KR20100074386A

KR20100074386A - 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포, 그의 제조방법 및 이를 이용한 간 질환 치료제

Info

Publication number: KR20100074386A
Application number: KR1020080132794A
Authority: KR
Inventors: 남명진; 이상구
Original assignee: 한 쎌 주식회사
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2008-12-24
Publication date: 2010-07-02

Abstract

본 발명은 간 질환 치료제로 사용될 수 있는 성체줄기세포 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 간성장인자 (human hepatic growth factor; hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환되어 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포, 제대혈로부터 유래한 중간엽 줄기세포를 분리, 배양하여 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환시키고 선별하는 과정으로 이루어진 상기 중간엽 줄기세포의 제조방법 및 상기 형질전환된 세포로부터 조정된 배양액 (conditioned media; CM)을 생성하는 상기 중간엽 줄기세포의 배양방법 그리고 상기 형질전환 중간엽 줄기세포 및 그의 배양액을 간 질환 예방 및 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 인간 간성장인자 (hHGF)를 생산하는 중간엽 줄기세포는 간세포를 효과적으로 증식시키고 세포사멸 (apoptosis)을 억제하며 간경화도 억제시키는 탁월한 효과를 나타내므로, 다양한 간 질환들을 예방하고 치료하는 데 널리 사용될 수 있다.

간 질환 치료제, 인간 간성장인자 (hHGF), 중간엽 줄기세포, 간경화, 배양액 (CM), 세포사멸 (apoptosis)

Description

인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포, 그의 제조방법 및 이를 이용한 간 질환 치료제 {Mesenchymal stem cell producing human hepatic growth factor (hHGF), method for preparing the same and therapeutic agent of liver diseases}

본 발명은 간 질환 치료제로 사용될 수 있는 성체줄기세포 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 간성장인자 (human hepatic growth factor; 이하, "hHGF"라고 약칭함) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환되어 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포, 제대혈로부터 유래한 중간엽 줄기세포를 분리, 배양하여 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환시키고 선별하는 과정으로 이루어진 상기 중간엽 줄기세포의 제조방법 및 상기 형질전환된 세포로부터 조정된 배양액 (conditioned media; CM)을 생성하는 상기 중간엽 줄기세포의 배양방법 그리고 상기 형질전환 중간엽 줄기세포를 간 질환 예방 및 치료제에 관한 것이다.

간 질환은 한국인에게 발병률이 높은 질환 중의 하나로서, 특히 만성간염 등에 이은 간경변증과 간암은 반드시 극복해야할 중요한 질환들이다. 한국인의 사망원인 통계연보에 의하면 감염성 질환에 의한 사망률은 점차 감소하는데 반해서 간경화를 포함한 만성 퇴행성 질환으로 인한 사망률은 증가하는 추세에 있으며, 간암에 의한 사망률은 10만 명당 23.7명으로 세계 1위, 간경변증 등 만성 간 질환에 의한 사망자도 28.8명으로 세계 3위라고 보고하고 있다. 그러나 간경변증 등은 만성 간 질환에 대한 많은 연구 노력에도 불구하고 현재까지 이러한 질환을 치료할 만족할 만한 약물이 없는 실정이다.

또한 만성 간 질환은 바이러스성 혹은 알코올성 간염을 앓고 난 후 만성간염으로 진행이 되고, 많은 경우에서 간경변증 단계를 거쳐 일부가 간암으로 발전되는 것이 일반적이다. 간세포가 자가면역성 또는 간염 바이러스 등의 원인으로 인하여 손상되면, 간세포의 괴사 후의 상처 재생과정의 조직 반응으로 손상된 간세포가 거식세포들에 의해 탐식되면서 그 자리로 섬유세포들이 이주하고 콜라겐 등을 분비하여 섬유질과 재생 결절이 가득 차는 섬유화가 진행이 되어 간경변증을 일으킨다.

이러한 간 질환을 진단하기 위해서는 혈액검사를 통한 간 기능검사 (AST, ALT, 빌리루빈, 알칼리성 포스파타제(ALP) 등)와 간염바이러스에 대한 혈청학적 표지자 검사, 간 초음파검사, 복강경검사, 간 조직검사 등이 이용되며, 남은 잔여 간 기능의 평가를 위해서 혈액의 알부민 검사나 혈액응고시간 (프로트롬빈 시간; PT)을 측정한다.

또한 만성 간 질환의 경우, 특별한 치료법이 없고, 다만 질환의 원인을 살펴 B형간염이나 C형 간염으로 인한 사례에서는 라미뷰딘 등의 항바이러스제 투여나 인터페론 치료를 보조적 치료법으로 시행하고 있다. 그러나 인터페론 치료 등의 보조적 치료는 적용치료 기간이 길고, 비용에 대한 부담이 큰 반면, 치료 효율이 낮으며 재발률이 높고 부작용을 동반하거나 자가 항체가 형성되어 갑상선 질환 등을 유발할 수 있다는 단점이 있다. 더욱이 만성 간 질환 단계를 지나 간암으로 발전한 경우, 수술적 절제법이나, 간동맥 색전술 (TACE), 경피적 에탄올 주입술 (PEIT), 고주파 열치료 (RFA) 등의 비수술적 치료법을 시행할 수 있으나, 이 역시 환자에게 대한 치료에 수반된 고통과 경제적 부담은 더욱 증가하는 반면 치료효율에 대한 기대치는 더욱 낮아진다.

따라서 지금까지의 만성 간 질환 및 간암의 치료법에 대한 이와 같은 문제점을 보안하고, 간암으로 발전하기 전단계인 간경변증 등의 만성 간 질환 단계에서의 치료법을 개발하기 위한 새로운 접근법이 필요하며, 이에 최근 각종 질환의 치료법으로 대두되어지는 줄기세포를 이용한 치료제 개발이 중요하게 제안되고 있다.

중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell; MSCs)는 중배엽 유래의 세포로 분화할 수 있는 다분화능을 갖는 줄기세포로 성인의 골수 및 말초혈액, 제대혈로부터 보다 쉽게 성체줄기세포를 채취할 수 있다.

이에 본 발명자들은 새로운 간 질환 치료제를 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하고 제대혈로부터 중간엽 줄기세포를 분리하여 배양한 다음 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 선별하는 과정으로 인간 간성장인자를 생산하는 형질전환된 중간엽 줄기세포를 제조하였다. 또한 상기 형질전환된 세포로부터 조정된 배양액 (conditioned media; CM)을 생성하도록 상기 중간엽 줄기세포를 배양한 다음, 상기 형질전환된 중간엽 줄기세포 및/또는 그의 CM 배양액이 간세포를 증식시키고 세포사멸 (apoptosis)을 억제하며 간경화 병변도 효과적으로 완화시킬 뿐만 아니라 이를 유효성분으로 하는 간 질환 예방 및 치료제가 개발될 수 있는 점을 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

본 발명은 새로운 간 질환 치료제 등으로 사용될 수 있는 줄기세포 및 그의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 간성장인자 (human hepatic growth factor; hHGF)를 발현하는 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells; MSCs)를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pMEX-HGF (수탁번호: 제 KCLRF-BP-00196)로 형질전환되어 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pMSCV-HGF로 형질전환되어 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포를 제공 한다.

또한, 본 발명은 (1) 제대혈로부터 중간엽 줄기세포를 분리하고; (2) 상기 중간엽 줄기세포를 계대배양하고; (3) 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환시키고; 및 (4) 이로부터 인간 간성장인자를 발현하는 형질전환된 세포를 선별하는; 과정으로 이루어진 상기 중간엽 줄기세포 (MSCs)의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포로부터 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양액 (conditioned media; CM)을 생성하는 상기 형질전환된 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포의 배양방법으로 제조된 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양액 (CM)을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 중간엽 줄기세포 (MSCs)를 유효성분으로 하는 간 질환 치료제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 간성장인자 (hepatic growth factor; HGF)를 발현하는 성체줄기세포를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 인간 간성장인자 (human hepatic growth factor; hHGF)를 발현하는 형질전환된 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells; MSCs)를 제공한다. 상기 중간엽 줄기세포는 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환되는 것이 바람직하고, 상기 재조합 발현 벡터에는 pMEX-HGF 또는 pMSCV-HGF 등이 포함되는 것이 바람직하다.

상기 형질전환된 중간엽 줄기세포는 2008년 12월 11일자로 국제미생물기탁기관인 서울대학교 부설 한국세포주연구재단에 기탁하였다 (수탁번호: 제 KCLRF-BP-00196).

또한, 본 발명은 상기 간성장인자 (hepatic growth factor; HGF)를 발현하는 성체줄기세포를 간 질환 치료제로서 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 중간엽 줄기세포 (MSCs)를 간 질환 예방 및 치료제로 사용하는 용도를 제공한다. 상기 간 질환에는 간경화, 간암 및 간염 등이 포함된다.

또한, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pMEX-HGF 및 이로 형질전환된 대장균 형질전환체를 제공한다. 또한, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pMSCV-HGF 및 이로 형질전환된 대장균 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 재조합 발현 벡터로는 상기 재조합 발현 벡터의 기본이 되는 pMEX-neo 또는 pMSCV-neo 이외에도 줄기세포를 포함한 세포 형질전환에 사용되는 모든 발현 벡터들에 인간 간성장인자 유전자를 삽입하는 경우 모두 사용될 수 있다.

상기 (1) 과정에서 사람의 제대혈을 사용하여 중간엽 줄기세포를 분리하는 것이 바람직하다. 구체적으로, 사람의 제대혈을 분리하여 원심분리하고 DPBS 완충용액 등을 사용하여 세포를 세척한 다음 다시 원심분리하고 ACK 완충용액 등을 사용하여 실온에서 2분 정도 방치한다. 다시 상기 완충용액의 5배 정도의 배양배지를 첨가하고 원심분리한다. 그 다음 LIF 완충용액 등을 사용하여 처리하고 배양 배지를 첨가하여 세포를 안정화시킨다.

이와 같이 얻은 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포는 5일 마다 계대 배양하여 사용하는 것이 바람직하고, 이 과정을 8세대 내외로 반복하여 계대 배양한 중간엽 줄기세포를 사용하는 것은 더욱 바람직하며, 또한 7 내지 8세대 계대 배양하여 사용하는 것이 가장 바람직하다.

상기 (2) 과정에서, 상기 중간엽 줄기세포는 7 내지 8세대 계대 배양하여 사용하는 것이 바람직하고, 상기 (3) 과정에서는, 상기 재조합 발현 벡터로서 상기 재조합 발현 벡터 pMEX-HGF 또는 pMSCV-HGF를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 (3) 과정에서, 일반적인 세포 형질전환방법은 모두 사용될 수 있으나 상기 재조합 발현 벡터를 나노입자 (nanoparticle) 등을 사용하여 형질전환시키는 것이 더욱 바람직하다. 또한 상기 (4) 과정에서, 상기 형질전환된 세포는 네오마이신 (neomycin)을 포함하는 항생제 마커를 사용하여 선별하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 중간엽 줄기세포 (MSCs)를 유효성분으로 하는 간 질환 치료제를 제공한다. 상기 간 질환에는 간경변, 간암 및 간염이 포함되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양액 (conditioned media; CM)을 생성하는 상기 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 정상 줄기세포를 혈청이 첨가된 배지를 사용하여 80% 정도에 이르도록 세포를 배양한 다음 여기세 상기 재조합 발현 벡터 등을 사용하여 세포 형질전환시킨 다음 다시 6시간 내외로 더 배양하는 과정으로 이루어진 상기 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공한다. 상기 배양방법은 상기 중간엽 줄기세포이외에도 모든 줄기세포에 사용될 수 있으며, 상기 중간엽 줄기세포에는 형질전환되지 않은 줄기세포와 형질전환된 줄기세포가 모두 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 형질전환된 중간엽 줄기세포의 CM 배양액을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 형질전환된 중간엽 줄기세포를 혈청을 첨가하지 않은 (serum-free media) 배지로 배양하여 제조한 상기 CM 배양액의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 형질전환된 중간엽 줄기세포의 배양액 (CM)을 간세포 증식에 사용하는 용도를 제공한다. 상기 조정 된 배양액 (CM)은 간경화, 간암 및 간염 등을 포함한 다양한 간질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

본 발명에서는 간경화치료를 위한 유전자 변형된 성체줄기세포를 개발하기 위하여 사람의 제대혈로부터 분리된 중간엽 줄기세포에 인간 간성장인자 (hHGF)유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 사용하여 HGF 유전자 형질전환하고, 이로부터 HGF 유전자가 전이된 hMSCs만을 선택적으로 배양한다. 또한 간경변증을 유발시킨 실험동물의 동물실험을 통하여 생산된 HGF 유전자 변형된 줄기세포 치료제의 효능 및 안전성 등을 조사한다. 특히 간경변증에 대해 여러 실험동물모델들이 논의되고 있으나, 본 실험에서는 비교적 안정적으로 간경변증을 유도한다고 보고된 사염화탄소(CCl4) 또는 TAA(Thioacetamide)를 실험동물의 복강 내로 투여하여 간경화를 유발시킨 실험동물을 사용한다. 상기 실험동물은 정상군, 간경화군, HGF 유전자 변형된 줄기세포치료제 치료군으로 나누어 실험이 실시되고, 실험동물로부터 얻어진 조직과 혈액을 조직염색, 총 콜라겐 양 측정, 혈청 생화학적 검사 등을 행하여, 항섬유화 정도와 HGF 유전자 변형된 줄기세포 치료제의 효능을 비교 평가한다.

본 발명의 상기 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 중간엽 줄기세포 (MSCs)를 유효성분으로 하는 간 질환 치료제용 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제를 포함할 수 있다. 또한 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제 형태로 제형화하는 것이 바람직하며, 등장성 멸균용액 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조제제 (특히 동결 건조제제)로도 제형화될 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포의 1회 투여량은 치료 하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 인자를 고려하여 증감이 가능하다.

또한, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 상기 재조합 발현 벡터 및 중간엽 줄기세포 또는 상기 인간 간성장인자 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포 등을 포함하는 간질환 치료용 키트를 제공한다. 상기 재조합 발현 벡터와 중간엽 줄기세포는 각각 따로 또는 상기 발현 벡터로 중간엽 줄기세포를 형질감염시킨 형태로 제공될 수 있다. 상기 간 질환에는 간경변, 간암 및 간염 등이 포함되는 것이 바람직하다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 인간 간성장인자 (human hepatic growth factor; hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환되어 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포, 제대혈로부터 유래한 중간엽 줄기세포를 분리, 배양하여 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환시키고 선별하는 과정으로 이루어진 상기 중간엽 줄기세포의 제조방법 및 상기 줄기세포로부터 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양액 (CM)을 생성하는 상기 중간엽 줄기세포의 배양방법 그리고 상기 형질전환 중간엽 줄기세포를 간 질환의 예방 및 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 인간 간성장인자 (hHGF)를 생산하는 중간엽 줄기세포는 간세포를 효과적으로 증식시키고 세포사멸 (apoptosis)을 억제하며 간경화도 억제시키는 탁월한 효과를 나타내므로, 다양한 간 질환들을 예방하고 치료하는 데 널리 사용될 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양

본 발명에서는 중간엽 줄기세포 (MSCs)는 사람의 제대혈 (human umbilical cord blood; HUCB)을 사용하여 플라스틱 부착과 밀도 구배 원심분리를 결합시킨 방법 (combining gradient density centrifugation with plastic adherence)에 따라 분리하였다. 구체적으로 사람의 제대혈을 원심분리하여 상층액을 제거하고 DPBS를 넣고 세포를 풀어준 다음 다시 원심분리하였다. ACK 완충용액을 첨가하여 실온에서 2분 동안 방치하고 다시 상기 완충용액의 5배 정도의 배양배지를 첨가한 다음 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그 다음 LIF 완충용액을 넣고 1분 후에 배양 배지를 첨가하여 필터링하였다. 이로부터 얻은 세포는 다시 원심분리하여 다음과 같이 세포 배양과정을 실시하였다.

이와 같이 분리한 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포는 계대 배양하고 4번째 계대배양 세포 (HUCB-derived MSCs)를 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum; FBS), 4 nmol/L L-글루타민 (glutamine), 100 IU/mL 페니실린 (penicillin) 및 100 mg/mL 스트렙토마이신 (streptomycin)이 첨가된 DMEM (Dulbecco modified Eagle medium) 배지를 사용하여 5% CO₂를 포함하는 37℃ 배양기 (incubator) 안에서 배양하였다. 이들 세포는 매 2일마다 새로운 배양액으로 바꾸어 주면서 1 내지 2주 동안 배양하였다. 세포가 배양용기에 70% 차게 되면 0.25% 트립신 (trypsin) 및 1 mM EDTA를 이용하여 배양용기에서 떼어낸 후, 새로운 배양용기에 다시 계대 배양하였다. 계대 배양된 세포들이 7 내지 8 계대에 이르렀을 때 하기에서 기술한 다양한 실험과정에 사용되었다. 실험에 사용하기 전, 상기 세포는 10% DMSO가 포함된 배양액에서 서서히 냉동시킨 후, -150℃에 보관하였다.

실시예 2. 간성장인자 (HGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터의 제작 및 세포 형질전환

본 발명에서는 간성장인자 (HGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하기 위하여, HGF 유전자는 사람으로부터 유래된 HGF (hHGF) 유전자를 사용하였다. 이 hHGF 유전자를 네오마이신 (neomycin)에 내성을 갖는 기존의 발현 벡터 pMSCV-neo 또는 pMEX-neo 내에 삽입하여 본 발명의 재조합 발현벡터 pMSCV-HGF 및 pMEX-HGF를 제작하였다 (도 1 참조). 이 때 유전자 증폭 시 발생하는 돌연변이 (mutation) 여부를 확인하기 위하여, 유전자 염기서열 중 적당한 부위에 해당하는 프라이머를 사용하여 유전자 시퀸싱을 실시하고 그 염기서열을 결정하여 확인하였다. 상기 재조합 발현 벡터들은 대장균 E. coli DH5α 에 형질전환시키어 대장균 보존고 (stock)들을 만든 다음 DNA와 함께 보관하였다. 또한 상기 재조합 발현 벡 터로 세포를 형질전환시키기 위하여, 사람의 제대혈로부터 유래한 중간엽 줄기세포 (HUCB-derived MSCs)의 7번째 계대배양 세포에 상기 재조합 발현 벡터 pMEX-HGF를 나노입자 (nanoparticle; MNP@SiO₂(RITC)_PTMA)를 사용하였다. 이와 같이 형질전환된 상기 hHGF 유전자 전이된 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포 (HUCB-derived MSCs)는 유전자 전이 시 동시에 전이된 GFP 단백질 유전자가 형광 발현되는지 여부를 형광현미경 하에서 조사하여 선별하였다 (도 2 및 도 3 참조). 도 2는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포와 정상 중간엽 줄기세포를 현미경 하에서 관찰, 비교하여 나타낸 것이다. 도 3은 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포와 정상 중간엽 줄기세포를 형광현미경 하에서 관찰, 비교하여 나타낸 것이다. 그 결과, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 인간 간성장인자를 발현하여 형광 시그날을 발현하면서 동시에 세포 형태에 차이가 생기는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 간성장인자 (HGF) 유전자의 발현 조사

본 발명에서는 간성장인자 (HGF) 유전자가 상기 형질전환된 줄기세포에서 발현되는 여부를 조사하기 위하여, 역전사효소-중합효소연쇄반응 (RT-PCR; reverse-transcription polymerase chain reaction)을 다음과 같이 실시하였다. 먼저 세포로부터 트리졸 (Trizol; Tel-Test Inc.)을 이용하여 총 RNA 시료를 얻고 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트 (1st strand cDNA synthesis kit; Roche)를 이용하여 역전사 반응으로 cDNA를 얻은 다음 hHGF 유전자 (426 bp)에 특이적인 서열번호 1 (5′-ATGATGATGCTCATGGACCCT-3')의 정방향 프라이머 및 서열번호 2 (5′-CTGGCAAGCTTCATTAAAACC-3')의 역방향 프라이머 (primer)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 때 시료들은 디네이처 (denaturation; 95℃, 10초), 아닐링 (annealing; 57℃, 30초), 합성 (synthesis; 72℃, 25초)의 조건에서 40회 (cycle) 증폭시켰으며, RT-PCR로 얻어진 증폭된 cDNA는 저분자량 DNA 마커 (low-molecular weight DNA marker; 100bp, Bioneer)를 사용하여 1.2% 아가로스 젤 상에서 분석, 확인하였다 (도 4 참조). 도 4는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포에서 인간 간성장인자 (hHGF)의 발현을 RNA 수준에서 조사하여 나타낸 것이다. 그 결과, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 인간 간성장인자 유전자를 효과적으로 발현, 생산할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 인간 간성장인자 (hHGF)의 웨스턴 블럿 분석

본 발명에서 발현시킨 간성장인자를 분석하기 위하여 다음과 같이 웨스턴 블럿을 실시하였다. 먼저 HGF를 처리한 hMSC 세포와 HGF를 처리하지 않은 hMSC세포들을 트립신 EDTA를 이용하여 수확하고 이로부터 단백질을 확보하였다. 이 시료는 30㎍의 단백질이 포함되도록 만들었으며, 시료의 양과 동량으로 2x 시료 완충용액 [sample buffer; 0.125M 트리스 (pH 6.8), 6% SDS, 20% 글리세롤, 0.02% 브로모페놀 블루 (bromophenol blue), 1.44mM β-머캅토에탄올]를 넣은 다음 100℃에서 5분간 끓이고 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤 상에서 분리하였다. 그 다음 PVDF 멤브 레인 (폴리비닐리덴 디플루오라이드 [Polyvinylidene difluoride; Amersham Pharmacia]에 트랜스퍼하고 TBST 완충용액 [50mM 트리스 (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20]에 녹인 5% 스킴 밀크 (skim milk)에 넣어 한 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 다음 일차 항체 (primary antibody)를 사용하여 5% 스킴 밀크에 1 : 1000 비율로 희석하고 90분 동안 상온에서 반응시킨 다음, TBST 완충용액으로 15분 동안 4번 세척하였다. 그러고 나서 이차 항체 (secondary antibody)를 사용하여 5% 스킴 밀크에 1 : 2,000 비율로 희석하여 60분 동안 반응시키고, 다시 TBST로 15분 동안 4번 세척하였다. ECL (Amersham Pharmacia)을 사용하여 항원-항체 (antigen-antibody)의 특이적 반응을 관찰 및 확인하였다 (도 5 참조). 도 5는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포에서 인간 간성장인자 (hHGF)의 발현을 단백질 수준에서 웨스턴 블럿 (a) 및 엘라이자 방법 (b)으로 조사하여 나타낸 것이다. 그 결과 본 발명의 중간엽 줄기세포는 인간 간성장인자를 대량 생산할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 형질전환된 중간엽 줄기세포의 특성 조사

본 발명에서는 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 형질전환된 중간엽 줄기세포의 특성을 세포 배양액 및 그의 세포 세포사멸 (apoptosis) 억제 효과에 관해 다음과 같이 조사하였다.

먼저 상기 형질전환된 중간엽 줄기세포의 배양액을 수집하여 정상 간세포 (NCTC 클론 1469)의 증식에 미치는 효과를 측정하였다 (도 6 참조). 참고로, 상기 세포 배양액은 우태아혈청 (FBS)를 첨가하지 않은 배양액 (conditioned media; CM)으로 상기 형질전환된 줄기세포에서 특이적으로 생성되는 것이다. 구체적으로 제대혈로부터 분리하여 8세대 계대배양한 중간엽 줄기세포를 약 1 X 10⁴세포를 10% FBS가 첨가된 MEM 배지에 접종한 다음 24시간 동안 배양하였다. 다시 혈청이 첨가되지 않은 (serum free MEM)으로 배지를 교환해준 다음 이로부터 얻은 배지를 사용하여 세포생존율에 미치는 효과를 조사하였다. 상세한 실험 조건은 하기 표 1 및 표 2에 정리하였다. 또한 상기 배양시간이 끝난 후 실험 전까지 상기 CM 배지는 원심분리하고 50KD 멤브레인 (membrane)을 사용하여 농축시킨 후 다음 실험에 사용되기 전까지 -70℃에 보관하였다. 그 결과, 본 발명의 형질전환된 성체줄기세포로부터 만들어진 배양배지 (CM)가 간세포를 탁월하게 증식시키는 것을 알 수 있었다. 또한 대조군과 비교하여 본 발명의 성체줄기세포로부터 발현되는 인간 간성장인자 (hHGF)도 종래의 재조합 간 성장인자 (rhHGF)보다 간세포를 증식시키는 효과가 탁월한 것을 확인할 수 있었다 (도 6 참조).

또한, 상기 형질전환된 성체줄기세포로부터 만들어진 배양배지 (CM)가 세포사멸을 억제하는 효과가 있음을 다음과 같이 조사하였다. 먼저 정상 간세포 (NCTC 클론 1469)를 1 X 10⁴세포/ml 농도로 접종한 다음 24시간 동안 배양하였다. 다시 배양 배지를 혈청을 첨가하지 않은 (serum free MEM) 배지로 교환하여 준 다음 세포사멸을 유발하는 약물인 GCDC 10μl 을 처리하고 이와 동시에 GCDC와 상기 CM 배지 를 각각 10μl 처리하여 24시간 동안 반응시키고 MTT 분석방법 (assay)으로 그 결과를 측정하였다. 그 결과 상기 CM 배지를 첨가한 경우 세포 생존율이 탁월하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 7 참조).

HGF 형질전환된 CM 배양배지

1	MSC 계대 배양	8세대
2	배양 배지	10% FBS MEM
3	CM 배지
	4 * 10⁵ 개 (10% FBS MEM) 세포를 접종, 약 80%에 이르면 세포형질전환, 6시간 배양 후 무혈청배지로 배지 교환	무혈청 배지 (serum free MEM)
	3일 동안 세포 배양	세포 수집
4	배지량 (부피)	6ml

형질전환되지 않은 CM 배양배지

1	MSC 계대 배양	8세대
2	배양 배지	10% FBS MEM
3	CM 배지
	4 * 10⁵개(10% FBS MEM)의 세포 접종, 약 70% 자라면 배지 교환	무혈청 배지 (serum free MEM)
	3일 동안 세포배양	세포 수집
4	배지량 (부피)	6ml

실시예 6. hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포의 선별 배양

본 발명에서는 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포를 선별 배양하기 위하여, 상기 hHGF 유전자를 발현하는 중간엽 줄기세포 (HUCB-derived MSCs) 는 400 ng/mL 농도의 네오마이신, 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum; FBS), 4 nmol/L L-글루타민 (L-glutamine), 100 IU/mL 페니실린, 100 mg/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Dulbecco modified Eagle medium) 배지를 사용하여 5% CO₂를 포함하는 37℃ 배양기 안에서 선택적으로 배양되었다 (도 2 참조). 그 결과, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 인간 간성장인자를 발현하면서 간경화가 유발된 실험동물의 간 조직에서 변화가 생기는 것을 확인할 수 있었다 (도 9 내지 도 12 참조).

실시예 7. hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포의 동물실험을 통한 효능 평가

본 발명에서는 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포의 효능 및 안정성을 평가하기 위하여 다음과 같이 동물실험을 실시하였다. 구체적으로, 실험동물에 간섬유화(경화)를 유도하고 HGF 유전자로 변형된 줄기세포 치료제를 미정맥으로 투여한 후, 혈청 생화학적 검사, 총 콜라겐 양 측정 및 간 조직의 조직병리학적 검사를 통해 시간의 경과에 따른 HGF량의 변화와 항섬유화 효과를 평가하였다.

(1) 실험동물

먼저 실험동물을 각 실험군으로 분류하기 위하여 12주령의 성숙된 암컷 위스타 랫트를 (230 내지 300g) 실험동물로 사용하여 15마리씩 세 가지 실험군들, 즉 PBS 처리군 (대조군), 줄기세포만 처리군 (줄기세포 치료제 실험군) 및 hHGF 유전자로 변형된 줄기세포 처리군 (hHGF-줄기세포 치료제 실험군)으로 구분하였다. 모든 실험군에 간경화를 유발시킨 후 PBS, 줄기세포, hHGF 유전자로 변형된 줄기세포를 투여하면서 밤과 낮의 리듬을 주고 먹이와 물을 자유롭게 공급하였다.

(2) 간섬유화(경화)유도

간섬유화를 유도하기 위하여, 간경화 유발방법으로 실험동물의 복강 내에 사염화탄소 (CCl₄) 및/또는 TAA (Thioacetamide)를 희석하여 주사하였다 (1ml/kg, 3회/주 투여). 모든 실험군의 실험동물에 간경화를 유도하였고, 이에 앞서 각 실험군에서 무작위로 선정된 실험동물을 희생시켜 장기와 혈청을 수집하였다. 또한 상기에서 얻은 시료로 조직학적·혈액학적 실험을 시행하여 성공적으로 간경화가 유도된 것을 확인하였다.

(3) 혈액시료의 수집 및 보관

상기 혈액시료를 수집하여 보관하기 위하여, 실험동물을 에테르로 마취시키고 복대정맥에서 채혈한 혈액을 4시간 이상 4℃에서 방치하여 3,000 rpm으로 원심분리하였다. 이로부터 얻은 혈청은 -20℃로 냉동 보관하여 혈청생화학적 측정에 사용하였다.

(4) 간조직의 수집 및 광학현미경적 관찰

상기 실험동물의 간조직을 관찰하기 위하여, 간의 외측 우엽과 후엽의 중간을 절취하여 10% 중성 포르말린 액에 고정시켰다. 그 다음, 알코올 탈수과정을 거쳐 파라핀에 담구어 (embedding) 5μm 크기의 조직절편을 얻었다. 이로부터 얻은 조직 절편은 헤마톡실린 및 에오신 (hematoxylin 및 eosin) 염색과 매이슨 트리크롬 (Masson's Trichrome) 염색을 하여 조직의 염증의 정도 및 간섬유화(경화) 정도를 평가를 위한 조직병리학적 검사를 시행하였다.

도 8은 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포를 간경화 동물모델에 투여하는 경우 간경화의 치료 효과를 조사하여 나타낸 것이다. 도 9 내지 도 11은 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포를 주사하는 경우에 간조직의 변화를 현미경 하에서 조사하여 나타낸 것이다. 도 12는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포 대신 대조군으로서 인산완충용액 (PBS)을 투여하는 경우에 간조직의 변화를 현미경 하에서 조사하여 나타낸 것이다. 그 결과, 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포는 간경화 동물모델에 투여하는 경우 간경화의 치료 효과가 탁월한 것을 확인할 수 있었다.

(5) 조직 내 총 콜라겐 양 측정

상기 실험동물의 조직 내 총 콜라겐 양을 측정하기 위하여, 염산으로 간조직을 가수분해시켜 일정량을 취하고 염산을 날려 보낸 다음 잔류물을 이소프로필 알코올 (isopropyl alcohol)에 녹여 클로라민-T (chloramine-T)로 산화시켰다. 이 때 발색제로는 얼리히 반응용액 [Ehrlich's reagent solution; p-디메틸아미노벤즈알데하이드 (p-dimethylaminobenzaldehyde)]을 사용하였고 558nm에서 흡광도를 측정하여 조직 중의 총 콜라겐 양을 계산하였다. 그 결과, 조직 내 총라겐의 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

(6) 혈청 생화학적 검사

상기 실험동물의 혈청 생화학적 검사를 실시하기 위하여, 10ml 시험관에 채혈한 혈액을 실온에 30분간 방치하여 응고시킨 후 원심분리 (3,000rpm, 30분)하였다. 이로부터 얻은 혈청에서 자동분석 혈청기 (RA-XT, Technicon, Co. Ltd., U.S.A)를 이용하여 알라닌 트랜스아미네이즈 (alanine transaminase; ALT), 아스파테이트 트랜스아미네이즈 (aspartate transaminase; AST), 알칼라인 포스파테이즈 (alkaline phosphatase; ALP) 및 총 빌리루빈 (total bilirubin; TB)의 양을 측정하였다.

그 결과 TAA 약물을 8주간 투여하고, GOT, GPT 측정을 통해 간에 심한 손상이 발생한 것을 확인하였으며, 쥐를 3그룹으로 나누어 첫 번째 군은 대조군으로 하여 용매인 PBS만을 투여하고, 두 번째 군은 HGF 유전자를 넣어준 줄기세포를 주사하고, 세 번째 군은 줄기세포만을 투여하였다. PBS와 줄기세포를 투여하고, 4주간 TAA를 투여하면서 간 손상을 계속 유발한 후에 부검하였다. PBS만을 투여한 대조군 쥐에서는 간의 파괴가 계속 진행되어 간 경화가 진행되었으나, hHGF 유전자를 발현시킨 줄기세포를 주사한 쥐에서는 병변의 진행이 느려지거나, 회복되는 경향을 나타내어 50 내지 60% 치료 효과를 나타낸 것을 확인하였다 (도 8참조).

(7) 통계 처리

상기 실험 결과로 통계 처리하기 위하여, 스튜던트 t-테스트 (student's t-test)를 시행하였고 메디안 (median) 및 표준편차 (standard deviation)로 표시하였으며 P-값 (value)을 구하여 (p<0.05) 유의성을 검증하였다.

[서열목록]

서열번호 1

5′-ATGATGATGCTCATGGACCCT-3'

서열번호 2

5′-CTGGCAAGCTTCATTAAAACC-3′

도 1은 본 발명에서 사용한 발현 벡터 pMEX-neo의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포와 정상 중간엽 줄기세포를 현미경 하에서 관찰, 비교하여 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포와 정상 중간엽 줄기세포를 형광현미경 하에서 관찰, 비교하여 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포에서 인간 간성장인자 (hHGF)의 발현을 RNA 수준에서 조사하여 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포에서 인간 간성장인자 (hHGF)의 발현을 단백질 수준에서 웨스턴 블럿 및 엘라이자 방법으로 조사하여 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명에서 발현시킨 hHGF 단백질이 포함된 세포 배양액을 정상 간세포 (NCTC 1469)에 처리하여 세포 생존율을 조사하고 대조군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명에서 발현시킨 hHGF 단백질이 포함된 세포 배양액이 세포사멸 (apoptosis)에 미치는 효과를 조사하여 대조군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포를 간경화 동물모델에 투여하는 경우 간경화의 치료 효과를 조사하여 나타낸 것이다.

도 9 내지 도 11은 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포를 주사하는 경우에 간조직의 변화를 현미경 하에서 조사하여 나타낸 것이다.

도 12는 대조군으로서 인산완충용액 (PBS)을 투여하는 경우에 간조직의 변화를 현미경 하에서 조사하여 나타낸 것이다.

<110> Han Cell <120> Mesenchymal stem cell producing human hepatic growth factor (hHGF), method for preparing the same and therapeutic agent of liver diseases <130> PA080095 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(oligonucleotide) <400> 1 atgatgatgc tcatggaccc t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(oligonucleotide) <400> 2 ctggcaagct tcattaaaac c 21

Claims

인간 간성장인자 (human hepatic growth factor; hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells; MSCs).
제 1항에 있어서,

상기 인간 간성장인자 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터는 pMEX-HGF 인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 (수탁번호: 제 KCLRF-BP-00196호).
제 1항에 있어서,

상기 인간 간성장인자 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터는 pMSCV-HGF 인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
제 1항에 있어서,

간경변을 포함한 각종 간 질환을 예방하고 치료하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
(1) 제대혈로부터 중간엽 줄기세포를 분리하고; (2) 상기 중간엽 줄기세포를 계대배양하고; (3) 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환시키고; 및 (4) 이로부터 인간 간성장인자를 발현하는 형질전환된 세포를 선별하는; 과정으로 이루어진 제 1항의 중간엽 줄기세포 (MSCs)의 제조방법.
제 5항에 있어서,

상기 (2) 과정에서는, 상기 중간엽 줄기세포를 7 내지 8세대 계대 배양하여 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 5항에 있어서,

상기 (3) 과정에서는, 상기 재조합 발현 벡터는 재조합 발현 벡터 pMEX-HGF 또는 재조합 발현 벡터 pMSCV-HGF를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 5항에 있어서,

상기 (3) 과정에서는, 상기 재조합 발현 벡터는 나노입자 (nanoparticle)를 사용하여 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 5항에 있어서,

상기 (4) 과정에서는, 상기 형질전환된 세포는 네오마이신 (neomycin)을 포함하는 항생제 마커를 사용하여 선별하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양액 (conditioned media; CM)을 생성하는 제 1항의 중간엽 줄기세포의 배양방법.
제 10항에 있어서,

정상 줄기세포를 혈청이 첨가된 배지를 사용하여 80% 정도에 이르도록 세포를 배양하고 세포 형질전환시킨 다음 다시 6시간 내외로 더 배양하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
제 10항의 배양방법으로 제조된 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양액 (CM).
제 1항의 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 중간엽 줄기세포 (MSCs)를 유효성분으로 하는 간 질환 치료제용 약학적 조성물.
제 13항에 있어서,

상기 간 질환은 간경변, 간암 및 간염을 포함하는 것을 특징으로 하는 간 질환 치료제용 약학적 조성물.
인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 중간엽 줄기세포 또는 형질전환된 중간엽 줄기세포를 포함하는 간질환 치료용 키트.
제 15항에 있어서,

상기 간 질환은 간경변, 간암 및 간염을 포함하는 것을 특징으로 하는 간 질환 치료용 키트.