KR20100019417A - 조성물 및 메티오닌 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황전이반응 경로의 내인성 유전자 및 직접 황수화반응 경로를 제공하는 외인성 유전자로부터 메티오닌 및 관련 산물을 생산하는 미생물에 관한 것이다. 또한, 메티오닌 및 SAMe 생산에 유용한 신규한 유전자가 제공된다.

황수화반응, 황전이반응, 외인성, 메티오닌, 호모세린, 대장균, SAMe

Description

조성물 및 메티오닌 생산방법{Composition and Methods of Producing Methionine}

본 발명은 균주, 효소 및 화학물질과 같은 조성물과 메티오닌 및 이와 관련된 산물의 생산을 위해 상기 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이다.

메티오닌은 동물소화에 있어 필수적인 아미노산이다. 메티오닌은 오랫동안 아크롤레인, 메틸 머캅탄 및 시안화물을 출발물질로 이용한 다단계 화학합성에 의해 화학적으로 합성되어져 왔다. 2가지 생성물 형태가 있다: D.L 메티오닌 및 그의 히드록시유사체(hydroxyanalog). D-메티오닌은 다른 모든 아미노산과는 달리 생체 내(in vivo)에서 요구되는 L-이성질체로 전환된다. 사료-등급의 메티오닌 시장은 가금류에 대한 수요와 최근에는 돼지 사료 보충제에 대한 수요가 늘어남으로 인해 증가하고 있다고 보고된 바 있다. 시장 수요에 부응하기 위한 주요 메티오닌 생산회사들(Degussa AG, Adisseo, Novus)의 능력은 원자재 공급에 달려있다. 중간대사물질인 아크롤레인과 메틸 머캅탄은 3-메틸티오프로피온알데하이드(MMP)로 전환되고, 수소 시안화물(hydrogen cyanide)을 이용하여 메티오닌으로 전환되어야 할 것이다. 세개 생산회사 모두 메티오닌 생산설비의 확장 계획 및 원자재 생산과의 통합 계획을 가지고 있다 (Chem. Marketing Reporter April 7, 2003).

메티오닌(아미노산 아스파르테이트 군에 속함)에 대한 생합성 경로는 많은 유기체에서 연구되어 왔고 차이점 뿐만 아니라 유사점도 보여준다. 제1단계인 호모세린의 아실화는 호모세린 아실트랜스퍼라제에 의해 촉매되고, 전이된 아실기의 차이에도 불구하고 모든 유기체에서 일어난다. metA의 촉매작용의 산물은 아세틸호모세린이거나 숙시닐호모세린이다. 그런 다음, 아실호모세린은 황전이반응(황전이반응) 또는 직접 황수화반응(직접 황수화반응) 경로를 거쳐 호모시스테인으로 전환된다. 양 경로 모두 효모, 곰팡이, 녹색식물과 박테리아 코리네박테리움 글루타미쿰에 존재하며 기능하고 있다고 보고되었다. 대장균(E.coli)은 오직 황전이반응 경로만을 가지고 있다. 상기 황전이반응 경로는 중간물질로서 시스타치오닌을 거치며 황 공여체(sulfur donor)로서 시스테인을 이용한다. 상기 직접 황수화반응 경로는 아실호모세린에 설파이드(청구항에 황화물이라고 썼으면 고칠것)를 직접 결합시키는 것과 관련된다. 상기 경로의 마지막 단계는 metE 또는 metH 유전자에 의해 코딩되는 호모시스테인 메틸트랜스퍼라제에 의해 촉매되는, 호모시스테인으로부터 메티오닌으로의 전환과 관련된다.

리신, 트레오닌, 및 트립토판과 같은 다른 중요 아미노산들은 발효과정을 거쳐 동물사료용으로 생산된다. 따라서, 이들 아미노산은 시작물질로서 글루코스 및 다른 재생가능한 자원을 이용하여 만들 수 있다. 불행하게도, 발효과정을 거친 메티오닌 생산은 성공적이지 못해, 오늘날까지도 메티오닌의 화학적 합성이 이용되고 있는 실정이다. 이는 부분적으로 메티오닌 생산에 효율적인 조작된 생합성 경로의 부족 및 적절한 생산 숙주의 부족에 기인한다. 하기에서는 향상된 메티오닌 생합성 경로 및 생산 숙주에 대하여 개시한다.

본 발명은 발효에 의한 메티오닌 생산 및 S-아데노실메티오닌(SAM)과 같은 관련 산물의 생산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 재조합 DNA분자를 포함하고 메티오닌을 생산하도록 유전적으로 조작된 미생물에 대해 개시하고 있다.

직접 황수화반응 활성을 가지는 펩타이드(EC 2.5.1.49, EC 4.2.99-)를 코딩하는 외인성 핵산서열 및 황전이반응 활성 (EC 2.5.1.48 and 4.4.1.8)을 가지는 펩타이드를 코딩하는 내인성 핵산서열을 포함하는 미생물이 개시된다. 상기 미생물은 메티오닌 및 이의 관련 산물을 생산할 수 있다. 하나의 예로서, 상기 미생물은 세포외 메티오닌 또는 SAMe의 농도를 적어도 0.1, 1, 2, 5, 10, 50, 75, 90, 또는 적어도 100 g/L의 농도로 가질 수 있다.

다른 예로서, 하나 이상의 메티오닌 생합성 경로가 존재하면 유기체는 직접 황수화반응 활성을 가지는 펩타이드를 코딩하는 외인성 핵산서열이 없는 경우보다 더 많은 메티오닌을 생산할 수 있다.

또다른 예로서, 둘 이상의 메티오닌 생합성 경로가 유기체 내에서 활성될 수 있다. 이들 예에서, 하나 이상의 외인성 핵산서열은 직접 황수화반응 활성을 가지는 펩타이드를 코딩할 수 있다. 이들 펩타이드 중 하나는 O-숙시닐호모세린을 기질로 사용할 수 있고, 다른 펩타이드는 O-아세틸호모세린을 기질로 사용할 수 있다.

또다른 예로서, 메티오닌 및 SAMe와 같은 관련 산물을 생산하도록 조작된 미생물은 황전이반응 생합성 경로 활성으로부터 상기 메티오닌의 적어도10%를 생산한다. 또다른 예로서, 상기 미생물은 황전이반응 생합성 경로 활성으로부터 생성물의 적어도 20, 30, 40 또는 적어도 50%를 생산한다.

또다른 예로서, 메티오닌 및 SAMe와 같은 관련 산물을 생산하도록 조작된 상기 미생물은 직접 황수화반응 생합성 경로 활성으로부터 상기 메티오닌의 적어도 10%를 생산한다. 또다른 예로서, 상기 미생물은 직접 황수화반응 생합성 경로 활성으로부터 생성물의 적어도 20, 30, 40 또는 적어도 50%를 생산한다.

또다른 예로서, 메티오닌 및 관련 산물을 생산하도록 조작된 미생물은 metD, metK, metJ, thrB, serA 유전자 또는 이들의 조합에 의해 코딩되는 펩타이드의 활성을 감쇠시키기 위하여 추가적으로 조작되어져 왔다. 또다른 예로서, 상기 미생물은 metA, metB, metC, metE, metY , metZ , metX , metH , cysPWUA , cysD , cysN , cysC , cysH, cysI , cysJ , cysG , csyK 및 cysM 과 같은 유전자를 하나 이상 과발현시키기 위해 추가적으로 조작된다.

본 발명은 메티오닌 및 SAMe을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 메티오닌 및 관련 산물(청구항에서 일치시킬 것)을 생산하기 위해 조작된 상기 미생물을 배양하는 단계 및 생성물을 분리하는 단계를 포함한다. 하나의 예로서, 상기 미생물은 대장균, 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.

또한, 본 발명은 신규한 핵산서열 및 그와 대응하는 아미노산 서열(서열번호 1 및 2)을 개시한다. 이러한 핵산서열, 그의 단편 및 변이체는 재조합 미생물에서 펩타이드를 생산하는데 유용하다. 상기 펩타이드는 특히(inter alia) 메티오닌 및 SAMe를 생산하는데 유용하다. 상기 펩타이드, 그의 단편 및 변이체는 또한 항체와 같은 특이적 결합물질을 생산하는데 유용하다.

본 발명은 또한 포스포아데닐일설페이트(PAPS) 중간대사물질을 회피함으로써(bypassing) 황 동화작용을 향상시키는 방법에 대해 개시한다. 상기 방법은 하나 이상의 아데닐일 설페이트 리덕타제(EC 1.8.9.92 or 1.8.4.9)의 과발현을 위한 재조합 핵산서열을 미생물에 도입함으로써 이루어질 수 있다. 과발현은 프로모터 또는 인핸서와 같은 새로운 조절인자를 도입하거나 변형하는 재조합 핵산서열을 도입하여 내인성 아데닐일 설페이트 리덕타제 생산을 증가시킴으로써 일어날 수 있고, 또는 아데닐일 설페이트 리덕타제를 코딩하는 재조합 핵산서열을 도입하여 일어날 수도 있다.

상기 개시한 기술의 내용은 하기의 상세한 설명 및 도면에 의해 분명해질 것이다.

약어 및 용어

본 발명에 대해 잘 설명하기 위해, 그리고 당업자들이 본 발명을 실시하는 것을 안내하기 위해 하기의 용어 및 방법들에 대한 설명이 제공된다. 하기에서 명확하게 달리 규정하지 않는 이상, "포함하는(comprising)" 은 "포함하는(including)"을 의미하고, 단수형인 "하나(a)" 또는 "하나(an)" 또는 "상기(the)"는 복수형을 포함한다. 예를 들면, "하나의 세포를 포함하는(comprising a cell)"은 그러한 세포들의 하나 또는 다수를 포함하는 것을 의미하며, "상기 호모시스테인 신타아제 펩타이드를 포함하는(comprising the homocysteine synthase peptide)"은 하나 이상의 호모시스테인 신타아제 펩타이드들 및 당업자에게 잘 알려진 이와 동등한 것을 의미한다. "또는(or)"은 명확하게 달리 규정하지 않는 이상, 열거된 대안적 요소의 하나의 단일 요소를 의미하거나 둘 이상의 요소들의 하나의 조합을 의미한다. 예를 들면, "호모시스테인 신타아제 활성 또는 시스타치오닌 감마-신타아제 활성"은 호모시스테인 신타아제 활성, 시스타치오닌 감마-신타아제 활성, 또는 호모시스테인 신타아제 활성 및 시스타치오닌 감마-신타아제 활성 둘 다의 조합을 의미한다.

달리 설명되지 않는다면, 본 발명에 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명의 기술이 속하는 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미와 같은 의미를 가진다. 비록 하기 개시된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 실험에 이용될 수 있더라도, 적절한 방법 및 물질이 하기에 개시된다. 물질, 방법 및 실시예는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니고 설명을 위한 것이다. 본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백할 것이다. 기탁번호(Accession Numbers): 본 발명에 개시된 기탁번호는 미국 국립 보건원에 의해 운영되는 NCBI 데이터베이스 (National Center for Biotechnology Information)에서 비롯된 것이다. 상기 기탁번호는 2007년 2월 20일자로 상기 데이터베이스에 제공된 것이다.

효소분류번호(Enzyme Classification numbers (EC.)): 본 발명에 개시된EC 번호는 유전자 및 게놈의 교토 백과(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics (KEGG))에 의해 운영되고 도쿄 대학에 의해 일부 지원받는 리간드 데이터베이스에서 비롯된 것이다. 상기 EC 번호는 2007년 2월 20일자로 상기 데이터베이스에 제공된 것이다.

감쇠(Attenuate): 어떤 것의 영향, 활성 또는 세기를 줄이는 것이다. 하나의 예로서, 생성물이나 반응물이 아닌 조성물에 의해 야기된 피드백 저해 또는 저해에 대한 특정 효소의 민감도(sensitivity)가 효소의 활성이 화합물의 존재에 의해 영향받지 않을 정도로 줄어드는 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 metA 유전자 및 그에 대응하는 아미노산 서열(서열번호 2에 개시된 서열과 같은)은 피드백 저해 민감도를 감쇠시키는 몇몇 돌연변이를 보여준다. 상기 MetA 민감도의 감쇠는 실시예 3.B.에서 보다 상세하게 기술된다. 다른 예로서, 활성이 줄어든 효소는 감쇠되었다고 할 수 있다.

cDNA (상보성 DNA): 내부의 비코딩 부분(인트론) 및 전사를 결정하는 조절 서열이 결여된 DNA 조각. cDNA는 세포로부터 추출된 전령 RNA로부터 역전사에 의해 합성될 수 있다.

결실(Deletion): 함께 결합되어 있는 어느 한쪽 영역에서, 핵산 분자로부터 하나 이상의 뉴클레오티드의 제거 또는 단백질로부터 하나 이상의 아미노산의 제거를 의미.

검출가능한(Detectable): 존재 또는 현존을 확신하게 할 정도의. 예를 들면, 반응물로부터 생성물의 생산, 예를 들면, 생성물 또는 반응물로부터 나오는 신호가 측정하기 충분할 정도로 강하다면 O-숙시닐호모세린 또는 호모시스테인의 생산은 검출가능하다

직접 황수화반응 활성(direct sulfhydrylation): 호모시스테인을 생산하기 위해 OSHS 또는 OAHS을 S^{2 -}와 직접 반응시키는 활성. 이러한 활성을 가진 펩타이드는 예를 들면, metZ 및 metY 와 같은 유전자에 의해 코딩되는 호모시스테인 신타아제(EC 4.2.99.-, EC 2.5.1.49)를 포함한다.

DNA: 데옥시리보핵산. DNA는 대부분의 살아있는 유기체의 유전물질을 포함하는 긴 사슬 폴리머이다(몇몇 바이러스는 리보핵산, RNA를 포함하는 유전자를 가진다). DNA폴리머에서 반복단위는 4개의 다른 뉴클레오티드, 4개의 염기 중 하나인, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민을 포함하는 이들 각각은 인산기가 붙어있는 데옥시리보오스 당에 결합된다. DNA분자에서 코돈으로 일컬어지는 뉴클레오티드의 트리플릿(triplet)은 펩타이드에 있는 아미노산을 코딩한다. 코돈이란 용어는 또한, DNA 서열이 전사된 mRNA에서 세개의 뉴클레오티드의 대응하는(그리고 상보적인) 서열에 사용된다.

내인성(endogenous): 본 발명에서는 재조합 조작 기술에 의해 세포로 도입된 것이 아닌, 세포에 있던 핵산 서열이나 펩타이드를 일컫는 핵산 분자 및 특정 세포 또는 미생물을 의미한다. 예를 들면, 자연으로부터 세포가 처음 분리될 때 세포에 있던 유전자. 만약 전사나 번역을 활성화시키는 프로모터나 인핸서 서열과 같은 조절 서열이 재조합 기술을 통해 변형되는 경우라면, 유전자는 여전히 내인성으로 간주된다.

외인성(exogenous): 자연상태에서 발견되는 특정세포로부터 유래하지 않은 핵산 분자를 일컫는 핵산 분자 및 특정 세포를 의미한다. 따라서, 비자연발생적인 핵산 분자는 세포에 일단 도입되면 세포에 대해 외인성으로 간주된다. 자연발생적인 핵산 분자 또한 특정 세포에 대해서는 외인성일 수 있다. 예를 들면, 세포 X 및 Y가 같은 세포유형이라 할지라도, 세포 X로부터 분리된 전체 코딩 서열은 일단 세포Y에 도입되면, 세포 Y에 대하여 외인성 핵산이다.

발현(Expression): 유전자의 코딩된 정보가 단백질, 운반 RNA, 또는 리보솜 RNA와 같은 세포의 구조나 기능으로 전환되는 과정. 발현된 유전자는 mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 유전자를 포함하고 RNA로는 전사되나 단백질로는 번역되지 않는 유전자(운반 및 리보솜 RNA)를 포함한다.

기능적 결실(Functional Deletion): 유전자 산물의 생산을 줄이거나 저해하는 유전자 서열로 만들거나, 또는 유전자 산물을 비기능적으로 만드는 돌연변이, 부분적 또는 전체 결실, 삽입, 또는 다른 변형. 예를 들면, 대장균에서 metJ 의 기능적 결실은 메티오닌 생합성 경로의 억제를 줄인다. 다른 예로서, 대장균에서 thrB의 기능적 결실은 트레오닌 생합성 경로에서 호모세린의 이용을 줄인다. 다른 예로서, 기능적 결실은 녹아웃 돌연변이로서 기술된다.

분리된(Isolated): "분리된" 생물학적 구성요소(핵산분자, 단백질 또는 세포)는 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA 및 단백질과 같이 자연발생적인 구성요소로서 다른 생물학적 구성요소로부터 실질적으로 분리되거나 정제된 것이다. 분리된 핵산분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산분자 및 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 화학적으로 합성된 핵산분자 및 단백질뿐만 아니라, 숙주세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산분자 및 단백질을 포함한다.

하나의 예로서, "분리된"은 서열이 유래된 유기체의 자연발생적인 게놈내에서 즉시 접촉하는 두개의 서열(5' 말단에 있는 하나와 3' 말단에 있는 하나)에 즉시 접촉하지 않은 자연발생적인 핵산 분자를 의미한다.

핵산분자: cDNA, 게놈DNA, 그리고 mRNA 등 제한없이, RNA 및 DNA 분자 둘다를 포함한다. 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 생산된 합성 핵산분자를 포함한다. 상기 핵산분자는 이중가닥일 수 있고 단일가닥일 수 있다. 단일가닥인 경우, 상기 핵산분자는 센스 가닥일 수 있고 안티센스 가닥일 수 있다. 또한, 핵산분자는 원형이거나 선형일 수 있다.

작동가능하게 연결된(Operably linked): 제1 핵산서열이 제2 핵산서열과 기능적 관계에 놓이면, 제1 핵산서열은 제2 핵산서열과 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 프로모터가 코딩서열의 전사나 발현에 영향을 미친다면 상기 프로모터는 코딩서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 동일 리딩 프레임에서 두개의 단백질 코딩 영역을 연결하는데 필요한 곳에 인접해 있다. 하나의 단일 전령 RNA처럼 나란히 전사된 분리된 유전자의 입체배치(configuration)는 오페론으로 나타난다. 따라서 근접위치에 놓여진 유전자들은, 예를 들면, 플라스미드 벡터에서, 하나의 단일 프로모터의 전사조절하에 하나의 합성 오페론을 구성한다.

ORF (open reading frame): 종결코돈이 없이 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 아미노산을 코딩하는 일련의 뉴클레오티드 트리플릿(코돈). 이들 서열은 보통 하나의 펩타이드로 번역될 수 있다.

정제된(Purified): "정제된"은 절대적 순도를 말하는 것은 아니고, 오히려 상대적인 용어이다. 따라서, 예를 들면, 숙시닐 CoA 호모세린 아실트랜스퍼라제 또는 호모시스테인 신타아제 제조와 같은 정제된 펩타이드 제조는 세포내의 환경에 있는 펩타이드보다 더 농축된 펩타이드를 말한다. 예를 들면, 정제된 펩타이드는 함께 있는 세포 구성요소(핵산, 지질, 탄수화물 및 다른 펩타이드)로부터 실질적으로 분리된 것을 말한다. 다른 예로서, 정제된 펩타이드 제조는 펩타이드의 화학적 합성에 부차적으로 존재할 수 있는 오염물질과 같은 것이 실질적으로 없는 것을 의미한다.

하나의 예로서, 펩타이드는 샘플의 적어도 약 50중량%가 상기 펩타이드로 구성될 때 정제된 것이고, 예를 들면, 샘플의 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99% 이상이 상기 펩타이드로 구성될 때이다. 펩타이드를 정제하기 위해 사용할 수 있는 방법의 구체예는 Sambrook et al . (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Ch. 17)에서 개시된 방법을 포함하며 반드시 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 단백질 정제는 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 결정될 수 있고, 이어서 상기 폴리아크릴아미드 겔을 염색하여 하나의 단일 펩타이드 밴드를 눈으로 확인하기; 고압액상 크로마토그래피; 시퀀싱; 또는 다른 통상의 방법들을 수행할 수 있다.

재조합(recombinant): 재조합 핵산분자 또는 단백질은 자연발생적이 아닌 서열을 가지며, 두개의 별개로 분리된 서열 또는 단편의 인공적인 조합에 의해 제조된 서열을 가지는 것을 말한다. 이러한 인공적인 조합은 예를 들면, 핵산분자 또는 단백질의 분리된 단편의 화학합성 또는 유전공학적 기술과 같은 인공적인 조작에 의해 수행된다. 재조합은 또한 인공적으로 조작되어지나, 핵산을 분리한 유기체에서 발견되는 동일한 조절 서열 및 코딩 영역을 가지는 핵산분자를 지칭할 때도 사용한다.

서열상동성/유사성: 둘 이상의 핵산서열 또는 둘이상의 아미노산 서열사이의 상동성/유사성은 서열간의 상동성 또는 유사성의 견지에서 표현되는 것이다. 서열상동성은 퍼센트 상동성의 견지에서 측정되기도 하며; 퍼센트가 높을수록 더 높은 상동성을 가지며, 상기 서열은 더 많이 동일한 것을 의미한다. 서열유사성은 퍼센트 유사성의 견지에서 측정될 수 있다(보존적 아미노산 대체를 설명하는); 퍼센트가 높을수록 더 높은 유사성을 갖고 상기 서열은 더 많이 유사한 것을 의미한다. 핵산 또는 아미노산 서열의 상동체 또는 오르토로그(ortholog)는 표준방법을 이용하여 비교할 때 상대적으로 높은 정도의 서열 상동성/유사성을 가지는 것이다.

서열비교를 위한 얼라인먼트(alignment) 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 프로그램 및 얼라인먼트 알고리즘이 개시된다: Smith & Waterman, Adv . Appl. Math . 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al ., Nuc. Acids Res . 16:10881-90, 1988; Huang et al . Computer Appls . in the Biosciences 8, 155-65, 1992; and Pearson et al., Meth . Mol . Bio . 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10, 1990 등에서 서열 얼라인먼트 방법 및 상동성 측정에 대해 상세하게 다루고 있다.

NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al ., J. Mol. Biol . 215:403-10, 1990)은 National Center for Biological Information (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894)을 포함한 인터넷에서 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn and tblastx의 이용을 위해 몇 개의 출처로부터 이용가능하다. 추가적인 정보는 NCBI 웹 사이트에서 찾을 수 있다.

BLASTP가 아미노산 서열을 비교하기 위해 이용되는 반면, BLASTN은 핵산서열을 비교하기 위해 이용된다. 핵산서열을 비교하기 위한 옵션은 하기와 같이 세팅될 수 있다: -i는 비교될 첫번째 핵산 서열을 포함하는 파일에 세팅되며( C:＼seq1.txt와 같이); -j는 비교될 두번째 핵산 서열을 포함하는 파일에 세팅되며( C:＼seq2.txt와 같이); -p는 블라스트엔에 세팅되며; -o는 원하는 파일명에 세팅되며( C:＼output.txt와 같이); -q는 -1로 세팅되며; -r는 2로 세팅되며; 그리고 모든 다른 옵션은 디폴딩 세팅에 남겨진다. 예를 들면, 하기 명령은 두 개의 서열사이간 비교를 포함하는 결과파일을 만들도록 이용될 수 있다: C:＼Bl2seq -i c:＼seq1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastn -o c:＼output.txt -q -1 -r2.

두 개의 아미노산 서열을 비교하기 위해, Bl2seq의 옵션이 하기와 같이 세팅될 수 있다: : -i는 비교될 첫번째 아미노산 서열을 포함하는 파일에 세팅되며( C:\seq1.txt와 같이); -j는 비교될 두번째 아미노산 서열을 포함하는 파일에 세팅되며(C:\seq2.txt와 같이); -p는 블라스트피에 세팅되며; -o는 원하는 파일명에 세팅되며( C:\output.txt와 같이); 그리고 모든 다른 옵션은 디폴딩 세팅에 남겨진다. 예를 들면, 하기 명령은 두개의 아미노산 서열사이의 비교를 포함하는 결과파일을 만들도록 이용될 수 있다: C:＼Bl2seq -i c:＼seq1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastp -o c:＼output.txt. 만약 두 개의 비교된 서열이 동종성을 갖는다면, 지정된 결과 파일은 비교된 서열에서 동종성이 있는 부분을 제시할 것이다. 만약 두 개의 비교 서열이 동종성을 갖지 않는다면, 지정된 결과 파일은 비교된 서열을 제시하지 않을 것이다.

일단 비교가 되면, 양 서열에 존재하는 동일한 뉴클레오티드나 아미노산 잔기 위치의 수를 카운팅함으로써 매치 수치가 결정된다. 퍼센트 서열 상동성은 매치 수치를 일치하는 서열에 제시된 서열 길이 또는 유기적으로 통합된 길이(하나의 일치된 서열에 제시된 서열로부터 나온 100개의 연속적인 뉴클레오티드나 아미노산 잔기와 같은)로 나누고, 결과 값에 100을 곱해서 결정될 수 있다. 예를 들면, 1554 뉴클레오티드를 갖는 테스트 서열과 비교시, 1166개의 매치를 갖는 핵산서열은 테스트 서열에 대해 75% 상동성을 갖는다(1166÷1554*100=75.0). 퍼센트 서열 상동성 수치는 반올림되는데, 예를 들면, 75.11, 75.12, 75.13, 및 75.14는 75.1가 되고, 75.15, 75.16, 75.17, 75.18, 및 75.19는 75.2가 된다. 길이 값은 항상 정수일 것이다.

30개를 넘는 아미노산 서열의 비교를 위해, Blast 2 서열 함수가 파라미터(gap existence cost of 11, and a per residue gap cost of 1)를 디폴트시키기 위해 디폴트 BLOSUM62 매트릭스 세트를 이용하여 사용된다. 동족체(homolog)는 nr 또는 swissprot database와 같은 데이터베이스를 가지는 NCBI Basic Blast 2.0, gapped blastp를 이용하여 아미노산 서열을 가지는 전체길이 얼라인먼트에 대하여 전형적으로 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 것으로 특징된다. 블라스트엔 프로그램으로 조회되는 질문은 DUST (Hancock and Armstrong, 1994, Comput . Appl . Biosci . 10:67-70)로 필터링되며, 다른 프로그램은 SEG를 사용한다. 게다가, 매뉴얼 얼라인먼트가 수행될 수 있다. 더 큰 유사성을 가진 단백질은 이 방법에 의해 평가될 때 대상서열의 활성을 보유하면서, 대상 서열(기탁번호 등에 의해 밝혀진)과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 더 높은 퍼센트 상동성을 보일 것이다. 일부 예에서는 대상서열은 천연 서열의 활성보다 더 큰 활성을 가질 것이고, 다른 예에서는 더 낮은 활성을 가질 것이다.

짧은 펩타이드(약 30개의 아미노산 미만)를 비교할 때, 얼라인먼트(alignment)는 파라미터(open gap 9, extension gap 1 penalties)를 디폴트시키기 위해 PAM30 매트릭스 세트를 사용하는, 블라스트 2 서열 함수를 이용하여 수행되어야 한다. 레퍼런스 서열과 훨씬 더 유사성을 가지는 단백질은 이 방법에 의해 평가될 때 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%과 같은 증가된 퍼센티지 상동성을 보여줄 것이다. 서열 상동성비교시 전체 서열 이하로 비교될 때는 동족체는 전형적으로 10-20 아미노산의 짧은 윈도우에 대해 적어도 75% 서열 상동성을 가질 것이며, 레퍼런스 서열에 대한 상동성에 따라, 적어도 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 상동성을 가질 것이다. 그러한 짧은 윈도우에 대한 서열 상동성을 결정하는 방법은 NCBI 웹 사이트에 기술되어 있다.

높은 정도의 상동성을 보이지 않는 핵산 서열은 그럼에도 불구하고 유전정보의 축퇴성 때문에 동일하거나 유사한 (보존적) 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 핵산서열에서의 변화는 실질적으로 동일한 단백질을 코딩하는 다수의 핵산분자를 생산하기 위해 이러한 축퇴성을 이용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 그러한 동족의 핵산서열은 대상 서열(기탁번호 등에 의해 밝혀진)과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가질 수 있다.

당업자는 이들 서열 상동성 범위는 단지 참고를 위해 제공되는 것이고, 상기 범위가 아니더라도 상당히 유사한 동족체를 얻을 수 있다는 것을 이해할 것이다.

형질전환된 세포(Transformed cell): 예를 들면 분자생물학 기술에 의해 숙시닐 CoA 호모세린 아실트랜스퍼라제, 호모시스테인 신타아제 핵산 분자와 같은 핵산분자가 도입된 세포. 형질전환은 핵산분자가 세포에 도입될 수 있는 모든 기술, 바이러스 벡터에 트랜스펙션, 컨쥬게이션, 플라스미드 벡터로 형질전환, 및 electroporation, lipofection, and particle gun acceleration에 의한 누드 DNA의 도입등 제한없이 포함한다.

황전이반응 활성: 중간대사산물인 시스타치오닌을 통해 메티오닌 또는 SAMe를 생산하는 활성. 이러한 활성을 갖는 펩타이드는 시스타치오닌 감마 신타아제(EC 2.5.1.48) 및 시스타치오닌 베타 리아제(EC 4.4.1.8)를 포함하며, 이들 펩타이드는 각각 metB 및 metC 유전자에 의해 코딩된다. 시스타치오닌 감마 신타아제(EC 4.2.99.9) 및 시스타치오닌 베타 리아제(EC 4.4.1.8) 펩타이드의 어떠한 조합도 미생물이 황전이반응 활성을 갖도록 이용될 수 있다.

생성물 생산을 허용하는 조건하에(Under conditions that permit product production): 미생물이 메티오닌 또는 SAMe와 같은 원하는 산물을 생산하도록 하는 어떠한 발효 조건. 상기 조건은 보통 온도, 통기, 및 배지를 포함한다. 상기 배지는 육즙 또는 겔일 수 있다. 일반적으로, 상기 배지는 글루코스, 프락토스, 셀룰로스 등과 같은 탄소원을 포함하며 이들 탄소원은 미생물에 의해 직접 대사되거나 또는 이들 탄소원 대사를 촉진시키기 위하여 상기 배지에 효소가 이용될 수 있다. 배양 조건이 생성물 생산을 허용하는지 여부를 결정하기 위해, 상기 미생물은 24, 36, 또는 48시간 동안 배양될 수 있고, 샘플을 취할 수 있다. 그런 다음, 상기 샘플의 세포는 원하는 산물의 존재 여부를 확인하기 위해 테스트될 수 있다. 예를 들면, 메티오닌 또는 SAMe의 존재 여부를 확인하기 위해 실시예에서 제공된 분석법이 사용될 수 있다.

벡터: 세포로 도입되어 형질전환된 세포를 만드는 핵산분자. 벡터는 복제 기점과 같은 세포에서 복제를 허용하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선택 마커 유전자 및 업계에 알려진 다른 유전적 요소를 포함할 수 있다.

발명의 상세한 설명

I. 메티오닌 생산 경로

도 1에서 보듯이, 많은 생합성 경로들이 메티오닌 또는 아스파르틸 포스페이트, 아스파르테이트 세미알데하이드, 호모세린, O-숙시닐호모세린 (OSHS), O-아세틸호모세린 (OAHS), 시스타치오닌, 호모시스테인, 메티오닌, 및 S-아데노실 메티오닌(SAMe)과 같은 중간대사산물을 생산하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 개시에서는 하나의 중간대사산물이 문맥에 따라 반응물(reactant) 또는 생성물(product)이 될 수 있다. 예를 들면, 아스파르테이트 키나아제를 이용하여 아스파르테이트를 아스파르틸 포스페이트로 전환하는 것에 대해 기술할 때는 상기 아스파르테이트는 반응물이고 상기 아스파르틸 포스페이트는 생성물이다. 유사하게, 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아게를 이용하여 아스파르틸 포스페이트를 아스파르테이트 세미알데하이드로 전환하는 것에 대해 기술할 때는 아스파르틸 포스페이트는 반응물이고, 아스파르테이트 세미알데하이드는 생성물이다. 하나의 반응물이 하나의 생성물로 전환되어 하나의 경로를 만들기 위해 각각의 효소류에 속하는 많은 효소가 이용될 수 있기 때문에, 당업자는 도 1이 많은 생합성 경로를 보인다고 이해할 것이다. 게다가, 이들 반응은 생체내(in vivo), 생체외( in vitro)에서 수행되거나, 생체내 반응과 비효소적 화학반응을 포함한 생체외 반응의 조합을 통해 수행될 수 있다.

또한 숙주 미생물이 발효 피드스톡(feedstock)에서 중간대사산물을 포함함으로써 상기 경로의 중간대사산물을 제공할 수 있다. 따라서, 만약 생합성 경로가 주어진 중간대사산물의 바람직한 양보다 적게 생산한다면 그러한 중간대사산물은 피드스톡에 추가될 수 있다. 이는 연속적인 발효 세팅 또는 배치(batch) 발효 세팅에서 수행될 수 있다.

당업자는 생산 숙주가 글루코스가 아닌 탄소원을 이용할 수 있다고 인식할 것이다. 예를 들면, 대체 탄소원은 수크로스, 프락토스, 셀룰로스, 헤미셀룰로서, 전분, 또는 글리세롤이다. 대체 탄소원이 이용될 때, 발효배지에서 탄소원을 변형시킬 수 있는 효소를 포함하는 것이 필요할 수 있다.

A. 글루코스에서 아스파르테이트까지

일반적으로 미생물은 글루코스로부터 아스파르테이트를 생산한다. 당업자는 생산균주에서 아스파르테이트를 증가시킬 많은 방법이 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 피루베이트 카르복실라제 및 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 효소의 발현을 증가시키거나, 글리옥실레이트 전환을 변경하거나 피루베이트가 아세테이트나 에탄올과 같은 다른 생성물로 소비되는 것을 제거하는 것 등이다.

또는, 아스파르테이트는 미생물에 의해 시작되는 발효 피드스톡에 포함될 수 있고 메티오닌 생합성 경로에서 반응물로서 이용될 수 있다.

아스파르테이트는 또한 리신, 트레오닌, 및 아스파라긴 생합성 경로에서 중간대사산물로서 작용한다. 그러므로, 이들 경로를 감쇠시키거나 제거(녹아웃)하여 보다 많은 아스파르테이트가 상기 메티오닌 생산 경로에 이용될 수 있도록 하는 것이 바람직할 것이다.

B. 아스파르테이트에서 아스파르틸 포스페이트까지

생산숙주는 알려진 폴리펩타이드를 이용하여 아스파르틸 포스페이트를 생산하도록 조작될 수 있다. 예를 들면, WO04069996A2에 개시된 피드백 저항성 아스파르테이트 키나아제가 내인성 아스파르테이트 키나아제를 대체할 수 있고 또는 내인성 아스파르테이트 키나아제에 더해 추가로 이용될 수 있다.

본 발명에서 아스파르테이트 키나아제는 아스파르테이트를 아스파르틸 포스페이트로 전환되는 것을 촉진시킬 수 있는 다른 펩티아드뿐만 아니라 효소분류번호(EC) 2.7.2.4의 펩타이드를 포함한다. 또한, 당업자는 몇몇 아스파르테이트 키나아제 펩타이드가 다른 반응도 촉매할 것이며, 예를 들면, 몇몇 아스파르테이트 키나아제 펩타이드는 아스파르테이트뿐만 아니라 다른 기질도 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 그러한 비특이적 아스파르테이트 키나아제 펩타이드 또한 본 발명에 포함된다. 아스파르테이트 키나아제 서열은 공개되어 있다. 예를 들면, 유전자은행 기탁번호 NZ_AAVY01000022, NC_006958 및 NZ_AAWW01000055는 아스파르테이트 키나아제 핵산 서열을 개시하고, 유전자은행 기탁번호 NP_418448, NP_599504 및 ZP_01638096은 아스파르테이트 키나아제 펩티드 서열을 개시한다. 특정 펩타이드의 아스파르테이트 키나아제 활성을 특성화(characterizing)하기 위한 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Cohen, GN, Methods in Enzymology, 113:596:600, 1985에 개시된 분석법이 특정 펩타이드의 활성을 특성화하기 위해 이용될 수 있다.

C. 아스파르틸 포스페이트에서 아스파르테이트 세미알데하이드까지

생산숙주는 알려진 폴리펩타이드를 이용하여 아스파르테이트 세미알데하이드를 생산하기 위해 또는 과다생산하기 위해 조작될 수 있다. 메티오닌 생합성 경로에서 생성물의 생산을 증가시키는 하나의 방법은 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제의 보다 활성화된 형태를 발현시키거나 과발현시키는 것을 통해서이다.

본 발명에서, 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제는 아스파르틸 포스페이트를 아스파르테이트 세미알데하이드로 전환하는 것을 촉매시킬 수 있는 다른 펩타이드뿐만 아니라 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 펩타이드(EC 1.2.1.11)를 포함한다. 또한, 당업자는 몇몇 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 펩타이드는 다른 반응도 촉매할 것이라는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 몇몇 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 펩타이드는 아스파르틸 포스페이트뿐만 아니라 다른 기질도 이용할 수 있으므로, 그러한 비특이적 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 펩타이드 또한 본 발명에 포함된다. 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 서열은 공개되어 있다. 예를 들면, 유전자은행 기탁번호 NC_006958, NZ_AAVY01000015 및 NZ_AAWW01000010은 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 핵산서열을 개시하고, 유전자은행 기탁번호 NP_417891, NP_599505 및 ZP_0164))72는 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 펩타이드 서열을 개시하고 있다. 특정 펩타이드의 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 활성을 특성화하기 위한 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Cohen, GN, Methods in Enzymology, 113:600-602, 1985에 개시된 분석법이 특정 펩타이드의 활성을 특성화하기 위해 이용될 수 있다.

D. 아스파르테이트 세미알데하이드에서 호모세린까지

생산숙주는 알려진 폴리펩타이드를 이용하여 호모세린을 생산하거나 과다생산하도록 조작될 수 있다. 메티오닌 생합성 경로에서 생성물의 생산을 증가시키는 하나의 방법은 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제의 보다 활성화된 형태를 발현시키거나 과발현시키는 것을 통해서이다

본 발명에서, 호모세린 디하이드로게나아제는 아스파르테이트 세미알데하이드를 호모세린으로 전환하는 것을 촉매시킬 수 있는 다른 펩타이드뿐만 아니라 호모세린 디하이드로게나아제 펩타이드(EC 1.1.1.3)를 포함한다. 또한, 당업자는 몇몇 호모세린 디하이드로게나아제 펩타이드는 다른 반응도 촉매할 것이며, 예를 들면, 몇몇 호모세린 디하이드로게나아제 펩타이드는 아스파르테이트 세미알데하이드뿐만 아니라 다른 기질도 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 그러한 비특이적 호모세린 디하이드로게나아제 펩타이드 또한 본 발명에 포함된다. 호모세린 디하이드로게나아제 펩타이드 서열은 공개되어 있다. 예를 들면, 유전자은행 기탁번호 NC_006958, NZ_AAVY01000013및 NZ_AAWW01000033 은 호모세린 디하이드로게나아제 핵산서열을 개시하고, 유전자은행 기탁번호 NP_414543, ZP_01639819 및 NP_600409는 호모세린 디하이드로게나아제 펩타이드 서열을 개시하고 있다. 특정 펩타이드의 호모세린 디하이드로게나아제 활성을 특성화하기 위한 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Patte et.al., Biochem . Biophys . Acta 128:426-439, 1966에 개시된 분석법이 특정 펩타이드의 활성을 특성화하기 위해 이용될 수 있다.

E. 호모세린에서 O- 숙시닐호모세린(OSHS)까지

생산숙주는 알려진 폴리펩타이드를 이용하여 O-숙시닐호모세린 (OSHS)을 생산하거나 과다생산하도록 조작될 수 있다. 메티오닌 생합성 경로에서 생성물의 생산을 증가시키는 하나의 방법은 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제 펩타이드의 보다 활성화된 형태를 발현시키거나 과발현시키거나 또는 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제 펩타이드의 피드백 저해 불감성 형태( insensitive form)를 이용하는 것이다

본 발명에서, 숙시닐 CoA 호모세린 아실트랜스퍼라제는 호모세린을 OSHS로 전환하는 것을 촉매시킬 수 있는 다른 펩타이드뿐만 아니라 호모세린O-숙시닐트랜스퍼라제 펩타이드(EC 2.3.1.46)를 포함한다. 또한, 당업자는 몇몇 호모세린O-숙시닐트랜스퍼라제 펩타이드는 다른 반응도 촉매할 것이며, 예를 들면, 몇몇 숙시닐 CoA 호모세린 아실트랜스퍼라제 펩타이드는 호모세린뿐만 아니라 다른 기질도 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 그러한 비특이적 숙시닐 CoA 호모세린 아실트랜스퍼라제 펩타이드 또한 본 발명에 포함된다. 호모세린O-숙시닐트랜스퍼라제 펩타이드 서열은 공개되어 있다. 예를 들면, 유전자은행 기탁번호 NZ_AAWW01000055는 호모세린O-숙시닐트랜스퍼라제 핵산서열을 개시하고, 유전자은행 기탁번호 AAC76983은 호모세린O-숙시닐트랜스퍼라제 펩타이드 서열을 개시하고 있다. 특정 펩타이드의 숙시닐 CoA 호모세린 아실트랜스퍼라제 활성을 특성화하기 위한 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Lawrence, J. Bacteriol ., 109:8-11, 1972에 개시된 분석법이 특정 펩타이드의 활성을 특성화하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 숙시닐 CoA 호모세린 아실트랜스퍼라제 펩타이드를 코딩하는 유전자는 metA로 지칭된다.

F. 호모세린에서 O- 아세틸호모세린 ( OAHS )까지

생산숙주는 알려진 폴리펩타이드를 이용하여 O-아세틸호모세린 (OAHS)을 생산하거나 과다생산하도록 조작될 수 있다. 메티오닌 생합성 경로에서 생성물의 생산을 증가시키는 하나의 방법은 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 펩타이드(EC 2.3.1.31)의 보다 활성화된 형태를 발현시키거나 과발현시키는 것을 통해서이다.

본 발명에서, 호모세린O-아세틸트랜스퍼라제는 호모세린을 OAHS로 전환하는 것을 촉매시킬 수 있는 다른 펩타이드뿐만 아니라 호모세린O-아세틸트랜스퍼라제 펩타이드(EC 2.3.1.31)를 포함한다. 또한, 당업자는 몇몇 호모세린O-아세틸트랜스퍼라제 펩타이드는 다른 반응도 촉매할 것이며, 예를 들면, 몇몇 호모세린O-아세틸트랜스퍼라제 펩타이드는 호모세린뿐만 아니라 다른 기질도 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 그러한 비특이적 호모세린O-아세틸트랜스퍼라제 펩타이드 또한 본 발명에 포함된다. 호모세린O-아세틸트랜스퍼라제 펩타이드 서열은 공개되어 있다. 예를 들면, 유전자은행 기탁번호 Y10744 REGION: 2822..3961, NZ_AAAH02000004 REGION: 166057..167193 및 NZ_AAAY02000081 REGION: complement(11535..12605)는 호모세린O-아세틸트랜스퍼라제 핵산서열을 개시하고, 유전자은행 기탁번호 CAA71733, ZP_00766367 및 ZP_00107218은 호모세린O-아세틸트랜스퍼라제 펩타이드 서열을 개시하고 있다. 특정 펩타이드의 호모세린O-아세틸트랜스퍼라제 활성을 특성화하기 위한 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Lawrence, J. Bacteriol ., 109:8-11, 1972에 개시된 분석법이 특정 펩타이드의 활성을 특성화하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 호모세린O-아세틸트랜스퍼라제 펩타이드를 코딩하는 유전자는 metX로 지칭된다.

G. 황수화반응

직접 황수화반응에 의한 호모시스테인의 생산은 호모시스테인 신타아제 효소들에 의해 수행되며, 이들 효소들 중 몇몇은 기질로서 OSHS를 이용하기도 하고, 몇몇은 OAHS를 이용하기도 한다. 또한, 이들 효소들 중 몇몇은 OSHS또는 OAHS를 기질로서 이용할 수 있다.

1. O- 숙시닐호모세린 ( OSHS )에서 호모시스테인까지

생산숙주는 알려진 폴리펩타이드를 이용하여 호모시스테인을 생산하거나 과다생산하도록 조작될 수 있다. 메티오닌 생합성 경로에서 생성물의 생산을 증가시키는 하나의 방법은 호모시스테인 신타아제 펩타이드(EC 4.2.99.-)의 보다 활성화된 형태를 발현시키거나 과발현시키는 것을 통해서이다.

본 발명에서, 호모시스테인 신타아제는 O-숙시닐호모세린 (OSHS)을 호모시스테인으로 전환하는 것을 촉매시킬 수 있는 다른 펩타이드뿐만 아니라 호모시스테인 신타아제 펩타이드(EC 4.2.99.-)를 포함한다. 본 발명에서는 설파이드(sulfide)와의 반응을 통한OSHS의 호모시스테인으로의 전환을 직접 황수화반응이라고 일컫는다. 또한, 당업자는 몇몇 호모시스테인 신타아제 펩타이드는 다른 반응도 촉매할 것이며, 예를 들면, 몇몇 호모시스테인 신타아제 펩타이드는 OSHS뿐만 아니라 다른 기질도 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 그러한 비특이적 호모시스테인 신타아제 펩타이드 또한 본 발명에 포함된다. 호모시스테인 신타아제 펩타이드 서열은 공개되어 있다. 예를 들면, 유전자은행 기탁번호 AE004091은 호모시스테인 신타아제(O-숙시닐-L-호모세린 설프하이드릴라제) 핵산서열을 개시하고, 유전자은행 기탁번호 AAG06495는 호모시스테인 신타아제(O-숙시닐-L-호모세린 설프하이드릴라제) 아미노산 서열을 개시하고 있다. 특정 펩타이드의 호모시스테인 신타아제 활성을 특성화하기 위한 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Yamagata, Methods in Enzymology, 143:478, 1987에 개시된 분석법이 특정 펩타이드의 활성을 특성화하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 호모시스테인 신타아제 펩타이드를 코딩하는 유전자는 metZ로 지칭된다.

2. O-아세틸호모세린(OAHS)에서 호모시스테인까지

생산숙주는 알려진 폴리펩타이드를 이용하여 호모시스테인을 생산하거나 과다생산하도록 조작될 수 있다. 메티오닌 생합성 경로에서 생성물의 생산을 증가시키는 하나의 방법은 호모시스테인 신타아제 펩타이드(EC 2. 5. 1.49)의 보다 활성화된 형태를 발현시키거나 과발현시키는 것을 통해서이다.

본 발명에서, 호모시스테인 신타아제는 O-숙시닐호모세린 (OSHS)을 호모시스테인으로 전환하는 것을 촉매시킬 수 있는 다른 펩타이드뿐만 아니라 호모시스테인 신타아제 펩타이드(EC 2.5.1.49)를 포함한다. 본 발명에서는 설파이드(sulfide)와의 반응을 통한OAHS의 호모시스테인으로의 전환을 직접 황수화반응이라고 일컫는다. 또한, 당업자는 몇몇 호모시스테인 신타아제 펩타이드는 다른 반응도 촉매할 것이며, 예를 들면, 몇몇 호모시스테인 신타아제 펩타이드는 OSHS뿐만 아니라 다른 기질도 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 하기 실시예 2에 개시된 호모시스테인 신타아제는 OAHS 또는 OSHS를 기질로서 이용한다. 따라서, 그러한 비특이적 호모시스테인 신타아제 펩타이드 또한 본 발명에 포함된다. 호모시스테인 신타아제 펩타이드 서열은 공개되어 있다. 예를 들면, 유전자은행 기탁번호 AE004091 REGION: 5655648..5656925, Y10744 REGION: 1485..2813, NZ_AAAH02000004 REGION: 164536..165990 및 NZ_AAAY02000081 REGION: complement(12750..14054) 는 호모시스테인 신타아제(O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제) 핵산서열을 개시하고, 유전자은행 기탁번호 AAG08410, CAA71732, ZP_00766366, 및 ZP_00107219는 호모시스테인 신타아제(O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제) 아미노산 서열을 개시하고 있다. 특정 펩타이드의 호모시스테인 신타아제 활성을 특성화하기 위한 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Yamagata, Methods in Enzymology, 143:478, 1987에 개시된 분석법이 특정 펩타이드의 활성을 특성화하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 호모시스테인 신타아제 펩타이드를 코딩하는 유전자는 metY로 지칭된다.

H. 황전이반응

1. O- 숙시닐호모세린 ( OSHS ) 또는 O- 아세틸호모세린 ( OAHS )에서 시스타치오닌까지

생산숙주는 알려진 폴리펩타이드를 이용하여 시스타치오닌을 생산하거나 과다생산하도록 조작될 수 있다. 메티오닌 생합성 경로에서 생성물의 생산을 증가시키는 하나의 방법은 시스타치오닌 감마-신타아제 펩타이드(EC 2.5.1.48)의 보다 활성화된 형태를 발현시키거나 과발현시키는 것을 통해서이다.

본 발명에서, 시스타치오닌 감마-신타아제는 OSHS 또는OAHS를 시스타치오닌으로 전환하는 것을 촉매시킬 수 있는 다른 펩타이드뿐만 아니라 시스타치오닌 감마-신타아제 펩타이드(EC 2.5.1.48)를 포함한다. 또한, 당업자는 몇몇 시스타치오닌 감마-신타아제 펩타이드는 다른 반응도 촉매할 것이며, 예를 들면, 몇몇 시스타치오닌 감마-신타아제 펩타이드는 OSHS 또는OAHS뿐만 아니라 다른 기질을 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 그러한 비특이적 시스타치오닌 감마-신타아제 펩타이드도 본 발명에 포함된다. 시스타치오닌 감마-신타아제 펩타이드 서열은 공개되어 있다. 예를 들면, 유전자은행 기탁번호 NC_006958, NZ_AAWW01000006 및 NC_004129는 시스타치오닌 감마-신타아제 핵산서열을 개시하고, 유전자은행 기탁번호 NP_418374, YP_348978 및 NP_601979는 시스타치오닌 감마-신타아제 펩타이드 서열을 개시하고 있다. 특정 펩타이드의 시스타치오닌 감마-신타아제 활성을 특성화하기 위한 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Methods in Enzymology, 17:425-433, 1971에 개시된 분석법이 특정 펩타이드의 활성을 특성화하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 시스타치오닌 감마-신타아제 펩타이드를 코딩하는 유전자는 metB로 지칭된다.

2. 시스타치오닌에서 호모시스테인까지

생산숙주는 알려진 폴리펩타이드를 이용하여 호모시스테인을 생산하거나 과다생산하도록 조작될 수 있다. 메티오닌 생합성 경로에서 생성물의 생산을 증가시키는 하나의 방법은 시스타치오닌 베타-리아제 펩타이드(EC 4.4.1.8)의 보다 활성화된 형태를 발현시키거나 과발현시키는 것을 통해서이다.

본 발명에서, 시스타치오닌 베타-리아제는 시스타치오닌을 호모시스테인으로 전환하는 것을 촉매시킬 수 있는 다른 펩타이드뿐만 아니라 시스타치오닌 베타-리아제 펩타이드(EC 4.4.1.8)를 포함한다. 또한, 당업자는 몇몇 시스타치오닌 베타-리아제 펩타이드는 다른 반응도 촉매할 것이며, 예를 들면, 몇몇 시스타치오닌 베타-리아제 펩타이드는 시스타치오닌뿐만 아니라 다른 기질을 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 그러한 비특이적 시스타치오닌 베타-리아제 펩타이드도 본 발명에 포함된다. 시스타치오닌 베타-리아제 펩타이드 서열은 공개되어 있다. 예를 들면, 유전자은행 기탁번호 NZ_AAWW01000001, NC_006958 및 NZ_AAVY01000004는 시스타치오닌 베타-리아제 핵산서열을 개시하고, 유전자은행 기탁번호 NP_746463, YP_226552 및 NP_417481은 시스타치오닌 베타-리아제 펩타이드 서열을 개시하고 있다. 특정 펩타이드의 시스타치오닌 베타-리아제 활성을 특성화하기 위한 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Methods in Enzymology, 143:483-486, 1987에 개시된 분석법이 특정 펩타이드의 활성을 특성화하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 시스타치오닌 베타-리아제 펩타이드를 코딩하는 유전자는 metC로 지칭된다.

I. 호모시스테인에서 메티오닌까지

생산숙주는 알려진 폴리펩타이드를 이용하여 메티오닌을 생산하거나 과다생산하도록 조작될 수 있다. 메티오닌 생합성 경로에서 메티오닌 또는 SAMe과 같은 생성물의 생산을 증가시키는 하나의 방법은 호모시스테인 메틸라아제 펩타이드(EC 2.1.1.14 및 2.1.1.13)의 보다 활성화된 형태를 발현시키거나 과발현시키는 것을 통해서이다.

본 발명에서, 호모시스테인 메틸라아제는 호모시스테인을 메티오닌으로 전환하는 것을 촉매시킬 수 있는 다른 펩타이드뿐만 아니라 호모시스테인 메틸라아제 펩타이드(EC 2.1.1.14, 및 2.1.1.13)를 포함한다. 또한, 당업자는 몇몇 호모시스테인 메틸라아제 펩타이드는 다른 반응도 촉매할 것이며, 예를 들면, 몇몇 호모시스테인 메틸라아제 펩타이드는 호모시스테인뿐만 아니라 다른 기질을 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 그러한 비특이적 호모시스테인 메틸라아제 펩타이드도 본 발명에 포함된다. 호모시스테인 메틸라아제 펩타이드 서열은 공개되어 있다. 예를 들면, 유전자은행 기탁번호 NC_004129, NC_006958 및 NC_000913은 호모시스테인 메틸라아제 핵산서열을 개시하고, 유전자은행 기탁번호 AP_004520, YP_225791 및 CAK16133은 호모시스테인 메틸라아제 펩타이드 서열을 개시하고 있다. 특정 펩타이드의 호모시스테인 메틸라아제 활성을 특성화하기 위한 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Analytical Biochemistry, 228, 323-329, 1995에 개시된 분석법이 특정 펩타이드의 활성을 특성화하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 호모시스테인 메틸라아제 펩타이드를 코딩하는 유전자는 metH 또는 metE로 지칭된다.

J. 메티오닌에서 S- 아데노실메티오닌까지

생산숙주는 알려진 폴리펩타이드를 이용하여 S-아데노실메티오닌(SAMe)을 생산하거나 과다생산하도록 조작될 수 있다. 메티오닌 생합성 경로에서 생성물의 생산을 증가시키는 하나의 방법은 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 펩타이드(EC 2.5.1.6)의 보다 활성화된 형태를 발현시키거나 과발현시키는 것을 통해서이다. 예를 들면, 당업자는 메티오닌이 원하는 생성물인 경우, metK에 의해 코딩되는 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 펩타이드(EC 2.5.1.6)의 활성이나 발현은 감쇠될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

본 발명에서, 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제는 메티오닌을 SAMe으로 전환하는 것을 촉매시킬 수 있는 다른 펩타이드뿐만 아니라 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 펩타이드(EC 2.5.1.6)를 포함한다. 또한, 당업자는 몇몇 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 펩타이드는 다른 반응도 촉매할 것이며, 예를 들면, 몇몇 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 펩타이드는 메티오닌뿐만 아니라 다른 기질을 이용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 그러한 비특이적 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 펩타이드도 본 발명에 포함된다. 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 펩타이드 서열은 공개되어 있다. 예를 들면, 유전자은행 기탁번호 NC_002516, NC_006958 및 NC_000913은 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 핵산서열을 개시하고, 유전자은행 기탁번호 NP_747070, CAI37180 및 NP_600817은 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 펩타이드 서열을 개시하고 있다. 특정 펩타이드의 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 활성을 특성화하기 위한 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Methods in Enzymology, 94: 219-222, 1983에 개시된 분석법이 특정 펩타이드의 활성을 특성화하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 펩타이드를 코딩하는 유전자는 metK로 지칭된다.

II. 메티오닌 생산 증가를 위한 생산균주의 유전적 조작

아스파르테이트 생산은 당업계에 알려진 방법을 이용하여 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 아스파르테이트 생산은 몇몇 다른 접근법으로 세포에 의해 생산되는 옥살로아세테이트의 양을 늘림에 의해 증가시킬 수 있다(Gokarn et.al, Appl . Microbiol. Biotechnol., 56:188-95, 2001; Sanchez et.al, Metabolic Eng ., 8:209-226, 2006).

또한 생성물의 생산은 L-메티오닌 생합성 경로에서 다양한 유전자를 과발현시킴으로써 증가시킬 수 있다. 예를 들면, metA, metB, metC, metE, 및 metH, cysD, cysN , cysC , cysH , cysI , cysJ , cysK 및 cysM 과 같은 유전자를 다양한 프로모터의 조절하에 놓음으로써, 이들 효소를 더 많이 생산되도록 할 수 있다.

상기 metA유전자는 호모세린으로부터의 메티오닌 생합성 경로에서 첫번째 효소이자 메티오닌 생산의 조절 포인트인 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제를 코딩한다. 상기 metA 단백질은 35.7 kDa의 측정 분자량을 가진 186개의 아미노산 잔기로 된 온도 민감성 단백질이다. 상기 metA활성은 마지막 생성물인, 메티오닌 및 S-아데노실메티오닌에 의해 저해되는 것으로 알려져 있다(Lee et al., J. Biol . Chem . 241:5479-5780, 1966). 이들 두 생성물에 의한 피드백 저해는 시너지효과가 있으며, 이는 각 대사산물만의 낮은 농도는 약한 저해활성을 보이지만 둘의 조합은 강한 저해활성을 나타내는 것을 의미한다. 따라서, 생산균주는 피드백 저해 저항성 MetA 활성으로부터 이득을 얻을 수 있다.

메티오닌 생산균주에서 감쇠되거나 결실될 수 있는 또다른 유전자는 metJ이다. metJ에 의해 코딩되는 펩타이드는 메티오닌 생합성 경로에 관련된 몇 개의 유전자의 발현을 조절한다. metJ에 의해 코딩되는 단백질은 S-아데노실메티오닌에 결합하여 metA, metC, 및 metF 유전자를 억제한다.

metF 유전자에 의해 코딩되는 단백질, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제는 호모시스테인으로부터 L-메티오닌을 생산하기 위한 메틸기 공여체인 N(5)-메틸테트라하이드로폴레이트의 합성에 관여한다(Sheppard et al., J. Bacteriol. 181:718-25, 1999). US 2002/0049305는 L-메티오닌의 생산은 코리네박테리아에서 5, 10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제(metF)의 발현을 증가시킴에 의해 향상될 수 있음을 개시하고 있다. 따라서, 본 발명에서 기술하는 조작된 미생물도 metF 생산을 증가시키도록 조작될 수 있다.

metK유전자의 조절 또한 메티오닌 및 SAMe 생산을 증가시킬 수 있다. S-아데노실메티오닌(SAMe)은 모든 유기체에서 일차 메틸기 공여체이고 폴리아민 생합성에 관여한다. SAMe은 또한 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제(MAT 또한 MetK, EC 2.5.1.6)로 알려져 있다. MetK는 SAMe 생합성의 유일하게 알려진 루트를 촉매한다. 온전한 트리폴리포스페이트 사슬은 ATP에 의해 쪼개지고 설포니움(sulfonium) 화합물이 형성된다.

SAMe의 형성은 메티오닌의 농도를 떨어뜨리고, MetA의 피드백 저해를 통해 메티오닌 생합성 경로의 활성을 감소시킨다. 그러므로, metK를 기능적으로 결실시키거나 감쇠시키면 메티오닌 생산을 늘릴 수 있다.

당업자는 메티오닌을 만들고 있는 세포에 의한 황의 이용효율이 중요하다는 것을 인식할 것이다. 이는 특히 황 동화작용의 과정에서 포스포아데닐일설페이트(PAPS)를 중간대사산물로 이용하는 미생물의 경우 그러한데, PAPS를 만드는데 ATP분자의 소비를 요하기 때문이다.

설페이트는 상당히 반응성이 낮기 때문에 세포에서 사용되기 위해서는 보다 반응성이 있는 형태로 전환되어야 한다. 대장균에서 설페이트는 주변세포질 공간에 위치한 세 개의 세포막 구성요소 및 기질특이적 결합 단백질로 구성된 주변세포질 수송계에 의해 세포로 유입된다. 설페이트 퍼미아제의 세 개의 막 구성요소는 cysT, cysW, 및 cysA 유전자 (cysA 로커스)에 의해 코딩된다. cysA 로커스의 산물은 cys 레귤론(cys regulon)의 일부로서 나머지 설페이트-동화작용 경로와 협력하여 조절된다. 그런다음, 설페이트는 대부분의 유기체에서 유사해보이는 경로를 통해 고에너지 뉴클레오시드 포스포설페이트를 만들기 위해 뉴클레오시드에 커플링됨으로써 활성된다.

도 6에서 보듯이, 대장균과 같은 미생물은 설페이트 아데닐일 트랜스퍼라제 펩타이드(cysNcysD에 의해 코딩되는 EC 2.7.7.4)를 이용하여 설페이트를 아데닐일설페이트(APS)로 전환하는 경로를 이용한다. 그리고 나서, 상기 APS는 APS 키나아제(cysC에 의해 코딩되는 EC 2.7.1.25)에 의해 PAPS로 전환된다. 이러한 과정은 ATP를 요구한다. PAPS는 PAPS 리덕타제(cysH에 의해 코딩된 EC 1.8.4.8)에 의해 설파이트로 전환되며, 설파이트는 NADPH-설파이트 리덕타제 (cysIcysJcysG에 의해 코딩되는 EC1.8.1.2)에 의해 설파이드로 환원된다. 도 6의 오른쪽에 도시한 대체 경로는 아데닐일 설페이트 리덕타제(EC 1.8.9.92 or 1.8.4.9)를 이용하여 APS를 직접 설파이트로 전환한다. 당업자는 APS를 설파이트로 전환할 수 있는 어떤 아데닐일 설페이트 리덕타제도 작용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 바실러스 서브틸리스(기탁번호 CAA04409) 유래 또는 슈도모나스 아에루기노사(기탁번호 NP_250447) 유래의 아데닐일 설페이트 리덕타제.

아데닐일 설페이트 리덕타제를 코딩하는 핵산서열은 메티오닌을 생산하기 위해 이용되는 어떤 미생물 속으로 도입될 수 있다. 예를 들면, Metabolic Explorer 에 의해 WO2005/108561 및 WO2006138689에 개시된 균주, 그리고 Kumar and Gomes, Biotechnology Advances 23:41-61, 2005에 개시된 균주뿐만 아니라, 본 발명에 개시된 균주는 PAPS를 건너뛰는, 그래서 설페이트 동화작용에 ATP 분자가 하나 덜 요구되는, 개시된 루트로부터 이익을 얻을 것이다.

도 1은 메티오닌을 생산하기 위해 다양한 미생물에 의해 이용되는 세가지 일반적인 경로를 도시한 것이다. 상기 경로 모두는 메티오닌 생산을 위한 전구체로서 부분적으로 아스파르테이트를 이용한다. 아스파르테이트는 여러 단계를 거쳐 호모세린으로 전환되고, 호모세린은 MetA 또는 MetX에 의해 O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린으로 전환된다. 대장균(E.coli)과 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)과 같은 일부 미생물은 MetA 폴리펩티드를 이용해 O-숙시닐호모세린을 만드는 반면, 코리네박테리움(Corynebacteriump)과 렙토스피라 속(Leptospira sp.)과 같은 다른 미생물은 MetX를 이용하여 O-아세틸호모세린을 만든다. 그런 다음, O-숙시닐호모세린 및 O-아세틸호모세린은 황수화반응을 통해 곧바로 호모시스테인으로 전환되거나, 황전이반응을 통해 호모시스테인으로 전환될 수 있다(상기 두 반응에 대해서는 하기에 상세히 개시된다). 황전이반응과 관련있는 효소는 별 두개(**)로 표시되고, 황수화반응과 관련있는 효소는 별 하나(*)로 표시된다.

도 2는 오직 황전이반응 활성만 가진 것(TF4076BJF), 오직 황수화반응 활성만 가진 것(TF4076BJF-A), 또는 두 활성을 동시에 가진 것(TF4076BJF metYX(Lm) 등 TF4076BJF에서의 메티오닌 축적을 보여주는 그래프이다.

도 3은 피드백 저해에 대한 저항성이 있는metA 돌연변이체를 동정하기 위해 이용된 스크리닝 방법에 대한 개략적인 도면이다(각 경우마다 축적된 생성물은 타원형 음영으로 표시되어 있다).

도 4는 피드백 저해 저항성 metA 유전자를 발현시킨 균주에 의해 생산된 메티오닌 축적을 시간에 따라 나타낸 것이다.

도 5는 대장균에서의 메티오닌 수송 모델을 도시한 것이다.

도 6은 천연의 황 동화작용 경로 및 신규한 대체 경로를 도시한 것이다.

실시예

실시예 1. 외인적으로 발현된 핵산서열을 이용하여 직접 황수화반응을 이용하는 다수의 메티오닌 생산 경로

A. metABC (황전이반응) 및 metAZ (직접 황수화반응)를 가지는 미생물의 제조.

상기에서 기술하였듯이, 대장균에서 메티오닌의 내인적 생산은 주로 황전이반응을 통해 일어난다. 본 실시예는 내인성 metABC 경로는 유지하면서, 직접 황수화반응을 증가시키기 위해 대장균을 조작하는 것에 대해 기술한다.

직접 황수화반응은 황화수소와 반응시켜 O-숙시닐호모세린을 호모시스테인으로 전환시키는 숙시닐설프하이드릴라제(EC 4.2.99.-)를 클로닝함으로써 증가시킬 수 있었다. 상기 효소는 metZ에 의해 코딩되며 슈도모나스 종에서 발견될 수 있 다(Vermeij and Kertesz, J Bacteriol. 181:5833-5837, 1999 및 Inoue et al., J. Bacteriol.179:3956-3962, 1997).

보다 구체적으로, 슈도모나스 아에루기노사 유래의 metZ는 트레오닌 생산균주인 TF4076으로부터 유래한 TF4076BJF 균주의 메티오닌 영양요구주내로 클론되었다(pTrc 프로모터의 조절하에 thrB 및 metJ를 결실시키고metF를 삽입함에 의해 추가적으로 수식된 것이며, 보다 상세하게는 하기 실시예 3에서 기술). 상기 영양요구주 metB유전자가 결실되거나 metB 및metC 유전자가 결실된 것이다. 슈도모나스 아에루기노사 유래의 metZ는 최소배지에서 metB 및metBC 결실 돌연변이체의 성장을 증가시켰다. 플라스크 배양에서 메티오닌 생산은 완전하게 회복되지는 않았지만, 표 1에서 보듯이, metZ 발현은 metBC 결실 돌연변이체에서 메티오닌 생산을 100mg/L까지 유도하였다. 이는 metZ가 세포에서 호모시스테인의 생산에 관여한다는 것을 말해준다.

metZ로 형질전환된 상기 결실 돌연변이체의 메티오닌 생산이 저조한 이유는 세포내 부분에서 설파이드의 제한때문일 것이다(설파이드 농도 증가방법은 하기에 기술된다). 이것은 metZ로 형질전환된 metBC결실 균주의 성장이 2 mM 소듐 설파이드의 존재하에 M9 배지에서 향상된 결과에 의해 뒷받침된다. 인비트로 분석법에서, O-숙시닐설프하이드릴라제는 낮은 설파이드 친화력을 보였다. 유도된 진전을 통해, 높은 설파이드 친화력 및 높은 활성을 가진 향상된 O-숙시닐설프하이드릴라제를 개발하는 것이 가능하다. 매우 활성된 O-숙시닐설프하이드릴라제는 메티오닌 경로에서 metB 및 metC를 대체할 수 있거나, 메티오닌에 탄소 유입을 증가시키는 경로를 보완할 수 있다.

B. metABC(황전이반응) 및 metXY (직접 황수화반응)을 가지는 미생물의 제조

본 실시예는 대장균에서 두개의 경로로부터 동시에 생산되는 메티오닌을 보여준다. 하나의 경로는 내인성 metABC 경로이고 두번째 경로는 다양한 유기체 유래의 metY 및 metX의 발현을 통한 직접 황수화반응을 허용하는 경로이다.

도 1에서 보듯이, 대장균은 황전이반응 경로 유전자 metA , metB 및 metC를 이용하고 OSHS를 거쳐 내인적으로 메티오닌을 생산한다. 대장균내로 metX 및 metY 유전자를 클론시키고 발현시킴으로써 대장균에 추가적인 경로를 부가하는데에는 유전공학적 기술이 이용되었고, 이로 인해 황전이반응과 직접 황수화반응을 동시에 수행하여 메티오닌을 생산하는 숙주 유기체가 제조되었다.

이종기원의 경로를 구축하기 위해 이용된 metY 및 metX 유전자가 하기 개시된 바와 같이, 렙토스피라 메에리(Leptospira meyeri), 데이노코커스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans), 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus), 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens), 노스톡 푼크티포르메(Nostoc punctiforme) 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) DNA로부터 클론되었고, 몇개의 다른 균주가 메티오닌 생산에 대한 이들 유전자의 부가로 인한 영향을 분석하기 위해 제조되었다. 또한, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 호모시스테인 신타아제가 클론되고 테스트되었다. 양 경로 모두 동시에 작용하도록 시범되었고 메티오닌 생산은 이러한 부가에 의해 증대되었다.

L. 메에리(L. meyeri ) metX 및 metY 효소가 대장균 메티오닌 영양요구주의 성장을 보완할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, L. meyeri metYX 유전자 클러스터가 플라스미드 metXY-pCR2.0-TOPO로부터 증폭되었고, 벡터pPRO-Nde-del로 클론되었다. 상기 플라스미드에서 metYX 유전자의 전사는 벡터내에 위치한 프로모터 lac/ara 에 의해 개시되었다.

W3110 △metA (OSHS의 생산 중단됨), TF4076BJF (호모세린 생산 증가됨), TF4076BJF △metA (OSHS의 생산 중단됨), 및 TF4076BJF △metAmetB (OSHS의 생산 및 OAHS 또는 OSHS로부터 시스타치오닌의 생산이 중단됨)를 포함하는 네 개의 대장균 균주가 평가되었다. TF4076BJF 균주는 트레오닌 영양요구주이며, 호모세린까지 탄소 유입을 증가시킴으로써 메티오닌을 생산하기 위해 조절해제되고, 상기 균주는 천연의 대장균 경로를 통해 메티오닌을 생산할 수 있다.

상기 균주들을 metYX를 포함한 플라스미드 및 클로닝 벡터로 각각 형질전환하였다. 그런다음, 형질전환체를 글루코스(2 g/L), 이소류신(0.15 g/L), 트레오닌(0.3 g/L), 카나마이신(50 mg/L), 및 IPTG를 포함한 M9 최소배지 플레이트에 도말하였다. 상기 렙토스피라 메에리 유래의 metYX 유전자 클러스터는 24시간 이내에 W3110 △metA 의 성장을 보완하였다. 상기 metX 만 발현하는 W3110 △metA 균주는 M9 최소 플레이트에서 자랄 수 없었다. 따라서, 대장균 W3110는 O-아세틸-L-호모세린을 메티오닌 생합성의 전구체로서 사용하는데 효율적인 효소를 결여하고 있다. WO2006113897에 개시된 바와 같이, 대조구 비어있는 벡터인 pPRO-Nde-del로 형질전환된 W3110 △metA 균주는 48시간 이내에 성장하지 못하였다. TF4076BJF균주는 L. 메에리 유래의 metYX를 포함하는 플라스미드 또는 클로닝 벡터로 형질전환될때, 최소배지 플레이트에서 성장하였다.

또한, 최소배지에서의 성장 보완(growth complementation)에 대하여metYX 대체 유전자를 테스트하였다. D. 라디오듀란스, C. 아우란티아쿠스, B. 리넨스, N. 푼크티포르메 유래의 metYX 유전자를 클로닝하는데 있어서, 다운스트림 유전자인 metX에 인접한 효율적인 대장균 리보솜 결합 부위(rbs)가 없기때문에, metX 유전자의 번역은 상기 벡터내에 위치한 rbs에 의해 개시된 metY유전자의 번역과 연결되었다.

L. 메에리, D. 라디오듀란스, 및 C. 아우란티아쿠스 유래의 metYX유전자 클러스터는 메티오닌 영양요구주 균주의 성장을 보완하는데 가장 효과적이었다. 상기 성장의 보완은 L. 메에리 유래 metYX 유전자 클러스터에서 metY (L.메에리)가 metY (P. 아에루기노사)로 대체된 경우의 메티오닌 영양요구주에서도 관찰되었다. 이들 세포는 L. 메에리 유래 metYX 를 발현시키는 동일한 메티오닌 영양요구주에 비해 상대적으로 줄어든 성장률을 보였다.

메티오닌 생산은 실시예 3에 기술된 진탕 플라스크 프로토콜을 이용하여 결정되었다. 간단하게, 클러스터는 150 mg/L 의 메티오닌으로 보충된(초기 성장을 증진시키기 위해) 배지에 30℃에서 50시간 동안 성장시켰고, 메티오닌은 HPLC에 의해 측정되었다. 표 2는 메티오닌 생산은 오직 황전이반응이나 직접 황수화반응만이 가능한 균주와 비교할 때 두 경로를 모두 수행한 균주에서 더 높게 나타났음을 보여준다.

metA 및 metB 유전자는 대장균 균주에서 메티오닌의 합성을 위해 필요하다. 둘 중 어느 하나의 유전자가 불활성되면, 대장균은 처음부터(de novo) 메티오닌 생산능을 상실한다. 상기 데이터는 metYX 오페론의 추가에 의해, 메티오닌 원영양체(prototroph)를 가지는 균주와 유사한 수준까지 메티오닌 생산을 회복하는 것을 보여준다. 세포에서 두 경로 모두 가능할 때 메티오닌 생산은 두 배 이상인 경우도 있다. 이러한 결과는 상기 경로들이 서로 배타적인 것이 아니며, 호모세린은 양 경로를 통해 메티오닌으로 전환될 수 있음을 보여준다.

양 경로의 잇점을 더 보여주기 위하여, 상기 균주는 실시예 3에 기술된 발효 프로토콜을 이용하여 5 리터 발효 용기에서 비교되었다. 메티오닌 축적은 약 24시간 후에 시작되었고, 피드(feed)가 중단될 때까지 계속되었다. 대부분의 유기체 유래의 metY 유전자에 의해 코딩된 효소는 메티오닌의 높은 농도에 의해 피드백 저해된다. 어느 경우에는, metX유전자에 의해 코딩된 효소도 피드백 저해된다. 그 결과, 이들 발효에서는 호모세린 및 OAHS이 상당히 축적되었음이 관찰되었다. 발효기에서 메티오닌 생산의 비교는 도 2에 도시하였고, 데이터는 표 3에 요약되었다. 이러한 결과는 플라스크에서의 관찰내용을 확인해준 것이고, 메티오닌의 생산은 이종기원의 직접 황수화반응 경로의 적절한 발현을 통해 현저히 향상시킬 수 있음을 확인해주었으며, 효소만 적절하게 발현된다면 상기 경로가 메티오닌 생산의 주류를 담당할 수 있음을 확인해주었다.

메티오닌까지의 생성물들의 공급량을 늘리기 위해, 피드백 저해 저항성이 있는 metY및 metX가 이용될 수 있다. 또한, 호모세린으로부터 메티오닌까지 더 빨리 유도하기 위해 metX의 발현 정도와 metH의 발현정도를 조절하는 것이 가능하다.

메티오닌 생산에서의 상기 차이점은 metXY 경로가 대장균에서 매우 효율적임을 가리키고, 조절해제된(deregulated) 균주에 추가된 metXY 경로는 메티오닌 축적을 2배 이상으로 증가시킬 수 있음을 가리킨다.

실시예 2. O-아세틸 L-호모세린(OAHS) 또는 O-숙시닐 L-호모세린 (OSHS)을 이용하는 호모시스테인 신타아제

본 실시예는 슈도모나스 아에루기노사(ATCC 47085) 유래 metY에 의해 코딩된 호모시스테인 신타아제를 분리하기 위해 이용된 방법에 대해 기술한다. 상기 효소는 L-메티오닌 및 S-아데노실 L-메티오닌에 의해 저해된다. 상기 효소 활성은 Yamagata, Methods in Enzymology, 143:478, 1987에 따라 분석되었다. 상기 방법은 다수의 샘플 포인트가 취해지고, 구아니딘이 반응을 저지하기 위해 사용된 점 및 호모시스테인의 형성이 실시예 3.B.에 기술된 metA에 대한 분석에서와 같이, DTNB ((5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Sigma D8130)를 사용하여 탐지된 점에서 약간의 수정이 가해졌다. 하나의 효소 단위(U)는 상온에서 1 분당 호모시스테인 1 mmole의 형성으로 정의되었다.

P. 아에루기노사 유래의 MetY가 발현되었고, 정제 단백질(N-태그됨) 17.5 mg을 이용하여 분석되었다. L. 메에리 유래 metY및 대부분의 다른 공지된 호모시스테인 신타아제와는 대조적으로, 상기 효소는 아세틸- 및 숙시닐-호모세린 둘 다에 대해 활성을 가졌다. 상기 활성은 두 기질에 대해 유사했고, 메티오닌 및 SAMe에 의해 피드백 저해되었으나, 피드백 저해의 정도는 OSHS를 기질로 하였을 때 약간 더 낮은 것 같다. 1 mM 메티오닌에서 약간의 저해가 관찰되었다. OAHS를 기질로 한 경우, 10, 50 및 100 mM에서, 상기 효소는 메티오닌 부재시 활성의 약 50%, 19% 및 9%를 보유하였다. 5 및10 mM SAMe이 존재할 경우 활성은 원래의 활성의 약72% 및 21%였다. OSHS를 기질로 한 경우에는, 활성은 메티오닌 50 and 100 mM 존재시에는 53% 및 31%까지 떨어지고, 5 and 10 mM SAMe 존재시에는 86% 및 19%까지 떨어졌다.

실시예 3. 메티오닌 생산을 증가시키기 위해 숙주 균주를 유전적으로 조작하는 방법

상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 숙주 유기체에 메티오닌 생합성 경로를 추가하는것에 더해, 상기 숙주 유기체는 메티오닌 생합성 경로 저해를 줄이고, 반응물의 이용가능성을 높이고, 및/또는 생성물의 분해를 줄이기 위해 유전적으로 더 조작될 수 있다.

A. 메티오닌 생산 증가를 위한 5,10-메틸렌-테트라하이드로폴레이트 리덕타제의 발현 증가 및 메티오닌 구형 억제인자(global repressor) 및 트레오닌 키나아제의 불활성

메티오닌 생산 균주를 만드는 하나의 방법은 트레오닌과 같은 아미노산을 생산하도록 이미 조작된 균주를 변형시키는 것이다. 예를 들면, 비록 메티오닌 영양요구주이지만, 대한민국 공개공보 제92-8365호에 개시된 트레오닌 생산 균주 TF 4076(KFCC 10718)를 이용할 수 있다. 추가적인 예시 균주로는 트레오닌 과다생산자로 개시된, ATCC (13070, 13071, 21148, 21149, 21150, 21151, 21272, 21277, 21278, 21318, 21319, 21320)에 기탁된 균주들을 포함한다.

출발 포인트로서 TF 4076 균주를 이용하여, 트레오닌 생산을 피하기 위해 thrB 유전자를 결실시키고, 메티오닌 생합성 경로 발현 억제를 풀어주기 위해 metJ유전자를 결실시켜서 메티오닌 생산을 향상시켰다. 상기 균주는 또한 metF 유전자를 과발현하도록 변형시켰다.

thrB 결실

thrB는 록스피-클로르암페니콜(loxP-Cm) 카세트(Gene 2000 vol. 247, p255 264)를 이용하여 결실되었다. 상기 thrB 유전자는 주형으로 대장균 K12 유래의 염색체를 이용하고, 프라이머 서열 1 및 2(서열번호 5 및 6)를 이용하여 PCR에 의해 클론되었다. HL PCR 프리믹스(Bioneer Co, Korea)로 94℃에서 30초; 그리고 나서, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 3분으로 25싸이클; 그리고 72℃에서 7분의 PCR 조건을 사용하였다. PCR 산물은 겔 분리될 수 있고, pCR2.1-topo 클로닝 키트(Invitrogen, USA)로 클론되어 pCR-thrB로 명명하였다. pCR-thrB는 pflMI를 이용하여 digested되고, loxP-Cm 카세트가 삽입되었다. 상기 플라스미드로부터 loxP-Cm 카세트를 포함한 thrB 유전자가 프라이머 1 및 2 (서열번호 11 및 12)를 이용하여 PCR 증폭되었다. 상기 PCR 산물은 겔 정제되었다. PCR 단편은 TF4076 균주내로 전기천공되었고, 클로르암페니콜 마커는 동정된 콜로니로부터 제거되었고 획득된 최종 균주는 TF4076B로 명명되었다. 상기 균주는 트레오닌이 없는 M9 최소배지(DIFCO)에서 자라지 못했는데, 이는 상기 균주가 트레오닌 영양요구주임을 나타낸다.

1. thrB SEQ ID NO: 11

5'- GCT AGC c atg gtt aaa gtt tat gcc ccg - 3'

2. thrB SEQ ID NO: 12

5'- GAG CTC tta gtt ttc cag tac tcg tgc gc - 3'

metJ 결실

메티오닌 구형 억제인자 metJ유전자를 결실시키기 위하여, FRT 원스텝 결실방법이 사용되었다(Datsenko and Wanner PNAS 97:6640-6645, 2000). PCR 단편은 프라이머3, 4 (서열번호13 및14) 및 pKD3주형을 이용하여 증폭되었다(Datsenko and Wanner, PNAS 97:6640-6645, 2000 참조). 사용된 PCT 조건은 HL PCR 프리믹스(Bioneer Co, Korea)로 94℃에서 30초; 그리고 나서, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 25싸이클; 그리고 나서 72℃에서 7분이었다. 클로르암페니콜 저항성 콜로니가 선택되었고 metJ 유전자 결실은 PCR 프라이머 서열 5 및 6(서열번호 15 및 16)을 이용하여 확인되었다. pCP20 플라스미드 형질전환을 이용하여, 클로르암페니콜 마커 유전자는 제거되었고, 상기 제거는 PCR을 이용하여 확인되었다. 여기서 획득된 균주는 TF4076BJ로 명명되었다.

3. metJ + 클로르암페니콜 SEQ ID NO: 13

5'- atggctgaat ggagcggcga atatatcagc ccatacgctg agcacggcaa ggtgtaggct ggagctgctt c-3'

4. metJ + 클로르암페니콜 SEQ ID NO: 14

5'- gtattcccac gtctccgggt taatccccat ctcacgcatg atctccatat gaatatcctc cttag-3'

5. metJ SEQ ID NO: 15

5' - gggctttgtc ggtgaaatg-3'

6. metJ SEQ ID NO: 16

5' - actttgcgat gagcgagag-3'

metF 삽입( integration )

TF4076BJ의 메티오닌 영양요구주를 보완하기 위하여, metF 유전자가 TF4076BJ 균주내에서 발현되었다. metF 유전자는 프라이머 서열 7 및 8(서열번호 17 및 18) 및 주형으로서 대장균 K12 균주의 염색체를 이용하여 증폭되었다. HL PCR 프리믹스(Bioneer Co, Korea)로 94℃에서 30초; 그리고 나서, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 1분으로 25싸이클; 그리고 나서 72℃에서 7분의 PCR 조건을 사용하였다. PCR 단편은 겔 분리되었고, pSE380 벡터(Invitrogen Co.)의 NheI 및SacI 부위로 삽입되었다. 상기 플라스미드는 pSE380-metF라고 명명되었다. pSE380-metF는 TF4076BJ 균주 내로 형질전환되었다. 상기 형질전환체는 트레오닌 및 이소류신이 포함된 M9 최소배지(Difco)에서 자랐는데, 이는 메티오닌 영양요구주를 보완함을 나타내는 것이다.

두개의 다른 프로모터의 조절하에 metF 유전자의 발현 정도가 결정되었다. 상기 프로모터는 pCJ1 프로모터(PCT/KR2005/004338)와 pThreonine 프로모터였다. metF 유전자는 프라이머 서열 9 및 10(서열번호 19 및 20)와 주형으로서 대장균K12 균주의 염색체를 이용하여 증폭되었다. HL PCR 프리믹스(Bioneer Co, Korea)로 94℃에서 30초; 그리고 나서, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 1분으로 25싸이클; 그리고 나서 72℃에서 7분의 PCR 조건을 사용하였다. PCR 단편은 겔 분리되었고, pCJ1 프로모터 또는 pThreonine 프로모터를 포함하는 pCL1920 벡터(Lerner and Inouye, 핵산s Research 18:4631, 1990)내의 PvuII 및 HindIII 부위로 연결되었다. 상기 pCJ1 프로모터는 프라이머 서열 11 및 12(서열번호 21 및 22)를 이용하여 PCR 증록되었고, 상기 pThreonine 프로모터는 프라이머 서열 13 및 14(서열번호 23 및 24)를 이용하여 대장균 K12 염색체로부터 증폭되었다. 상기 PCR 단편은 겔 분리되었고 pCL1920 벡터내의 KpnI 및 EcoRV 부위내로 삽입되었다. PCR 조건은 상기에서 개시한 것과 동일하였다. pCJ1 프로모터의 조절하에 metF유전자를 포함하는 플라스미드는 pCL-pCJ1-metF로 명명되었고, pThreonine 프로모터의 조절하에 metF유전자를 포함하는 플라스미드는 pCL-pThr-metF로 명명되었다. 각각의 플라스미드는 TF4076BJ 균주로 형질전환되었고, 메티오닌 생산이 측정되었다.

상기 균주들을 테스트하기 위하여 진탕 플라스크 배양 프로토콜이 하기와 같이 이용되었다: 시드 배양(seed culture)이 (1L 내): 10 g 효모 추출물, 6g Na₂HPO₄·12H₂O, 0.5g NaCl, 3g KH₂PO₄, 2g 글루코스, 0.49 g MgSO₄·7H2O, 0.015g CaCl₂··2H₂O로 구성된 배지에 31℃ 에서 6 시간동안 인큐베이트되었다. 그런 다음, 플라스크를 하기 배지로 접종하기 위해 이용되었다: (1L 내): 17 g (NH₄)2SO₄, 1g MgSO₄·7H2O, 2g 효모 추출물, 0.3 g L-트레오닌,10 mg MnSO₄·7H₂O, 10 mg FeSO₄·7H₂O, 10 mg Zn SO₄, 30g CaCO₃, 40g 글루코스, 및 2g KH₂PO₄ pH 7.2. 상기 플라스크는 250 rpm 속도로 흔들면서 31℃에서 64 내지 72시간동안 인큐베이트되었다. 원심분리를 한 후, 배양 상청액은 분리되었고 메티오닌 분석을 위해 사용되었다.

pSE380-metF 플라스미드를 포함하는 세포의 배양을 위하여, 100 ㎕/L 엠피실린 및0.5 mM IPTG가 배지에 추가되었다. 하기 표 4에서 보듯이, pCJ1 프로모터의 조절하에 metF 유전자는 대부분의 메티오닌을 생산하였다.

metF 유전자를 보다 안정적으로 발현시키기 위하여, pTrc, pCJ1, 및 pThreonine 프로모터하에 metF 유전자는 TF4076BJ 염색체의 lacZ 로커스로 삽입되었다. 각각의 metF 유전자는 각각의 플라스미드로부터 PCR 증폭되었고 pBrint 벡터내의 NsiI 부위로 삽입되었다(Borgne et al., Gene 223:213-219, 1998). 상기 벡터들은 TF4076BJ 균주내로 형질전환되었고, 37℃에서 클로르암페니콜을 포함한 배지에서 자란 형질전환체가 선택되었고, metF유전자가 염색체내 lacZ 로커스로 삽입되었는지 확인되었다. 선택된 콜로니는 pJW168에 의해 형질전환되었고, 클로르암페니콜 마커는 제거되었다. 상기 pCJ1-metF 유전자를 가진 세포는 얻을 수 없었고, pThr-metF 카세트를 포함하는 형질전환체는 잘 자라지 않았다. 오직 LacZ 로커스에 pTrc-metF유전자를 포함한 세포만이 잘 자랐다. 상기 균주의 플라스크 배양은 0.5 mM IPTG가 들어있는 배지에서 ~600 mg/L 메티오닌 생산 결과를 보여주었다. pTrc-metF 유전자를 포함한 마지막 균주는 TF4076BJF로 명명되었고, 분석되었다.

요약하면, 상기 TF4076BJF균주는 트레오닌-생산 균주인 TF 4076로부터 유래하였고, 상기 TF 4076는 pTrc 프로모터의 조절하에 thrB 및 metJ는 결실되고, metF는 삽입되는 수식을 거쳤다. 표 5는 TF4076BJF에 의한 호모세린 및 메티오닌의 생산을 보여준다.

7. metF SEQ ID NO: 17

5'- GCT AGC c atgagcttttttcacgccag - 3'

8. metF SEQ ID NO: 18

5'- GAG CTC ttataaaccaggtcgaaccc - 3'

9. metF SEQ ID NO: 19

5'- CAGCTGatgagcttttttcacgccag- 3'

10. metF SEQ ID NO: 20

5'- AAGCTT ttataaaccaggtcgaaccc- 3'

11. CJ1 프로모터 서열번호: 21

5'- cgg ggt acc acc gcg ggc tta ttc cat tac at- 3'

12. CJ1 프로모터 서열번호: 22

5'- acg cga tat ctt aat ctc cta gat tgg gtt tc- 3'

13. threonine 프로모터 서열번호: 23

5'- cgg ggt acc tgg tta caa caa cgc ctg g- 3'

14. threonine 프로모터 서열번호: 24

5'- cat gat atc tac ctcg tta cc ttt ggt cg- 3'

TF4076BJF 균주는 하기 기술된 프로토콜에 따라 5 L 발효기에서 성장하였고, 96시간내에 약 2.2 g/L의 메티오닌을 생산하였다.

5 L 발효는 하기 프로토콜을 이용하여 수행되었다. 대장균 균주내에 클론되는 다른 유전자들의 영향을 비교하기 위하여, 5리터 용기용 기본 발효 프로토콜이 이용되었다. 상기 접종물(inoculum)은 1 L 당 10.0 g의 효모 추출물, 4.49 g Na₂HPO₄·7H₂0, 0.5 g NaCl, 3.0 g KH₂PO₄, 0.49 g MgSO₄·7H₂O, 0.015 g CaCl₂·2H₂O, 및 2 g/L 글루코스로 구성된 배지 25 mL에서 배양되었다. 50 mg/L의 적절한 항생물질은 테스트된 균주의 저항성에 따라 이용되었다. 31℃에서 8 - 24 시간 동안 250 rpm의 속도로 진탕배양한 후 상기 배양은 200 mL의 동일한 배지로 옮겨졌고 16-20 시간 동안 동일한 조건에서 배양되었다. 상기 배양은 2.5L의 배지로 발효기를 접종하기 위해 이용되었다.

발효배지는 17.0 g/L (NH₄)₂SO₄, 2.0 g/L 효모 추출물, 2.0 g/L KH₂PO₄, 1.0 g/L L-트레오닌, 0.3 g/L 이소류신, 0.01 g/L MnSO₄-H₂O, 0.01 g/L FeSO₄-7H₂O, 0.01 g/L ZnSO₄-7H₂O,1.0 g/L MgSO₄-7H₂O, 2 mg/L 피리독살, 2 mg/L 비타민B12 및 40 g/L 글루코스로 이루어졌다. 항생물질 및 IPTG는 균주의 성장정도에 따라 추가되었다. 발효 온도는 31℃로 유지되었고, 용존산소는 30% 이상의 포화로, pH는 초기에 28% NH₄OH로 조절되었다. 글루코스가 소비된 후 pH는 상승할 것이다. 그 시점에서, 연속적으로 픽스된 피드(fixed feed)를 시작하거나, 또는 pH 증가에 따라 한번에100 150 mL 알리쿼트(aliquot)의 피드가 첨가될 것이다. 상기 피드는 4.0 g/L 효모 추출물, 33 g/L (NH₄)₂SO₄, 3.0 g/L KH₂PO₄, 1.5 g/L L-트레오닌, 1.0 g/LMgSO₄-7H₂O, 2 mg/L 비타민 B12 및400 g/L 글루코스로 이루어졌다. 배지에 약간의 작은 변형 및 피드가 균주에 따라 도입되었다. 상기 발효는 72 내지 96시간동안 진행되었다. 광학적 밀도에 의한 세포 성장 및 글루코스 이용뿐만 아니라 메티오닌 농도도 실험내내 측정되었다.

B. 메티오닌 생산을 위한 피드백 저항성 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제의 생성

metA 및 metB 유전자가 제거된 대장균 균주가 제조되었다. 상기 균주는 MetA 활성 상실로 인한 호모세린 축적을 나타내었다. 상기 균주에 야생형 metA 카세트가 발현되었을 때, 메티오닌이 없는 가운데 OSHS가 MetA 활성에 의해 생산되었다. 그러나, 메티오닌이 배지에 추가되었을 때, 상기 야생형 metA 카세트를 가진 균주는 MetA 활성의 피드백 저해에 의해 다시 호모세린을 축적하였다. 따라서, 피드백 저항성 metA 유전자는 메티오닌 존재하에 O-숙시닐 호모세린 축적을 테스트함으로써 동정되었다. 배지에 많은 양의 메티오닌이 존재할 때 더 많은 OSHS를 생산하는 돌연변이체가 가장 많은 피드백 저해 저항성 metA를 포함한다.

스크리닝 방법론에 대한 개략적인 도면은 도 3에 제시된다.

metB 결실 돌연변이체의 제조

TF4076BJF에 metB 결실 돌연변이를 만들기 위해, FRT 원스텝 결실 방법이 이용되었다(Datsanko and Wanner, PNAS 97:6640-6645, 2000). PCR 단편은 프라이머 서열 15 및 16(서열번호 25 및 26)을 이용하여 증폭되었고, 주형 pKD3은 TF4073BJF 세포내로 전기천공되었다. HL PCR 프리믹스(Bioneer Co, Korea)로 94℃에서 30초; 그리고 나서, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 1분으로 25싸이클; 그리고 나서 72℃에서 7분의 PCR 조건이 사용되었다. 클로르암페니콜 저항성 콜로니들이 선택되었고 PCR을 이용하여 metB 유전자결실을 확인하였다. 클로르암페니콜 마커 유전자는 pCP20 플라스미드 형질전환을 이용하여 제거되었고, 상기 제거는 PCR에 의해 확인되었다. 이러한 과정에 의해 제조된 균주는 TF4076BJF-B라고 명명되었다.

15. metB + 클로르암페니콜 서열번호 25

5'- TTACTCTGGT GCCTGACATT TCACCGACA AAGCCCAGGG AACTTCATCA Cgtgtaggct ggagctgctt c - 3'

16. metB + 클로르암페니콜 서열번호 26

5'- TTACCCCTTG TTTGCAGCCC GGAAGCCATT TTCCAGGTCG GCAATTAAA Tcatatgaat atcctcctta g - 3'

metA 결실 돌연변이체의 제조

TF4076BJF-B에 metA 결실 돌연변이를 만들기 위해, FRT 원스텝 결실 방법이 이용되었다(PNAS .97:6640-6645, 2000). PCR 단편은 프라이머 서열 17 및 18(서열번호 27 및 28)을 이용하여 증폭되었고, 주형 pKD3은 TF4073BJF-B 세포내로 전기천공되었다. HL PCR 프리믹스(Bioneer Co, Korea)로 94℃에서 30초; 그리고 나서, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 1분으로 25싸이클; 그리고 나서 72℃에서 7분의 PCR 조건이 사용되었다. 클로르암페니콜 저항성 콜로니들이 선택되었고 PCR을 이용하여 metA 유전자결실을 확인하였다. 클로르암페니콜 마커 유전자는 pCP20 플라스미드 형질전환을 이용하여 제거되었고, 상기 제거는 PCR에 의해 확인되었다. 이러한 과정에 의해 제조된 균주는 TF4076BJF-BA라고 명명되었다.

17. metA + 클로르암페니콜 서열번호 27

5'- CAATTTCTTGCGTGAAGAAAACGTCTTTGTGATGACAACTT

CTCGTGCGTgtgtaggctggagctgcttcc - 3'

18. metA + 클로르암페니콜 서열번호 28

5' -AATCCAGCGTTGGATTCATGTGCCGTAGATCGTATGGCGT

GATCTGGTAGcatatgaatatcctccttag-3'

metA 발현 벡터의 제조

metA 라이브러리를 만들기 위해, metA 발현 벡터가 제조되었다. metA 유전자는 주형으로서 대장균 K12 균주 유래의 염색체 및 프라이머 서열 19 및 20(서열번호 29 및 30)을 이용하여 증폭되었다. HL PCR 프리믹스(Bioneer Co, Korea)로 94℃에서 30초; 그리고 나서, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 1분으로 25싸이클; 그리고 나서 72℃에서 7분의 PCR 조건이 사용되었다. PCT 단편은 겔 겔 분리되었고, SmaI 부위에서 pCL 1920으로 연결되었다, 상기 플라스미드는 pA-CL라고 명명되었다. 상기 pA-CL 플라스미드는 TF4076BJF-AB 균주내로 형질전환되었고, 플라스크 배양은 메티오닌이 존재한 상태 및 존재하지 않은 상태에서 수행되었다. OSHS 및 호모세린은 메티오닌에 대해 상기 기술된 방법과 동일한 방법에 의해 측정되었다. 표 6에서 보듯이, 메티오닌의 부재하에pA-CL 플라스미드를 포함하는 세포는 0.24 g/L 호모세린으로 3.8 g/L OSHS를 생산하였다. 그러나, 1g/L 메티오닌의 존재하에서 상기 세포는 4.9 g/L 호모세린으로 5.8 g/L OSHS를 생산하였다. 호모세린의 증가는 메티오닌에 의한 metA 활성의 피드백 저해에 의한 것인 반면, OSHS 양의 증가는 메티오닌 추가에 의한 생산의 증가때문이다.

19 : metA SEQ ID NO: 29

5' - aatggatccTGCCGTGAGCGGCGAATAC-3'

20 : metA SEQ ID NO: 30

5' - agctctagaCTGCTGAGGTACGTTTCGG-3'

pA - CL 돌연변이체 라이브러리의 제조

pA-CL돌연변이체 라이브러리를 제조하기 위해, 에러-프론(error-prone) PCR이 수행되었다. 에러-프론 PCR은 주형으로 pA-CL 플라스미드를 가지고 프라이머 서열 21 및 22(서열번호 31 및 32)를 이용하여 수행되었다. HL PCR 프리믹스(Bioneer Co, Korea)로 94℃에서 30초; 그리고 나서, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 68℃에서 2분으로 25싸이클; 그리고 나서 72℃에서 7분의 PCR 조건이 사용되었고, BD 다이버시파이 PCR 돌연변이유발 키트(BD, USA)가 사용되었다. PCT 단편은 BamHI 및 XbaI에 의해 절단되었고 pCL1920로 연결되었다. 상기 라이브러리는 TF4076BJF-AB 균주내로 형질전환되었고, ~30,000 형질전환체가 추후 분석을 위해 수집되었다.

21: pCL1920 SEQ ID NO: 31

5' -CGAAGTAATCGCAACATCCG-3

22: pCL1920 SEQ ID NO: 32

5' -GTCTGCTATGTGGTGCTATC-3

MetB 효소 조추출액의 준비

OSHS를 효소적 방법으로 측정하기 위해, 대장균 유래의MetB 효소를 이용하였다. 상기 MetB효소는 OSHS및 시스테인과 1:1 비율로 반응하여 시스타치오닌을 생산한다. DTNB (5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid, Sigma D8130) 시약은 시스테인의 유리 SH기와 반응하여, 415nm에서 측정될 수 있는 노란색을 만든다. MetB 반응 후에, 시스테인은 DTNB에 결합할 수 없는 시스타치오닌으로 변한다. 상기 반응 후 415nm에서 OD의 감소에 의해, 반응 믹스에 있는 OSHS의 양을 측정할 수 있다.

MetB 효소의 과발현을 위하여, 대장균 K12 염색체 유래의 PCT 증폭된 metB 유전자는 BamHI 및 HindIII에 의해 절단되고 pCDF-Duet 벡터(Novagene, USA)내로 클론되었다. PCR 반응은 대장균 K12 염색체를 주형으로, 프라이머 서열 23 및 24(서열번호 33 및 34)를 이용하여 수행되었다. HL PCR 프리믹스(Bioneer Co, Korea)로 94℃에서 30초; 그리고 나서, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 1분으로 25 싸이클; 그리고 나서 72℃에서 7분의 PCR 조건이 사용되었다. 상기 metB 유전자를 포함하는 플라스미드는 튜너 세포(Novagen, USA)를 이용하여 대장균 내로 형질전환되었으며, 상기 형질전환체를 50 ㎍/mL 스펙티노마이신을 포함하는 LB 배지에서 밤새 성장시켰다. 오버나이트 배양액은 50 ㎍/mL 스펙티노마이신을 포함하는 LB 배지에서 희석되었고, 37℃에서 600 nm에서 0.6의 OD에 도달할 때까지 배양하였고, 이 시점에서 IPTG가 최종농도 0.2mM가 되도록 첨가되었으며 상기 배양은 30℃에서 4시간동안 배양되었다. 상기 세포는 12,000 rpm에서 원심분리에 의해 수거되었고, 0.1 M 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에서 재현탁되었으며, 초음파 분해되었다(5 x 30 초). 세포 조추출액은 12,000 rpm에서 20분 동안 원심분리에 의해 획득되었고, 그런다음 상청액이 효소 분석법을 위해 이용되었다.

23: metB SEQ ID NO: 33

5' - gccaggatccgATGACGCGTAAACAGGCCAC-3'

24: metB SEQ ID NO: 34

5' - ccgcaagcttTTTACCCCTTGTTTGCAGCC-3'

피드백 저항성 metA 의 스크리닝

피드백 저항성 metA 돌연변이는 pA-CL 돌연변이체를 포함한 TF4076BJF-AB 균주를 ㎕미세발효 배지를 포함한 96웰 플레이트에 접종하고, 흔들면서 31℃에서 48시간 동안 배양함으로써 동정되었다. 미세발효 배지는 실시예 3에서 기술된 바와 같이 진탕 플라스크 배지 1 부피이고, 5g/L L-메티오닌을 포함한 pH6.5의 포타슘 포스페이트 버퍼 0.05M의 1 부피이다.

그런 다음, 96 웰 플레이트는 3,000 rpm에서 10분간 원심분리되었고 OSHS가 상기 기술된 효소적 방법(MetB 조추출액의 제조)에 의해 상청액에서 측정되었다. 50㎕의 배양 상청액은 50㎕의 반응 버퍼와 혼합되었다(반응 버퍼: 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.5) + 2.5 mM 시스테인 + 1/500 10 mM PLP (피리독살 5'- 포스페이트 하이드레이트, 시그마사 P9255) + 1/100 MetB 조추출액 (5 mg/mL)). 상기 반응은 37℃에서 10분간 진행되었다. 100㎕ DTNB (4 mg/10 mL 0.1 M 포타슘 포스페이트 버퍼, pH 7.5)가 첨가되었고 415 nm에서 OD가 측정되었다. 각 96 웰 플레이트로부터 415nm에서 가장 낮은 흡광도를 보이는 1 또는 2개의 콜로니를 선택하였고 50㎕/mL 스펙티노마이신을 포함하는 LB 배지 위에 도말하였다. 상기 결과 콜로니는 미세발효 배지를 포함하는 또다른 96 웰 플레이트 위에서 배양되었으며, 2차 스크리닝이 수행되었다. 그런 다음, 배지에 5 g/L 메티오닌을 추가하고 O-숙시닐호모세린 생산을 측정하여 상기에서 기술한 진탕 플라스크 배양 조건에서 선택된 균주를 테스트하였다.

12,000 콜로니로부터 24개의 돌연변이체가 플라스크 배양을 위해 선택되었고, 14 돌연변이체가 시퀀싱을 위해 선택되었다. 이들로부터, 5개의 새로운 돌연변이체가 동정되었다. 나머지 19개의 돌연변이체는 앞서 보고하였듯이 동일한 돌연변이를 가졌다. 14개의 돌연변이체에 대한 진탕 플라스크 배양에서 O-SHS 및 호모세린의 축적은 표 7에 도시되었고, 선택된 돌연변이체의 metA서열에서의 아미노산 변화는 도 8에 도시되었다.

돌연변이 met A의 피드백 저항성

플라스크 배양에서 모든 피드백 저해 저항성 metA들이 5 g/L 메티오닌의 존재하에 유사한 OSHS 양을 생산하였기 때문에, 고농도의 메티오닌이 플라스크 배양 배지에 추가되었고, OSHS의 생산이 결정되었다. 30 g/L L-메티오닌으로 64시간 배양 후에, OSHS의 생산은 #37 돌연변이 샘플에서만 감소하였으며, 나머지는 5 g/L 메티오닌의 존재하에 유사한 정도의 OSHS 생산을 보였다. 표 9에 도시된 이러한 결과는 피드백 저해 저항성 metA들이 30 g/L 메티오닌과 같은 높은 농도에 저항성을 보임을 가리킨다.

돌연변이 metA 단백질의 인비트로 특성화

PCR이 증폭을 위해 이용되었고, pCL-A#10, pCL-A#11, pCL-A#32, pCL-A#37, 그리고 pCL-A#41로 표기된 5개의 metA 돌연변이 유전자를 pET30벡터로 클론하였다. 돌연변이의 존재를 확인하기 위해, 모든 제조물은 DNA 서열 분석을 하였다. 상기 유전자들은 효소 정제를 위해 C-말단 His 태그를 가지도록 클론되었다. 상기 효소들은 과발현되고, 정제되었고, Lawrence, J. Bacteriol ., 109:8-11, 1972에 기술된대로, 활성이 다른 정도의 메티오닌 및 SAMe의 존재하에 측정되었다. 상기 분석법에 유일한 변형은 다수의 포인트가 취해지고, 구아니딘이 반응을 저지하기 위해 사용된 것이다. 표 10은 다양한 돌연변이체 유래 활성을 요약한 것이며, 야생형 효소와 비교할 때, 모든 돌연변이체가 피드백 저해 저항성임을 보여주며, 돌연변이체 #10 및 #11은 메티오닌 저해 및 SAM 저해 모두에 가장 저항성이 있음을 보여준다.

돌연변이체 metA#10 및 metA#11 (각각 서열번호 5 및 7)은 추후 분석을 위해 선택되었다. metA 돌연변이 #10 및 #11은 300 mM의 메티오닌을 이용하여 실험에서 저해 결여에 대해 분석되었다. 이는 분석 조건에서 취할 수 있는 가장 높은 농도에 근접하는 것이다. 메티오닌의 수용성은 30℃에서 5.6 g/100 mL이며, 이는 농도 375mM에 대응된다. 300mM 메티오닌의 존재시, 돌연변이체 metA#10은 특이적 활성의 70%를 보유하고, 돌연변이체 metA #11는 특이적 활성의 55%를 보유하였다. 따라서, metA#10 및 #11 돌연변이체가 메티오닌 생산 미생물로 이용될 수 있다.

피드백 저해 저항성 metA 로 메티오닌 생산하기

metA#10 및 metA#11은 메티오닌 생산 균주 TF4076BJF내로 클론되었다. MetA#10은 또한 L. 메에리 유래의 metYX와 함께 클론되었다. 상기 클론은 실시예 3A에 기술된 발효 프로토콜에 따라 테스트되었다. 메티오닌 농도는 발효 78시간 후에 평가되었고, 결과는 표 11에 도시하였다. 다른 발효에서는 O-숙시닐호모세린이 없었다. 메티오닌 생산의 시간 코스는 표 4에 도시하였다.

상기 결과는 피드백 저해 저항성 metA들의 발현이 메티오닌 생산을 증가시키고, 직접 황수화반응 경로 및 피드백 저해 저항성 metABC 경로의 조합은 천연형 MetA의 경우와 비교하여 더 약한 시너지 효과를 보임을 나타낸다. 약한 시너지 효과가 관찰된 것은 메티오닌의 축적은 MetY를 저해할 수 있음을 나타낸다. 메티오닌 생산을 더 증가시키기 위해 피드백 저해 저항성 MetY가 이용될 수 있다.

C. 대장균에서 MetK 활성 감쇠를 위한 전략

상기에서 기술하였듯이, SAMe의 형성은 메티오닌의 농도를 떨어뜨리고, metA의 피드백 저해를 통해 메티오닌 생합성 경로의 활성을 감소시킨다.

metK유전자의 돌연변이체들의 동정은 에치오닌-저항성 돌연변이가 metK의 감소를 보이며 메티오닌을 과다생산하는 것을 관찰하면 용이해진다. 표 12는 MetK활성에서 감소를 야기하는 것으로 기술되는 다양한 metK돌연변이를 정리한 것이다. 이들 돌연변이체는 하기 기술된대로 제조되었다.

대장균 유래 metK유전자(기탁번호 AP_003499 또는 BAE77005)는 pET28b 벡터에서 N-말단 또는 C-말단His 태크로 클론되었고 과발현되었다. 원하는 돌연변이를 얻기위해 위치지정돌연변이유발이 C-말단 His 태그된 metK 클론을 이용하여 수행되었다. 돌연변이MetK 단백질의 발현이 확인되었다.

MetK 돌연변이체는 정제되었고(C-말단His 태크를 이용하여) 인비트로에서 분석되었다. 야생형 C-말단His 태크된 MetK 단백질이 대조구로서 이용되었다. 상기 돌연변이체는 방사능 분석법을 이용하여 분석되었다. 상기 분석 조건은 하기와 같다.

분석 믹스:

1.0 mL 0.5 M HEPES/KOH, pH 8.0

0.5 mL 1.0 M KCl

0.2 mL 1.0 M MgCl₂

1.0 mL 100 mM ATP (디소듐 염, pH 8.0 with KOH)

0.1 mL 50 mM 메티오닌

0.1 mL NEN [메틸-¹⁴C]메티오닌

6.6 mL H₂O

25 mM EDTA pH 8.0 stop for assays.

45㎕의 분석 믹스가 5㎕의 효소 및 에펜도르프 튜브에 첨가되었고 정상화된 데이터는 표 13에 개시되었다. 반응은 원하는 시간동안(1 내지 10분) 상온(또는 25℃)에서 진행되었다. 상기 반응은 150㎕의 25 mM EDTA를 첨가하여 중단되었다. 100 ㎕의 반응물이 직경 2.5cm 왓트만 P-18 포스포셀룰로오스 필터 서클(연필로 라벨함) 위에 놓여졌다. 상기 필터는 3L증류수로 세척되었고, 에어드라이되어 아쿠아솔이 있는 신틸레이션 비얼에 놓여졌다. 분출은 ¹⁴C 에서 약 0까지 늘어나는 윈도우를 이용하여 계수되었다. 분석효율 및 방전소멸 정도가 순수 ¹⁴C-SAM의 아는 양의 카운트를 더하고, 전과정에 거쳐 프로세스됨에 의해 결정되었다. 배경은 전형적으로 < 100 cpm이다(반응당 총 카운트 ca. 10 ⁵ cpm)

MetK 반응의 산물인 SAMe는 MetK의 비-경쟁적 저해제이다. 따라서, 분석을 위해 반응 키네틱이 조절되었고 야생형과 돌연변이형의 활성간의 차이가 훨씬 높아질 것으로 예상된다. 다양한 MetK 효소 돌연변이체의 활성을 이해하면 적절한 생산 숙주를 디자인할 수 있다.

D. SAMe 수송자 조절

S-아데노실메티오닌(SAMe)은 모든 유기체에서 일차적 메틸기 공여체로서 작용하며, 폴리아민 생합성에 관여하고, 세포 성장에 필수적이다. 대장균은 성장 배지로부터 SAMe를 흡수할 수 없기 때문에 S-아데노실트랜스퍼라제(MetK, EC 2.5.1.6)는 대장균에서 오직 알려진 SAMe 생합성 루트만을 촉매한다. 상기 기술한바와 같이, metK의 다운 레귤레이션에 대한 대안은 그러한 루트를 통한 메티오닌의 이용을 줄이거나 피하기 위해, 대장균에 SAMe를 흡수할 수 있는 능력을 제공하고 동시에 metK 유전자를 녹아웃시키는 것이다. 그러면 세포 성장은 발효 배지에 SAMe을 추가함으로써 조절될 수 있다.

리켓시아 고친화성 SAMe 수송 시스템이 밝혀졌다(Tucker et al., J. Bact . 185: 3031-3035, 2003). 상기 SAMe 수송자(tranproter)는 2-8 mM의 K_T 값을 가지며 이 값은 S. 세레비지에(3.3 mM), P. 카르니(4.5 mM), 및 래트 간(8.9 mM) 유래의 수송자의 값과 비교된다. 게다가, 리켓시아 SAMe 수송 시스템은 대장균 metK 결실 돌연변이를 보완할 수 있다(Driskell et al., J. Bact . 187:5719-5722, 2005).

W3110 및TF4076BJF 균주는 상기 언급된 SAM 수송자를 포함하는 플라스미드로 형질전환되었다. W3110 유래 metK 유전자는 녹아웃되었고 PCR에 의해 증명되었다. 이들 수식에 따라, 새로운 균주는 SAM의 존재하에서만 성장할 수 있을 것이나, SAM이 없는 경우는 성장할 수 없을 것이다. 그러나, 외인성 SAM의 경우는 존재 및 부존재 두 경우 모두에서 성장을 계속할 수 있다.

E. 발효배지에서 메티오닌을 증가시키기 위한 메티오닌 흡수 수송자의 녹아웃

두개의 L-메티오닌 수송자가 대장균에서 밝혀졌는데, 하나는 매우 높은 친화력(Km = 0.1- 0.13㎛) 을 가진 것이고, 두번째는 낮은 친화력(Km = 20-40㎛)을 가진 것이다. metD 돌연변이가 D-메티오닌을 수송할 수 없기 때문에 그것을 메티오닌 소스로서 이용하기 위하여 지정된 높은 친화력 수송자 시스템을 위한 로커스는 metD이다. 상기 metD 로커스는 L-메티오닌 및 D-메티오닌 흡수에 필요한 ABC 수송자를 코딩하는 abc ( metN ), yaeE ( metI) 및yaeC ( metQ ) 유전자에 대응한다. metN은 추정적 ATP효소를 코딩하고 metI는 metD ABC 수송자의 막-회전 부위를 코딩한다. 세번째 구성요소인 metQ는 기질결합 도메인을 코딩하는 것으로 예상된다. metI , metN 및 metQ 결실 돌연변이는 L-메티오닌의 존재하에 여전히 성장할 수 있기 때문에, 낮은 친화력metP시스템의 존재에 대한 간접적인 증거로 여겨진다.

도 5에 도시되어 있듯이, 유전적으로 특성화되지 않은 수송자 metP가 L-메티오닌만 받아들이는 반면에, metD는 D- 및 L- 메티오닌을 받아들인다. MetD는 세가지 구성요소를 가진 전형적인 ABC 수송자로서 여겨진다: A, E, 및 C는 각각 abc (ATP효소), yaeE (퍼미아제), 및 yaeC (D-메티오닌 결합 단백질) (Merlin et al., J. Bacteriol . 184: 5513-5517, 2002).

구형의 메티오닌 억제인자 단백질인 metJ는 metD 로커스를 코딩하는 오페론의 발현을 음성적으로 조절하는 것으로 나타났다. metD 유전자의 전사는 metJ 공동억제인자인 메티오닌 부족상태에 따라 증가한다. metJ 결실을 가진 세포에서, 수송자는 더 높게 발현되고 메티오닌에 의해 억제되지 않는다 (Merlin et al., J. Bacteriol. 184: 5513-5517, 2002). 메티오닌 생산균주는 생산을 증대시키기 위해 일반적으로 감쇠된 metJ 서열 또는 metJ 결실을 가지는데, 이것은 메티오닌 유입 활성을 줄이기 위해 특히 중요할 수 있다. 상기 균주는 metD 메티오닌 흡수 시스템을 녹아웃하여 수식될 수 있다. 이것은 메티오닌 흡수를 막을 것이고 흡수/분비의 잠재적으로 에너지를 소비하는 무익한 사이클을 피할 수 있다.

metD를 녹아웃하면 상기 실시예 3에서 기술된 진탕 플라스크 프로토콜에 의해 측정시, 발효액에서 메티오닌 축적이25% 상승한다.

F. metH의 과발현

본 발명에서 기술한 균주의 수식에 의해 메티오닌 경로로의 탄소유입이 증가하면 세포 내부의 호모시스테인의 축적을 가져올 수 있다. 호모시스테인은 세포에 강한 독성으로 작용한다. 호모시스테인의 축적을 방지하고 이를 메티오닌으로 전환시키기 위해, 매우 활성된 호모시스테인 메틸라제 활성(EC 2.1.1.13 및 2.1.1.14)이 중요한데, 이들은 각각 metE 및 metH에 의해 코딩된다. 이것을 달성하기 위한 하나의 방법은 플라스미드 시스템에서 이들 유전자를 과발현시키거나 염색체를 강한 프로모터의 조절하에 두는 것이다.

대장균 유래의 상기 천연형 metH 유전자는 metABC 및 metXY의 이중 경로를 포함하는 균주에서 몇 개의 다른 프로모터 하에 과다발현되었고, 메티오닌 생산은 진탕 플라스크 프로토콜에 의해 측정되었다. metH과다발현에 이용되는 세개의 벡터는 상업적으로 입수가능한 플라스미드 pCL1920를 수식하여 제조할 수 있으며, 이를 위해 Plac 프로모터를 각각 대장균 cysK 유전자, 상용 벡터 pPROLar 유래의 프로모터, 그리고 CJ 제일제당 소유의 프로모터인 CJ1로 대체하여 제조하였고, 이는 pCL-P(cysK), pCL-P(pro), 및 pCL-P(CJ-1)이다. 대장균 metH 유전자의 ORF는 프로모터의 하부(downstream)에 위치하였다. 획득된 결과는 하기 표 13에 도시되었다. 진탕 플라스크 프로토콜에서 비록 축적된 메티오닌이 낮은 수준일지라도, 높은 농도의 호모시스테인 메틸라제가 존재하면 메티오닌 생산에 매우 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 상기 영향은 발효기에서 훨씬 더 분명할 것이다.

G. 메티오닌 생산 미생물에서 설페이트 흡수 향상 및 APS 풀 증가

본 실시예는 대장균의 내인성 황 동화작용 경로에서 중간대사산물인 PAPS를 건너뛰도록 대장균을 조작하는 방법에 대해 기술한다. 상기 새로 생긴 경로는 설파이드로 줄어든 각 설페이트 분자 당 한 개의 ATP 분자를 덜 요구하므로, 보다 에너지 효율적이다(도 6 참조).

상기에서 기술되었듯이, 도 6은 황 동화작용 대체경로를 이용할 수 있는 두개의 방법을 보여준다. 하나의 방법은 바실러스 유래 또는 P. 아에루기노사 유래의 아데닐일 설페이트 리덕타제 cysH (EC 1.8.4.9) 유전자를 클론하여, 그것을 대장균 게놈으로 삽입하거나 플라스미드로부터 발현시키는 것이다. 이 방법은 하나의 단일 단계에서 APS를 설파이트로 전환시키므로, 대장균 APS 키나아제(cysC)에 의해 촉매되는 APS나 PAPS로의 전환을 피할 수 있다. 두번째 방법은 박테리아cysH 동종체에 기반하여, 대장균 PAPS 리덕타제 유전자를 돌연변이시켜서 그의 기질 특이성이 PAPS로부터 APS로 바뀌도록 하는 것이다.

바실러스 서브틸리스 168 유래의 cysH 유전자(기탁번호 AJ000974 REGION: 548..1249) 및 슈도모나스 아에루기노사 PA01유래의 cysH 유전자 (기탁번호NC_002516 REGION: 1895692..1896495)가 플라스미드내로 클론되고, 대장균 cysC 또는 cysH녹아웃 돌연변이를 보완할 수 있는지 보기 위해 테스트되었다. 상기 균주는 시스테인 및 메티오닌 둘다의 영양요구주이다.

보완을 테스트하기 위해 간단하게, 바실러스 서브틸리스 168 및 슈도모나스 아에루기노사 PA01유래의 cysH 유전자는 BL21(DE3)의 cysH 녹아웃인 BL21(DE3)DcysH내로 형질전환되었다. 하기 4개 균주 유래의 단일 콜로니들이 노바겐사의 오버나이트 익스프레스 배지(OnEX: defined medium supplemented with amino acids but not cysteine or methionine)를 포함하는 5mL 배지액을 접종시키기 위해 이용되었다.

배지액은 연속 진탕으로 30℃에서 48시간 동안 접종되었다. 표 14에 나타나듯이, 그 결과는 바실러스 서브틸리스 및 슈도모나스 아에루기노사 유래의 두 cysH 유전자 모두 대장균에서 cysH 녹아웃을 보완할 수 있으며, 성장을 유지할 수 있다는 것을 나타낸다.

유사하게, 녹아웃된 cysC 유전자를 가지는 균주는 바실러스 서브틸리스 및 슈도모나스 아에루기노사 유래의 cysH 유전자에 의한 보완을 테스트하기 위해 이용되었다. BL21(DE3) DcysC균주는 각각 pET23a, pET23a+cysH (B. 서브틸리스), 및 pET23a+cysH (P. 아에루기노사) 플라스미드로 형질전환되었다. BL21(DE3)를 함께 가진 상기 세 개의 균주의 단일 클로니들은 L-시스테인 및 L-메티오닌을 제외한 아미노산을 포함한 5 mL의 OnEx 배지에서 접종되었다. 세포들은 48시간 동안 진탕으로 37℃에서 배양되었고, 그 성장은 OD_600nm에 의해 측정되었다. 표 15에서 보듯이, 그 결과는 바실러스 서브틸리스 및 슈도모나스 아에루기노사 유래의 cysH - coated APS 리덕타제는 대장균에서 BL21(DE3)에 있는 cysC 돌연변이를 보완할 수 있음을 나타내며, 이는 PAPS의 형성을 건너뛰는 것이 가능함을 시사하는 것이다.

황 동화작용 경로에서 효소의 과발현

상기에서 기술하였듯이, 메티오닌 생산을 증가시키기 위해서는 매우 효율적인 황 동화작용 경로를 가지는 것이 도움이 될 수 있다. 아실호모세린 전구체의 직접 황수화반응을 촉진시키기 위해, SH₂의 이용가능성이 필수적이다. 상기 황 동화작용 경로의 주요 유전자 모두는 메티오닌 생산 균주TF4076BJF내에 클론되어 과발현되었다. 상기 과발현된 유전자는 다음과 같다:

cys PUWA: 설페이트 퍼미아제

cysDN: ATP 설프우릴라제(EC 2.7.7.4)

CysCCysH: APS 키나아제 및 PAPS 설포트랜스퍼라제(EC 2.7.1.25 및 EC 1.8.4.8)

CysIJCysG: NADPH-설파이트 리덕타제 (EC 1.8.1.2)

CysB: 전사 활성인자

상기 유전자들은 metABC 및 metXY의 양 경로를 가지는 균주내에서 과발현되었고, 메티오닌 생산은 표준 진탕 플라스크 프로토콜에 의해 측정되었다. 상기에서 언급한 설페이트 동화작용 유전자 5개 그룹은 플라스미드 pCL1920의 Plac 프로모터를 대장균 rmf 유전자의 프로모터로 대체하여 제조된 벡터 pCL-(Prmf)내로 각각 클론되었다. 그 결과는 하기 표 16에 나타내었다.

전사 조절뿐만 아니라 수송 효소의 과발현은 메티오닌의 저조한 생산으로 나타났고, 세포 매스의 유닛당 메티오닌 양의 급감을 초래하였다. 설프우릴라제, APS 키나아제 및 설포트랜스퍼라제의 활성 증가는 모두 생산된 총 메티오닌 뿐만 아니라 세포 유닛당 증가된 메티오닌 생산을 보였다. 두개의 다른 플라스미드를 활용한 균주에서 관찰된 이러한 증가로 미루어볼 때, 효소의 발현이 조절되고 최적화된다면 상기 결과는 훨씬 더 증가할 것으로 예상된다.

실시예 4. 예시적인 메티오닌 생산 균주

상기에서 기술하였듯이, 본 발명에 기술된 다양한 유전적 수식이 염색체와 무관하게 재조합 DNA 서열의 삽입(incorporation)을 통해 이루어지거나, 재조합 DNA 서열을 생산균주 염색체내로 삽입할 수 있다. 상기 재조합 DNA 서열은 하나의 카피 또는 다수 카피로서 숙주 세포내로 삽입될 수 있다.

i) 대장균 ATCC # 13070 또는TF4076와 같은 미생물은 thrB 및 metJ 의 기능적 결실을 포함하여 상기 유전자가 감쇠하도록 조작될 수 있다. 상기 미생물은 천연 metH 유전자의 과발현을 야기하는 재조합 핵산 서열뿐만 아니라, metX 및 metY 유전자를 발현한다. , metX 및 metY의 발현은 대장균에 추가적인 경로를 도입하며, 천연 metH 유전자의 과발현은 호모시스테인의 메티오닌으로 증가된 유입을 가져온다.

ii) 다른 생산 균주는 상기 i)에 기술된 미생물에 하기 수식을 거쳐 제조된다. 상기 i)에 기술된 미생물은 슈도모나스 아에루기노사 유래 유전자와 같은 활성 metZ 유전자를 코딩하는 재조합 DNA 분자로 형질전환됨으로써 추가로 수식된다.

iii) 또다른 생산균주는 상기 i)에 기술된 미생물에 하기 수식을 거쳐 제조된다. 상기 i)에 기술된 미생물은 천연 metA 유전자를 실시예 3에 기술된 것과 같은 피드백 저해 저항성 metA 유전자로 대체하도록 추가로 수식할 수 있다.

iv) 또다른 생산균주는 상기 iii)에 기술된 미생물에 하기 수식을 거쳐 제조된다. 상기 iii)에 기술된 미생물은 활성 metZ 유전자로 형질전환될 수 있다.

v) 또다른 생산균주는 상기 i)에 기술된 미생물에 하기 수식을 거쳐 제조된다. 상기 i)에 기술된 미생물은 천연 metF 유전자의 산물을 과발현하여 전사 억제인자 유전자 lacI를 감쇠하도록 추가적으로 수식될 수 있다.

vi) 추가적인 생산균주는 본 발명에 기술된 어느 생산 균주에라도 하기의 수식을 하여 제조될 수 있다. 생산 균주는 황 동화작용을 향상시키기 위해 cysDN , cysIJ, 또는 cysCH 유전자 또는 그의 조합을 과발현시키도록 조작된다. 선택적으로, 이들 생산 균주는 대장균 유래의 천연 cysC 및 cysH를 P. 이에루기노사나 B. 서브틸리스 유래의 단일 cysH 유전자로 대체되도록 추가적으로 수식될 수 있다.

vii) 다른 생산 균주는 메티오닌 유입 유전자metD를 감쇠하도록 본 발명에 기술된 생산 균주를 수식함으로써 제조될 수 있다.

서열목록

서열목록에 기재된 핵산 및 아미노산 서열은 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 약자 및 아미노산에 대한 세글자 코드를 이용하여 표시하였다. 각 핵산서열은 한 가닥만 표시되었지만 상보적인 가닥은 개시된 가닥으로부터 이해될 수 있을 것이다.

서열번호 1-10은 대장균 유래의 다양한 metA 유전자 돌연변이의 핵산서열 및 이에 대응되는 아미노산 서열을 나타내고 있다.

서열번호 11-34는 실시예에서 사용한 다양한 프라이머 서열을 나타낸 것이다.

본 발명은 신규한 핵산서열 및 그와 대응하는 아미노산 서열(서열번호 1 및 2)을 개시한다. 이러한 핵산서열, 그의 단편 및 변이체는 재조합 미생물에서 펩타이드를 생산하는데 유용하다. 상기 펩타이드는 특히(inter alia) 메티오닌 및 SAMe를 생산하는데 유용하다. 상기 펩타이드, 그의 단편 및 변이체는 또한 항체와 같은 특이적 결합물질을 생산하는데 유용하므로 산업상 이용가능성이 있다.

<110> Cargill, Incorporated and CJ CHEILJEDANG Corporation <120> COMPOSITIONS AND METHODS OF PRODUCING METHIONINE <130> IKPA090384 <160> 34 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 930 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgccgattc gtgtgccgga cgagctaccc gccgtcaatt tcttgcgtga agaaaacgtc 60 tttgtgatga caacttctcg tgcgtctggt caggaaattc gtccgcttaa ggttctgatc 120 cttaacctga tgccgaagaa gattgaaact gaaaatcagt ttctgcgcct gctttcaaac 180 tcacctttgc aggtcgatat tcagctgttg cgcatcgatt cccgtgaatc gcgcaacacg 240 cccgcagagc atctgaacaa cttctactgt aactttgaag atattcagga tcagaacttt 300 gacggtttga ttgtaactgg tgcgccgctg ggcctggtgg agtttaatga tgtcgcttac 360 tggccgcaga tcaaacaggt gctggagtgg tcgaaagatc acgtcacctc gacgctgttt 420 gtctgctggg cggtacaggc cgcgctcaat atcctctacg gcattcctaa gcaaactcgc 480 accgaacaac tctctggcgt ttacgagcat catattctcc atcctcatgc gcttctgacg 540 cgtggctttg atgattcatt cctggcaccg cattcgcgct atgctgactt tccggctgcg 600 ttgattcgtg attacaccga tctggaaatt ctggcagaga cggaagaagg ggatgcatat 660 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Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu 195 200 205 Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser 210 215 220 Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala 225 230 235 240 Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp 245 250 255 Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr 260 265 270 Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp 275 280 285 Leu Asn Asn Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Leu 290 295 300 Asn Pro Thr Leu Asp 305 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> PCR primer <400> 11 gctagccatg gttaaagttt atgccccg 28 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> PCR primer <400> 12 gagctcttag ttttccagta ctcgtgcgc 29 <210> 13 <211> 71 <212> DNA <213> PCR primer <400> 13 atggctgaat ggagcggcga atatatcagc ccatacgctg agcacggcaa ggtgtaggct 60 ggagctgctt c 71 <210> 14 <211> 65 <212> DNA <213> PCR primer <400> 14 gtattcccac gtctccgggt taatccccat ctcacgcatg atctccatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> PCR primer <400> 15 gggctttgtc ggtgaaatg 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> PCR primer <400> 16 actttgcgat gagcgagag 19 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> PCR primer <400> 17 gctagccatg agcttttttc acgccag 27 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> PCR primer <400> 18 gagctcttat aaaccaggtc gaaccc 26 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> PCR primer <400> 19 cagctgatga gcttttttca cgccag 26 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> PCR primer <400> 20 aagcttttat aaaccaggtc gaaccc 26 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> PCR primer <400> 21 cggggtacca ccgcgggctt attccattac at 32 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> PCR primer <400> 22 acgcgatatc ttaatctcct agattgggtt tc 32 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> PCR primer <400> 23 cggggtacct ggttacaaca acgcctgg 28 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> PCR primer <400> 24 catgatatct acctcgttac ctttggtcg 29 <210> 25 <211> 70 <212> DNA <213> PCR primer <400> 25 ttactctggt gcctgacatt tcaccgacaa agcccaggga acttcatcac gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 26 <211> 69 <212> DNA <213> PCR primer <400> 26 ttaccccttg tttgcagccc ggaagccatt ttccaggtcg gcaattaaat catatgaata 60 tcctcctta 69 <210> 27 <211> 71 <212> DNA <213> PCR primer <400> 27 caatttcttg cgtgaagaaa acgtctttgt gatgacaact tctcgtgcgt gtgtaggctg 60 gagctgcttc c 71 <210> 28 <211> 70 <212> DNA <213> PCR primer <400> 28 aatccagcgt tggattcatg tgccgtagat cgtatggcgt gatctggtag catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> PCR primer <400> 29 aatggatcct gccgtgagcg gcgaatac 28 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> PCR primer <400> 30 agctctagac tgctgaggta cgtttcgg 28 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> PCR primer <400> 31 cgaagtaatc gcaacatccg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> PCR primer <400> 32 gtctgctatg tggtgctatc 20 <210> 33 <211> 31 <212> DNA <213> PCR primer <400> 33 gccaggatcc gatgacgcgt aaacaggcca c 31 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> PCR primer <400> 34 ccgcaagctt tttacccctt gtttgcagcc 30

Claims (43)

1. OSHS 또는 OAHS를 기질로 이용한 직접 황수화반응(direct sulfhydrylation) 활성을 가지는 하나 이상의 제1 펩타이드(EC 2.5.1.49 및 4.2.99.); 및

   황전이반응(transsulfuration) 활성을 가지는 하나 이상의 제2 펩타이드(EC 2.5.1.48, 및 4.4.1.8)를 포함하는 미생물로서, 상기 직접 황수화반응 활성은 외인성 핵산서열로부터 발현되는 것인 미생물.
2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(E. coli)인 미생물.
3. 제1항에 있어서, 검출가능한 양의 메티오닌을 추가로 포함하는 미생물.
4. 제1항에 있어서, 검출가능한 양의 SAMe를 추가로 포함하는 미생물.
5. 제3항에 있어서, 상기 생산된 메티오닌의 적어도 10%는 황전이반응 활성으로부터 얻은 것인 미생물.
6. 제4항에 있어서, 상기 생산된 SAMe의 적어도 10%는 황전이반응 활성으로부터 얻은 것인 미생물.
7. 제3항에 있어서, 상기 생산된 메티오닌의 적어도 10%는 직접 황수화반응 활성으로부터 얻은 것인 미생물.
8. 제4항에 있어서, 상기 생산된 SAMe의 적어도 10%는 직접 황수화반응 활성으로부터 얻은 것인 미생물.
9. 제1항에 있어서, 피드백 저항성이 있는 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 펩타이드를 추가로 포함하는 미생물.
10. 제1항에 있어서, 아미노산 위치 24, 29, 79, 114, 140, 163, 222, 275, 290, 291, 295, 297, 304, 305 또는 이들의 조합의 돌연변이를 갖는 유전자은행 기탁번 호 AAC76983의 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 펩타이드를 추가로 포함하는 미생물.
11. 제1항에 있어서, 서열번호 2, 4, 6, 8, 또는 10을 포함하여 이루어진 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 펩타이드를 추가로 포함하는 미생물.
12. 제1항에 있어서, 아데닐일 설페이트 리덕타제 (EC 1.8.99.2)를 코딩하는 외인성 핵산서열을 추가로 포함하는 미생물.
13. 제1항에 있어서, metD , metK , metJ , thrB , serA 또는 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자가 감쇠된 미생물.
14. 제1항에 있어서, metA, metB, metC, metE, metY , metZ , metX , metH , cysPWUA, cysD , cysN , cysC , cysH , cysI , cysJ , cysG , csyK , cysM , 및 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자가 과발현된 미생물.
15. 메티오닌의 생산이 가능한 조건하에서 제1항의 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 메티오닌을 분리하는 단계를 포함하는, 메티오닌의 생산방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 직접 황수화반응 활성을 가지는 제1 펩타이드는 metZ, metY 또는 이들의 조합에 의해 코딩된 것인 메티오닌의 생산방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(E. coli)인 메티오닌의 생산방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 메티오닌의 적어도 10%는 상기 제1 펩타이드로부터 생산된 것이고, 상기 제1 펩타이드는 metZ, metY 또는 이들의 조합에 의해 코딩된 것인 메티오닌의 생산방법.
19. 제15항에 있어서, 상기 메티오닌의 적어도 10%는 제2 펩타이드로부터 생산된 것이고, 상기 제2 펩타이드는 metB , metC 또는 이들의 조합에 의해 코딩된 것인 메티오닌의 생산방법.
20. 제15항에 있어서, 상기 내인성 황전이반응 활성은 metB , metC 또는 이들의 조합에 의해 코딩된 것인 메티오닌의 생산방법.
21. 제1항에 있어서, 상기 생산된 메티오닌의 적어도 10%는 상기 제1 펩타이드로부터 생산된 것이고, 상기 제1 펩타이드는 metZ 유전자에 의해 코딩된 것인 메티오닌의 생산방법.
22. 제1항에 있어서, 상기 제1 펩타이드는 기탁번호 CAA71733, ZP_00766367 또는 ZP_00107218과 적어도 70%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 MetX 펩타이드인 미생물.
23. 제1항에 있어서, 상기 제1 펩타이드는 기탁번호 CAA71733, ZP_00766367 또는 ZP_00107218과 적어도 90%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 MetX 펩타이드인 미생물.
24. 제15항에 있어서, 상기 제1 펩타이드는 기탁번호 AAG08410, CAA71732, ZP_00766366, 또는 ZP_00107219와 적어도 70%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 MetY 펩타이드인 메티오닌의 생산방법.
25. 제15항에 있어서, 상기 제1 펩타이드는 기탁번호 AAG08410, CAA71732, ZP_00766366, 또는 ZP_00107219와 적어도 90%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 MetY 펩타이드인 메티오닌의 생산방법.
26. 제15항에 있어서, 상기 제2 펩타이드는 기탁번호 AAG06495와 적어도 70%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 MetZ 펩타이드인 메티오닌의 생산방법.
27. 제15항에 있어서, 상기 제2 펩타이드는 기탁번호 AAG06495와 적어도 90%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 MetZ 펩타이드인 메티오닌의 생산방법.
28. 제15항에 있어서, 상기 미생물은 metD , metK , metJ , thrB , serA 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 감쇠된 유전자를 추가로 포함하는 것인 메티오닌의 생산방법.
29. 제15항에 있어서, 상기 미생물은 유전적으로 조작된 생산 미생물을 초래하는 추가적인 유전적으로 조작된 핵산 서열의 변화를 더 포함하고, 상기 유전적으로 조작된 생산 미생물은 그러한 변화가 없는 미생물에 비해 10%의 메티오닌을 더 생산하는 것인 메티오닌의 생산방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 생산 미생물은 생성물의 분해를 감소시키거나, 반응물의 이용가능성을 증가시키거나, 메티오닌 생합성 경로의 저지를 감소시키거나, 또는 이들의 조합을 위해 유전적 수식을 포함하는 것인 메티오닌의 생산방법.
31. 외인성 핵산서열로부터 발현된 시스타치오닌 감마 신타아제(EC 2.5.1.48) 또는 O-숙시닐호모세린 설프히드릴라아제(EC4.2.99.-) 및 호모시스테인 신타아제(EC 2.5.1.49)를 포함하는 분리된 대장균.
32. 제31항에 있어서, 내인성 핵산서열로부터 발현되는 시스타치오닌 감마 신타아제(EC 2.5.1.48) 및 외인성 핵산서열로부터 발현된 호모시스테인 신타아제(EC 2.5.1.49)를 포함하는 분리된 대장균.
33. 제32항에 있어서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제(EC 2.3.1.31)를 추가로 포함하는 분리된 대장균.
34. 제31항에 있어서, 상기 외인성 핵산서열은 기탁번호 AE004091, AE004091 REGION: 5655648..5656925, Y10744 REGION: 1485..2813, NZ_AAAH02000004 REGION: 164536..165990 및 NZ_AAAY02000081 REGION: complement(12750..14054)로부터 선택된 기탁번호와 적어도 70% 서열 상동성을 공유하는, 분리된 대장균.
35. 제31항에 있어서, 상기 외인성 핵산서열은 기탁번호 AE004091, AE004091 REGION: 5655648..5656925, Y10744 REGION: 1485..2813, NZ_AAAH02000004 REGION: 164536..165990 and NZ_AAAY02000081 REGION: complement(12750..14054)로부터 선택된 기탁번호와 적어도 90% 서열 상동성을 공유하는, 분리된 대장균.
36. 제31항에 있어서, 상기 외인성 핵산서열은 기탁번호 AE004091, AE004091 REGION: 5655648..5656925, Y10744 REGION: 1485..2813, NZ_AAAH02000004 REGION: 164536..165990 and NZ_AAAY02000081 REGION: complement(12750..14054)로부터 선택된 것인, 분리된 대장균.
37. 제31항에 있어서, 아데닐일 설페이트 리덕타제(EC 1.8.99.2)를 코딩하는 외인성 핵산서열을 추가로 포함하는 분리된 대장균.
38. 메티오닌을 생산하기에 충분한 조건 하에서 아데닐일 설페이드 리덕타제(EC 1.8.99.2)를 과발현하는 재조합 DNA 분자를 포함하는, 분리된 미생물을 미생물을 단계; 및 메티오닌을 분리하는 단계를 포함하는, 메티오닌 생산방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 메티오닌 생산방법.
40. 제38항에 있어서, 상기 미생물은 metX , metY , metB , metC , metZ , 및 이들의 조합을 코딩하는 유전자를 포함하는 메티오닌 생산방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 유전자는 내인성인 것을 특징으로 하는 메티오닌 생산방법.
42. 제40항에 있어서, 상기 유전자는 외인성인 것을 특징으로 하는 메티오닌 생산방법.
43. 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제 활성을 가지며, 서열번호 1, 3, 5, 7, 또는 9로부터 선택되는 핵산서열에 의해 코딩되는 펩타이드를 포함하는, 분리된 펩타이드.

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