KR20100110841A

KR20100110841A - 배합물

Info

Publication number: KR20100110841A
Application number: KR1020107016586A
Authority: KR
Inventors: 프레드릭 닐슨; 칼 요한 브링크
Original assignee: 바이오인벤트 인터내셔날 에이비
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2008-12-22
Publication date: 2010-10-13
Also published as: NZ586303A; US20090169544A1; JP2011507922A; WO2009083225A8; UA100255C2; WO2009083225A2; AU2008342942A1; US20110014203A1; CN101951885A; RU2470628C2; WO2009083225A3; IL206467A0; RU2010131482A; BRPI0821600A2; CA2710775A1; EP2240156A2; ZA201004439B

Abstract

SEQ ID No: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID No: 4의 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체 및 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제, 캐리어 또는 부형제를 포함하며, pH 4-6을 갖는 안정한, 수성 약학 조성물.

Description

배합물{FORMULATION}

본 발명은 약학 조성물에 관한 것으로, 상세하게는, 아테롬성 동맥 경화증의 치료에 유용한 산화 LDL에 바인딩하는 항체의 안정한, 수성 약학 조성물에 관한 것이다.

아테롬성 동맥 경화증은 흡연, 고혈압, 진성 당뇨병, 과다콜레스테롤, 증강된 혈장 저밀도 리포단백질(LDL) 및 트리글리세라이드, 고피브리노겐혈증 및 고혈당증을 포함하는 생화학적 위험 인자가 존재하는 환자에서 우선적으로 생기는 다인성 질병이다. 아테롬성 동맥 경화증은 대 및 중간 크기 동맥의 가장 안쪽층(내막(intima))의 비후를 유발하는 만성 질병이다. 이는 혈류를 감소시키며 영향을 받은 혈관에 의해 공급되는 기관에서 국소성 빈혈 및 조직 파괴를 야기할 수 있다. 아테롬성 동맥 경화증 병변(atherosclerotic lesions)은 사람에서 수십년에 걸쳐 발생되고 있으며, 이는 관상동맥, 뇌허혈 및 혈전 색전증 질병, 및 심근 및 뇌 경색과 같은 합병증을 일으킨다.

아테롬성 동맥 경화증은 급성 심근 경색, 뇌졸증 및 말초동맥질화의 주요 원인이다. 심혈관 질병은 산업화된 나라에서 질병률 및 사망률의 주요 원인이며, 신흥 부상국에서 끊임없이 일어나며, 관상동맥 아테롬성 동맥 경화증이 주요 근본적인 병리학이다. 아테롬성 동맥 경화증의 현재 치료법은 질병 발달 및 합병증 억제에 완전히 효과적이지 못하다.

상기 질병은 혈관의 세포외 매트릭스내에 리포단백질, 주로 LDL의 축적에 의해 개시된다. 이러한 LDL 입자들은 응집되고 산화적 변형을 겪는다. 산화된 LDL은 독성적이며 혈관 장해를 일으킨다. 아테롬성 동맥 경화증은 다수 측면에서 염증 및 섬유증을 포함하는 이러한 장해에 대한 반응을 대표한다.

고 혈장 수준의 콜레스테롤, 특히 고수준의 LDL은 일반적으로 아템롬성 동맥 경화증 발달에 강력한 영향력이 있으며, 반면에 고수준의 고밀도 리포단백질(HDL)은 아테롬성 동맥 경화증 발달에 대응하는 것으로 일반적으로 인식되어 있다. HDL은 결과적으로 좋은 콜레스테롤로 불리며, 한편 LDL은 나쁜 콜레스테롤로 불린다. 간략히, LDL은 조직에 콜레스테롤을 운반하나, HDL은 조직으로부터 콜레스테롤을 흡수하고 이를 간으로 운반하여 간에서 분해된다. LDL을 감소시키고 HDL을 증가시키는 치료 전략이 아테롬성 동맥 경화증의 치료를 위한 개발중에 있다.

ApoB-100은 LDL의 단백질 성분이며, 이는 사람 혈청내의 콜레스테롤의 주요 캐리어이다. LDL의 산화는 아테롬을 발생시키는(아테로제닉) 파티클로의 전환에서 필수적인 단계이며, 산화적 변형은 가장 이른 가시적인 아테롬성 동맥 경화증 병변인 지방선(fatty streaks)의 초기 형성을 유도한다.

산화된 LDL에 바인딩하는 방사성 동위원소 표지 형태의 항체가 또한 실험 동물에서 아테롬성 동맥 경화증 병변의 방사면역측정법에 유용할 수 있다(Tsimikas et al, 2000). ¹²⁵요오드-표지 항-MDA 리신 에피토프 항체가 마우스와 토끼에서 플라크를 검출하는데 사용되었으며, 주입된 항체는 대동맥에서 플라크에 위치되는 것으로 확인되었다.

사람 항체는 n-CoDeR^®이라 불리는 재조합 항체 프레그먼트 라이브러리로부터 개발되었으며, 이는 사람 ApoB-100으로부터 유도된 산화 펩타이드에 대한 것이었다(WO 02/080954). 이러한 재조합 항체들 뿐만 아니라, 다른 산화 LDL 에피토프에 대한 항체들은 동물 모델에서 플라크 형성을 현저히 저해하며, 아테롬성 동맥 경화증 병변의 발달을 억제하는 것으로 나타났다(Schiopu et al, 2004; WO 2004/030607; US 6,716,410).

후속적으로, WO 2004/030607에 개시된 산화 ApoB-100에 바인딩하는 항체들, 특히 IEI-E3, LDO-D4, KTT-B8 및 2-DO3는 처리 수주후 대동맥에서 전에 존재하는 확립된 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 퇴행을 활성적으로 유도하는 것으로 나타났다. 이러한 항체들은 질병 진행을 되돌려 플라크 존재량을 감소시키는 진전된 아테롬성 동맥 경화증의 치료를 위해서 뿐만 아니라, 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질병의 치료를 위해 제안되어 왔다. 따라서, 모노클로날 항체 치료를 이용한 산화 LDL 표적은 서양에서 주요 사망 원인의 일부에 대해 점점 더 매력적인 처리 양상이다.

기존에 존재하는 플라크의 퇴행을 유도하는데 가장 효과적인 WO 2007/025781에서의 항체는 항체 2D03이었다. 항체 2D03의 V_H 및 V_L은 WO 2004/030607의 도 3에 주어지며, 항체 2D03의 CDR 서열은 WO 2007/025781의 표 2에 열거되어 있다. 당 기술분야에 잘 알려진 바와 같이, 안정한 제형은 약물 분배 및 보관이 간단하며, 이에 따라 약학 산업 및 환자 모두에 있어 비용이 감소된다(Lucas et al (2004) Pharmaceutical Technology, July 2004 Issue, pp: 69-72). 치료학적 용도에 적합한 항체 2D03을 포함하는 안정한 약학 배합물이 당 기술분야에 요구된다.

지난 수년간, 생명공학기술의 발전은 재조합 DNA 기술을 이용한 약학적 적용에 있어 항체와 같은 다양한 단백질의 생성을 가능케 하였다. 단백질은 통상적인 유기 및 무기 약물보다 크고 복잡하기 때문에(즉, 복잡한 3차원 구조에 부가적으로 다작용기를 가짐), 이러한 단백질의 안정한 배합물은 특별한 문제를 제기한다. 항체와 같은 단백질에 있어서 생물학적 활성을 유지하기 위해, 배합물은 단백질의 아미노산의 적어도 코어 서열의 온전한 형태학적 완전성을 보존해야하며, 이와 동시에 단백질의 작용기가 분해되지 않도록 보호해야한다. 단백질의 분해 경로는 화학적 불안정성(즉, 새로운 화학적 엔티티를 생성하는 결합 형성 또는 분할에 의한 단백질의 변형과 관련된 어느 프로세스) 또는 물리적 불안정성(즉, 보다 높은 순위 구조의 단백질로 변화하는 것)과 관련될 수 있다. 화학적 불안정성은 탈아미드화, 라세미화, 가수분해, 산화, 베타 제거 또는 이황화 교환으로부터 발생할 수 있다. 물리적 불안정성은 예를 들어, 변성, 응집, 침전 또는 흡착으로부터 발생할 수 있다. 3가지 가장 일반적인 단백질 분해 경로는 단백질 응집, 탈아미드화 및 산화이다(Cleland et al (1993) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377).

항체 조성물의 안정성을 증가시키기위한 다수의 배합물이 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,171,586호에는 항체를 안정화하는 작용을 하는 폴리올 및 계면활성제를 함유하며, 소디움 클로라이드를 함유하지 않는 배합물이 기술되어 있다.

놀랍게도 그리고 예기치않게, 본 발명자들은 항체 2D03가 기존의 n-CoDeR^® 생성 항체 산물과 다른 용해도 특성을 나타냄을 발견하였다. 전형적으로, 150mM NaCl을 함유하는 pH 7-7.5의 10-20mM 포스페이트 버퍼는 n-CoDeR^® 생성 항체 산물의 안정한 배합물을 생성한다.

n-CoDeR^® 프래임워크를 갖는 다른 항체들과 비교하여, 본 발명자들은 2D03이 pH 6.0이상에서 응집되는 것을 발견하였다. pH 4이하는 환자에게 정맥내 또는 피하 투여용 조성물로 부적합하기 때문에, 본 발명자들은 보관시 유용한 기간동안 안정하며, 환자에게 정맥내 또는 피하 투여용으로 안정한 항체 2D03을 함유하는 조성물에 대해 좁은 pH 윈도를 발견하였다.

또한, 2D03의 한외여과에 의한 농축 또는 버퍼 교환은 저 전도성(100mM 미만의 NaCl 등가물)의 용액에서 수행시 응집물을 생성하였다. 초기 연구는 pH가 pH 5.5로 유지되고, 150mM NaCl이 포함된 경우, 항체 2D03 산물이 적어도 160mg/ml로 농축될 수 있음을 보여주었다.

초기 시험에서, 폴리소르베이트 20, 아르기닌, 히스티딘, 글루탐산 및 만니톨과 같은 표준 첨가제들의 첨가에 의한 2D03의 안정성을 증가시키려는 시도는 충분히 효과적이지 못하였다.

따라서, 본 발명의 제 1 견지는 항체 2D03 및 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제, 캐리어 또는 부형제를 포함하며, 조성물은 pH 4-6을 갖는 수성 약학 조성물을 제공한다.

2D03은 완전히 산화 LDL에 대한 휴먼 모노클로날 IgG₁ 항체이다. 항체 2D03의 중쇄 및 경쇄를 암호하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 도 1에 주어지며, 각각 SEQ ID No: 1 및 SEQ ID No: 2로 표시된다. 항체 2D03의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 도 2에 주어지며, 각각 SEQ ID No: 3 및 SEQ ID No: 4로 표시된다.

따라서, 본 발명의 이러한 견지는 SEQ ID NO: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID: 4의 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체 및 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제, 캐리어 또는 부형제를 포함하며, 조성물은 pH 4-6을 갖는 수성 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 아테롬성 동맥 경화증의 치료에 유용한 산화 LDL에 바인딩하는 항체의 안정한, 수성 약학 조성물이 제공된다.

도 1은 2D03 중쇄(SEQ ID No: 1) 및 경쇄(SEQ ID No: 2)를 암호하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 2는 도 1에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열로 암호화된 2D03 중쇄(SEQ ID No: 3) 및 경쇄(SEQ ID No: 4)의 아미노산 서열을 나타낸다.

상기 약학 조성물내 항체는 항체를 생성하는 분야에 잘 알려진 어느 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 재조합 항체를 생성하는 예시적인 방법은 이하 보다 자세히 기술된다.

용어 "약학 조성물"은 당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 활성 성분(즉, 항체 2D03)의 생물학적 활성이 효과적일 수 있는 형태로 존재하며, 조성물을 투여받는 환자에게 독성적인 부가 성분들을 함유하지 않는 제조물을 칭한다. 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제, 캐리어 및 부형제는 사용되는 활성 성분의 효과적인 투여량을 제공하도록 환자에게 합리적으로 투여될 수 있는 것들이며, 당 기술분야에 잘 알려져 있다.

항체를 포함하는 약학 조성물의 안정성이 평가될 수 있는 다수의 방법이 있으며, 이의 여러 방법을 하기 실시예 2 및 3에 상세히 기재하였다. 예를 들어, 항체-함유 약학 조성물의 안정성은 예를 들어, 크기-배제 크로마토그래피, 이온 크로마토그래피 및/또는 SDS-PAGE에 의해 이의 순도를 측정함으로써 검출될 수 있다. 부가적으로 또는 택일적으로, 상기 항체-함유 약학 조성물의 안정성은 육안으로 평가되거나 410nm에서의 광 산란에 의해 평가되는 이의 외관에 의해 측정될 수 있다. 또한 부가적으로 또는 택일적으로, 상기 약학 조성물의 안정성은 항체 2D03의 활성을 참조하여, 전형적으로 항체 2D03의 항원 바인딩 활성(예, MDA-ApoB100에 바인딩하는 능력)을 참조하여 측정될 수 있다. 따라서, "안정한" 약학 조성물이란, 항체가 보관 후(특정 시간동안, 특정 조건하에) 명시된 바와 같이 보관되지 않은 항체에 비해, 이의 MDA-ApoB100에 대한 바인딩 능력의 적어도 50%를 유지하는 것을 의미한다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 이의 MDA-ApoB100에 대한 바인딩 능력의 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95%를 유지한다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 명시된 시간 동안, 그리고 하기에 주어진 조건하에서 명시된 바와 같이 보관된 후 이의 MDA-ApoB100에 대한 바인딩 능력의 적어도 99% 또는 100%를 유지한다.

"안정한 약학 항체 제조물"이란, 명시된 시간 동안, 그리고 하기에 주어진 조건하에서 명시된 바와 같이 보관된 후, 항체 제조물의 순도가 본래의 모노머릭 항체의 적어도 90%, 보다 바람직하게 본래의 모노머릭 항체의 95%이상, 특히 본래의 모노머릭 항체의 96% 또는 97%, 또는 98% 또는 99%이상임을 의미하는 것을 포함한다. 바람직하게, 보관 후 항체 제조물의 순도는 첨부된 실시예에 기술된 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 검출 및/또는 측정된다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 이러한 견지의 약학 조성물은 안정한 약학 조성물이다. 전형적으로, 상기 조성물은 약 2-8℃의 보관 온도에서 적어도 4주간 안정하다. 유리하게, 상기 약학 조성물은 약 2-8℃에서 적어도 8주간 안정하다. 보다 바람직하게, 상기 약학 조성물은 약 2-8℃에서 적어도 14주간 또는 그 이상동안 안정하다. 보다 바람직하게, 상기 약학 조성물은 약 2-8℃에서 적어도 12개월간, 편리하게 적어도 1.5년간, 그리고 유리하게 적어도 3년간 안정하다. 보다 유용하게 상기 약학 조성물은 적어도 4 또는 5년간 안정하다. 전형적으로, 상기 약학 조성물은 조성물의 동결 및 해동 후 안정하다.

적절히, 상기 약학 조성물은 약 24℃에서(예, 25℃에서) 적어도 4주간, 그리고 보다 바람직하게 적어도 8주간이상 안정하다. 첨부된 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 약학 조성물은 25℃에서 6개월간 안정할 수 있다.

본 발명의 구현으로, 상기 약학 조성물은 4.1, 또는 4.2, 또는, 4.3, 또는 4.4, 또는 4.5, 또는 4.6, 또는 4.7, 또는 4.8, 또는 4.9의 최소 pH, 및 6.0의 최대 pH를 갖는다.

다른 구현으로, 상기 약학 조성물은 5.9, 또는 5.8, 또는 5.7, 또는 5.6, 또는 5.5, 또는 5.4, 또는 5.3, 또는 5.2, 또는 5.1의 최대 pH, 및 4의 최소 pH를 갖는다.

다른 구현으로, 상기 약학 조성물은 5.9, 또는 5.8, 또는 5.7, 또는 5.6, 또는 5.5, 또는 5.4, 또는 5.3, 또는 5.2, 또는 5.1의 최대 pH, 및 4.5의 최소 pH를 갖는다.

일 구현으로, 상기 약학 조성물은 4.9-5.1의 pH, 그리고 보다 구체적으로 5.0의 pH를 갖는다.

다른 구현으로, 상기 약학 조성물은 예를 들어, pH 5.0-5.9, pH 5-5.8, pH 5-5.7, 또는 pH 5.0-5.6과 같이 5-6의 pH를 갖는다. 보다 특정한 구현으로, 상기 약학 조성물은 5.4-5.6의 pH, 그리고 보다 구체적으로 약 5.5의 pH를 갖는다.

원하는 pH를 유지하기 위해, 상기 약학 조성물은 버퍼를 포함하는 것으로 인식될 것이다. 본 명세서에 사용된 "버퍼"는 이의 산-염기 결합 성분의 작용에 의해 pH 변화에 견디는 완충 용액을 칭한다. 본 발명의 버퍼는 약 4-6의 pH 범위; 바람직하게 약 4.5-5.8의 pH 범위; 보다 바람직하게 약 4.8-5.6의 pH 범위; 그리고 가장 바람직하게 5.0-5.6의 pH를 갖는다. 이러한 범위내 pH를 조절하는 버퍼의 예는 아세테이트(예, 소디움 아세테이트), 숙시네이트(소디움 숙시네이트와 같은), 글루코네이트, 시트레이트 및 다른 유기산 버퍼들을 포함한다. 바람직하게, 상기 버퍼는 포스페이트 버퍼가 아니며, 특히 동결-해동 안정한 배합물이 원하여지는 경우에 그러하다.

상기 버퍼 농도는 약 1-50mM, 적절히 약 5-40mM, 그리고 바람직하게 약 10-30mM일 수 있으며, 이는 예를 들어 배합물의 버퍼 및 원하는 등장성에 따라 달라진다.

바람직한 구현으로, 상기 약학 조성물은 아세테이트 버퍼를 포함한다. 전형적으로, 상기 아세테이트는 5-30mM, 그리고 보다 바람직하게 10-30mM로 존재한다. 보다 특정 구현으로, 상기 아세테이트는 약 20mM로 존재한다.

일 구현으로, 상기 약학 조성물은 또한 소디움 클로라이드를 포함한다. 상기 소디움 클로라이드는 약 50-200mM, 적절히 약 100-200mM, 그리고 바람직하게 약 150mM로 존재할 수 있다.

부가적으로 또는 소디움 클로라이드 대신에, 상기 약학 조성물은 다른 염 및/또는 아미노산을 더 포함할 수 있다.

전형적으로, 상기 항체는 예를 들어, 25-150mg/ml과 같이 10-200mg/ml의 농도로 상기 약학 조성물에 존재한다. 특정 구현으로, 상기 항체는 약학 조성물에 25±10mg/ml, 120±20mg/ml, 또는 약 150±10mg/ml로 존재한다. 예를 들어, 상기 항체는 약학 조성물에 10mg/ml 또는 20mg/ml 또는 30mg/ml 또는 40mg/ml 또는 50mg/ml 또는 60mg/ml 또는 70mg/ml 또는 80mg/ml 또는 90mg/ml 또는 100mg/ml 또는 110mg/ml 또는 120mg/ml 또는 130mg/ml 또는 140mg/ml 또는 150mg/ml 또는 160mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 바람직하게, 상기 항체는 약학 조성물에 100mg/ml미만 또는 50mg/ml미만 또는 25mg/ml미만과 같이 160mg/ml미만의 농도로 존재한다.

본 발명의 바람직한 구현은 ml당

상기 정의한 바와 같은 항체 15-160mg;

소디움 클로라이드 8.77mg;

소디움 아세테이트-3 하이드레이트 2.35mg;

아세트산 0.16㎕;

pH 5.5로 맞춘 양(즉, pH 5.5의 최종 pH에 맞는 양)의 소디움 히드록시드; 및

1ml(즉, 최종 체적)까지 맞춘 양의 물

을 포함하는 안정한, 수성 약학 조성물을 제공한다.

상기 항체는 25±10mg/ml, 120±10mg/ml, 또는 약 150±10mg/ml의 농도로 존재할 수 있다.

다른 바람직한 구현으로, 본 발명은

청구항 1에 정의된 항체 25mg/ml;

소디움 아세테이트 20mM;

소디움 클로라이드 150mM;

pH 5.5로 맞춘 양(즉, pH 5.5의 최종 pH에 맞는 양)의 소디움 히드록시드;

≥95% 순도

를 포함하는 안정한, 수성 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물은 또한 보존제를 포함할 수 있다. "보존제"는 그 안에서 박테리아 작용을 본질적으로 감소시키기 위해 배합물내에 포함될 수 있는 화합물이며, 이에 따라, 예를 들어 다용도 배합물의 생성을 촉진할 수 있다.

잠재적 보존제의 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드(알킬기가 긴사슬 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드들의 혼합물), 및 벤즈에토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 타입의 보존제는 페놀, 부틸 및 벤질 알코올과 같은 방향족 알코올, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레조시놀, 시클로헥사놀, 3-펜타놀, 및 m-크레졸을 포함한다. 바람직한 보존제는 벤질 알코올이다. 그러나, 실시예 3에서 배합물은 멸균되고 박테리아 및 균류(곰팡이) 오염이 없는 것으로 나타났기 때문에 보존제가 필요없을 수 있다는 것이 인식된다.

상기 약학 조성물은 특정 구현으로 또한 폴리올을 포함할 수 있는 것으로 인식된다. "폴리올"은 다중 히드록실기를 갖는 물질이며, 당(환원 및 비환원당), 당 알코올 및 당산을 포함한다. 전형적인 폴리올은 약 600kD미만(예, 약 120-400kD 범위)의 분자량을 갖는다. "환원당"은 금속이온을 환원시킬 수 있거나 단백질내 리신 및 다른 아미노기와 공유적으로 반응할 수 있는 헤미아세탈기를 함유하는 것이며, 그리고 "비환원당"은 이러한 환원당의 특성을 갖지 않는 것이다. 환원당의 예는 프룩토즈, 만노즈, 말토즈, 락토즈, 아라비노즈, 자일로즈, 리보즈, 람노즈, 갈락토즈 및 글루코즈이다. 비환원당은 수크로즈, 트레할로즈, 소르보즈, 멜레지토즈 및 라피노즈를 포함한다. 자일리톨, 트레이톨, 소르비톨 및 글리세롤은 당 알코올의 예이다. 수크로즈 및 트레할로즈와 같은 비환원당이 특정 환경에서 바람직한 폴리올일 수 있다.

상기 약학 조성물은 특정 구현으로 당 기술분야에 다수가 잘 알려져 있는 계면활성제를 또한 포함할 수 있는 것이 또한 인식된다. 예시적인 계면활성제는 폴록사머(예, 폴록사머 188)를 포함한다. 첨가될 수 있는 계면활성제의 양은 항체의 응집을 감소시키며 그리고/또는 배합물내 입자의 형성을 최소화하는 정도이다. 예를 들어, 계면활성제는 배합물내에 약 0.001-0.2%, 바람직하게 약 0.01-0.1%의 양으로 존재할 수 있다.

일 구현으로, 상기 조성물은 폴리올 및/또는 계면활성제를 포함하지 않는다.

본 발명의 일 구현으로, 상기 약학 조성물은 폴리소르베이트 20, 아르기닌, 히스티딘, 글루타믹산 및 만니톨로부터 선택된 첨가제를 포함하지 않는다.

일 구현으로, 본 발명은 항체가 95%이상의 순도로(예, 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 또는 100%와 같은 그 이상) 제공되는 약학 조성물을 제공한다.

환자에게 생체내 투여를 위해 사용되는 상기 약학 조성물은 바람직하게 멸균된 것이다. 이는 예를 들어, 0.22㎛ 멸균 필터를 통해 여과시킴으로써 쉽게 수행된다.

상기 약학 조성물은 피하 또는 정맥내 투여용으로 배합될 수 있다. 특정 구현으로, 특히 정맥내 투여용으로 배합될 경우, 상기 약학 조성물은 등장성인 것이 바람직하다. "등장성"이란 관심있는 배합물이 사람 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는 것을 의미한다. 등장성 배합물은 일반적으로 약 250-350mOsm의 삼투압을 가질 것이다. 등장성은 예를 들어, 증기압 또는 제빙 타입 삼투압계를 이용하여 측정될 수 있다.

일 구현으로, 상기 항체를 포함하는 약학 조성물은 사전 동결건조되지 않는다.

SEQ ID No: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID No: 4의 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체를 갖는 항체와 같이, 항체를 제조하는 방법은 당 기술분야에 잘 알려져 있다.

간략히, 항체 2D03의 재조합 생성을 위해, 이를 암호하는 폴리뉴클레오타이드(도 1)가 발현을 위해 복제가능한 벡터내로 삽입된다. 다수의 적절한 발현 벡터가 이용가능하다. 상기 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 오리진, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 엘리먼트, 프로모터 및 전사종결 서열을 포함한다.

글리코실화 항체의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 식물 및 곤충 세포들이 적절한 숙주 세포이나, 상기 숙주 세포는 척추동물 세포인 것이 바람직하며, 조직배양시 척추동물 세포의 증식은 통상적인 공정으로 이루어진다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 COS-7, CV1, VERO-76, HEK293, BHK, CHO, TM4, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, MMT, TRI, MRC5, NSO 및 FS4이다.

숙주 세포는 항체 생성을 위해 발현 벡터로 트랜스팩팅되고, 프로모터 도입, 트랜스팩턴트 선택 또는 상기 항체 서열을 암호하는 유전자 증폭을 위해 적절히 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 상기 항체를 생성하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 잘 알려진 상업적으로 이용가능한 배지에서 배양될 수 있으며, 이는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 염, 버퍼, 뉴클레오타이드, 항생제, 미량원소 및 글루코즈와 같은 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 다른 필요한 보충성분들이 또한 적절한 농도로 포함될 수 있으며, 이는 당 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 또한 당 기술분야에 잘 알려져 있다.

재조합 기술을 이용할 경우, 상기 항체는 원형질내에 세포내적으로 생성되거나 배지내로 직접 분비될 수 있다. 만일 상기 항체가 세포내적으로 생성되는 경우, 제1단계로서 숙주 세포 또는 용해된 세포의 미립성 찌꺼기를 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 항체가 배지내로 분비될 경우, 이러한 발현 시스템의 상층액은 일반적으로 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon ultrafiltration unit와 같이 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터를 이용하여 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 인히비터가 단백질 가수분해를 억제하기 위해 앞선 어느 단계들에 포함될 수 있으며, 항생제가 외래성 오염물의 성장을 예방하기 위해 포함될 수 있다.

상기 세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있으며, 친화 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 어느 면역글로블린 Fc 도메인의 종 및 아이소타이프에 따라 달라진다. 단백질 A는 휴먼 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄에 기초한 항체를 정제하는데 사용될 수 있다(Lindmark et al, (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13). 친화 리간드가 결합되는 매트릭스는 대부분 종종 아가로즈이지만, 다른 매트릭스가 이용가능하다. 제어된 포어 글래스 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로즈로 달성될 수 있는 것보다 빠른 유속 및 보다 짧은 공정 시간을 제공할 수 있다. 단백질 정제에 유용한 다른 기술은 이온-교환 컬럼상에서의 분획, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상에서의 크로마토그래피, 헤파린 Sepharoset^TM에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(폴리아스파틱산 컬럼과 같은)상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 암모늄 설페이트 침전을 포함한다.

바람직하게, 배합되는 상기 항체 2D03은 본질적으로 순수하며, 바람직하게 본질적으로 균질하다(즉, 오염 단백질이 함유되지 않음). "본질적으로 순수한" 항체 배합물이란 조성물내 단백질의 총 중량을 기준으로 적어도 90중량%, 바람직하게 적어도 95중량%의 항체를 포함하는 조성물을 의미한다. "본질적으로 균질한" 항체 배합물이란 조성물내 총 단백질 중량을 기준으로 적어도 99중량%의 항체를 포함하는 조성물을 의미한다.

본 발명의 제 2 견지로, 본 발명의 제 1 견지에 정의된 상기 안정한, 수성 약학 배합물을 보유하는 멸균 용기를 포함하는 제조물품이 제공된다. 상기 제조물품은 일회용 주사기, 병 또는 바이얼 등일 수 있다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 예시적인 용기는 3-20ml 일회용 유리 바이얼이다. 택일적으로, 상기 용기는 3-100ml 유리 바이얼일 수 있다. 상기 용기는 상기 조성물을 수용하며, 임의로 상기 용기상의 또는 이와 결합된 라벨은 사용법이 표기될 수 있다. 상기 제조물품은 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘 및 사용 지침이 담긴 포장 삽입물을 포함하는 상업적이며 사용자의 견지에서 원하여질 수 있는 다른 물질들을 더 포함할 수 있다.

WO 2004/030607 및 WO 2007/025781에 기술된 바와 같이, 항체 2D03은 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 퇴행을 억제 및 유도하는 능력을 모두 갖는다. 따라서, 본 발명의 제 3 견지는 환자에서 아테롬성 동맥 경화증 또는 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질병을 치료 및/또는 예방 및/또는 감소 및/또는 퇴치하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 제 1 견지와 관련하여 상기 정의된 약학 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 정황상, 항체의 "치료 유효량"은 아테롬성 동맥 경화증 또는 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질병의 예방 또는 치료에 효과적인 양을 칭한다.

본 발명은 환자에서 아테롬성 동맥 경화증 또는 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질병을 치료 및/또는 예방 및/또는 감소 및/또는 퇴치하기 위해, 본 발명의 제 1 견지에 정의된 약학 조성물의 제조시, 2D03, 즉, SEQ ID No: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID No: 4의 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체의 사용을 포함한다.

본 발명은 또한 환자에서 아테롬성 동맥 경화증 또는 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질병을 치료 및/또는 예방 및/또는 감소 및/또는 퇴치하기 위해 사용되는 본 발명의 제 1 견지에 정의된 약학 조성물을 포함한다.

일 구현으로, 상기 약학 조성물내의 항체는 환자에서 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 형성을 감소시킨다. 즉, 아테롬성 동맥 경화증의 발달을 늦추며, 바람직하게는 새로운 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 형성을 감소 혹은 억제한다.

다른 구현으로, 상기 약학 조성물내의 항체는 환자에서 전에 존재하는 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 퇴행을 유도한다.

"아테롬성 동맥 경화증 플라크의 퇴행"이란 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 크기 및/또는 양 및/또는 정도를 감소시키는 의미를 포함한다. 전형적으로, 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 퇴행은 플라크로 덮힌 내부 동맥 표면의 면적 감소를 일으킨다. 따라서, "아테롬성 동맥 경화증 플라크의 퇴행"이란 개체에 부담된 전체적인 플라크를 감소시키는 것 뿐만 아니라, 각각의 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 일부 또는 전체의 크기를 감소시키는 것을 포함한다. 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 퇴행은 혈관강의 증가(동맥 혈관의 유효 단면 증가)를 일으켜 혈류 속도 증가에 기여한다.

개체에서 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 크기 및/또는 양 및/또는 정도를 측정하는 방법은 당 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 앤지오그래피, 혈관 초음파, 컴퓨터 토모그래피 및 자기공명영상법을 포함한다.

"크기 및/또는 양 및/또는 정도를 감소시키는 것"은 약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5%의 감소, 또는 약 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10%의 보다 높은 감소, 또는 10-25%의 감소와 같은 약 1-25%의 감소를 포함한다. 25-50% 또는 50-75%, 또는 그 이상의 보다 높은 감소가 보다 바람직하다.

아테롬성 동맥 경화증 플라크로 덮힌 내부 동맥 표면의 면적을 감소시키는 것은 약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5%의 감소, 또는 약 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10%의 보다 높은 감소, 또는 10-25%의 감소와 같은 약 1-25%의 감소를 포함한다. 25-50% 또는 50-75%, 또는 그 이상의 보다 높은 감소가 보다 바람직하다.

동맥 혈관의 유효 단면의 증가란 약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5%의 증가, 또는 약 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10%의 보다 높은 증가, 또는 10-25%의 증가와 같은 1-25%의 증가를 의미하는 것을 포함한다. 25-50%, 또는 50-75%, 또는 75-100%의 보다 높은 증가가 보다 바람직하다. 가장 바람직하게, 동맥 혈관의 유효 단면은 2- 또는 3- 또는 4- 또는 5- 또는 10-배, 또는 그 이상 증가된다. 분명히, 동맥 혈관의 단면 증가의 정도는 처리 전 아테롬성 동맥 경화증 병변에 의해 유발된 동맥 폐색의 수준에 따라 달라진다.

퇴행되는 아테롬성 동맥 경화증은 전형적으로 개체의 대동맥내의 것이지만, 대퇴부, 경동맥 및 관상 동맥과 같이 환자내의 다른 동맥 부위에서 또한 발견될 수 있다.

전형적으로, 치료받는 환자는 사람, 가축 및 농장 동물, 및 동물원 동물, 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지, 낙타 등과 같은 스포츠용 또는 애완 동물을 포함하는 포유류이다. 바람직하게, 상기 환자는 사람이다.

전형적으로, 상기 환자는 아테롬성 동맥 경화증을 가진 사람 환자이다. 약학 조성물내에 존재하는 항체는 전에 존재하는 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 크기를 감소시키기 때문에(WO 2007/025781), 상기 약학 조성물은 진전된 또는 심한 아테롬성 동맥 경화증 및 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 진전된 또는 심한 형태의 심혈관 질병에 걸린 환자를 치료하는데 특히 유용하다.

상기 환자는 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환을 갖거나 가질 위험이 있는 사람 환자일 수 있다. 용어 "아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환"은 아테롬성 동맥 경화증 병변의 결과인 점에서 아테롬성 동맥 경화증과 의학적으로 연결된 질병들에 대한 언급을 포함한다. 언급될 수 있는 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환은 관상동맥 질환, 심근 경색 및 뇌졸증을 포함한다.

상기 약학 조성물내 항체는 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 형성을 감소시키며, 또한 전에 존재하는 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 퇴행을 유도하기 때문에, 상기 약학 조성물은 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 존재에 기인하여 상기 심혈관 질환이 생길 위험이 있는 환자에서 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환의 위험을 감소시키는데 유용한 것으로 또한 인식된다.

상기 환자는 다중 위험 인자들(비만, 흡연, 고혈압, 진성 당뇨병 및 조기 관상심장병의 가족력 포함)로 인해 관상심장병이 발병할 위험이 있는 자; 콜레스테롤 및/또는 트리글리세라이드의 매우 높은 혈장 농도로 특징지어지는 가족 질환을 가진 자; 근본적인 질병(갑상선기능저하증, 신장 증후군, 간장병 또는 알코올 중독)에 대해 2차적이지 않은 고지혈증을 가진 자; 상승된 LDL-콜레스테롤을 가진 자; 또는 식이요법 고지혈증 조절(보완 치료)중인 자일 수 있다.

본 발명의 이러한 견지의 일 구현으로, 본 발명은 개체에서 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 크기 및/또는 양 및/또는 정도를 측정하는 전단계를 포함할 수 있다. 이는 개체가 아테롬성 동맥 경화증 플라크 존재량을 감소시키는 치료가 요구되는지 평가하기 위해, 또는 이러한 치료의 효능을 평가하는 기준 측정값을 제공하기 위해, 또는 두 목적 모두를 위해 수행될 수 있다. 감소시킬 필요가 있는 아테롬성 동맥 경화증 플라크 존재량은 전체 플라크 존재량의 크기 및/또는 정도에 기인할 수 있는 것으로 인식된다. 부가적으로 또는 택일적으로, 이는 예를 들어, 이들의 불안정한 정도와 같이 플라크의 본질에 기인할 수 있다.

임의로, 그리고 전형적으로, 본 발명은 본 발명의 치료 효능을 치료전에 취해진 기준 측정값과 비교하여 평가하도록 약학 조성물의 투여 후, 환자에서 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 크기 및/또는 양 및/또는 정도를 측정하는 후속적인 단계를 또한 포함할 수 있다.

특정 환자가 치료로부터 혜택을 받을지 예상되는 자인지 여부는 의사에 의해 결정될 수 있다.

스태틴(3-히드록시-3-메틸글루터릴-코엔자임 A(HMG-CoA) 환원 효소의 인히비터)은 혈장 콜레스테롤 함량을 감소시킴으로써(그리고 아직 규명되어야할 부가적인 메카니즘에 의해) 급성 심혈관 이벤트를 예방하는데 효과적인 것으로 증명되었다. 상기 면역치료요법과 결합된 스태틴의 투여는 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 퇴행을 보충하기 위한 유용한 치료 수단일 수 있다.

따라서, 본 발명의 제 4 견지는 성분들: 본 발명의 제 1 견지와 관련되어 상기 정의한 바와 같은 약학 조성물, 또는 동결건조 조성물, 및 스태틴을 포함하는 성분 키트를 제공한다. 적절하면서 바람직한 스태틴은 아토바스태틴, 세리바스태틴, 플루바스태틴, 로바스태틴, 메바스태틴, 파라바스태틴, 로서바스태틴 및 심바스태틴으로부터 선택된다. 전형적으로, 상기 스태틴은 경구 투여용으로 배합된다.

상기 성분들은 서로 복합적으로 투여하기에 적절한 형태로 각각 제공된다. "복합적으로"란 성분들이 환자에게 동시 투여 또는 결합 투여에 적절할 수 있다는 의미를 포함한다. 그러나, 상기 성분들은 전형적으로 다른 경로에 의해 투여되기 때문에, "복합적으로"란 또한 동일한 치료 체제내에서의 연속 투여 또는 개별 투여의 의미를 포함한다.

상기 키트는 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘 및 사용 지침이 담긴 포장 삽입물을 포함하는 상업적이며 사용자의 견지에서 원하여질 수 있는 다른 물질들을 더 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 키트내의 두 성분들은 상승 효과를 갖도록 선택된다.

본 발명의 제 5 견지는 본 발명의 제 1 견지와 관련되어 상기 정의된 바와 같은 약학 조성물 및 스태틴을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환을 치료 및/또는 예방 및/또는 퇴치하는 방법을 포함한다.

본 발명은 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환을 치료 및/또는 예방 및/또는 퇴치하는데 복합적으로 사용하는, 본 발명의 제 1 견지와 관련되어 상기 정의된 바와 같은 약학 조성물 및 스태틴을 포함한다.

바람직하게 상기 두 투여 체제는 상승 효과를 갖도록 선택된다.

적절하면서 바람직한 스태틴은 아토바스태틴, 세리바스태틴, 플루바스태틴, 로바스태틴, 메바스태틴, 파라바스태틴, 로서바스태틴 및 심바스태틴을 포함한다.

본 명세서에 언급된 모든 문헌들은 이의 전체가 참고문헌으로 본 명세서에 편입된다. 특히, 항체 2D03과 관련된 WO 2004/030607 및 WO 2007/025781의 전체 명세서가 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.

본 명세서에서 앞서 공개된 문헌의 열거 및 언급은 그 문헌이 당 기술분야의 상태의 일부이며 공통된 일반적인 지식임을 인정하는 것으로 반드시 취해지는 것은 아니다.

본 발명은 하기 실시예 및 도면을 참조로 보다 상세히 설명될 것이다.

실시예 1: 안정성에 미치는 pH의 영향

정제 방법의 개발중에 본 발명자들은 항체 2D03이 기존의 n-CoDeR^® 생성 산물에 비해 다른 용해도 특성을 나타냄을 발견하였다. 전형적으로, 150mM NaCl을 함유하는 pH 7-7.5의 10-20mM 포스페이트 버퍼는 n-CoDeR^® 생성 항체 산물의 안정한 배합물을 형성한다. 그러나, 항체 2D03은 이러한 배합물에서 안정하지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 항체 2D03의 안정성에 미치는 pH 및 염농도의 영향을 조사하였다.

정리하면,

2D03 항체 산물은 pH 6.0 이상에서 응집되었으나, pH 6.0 미만에서는 응집되지 않았다.

한외여과에 의한 농축 또는 버퍼 교환은 저 전도성의, 100mM 미만의 NaCl 당량(밀리지멘스)을 갖는 용액에서 수행시 응집물을 생성하였으나, 이 이상의 농도에서는 응집물을 생성하지 않았다.

초기 시험은 pH가 pH 5.5로 유지되고, 150mM NaCl이 포함된 경우에, 항체 2D03 산물은 적어도 160mg/ml로 농축될 수 있는 것으로 나타났다.

실시예 2: 안정성 시험

요약

본 시험의 목적은 100mg/ml 이상의 농도를 갖는 항체 2D03에 대한 안정한 배합물을 찾아내는 것이다. 100-150mg/ml 사이의 항체 농도를 가지며, pH 5.5를 갖는 6가지 다른 배합물의 안정성을 5℃ 및 24℃에서 배양 후 조사하였다(가속 시험).

배경

실시예 1에서 본 발명자들은 항체 2D03이 기존의 n-CoDeR^® 생성 항체 산물에 비해 다른 용해도 특성을 나타내었다. 요약하면, 상기 산물은 pH 6.0 이상에서 응집이 보였으며, 한외여과에 의한 농축 또는 버퍼 교환은 저 전도성을 갖는 용액에서 수행한 경우에 응집물을 생성하였다. 이러한 발견에 기초하여, 하기 배합물 안정성 시험은 모든 배합물에 포함된 150mM NaCl을 함유한 pH 5.5를 갖는 배합물들로 제한되었다.

고농도 n-CoDeR^® 산물 배합물을 이용한 앞선 실험에 기초하여, 폴리소르베이트 20을 포함한 시험 배합물은 n-CoDeR^® 항체 배합물의 안정성을 증가시키는 것으로 나타났기 때문에 폴리소르베이트 20은 대부분의 시험 배합물에 포함되었으며; Golovanov et al (2004) J. Am. Chem. Soc., 126: 8933-8939에 보고된 발견에 기초하여 아르기닌 및 글루탐산이 일 배합물에 부형제로서 포함되었으며; 만니톨은 항체 배합물의 안정성을 증가시키는 것으로 나타났기 때문에 일 시험 배합물에 포함되었으며; 그리고 히스티딘은 적절한 완충 범위를 갖는 일반적으로 적절한 생물학적 버퍼이기 때문에 시험되었다.

분석방법

하기 방법은 다른 배합물에서 항체 2D03의 안정성을 평가하는데 사용되었다. 각 분석(농도, 외관, 순도, 항원 바인딩 활성, 삼투압 및 정성 평가)은 5℃ 및 24℃ 모두에서 0, 4, 8, 14 및 18주 후에 각각의 배합물 I-VI에 대해 수행되었다.

크기 배제 크로마토그래피에 의한 순도

항체의 순도는 TOSOH Bioscience의 TSKgel 3000SWXL을 이용하여 HPLC에 의해 정석적으로 측정되었다. 이는 이들의 분자량에 따라 분자를 분리하며, 10-500kDa 사이에서 가장 유효한 해상도를 갖는 크기 배제 컬럼이다. 0.4M 소디움 클로라이드를 함유하며, pH 7.2를 갖는 5mM 포타슘 포스페이트의 이동상을 1ml/min의 유속으로 사용하였다. UV-검출은 280nm에서 수행되었으며, 모노머 피크의 면적은 총 피브 면적의 퍼센트로서 계산되었다. 통합은 파라미터를 수동 설정한 후 자동화되었다.

A ₂₈₀ 에 의한 단백질 농축

단백질 함량의 측정은 280nm에서 방향족 영역내의 단백질들의 자외선 흡광도에 근거하였다. 280nm에서의 흡광도는 Lambert-Beers 법칙에 따른 단백질 농도에 직접적으로 비례한다. 상기 흡광도는 Ultrospec110 pro 분광 광도계를 이용하여 측정되었다. 시료들은 10mM 소디움 포스페이트 버퍼, 0.15M NaCl, pH 7.4에서 0.05-1.0 AU로 희석되었다.

A = εb c

A는 흡광도이며, ε는 흡광 계수(이 경우에 1.62)이며, c는 mg/ml로 농도이며, 그리고 b는 센티미터로 큐벳의 패쓰(path) 길이이다.

양이온-교환 크로마토그래피

항체의 정성 평가는 단백질의 전체적 전하간의 차이에 기초하여 분자를 분리하는 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 수행되었다. ProPac^® 약산 양이온 교환 컬럼이 사용되었다. 이 컬럼은 특히 고해상도 및 고 효율 단백질 분리 및 pl=3-10 및 MW>10000을 갖는 글리코단백질을 제공하도록 디자인되었다. 10mM 소디움 아세테이트, pH 5.0(이동상 A) 및 10mM 소디움 아세테이트, 1M NaCl, pH 5.0(이동상 B)을 1ml/min의 유속으로 사용하였다. 10분간 0-75% 이동상 B의 선형 구배를 적용하였다. 측정은 280nm에서의 흡광도에 의해 수행되었다.

410nm에서의 광 산란

침전을 평가하기 위해, 광 산란은 Ultrospec110 pro 분광 광도계를 이용하여 410nm에서 측정되었다. 탈이온수수가 보정을 위해 사용되었다.

SDS-PAGE

SDS-PAGE Phast system^TM을 제조자의 매뉴얼에 따라 사용하였다. 단백질들(Phastgel Gradient 8-25)은 쿠마시 염색에 의해 검출되었다. 시료 적재 농도는 약 0.5mg/ml이었으며, 웰당 3-4㎕가 적재되었다. Fermentas PageRuler Prestained Protein Ladder를 각 겔의 일차 웰에 적재하였다.

항원 바인딩

마이크로타이터 플래이트는 MDA-ApoB100으로 밤새 코팅되었다. 세정 후, 플래이트를 0.45% 피쉬 젤라틴으로 실온에서 1시간동안 블로킹하였다. 스탠다드 2D03 타이트레이션 및 시험 시료들을 상기 코팅 및 블로킹된 마이크로타이터 플래이트에 첨가하고 실온에서 2시간동안 배양하였다. 세정 후, P214 토끼-항-인간 Ig-HRP 접합체를 첨가하고, 플래이트를 실온에서 추가 1시간동안 배양하였다. 바인딩은 OPD-기질(o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드)로 가시화되었으며, 1M HCl로 정지되었다. 흡광도는 두 파장, 490nm(λ_test) 및 650nm(λ_ref)에서 Versamax 리더에서 읽혀졌다. 데이타는 SOFTmax Pro 4.0 소프트웨어로 수집되었으며, 이는 특정 항체 농도들의 계산을 수행하였다. 항원 바인딩은 ELISA법에 의해 얻어진 특정 농도를 (A₂₈₀에 의해 측정된)총 단백질 분석으로부터 얻어진 값으로 나누어 계산되었다.

삼투압

정량적 삼투압은 Micro-Osmometer Typ 13/13 DR을 이용하여 확립되었다. 보정 포인트는 0 및 300mOsm/kg H₂O이다. 시료는 필요에 따라 보정 간격에 맞도록 Milli-Q H₂O로 희석되었다.

순도

안정성 시험 시간의 끝에 측정된 배합물의 순도는 95%미만이었다.

결과

배합물 I

항체 2D03 136mg/ml

소디움 아세테이트 20mM

NaCl 150mM

pH 5.5

결과

5℃에서의 안정성: 14주에 안정, 18주에 안정성 상실

24℃에서의 안정성: 8주에 안정, 14주에 안정성 상실

배합물 II

항체 2D03 136mg/ml

소디움 아세테이트 20mM

NaCl 150mM

폴리소르베이트 20 0.1%(1.1mg/ml)

pH 5.5

결과

5℃에서의 안정성: 4주에 안정, 8주에 안정성 상실

24℃에서의 안정성: 0주에 안정, 4주에 안정성 상실

배합물 III

항체 2D03 136mg/ml

소디움 아세테이트 20mM

NaCl 150mM

폴리소르베이트 20 0.1%(1.1mg/ml)

만니톨 50mM

pH 5.5

결과

5℃에서의 안정성: 8주에 안정, 14주에 안정성 상실

24℃에서의 안정성: 8주에 안정, 14주에 안정성 상실

배합물 IV

항체 2D03 136mg/ml

소디움 아세테이트 20mM

NaCl 150mM

His-HCl 50mM

폴리소르베이트 20 0.1%(1.1mg/ml)

pH 5.5

결과

5℃에서의 안정성: 0주에 안정, 4주에 안정성 상실

24℃에서의 안정성: 0주에 안정, 4주에 안정성 상실

배합물 V

항체 2D03 136mg/ml

소디움 아세테이트 20mM

NaCl 150mM

아르기닌 50mM

글루타메이트 50mM

폴리소르베이트 20 0.1%(1.1mg/ml)

pH 5.5

결과

5℃에서의 안정성: 0주에 안정, 4주에 안정성 상실

24℃에서의 안정성: 0주에 안정, 4주에 안정성 상실

배합물 VI

항체 2D03 151mg/ml

소디움 아세테이트 20mM

NaCl 150mM

His-HCl 50mM

폴리소르베이트 20 0.1%(1.1mg/ml)

pH 5.5

결과

5℃에서의 안정성: 0주에 안정, 4주에 안정성 상실

24℃에서의 안정성: 0주에 안정, 4주에 안정성 상실

결론

배합물 I은 5℃에서 적어도 14주간 안정하였으며, 24℃에서의 가속 시험에서 적어도 8주간 안정하였으며, 가장 안정한 배합물로 확인되었다. 이 배합물은 육안 및 410nm에서의 광 산란에 의해 확립된 침전의 존재에 기인하여 5℃에서 18주 및 24℃에서 14주에 불안정한 것으로 여겨졌다.

각 배합물 I 내지 VI에 대해, 어느 배합물에서 시간 경과에 따라 상기 어느 방법에 의해서 순도, 농도, 특성 또는 활성에 있어서 현저한 차이가 검출되지 않았다. 모든 배합물들의 불안정성은 육안 및 410nm에서의 광 산란에 의해 구별되는 침전에 의해 측정되었다.

실시예 3: 농축 2D03 용액의 배합물

요약

벌크 용액내의 항체 2D03(A₂₈₀에 의해 측정된 24.3mg/ml의 단백질 농도 기준으로 1534.6ml의 체적내에 37.3g)을 Pellicon 필터를 이용하여 여과함으로써(공급 압력: 1.4-2.1 bar; 투석 압력: 0-0.7 bar) 실온에서 120±20mg/ml의 최종 농도(실제 농도 133mg/ml)로 농축하였다. 농축 후, 산물은 멸균 0.22㎛ 필터를 통해 여과되고 멸균 PETG 병에 +2℃ 내지 8℃에 보관되었다.

농축 항체 용액은 후술된 바와 같이 인식 QC 공정을 이용하여 외관, 단백질 농도, pH, 엔도톡신, 순도, 등전점 전기영동, 바이오버든 및 항원 바인딩에 대해 평가되었다.

외관

시료 용액은 입자, 투명도 및 색에 대해 육안으로 검사되었다. 입자 분석을 위해, 시료는 검은 백그라운드 및 흰 백그라운드 모두의 앞에서 조사되었다. 투명도 측정을 위해, 1ml의 시료를 유리 튜브에 옮기고, 유백광은 유럽 약전에 따라 기준 용액과 비교한 검은 백그라운드에 대해 조사되었다. 상기 시료는 이의 투명도가 물과 동일한 정도로 투명한지 또는 이의 유백광이 기준 서스펜션 I보다 확연하지 않은지 감별되었다. 만일 시료가 이러한 기준에 부합하지 않을 경우, 유백광의 수준은 예를 들어, <II 또는 <III 와 같이, 시료보다 더 높은 유백광을 띠는 제1 기준 서스펜션미만으로 보고되었다. 시료의 색을 검사하고, 흰 백그라운드에 대해 물과 비교하였다. 시료가 물과 같은 정도로 무색인 경우, 이는 무색으로 보고되었다. 그렇지 않은 경우, 색조가 표시되었다.

수용 기준은 실제로 입자가 없는 것이었다. 유백광 및 색이 보고되었다.

A ₂₈₀ 에 의한 단백질 농도

단백질 농도는 Shimandzu UV-1601 분광 광도계가 사용된 것을 제외하고 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정되었다.

수용 기준은 단백질 농도 120±20mg/ml이었다.

pH-측정

pH 미터, 결합된 pH 전극, Radiometer-Copenhagen pHM-210을 표준 버퍼 용액(Radiometer Analytical)을 이용하여 측정 범위내에서 보정되었다. 그 다음, 시료의 pH를 측정하였다.

수용 기준은 pH 5.5±0.5이었다.

동역학적 LAL에 의한 엔도톡신

그람-음성 박테리아 엔도톡신의 검출을 위한 정량적 동역학 어세이로서 Kinetic-QCL^TM(BioWhittaker)이 사용되었다. 본 어세이는 엔도톡신이 리멀러스 아메보사이트 라이세이트(limulus amebocyte lysate)(LAL)내의 효소원을 활성화시키고, 이는 그 다음 pNitroaniline(pNA)의 분할을 촉매하여 노란 색을 생성하는 효소 반응에 기초한다.

시료 및 표준 적정의 엔도톡신을 엔도톡신-프리 유리튜브를 이용하여 리멀러스 아메보사이트 라이세이트(LAL) 시약물에 희석하였다. 100㎕의 희석액을 피리노겐-프리 96-웰 플래이트로 옮겼다. 각 시료 희석액을 알려진 양의 엔도톡신과 섞었다. 상기 플래이트를 Versamax 마이크로플래이트 리더에서 37℃에서 10분간 예비배양하였다. LAL/기질은 LAL 시약물에 용해되었다. 배양 후, 100㎕의 LAL/기질 용액을 각 웰에 첨가하였다. 즉시 리딩을 시작하고, 40리딩에 대해 각 2.5분간 모니터하였다. 반응은 37℃에서 수행되었다. 흡광도는 405nm에서 읽혀졌다. 노란 색을 나타내는데 필요한 시간은 엔도톡신 존재량에 반비례한다. 데이타는 SOFTmax Pro 4.0 소프트웨어에 의해 수집되고, 계산이 수행된다. 엔도톡신의 양은 IU/ml로서 정의된 국제 단위로 표기된다.

섞여진 엔도톡신의 50-150% 회수율을 생성하는 최저 시료 희석액이 수용된다.

수용 기준은 엔도톡신 ≤ 4.0 IU/ml이었다.

순도(HPLC-SEC)

Beckman System Gold 시스템을 이용하여, 항체의 순도를 TSK3000 컬럼(TosoHaas)을 이용한 HPLC에 의해 정량화되었다. 이는 이들의 분자량에 따라 분자를 분리하며, 10-500kDa의 최고 해상도를 갖는 크기 배제 컬럼이다. 0.4M 소디움 클로라이드를 함유하는 5mM 포타슘 포스페이트(pH 7.2)의 이동상은 1ml/min의 유속으로 사용되었다. 주입량은 20㎕이었다. UV-검출은 280nm에서 수행되었다. 통합 표면적은 수동적으로 설정된 파라미터 및 소프트웨어 32 Karat Version 5.0을 이용하여 자동적으로 계산되었다.

수용 기준은 ≥ 90 면적%이었다. 메인 피크 및 피크 ≥ 0.5면적%에 대한 체류 시간 및 면적%가 보고되었다.

순도(SDS-PAGE)

시료의 순도는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 평가되었다. 단백질을 함유하는 시료들은 머캅토에탄올을 함유하거나 함유하지 않은 트리스-글리신-SDS-브로모페놀블루 버퍼에서 5분간 95℃에서 가열되었다. 겔은 Novex X-cell II Mini cell equipment를 이용하여 125V에서 120분간 트리스-글리신-SDS 버퍼에서 런닝되었다. 단백질들은 GELCODE Blue stain으로 염색하여 가시화되었다. 염색된 겔은 Bio-Rad GS-710 농도계로 스캐닝되고, 상대적 순도가 계산되었다. 그 결과는 Quantity-One 소프트웨어(BioRad)를 이용하여 평가되었다.

수용 기준은 레퍼런스와의 대등성, 및 총 단백질의 10%이상에 상응하는 부가적인 밴드가 없는 것이었다.

등전점 전기영동

등전점 전기영동은 IsoGel^® Agarose Plates(pH 범위 3-10)를 이용하여 Multiphor II 전기영동 유니트에서 수행되었다. 양극 용액은 0.5M 아세트산이었으며, 음극 용액은 1M 소디움 히드록시드이었다. IEF Calibration kit Broad pl(Amersham Biosciences)가 마커로 사용되었다. 시료는 겔에 적용하기 전에 1% 글리신에 대해 투석에 의해 탈염되었다. 온도는 10℃로 설정되었으며, 시료들은 1500V 및 150mA로 전촛점화되었다. 전촛점화 후, 이펙트를 25W로 증가되었으며, 촛점화는 60분이하동안 수행되었다. 단백질은 쿠마시 염색으로 검출되었으며, 겔은 GS-710 농도계(BioRad)로 스캐닝되었다. Quantity One 소프트웨어로 마커 단백질 및 이들의 pI-값의 이동 거리로부터 생성된 검정 곡선을 이용하여 시료들의 pI-값을 계산하였다.

이 방법은 2D03 항체에 대해 최적화되었으며, 적재되는 단백질의 최적량은 음극에서 5cm 거리에서 25㎍이었다. 이러한 발견을 이용하여 시료들은 3중 분석되었다. 밴드들의 pI-값 및 수를 측정하여, 그 결과를 밴드들의 pI(min) - pI(max)로 보고하였다.

수용 기준은 레퍼런스와의 대등성이었다.

바이오버든

샘플링 후 24시간내에, 산물은 박테리아 검출을 위해 32.5±2.5℃에서 Tryptone Soya 아가 플래이트에서, 그리고 균류 검출을 위해 22.5±2.5℃에서 Sabouraud Dextrose 아가 플래이트에서 배양되었다. 3일 후, 상기 Tryptone Soya 아가 플래이트를 관찰하고, 콜로니를 세었으며, 그리고 5일 후, 상기 Sabouraud Dextrose 아가 플래이트를 관찰하였다.

수용 기준은 무 박테리아 또는 무 균류이었다.

항원 바인딩

항원 바인딩은 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정되었다.

수용 기준은 레퍼런스의 50%이상이었다.

결과

2D03 농축 용액은 다음과 같이 배합되었다(ml당):

항체 2D03 133mg;

소디움 클로라이드 8.77mg;

소디움 아세테이트-3 하이드레이트 2.35mg;

아세트산 0.16㎕;

1ml(즉, 최종 체적)까지 맞춘 양의 물.

2중으로 시험한 후, 상기 2D03 농축 용액은 상기 모든 시험에 대해 수용 기준을 만족하였다.

실시예 4: 2D03 제조물의 장기 안정성 시험

장기 안정성 시험은 상기 항체 제조물이 임상적 환경에서 사용시 필요한 충분한 보전 기간을 가짐을 입증하기 위해 수행되었다.

20mM 소디움 아세테이트 및 150mM 소디움 클로라이드내에 용해된 25mg/ml 2D03 항체를 함유하는 항체 제조물(pH 5.5)을 +5℃에서 12개월간 보관되었다. 제조물의 순도는 95%이상이었다.

시험	방법	수용 기준	결과(12개월)
단백질 농도	A280에서의 흡광도	25.0±5.0mg/ml	26.2
pH	pH 미터	5.5±0.5	5.6
순도	HPLC-SEC	≥95.0%	96.8

안정성 시험 및 결과:

이러한 결과는 상기 2D03 항체가 임상적 환경에서 사용시 허용되는 +5℃에서 12개월간 상기 배합물내에서 충분히 안정함을 입증한다.

실시예 5: 2D03 제조물의 장기 안정성 시험

실시예 4의 제조물과 같은 항체 제조물을 +25℃에서 6개월간 보관하였다.

시험	방법	수용 기준	결과(6개월)
단백질 농도	A280에서의 흡광도	25.0±5.0mg/ml	25.4
pH	pH 미터	5.5±0.5	5.6
순도	HPLC-SEC	≥95.0%	95.7

이러한 결과는 상기 2D03 항체가 임상적 환경에서 사용시 허용되는 +25℃에서 6개월간 상기 배합물내에서 충분히 안정함을 입증한다.

<110> BioInvent International AB <120> Formulation <130> BIOBX/P42377PC <150> US 61/017290 <151> 2007-12-28 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2D03 Heavy Chain <400> 1 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaagt attagtgttg gtggacatag gacatattat 180 gcagattccg tgaagggccg gtccaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc acggatacgg 300 gtgggtccgt ccggcggggc ctttgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 2 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2D03 Light Chain <400> 2 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcaacac caacattggg aagaactatg tatcttggta tcagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctaatagca atcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgcg tcatgggatg ccagcctgaa tggttgggta 300 ttcggcggag gaaccaagct gacggtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 360 ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420 agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480 gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540 tatctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600 catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctacag aatgttca 648 <210> 3 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2D03 Heavy Chain translated sequence <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Val Gly Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Arg Val Gly Pro Ser Gly Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 4 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2D03 Light Chain translated sequence <400> 4 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Thr Asn Ile Gly Lys Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215

Claims

치료 유효량의 SEQ ID No: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID No: 4의 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체 및 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제, 캐리어 또는 부형제를 포함하며, pH 4-6을 갖는 수성 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 pH 4.5이상을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 조성물은 pH 4.9이상을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 조성물은 pH 4.9-5.1을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 조성물은 약 pH 5를 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 pH 5-6을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 조성물은 pH 5-5.9를 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 조성물은 pH 5.4-5.6을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 조성물은 약 pH 5.5를 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 96%, 또는 97%, 또는 98% 또는 그 이상, 또는 100%의 순도와 같이 95% 이상의 순도로 제공되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 10-200mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 항체는 25-150mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 항체는 25±10mg/ml로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 항체는 120±20mg/ml로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 항체는 약 150±10mg/ml로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 아세테이트 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 아세테이트는 5-30mM로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 17항에 있어서, 상기 아세테이트는 10-30mM로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 18항에 있어서, 상기 아세테이트는 약 20mM로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 소디움 클로라이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 20항에 있어서, 상기 소디움 클로라이드는 100-200mM, 바람직하게 약 150mM로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
ml당
제 1항에 정의된 항체 15-160mg;
소디움 클로라이드 8.77mg;
소디움 아세테이트-3 하이드레이트 2.35mg;
아세트산 0.16㎕;
pH 5.5로 맞춘 양의 소디움 히드록시드; 및
1ml까지 맞춘 양의 물
을 포함하는 약학 조성물.
제 22항에 있어서, 상기 항체는 25±10mg/ml, 120±20mg/ml, 또는 150±10mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항에 정의된 항체 25mg/ml;
소디움 아세테이트 20mM;
소디움 클로라이드 150mM;
pH 5.5로 맞춘 양의 소디움 히드록시드
를 포함하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 보존제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 25항에 있어서, 상기 보존제는 벤질 알코올인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 피하 또는 정맥내 투여용으로 배합되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 2-8℃의 온도에서 적어도 14주동안 안정한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 2-8℃의 온도에서 적어도 12개월동안 안정한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 2-8℃의 온도에서 적어도 1.5년 또는 적어도 3년동안 안정한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 약 24℃의 온도에서 적어도 8주동안 안정한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 동결 및 해동 후 안정한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 사전 동결건조되지 않는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 정의된 안정한 수성 약학 배합물을 보유하는 멸균 용기를 포함하는 제조물품.
제 34항에 있어서, 상기 제조물품은 일회용 주사기인 것을 특징으로 하는 제조물품.
제 1항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 따른 안정한 약학 조성물 및 스태틴을 포함하는 성분 키트.
제 36항에 있어서, 상기 스태틴은 경구 투여용으로 배합되는 것을 특징으로 하는 성분 키트.
제 36항 또는 제 37항에 있어서, 상기 스태틴은 아토바스태틴, 세리바스태틴, 플루바스태틴, 로바스태틴, 메바스태틴, 파라바스태틴, 로서바스태틴 및 심바스태틴으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 성분 키트.
제 1항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 정의된 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 아테롬성 동맥 경화증 또는 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질병을 퇴치하는 방법.
제 39항에 있어서, 상기 항체는 환자에서 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 형성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39항에 있어서, 상기 항체는 환자에서 전에 존재하는 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 퇴행을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
환자에서 아테롬성 동맥 경화증 또는 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환을 퇴치하기 위해 제 1항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 정의된 약학 조성물의 제조에 사용되는, SEQ ID No: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID No: 4의 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체의 용도.
환자에서 아테롬성 동맥 경화증 또는 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환을 퇴치하기 위해 사용되는 제 1항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 정의된 약학 조성물.
제 39항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 아테롬성 동맥 경화증을 가진 사람 환자인 것을 특징으로 하는 방법, 용도 또는 약학 조성물.
제 39항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환을 갖거나 가질 위험이 있는 사람 환자인 것읕 특징으로 하는 방법, 용도 또는 약학 조성물.
제 39항 내지 제 43항 및 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환은 관상동맥 질환, 심근 경색 및 뇌졸증으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법, 용도 또는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 정의된 약학 조성물 및 스태틴을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환을 퇴치하는 방법.
아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환을 퇴치하는데 복합적으로 사용되는, 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 정의된 약학 조성물 및 스태틴.
첨부된 설명, 도면 및/또는 그림을 참조하여 본 명세서에 실질적으로 기재된 약학 조성물.
첨부된 설명, 도면 및/또는 그림을 참조하여 본 명세서에 실질적으로 기재된 제조물품.
첨부된 설명, 도면 및/또는 그림을 참조하여 본 명세서에 실질적으로 기재된, 환자에서 아테롬성 동맥 경화증, 또는 아테롬성 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환을 퇴치하는 방법.
첨부된 설명, 도면 및/또는 그림을 참조하여 본 명세서에 실질적으로 기재된 약학 조성물.
첨부된 설명, 도면 및/또는 그림을 참조하여 본 명세서에 기재된, 약학 조성물의 제조에 사용되는 SEQ ID No: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID No: 4의 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체의 용도.