KR20100097737A - Ｃｃｒ５에 대한 어푸코실화된 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CCR5에 결합하고 Asn297에서 당쇄에 의해 당화되는 항체로서, 상기 당쇄내의 푸코스의 양이 65 % 이하인 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 항-염증 요법에서 개선된 특성을 갖는다.

Description

ＣＣＲ５에 대한 어푸코실화된 항체 및 이의 용도{AFUCOSYLATED ANTIBODIES AGAINST CCR5 AND THEIR USE}

본 발명은 CCR5에 대한 어푸코실화된 항체, 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물, 및 염증 병태, 예컨대 급성 및 만성 이식 거부반응의 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다.

케모카인 및 이의 수용체는 백혈구 소통(leukocyte trafficking)을 매개함으로써 동종이식편 거부반응에 관여하는 것으로 공지되어 있다. 문헌[Panzer, U., et al., Transplantation 78 (2004) 1341-50]은 급성 인간 동종이식편 거부반응에서의 CCR5-양성 T-세포 보충을 보고하였고, 문헌[Luckow, B., et al., Eur. J. Immunol. 34 (2004) 2568-78]은 CCR5-결핍 동물에서 금속단백질분해효소(metalloproteinase) 및 동맥경화증의 감소된 인트라그래프트(intragraft) 수준을 관찰하였다. 또한, 문헌[Gao, W., et al., Transplantation 72 (2001) 1199-1205]은 CCR5-특이적 단일클론성 항체로 치료된 마우스 및 CCR5-결핍 마우스의 연장된 동종이식편 생존을 나타냈다. 문헌[Schroeder, C., et al., J. Immunol. 179 (2007) 2289-2299]은 염증반응 및 동종면역반응 동안 CCR5 조절의 연구를 위해 사이노몰거스 원숭이 심장 동종이식편 모델에서의 CCR5 길항제의 효과를 조사하였다. 또한, 인간 이식 수용 무리의 후향 연구는 CCR5-결핍 환자(델타 32)가 연장된 동종이식편 생존을 나타냈음을 알아냈다(문헌[Fischereder, M., et al., Lancet 357 (2001) 1758-1761]).

실험 모델에서, 수용체-리간드 상호작용의 잉여성에 기인하여, 단일 케모카인의 결핍 또는 차단은 급성 거부반응으로부터 동종이식편을 보호하지 못한다(문헌[Fischereder, M., et al., Lancet 357 (2001) 1758-1761; Gao, W., et al., Transplantation 72 (2001) 1199-1205; Hancock, W.W., et al., Curr. Opin. Immunol. 12 (2000) 511-516; Hancock, W.W., et al., Curr. Opin. Immunol. 15 (2003) 479-486]).

국제특허공개 제WO 01/78707호는 CCR5 기능의 길항제를 투여함을 포함하는, 이식편 거부반응을 억제하는 방법에 관한 것이다.

단일클론성 항체의 세포-매개된 작동자 기능은 문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 미국특허 제US 6,602,684호에 기술된 바와 같이 올리고당 성분을 엔지니어링함으로써 강화될 수 있다. 암 면역요법에 가장 통상적으로 사용되는 항체인 IgG1 유형 항체는 각각의 C_H2 도메인중 Asn297에서 보존된 N-결합 당화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 착물 바이안테너리(biantennary) 올리고당을 C_H2 도메인 사이에 묻고, 폴리펩티드 골격과 광범위하게 접촉하고, 이의 존재는 작동자 기능, 예컨대 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 매개하는 항체에 필수적이다(문헌[Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A. and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32]). 문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 국제특허공개 제WO 99/54342호는 이등분된 올리고당의 형성을 촉진하는 당전이효소인 β(1,4)-N-아세틸글루코사민일전이효소 III("GnTIII")의 중국 햄스터 난소(CHO) 세포의 과발현이 항체의 시험관내 ADCC 활성을 상당히 증가시킴을 나타냈다. N297 탄수화물의 조성의 변경 또는 이의 제거가 또한 FcγR 및 C1q로의 결합에 영향을 준다(문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147]).

문헌[Iida, S., et al., Clin. Cancer Res. 12 (2006) 2879-2887]은 비-푸코실화된 항-CD20 항체의 효능이 푸코실화된 항-CD20 항체의 첨가에 의해 억제되었음을 나타낸다. 비-푸코실화된 및 푸코실화된 항-CD20 항체의 1:9 혼합물(10 ㎍/㎖)의 효능은 비-푸코실화된 항-CD20 항체 단독의 1,000 배 희석액(0.01 ㎍/㎖)보다 열등하였다. 이들은 푸코실화된 대응물을 포함하지 않는 비-푸코실화된 IgG1이 이의 높은 Fc감마RIIIa 결합을 통해 ADCC에 대한 혈장 IgG의 억제 효과를 회피할 수 있는 것으로 결론이 난다. 문헌[Natsume, A., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 93-103]은 인간 IgG1-형 항체의 착물-형 올리고당으로부터의 푸코스 제거가 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)의 상당한 강화를 야기함을 나타낸다. 문헌[Satoh, M., et al., Expert Opin. Biol. Ther. 6 (2006) 1161-1173]은 차세대 치료용 항체로서 비-푸코실화된 치료용 항체에 대해 검토한다. 사토(Satoh)는 비-푸코실화된 인간 IgG1 형태만으로 이루어진 항체가 이상적으로 여겨지는 것으로 결론을 내린다. 문헌[Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688]은 푸코실화된 항-CD20 항체(96 % 푸코실화, CHO/DG44 1H5)를 비-푸코실화된 항-CD20 항체와 비교한다. 문헌[Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294]은 항-CD20 항체의 경우에, 증가된 ADCC가 FcγRIII으로의 증가된 결과와 서로 관련되는 것을 보고한다.

단일클론성 항체의 세포-매개된 작동자 기능을 강화시키기 위한 방법은 국제특허공개 제WO 2005/018572호, 제WO 2006/116260호, 제WO 2006/114700호, 제WO 2004/065540호, 제WO 2005/011735호, 제WO 2005/027966호, 제WO 1997/028267호, 제US 2006/0134709호, 제US 2005/0054048호, 제US 2005/0152894호, 제WO 2003/035835호 및 제WO 2000/061739호에 기술되어 있다.

본 발명은 CCR5에 결합하고 Asn297에서 당쇄에 의해 당화되는 항체로서, 상기 당쇄내의 푸코스의 양이 65 % 이하인 항체를 포함한다.

본 발명은 CCR5에 결합하고 Asn297에서 당쇄에 의해 당화되는 항체로서, 상기 당쇄내의 푸코스의 양이 한 양태에서 5 내지 65 %, 다른 양태에서 20 내지 40 %인 항체를 포함한다.

이러한 양의 푸코스를 포함하는 본 발명에 따른 항체는 또한 "어푸코실화된(afucosylated)"으로서 지칭된다.

본 발명은 CCR5에 결합하고 Asn297에서 당쇄에 의해 당화되는 항체로서, FcγRIII에 대한 높은 친화도를 나타내는 항체를 포함한다.

한 양태에서, 항체는 인간 IgG1 또는 IgG3 유형이다.

다른 양태에서, 상기 당쇄내에서 NGNA의 양은 1 % 이하이고/이거나 N-말단 알파-1,3-갈락토스의 양은 1 % 이하이다.

다른 양태에서, NGNA의 양은 0.5 % 이하, 또 다른 양태에서, 0.1 % 이하이고, 다른 양태에서, 심지어 검출가능하지 않다(LCMS).

한 양태에서, 상기 당쇄내에서 N-말단 알파-1,3-갈락토스의 양은 0.5 % 이하, 다른 양태에서, 0.1 % 이하이고, 또 다른 양태에서, 심지어 검출가능하지 않다(LCMS).

한 양태에서, CCR5에 결합하는 항체는 T-세포 에피토프 격감(depleting)된 항체, 단일특이적 4 가 항체, 또는 다중특이적 항체이다.

당쇄는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현되는 CCR5에 결합하는 항체의 Asn297에 부착된 N-결합 글리칸의 특징을 나타낸다.

본 발명은 CCR5에 결합하는 어푸코실화된 항체로서, 인간 CCR5에 결합하고, 시험관내 및 생체내 CCR5+ T-세포가 격감되도록 인간 CCR5의 기능을 차단하는 항체를 포함한다.

본 발명에 따른 항체는 이식 거부반응을 억제하는 것을 필요로 하는 환자에게 유리하다.

상기 항체는, 한 양태에서, 단일클론성 항체이거나, 다른 양태에서, 키메라 항체이거나(인간 불변 쇄), 또는 인간화된 항체, 또는, 또 다른 양태에서, 인간 항체이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를, 선택적으로 약학적인 목적을 위한 항체의 제형화에 유용한 보조제 및/또는 완충액과 함께 함유하는 약학 조성물을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.

본 발명은 본 발명에 따른 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 상기 약학 조성물이 제조 제품 또는 키트에 포함될 수 있다. 본 발명은 이식 거부반응의 치료용 약학 조성물의 제조를 위한, 본 발명에 따른 항체의 용도를 추가로 제공한다. 항체는 약학적인 효과량으로 사용된다.

본 발명은 동종이식편 거부반응, 염증, 및 면역-매개된 질병의 예방용 약학 조성물의 제조를 위한, 본 발명에 따른 항체의 용도를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 상기 질병은 류마티스성 관절염(RA), 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 육아종성 대장염, 또는 국소적 장염(크론병)이다. 항체는 약학적인 효과량으로 사용된다.

본 발명은 CHO 숙주 세포중에서 CCR5에 결합하는 항체를 코딩하는 핵산을 발현하는 단계(이때, 상기 항체를 본 발명에 따른 양으로 푸코실화한다), 및 상기 세포로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 인간 항체의 제조 방법을 추가로 포함한다. 본 발명은 상기 재조합 방법에 의해 수득가능한 항체를 추가로 포함한다.

본 발명은 β(1,4)-N-아세틸글루코사민일전이효소 III(GnTIII), 선택적으로 또한 만노시다제 II(ManII), 및 항-CCR5 항체를 재조합적으로 발현할 수 있는 CHO 세포를 추가로 포함한다. 이러한 CHO 세포는 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 선택적으로 ManII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 제 1 DNA 서열, 적어도 CCR5에 대한 항체의 중쇄의 가변 도메인을 코딩하는 제 2 DNA 서열, 및 적어도 CCR5에 대한 항체의 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 제 3 DNA 서열에 의해 형질전환된 CHO 세포이다. 한 양태에서, 제 2 및 제 3 DNA 서열은 인간 IgG1 유형의 CCR5에 대한 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩한다.

본 발명은 숙주 세포, 바람직하게는 CHO 세포를, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 제 1 DNA 서열, 적어도 CCR5에 대한 항체의 중쇄의 가변 도메인을 코딩하는 제 2 DNA 서열, 및 적어도 CCR5에 대한 항체의 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 제 3 DNA 서열로 형질전환시키는 단계; 상기 숙주 세포가 발효 매질로 상기 항체를 분비하는 조건하에, 한 양태에서 독립적으로 상기 제 1, 제 2 및 제 3 DNA 서열을 발현하는 숙주 세포를 발효 매질중에서 배양하는 단계; 및 상기 항체를 발효 매질로부터 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 특성을 나타내는 CCR5에 대한 항체의 제조 방법을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 CCR5에 대한 항체를 인간을 비롯한 포유동물에게 투여함을 포함하는, 상기 포유동물의 급성 및 만성 기관 이식 거부반응(동종이식편, 이종이식편)의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.

도 1: CHO 세포에 결합하는 Fc 수용체, 어푸코실화된 항체(◆), WT 항체(■).
도 2: ADCC, 어푸코실화된 항체(■), WT 항체 (●) 및 LALA 돌연변이 항체(▲).
도 3: CCR5+ 세포의 생체내 격감.
도 4: CD8+ 세포, CD4+ 세포 및 단핵세포의 전반에 걸친 CCR5 세포 발현의 모니터링. 회색: 대조군, 비특이적 단일클론성 항체; 흑색: 치료된 사이노몰거스.
도 5: 본 발명에 따른 항-CCR5 항체를 수용하는 사이노몰거스 원숭이의 연장된 심장 동종이식편 생존.

도 6: 심장 수용 사이노몰거스 원숭이의 심장 동종이식편 혈관병증을 예방하는 병용 요법.

용어 "CCR5"는 인간 케모카인 수용체를 나타낸다(예를 들어, 스위스 프로트(Swiss Prot) P51681 및 문헌[Mueller, A., and Strange, P.G., Int. J. Biochem. Cell Biol. 36 (2004) 35-38] 참고). 용어 "CCR5 항체"는 CCR5에 대한 항체, 즉 항-CCR5 항체를 의미한다.

용어 "항체"는 다양한 형태의 항체, 예컨대 비제한적으로 본 발명에 따른 특징적인 특성이 보유되는 한, 전장 항체, 항체 단편, 인간 항체, 인간화된 항체, 및 유전학적으로 엔지니어링된 항체를 포함한다

"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 적어도 이의 가변 영역 또는 항원 결합 부분을 포함한다. 항체 단편의 예는 디아바디(diabody), 단쇄 항체 분자, 접합물, 예컨대 면역독소, 및 항체 단편을 포함하는 다중특이적 항체를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성을 가진 항체 분자로 이루어진 제제를 지칭한다. 따라서, 용어 "인간 단일클론성 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 뼈대 영역 및 불변 영역을 갖는 단일한 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다.

용어 "키메라 항체"는 하나의 공급원 또는 종으로부터의 가변 영역 즉, 결합 영역, 및 다른 공급원 또는 종으로부터 유도된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하며, 통상적으로 재조합 DNA 기술로 제조되는 단일클론 항체를 지칭한다. 뮤린(murine) 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 특히 바람직하다. 이러한 뮤린/인간 키메라 항체는 뮤린 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 DNA 절편, 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 DNA 절편을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 본 발명에 의해 포괄되는 "키메라 항체"의 다른 형태는 클래스 또는 서브클래스가 원래의 항체의 클래스 또는 서브클래스로부터 변경되거나 변화된 항체 형태이다. 이러한 "키메라" 항체는 "클래스가 전환된 항체"로도 지칭된다. 키메라 항체의 제조 방법은 현재 당해 분야에 널리 공지되어 있는 통상적인 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 기술을 포함한다(예를 들어, 문헌[Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; 미국특허 제5,202,238호 및 제5,204,244호 참고).

용어 "인간화된 항체"는 모 면역글로불린과 비교하여 상이한 특이성을 갖는 면역글로불린의 "상보성 결정 영역(CDR)"을 포함하도록 개질된 CDR 및/또는 뼈대 영역(FR)을 갖는 항체를 지칭한다. 한 양태에서, 뮤린 CDR을 인간 항체의 뼈대 영역으로 이식하여 "인간화된 항체"를 제조한다(예를 들어, 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; and Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270] 참고). 특히, CDR은 키메라 및 이작용성 항체에 대해 본원에 표시된 항원을 인식하는 서열을 나타내는 것과 상응한다. 한 양태에서, 상기 항원은 CCR5의 에피토프이다.

본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 한 양태에서, 가변 중쇄 영역은 생식계열 서열 DP-50(젠뱅크(GenBank) LO6618)으로부터 유도되고, 가변 경쇄 영역은 생식계열 서열 L6(젠뱅크 X01668)으로부터 유도되거나, 또는 가변 중쇄 영역은 DP-61(젠뱅크 M99682)로부터 유도되고, 가변 경쇄 영역은 생식계열 서열 L15(젠뱅크 K01323)로부터 유도된다. 항체의 불변 영역은 인간 IgG1 유형의 불변 영역이다. 이러한 영역은 동종유형일 수 있고, 예를 들어 문헌[Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 및 본원에 인용된 데이터베이스에 기술되어 있다.

용어 "재조합 인간 항체"는 재배열된 형태인 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체내 체세포 과돌연변이(somatic hypermutation)를 거쳤다. 따라서, 재조합 항체의 가변 중쇄 영역(VH) 및 가변 경쇄 영역(VL)의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.

본원에 사용된 용어 "결합"은 약 10^-13 내지 10^-8 M(K_D), 한 양태에서, 약 10^-13 내지 10^-9 M의 친화도로 CCR5에 결합하는 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있지만, 이중-가닥 DNA가 바람직하다.

IgG1 또는 IgG3 유형을 갖는 인간 불변 영역은 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991); Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527]에 상세히 기술되어 있다. 예는 서열식별번호 1 번 내지 3 번이다.

인간 IgG1, IgG2 또는 IgG3 유형의 불변 영역은 Asn297에서 당화된다. 본 발명에 따른 "Asn297"은 Fc 영역의 위치 297에 대략 위치하는 아미노산 아스파라긴을 의미하고; 항체의 부수적인 서열 변형에 기인하여, Asn297은 또한 위치 297의 업스트림 또는 다운스트림(통상적으로 ± 3 이하의 아미노산), 즉 위치 294 및 위치 300 사이의 일부 아미노산에 위치할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "가변 영역"(경쇄의 가변 영역(VL), 중쇄의 가변 영역(VH))은 항원으로의 항체의 결합에 직접 관여하는 경쇄 및 중쇄 도메인의 쌍의 각각의 구성원을 나타낸다. 인간 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 동일한 일반 구조를 가지고, 각각의 영역은 이의 서열이 3개의 "초가변 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 광범위하게 보존되고 결합된 4개의 "뼈대 영역(FR)"을 포함한다. 뼈대 영역은 β-시트 형상을 채용하고, CDR은 β-시트 구조를 결합하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 쇄내의 CDR은 뼈대 영역에 의해 이의 3-차원 구조로 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화도에서 특히 중요하고, 이에 따라 본 발명의 추가의 양상을 제공한다.

본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합 부분"은 항원-결합을 야기하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "뼈대" 또는 "FR" 영역은 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 또는 중쇄는 N-말단으로부터 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3은 대부분 항원 결합에 공헌하고 항체를 특징짓는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]의 표준 정의에 따라 결정되고/되거나 "초가변 루프"를 형성하는 잔기이다.

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자(determinant)를 의미한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자로 이루어진 화학적 활성 표면 기(grouping)로 통상적으로 구성되고, 특이적인 3-차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가진다. 구조적 에피토프와 비구조적 에피토프는 구조적 에피토프와의 결합이 변성제의 존재하에 상실되지만 비구조적 에피토프와의 결합은 상실되지 않는다는 점에서 구별된다.

항체 A(DSM ACC 2683)는 CCR5의 ECL2 도메인상의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하고(문헌[Lee, B., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 9617-9626]), 이는 항체 2D7에 의해 인식되는 에피토프와는 상이하다(2D7은 ECL2A의 아미노산 K171 및 E172에 결합하지만 ECL2B 아미노산 184 내지 189에는 결합하지 않는다). 항체 A에 대한 에피토프 결합은 CCR5 돌연변이 K171A 또는 E172A에 대해 20 %인 것으로 밝혀졌다(glu172가 ala로 돌연변이되는 경우). 100 % 에피토프 결합이 야생형 CCR5에 대해 정의된다. 따라서, 본 발명의 다른 양태는 CCR5에 결합하고 항체 A가 결합하는 바와 동일한 에피토프에 결합하는 어푸코실화된 항체이다. 결합 억제는 20 내지 50 nM의 농도의 부동화된 항체 A 및 CCR5, 및 100 nM의 농도에서 검출되는 항체를 사용하는 SPR 어세이에 의해 검출될 수 있다. 50 % 이상의 신호 감소는 상기 항체가 항체 A와 경쟁함을 나타낸다. 에피토프 결합은 또한 에피토피 매핑(mapping)에 대하여 문헌[Olson, W.C., et al., J. Virol. 73 (1999) 4145-4155]에 기술된 방법에 따른 CCR5의 알라닌 돌연변이에 의해 조사될 수 있다. 75 % 이상의 신호 감소는 돌연변이된 아미노산이 상기 항체의 에피토프에 기여함을 나타낸다. 조사된 항체의 에피토프에 기여하는 하나 이상의 아미노산이 항체 A의 에피토프에 기여하는 하나 이상의 아미노산과 동일한 경우에, 동일한 에피토프로의 결합이 발견된다. 한 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 CCR5의 ECL2 도메인에 결합한다.

본 발명에 따른 바람직한 CCR5 항체의 아미노산 서열은 국제특허공개 제WO 2006/103100호 및 제WO 2008/037419호에 기술되어 있다.

본 발명은 CCR5에 결합하는 어푸코실화된 항체로서, 항체의 가변 중쇄 아미노산 서열 CDR3이 중쇄 CDR3 서열 서열식별번호 4 번 및 5 번으로부터 선택되는 항체를 포함한다.

한 양태에서, 상기 항체는 중쇄 CDR로서 서열식별번호 6 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 7 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 8 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 9 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 10 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 11 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 12 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 13 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 14 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 15 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 16 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 19 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 16 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 20 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 17 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 19 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 17 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 20 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 18 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 19 번의 CDR, 또는 중쇄 CDR로서 서열식별번호 18 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 20 번의 CDR을 함유하는 것을 특징으로 한다.

다른 양태에서, 본 발명은 CCR5에 결합하는 어푸코실화된 항체로서, 중쇄 가변 도메인이 하기 구조식 I의 아미노산 서열인 항체를 포함한다:

[구조식 I]

Gln-Val-Gln-Leu-X01-X02-Ser-Gly-Pro-Gly-Leu-Val-X03-Pro-Ser-Gln-Ser-Leu-Ser-Ile-Thr-Cys-Thr-Val-Ser-Gly-Phe-Pro-Leu-Gly-Ala-Phe-Gly-Val-His-Trp-Val-Arg-Gln-Ser-Pro-Gly-Lys-Gly-X04-Glu-Trp-Leu-Gly-Val-Ile-Trp-Lys-Gly-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-X05-Ser-Arg-Leu-Arg-Ile-Thr-Lys-Asp-Asn-Ser-Lys-Ser-Gln-Val-Phe-Phe-Arg-Met-Asn-Ser-Leu-Gln-Thr-Asp-Asp-Thr-Ala-X06-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Val-Asn-Leu-Ala-Asp-Ala-Met-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-X07-Val-X08-Val-Ser-Ser

(서열식별번호 14 번)

상기 식에서,

X01은 Lys 또는 Gln이고,

X02는 Gln 또는 Glu이고,

X03은 Arg 또는 Lys이고,

X04는 Leu 또는 Pro이고,

X05는 Met 또는 Lys이고,

X06은 Ile 또는 Thr이고,

X07은 Ser 또는 Thr이고,

X08은 Ile 또는 Thr이다.

한 양태에서, 상기 항체는 상기 항체의 경쇄 가변 도메인인 하기 구조식 II의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다:

[구조식 II]

Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ser-Ala-Ser-Val-Gly-Glu-Thr-Val-Thr-Ile-Thr-Cys-Arg-Ala-Ser-Gly-Asn-X10-His-Gly-Tyr-Leu-Ala-Trp-X11-Gln-Gln-Lys-X12-Gly-Lys-X13-Pro-X14-Leu-Leu-X15-Tyr-Asn-Thr-Lys-Thr-Leu-Ala-Glu-Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-X16-Phe-X17-X18-X19-Ile-X20-Ser-X21-Gln-Pro-Glu-Asp-Phe-X22-X23-Tyr-Tyr-Cys-Gln-His-His-Tyr-Asp-Leu-Pro-Arg-Thr-Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Lys-X24-Glu-Ile-Lys

(서열식별번호 15 번)

상기 식에서,

X10은 Ile 또는 Ala이고,

X11은 Phe 또는 Tyr이고,

X12는 Gln 또는 Pro이고,

X13은 Ser 또는 Ala이고,

X14는 Gln 또는 Lys이고,

X15는 Val 또는 Ile이고,

X16은 Gln 또는 Asp이고,

X17은 Ser 또는 Thr이고,

X18은 Leu 또는 Ala이고,

X19는 Lys 또는 Thr이고,

X20은 Asn 또는 Ser이고,

X21은 Leu 또는 Ala이고,

X22는 Gly 또는 Ala이고,

X23은 Asn 또는 Thr이고,

X24는 Leu 또는 Val이다.

한 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 상기 항체가 CCR5에 결합하고, 서열식별번호 14 번의 중쇄 가변 도메인, 서열식별번호 15 번의 경쇄 가변 도메인, 또는 이들의 CCR5-결합 단편을 포함하는 가변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 또는 경쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 불변 영역(경쇄 및 중쇄)이 인간 유래인 것을 특징으로 한다. 이러한 불변 영역(쇄)은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 카바트(Kabat)에 의해 기술되어 있다(예컨대, 문헌[Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 참고). 예를 들어, 유용한 인간 중쇄 불변 영역은 서열식별번호 1 번 및 2 번으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 유용한 인간 경쇄 불변 영역은 서열식별번호 3 번의 카파-경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 항체는 마우스 유래이고, 카바트에 따른 마우스 항체의 항체 가변 서열 뼈대를 포함한다(문헌[Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 참고).

본 발명에 따른 항체는 인간 CCR5의 하나 이상의 기능, 예컨대 CCR5에 대한 리간드 결합, 신호 활성을 억제한다(예를 들어, 포유동물 G 단백질의 활성화, 시토졸성 유리 Ca²⁺의 농도의 신속하고 일시적인 증가의 유도, 및/또는 세포 반응의 자극(예컨대, 주화성, 엑소사이토시스 또는 백혈구에 의한 염증 매개자 방출의 자극, 인테그린 활성화)). 항체는 인간 CCR5로의 RANTES, MIP-1 알파 및/또는 MIP-1 베타의 결합을 억제하고/하거나 인간 CCR5에 의해 매개되는 기능, 예컨대 백혈구 소통, T-세포 활성화, 염증 매개자 방출 및/또는 백혈구 탈과립을 억제한다.

한 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 100 ㎍/㎖ 이하의 항체 농도에서 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR6 및 CXCR4에 대한 결합 어세이에서 케모카인 결합을 역제하지 않는다.

인간 IgG1 또는 IgG3의 당화는 코어 푸코실화된 바이안테너리 착물 올리고당으로서 Asn297에서 발생하고, 이에 의해 당화는 2 개 이하의 Gal 잔기에 의해 종결된다. 이러한 구조는 종결 Gal 잔기의 양에 따라, G0, G1(α-1,6- 또는 α-1,3-), 또는 G2 글리칸 잔기로서 표시된다(문헌[Raju, T. S., Bioprocess Int., April 2003, 44-53]). 항체 Fc 부분의 CHO 유형 당화는, 예를 들어 문헌[Routier, F. H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207]에 기술되어 있다. 비-글리코개질된(non-glycomodified) CHO 숙주 세포에서 재조합적으로 발현되는 항체는 통상적으로 85 %(몰%, 몰 백분율) 이상의 양으로 Asn297에서 푸코실화된다.

본 발명에 따라서, 용어 "푸코스의 양"은 MALDI-TOF 질량 스펙트로미트리에 의해 측정되고, 평균 값으로서 계산된, Asn297에 부착된 모든 당 잔기(예컨대, 착물, 하이브리드- 및 고-만노스 구조)의 합계에 대하여, Asn297에서의 당쇄내의 푸코스의 양을 의미한다(실시예 8 참고). 푸코스의 상대적인 양은 MALDI-TOF에 의한, N-글리코시다제 F 처리된 샘플에서 동정된 모든 글리코구조(예컨대, 각각 착물, 하이브리드- 및 올리고- 및 고-만노스 구조)와 관련된 푸코스-함유 구조의 백분율이다.

본 발명에 따른 어푸코실화된 항-CCR5 항체는 본 발명에 따른 항체의 Fc 영역을 본 발명에 따른 양으로 푸코실화하기 위하여, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산, 선택적으로 또한 ManII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현하도록 엔지니어링된 글리코개질된 숙주 세포로 발현될 수 있다. 한 양태에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이다.

선택적으로, 숙주 세포의 α1,6-푸코실전이효소 활성은 미국특허 제US 6,946,292호에 따라 감소되거나 제거되어 글리코개질된 숙주 세포를 생성할 수 있다. 항체 푸코실화의 양은, 예컨대 발효 조건에 의해, 또는 상이한 푸코실화 양을 갖는 2 개 이상의 항체의 조합에 의해 미리 정해질 수 있다.

본 발명에 따른 항-CCR5 항체는 (a) 본 발명에 따른 (항체의 Fc 영역에 존재하는 올리고당의) 푸코스의 양을 갖는 항체를 생산하도록 하는 조건하에, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로 ManII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 엔지니어링된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 세포 또는 배양 매질로부터 상기 항체를 단리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 한 양태에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이고, 다른 양태에서, 융합 폴리펩티드는 GnTIII의 촉매적 도메인; 및 만노시다제 II의 국소화 도메인, β(1,2)-N-아세틸글루코사민일전이효소 I("GnTI")의 국소화 도메인, 마르모시다제 I의 국소화 도메인, β(1,2)-N-아세틸글루코사민일전이효소 II("GnTII")의 국소화 도메인, 및 α(1-6) 코어 푸코실전이효소의 국소화 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 비상동 Golgi 잔류 폴리펩티드의 Golgi 국소화 도메인을 포함한다. 한 양태에서, 상기 Golgi 국소화 도메인은 만노시다제 II 또는 GnTI로부터 수득된다.

추가의 양상에서, 본 발명은 상기 방법을 사용함으로써 항-CCR5 항체의 당화 프로파일을 개질하는 방법에 관한 것이다. 이러한 양상에서, 본 발명은 GnTIII 활성을 갖고 비상동 Golgi 잔류 폴리펩티드의 Golgi 국소화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 사용함으로써, 항-CCR5 항체의 당화를 개질하는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 GnTIII의 촉매적 도메인을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 Golgi 국소화 도메인은 만노시다제 II의 국소화 도메인, GnTI의 국소화 도메인, 만노시다제 I의 국소화 도메인, GnTII의 국소화 도메인, 및 α(1-6) 코어 푸코실전이효소의 국소화 도메인으로부터 선택된다. 한 양태에서, Golgi 국소화 도메인은 만노시다제 II 또는 GnTI로부터 수득된다.

본 발명에 따라서, 항-CCR5 항체의 상기 개질된 올리고당은 하이드리드 또는 착물일 수 있다. 한 양태에서, 이등분된 비-푸코실화된 올리고당은 하이브리드이다. 다른 양태에서, 이등분된 비-푸코실화된 올리고당은 착물이다.

본원에 사용된 "GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드"는 N-결합 올리고당의 트라이만노실 코어의 β-결합 만노시드로의 β-1-4 결합중 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 첨가를 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 이들은 β(1,4)-N-아세틸글루코사민일전이효소 III(또한, 생화학 및 분자생물학의 국제 연맹의 명명법 위원회(NC-IUBMB)에 따라 β-1,4-만노실-당단백질 4-베타-N-아세틸글루코사민일-전이효소(EC 2.4.1.144)로서 공지됨)의 활성(투여량 의존적이거나 비의존적이고 특정 생물학적 어세이로 측정됨)과 유사하지만 필수적으로 동일하지는 않은 효소적 활성을 나타내는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 투여량 의존성이 존재하는 경우에, 이는 GnTIII의 투여량 의존성과 동일할 필요는 없지만, GnTIII과 비교되는 소정 활성의 투여량 의존성과 실질적으로 유사하다(즉, 후보 폴리펩티드는 GnTIII에 비해서 보다 큰 활성, 또는 약 25 배 이하로 적은 활성, 한 양태에서, 약 10 배 이하로 적은 활성, 다른 양태에서 약 3 배 이하로 적은 활성을 나타낸다). 본원에 사용된 용어 "Golgi 국소화 도메인"은 Golgi 착물내의 위치에 폴리펩티드를 고착시키는 Golgi 잔류 폴리펩티드의 아미노산 서열을 지칭한다. 일반적으로, 국소화 도메인은 효소의 아미노 종결 "꼬리"를 포함한다.

본 발명에 따른 항체는 Fc 감마 수용체 III(FcγRIII, CD16a)에 대한 높은 결합 친화도를 나타낸다. FcγRIII에 대한 높은 결합 친화도는 결합이 CHO 숙주 세포, 예컨대 CHO DG44 또는 CHO K1 세포에서 발현된 기준 물질로서 야생형 항-CCR5 항체(95 % 푸코실화)에 관하여 10 배 이상 CD16a/F158에 대해서 강화(실시예 5 참고)되고/되거나 결합이 100 nM의 항체 농도로 부동화된 CD16a를 사용하는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR)에 의해 측정된 야생형 항-CCR5 항체에 관하여 2 배 이상 CD16a/V158에 대해서 강화(실시예 3 참고)되는 것을 나타낸다. FcγRIII 결합은 당해 분야에 공지된 기술에 따른 방법에 의해, 예를 들어 Fc 부분의 아미노산 서열의 개질, 또는 항체의 Fc 부분의 당화에 의해 증가될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "CCR5에 결합하는"은 시험관내 어세이, 한 양태에서, 항체가 표면에 결합되고 CCR5의 결합이 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정되는 결합 어세이에서의 CCR5로의 항체의 결합을 나타낸다. 결합은 10^-8 M 이하, 한 양태에서, 10^-13 M 내지 10^-9 M의 결합 친화도(K_D)를 의미한다. CCR5 또는 FcγRIII으로의 항체의 결합은 바이아코어 어세이(BIAcore assay)(스웨덴 웁살라 소재 파마시아 바이오센서 에이비(Pharmacia Biosensor AB))에 의해 조사될 수 있다. 상기 결합의 친화도는 용어 ka(항체/항원 착물로부터의 항체의 회합에 대한 속도 상수), kd(해리 상수) 및 K_D(kd/ka)로서 정의된다. 본 발명에 따른 항체는 CCR5로의 결합에 대해 10^-8 M 이하의 K_D를 나타낸다.

용어 "CCR5 발현 세포"는 (a) 자연적으로 CCR5를 발현하는 세포(예컨대, CD4+ 및 CD8+ T-세포, 및 단핵세포 및 다른 면역 세포), (b) 재조합적으로 엔지니어링된 마우스 L1.2 세포(ATCC HB204) 및 CHO 세포(CHO K1 - ATCC CCL-61, CHO DG44 - 문헌[Urlaub et al., Cell 33 (1983) 405-412]), 또는 다른 세포주, 또는 (c) 사이토카인, HIV, 나트륨 부티레이트 또는 다른 자극제에 의한 자극 후 CCR5를 발현하는 세포를 지칭한다.

용어 "CCR5+"는 이의 외부 세포 막 표면상에 케모카인 수용체 CCR5를 발현하고 제공하는 세포를 나타낸다.

용어 "항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)"은 작동자 세포의 존재하에 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 표적 세포의 용해를 지칭한다. 한 양태에서, ADCC는 작동자 세포, 예컨대 새로이 단리된 PBMC, 또는 연막으로부터 정제된 작동자 세포, 예컨대 단핵세포 또는 자연 킬러(NK) 세포, 또는 영구적으로 성장하는 NK 세포주의 존재하에 본 발명에 따른 항체에 의한 CCR5 발현 세포의 제제의 처리에 의해 측정된다.

본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 항원-결합 분자 및 폴리펩티드를 생성하도록 엔지니어링될 수 있는 임의의 종류의 세포성 시스템을 나타낸다. 한 양태에서, 숙주 세포는 개질된 글리코폼을 갖는 항원 결합 분자의 생성이 가능하도록 엔지니어링될 수 있다. 숙주 세포는 추가로 조작되어 GnTIII 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드의 증가된 수준을 발현한다. 한 양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.

숙주 세포의 단백질 발현을 위하여, 경쇄 및 중쇄 또는 이들의 단편을 코딩하는 핵산이 표준 방법에 의해 발현 벡터에 삽입된다. 발현이 상기 숙주 세포에서 수행되고, 항체가 상기 세포(용해 후 상청액 또는 세포)로부터 회수된다. 항체의 재조합 제조를 위한 일반적인 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880]에 기술되어 있다.

항체는 전 세포(whole cell), 세포 용해물, 또는 정제된 형태로 존재할 수 있다. 다른 세포성 성분 또는 오염물, 예컨대 세포성 핵산 또는 단백질을 제거하기 위하여, 표준 기술, 예컨대 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동, 및 당해 분야에 널리 공지된 다른 기술에 의해 정제가 수행된다(예를 들어, 문헌[Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 참고).

원핵 생물에 적합한 조절 서열은, 예를 들어 프로모터, 선택적으로 작동유전자 서열, 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵 생물의 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적인 관계가 있는 경우에 "작동가능하게 결합된다". 예를 들어, 프리-서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(secretory leader)를 위한 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참가하는 프리-단백질(pre-protein)로서 발현되는 경우에 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동가능하게 결합되거나; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 주는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 결합되거나; 또는 리보좀 결합 부위가 번역을 용이하게 하도록 위치되는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 결합된다. 일반적으로, "작동가능하게 결합된"은 결합된 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우에는 인접하고 판독 프레임내에 위치한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 결합은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 결합기가 편리한 실시에 따라 사용된다.

단일클론성 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예컨대 단백질 A-세파로스 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 매질로부터 적절히 분리된다. 단일클론성 항체를 코딩하는 DNA 및 RNA는 통상적인 과정에 의해 용이하게 단리되고, 시퀀싱(sequencing)될 수 있다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA 및 RNA의 공급원으로서 역할을 할 수 있다.

본 발명의 양상은 환자에게 본 발명에 따른 항체를 투여함을 특징으로 하는, 동종이식편 거부반응을 앓고 있는 환자의 치료 또는 예방, 및 염증 및 다른 면역-매개된 질병의 치료를 위한 방법이다. 동종이식편 거부반응의 치료 또는 예방용, 염증의 치료용, 또는 다른 면역-매개된 질병의 치료용 약제의 제조를 위한 항체의 용도가 또한 본 발명의 양상이다.

또한, 본 발명의 양태는 이식편 거부반응 또는 이식편 대 숙주 질환을 앓고 있는 환자에게 본 발명에 따른 항체를 투여함을 특징으로 하는, 상기 환자의 치료 방법이다. 이식편 거부반응 또는 이식편 대 숙주 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도가 또한 본 발명의 양상이다.

본 발명의 한 양상은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물이다. 본 발명의 다른 양상은 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다. 본 발명의 다른 양상은 본 발명에 따른 항체 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법이다. 한 양태에서, 약학 조성물은 본 발명에 따른 항체 및 면역억제제의 조합을 포함한다.

용어 "면역억제제"는 유기체에 투여되는 경우 상기 유기체의 면역 반응을 감소시키거나 억제하는 화합물을 나타낸다. 면역억제제의 예는 칼시뉴린 억제제, 예컨대 카클로스포린(Caclosporin) A이다. 따라서, 한 양태에서, 면역억제제는 칼시뉴린 억제제이다. 다른 양태에서, 면역억제제는 사이클로스포린(Cyclosporin) A이다.

다른 양상에서, 본 발명은 약학적인 담체와 함께 제형화되고, 본 발명의 항체를 함유하는 조성물, 예를 들어 약학 조성물을 제공한다.

본원에 사용된 "약학적인 담체"는 생리학적으로 상용가능한 임의의 용매 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 살균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연 약품 등을 포함한다. 한 양태에서, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여(예컨대 주사 또는 주입에 의함)에 적합하다.

본 발명의 조성물은 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 변한다.

특정 투여 경로에 의해 본 발명의 화합물을 투여하기 위하여, 이의 불활성화를 예방하는 물질로 화합물을 코팅하거나, 또는 이러한 물질과 함께 화합물을 병용-투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 적절한 담체, 예를 들어, 리포솜, 또는 희석제중에서 대상에게 투여될 수 있다. 약학적으로 허용되는 희석제는 염수 및 수성 완충 용액을 포함한다.

약학적인 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 약품의 사용은 당해 분야에 공지되어 있다.

본원에 사용된 어구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여되는"은, 장 및 국소 투여 외에, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 협막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 기관지경, 피하, 표피밑, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 또한 보조제, 예컨대 방부제, 습윤제, 에멀젼화제 및 분산제를 포함할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 상기 멸균 과정, 및 다양한 살균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 또한, 등장성 약품, 예컨대 당, 나트륨 클로라이드 등을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사용 약학 형태의 연장된 흡수가 흡수를 지연시키는 약품, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 야기될 수 있다.

선택된 투여 경로에 관계 없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는, 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 약학 조성물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용되는 투여 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물내의 활성 성분의 실제 투여 수준은 환자에게 독성 없이 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대한 목적 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하기 위하여 변화될 수 있다. 선택된 투여 수준은 다양한 약동학적 인자, 예컨대 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배설 속도, 치료의 지속 시간, 사용된 특정 조성물과 병용되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적인 건강 및 이전의 의학적인 병력, 및 의학 분야에 널리 공지된 인자 등에 따라 변한다.

조성물은 멸균이어야 하고, 주사기에 의해 전달가능한 정도로 유동적이어야 한다. 한 양태에서, 물 외에, 담체는 등장성 완충된 염수 용액이다.

적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 약품, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 나트륨 클로라이드를 조성물내에 포함하는 것이 유리하다.

이식은 다양한 세포 유형, 조직 형태 및 기관 유형, 예컨대 췌장 섬, 각막, 골수, 줄기 세포, 피부 이식편, 골격근, 대동맥 및 대동맥 판막, 및 심장, 폐, 신장, 간 및 췌장과 같은 기관을 사용하여 당해 분야의 기술에 따라 수행된다.

본 발명은 GvHD(이식편 대 숙주 질환) 또는 HvGD(숙주 대 이식편 질환)(예컨대, 이식 후)를 앓고 있는 환자의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 GvHD 및 HvGD를 앓고 있는 환자의 치료 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 GvHD 또는 HvGD의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.

본 발명의 또한 CCR5에 의해 매개되는 염증 매개자 방출을 앓고 있는 환자의 치료를 위해, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 약학 제제의 제조를 위한 효과량인, 본 발명에 따른 항체의 용도을 제공한다.

본원에 사용된 용어 "이식편 거부반응"은 이식된 조직에 대한 인간 면역 시스템의 반응을 나타낸다. 조직이 공여자로부터 숙주에 이식되는 경우, 공여자의 조직의 인간 백혈구 항원 유전자는 아마도 숙주의 조직의 유전자와는 상이하다. 따라서, 숙주의 면역 시스템은 이식된 조직을 이질적인 것으로 인식하고, 이식편 거부반응으로 지칭되는 면역 반응을 수행한다. 이러한 이식편 거부반응은 "이식편 대 숙주 질환(GvHD)"으로 지칭된다.

용어 "당쇄는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현되는 CCR5에 결합하는 항체의 Asn297에 부착된 N-결합 글리칸의 특징을 나타낸다"는 본 발명에 따른 항체의 Asn297에서의 당쇄가 푸코스 잔기를 제외하고는 개질되지 않은 CHO 세포에서 발현된 항-CCR5 항체, 예컨대 국제특허공개 제WO 2006/103100호에 따른 항-CCR5 항체의 당쇄와 동일한 구조 및 당 잔기 서열을 가짐을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "NGNA"는 당 잔기 N-글리콜릴뉴라민산을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 인간을 비롯한 포유동물에게 본 발명에 따른 항체를 투여함을 특징으로 하는, 상기 포유동물의 급성 및 만성 기관 이식 거부반응의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 인간을 비롯한 포유동물의 급성 및 만성 기관 이식 거부반응의 치료 또는 예방을 위한 본 발명에 따른 항체가 또한 제공된다. 또한, 본 발명은 급성 및 만성 이식 거부반응의 치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명에 다른 항체의 용도를 포함한다.

5 마리의 사이노몰거스 원숭이가 심장 동종이식편 수용자로서 선택되었다. 단독으로(n = 2, 단일 요법), 또는 치료적 투여량의 사이클로스포린 A와 병용으로(CsA, n = 3, 병용 요법), 원숭이를 본 발명에 따른 항체로 치료하였다. 본 연구는 본 발명에 따른 항체가 다음과 같이 면역억제성임을 나타냈다:

- 단일 요법에 의해 관찰된 연장된 이식편 생존을 미치료된 대조군과 비교하였다(19 ± 5.7 일 대 6.4 ± 0.4 일; p = 0.034),

- 본 발명에 따른 항체 및 CsA의 병용 용법에 의한 만성 동종이식편 거부반응(만성 동종이식편 혈관병증(CAV))의 억제를 CsA 단일 요법과 비교하였다(CAV 점수: 0.2 ± 0.1 대 1.9 ± 0.4, p=0.024),

- 본 발명에 따른 항체 및 CsA의 병용 용법에 의한 항-공여자 동종항체 생산의 억제를 CsA 단일 요법과 비교하였다,

- 본 발명에 따른 항체 및 CsA의 병용 용법에 의한 연장된 1 차 이식편 생존을 면역억제의 증거를 갖는 CsA 단일 요법과 비교하였다.

용어 "병용 요법"은 단일 제형 또는 2 개의 별개 제형으로서 본 발명에 따른 항-CCR5 항체 및 면역억제제의 투여를 지칭한다. 투여는 동시 또는 임의의 순서로 순차적일 수 있고, 이때, 한 양태에서, 활성 약품 둘다(또는 모두)가 이들의 생물학적 활성을 동시해 발휘하는 기간이 존재한다. 상기 항-CCR5 항체 및 상기 면역억제제는 병용 요법으로(예를 들어, 연속적인 주입(항체용 하나, 및 결국 면역억제제용 하나)을 통해 정맥내로) 동시에 또는 순차적으로 투여된다.

연구자, 수의사, 의학 박사 또는 다른 의료진에 의해 추구되는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 개별적인 화합물 또는 조합의 양인 "치료적 효과량"(또는 간단히 "효과량")으로 항체가 환자에게 투여됨이 자명하다.

상기 항-CCR5 항체 및 상기 면역억제제의 양 및 투여 시기는 치료되는 환자의 유형(종, 성별, 연령, 체중 등) 및 병태, 및 치료되는 질병 또는 병태의 중증도에 따라 다르다. 질병의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg(한 양태에서, 10 내지 25 mg/kg)의 상기 항-CCR5 항체 및 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg(한 양태에서, 5 내지 20 mg/kg)의 상기 면역억제제가 약물 둘다를 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다.

따라서, 본 발명의 한 양상은 면역억제제와의 병용 요법에 의한 이식편 거부반응의 치료용 약제의 제조를 위한 항-CCR5 항체의 용도이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항-CCR5 항체 및 면역억제제의 병용 요법에 의한 환자의 이식편 거부반응의 치료 방법을 포함한다.

본 발명의 다른 양상은 면역억제제와의 병용 요법에 의한 항-공여자 동종항체 생산의 치료용 약제의 제조를 위한 항-CCR5 항체의 용도이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항-CCR5 항체 및 면역억제제의 병용 요법에 의한 환자의 항-공여자 동종항체 생산의 치료 방법을 포함한다.

용어 "동종항체"는 동일한 종의 인간으로부터의 이질적인 조직에 대항하여 유기체에 의해 발생하는 항체를 나타낸다.

본 발명에 따른 항체에 의해 CCR5를 표적화함으로써, CCR5+ 세포가 격감됨에 따라 급성 동종이식편 거부반응이 감소되거나 심지어 예방될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 항체를 적용함으로써, 연장된 동종이식편 생존 및 완전히 예방된 만성 거부반응(CAV 발병 및 중증도에 의해 증명됨)이 관찰되었다.

따라서, 본 발명의 양상은 동종이식편 거부반응의 예방, 또는 동종이식편 수용자의 동종면역반응의 치료를 위한 본 발명에 따른 항-CCR5 항체의 용도, 동종이식편 거부반응의 예방용, 또는 동종이식편 수용자의 동종면역반응의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항-CCR5 항체의 용도, 및 본 발명에 따른 항체를 수용자에게 투여함을 포함하는, 동종이식편 수용자의 동종이식편 거부반응의 예방 방법, 또는 동종면역반응의 치료 방법이다. 한 양태에서, 본 발명에 따른 항-CCR5 항체는 면역억제제와 병용 요법으로 투여된다.

제 1 주 동안 3 내지 5일 내내, 이어서 매주 10 mg/kg의 항체 단일 요법으로 치료된 사이노몰거스 마카크에서, 심장 동종이식편은 미치료된 원숭이보다 상당히 긴 14 및 23 일 동안 생존하였다(MST 6.5 ± 0.4 일; n = 5, p = 0.034)(도 5 참고). 급성 세포성 거부반응은 조직학적으로 확인되었다. 상기한 바와 같이 투여된 본 발명에 따른 항-CCR5 항체 및 CsA의 병용 요법을 사용함으로써, 병용 치료된 3 마리의 동물중 어떠한 동물도 85 내지 90 일의 관찰의 끝까지 내내 증상적인 거부반응을 발병시키지 않았다. 이식편의 외식 후, 이식편이 거부반응의 임상적인 증거가 없음이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명에 따른 항-CCR5 항체 및 CsA의 병용 요법에 의한 치료 동안 검출가능한 급성 이식편 거부반응의 어떠한 에피소드도 존재하지 않았고, 모든 3개의 이식편이 약 90 일에 정상적인 기능을 갖고, 선택적으로 외식되었음이 밝혀졌다.

대조적으로, CsA 단일 요법으로 치료된 8 마리의 과거 동물중 4 마리에서, 증상적인 급성 동종이식편 거부반응의 제 1 에피소드(이식편 서맥 및/또는 감소된 수축성, 수용자 열병)가 90 일 전에(각각 7, 23, 44 및 71 일에) 검출되었다. 상기 동물중 3 마리에서, 거부반응은 스테로이드-반응성이었고(3 개의 일일 스테로이드 볼루스, 솔루-메드롤(Solu-Medrol, 등록상표), 10 mg/kg); 하나의 이식편이 치료가 개시되기 7 일 전에 거부되었다. 과거 대조군중 1 마리의 동물이 중심 정맥관 감염으로부터의 패혈증에 의해 26 일에 죽었다. 나머지 3 개의 과거 이식편은 선택적인 이식편 외식에 대한 급성 거부반응 없이 85 내지 90 일에 생존하였다.

따라서, 본 발명에 따른 항-CCR5 항체 및 CsA의 병용 요법이 연장된 이식편 생존 및 감소된 급성 이식편 거부반응을 제공함이 밝혀졌다. 중간 생존 시간 (MST)이 CsA 단일 요법에 의한 71 일에 대해 90 일 초과이었고(p = 0.13), 급성 거부반응의 발병률은 CsA 단독이 7 마리중 4 마리인 반면에 본 발명에 따른 항-CCR5 항체 및 CsA의 병용 요법은 3 마리중 0 마리이다(p = 0.2).

단일 요법하의 동종이식편 거부반응은 국제 심장 폐 이식 학회(ISHLT)에 따르면 심각한 급성 세포성 거부반응의 전형적인 특징을 나타냈다(등급 3R, 다중초점 심장 근세포 손상에 의한 확산 염증성 침투 및 관련된 부종 및 출혈을 동반함). 대조적으로, 거부반응 점수는 본 발명에 따른 항-CCR5 항체를 단독으로 사용하는 단일 요법 또는 치료되지 않은 경우에 비해서 본 발명에 따른 항-CCR5 항체 및 CsA의 병용 요법으로 치료된 원숭이에서 일관되게 낮았다(등급 0 또는 1). 현저하게는, CsA 단일 요법으로 치료된 모든 이식편이 외식에서 중간 내지 심각한 심장 동종이식편 혈관병증을 나타낸 반면에(CAV 중증도 점수 1.9 ± 0.4; 모든 점수 ≥ 1.5, N = 6), 본 발명에 따른 항-CCR5 항체 및 CsA의 병용 요법과 관련된 CAV 점수는 CsA를 사용하는 단일 요법에 비해서 상당히 감소하였다(0.2 ± 0.1, n = 3; p = 0.024 대 CsA)(도 6).

동종항체 합성은 항-CCR5 항체 단일 요법(10.7 mg/kg)으로 치료된 동물 둘다에서 2 주내에 검출되었다. 한 양태에서, 18 내지 22 mg/kg(21.4 mg/kg)의 본 발명에 따른 보다 높은 투여량의 항-CCR5 항체를 CsA와의 병용 요법으로 투여한 경우, 3 마리의 동물중 2 마리가 아무것도 10 %의 양성 역치에 도달하지 않으면서 단지 미량의/측정가능한 항-공여자 IgG 항체를 합성하였고, 이들중 단지 1 마리가 또한 1 개월에 일시적인 저-농도 IgM을 나타냈다. 대조적으로, 동종항체 생산이 CsA의 단일 요법으로 치료된 6/7(IgM) 및 4/7(IgG) 과거 대조군 동물에서 90 일내에 검출되었다. 따라서, 본 발명에 따른 항-CCR5 항체와의 병용 요법은 수반되는 칼시뉴린 억제제 요법의 맥락에서 심장 동종이식편에 반응하는 동종항체 합성을 약화시킨다. 본 발명의 한 양태에서, CsA는 매일 근육내로 15 ± 10 mg/kg의 투여량(즉, 5 내지 25 mg/kg의 투여량)으로 투여되어 400 ng/㎖ 초과의 치료적 최저 수준을 달성하였다.

따라서, 본 발명의 다른 양상은 동종항원에 대한 체액성 면역의 약화를 위해 칼시뉴린 억제제 요법과 병용되는 본 발명에 따른 항-CCR5 항체의 용도이다.

따라서, 유지 치료법으로서 CCR5 격감은 상당히 낮은 투여량의 CsA를 사용하도록 한다.

본 발명에 따른 항-CCR5 항체 단일 요법에 의해 지연된 이식편 거부반응 시의 조직학을 비교하면, 이식편의 세포성 침투는 단일 요법 단독으로는 예방되지 않았다. 구체적으로, 많은 수의 T-세포 및 대식세포가 항체 단일 요법과 관련된 부분적인 CCR5+ 세포 격감에도 불구하고 이식편에 들어간다.

단독의 또는 본 발명에 따른 항체와 병용된 CsA로 치료된 수용자에 대한 이식편 결과 및 조직학의 요약이 하기 표 1에 제시된다(제 2 생존은 급성 거부반응의 제 1 에피소드가 치료된 후 거부된 이식편이 외식된 시간을 나타낸다; >는 여전히 비팅(beating)하면서 외식된 이식편을 나타낸다; CAV는 심장 동종이식편 혈관병증을 나타낸다; ISHLT는 국제 심장 폐 이식 학회에 따른 거부반응 점수를 나타낸다; CsA는 400 ng/㎖ 초과의 최저 수준을 달성하기 위하여 이식편 외식하에 매일 15 ± 10 mg/㎖로 제공된 사이클로스포린 A이다; "항체"는 -1, 5, 8, 14, 21 및 28 일에, 또는 이식편 외식까지 10 mg/kg으로 제공(단일 요법)되거나, 또는 -1, 5, 8, 14 일, 및 이어서 90 일까지 매주 20 mg/kg으로 제공(병용 요법)된 본 발명에 따른 항-CCR5 항체에 의한 치료를 나타낸다).

항체 기탁

하기 실시예, 도면 및 서열목록이 본 발명의 이해에 도움을 주기 위해 제공되고, 이의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 설명된다. 본 발명의 사상을 벗어남이 없이 설명된 과정에 대한 개질이 수행될 수 있음이 이해된다.

실시예

물질 및 방법

항체

항체로서 국제특허공개 제WO 2006/103100호 및 제WO 2008/037419호에 기술된 CCR5에 대한 IgG1 항체를 사용하였다(가변 영역은 서열식별번호 6 번 내지 서열식별번호 13 번을 참고하고, CDR 서열은 서열식별번호 4 번, 5 번 및 서열식별번호 21 내지 35 번을 참고함). 항체를 야생형 항체(WT Ab, 8 % 어푸코실화됨), 어푸코실화된 항체(어푸코실화된 Ab) 및 LALA 돌연변이 항체(제WO 2008/037419호 참고)(LALA 돌연변이 Ab)로서 사용하였다. 용어 LALA는 상기 항체의 불변 영역의 위치 234 및 235에서의 류신으로부터 알라닌으로의 아미노산 교환을 나타낸다(L234A, L235A).

플라스미드

발현 시스템은 CMV 프로모터 시스템을 포함하고(유럽특허 제EP 0 323 997호), 하기 표 2 및 3에 기술되어 있다.

인간 CCR5 세포주

인간 CCR5 수용체를 안정적으로 발현하는 L1.2 세포주(L1.2hCCR5 세포)를 인간 CCR5 주화성 어세이에 사용한다. L1.2hCCR5 세포를 10 % FBS, 10 단위/㎖ 페니실린, 10 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 0.1 mM 글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 55 μM 2-머캡토에탄올, 250 ㎍/㎖ 제네티신을 함유하는 RPMI 1640에서 배양한다(모두 인비트로겐(Invitrogen)에서 구입함). 주화성 어세이의 설정 직전에, 세포를 스피닝 다운(spinning down)하고, 주화성 완충액(0.1 % BSA(시그마(Sigma)) 및 10 mM HEPES 완충액(인비트로겐 코포레이션, 미국)을 함유하는 행크스 밸런스드 솔트 솔루션 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution HBSS, 인비트로겐))에 재현탁한다. 세포를 5 x 10⁶ 세포/㎖의 최종 농도로 주화성 어세이에 사용한다.

사이노몰거스 CCR5 세포주

사이노몰거스 CCR5 수용체를 안정적으로 발현하는 L1.2 세포주(L1.2사이노CCR5 세포)를 사이노몰거스 CCR5 주화성 어세이에 사용한다. L1.2사이노CCR5 세포를 L1.2hCCR5 세포와 동일한 성장 매질에서 배양한다. 세포를 어세이 전 날에 5 mM 나트륨 부티레이트(시그마)를 함유하는 성장 매질중에 8 x 10⁵ 세포/㎖의 세포 밀도로 시딩(seeding)한다. 주화성 어세이의 설정 직전에, 세포를 스피닝 다운하고, 주화성 완충액에 재현탁한다. 세포를 5 x 10⁶ 세포/㎖의 최종 농도로 주화성 어세이에 사용한다.

리간드의 제조

CCR5 리간드 인간 MIP1α, MIP1β 또는 RANTES(알앤드디 시스템즈(R&D Systems))를 주화성 완충액에 현탁하고, 10 nM의 최종 농도로 사용한다. LALA 돌연변이 Ab 및 이소타입(Isotype) 대조군 마우스 IgG2_A(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국)를 주화성 완충액에 희석한다.

항-CCR5 항체의 제조

플라스미드 pETR 3928을 이전에 플라스미드 pETR 2896으로 형질감염된 글루타민 원영양체 CHO 또는 HEK293 숙주 세포(유럽특허 제EP 0 256 055호)에서 형질감염시켰다. 세포주를 혈청 부재 매질에서 14 일 이하 동안 유가 배양(fed batch cultivation)으로서 배양하여 상이한 양의 푸코실화를 갖는 항체 회분을 생성하였다(샘플 1 내지 4, CHO). 항체를 상청액으로부터 단리하고, 크로마토그래피 방법에 의해 정제하였다.

WT 항체(92 %의 푸코실화) 또는 LALA 돌연변이 Ab를 HEK 293 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주, CHO-DG44중에서 재조합적으로 제조한다(문헌[Flintoff, W.F., et al., Somat. Cell Genet. 2 (1976) 245-261; Flintoff, W.L., et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982) 275-285; Urlaub, G., et al., Cell 33 (1983) 405-412; Urlaub, G., et al., Somat. Cell Mol. Genet. 12 (1986) 555-566]). CHO-DG44 세포를 MEM 알파 마이너스 매질(MEM alpha Minus Medium, 깁코(Gibco) 번호 22561), 10 % 투석된 FCS(깁코 번호 26400-044) 및 2 mmol/ℓ L-글루타민, 100 μM 하이포잔틴, 16 μM 티미딘(HT 보충제)중에서 성장시켰다.

동물

사이노몰거스 원숭이(Macaca fascicularis)(3 내지 7 kg)를 혈액형 상용성인 것과 혼합 림프구 반응(MLR)-부적당하게 짝지었다(실제 SI 범위: 6-8). 동물을 문헌[the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (HHS, NIH Publication 86-23, 1985)]에 따라 통상적인 조건하에 사육하였다.

원숭이의 심장 이식 및 면역억제

모든 수용자 동물은 상기한 바와 같이 이소성 복부내 심장 동종이식편 이식을 거쳤다(문헌[Schroeder. C., et al., J. Immunol. 179 (2007) 2289-2299]). 2 마리의 동물을 -1, 5, 8, 14, 21 및 28 일에 매일 정맥내 주사에 의해 10 mg/kg의 항체 단일 요법으로 치료하였다. 3 마리의 추가 동물은 -1, 5, 8, 14 일, 및 이후 90 일까지 매주 20 mg/kg의 항체와 부가적인 사이클로스포린 A(CsA, 미국 오하이오주 베드포드 소재 베드포드 래보러토리스(Bedford Laboratories)로부터의 제너릭 제형)를 수용하였다. CsA를 수술 일로부터 90 일까지 매일 1 회 제공하여(15 ± 10 mg/kg으로 근육내(IM)) 목적 최저 수준(400 ng/㎖ 초과)을 달성하였다. 급성 거부반응 에피소드를 경험하는 동물은 3 일 과정의 스테로이드를 수용하여(10 mg/kg 볼루스, 솔루-메드롤(등록상표), 미국 미시간주 칼라마주 소재 파마시아(Pharmacia)) 90 일의 이식편 생존을 얻었다. 개흉 심장 생체검사(open cardiac biopsies)를 이식편 혈관이식 후 30 분 및 수술 후 5 (단일 요법만), 14, 28 및 56 일에 수행하였다. 이식편 기능은 이식된 텔레메트리(미국 미네소타 세인트 폴 소재 데이터 사이언시스 인터내셔널(Data Sciences International))에 의해 적어도 매일 모니터링하였다. 임상적인 급성 이식편 거부반응이 3 개의 중요한 신호중 2 개에 근거하여 의심되었다: 일정하게 높은 체온(38.5 ℃ 초과); 이식 심박수의 감소(120 미만의 분 당 비트(bpm), 또는 안정한 기준선으로부터 40 bpm(약 20 %)을 초과하는 지속적인 강하); 또는 기술적인 측정 결과에 기인하지 않는 20 mmHg 초과의 이식편 맥압(수축기 혈압 - 이완기 혈압)의 감소. 이식편 파괴는 텔레메트리에 의한 수축의 손실로서 정의되고, 외식에서의 시각화에 의해 확인되고, 급성 거부반응의 신호가 항상 선행한다. 매일 DSI 텔레메트리 시스템을 사용하여 체온을 측정하고, 하나의 아침 측정치로서 기록하였다. 기준 동물은 치료를 받지 않거나(n = 5), 또는 400 ng/㎖ 초과의 목표 최저 수준을 달성하도록 투여된 CsA를 수용하는(CsA 단일 요법, n = 8) 과거 동물을 포함한다.

CBC 및 FACS 분석

완전한 혈액 세포(CBC) 어세이를 원숭이 설정을 사용하여 자동화된 세포 계수기(헤마베트(Hemavet))를 사용하여 새로이 수집된 EDTA-혈액에서 수행하였다. EDTA(100 ㎕)중에 수집된 전혈, 및 림프절(LN)로부터 단리된 세포(1 x 10⁶ 세포)를 규칙적인 간격으로 CCR5의 발현에 대해 분석하였다. 간략하게는, 세포를 FACS 세척 완충액(10 % FCS 및 0.2 % 나트륨 아자이드가 보충된 PBS(포스페이트 완충된 염수))중 PerCP-Cy5.5-공액된 항-인간 CD4 mAb(L200, 비디 파민겐(BD Pharmingen), 미국 캘리포니아주 샌 디에고), APC-공액된 항-인간 CD8α(3B5, 칼태그(Caltag), 인비트로겐, 미국 캘피포니아주 칼스배드), 알렉사플루오르488(AlexaFluor488)-공액된 항-인간 CD14(M5E2, 비디 파민겐, 미국) 및 PE-공액된 항-인간 CD195(CCR5)(3A9, 비디 파민겐, 미국)로 4℃에서 20 분 동안 염색하였다. 적혈구를 BD FACS라이스(FACSLyse)로 용해시켰다. 일부 실험에서, 세포를 또한 CXCR3에 대해 알렉사플루오르488-공액된 항-인간 CD183(CXCR3)(1C6, 비디 파민겐, 미국)으로 염색하고, 두 경우에, 이식편 침투 세포(GIL)를 콜라겐아제 소화 및 피콜(Ficoll) 구배 분리에 의해 단리하고, 상기한 바와 같이 염색하였다. 림프구 집단을 전방/측면 산란 분석에 의해 통문(gating)하여 잔해를 제거하였다. 데이터 분석 및 그래프 디스플레이를 셀퀘스트(CellQuest) 또는 윈리스트(Winlist) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 혈액내 CD4+ 및 CD8+ 림프구중 CCR5-양성 세포의 비율을 감별 분석으부터의 림프구 수로부터 계산된 CD4 및 CD8의 절대 수와 곱하여 혈액 1 ㎕ 당 CCR5 + CD4+ 및 CCR5 + CD8+ 세포의 절대 수를 수득한다.

항-공여자 동종항체의 검출

동종항체를 상기한 바와 같이 유세포분석(flow cytometry)에 의해 후향적으로 측정하였다(상기 슈뢰더(Schroeder, C.) 등의 2007년 문헌 참고). 간략하게는, 보관된 동결된 공여자 비장세포(0.5 x 10⁶ 세포)를 4 ℃에서 30 분 동안 열-불활성화된 수용자 혈청(50 ㎕)과 함께 배양하였다. 세척 후, 항체 결합을 PE-표지된 염소 항-인간 IgM(Fcγ 특이적) 항체(바이오소스(Biosource), 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드), 또는 바이오틴-표지된 염소 항-원숭이 IgG(Fcγ 특이적) 항체(노르딕(Nordic), 네덜란드 틸부르그) 및 이어서 PE-표지된 스트렙타비딘(비디 파민겐, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)을 사용하여 나타냈다. FITC-표지된 항-인간 CD3(비디 파민겐, 미국)을 첨가하여 T-세포를 통문하였다. 데이터를 이식 전 수준을 뺀 후의 이식 후 T-세포 양성의 계산된 백분율로서 표현하였다. 반응성은 10 % 초과의 증가로서 정의되었다.

조직학

조직을 10 % 포르말린으로 고정하고, 파라핀 포매(embedding)를 위해 일상적으로 처리하였다. 파라핀-포매된 조직의 구역을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 세포성 침투를 ISHLT 기준에 의해 급성 거부반응에 대하여 등급을 매겼다. 70 일 후 외식된 비팅 심장의 CAV 발병을 각각의 시점에서 관련된 동맥 및 소동맥 혈관의 백분율로서 기록하였다(CAV 점수 ≥ 1). CAV 중증도를 상기 외식된 심장에서 다음과 같이 점수매겼다: 등급 0, 정상적인 동맥 형태; 등급 1, 확대된 핵 및/또는 점착성 백혈구를 갖고, 루미날 협착(luminal narrowing)이 없는 활성화된 내피 세포(< 10 %); 등급 2, 뚜렷한 신생내막의 두꺼워짐, 루미날 협착 < 50 %; 등급 3, 50 % 초과의 루미날 폐색을 갖는 광범위한 신생내막 증식. 점수매김은 치료군에 대해 모르는 3 명의 평가자에 의해 각각의 외식된 심장에 대해 독립적으로 수행되었다. 각각의 생체검사 또는 외식에 대한 평균 CAV 점수를 다음과 같은 식을 사용하여 계산하였다: [(#등급 0 - 혈관 x 0) + (#등급 1 - 혈관 x 1) + (#등급 2 - 혈관 x 2) + (#등급 3 - 혈관 x 3)]/(점수매긴 동맥 혈관의 총 수). 개별적인 이식편 평균 CAV 점수를 평균하여 각각의 치료군에 대한 군 평균(± SD)을 계산하였다.

면역조직화학

면역조직화학적 염색을 다음과 같은 자동화된 방법을 사용하여 수행하였다. 포르말린 고정된 파라핀 포매된(FFPE) 조직 구역을 탈-파라핀화하고, ABC 방법을 사용하여 벤타나(Ventana) ES 자동화된 염색기(벤타나 메디칼 시스템즈 인코포레이티드(Ventana Medical Systems, Inc.), 미국 아리조나주 투크슨)에서 염색하였다. 벤타나 장치에 위치된 모든 시약은 벤타나로부터 구입하였다. 설정을 마일드 CC1, 컨디셔너 1, 및 표준 1로 조정하였다. 하기 1 차 항체를 사용하였다: CD3(2GV6, 벤타나, 미국), CD68(KP1, 다코(DAKO)) 및 CD20(L26, 다코, 덴마크 코펜하겐). 항체 단일 요법으로 치료된 동물 및 비치료된 대조군에 대하여, 세포의 수를 다음과 같이 계산하였다: 낮은, 중간 또는 강한 세포성 침투를 갖는 조직의 면적을 평가하고, 이어서 대표적인 필드에 상응하는 10 개의 그림을 취하였다. 이어서, 필드 당 세포의 수를 계수하고, 필드 당 세포의 평균을 계산하였다. 조직 샘플이 상이한 블록으로 분리되는 경우, 모든 블록을 별도로 처리하고, 모든 블록에 대한 세포의 수/필드를 평균하여 조직 샘플에 대한 세포 수를 수득하였다. 항체 및 CsA의 병용 요법, 및 CsA 단일 요법 대조군으로 치료된 동물에 대해서, 하기 등급을 사용하여 세포성 침투를 점수매겼다: 0, 세포의 부재; 1, 집중적인 염색 또는 약한 확산; 2, 1 내지 3 개의 작은 마디 또는 마일드 확산 간질성 침투; 3, 3 내지 10 개의 작은 마디 또는 중간 침투; 4, 10 개 초과의 작은 마디 또는 강한 침투; 5, 대량 침투.

실시간 PCR

심장 조직을 액체 질소에서 스냅 동결하고, -70 ℃에서 저장하였다. 전체 RNA를 추가 분석을 위해 퀴아젠(Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아)에서 시판중인 알엔이지(RNeasy) 미니 키트를 사용하여 심장 이식편으로부터 단리하였다.

약물 수준 분석

혈청 샘플을 각각의 연구 시점에 수집하고, 항체 수준을 측정하였다. CsA 혈장 수준을 HPLC 방법에 의해 측정하였다.

통계적인 분석

이식편 생존 시간을 중간 생존 시간(MST)으로서 표현하고, 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 도시하였다. 로그-등급 시험을 사용하여 상이한 군 사이의 생존 시간을 비교하였다. 연속적인 변수를 달리 지시되지 않는 한 평균 + 표준 편차로서 표현하고, 만-휘트니(Mann-Whitney) 비-매개변수 시험을 사용하여 비교하였다. 공칭 변수(즉, 초기 거부반응의 발병률)를 분할표 및 피셔 정확 검정(Fischer exact test)을 사용하여 측정하였다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 모든 통계적인 분석을 윈도우 XP용 통계 패키지 SPSS(버젼 11.0, SPSS, 미국 일리노이주 시카고) 또는 그래프패드 인스태트(GraphPad InStat)(버젼 5.1, 그래프패드 소프트웨어, 미국 샌 디에고)를 사용하여 퍼스널 컴퓨터상에서 수행하였다.

실시예 1

CCR5로의 항-CCR5 항체의 결합

어푸코실화된 항체(Ab) 및 WT 항-CCR5 항체의 결합 능력이 비교되었다. 뮤린 L1.2hCCR5 세포주를 표적 세포주로서 사용하였다. 제 2 항체로서 FITC-공액된 어피니푸어(AffiniPure) F(ab)₂ 단편 염소 항-인간 IgG(Fcγ 특이적)(잭슨 이뮤노리서치 랩(Jackson ImmunoResearch Lab) 109-096-098)를 사용하였다. 항-인간 CCR5-FITC(벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson), BD 555992) 및 마우스 IgG2a-FITC를 대조군 항체로서 사용하였다. RPMI 1640 매질 + 10 % FCS + 1 % 글루타민 + 1 % 나트륨 피루베이트 + 0.05 mM β-머캡토에탄올 + 0.8 mg/㎖ G418이 세포 배양균 매질이었다. 세포 표면상에 hCCR5 발현을 유발하기 위하여, 0.2 Mio 내지 0.5 Mio 세포/㎖를 1 mM 나트륨 부티레이트(시그마 B5887)를 함유하는 매질에서 배양하였다. 나트륨 부티레이트 없이 배양된 세포는 음성 대조군으로서 역할을 했다.

방법:

PBS/0.1 % BSA에 희석된 0.2 Mio 세포/180 ㎕/웰을 96-환저 플레이트에서 평판배양하고, 20 ㎕의 희석된 항체를 첨가하였다. 4 ℃에서 30 분 동안 배양한 후, 세포를 PBS/0.1 % BSA로 세척하고, 15 ㎕/웰 희석된 제 2 항체 또는 대조군을 첨가하였다. 세포를 4 ℃에서 추가로 30 분 동안 배양하고, 이어서 2 회의 세척 단계를 거쳤다. FACS칸토(FACSCanto)에서 세포를 측정하기 전에, 프로피듐 요오다이드를 첨가하였다.

결과:

WT Ab 및 어푸코실화된 Ab는 항체 농도에 의존적인 표적 세포에 대한 유사한 결합을 나타냈다. EC₅₀ 값을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 4를 사용하여 항체 둘다에 대해 계산하였다. 100 ㎍/㎖ 항체에 대한 평균 값을 제외하였다. EC₅₀ 어푸코실화된 Ab: 0.1376; EC₅₀ WT Ab: 0.09407.

실시예 2

세포성 Fc 결합

WT Ab에 대한 어푸코실화된 Ab의 Fc-결합을 조사하였다.

10⁴ 이상의 CCR5 분자/세포를 발현하는 CHO 세포주가 표적 세포주로서 역할을 하였다. 제 2 Ab로서 항체 FITC-공액된 어피니푸어 F(ab)₂ 단편 염소 항-인간 IgG(F(ab)₂ 단편-특이적)(잭슨 이뮤노리서치 랩 109-096-097)를 사용하였다. 항-인간 CD16-FITC(벡맨 콜터(Beckman Coulter) PN IM0814); 마우스 IgG1 이소타입: 마우스 IgG1-FITC를 대조군으로서 사용하였다. 세포 배양 매질은 IMDM + 글루타맥스+ 25 mM HEPES(깁코 31980) + 10 % FCS + HT 보충제 + 6 μM 푸로마이신이었다. 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포)를 T150 플라스크에서 배양하였고, 13 x 10⁶ 세포/플라스크의 밀도에 도달할 때 어세이에 사용하였다. 세포를 트립신/EDTA로 수확하였다.

세포 배양균:

매질: IMDM + 글루타맥스 + 25 mM HEPES(깁코 31980) + 10 % FCS + HT 보충제 + 6 μM 푸로마이신 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포)를 T150 플라스크에서 배양하고, 13 Mio 세포/플라스크의 밀도에 도달할 때 어세이에 사용하였다. 세포를 트립신/EDTA로 수확하였다.

방법:

PBS/0.1 % BSA중에 희석된 0.2 Mio 세포/180 ㎕/웰을 96-환저 플레이트에서 평판배양하고, 20 ㎕의 희석된 항체를 첨가하였다. 4 ℃에서 30 분의 배양 후, 세포를 PBS/0.1 % BSA로 세척하고, 12 ㎕/웰 희석된 2 차 항체 또는 대조군을 첨가하였다. 세포를 4 ℃에서 추가로 30 분 동안 배양하고, 이어서 2 회의 세척 단계를 거쳤다. 세포를 4 ℃에서 20 분 동안 2 % PFA로 고정하고, 이어서 FACS칸토에서 이들을 측정하기 전에 세척 단계를 거쳤다(도 1).

실시예 3

FcγRIII(CD16a)에 대한 항-CCR5 항체의 친화도의 측정

His-CD16a는 CM5-칩의 표면에 커플링된 아민이었다. 측정을 바이아코어(등록상표) 3000 장치상에서 수행하였다. 실행 및 희석 완충액은 HBS-P였다. 칩 표면을 His-CD16a로 포화시켰다. 아민 커플링 기를 포화시켰다. 분석물을 10 nM의일정한 농도로 완충액 흐름에 첨가한 반면, 억제제인 가용성 CD16a를 증가하는 농도(0 내지 1,000 nM)로 완충액 흐름에 첨가하였다. RU 값은 항체와 CD16a 사이의 친화도를 반영한다.

실시예 4

NK 세포상 FcγRIIIa에 결합하는 항-CCR5 단일클론성 항체의 잠재력

자연 킬러(NK) 세포상 FcγRIIIa(CD16)에 결합하는 본 발명의 항체의 능력을 측정하기 위하여, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하고, FcγRIIIa에 대한 차단 마우스 항체(항-CD16, 클론 3G8, RDI, 미국 뉴저지주 플란더스) 20 ㎍/㎖의 존재 또는 부재하에 20 ㎍/㎖의 항체 및 대조군 항체와 함게 배양하여 FcγRIIIa를 통한 결합을 확인하였다. 음성 대조군으로서, FcγRIIIa를 결합하지 않는 인간 IgG2 및 IgG4(결합 부위)가 사용되었다. 인간 IgG1 및 IgG3(결합 부위)을 FcγRIIIa 결합을 위한 양성 대조군으로서 포함한다. NK 세포상의 결합된 항체는 PE-표지된 마우스 항-인간 CD56(NK-세포 표면 마커) 항체(비디 바이오사이언시스 파르민겐, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)를 FITC-표지된 염소 F(ab)₂ 항-인간 IgG(Fc) 항체(프로토스 이뮤노리서치(Protos Immunoresearch), 미국 캘리포니아주 벌링게임)와 병용하여 사용하는 FACS 분석에 의해 검출된다. 최대 결합(B_max)은 20 ㎍/㎖의 항체 농도에서 측정된다. 인간 IgG1의 100 % B_max에 비해서, 대조군 항체(인간 IgG4)는 30 % 이하의 B_max를 나타낸다. 따라서, "FcγRIIIa 결합의 부존재 또는 ADCC의 부존재"는 20 ㎍/㎖의 항체 농도에서 인간 IgG1에 대해 30 % 이하의 B_max 값을 의미한다.

크로뮴 ⁵¹ -방출 어세이에 의한 ADCC 및 CDC의 측정

물질:

아머샴(Amersham)으로부터의 크로뮴, Cat CJS11; 환저 폴리프로필렌 플레이트 코스타, Cat 3790; 루마플레이트(Lumaplate)-96(고체 섬광체 코팅된 폴리스타이렌 플레이트): 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)로부터, 부품 번호 - 6006633.

표적 세포: CCR5-발현 세포(L1.2 세포주, 실시예 2 참고).

작동자 세포 또는 보체 혈청(인간 PBMC, 단리된 NK 세포)

방법:

1 x 10⁶ 표적 세포를 37 ℃에서 1 시간 동안 100 μCi의 크롬⁵¹로 표지하였다. 표지된 세포를 매질로 4 회 세척하고, 5 ㎖(200,000 세포/㎖의 농도)에 재현탁하였다. 50 ㎕의 표적 세포(200,000 세포/㎖의 농도)를 웰 마다 평판배양하였다. 50 ㎕의 시험 항체를 상이한 농도로 첨가하고, 4 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 목적 E:T 비로 보체 혈청 또는 작동자 세포(목적 비에서)를 첨가하고, 세포를 37 ℃에서 4 시간 동안 배양하였다.

대조군:

자발적인 용해 대조군, 50 ㎕ 표적 세포 및 100 ㎕ 배양균 매질을 혼합하고, 측정하였다. 최대 용해를 50 ㎕ 표지된 표적 세포 + 50 ㎕ 트라이톤(Triton)-X-100(PBS중 1 %) + 50 ㎕ 매질을 사용하여 측정하였다. 배양의 종결 시에 50 ㎕의 배양균 상청액을 루마(Luma) 플레이트에 첨가하였다. 결과를 탑 카운트에서 판독하였다. 세포독성을 다음과 같은 식을 사용하여 계산하였다: 백분율 세포독성 = [(샘플 CPM - 자발적인 용해 CPM) / (최대 용해 CPM - 자발적인 용해 CPM)] * 100.

결과가 도 2에 제시된다.

실시예 5

CCR5 주화성 어세이

인간 CCR5를 함유하는 L1.2hCCR5 세포 또는 사이노몰거스 CCR5를 함유하는 L1.2mCCR5를 10 % 소 태아 혈청, 1x 페니실린/스트렙토마이신, 1x 글루타민, 1x 나트륨 피루베이트, 1x β-머캡토에탄올 및 250 ㎍/㎖ G418(모두 인비트로겐으로부터 구입함)을 함유하는 RPMI 1640중에서 배양하였다. 주화성 어세이의 설정 직전에 세포를 스피닝 다운하고, 주화성 완충액(0.1 % BSA 및 10 mM HEPES를 함유하는 행크스 밸런스드 솔트 솔루션 HBSS(인비트로겐))에 재현탁하였다. 세포를 5 x 10⁶ 세포/㎖의 최종 농도로 주화성 어세이에 사용하였다. CCR5 리간드 hMIP1α, hMIP1β 또는 hRANTES(알앤드디 시스템즈)를 주화성 완충액에 희석하고, 20 nM의 최종 농도로 사용하였다. 시험 항체 또는 적절한 이소타입 대조군 항체를 HBSS에 희석하였다. 주화성을 0.5 μm 공극 96-웰 케모티엑스(ChemoTx, 등록상표) 시스템(뉴로프로브(Neuroprobe))에서 설정하였다. 각각의 항체를 하나의 CCR5 리간드와 혼합하고, 30 ㎕의 상기 혼합물을 케모티엑스(등록상표) 시스템의 바닥 웰에 위치시켰다. 필터 스크린을 바닥 웰의 상부에 위치시켰다. 각각의 항체를 L1.2hCCR5 또는 L1.2mCCR5 세포와 혼합하고, 20 ㎕의 상기 혼합물을 필터에 위치시켰다. 이어서, 플레이트를 적신 챔버에 위치시키고, 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 3 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 필터로부터 긁고, 플레이트를 테이블 탑 원심분리기에서 2,000 rpm으로 10 분 동안 회전시켰다. 이어서, 필터를 제거하고, 바닥 웰로 이동된 세포의 밀도를 제조사의 설명서에 따라 사이콴트(CyQUANT, 등록상표) 세포 증식 어세이 키트(인비트로겐) 및 스펙트라 맥스 제미니엑스에스(Spectra MAX GeminiXS) 플레이트 판독기(몰리큘라 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 검출하였다. IC₅₀을 프리즘 4(그래프패드)를 사용하여 계산하였다.

L1.2CCR5 세포를 어세이 전 24 시간에 2 mM 나트륨 부티레이트를 사용하여 8 x 10⁵ 세포/㎖로 시딩하였다. 항체를 CTX 완충액(HBSS, 0.1 % BSA, 10 mM HEPES)에 희석하였다. 리간드를 희석하였다(MIP1a MIP1b RANTES, CTX 완충액중 20 nM 저장액(2x)). 세포를 세척하고, 1 x 10⁷(2x)로 CTX 완충액(HBSS, 10 mM HEPES, 0.1 % BSA)에 재현탁하였다. 깊은 웰에서 블록을 제조하였다: 항체 + 리간드 및 상부 현탁액 항체 + 세포. 어세이를 101-5 케모티엑스(등록상표)(뉴로프로브) 플레이트에 대한 주화성으로 설정하고, 적신 챔버에서 37 ℃에서 3 시간 배양하였다. 필터의 상부로부터 세포를 세척하고, 긁고, 플레이트를 2,000 rpm으로 10 분 동안 회전시켰다. 필터를 제거하고, 각각의 바닥 웰로부터 10 ㎖ 상청액을 취하였다. 동결/해빙 후, 10 ㎖ 2x 사이콴트(인비트로겐)를 각각의 웰에 첨가하고, 결과를 형광판 판독기상에서 판독하였다.

결과:

인간 CCR5 세포의 이동을 WT Ab 및 어푸코실화된 Ab에 의해 효과적으로 차단하였다(표 5).

실시예 6

CCR5 ⁺ 세포의 생체내 격감

사이노몰거스 원숭이는 1 mg/kg 또는 10 mg/kg 어푸코실화된 Ab의 1 회 단일 정백내 주입을 수용하였다. 데이터는 혈액내의 지시된 서브세트(CD8+ 및 CD4+ T-세포 및 단핵세포)중 CCR5+ 세포의 %로서 제시되었다(도 3).

실시예 7

생체내 격감 독성 연구

목적: CD8+ 세포, CD4+ 세포 및 단핵세포의 전반에 걸친 CCR5 세포 발현을 모니터링하기 위함. CD8+ 세포가 어푸코실화된 Ab로 치료된 동물내에서 격감되는지를 측정하여 조직내의 CCR5 발현에 대한 치료 효과를 측정한다.

● 12 마리의 동물: 4 마리의 대조군, 21 mg/kg/일을 사용한 8 마리;

● 1 일 및 15 일에 투여;

● 염색을 위한 전혈;

● 예비투여(pre-dose) -6 일, 예비투여 1, 2, 4, 8, 15, 16, 18, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71 일;

● CD8+, CD4+, CD8+CD4+, 단핵세포중 CCR5+에 대한 염색(관문(gate)에 의함);

● CD8+ 및 CD4+중 CXCR3+에 대한 염색;

● 비드의 계수에 의한 격감 확인;

● 8, 15, 18, 71 일에 CCR5를 염색하기 위한 지라, 림프절 및 골수.

상기 결과가 도 4에 도시된다.

실시예 8

항체의 글리코구조의 분석

푸코스- 및 비-푸코스(어푸크스) 함유 올리고당 구조의 상대적인 비를 측정하기 위하여, 정제된 항체 물질의 방출된 글리칸을 MALDI-TOF 질량 스펙트로미트리에 의해 분석하였다. 이를 위하여, 단백질 골격으로부터 올리고당을 방출하기 위하여, 항체 샘플(약 50 ㎍)을 0.1 M 나트륨 포스페이트 완충액(pH 6.0)중 5 mU N-글리코시다제 F(프로자임(Prozyme) GKE-5010B)와 함께 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 방출된 글리칸 구조를 단리하고, 뉴팁-카본(NuTip-Carbon) 피펫 팁(글리젠(Glygen)으로부터 입수함: 뉴팁 1 내지 10 ㎕, Cat NT1CAR)을 사용하여 탈염시켰다. 제 1 단계로서, 3 ㎕ 1 M NaOH 및 이어서 20 ㎕ 순수(예컨대, 베이커(Baker)로부터의 HPLC-구배 등급, 4218), 3 ㎕ 30 % (v/v) 아세트산 및 다시 20 ㎕ 순수로 세척함으로써, 올리고당의 결합을 위해 뉴팁-카본 피펫 팁을 준비하였다. 이를 위해서, 각각의 용액을 뉴팁-카본 피펫 팁중 크로마토그래피 물질의 상부에 적재하고, 이를 통해 밀어냈다. 이어서, 상기 N-글리코시다제 F 다이제스트를 4 또는 5 회 위아래로 당김으로써, 10 ㎍ 항체에 상응하는 글리칸 구조를 뉴팁-카본 피펫 팁중 물질에 결합시켰다. 뉴팁-카본 피펫 팁중 물질에 결합된 글리칸을 상기한 바와 같은 방식으로 20 ㎕ 순수로 세척하고, 각각 0.5 ㎕ 10 % 및 2.0 ㎕ 20 % 아세토나이트릴을 사용하여 단계적으로 용리하였다. 이러한 단계를 위하여, 용리 용액을 0.5 ㎖ 반응 바이알에 충전하고, 각각 4 또는 5회 위아래도 당겼다. MALDI-TOF 질량 스펙트로미트리에 의한 분석을 위하여, 용출액을 둘다 합하였다. 이러한 측정을 위하여, 0.4 ㎕의 합한 용출액을 1.6 ㎕ SDHB 매트릭스 용액(20 % 에탄올/5 mM NaCl중에 5 mg/㎖로 용해된 2,5-다이하이드록시벤조산/2-하이드록시-5-메톡시벤조산[브루커 달토닉스(Bruker Daltonics) 209813])과 함에 MALDI 표적에서 혼합하고, 적절히 조정된 브루커 울트라플렉스(Bruker Ultraflex) TOF/TOF 장치를 사용하여 분석하였다. 일상적으로, 50 내지 300 회의 샷을 기록하고, 단일 실험으로 합계했다. 수득된 스펙트럼을 플렉스 분석 소프트웨어(브루커 달토닉스)로 평가하고, 검출된 각각의 피크에 대해 질량을 측정하였다. 이어서, 각각의 구조(예컨대, 각각 푸코스가 존재하거나 부재하는 착물, 하이브리드 및 올리고- 또는 고-만노스)에 대해 계산된 질량을 이의 이론적으로 기대되는 질량과 비교함으로써, 피크를 글리코구조를 함유하는 푸코스 또는 어푸코스(비-푸코스)에 할당하였다.

하이브리드 구조의 비를 측정하기 위하여, 항체 샘플을 동시에 N-글리코시다제 F 및 엔도-글리코시다제 H와 함께 다이제스팅하였다. N-글리코시다제 F는 단백질 골격으로부터 모든 N-결합 글리칸 구조(착물, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노스 구조)를 방출하고, 엔도-글리코시다제 H는 글리칸의 환원 말단에서 2 개의 GlcNAc-잔기 사이의 모든 하이브리드 유형 글리칸을 부가적으로 분해한다. 이어서, 이러한 다이제스트를 처리하고, N-글리코시다제 F 다이제스팅된 샘플에 대해 상기한 바와 동일한 방식으로 MALDI-TOF 질량 스펙트로미트리로 분석하였다. N-글리코시다제 F 다이제스트 및 합한 N-글리코시다제 F/엔도 H 다이제스트로부터의 패턴을 비교함으로써, 특이적인 글리코구조의 신호의 감소도를 하이브리드 구조의 상대적인 함량을 평가하는데 사용한다.

각각의 글리코구조의 상대적인 양을 개별적인 글리콜 구조의 피크 높이와 검출된 모든 글리코구조의 피크 높이의 합의 비로부터 계산하였다. 어푸코스의 상대적인 양은 N-글리코시다제 F 처리된 샘플(예컨대, 각각 착물, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노스 구조)에서 확인된 모든 글리코구조에 대한 푸코스-결핍 구조의 백분율이다(표 6 참고).

실시예 9

비-인간 영장류(사이노몰거스 원숭이)의 심장 이식의 모델에서 항-CCR5 항체-계 면역억제 요법

불일치한 공여자 동물로부터 심장 이식을 수용하는 사이노몰거스 원숭이의 CCR5+ 세포를 격감함에 있어서 단일클론성 항체 X의 효능이 증명되었다. CCR5+ 세포의 수를 이식 후 4 또는 5 일에 이식편에서 측정한다. 또한, 단일클론성 항체 X의 면역억제 효과를 동종이식편 생존의 지속 시간에 의해 측정된 바와 같이 단일 요법으로서 평가한다.

동물:

불일치한 성인 수컷 사이노몰거스 원숭이; 체중 약 3 내지 6 kg; 기존의 유의한 병리 없음, 특히 시미언 레트로바이러스와 같은 감염의 부존재.

N = 상 I의 5 개의 이식편(A + B).

[후에 상 I의 관찰을 입증하는 상 II 연구가 또한 기술됨: N = 10]

이식 과정:

모든 과정을 IACUC-승인된 프로토콜에 따라 수행한다:

수술 전 혈액형, MLR(ABO 상용성을 보장함, 고-반응자 = MHC-불일치). 보관 혈청, 림프구(기준선).

이소성 심장 이식(하나의 공여자, 하나의 수용자), 한계 위치, 텔레메트리 이식 D0.

생체검사 이식편(척추, 림프절) D4-5, D14, D28-30, D60, 외식 D90.

희생 D90, 또는 조기 이식편 외식 후 30 일.

D0, 각각의 생체검사일, + D21, + D45, + D75에 정맥천자(세포, 혈청), 동종항체에 대해, FACS, RO-수준, 미래 연구를 위해 보관된 세포.

D14 백신으로 면역시키고, 이어지는 반응을 모니터링함.

연구 고안:

단일 요법으로서, 항-CCR5 항체는 과거 대조군(6 일)보다 유의하게 긴 이식편 생존(10 일 초과)을 가능하게 한다. 동물이 거부될 때까지, 또는 90 일 동안(우선책) 치료된다.

10 mg/kg CCR5 항체(정맥내, 격주로 1 회)는 이식 후 90 일 이하 동안 투여된다. 이식편 생체검사 재료 및 혈액 샘플을 3 내지 5 일에 채취하고, 각각 IHC 및 FACS로 평가하였다. 이어서, 혈액 샘플을 14 일에, 30 일까지 주 당 1 회, 이어서 격주로 채취하였다. 생체검사 재료를 이식편 파괴 시 또는 90 일(둘중 빠른 날)에 실험이 종결될 때까지 매월 수득한다. 종결 시, 이식편을 CAV에 대해 평가한다. 이식편 파괴가 60 일 전에 발생한 경우, 동물을 추가로 30 일의 면역 모니터링 동안 이식편 외식 후 회수한다(동물의 상태가 허락하는 경우).

실시예 10

비-인간 영장류(사이노몰거스 원숭이)의 심장 이식의 모델에서 항-CCR5 항체-계 면역억제 요법 - 병용 요법

추가의 실험에서, 하나 이상의 다른 면역억제제와 병용되는 단일클론성 항체 X의 면역억제 효과는 심장 동종이식편 혈관병증(CAV)의 발병 및 중증도에 측정된 바와 같이 평가된다.

사용된 동물 및 이식 과정은 실시예 9에 기술되어 있다.

10 mg/kg CCR5 항체(정맥내, 격주로 1 회)를 이식 후 90 일 이하 동안 투여한다. 병용 요법은 이식편 손실 시까지의 PI에 의해 측정되는 바와 같이, 12.5 mg/kg(5 내지 20 mg/kg, 300 초과의 "치료적" 최저 CsA를 달성하는 수준에 의해 투여됨)으로 출발하는 사이클로스포린 A(CsA)로 이루어진다. 급성 거부반응(3 개의 중요한 신호중 2 개에 의해 진단됨: 감소된 이식편 심박수, 감소된 이식편 수축, 증가된 수용자 온도; 생체검사에 의해 확인된 진단)은 스테로이드로 치료된다. 이식편 생체검사 재료 및 혈액 샘플을 4, 5 및 14 일에 채취하고, 각각 IHC 및 FACS로 평가하였다. 이어서, 혈액 샘플을 14 일에, 30 일까지 주 당 1 회, 이어서 격주로 채취하였다. 생체검사 재료를 이식편 파괴 시 또는 90 일(둘중 빠른 날)에 실험이 종결될 때까지 매월 수득한다. 종결 시, 이식편을 CAV에 대해 평가한다. 이식편 파괴가 60 일 전에 발생한 경우, 동물을 추가로 30 일의 면역 모니터링 동안 이식편 외식 후 회수한다(동물의 상태가 허락하는 경우).

DSMZ(독일 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하) DSMACC2683 20040818

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Afucosylated antibodies against CCR5 and their use <130> 24712 WO <140> PCT/EP2009/000133 <141> 2009-01-13 <150> US 61/011348 <151> 2008-01-15 <160> 35 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 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Claims (23)

1. CCR5에 결합하고 Asn297에서 당쇄에 의해 당화되는 항체로서, 상기 당쇄내의 푸코스의 양이 65 % 이하인 항체.
2. 제 1 항에 있어서,
   당쇄내의 푸코스의 양이 5 내지 65 %인 항체.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   당 잔기 N-글리콜릴뉴라민산(NGNA)의 양이 1 % 이하이고/이거나 N-말단 알파-1,3-갈락토스의 양이 1 % 이하인 항체.
4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,
   NGNA의 양이 0.5 % 이하인 항체.
5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
   N-말단 알파-1,3-갈락토스의 양이 0.5 % 이하인 항체.
6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
   키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체인 항체.
7. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,
   CCR5에 대한 친화도가 약 10^-13 내지 10^-9 M(K_D)인 항체.
8. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서,
   중쇄 상보성 결정 영역(CDR)으로서 서열식별번호 6 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 7 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 8 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 9 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 10 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 11 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 12 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 13 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 14 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 15 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 16 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 19 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 16 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 20 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 17 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 19 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 17 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 20 번의 CDR, 중쇄 CDR로서 서열식별번호 18 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 19 번의 CDR, 또는 중쇄 CDR로서 서열식별번호 18 번의 CDR 및 경쇄 CDR로서 서열식별번호 20 번의 CDR을 포함하는 항체.
9. 인간 케모카인 수용체 유형 5(CCR5)에 결합하고 Asn297에서 당쇄에 의해 당화되는 항체로서, Fc 감마 수용체 III(FcγRIII)에 대한 높은 결합 친화도를 나타내는 항체.
10. 약학 조성물의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
11. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물.
12. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법.
13. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 항체를 인간을 비롯한 포유동물에게 투여함을 포함하는, 급성 또는 만성 기관 이식 거부반응의 치료 또는 예방 방법.
14. β(1,4)-N-아세틸글루코사민일전이효소 III(GnTIII) 및 항-CCR5 항체를 재조합적으로 발현하는 CHO 세포.
15. 제 14 항에 있어서,
    추가로 만노시다제 II(ManII)를 재조합적으로 발현하는 CHO 세포.
16. 인간을 비롯한 포유동물의 급성 또는 만성 기관 이식 거부반응의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
17. 동종이식편 거부반응의 치료 또는 예방용, 염증의 치료용, 또는 다른 면역-매개된 질병의 치료용 약제의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
18. 면역억제제와의 병용 요법에 의한 이식편 거부반응의 치료용 약제의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
19. 제 18 항에 있어서,
    면역억제제가 칼시뉴린 억제제인 용도.
20. 면역억제제와의 병용 요법에 의한 항-공여자 동종항체 생산의 치료용 약제의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
21. 제 17 항 내지 제 20 항중 어느 한 항에 있어서,
    항체를 10 내지 25 mg/kg의 투여량으로 투여하는 용도.
22. 제 18 항 내지 제 21 항중 어느 한 항에 있어서,
    면역억제제가 사이클로스포린 A인 용도.
23. 제 22 항에 있어서,
    사이클로스포린 A를 5 내지 20 mg/kg의 투여량으로 투여하는 용도.

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