 펩티드가 있는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho (서열 44 또는 서열 45); (2) 서열 11을 포함하는 링커; 및 (3) 신호 펩티드가 없는 FGF-23 (R179Q) 변이체 (서열 43)을 포함하는 융합 폴리펩티드 (예를 들어, 글리코실화된 또는 비-글리코실화된)를 포함하는 제약 조성물 (예를 들어, 근육내 투여형으로); 및 노화-관련 병태, 예를 들어 근육 위축을 치료 및/또는 예방하기 위한 제약 조성물의 용도를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 (예를 들어, 유일한 제약 활성 성분으로서) (1) 신호 펩티드가 없는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho (서열 7); (2) 서열 11을 포함하는 링커; 및 (3) 신호 펩티드가 없는 FGF-23 (R179Q) 변이체 (서열 43)를 포함하는 융합 폴리펩티드 (예를 들어, 글리코실화된 또는 비-글리코실화된)를 포함하는 제약 조성물 (예를 들어, 근육내 투여형으로); 및 노화-관련 병태, 예를 들어 근육 위축을 치료 및/또는 예방하기 위한 제약 조성물의 용도를 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 (예를 들어, 유일한 제약 활성 성분으로서) 서열 19, 20, 40, 또는 41의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드 (예를 들어, 글리코실화된 또는 비-글리코실화된)를 포함하는 제약 조성물 (예를 들어, 근육내 투여형으로); 및 노화-관련 병태, 예를 들어 근육 위축을 치료 및/또는 예방하기 위한 제약 조성물의 용도를 제공한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 (예를 들어, 유일한 제약 활성 성분으로서) 신호 펩티드가 있는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho (서열 44 또는 서열 45); 및 서열 11을 포함하는 링커를 포함하는 융합 폴리펩티드 (예를 들어, 글리코실화된 또는 비-글리코실화된)를 포함하는 제약 조성물 (예를 들어, 근육내 투여형으로); 및 노화-관련 병태, 예를 들어 근육 위축을 치료 및/또는 예방하기 위한 제약 조성물의 용도를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 (예를 들어, 유일한 제약 활성 성분으로서) 신호 펩티드가 없는 알파 Klotho 단백질의 sKlotho (서열 7); 및 서열 11을 포함하는 링커를 포함하는 융합 폴리펩티드 (예를 들어, 글리코실화된 또는 비-글리코실화된)를 포함하는 제약 조성물 (예를 들어, 근육내 투여형으로); 및 노화-관련 병태, 예를 들어 근육 위축을 치료 및/또는 예방하기 위한 제약 조성물의 용도를 제공한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 (예를 들어, 유일한 제약 활성 성분으로서) 인간 FGF 단백질 또는 그의 활성 단편 (예를 들어, 신호 펩티드가 없는); 및 서열 11을 포함하는 링커를 포함하는 융합 폴리펩티드 (예를 들어, 글리코실화된 또는 비-글리코실화된)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물, 및 노화-관련 병태 (예를 들어, 근육 위축) 또는 대사 장애 (예를 들어, 당뇨병)를 치료 또는 예방하기 위한 그들의 용도가 또한 본 발명에 포함된다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 19에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 20에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 융합 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 40에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 41에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 융합 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 FGF-19 또는 그의 활성 단편에 (직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로) 융합된 신호 펩티드가 있는 베타 Klotho 단백질의 sKlotho를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 FGF-19 또는 그의 활성 단편에 (직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로) 융합된 신호 펩티드가 없는 베타 Klotho 단백질의 sKlotho를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 FGF-21 또는 그의 활성 단편에 (직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로) 융합된 신호 펩티드가 있는 베타 Klotho 단백질의 sKlotho를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 FGF-21 또는 그의 활성 단편에 (직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로) 융합된 신호 펩티드가 없는 베타 Klotho 단백질의 sKlotho를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 본원에서 설명되는 임의의 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에서 고려되는 임의의 Klotho 융합 폴리펩티드를 갖는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 헤파린을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 개체에서 노화-관련 병태를 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 개체 (예를 들어, 인간)에는 노화-관련 병태를 치료 또는 예방하기 위해 Klotho 단백질 (예를 들어, 알파 Klotho 단백질)의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자 또는 그의 활성 단편을 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 함유하는 치료 유효 용량의 제약 조성물이 투여된다. 특히, 본 발명은 개체 (예를 들어, 인간)에게 알파 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자 (또는 그의 활성 단편)를 갖는 치료 유효량의 융합 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 근육 쇠약을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 개체에서 대사 장애를 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 개체에는 대사 장애를 치료하기 위해 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자 (또는 그의 활성 단편)를 갖는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 함유하는 치료 유효 용량의 제약 조성물이 투여된다. 특히, 베타-Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자 21을 갖는 본 발명의 융합 폴리펩티드는 대사 장애를 치료하기 위해 유용하다.
본 발명의 Klotho-FGF23 융합 폴리펩티드는 개체에서 고인산혈증 또는 석회증을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드를 함유하는 약물 유효 용량의 제약 조성물이 고인산혈증 또는 석회증을 치료 또는 예방하기 위해 투여된다. 특히, 알파 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자 23을 갖는 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 고인산혈증 또는 석회증을 치료하기 위해 유용하다.
본 발명의 Klotho-FGF23 융합 폴리펩티드는 개체에서 만성 신장병 또는 만성 신부전증을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. Klotho 단백질 (예를 들어, 알파 Klotho 단백질)의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드를 함유하는 치료 유효 용량의 제약 조성물은 만성 신장병 또는 만성 신부전증을 치료 또는 예방하기 위해 투여된다.
본 발명의 Klotho-FGF23 융합 폴리펩티드는 개체에서 암 (예를 들어, 유방암)을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. Klotho 단백질 (예를 들어, 알파 Klotho 단백질)의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드를 함유하는 치료 유효 용량의 제약 조성물은 암 또는 유방암을 치료 또는 예방하기 위해 투여된다.
본 발명은 의약에서 사용하기 위한, Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 FGF 또는 그의 활성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 근육 위축을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 FGF 또는 그의 활성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 가용성 Klotho 단백질을 포함하는 치료 유효 용량의 제약 조성물을 노화 관련 병태 (예를 들어, 근육 위축)의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 노화 관련 병태 (예를 들어, 근육 위축)를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 개체에서 노화-관련 질환 또는 대사 장애를 치료 또는 예방하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 사용지시서, 및 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 정제된 Klotho 융합 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드를 제조하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 사용지시서, 및 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다.
도 1은 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드의 몇몇 상이한 실시태양을 예시한 것이다. 제시된 융합 폴리펩티드는 섬유모세포 성장 인자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 Klotho 세포외 하위도메인을 포함한다. 하나 이상의 Klotho 세포외 하위도메인을 함유하는 폴리펩티드는 예를 들어 Klotho의 세포외 도메인 (예를 들어, 인간 Klotho의 a.a. 1 내지 982), 또는 Klotho의 활성 단편을 포함한다.
도 2는 본 발명의 몇몇 Klotho 융합 폴리펩티드 및 그의 성분 (예를 들어, Klotho 세포외 도메인, FGF)의 아미노산 및 핵산 서열을 예시한 것이다.
도 3a-3c는 sKlotho-FGF23 융합 단백질의 단백질 발현을 도시한 것이다. 도 3a는 항-FGF23 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅 (Western blotting)에 의해 sKlotho-FGF23 융합 단백질이 조건화된 배지에서 검출되었음을 보여준다. 도 3b는 SDS-PAGE 및 쿠마지 블루 (Coomassie blue) 염색에 의해 sKlotho-FGF23 융합 단백질이 조건화된 배지에서 검출되었음을 보여준다. 도 3c는 SDS-PAGE 및 쿠마지 블루 염색에 의해 분석된, 고도로 정제된 sKlotho-FGF23-6xHis 융합 단백질을 보여준다.
도 4는 헤파린 (20 ㎍/ml)의 부재 또는 존재 하에 Klotho 융합 폴리펩티드, FGF23 폴리펩티드만, 가용성 Klotho (sKlotho) 폴리펩티드만, 및 가용성 Klotho 폴리펩티드를 FGF23 폴리펩티드와 조합으로 함유하는 조건화된 배지로 처리한 세포에서 Egr-1의 활성화 수준을 비교하는 Egr-1 루시퍼라제 분석 결과를 도시한 것이다.
도 5a-5b는 헤파린의 부재 또는 존재 하에 정제된 Klotho 융합 폴리펩티드, FGF23 폴리펩티드, 또는 가용성 Klotho 폴리펩티드로 처리한 세포에서 Egr-1의 활성화 수준을 비교하는 Egr-1 루시퍼라제 분석 결과를 도시한 것이다. 도 5a는 헤파린 (20 ㎍/ml)의 부재 또는 존재 하에 FGF23 단독, sKlotho-His (10 nM 또는 20 nM) 및 FGF23과 sKlotho-His (10 nM 또는 20 nM)의 조합물로 처리한 세포에서 Egr-1의 활성화 수준을 비교하는 실험의 결과를 보여준다. 도 5b는 sKlotho-FGF23-His 융합체 (0 nM, 0.6 nM, 1.21 nM, 2.41 nM, 4.83 nM, 9.65 nM, 및 19.3 nM)로 처리한 세포에서 Egr-1 루시퍼라제 리포터 활성을 보여준다.
도 6a-6b는 C2C12 근육 세포에 대한 정제된 sKlotho 융합 폴리펩티드를 사용한 처리의 효과를 도시한 것이다. 도 6a는 덱사메타손 (100 μM)의 부재 또는 존재 하에 IGF-1 (10 nM), FGF2 (20 ng/ml), 또는 정제된 Klotho 융합 폴리펩티드 (20 nM)로 처리한 C2C12 근육 세포에서 근관 (myotube) 직경의 측정치를 보여준다. 도 6b는 라파마이신 (40 nM)의 부재 또는 존재 하에 IGF-1 (10 nM), FGF2 (20 ng/ml), 또는 정제된 Klotho 융합 폴리펩티드 (20 nM)에 의한 C2C12 근육 세포에서의 신호전달 경로 단백질의 인산화를 보여준다.
본 발명은 노화-관련 병태 및 대사 장애를 예방 또는 치료하기 위한 방법, 키트 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 융합 폴리펩티드는 Klotho 단백질 또는 그의 활성 단편을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 섬유모세포 성장 인자 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편에 작동가능하게 연결된 Klotho 단백질 또는 그의 활성 단편을 포함한다. 본 발명의 Klotho 융합 단백질 또는 sKlotho는 근감소증 (sarcopenia), 피부 위축, 근육 쇠약, 뇌 위축, 죽상경화증, 동맥경화증, 폐기종, 골다공증, 골관절염, 면역부전, 고혈압, 치매, 헌팅턴 (Huntington) 병, 알츠하이머 (Alzheimer) 병, 백내장, 노화-관련 황반 변성, 전립선암, 뇌졸중, 기대 수명 감소, 기억 상실, 주름, 신장 기능 손상, 및 노화-관련 난청을 포함한 다양한 노화-관련 병태; 및 II형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈당증, 및 비만을 포함한 대사 장애의 치료 및 예방에서 유용하다.
본 발명은 적어도 부분적으로, 물리적 제약 (예를 들어, Klotho 및 FGF 폴리펩티드 모두의 큰 크기)에도 불구하고, Klotho-FGF 융합 폴리펩티드는 FGF 수용체를 활성화시키는데 있어서 고도로 효과적이라는 발견에 기초한 것이다. 이들 2개의 단백질의 융합은 아마도 이종이량체화를 저해하고 따라서 단백질의 활성을 저해할 것임을 고려할 때 상기 발견은 예기치 않은 것이고; 예를 들어, 단백질의 결합 도메인은 융합에 의해 불안정해질 수 있거나, 단백질들은 "cis" 형태로 함께 놓이면 공간적으로 잘못 배향될 수 있다.
본원에서 설명되는 Klotho-FGF 융합 폴리펩티드는 단독으로 또는 별개의 폴리펩티드로서 함께 투여된 Klotho 또는 FGF에 비해 향상된 활성을 갖는 단일 치료 단백질의 투여를 허용하기 때문에 유리하다. 2개의 별개의 폴리펩티드 (즉, Klotho 폴리펩티드 및 별개의 FGF 폴리펩티드)로서보다는 단일 융합 폴리펩티드로서 Klotho 및 FGF의 사용이 FGF 수용체를 활성화시키는데 있어서 더 효과적이다.
정의
"Klotho 폴리펩티드", "Klotho 단백질", 또는 "Klotho"는 본원에서 사용될 때, 야생형 "Klotho"의 활성 단편, 유도체, 모방체 (mimetic), 변이체 및 화학적으로 변형된 화합물 또는 그의 하이브리드를 포함한다. Klotho 활성 단편은 FGF 폴리펩티드에 결합하는 능력을 갖는다. 일반적으로, Klotho 활성 폴리펩티드는 적어도 Klotho 하위도메인 (예를 들어, KL-D1 및 KL-D2)을 함유한다. 야생형 Klotho는 자연에서 발견되는 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 예시적인 Klotho 폴리펩티드는 알파-Klotho (서열 2) 및 베타-Klotho (서열 4)를 포함한다. 알파-Klotho 및 베타-Klotho의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 GenBank 데이타베이스에서 각각 기탁 번호 NM_004795; NP_004786 및 NM_175737; NP_783864로 발견된다. Klotho 폴리펩티드는 그 전문을 본원에 참고로 포함시킨 미국 특허 6,579,850에 기재된 것을 포함한다. Klotho 폴리펩티드는 인간 이외의 다른 종으로부터의 것, 예를 들어 마우스 (NP_038851), 래트 (NP_112626), 토끼 (NP_001075692)로부터의 알파-Klotho 및 마우스로부터의 베타-Klotho (NP_112457)을 포함한다. 알파-Klotho를 갖는 것으로 예상되는 종은 침팬지 (XP_522655), 짧은꼬리 원숭이 (macaque) (XP_001101127), 말 (XP_001495662), 소 (XP_001252500), 오리너구리 (XP_001510981), 및 닭 (XP_417105)을 포함한다. 베타-Klotho를 갖는 것으로 예상되는 종은 침팬지 (XP_526550), 짧은꼬리 원숭이 (XP_001091413), 말 (XP_001495248), 개 (XP_536257), 래트 (XP_001078178), 오리너구리 (XP_001512722), 및 닭 (XP 423224)을 포함한다. Klotho 폴리펩티드는 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한; 즉, 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열, 또는 그의 활성 단편을 갖는다.
"융합 폴리펩티드" 또는 "융합 단백질"은 본원에서 사용될 때, 동일한 폴리펩티드에서 자연적으로 존재하지 않는 2개 이상의 상이한 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편을 포함하는 폴리펩티드를 의미할 것이다. 일부 실시태양에서, 2개 이상의 상이한 폴리펩티드는 공유 방식으로 함께 작동가능하게 연결되고, 예를 들어, 펩티드 결합에 의해 인 프레임으로 화학적으로 연결되거나 융합된다. 본원에서 사용될 때, "Klotho 융합 폴리펩티드"는 Klotho 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편으로부터의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
"섬유모세포 성장 인자" 및 "FGF"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 인간 대상을 포함한 동물에서 세포 증식, 이동, 분화, 항상성, 조직 수복 및 손상에 대한 반응을 조절하는 폴리펩티드를 나타낼 것이다. FGF는 섬유모세포 성장 인자 수용체에 결합하여, FGFR의 자가인산화, FRS2 (FGF 수용체 기질 2) 및 ERK1/2 (세포외 신호-조절된 단백질 키나제 1/2)의 인산화, 및 Egr-1 (초기 성장 반응-1)을 활성화시키는 것을 포함한 그의 활성을 조절하는 능력이 있다. 용어 "FGF"는 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같이 및 그 전문을 본원에 참조로 포함시킨 미국 특허 7,223,563 및 미국 특허 7,259,248에 설명된 바와 같이 야생형 "FGF"의 활성 단편, 유도체, 모방체, 변이체 및 그의 화학적으로 변형된 화합물 또는 하이브리드를 포함한다. 야생형 FGF는 자연에서 발견되는 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 예시적인 섬유모세포 성장 인자는 섬유모세포 성장 인자-19 (FGF19; 서열 31), 섬유모세포 성장 인자-21 (FGF21; 서열 33), 및 섬유모세포 성장 인자-23 (FGF23; 서열 35)을 포함한다. FGF 폴리펩티드는 인간 이외의 다른 종으로부터의 것, 예를 들어 쥐 FGF를 포함한다. 일반적으로, FGF 폴리펩티드는 서열 31, 서열 33 또는 서열 35의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열; 즉, 서열 31, 서열 33 또는 서열 35의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열, 또는 그의 활성 단편을 갖는다.
용어 "FGF"는 전장 폴리펩티드의 활성 단편을 포함한다. 그들의 상응하는 FGF 수용체에 결합할 수 있는 활성 FGF 단편은 당업계에 공지되어 있고, 또한 본 발명에서 사용이 고려된다. 당업자는 본원에 개시된 서열에 기초하여, FGF의 겹치는 단편이 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)] 및 [Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York)]에 기재된 표준 재조합 기술을 이용하여 생성될 수 있음을 알 것이다. 당업자는 본원에 제시된 개시문에 기초하여 FGF 수용체에 대한 결합을 포함한 FGF 단편의 생물학적 활성이 당업계에 잘 공지되고 본원에서 설명되는 방법에 의해 시험될 수 있음을 알 것이다. 유사하게, 필수 FGF 신호 전달 기구 (즉, FGF 수용체)를 갖는 세포 배양 모델은 FGF 단편으로 형질감염되고, 후속적으로 야생형 FGF에 비해 FGF 신호전달에서 변경에 대해 시험될 수 있다.
FGF는 특히 상이한 FGF 하위패밀리 사이에서, 길이 및 1차 서열 모두에서 고도로 가변성인 N- 및 C-말단 서열이 측면에 접하는 FGF 코어 (core) 상동성 도메인 (대략 120 아미노산 길이)의 상동성을 기초로 하여 7개의 하위패밀리로 분류된다 (Goetz et al., Molecular and Cellular Biology, 2007, Vol 27, 3417-3428). FGF 활성 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 FGF 코어 상동성 도메인을 함유한다. 일부 실시태양에서, FGF 활성 폴리펩티드는 FGF 코어 상동성 도메인에 추가로, FGF 수용체에 결합하는데 추가의 특이성을 부여할 수 있는 측면에 접하는 서열을 함유할 수 있다. FGF19, FGF21, 및 FGF23은 이들 리간드의 코어 구역이 다른 FGF에 비해 높은 서열 동일성을 공유하므로 FGF19 하위패밀리 내에 분류된다 (FGF19 v. FGF21: 38% 동일성; FGF19 v. FGF23: 36% 동일성). FGF19 하위패밀리 구성원은 내분비계의 신호전달 분자에 유사하게 작용하고, 전통적인 FGF에 일반적이지 않은 다양한 생리학적 과정을 조절한다 (예를 들어, FGF19: 에너지 및 담즙산 항상성; FGF21: 글루코스 및 지질 대사; 및 FGF23: 포스페이트 및 비타민 D 항상성).
"섬유모세포 성장 인자 수용체" 및 "FGFR"은 본원에서 사용될 때, 당업계에 공지된 임의의 하나의 FGFR 1-4, 또는 그의 스플라이스 (splice) 변이체 (예를 들어, FGFR1c)를 나타낸다. 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 예시적인 섬유모세포 성장 인자 수용체는 섬유모세포 성장 인자 수용체-19 (예를 들어, FGFR4-베타 Klotho), 섬유모세포 성장 인자 수용체-21 (예를 들어, FGFR1c-알파 Klotho), 및 섬유모세포 성장 인자 수용체-23 (예를 들어, FGFR1c-알파 Klotho, FGFR3-알파 Klotho, FGFR4-알파 Klotho)을 포함한다.
"세포외 도메인"은 본원에서 사용될 때, 세포의 외부에 존재하는 막횡단 단백질의 단편 (예를 들어, 세포내 또는 막횡단 구역을 포함하지 않음)을 나타낸다. "Klotho 단백질의 세포외 도메인", "가용성 Klotho", 또는 "sKlotho" (예를 들어, 서열 7; 서열 39)는 섬유모세포 성장 인자에 결합할 수 있고/있거나 섬유모세포 성장 인자에 결합함으로써 섬유모세포 성장 인자 수용체에 대한 섬유모세포 성장 인자의 결합을 가능하게 할 수 있는 Klotho 폴리펩티드의 세포외 도메인을 나타낸다. Klotho 세포외 도메인은 전장 알파 Klotho 서열 (서열 2)의 아미노산 잔기 28-982에 및 전장 베타 Klotho 서열 (서열 4)의 아미노산 잔기 52-997에 상응한다.
"Klotho 단백질의 세포외 하위도메인" 및 "Klotho 단백질의 세포외 하위도메인"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 섬유모세포 성장 인자에 결합할 수 있고/있거나 섬유모세포 성장 인자에 결합함으로써 섬유모세포 성장 인자 수용체에 대한 섬유모세포 성장 인자의 결합을 가능하게 할 수 있는 Klotho 폴리펩티드의 세포외 도메인 내의 구역을 나타낼 것이다. Klotho 세포외 도메인은 반복되는 2개의 상동성 하위도메인, 즉, KL-D1 (서열 5) 및 KL-D2 (서열 6)를 갖는다. KL-D1 및 KL-D2는 각각 전장 알파 Klotho 폴리펩티드 (서열 2)의 아미노산 잔기 58-506 및 517-953에, 및 각각 전장 베타 Klotho 폴리펩티드 (서열 4)의 아미노산 잔기 77-508 및 571-967에 상응하고, 본 발명에서 사용하기 위해 적합하다. 일반적으로, 적어도 하나의 Klotho 하위도메인을 함유하는 폴리펩티드는 Klotho 활성 폴리펩티드이다. 본 발명의 폴리펩티드에서 사용하기 위한 Klotho 세포외 하위도메인은 각각 서열 5 또는 서열 37의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 알파 Klotho 또는 베타 Klotho KL-D1 도메인일 수 있다. 추가로, Klotho KL-D1 도메인은 서열 5 또는 서열 37의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. Klotho 세포외 하위도메인은 또한 각각 서열 6 또는 서열 38의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 알파 또는 베타 Klotho 폴리펩티드 KL-D2 도메인일 수 있다. 추가의 실시태양에서, KL-D2 도메인은 서열 6 또는 서열 38의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
"신호 펩티드"는 본원에서 사용될 때, 소포체로의 단백질의 번역후 수송을 지시하는 펩티드 사슬 (3-60개 아미노산 길이)를 의미할 것이고 절단 제거될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 예시적인 신호 펩티드는 Klotho 신호 펩티드 (서열 19) 및 IgG 신호 펩티드 (서열 20)를 포함한다.
"링커"는 본원에서 사용될 때, 2개 이상의 폴리펩티드 또는 핵산을 서로 연결되도록 공유 부착시키는 관능기 (예를 들어, 화학물질 또는 폴리펩티드)를 의미할 것이다. 본원에서 사용될 때, "펩티드 링커"는 2개의 단백질을 함께 결합시키기 위해 (예를 들어, Klotho의 세포외 도메인 및 섬유모세포 성장 인자-23을 결합시키기 위해) 사용되는 하나 이상의 아미노산을 나타낸다. 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 펩티드 링커는 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17 및 서열 18로 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"작동가능하게 연결된"은 본원에서 사용될 때, 생체분자와 연관된 생물학적 기능, 활성, 및/또는 구조가 적어도 보유되도록 하는 2개 이상의 생체분자의 연결을 의미할 것이다. 폴리펩티드에 관하여, 상기 용어는 2개 이상의 폴리펩티드의 연결이 각각의 폴리펩티드 성분의 각각의 개별 활성의 적어도 일부를 보유하는 융합 폴리펩티드를 생성하는 것을 의미한다. 2개 이상의 폴리펩티드는 직접적으로 또는 링커를 통해 연결될 수 있다. 핵산에 관하여, 상기 용어는 제1 폴리뉴클레오티드가, 적절한 분자 (예를 들어, 전사 활성인자 단백질)가 제2 폴리뉴클레오티드에 결합할 때, 제1 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시하는 제2 폴리뉴클레오티드에 인접하여 위치하는 것을 의미한다.
"특이적으로 결합하다"는 본원에서 사용될 때, 자신과 다른 표적 분자 사이의 비공유 상호작용을 형성하는데 좋은 특정 구조를 채택하는 제1 분자의 능력 때문에 그가 노출될 수 있는 많은 상이한 종류의 분자 중에서 표적 분자에 결합하는 제1 분자의 능력을 나타낼 것이다. 제1 분자는 안정한 복합체를 형성하는 표적에 결합하는 반면, 임의의 다른 비-특이적 분자와 제1 분자의 인식, 접촉, 또는 복합체 형성은 실질적으로 더 적다.
"폴리펩티드 변이체" 또는 "단백질 변이체"는 본원에서 사용될 때, 하나 이상의 아미노산이 참조 서열과 상이한 아미노산으로 치환된 폴리펩티드를 나타낸다. 당업계에서는 이하 설명되는 바와 같이 일부 아미노산이 폴리펩티드의 활성의 성질을 변화시키지 않으면서 대략 유사한 특성을 갖는 다른 것으로 치환될 수 있음이 잘 이해된다 (보존적 치환). 이들 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 부가되거나 결실된, 또는 상이한 아미노산으로 교체된 폴리펩티드, 예를 들어, 단백질 이소형을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 섬유모세포 성장 인자-23의 예시적인 변이체는 섬유모세포 성장 인자-23 변이체 (R179Q)이다.
"제약 조성물"은 본원에서 사용될 때, 개체에서 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위해 투여될 수 있는 화합물 (예를 들어, 본 발명의 융합 폴리펩티드)을 함유하는 조성물을 의미할 것이다.
"개체" 또는 "대상"은 본원에서 사용될 때, 인간 또는 비-인간 포유동물, 예를 들어 소, 말, 개, 양, 또는 고양이를 포함하고 이로 포함되지 않은 포유동물을 나타낼 것이다.
"치료하다"는 본원에서 사용될 때, 질병의 발생 또는 진행을 감소, 억제, 약화, 축소, 중지 또는 안정화시키는 것을 의미할 것이다. 본 발명의 문맥에서, 본 발명의 폴리펩티드의 투여는 근감소증, 피부 위축, 근육 쇠약, 뇌 위축, 죽상경화증, 동맥경화증, 폐기종, 골다공증, 골관절염, 면역부전, 고혈압, 치매, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 백내장, 노화-관련 황반 변성, 전립선암, 뇌졸중, 기대 수명 감소, 기억 상실, 주름, 신장 기능 손상, 및 노화-관련 난청을 포함한 노화-관련 병태; 및 II형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈당증, 및 비만을 포함한 대사 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
"예방하다"는 본원에서 사용될 때, 대상에서 질환의 발생의 감소, 또는 질환 또는 그의 연관된 증상에 걸리는 위험의 감소를 나타낼 것이다. 본 발명의 문맥에서, 본 발명의 폴리펩티드의 투여는 근감소증, 피부 위축, 근육 쇠약, 뇌 위축, 죽상경화증, 동맥경화증, 폐기종, 골다공증, 골관절염, 면역부전, 고혈압, 치매, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 백내장, 노화-관련 황반 변성, 전립선암, 뇌졸중, 기대 수명 감소, 기억 상실, 주름, 신장 기능 손상, 및 노화-관련 난청을 포함한 노화-관련 병태; 및 II형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈당증, 및 비만을 포함한 대사 장애를 예방하기 위해 사용될 수 있다. 예방은 완전한, 예를 들어, 노화-관련 병태 또는 대사 장애의 완전 부재일 수 있다. 예방은 또한 부분적일 수 있어서, 대상에서 노화-관련 병태 또는 대사 장애의 발생 가능성이 본 발명이 실시되지 않은 대상에서 발생하는 것보다 아마도 더 작을 것이다.
"질병"은 본원에서 사용될 때, 세포, 조직, 또는 장기의 정상 기능을 손상시키거나 저해하는 임의의 상태 또는 질환을 의미할 것이다.
"노화-관련 병태"는 본원에서 사용될 때, 집단에서 그의 발생 또는 개체에서의 중증도가 노화의 진행과 상호관련되는 임의의 질병 또는 질환을 의미할 것이다. 한 실시태양에서, 노화-관련 병태는 60세 초과의 인간 개체들 사이에서 그의 발생이 30-40세의 인간 개체에 비해 및 100,000며 초과의 개체의 선택된 집단에서 적어도 1.5배 더 높은 질병 또는 질환이다. 본 발명에 관련한 노화-관련 병태는 근감소증, 피부 위축, 근육 쇠약, 뇌 위축, 죽상경화증, 동맥경화증, 폐기종, 골다공증, 골관절염, 면역부전, 고혈압, 치매, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 백내장, 노화-관련 황반 변성, 전립선암, 뇌졸중, 기대 수명 감소, 기억 상실, 주름, 신장 기능 손상, 및 노화-관련 난청을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"대사 장애"는 본원에서 사용될 때, 세포에서 에너지의 생산 또는 세포, 조직, 장기, 또는 개체에서 독소의 축적에 영향을 미침으로써 세포, 조직, 또는 장기에서 정상 기능을 손상시키거나 저해하는 임의의 질병 또는 질환을 의미할 것이다. 본 발명에 관련한 대사 장애는 II형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈당증, 및 비만을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"유효 용량" 또는 "유효량"은 유익하거나 목적하는 임상 결과를 가져오기에 충분한 양이다. 본 발명의 문맥에서, 이는 의도된 약물학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하기 위해 효과적인 Klotho 융합 폴리펩티드 또는 sKlotho의 양이다. 치료 유효 용량은 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상 (예를 들어, 노화-관련 병태 또는 대사 장애)의 예방 또는 개선을 일으킨다. 치료 유효 용량은 치료되는 대상 및 질병 상태, 대상의 체중 및 연령, 질병 상태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 변할 것이고, 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
"Klotho 핵산 분자"는 본원에서 사용될 때 Klotho 단백질을 코딩하는 유전자이다. 예시적인 인간 Klotho 유전자는 GenBank 기탁 번호 NM_004795 (서열 1)로 제공된다.
"단편"은 본원에서 사용될 때, 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 일부를 나타낸다. 상기 일부는 바람직하게는 참조 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상을 함유한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 또는 3000개 이하의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.
용어 "실질적으로 동일한"은 참조 아미노산 서열 (예를 들어, 본원에서 설명되는 아미노산 서열 중 임의의 하나) 또는 핵산 서열 (예를 들어, 본원에서 설명되는 핵산 서열 중 임의의 하나)에 적어도 50%의 동일성을 보이는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 나타낸다. 바람직하게는, 그러한 서열은 비교를 위해 사용된 서열에 대해 아미노산 수준 또는 핵산에서 적어도 60%, 70%, 75%, 80% 또는 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하다.
본 발명은 노화-관련 병태 및 대사 장애를 예방 또는 치료하기 위한 방법, 키트 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인을 갖는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시태양에서, 융합 폴리펩티드는 섬유모세포 성장 인자 또는 그의 활성 단편을 추가로 포함한다. Klotho 세포외 도메인은 알파 또는 베타 Klotho 이소형으로부터 유래될 수 있다. 추가로, Klotho 융합 폴리펩티드의 FGF 성분은 주로 섬유모세포 성장 인자-19, 섬유모세포 성장 인자-21 및 섬유모세포 성장 인자-23을 참조로 하여 설명되지만, 임의의 23개의 공지의 FGF 또는 그의 활성 단편이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
Klotho 단백질의 세포외 도메인은 Klotho 단백질의 KL-D1 및 KL-D2 도메인 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, Klotho 융합 폴리펩티드는 Klotho 단백질의 적어도 2개의 세포외 하위도메인을 갖는다. 예를 들어, 2개의 세포외 하위도메인은 직렬 반복되는 2개의 KL-D1 도메인, 직렬 반복되는 2개의 KL-D2 도메인, 또는 하나의 KL-D1 도메인과 하나의 KL-D2 도메인일 수 있다.
Klotho 단백질의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자 (또는 그의 활성 단편)는 다양한 배향 및 방식으로 서로 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, Klotho 단백질의 세포외 하위도메인은 섬유모세포 성장 인자의 N-말단에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 별법으로 섬유모세포 성장 인자는 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인의 N-말단에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 발명의 융합 폴리펩티드는 Klotho 세포외 도메인, 즉, KL-D1 (서열 5) 및 KL-D2 (서열 6) 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. KL-D1 및 KL-D2는 각각 전장 알파 Klotho 폴리펩티드 (서열 2)의 아미노산 잔기 58-506 및 517-953에, 및 전장 베타 Klotho 폴리펩티드 (서열 4)의 아미노산 잔기 77-508 및 571-967에 상응하고, 본 발명에서 사용하기 위해 적합하다. Klotho 융합 폴리펩티드는 서열 5의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 알파 Klotho 폴리펩티드의, 또는 서열 37의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 베타 Klotho 폴리펩티드의 KL-D1 도메인을 가질 수 있다. 구체적으로, Klotho 융합 폴리펩티드는 서열 5 또는 서열 37에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. Klotho 융합 폴리펩티드는 서열 6의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 알파 Klotho 폴리펩티드의, 또는 서열 38의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 베타 Klotho 폴리펩티드의 KL-D2 도메인을 가질 수 있다. 구체적으로, Klotho 융합 폴리펩티드는 각각 서열 6 또는 서열 38에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 가용성이고, FGF 수용체에 결합할 수 있다.
본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 폴리펩티드를 연결시키는 폴리펩티드 링커를 함유할 수 있다. 적합한 링커는 당업계에 잘 공지되어 있고, 일반적으로 몇몇 Gly 및 몇몇 Ser 잔기, 예를 들어, (Gly4 Ser)3 (서열 11), Gly4 Ser 폴리펩티드 (서열 12), Gly (서열 13), Gly Gly (서열 14), Gly Ser (서열 15), Gly2 Ser (서열 16), Ala (서열 17), 및 Ala Ala (서열 18)를 함유한다. 일부 실시태양에서, 링커는 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 또는 서열 18 중 임의의 하나에 의해 제시된 아미노산 서열의 적어도 2개 내지 약 30개 이하의 반복체를 가질 것이다.
폴리펩티드 링커가 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드 내에 존재하는 경우에, Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인을 갖는 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 링커 폴리펩티드의 N-말단에 연결될 수 있고, 여기서 FGF는 펩티드 결합에 의해 폴리펩티드 링커의 C-말단에 연결된다. 별법으로, FGF는 펩티드 결합에 의해 링커 폴리펩티드의 N-말단에 연결될 수 있고, 여기서 Klotho의 적어도 하나의 세포외 하위도메인을 갖는 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 폴리펩티드 링커의 C-말단에 연결된다. 화학적 링커가 또한 2개의 폴리펩티드를 연결하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함할 수 있다. Klotho 융합 폴리펩티드에 사용하기 위한 예시적인 신호 펩티드는 Klotho 신호 펩티드 (서열 8) 및 IgG 신호 펩티드 (서열 9)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
4.1. Klotho 및 섬유모세포 성장 인자 폴리펩티드
본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 성질상 FGF에 상당하는 생물학적 활성, 예를 들어 FGF 수용체에 결합하고, FGF 수용체, FRS2 (FGF 수용체 기질 2) 및 ERK1/2 (세포외 신호-조절된 단백질 키나제 1/2)의 인산화를 유도하고, Egr-1 (초기 성장 반응-1) 유전자를 활성화시킬 것으로 예상된다. FGF는 FGF 수용체에 결합하는 분비된 펩티드 성장 인자이다. FGF의 아미노산 및 핵산 서열은 당업자에게 쉽게 이용가능하다. 예를 들어, FGF19, FGF21, 및 FGF23에 대한 예시적인 뉴클레오티드 서열은 GenBank 데이타베이스에서 각각 기탁 번호 NM_005117, NM_019113, 및 NM_020638로, 및 본원에서 각각 서열 30, 32, 및 34로 찾을 수 있다. FGF19, FGF21, 및 FGF23에 대한 예시적인 아미노산 서열은 GenBank 데이타베이스에서 각각 기탁 번호 NP_005108, NP_061986, 및 NP_065689로, 및 본원에서 각각 서열 31, 35, 및 35로 찾을 수 있다. 추가로, FGF는 단백질의 발현을 돕는 하나 이상의 변경, 예를 들어, FGF23 (R179Q) 변이체 (서열 36)를 포함할 수 있다.
Klotho 단백질은 세포외 도메인 및 짧은 세포질 도메인을 갖는 130 kDa의 단일 통과형 I 막횡단 단백질이다. Klotho의 아미노산 및 핵산 서열은 당업자에게 쉽게 이용가능하다. 예를 들어, 알파-Klotho 및 베타-Klotho에 대한 예시적인 뉴클레오티드 서열은 GenBank 데이타베이스에서 각각 기탁 번호 NM_004795 및 NM_175737로, 및 본원에서 각각 서열 7 및 8로 찾을 수 있다. 알파-Klotho 및 베타-Klotho에 대한 예시적인 아미노산 서열은 GenBank 데이타베이스에서 각각 기탁 번호 NP_004786 및 NP_783864로, 및 본원에서 각각 서열 2 및 4로 찾을 수 있다.
본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 섬유모세포 성장 인자 수용체에 결합할 수 있고, 섬유모세포 성장 인자-19 (서열 31), 섬유모세포 성장 인자-21 (서열 33), 섬유모세포 성장 인자-23 (서열 35), 또는 그의 변이체 (섬유모세포 성장 인자-23 변이체 (R179Q) (서열 36) 포함)에 작동가능하게 연결된 알파-Klotho 또는 베타-Klotho 세포외 도메인을 갖는다.
구체적으로, 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 섬유모세포 성장 인자-23 (서열 35) 또는 섬유모세포 성장 인자-23 변이체 (R179Q) (서열 36)에 작동가능하게 결합된 알파-Klotho (서열 2)를 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 섬유모세포 성장 인자-19 (서열 31)에 작동가능하게 결합된 베타-Klotho (서열 4)를 가질 수 있다. 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 섬유모세포 성장 인자-21 (서열 33)에 작동가능하게 결합된 베타-Klotho (서열 4)를 포함할 수 있다.
본 발명은 다양한 Klotho 및 FGF 유전자, 및 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 상동체를 포함한다. 유전자에 관련하여 "상동체"는 뉴클레오티드 서열이 그가 상동체인 유전자에 의해 코딩되는 단백질과 실질적으로 동일한 활성/기능을 갖는 단백질을 코딩한다면, 유전자의 적어도 일부에 걸쳐 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보성 가닥 또는 그의 일부를 나타낸다. 본원에서 설명되는 유전자의 상동체는 추정 상동체에 대한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열, 및 유전자 또는 이들에 의해 코딩되는 단백질에 대한 서열 (예를 들어, Klotho 및 FGF를 코딩하는 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열 또는 그들의 상보성 가닥) 사이의 동일성 백분율에 의해 확인할 수 있다. 동일성 백분율은 예를 들어, 시각적 검사에 의해 또는 당업계에 공지되거나 본원에 설명되는 다양한 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 결정할 수 있다. 서열 동일성은 대개 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, 제네틱스 컴퓨터 그룹, 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 미국 53705 위스콘신주 매디슨 1710 유니버시티 애비뉴)의 서열 분석 소프트웨어 패키지, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 측정된다. 그러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 및/또는 다른 변형에 대해 상동성의 정도를 부여함으로써 동일하거나 유사한 서열을 매칭시킨다. 보존적 치환은 대개 다음 그룹 내에서의 치환을 포함한다: 글라이신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성 정도를 결정하는 예시적인 방법에서, BLAST 프로그램이 사용될 수 있고, 여기서 e-3 내지 e-100의 확률 점수 (probability score)가 밀접하게 관련된 서열을 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 용어 "상동성" 및 "상동성인"은 이론적인 공통 유전적 조상을 갖는 단백질을 지정하도록 제한되지 않고, 대신에 유전학상 비관련될 수 있고, 그럼에도 불구하고 유사한 기능을 수행하고/하거나 유사한 구조를 갖도록 진화된 단백질을 포함한다. 본원에서 설명되는 다양한 단백질에 대한 기능적 상동성은 또한 그가 상동체인 상응하는 단백질의 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 기능적 상동성을 갖는 단백질에 대해, 그들의 아미노산 서열에서 유의한 동일성을 갖는 것이 요구되지 않고, 대신에, 기능적 상동성을 갖는 단백질이 유사하거나 동일한 활성을 갖는 것으로 정의된다. 예를 들어, Klotho 분자에 관하여, 폴리펩티드는 FGF 폴리펩티드에 결합하고 FGFR에 대한 FGF의 결합을 가능하게 하는 기능적 특징을 가져야 한다. FGF 분자에 관하여, 폴리펩티드는 FGFR에 결합하고 FGFR의 활성화 (예를 들어, 인산화)를 일으키는 기능적 특징을 가져야 한다. FGF 수용체에 대한 FGF 결합 및/또는 FGF 신호전달 경로의 활성화를 평가하기 위한 분석은 당업계에 공지되어 있고 본원에 설명되어 있다 (실시예 2 참조). Klotho 활성을 평가하기 위한 분석은 또한 당업계에 잘 공지되어 있고 본원에서 설명된다 (예를 들어, FGF 폴리펩티드에 대한 결합). 구조적 상동성을 갖는 단백질은 유사한 3차 (또는 4차) 구조를 갖는 것으로서 규정되고, 반드시 이들을 코딩하는 유전자에 대한 아미노산 동일성 또는 핵산 동일성을 요구하지는 않는다. 특정 상황에서, 구조적 상동체는 단백질의 활성 부위 또는 결합 부위에서만 구조적 상동성을 유지하는 단백질을 포함할 수 있다.
구조적 및 기능적 상동성에 추가로, 본 발명은 본원에서 설명되는 다양한 Klotho 및 FGF 아미노산 서열에 대해 아미노산 동일성을 갖는 단백질을 추가로 포함한다. 2개의 아미노산 서열의 동일성/상동성 백분율을 결정하기 위해, 서열을 최적 비교 목적을 위해 정렬시킨다 (예를 들어, 다른 단백질의 아미노산 서열과의 최적 정렬을 위해 하나의 단백질의 아미노산 서열 내에 갭 (gap)을 도입할 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 잔기들을 비교한다. 하나의 서열 내의 위치가 다른 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기로 점령되면, 분자들을 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 동일성 백분율은 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, 동일성 % = (동일한 위치의 #/위치의 총 #) X 100).
본원에서 설명되는 본 발명의 분자의 아미노산 서열은 본원에서 설명되는 아미노산 서열에 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나 상동성인 아미노산 서열을 갖는다.
본원에서 설명되는 본 발명의 분자의 핵산 서열은 본원에서 설명되는 뉴클레오티드 서열에 혼성화하거나, 그에 대해 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나 상동성인 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
본 발명의 융합 폴리펩티드에서 사용하기 위해 적절한 핵산 분자는 엄격한 조건 하에 각각 Klotho 또는 FGF를 코딩하는 핵산 분자의 상보체에 혼성화하는 Klotho 또는 FGF 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 "엄격한 조건 하에 혼성화하다"는, 서로 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90% 이상 상동성인 뉴클레오티드 서열이 대개 서로 혼성화된 상태로 유지되는 혼성화 및 세척을 위한 조건을 설명하는 것으로 의도된다. 그러한 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있고, 문헌 [Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (2001), 6.3.1-6.3.6]에서 찾을 수 있다. 엄격한 혼성화 조건의 비제한적인 특정 예는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) 내에서의 혼성화, 이어서 50-65℃에서 0.2 X SSC, 0.1% SDS 내에서 1회 이상의 세척이다.
4.2. 본 발명의 Klotho - FGF 융합 폴리펩티드
본 발명의 일부 실시태양에서, Klotho 융합 폴리펩티드는 Klotho 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편의 제1 폴리펩티드 서열, 및 FGF 또는 그의 활성 단편의 제2 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드 사슬을 갖는다.
본 발명은 서열 19-28에 제시된 아미노산 서열에 적어도 약 95% 이상 상동성인 융합 폴리펩티드를 포함한다. 서열 19의 아미노산 서열은 FGF23 (R179Q) 변이체 (서열 36)에 N-말단 연결된 Klotho 세포외 도메인을 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 서열 20의 아미노산 서열은 FGF23 (R179Q) 변이체에 N-말단 연결된 신호 펩티드가 결핍되는 Klotho 세포외 도메인에 N-말단 연결된 IgG 신호 펩티드를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 서열 21의 아미노산 서열은 FGF23 (R179Q) 변이체에 N-말단 연결된 KL-D1 세포외 하위도메인을 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 서열 22의 아미노산 서열은 FGF23 (R179Q) 변이체에 N-말단 연결된 KL-D2 세포외 하위도메인을 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 서열 23의 아미노산 서열은 FGF23 (R179Q) 변이체에 N-말단 연결된 2개의 KL-D1 세포외 하위도메인을 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 서열 24의 아미노산 서열은 FGF23 (R179Q) 변이체에 N-말단 연결된 2개의 KL-D2 세포외 하위도메인을 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 서열 25의 아미노산 서열은 Klotho 세포외 도메인에 N-말단 연결된 FGF23 (R179Q) 변이체를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 서열 26의 아미노산 서열은 KL-D1 세포외 하위도메인에 N-말단 연결된 FGF23 (R179Q) 변이체를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 서열 27의 아미노산 서열은 KL-D2 세포외 하위도메인에 N-말단 연결된 FGF23 (R179Q) 변이체를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 서열 28의 아미노산 서열은 2개의 KL-D1 세포외 하위도메인에 N-말단 연결된 FGF23 (R179Q) 변이체를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 서열 29의 아미노산 서열은 2개의 KL-D2 세포외 하위도메인에 N-말단 연결된 FGF23 (R179Q) 변이체를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 서열 7에 제시된 아미노산 서열에 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 서열 7의 아미노산 서열은 신호 펩티드가 결핍되는 Klotho 세포외 도메인을 코딩한다.
본 발명의 융합 단백질은 본원에서 설명되고, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 미국 특허 6,194,177에 설명된 바와 같이 구성될 수 있다. Klotho 폴리펩티드의 용도는 미국 특허 6,579,850에 설명되어 있다. FGF 핵산 분자의 용도는 미국 특허 7,223,563에 설명되어 있다.
일부 실시태양에서, Klotho를 코딩하는 핵산 분자를 PCR에 의해 클로닝하고, FGF를 코딩하는 핵산 분자와 인 프레임으로 라이게이팅시킨다. Klotho-FGF 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 발현을 허용하도록 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 후속적으로 발현을 위해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 최종 구성체의 서열은 서열 결정에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 제조할 때, Klotho의 세포외 하위도메인을 코딩하는 핵산 분자는 FGF를 코딩하는 핵산 분자에 인 프레임으로 융합될 것이다. 생성되는 핵산 분자의 발현은 FGF 폴리펩티드에 대해 N-말단에 융합되는 Klotho의 세포외 하위도메인을 생성시킨다. Klotho의 세포외 하위도메인이 FGF 폴리펩티드에 대해 C-말단에 융합되는 융합도 가능하다. 융합 단백질을 제조하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 융합 폴리펩티드는 공유 연결되는 적어도 2개의 폴리펩티드를 갖고, 여기서 하나의 폴리펩티드는 하나의 단백질 서열 또는 도메인, 예를 들어, Klotho로부터 유래하고, 다른 폴리펩티드는 또다른 단백질 서열 또는 도메인, 예를 들어 FGF로부터 유래한다. 본 발명의 융합 폴리펩티드의 Klotho 및 FGF는 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 연결될 수 있다. 이들 방법은 화학적 및 재조합 수단을 모두 포함한다.
본 발명의 융합 폴리펩티드 내로 포함되는 도메인을 코딩하는 핵산은 재조합 유전학 분야에서 일상적인 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 본 발명에서 유용한 일반적인 방법을 개시하는 기본적인 문서는 문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994-1999)]을 포함한다. 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에서, 각각 서열 1 및 서열 3에 의해 제시된, 알파-Klotho 또는 베타-Klotho를 코딩하는 핵산 서열을 사용할 수 있다. Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에서, 각각 서열 30, 서열 32 및 서열 34에 의해 제시된, FGF19, FGF21, 또는 FGF23을 코딩하는 핵산 서열을 사용할 수 있다. 본원에서 설명되는 본 발명의 분자의 핵산 서열은 서열 1, 서열 3, 서열 30, 서열 32, 또는 서열 34에 혼성화하거나 그에 대해 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Klotho 및 FGF 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 임의의 다양한 방법을 이용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 프로브를 사용한 혼성화에 의해 cDNA 및 게놈 DNA 라이브러리로부터 클로닝하거나, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 증폭 기술을 이용하여 단리할 수 있다. 보다 일반적으로, DNA 또는 RNA 주형을 사용하여 Klotho 및 FGF 서열을 증폭하고 단리하기 위해 증폭 기술을 이용한다 (예를 들어, [Dieffenfach & Dveksler, PCR Primers: A Laboratory Manual (1995)] 참조). 별법으로, 겹치는 올리고뉴클레오티드는 합성 방식으로 생산하고 하나 이상의 도메인을 생산하도록 연결시킬 수 있다. Klotho 또는 FGF를 코딩하는 핵산은 또한 프로브로서 항체를 사용하여 발현 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본 발명에 따라, Klotho 및 FGF는 직접적으로 또는 공유 링커, 예를 들어 아미노산 링커, 예를 들어 폴리글라이신 링커, 또는 다른 종류의 화학적 링커, 예를 들어 탄수화물 링커, 지질 링커, 지방산 링커, 폴리에테르 링커, 예를 들어 PEG 등을 통해 연결될 수 있다 (예를 들어, [Hermanson, Bioconjugate techniques (1996)] 참조). 융합체/융합 폴리펩티드를 형성하는 폴리펩티드는 대개 C-말단 대 N-말단 연결되지만, 이들은 또한 C-말단 대 C-말단, N-말단 대 N-말단, 또는 N-말단 대 C-말단 연결될 수 있다. 하나 이상의 폴리펩티드 도메인이 본 발명의 융합 폴리펩티드 내의 내부 위치에 삽입될 수 있다. 융합 단백질의 폴리펩티드는 임의의 순서일 수 있다. 융합 폴리펩티드는 융합 단백질을 연속하여 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조함으로써, 하나의 단백질 서열, 예를 들어, Klotho의 세포외 하위도메인으로부터의 아미노산의 사슬을 또다른 단백질 서열, 예를 들어 FGF로부터의 아미노산의 사슬에 공유 연결함으로써 생산할 수 있다. 융합 단백질 내의 아미노산의 상이한 사슬들은 함께 직접 스플라이싱되거나, 화학적 연결기 또는 아미노산 연결기를 통해 함께 간접적으로 스플라이싱될 수 있다. 아미노산 연결기의 길이는 약 200개 이상의 아미노산, 또는 일반적으로 1 내지 100개의 아미노산일 수 있다. 일부 실시태양에서, 링커에 의한 유의한 2차 구조 요소의 형성을 방지하기 위해 프롤린 잔기가 링커 내로 포함된다. 링커는 종종 재조합 융합 단백질의 일부로서 합성되는 가요성 아미노산 하위서열일 수 있다. 그러한 가요성 링커는 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따라, Klotho 또는 그의 단편의 세포외 하위도메인의 아미노산 서열은 펩티드 링커를 통해 FGF에 연결될 수 있다. 예시적인 펩티드 링커는 당업계에 잘 공지되어 있고 본원에서 설명된다. 예를 들어, 펩티드 링커는 일반적으로 몇몇 Gly 및 몇몇 Ser 잔기, 예를 들어 (Gly4 Ser)3 (서열 11), Gly4 Ser 폴리펩티드 (서열 12), Gly (서열 13), Gly Gly (서열 14), Gly Ser (서열 15), Gly2 Ser (서열 16), Ala (서열 17), 및 Ala Ala (서열 18)을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 융합 단백질에 사용하기 위한 펩티드 링커는 가요성 힌지로서 작용할 수 있다.
Klotho 또는 FGF의 신호 서열은 Klotho가 본 발명의 융합 단백질 내로 통합되기 전에 제거될 수 있다. 융합 단백질의 Klotho 또는 FGF에 대한 신호 서열, 예를 들어 서열 19로 제시되는 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 그러나, 그러한 서열은 또한 제거되거나, 상이한 단백질의 신호 서열, 예를 들어, IgG 신호 서열 (서열 9)로 교체될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 제약 조성물은 Klotho 및 FGF의 성숙 형태를 함유할 것이다.
일반적으로, 인트론은 융합 폴리펩티드 내로 통합되기 전에 Klotho 또는 FGF 모이어티 중 하나 또는 둘 모두로부터 제거된다.
본 발명의 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 반응성 아미노산 측쇄에 공유 부착된 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 그러한 중합체는 하나 이상의 유리 시스테인 술프히드릴 잔기에 부착되어 단백질이 산화 조건에 노출될 때 디술피드 결합의 형성 및 응집을 차단할 수 있는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 폴리펩티드의 PEG화는 증가된 반감기, 용해도, 및 프로테아제 내성과 같은 개선된 특성을 제공하는 것으로 기대된다. 본 발명의 융합 폴리펩티드는 별법으로 유리 아미노기, 예를 들어 라이신 엡실론 또는 N-말단 아미노기에 중합체의 공유 첨가에 의해 변형될 수 있다. 공유 변형을 위한 바람직한 시스테인 및 라이신은 수용체 결합, 헤파린 결합, 또는 적합한 단백질 폴딩 (folding)에 관여하지 않는 것일 것이다. 특정 아미노산 잔기의 변형이 목적하는 단백질의 활성에 영향을 미치는지 결정하기 위해, 융합 폴리펩티드의 생화학적 및/또는 생물학적 활성을 분석하기 위한 방법이 사용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 유사한 적합한 변형이 고려되고 당업계에 공지되어 있다.
본 발명은 또한 서열 19-28에 제시된 아미노산 서열에 적어도 약 95% 이상 상동성인 융합 폴리펩티드의 발현에 관한 것이다.
4.3. 본 발명의 융합 폴리펩티드의 발현
본 발명의 융합 단백질을 발현하기 위해, 본원에서 설명되거나 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 얻은 DNA 분자를 당업계에 잘 공지된 기술에 의해 적절한 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥 cDNA는 동종중합체 테일링 (homopolymeric tailing)에 의해 또는 합성 DNA 링커의 사용을 포함하는 제한 효소 연결에 의해 또는 블런트 단부 (blunt-ended) 라이게이션에 의해 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있다. DNA 리가제는 대체로 DNA 분자를 라이게이팅하기 위해 사용되고, 바람직하지 않은 연결은 알칼리성 포스파타제를 사용한 처리에 의해 방지될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본원에서 설명되는 바와 같이 핵산 분자 (예를 들어, 유전자 또는 재조합 핵산 분자를 코딩하는 유전자)를 포함하는 벡터 (예를 들어, 재조합 플라스미드 및 박테리오파지)를 포함한다. 용어 "재조합 벡터"는 그로부터 재조합 벡터가 유래된 천연 또는 자연 핵산 분자 내에 포함된 것보다 더 많거나, 더 적거나, 그와 상이한 핵산 서열을 함유하도록 변경, 변형 또는 조작된 벡터 (예를 들어, 플라스미드, 파지, 파스미드, 바이러스, 코스미드 (cosmid), 포스미드 (fosmid), 또는 다른 정제된 핵산 벡터)를 포함한다. 예를 들어, 재조합 벡터는 본원에 규정된 바와 같이 조절 서열, 예를 들어, 프로모터 서열, 종결자 서열 및/또는 인공 리보좀 결합 부위 (RBS)에 작동가능하게 연결된 Klotho-FGF23 융합체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 그 내부에 포함된 유전자 또는 핵산의 발현을 허용하는 재조합 벡터를 "발현 벡터"로서 칭한다.
진핵생물 숙주에 대해, 숙주의 성질에 따라 상이한 전사 및 번역 조절 서열을 사용할 수 있다. 이들은 바이러스 공급원, 예를 들어 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 원숭이 바이러스 등으로부터 유래될 수 있고, 여기서 조절 신호는 높은 수준의 발현을 갖는 특정 유전자와 연관된다. 그 예는 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터, SV40 조기 프로모터, 효모 gal4 유전자 프로모터 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 유전자의 발현이 조정될 수 있도록 억제 또는 활성화를 허용하는 전사 개시 조절 신호가 선택될 수 있다.
본원에서 설명되는 본 발명의 분자의 일부에서, 융합 폴리펩티드의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 DNA 분자는 요구되는 DNA 분자를 숙주 세포 내로 통합시킬 수 있는 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 도입된 DNA에 의해 안정하게 형질전환된 세포는 예를 들어, 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 발현시킬 핵산 서열에 직접 연결되거나, 동시-형질감염에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에서 설명되는 단백질의 최적 합성을 위해 추가의 요소가 또한 필요할 수 있다. 어떠한 추가의 요소가 사용되는지는 당업자에게 명백할 것이다.
특정 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 선택하는데 있어서 중요한 요소는 벡터를 함유하는 수여체 세포를 인식하고 벡터를 함유하지 않는 수여체 세포로부터의 선택의 용이함; 특정 숙주에서 바람직한 벡터의 카피 수; 및 상이한 종의 숙주 세포들 사이에서 숙주를 "셔틀링(shuttling)할" 수 있는 것이 바람직한지의 여부를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
벡터(들)이 발현을 위한 DNA 서열을 포함하도록 구성되면, 예를 들어, 형질전환, 형질감염, 컨쥬게이션, 원형질체 융합, 전기천공, 인산칼슘 침전, 직접 마이크로주사 등을 포함하고 이로 제한되지 않는, 당업계에 공지된 하나 이상의 다양한 적합한 방법에 의해 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 진핵생물 숙주 세포의 예는 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어 인간, 원숭이, 마우스, 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함한다. 그러한 세포는 단백질의 번역후 변형, 예를 들어, 정확한 폴딩 또는 글리코실화를 용이하게 한다. 추가로, 본 발명의 융합 폴리펩티드를 발현시키기 위해 효모 세포가 또한 사용될 수 있다. 대부분의 포유동물 세포처럼, 효모 세포는 또한 단백질의 번역후 변형, 예를 들어, 글리코실화를 가능하게 한다. 효모에서 단백질의 생산을 위해 이용될 수 있는 강한 프로모터 서열 및 고카피수 플라스미드를 이용하는 많은 재조합 DNA 전략이 존재한다. 효모 전사 및 번역 기구는 클로닝된 포유동물 유전자 생성물 상의 리더 서열을 인식하여, 리더 서열을 보유하는 펩티드 (즉, 프리-펩티드)의 분비를 가능하게 할 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드의 고수율 생산의 특히 바람직한 방법은 미국 특허 4,889,803에 설명된 바와 같이 연속적으로 증가하는 수준의 메토트렉세이트의 사용에 의해 DHFR-결핍 CHO 세포에서 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 증폭의 사용을 통한 것이다. 얻어진 폴리펩티드는 글리코실화된 형태로 존재할 수 있다.
하나 이상의 벡터(들)의 도입 후에, 숙주 세포는 대체로 벡터-함유 세포의 성장을 위해 선택하는 선택 배지 내에서 성장된다. 재조합 단백질의 정제는 당업계에 공지되거나 본원에서 설명되는 임의의 방법, 예를 들어, 추출, 침전, 크로마토그래피 및 전기영동을 포함한 임의의 통상적인 절차에 의해 수행할 수 있다. 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있는 추가의 정제 절차는 표적 단백질에 결합하는 모노클로날 항체를 사용하는 친화도 크로마토그래피이다. 일반적으로, 재조합 단백질을 함유하는 조질 제제를 적합한 모노클로날 항체가 고정된 컬럼을 통해 통과시킨다. 단백질은 대체로 특이적 항체를 통해 컬럼에 결합하지만, 불순물은 통과한다. 컬럼을 세척한 후에, 예를 들어 pH 또는 이온 강도를 변화시킴으로써 단백질을 겔로부터 용출시킨다.
4.4. 융합 폴리펩티드 활성을 평가하기 위한 분석
본원에서 설명되는 분석 (실시예 2 참조) 및 당업계에 공지된 것이 본 발명의 융합 폴리펩티드의 Klotho 또는 FGF 활성을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 활성 분석은 수용체 결합 분석, 세포 증식 분석 및 세포 신호전달 분석을 포함한다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드가 Klotho 또는 FGF 활성을 갖는지 결정하기 위해 사용할 수 있는 결합 분석은 FGF 수용체에 대한 융합 폴리펩티드의 결합의 분석을 포함한다. FGF 수용체 결합 분석은 경쟁적 및 비-경쟁적 분석을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, FGF 수용체 결합은 FGF 수용체를 발현하는 세포를 표지된 FGF (예를 들어, 방사성 표지) 및 증가하는 농도의 비표지된 Klotho-FGF 융합 폴리펩티드와 접촉시킴으로써 검출할 수 있다. 동일한 수용체에 대한 결합을 위해 경쟁하는 2개의 리간드가 세포를 함유하는 반응 혼합물에 첨가된다. 세포를 후속적으로 세척하고, 표지된 FGF를 측정한다. 비표지된 융합 폴리펩티드의 존재 하에 그의 수용체에 대한 표지된 FGF의 양의 감소는 수용체에 대한 Klotho-FGF 융합 폴리펩티드의 결합을 표시한다. 별법으로, Klotho-FGF 융합 폴리펩티드가 표지될 수 있고, 세포에 대한 융합 폴리펩티드의 직접 결합이 검출된다.
Klotho 또는 FGF 활성은 또한 융합 폴리펩티드가 세포 반응을 유도하는지 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, Klotho-FGF 융합 폴리펩티드의 생물학적 활성을 검출하기 위한 분석은 FGF 수용체를 발현하는 세포를 융합 폴리펩티드와 접촉시키고, 세포 반응, 예를 들어 세포 증식 또는 Egr-1 활성화, C2C12 세포에서 근관 직경을 분석하고, 융합 폴리펩티드의 존재 및 부재 하에 세포 반응을 비교하는 것을 포함한다. 융합 폴리펩티드 복합체의 부재 하에서에 비해 융합 폴리펩티드 복합체의 존재 하에서의 세포 반응의 증가는 융합 폴리펩티드가 생물학적 활성을 가짐을 표시한다. 또한, 생물학적 활성의 표시자로서 수용체로부터 하류 신호전달 사건의 증가를 또한 측정할 수 있다 (예를 들어, FGFR, FRS2, ERK1/2, p70S6K 등의 인산화).
4.5 제약 조성물 및 치료 방법
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 융합 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 희석제 또는 담체를 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다. 제약 조성물은 제약상 유효 용량의 헤파린을 추가로 포함할 수 있다. 상기 제약 조성물은 키트 또는 용기 내에 포함될 수 있다. 그러한 키트 또는 용기에는 융합 폴리펩티드의 연장된 생체내 반감기 또는 시험관내 저장 수명에 관련한 지시서가 포장될 수 있다. 약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 지시된 형태의 경고문이 그러한 키트 또는 용기(들)에 임의로 부속될 수 있고, 상기 경고문은 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 정부 기관의 승인을 반영한다. 그러한 조성물은 환자에게 제약 조성물을 투여함으로써 환자, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에서 질병 또는 질병 증상 (예를 들어, 노화-관련 병태 또는 대사 장애)을 치료, 예방 또는 개선하는 방법에서 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 제약 조성물의 치료 유효량은 약 0.0001 mg/kg 내지 0.001 mg/kg; 0.001 mg/kg 내지 약 10 mg/kg (체중) 또는 약 0.02 mg/kg 내지 약 5 mg/kg (체중)이다. 일반적으로, 융합 폴리펩티드의 치료 유효량은 예를 들어 약 0.001 mg 내지 약 0.01 mg, 약 0.01 mg 내지 약 100 mg, 또는 약 100 mg 내지 약 1000 mg이다. 바람직하게는, 융합 폴리펩티드의 치료 유효량은 약 0.001 mg/kg 내지 2 mg/kg이다.
융합 폴리펩티드에 대한 최적 제약 제형은 투여 경로 및 목적하는 투여량에 따라 당업자가 결정할 수 있다 (예를 들어, 그 전문을 본원에 참조로 포함시킨 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa.] 참조).
본 발명의 융합 폴리펩티드는 고체, 액체 또는 기체 (에어로졸) 형태일 수 있는 제약 조성물로서 투여될 수 있다. 전형적인 투여 경로는 비제한적으로 경구, 국소, 비경구, 설하, 직장, 질내, 피부내 및 비강내를 포함할 수 있다. 비경구 투여는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 복강내, 흉강내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 바람직하게는, 조성물은 비경구로 투여된다. 보다 바람직하게는, 조성물은 정맥내 투여된다. 본 발명의 제약 조성물은 대상에 조성물의 투여 시에 본 발명의 폴리펩티드가 생체이용가능하도록 제형화될 수 있다. 조성물은 하나 이상의 투여 단위 형태를 취할 수 있고, 여기서 예를 들어, 정제는 단일 투여 단위일 수 있고, 에어로졸 형태의 본 발명의 폴리펩티드의 용기는 복수의 투여 단위를 보유할 수 있다.
제약 조성물을 제조하는데 사용되는 물질은 사용된 양에서 비-독성일 수 있다. 제약 조성물 내의 활성 성분(들)의 최적 투약은 다양한 인자에 따라 좌우될 것임이 당업자에게 명백할 것이다. 관련 인자는 비제한적으로 대상의 종류 (예를 들어, 인간), 대상의 전반적인 건강, 노화-관련 병태 또는 대사 장애의 종류, 치료를 필요로 하는 대상, 다제-약물 요법의 일부로서 조성물의 사용, 본 발명의 폴리펩티드의 특정 형태, 투여 방식, 사용된 조성물을 포함한다.
제약상 허용되는 담체 또는 비히클은 입자형일 수 있어서, 조성물은 예를 들어 정제 또는 분말 형태이다. 담체(들)은 액체일 수 있고, 여기서 조성물은 예를 들어, 경구 시럽 또는 주사가능 액체이다. 또한, 담체(들)은 예를 들어 흡입 투여에 유용한 에어로졸 조성물을 제공하도록 기체상일 수 있다.
용어 "담체"는 본 발명의 폴리펩티드가 그와 함께 투여되는 희석제, 어쥬번트 또는 부형제를 나타낸다. 그러한 제약상 담체는 액체, 예를 들어 물 및 오일, 예를 들어 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예를 들어 땅콩기름, 콩기름, 광물유, 참기름 등일 수 있다. 담체는 염수, 아카시아 검, 젤라틴, 전분 페이스트, 탈크, 케라틴, 콜로이드상 실리카, 우레아 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 농후제, 윤활제 및 착색제가 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 대상에게 투여될 때, 본 발명의 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체는 멸균된 것이다. 본 발명의 폴리펩티드가 정맥내 투여될 때 물이 바람직한 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사가능한 용액에 대한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 제약상 담체는 또한 부형제, 예를 들어 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 석회분말, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 본 발명의 조성물은 원하는 경우에 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다.
조성물은 경구 투여를 위해 의도될 수 있고, 그러한 경우에 조성물은 바람직하게는 고체 또는 액체 형태이고, 여기서 반고체, 반액체, 현탁액 및 겔 형태가 본원에서 고체 또는 액체로서 고려되는 형태 내에 포함된다.
경구 투여를 위한 고체 조성물로서, 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 알약, 캡슐, 추잉검, 웨이퍼 (wafer) 등의 형태로 제형화될 수 있다. 그러한 고체 조성물은 대개 하나 이상의 불활성 희석제를 함유한다. 또한, 하나 이상의 다음 물질이 존재할 수 있다: 결합제, 예를 들어 에틸 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어 전분, 락토스 또는 덱스트린; 붕해제, 예를 들어 알긴산, 알긴산나트륨, 프리모겔 (Primogel), 옥수수 전분 등; 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘 또는 스테로텍스 (Sterotex); 활탁제, 예를 들어 콜로이드상 이산화규소; 감미제, 예를 들어 수크로스 또는 사카린, 향미제, 예를 들어 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미제, 및 착색제.
제약 조성물이 캡슐, 예를 들어, 젤라틴 캡슐 형태로 존재하는 경우에, 상기한 종류의 물질에 추가로, 액체 담체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 시클로덱스트린 또는 지방 오일을 함유할 수 있다.
제약 조성물은 액체, 예를 들어, 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 경구 투여 또는 주사에 의한 전달을 위해 유용할 수 있다. 경구 투여를 위해 의도될 때, 조성물은 하나 이상의 감미제, 보존제, 염료/착색제 및 향미 강화제를 함유할 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 조성물에서, 하나 이상의 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 버퍼, 안정화제 및 등장제가 또한 포함될 수 있다.
본 발명의 액체 조성물은 용액, 현탁액 또는 다른 유사한 형태이든지 또한 하나 이상의 다음 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어 주사용수, 염수 용액, 바람직하게는 생리학적 염수, 링거 (Ringer) 용액, 등장성 염화나트륨, 고정유, 예를 들어 합성 모노 또는 디글리세리드 (이는 용매 또는 현탁 매질로서 역할을 할 수 있음), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 시클로덱스트린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항균제, 예를 들어 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 또는 아황산나트륨; 킬레이팅제, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산; 버퍼, 예를 들어 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장성 (tonicity) 조정제, 예를 들어 염화나트륨 또는 덱스트로스. 비경구 조성물은 유리, 플라스틱 또는 다른 물질로 제조된 앰풀, 1회용 주사기 또는 다수-용량 바이알 내에 넣어질 수 있다. 생리학적 염수가 바람직한 보조제이다. 주사가능 조성물은 바람직하게는 멸균성이다.
제약 조성물은 적합한 투여량이 얻어지도록, 유효량의 본 발명의 화합물 (예를 들어, 융합 폴리펩티드)을 함유한다. 제약 조성물은 각각의 질환에 대해 현재 지시된 것과 같은 공지의 유효량의 화합물을 함유할 수 있다.
노화-관련 병태 또는 대사 장애의 예방, 치료, 및/또는 관리에서 효과적일 예방 및/또는 치료 요법에서 사용되는 본 발명의 폴리펩티드의 투여 경로는 당업계에 공지된 다른 치료제에 대한 현재 지시된 투여 경로를 기초로 할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼러스 (bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내층 (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장관 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소적일 수 있다. 다양한 전달 시스템, 예를 들어 미세입자, 미세캡슐, 캡슐 등이 공지되어 있고, 본 발명의 폴리펩티드를 투여하기 위해 유용할 수 있다. 본 발명의 하나 초과의 폴리펩티드가 대상에게 투여될 수 있다. 투여 방법은 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않고; 여기서, 비경구 투여는 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 설하, 비강내, 뇌내, 심실내, 경막내, 질내, 경피, 직장, 흡입에 의해, 또는 귀, 코, 눈 또는 피부에 국소 투여를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 폴리펩티드는 비경구로 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 정맥내 투여될 수 있다.
폐 투여가 예를 들어 흡입기 (inhaler) 또는 연무기 (nebulizer), 및 에어로졸화제를 사용한 제형의 사용에 의해, 또는 플루오로탄소 또는 합성 폐 계면활성제 내에서 관류를 통해 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 전통적인 결합제 및 담체, 예를 들어 트리글리세리드를 사용하여 좌제로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 펌프가 사용될 수 있다 ([Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 1987, 14, 201]; [Buchwald et al., Surgery 1980, 88: 507]; [Saudek et al., N. Engl. J. Med. 1989, 321: 574] 참조). 또한, 중합체 물질이 본 발명의 폴리펩티드의 제어 방출을 위해 사용될 수 있다 ([Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FL, 1974]; [Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984]; [Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 1983, 23, 61] 참조; 또한 [Levy et al., Science 1985, 228, 190]; [During et al., Ann. Neurol, 1989, 25, 351]; [Howard et al., J. Neurosurg., 1989, 71, 105] 참조). 구체적으로, 제어 방출 시스템은 본 발명의 폴리펩티드의 표적, 예를 들어 뇌에 근접하게 위치할 수 있어서, 전신 용량의 한 분획만을 필요로 한다 (예를 들어, 문헌 [Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 상기 문헌, vol. 2, 1984, pp. 115-138] 참조). 문헌 [Langer, Science 1990, 249, 1527-1533]에서 논의된 다른 제어 방출 시스템을 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 제어 또는 지속 방출을 달성하기 위해 사용되는 중합체 물질은 예를 들어 미국 특허 5,679,377; 미국 특허 5,916,597; 미국 특허 5,912,015; 미국 특허 5,989,463; 미국 특허 5,128,326; PCT 공개 WO 99/15154; 및 PCT 공개 WO 99/20253에 개시되어 있다. 지속 방출 제형에서 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-히드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드 (PLG), 폴리안하이드라이드 (polyanhydride), 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드 (PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA) 및 폴리오르토에스테르를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 지속 방출 제형에 사용되는 중합체는 불활성이고, 침출성 불순물이 존재하지 않고, 저장시 안정하며, 멸균 상태이고, 생분해성이다.
일반적으로, 본 발명의 제약 조성물의 치료 유효량은 약 0.0001 mg/kg 내지 0.001 mg/kg; 0.001 mg/kg 내지 약 10 mg/kg (체중), 또는 약 0.02 mg/kg 내지 약 5 mg/kg (체중)이다.
다른 실시태양에서, 예방 및/또는 치료 요법은 환자에게 본 발명의 폴리펩티드의 유효량의 하나 이상의 용량을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 유효량의 용량은 적어도 0.01 ㎍/mL 내지 적어도 400 ㎍/mL의 본 발명의 폴리펩티드의 혈장 수준을 달성한다.
예방 및/또는 치료 요법은 환자에게 본 발명의 폴리펩티드의 유효량의 복수의 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 복수의 용량은 적어도 0.01 ㎍/mL 내지 400 ㎍/mL의 본 발명의 폴리펩티드의 혈장 수준을 유지한다. 예방 및/또는 치료 요법은 적어도 1일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월 또는 9개월 동안 투여될 수 있다.
예방 및/또는 치료 요법은 하나 이상의 추가의 치료제와 조합하여 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 노화-관련 병태 또는 대사 장애의 예방, 치료, 및/또는 관리를 위해 현재 사용된 하나 이상의 치료제의 권장 투여량은 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 문헌 ([Hardman et al., eds., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, 2001]; [Physician's Desk Reference (60th ed., 2006)])을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 참조문으로부터 얻을 수 있다.
본 발명은 질환의 치료 방법을 포함하고, 여기서 Klotho 단백질 및 FGF의 작용제 활성이 바람직하다. 본 발명의 상기 방법의 예는 노화-관련 병태 또는 대사 장애를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 개체에서 노화-관련 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 치료를 필요로 하는 개체에는 노화-관련 병태를 치료 또는 예방하기 위해 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 함유하는 약물 유효 용량의 제약 조성물이 투여된다. 일부 실시태양에서, Klotho 융합 폴리펩티드는 약물 유효 용량의 헤파린과 함께 동시 투여된다. 노화-관련 병태는 근감소증, 피부 위축, 근육 쇠약, 뇌 위축, 죽상경화증, 동맥경화증, 폐기종, 골다공증, 골관절염, 면역부전, 고혈압, 치매, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 백내장, 노화-관련 황반 변성, 전립선암, 뇌졸중, 기대 수명 감소, 기억 상실, 주름, 신장 기능 손상, 및 노화-관련 난청을 포함한다. 일부 실시태양에서, Klotho 융합 폴리펩티드는 알파 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 도메인을 함유한다. 특정 실시태양에서, 알파 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 도메인 및 섬유모세포 성장 인자 23을 함유하는 Klotho 융합 단백질이 근육 쇠약에 대한 치료를 필요로 하는 개체에게 투여된다.
본 발명은 또한 개체에서 대사 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 치료를 필요로 하는 개체에는 대사 장애를 치료하기 위해 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 함유하는 약물 유효 용량의 제약 조성물이 투여된다. 일부 실시태양에서, Klotho 융합 폴리펩티드는 약물 유효 용량의 헤파린과 동시 투여된다. 방법은 II형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈당증, 및 비만의 치료 또는 예방에서 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 베타-Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 도메인 및 섬유모세포 성장 인자 21을 함유하는 Klotho 융합 단백질이 대사 장애에 대한 치료를 필요로 하는 개체에게 투여된다.
본 발명은 또한 개체에서 고인산혈증 또는 석회증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 치료를 필요로 하는 개체에는 고인산혈증 또는 석회증을 치료하기 위해 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 함유하는 약물 유효 용량의 제약 조성물이 투여된다. 일부 실시태양에서, Klotho 융합 폴리펩티드는 약물 유효 용량의 헤파린과 동시 투여된다. 특정 실시태양에서, 알파 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 도메인 및 섬유모세포 성장 인자 23을 함유하는 Klotho 융합 단백질이 고인산혈증 또는 석회증에 대한 치료를 필요로 하는 개체에게 투여된다.
본 발명은 또한 개체에서 만성 신장병 또는 만성 신부전증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 치료를 필요로 하는 개체에는 만성 신장병 또는 만성 신부전증을 치료하기 위해 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 함유하는 약물 유효 용량의 제약 조성물이 투여된다. 일부 실시태양에서, Klotho 융합 폴리펩티드는 약물 유효 용량의 헤파린과 동시 투여된다. 일부 실시태양에서, 알파 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 도메인을 함유하는 Klotho 융합 단백질이 만성 신장병 또는 만성 신부전증에 대한 치료를 필요로 하는 개체에게 투여된다.
본 발명은 또한 개체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 치료를 필요로 하는 개체에는 암을 치료하기 위해 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 함유하는 약물 유효 용량의 제약 조성물이 투여된다. 방법은 유방암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, Klotho 융합 폴리펩티드는 약물 유효 용량의 헤파린과 동시 투여된다. 일부 실시태양에서, 알파 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 도메인을 함유하는 Klotho 융합 단백질은 암에 대한 치료를 필요로 하는 개체에게 투여된다.
Klotho 융합 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물을 투여함으로써 질환을 치료하는 방법에서, Klotho 융합 폴리펩티드는 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는다. 특정 실시태양에서, Klotho 융합 단백질은 베타 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 도메인 및 섬유모세포 성장 인자 21을 함유한다.
Klotho 융합 폴리펩티드 조성물은 당업자에게 공지되고 본원에 설명되는 임의의 투여 방법에 따라 투여될 수 있다. 바람직한 투여 방법은 피하 또는 정맥내 투여를 포함한다. 다른 효과적인 투여 방식을 본원에서 설명한다.
4.6. 치료 방법 및 효능을 평가하기 위한 분석
Klotho 융합 폴리펩티드를 개체에게 투여하는 본 발명의 방법은 노화-관련 질환 또는 대사 장애를 포함한 다양한 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 임의의 특정 이론에 의해 제한되지 않으면서, Klotho/FGF 융합 폴리펩티드는 Klotho 또는 FGF의 조절곤란이 존재하는 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 질환은 대사 장애 및 노화-관련 질환을 포함한다. 예를 들어, FGF23 또는 Klotho 낙아웃 (knock-out) 마우스는 둘 모두 낮은 신체 활동, 성장 지연, 근육 쇠약, 피부 위축, 죽상경화증, 짧은 수명 등을 포함한 다양한 유사한 표현형을 보인다 (본원에 참고로 포함시킨 문헌 [Razzaque and Lanske, J. of Endrocrinology, 194:1-10 (2007)] 참조).
특히, 본 발명의 Klotho/FGF23 융합 폴리펩티드는 근육 쇠약을 포함한 노화-관련 질환의 치료에서 특히 유용하다. 이론에 매이지 않으면서, 무기질 (예를 들어, 포스페이트 및 칼슘) 및 비타민 D 항상성을 제어하는 Klotho 및 FGF23의 능력은 이들 단백질이 노화 및 근육 위축을 조정하는 수단일 수 있다.
다른 한편으로, 본 발명의 Klotho/FGF19 융합 폴리펩티드 및 Klotho/FGF21 융합 폴리펩티드는 대사 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 베타-Klotho 및 FGF19는 콜레스테롤 7-α-히드록실라제 (CYP7A1)를 조절함으로써 담즙산 항상성을 제어하는 것으로 나타났다. 담즙 항상성 질환의 비제한적인 예는 담즙울체이다. 베타-Klotho 및 FGF21은 지방세포에서 지방 분해를 유도하고, 따라서, 지방 저장을 감소시키고, 글루코스 흡수를 증가시키는 것으로 나타났다. 지방 분해/지방 저장 질환의 비제한적인 예는 비만 및 연관된 대사 및 심혈관 질병이다.
적어도 부분적으로는 FGF23이 소변 내의 포스페이트의 분비를 자극하여, 혈청 내의 포스페이트 수준을 감소시킬 수 있다는 발견에 기초하여, 본 발명의 Klotho-FGF23 융합 폴리펩티드는 개체에서 고인산혈증 또는 석회증을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 환자에서 Klotho의 결핍을 일으키는, Klotho의 동종접합성 미스센스 (missense) 돌연변이는 중증 종양성 석회증 및 동맥 석회화를 유발할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (본원에 참고로 포함시킨 문헌 [Ichikawa et al., J. Clin. Invest. 117:2684-2691 (2007)]). 개체에는 고인산혈증 또는 석회증을 치료하기 위해 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 함유하는 약물 유효 용량의 제약 조성물이 투여된다. 특히, 알파 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 함유하는 Klotho 융합 폴리펩티드는 고인산혈증 또는 석회증을 치료하기 위해 유용하다.
본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 또한 개체에서 만성 신장병 또는 만성 신부전증을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Klotho 발현은 이환되지 않은 신장에 비해 만성 신부전증 환자의 신장에서 감소되는 것으로 나타났다 (본원에 참고로 포함시킨 문헌 [Koh et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 280:1015-1020 (2001)]). 개체에는 만성 신장병 또는 만성 신부전증을 치료 또는 예방하기 위해 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 함유하는 약물 유효 용량의 제약 조성물이 투여된다. 특히, 알파 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 도메인을 함유하는 Klotho 융합 폴리펩티드는 만성 신장병 또는 만성 신부전증을 치료하기 위해 유용하다.
본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 또한 개체에서 암을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Klotho 발현은 정상 유방암 조직에 비해 유방암 조직에서 감소되는 것으로 나타났다 (본원에 참고로 포함시킨 문헌 [Wolf et al., Oncogene (2008) advance online publication]). 개체는 암 또는 유방암을 치료 또는 예방하기 위해 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인 및 섬유모세포 성장 인자를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 함유하는 약물 유효 용량의 제약 조성물이 투여된다. 특히, 알파 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 도메인을 함유하는 Klotho 융합 단백질은 암 또는 유방암을 치료하기 위해 유용하다.
노화-관련 질환 또는 대사 장애에 대한 본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드의 효능의 평가 효능 및/또는 유효 용량의 결정 방법은 예를 들어 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 영장류, 또는 일부 다른 비-인간 동물), 또는 다른 동물 (예를 들어, 제노푸스 (Xenopus), 제브라피시 (zebrafish), 또는 무척추동물, 예를 들어 파리 또는 선충)을 이용하는 유기체 기반 분석을 포함한다. Klotho 융합 폴리펩티드는 유기체에게 1회로 또는 하나의 요법 (규칙적 또는 불규칙적)으로서 투여될 수 있다. 이어서, 유기체의 파라미터, 예를 들어, 연령 관련 파라미터를 평가한다. 관심있는 Klotho 융합 폴리펩티드는 참조물, 예를 들어, 대조 유기체의 파라미터에 비해 파라미터에서 변화를 일으킨다. 다른 파라미터 (예를 들어, 독성, 소실율, 및 약력학에 관련된)를 또한 평가할 수 있다.
본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드는 특정 질환, 예를 들어, 본원에서 설명되는 질환, 예를 들어, 노화-관련 질환, 대사 장애를 갖는 동물을 이용하여 평가할 수 있다. 이들 질환은 또한 생리에 대한 시험 폴리펩티드의 효과를 관찰할 수 있는 민감화된 시스템을 또한 제공할 수 있다. 예시적인 질환은 신경차단, 불용 위축; 대사 장애 (예를 들어, 비만 및/또는 당뇨병 동물, 예를 들어 db/db 마우스 및 ob/ob 마우스의 질환); 뇌, 간 허혈; 시스플라틴/탁솔/빈크리스틴 모델; 다양한 조직 (제노그라프 (xenograph)) 이식편; 트랜스제닉 (transgenic) 뼈 모델; 통증 증후군 (염증성 및 신경병성 질환 포함); 파라콰트 (Paraquat), 유전자독성, 및 산화 스트레스 모델; 및 종양 I 모델을 포함한다.
노화-관련 질환을 측정하기 위해, 동물 모델은 칼로리 제한될 때 변경된 표현형을 갖는 동물일 수 있다. 예를 들어, F344 래트는 Klotho 융합 폴리펩티드를 평가하기 위한 유용한 분석 시스템을 제공한다. 칼로리 제한될 때, F344 래트는 신병증의 0 내지 10% 발생률을 갖는다. 그러나, 자유로이 먹이를 먹었을 때, 이들은 신병증의 60 내지 100% 발생률을 갖는다.
본 발명의 Klotho 융합 폴리펩티드를 평가하기 위해, 동물 (예를 들어, F344 래트 또는 다른 적합한 동물)에게 투여하고, 예를 들어 일정 기간 후에 동물의 파라미터를 평가한다. 동물은 자유로이 또는 정상적으로 먹이를 먹을 수 있다 (예를 들어, 칼로리 제한 하에서는 아니지만, 일부 파라미터는 상기 조건 하에 평가될 수 있다). 대개, 그러한 동물의 코호트 (cohort)를 분석을 위해 사용한다. 일반적으로, 시험 폴리펩티드가 유사한 동물 대상의 표현형을 칼로리 제한 방향으로 파라미터에 영향을 미치면 시험 폴리펩티드는 동물에서 수명 조절을 양호하게 변경시키는 것으로 표시될 수 있다. 그러한 시험 폴리펩티드는 유기체에서 칼로리 흡수를 박탈할 필요 없이 칼로리 제한의 수명 조절 효과의 적어도 일부, 예를 들어, 상기 효과의 하위세트를 유발할 수 있다.
시험할 파라미터는 연령-관련 또는 질병 관련 파라미터, 예를 들어, 동물 모델과 연관된 질환의 증상일 수 있다. 예를 들어, 시험 폴리펩티드는 SH 래트에게 투여될 수 있고, 혈압을 모니터링한다. 양호하게 표시되는 시험 폴리펩티드는 폴리펩티드로 처리하지 않은 유사한 참조 동물에 비해 증상의 개선을 일으킬 수 있다. 질환 또는 노화에 관련한 다른 파라미터는 항산화제 수준 (예를 들어, 항산화제 효소 수준 또는 활성), 스트레스 내성 (예를 들어, 파라콰트 내성), 심부 (core) 체온, 글루코스 수준, 인슐린 수준, 갑상선-자극 호르몬 수준, 프로락틴 수준, 및 황체화 호르몬 수준을 포함할 수 있다.
노화-관련 질환의 치료에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 유효성을 측정하기 위해, Klotho 발현이 감소된 동물, 예를 들어 돌연변이체 Klotho가 존재하는 마우스를 사용할 수 있다 (둘 모두 그 전문을 본원에 참고로 포함시킨 문헌 [Kuroo, et al. Nature, 390; 45 (1997)] 및 미국 특허 출원 공개 2003/0119910 참조). 예를 들어, 시험 폴리펩티드를 돌연변이체 마우스에게 투여하고, 노화-관련 파라미터를 모니터링한다. 양호하게 표시되는 시험 폴리펩티드는 폴리펩티드로 처리하지 않은 유사한 참조 동물에 비해 증상의 개선을 일으킬 수 있다. 대사 장애 또는 노화에 관련한 파라미터는 체중의 측정, 생식 능력의 획득에 대한 검사, 혈당 수준의 측정, 수명의 관찰, 피부의 관찰, 운동 기능, 예를 들어 보행의 관찰 등에 의해 평가할 수 있다. 평가는 또한 흉선 중량의 측정, 흉강의 내부 표면에 형성된 석회화 결정의 크기 관찰 등에 의해 이루어질 수 있다. 추가로, Klotho 유전자 또는 Klotho 단백질에 대한 mRNA의 정량적 결정이 또한 평가를 위해 유용하다.
또다른 생체내 모델 및 유기체 분석은 동물을 대사 파라미터, 예를 들어, 인슐린 질환, II형 당뇨병에 관련한 파라미터에 대해 평가하는 것을 포함한다. 예시적인 대사 파라미터는 글루코스 농도, 인슐린 농도, 및 인슐린 감수성을 포함한다.
다른 예시적인 시스템은 예를 들어 동물 모델에서 종양을 특징으로 한다. 종양은 자발성이거나 유도될 수 있다. 예를 들어, 종양은 다양한 유전자 구성을 갖는 세포로부터 발생할 수 있고, 예를 들어, 이들은 p53+ 또는 p53-일 수 있다. 자가면역 질환이 있는 유기체, 예를 들어 SLE에 대한 소인이 있는 NZB 마우스를 사용하는 것이 또한 가능하다. 뼈 질병의 특징을 평가하기 위해, 예를 들어, 골다공증에 대해, 예를 들어 모델로서 난소적출한 동물을 사용하는 것이 가능하다. 유사하게, 관절 질병에 대해, 모델은 보조 관절염에 기초할 수 있고 (예를 들어, 마우스는 연골 프로테오글리칸, 고 이동성 군 단백질, 연쇄구균 세포벽 물질, 또는 콜라겐으로 면역화될 수 있다); 신장 질병에 대해, kd/kd 마우스가 사용될 수 있다. 인식, 특히 학습 및 기억의 동물 모델도 이용가능하다. 당뇨병 및 그의 합병증의 동물 모델, 예를 들어, 스트렙토조토신 모델도 이용가능하다. 예를 들어 뇌졸중 및 허혈을 평가하기 위해 개 모델이 사용될 수 있다.
시험 폴리펩티드가 수명 조절을 변경시킬 수 있는지 평가하는데 있어서, 많은 연령-관련 파라미터 또는 생체마커를 모니터링 또는 평가할 수 있다. 예시적인 연령-관련 파라미터는 다음을 포함한다: (i) 세포 또는 유기체의 수명; (ii) 생물학적 연령 의존성 발현 패턴을 갖는 세포 또는 유기체 내에 유전자 전사체 또는 유전자 생성물의 존재 또는 풍부함; (iii) 스트레스에 대한 세포 또는 유기체의 내성; (iv) 세포 또는 유기체의 하나 이상의 대사 파라미터 (예시적인 파라미터는 순환 인슐린 수준, 혈당 수준; 지방 함량; 심부 체온 등을 포함한다); (v) 세포 또는 유기체 내에 존재하는 세포의 세트의 증식 능력; 및 (vi) 세포 또는 유기체의 물리적 외관 또는 거동.
용어 "평균 수명"은 유기체의 하나의 코호트의 사망 연령의 평균을 나타낸다. 일부 경우에, "평균 수명"은 제어된 환경 조건 하에 유전학상 동일한 유기체의 코호트를 사용하여 평가된다. 사고로 인한 사망은 제외한다. 제어된 환경 조건 하에 평균 수명을 결정할 수 없는 경우에 (예를 들어, 인간에 대해), 충분히 큰 집단에 대한 신뢰가능한 통계학적 정보 (예를 들어, 보험통계표로부터)를 평균 수명으로서 사용할 수 있다.
2개의 그러한 유기체, 예를 들어, 하나의 참조 유기체 및 Klotho 융합 폴리펩티드로 처리한 하나의 유기체 간의 분자 차이의 특성결정에 의해 유기체의 생리학적 상태의 차이를 밝힐 수 있다. 참조 유기체 및 처리된 유기체는 대개 동일한 생활 나이이다. 용어 "생활 나이"는 본원에서 사용될 때 예정된 사건, 예를 들어 수정, 규정된 발생 또는 태아 시기, 또는 보다 바람직하게는 출생 이후로 경과한 시간을 나타낸다. 비교 분석을 위해 유기체가 "동일한" 생활 나이인지 결정하기 위해 다양한 기준을 이용할 수 있다. 일반적으로, 요구되는 정확도는 야생형 유기체의 평균 수명의 함수이다. 예를 들어, 실험실 야생형 균주 N2가 일부 제어된 조건 하에 평균 약 16일까지 사는 선충 씨. 엘레간스 (C. elegans)에 대해, 동일한 연령의 유기체는 동일한 일수 동안 살 수 있다. 마우스에 대해, 동일한 연령의 유기체는 동일한 주수 또는 월수 동안 살 수 있고; 영장류 또는 인간에 대해, 동일한 연수 (또는 2, 3, 또는 5년 이내) 동안 살 수 있는 등이다. 일반적으로, 동일한 생활 나이의 유기체는 그 종의 야생형 유기체의 평균 수명의 15, 10, 5, 3, 2 또는 1%의 시간 동안 살 수 있다. 바람직하게는, 유기체는 성체 유기체이고, 예를 들어, 유기체는 적어도 평균 야생형 유기체가 생식을 하는 나이로 성숙할 시간 동안 산다.
유기체 스크리닝 분석은 유기체가 노화의 명시적인 물리적 특징을 보이기 전에 수행할 수 있다. 예를 들어, 유기체는 동일한 종의 야생형 유기체의 평균 수명의 단지 10, 30, 40, 50, 60, 또는 70% 동안 생존한 성체일 수 있다. 대사, 면역 기능, 및 염색체 구조의 연령 관련 변화를 기록하였다. 임의의 이들 변화를 시험 대상 (예를 들어, 유기체 기반 분석에 대해), 또는 환자 (예를 들어, 본원에서 설명되는 치료제를 사용한 처리 전, 처리 동안 또는 처리 후에)에 대해 평가할 수 있다.
칼로리 제한과 연관된 마커를 또한 스크리닝 분석의 대상 유기체 (또는 치료된 대상)에서 평가할 수 있다. 이들 마커는 노화-관련되지 않을 수 있지만, Klotho 경로가 조정될 때 변경되는 생리학적 상태를 표시할 수 있다. 마커는 칼로리 제한된 동물에서 그의 풍부함이 변화하는 mRNA 또는 단백질일 수 있다. WO01/12851 및 미국 특허 6,406,853에서는 예시적인 마커를 설명한다. 본원에서 설명되는 동물의 세포로부터 유래하거나 본원에서 설명되는 동물 모델에 유사한 세포 모델을 세포-기반 분석을 위해 사용할 수 있다.
근육 위축에 대한 시험 폴리펩티드의 효과를 평가하기 위한 모델은 다음을 포함한다: 1) 예를 들어, 중간 허벅지에서 우측 좌골 신경 절단에 의한 신경차단으로 인해 발생하는 래트 안쪽 장딴지 근육량 손실; 2) 예를 들어, 우측 발목 관절을 90도 굽혀 고정시킴으로써 유도되는 운동억제로 인해 발생하는 래트 안쪽 장딴지 근육량 손실; 3) 뒷다리 매달기로 인해 발생하는 래트 안쪽 장딴지 근육량 손실 (예를 들어, U.S. 2003-0129686 참조); 4) 악액질 시토킨인 인터류킨-1 (IL-1) 처리로 인해 발생하는 골격근 위축 (R.N. Cooney, S.R. Kimball, T.C. Vary, Shock 7, 1-16 (1997)); 및 5) 글루코코르티코이드인 덱사메타손 처리로 인해 발생하는 골격근 위축 (A.L. Goldberg, J Biol Chem 244, 3223-9 (1969)).
AMD에 대한 예시적인 동물 모델은 다음을 포함한다: 삼출성 (습식) 황반 변성을 시뮬레이션하는 레이저-유도 마우스 모델 [Bora et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 100:2679-84 (2003)]; AMD의 "지도형 (geographic) 위축" 형태와 연관된 특징을 생성시키는 돌연변이 형태의 카텝신 D를 발현하는 트랜스제닉 마우스 [Rakoczy et al., Am. J. Pathol., 161:1515-24 (2002)]; 및 CNV를 일으키는 망막 색소 상피에서 VEGF를 과다발현하는 트랜스제닉 마우스 [Schwesinger et al., Am. J. Pathol. 158:1161-72 (2001)].
파킨슨 (Parkinson) 병의 예시적인 동물 모델은 다음을 포함한다: 도파민성 신경독소 1-메틸-4 페닐 1,2,3,6-테트라히드로피리딘 (MPTP) 처리에 의해 파킨슨병이 유발된 영장류 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030055231 및 문헌 [Wichmann et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 991:199-213 (2003)] 참조); 6-히드록시도파민-손상 래트 (예를 들어, [Lab. Anim. Sci., 49:363-71 (1999)]); 및 트랜스제닉 무척추동물 모델 (예를 들어, [Lakso et al., J. Neurochem. 86:165-72 (2003)] 및 [Link, Mech. Ageing Dev., 122:1639-49 (2001)]).
II형 당뇨병의 예시적인 분자 모델은 다음을 포함한다: 결함 Nkx-2.2 또는 Nkx-6.1을 갖는 트랜스제닉 마우스 (미국 특허 6,127,598); 주커 (Zucker) 당뇨성 지방 fa/fa (ZDF) 래트 (미국 특허 6,569,832); 및 자발적으로 비만이 발생하고 후속적으로 종종 현성 II형 당뇨병으로 진행하는 붉은털 (Rhesus) 원숭이 (Hotta et al., Diabetes, 50:1126-33 (2001)); 및 II형 당뇨병-유사 인슐린 내성을 갖는 우성-음성 IGF-I 수용체 (KR-IGF-IR)이 존재하는 트랜스제닉 마우스.
신경병증에 대한 예시적인 동물 및 세포 모델은 다음을 포함한다: 마우스 (미국 특허 5,420,112) 또는 토끼 (Ogawa et al., Neurotoxicology, 21:501-11 (2000))에서 빈크리스틴으로 유도된 감각-운동 신경병증; 자율 신경병증의 연구를 위한 스트렙토조토신 (STZ)-당뇨병 래트 (Schmidt et al., Am. J. Pathol., 163:21-8 (2003)); 및 진행성 운동 신경병증 (pmn) 마우스 (Martin et al., Genomics, 75:9-16 (2001)).
고인산혈증 또는 종양성 석회증의 예시적인 동물 모델은 Klotho 낙아웃 마우스 및 FGF23 낙아웃 마우스를 포함한다 (Yoshida et al., Endocrinology 143:683-689 (2002)).
만성 신장병 또는 만성 신부전증의 예시적인 동물 모델은 COL4A3+/- 마우스를 포함한다 (Beirowski et al., J. Am. Soc. Nephrol. 17:1986-1994 (2006)).
암의 예시적인 동물 모델은 당업계에 공지된 바와 같은 누드 (nude) 마우스 내로 암 세포 또는 조직의 이식 또는 삽입을 포함한다 (Giovanella et al., Adv. Cancer Res. 44:69-120 (1985)). 예를 들어, 유방암의 동물 모델은 유방암 세포 또는 조직을 이식 또는 삽입한 누드 마우스를 포함한다 (예를 들어, [Yue et al., Cancer Res. 54:5092-5095 (1994)]; [Glinsky et al., Cancer Res. 56:5319-5324 (1996)]; [Visonneau Am. J. Path. 152: 1299-1311 (1998)]).
조성물은 대상, 예를 들어, 성인 대상, 특히 건강한 성인 대상 또는 노화-관련 질병이 있는 대상에게 투여될 수 있다. 후자의 경우에, 상기 방법은 예를 들어, 노화-관련 질병의 증상 또는 다른 질병 마커의 특성을 결정하기 위해 대상을 평가하고, 그에 의해 신경퇴행성 질병, 예를 들어, 알츠하이머병 또는 노화-관련 질병에 있거나 상기 질병에 소인이 있는 것으로서 대상을 확인하는 것을 포함할 수 있다.
골격근 위축
Klotho 융합 폴리펩티드를 개체에게 투여하는 것을 제공하는 본 발명의 방법은 골격근 위축을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 근육 위축은 수많은 신경근육, 대사, 면역학 및 신경학적 질환 및 질병, 및 기아, 영양 결핍, 대사 스트레스, 당뇨병, 노화, 근육 퇴행위축 (dystrophy), 또는 근병증을 포함한다. 근육 위축은 노화 과정 동안 일어난다. 근육 위축은 또한 근육의 사용 감소 또는 불용으로 인해 발생한다. 증상은 골격근 조직량의 감소를 포함한다. 인간 남성에서, 50세 내지 80세 사이에 근육량이 1/3로 감소한다. 근육 위축의 일부 분자 특징은 유비퀴틴 리가제의 상향조절, 및 근원섬유 단백질의 손실을 포함한다 (Furuno et al., J. Biol. Chem., 265:8550-8557, 1990). 상기 단백질의 파괴는 예를 들어 액틴, 및 특정 근육에서 미오신의 특이적 구성성분인 3-메틸-히스티딘 생산을 측정함으로써 추적할 수 있다 ([Goodman, Biochem. J. 241:121-12, 1987] 및 [Lowell, et al., Metabolism, 35:1121-112, 1986]; [Stein and Schluter, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 272: E688-E696, 1997]). 크레아틴 키나제 (세포 손상 마커) (Jackson, et al., Neurology, 41:101 104, 1991)의 방출도 또한 지표가 될 수 있다.
인슐린- 비의존성 당뇨병
Klotho 융합 폴리펩티드를 개체에게 투여하는 것을 제공하는 본 발명의 방법은 인슐린-비의존성 당뇨병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 인슐린-비의존성 당뇨병은 "성인 발병" 당뇨병 및 II형 당뇨병으로도 불린다. II형 당뇨병은 또한 "비-비만형 2" 및 "비만형 2"를 포함한다. II형 당뇨병은 (1) 인슐린의 췌장-베타-섬세포 분비 감소 (그에 의해 혈액 글루코스 수준의 균형을 유지하기 위해 필수량 미만의 인슐린이 생산된다) 및/또는 (2) "인슐린 내성" (여기서, 신체는 인슐린에 대해 정상적으로 반응하지 못한다)을 특징으로 할 수 있다 (미국 특허 5,266,561 및 미국 특허 6,518,069). 예를 들어, 글루코스-자극된 인슐린 수준이 대개 4.0 nmol/L를 초과하여 상승하지 못한다 (미국 특허 5,266,561). II형 당뇨병의 예시적인 증상은 공복시 고혈당증 (미국 특허 5,266,561); 피로; 과도한 갈증; 빈뇨; 시력 저하 (blurred vision); 및 증가된 감염률을 포함한다. II형 당뇨병의 분자 징후는 췌장에서 섬 아밀로이드 침착을 포함한다.
신경병증
신경병증은 운동, 감각, 감각운동 또는 자율 신경에 해를 끼치는 전신 질병, 유전 병태 또는 독성제에 의해 유발되는 중추 및/또는 말초 신경 기능장애를 포함할 수 있다 (예를 들어, US 특허 출원 20030013771 참조). 증상은 신경 손상의 원인 및 이환된 특정 종류의 신경에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 운동 신경병증의 증상은 육체적 업무를 수행하는데 있어서 어눌함 또는 근육 약화로 인해, 사소한 활동 후의 탈진, 기립 또는 보행 곤란, 및 신경근육 반사의 약화 또는 부재를 포함하고 (미국 특허 출원 20030013771), 자율 신경병증의 증상은 변비, 심장 불규칙성 및 체위성 저혈압 반사의 약화를 포함하고 (미국 특허 출원 20030013771), 감각 신경병증의 증상은 통증 및 무감각; 손, 다리 또는 발의 저림; 및 접촉에 대한 과민성을 포함하고, 망막병증의 증상은 시력 저하, 돌발 시력 상실, 흑반, 및 눈부심 (flashing light)을 포함한다.
알츠하이머병
Klotho 융합 폴리펩티드를 개체에게 투여하는 것을 제공하는 본 발명의 방법은 알츠하이머병 (AD)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 알츠하이머병은 비가역적인 뉴런 상실을 일으키는 복잡한 신경퇴행성 질병이다. 이는 또한 노화-관련 병태인 신경퇴행성 질병의 하나의 예만을 제공한다. 알츠하이머병의 임상 특질은 기억, 판단, 물리적 환경에 대한 방향감, 및 언어의 진행성 장애를 포함한다. AD의 신경병리학적 특질은 구역-특이적 뉴런 상실, 아밀로이드 플라크, 및 신경섬유 매듭 (tangle)을 포함한다. 아밀로이드 플라크는 8-아밀로이드 전구체 단백질 (또한 APP로서도 공지됨)의 절단 생성물인 아밀로이드 펩티드 (또한 Ap 또는 Ap42로서도 공지됨)을 함유하는 세포외 플라크이다. 신경섬유 매듭은 비정상적으로 과다인산화된 미세관-연관된 단백질의 필라멘트로 구성된 불용성 세포내 응집물이고, 단단한 아밀로이드 플라크 및 신경섬유 매듭은 세포자멸에 의한 뉴런 상실을 일으키는 2차 사건에 기여할 수 있다 (Clark and Karlawish, Ann. Intern. Med. 138(5):400-410 (2003)). 예를 들어, p-아밀로이드는 배양된 뉴런에서 카스파제-2-의존적 세포자멸을 일으킨다 (Troy et al. J Neurosci. 20(4):1386-1392). 생체내 플라크의 침착은 유사한 방식으로 근위 뉴런의 세포자멸을 촉발시킬 수 있다.
대상에서 AD를 평가하기 위해 유전학, 생화학, 생리학, 및 인지 기준을 포함한 다양한 기준이 사용될 수 있다. AD의 증상 및 진단은 의료 담당자에게 공지되어 있다. AD의 몇몇 예시적인 증상 및 마커를 아래에 제시한다. 이들 징후 및 AD와 연관된 것으로 공지된 다른 징후에 대한 정보가 "AD-관련 파라미터"로서 사용될 수 있다. AD 관련 파라미터는 정성적 또는 정량적 정보를 포함할 수 있다. 정량적 정보의 예는 하나 이상의 치수, 예를 들어, 단백질의 농도 또는 단층촬영 (tomographic) 지도의 수치값. 정성적 정보는 평가, 예를 들어, 의사의 의견 또는 2항 문진 (binary) ("yes"/"no") 등을 포함할 수 있다. AD-관련 파라미터는 대상이 AD로 진단되지 않거나 AD의 특정 징후를 갖지 않음을 나타내는 정보, 예를 들어, AD를 대표하지 않는 인지 시험 결과 또는 AD와 연관되지 않은 유전적 APOE 다형성을 포함한다.
진행성 인지 장애가 AD의 특질이다. 상기 장애는 기억, 판단, 결정, 물리적 환경에 대한 방향감, 및 언어의 감소로서 나타날 수 있다 (Nussbaum and Ellis, New Eng J. Med. 348(14):1356 35 1364 (2003)). 다른 형태의 치매를 배제하는 것이 AD 진단을 도울 수 있다. 뉴런 사멸은 AD 환자에서 진행성 대뇌 위축을 일으킨다. 영상화 기술 (예를 들어, 자기 공명 영상화, 또는 컴퓨터 단층촬영)이 뇌에서 AD-연관된 병변 및/또는 뇌 위축을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
AD 환자는 질병의 병상으로부터 기인하는 생화학적 이상을 보일 수 있다. 예를 들어, AD 환자에서 뇌척수액 내의 단백질 수준이 상승한다 (Andreasen, N. et al. Arch Neurol. 58:349-350 (2001)).
아밀로이드 베타 42 (A,B42) 펩티드의 수준은 AD 환자의 CSF에서 감소할 수 있다. Ap42의 수준은 AD 환자의 혈장에서 증가할 수 있다 (Ertekein-Taner, N., et al. Science 290:2303 2304 (2000)). 대상으로부터의 샘플에서 생화학적 이상을 검출하는 기술은 당업계에 공지된 세포적, 면역학적, 및 다른 생물학적 방법을 포함한다. 일반적인 지침으로서, 예를 들어, 문헌 ([Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3r Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)], [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)], [Harrow, E. and Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]] 및 그의 최신판에 설명된 기술을 참조한다.
예를 들어, 항체, 다른 면역글로불린, 및 다른 특이적 결합 리간드가 AD와 연관된 생체분자, 예를 들어, 단백질 또는 다른 항원을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 특이적 항체가 샘플을 프로빙하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 포맷, 예를 들어, ELISA, 형광-기반 분석, 웨스턴 블롯, 및 단백질 어레이가 가능하다. 폴리펩티드 어레이의 생산 방법은 당업계에서, 예를 들어, 문헌 ([De Wildt et al. (2000). Nature Biotech. 18, 989-994]; [Lucking et al. (1999). Anal. Biochem. 270, 103-111]; [Ge, H. (2000). Nucleic Acids Res. 28, e3, 1-VII]; [MacBeath, G., and Schreiber, S.L. (2000). Science 289, 1760 to 1763]); 및 WO 99/51773A1에서 설명되어 있다.
한 분석에서, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 치료 요법을 평가하기 위해 AD의 비-인간 동물 모델 (예를 들어, 마우스 모델)을 사용한다. 예를 들어, 미국 특허 6,509,515에서는 학습 및 기억 시험에 자연적으로 사용될 수 있는 하나의 그러한 모델 동물을 설명한다. 동물은 뇌 조직 내의 수준에서 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 서열을 발현하여, 동물은 출생으로부터 짧은 기간 내에, 일반적으로 출생으로부터 1년 내에, 바람직하게는 출생으로부터 2 내지 6개월 내에 진행성 신경학적 질환을 발병한다. APP 단백질 서열은 동물 또는 동물의 조상에 배아기, 바람직하게는 1 세포, 또는 수정된 난모세포, 기, 및 일반적으로 약 8세포기 이내에 도입된다. 이어서, 접합체 또는 배아는 위임신 대리모 암컷에서 만기로 발달된다. 아밀로이드 전구체 단백질 유전자를 동물 배아 내로 도입시켜, 뇌의 피질-변연 영역 (AD와 같은 진행성 신경학적 질병 상태에서 현저하게 이환되는 뇌의 영역)에서 아밀로이드 전구체 단백질의 초 (super) 내인성 발현 및 진행성 신경학적 질병의 발생을 일으키는 상태로 염색체에 통합시킨다. 신경교증 및 이환된 트랜스제닉 동물에서의 임상 증상을 통해 신경학적 질병을 모델링한다. 신경학적 질병의 진행성 측면은 약화된 탐색 및/또는 이동 (locomotor) 거동 및 약화된 데옥시글루코스 섭취/이용, 및 뇌의 피질-변연 구역에서 비대 신경교증을 특징으로 한다. 추가로, 나타난 변화는 일부 노화하는 동물에서 보이는 것과 유사하다. 다른 동물 모델은 또한 US 5,387,742; 5,877,399; 6,358,752; 및 6,187,992에 설명되어 있다.
파킨슨병
Klotho 융합 폴리펩티드를 개체에게 투여하는 것을 제공하는 본 발명의 방법은 파킨슨병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 파킨슨병은 운동 기능을 조절하는 흑질 도파민 시스템의 퇴행을 일으키는, 흑질에서 도파민성 뉴런의 신경퇴행을 포함한다. 상기 병리학은 다시 운동 기능장애를 일으킨다 (예를 들어, 문헌 [Lotharius et al., Nat. Rev. Neurosci., 3:932-42 (2002)] 참조). 예시적인 운동 증상은 운동불능, 구부정한 자세, 보행 곤란, 자세 불안정성, 강경증 (catalepsy), 근육 경직 및 떨림 (tremor)을 포함한다. 예시적인 비-운동 증상은 우울증, 동기의 결핍, 수동성, 치매 및 위장관 기능장애를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Fahn, Ann. N.Y. Acad. Sci., 991:1-14 (2003)] 및 [Pfeiffer, Lancet Neurol., 2: 107-16 (2003)] 참조). 파킨슨병은 65 내지 69세의 사람의 0.5 내지 1%에서, 및 80세 이상의 사람의 1 내지 3%에서 관찰되었다 (예를 들어, [Nussbaum et al., N. Engl. J. Med., 348: 1356-64 (2003)] 참조). 파킨슨병의 분자 마커는 방향족 L 아미노산 데카르복실라제 (AADC)의 감소 (예를 들어, US 출원 20020172664 참조); 및 흑질 뉴런에서 도파민 함량의 상실을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Fahn, Ann. N.Y. Acad. Sci., 991:1-14 (2003)] 및 [Lotharius et al., Nat. Rev. Neurosci., 3:932-42 (2002)] 참조). 일부 가족성 사례에서, PD는 알파-시누클레인 및 파르킨 (E3 유비퀴틴 리가제) 단백질을 코딩하는 단일 유전자의 돌연변이에 관련된다 (예를 들어, 문헌 [Riess et al., J. Neurol. 250 Suppl 1:I3 10 (2003)] 및 [Nussbaum et al., N. Engl. J. Med., 348: 1356-64 (2003)] 참조). 뉴런-특이적 C-말단 유비퀴틴 히드롤라제 유전자에서 미스센스 돌연변이가 또한 파킨슨병과 연관된다 (예를 들어, 문헌 [Nussbaum et al., N. Engl. J. Med., 348:1356-64 (2003)] 참조).
헌팅턴병
Klotho 융합 폴리펩티드를 개체에게 투여하는 것을 제공하는 본 발명의 방법은 헌팅턴병을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 헌팅턴병에 대한 Klotho 융합 폴리펩티드의 효능을 평가하고/하거나 그의 유효 용량을 결정하는 방법은 예를 들어 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 영장류, 또는 일부 다른 비-인간), 또는 다른 동물 (예를 들어, 제노푸스, 제브라피시, 또는 무척추동물, 예를 들어 파리 또는 선충)을 사용한 유기체 기반 분석을 포함한다. 헌팅턴병에 대한 많은 동물 모델 시스템이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Brouillet, Functional Neurology 15(4):239-251 (2000)]; [Ona et al. Nature 399:263-267 (1999)], [Bates et al. Hum Mol Genet. 6(10):1633-7 (1997)]; [Hansson et al. J. of Neurochemistry 78:694-703]; 및 [Rubinsztein, D.C, Trends in Genetics, Vol. 1S, No.4, pp. 202-209 (HD의 다양한 동물 및 비-인간 모델에 대한 검토)] 참조).
그러한 동물모델의 예는 트랜스제닉 마우스 균주 R6/2 주이다 (Mangiarini et al. Cell 87: 493-506 (1996)). R6/2 마우스는 (내인성 프로모터의 제어 하에) 인간 HD 유전자의 엑손 1을 과다발현하는 트랜스제닉 헌팅턴병 마우스이다. R6/2 인간 HD 유전자의 엑손 1은 확장된 CAG/폴리글루타민 반복체 길이 (평균 150개의 CAG 반복체)를 갖는다. 이들 마우스는 인간 헌팅턴병의 많은 특징을 갖는 진행성의, 궁극적으로 치명적인 신경학적 질병을 발병한다. 부분적으로 헌팅틴 (Huntingtin) (HD 엑손 1에 의해 코딩됨)의 N 말단 부분에 의해 구성되는 비정상적인 응집물이 R6/2 마우스에서 세포의 세포질 및 핵 모두에서 관찰된다 (Davies et al. Cell 90:537-548 (1997)). 예를 들어, 트랜스제닉 동물 내의 인간 헌팅틴 단백질은 적어도 55개의 CAG 반복체, 보다 바람직하게는 약 150개의 CAG 반복체를 포함하는 유전자에 의해 코딩된다. 이들 트랜스제닉 동물은 헌팅턴병-유사 표현형을 발생할 수 있다.
이들 트랜스제닉 마우스는 출생 후 8 내지 10주부터 체중 증가 감소, 수명 감소, 및 비정상적인 보행, 안정 떨림, 뒷다리 움츠림 (clasping) 및 과다활동을 특징으로 하는 운동 장애를 특징으로 한다 (예를 들어 R6/2 균주; [Mangiarini et al. Cell 87:493-506 (1996)] 참조). 표현형은 운동감소증으로 진행적으로 악화한다. 이들 트랜스제닉 마우스의 뇌는 또한 신경화학적 및 조직학적 이상, 예를 들어 신경전달물질 수용체 (글루타메이트, 도파민성)에서 변화, N-아세틸아스파르테이트 (뉴런 완전성의 마커)의 농도 감소, 및 선조체 및 뇌 크기 감소를 나타낸다. 따라서, 평가는 신경전달물질 수준, 신경전달물질 수용체 수준, 뇌 크기 및 선조체 크기에 관련된 파라미터를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 인간 헌팅틴 단백질의 트랜스제닉 부분 또는 전장 인간 헌팅틴 단백질을 함유하는 비정상적인 응집물이 이들 동물 (예를 들어, R6/2 트랜스제닉 마우스 균주)의 뇌 조직 내에 존재한다 (예를 들어, 문헌 [Mangiarini et al. Cell 87:493-506 (1996)], [Davies et al. Cell 90:537-548 (1997)], [Brouillet, Functional Neurology 15(4):239-251 (2000)] 및 [Cha et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:6480-6485 (1998)] 참조).
동물 모델에서 본원에서 설명되는 시험 폴리펩티드 또는 공지의 폴리펩티드의 효과를 시험하기 위해, 예를 들어, 시험 폴리펩티드를 동물의 순환계 내로 주사함으로써 상이한 농도의 시험 폴리펩티드를 트랜스제닉 동물에게 투여한다. 헌팅턴병-유사 증상을 동물에서 평가할 수 있다. 이어서, 예를 들어, 마우스 모델에 대해 상기 설명된 바와 같이 헌팅턴병-유사 증상의 진행을 모니터링하여, 시험 폴리펩티드를 사용한 처리가 증상의 감소 또는 지연을 일으키는지 결정한다. 다른 분석에서, 이들 동물에서 헌팅틴 단백질 응집물의 분해를 모니터링한다. 이어서, 동물을 희생시킬 수 있고, 뇌 슬라이스 (slice)를 얻는다. 이어서, 뇌 슬라이스를 트랜스제닉 인간 헌팅틴 단백질, 그의 일부, 또는 인간 헌팅틴 단백질 또는 그의 일부를 포함하는 융합 단백질을 함유하는 응집물의 존재에 대해 분석한다. 상기 분석은 예를 들어 뇌 조직의 슬라이스를 항-헌팅턴 항체로 염색하고, 항-헌팅턴 항체를 인식하는 FITC와 컨쥬게이팅된 2차 항체를 첨가하고 (예를 들어, 항-헌팅틴 항체는 마우스 항-인간 항체이고, 2차 항체는 인간 항체에 특이적이다), 단백질 응집물을 형광 현미경에 의해 가시화하는 것을 포함할 수 있다.
헌팅턴병을 평가 및/또는 모니털이하기 위해 다양한 방법이 이용가능하다. 질병에 대한 다양한 임상 증상 및 징후가 공지되어 있다. 헌팅턴병은 운동 질환, 정신과 장애 및 인지 변화를 일으킨다. 이들 증상의 정도, 발병 연령, 및 표명은 변할 수 있다. 운동 질환은 무도병으로 불리는 빠르고 무작위한 춤-유사 운동을 포함할 수 있다.
예시적인 운동 평가는 다음을 포함한다: 안구 추적, 단속 안구운동 (saccade) 개시, 단속 안구운동 속도, 조음장애, 혀 내밀기, 손가락 두드림 (tap) 능력, 내전 (pronate)/외전 (supinate), 주먹-손-손바닥 (fist-hand-palm) 순서, 팔의 경직, 운동감소증, 최대 근육긴장이상 (몸통, 상지 및 하지), 최대 무도병 (예를 들어, 몸통, 얼굴, 상지 및 하지), 보행, 일직선 보행, 및 역보행. 예시적인 처리는 예를 들어, 1년에 걸쳐 총 운동 스코어 4 (TMS-4) (UHDRS의 하위스케일)의 변화를 일으킬 수 있다.
암
Klotho 융합 폴리펩티드를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 본 발명의 방법은 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 암은 부적절하게 높은 수준의 세포 분할, 부적절하게 낮은 수준의 세포자멸, 또는 둘 모두에 의해 유발되거나 그를 유발시키는 임의의 질병을 포함한다. 암의 예는 비제한적으로 백혈병 (예를 들어, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수모구 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단핵구성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 급성 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병), 진성 적혈구증가증, 림프종 (호지킨 (Hodgkin) 병, 비-호지킨병), 발덴스트롬 (Waldenstrom) 마크로글로불린혈증, 중쇄병 및 고형 종양, 예를 들어 육종 및 암종 (예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 (Ewing) 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 고환종, 배아 암종, 윌름 (Wilm) 종양, 경부암, 자궁암, 정소암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경아교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 슈반세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 및 망막모세포종)를 포함한다. 림프구증식 질환은 또한 증식성 질병인 것으로 간주된다.
본원에 인용되는 모든 특허, 특허 출원, 및 공개 참조문은 그 전문을 본원에 참조로 포함시킨다. 본 발명은 그의 실시태양을 참조하여 구체적으로 제시되고 설명되었지만, 당업자는 첨부된 특허청구범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 상세한 내용에 있어서 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
5. 실시예
실시예 1. Klotho 융합 폴리펩티드의 발현 또는 정제
Klotho 융합 폴리펩티드의 발현
본 발명의 폴리펩티드는 알파 Klotho의 세포외 도메인 및 FGF23 (R179Q) 변이체를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터로 HEK293T 세포를 일시적으로 형질감염시켜 제조하였다. 발현된 폴리펩티드를 함유하는 조건화된 배지는 Klotho, FGF23, 및 Klotho-FGF23(R179Q) 융합 단백질에 대한 각각의 발현 플라스미드의 일시적인 형질감염에 의해 생성되었다. 형질감염은 Lipofectamine 2000 (인비트로겐, Cat # 11668-019)을 사용하여 6-웰 플레이트에서 수행하였다. 형질감염 5시간 후에, 형질감염 혼합물을 3 ml DMEM + 1% FBS로 교체하였다. 3 ml DMEM + 1% FBS 첨가 72시간 후에 조건화된 배지를 수집하였다. 다양한 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포로부터 조건화된 배지의 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리하고, 웨스턴 블롯 (도 3a)으로 분석하거나 또는 쿠마지 블루 (도 3b)로 염색하였다.
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 다양한 샘플에 대해 수행하였다 (레인 1, 대조군; 레인 2, FGF23; 레인 3, sKlotho; 레인 4-6, sKlotho-FGF23). 쿠마지 블루 염색은 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터로 형질감염되지 않은 샘플을 함유한 레인 1-3에는 존재하지 않는, 높은, > 180 kDa 밴드 (도 3b, 우측에 화살표로 표시됨)의 발현을 보였다. 배지 내로 분비된 Klotho 융합 폴리펩티드의 품질을 웨스턴 블롯으로 평가하였다 (도 3a). 항-FGF23 래트 모노클로날 IgG2A (알앤디 시스템즈, Cat# MAB26291)를 웨스턴 블롯에 의해 Klotho 융합 폴리펩티드를 검출하기 위한 1차 항체로서 사용하였다. 웨스턴 블롯을 통해, 쿠마지 염색 겔에서 관찰된 추가의 밴드가 Klotho 융합 폴리펩티드임이 확인되었다. 웨스턴 블롯에 의해, Klotho 융합 폴리펩티드가 Klotho 융합 폴리펩티드에 대해 예상된 분자량을 갖는 것이 확인되었다. 상기 분석은 Klotho-FGF23(R179Q) 융합 단백질의 발현을 보여준다.
Klotho 융합 폴리펩티드의 정제
본 발명의 폴리펩티드는 알파 Klotho의 세포외 도메인 및 FGF23 R179Q 변이체를 갖는 Klotho 융합 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터로 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포 배양액의 조건화된 배지로부터 정제하였다. 조건화된 배지를 생성하기 위해, sKlotho-FGF23-6xHis을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시켰다 (18 ml의 2 ㎍/ml 폴리에틸렌이민 (PEI)과 혼합된 18 ml의 OptiMEM 1 (깁코, Cat #11058) 내의 500 ㎍ DNA를 발현 배지 내의 현탁액에서 성장시킨 HEK293 세포 (Freestype 293 발현 배지 (깁코, Cat #12338) 내의 106 세포/ml의 464 ml의 HEK293T 세포) 내로 도입). 형질감염 후에, 배양액을 성장시켰다 (120시간; 5% CO2 인큐베이터 중의 37℃; 125 rpm에서 진탕). 인큐베이션 종료시에, 조건화된 배지를 원심분리 (5분 동안 1000 rpm)에 의해 회수하였다. 이어서, 조건화된 배지를 니켈-아가로스 컬럼에 적용하였다. sKlotho-FGF23-6xHis은 컬럼에 단단하게 결합하였고, 50 mM 이미다졸로 용출시켰다. 이어서, 생성되는 정제된 물질을 PBS에서 투석하여 이미다졸을 제거하였다. 정제된 sKlotho-FGF23-6xHis의 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분리하고 (레인 1, 정제된 sKlotho-FGF23-6xHis; 레인 2, 분자량 마커), 쿠마지 블루 염색으로 분석하였다 (도 3c). 염색된 SDS-PAGE 겔을 통해, 정제된 sKlotho-FGF23-6xHis이 예상된 분자량을 갖는다는 것이 확인되었다. 정제된 물질이 로딩된 레인에서 전장 sKlotho-FGF23-6xHis 이외의 다른 단백질에 대응하는 밴드를 검출할 수 없다는 사실에 의해, sKlotho-FGF23-6xHis이 정제되었음이 밝혀졌다.
실시예 2. Klotho 융합 폴리펩티드의 활성을 평가하는 시험관내 분석.
Egr -1- 루시퍼라제
발현된 알파 Klotho 융합 폴리펩티드의 생물학적 활성을 Egr-1-루시퍼라제 리포터 분석으로 시험하였다. FGF23 수용체에 대한 Klotho 융합 폴리펩티드의 결합은 Egr-1의 하류 활성화 및 Egr-1 프로모터에 의해 제어되는 루시퍼라제 리포터의 발현을 유발하였다. 문헌 [Urakawa et al., Nature, 2006, Vol 444, 770-774]에 기록된 내용을 기초로 하여 Egr-1-루시퍼라제 리포터 유전자를 구성하였다. 48-웰 폴리-D-라이신 플레이트에 접종된 HEK293T 세포를 형질감염 정규화 리포터 유전자 (Renilla 루시퍼라제)와 함께 Egr-1-루시퍼라제 리포터 유전자로 형질감염시켰다. Egr-1 루시퍼라제 리포터 유전자의 형질감염 5시간 후에, 형질감염 혼합물을 3 ml DMEM + 1% FBS로 교체하였다. 3 ml DMEM + 1% FBS 첨가 72시간 후에, 조건화된 배지를 수집하였다. 5시간 후에, 형질감염 혼합물을 활성에 대해 시험할 샘플로 교체하였다. 초기 실험에서, 50% 조건화된 배지 (단독 또는 Klotho, FGF23, Klotho 및 FGF23, 및 Klotho-FGF23(R179Q) 융합 단백질 함유) 및 20 ㎍/ml 헤파린 (시그마, Cat#H8537; 2 mg/ml 원액으로서 DMEM에 용해됨)의 존재 또는 부재 하의 1% FBS가 존재하는 50% DMEM을 Egr-1-루시퍼라제 리포터 분석으로 시험하였다 (도 4). 추가의 실험은 규정된 양의 정제된 폴리펩티드를 사용하였다 (도 5a 및 5b). 세포를 20시간 후에 수동 용해 버퍼 (프로메가, Cat #E194A)에 용해시키고, Dual-Glo 루시퍼라제 분석 시스템 (프로메가, Cat #E2940)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 결정하였다.
초기 실험에서, Klotho 융합 폴리펩티드 활성은 비분획화된 조건화된 배지에서 입증되었다. Egr-1-루시퍼라제 리포터 유전자를 사용하여 (도 4), 상기 실험은 루시퍼라제 리포터 발현의 변화 배수를 정량하였다. FGF23 및 Klotho 단백질의 세포외 도메인의 조합물을 함유하는 조건화된 배지는 Egr-1-루시퍼라제를 활성화시켰지만, FGF23만을 함유하는 조건화된 배지 또는 Klotho의 세포외 도메인만을 함유하는 조건화된 배지는 Egr-1-루시퍼라제를 활성화시키지 않았다. FGF23 또는 Klotho만을 함유하는 조건화된 배지에 비해, 융합 단백질 sKlotho-FGF23(R179Q)을 함유하는 조건화된 배지는 Egr-1-루시퍼라제 리포터 유전자를 활성화시켰다. 상기 실험에서, 융합 단백질 sKlotho-FGF23(R179Q)을 함유하는 조건화된 배지는 FGF23 및 Klotho의 조합물을 함유하는 조건화된 배지보다 상당히 더 우수하게 Egr-1-루시퍼라제 리포터 유전자를 활성화시켰다. 헤파린의 존재 하에, 융합 단백질 sKlotho-FGF23(R179Q)을 함유하는 조건화된 배지 및 FGF23 및 Klotho의 조합물을 함유하는 조건화된 배지에 의한 유도가 유의하게 향상되었다. 표 1은 Egr-1-루시퍼라제 리포터 분석에서 조건화된 배지에서 다양한 FGF-Klotho 융합 폴리펩티드의 상대적인 발현 및 다양한 FGF-Klotho 융합 폴리펩티드에 대응하는 비분획화된 조건화된 배지의 상대적인 활성을 나열한 것이다.
Figure pct00001
또한, 실시예 1에 기재된 정제 절차를 사용하여 Egr-1-루시퍼라제 리포터 분석을 조건화된 배지로부터 정제된 규정된 양의 단백질을 사용하여 수행하였다. 발현된 폴리펩티드를 함유하는 비분획화된 조건화된 배지를 사용하여 얻은 이전의 결과와 일치하게, 정제된 FGF23 및 sKlotho의 조합물 처리는 루시퍼라제 리포터 활성을 유도하지만, 정제된 FGF23 단독 처리는 그렇지 않았다 (도 5a). 정제된 FGF23 및 sKlotho의 조합물로부터의 루시퍼라제 리포터 활성은 또한 정제된 sKlotho의 용량에 의존성이었고, 효과는 헤파린 (20 ㎍/ml)의 존재 하에 향상될 수 있었다. 루시퍼라제 활성에 대한 sKlotho-FGF23-6xHis 융합 폴리펩티드의 효과는 Egr-1-루시퍼라제 리포터 분석에서 약 1.21 nM (1.2배 변화)의 낮은 농도에서 및 적어도 약 19.3 nM 이하 (2.4배 변화)의 농도에서 검출될 수 있었다 (도 5b). 루시퍼라제 활성에 대한 sKlotho-FGF23-6xHis 융합 폴리펩티드의 활성은 헤파린 (20 ㎍/ml)의 존재 하에 유의하게 향상되었다. 헤파린의 존재 하에, 루시퍼라제 활성에 대한 sKlotho-FGF23-6xHis 융합 폴리펩티드의 효과는 약 0.6 nM (2.0배 변화)의 낮은 농도에서 검출될 수 있었다. 그 결과는 정제된 sKlotho-FGF23-6xHis이 EGR-1-luc 리포터 유전자를 용량-의존적으로 유도하였고, sKlotho-FGF23-6xHis 처리를 보여주었다.
실시예 3. 근육 세포에 대한 Klotho 융합 폴리펩티드의 효과를 평가하는 시 험관내 분석.
발현된 Klotho 융합 폴리펩티드의 생물학적 효과를 C2C12 근모세포에 대해 시험하였다. C2C12 근모세포에 대한 IGF-1, FGF2, 또는 sKlotho-FGF23 처리는 근관 성장 및 신호전달 단백질의 인산화를 유발하였다. C2C12 근모세포를 6-웰의 폴리-D-라이신 및 피브로넥틴 코팅 플레이트 내에서 성장 배지 (3부의 DMEM 및 1부의 F12), 10% FBS, 1% Glut; 1% P/S; 1% 리놀산; 0.1% ITS: [인슐린 (10 mg/ml), 트랜스페린 (5.5 mg/ml), 및 셀레늄 (5 ng/ml)]에 40,000 세포/웰의 밀도로 접종하였다. 근모세포가 융합에 도달한 후 (3일), 배지를 분화 배지 (2% 말 혈청; 1% Glut; 1% P/S가 존재하는 DMED)로 변경하였다.
근관 직경 실험을 위해, 융합 배지 (confluent media)가 분화 배지로 변한 지 3일 후에, 세포를 24시간 동안 분화 배지 내에서 덱사메타손 (100 μM)의 부재 또는 존재 하에 IGF-1 (10 nM), FGF2 (20 ng/ml) 또는 sKlotho-FGF23 (20 nM)으로 처리하였다. 처리 종료시에, 세포를 글루타르알데히드 (PBS 중의 5%)로 고정하고, 다수의 형광 영상을 수집하였다. 근관 직경은 비대 또는 위축을 결정하기 위해 Pipeline Pilot 프로그램을 사용하여 측정하였다.
신호전달 단백질 인산화 실험을 위해, 융합 배지를 분화 배지로 변경한 지 3일 후에, 세포를 FBS가 존재하지 않는 DMEM으로 4시간 동안 단식시킨 후, 라파마이신 (40 nM)의 부재 또는 존재 하에 30분 동안 IGF-1 (10 nM), FGF2 (20 ng/ml) 또는 sKlotho-FGF23 (20 nM)으로 처리하였다. 세포를 프로테아제 및 포스파타제 억제제의 존재 하에 RIPA 버퍼 내에 용해시켰다. 웨스턴 블롯 분석을 수행하고, 막을 도면에 나타낸 바와 같이 상이한 항체로 프로빙하고, X-선 필름 상에 현상하고, 스캐닝하였다.
상기 연구 결과는 sKlotho-FGF23이 IGF-1 및 FGF2에 대한 결과와 유사하게 대조군에 비해 근관 직경을 증가시키고 C2C12 근관 비대를 유도함을 보여주었다 (도 5a). 또한, sKlotho-FGF23, IGF-1, 및 FGF2 처리는 근관 직경의 측정을 기초로 하여 덱사메타손에 의해 유도된 근관 위축을 부분적으로 역전시킬 수 있었다. 덱사메타손의 부재 또는 존재 하에 근관 형태 (근관의 두께에 의해 측정됨)에 대해 sKlotho-FGF23과 FGF2 사이에 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. sKlotho-FGF23, IGF-1, 및 FGF2의 비후 효과는 통계학상 유의한 것이었다.
C2C12 근관에 대한 효과와 일치하게, sKlotho-FGF23 융합 단백질 신호전달은 C2C12 근관에서 p70S6K 및 ERK의 인산화를 유도하였지만, AKT 또는 FoxO는 유도하지 않았다 (도 5b). 신호전달에 대한 sKlotho-FGF23의 효과는 FGF2와 유사하였지만, IGF-1과는 상이하였다. sKlotho-FGF23에 의한 ERK 인산화의 정도는 IGF-1 또는 FGF2보다 작은 것으로 관찰되었다. sKlotho-FGF23에 의한 p70S6K의 인산화는 라파마이신 감수성이었다. C2C12 세포를 포함하는 실험에서, 헤파린은 신호전달의 활성화를 위해 필요하지 않았다. 상기 결과는 sKlotho-FGF23 융합 폴리펩티드가 C2C12 근관에서 신호전달을 활성화시켰음을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> Methods of Compositions Using Klotho FGF Fusion Polypeptides <130> 52377-US-NP <160> 45 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5003 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 cgcgcagcat gcccgccagc gccccgccgc gccgcccgcg gccgccgccg ccgtcgctgt 60 cgctgctgct ggtgctgctg ggcctgggcg gccgccgcct gcgtgcggag ccgggcgacg 120 gcgcgcagac ctgggcccgt ttctcgcggc ctcctgcccc cgaggccgcg ggcctcttcc 180 agggcacctt ccccgacggc ttcctctggg ccgtgggcag cgccgcctac cagaccgagg 240 gcggctggca gcagcacggc aagggtgcgt ccatctggga tacgttcacc caccaccccc 300 tggcaccccc gggagactcc cggaacgcca gtctgccgtt gggcgccccg tcgccgctgc 360 agcccgccac cggggacgta gccagcgaca gctacaacaa cgtcttccgc gacacggagg 420 cgctgcgcga gctcggggtc actcactacc gcttctccat ctcgtgggcg cgagtgctcc 480 ccaatggcag cgcgggcgtc cccaaccgcg aggggctgcg ctactaccgg cgcctgctgg 540 agcggctgcg ggagctgggc gtgcagcccg tggtcaccct gtaccactgg gacctgcccc 600 agcgcctgca ggacgcctac ggcggctggg ccaaccgcgc cctggccgac cacttcaggg 660 attacgcgga 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Tyr Tyr Arg Arg Leu 165 170 175 Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr 180 185 190 His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala 195 200 205 Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu Cys Phe 210 215 220 Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp Asn Pro 225 230 235 240 Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala Pro Gly 245 250 255 Ile Arg Gly Ser Pro Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn Leu Leu 260 265 270 Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe Arg Pro 275 280 285 Thr Gln Gly Gly Gln Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp Ile Asn 290 295 300 Pro Arg Arg Met Thr Asp His Ser Ile Lys Glu Cys Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Val Phe Ile Asp Gly Asp 325 330 335 Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Ile Leu Pro Asp Phe 340 345 350 Thr Glu Ser Glu Lys Lys Phe Ile Lys Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala 355 360 365 Leu Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu 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Pro Ala Ser Ala Pro Pro Arg Arg Pro Arg Pro Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Arg Arg Leu Arg 20 25 30 Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Phe Ser Arg Pro 35 40 45 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Phe Gln Gly Thr Phe Pro Asp Gly 50 55 60 Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly Gly Trp 65 70 75 80 Gln Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr His His 85 90 95 Pro Leu Ala Pro Pro Gly Asp Ser Arg Asn Ala Ser Leu Pro Leu Gly 100 105 110 Ala Pro Ser Pro Leu Gln Pro Ala Thr Gly Asp Val Ala Ser Asp Ser 115 120 125 Tyr Asn Asn Val Phe Arg Asp Thr Glu Ala Leu Arg Glu Leu Gly Val 130 135 140 Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly 145 150 155 160 Ser Ala Gly Val Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg Arg Leu 165 170 175 Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr 180 185 190 His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala 195 200 205 Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu Cys Phe 210 215 220 Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp Asn Pro 225 230 235 240 Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala Pro Gly 245 250 255 Ile Arg Gly Ser Pro Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn Leu Leu 260 265 270 Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe Arg Pro 275 280 285 Thr Gln Gly Gly Gln Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp Ile Asn 290 295 300 Pro Arg Arg Met Thr Asp His Ser Ile Lys Glu Cys Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Val Phe Ile Asp Gly Asp 325 330 335 Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Ile Leu Pro Asp Phe 340 345 350 Thr Glu Ser Glu Lys Lys Phe Ile Lys Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala 355 360 365 Leu Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro His Met 370 375 380 Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu Ser Trp 385 390 395 400 Ile Asp Leu Glu Phe Asn His Pro Gln Ile Phe Ile Val Glu Asn Gly 405 410 415 Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr Met Tyr 420 425 430 Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Lys Leu Asp 435 440 445 Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp Gly Phe 450 455 460 Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp 465 470 475 480 Phe Leu Ser Gln Asp Lys Met Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala Leu Phe 485 490 495 Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Lys Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro Glu Asn 500 505 510 Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly Val Val 515 520 525 Asp Asn Tyr Ile Gln Val Asp Thr Thr Leu Ser Gln Phe Thr Asp Leu 530 535 540 Asn Val Tyr Leu Trp Asp Val His His Ser Lys Arg Leu Ile Lys Val 545 550 555 560 Asp Gly Val Val Thr Lys Lys Arg Lys Ser Tyr Cys Val Asp Phe Ala 565 570 575 Ala Ile Gln Pro Gln Ile Ala Leu Leu Gln Glu Met His Val Thr His 580 585 590 Phe Arg Phe Ser Leu Asp Trp Ala Leu Ile Leu Pro Leu Gly Asn Gln 595 600 605 Ser Gln Val Asn His Thr Ile Leu Gln Tyr Tyr Arg Cys Met Ala Ser 610 615 620 Glu Leu Val Arg Val Asn Ile Thr Pro Val Val Ala Leu Trp Gln Pro 625 630 635 640 Met Ala Pro Asn Gln Gly Leu Pro Arg Leu Leu Ala Arg Gln Gly Ala 645 650 655 Trp Glu Asn Pro Tyr Thr Ala Leu Ala Phe Ala Glu Tyr Ala Arg Leu 660 665 670 Cys Phe Gln Glu Leu Gly His His Val Lys Leu Trp Ile Thr Met Asn 675 680 685 Glu Pro Tyr Thr Arg Asn Met Thr Tyr Ser Ala Gly His Asn Leu Leu 690 695 700 Lys Ala His Ala Leu Ala Trp His Val Tyr Asn Glu Lys Phe Arg His 705 710 715 720 Ala Gln Asn Gly Lys Ile Ser Ile Ala Leu Gln Ala Asp Trp Ile Glu 725 730 735 Pro Ala Cys Pro Phe Ser Gln Lys Asp Lys Glu Val Ala Glu Arg Val 740 745 750 Leu Glu Phe Asp Ile Gly Trp Leu Ala Glu Pro Ile Phe Gly Ser Gly 755 760 765 Asp Tyr Pro Trp Val Met Arg Asp Trp Leu Asn Gln Arg Asn Asn Phe 770 775 780 Leu Leu Pro Tyr Phe Thr Glu Asp Glu Lys Lys Leu Ile Gln Gly Thr 785 790 795 800 Phe Asp Phe Leu Ala Leu Ser His Tyr Thr Thr Ile Leu Val Asp Ser 805 810 815 Glu Lys Glu Asp Pro Ile Lys Tyr Asn Asp Tyr Leu Glu Val Gln Glu 820 825 830 Met Thr Asp Ile Thr Trp Leu Asn Ser Pro Ser Gln Val Ala Val Val 835 840 845 Pro Trp Gly Leu Arg Lys Val Leu Asn Trp Leu Lys Phe Lys Tyr Gly 850 855 860 Asp Leu Pro Met Tyr Ile Ile Ser Asn Gly Ile Asp Asp Gly Leu His 865 870 875 880 Ala Glu Asp Asp Gln Leu Arg Val Tyr Tyr Met Gln Asn Tyr Ile Asn 885 890 895 Glu Ala Leu Lys Ala His Ile Leu Asp Gly Ile Asn Leu Cys Gly Tyr 900 905 910 Phe Ala Tyr Ser Phe Asn Asp Arg Thr Ala Pro Arg Phe Gly Leu Tyr 915 920 925 Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Phe Glu Pro Lys Ala Ser Met Lys His Tyr 930 935 940 Arg Lys Ile Ile Asp Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Glu Thr Leu Glu 945 950 955 960 Arg Phe Cys Pro Glu Glu Phe Thr Val Cys Thr Glu Cys Ser Phe Phe 965 970 975 His Thr Arg Lys Ser Leu 980 <210> 45 <211> 974 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 45 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Leu Gly Gly Arg Arg Leu Arg Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ala Gln 20 25 30 Thr Trp Ala Arg Phe Ser Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu 35 40 45 Phe Gln Gly Thr Phe Pro Asp Gly Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala 50 55 60 Ala Tyr Gln Thr Glu Gly Gly Trp Gln Gln His Gly Lys Gly Ala Ser 65 70 75 80 Ile Trp Asp Thr Phe Thr His His Pro Leu Ala Pro Pro Gly Asp Ser 85 90 95 Arg Asn Ala Ser Leu Pro Leu Gly Ala Pro Ser Pro Leu Gln Pro Ala 100 105 110 Thr Gly Asp Val Ala Ser Asp Ser Tyr Asn Asn Val Phe Arg Asp Thr 115 120 125 Glu Ala Leu Arg Glu Leu Gly Val Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser 130 135 140 Trp Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Ala Gly Val Pro Asn Arg Glu 145 150 155 160 Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg Arg Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly 165 170 175 Val Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu 180 185 190 Gln Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe 195 200 205 Arg Asp Tyr Ala Glu Leu Cys Phe Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys 210 215 220 Tyr Trp Ile Thr Ile Asp Asn Pro Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr 225 230 235 240 Ala Thr Gly Arg Leu Ala Pro Gly Ile Arg Gly Ser Pro Arg Leu Gly 245 250 255 Tyr Leu Val Ala His Asn Leu Leu Leu Ala His Ala Lys Val Trp His 260 265 270 Leu Tyr Asn Thr Ser Phe Arg Pro Thr Gln Gly Gly Gln Val Ser Ile 275 280 285 Ala Leu Ser Ser His Trp Ile Asn Pro Arg Arg Met Thr Asp His Ser 290 295 300 Ile Lys Glu Cys Gln Lys Ser Leu Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala 305 310 315 320 Lys Pro Val Phe Ile Asp Gly Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn 325 330 335 Leu Ser Ser Ile Leu Pro Asp Phe Thr Glu Ser Glu Lys Lys Phe Ile 340 345 350 Lys Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala Leu Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser 355 360 365 Phe Gln Leu Leu Asp Pro His Met Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro 370 375 380 Asn Leu Arg Gln Leu Leu Ser Trp Ile Asp Leu Glu Phe Asn His Pro 385 390 395 400 Gln Ile Phe Ile Val Glu Asn Gly Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys 405 410 415 Arg Asp Asp Ala Lys Tyr Met Tyr Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu 420 425 430 Thr Leu Lys Ala Ile Lys Leu Asp Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr 435 440 445 Ala Trp Ser Leu Met Asp Gly Phe Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile 450 455 460 Arg Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp Phe Leu Ser Gln Asp Lys Met Leu 465 470 475 480 Leu Pro Lys Ser Ser Ala Leu Phe Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Lys Asn 485 490 495 Gly Phe Pro Pro Leu Pro Glu Asn Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro 500 505 510 Cys Asp Phe Ala Trp Gly Val Val Asp Asn Tyr Ile Gln Val Asp Thr 515 520 525 Thr Leu Ser Gln Phe Thr Asp Leu Asn Val Tyr Leu Trp Asp Val His 530 535 540 His Ser Lys Arg Leu Ile Lys Val Asp Gly Val Val Thr Lys Lys Arg 545 550 555 560 Lys Ser Tyr Cys Val Asp Phe Ala Ala Ile Gln Pro Gln Ile Ala Leu 565 570 575 Leu Gln Glu Met His Val Thr His Phe Arg Phe Ser Leu Asp Trp Ala 580 585 590 Leu Ile Leu Pro Leu Gly Asn Gln Ser Gln Val Asn His Thr Ile Leu 595 600 605 Gln Tyr Tyr Arg Cys Met Ala Ser Glu Leu Val Arg Val Asn Ile Thr 610 615 620 Pro Val Val Ala Leu Trp Gln Pro Met Ala Pro Asn Gln Gly Leu Pro 625 630 635 640 Arg Leu Leu Ala Arg Gln Gly Ala Trp Glu Asn Pro Tyr Thr Ala Leu 645 650 655 Ala Phe Ala Glu Tyr Ala Arg Leu Cys Phe Gln Glu Leu Gly His His 660 665 670 Val Lys Leu Trp Ile Thr Met Asn Glu Pro Tyr Thr Arg Asn Met Thr 675 680 685 Tyr Ser Ala Gly His Asn Leu Leu Lys Ala His Ala Leu Ala Trp His 690 695 700 Val Tyr Asn Glu Lys Phe Arg His Ala Gln Asn Gly Lys Ile Ser Ile 705 710 715 720 Ala Leu Gln Ala Asp Trp Ile Glu Pro Ala Cys Pro Phe Ser Gln Lys 725 730 735 Asp Lys Glu Val Ala Glu Arg Val Leu Glu Phe Asp Ile Gly Trp Leu 740 745 750 Ala Glu Pro Ile Phe Gly Ser Gly Asp Tyr Pro Trp Val Met Arg Asp 755 760 765 Trp Leu Asn Gln Arg Asn Asn Phe Leu Leu Pro Tyr Phe Thr Glu Asp 770 775 780 Glu Lys Lys Leu Ile Gln Gly Thr Phe Asp Phe Leu Ala Leu Ser His 785 790 795 800 Tyr Thr Thr Ile Leu Val Asp Ser Glu Lys Glu Asp Pro Ile Lys Tyr 805 810 815 Asn Asp Tyr Leu Glu Val Gln Glu Met Thr Asp Ile Thr Trp Leu Asn 820 825 830 Ser Pro Ser Gln Val Ala Val Val Pro Trp Gly Leu Arg Lys Val Leu 835 840 845 Asn Trp Leu Lys Phe Lys Tyr Gly Asp Leu Pro Met Tyr Ile Ile Ser 850 855 860 Asn Gly Ile Asp Asp Gly Leu His Ala Glu Asp Asp Gln Leu Arg Val 865 870 875 880 Tyr Tyr Met Gln Asn Tyr Ile Asn Glu Ala Leu Lys Ala His Ile Leu 885 890 895 Asp Gly Ile Asn Leu Cys Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser Phe Asn Asp Arg 900 905 910 Thr Ala Pro Arg Phe Gly Leu Tyr Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Phe Glu 915 920 925 Pro Lys Ala Ser Met Lys His Tyr Arg Lys Ile Ile Asp Ser Asn Gly 930 935 940 Phe Pro Gly Pro Glu Thr Leu Glu Arg Phe Cys Pro Glu Glu Phe Thr 945 950 955 960 Val Cys Thr Glu Cys Ser Phe Phe His Thr Arg Lys Ser Leu 965 970

Claims (62)

  1. (a) Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 섬유모세포 성장 인자를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, (a)의 폴리펩티드가 (b)의 폴리펩티드의 N-말단에 작동가능하게 연결되는 것인 융합 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, (b)의 폴리펩티드가 (a)의 폴리펩티드의 N-말단에 작동가능하게 연결되는 것인 융합 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 폴리펩티드 및 (b)의 폴리펩티드가 폴리펩티드 링커에 의해 연결되는 것인 융합 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 폴리펩티드 링커가 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 및 서열 18로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 폴리펩티드.
  6. 제4항에 있어서, 폴리펩티드 링커가 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 및 서열 18로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열의 적어도 1개 내지 약 30개 이하의 반복체를 포함하는 것인 융합 폴리펩티드.
  7. 제4항에 있어서, (a)의 폴리펩티드가 펩티드 결합에 의해 상기 폴리펩티드 링커의 N-말단에 연결되고, (b)의 폴리펩티드가 펩티드 결합에 의해 상기 폴리펩티드 링커의 C-말단에 연결되는 것인 융합 폴리펩티드.
  8. 제4항에 있어서, (a)의 폴리펩티드가 펩티드 결합에 의해 상기 폴리펩티드 링커의 C-말단에 연결되고, (b)의 폴리펩티드가 펩티드 결합에 의해 상기 폴리펩티드 링커의 N-말단에 연결되는 것인 융합 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, Klotho 단백질의 세포외 하위도메인이 KL-D1 도메인 또는 KL-D2 도메인인 융합 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 폴리펩티드가 Klotho 단백질의 적어도 2개의 세포외 하위도메인을 포함하는 것인 융합 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, Klotho 단백질의 2개의 세포외 하위도메인이 직렬 반복되는 2개의 KL-D1 도메인인 융합 폴리펩티드.
  12. 제10항에 있어서, Klotho 단백질의 2개의 세포외 하위도메인이 직렬 반복되는 2개의 KL-D2 도메인인 융합 폴리펩티드.
  13. 제10항에 있어서, Klotho 단백질의 2개의 세포외 하위도메인이 KL-D1 도메인 및 KL-D2 도메인인 융합 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 폴리펩티드가 Klotho 단백질의 세포외 도메인인 융합 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩티드를 추가로 포함하는 융합 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 신호 펩티드가 Klotho 신호 펩티드인 융합 폴리펩티드.
  17. 제15항에 있어서, 신호 펩티드가 IgG 신호 펩티드인 융합 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유모세포 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 융합 폴리펩티드.
  19. 제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, Klotho 단백질이 알파-Klotho인 융합 폴리펩티드.
  20. 제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, Klotho 단백질이 베타-Klotho인 융합 폴리펩티드.
  21. 제19항에 있어서, 섬유모세포 성장 인자가 섬유모세포 성장 인자-23인 융합 폴리펩티드.
  22. 제19항에 있어서, 섬유모세포 성장 인자가 섬유모세포 성장 인자-23 변이체 (R179Q)인 융합 폴리펩티드.
  23. 제20항에 있어서, 섬유모세포 성장 인자가 섬유모세포 성장 인자-19인 융합 폴리펩티드.
  24. 제20항에 있어서, 섬유모세포 성장 인자가 섬유모세포 성장 인자-21인 융합 폴리펩티드.
  25. 제1항에 있어서, 서열 19의 아미노산 서열에 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  26. 제1항에 있어서, 서열 20의 아미노산 서열에 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  27. 제1항에 있어서, 서열 40의 아미노산 서열에 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  28. 제1항에 있어서, 서열 41의 아미노산 서열에 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  29. 제1항에 있어서, 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩티드.
  30. 제1항에 있어서, 서열 20의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩티드.
  31. 제1항에 있어서, 서열 40의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩티드.
  32. 제1항에 있어서, 서열 41의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩티드.
  33. 제1항에 있어서, 서열 5에 제시된 아미노산 서열에 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  34. 제1항에 있어서, 서열 6에 제시된 아미노산 서열에 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  35. 제1항에 있어서, 서열 7에 제시된 아미노산 서열에 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  36. 제1항에 있어서, 서열 35에 제시된 아미노산 서열에 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  37. 제1항 내지 36항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  38. 제1항 내지 36항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산.
  39. 제38항의 핵산을 함유하는 숙주 세포.
  40. 제38항의 핵산을 포함하는 벡터.
  41. (a) Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 섬유모세포 성장 인자를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 치료 유효 용량의 제약 조성물을 노화-관련 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 노화-관련 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 노화-관련 병태가 근감소증, 피부 위축, 근육 쇠약, 뇌 위축, 죽상경화증, 동맥경화증, 폐기종, 골다공증, 골관절염, 면역부전, 고혈압, 치매, 헌팅턴 (Huntington) 병, 알츠하이머 (Alzheimer) 병, 백내장, 노화-관련 황반 변성, 전립선암, 뇌졸중, 기대 수명 감소, 기억 상실, 주름, 신장 기능 손상, 및 노화-관련 난청으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, Klotho 단백질이 알파 Klotho 단백질인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 노화-관련 병태가 근육 쇠약이고, Klotho 단백질이 알파 Klotho 단백질이고, 섬유모세포 성장 인자가 섬유모세포 성장 인자 23인 방법.
  45. (a) Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 섬유모세포 성장 인자를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 치료 유효 용량의 제약 조성물을 대사 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 대사 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 대사 장애가 II형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈당증, 및 비만으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 융합 폴리펩티드가 (a) 베타-Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 섬유모세포 성장 인자 21을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  48. (a) Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 섬유모세포 성장 인자를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 치료 유효 용량의 제약 조성물을 고인산혈증 또는 석회증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 고인산혈증 또는 석회증을 치료 또는 예방하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 융합 폴리펩티드가 (a) 알파 Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 섬유모세포 성장 인자 23을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  50. (a) Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 섬유모세포 성장 인자를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 치료 유효 용량의 제약 조성물을 만성 신장병 또는 만성 신부전증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 만성 신장병 또는 만성 신부전증을 치료 또는 예방하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, Klotho 단백질이 알파 Klotho 단백질인 방법.
  52. (a) Klotho 단백질의 적어도 하나의 세포외 하위도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 섬유모세포 성장 인자를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 치료 유효 용량의 제약 조성물을 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법
  53. 제52항에 있어서, 암이 유방암인 방법.
  54. 제52항에 있어서, Klotho 단백질이 알파 Klotho 단백질인 방법.
  55. 제1항 내지 36항 중 어느 한 항에 있어서, Klotho 단백질이 인간 Klotho 단백질인 융합 폴리펩티드.
  56. 제37항에 있어서, 헤파린을 추가로 포함하는 제약 조성물.
  57. 제41항 내지 54항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 유효 용량의 헤파린을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  58. 제41항 내지 54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 인간인 방법.
  59. 제1항 내지 36항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 융합 폴리펩티드.
  60. 제1항 내지 36항 중 어느 한 항에 있어서, 근육 위축을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 융합 폴리펩티드.
  61. 서열 7, 서열 44, 또는 서열 45의 가용성 Klotho 단백질을 포함하는 치료 유효 용량의 제약 조성물을 근육 위축의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하거나 필수적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 구성되는, 근육 위축을 치료 또는 예방하는 방법.
  62. (1) 서열 7, 서열 44, 또는 서열 45의 가용성 Klotho 단백질, 및 (2) 링커를 포함하는 치료 유효 용량의 제약 조성물을 근육 위축의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하거나 필수적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 구성되는, 근육 위축을 치료 또는 예방하는 방법.
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