KR20090133133A - Ｏｘ2 수용체 동족체 - Google Patents

Abstract

본원에는 OX2의 포유류, 예를 들면, 영장류 수용체를 암호화하는 핵산, 정제된 단백질 및 이의 단편이 제공된다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체가 또한 제공된다. 당해 조성물을 진단학적 및 치료학적 용도를 위해 사용하는 방법이 기재되어 있다.

OX2 수용체 동족체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 면역계

Description

ＯＸ2 수용체 동족체{OX2 RECEPTOR HOMOLOGS}

본 발명은 면역계 기능을 포함한 포유류 생리학에 영향을 미치기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 발생 및/또는 면역계를 조절할 수 있는 시약 또는 방법을 제공한다. 이들 물질의 진단 및 치료학적 용도가 또한 기재되어 있다.

OX2 항원(OX2)은 흉선 세포, B 림프구, 활성화 T 림프구, 신경 단위, 내피 세포 및 포상 수지상 세포를 포함한 각종 세포 상에서 동정된 세포 표면 단백질이다[참조: Barclay (1981) Immunology 44:727-736]. 서열 분석은, OX2가 2개의 세포외 면역글로불린-유사(Ig-유사) 도메인과 짧은 세포질 도메인을 함유하는 막관통(transmembrane) 단백질이라는 것을 나타낸다[참조: Clark, et al. (1985) EMBO J. 4:113-118]. 이러한 도메인 체제는 수 많은 상이한 백혈구 표면 단백질에서 통상적으로 발견된다[참조: Barclay, et al. (1997) Leucocyte Antigens Factsbook (2d.ed.) Academic Press, London]. 이들 유형의 단백질은 종종, Ig-유사 도메인을 함유하기도 하는 기타 세포 표면 상의 기타 단백질과 상호작용한다.

OX2 항원의 분포도는, OX2가 시그널을 결합 파트너, 예를 들면, OX2 수용체(OX2R)를 통하여, 이러한 수용체를 발현하는 대식세포를 포함한 백혈구 계통 내의 세포[참조: Preston, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1911-1918] 및 가능하게는 단핵구-대식세포 계통의 기타 세포에 중계한다는 가설과 일치한다. 또한, OX2는 대식세포의 각종 기능 조절에 관여하여 왔다. 이러한 계획안에서는, 예를 들면, OX2를 신경 단위 상에서 발현시킴으로써, OX2R을 발현할 수도 있는 마이크로글리아(microglia)로 불리우는 뇌에 내재한 대식세포에 대한 직접적인 전달 수단을 정착시킬 수 있는데, 이는 이들이 단핵구-대식세포 계통으로부터 유래되기 때문이다[참조: Perry and Gordon (1988) Trends Neurosci. 11:273-277].

일반적으로, 대식세포의 결함있는 활성화나 과장된 활성화는 광범위한 면역학적 질환과 기타 질환의 발병 원인이 된다[참조: McGee, et al. (eds. 1992) Oxford Textbook of Pathology Oxford University Press, Oxford; Lewis and McGee (eds. 1992) The Macrophage IRL Press, Oxford; and Bock and Goode (eds. 1997) The Molecular Basis of Cellular Defence Mechanisms Willey & Sons].

또한, OX2 상호작용성 단백질, 예를 들면, OX2 항원에 대한 OX2R을 동정하는 것은 어려운 일인데, 이는 이러한 상호작용물의 친화도가 종종 극히 낮기 때문이다. 이는 재조합 형태의 세포 표면 단백질, 예를 들면, OX2를 이의 결합 파트너, 즉 상호작용성 단백질, 예를 들면, OX2R에 결합시키는 것이, 정상적인 방법에 의해 검출할 수 있도록 하기엔 충분히 안정적이지 못하다라는 것을 의미한다. 따라서, CD48과 CD2 간의 상호작용(이들 양 파트너는 이들의 세포외 영역 외에 2개의 Ig-유 사 도메인을 함유한다)은 극히 짧은(순식간의) 반감기를 지닌다[참조: Van der Merwe, et al. (1993) Biochem. Soc. Trans. 21:340S; and Van der Merwe and Barclay (1994) Trends Biochem. Sci. 19:354-358].

재조합 형태의 세포 표면 단백질, 예를 들면, OX2는 수 많은 방법으로 다가성이 되도록 하여 신규한 단백질을 검출하는데 사용할 수 있다. OX2는 CD4로부터의 2개의 Ig-유사 도메인의 태그(tag)를 포함하도록 공학적으로 처리시켰다. 이러한 재조합 가용성 단백질은 통상적인 발현 방법에 의해 진핵 세포에서 발현된다. 초기 연구에서는, 형광성 비드와 마우스 대식세포 상의 다가 재조합 OX2 단백질 간에 상호작용이 관찰되었다[참조: Preston, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1911-1918].

상기 관찰에도 불구하고, 차단 항체 OX89를 사용함으로써 마우스 대식세포 상에서 OX2R을 동정하기 위한 시도는 성공하지 못하였다[참조: Preston, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1911-1918].

전술한 내용으로부터, OX2-유사 분자에 대한 신규한 수용체를 발견 및 동정하여 이를 파악하는 것이 상당히 유리할 수 있다는 것은 명백하다. 본 발명은 OX2 리간드에 대한 신규한 수용체 동족체 및 관련 화합물, 및 이들의 사용 방법을 제공한다.

본 발명은 예를 들면, 설치류 및 영장류 양태의, OX2로 명명된 리간드에 대한 신규한 수용체 동족체에 관한 것이다. 이들은 총체적으로 OX2 수용체 동족체(OX2RH)로 명명되었는데, 각종 설치류 및 영장류 종으로부터의 양태를 지닌다. 2가지가 각각의 종 OX2와 실제적으로 결합하는 것으로 확인되었다. 특히, 본 발명은 OX2RH1, OX2RH2, OX2RH3 및 OX2RH4로 명명된 동족체에 대한 설명을 제공한다. 이에는 폴리펩티드 자체를 암호화하는 핵산과 이들의 생성 및 사용 방법이 포함된다. 본 발명의 핵산은 부분적으로는, 본원에 제시된 클론된 상보 DNA(cDNA) 서열에 대한 이들의 상동률로써 성상 확인한다.

본 발명자들은 OX2와 OX2R 간의 상호작용을 차단시키는, 랫트 대식세포 상의 OX2R에 대한 신규한 모노클로날 항체(mAb)(OX102로 명명됨)를 생산하였다. 본 발명자들은 또한, 랫트 OX2R 유전자와 폴리펩티드를 분리하고 이를 성상 확인하였다. 랫트 OX2R 핵산 분자 및 폴리펩티드에 대한 서열(추정된 아미노산 서열)이 본원에 제공되어 있다. 유사한 단백질에서 유추하여 볼때, 본 발명자들은 사람 OX2R의 뉴 클레오티드 및 아미노산 서열이 상응하는 랫트 OX2R 서열과 50% 이상의 상동률을 나타낼 것이라고 교시하고 있다. 랫트 OX2R cDNA 및 추정된 OX2R 폴리펩티드 서열을 이용할 수 있음으로 인해, 공지된 사람 서열의 스크리닝을 통하거나 하이브리드화 또는 PCR 기술에 의한 사람 핵산의 분리를 통하여 등가의 사람 OX2R 서열을 동정할 수 있다.

큰 세포질 서열이 OX2R 폴리펩티드 내에 존재한다는 것은, OX2R이 시그널링에서 또는 세포질 성분과의 상호작용을 통하여, 대식세포 기능에 관여하고 있다는 것을 지시해준다. 따라서, 본 발명은 OX2R 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 모사하거나 인식하는 OX2R계 시약, 예를 들면, OX2R 결합 부위와 반응하도록 고안된 작은 분자 실체, OX2R에 대해 생성된 mAbs 또는 안티센스 서열을 제공해주는데, 이러한 시약은 세포 활성을 증진시키거나 억제시킴으로써, OX2 및/또는 OX2R 세포 표면 단백질을 수반하는 세포의 기능(예를 들면, 대식세포, 활성화 림프구, 신경 단위, 내피 세포, 수지상 세포, 흉선 세포 및 B 림프구와 같은 세포의 기능)을 변형시키는데 치료학적으로 유용한 화합물로 구성된다. 따라서, OX2R 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 모사하거나 인식하는 OX2R계 시약은 세균성 감염, 자가면역 질환 등에 대한 반응을 포함한 광범위한 대식세포 기능을 제어하는데 효과적으로 적용된다.

OX2R의 세포외 도메인이 OX2와의 상호작용의 원인이 되는 것으로 여겨지기 때문에, 본 발명자들은 OX2와 OX2R 간의 결합에 (긍정적으로 또는 부정적으로) 영향을 미치는 능력을 알아보기 위해 후보 화합물을 스크리닝하는 수단을 제공해준다. 따라서, 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 OX2R은, 예를 들면, OX2와 OX2R 간 의 상호작용을 억제하므로, 대식세포와 면역계의 기타 세포, 예를 들면, 림프구 또는 포상 수지상 세포 간의 상호작용에도 영향을 미치게 되는 화합물을 검출하는데 사용할 수 있다.

랫트 OX2R에 대한 핵산 및 아미노산 서열이 표 1에 제시되어 있다. 본 발명의 각종 국면이 다음에 언급되어 있다. 기타 국면은 상세한 설명으로부터 명백하다.

따라서, 제1 국면에서는, 본 발명은 표 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 물질을 제공한다.

추가의 국면에서는, 본 발명은 표 1에 제시된 아미노산 서열과 50% 이상의 아미노산 서열 동일률을 나타내는 폴리펩티드를 포함하는 물질을 제공한다.

추가의 국면에서는, 본 발명은 상기 폴리펩티드의 돌연변이체, 변이체, 유도체 또는 대립유전자이고; 완전한 길이의 OX2R의 특징적인 성질, 예를 들면, OX2와 결합하거나 또는 완전한 길이의 OX2R에 대한 항체와 결합하는 능력을 지니고 있는 폴리펩티드를 제공한다.

추가의 국면에서는, 본 발명은 완전한 길이의 OX2R 단백질의 특징적인 성질을 나타내는, 상기 폴리펩티드의 단편(예를 들면, 표 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편)인 물질을 제공한다. 예를 들면, 이러한 단편은 OX2 단백질과 결합하거나 또는 완전한 길이의 OX2R 단백질에 대한 항체와 결합할 수 있다. 한 양태에 있어서, 상기 단편은 OX2R의 세포질 도메인의 전부 또는 일부를 포함하거나 이러한 도메인의 활성 부분을 포함한다. 또 다른 양태에 있어서, 상기 단편 은 OX2R의 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 포함하거나 이러한 도메인의 활성 부분을 포함한다. 이러한 세포외 도메인은 OX2와의 상호작용의 원인이 되는 것으로 여겨지기 때문에, 상기 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 본 발명에 따르는 단편을 사용하여, OX2와 OX2R 간의 결합을 방해하는 능력에 대해 후보 화합물을 스크리닝할 수 있다.

따라서, 본 발명은 흉선 세포, B 림프구, 활성화 T 림프구, 신경 단위, 내피 세포 및 포상 수지상 세포를 포함한 기타 세포와 대식세포 간의 OX2/OX2R 상호작용을 방해하는 능력을 지니는 것으로 예상되는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법 및 이를 위한 물질을 제공한다.

상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드 및 단편은 재조합 및/또는 분리된 폴리펩티드일 수 있다.

추가의 국면에서는, 본 발명은 표 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 물질을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 폴리펩티드 또는 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 물질을 제공한다. 따라서, 표 1은 OX2R 폴리펩티드를 암호화하는 예시적 핵산 분자의 cDNA 서열을 제시한 것이다. 이러한 핵산 분자는 표 1의 핵산 서열과 50% 이상의 서열 상동률을 나타낼 수 있다.

본 발명은 또한, 표 1의 암호화 뉴클레오티드 서열의 일부를 갖는 핵산 분자를 포함하는 물질을 제공한다. 이러한 물질이 표 1의 암호화 뉴클레오티드 서열의 일부를 포함하는 경우, 이는 OX2R 유전자에 특징적인 일부일 것이다. 따라서, 이러한 일부는 OX2와 결합하거나 완전한 길이의 OX2R에 대한 항체와 결합하는, 상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드 단편을 암호화할 수 있다. 또 다른 한편, 상기 일부는 표 1의 뉴클레오티드 서열의 4 내지 7개 이상의 연속된 코돈(contiguous codon), 종종 7 내지 9개 이상의 연속된 코돈, 전형적으로 9 내지 13개 이상의 연속된 코돈, 가장 바람직하게는 20 내지 30개 이상의 연속된 코돈을 포함할 수 있다. 또 다른 한편, 상기 일부는 표 1의 폴리펩티드 서열의 4 내지 7개 이상의 연속된 아미노산, 종종 7 내지 9개 이상의 연속된 아미노산, 전형적으로 약 9 내지 13개 이상의 연속된 아미노산, 가장 바람직하게는 약 20 내지 30개 이상의 연속된 아미노산을 암호화할 수 있다.

상기 언급된 바와 같은 핵산 분자는 재조합되고/되거나 분리될 수 있다.

추가의 국면에서는, 본 발명은 본원에 제공된 바와 같은 OX2R 핵산을 포함하는 벡터, 예를 들면, OX2R 핵산 서열이 이의 발현을 지시해주는 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있는 발현 벡터를 제공한다. 또한, 이러한 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 본 발명은 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 이로써 생성된 OX2R 폴리펩티드를 분리시키는 단계를 포함하여, OX2R 폴리펩티드를 생성시키는 방법을 추가로 포함한다.

추가의 국면에서는, 본 발명은 숙주 세포에서 OX2R을 발현시키는 방법이 제공되는데, 이러한 방법은 상기 언급된 바와 같은 핵산 분자를 숙주 세포 내로 삽입하는 단계; 및 이러한 핵산 분자를 상기 숙주 세포에서 발현시키기 위한 조건을 제공하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 발현 벡터를 이용할 수 있다.

추가의 국면에서는, 본 발명은 가용성 형태의 상기 언급된 바와 같은 OX2R 폴리펩티드 또는 단편을 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 조성물은 보조제(adjuvant), 약제학적 담체 또는 부형제를 임의로 포함한다. 당해 조성물은, 예를 들면, OX2R 폴리펩티드에 대한 항체 반응을 생성시키기 위해 사용할 수 있다.

추가의 국면에서는, 본 발명은 치료제로서 유용한 것으로 예상되는 후보 화합물을 스크리닝하는데 사용하기 위한 상기 OX2R 폴리펩티드 및 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 세균성 감염, 자가면역 질환 등의 치료에 유용할 것으로 예상되는 물질을 스크리닝하는데 있어서, 상기 언급된 바와 같은 OX2R 폴리펩티드 또는 단편의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, OX2 이외의 OX2R에 대한 리간드를 동정하기 위한, OX2R 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편 및 핵산의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한, OX2 모사체를 고안하기 위한, OX2R 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편 및 핵산의 용도를 제공한다.

추가의 국면에서는, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 OX2R 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편 및 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 항체; 및 이러한 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이들 항체는 OX2R의 존재 여부를 검출하고 이를 정량화하기 위한 검정에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 OX2R의 정제 방법에도 사용할 수 있다. 상기 항체는 폴리클로날일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체가 IgG 항체, 더욱 바람직하게는 모노클로날 IgG 항체이다.

추가의 국면에서는, 본 발명은 OX2와 OX2R 간의 상호작용을 차단시킬 수 있는 결합성 분자, 예를 들면, 하나 이상의 항체 도메인을 갖는 물질을 생성시키기 위한, 본원에 제공된 바와 같은 OX2R 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편 및 핵산 분자의 용도를 제공한다. 이들은 세균성 감염, 자가면역 질환 등을 치료하기 위한 약물 제조에 유용한 것으로 예상되는 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 결합성 분자가 항체인 경우, 이들은 IgG 항체, 바람직하게는 모노클로날 IgG 항체일 수 있다.

추가의 국면에서는, 본 발명은 대식세포 세포 집단에서의 OX2R 발현을 제한하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 이러한 올리고뉴클레오티드의 내부 이행 및 안정화를 촉진시킬 수 있는 포스포로티올화 또는 콜레스테롤-연결된 올리고뉴클레오티드를 고안하는데 있어서, 상기 정의된 바와 같은 OX2R 핵산의 용도를 제공한다.

추가의 국면에서는, 본 발명은 본원에 제공된 서열 정보로부터 수득할 수 있는 프라이머 올리고뉴클레오티드로 핵산 폴리머라제 반응을 프라이밍(priming)하는 것을 포함하여, 핵산 시험용 샘플을 증폭시키는 방법을 제공한다. 상기 핵산 시험용 샘플은 사람 기원일 수 있으므로, 사람 OX2R을 암호화하는 핵산을 상기 방법을 사용하여 증폭시킨다.

추가의 국면에서는, 본 발명은 관심있는 종으로부터의 핵산 시험용 샘플을, 본원에 제공된 서열 정보로부터 수득할 수 있는 핵산 프로브로 프로빙시키는 것을 포함하여, 랫트 이외의 종으로부터의 OX2R(예: 사람 OX2R)의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 분자를 수득하는 방법을 제공한다.

추가의 국면에서는, 본 발명이 본원에 제공된 바와 같은 OX2R 아미노산 서열(표 1)과 50% 이상의 상동률을 나타내는 폴리펩티드 서열을 찾기 위해 데이터베 이스를 조사하는 단계를 포함하여, 랫트 이외의 종으로부터 OX2R(예: 사람 OX2R) 폴리펩티드 서열을 수득하는 방법을 제공한다. 유사하게, 랫트 이외의 종으로부터의 OX2R(예: 사람 OX2R) 핵산 서열은 본원에 제공된 바와 같은 OX2R 뉴클레오티드 서열과 50% 이상의 상동률을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 찾기 위해 데이터베이스를 조사함으로써 수득할 수 있다.

본 발명은 또한, 예를 들면, 단일가닥 입체 구조 다형성(SSCP)과 같은 기술을 사용하여, OX2R 유전자에서 돌연변이를 조사하는데 있어서, 본원에 제공된 핵산 서열 정보의 용도를 제공한다.

본 발명은, 서열 2의 분절과 동일한 4개 이상의 아미노산 중에서 3개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 서열 2의 분절과 동일한 5개 이상의 아미노산 중에서 2개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 성숙한 서열 2를 포함하는 천연 서열 설치류 OX2RH1 폴리펩티드; 랫트 OX2RH1 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드; 서열 4의 분절과 동일한 4개 이상의 아미노산 중에서 3개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 서열 4의 분절과 동일한 5개 이상의 아미노산 중에서 2개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 성숙한 서열 4를 포함하는 천연 서열 설치류 OX2RH1 폴리펩티드; 사람 OX2RH1 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드; 서열 6의 분절과 동일한 4개 이상의 아미노산 중에서 3개 이상의 별개의 중첩되지 않 은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 서열 6의 분절과 동일한 5개 이상의 아미노산 중에서 2개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 성숙한 서열 6를 포함하는 천연 서열 설치류 OX2RH1 폴리펩티드; 마우스 OX2RH1 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드; 서열 8의 분절과 동일한 4개 이상의 아미노산 중에서 3개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 서열 8의 분절과 동일한 5개 이상의 아미노산 중에서 2개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 성숙한 서열 8를 포함하는 천연 서열 설치류 OX2RH1 폴리펩티드; 사람 OX2RH2 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드; 서열 10의 분절과 동일한 4개 이상의 아미노산 중에서 3개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 서열 10의 분절과 동일한 5개 이상의 아미노산 중에서 2개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 성숙한 서열 10를 포함하는 천연 서열 설치류 OX2RH2 폴리펩티드; 마우스 OX2RH2 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드; 서열 12의 분절과 동일한 4개 이상의 아미노산 중에서 3개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 서열 12의 분절과 동일한 5개 이상의 아미노산 중에서 2개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 성숙한 서열 12를 포함하는 천연 서열 설치류 OX2RH3 폴리펩티드; 마우스 OX2RH3 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드; 서열 20의 분절과 동일한 4개 이상의 아미노산 중에서 3개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 서열 20의 분절과 동일한 5개 이상의 아미노산 중에서 2개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 성숙한 서열 20을 포함하는 천연 서열 영장류 OX2RH1.2 폴리펩티드; 영장류 OX2RH1.2 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드; 서열 23의 분절과 동일한 4개 이상의 아미노산 중에서 3개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 서열 23의 분절과 동일한 5개 이상의 아미노산 중에서 2개 이상의 별개의 중첩되지 않은 분절을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드; 성숙한 서열 23를 포함하는 천연 서열 설치류 OX2RH4 폴리펩티드; 또는 마우스 OX2RH4 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드 중에서 선택된 물질의 조성물을 제공한다. 몇몇 바람직한 양태에는 별개의 중첩되지 않은 분절 실체가 8개 이상의 아미노산 중에서 1개를 포함하거나; 4개 이상의 아미노산 중에서 1개와 5개 이상의 아미노산 중에서 또 다른 1개를 포함하거나; 4개, 5개 또는 6개 이상의 아미노산 중에서 3개 이상의 분절을 포함하거나; 또는 12개 이상의 아미노산 중에서 1개를 포함하는 양태가 포함된다. 기타 바람직한 양태에는 a) OX2RH1 폴리펩티드가 표 1 또는 2의 성숙한 서열을 포함하거나; OX2RH 폴리펩티드의 비-글리코실화 형태이거나; 영장류, 예를 들면, 사람 기원이거나; 설치류, 예를 들면, 랫트 또는 마우스 기원이거나; 서열 2, 4, 6 또는 20의 17개 이상의 아미노산을 포함하거나; 서열 2, 4, 6 또는 20의 7개 이상의 아미노산 중에서 4개 이상의 중첩되지 않은 분절을 나타내거나; OX2RH1의 천연 대립유전자성 변이체이거나; 길이가 약 30개 이상의 아미노산이거나; 영장류 또는 설치류 OX2RH1에 특이적인 2개 이상의 중첩되지 않은 에피토프를 나타내거나; 글리코실화되거나; 천연 글리코실화를 나타내는, 분자량이 30kD 이상이거나; 합성 폴리펩티드이거나; 고체 기질에 부착되거나; 또 다른 화학적 잔기에 접합되거나; 천연 서열로부터 5회 이하 치환되거나; 또는 천연 서열로부터의 결실 또는 삽입 변이체이거나; b) OX2RH2 폴리펩티드가 표 2의 성숙한 서열을 포함하거나; OX2RH2 폴리펩티드의 비-글리코실화 형태이거나; 영장류, 예를 들면, 사람 기원이거나; 설치류, 예를 들면, 마우스 기원이거나; 서열 8 또는 10의 17개 이상의 아미노산을 포함하거나; 서열 8 또는 10의 7개 이상의 아미노산 중에서 4개 이상의 중첩되지 않은 분절을 나타내거나; OX2RH2의 천연 대립유전자성 변이체이거나; 길이가 약 30개 이상의 아미노산이거나; 영장류 또는 설치류 OX2RH2에 특이적인 2개 이상의 중첩되지 않은 에피토프를 나타내거나; 글리코실화되거나; 천연 글리코실화를 나타내는, 분자량이 30kD 이상이거나; 합성 폴리펩티드이거나; 고체 기질에 부착되거나; 또 다른 화학적 잔기에 접합되거나; 천연 서열로부터 5회 이하 치환되거나; 또는 천연 서열로부터의 결실 또는 삽입 변이체이거나; c) OX2RH3 폴리펩티드가 표 3의 성숙한 서열을 포함하거나; OX2RH3의 비-글리코실화 형태이거나; 설치류, 예를 들면, 마우스 기원이거나; 서열 12의 17개 이상의 아미노산을 포함하거나; 서열 12의 7개 이상의 아미노산 중에서 4개 이상의 중첩되지 않은 분절을 나타내거나; OX2RH3의 천연 대립유전자성 변이체이거나; 길이가 약 30개 이상의 아미노산이거나; 설치류 OX2RH3에 특이적인 2개 이상의 중첩되지 않은 에피토프를 나타내거나; 글리코실화되거나; 천연 글리코실화를 나타내는, 분자량이 30kD 이상이거나; 합성 폴리펩티드이거나; 고체 기질에 부착되거나; 또 다른 화학적 잔기에 접합되거나; 천연 서열로부터 5회 이하 치환되거나; 또는 천연 서열로부터의 결실 또는 삽입 변이체이거나; 또는 d) OX2RH4 폴리펩티드가 표 2의 성숙한 서열을 포함하거나; OX2RH4의 비-글리코실화 형태이거나; 설치류, 예를 들면, 마우스 기원이거나; 서열 23의 17개 이상의 아미노산을 포함하거나; 서열 23의 7개 이상의 아미노산 중에서 4개 이상의 중첩되지 않은 분절을 나타내거나; OX2RH4의 천연 대립유전자성 변이체이거나; 길이가 약 30개 이상의 아미노산이거나; 설치류 OX2RH4에 특이적인 2개 이상의 중첩되지 않은 에피토프를 나타내거나; 글리코실화되거나; 천연 글리코실화를 나타내는, 분자량이 30kD 이상이거나; 합성 폴리펩티드이거나; 고체 기질에 부착되거나; 또 다른 화학적 잔기에 접합되거나; 천연 서열로부터 5회 이하 치환되거나; 또는 천연 서열로부터의 결실 또는 삽입 변이체인 양태가 포함된다. 또한, 기타 양태에서는, 본 발명이 a1) 실질적으로 순수한 OX2RH1 및 또 다른 Ig 상과(superfamily) 구성원; a2) 실질적으로 순수한 OX2RH2, 및 또 다른 Ig 상과 구성원인 DAP12 또는 DAP10; a3) 실질적으로 순수한 OX2RH3, 및 또 다른 Ig 상과 구성원인 DAP12 또는 DAP10; a4) 실질적으로 순수한 OX2RH4, 및 또 다른 Ig 상과 구성원인 DAP12 또는 DAP10; 또는 멸균성 OX2RH1 폴리펩티드; 멸균성 OX2RH2 폴리펩티드; 멸균성 OX2RH3 폴리펩티드; 멸균성 OX2RH4 폴리펩티드; OX2RH1, OX2RH2, OX2RH3 또는 OX2RH4 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 담체는 물, 식염수 및/또는 완충제를 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국부 또는 비경구 투여용으로 제형화된다.

예를 들면, 표 1 내지 3의 성숙한 단백질 서열; FLAG, His6 또는 Ig 서열을 포함한, 검출 또는 정제용 태그; 또는 또 다른 Ig 상과 단백질의 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드가 또한 제공된다. 예를 들면, OX2RH2 폴리펩티드와, 당해 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 구획; 또는 키트 내의 시약 사용이나 처분에 대한 지시 사항을 포함하는 키트가 또한 제공된다.

본 발명은 또한, 상이한 종으로부터 유도된 항체를 포함한, 각종 항체 유사 시약을 포괄한다. 이는, 예를 들면, 천연의 OX2RH 폴리펩티드, 예를 들면, OX2RH1, OX2RH2, OX2RH3 및/또는 OX2RH4와 특이적으로 결합하는, 항체로부터의 항원 결합성 부위를 포함하는 결합성 화합물을 제공하는데, 여기서는 상기 결합성 화합물이 용기 내에 있거나; OX2RH 폴리펩티드가 설치류 또는 영장류 기원이거나; 결합성 화합물이 Fv, Fab 또는 Fab2 단편이거나; 결합성 화합물이 또 다른 화학적 잔기에 접합되거나; 또는 항체가 표 1 내지 3의 성숙한 폴리펩티드의 펩티드 서열에 대해 생성되거나, 성숙한 OX2RH에 대해 생성되거나, 정제된 포유류 OX2RH에 대해 생성되거나, 면역선별되거나, 폴리클로날 항체이거나, 변성된 OX2RH에 결합되거나, 항원에 대한 Kd가 30μM 이상이거나, 비드 또는 플라스틱 막을 포함한 고체 기질에 부착되거나, 멸균 조성물 내에 함유되거나, 또는 방사성 또는 형광성 표지를 포함하여, 검출 가능한 수준으로 표지된다. 이로써, 예를 들면, 상기 결합성 화합물과, 이러한 결합성 화합물을 포함하는 구획; 또는 키트 내의 시약 사용이나 처분에 대한 지시 사항을 포함하는 키트가 제공된다. 적당한 조건 하에서 포유류 OX2RH 폴리펩티드를 항체와 접촉시킴으로써, 복합체가 형성되도록 하는 것을 포함하여, 항원:결합성 화합물 또는 항원:항체 복합체를 생성시키는 방법이 또한 제공된다. 바람직하게는, 이러한 방법에서는, 상기 복합체를 기타 사이토킨 또는 Ig 상과 수용체로부터 정제하거나; 복합체를 기타 항체로부터 정제하거나; 포유류 OX2를 포함하는 샘플과 접촉을 수행하거나; 상기 접촉이 항원의 정량적 검출을 가능케 해주거나; 항체를 포함하는 샘플과 접촉을 수행하거나; 또는 이러한 접촉이 항체의 정량적 검출을 가능케 해준다. 예를 들면, 멸균 결합성 화합물, 또는 상기 결합성 화합물 및 담체를 포함하는 관련 조성물이 이용 가능한데, 여기서 상기 담체는 물, 식염수 및/또는 완충제를 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국부 또는 비경구 투여용으로 제형화된다.

본 발명은 추가로, 핵산, 예를 들면, OX2RH 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산을 제공하는데, 여기서는 OX2RH가 포유류 기원이거나; 또는 상기 핵산이 표 1 내지 3의 항원성 펩티드 서열을 암호화하거나, 표 1 내지 3의 다수의 항원성 펩티드 서열을 암호화하거나, 상기 분절을 암호화하는 천연 cDNA와 13개 이상의 뉴클레오티드에 걸쳐 동일성을 나타내거나, 발현 벡터이거나, 복제 기점을 추가로 포함하거나, 천연 공급원으로부터 유래된 것이거나, 검출 가능한 표지를 포함하거나, 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 6kb 미만, 바람직하게는 3kb 미만이거나, 영장류 또는 설치류 기원이거나, 천연의 완전한 길이의 암호화 서열을 포함하거나, OX2RH를 암호화하는 유전자에 대한 하이브리드화 프로브이거나, DAP12 또는 DAP10을 추가로 암호화하거나, 또는 PCR 프라이머, PCR 생성물 또는 돌연변이유발 프라이머이다. 상기 재조합 핵산을 포함하는 세포가 또한 제공되는데, 예를 들면, 이러한 세포는 원핵 세포, 진핵 세포, 세균성 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 포유류 세포, 마우스 세포, 영장류 세포 또는 사람 세포이다. 상기 핵산을, 예를 들면, 이러한 핵산을 포함하는 구획; 포유류 OX2RH 폴리펩티드를 추가로 포함하는 구획; 또는 키트 내의 시약 사용이나 처분에 대한 지시 사항과 함께 포함하는 키트가 제공된다.

또 다른 한편, 본 발명은 40℃ 및 2M 미만 염의 30분 세척 조건 하에서 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 19 또는 22의 암호화 부분과 하이브리드화되거나; 또는 영장류 또는 설치류 OX2RH cDNA와 약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 동일성을 나타내는 핵산을 제공한다. 바람직하게는, 상기 세척 조건이 50℃ 및/또는 500mM 염, 또는 60℃ 및/또는 150mM 염이거나; 상기 연장물이 55개 또는 75개 이상의 뉴클레오티드이거나; 또는 상기 핵산이 DAP12 또는 DAP10 펩티드를 추가로 암호화한다.

기타 방법, 예를 들면, 특정 세포를 포유류 OX2RH의 효능제 또는 길항제와 접촉시키는 것을 포함하여, 상기 세포 또는 조직 배양 세포의 생리학 또는 발생을 조절하는 방법이 추가로 포괄된다. 종종, 이러한 세포는 OX2RH를 암호화하는 핵산으로 형질전환시킨다.

본 발명에 의해 제공된 바와 같은 OX2R은, 예를 들면, OX2와 OX2R 간의 상호작용을 억제하므로, 대식세포와 면역계의 기타 세포, 예를 들면, 림프구 또는 포상 수지상 세포 간의 상호작용에도 영향을 미치게 되는 화합물을 검출하는데 사용할 수 있다.

개요

I. 총론

II. 활성

III. 핵산

A. 암호화 단편, 서열, 프로브

B. 돌연변이물, 키메라, 융합물

C. 핵산 제조

D. 벡터, 이를 포함하는 세포

IV. 단백질, 펩티드

A. 단편, 서열, 면역원, 항원

B. 돌연변이 단백질

C. 효능제/길항제, 기능성 등가물

D. 단백질 제조

V. 핵산, 단백질 제조

A. 합성

B. 재조합

C. 천연 공급원

VI. 항체

A. 폴리클로날

B. 모노클로날

C. 단편; Kd

D. 항-유전자형 항체

E. 하이브리도마 세포주

VII. OX2RHs를 정량화하는 방법 및 키트

A. ELISA

B. 암호화하는 mRNA 검정

C. 정성적/정량적

D. 키트

VIII. 치료학적 조성물, 방법

A. 조합 조성물

B. 단위 용량

C. 투여

IX. 스크리닝

X. 리간드

I. 총론

본 발명은 포유류(본원에서는 영장류 및 설치류) 수용체-유사 아단위 분자의 아미노산 서열 및 DNA 서열을 제공하는데, 상기 분자는 OX2 수용체 동족체(OX2RH)로 명명된다. 이들 유전자는 구조적 및 생물학적 측면 중의 어느 하나 또는 둘 다에서 특정하게 규정된 성질을 지니고 있다. 이들 분자를 암호화하는 각종 cDNA를 포유류(예: 사람 및 설치류) cDNA 서열 라이브러리로부터 수득하였다. 기타 포유류, 예를 들면, 영장류, 설치류 등의 대응물이 또한 바람직할 수 있다.

OX2 항원은 모노클로날 항체(mAb) MRC OX2를 사용하여 랫트에서 처음으로 성상 확인하였다[참조: McMaster and Williams (1979) Eur. J. Immunol. 9:426-433; Barclay (1981) Immunology 44:727-736; Barclay (1981) Immunology 42:593-600; Bukovsky, et al. (1984) Immunology 52:631-640; and Webb and Barclay (1984) J. Neurochem. 43:1061-1067]. 유동 세포계수를 위한 조직 절편 또는 세포 현탁액의 면역조직화학(IHC) 염색에 상기 항체를 사용한 결과, OX2 항원이 광범위한 세포, 예를 들면, 신경 단위, 혈관성 내피, B 세포, 활성화 T 세포, 포상 수지상 세포, 평활근 세포 및 영양막에 의해 발현되는 것으로 밝혀졌다. 더우기, 사람 OX2는 정상적인 뇌 및 B 세포에서 발현되는 것으로 공지되어 있다[참조: McCaughan, et al. (1987) Immunogenetics 25:329-335]. MRC OX2에 의해 인식된 랫트 단백질의 성상 확인 결과[참조: Clark, et al. (1985) EMBO J. 4:113-118], OX2가 2개의 세포외 면역글로불린(Ig) 도메인, 막관통 도메인 및 짧은 C-말단 세포질 말미(tail)를 포 함하는 약 248개 아미노산으로 이루어지는 것으로 나타났다. 상기 분자는 6N-연결된 글리코실화 부위(이중 3개는 N-말단 V-유사 Ig 도메인에 존재하고, 나머지는 막 인접한 C2-유사 Ig 도메인에 존재한다)를 통하여 글리코실화된다. 이로써, OX2가 Ig 상과(IgSF)에 위치하게 되어, 예를 들면, Ig 가변 및 불변 도메인에 상응하는 면역글로불린-유사 도메인, 막관통 분절, 세포내 도메인, 및 특징적인 시스테인 및 트립토판 잔기 스페이싱이 존재한다는 사실로써 구조적으로 성상 확인되는, CD2, CD48, CD58, CD80, CD86, CD90 및 CD147과 같은 분자와 함께 작은 IgSF 분자의 아그룹을 형성한다[참조: Campbell, et al. (1979) Nature 282:341-342]. 흥미롭게도, CD90은 또한, 신경 단위에 의해 고도로 발현된다[참조: Williams, et al. (1977) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 41 Pt 1:51-61]. 추가로, OX2가 CD80 및 CD86의 구조적 동족체라는 사실[참조: Borriello, et al. (1997) J. Immunol. 158:4548-4554]과, OX2 유전자가 마우스 내의 염색체 16 상의 CD80과 CD86을 암호화하는 유전자와 밀접하게 연결되어 있다는 사실이 밝혀졌다[참조: Borriello, et al. (1998) Mamm. Genome 9:114-118]. CD80과 CD86은 모두 공-자극으로서 공지된 과정에서 리간드로서 작용하므로, OX2는 또한 리간드로서 작용하는 것으로 예상된다. 이러한 OX2 항원은 본원에서 OX2 단백질 또는 리간드 OX2로서 후술될 것이다. 이의 결합 파트너가 OX2 수용체로서 지칭될 것이다.

OX2에 대한 수용체(OX2R)를 동정하기 위하여, 형광성 비드에 결합된 랫트 OX2-랫트 CD4 융합 단백질을 사용하여 다가 시약을 제조한다. 이러한 시약은 마우스와 랫트 복막 대식세포에 결합되는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 결합은 mAb MRC OX88에 의해 차단될 수 있다[참조: Preston, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1911-1918]. 상기 mAb는 복막과 비장 모두로부터 분리된 대식세포와 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 비장 절편 염색물 상의 IHC에서는, 대식세포를 상당 비율로 함유하는 것으로 공지된 영역이 발견되었다.

바클레이(Barclay) 그룹에 의해 생성된 제2의 모노클로날 항체(OX102로 명명됨)는 랫트 종 내의 대식세포와 결합하고, 또한 랫트 복막 대식세포에 대한 OX2 분자의 결합을 특이적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다. OX102 분자와 결합하는 물질을 분리하고 N-말단을 서열화한 결과, 추정상의 OX2 수용체(OX2R)가 신규한 분자라는 사실이 밝혀졌다. 이는 본원에 기재된 바와 같이 클로닝시켰다. OX102 항체에 의해 인식된 단백질이 실은 수용체라는 사실은, 상기 분자 상의 세포질 말미가 OX2 분자 자체(리간드)와 비교해서 더 길다는 입증 내용으로 뒷받침되었다[참조: Clark, et al. (1985) EMBO J. 4:113-118]. OX2R을 예비 분석한 결과, 공지된 시그널링 분자와 일치되는 명백한 모티프가 나타나지는 않았지만, 이것이 OX2-전달된 시그널 조절에 있어서의 상기 분자의 잠재적 역할을 배제하지는 않는다.

이어서, OX2RH1로 명명된 마우스 동족체를 동정하였다. 용어 OX2R은 OX2와 실제적으로 결합되는 것으로 입증된 단백질에 대한 것이기 때문에, 적용된 약식 명칭은 그룹 1의 수용체 동족체이다. 이러한 분자의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 본원에 기재되어 있다.

입수 가능한 서열 데이터 베이스에 대한 추가의 분석 결과, 추정상의 세포외 Ig-도메인 구조 측면에서는 OX2RH1와 상당한 상동성을 나타내지만 상이한 막관통 및 세포질 서열을 갖는 분자인 또 다른 별개 형태의 OX2RH가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이들 형태는 본원에서 OX2RH2로 명명되었으며, 사람과 마우스 양태 모두가 동정되었다. 특히 주목할 것은 상기 분자의 막관통 부분 내에 있는 224번 위치(사람) 및 170번 위치(마우스)에 리신(K) 잔기가 존재한다는 것이다. 이러한 잔기는, 상기 분자가 세포성 활성화를 위해 시그널링할 수 있는 모티프를 발현하는 것으로 공지된 DAP12와 같은 분자상 파트너와 연합할 것이라는 것을 제시해준다[참조: Lanier et al. (1998) Nature 391:703-707; Colonna (1998) Nature 391:642-3; Campbell, et al. (1999) Int. J. Biochem. Cell. Biol. 31:631-636; and Lopez-Botet, et al. (1999) Curr. Opin. Immunol. 11:301-307]. 더우기, 이는 각종 시그널링 경로 및 연관된 생화학을 제시해준다[참조: Lanier, et al. (1998) Immunity 8:693-701; Smith, et al. (1998) J. Immunol. 161:7-10; Gosselin, et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66:165-171; Tomasello, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:34115-34119; and McVicar, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:32934-32942]. 그러나, 완전한 길이의 마우스 또는 사람 OX2RH2 형태는 아직까지 분리하지 못하고 있다.

OX2RH1 분자의 마우스 세포외 영역과 랫트 세포외 영역 간의 상동성은 높은데, 이들 모두는 이들 각각의 종 OX2와 결합하는 것으로 확인되었다. 따라서, 랫트와 마우스 OX2RH1 양태는 또한, 기능적으로 OX2R로서 적절히 지칭된다. 양 양태는 전형적인 세포외, 막관통 및 세포내 도메인 구조를 함유한다. 사람 OX2RH1 양태를 발견하였다. 부가적으로, 가용성 형태의 랫트 및 마우스 OX2RH1이 존재할 수 있다.

마우스 및 사람에서 유래되는 각종 양태의, OX2RH2 및 OX2RH4로 명명된 관련 동족체가 또한 기재되었다. OX2RH2, H3 및 H4 양태는 막관통 분절 내에 전하를 띤 리신 잔기를 나타낸다. 사람 OX2RH2 양태는 시그널 서열이 결핍되어 있고 몇몇 게놈성 서열 특징을 나타내는데, 이는 기능성 형태의 천연 사람 OX2RH2가, 제공된 서열과 밀접하게 관련되긴 하지만 이와 약간은 상이해야 한다는 것을 제시해준다. 마우스 및 사람 동족체 2와 4의 기능적 관계 확인은 뒷날로 미루어진다.

추가의 OX2R 동족체가 또한 마우스에서 발견되었다. 이의 상동성이 훨씬 더 서로 다르긴 하지만, 이는 몇몇 서열 유사성을 나타낸다. 특히, 이는 막관통 영역 내에 리신 잔기를 갖는다. 따라서, 이러한 형질을 나타내는 기타 OX2RH2, H3 및 H4 분자와 같이, DAP12와 같은 연합성 분자를 통하여 시그널링할 것으로 예상된다. 이러한 양태가 본원에서 설치류(예: 마우스)로부터의 OX2RH3으로 명명된다.

OX2RH1의 발현 패턴에 관해 진행되는 분석 결과는, 랫트, 마우스 및 사람 백혈구에서, OX2RH1(OX102 항체로의 유동 세포계수적 염색 및/또는 PCR 기술에 의한 mRNA 발현 분석으로 결정된 바와 같음)이 단핵구, 과립구 및 비만 세포에 의해 가장 강력하게 발현되고, B 세포에 의해서는 약간 발현되며 T 세포에 의해서는 약하게 발현된다는 것을 지시해준다. 이는 리간드 OX2가 초기 연구에서 대식세포에 우선적으로 결합된다는 사실과 부합된다. 정상적인 랫트 중추 신경계에서는, 일정 비율의 내재된 대식세포(또는 마이크로글리아 세포)가 OX2R을 발현하기도 하지만, 이는 낮은 수준이다.

적용될 수 있는 몇몇 표준 방법이 본원에 참조문헌으로 삽입된 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; or Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York].

설치류(예: 랫트) OX2 수용체 동족체 1(OX2RH1) 암호화 분절의 뉴클레오티드(서열 1) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 2)이 표 1에 제시되어 있다. 유사하게, 추가의 양태, 영장류(예: 사람) 및 설치류(예: 마우스)가 OX2RH1, 1.2, 2 및 4로 명명되어 기재되어 있다. 이의 핵산 서열은 서열 3, 19, 5, 7, 9 및 22이고; 상응하는 아미노산 서열은 서열 4, 20, 6, 8, 10 및 23이며, 이는 표 2에 제시되어 있다. 표 3은 기타 설치류(예: 마우스) OX2RH3의 서열(서열 11 및 12)을 제공한다.

역해독 핵산 서열이 표 4에 제공되어 있다(서열 13-14, 21, 15-17, 24 및 18). 표 5는 폴리펩티드 서열의 정렬 및 수적 비교를 제공해준다.

[표 1]

설치류 OX2R (동족체 1)의 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열

[표 2]

부가의 OX2R 동족체의 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열

[표 3]

설치류 (예 : 마우스) OX2RH3 (서열 11 및 12)

[표 4]

OX2R 동족체의 역해독

[표 5]

각종 종 OX2R 동족체 1 및 2의 정렬

OX2RH1 및 2 양태는 서로에 대해 특별한 유사성을 나타낸다(예를 들어, 표 5 참조). 관심있는 특정한 영역 또는 위치는 랫트 H1의 경우, cys2, leu33, cys35, ile46, trp48, arg53, pro56, cys58, tyr62, cys74, thr80, trp81, leu91, ile93, his100, gly102, tyr104, gly113, phe115, leu122, val123, pro127, asn136, ala139, val140, cys141, ala143, lys147, pro148, ala149, ile152, trp154, pro156, asn169, thr171, val174, ser176, cys178, glu181, ser186, val188, cys190, ser193, his194, thr196, asn198, leu202, gly215, tyr217, leu237, lys238 및 ile304(이들 위치 전에, 이들 위치에 또는 이들 위치 다음에) 인접한 경계이다. 많은 잔기가 H1 및 H2 부류에 걸쳐 보존된다. H2 및 H4 부류도 마찬가지이다(표 5 참조). 랫트 OX2RH1에서 관심있는 특정한 도메인은 약 cys2에서 pro127까지의 C2 도메인, 약 glu128에서 gly215까지의 C2 도메인, 약 tyr217에서 leu237까지의 TM 분절 및 약 lys238에서 ile304까지의 세포내 도메인이다. 마우스 H1에서 상응하는 분절은 약 ser24-pro150, glu151-gly231, tyr239-leu259 및 lys260-ile326이다. 마우스 H2에서는, 상기 분절이, 이용 가능한 서열에 있어서, 약 arg1-pro74, glu75-gly155, pro161-gly182 및 phe183-thr194에 상응한다. 사람 H2의 경우, 막관통 분절은 약 ala214-val233 및 thr234-leu250이고, 마우스 H3에서는, 막내(intramembrane) lys228을 갖는 약 pro119-gly237, 및 phe238-gly252이다. 표 5는 또한, H2 및 H4 양태의 정렬을 지시해준다. 예를 들면, 단편들에 대한 경계로서의 관심있는 부가의 위치는 랫트 OX2RH1 또는 이 계열 구성원의 각종 아세트와의 동족체 그룹에 걸쳐 보존된 것일 것이다.

기능적으로, 랫트와 마우스 H1은 OX2와 결합하는 것으로 나타났다. 이는 사람 H1에 대해서는 아직까지 확인되지 않았지만, 용이하게 시험될 수는 있다. H2, H4 및 H3 그룹에 부합되는 리간드가 다음에 기재되어 있다.

설치류 H3은 예상된 바와 같이 DAP12와 연합하는 것으로 나타났다. 재조합적으로 발현된 에피토프 태그된 DAP12는 채파론(chaparone) 파트너과의 공동 발현 부재하에서는 막 연합되지 않는다[참조: Bakker, et al. (1999) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:9792-9796]. 마우스 H3은 채파론 파트너로서 작용할 수 있다. 그러 나, DAP12를 통한 시그널 경로는 H3 리간드와의 결합을 요구하는데, 이러한 리간드는 아직까지 동정되지 않았지만, 적당한 스크리닝 방법, 예를 들면, 생화학적 또는 물리적 방법을 사용하여 발견할 수 있다. H2와 설치류 H4와의 서열 유사성은 DAP12, 또는 가능하게는 DAP10과의 유사한 연합을 제시해준다.

마우스 H2 및 H4와 사람 H2는 또한, 이러한 특성, 예를 들면, DAP12(활성화) 또는 DAP10과 연합하는 특성을 보유하는 것으로 예상된다. 시그널링 경로는 NK 세포 상의 몇몇 관련 수용체로 결정하였다[참조: Lanier, et al. (1998) Immunity 8:693-701; Smith, et al. (1998) J. Immunol. 161:7-10; Gosselin, et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66:165-171; Tomasello, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:34115-34119; and McVicar, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:32934-32942]. 세포외 도메인과 H1 구성원과의 유사성 때문에, OX2-유사 유전자, 특히 OX2는 리간드인 것으로 예상된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 OX2RH1, OX2RH2 또는 OX2RH4는, 예를 들면, 표 1 내지 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 기재하는데 사용될 것이다. 많은 경우에 있어서, 예를 들면, 세포외 또는 세포내 도메인을 포함한, 이의 실질적인 단편이 기능적 또는 구조적으로 등가일 것이다. 본 발명은 또한, 이의 서열이 제공된 각각의 OX2RH 대립유전자의 단백질 변이체, 예를 들면, 돌연변이 단백질 또는 가용성 세포외 작제물을 포함한다. 전형적으로, 이러한 효능제 또는 길항체는 약 10% 미만의 서열 상이성을 나타낼 것이므로, 종종 1 내지 11개 잔기, 예를 들면, 2, 3, 5, 7개 등의 잔기 치환을 나타낼 것이다. 이는 또한, 기재된 단백 질의 대립유전자성 및 기타 변이체, 예를 들면, 천연 다형성 변이체를 포괄한다. 전형적으로, 상기 수용체는, 예를 들어, 약 100nM 이상, 통상적으로 약 30nM 이상, 바람직하게는 약 10nM 이상, 보다 바람직하게는 약 3nM 이상에서, 상응하는 생물학적 리간드와 고친화도로 결합할 것이다. 상기 용어는 또한, 관련된 천연의 형태, 예를 들면, 포유류 단백질의 대립유전자, 다형성 변이체 및 대사적 변이체를 지칭하기 위해 본원에 사용될 것이다. 바람직한 형태의 수용체 복합체는 리간드-수용체 상호작용에 적당한 친화도 및 선택도로 적당한 리간드와 결합할 것이다.

본 발명은 또한, 표 1 내지 3의 아미노산 서열과 상당한 아미노산 서열 동일성을 나타내는 단백질 또는 펩티드의 조합물을 포괄한다. 이에는 비교적 적은 치환물, 예를 들면, 바람직하게는 약 3 내지 5개 미만의 치환물을 갖는 서열 변이체가 포함될 것이다.

실질적인 폴리펩티드 "단편" 또는 "분절"는 약 8개 이상의 아미노산, 일반적으로 10개 이상의 아미노산, 보다 일반적으로 12개 이상의 아미노산, 종종 14개 이상의 아미노산, 보다 종종 16개 이상의 아미노산, 전형적으로 18개 이상의 아미노산, 보다 전형적으로 20개 이상의 아미노산, 통상적으로 22개 이상의 아미노산, 보다 통상적으로 24개 이상의 아미노산, 바람직하게는 26개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 28개 이상의 아미노산, 특히 바람직한 양태에서는 약 30개 이상의 아미노산의 아미노산 잔기 연장물이다. 상이한 단백질의 분절의 서열은 적당한 길이의 연장물에 걸쳐 서로 비교할 수 있다. 많은 상황하에서는, 단편이 본래의 아단위의 기능적 특성을 나타낼 수 있는데, 예를 들면, 막관통 수용체의 세포외 도메인 은 리간드 결합 특징을 보유할 수 있고 가용성 수용체-유사 복합체를 제조하는데 사용할 수 있다.

아미노산 서열 상동성 또는 서열 동일성은 잔기 매치를 최적화함으로써 결정한다. 몇몇 비교에서는, 필요에 따라 갭이 도입될 수 있다[참조: Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, et al. (1983) chapter on in Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; and software packages from IntelliGenetics, Mountain View, CA; and the University of Wisconsin Genetics Computer Group(GCG), Madison, WI; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다]. 이는 보존적 치환물을 매치물로서 간주할 때 변한다. 보존적 치환물에는 전형적으로, 다음 그룹 내에서의 치환물이 포함된다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루이신, 루이신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 상동 아미노산 서열에는 수용체 동족체 서열 내의 천연의 대립유전자성 변이물 및 종간 변이물이 포함된다. 전형적인 상동 단백질 또는 펩티드는 표 1 내지 3의 아미노산 서열 분절과 50 내지 100%의 상동률(갭이 도입될 수 있는 경우)에서부터 60 내지 100% 상동률(보존적 치환물이 포함되는 경우)을 나타낼 것이다. 상동률 측정치는 약 70% 이상, 일반적으로 76% 이상, 보다 일반적으로 81% 이상, 종종 85% 이상, 보다 종종 88% 이상, 전형적으로 90% 이상, 보다 전형적으로 92% 이상, 통상적으로 94% 이상, 보다 통상적으로 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상일 것이다. 상동률은 비교된 분절의 길이에 따라서 다양할 것이다. 대립유전자성 변이체와 같은 상동 단백질 또는 펩티드는 표 1 내지 3에 기재된 양태와 대부분의 생물학적 활성을 공유할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 활성"은 염증 반응, 선천성 면역, 및/또는 수용체-유사 단백질에 의한 형태발생적 발생에 대한 효과를 제한없이 기재하는데 사용된다. 예를 들면, 이들 수용체는 포스파타제 또는 포스포릴라제 활성을 통하여 이들의 효과를 매개하는 것으로 예상되며, 상기 활성들은 표준 방법에 의해 용이하게 측정한다[참조: Hardie, et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I and II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991) Meth. Enzymol. 200:38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70:375-388; Lewin (1990) Cell 61:743-752; Pines, et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 56:449-463; and Parker, et al. (1993) Nature 363:736-738]. 수용체 동족체 또는 이의 부분은 일반적이거나 특이적인 기질을 표지시키기 위한 포스페이트 표지화 효소로서 유용할 수 있다. 이러한 아단위는 또한, 인식성 항체를 유발시키는 기능적 면역원, 또는 항체와 결합할 수 있는 항원일 수 있다.

예를 들면, OX2RH의 리간드, 효능제, 길항제 및 유사체란 용어에는 OX2 단백질의 결합에 대한 특징적인 세포성 반응을 조절하는 분자 뿐만 아니라 예를 들면, 길항제가 수용체 동족체 또는 항체의 가용성 세포외 도메인인 경우에, 리간드-수용체 상호작용의 표준 구조적 결합 경쟁 특징을 보다 많이 보유하고 있는 분자가 포함된다. 상기 세포성 반응은 수용체 티로신 키나제 경로를 통하여 통상 매개되는 것으로 예상된다.

또한, 수용체 동족체는 상기 리간드 또는 이의 유사체가 결합되는 천연 수용체로서 작용하는 분자; 또는 이러한 천연 수용체의 기능성 유사체인 분자일 수 있다. 이러한 기능성 유사체는 구조적 변형을 나타내는 수용체 동족체이거나, 또는 적당한 리간드 결합 결정기와 상호작용하는 분자 형태를 지닌 완전히 무관한 분자일 수 있다. 상기 리간드는 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있다[참조: Goodman, et al. (eds. 1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, Pergamon Press, New York].

합리적인 약물 고안은 또한 수용체 동족체, 항체, 또는 기타 효과인자(effector) 또는 수용체 동족체 연합된 실체의 분자 형태에 관한 구조적 연구에 근거할 수 있다[참조: Herz, et al. (1997) J. Recept. Signal Transduct. Res. 17:671-776; and Chaiken, et al. (1996) Trends Biotechnol. 14:369-375]. 효과인자는 리간드 결합에 반응하여 기타 기능을 매개하는 기타 단백질, 또는 수용체 동족체와 정상적으로 상호작용하는 기타 단백질일 수 있다. 특이적인 기타 단백질과 상호작용하는 부위를 결정하기 위한 한 가지 방법은 물리적 구조 결정법, 예를 들면, x선 결정학 또는 2차원적 NMR 기술이다. 이들은 아미노산 잔기가 분자상 접촉 영역을 형성하는 것에 관한 지침을 제공할 것이다. 단백질 구조 결정법에 관한 상세한 내역은 본원에 참조문헌으로 삽입된 문헌[Blundell and Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York]을 참조할 수 있다.

II. 활성

수용체-유사 단백질은 수 많은 상이한 생물학적 활성, 예를 들면, 세포 증식을 조절하는 활성, 또는 포스페이트 대사에서는, 특정 기질, 전형적으로 단백질에 가해지거나 이로부터 제거되는 활성을 지닐 것이다. 이로써, 일반적으로 염증 기능, 기타 선천성 면역 반응 또는 형태학적 효과가 조절될 것이다. 수용체 동족체는 기재된 바와 같이, 리간드와의 고유 결합 친화도가 낮은 것으로 예상된다.

OX2RH1은 수용체 티로신 키나제 경로를 통하여 수용체 시그널링을 암시하는 모티프를 갖는다[참조: Ihle, et al. (1997) Stem Cells 15(suppl. 1):105-111; Silvennoinen, et al. (1997) APMIS 105:497-509; Levy (1997) Cytokine Growth Factor Review 8:81-90; Winston and Hunter (1996) Current Biol. 6:668-671; Barrett (1996) Baillieres Clin. Gastroenterol. 10:1-15; and Briscoe, et al. (1996) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 351:167-171].

OX2R 동족체의 생물학적 활성은, 전형적으로는 특정 방식으로 진행되지만, 종종 특정하지 않은 방식으로 진행되는, 포스페이트 잔기를 기질에 첨가하거나 이로부터 제거하는 것과 관련될 것으로 예상된다. 기질을 동정할 수 있거나, 또는 효소적 활성에 대한 조건은 예를 들어, 문헌[참조: Hardie, et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I and II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991) Meth. Enzymol. 200:38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70:375-388; Lewin (1990) Cell 61:743-752; Pines, et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 56:449-463; and Parker, et al. (1993) Nature 363:736-738]에 기재된 바와 같이, 표준 방법에 의해 검정할 수 있다.

수용체 동족체는 하나 이상의 기타 단백질과 조합하여, 예를 들어, 리간드와 결합하거나 항체를 제조하는데 유용할 수 있는 기능성 복합체를 형성할 수 있다. 이들은 검출 또는 정량화를 포함한 실질적인 진단 용도를 지닐 것이다.

III. 핵산

본 발명은, 예를 들면, 바람직하게는 생물학적으로 활성인 상응하는 폴리펩티드를 암호화하기 위하여, 그 자체를 암호화하거나 밀접하게 관련된 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 분리된 핵산 또는 이의 단편의 용도를 고려한다. 또한, 본 발명은, 예를 들면, 상기 동족체의 특징적 서열을 갖는 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 조합물을 암호화하는 재조합 또는 분리된 DNAs를 포괄한다. 전형적으로, 상기 핵산은 적당한 조건 하에서, 표 1 내지 3에 제시된 핵산 서열 분절과는 하이브리드화할 수 있지만, 바람직하게는 기타 공지된 Ig 상과 수용체의 상응하는 분절과는 하이브리드화할 수 없다. 이러한 생물학적 활성의 단백질 또는 폴리펩티드는 완전한 길이의 단백질 또는 단편일 수 있고, 전형적으로 표 1 내지 3에 제시된 것과 고도의 아미노산 서열 상동성인, 예를 들어, 상당한 연장물이 동일성을 나타내는 분절을 지닐 것이다. 추가로, 본 발명은 OX2RH 단백질과 등가인 단편을 갖는 단백질을 암호화하는 분리된 또는 재조합 핵산 또는 이들의 단편의 용도를 포괄한다. 이러한 분리된 핵산은 5' 및 3' 플랭크 내에 각각의 조절성 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서(enhancer), 폴리-A 부가 시그널, 및 천연 유전자로부터의 기타 서열을 지닐 수 있다.

"분리된" 핵산은 실질적으로 순수한, 예를 들면, 리보솜, 폴리머라제 및 유 래 종으로부터의 플랭킹(flanking) 게놈 서열과 같은 본래의 서열을 천연 상태로 수반하는 기타 성분들로부터 분리되는 핵산, 예를 들면, RNA, DNA 또는 혼합된 중합체이다. 이 용어는 이의 천연 환경으로부터 제거시킨 핵산 서열을 포괄하고, 이에는 천연 조성물과는 식별 가능한 재조합 또는 클론된 DNA 분리물, 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체가 포함된다. 실질적으로 순수한 분자에는 완전히 순수하거나 실질적으로 순수한, 분자의 분리된 형태가 포함된다.

분리된 핵산은 일반적으로, 동종 분자 조성물일 것이지만, 몇몇 양태에서는, 이종성을 바람직하게는 약간 지닐것이다. 이러한 이종성은 전형적으로, 목적하는 생물학적 기능이나 활성에 중요하지 않는 중합체 말단 또는 부분에서 발견된다.

"재조합" 핵산은 전형적으로, 이의 제조 방법이나 이의 구조로써 정의된다. 예를 들면, 특정 생성물을 특정 공정에 의해 제조할 수 있는 이의 제조 방법을 참조로 하면, 상기 공정은, 예를 들어, 사람이 뉴클레오티드 서열에 간섭하는 것을 포함하는 재조합 핵산 기술을 사용한다. 전형적으로, 이러한 간섭은 시험관내 조작을 수반하지만, 특정 상황하에서는, 보다 전통적인 동물 육종 기술을 수반할 수 있다. 또 다른 한편, 이는, 천연 상태에서는 서로 연속되지 않지만, 천연 생성물, 예를 들면, 이들의 천연 상태에서 발견되는 바와 같은 천연의 돌연변이체는 배제시킨 두 단편의 융합물을 포함하는 서열을 생성시킴으로써 만든 핵산일 수 있다. 따라서, 예를 들면, 천연이 아닌 벡터로 세포를 형질전환시킴으로써 만든 생성물이 포괄되는데, 이는 대부분의 합성 올리고뉴클레오티드 공정을 사용하여 유도된 서열 을 포함하는 핵산에서와 같다. 이러한 공정은 제한 효소 서열 인식 부위를 전형적으로 도입하거나 제거시키면서, 한 코돈을 동일한 아미노산 또는 보존적 아미노산을 암호화하는 중복 코돈으로 대체시키기 위해 종종 수행된다. 또 다른 한편, 상기 공정은 목적하는 기능의 핵산 분절을 함께 연결시키기 위해 수행되어, 통상의 입수 가능한 천연 형태에서는 발견되지 않는 목적하는 기능 조합물을 포함하는, 예를 들어, 융합 단백질을 암호화하는 단일 유전적 실체를 생성시킨다. 제한 효소 인식 부위가 종종 이러한 인공적 조작의 표적이긴 하지만, 기타 부위 특이적 표적물, 예를 들면, 프로모터, DNA 복제 부위, 조절 서열, 제어 서열 또는 기타 유용한 특징물을 고안하여 혼입할 수 있다. 유사한 개념이 재조합(예를 들면, 융합) 폴리펩티드에 대해서도 적용된다. 이는 이량체성 반복체를 포함할 것이다. 유전 암호 중복성에 의해, OX2 수용체 동족체의 단편 및 각종 상이한 관련 분자, 예를 들면, 기타 Ig 상과 구성원으로부터의 서열 융합물과 등가의 폴리펩티드를 암호화하는 합성 핵산이 구체적으로 포함된다.

핵산 맥락에서의 "단편"은 약 17개 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로 21개 이상의 뉴클레오티드, 보다 일반적으로 25개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로 30개 이상의 뉴클레오티드, 보다 통상적으로 35개 이상의 뉴클레오티드, 종종 39개 이상의 뉴클레오티드, 보다 종종 45개 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로 50개 이상의 뉴클레오티드, 보다 전형적으로 55개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로 60개 이상의 뉴클레오티드, 보다 통상적으로 66개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 72개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 79개 이상의 뉴클레오티드, 특히 바람 직하게는 85개 이상의 뉴클레오티드의 연속된 분절이다. 전형적으로, 상이한 유전 서열의 단편은 적당한 길이의 연장물, 특히 다음에 기재된 도메인과 같이 규정된 분절에 걸쳐 서로에 대해 비교할 수 있다.

OX2R 동족체를 암호화하는 핵산은 그 자체를 암호화하거나 밀접하게 관련된 단백질을 암호화하는 유전자, mRNA 및 cDNA 종 뿐만 아니라, 예를 들어, 상이한 개개인 또는 관련 종으로부터의 다형성, 대립유전자성 또는 기타 유전적 변이체를 암호화하는 DNAs를 동정하는데 특히 유용할 것이다. 이러한 스크린에 바람직한 프로브는 상이한 다형성 변이체들 간에 보존되거나 특이성이 결여된 뉴클레오티드를 함유하는 수용체 동족체의 영역이고, 이는 바람직하게는 완전한 길이 또는 거의 완전한 길이일 것이다. 기타 상황하에서는, 다형성 변이체 특이적 서열이 보다 유용할 것이다. 정량화 또는 특이적 서열 분석은 질병 또는 의학 상태에 대한 마커(marker)로서 유용할 수 있거나, 또는 특정한 치료학적 처치를 선택하는데 유용할 수 있다.

본 발명은 추가로, 본원에 제시된 분리된 DNA와 동일하거나 이와 고도로 상동성인 핵산 서열을 갖는 재조합 핵산 분자 및 단편을 포괄한다. 특히, 상기 서열은 종종, 전사, 해독 및/또는 DNA 복제를 조절하는 DNA 분절과 작동적으로 연결될 것이다. 이들 부가의 분절은 전형적으로, 목적하는 핵산 분절의 발현을 도와준다.

서로 비교해 볼때, 상동성이거나 고도로 동일한 핵산 서열, 예를 들면, OX2RH 서열은 상당한 유사성을 나타낸다. 핵산 상동률에 대한 표준은 당해 분야에서 일반적으로 사용된 서열 비교에 의한 상동률 측정이나 하이브리드화 조건에 근 거한 측정이다. 비교 하이브리드화 조건이 다음에 보다 상세히 기재되어 있다.

핵산 서열 비교 맥락에서의 실질적인 동일성은 분절 또는 이들의 상보쇄를 비교해 볼때, 이들이 최적으로 정렬된 경우에, 예를 들면, 다음에 기재된 분절과 같은 구조적 도메인을 암호화하는 분절을 포함한 적당한 뉴클레오티드 삽입물 또는 결실물과, 뉴클레오티드의 약 60% 이상, 일반적으로 66% 이상, 통상적으로 71% 이상, 종종 76% 이상, 보다 종종 80% 이상, 통상적으로 84% 이상, 보다 통상적으로 88% 이상, 전형적으로 91% 이상, 보다 통상적으로 약 93% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 더욱 바람직하게는 약 96 내지 98% 이상, 특히 바람직하게는 약 99% 이상이 동일한 것을 의미한다. 또 다른 한편, 실질적인 동일성은, 상기 분절이 선택적인 하이브리드화 조건 하에서, 전형적으로 표 1 내지 3으로부터 유도된 서열을 사용하여 특정 쇄 또는 이의 보체와 하이브리드화될 경우에 존재할 것이다. 전형적으로, 선택적인 하이브리드화는 약 14개 이상의 뉴클레오티드의 연장물에 걸쳐 약 55% 이상, 보다 전형적으로는 약 65% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 상동률을 나타내는 경우에 일어날 것이다[참조: Kanehisa (1984) Nucl. Acids Res. 12:203-213; 이는 본원에 참조문헌으로 삽입된다]. 기재된 바와 같은 상동률 비교 길이는 보다 긴 연장물에 걸친 것일 수 있으며, 특정 양태에서는, 이것이 약 17개 이상의 뉴클레오티드, 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로 약 24개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로 약 28개 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로 약 32개 이상의 뉴클레오티드, 보다 통상적으로 약 40개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하 게는 약 75 내지 100개 이상의 뉴클레오티드의 연장물에 걸친 것이다. 이에는 예를 들면, 125, 150, 175, 200, 225, 246, 273, 300, 325, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900개 등의 길이가 포함된다.

하이브리드화 맥락의 상동률을 참조로 하면, 엄격한 조건은 염, 온도, 유기 용매, 및 하이브리드화 반응에서 전형적으로 제어된 기타 파라미터의 엄격한 조합 조건일 것이다. 엄격한 온도 조건에는 통상적으로 약 30℃ 초과 온도, 보다 통상적으로 약 37℃ 초과 온도, 전형적으로 약 45℃ 초과 온도, 보다 통상적으로 약 50℃ 초과 온도, 예를 들면, 55℃ 또는 60℃, 바람직하게는 약 65℃ 초과 온도, 보다 바람직하게는 약 70℃ 초과 온도가 포함될 것이다. 엄격한 염 조건은 통상적으로 약 1M 미만, 보다 통상적으로 약 500mM 미만, 통상적으로 약 400mM 미만, 보다 통상적으로 약 300mM 미만, 전형적으로 약 200mM 미만, 바람직하게는 약 100mM 미만, 보다 바람직하게는 약 80mM 미만, 예를 들면, 50mM 미만, 심지어 약 20mM 미만일 것이다. 그러나, 파라미터의 조합이 어떠한 단일 파라미터의 측정치 보다 훨씬 더 중요하다[참조: Wetmur and Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370; 이는 본원에 참조문헌으로 삽입됨].

분리된 DNA는 뉴클레오티드 치환, 뉴클레오티드 결실, 뉴클레오티드 삽입, 및 뉴클레오티드 연장물의 전위에 의해 용이하게 변형시킬 수 있다. 이들 변형으로 인해, 일반적으로 상기 단백질 또는 이의 유도체를 암호화하는 신규한 DNA 서열이 생성된다. 이와 같이 변형된 서열을 사용하여, 돌연변이체 단백질(돌연변이 단백질)을 생성시키거나 변이체 종의 발현을 증진시킬 수 있다. 발현 증진은 유전자 증폭, 전사 증가, 해독 증가, 및 기타 기전을 수반할 수 있다. 이러한 돌연변이체 OX2R 동족체 유도체에는 유전 암호 변성을 이용한 침묵 돌연변이를 포함한, 상기 단백질 또는 이의 단편의 예정되거나 부위-특이적인 돌연변이가 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 "돌연변이체 OX2 수용체 동족체"는 상기 언급된 바와 같은 OX2 수용체 동족체의 정의 내에 속하지만, 결실, 치환 또는 삽입을 통해서, 천연상 발견되는 것과 같은 기타 Ig 상과 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포괄한다. 특히, "부위 특이적 돌연변이체 OX2 수용체 동족체"는 표 1 내지 3의 단백질과 실질적인 서열 동일성을 지니는 단백질을 포괄하고, 전형적으로 본원에 기재된 형태의 생물학적 활성 또는 효과(예: 면역원성)의 일부 또는 대부분을 공유하고 있다.

부위 특이적 돌연변이 부위가 예정된 것이긴 하지만, 돌연변이체가 부위 특이적일 필요는 없다. 포유류 OX2 수용체 동족체 돌연변이 유발은 발현과 결부시켜, 유전자 내에 아미노산 삽입 또는 결실을 만듦으로써 달성할 수 있다. 치환물, 결실물, 삽입물 또는 많은 조합물이 생성되도록 하여 최종 작제물에 도달할 수 있다. 삽입물에는 아미노- 또는 카복시-말단 융합물이 포함된다. 무작위 돌연변이 유발은 표적 코돈에서 수행할 수 있고, 이어서 발현된 포유류 OX2RH 돌연변이체를 대상으로 하여 목적하는 활성에 대해 스크리닝할 수 있으며, 이로써 구조-활성 관계의 몇몇 국면이 제공된다. 공지된 서열을 갖는 DNA 중의 예정된 부위에서 치환 돌연변이를 만드는 방법, 예를 들면, M13 프라이머 돌연변이 유발 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다[참조: Sambrook, et al. (1989) and Ausubel, et al. (1987) and periodic Supplements].

DNA 내의 돌연변이는 암호화 서열을 판독 프레임으로부터 벗어나서 위치시키지 말아야 하고, 바람직하게는 루프 또는 헤어핀과 같은 2차 mRNA 구조를 생성시키도록 하이브리드화할 수 있는 상보적 영역을 생성시키지 않을 것이다.

문헌[참조: Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862]에 기재된 포스포르아미다이트 방법은 적합한 합성 DNA 단편을 생성시킬 것이다. 상보 쇄를 합성한 다음 이러한 쇄를 적당한 조건 하에서 함께 어닐링(annealing)시키거나, 또는 적당한 프라이머 서열을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보 쇄를 가함으로써 이중가닥 단편을 종종 수득할 것이다.

폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술을 종종 돌연변이 유발에 적용할 수 있다. 또 다른 한편, 돌연변이 유발 프라이머가 예정된 부위에서 규정된 돌연변이를 발생시키는 방법에 통상적으로 사용된다[참조: Innis, et al. (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA; and Dieffenbach and Dveksler (1995; eds.) PCR Primer: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY].

본 발명의 특정 양태는 본원에 기재된 수용체 동족체 또는 리간드 서열을 포함하는 조합 조성물에 관한 것이다. 기타 양태에서는, 이러한 서열의 기능성 부분을 연결하여 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 기타 형태에서는, 기재된 서열의 변이체가 치환될 수 있다.

IV. 단백질, 펩티드

상기 언급된 바와 같이, 본 발명은, 예를 들어, 이의 서열이 표 1 내지 3 및 상기 언급된 포유류 OX2RH 폴리펩티드를 포괄한다. 상기 서열과, 예를 들어, 에피토프 태그, 기능성 도메인, 및 DAP12 또는 DAP10 서열을 포함한 기타 서열과의 융합 단백질 결합 부분을 포함한, 대립유전자성 및 기타 변이체 폴리펩티드가 또한 고려된다.

본 발명은 또한, 영장류 또는 설치류 단백질로부터의 분절을 사용하여 재조합 단백질, 예를 들면, 이종 융합 단백질을 제공한다. 이종 융합 단백질은 천연적으로는 동일한 방식으로 융합되지만 정상적으로는 동일한 방식으로 융합되지 않는 단백질 또는 분절의 융합물이다. 따라서, 2개의 OX2RHs의 융합 생성물은 전형적인 펩티드 연결로 융합된 서열을 가지고, 전형적으로 단일 해독 산물로서 만들어지며, 각 공급원 펩티드로부터 유도된 서열 또는 항원성 등의 특성을 나타내는 연속되는 단백질 분자이다. 유사한 사상이 이종 핵산 서열에도 적용된다. 복합체 내로의 각종 명칭의 단백질의 조합물이 또한 제공된다.

또한, 종 변이체를 포함한 기타 관련 단백질, 예를 들면, 기타 ITIM, ITAM 또는 YxxM 모티프 함유 수용체로부터 유사한 기능적 또는 구조적 도메인을 결합함으로써 신규한 작제물을 제조할 수 있다. 예를 들면, 리간드-결합성 또는 기타 분절은 상이한 신규한 융합 폴리펩티드 또는 분절 사이에 "스와핑"시킬 수 있다[참조: Cunningham, et al. (1989) Science 243:1330-1336; and O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992; 이들 각각은 본원에 참조문헌으로 삽입된다]. 따라서, 신규한 특이성 조합을 나타내는 신규한 키메릭 폴리펩티드가 수용체 -결합성 특이성의 기능적 연결로부터 발생될 것이다. 예를 들면, 기타 관련된 수용체 동족체 분자로부터의 리간드 결합성 도메인을 가하거나 또는 상기 단백질 또는 관련 단백질의 기타 도메인으로 치환할 수 있다. 이로써 생성된 단백질은 종종 하이브리드 기능과 특성을 지닐 것이다. 예를 들면, 융합 단백질은 특정한 아세포성 세포 소기관에 대한 융합 단백질의 봉쇄를 제공하도록 작용할 수 있는 표적화 도메인을 포함할 수 있다.

후보 융합 파트너 및 서열은 각종 서열 데이터 베이스(예를 들면, GenBank, c/o IntelliGenetics, Mountain View, CA; 및 BCG, University of Wisconsin Biotechnology Computing Group, Madison, WI; 각각 본원에 참조로써 삽입됨)로부터 선택할 수 있다. 특히, 표 1 내지 3에 제공된 폴리펩티드 서열의 조합물이 특히 바람직하다. 각종 형태의 단백질이 기재된 조합물에서 치환될 수 있다.

본 발명은 특히, OX2-유사 리간드와 결합되고/되거나 시그널 형질도입에 영향을 미치는 돌연변이 단백질을 제공한다. OX2 수용체 동족체 계열의 각종 구성원의 구조적 정렬은 보존된 형질/잔기를 나타낸다(표 5 참조). OX2R 동족체 서열의 정렬은 각종의 구조적 및 기능적으로 공유된 형질을 지시하고 있다[참조: Bazan, et al. (1996) Nature 379:591; Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1766; Sayle and Milner-White (1995) TIBS 20:374-376; and Gronenberg, et al. (1991) Protein Engineering 4:263-269].

마우스 서열이나 사람 서열로의 치환이 특히 바람직하다. 이와 반대로, 리간드 결합성 상호작용 영역으로부터 벗어나는 보존적 치환은 아마도, 대부분의 시 그널링 활성을 보존할 것이며; 세포내 도메인으로부터 벗어나는 보존적 치환은 아마도, 대부분의 리간드 결합 특성을 보존할 것이다.

포유류 OX2RH의 "유도체"에는 아미노산 서열 돌연변이체, 글리코실화 변이체, 대사적 유도체, 및 기타 화학적 잔기와의 공유적 또는 응집성 접합체가 포함된다. 공유적 유도체는, 예를 들면, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해, OX2RH 아미노산 측쇄 또는 N- 또는 C-말단에서 발견되는 그룹에 작용기를 연결함으로써 제조할 수 있다. 이들 유도체에는 카복실 말단의 지방족 에스테르 또는 아미드, 카복실 측쇄를 함유하는 잔기의 지방족 에스테르 또는 아미드, 하이드록실 그룹 함유 잔기의 O-아실 유도체, 및 아미노 말단 아미노산 또는 아미노 그룹 함유 잔기, 예를 들면, 리신 또는 아르기닌의 N-아실 유도체가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 아실 그룹은 C3 내지 C18 알킬을 포함한 알킬 잔기 그룹 중에서 선택함으로써, 알카노일 아로일 종을 형성시킨다.

특히, 예를 들면, 특정 폴리펩티드의 합성 및 프로세싱 동안, 또는 추가의 프로세싱 단계에서, 이러한 폴리펩티드의 글리코실화 패턴을 변형시킴으로써 제조된 글리코실화 변형물이 또한 포함된다. 이를 수행하는데 특히 바람직한 방법은 상기 프로세싱을 정상적으로 제공해주는 세포로부터 유도된 글리코실화 효소, 예를 들면, 포유류 글리코실화 효소에 상기 폴리펩티드를 노출시키는 것이다. 탈글리코실화 효소가 또한 고려된다. 또한, 인산화 아미노산 잔기, 예를 들면, 포스포티로신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌을 포함한, 기타 부 변형물을 갖는 동일한 1차 아미노산 서열의 변형물이 포괄된다.

유도체의 주요 그룹은 당해 수용체 동족체 또는 이의 단편과 폴리펩티드의 기타 단백질과의 공유적 접합체이다. 이들 유도체는 N- 또는 C-말단 융합물과 같은 재조합 배양물에서 합성할 수 있거나, 또는 반응성 측쇄 그룹을 통하여 가교 결합성 단백질에 유용한 것으로 당해 분야에 공지된 제제를 사용함으로써 합성할 수 있다. 가교 결합제를 이용하여 유도체화하는데 바람직한 부위는 자유 아미노 그룹, 탄수화물 잔기 및 시스테인 잔기 부위이다.

수용체 동족체와 기타 동종 또는 이종 단백질 간의 융합 폴리펩티드가 또한 제공된다. 동종 폴리펩티드는, 예를 들면, 다중의 상이한 OX2 관련 리간드에 대한 결합 특이성을 나타내는 하이브리드 단백질, 또는 확대되거나 약화된 기질 효과 특이성을 지닐 수 있는 수용체를 생성시키는, 상이한 수용체들 간의 융합물일 수 있다. 마찬가지로, 유도체 단백질의 조합 특성 또는 활성을 나타낼 수도 있는 이종 융합물을 작제할 수 있다. 전형적인 예는 리포터 폴리펩티드, 예를 들면, 루시퍼라제와 수용체의 특정 분절 또는 도메인, 예를 들면, 리간드-결합성 분절과의 융합물이므로, 목적하는 리간드의 존재 또는 위치를 용이하게 결정할 수 있다[참조: Dull, et al. 미국 특허 제4,859,609호; 이는 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 기타 유전자 융합 파트너에는 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST), 세균성 β-갈락토시다제, trpE, 단백질 A, β-락타마제, 알파 아밀라제, 알코올 데하이드로게나제 및 효모 알파 교배 인자가 포함된다[참조: Godowski, et al. (1988) Science 241:812-816]. 표지된 단백질은 종종, 기재된 단백질 조합물에서 치환될 것이다.

문헌[참조: Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862] 에 기재된 포스포르아미다이트 방법은 적합한 합성 DNA 단편을 생성시킬 것이다. 상보 쇄를 합성한 다음 이러한 쇄를 적당한 조건 하에서 함께 어닐링시키거나, 또는 적당한 프라이머 서열을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보 쇄를 가함으로써 이중가닥 단편을 종종 수득할 것이다.

이러한 폴리펩티드는 또한, 인산화, 설폰화, 바이오티닐화에 의해 화학적으로 변형시키거나, 또는 기타 잔기, 특히 포스페이트 그룹과 유사한 분자 형태를 지닌 잔기를 부가하거나 제거함으로써 화학적으로 변형시킨 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 몇몇 양태에서는, 이러한 변형물이 유용한 표지화 시약이거나, 또는 정제 표적물, 예를 들면, 친화 리간드로서 작용할 것이다.

융합 단백질은 전형적으로, 재조합 핵산 방법 또는 합성 폴리펩티드 방법에 의해 제조될 것이다. 핵산 조작 및 발현 기술이 일반적으로, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, and Ausubel, et al. (eds. 1987 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로 삽입됨]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 합성 기술이, 예를 들면, 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156; Merrifield (1986) Science 232:341-347; and Atherton, et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로 삽입됨]. 보다 큰 폴리펩티드의 제조 방법이 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Dawson, et al. (1994) Science 266:776-779].

본 발명은 또한, 아미노산 서열 또는 글리코실화에 있어서, 변이물 이외의 OX2RH의 유도체의 용도를 고려하고 있다. 이러한 유도체는 화학적 잔기와의 공유적 또는 응집성 연합을 수반할 수 있다. 이들 유도체는 일반적으로, 다음 세 가지 부류에 속한다: (1) 염, (2) 측쇄 및 말단 잔기 공유적 변형물, 및 (3) 예를 들면, 세포막과의 흡착 복합체. 상기 공유적 또는 응집성 유도체는 면역원으로서 또는 면역검정에서의 시약으로서 유용하거나, 또는 수용체 또는 기타 결합성 분자, 예를 들면, 항체의 친화 정제와 같은 정제 방법에 유용하다. 예를 들면, OX2 리간드는, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로즈와 같은 고체 지지체에 공유 결합시킴으로써 고정화시키거나, 또는 OX2RH, 항체 또는 기타 유사한 분자의 검정이나 정제에 사용하기 위하여, 글루타르알데히드 가교결합시키거나 시키지 않으면서 폴리올레핀 표면 상으로 흡착시킬 수 있다. 상기 리간드는 또한, 검출 가능한 그룹으로 표지시키는데, 예를 들면, 클로라민 T 과정에 의해 방사성 요오드화시키거나, 희토류 킬레이트제에 공유적으로 결합시키거나, 또는 진단 검정에 사용하기 위하여 또 다른 형광성 잔기에 접합시킬 수 있다.

본 발명의 조합물(예를 들면, OX2RH를 포함함)은 특이적인, 예를 들면, 기타 OX2 수용체 동족체들 간을 구별할 수 있는 항혈청 또는 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용할 수 있거나, 또는 목적하는 조합 특이성을 위한 면역원으로서 사용할 수 있다. OX2RHs는 상기 단백질을 함유하는 각종 형태의 불순한 제제로 면역시킴으로써 제조된 모노클로날 항체 또는 항원-결합성 단편을 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 특히, 용어 "항체"는 또한, 천연 항체의 항원 결합성 단편, 예를 들면, Fab, Fab2, Fv 등을 포괄한다. 정제된 OX2RH는 또한, 내인성 수용체 동족체에 대한 항체 생성을 유발시키는 면역학적 장애, 또는 발현 수준 증가에 반응하여 생성된 항체를 검출하기 위한 시약으로서 사용할 수 있다. 부가적으로, OX2RH 단편은 바로 다음에 기재하는 바와 같이, 본 발명의 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 작용할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명은 표 1 내지 3에 제시된 아미노산 서열, 이의 단편, 또는 각종 상동 펩티드 또는 아세트에 대한 결합 친화성을 지니거나 이에 대해 생성된 항체를 고려한다. 특히, 본 발명은 본래의 OX2RH의 외부 단백질 표면에 노출되는 것으로 예상되거나 실제로 이에 노출된 특이적 단편에 대한 결합 친화성을 지니거나 이에 대해 생성된 항체를 고려한다. 단백질 조합 복합체가 또한 유용할 것이며, 이에 대한 항체 제제를 만들 수 있다.

수용체 리간드에 대한 생리학적 반응의 차단은, 아마도 경쟁적 억제를 통하여 수용체에 대한 리간드의 결합을 억제시키거나, 또는 항체 결합으로 인해 수용체 발현을 하향 조절함으로써 비롯될 수 있다. 따라서, 본 발명의 시험관내 검정은 종종, 항체 또는 이들 항체의 항원 결합성 분절, 또는 고체 상 기질에 부착된 단편을 이용할 것이다. 이들 검정은 리간드 결합성 영역 돌연변이와 변형, 또는 시그널링 또는 효소 기능에 영향을 미치는 기타 돌연변이와 변형 효과를 진단적으로 결정해줄 수 있을 것이다.

본 발명은 또한, 예를 들어, 수용체 복합체 또는 단편에 대한 중화 항체가 리간드 또는 기타 항체와 결합하기 위해 시험 화합물과 경쟁하는 경쟁적 약물 스크 리닝 검정의 용도를 고려한다. 이러한 방식으로, 중화 항체 또는 단편을 사용하여, 수용체에 대한 하나 이상의 결합성 부위를 공유하는 폴리펩티드의 존재 여부를 검출할 수 있으며, 상기 중화 항체 또는 단편을 또한 사용하여, 리간드와 결합할지도 모르는 수용체 상의 결합 부위를 점유할 수 있다.

V. 핵산 및 단백질 제조 방법

당해 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA는 화학적으로 합성하거나, cDNA 라이브러리를 스크리닝하거나 또는 광범위한 세포주 또는 조직 샘플로부터 제조된 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 예를 들면, 표 1 내지 3에 제공된 서열 및 표준 방법을 사용하여 천연 서열을 분리시킬 수 있다. 역해독 서열이 표 4에 제공되어 있다. 하이브리드화 기술, 조합된 각종 PCR 기술, 또는 서열 데이터베이스(예: GenBank)에서 조사함으로써 기타 종 대응물을 동정할 수 있다. 종 대응물 상에서 발현 클로닝 작업을 수행하는데 항체를 사용할 수 있다.

이러한 DNA는 예를 들어, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생성시키는데 사용될 수 있는 완전한 길이의 수용체 또는 단편을 합성하기 위해; 결합성 연구를 위해; 변형된 리간드 결합성 또는 키나제/포스파타제 도메인의 작제 및 발현을 위해; 및 구조/기능 연구를 위해, 광범위한 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 적당한 발현 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킨 숙주 세포에서 변이체 또는 단편을 발현시킬 수 있다. 이들 분자는 재조합 숙주로부터 유도된 것 이외에, 단백질이나 세포성 오염물을 거의 함유하지 않을 수 있으므로, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제와 조합될 때 약제학적 조성물에 특히 유용하다. 단백질 또는 이의 부분은 기타 단백질과의 융합물로서 발현시킬 수 있다. 본원에 기재된 단백질의 조합물, 또는 이를 암호화하는 핵산이 특히 흥미롭다.

발현 벡터는 전형적으로, 적합한 숙주 세포에서 인식되는 적합한 유전 조절 인자에 통상 작동적으로 연결되는, 목적하는 수용체 동족체 유전자 또는 이의 단편을 함유하는 자가 복제성 DNA 또는 RNA 작제물이다. 이들 조절 인자들은 적합한 숙주 내에서의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 다중 유전자가 배위적으로 발현될 수 있고, 폴리시스트론성 메시지 상에 존재할 수 있다. 발현시키는데 필요한 특정 유형의 조절 인자들은 사용된 궁극적인 숙주 세포에 좌우될 것이다. 일반적으로, 유전 조절 인자에는 원핵성 프로모터 시스템 또는 진핵성 프로모터 발현 조절 시스템이 포함될 수 있으며, 이에는 전형적으로 전사 프로모터, 전사 개시를 조절하기 위한 임의의 작동인자, mRNA 발현 수준을 상승시키기 위한 전사 인핸서, 적합한 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 해독을 종결시키는 서열이 포함된다. 발현 벡터는 또한, 통상적으로 벡터가 숙주 세포와 독립적으로 복제하도록 해주는 복제 기점을 함유한다.

본 발명의 벡터에는 기재된 바와 같은 단백질의 조합물, 또는 생물학적 활성 등가의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 함유하는 벡터가 포함된다. 이러한 DNA는 바이러스성 프로모터의 조절 하에 있을 수 있고, 선별 마커를 암호화할 수 있다. 본 발명은 추가로, 원핵성 또는 진핵성 숙주에서 상기 단백질을 암호화하는 진핵성 cDNA를 발현할 수 있는 상기 발현 벡터의 용도를 고려하는데, 여기서 상기 벡터는 숙주와 화합성이고, 상기 벡터를 함유하는 숙주의 성장이 문제의 cDNA를 발현하도 록 상기 진핵성 cDNA를 상기 벡터 내로 삽입한다. 통상적으로, 발현 벡터는 이들의 숙주 세포에서 안정적으로 복제하도록 고안되거나, 또는 세포당 목적하는 유전자의 복사물 총 수를 상당히 증가시키기 위해 증폭시키도록 고안된다. 발현 벡터가 숙주 세포에서 항상 복제될 필요는 없는데, 예를 들면, 숙주 세포에 의해 인식되는 복제 기점을 함유하지 않은 벡터를 사용하여 각종 숙주에서 상기 단백질 또는 이의 단편을 일시적으로 발현시키는 것이 가능하다. 또한, 상기 단백질 암호화 부분을 재조합에 의해 숙주 DNA 내로 통합시킬 수 있는 벡터를 사용할 수도 있다.

본원에 사용된 바와 같은 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파아지, 통합 가능한 DNA 단편, 및 DNA 단편을 숙주의 게놈 내로 통합시킬 수 있는 기타 비히클을 포함한다. 발현 벡터는 작동적으로 연결된 유전자를 발현시키는 유전 조절 인자를 함유하는 특수 벡터이다. 플라스미드는 가장 통상적으로 사용되는 벡터 형태이지만, 등가의 기능을 제공해주고 당해 분야에 공지된 기타 모든 형태의 벡터가 본 발명에서 사용하기에 적합하다[참조: Pouwels, et al. (1985 and Supplements) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., and Rodriguez, et al. (eds. 1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston; 본원에 참조문헌으로 삽입됨].

형질전환된 세포는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제된 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킨 세포, 바람직하게는 포유류 세포이다. 형질전환된 숙주 세포는 통상적으로, 목적하는 단백질을 발현하지만, 이의 DNA를 클로닝, 증폭 및 조작하기 위해서라면, 대상 단백질을 발현시킬 필요는 없다. 본 발명은 추가로, 형질전환된 세포를 영양 배지에서 배양함으로써, 단백질을 축적시키는 것을 고려한다. 상기 단백질은 상기 배양물로부터 회수하거나, 또는 특정 경우에는, 배양 배지로부터 회수할 수 있다.

본 발명의 목적상, 핵산 서열은 이들이 서로 기능적으로 관련이 있을 경우에 작동적으로 연결된다. 예를 들면, 프레서열 또는 분비성 리더에 대한 DNA는, 이것이 프레단백질로서 발현되거나 또는 특정 폴리펩티드를 세포막에 지시하거나 이러한 폴리펩티드를 분비하는데 관여한 경우에, 상기 폴리펩티드에 작동적으로 연결된다. 프로모터는, 이것이 폴리펩티드의 전사를 조절하는 경우에 암호화 서열에 작동적으로 연결되고; 리보솜 결합 부위는, 이것이 해독을 허용하도록 위치되는 경우에 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 통상적으로, 작동적으로 연결된이란 판독 프레임 내에 연속해서 존재하는 것을 의미하지만, 억제인자 유전자와 같은 특정의 유전 인자는 연속해서 연결되지는 않지만, 발현을 조절해주는 작동인자 서열에 여전히 결합되어 있다.

적합한 숙주 세포에는 원핵 생물, 하등 진핵 생물 및 고등 진핵 생물이 포함된다. 원핵 생물에는 그람 음성 및 그람 양성 유기체, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 및 비. 서브틸리스(B. subtilis)가 포함된다. 하등 진핵 생물에는 효모, 예를 들면, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 및 피치아(Pichia), 및 딕티오스텔륨(Dictyostelium) 속의 종이 포함된다. 고등 진핵 생물에는 비-포유류 기원의 동물 세포, 예를 들면, 곤충 세포 및 조류 세포와 포유류 기원의 동물 세포, 예를 들면, 사람, 영장류 및 설치류 세포 모두로부터의 정착된 조직 배양 세포주가 포함된 다.

원핵성 숙주-벡터 시스템에는 상이한 많은 종에 대한 광범위한 벡터가 포함된다. 이. 콜라이 및 이의 벡터가 기재될 것이지만, 등가의 벡터 및 숙주가 일반적으로 대체될 수 있다. DNA를 증폭시키기 위한 대표적인 벡터는 pBR322 또는 수 많은 이의 유도체일 수 있다. 당해 수용체 동족체 또는 이의 단편을 발현시키기 위해 사용될 수 있는 벡터에는 lac 프로모터를 함유하는 벡터(pUC-시리즈); trp 프로모터를 함유하는 벡터(pBR322-trp); Ipp 프로모터를 함유하는 벡터(pIN-시리즈); 람다-pP 또는 pR 프로모터를 함유하는 벡터(pOTS); 또는 ptac 등의 하이브리드 프로모터를 함유하는 벡터(pDR540)가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다[참조: Brosius, et al. (1988) "Expressin Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", in Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, (eds. Rodriguez and Denhardt), Buttersworth, Boston, Chapter 10, pp. 205-236; 본원에 참조문헌으로 삽입됨].

하등 진핵 생물, 예를 들면, 효모 및 딕티오스텔륨은 OX2RH 서열 함유 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 가장 대중적인 하등 진핵성 숙주는 제빵용 효모인 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다. 이는 하등 진핵 생물을 예시하기 위해 사용될 것이지만, 많은 기타 균주 및 종이 또한 이용될 수 있다. 효모 벡터는 전형적으로, 복제 기점(통합형이 아닌 경우), 선별 유전자, 프로모터, 당해 수용체 동족체 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA, 및 해독 종결, 폴리아데닐화 및 전사 종결용 서열로 이루어진다. 효모에 적합한 발현 벡터에는 3-포스포글 리세레이트 키나제 및 각종의 기타 당분해성 효소 유전자 프로모터와 같은 구성성 프로모터, 또는 알코올 데하이드로게나제 2 프로모터 또는 메탈로티오닌 프로모터와 같은 유도성 프로모터가 포함된다. 적합한 벡터에는 다음 유형의 유도체가 포함된다: 자가 복제성 저 복사수(예: YRp-시리즈), 자가 복제성 고 복사수(예: YEp-시리즈); 통합 유형(예: YIp-시리즈), 또는 미니-염색체(예: YCp-시리즈).

고등 진핵성 조직 배양 세포는 정상적으로, 기능적 활성 OX2RH 단백질의 발현에 바람직한 숙주 세포이다. 원칙적으로, 많은 고등 진핵성 조직 배양 세포주, 예를 들면, 무척추동물 공급원으로부터든지 아니면 척추동물 공급원으로부터든지 간에, 곤충 바쿨로바이러스 발현 시스템이 작동 가능한다. 그러나, 포유류 세포가 바람직하다. 이러한 세포의 형질전환 또는 형질감염과 증식은 통상적인 과정이 되었다. 유용한 세포주의 예로는 HeLa 세포, 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포주, 갓난 랫트 신장(BRK) 세포주, 곤충 세포주, 조류 세포주 및 원숭이(COS) 세포주가 있다. 이러한 세포주에 대한 발현 벡터에는 통상적으로, 복제 기점, 프로모터, 해독 개시 부위, RNA 스플라이스 부위(게놈성 DNA가 사용된 경우), 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 부위가 포함된다. 이들 벡터는 또한 통상적으로, 선별 유전자 또는 증폭 유전자를 함유한다. 적합한 발현 벡터는, 예를 들어, 아데노바이러스, SV40, 파보바이러스, 백시니아 바이러스 또는 사이토메갈로바이러스와 같은 공급원으로부터 유도된 프로모터를 수반하는 레트로바이러스, 플라스미드 또는 바이러스일 수 있다. 적합한 발현 벡터의 대표적인 예에는 pCDNA1; pCD[참조: Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142]; pMC1neo 폴리A[참조: Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512]; 및 pAC 373 또는 pAC 610 등의 바쿨로바이러스 벡터가 포함된다.

분비된 단백질 및 몇몇 막 단백질의 경우, 개방 판독 프레임은 통상적으로, 이의 N-말단에서 시그널 펩티드에 작동적으로 연결된 성숙하거나 분비된 생성물로 이루어진 폴리펩티드를 암호화한다. 이러한 시그널 펩티드는 성숙하거나 활성인 폴리펩티드의 분비 이전에 절단된다. 상기 절단 부위는 실험 공식으로부터 고 정밀도로 예견할 수 있다[참조: von-Heijne (1986) Nucleic Acids Research 14:4683-4690, and Nielsen, et al. (1997) Protein Eng. 10:1-12]. 시그널 펩티드의 정확한 아미노산 조성은 종종, 이의 기능에 중요한 것으로 여겨지지 않는다[참조: Randall, et al. (1989) Science 243:1156-1159; Kaiser, et al. (1987) Science 235:312-317]. 본 발명의 성숙한 단백질은 표준 방법을 사용하여 용이하게 결정할 수 있다.

특이하거나 규정된 글리코실화 패턴을 제공해주는 시스템에서 이들 폴리펩티드를 발현하는 것이 종종 바람직할 것이다. 이러한 경우, 통상의 패턴은 발현 시스템에 의해 천연상 제공되는 것일 것이다. 그러나, 이러한 패턴은 상기 폴리펩티드, 예를 들면, 글리코실화되지 않은 형태를, 이종 발현 시스템 내로 도입된 적당한 글리코실화 단백질에 노출시킴으로써 변형시킬 수 있을 것이다. 예를 들면, OX2RH 유전자는 포유류 또는 기타 글리코실화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자와 함께 형질전환시킬 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 특정의 포유류 글리코실화 패턴이 원핵 생물 또는 기타 세포에서 달성될 수 있을 것이다. 원핵 생물 세포에서의 발현은 전형적으로, 글리코실화되지 않은 형태의 단백질을 유도할 것이다.

OX2RH의 공급원은 상기 언급된 바와 같은 재조합 폴리펩티드를 발현하는 진핵성 또는 원핵성 숙주일 수 있다. 이 공급원은 세포주일 수 있지만, 기타 포유류 세포주가 또한 본 발명에 의해 고려되며, 바람직한 세포주는 사람 종 기원이다.

그 서열이 공지되어 있기 때문에, 영장류 OX2RH, 이의 단편 또는 유도체는 통상적인 펩티드 합성 방법으로 제조할 수 있다. 이들 방법에는 각각이 본원에 참조문헌으로 삽입된 다음 문헌에 기재된 바와 같은 방법이 포함된다[참조: Stewart and Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky and Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; and Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York]. 예를 들면, 아지드 방법, 산 클로라이드 방법, 산 무수물 방법, 혼합 무수물 방법, 활성 에스테르 방법(예를 들면, p-니트로페닐 에스테르, N-하이드록시석신이미드 에스테르, 또는 시아노메틸 에스테르), 카보디이미다졸 방법, 산화적-환원적 방법 또는 디사이클로헥실카보디이미드(DCCD)/부가적 방법을 사용할 수 있다. 고체 상 및 용액 상 합성법 둘 다가 전술한 방법에 적용될 수 있다. 부분적 OX2RH 서열을 이용하는 유사한 기술이 사용될 수 있다.

OX2RH 단백질, 단편 또는 유도체는, 일반적으로 아미노산을 말단 아미노산에 하나씩 차례로 축합시키는 것을 포함하는 소위 단계식 공정에 의해서 또는 펩티드 단편을 말단 아미노산에 커플링시킴으로써, 펩티드 합성에 전형적으로 이용된 바와 같은 상기 방법에 따라서 적합하게 제조한다. 커플링 반응에 사용되지 않는 아미노 그룹은 전형적으로, 부정확한 위치에서의 커플링을 방지하도록 보호시켜야만 한다.

고체 상 합성법이 채택된 경우, C-말단 아미노산을 이의 카복실 그룹을 통하여 불용성 운반체 또는 지지체에 결합시킨다. 이러한 불용성 운반체는 반응성 카복실 그룹과 결합하는 능력을 지녀야 하는데, 예를 들면, 할로메틸 수지, 예를 들면, 클로로메틸 수지 또는 브로모메틸 수지, 하이드록시메틸 수지, 페놀 수지, 3급-알킬옥시카보닐하이드라지드화 수지 등이다.

아미노 그룹-보호된 아미노산은 이의 활성화 카복실 그룹과 앞서 형성된 펩티드 또는 쇄의 반응성 아미노 그룹 간의 축합을 통하여 차례 차례로 결합되어 상기 펩티드를 단계식으로 합성한다. 완전한 서열을 합성한 후, 상기 펩티드를 불용성 운반체로부터 분할하여 펩티드를 생성시킨다. 이러한 고체 상 접근법은 일반적으로 본원에 참조문헌으로써 삽입된 문헌[참조: Merrifield, et al. (1963) in J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156]에 기재되어 있다.

제조된 단백질 및 이의 단편은 펩티드 분리 방법, 예를 들면, 추출, 침전, 전기영동, 각종 형태의 크로마토그래피 등을 통하여 반응 혼합물로부터 분리 및 정제할 수 있다. 본 발명의 수용체 동족체는 목적하는 용도에 따라서 다양한 순도로 수득할 수 있다. 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 정제를 수행할 수 있거나, 또는 본원에 기재된 항체를 면역흡착 친화성 크로마토그래피 방법으로 정제할 수 있 다. 전형적으로, 친화성 크로마토그래피는 항체를 먼저 고체 지지체에 연결시킨 다음, 이와 같이 연결된 항체를, 적당한 세포의 가용화 용해물, OX2RH를 발현하는 기타 세포의 용해물, 또는 DNA 기술 결과로서 단백질을 생성시키는 세포의 용해물 또는 상등액과 접촉시킴으로써 수행한다(하기 참조).

일반적으로, 이와 같이 정제된 단백질은 순도가 약 40% 이상, 통상적으로 약 50% 이상, 통상적으로 약 60% 이상, 전형적으로 약 70% 이상, 더욱 전형적으로 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 특히 바람직하게는 97 내지 99% 이상일 것이다. 순도는 통상 중량을 기준으로 한 것이지만, 몰 기준으로 한 것일 수도 있다. 상이한 검정이 경우에 따라 적용될 것이다. 개개의 단백질을 정제한 후, 조합할 수 있다.

VI. 항체

항체는 천연의 본래 형태와 이들의 변성 형태 모두의 각종 포유류(예: 영장류) OX2RH 단백질 및 이의 단편에 대해 생성될 수 있다. 본래의 OX2RH에 대해 생성된 항체는 본래의 입체 구조에만 존재하는 에피토프를 보다 잘 인식하는 것으로 예상된다. 변성 항원 검출은, 예를 들어, 웨스턴(Western) 분석에 유용할 수도 있다. 예를 들어, 진단용 시약으로서 유용할 수 있는 항-유전자형 항체가 또한 고려된다.

결합성 단편 및 단일 쇄 변형물을 포함한, 단백질의 예정된 단편에 대한 항체는 상기 단편과 면역원성 단백질 간의 접합체로 동물을 면역시킴으로써 생성시킬 수 있다. 모노클로날 항체는 목적하는 항체를 분비하는 세포로부터 제조한다. 이 들 항체를 대상으로 하여, 정상적이거나 결함있는 단백질과 결합하는지에 대해 스크리닝하거나, 또는 효능 활성 또는 길항 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 이들 모노클로날 항체는 통상적으로 약 1mM 이상의 K_D, 보다 통상적으로 약 300μM 이상의 K_D, 전형적으로 약 100μM 이상의 K_D, 보다 전형적으로 약 30μM 이상의 K_D, 바람직하게는 약 10μM 이상의 K_D, 보다 바람직하게는 약 3μM 이상의 K_D로 결합될 것이다.

본 발명의 항체(항원 결합성 단편 포함)는 상당한 진단적 또는 치료적 가치를 지닐 수 있다. 이들은 수용체 동족체와 결합하고 리간드에 대한 결합을 억제하거나 상기 수용체 동족체가 생물학적 반응을 유도하는 능력, 예를 들면, 이의 기질 상에서 작용하는 능력을 억제시키는 강력한 길항제일 수 있다. 이들은 또한, 비-중화 항체로서 유용할 수 있고, 독소 또는 방사성핵종에 커플링되어 OX2RH 생성 세포와 결합할 수 있다. 추가로, 이들 항체는 약물이나 기타 치료제에 직접적 또는 간접적으로, 예를 들면, 링커(linker)를 통하여 접합될 수 있다.

본 발명의 항체는 또한, 진단 적용 분야에 유용할 수 있다. 포획물 또는 비-중화 항체로서, 이들은 리간드 또는 기질 결합을 억제시키지 않으면서 OX2RH과 결합할 수도 있다. 중화 항체로서, 이들은 경쟁적 결합 검정에 유용할 수 있다. 이들은 또한, 리간드를 검출하거나 정량화하는데 유용할 것이다. 이들은 웨스턴 블롯 분석용 시약, 또는 각각의 단백질의 면역침전 또는 면역정제용 시약으로서 사용할 수 있다. 마찬가지로, 친화성 정제 또는 검출 방법을 위해, 핵산과 단백질을 고체 기질에 고정화시킬 수 있다. 이러한 기질은, 예를 들면, 고체 수지 비드, 플라스틱 시트, 또는 유도체화 유리일 수 있다.

단백질 단편을 기타 물질, 특히 폴리펩티드에, 융합되거나 공유적으로 연결된 폴리펩티드로서 연결시켜, 이를 면역원으로서 사용할 수 있다. 포유류 OX2RH 폴리펩티드 및 단편을 각종 면역원, 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 소의 혈청 알부민, 파상풍 톡소이드 등에 융합시키거나 공유적으로 연결시킬 수 있다[참조: Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; and Williams, et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, Academic Press, New York; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로 삽입됨]. 전형적인 방법은 동물을 항원으로 초면역시키는 것을 포함한다. 이어서, 반복된 면역화 직후에 동물 혈액을 수집하고, 혈청 또는 감마 글로불린을 분리시킨다.

몇몇 경우에서는, 각종 포유류 숙주, 예를 들면, 마우스, 설치류, 영장류, 사람 등으로부터 모노클로날 항체를 제조하는 것이 바람직하다[참조: Stites, et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA 및 이에 인용된 참조문헌; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York; and particularly Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497; 이들 각각이 본원 에 참조문헌으로 삽입됨]. 간략하게 언급하면, 면역원을 동물에게 주사하여 면역 반응을 유도시킨다. 이어서, 상기 동물을 희생시키고, 이의 비장으로부터 세포를 취하고, 이를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성시킨다. 이어서, 하이브리도마 집단을 스크리닝하여, 상기 면역원과 결합하는 항체를 분비하는 개개의 클론을 분리시킨다.

기타 적합한 기술은 림프구를 항원성 폴리펩티드에 시험관내 노출시키거나, 또는 파아지 또는 유사한 벡터에서 항체 라이브러리를 선별하는 것을 포함한다[참조: Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246:1275-1281; and Ward, et al. (1989) Nature 341:544-546; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로 삽입됨]. 키메릭 또는 사람 적응화 항체를 생성할 수 있거나[참조: Cabilly의 미국 특허 제4,816,567호] 형질전환성 마우스에서 만들 수 있다[참조: Mendez, et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156]. 이들 문헌은 본원에 참조문헌으로 삽입된다.

폴리펩티드 및 항체를 종종 표지시킬 수 있다. 광범위한 표지물과 접합 기술이 공지되어 있고 과학지와 특허 문헌 모두에 광범위하게 보고되어 있다. 적합한 표지물에는 방사성핵종, 효소, 기질, 조인자, 억제인자, 형광성 잔기, 화학발광성 잔기, 자기 입자 등이 포함된다. 이러한 표지의 용도를 교시하는 특허에는, 예를 들면, 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호가 포함된다.

본 발명의 항체는 OX2RH 단백질 또는 펩티드를 분리하는데 있어서 친화성 크 로마토그래피하는데 사용될 수도 있다. 항체를 고체 지지체, 예를 들면, 입자, 예를 들어, 아가로즈, 세파덱스 등에 연결시킨 칼럼을 제조할 수 있는데, 여기서 세포 용해물을 이러한 칼럼 내로 통과시킬 수 있고, 이 칼럼을 세척한 다음, 순한 변성제의 농도를 증가시킴으로써, 정제된 단백질이 방출될 것이다. 또 다른 한편, 상기 단백질을 사용하여 항체를 정제할 수 있다. 적당한 교차 흡수 또는 고갈을 적용할 수 있다.

당해 항체를 사용하여 특정한 발현 생성물에 대한 발현 라이브러리를 스크리닝할 수도 있다. 통상적으로, 이러한 과정에 사용된 항체는 항체 결합에 의해 항원의 존재를 용이하게 검출해주는 잔기로 표지시킬 것이다.

OX2RH에 대해 생성된 항체는 또한, 항-유전자형 항체를 생성시키는데 사용될 것이다. 이들은 상기 단백질의 발현과 관련된 각종 면역학적 질환 또는 상기 단백질을 발현하는 세포를 검출하거나 진단하는데 유용할 것이다. 이들은 또한, 천연 리간드에 대한 경쟁적 억제인자이거나 대체물일 수 있는, 상기 리간드의 효능제 또는 길항제로서 유용할 것이다.

규정된 면역원, 예를 들면, 서열 2의 아미노산 서열로 이루어진 면역원에 대해 생성된 항체와 특이적으로 결합되거나 또는 이러한 항체와 특이적으로 면역반응성인 수용체 동족체 단백질은 전형적으로 면역검정으로 결정한다. 이러한 면역검정은 전형적으로, 예를 들어, 서열 2의 단백질에 대해 생성되는 폴리클로날 항혈청을 이용한다. 이러한 항혈청은, 바람직하게는 동일한 종으로부터의 기타 Ig 상과 수용체 구성원, 예를 들면, NKG2D에 대한 교차 반응성이 낮도록 선택되고, 면역검 정에 사용하기 이전에 면역흡착시킴으로써 어떠한 교차 반응성도 제거시킨다.

면역검정에 사용하기 위한 항혈청을 생성시키기 위해서는, 예를 들어, 서열 2의 단백질을 본원에 기재된 바와 같이 분리시킨다. 예를 들면, 재조합 단백질을 포유류 세포주에서 생성시킬 수 있다. 적당한 숙주, 예를 들면, Balb/c 등의 마우스의 동계교배된 균주를, 전형적으로 표준 보조제, 예를 들면, 프로인드 보조제와 표준 마우스 면역화 프로토콜을 사용하여, 상기 선택된 단백질로 면역시킨다[Harlow and Lane, 상기 참조]. 또 다른 한편, 본원에 기재된 서열로부터 유도되고 운반체 단백질에 접합된 합성 펩티드를 면역원으로서 사용할 수 있다. 폴리클로날 혈청을 수집하고, 면역검정, 예를 들면, 고체 지지체 상에 고정화된 면역원을 이용한 고체 상 면역검정에서 면역원 단백질에 대해 역가 측정한다. 역가가 10⁴ 이상인 폴리클로날 항혈청은 선택하고, 이를 대상으로 하여, 문헌[Harlow and Lane, 상기 참조, pages 570-573]에 기재된 바와 같은 경쟁적 결합 면역검정을 이용하여 기타 Ig 상과 수용체 구성원에 대한 이들의 교차 반응성을 시험한다. 바람직하게는, 2개 이상의 수용체 계열 구성원이 이러한 결정법에 사용된다. 이들 수용체 계열 구성원은 재조합 단백질로서 생성될 수 있고, 본원에 기재된 바와 같은 표준 분자 생물학 및 단백질 화학 기술을 사용하여 분리시킬 수 있다.

경쟁적 결합 포맷의 면역검정을 교차 반응성 결정법에 사용할 수 있다. 예를 들면, 서열 2의 단백질을 고체 지지체에 고정화시킬 수 있다. 이러한 검정에 가해진 단백질은 고정화된 항원에 대한 항혈청의 결합과 경쟁한다. 고정화된 단백 질에 대한 항혈청의 결합과 경쟁하는 상기 단백질의 능력을 상기 단백질에 비유한다. 상기 단백질에 대한 교차 반응율(%)은 표준 계산법을 사용하여 계산한다. 상기 열거된 단백질 각각과의 교차 반응율이 10% 미만인 항혈청을 선별하고 이를 풀링한다(pooled). 이어서, 상기 열거된 단백질과 면역흡착시킴으로써, 상기와 같이 풀링된 항혈청으로부터 교차 반응성 항체를 제거시킨다.

이어서, 상기와 같이 면역흡착되고 풀링된 항혈청을 상기 언급된 바와 같은 경쟁적 결합 면역검정에 사용하여, 제2의 단백질을 면역원 단백질(예를 들면, 서열 2의 OX2RH1 유사 단백질)과 비교한다. 이러한 비교를 하기 위해서는, 2개의 단백질을 각각 광범위한 농도에서 검정하고, 고정화된 단백질에 대한 항혈청의 결합을 50%를 억제하는데 요구되는 각 단백질의 양을 결정한다. 요구되는 제2의 단백질 양이 요구되는 선택된 단백질(들)의 단백질 양 보다 2배 미만인 경우에는, 이러한 제2의 단백질이 상기 면역원에 대해 발생된 항체와 특이적으로 결합한다고 여겨진다.

이들 OX2 수용체 동족체 단백질이 지금까지 동정된 유전자 6개 이상을 포함하는 동종 단백질 계열의 구성원이라는 것을 인지해야 한다. 특정한 유전자 생성물, 예를 들면, OX2RH1의 경우, 상기 용어는 본원에 기재된 아미노산 서열 뿐만 아니라 대립유전자성, 비-대립유전자성 또는 종 변이체인 기타 단백질도 지칭한다. 또한, 상기 용어에는 단일 부위 돌연변이와 같이, 통상적인 재조합 기술을 이용하여 계획적으로 돌연변이시킴으로써 도입시키거나, 각각의 단백질을 암호화하는 DNA의 짧은 절편을 절단시킴으로써 도입시키거나, 또는 새로운 아미노산으로 치환하거 나 새로운 아미노산을 가함으로써 도입시킨, 천연이 아닌 돌연변이물이 포함된다. 이러한 부 변형물은 전형적으로, 본래 분자의 면역동일성 및/또는 이의 생물학적 활성을 실질적으로 유지할 것이다. 따라서, 이들 변형물에는 명칭된 천연의 OX2RH 단백질과 특이적으로 면역반응성인 단백질이 포함된다. 이와 같이 변형된 단백질의 생물학적 특성은 이러한 단백질을 적당한 세포주에서 발현시킨 다음, 예를 들어, 형질감염된 림프구에 대한 적당한 효과를 측정함으로써 결정할 수 있다. 보다 중요하지 않은 것으로 간주된 특정한 단백질 변형물에는 당해 수용체 동족체 계열에 대해 총괄하여 상기 언급된 바와 같이, 유사한 화학적 특성을 지닌 아미노산의 보존적 치환물이 포함될 것이다. 특정 단백질을 당해 수용체 동족체의 단백질과 최적으로 정렬시키고 면역동일성을 결정해주기 위해 본원에 기재된 통상적인 면역검정을 사용함으로써, 본 발명의 단백질 조성을 결정할 수 있다.

VII. 키트 및 정량화

본 발명의 천연 형태 및 재조합 형태의 수용체 유사 분자 모두가 키트 및 검정 방법에 특히 유용하다. 예를 들면, 이들 방법은 예를 들어, 이들 단백질에 대한 리간드의 결합 활성을 스크리닝하는데 적용할 수도 있다. 몇몇 자동화 검정 방법이 최근 수 년간 개발되어, 매년 수 십만의 화합물을 스크리닝할 수 있다[참조: BIOMEK automated workstation, Beckman Instruments, Palo Alto, California, and Fodor, et al. (1991) Science 251:767-773; 이는 본원에 참조문헌으로 삽입된다]. 후자에는 고체 기질 상에서 합성된 다수의 규정된 중합체에 의해 결합을 시험하기 위한 수단이 기재되어 있다. 리간드 또는 효능제/길항제 동종 단백질을 스크리닝 하는데 적합한 검정법의 개발은 본 발명에 의해 제공된 바와 같은, 활성 상태의 정제된 가용성 수용체를 다량으로 이용할 수 있음으로 해서 상당히 촉진될 수 있다.

정제된 OX2RH는 전술된 리간드 스크리닝 기술에 사용하기 위하여 플레이트 상으로 직접적으로 피복시킬 수 있다. 그러나, 이들 단백질에 대한 비-중화 항체를 포획 항체로서 사용하여 각각의 수용체 동족체를, 예를 들어, 진단 용도에 유용한 고체 상 위에 고정화시킬 수 있다.

본 발명은 또한, 단백질 또는 이의 리간드의 존재를 검출하기 위한 각종 진단용 키트 및 방법에 있어서의, OX2RH, 이의 단편, 펩티드 및 이들의 융합 생성물의 용도를 고려한다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 이러한 분자에 대한 항체를 상기 키트 및 방법에 혼입시켜, OX2RH 또는 이를 발현하는 세포를 정량화하는데 사용할 수 있다. 전형적으로, 상기 키트는 OX2RH 펩티드 또는 유전자 분절, 또는 이들 중의 어느 하나를 인식하는 시약을 함유하는 구획을 가질 것이다. 전형적으로, 펩티드 경우의 인식용 시약은 수용체 동족체 또는 항체일 수 있거나, 또는 유전자 분절의 경우에는, 통상적으로 하이브리드화 프로브일 수 있다.

샘플 중의 OX2RH의 농도를 결정하는데 바람직한 키트는 전형적으로, OX2RH에 대한 공지된 결합 친화성을 지닌 표지된 화합물, 예를 들면, 리간드 또는 항체, 양성 대조군으로서의 OX2RH의 공급원(천연 또는 재조합), 및 자유 표지된 화합물로부터 상기 결합물을 분리시키기 위한 수단, 예를 들면, 시험 샘플 중의 OX2RH를 고정화시키기 위한 고체 상을 포함할 것이다. 시약을 함유하는 구획과 지시 사항이 통상적으로 제공될 것이다. 적당한 핵산 또는 단백질 함유 키트가 또한 제공된다.

포유류 OX2RH 또는 펩티드 단편, 또는 수용체 동족체 단편에 특이적인 항체(항원 결합성 단편 포함)가 상승 수준의 동족체 및/또는 이의 단편의 존재를 검출하기 위한 진단 적용 분야에 유용하다. 진단 검정은 균일하거나(자유 시약과 항체-항원 복합체 간에 분리 단계가 없음) 불균일하다(분리 단계가 있다). 방사성 면역검정(RIA), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 효소 면역검정(EIA), 효소 다형 면역검정 기술(EMIT), 기질 표지된 형광성 면역검정(SLFIA) 등의 각종 시판용 검정이 존재한다. 예를 들면, 표지되어 수용체 동족체 또는 이의 특정한 단편에 대한 항체를 인식하는 제2의 항체를 사용함으로써, 표지되지 않은 항체를 이용할 수 있다. 이들 검정이 또한 당해 문헌에 광범위하게 논의되었다[참조: 예를 들면, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH., and Coligan (ed. 1991 and periodic supplements) Current Protocols In Immunology Greene/Wiley, New York].

항-유전자형 항체는 당해 수용체 동족체의 효능제 또는 길항제로서 작용하는 유사한 용도를 지닐 수 있다. 이들은 적당한 상황 하에서 치료학적 시약으로서 유용해야 한다.

빈번하게, 진단 검정용 시약을 키트에 공급하여, 검정의 민감도를 최적화시킨다. 본 발명의 경우, 검정의 종류에 따라서, 프로토콜 및 표지, 표지되거나 표지되지 않은 항체, 또는 표지된 리간드가 제공된다. 이는 통상적으로, 기타 첨가제, 예를 들면, 완충제, 안정화제, 시그널 생성에 필요한 물질, 예를 들면, 효소용 기질 등과 연계된다. 바람직하게는, 상기 키트는 적당한 사용과 사용 후의 내용물 처분에 대한 지시 사항을 함유할 것이다. 전형적으로, 상기 키트는 각각의 유용한 시약에 대한 구획을 가지며, 시약의 적당한 사용과 처분에 대한 지시 사항을 함유할 것이다. 바람직하게는, 이러한 시약은 건조 동결건조된 분말로서 제공되며, 여기서 상기 시약은 당해 검정을 수행하기에 적당한 농도를 지닌 수성 매질 중에서 재구성될 수 있다.

진단 검정의 전술한 구성분은 변형시키지 않고 사용할 수 있거나, 또는 각종 방식으로 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 검출 가능한 시그널을 직접적 또는 간접적으로 제공해주는 잔기를 공유적 또는 비-공유적으로 연결시킴으로써 표지화를 달성할 수 있다. 많은 이들 검정에서는, 시험 화합물, 수용체 동족체, 또는 이에 대한 항체를 직접적 또는 간접적으로 표지시킬 수 있다. 직접적으로 표지화하는데 가능한 수단에는 다음 표지 그룹이 포함된다: 방사성 표지, 예를 들면, ¹²⁵I, 효소(미국 특허 제3,645,090호), 예를 들면, 퍼옥시다제 및 알칼린 포스파타제, 및 형광 세기, 파장 이동 또는 형광 편광의 변화를 모니터할 수 있는 형광성 표지(미국 특허 제3,940,475호). 이들 양 특허 모두가 본원에 참조문헌으로 삽입된다. 간접적으로 표지화하는데 가능한 방법은 하나의 구성분을 바이오티닐화한 다음, 상기 표지 그룹 중의 하나와 커플링된 아비딘에 결합시키는 것을 포함한다.

결합물을 자유 리간드로부터 분리시키거나, 또는 결합물을 자유 시험 화합물로부터 분리시키는 수 많은 방법이 있다. 당해 수용체 동족체를 각종 매트릭스 상에 고정화시킨 다음 세척할 수 있다. 적합한 매트릭스로는 플라스틱, 예를 들면, ELISA 플레이트, 필터 및 비드가 있다. 수용체 동족체를 매트릭스에 고정화시키는 방법으로는 플라스틱에 대한 직접적인 부착 방법, 포획 항체를 사용하는 방법, 화학적 커플링 방법 및 바이오틴-아비딘 방법이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 접근법의 최종 단계는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 등의 유기 용매 또는 황산암모늄 등의 염을 사용하는 것을 포함한 몇몇 방법에 의해 항체/항원 복합체를 침전시키는 것을 포함한다. 기타 적합한 분리 기술에는 문헌[참조: Rattle, et al. (1984) Clin. Chem. 30(9):1457-1461]에 기재된 플루오레세인 항체 자화 가능한 입자 방법, 및 미국 특허 제4,659,678호(상기 문헌 각각은 본원에 참조문헌으로 삽입된다)에 기재된 이중 항체 자기 입자 분리법이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.

단백질 또는 단편을 각종 표지에 연결하는 방법은 당해 문헌에 광범위하게 보고되어 있으며 본원에서 상세히 논의할 필요는 없다. 많은 기술이 카보디이미드 또는 활성 에스테르의 사용을 통하여 활성화 카복실 그룹을 사용하여 펩티드 결합을 형성하는 방법, 또는 연결을 위해, 머캅토 그룹과 활성화 할로겐(예: 클로로아세틸) 또는 활성화 올레핀(예: 말레이미드)과의 반응에 의해 티오에테르를 형성하는 방법 등을 수반한다. 융합 단백질이 또한, 이들 적용 분야에 사용될 것이다.

본 발명의 또 다른 진단 국면은 수용체 동족체의 서열로부터 취한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하는 것을 포함한다. 이들 서열은 면역학적 장애가 있는 것으로 추정되는 환자에게서 각각의 수용체 동족체의 수준을 검출하기 위한 프로브로서 사용할 수 있다. RNA와 DNA 뉴클레오티드 서열의 제조, 이러한 서열의 표지화, 및 바람직한 서열 크기는 당해 문헌에 충분히 논의되고 기재되어 있다. 정상적으로, 올리고뉴클레오티드 프로브는 약 14개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로 약 18개 이상의 뉴클레오티드를 가져야 하고, 폴리뉴클레오티드 프로브는 수 킬로염기 이하일 수 있다. 각종 표지를 이용할 수 있는데, 가장 통상적으로는 방사성핵종, 특히 ³²P를 이용할 수 있다. 그러나, 폴리뉴클레오티드 내로 도입하기 위하여 바이오틴 변형된 뉴클레오티드를 사용하는 것과 같은 기타 기술을 이용할 수도 있다. 이때, 바이오틴은 광범위한 표지, 예를 들면, 방사성핵종, 형광제, 효소 등으로 표지시킬 수 있는, 아비딘 또는 항체에 대한 결합 부위로서 작용한다. 또 다른 한편, DNA 이중체, RNA 이중체, DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함한 특이적 이중체를 인식할 수 있는 항체를 이용할 수 있다. 이어서, 이러한 항체를 표지시킬 수 있고, 상기 이중체가 표면에 결합시킨 검정을 수행하여, 이러한 표면 상에 이중체가 형성되면, 이중체에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있다. 신규한 안티-센스 RNA에 프로브를 사용하는 것은 핵산 하이브리드화, 플러스 및 마이너스 스크리닝, 재조합 프로빙, 하이브리드 방출된 해독(HRT) 및 하이브리드 저지된 해독(HART) 등의 통상적인 기술로 수행할 수 있다. 이에는 또한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 등의 증폭 기술이 포함된다.

기타 마커의 정성적 또는 정량적 존재를 시험하기 위한 진단용 키트가 또한 고려된다. 진단 또는 예후는 마커로서 사용된 다수의 징조들 조합에 좌우될 수 있다. 따라서, 키트는 마커의 조합을 시험할 수 있다[참조: Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97].

VIII. 치료학적 용도

본 발명은 상당한 치료학적 가치를 지닌 시약을 제공한다[참조: Levitzki (1996) Curr. Opin. Cell Biol. 8:239-244]. 당해 수용체 동족체(천연 또는 재조합), 이의 단편, 돌연변이 단백질 수용체 및 항체는 이러한 수용체 동족체 또는 항체에 대한 결합 친화성을 지니는 것으로 동정된 화합물과 함께, 골수종 계통 세포의 기능 조절이 특히 요망되는 질환의 치료에 유용해야 한다. 이러한 비정상은 전형적으로, 면역학적 장애로써 나타날 수 있을 뿐만 아니라 골수종 세포 활성이 생리학적 과정, 예를 들면, CNS 성숙 또는 발생 등에 나쁜 영향을 미치는 질환으로써 나타날 수 있다. 부가적으로, 본 발명은 비정상적인 발현이나 리간드에 대한 비정상적인 반응 촉발과 연관된 각종 질환이나 장애에 치료학적 가치를 제공해야 한다.

OX2R을 발현하는 백혈구(대식세포/골수 계통 세포 포함)가 병리학과 관련이 있고 질환 과정의 원인이 되는 경우에는, 이들 세포의 기능을 억제하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 OX2R을 적당히 자극하여, 수용체 시그널링의 세포-억제 활성을 유동적으로 함으로써 달성될 수 있다. 이는, 예를 들면, 수용체에 대한 효능 활성을 지니고 있는, OX2R에 대한 리간드 OX2 효능제 또는 항체를 사용하여 달성할 수 있다. 이에 적합한 질환은 동물이 염증, 백혈구 증식성, 신경 변성 또는 외상 후 질환의 징후 또는 증상을 나타내는 질환일 것이다. 바람직한 양태에는 이러한 징후 또는 증상이 신경 조직; 림프계 조직; 골수 조직; 췌장; 위장 조직; 갑상선 조직; 근육 조직; 또는 피부 또는 콜라겐성 조직 내에서 나타나는 것인 질환이 포 함된다. 특정의 양태에는 동물이 자가면역; 염증 질환; 조직 특이적 자가면역; 변성 자가면역; 류마티스성 관절염; 아테롬성 동맥경화증; 다발성 경화증; 혈관염; 지연형 과민증; 피부 이식; 이식조직; 척수 손상; 발작; 신경변성; 또는 허혈증의 징후 또는 증상을 나타내는 질환이 포함된다. 투여제는 소염성 사이토킨 효능제 또는 길항제; 진통제; 소염제; 또는 스테로이드와 조합할 수 있다.

이와는 달리, OX2R을 발현하는 백혈구(대식세포/골수 계통 세포 포함)가 면역화 및 백신 접종 과정, 수복 기전, 제한 병리학, 또는 감염, 특히 세균성 감염 제어와 관련이 있는 경우에는, 이들 세포의 기능을 증진시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 OX2R을 치료학적으로 적당히 자극하여, 수용체 시그널링의 세포-활성화 활성을 유동적으로 만들거나, 또는 OX2-OX2R 상호작용을 완전히 차단시킴으로써 세포-활성화가 진행되도록 함으로써 달성될 수 있다. 후자는 리간드 OX2의 결핍으로 인해 골수 세포 활성화가 유발되는 리간드 OX2 유전자 녹아웃(knockout) 마우스에서 일어난다. 이는, 예를 들면, 리간드 OX2 길항제(예: 리간드 OX2에 대한 항체); OX2-OX2R 상호작용을 방지해주는, OX2R에 대한 항체; OX2R 발현을 방지할 수 있는 안티센스 핵산; 예를 들어, 경쟁적 결합에 의해, 세포 결합된 OX2R과 상호작용할 수 있는 세포 결합된 OX2의 능력을 차단시키는 Ig-OX2R 융합 단백질; 또는 작은 분자 길항제를 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 실시 양상이 골수 세포 기능 증진을 위해 생체내 적용된다는 것은, 예를 들어, 마우스 OX2와 결합하는 것으로 공지된 사람 IgG-마우스 OX2RH1 융합 단백질을 생성하는 아데노바이러스 작제물을 마우스에게 정맥내 주사하면, 주쇄 사람 IgG-융합 단백질 만을 생성하는 아데노바 이러스 작제물이 주입된 마우스와 비교해서, 이들 마우스에서 자가면역 질병 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 발병이 촉진되었다는 실험으로써 입증되었다. 질병 촉진 정도는 OX2R에 대한 리간드, 즉 OX2를 유전자 표적화에 의해 불활성화시킨 마우스에서 관찰된 것에 필적한다.

또 다른 한편, 본원에 기재된 각종 OX2R 분자가 활성화 대 억제 기능을 지니고 있는 경우, 세포성 활성화를 유도하는 OX2R의 특이적 활성화가 적당할 수 있다. 이는 예를 들어, 소정의 OX2R의 효능 활성을 지닌 특이적 항체를 사용함으로써 달성할 수 있다. 각종 양태에서는, 동물이 대식세포 활성화 증진이 요망될 수 있는 응혈 형성이나 상처 치유 징후 또는 증상을 나타내는 경우, 또는 동물이 과립구 및/또는 대식세포에 의한 식세포 활성화 증진이 요망되는 세균성 감염에 걸린 경우에 상기 방법이 적용된다. 투여는 종종 혈관형성 인자; FGF 또는 PDGF를 포함한 성장 인자; 항생제; 또는 응혈 인자와 조합할 것이다.

재조합 수용체, 돌연변이 단백질, 이에 대한 효능제 또는 길항제 항체, 또는 항체를 정제한 다음, 환자에게 투여할 수 있다. 이들 시약은 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 통상적인 담체 또는 희석제 중에, 생리학적으로 무해한 안정화제 및 부형제와 함께, 치료학적 용도를 위해 부가의 활성 성분과 조합할 수 있다. 이들 조합물은 멸균성일 수 있는데, 예를 들면, 여과시킨 다음, 투여용 바이알 내에 동결건조된 바와 같은 투여 형태로 놓아두거나 안정화된 수성 제제에 저장한다. 본 발명은 또한, 보체 결합(complement binding)되지 않는 항체 또는 이의 결합성 단편의 용도를 고려한다.

수용체 또는 이의 단편을 사용한 리간드 스크리닝을 수행하여, 이러한 수용체에 대한 결합 친화성을 지닌 분자를 동정할 수 있다. 이어서, 연속적으로 생물학적 검정을 활용하여, 추정상의 리간드가, 내재된 자극 활성을 차단시킬 수 있는 경쟁적 결합을 제공해줄 수 있는지를 결정할 수 있다. 수용체 단편은 이것이 리간드의 활성을 차단한다는 점에서 차단제 또는 길항제로서 사용할 수 있다. 마찬가지로, 내재된 자극 활성을 지닌 화합물은 상기 수용체를 활성화시킬 수 있으므로, 이것이 리간드의 활성, 예를 들면, 시그널링 유도를 자극한다는 점에서 효능제이다. 본 발명은 추가로, 길항제로서의, 수용체에 대한 항체의 치료학적 용도를 고려한다.

유효한 치료에 필요한 시약의 양은 투여 방법, 표적 부위, 시약의 생리학적 수명, 약리학적 수명, 환자의 생리학적 상태, 및 투여된 기타 약물을 포함한 상이한 많은 요인들에 좌우될 것이다. 따라서, 치료 투여량은 안전성과 효능을 최적화하도록 역가되어야 한다. 전형적으로, 시험관내에서 사용된 투여량은 이들 시약의 동일계 투여에 유용한 양에 있어서 유용한 지침을 제공할 수 있다. 특정한 질병의 치료에 유효한 용량에 관한 동물 시험은 사람 투여량에 관한 추가의 서술적 조치를 제공해준다. 각종의 고려 사항이, 예를 들면, 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로 삽입됨]. 예를 들면, 경구, 정맥내, 복강내 또는 근육내 투여, 경피 확산 등의 투여 방법이 본원 및 다음에 논의되어 있다. 약제학적으로 허용되는 담체에는 물, 식염수, 완충제, 및 문헌[참조: Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey]에 기재된 기타 화합물이 포함될 것이다. 투여량 범위는 적당한 담체를 포함하여, 통상적으로 100mM 미만 농도, 전형적으로 약 1mM 미만 농도, 통상적으로 약 100μM 미만 농도, 바람직하게는 약 1μM 미만 농도, 가장 바람직하게는 약 10nM 미만 농도의 양인 것으로 예상된다. 서방성 제형, 또는 서방성 장치가 지속적인 투여를 위해 종종 이용될 것이다.

수용체 동족체, 이의 단편, 및 항체 또는 이의 단편, 길항제 및 효능제는 치료받고자 하는 숙주에게 직접적으로 투여할 수 있거나, 또는 화합물의 크기에 따라서, 이들을 투여하기에 앞서 오브알부민 또는 혈청 알부민 등의 담체 단백질과 접합시키는 것이 요망될 수 있다. 치료학적 제형은 많은 통상적인 투여 제형으로 투여할 수 있다. 활성 성분을 단독으로 투여하는 것이 가능하긴 하지만, 이를 약제학적 제형으로서 투여하는 것이 바람직하다. 제형은 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 활성 성분을 하나 이상의 허용되는 담체와 함께 포함한다. 각 담체는 기타 성분들과 화합성이고 환자에게 무해하다는 점에서 약제학적으로 허용되고 또한 생리학적으로도 허용되어야만 한다. 제형에는 경구, 직장, 비내 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내 포함) 투여에 적합한 것이 포함된다. 이러한 제형은 단위 투여 형태로 편리하게 제시될 수 있고 조제학 분야에 널리 공지된 방법으로 제조할 수 있다[참조: Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis, et al. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; and Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY]. 본 발명의 치료법은 기타 치료학적 제제, 특히 기타 수용체 계열 구성원의 효능제 또는 길항제와 조합하거나 이와 연합하여 사용할 수 있다.

IX. 스크리닝

OX2RH 또는 이의 단편을 사용한 약물 스크리닝을 수행하여, 연합된 성분의 분리를 포함한, 수용체 동족체에 대한 결합 친화성을 지닌 화합물을 동정할 수 있다. 이어서, 연속적으로 생물학적 검정을 활용하여, 상기 화합물이 내재된 자극 활성을 지니고 있는지를 결정할 수 있으므로, 상기 화합물이 상기 리간드의 활성을 차단한다는 점에서 차단제 또는 길항제이다. 마찬가지로, 내재된 자극 활성을 지닌 화합물은 상기 수용체를 활성화시킬 수 있으므로, 이것이 리간드, 예를 들면, OX2의 활성을 자극한다는 점에서 효능제이다. 본 발명은 추가로, 효능제 또는 길항제로서의, 상기 수용체에 대한 항체의 치료학적 용도를 고려한다.

유사하게, 다중 단백질을 포함하는 복합체를 사용하여, 이러한 복합체를 인식할 수 있는 시약이나 리간드를 스크리닝할 수 있다. 몇몇 수용체는 동일하거나 상이할 수 있는 2개 이상의 아단위를 포함한다. 또 다른 한편, 예를 들어, 제2의 수용체 아단위로서 작용하는 또 다른 가용성 단백질과 연합된 리간드를 포함하는 복합체에 막관통 수용체를 결합할 수 있다.

약물 스크리닝의 한 방법은 또 다른 수용체 아단위와 조합하여 OX2RH를 발현하는 재조합 DNA 분자로 안정적으로 형질전환시킨 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포를 이용한다. 기타 기능성 수용체로부터의 분리에서 특정 수용체를 발현하는 세포를 분리할 수 있다. 살아있거나 고정된 형태의 상기 세포를 표준 항체/항원 또는 리간드/수용체 결합 검정에 사용할 수 있다. 문헌[참조: Parce, et al. (1989) Science 246:243-247; and Owicki, et al., (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:4007-401]에는 세포성 반응을 검출하기 위한 민감한 방법이 기재되어 있다. 경쟁적 검정이 특히 유용한데, 여기서는 세포(추정상 리간드의 공급원)를, 리간드에 대한 공지된 결합 친화성을 지니는 표지된 수용체 또는 항체, 예를 들면, ¹²⁵I-항체와 접촉시키고 이와 함께 항온 배양한 다음, 상기 결합 조성물에 대한 시험 샘플의 결합 친화도를 측정한다. 이어서, 결합된 및 자유 표지된 결합 조성물을 분리시켜 리간드 결합도를 평가한다. 결합된 시험 화합물의 양은 공지된 공급원에 대한 표지된 수용체의 결합 양에 반비례한다. 유리 리간드로부터 결합된 리간드를 분리시키기 위한 많은 기술을 사용하여, 리간드 결합도를 평가할 수 있다. 이러한 분리 단계는 전형적으로, 필터에 부착시킨 다음 세척하는 과정, 플라스틱에 부착시킨 다음 세척하는 과정, 또는 세포막을 원심분리시키는 과정 등을 포함한다. 살아있는 세포를 또한 이용하여, OX2 매개된 기능, 예를 들면, 제2의 메신저 수준, 즉 Ca⁺⁺; 세포 증식; 이노시톨 포스페이트 풀 변화 등에 대한 약물의 효과를 스크리닝할 수 있다. 몇몇 검출 방법은 분리 단계를 없애줄 수 있는데, 예를 들면, 근접 민감성 검출 시스템이다. 칼슘 민감성 염료는 형광계 또는 형광 세포 분류 장치를 사용하여, Ca⁺⁺ 수준을 검출하는데 유용할 것이다.

X. 리간드

본원에서의 OX2RH의 상세한 설명은 상기 언급된 바와 같은 리간드를 동정하기 위한 수단을 제공해준다. 이러한 리간드는 상당히 고 친화성으로 각각의 수용체와 특이적으로 결합해야 한다. 각종 작제물을 이용할 수 있는데, 이는 이의 리간드를 검출하기 위해 수용체를 표지화시킬 수 있다. 예를 들면, 수용체를 직접적으로 표지화시키거나, 2차 표지화를 위해 이를 마커, 예를 들면, FLAG 또는 기타 에피토프 태그 상으로 융합시킴으로써, 수용체를 검출할 수 있을 것이다. 이는 생화학적 정제, 또는 발현 클로닝 접근법에서의 표지화 또는 선별에 대한 친화성 방법으로서 조직학적일 수 있다. 입수 가능한 수용체 서열을 갖는 적당한 작제물을 제조하는데 2개-하이브리드 선별 시스템을 적용할 수도 있다[참조: Fields and Song (1989) Nature 340:245-246].

본 발명의 넓은 범위가 다음 실시예를 참조로 하여 보다 잘 이해되며, 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 언급된 특정 양태로 제한하지 않는다.

I. 일반적인 방법

몇몇 표준 방법이 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning , A Laboratory Manual, (2d ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; or Ausubel, et al. (1987 and Supplements) Current Protocols In Molecular Biology, Greene/Wiley, New York]. 단백질 정제 방법에는 황산암모늄 침전법, 칼럼 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 결정화 등의 방법이 포함된다[참조: Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements); Coligan, et al. (ed. 1996 and periodic supplements), Current Protocols In Protein Science, Greene/Wiley, New York; Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology, vol. 182, 및 이 시리즈의 기타 권; 및 단백질 정제 생성물 사용에 관한 제조업자(예를 들면, Pharmacia, Piscataway, N.J. 또는 Bio-Rad, Richmond, CA)의 문헌]. 재조합 기술과의 조합으로 인해, 적당한 분절, 예를 들면, FLAG 서열, 또는 프로테아제 제거 가능한 서열을 통하여 융합될 수 있는 등가물과 융합할 수 있다[참조: Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; and Crowe, et al. (1992) OIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA].

예를 들면, GCG(U. Wisconsin) 및 GenBank 공급원으로부터의 것을 포함한, 입수 가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 컴퓨터 서열 분석을 수행한다. GenBank 등으로부터의 공개된 서열 데이터베이스를 또한 사용한다.

예를 들면, 본원에 참조문헌으로 삽입된 USSN 08/110,683(IL-10 수용체)에 기재된 바와 같이, IL-10 수용체에 적용 가능한 많은 기술을 OX2RH에 적용할 수 있다.

II. 대식세포 상에서의 랫트 OX2/OX2RH 상호작용을 차단시키는 모노클로날 항체

재조합 OX2-CD4 단백질 및 랫트 복막 대식세포를 사용하여 비드 검정을 설정한다[참조: Preston, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1911-1918]. 형광성 비드에 결합된 매크로파이지를 재조합 OX2-CD4 단백질로 피복시킨다. 6주생 BALB/c 마우스를 0.1 내지 0.25mg 조 막 분획[참조: Williams and Barclay (1986) in Handbook of Experimental Immunology vol. 1, 22.1-22.24, Blackwell Scientific Publications] 또는 내재성 랫트 복막 삼출액 세포(5백만개)로 6회 면역시킨다. 마우스를 대상으로 하여, 간접적 면역형광 및 유동 세포계수법으로 대식세포를 표지화하기 위하여 혈청의 각종 희석물을 시험함으로써 항체 인식성 대식세포의 고역가에 대해 스크리닝한다. 랫트 대식세포에 대한 우수한 면역 반응을 유발시키는 마우스에게 복막 삼출액 세포를 주사함으로써 상기 마우스를 최종적으로 촉진시킨다. 4일 후, 비장을 꺼내고 이를 NS-1 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성시킨다. 스크리닝 이전의 최종 주사는 비장내이다. 하이브리도마 상등액을 대상으로 하여, 랫트 대식세포를 표지시키는 능력 및 랫트 OX와 대식세포와의 상호작용을 차단시키는 능력에 대해 스크리닝한다. OX102로 명명된 하나의 항체를 수득하고 이를 클로닝한다. 이 항체는 명백한 차단을 제공해준다. 상기 하이브리도마 를 벌크로 성장시키고, 상기 항체를 표준 방법으로 정제시킨다.

III. OX102 mAb에 대한 항원의 정제

정제된 OX102 mAb를 제조업자에 의해 권장된 바와 같이 CNBr 활성화 세파로즈-4B(Pharmacia)에 공유적으로 커플링시킨다. 트윈 40 및 나트륨 데옥시콜레이트를 사용하여 막 단백질을 가용화시키고, OX102 mAb와 커플링된 세파로즈 비드와 함께 70시간 동안 항온 배양한다[참조: Williams and Barclay (1986) in Handbook of Experimental Immunology vol. 1, 22.1-22.24, Blackwell Scientific Publications]. OX102 mAb-커플링된 세파로즈 비드를 원심분리시켜 펠릿화하고, 0.1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)에서 세척한 다음, 55℃에서 15분 동안 0.5% SDS에서 최종적으로 용출시킨다. 이와 같이 용출된 분획을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)함으로써 분석한다.

IV. OX102 mAb에 대한 항원의 N-말단 서열

어플라이드 바이오시스템즈 프로시스(Applied Biosystems Procise) 494A 단백질 서열화기(Perkin-Elmer Ltd., UK)에서 자동화 에드만(Edman) 분해를 이용하여 아미노 말단 서열화를 수행한다. 이러한 N-말단 서열은 표 1에 제시된 바와 같이 확인하였다. 여백 사이클은 N-연결된 글리코실화에 의해 변형된 아스파라긴의 존재로 인해 아스파라긴인 것으로 추측된다. 정제된 폴리펩티드는, OX102 mAb에 대한 항원의 N-말단 20개 아미노산을 갖는 공지된 단백질 데이터베이스를 스크리닝함으로써 신규한 것으로서 동정되었다.

V. OX102 mAb의 항원을 암호화하는 cDNA 클론의 분리

RNAzol B(Biogenesis)를 사용하여 랫트 복막 삼출액 세포로부터 전 RNA를 추출한 다음, 제조업자에 의해 권장된 바와 같이 올리고 dT 비드(Oligotex, QIAGEN)를 사용하여 폴리-A 분획을 정제한다. 대략 50ng의 폴리A+ 정제된 mRNA를 1μM의 선택된 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드, 1mM dNTPs, 및 2mM DTT, 50mM 트리스-HCl pH 8.3, 75mM KCl, 3mM MgCl의 존재 하에서 슈퍼스크립트 II 역전사효소(GIBCO BRL) 200U로 처리하고, 42℃에서 1시간 동안 항온 배양한다.

이어서, 상기 cDNA를 PCR 반응에서 주형으로서 사용하는데, 예를 들면, 10x 어드밴티지 Taq 호열성 PCR 완충액(공급원: Clontech) 40㎕; 10mM dNTPs 8㎕; 어드밴티지 Taq(공급원: Clontech) 8㎕; 상기 언급된 바와 같이 제조된 cDNA 2㎕; 증류수 318㎕; 10μM에서 N-말단 펩티드에 상응하는 안티센스, 변성 올리고뉴클레오티드 16㎕; 및 10μM 센스 올리고뉴클레오티드 8㎕가 제공된다. 5' 말단 포스페이트를 사용하여 양 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하여(Genosys) 클로닝을 촉진시킨다.

PCR 혼합물을 8 x 50㎕ 샘플로 등분하고, 조작자가 별개의 샘플에서 어닐링 온도를 동시에 변화시킬 수 있는 로보사이클러(Robocycler) PCR 기계(공급원: Stratagene) 내에서 PCR 조건 하에 둔다. 실시예 파라미터는 다음과 같다: 93℃ 30초; 이어서, 93℃ 30초; 42-56℃ 1분; 72℃ 30초; 및 최종 주기 72℃ 8분의 35 주기.

10㎕의 PCR 생성물을 표준 방법에 의해 아가로즈 겔 전기영동시켜 분석한다. 어닐링 온도가 약 42℃, 44℃ 및 46℃인 3개 샘플 중에서 길이가 100 내지 300염기 쌍 범위인 PCR 생성물을 상기 겔로부터 절단하고, QIAquick(QIAGEN)을 사용하여 핵산을 정제한다. 이들 정제된 생성물을 표준 과정을 사용하여 약 16℃에서 48시간 동안, SmaI 분해시키고 포스파타제 처리시킨 PCRScript 벡터(공급원: Stratagene)에 연결시킨다.

형질전환체를 콜로니 PCR에 의해 초기에 스크리닝하고, 적당한 크기의 삽입체를 함유하는 20개 콜로니를 50㎍/ml 앰피실린의 존재하에 LB 브로쓰에서 성장시킨 다음, QIAGEN 로보트로 플라스미드를 정제한다. BIGDYE 형광성 디데옥시-종결인자 기술 및 ABI-PRISM 모델 377(Perkin-Elmer Ltd., UK)을 사용하여 삽입체를 서열화한다. OX102 mAb에 대한 항원의 N-말단 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 삽입체를 사용하여 3' RACE 반응용 올리고뉴클레오티드를 고안하였다.

OX102에 대한 항원의 완전한 cDNA 서열을 3' RACE PCR(상기와 동일한 프로토콜을 사용함)으로 수득하지만, 적당한 올리고뉴클레오티드를 각 0.2μM의 최종 농도로 사용함으로써 변형시킨다. PCR 조건은, 예를 들면, 다음과 같다: 93℃ 30초; 이어서, 93℃ 30초; 51-65℃ 1분; 72℃ 3.5분; 및 최종 주기 72℃ 12분의 30 주기.

대략 2.3Kb의 밴드를 65℃ PCR 반응물로부터 절단하고, 겔 정제하며, NotI 및 XhoI로 분해시킨 다음, 표준 과정을 사용하여 NotI/XhoI 분해된 벡터(PCRScript, Stratagene)에 연결한다. 삽입체를 상기와 같이 서열화한다.

본원에서 랫트 OX2RH1로서 지칭되기도 하는 OX102 단백질의 cDNA 서열이 표 1에 제시되어 있다. 기타 동족체 양태의 완전한 길이의 분리물을 유사하게 클로닝하고 서열을 확인한다. 표준 방법을 용이하게 적용할 수 있다.

VI. 기타 OX2RH cDNAs를 수득함

랫트 OX2RH1 뉴클레오티드 및 추정된 아미노산 서열에 관한 지식으로 인해, 당업자는 마우스 또는 사람 OX2RH1을 포함한, 기타 종으로부터 상동성 기능적 등가물을 수득할 수 있는데, 이는 이들의 서열 유사성에 근거한 것이며 또한 랫트 OX2RH1이 이러한 등가물을 분리시키기 위한 도구를 제공해주기 때문이다.

따라서, 사람 OX2RH1을 동정하기 위해서는, 본원에 제공된 랫트 OX2RH1 핵산 및 아미노산 서열과 상동성을 지닌 서열을 알아보기 위하여, 공지되지 않은 실체의 폴리펩티드에 대해 존재하는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터베이스(예를 들면, 사람 게놈 프로젝트로부터 수득된 서열을 저장한 데이터베이스)를 조사할 수 있다. 유럽 생물정보 센터(European Bioinformatics Centre)(http://www.ebi.ac.uk/) 및 국립 생물기술 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)(http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/)을 포함한 많은 장소에서 업데이트되어 저장된 데이터베이스는 FASTA 또는 BLAST 등의 광범위하게 사용된 프로그램에 의해 평가할 수 있다. 이들 데이터베이스에는 무작위 cDNA 클론으로부터 서열화된 뉴클레오티드 서열의 짧은 영역인 발현된 서열 태그(ESTs)에 대한 서열이 포함된다. 이로써, 본원에 제공된 랫트 OX2RH 서열 정보와 비교함으로써 마우스 또는 사람 OX2RH에 대한 부분적 cDNA 클론을 분리시킬 수 있다. 이어서, 대식세포 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하거나 또는 완전한 길이의 랫트 OX2RH1 클론을 수득하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 프라이머 연장 기술에 의해 완전한 길이의 클론을 분리시킬 수 있다.

랫트 OX2RH1과 관련된 마우스 및 사람 서열은, 예를 들면, BLAST 서버[참조: Altschul, et al. (1994) Nature Genet. 6:119-129]를 사용하여 게놈 서열 데이터베이스로부터 동정하였다. 표준 분석 프로그램, 예를 들면, PHD[참조: Rost and Sander (1994) Proteins 19:55-72] 및 DSC[참조: King and Sternberg (1996) Protein Sci. 5:2298-2310]을 사용하여 구조를 평가할 수 있다. 표준 비교용 소프트웨어에는 다음 문헌에 기재된 것이 포함된다[참조: Altshul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10; Waterman (1995) Introduction to Computational Biology: Maps, Sequences, and Genomes Chapman & Hall; Lander and Waterman (eds. 1995) Calculating the Secrets of Life: Applications of the Mathematical Sciences in Molecular Biology National Academy Press; and Speed and Waterman (eds. 1996) Genetic Mapping and DAN Sequencing (IMA Volumes in Mathematics and Its Applications, Vol 81) Springer Verlag].

랫트 및 사람 OX2RH1에 대한 핵산 서열은 표 5에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 50 내지 98% 상동률을 지닐 것이다. 기타 동족체의 경우, 특히 동족체 3과의 유사율은 보다 낮을 수 있다.

데이터베이스 스크리닝에 대한 대안으로서, 본원에 제공된 바와 같은 랫트 OX2RH1 핵산 서열을 사용하여 대식세포 cDNA 또는 게놈 라이브리러를 스크링함으로써, 적당히 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하기에 충분히 상동성인 사람 서열을 동정할 수 있다. 이러한 접근법을 이용하여, 프로브로서 랫트 OX2 핵산을 사용하여 사람 OX2 유전자를 분리시킨다[참조: McCaughan, et al. (1987) Immunogenetics 25:329-335]. 주형으로서 cDNA, 게놈 DNA, cDNA 클론 또는 게놈 클론을 사용하는 PCR-이용 방법을 또한 광범위하게 사용하는데, 일반적인 접근법은 cDNA로부터 마우스 OX2를 분리시킴으로써 예시된다[참조: Preston, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1911-1918].

제공된 OX2RH 서열로부터 유도된 PCR 프라이머를 사용하여 사람, 또는 기타 종 또는 조직, cDNA 라이브러리를 프로빙시킨다. 서열은, 예를 들면, 표 1 내지 4, 바람직하게는 서열 말단에 인접한 서열로부터 유도할 수 있다. 영장류, 설치류, 또는 기타 종 OX2RH에 대한 완전한 길이의 cDNA는, 예를 들면, λgt10 파아지를 DNA 하이브리드화 스크리닝함으로써 클로닝한다. 적당한 조건 하에서 티. 아쿠아티쿠스(T. aquaticus) Taqplus DNA 폴리머라제(공급원: Stratagene)를 사용하여 PCR 반응을 수행한다.

추가로, 랫트 OX2RH1 서열을 사용하여 상응하는 마우스 OX2RH1 서열을 분리시키고, 이들 간에 보존된 영역을 동정할 수 있다. 특히, 동족체 그룹의 발견을 이용하여, 유사성 영역을 동정할 수 있다. 보존된 영역 서열은 종 범위 내에서 소정의 유전자를 동정하는데 유용한 시약을 제공해준다. 예를 들면, 마우스와 랫트 OX2의 도메인 1은 아미노산 수준에서 90%가 동일한데, 이는 동일한 사람과 랫트 도메인 간의 77% 동일률에 비유된다[참조: Preston, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1911-1918].

또 다른 방법은 발현 클론에 대한 항체 시약을 사용하거나 또는 적당한 세포 유형, 예를 들면, 대식세포, 또는 기타 종으로부터의 cDNA 라이브러리에서 발현된 교차반응성 단백질을 동정하는 것이다.

VII. 염색체 국재

유전자를 지도화(mapping)할 것이다. 예를 들면, 염색체 확산물을 제조한다. 72시간 동안 배양된, 예를 들어, 사람으로부터의 피토헤마글루티닌-자극된 림프구로부터 수득된 염색체 제제 상에서 동일계 하이브리드화를 수행한다. 최종 7시간의 배양 동안 5-브모로데옥시우리딘(60㎍/매질 ml)을 가하여 양질의 하이브리드화 후 염색체 밴딩(banding)을 보장한다.

프라이머의 도움으로 증폭된 PCR 단편을 적당한 벡터 내로 클로닝시킨다. 이 벡터를 ³H로 니크-해독(nick-translation)시킴으로써 표지시킨다. 방사성표지된 프로브를 문헌[참조: Mattei, et al. (1985) Hum. Genet. 69:327-331]에 기재된 바와 같이 하이브리드화 용액의 최종 농도 200ng/ml에서 중기(metaphase) 확산물과 하이브리드화시킨다.

핵 트랙 에멀션(KODAK NTB₂)로 피복시킨 후, 슬라이드를 노출시킨다. 밴딩 과정 동안 실버 그레인의 어떠한 슬리핑도 피하기 위하여, 염색체 확산물을 먼저, 완충된 김사(Giemsa) 용액으로 염색시키고 중기 사진을 찍는다. 이어서, 형광색소-광분해-김사(FPG) 방법으로 R-밴딩을 수행하고, 중기 사진을 다시 찍은 후에 분석한다. 유사한 적당한 방법이 기타 종에 사용된다.

VIII. 각종 OX2RH mRNA의 국재

OX2RH1의 예상된 발현 패턴이 주로 대식세포, 과립구 및 비만 세포 상에서이 긴 하지만, 동족체 H2, H3 및/또는 H4는 기능적으로 그렇게 밀접하게 관련되지 않을 수 있다. 따라서, 이들의 분포가 특히 관심있을 것이다. 분포는, 예를 들면, 하이브리드화 또는 PCR 방법에 의해 핵산 수준으로 평가하거나, 조직학 또는 면역화학적 방법에 의해 단백질 수준으로 평가할 수 있다.

레인당 대략 2㎍의 폴리(A)+ RNA를 함유하는, 사람 다중 조직(Cat #1, 2) 및 암 세포주 블롯(Cat #7757-1)을 다음 공급원(Clontech; Palo Alto, CA)으로부터 구입한다. 예를 들면, 아머샴 레디프라임(Amersham Rediprime) 무작위 프라이머 표지화 키트(RPN1633)를 사용하여, 프로브를 [α-³²P] dATP로 방사성 표지시킨다. 예비하이브리드화 및 하이브리드화를, 예를 들면, 0.5M Na₂HPO₄, 7% SDS, 0.5M EDTA(pH 8.0) 중에서 65℃하에 수행한다. 고도로 엄격한 세척을, 예를 들면, 다음과 같이 수행한다: 65℃에서 40분 동안 2 x SSC, 0.1% SDS에서 초기 2회 세척한 다음, 0.1 x SSC, 0.1% SDS에서 20분 동안 세척한다. 이어서, 막을 -70℃에서 증감 스크린의 존재 하에 X-선 필름(Kodak)에 노출시킨다. 선택된 적당한 포유류 OX2RH 클론을 이용하여 cDNA 라이브러리 서던에 의한 보다 상세한 연구를 수행하여, 조혈 또는 기타 세포 아세트에서의 이들의 발현을 검사한다.

또 다른 한편, 2개의 적당한 프라이머를, 예를 들면, 표 1 내지 4로부터 선별한다. cDNA를 생성시키는 메시지의 존재에 대해 선별된 적당한 mRNA 샘플, 예를 들면, 상기 유전자를 발현하는 샘플 상에서 RT-PCR을 수행한다.

PCR 시그널에 의해 예비선별된 적당한 조직으로부터 cDNA 라이브러리를 하이 브리드화함으로써, 완전한 길이의 클론을 분리시킬 수 있다. 노던 블롯을 수행할 수 있다.

OX2RHs를 암호화하는 유전자에 대한 메시지는 적당한 기술, 예를 들면, PCR, 면역검정, 하이브리드화 등에 의해 검정할 것이다. 조직 및 기관 cDNA 제제는, 예를 들면, 공급원[Clontech, Mountain View, CA]로부터 입수 가능하다. 천연 발현 공급원의 동정이 기재된 바와 같이 유용하다.

마우스 분포의 경우에는, 예를 들면, 서던 분석을 다음과 같이 수행할 수 있다: 1차 증폭된 cDNA 라이브러리로부터의 DNA(5㎍)을 적당한 제한 효소로 분해하여 삽입체를 방출시키고, 1% 아가로즈 겔 상에서 수행한 다음 나일론 막(Schleicher and Schuell, Keene, NH)에 옮긴다.

마우스 mRNA 분리용 샘플에는 다음이 포함될 수 있다: 휴지기 마우스 섬유아세포성 L 세포주(C200); Braf:ER(에스트로겐 수용체에 대한 Braf 융합물) 형질감염된 세포, 대조군(C201); T 세포, TH1 편광됨(Mel14 브라이트, 비장으로부터의 CD4+ 세포, IFN-γ 및 항-IL-4로 7일 동안 편광됨; T200); T 세포, TH2 편광됨(Mel14 브라이트, 비장으로부터의 CD4+ 세포, IL-4 및 항-IFN-γ로 7일 동안 편광됨; T201); T 세포, 고도로 TH1 편광됨(Openshaw, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367 참조; 2, 6, 16시간 동안 풀링된 항-CD3으로 활성화됨; T202); T 세포, 고도로 TH2 편광됨(Openshaw, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367 참조; 2, 6, 16시간 동안 풀링된 항-CD3으로 활성화됨; T203); CD44-CD25+ 프레 T 세포, 흉선으로부터 분류됨(T204); TH1 T 세포 클론 D1.1, 항원으로 마지막 자극 후 3주 동안 휴지기 임(T205); TH1 T 세포 클론 D1.1, 15시간 동안 자극된 10㎍/ml ConA(T206); TH2 T 세포 클론 CDC35, 항원으로 마지막 자극 후 3주 동안 휴지기임(T207); TH2 T 세포 클론 CDC35, 15시간 동안 자극된 10㎍/ml ConA(T208); 비장으로부터의 실험받은 적 없는 Mel14+ T 세포, 휴지기(T209); Mel14+ T 세포, 6, 12, 24시간 동안 풀링된 IFN-γ/IL-12/항-IL-4로 Th1에 대해 편광됨(T210); Mel14+ T 세포, 6, 13, 24시간 동안 풀링된 IL-4/항-IFN-γ로 Th2에 대해 편광됨(T211); 자극되지 않은 성숙한 B 세포 백혈병 세포주 A20(B200); 자극되지 않은 B 세포주 CH12(B201); 비장으로부터의 자극되지 않은 큰 B 세포(B202); 전 비장으로부터의 B 세포, LPS 활성화됨(B203); 비장으로부터의 메트리즈아미드 증진된 수지상 세포, 휴지기(D200); 골수로부터의 수지상 세포, 휴지기(D201); LPS로 4시간 동안 활성화된 단핵구 세포주 RAW 264.7(M200); GM 및 M-CSF로 유도된 골수 대식세포(M201); 대식세포 세포주 J774, 휴지기(M202); 0.5, 1, 3, 6, 12시간 동안 풀링된 대식세포 세포주 J774 + LPS + 항-IL-10(M203); 0.5, 1, 3, 5, 12시간 동안 풀링된 대식세포 세포주 J774 + LPS + IL-10(M204); 에어로졸 챌린지된 마우스 폐 조직, Th2 프라이머, 7, 14, 23시간 동안 풀링된 에어로졸 OVA 챌린지[참조: Garlisi, et al. (1995) Clinical Immunology and Immunopathology 75:75-83; X206]; 니포스트롱굴러스-감염된 폐 조직[참조: Coffman, et al. (1989) Science 245:308-310; X200]; 전 성인 폐, 정상(O200); 전 폐, rag-1[참조: Schwarz, et al. (1993) Immunodeficiency 4:249-252; O205]; IL-10 K.O. 비장[참조: Kuhn, et al. (1991) Cell 75:263-274; X201]; 전 성인 비장, 정상(O201); 전 비장, rag-1(O207); IL-10 K.O. 페이어(Peyer) 패 치(O202); 전 페이어 패치, 정상(O210); IL-10 K.O. 장간막 림프절(X203); 전 장간막 림프절, 정상(O211); IL-10 K.O. 결장(X203); 전 결장, 정상(O212); NOD 마우스 췌장[참조: Makino, et al. (1980) Jikken Dobutsu 29:1-13; X205]; 전 흉선, rag-1(O208); 전 신장, rag-1(O209); 전 심장, rag-1(O202); 전 뇌, rag-1(O203); 전 고환, rag-1(O204); 전 간, rag-1(O206); 랫트 정상 관절 조직(O300); 및 랫트 관절염 관절 조직(X300).

사람 mRNA 분리용 샘플에는 다음이 포함될 수 있다: 말초혈 단핵 세포(단핵구, T 세포, NK 세포, 과립구, B 세포), 휴지기(T100); 말초혈 단핵 세포, 2, 6, 12시간 동안 풀링된 항-CD3으로 활성화됨(T101); T 세포, TH0 클론 Mot 72, 휴지기(T102); T 세포, TH0 클론 Mot 72, 3, 6, 12시간 동안 풀링된 항-CD28 및 항-CD3으로 활성화됨(T103); T 세포, TH0 클론 Mot 72, 2, 7, 12시간 동안 풀링된 특이적 펩티드로 무감작 처리됨(T104); T 세포, TH1 클론 HY06, 휴지기(T107); T 세포, TH1 클론 HY06, 3, 6, 12시간 동안 풀링된 항-CD28 및 항-CD3으로 활성화됨(T108); T 세포, TH1 클론 HY06, 2, 6, 12시간 동안 풀링된 특이적 펩티드로 무감작 처리됨(T109); T 세포, TH2 클론 HY935, 휴지기(T110); T 세포, TH2 클론 HY935, 2, 7, 12시간 동안 풀링된 항-CD28 및 항-CD3으로 활성화됨(T111); T 세포, 항-CD28, IL-4 및 항-IFN-γ에서 27일 동안 편광된 CD4+CD45RO-T 세포, TH2 편광됨, 4시간 항-CD3 및 항-CD28로 활성화됨(T116); T 세포 종양주 저캣 및 Hut78, 휴지기(T117); T 세포 클론, 풀링된 AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69, 휴지기(T118); T 세포 무작위 γδT 세포 클론, 휴지기(T119); 비장 세포, 휴지 기(B100); 비장 세포, 항-CD40 및 IL-4로 활성화됨(B101); B 세포 EBV 주 풀링된 WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY, 휴지기(B102); B 세포주 JY, 1, 6시간 동안 풀링된 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(B103); 풀링된 NK 20 클론, 휴지기(K100); 풀링된 NK 20 클론, 6시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(K101); NKL 클론, LGL 백혈병 환자의 말초혈로부터 유도됨, IL-2 처리됨(K106); NK 세포독성 클론 640-A30-1, 휴지기(K107); 조혈 전구체 주 TF1, 1, 6시간 동안 풀링된 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(C100); U937 전단핵구 주, 휴지기(M100); U937 전단핵구 주, 1, 6시간 동안 풀링된 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(M101); 세정된 단핵구, 1, 2, 6, 12, 24시간 동안 풀링된 LPS, IFNγ, 항-IL-10으로 활성화됨(M102); 세정된 단핵구, 1, 2, 6, 12, 24시간 동안 풀링된 LPS, IFNγ, IL-10으로 활성화됨(M103); 세정된 단핵구, 4, 16시간 동안 풀링된 LPS, IFNγ, 항-IL-10으로 활성화됨(M106); 세정된 단핵구, 4, 16시간 동안 풀링된 LPS, IFNγ, IL-10으로 활성화됨(M107); 세정된 단핵구, 1시간 동안 LPS로 활성화됨(M108); 세정된 단핵구, 6시간 동안 LPS로 활성화됨(M109); DC 70% CD1a+, CD34+ GM-CSF로부터임, TNFα12일, 휴지기(D101); DC 70% CD1a+, CD34+ GM-CSF로부터임, TNFα12, 1시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(D102); DC 70% CD1a+, CD34+ GM-CSF로부터임, TNFα12일, 6시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(D103); DC 95% CD1a+, CD34+ GM-CSF로부터임, TNFα12일 FACS 분류됨, 1, 6시간 동안 풀링된 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(D104); DC 95% CD14+, ex CD34+ GM-CSF, TNFα12일 FACS 분류됨, 1, 6시간 동안 풀링된 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(D105); DC CD1a+ CD86+, CD34+ GM-CSF로부터임, TNFα12일 FACS 분류됨, 1, 6시간 동안 풀링된 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(D106); 단핵구 GM-CSF로부터의 DC, IL-4 5일, 휴지기(D107); 단핵구 GM-CSF로부터의 DC, IL-4 5일, 휴지기(D108); 단핵구 GM-CSF로부터의 DC, IL-4 5일, 4, 16시간 동안 풀링된 LPS로 활성화됨(D109); 단핵구 GM-CSF로부터의 DC, IL-4 5일, 4, 16시간 동안 풀링된 TNFα, 단핵구 슈퍼로 활성화됨(D110); 평활근종 L11 양성 종양(X101); 정상적인 자궁근층 M5(O115); 악성 평활근육종 GS1(X103); 폐 섬유아세포 육종 주 MRC5, 1, 6시간 동안 풀링된 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(C101); 신장 상피 암종 세포주 CHA, 1, 6시간 동안 풀링된 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(C102); 28주생 태아 숫컷 신장(O100); 28주생 태아 숫컷 폐(O101); 28주생 태아 숫컷 간(O102); 28주생 태아 숫컷 심장(O103); 28주생 태아 숫컷 뇌(O104); 28주생 태아 숫컷 담낭(O106); 28주생 태아 숫컷 소장(O107); 28주생 태아 숫컷 지방 조직(O108); 25주생 태아 암컷 난소(O109); 25주생 태아 암컷 자궁(O110); 28주생 태아 숫컷 고환(O111); 28주생 태아 숫컷 비장(O112); 28주생 성인 췌장(O113); 및 12세로부터의, 염증발생된 편도선(X100).

유사한 샘플을 평가하기 위해 다른 종에서 분리시킬 수 있다. 조직학을 수행할 수 있다.

IX. 포유류 OX2RH 단백질의 생성

적당한, 예를 들면, GST 융합 작제물을, 예를 들면, 이. 콜라이에서 발현하도록 공학적으로 처리한다. 예를 들면, 마우스 OX2RH pGex 플라스미드를 작제하고 이를 이. 콜라이 내로 형질전환시킨다. 신선하게 형질전환된 세포를, 예를 들면, 50㎍/ml 앰피실린을 함유하는 LB 배지에서 성장시키고 IPTG(Sigma, St. Louis, MO)로 유도시킨다. 밤새 유도한 후, 상기 세균을 수거하고, OX2RH 단백질을 함유하는 펠릿을 분리시킨다. 이 펠릿을 2리터의 TE 완충액(50mM 트리스-기재 pH 8.0, 10mM EDTA 및 2mM pefabloc)에서 균질화시킨다. 이 물질을 미세유동화기(Microfluidics, Newton, MA)를 통하여 3회 통과시킨다. 이와 같이 유동화된 상등액을 소르발(Sorvall) GS-3 로토 상에서 1시간 동안 13,000rpm으로 스핀 다운시킨다. 이로써 생성된 OX2RH 단백질 함유 상등액을 여과시키고, 50mM 트리스-기재 pH 8.0에서 평형시킨 글루타치온-세파로즈 칼럼 상으로 통과시킨다. OX2RH-GST 융합 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 예를 들면, 트롬빈(공급원: Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN)으로 절단한다. 이어서, 이와 같이 절단된 풀을 50mM 트리스-기재에서 평형시킨 Q-세파로즈 칼럼 상으로 통과시킨다. OX2RH를 함유하는 분획을 풀링하고 찬 증류수에서 희석시켜, 전도율을 낮추며, 신선한 Q-세파로즈 칼럼 상으로 다시 통과시키는데, 이는 상기 칼럼 단독으로 수행하거나 면역친화성 항체 칼럼으로 연속해서 수행한다. OX2RH 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 등분하며, -70℃ 냉동고에서 저장한다.

OX2RH를 이용하여 각종 융합 작제물을 만든다. 따라서, 예를 들면, OX2RH2, H3 또는 H4의 세포외 부분의 융합물을 DAP12의 세포내 부분에 융합시키거나, 또는 IgG 도메인 또는 기타 표지화 또는 기능성 도메인에 융합시킬 수 있다. 적당한 유 전자의 일정 부분을 에피토프 태그, 예를 들면, FLAG 태그, 또는 2개의 하이브리드 시스템 작제물에 융합시킨다[참조: Fields and Song (1989) Nature 340:245-246].

상기 에피토프 태그를 항-FLAG 항체로의 검출을 수반하는 발현 클로닝 과정에 사용하여, 결합 파트너, 예를 들면, 각각의 수용체 동족체에 대한 리간드를 검출할 수 있다. 2개의 하이브리드 시스템을 또한 사용하여, OX2RH와 특이적으로 결합되는 단백질을 분리시킬 수 있다.

유사한 Ig 상과 수용체 단백질과의 CD 스펙트럼 비교는, 상기 단백질이 정확하게 폴딩되었다는 것을 제시해줄 수 있다[참조: Hazuda, et al. (1969) J. Biol. Chem. 264:1689-1693; and Campbell, et al. (1979) Nature 282:341-342].

결합 특성, 예를 들면, 역학 및 기능적 효과 측면에서의 OX2/OX2R의 반응성을 연구할 수 있다. 효모 2개-하이브리드 시스템과 같은 유전 방법 또는 널리 입증된 면역침전 방법을 사용하여, OX2R 세포질 도메인의 상호작용을 결정할 수 있다. 상기 단백질을 정상적으로 발현하지 않는 세포 내로 OX2RH를 형질감염시키는 것은 생리학적 및 시그널링 연구에 유용할 수 있다.

X. OX2RHs에 특이적인 항체의 제조

적당한 종 또는 균주, 예를 들면, 동계교배된 Balb/c 마우스를 재조합 형태의 단백질, 예를 들면, 정제된 OX2RH 또는 안정적으로 형질감염된 NIH-3T3 세포로 복강내 면역시킨다. 동물을 추가의 보조제의 존재하 또는 부재하에서, 적당한 시점에 단백질로 촉진시켜 항체 생성을 추가로 자극한다. 혈청을 수집하거나, 또는 수거된 비장으로 하이브리도마를 생성시킨다.

또 다른 방법으로는, 상기 동물, 예를 들면, Balb/c 마우스를 유전자 또는 이의 단편으로 형질전환시킨 세포(내인성 또는 외인성 세포), 또는 항원 발현을 위해 보강된 분리된 막으로 면역시킨다. 혈청을 적당한 시점, 전형적으로 수 많은 추가의 투여 후에 수집한다. 각종 유전자 치료 기술이, 예를 들면, 면역 반응을 발생시키기 위해 동일계에서 단백질을 생성시키는데 유용할 수 있다. 혈청 또는 항체 제제를 교차-흡착시키거나 면역선별하여, 규정된 특이성과 고친화성을 지닌 실질적으로 정제된 항체를 제조할 수 있다. 따라서, 각종 종 대응물을 인식하는 항체, 또는 특정 종 또는 아세트 그룹, 예를 들면, 설치류 양태를 인식하는 항체가 제조될 수 있다.

모노클로날 항체를 만들 수 있다. 예를 들면, 비장세포를 적당한 융합 파트너와 융합시키고, 하이브리도마를 표준 과정에 의해 성장 배지에서 선별한다. 하이브리도마 상등액을 대상으로 하여, 예를 들면, ELISA 또는 기타 검정에 의해, 랫트 OX2RH1과 결합하는 항체의 존재에 대해 스크리닝한다. 특이적 OX2RH 양태를 특이적으로 인식하는 항체를 선별하거나 제조할 수도 있다.

또 다른 방법에서는, 합성 펩티드 또는 정제된 단백질을 면역 시스템에 표시하여 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 생성시킨다[참조: Coligan (ed. 1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; and Harlow and Lane (1989) Antibodies : A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press]. 적당한 상황 하에서는, 상기 결합성 시약을 상기 언급된 바와 같이, 예를 들어, 형광성으로 표지시키거나, 또는 패닝(pannig) 방법을 위해 기질에 고정화시킨다. 핵산을 동물 내의 세포에 도입하여, 면역 반응을 유발시키는 작용을 하는 항원을 생성시킬 수도 있다[참조: Wang, et al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90:4156-4160; Barry, et al. (1994) BioTechniques 16:616-619; and Xiang, et al. (1995) Immunity 2: 129-135].

XI. 리간드 결합 및 파트너 특이성

결합 선택성과 친화성을 시험하기 위한 수단은 용이하게 입수 가능하다. 표면 플라스몬 공명(제조업자의 프로토콜 참조; BIAcore manual, Pharmacia Biosensor) 또는 기타 방법을 사용하여 OX2RHs에 대한 리간드를 결정할 수 있다. 랫트와 마우스 H1은 이들의 종 대응물 리간드 OX2와 결합하고; 사람 H1은 유사하게 시험할 것이다. H2는 유사한 잠재적 리간드에 대해 유사하게 시험할 것이지만, 공지된 수용체(랫트 및 마우스 H1)에 대한 H2의 세포외 도메인의 유사성은 동일하거나 밀접하게 관련된 리간드를 제시해준다.

수용체를 특이적 결합 파트너로서 사용하여, 이의 결합 특이성의 이점을 고려하여 이의 결합 파트너를 동정할 수 있는데, 훨씬 더 유사한 항체를 사용할 수도 있다. 결합성 수용체는 OX2RH일 수 있거나, 또는 예를 들면, OX2RH와 또 다른 아단위와의 복합체를 포함할 수 있다. 결합성 시약을 상기 언급된 바와 같이, 예를 들어, 형광 등으로 표지시키거나, 또는 패닝 방법을 위해 기질에 고정화시킨다.

결합 조성물을 사용하여, 바람직하게는 막 연합된 결합 파트너, 즉 리간드를 발현하는 세포주로부터 만든 발현 라이브러리를 스크리닝한다. 표준 염색 기술을 사용하여, 표면 발현된 리간드를 검출 또는 분류하거나, 또는 형질전환된 세포를 발현하는 표면을 패닝에 의해 스크리닝한다. 세포내 발현의 스크리닝은 각종 염색 또는 면역형광 과정에 의해 수행한다[참조: McMahan, et al. (1991) EMBO J. 10:2821-2823].

또 다른 한편, 수용체 시약을 사용하여 추정상의 리간드를 발현하는 세포를 친화성 정제하거나 분류한다[참조: Sambrook, et al., or Ausubel, et al.].

또 다른 전략은 패닝에 의해 막 결합된 리간드를 스크리닝하는 것이다. 수용체 cDNA를 상기 언급된 바와 같이 작제한다. OX2RH 융합 작제물 상에서, 예를 들어, FLAG 서열을 인식하는 적당한 항체를 사용하거나, 또는 제1 항체에 대해 생성된 항체를 사용함으로써 고정화를 달성할 수 있다. 선별과 증폭 주기를 반복하여, 적당한 클론을 풍부하게 하고 궁극적으로 수용체 발현 클론을 분리시킨다.

파아지 발현 라이브러리는 포유류 OX2RH, 예를 들면, 표지된 형태로써 스크리닝할 수 있다. 적당한 표지 기술, 예를 들면, 항-FLAG 항체는 적당한 파아지 클론의 특이적 표지화를 허용해줄 것이다.

OX2-OX2RH 결합 확인시, 또는 기타 동족체에 대한 대체 리간드의 동정시, 시그널링 경로를 시험할 것이다[참조: Preston, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1911-1918]. DAP12 연관의 밀접한 관계 또한 명료하다[참조: Bakker, et al. (2000) Human Immunology 61:18-27; Lanier, et al. (1998) Immunity 8:693-701; Smith, et al. (1998) J. Immunol. 161:7-10; Gosselin, et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66:165-171; Tomasello, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:34115-34119; and McVicar, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:32934-32942]. 유사하게 또는 대 안적으로, DAP10이 관련될 수도 있다[참조: Wu J, et al. (1999) Science 285:730-732; and Bauer, et al. (1999) Science 285:727-729].

특히, DAP12 보조수용체 파트너는, ITIM 모티프를 보유하고 있고 syk/zap70 단백질 티로신 키나제를 수반하는 경로를 통하여 시그널링되는 , T 세포 수용체 아단위 ζ및 FcεRγ와 동일한 계열 내이다. DAP10은 P13 키나제 경로를 통하여 또는 이에 유사하게 시그널링되는 YxxM 모디프를 갖는다.

NK 세포 상의 특정한 이소형(isoform)의 MHC 부류 I 수용체는 이들의 세포질 도메인 내에 ITIM 서열이 결여되어 있고, 이들 이소형은 NK 세포를 억제시키기 보다는 오히려 활성화시키는 것으로 제안되었다. 이들 활성화 수용체는 어떠한 시그널링 모티프도 결여되어 있는 극히 짧은 세포내 영역을 지니고 있으며, 이들 모두는 이들의 막관통 도메인 내에 양전하를 띤 잔기를 공유하고 있는데, 이는 시그널링할 수 있는 어댑터 분자와 연합되어 있다는 것을 제시해준다. ITAM을 함유하는 유형 I 디설파이드-연결된 동종 이량체인 DAP12는 사람 KIR2DS 수용체와 비공유적으로 어셈블리한다. DAP12는 이의 막관통 영역 내에 음전하를 띤 아스파르트산 잔기를 가지며, 이는 KIR2DS와 함께 면역침전되는 것으로 밝혀진, 12 내지 13kD로 보고된 인단백질에 상응한다.

수용체 진입시, DAP12는 인산화되고 상기 Syk 키나제를 채용하므로, T 세포 수용체와 유사한 시그널링 캐스케이드(cascade)를 유도한다. KIR2DS와 연합되는 것 이외에도, HLA-C에 대한 수용체인 DAP12는 또한, H-2를 인식하는 활성화 마우스 Ly49D 및 Ly49H 수용체와 연합되고 HLA-E를 인식하는 사람 CD94/NKG2C 이종 이량체 수용체 복합체와 연합되는 NK 세포의 세포 표면에서 발현된다.

EST 데이터베이스를 조사함으로써 효능있는 막 시그널링 단백질을 동정하고자 하는 최근의 노력으로, 조혈 세포에서 주로 발현되는 신규한 10kD 표면 어댑터인 DAP10을 동정할 수 있었다. DAP10이 DAP12와 한정된 유사성만을 지니긴 하지만, 이의 막관통 도메인은 DAP12의 막관통 영역과 TCR의 CD3 아단위 모두에서 보존되는, 음전하를 띤 잔기를 함유한다. 또한, DAP12의 세포외 도메인과 CD3 쇄 내에 보존된 시스테인 잔기는 또한 DAP10에 존재한다. 흥미롭게도, 사람 DAP10 및 DAP12 유전자는 반대편 전사 배향으로, 염색체 19q13.1 상에 인접하여 놓여 있고, 아마도 유전자 중복 결과로서, 단지 대략 130개 염기쌍에 의해 격리되어 있다. DAP10의 하나의 독특한 특징은 이것이, 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI 3-키나제)의 p85 조절성 아단위에 대한 효능있는 src-상동체 2(SH2) 도메인-결합성 부위인 YxxM 시그널링 모티프를 함유하는, 짧지만 보존된 세포질 말미라는 것이다. 각종 OX2RH와 DAP12 또는 DAP10와의 물리적 및 기능적 연합을 결정할 수 있다.

XII. 유전 분석, 동물 연구

서열은 염색체 지도화, 질병 마커 상관관계의 결정, 및 각각의 유전자의 유전 구조물의 분리 및 결정에 유용한 이용 가능한 정보와 시약을 만들어 준다. 인트론/엑손 구조를 결정할 것이며, 형질전환성 및 결실 동물을 제조할 것이다[참조: Goodnow (1992) "Transgenic Animals" in Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego, pp. 1502-1504; Travis (1992) Science 256:1392-1394; Kuhn, et al. (1991) Science 254:707-710; Capecchi (1989) Science 244:1288; Robertson (ed. 1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; Rosenberg (1992) J. Clinical Oncology 10:180-199; and Cournoyer and Caskey (1993) Ann. Rev. Immunol. 11:297-329].

시험관내 및 생체내에서 OX2-OX2R 상호작용의 기능을 결정하기 위해서, 사람 IgG에 융합된 OX2RH1의 세포외 영역인, 가용성 형태로 생성되는 아데노바이러스 작제물을 제조한다. 단지 사람 IgG 주쇄인, 가용성 형태로 생성되는 대조군 작제물을 제조한다. 첫 번째 경우에서는, 이들 융합 단백질을 함유하는 상등액을 시험관내 세포성 감염시킴으로써 준비하여, 이러한 OX2 융합 단백질이 정상적으로 발현된 마우스 OX2에 대한 결합을 기준으로 하여 생물학적 기능을 지니고 있는지를 시험하였다. 첫 번째 시리즈 연구에서는, 정상적인 마우스 뿐만 아니라 OX2-유전자 녹아웃(KO) 마우스로부터의 마우스 비장의 조직 절편을 준비하고, OX2R 또는 대조군 융합 단백질을 가하면, 이들 시약은 상기 융합 단백질의 사람 Fc 부분에 대한 항체 결합의 첨가로써 검출되었으며, 후속 면역퍼옥시다제 염색 과정은 결합을 나타내었다. OX2R 융합 단백질만의 약한 결합, 및 정상적인 마우스 뿐만 아니라 OX2 KO 마우스에서의 약한 결합이 포상 수지상 세포와 내피 세포 상에서 검출되었다. 양 세포 유형은 리간드 OX2를 극히 고수준으로 발현하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 상기 시약이 생리학적 형태의 OX2에 결합되었으며, 리간드 OX2가 유전자 표적화로 인해 부재하는 비장에서는 결합이 전혀 관찰되지 않았다.

B 세포는 리간드 OX2를 발현하는 것으로 공지되어 있지만, 포상 수지상 세포 와 내피 세포 상에서 보다는 낮은 수준이다. 면역조직화학은 특별히 민감한 기술이 아니다. 따라서, 두 번째 연구에서는, 동일한 융합 단백질을 정상적인 마우스와 OX2 KO 마우스로부터 분리된 비장 백혈구에 적용하고, B 세포 상의 B220 분자에 특이적인 mAb를 사용하는 유동 세포계수법, 및 피코에리트린과 커플링된 사람 IgG에 대한 2차 항체에 의한 융합 단백질의 보다 민감한 검출법에 의해, B 세포에 대한 결합을 결정하였다. 이러한 경우, 정상적인 마우스에서의 모든 B 세포를 OX2R 융합 단백질로써 표지시키지만, 대조군 융합 단백질로써는 표지시키지 않는다. OX2R과 상호작용하는 마우스 OX2 분자의 일부와 결합하는 것으로 공지된 소위 OX90의 mAb를 첨가함으로써, OX2R 융합 단백질과 B 세포와의 상호작용을 차단시킨다. 또한, 대조군 융합 단배질을 사용하여 관찰된 배경 수준 이상의 어떠한 결합도, OX2R 융합 단백질을 OX2 KO 마우스로부터의 B 세포에 가할 경우에는 전혀 관찰되지 않았다.

이들 연구 결과는 다음과 같다: (1) OX2R 융합 단백질이 생물학적으로 활성이고 조혈 및 비-조혈 세포 상의 OX2와 결합되고; (2) OX2R에 의해 결합된 주요 리간드가 실제로는, 항-OX2(OX90) 결합 억제와 OX2 KO 마우스로부터의 B 세포에 대한 검출 가능한 결합 결여를 기준으로 하면, 동정된 리간드 OX2이다. 이들 데이터는, 심지어 유동 세포계수법도 극히 낮은 수준으로 발현된 세포-표면 분자를 검출하지 못하였기 때문에, 공지된 리간드 OX2 이외에도 OX2R에 의해 결합된 기타 리간드가 존재한다는 가능성을 배제할 수 없다.

형질전환성 마우스를 표준 방법으로 생성시킬 수 있다. 이러한 동물은 특정 조직에서의 유전자 결실 효과, 또는 완벽하게 유기체 전체 중의 유전자 결실 효과를 결정하는데 유용하다. 이는 각종 단계의 특정한 조직이나 동물을 개발하는데 흥미로운 통찰을 제공할 수 있다. 더우기, 생물학적 스트레스에 대한 각종 반응 상의 효과를 평가할 수 있다[참조: Hogan, et al. (1995) Manipulation the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (2d ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press]. 마찬가지로, 결실 마우스, 예를 들면, 녹아웃 마우스를 생성시킬 수 있다.

이들 동물을 생체내에서 유전자의 기능을 연구하기 위한 동물 모델로 할 것이다[참조: Gorczynski, et al. (1999) J. Immunol. 163:1654-1660; Mankoo, et al. (1990) Nature 400:69-73; Gorczynski, et al. (1999) Transplant. Proc. 31:577-578; and Gorczynski L, et al. (1999) J. Immunol. 162:774-781]. 특히 흥미로운 것은, 신경계 내의 마이크로글리아를 포함한, 혈액, 림프계 조직 또는 고형 기관에서의 대식세포 또는 기타 골수 세포 집단의 역할일 것이다. 감염, 자가면역 염증 및 신경 변성에 걸리기 쉬운지에 대한 시험이 지시된다. 길항제와 효능제 모두가, 기재되어 있거나 이용 가능하게 만든 시험관내 또는 생체내 모델에서 유용한 시약이 될 것이다.

XIII. 치료학적 가치를 지니는 것으로 예상되는 물질에 대한 스크리닝

대식세포 세포 표면 막에서 OX2R 분자를 가교결합시키기 위해 OX2R(OX2에 대한 실험적 치환물)과 반응성인 항체를 사용하고, 예를 들면, 시그널링 단백질의 산화질소 생성이나 인산화의 변화를 고찰함으로써, OX2R/OX2 상호작용의 생물학적 효과를 조사할 수 있다.

OX2R을 수반하는 대식세포를 OX2R에 대한 mAb(예: OX102)와 같은 가교 결합성 결합 파트너에 노출시키거나 또는 후보 물질의 존재 및 부재 하에 OX2의 재조합 다가 변형물에 노출시킴으로써, 상기 OX2R을 수반하는 대식세포를 사용하여 OX2R/OX2 상호작용의 섭동(perturbing) 효과를 시험할 수 있다. 후보 화합물의 존재하 및 부재하에서의 대식세포의 활성(예를 들면, 시그널링 단백질의 산화질소 생성 또는 인산화) 비교는 이러한 후보 물질이 조절성 효과(예를 들면, 억제 또는 증진)를 지니고 있는지를 지시해줄 것이다.

대식세포가 해당 질병의 병리학과 관련이 있는 질병, 예를 들면, 자가면역 질병이 있는 것으로 널리 확증된 모델에서 후보 물질을 시험할 수도 있다. 예를 들면, 상기 기재되고 예시된 바와 같이, 실험적 알레르기성 뇌척수염과 같은 기정의 모델을 사용할 수 있는데, 예를 들면, 이러한 모델은 마우스에서 자가면역 질병 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 발병 촉진을 나타내었다. OX2R 모사체는 만성 육아종과 같은 만성 질환에 유리할 수 있다. OX2/OX2R 시그널링의 효능제 또는 길항제의 조합물을, 현재 사용되고 있는 상기 질환 치료제와 조합할 수 있다[참조: Physicians' Desk Reference Medical Economics Co, Montvale, NJ].

상기와 같은 분석은 OX2R/OX2 상호작용 섭동이 치료학적으로 유익할 수 있는 방법을 지시할 것이다. 예를 들면, 본 발명은 상기 상호작용을 차단시키는 가능한 약리학적 시약을 스크리닝하기 위하여 이용 가능한 OX2 단백질과 연계하여 사용할 수 있는, OX2RH의 재조합 변형물을 만드는 수단을 제공해준다. 상호작용성 단백질의 입수 용이성은 약리학 산업에서 사용된 바와 같이, 고처리량 소 분자 스크리닝 프로그램에 대한 수단을 제공해준다[참조: High Throughput Screening, International Business Communication, Southborough, MA 01772-1749]. OX2RH의 세포질 영역을 통한 상호작용은 치료학적 표적인 것으로 예상되고, 서열과 이의 상호작용에 대한 지식은 유사한 스크리닝 방법을 통하여 약리학적 시약을 개발해주는 수단을 제공해준다.

XIV. 구조 활성 관계

특정한 잔기의 임계성에 대한 정보는 표준 과정 및 분석을 이용하여 결정한다. 예를 들면, 상이한 많은 변이체를 예정된 위치, 예를 들면, 상기 확인된 위치에서 생성시킨 다음 이러한 변이체의 생물학적 활성을 평가함으로써, 표준 돌연변이 유발 분석을 수행한다. 이는 활성을 변형시키는 위치를 결정하는 정도로 수행할 수 있거나, 또는 생물학적 활성을 보유하거나, 차단시키거나 또는 조절하도록 치환될 수 있는 잔기를 결정하기 위한 특이적 위치에 초점을 맞출 수 있다.

또 다른 한편, 천연 변이체의 분석은 천연 돌연변이에 대한 내성을 지닌 위치가 무엇인지를 지시해줄 수 있다. 이는 개개인들 간의 변이, 또는 균주 또는 종 간의 변이를 집단적으로 분석함으로써 비롯된 것일 수 있다. 선택된 개개인으로부터의 샘플을, 예를 들면, PCR 분석 및 서열화하여 분석한다. 이로써 집단 다형성을 평가할 수 있다.

본원의 모든 인용문헌은 각각의 개개 공보 또는 특허 출원이 참조문헌으로써 삽입되었다고 구체적으로 지시된 경우와 동일한 정도로 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다.

당해 분야의 숙련인에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 많은 변형 및 변이가 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 특정 양태는 단지 예로써 제공된 것이며, 본 발명은 첨부된 청구의 범위와 등가의 전범위와 함께, 이들 청구의 범위로서만 제한되며; 본 발명은 본원에 예로써 제시된 특정 양태로써 제한되지 않는다.

- 서열 목록 -

서열 1은 설치류 OX2R 뉴클레오티드 서열이다.

서열 2는 설치류 OX2R 폴리펩티드 서열이다.

서열 3은 영장류 OX2R 동족체 1 뉴클레오티드 서열이다.

서열 4는 영장류 OX2R 동족체 1 폴리펩티드 서열이다.

서열 5는 설치류 OX2R 동족체 1 뉴클레오티드 서열이다.

서열 6은 설치류 OX2R 동족체 1 폴리펩티드 서열이다.

서열 7은 영장류 OX2R 동족체 2 핵산 서열이다.

서열 8은 영장류 OX2R 동족체 2 폴리펩티드 서열이다.

서열 9는 설치류 OX2R 동족체 2 핵산 서열이다.

서열 10은 설치류 OX2R 동족체 2 폴리펩티드 서열이다.

서열 11은 설치류 OX2R 동족체 3 핵산 서열이다.

서열 12는 설치류 OX2R 동족체 3 폴리펩티드 서열이다.

서열 13은 설치류 OX2R 폴리펩티드 암호화 서열이다.

서열 14는 영장류 OX2R 동족체 1 폴리펩티드 암호화 서열이다.

서열 15는 설치류 OX2R 동족체 1 폴리펩티드 암호화 서열이다.

서열 16은 영장류 OX2R 동족체 2 폴리펩티드 암호화 서열이다.

서열 17은 설치류 OX2R 동족체 2 폴리펩티드 암호화 서열이다.

서열 18은 설치류 OX2R 동족체 3 폴리펩티드 암호화 서열이다.

서열 19는 영장류 OX2R 동족체 1.2 뉴클레오티드 서열이다.

서열 20은 영장류 OX2R 동족체 1.2 폴리펩티드 서열이다.

서열 21은 영장류 OX2R 동족체 1.2 폴리펩티드 암호화 서열이다.

서열 22는 설치류 OX2R 동족체 4 핵산 서열이다.

서열 23은 설치류 OX2R 동족체 4 폴리펩티드 서열이다.

서열 24는 설치류 OX2R 동족체 4 폴리펩티드 암호화 서열이다.

<110> Medical Research Council Schering Corporation <120> OX2 Receptor Homologs <130> DX01052K1 PCT <140> PCT/US 00/12998 <141> 2000-05-11 <150> GB 9911123.9 <151> 1999-05-13 <150> GB 9925989.7 <151> 1999-11-03 <160> 24 <170> KoPatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1574 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism:rodent; surmised rattus rattus <220> <221> CDS <222> (91)..(1071) <220> <221> mat_peptide <222> (162)..(1071) <400> 1 agcggaggga tcctggtcat ggtcaccgct gctcccctac ctgtgaagag aaagagcacc 60 gagtgagccg ctgaaaacca gaaaaccgaa atg ctc tgc ttt tgg aga act tct 114 Met Leu Cys Phe Trp Arg Thr Ser 1 5 cac gta gca gta ctc ttg atc tgg ggg gtc ttc gcg gct gag tca agt 162 His Val Ala Val Leu Leu Ile Trp Gly Val Phe Ala Ala Glu Ser Ser 10 15 20 tgt cct gat aag aat caa aca atg cag aac aat tca tca act atg aca 210 Cys Pro Asp Lys Asn Gln Thr Met Gln Asn Asn Ser Ser Thr Met Thr 25 30 35 40 gaa gtt aac act aca gtg ttt gta cag atg ggt aaa aag gct ctg ctc 258 Glu Val Asn Thr Thr Val 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Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu 90 95 100 aga ggc cag cct tcc tgc aca aaa gcc tac aag aaa gaa aca aat gag 567 Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Lys Lys Glu Thr Asn Glu 105 110 115 acc aag gaa acc aac tgt act gat gag aga ata acc tgg gtc tcc aga 615 Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg 120 125 130 cct gat cag aat tcg gac ctt cag att cgt acc gtg gcc atc act cat 663 Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Thr Val Ala Ile Thr His 135 140 145 gac ggg tat tac aga tgc ata atg gta aca cct gat ggg aat ttc cat 711 Asp Gly Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His 150 155 160 165 cgt gga tat cac ctc caa gtg tta gtt aca cct gaa gtg acc ctg ttt 759 Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe 170 175 180 caa aac agg aat aga act gca gta tgc aag gca gtt gca ggg aag cca 807 Gln Asn Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro 185 190 195 gct gcg cat atc tcc tgg atc cca gag ggc gat tgt gcc act aag caa 855 Ala Ala His Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln 200 205 210 gaa tac tgg agc aat ggc aca gtg act gtt aag agt aca tgc cac tgg 903 Glu Tyr Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp 215 220 225 gag gtc cac aat gtg tct acc gtg acc tgc cac gtc tcc cat ttg act 951 Glu Val His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr 230 235 240 245 ggc aac aag agt ctg tac ata gag cta ctt cct gtt cca ggt gcc aaa 999 Gly Asn Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys 250 255 260 aaa atc agc aaa att ata tat tcc ata tat cat cct tac tat tat tat 1047 Lys Ile Ser Lys Ile Ile Tyr Ser Ile Tyr His Pro Tyr Tyr Tyr Tyr 265 270 275 tta gac cat cgt ggg att cat ttg gtt gtt gaa agt caa tgg ctg cag 1095 Leu Asp His Arg Gly Ile His Leu Val Val Glu Ser Gln Trp Leu Gln 280 285 290 aaa ata taaattgaa taaaacagaa tctactccag ttgttgagga ggatgaaatg 1150 Lys Ile 295 cagccctatg ccagctacac agagaagaac aatcctctct atgatactac aaacaaggtg 1210 aaggcatctg aggcattaca aagtgaagtt gacacagacc tccatacttt ataagttgtt 1270 ggactctagt accaagaaac aacaacaaac gagatacatt ataattactg tctgattttc 1330 ttacagttct agaatgaaga cttatattga aattaggttt tccaaggttc ttagaagaca 1390 ttttaatgga ttctcattca tacccttgta taattggaat ttttgattct tagctgctac 1450 cagctagttc tctgaagaac tgatgttatt acaaagaaaa tacatgccca tgaccaaata 1510 ttcaaattgt gcaggacagt aaataatgaa aaccaaattt cctcaagaaa taactgaaga 1570 aggagcaagt gtgaacagtt tcttgtgtat cctt 1604 <210> 4 <211> 295 <212> PRT <213> Unknown <400> 4 Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu 1 5 10 15 Thr Ile Phe Leu Val Ala Glu Ala Glu Gly Ala Ala Gln Pro Asn Asn 20 25 30 Ser Leu Met Leu Gln Thr Ser Lys Glu Asn His Ala Leu Ala Ser Ser 35 40 45 Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val 50 55 60 Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala 65 70 75 80 Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr 85 90 95 Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Lys 100 105 110 Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile 115 120 125 Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Thr 130 135 140 Val Ala Ile Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro 145 150 155 160 Asp Gly Asn Phe His Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro 165 170 175 Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala 180 185 190 Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala His Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp 195 200 205 Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys 210 215 220 Ser Thr Cys His Trp Glu Val His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His 225 230 235 240 Val Ser His Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro 245 250 255 Val Pro Gly Ala Lys Lys Ile Ser Lys Ile Ile Tyr Ser Ile Tyr His 260 265 270 Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Leu Asp His Arg Gly Ile His Leu Val Val Glu 275 280 285 Ser Gln Trp Leu Gln Lys Ile 290 295 <210> 5 <211> 1490 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism:rodent; surmised mus musculus <220> <221> CDS <222> (10)..(987) <220> <221> mat_peptide <222> (85)..(987) <400> 5 aaaaccgaa atg ttt tgc ttt tgg aga act tct gcc cta gca gtg ctc tta 51 Met Phe Cys Phe Trp Arg Thr Ser Ala Leu Ala Val Leu Leu 1 5 10 ata tgg ggg gtc ttt gtg gct ggg tca agt tgt act gat aag aat caa 99 Ile Trp Gly Val Phe Val Ala Gly Ser Ser Cys Thr Asp Lys Asn Gln 15 20 25 30 aca aca cag aac aac agt tca tct cct ctg aca caa gtg aac act aca 147 Thr Thr Gln Asn Asn Ser Ser Ser Pro Leu Thr Gln Val Asn Thr Thr 35 40 45 gtg tct gta cag ata ggt aca aag gct ctg ctc tgc tgc ttt tct att 195 Val Ser Val Gln Ile Gly Thr Lys Ala Leu Leu Cys Cys Phe Ser Ile 50 55 60 cca ctg aca aaa gca gta tta atc aca tgg ata ata aag ctc aga ggc 243 Pro Leu Thr Lys Ala Val Leu Ile Thr Trp Ile Ile Lys Leu Arg Gly 65 70 75 ctg cca tcc tgc aca ata gca tac aaa gta gat aca aag acc aat gaa 291 Leu Pro Ser Cys Thr Ile Ala Tyr Lys Val Asp Thr Lys Thr Asn Glu 80 85 90 acc agc tgc ttg ggc agg aac atc acc tgg gcc tcc aca cct gac cac 339 Thr Ser Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro Asp His 95 100 105 110 agt cct gaa ctt cag atc agt gca gtg acc ctc cag cat gag ggg act 387 Ser Pro Glu Leu Gln Ile Ser Ala Val Thr Leu Gln His Glu Gly Thr 115 120 125 tac aca tgt gag aca gta aca cct gaa ggg aat ttt gaa aaa aac tat 435 Tyr Thr Cys Glu Thr Val Thr Pro Glu Gly Asn Phe Glu Lys Asn Tyr 130 135 140 gac ctc caa gtg ctg gtg ccc cct gaa gta acc tac ttt cca gag aaa 483 Asp Leu Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Pro Glu Lys 145 150 155 aac aga tct gca gtc tgt gag gca atg gca ggc aag cct gct gca cag 531 Asn Arg Ser Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln 160 165 170 atc tct tgg tct cca gat ggg gac tgt gtc act acg agt gaa tca cac 579 Ile Ser Trp Ser Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Thr Ser Glu Ser His 175 180 185 190 agc aat ggc act gtg act gtc agg agc aca tgc cac tgg gag cag aac 627 Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu Gln Asn 195 200 205 aat gtg tct gat gtg tcc tgc att gtc tct cat ttg act ggt aac caa 675 Asn Val Ser Asp Val Ser Cys Ile Val Ser His Leu Thr Gly Asn Gln 210 215 220 tct ctg tcc ata gaa ctg agt aga ggt ggt aac caa tca tta cga cca 723 Ser Leu Ser Ile Glu Leu Ser Arg Gly Gly Asn Gln Ser Leu Arg Pro 225 230 235 tat att cca tac atc ata cca tca att atc att ttg atc atc ata gga 771 Tyr Ile Pro Tyr Ile Ile Pro Ser Ile Ile Ile Leu Ile Ile Ile Gly 240 245 250 tgc att tgt ctt ttg aaa atc agt ggc ttc aga aaa tgc aaa ttg cca 819 Cys Ile Cys Leu Leu Lys Ile Ser Gly Phe Arg Lys Cys Lys Leu Pro 255 260 265 270 aaa tta gaa gct act tca gct att gag gag gat gaa atg cag cct tat 867 Lys Leu Glu Ala Thr Ser Ala Ile Glu Glu Asp Glu Met Gln Pro Tyr 275 280 285 gct agc tat aca gag aag agc aat cca ctc tat gat act gtg act aag 915 Ala Ser Tyr Thr Glu Lys Ser Asn Pro Leu Tyr Asp Thr Val Thr Lys 290 295 300 gtg gag gca ttt cca gta tca caa ggc gaa gtc aat ggc aca gac tgc 963 Val Glu Ala Phe Pro Val Ser Gln Gly Glu Val Asn Gly Thr Asp Cys 305 310 315 ctt act ttg tcg gcc att gga atc tag aaccaagaaa aaagaagtca 1010 Leu Thr Leu Ser Ala Ile Gly Ile 320 325 agagacatca taattactgc tttgctttct ttaaaattcg acaatggaag gactacttgg 1070 aaattagctc ttccaaagct attaaaaagc acaaatgttc taatgaaatt gcatttaaat 1130 tctatcattg gaagtttgga atctctgctg ctacctgtta attttaggaa gaactgattt 1190 aattattaca aagaaagcac atggttatgg tgaaatatca agttgtgcaa taaagtatga 1250 tgaaaactga gtttcctcaa gaaataactg caggaggaac aatcatcact aaagaatttc 1310 atgtgagttc ttacaaaaaa attcctatgt atacatgact atggtatgtg tgtccaatta 1370 catgtttatt tacaaatgtg tatatatgca cacatttgct tttcaggaca tctccttgta 1430 aaaaacacac tggagttttg gatttataaa agcttataaa gtgagcattg gagatatttt 1490 1490 <210> 6 <211> 326 <212> PRT <213> Unknown <400> 6 Met Phe Cys Phe Trp Arg Thr Ser Ala Leu Ala Val Leu Leu Ile Trp 1 5 10 15 Gly Val Phe Val Ala Gly Ser Ser Cys Thr Asp Lys Asn Gln Thr Thr 20 25 30 Gln Asn Asn Ser Ser Ser Pro Leu Thr Gln Val Asn Thr Thr Val Ser 35 40 45 Val Gln Ile Gly Thr Lys Ala Leu Leu Cys Cys Phe Ser Ile Pro Leu 50 55 60 Thr Lys Ala Val Leu Ile Thr Trp Ile Ile Lys Leu Arg Gly Leu Pro 65 70 75 80 Ser Cys Thr Ile Ala Tyr Lys Val Asp Thr Lys Thr Asn Glu Thr Ser 85 90 95 Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro Asp His Ser Pro 100 105 110 Glu Leu Gln Ile Ser Ala Val Thr Leu Gln His Glu Gly Thr Tyr Thr 115 120 125 Cys Glu Thr Val Thr Pro Glu Gly Asn Phe Glu Lys Asn Tyr Asp Leu 130 135 140 Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Pro Glu Lys Asn Arg 145 150 155 160 Ser Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser 165 170 175 Trp Ser Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Thr Ser Glu Ser His Ser Asn 180 185 190 Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu Gln Asn Asn Val 195 200 205 Ser Asp Val Ser Cys Ile Val Ser His Leu Thr Gly Asn Gln Ser Leu 210 215 220 Ser Ile Glu Leu Ser Arg Gly Gly Asn Gln Ser Leu Arg Pro Tyr Ile 225 230 235 240 Pro Tyr Ile Ile Pro Ser Ile Ile Ile Leu Ile Ile Ile Gly Cys Ile 245 250 255 Cys Leu Leu Lys Ile Ser Gly Phe Arg Lys Cys Lys Leu Pro Lys Leu 260 265 270 Glu Ala Thr Ser Ala Ile Glu Glu Asp Glu Met Gln Pro 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Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Val Glu Arg Ile Thr Trp Val 65 70 75 80 tct aga cct gat cag aat tcg gac ctt cag att cgt ccg gtg gac acc 288 Ser Arg Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Asp Thr 85 90 95 act cat gac ggg tat tac aga ggc ata gtg gta aca cct gat ggg aat 336 Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Ile Val Val Thr Pro Asp Gly Asn 100 105 110 ttc cat cgt gga tat cac ctc caa gtg tta gtt aca ccc gaa gtg aac 384 Phe His Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Asn 115 120 125 cta ttt caa agc agg aat ata act gca gta tgc aag gca gtt aca ggg 432 Leu Phe Gln Ser Arg Asn Ile Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Thr Gly 130 135 140 aag cca gct gcc cag atc tcc tgg atc cca gag gga tct att ctt gcc 480 Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Ser Ile Leu Ala 145 150 155 160 act aag caa gaa tac tgg ggc aat ggc aca gtg acg gtt aag agt aca 528 Thr Lys Gln Glu Tyr Trp Gly Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr 165 170 175 tgc ccc tgg gag ggc cac aag tct act gtg acc tgc cat gtc tcc cat 576 Cys Pro Trp Glu Gly His Lys Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His 180 185 190 ttg act ggc aac aag agt ctg tcc gta aag ttg aat tca ggt ctc aga 624 Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Ser Val Lys Leu Asn Ser Gly Leu Arg 195 200 205 acc tca gga tct cca gcg ttg tcc tta ctg atc att ctt tat gtg aaa 672 Thr Ser Gly Ser Pro Ala Leu Ser Leu Leu Ile Ile Leu Tyr Val Lys 210 215 220 ctc tct ctt ttt gtg gtc att ctg gtc acc aca gga ttt gtt ttc ttc 720 Leu Ser Leu Phe Val Val Ile Leu Val Thr Thr Gly Phe Val Phe Phe 225 230 235 240 cag agg ata aat cat gtc aga aaa gtt ctt taaagaagaa ggaagggtct 770 Gln Arg Ile Asn His Val Arg Lys Val Leu 245 250 tcttttgctt ctcctccttg tctctggact gcaacattgg tgagatgagt gatggtccag 830 cagtgaactt gggccatgga tgatgttaag gatagaagcc actcagtagg atagaagaaa 890 agaaagatgg aagaaggatc ctgggcttga tgaccatgaa gtttccctat aaaccctcaa 950 ccacctattc attgacttct tttgtgttag agtgaataaa attttgttca tgccagtgtt 1010 1010 <210> 8 <211> 250 <212> PRT <213> Unknown <400> 8 Met Gly Gly Lys Gln Met Thr Gln Asn Tyr Ser Thr Ile Phe Ala Glu 1 5 10 15 Gly Asn Ile Ser Gln Pro Val Leu Met Asp Ile Asn Ala Val Leu Cys 20 25 30 Cys Pro Pro Ile Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile 35 40 45 Ile Leu Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Lys Lys Glu Thr 50 55 60 Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Val Glu Arg Ile Thr Trp Val 65 70 75 80 Ser Arg Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Asp Thr 85 90 95 Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Ile Val Val Thr Pro Asp Gly Asn 100 105 110 Phe His Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Asn 115 120 125 Leu Phe Gln Ser Arg Asn Ile Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Thr Gly 130 135 140 Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Ser Ile Leu Ala 145 150 155 160 Thr Lys Gln Glu Tyr Trp Gly Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr 165 170 175 Cys Pro Trp Glu Gly His Lys Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His 180 185 190 Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Ser Val Lys Leu Asn Ser Gly Leu Arg 195 200 205 Thr Ser Gly Ser Pro Ala Leu Ser Leu Leu Ile Ile Leu Tyr Val Lys 210 215 220 Leu Ser Leu Phe Val Val Ile Leu Val Thr Thr Gly Phe Val Phe Phe 225 230 235 240 Gln Arg Ile Asn His Val Arg Lys Val Leu 245 250 <210> 9 <211> 1085 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism:rodent; surmised mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(582) <400> 9 aga ggc cag cct tcc tgc ata atg gcc tac aaa gta gaa aca aag gag 48 Arg Gly Gln Pro Ser Cys Ile Met Ala Tyr Lys Val Glu Thr Lys Glu 1 5 10 15 acc aat gaa acc tgc ttg ggc agg aac atc acc tgg gcc tcc aca cct 96 Thr Asn Glu Thr Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro 20 25 30 gac cac att cct gac ctt cag atc agt gcg gtg gcc ctc cag cat gag 144 Asp His Ile Pro Asp Leu Gln Ile Ser Ala Val Ala Leu Gln His Glu 35 40 45 ggg aat tac tta tgt gag ata aca aca cct gaa ggg aat ttc cat aaa 192 Gly Asn Tyr Leu Cys Glu Ile Thr Thr Pro Glu Gly Asn Phe His Lys 50 55 60 gtc tat gac ctc caa gtg ctg gtg ccc cct gaa gta acc tac ttt ctc 240 Val Tyr Asp Leu Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Leu 65 70 75 80 ggg gaa aat aga act gca gtt tgt gag gca atg gca ggc aag cct gct 288 Gly Glu Asn Arg Thr Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala 85 90 95 gca cag atc tct tgg act cca gat ggg gac tgt gtc act aag agt gag 336 Ala Gln Ile Ser Trp Thr Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Lys Ser Glu 100 105 110 tca cac agc aat ggc act gtg act gtc agg agc act tgc cac tgg gag 384 Ser His Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu 115 120 125 cag aac aat gtg tct gct gtg tcc tgc att gtc tct cat tcg act ggt 432 Gln Asn Asn Val Ser Ala Val Ser Cys Ile Val Ser His Ser Thr Gly 130 135 140 aat cag tct ctg tcc ata gaa ctg agt aga ggt acc acc agc acc acc 480 Asn Gln Ser Leu Ser Ile Glu Leu Ser Arg Gly Thr Thr Ser Thr Thr 145 150 155 160 cct tcc ttg ctg acc att ctc tac gtg aaa atg gtc ctt ttg ggg att 528 Pro Ser Leu Leu Thr Ile Leu Tyr Val Lys Met Val Leu Leu Gly Ile 165 170 175 att ctt ctt aaa gtg gga ttt gct ttc ttc cag aag aga aat gtt acc 576 Ile Leu Leu Lys Val Gly Phe Ala Phe Phe Gln Lys 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Ile Leu 5 10 15 gtg cct gag tca agt tgt tca gtg aaa gga cgg gag gag atc cca ccg 146 Val Pro Glu Ser Ser Cys Ser Val Lys Gly Arg Glu Glu Ile Pro Pro 20 25 30 35 gat gat tca ttt cct ttt tca gat gat aat atc ttc cct gat gga gtg 194 Asp Asp Ser Phe Pro Phe Ser Asp Asp Asn Ile Phe Pro Asp Gly Val 40 45 50 ggc gtc acc atg gag att gag att atc act cca gtg tct gta cag ata 242 Gly Val Thr Met Glu Ile Glu Ile Ile Thr Pro Val Ser Val Gln Ile 55 60 65 ggt atc aag gct cag ctt ttc tgt cat cct agt cca tca aaa gaa gca 290 Gly Ile Lys Ala Gln Leu Phe Cys His Pro Ser Pro Ser Lys Glu Ala 70 75 80 aca ctt aga ata tgg gaa ata act ccc aga gac tgg cct tcc tgc aga 338 Thr Leu Arg Ile Trp Glu Ile Thr Pro Arg Asp Trp Pro Ser Cys Arg 85 90 95 cta ccc tac aga gca gag ttg cag cag atc agt aaa aaa atc tgt act 386 Leu Pro Tyr Arg Ala Glu Leu Gln Gln Ile Ser Lys Lys Ile Cys Thr 100 105 110 115 gag aga gga acc act agg gtc cct gca cat cac cag agt tct gac ctt 434 Glu Arg Gly Thr Thr Arg Val Pro Ala His His Gln Ser Ser Asp Leu 120 125 130 ccc atc aaa tca atg gcc ctc aag cat gat ggg cat tac tca tgt cgg 482 Pro Ile Lys Ser Met Ala Leu Lys His Asp Gly His Tyr Ser Cys Arg 135 140 145 ata gaa aca aca gat ggg att ttc caa gag aga cat agc atc caa gtg 530 Ile Glu Thr Thr Asp Gly Ile Phe Gln Glu Arg His Ser Ile Gln Val 150 155 160 cca ggg gaa aat aga act gta gtt tgt gag gca att gca agc aag cct 578 Pro Gly Glu Asn Arg Thr Val Val Cys Glu Ala Ile Ala Ser Lys Pro 165 170 175 gct atg cag atc ttg tgg act cca gat gag gac tgt gtc act aag agt 626 Ala Met Gln Ile Leu Trp Thr Pro Asp Glu Asp Cys Val Thr Lys Ser 180 185 190 195 aaa tca cac aat gac acc atg att gtc agg agc aag tgc cac agg gag 674 Lys Ser His Asn Asp Thr Met Ile Val Arg Ser Lys Cys His Arg Glu 200 205 210 aaa aac aat ggc cac agt gtg ttc tgc ttt atc tcc cat ttg act gat 722 Lys Asn Asn Gly His Ser Val Phe Cys Phe Ile Ser His Leu Thr Asp 215 220 225 aac tgg att ctc tcc atg gaa cag aat cga ggt aca acc agc atc ctg 770 Asn Trp Ile Leu Ser Met Glu Gln Asn Arg Gly Thr Thr Ser Ile Leu 230 235 240 cct tcc ttg ctg agc att ctc tat gtg aaa ctg gct gta act gtt ctc 818 Pro Ser Leu Leu Ser Ile Leu Tyr Val Lys Leu Ala Val Thr Val Leu 245 250 255 atc gta gga ttt gct ttt ttc cag aag aga aat tat ttc aga gtg cca 866 Ile Val Gly Phe Ala Phe Phe Gln Lys Arg Asn Tyr Phe Arg Val Pro 260 265 270 275 gaa ggc tcc tgagg agagtggtct gtggttaaga tgagatttac caccatctga 920 Glu Gly Ser aagacatctt gtctaccgcg cagcgtgctg agattccgag aagcagccac agaacctact 980 aggaagacaa atctgatgtg gttgtcaatc ctttcaatgg acctgagtac ttctataaac 1040 ccgagtgagg ttgtgctgga cccaggagcc aggctaggtc atatatgttg atttttgctg 1100 caagacctca tggtttatct acaaatccta aattctttca cttccagttt taaaactttt 1160 ggcccaagca ttttatccac agcataacac ctttaaagaa actctcccac ggaaactgct 1220 ggttccatgg aatggaaaat tgcaacatgg tttacaagac agtgcaaacc aagcagcatt 1280 ccaagatatg agcttcagaa agttacagga actgtcttgg gacgagaaag aaggattaaa 1340 tagttcccag tccc 1354 <210> 12 <211> 278 <212> PRT <213> Unknown <400> 12 Met His Ala Leu Gly Arg Thr Leu 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hgcnggnaar ccngcngcnc arathwsntg gacnccngay 540 ggngaytgyg tngcnaaraa ygarwsncay wsnaayggna cngtnacngt nmgnwsnacn 600 tgycaytggg arcarwsnca ygtnwsngtn gtnttytgyg tngtnwsnca yytnacnacn 660 ggnaaycarw snytnwsnat hgarytnggn mgnggnggng aycarytnyt nggnwsntay 720 athcartaya thathccnws nathathath ytnathatha thggntgyat htgyytnytn 780 aarathwsng gntgymgnaa rtgyaarytn ccnaarwsng gngcnacncc ngayathgar 840 gargaygara tgcarccnta ygcnwsntay acngaraarw snaayccnyt ntaygayacn 900 gtnacnacna cngargcnca yccngcnwsn carggnaarg tnaayggnac ngaytgyytn 960 acnytnwsng cnatgggnat h 981 <210> 14 <211> 885 <212> DNA <213> reverse translation <220> <221> misc_feature <222> (1)..(885) <223> n may be a, c, g, or t <400> 14 atgytntgyc cntggmgnac ngcnaayytn ggnytnytny tnathytnac nathttyytn 60 gtngcngarg cngarggngc ngcncarccn aayaaywsny tnatgytnca racnwsnaar 120 garaaycayg cnytngcnws nwsnwsnytn tgyatggayg araarcarat hacncaraay 180 taywsnaarg tnytngcnga rgtnaayacn wsntggccng tnaaratggc nacnaaygcn 240 gtnytntgyt 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Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp 195 200 205 tgt gcc act aag caa gaa tac tgg agc aat ggc aca gtg act gtt aag 672 Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys 210 215 220 agt aca tgc cac tgg gag gtc cac aat gtg tct acc gtg acc tgc cac 720 Ser Thr Cys His Trp Glu Val His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His 225 230 235 240 gtc tcc cat ttg act ggc aac aag agt ctg tac ata gag cta ctt cct 768 Val Ser His Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro 245 250 255 gtt cca ggt gcc aaa aaa tca gca aaa tta tat att cca tat atc atc 816 Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser Ala Lys Leu Tyr Ile Pro Tyr Ile Ile 260 265 270 ctt act att att att ttg acc atc gtg gga ttc att tgg ttg ttg aaa 864 Leu Thr Ile Ile Ile Leu Thr Ile Val Gly Phe Ile Trp Leu Leu Lys 275 280 285 gtc aat ggc tgc aga aaa tat aaa ttg aat aaa aca gaa tct act cca 912 Val Asn Gly Cys Arg Lys Tyr Lys Leu Asn Lys Thr Glu Ser Thr Pro 290 295 300 gtt gtt gag gag gat gaa atg cag ccc tat gcc agc tac aca gag aag 960 Val Val Glu Glu Asp 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His Thr Leu 340 345 <210> 21 <211> 1044 <212> DNA <213> reverse translation <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1044) <223> n may be a, c, g, or t <400> 21 atgytntgyc cntggmgnac ngcnaayytn ggnytnytny tnathytnac nathttyytn 60 gtngcngarg cngarggngc ngcncarccn aayaaywsny tnatgytnca racnwsnaar 120 garaaycayg cnytngcnws nwsnwsnytn tgyatggayg araarcarat hacncaraay 180 taywsnaarg tnytngcnga rgtnaayacn wsntggccng tnaaratggc nacnaaygcn 240 gtnytntgyt gyccnccnat hgcnytnmgn aayytnatha thathacntg ggarathath 300 ytnmgnggnc arccnwsntg yacnaargcn taymgnaarg aracnaayga racnaargar 360 acnaaytgya cngaygarmg nathacntgg gtnwsnmgnc cngaycaraa ywsngayytn 420 carathmgnc cngtngcnat hacncaygay ggntaytaym gntgyathat ggtnacnccn 480 gayggnaayt tycaymgngg ntaycayytn cargtnytng tnacnccnga rgtnacnytn 540 ttycaraaym gnaaymgnac ngcngtntgy aargcngtng cnggnaarcc ngcngcncar 600 athwsntgga thccngargg ngaytgygcn acnaarcarg artaytggws naayggnacn 660 gtnacngtna arwsnacntg ycaytgggar gtncayaayg tnwsnacngt nacntgycay 720 gtnwsncayy tnacnggnaa yaarwsnytn tayathgary tnytnccngt nccnggngcn 780 aaraarwsng cnaarytnta yathccntay athathytna cnathathat hytnacnath 840 gtnggnttya thtggytnyt naargtnaay ggntgymgna artayaaryt naayaaracn 900 garwsnacnc cngtngtnga rgargaygar atgcarccnt aygcnwsnta yacngaraar 960 aayaayccny tntaygayac nacnaayaar gtnaargcnw sncargcnyt ncarwsngar 1020 gtngayacng ayytncayac nytn 1044 <210> 22 <211> 813 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism:rodent; surmised mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(810) <220> <221> mat_peptide <222> (76)..(810) <400> 22 atg cat gct ctg ggg agg att ccg act ttg act ttg ctg atc ttc atc 48 Met His Ala Leu Gly Arg Ile Pro Thr Leu Thr Leu Leu Ile Phe Ile 1 5 10 15 aat att ttt gtg tct ggg tca agt tgt act gat gag aat caa aca ata 96 Asn Ile Phe Val Ser Gly Ser Ser Cys Thr Asp Glu Asn Gln Thr Ile 20 25 30 cag aat gac agt tca tct tct ctg aca caa gtt aac act aca atg tct 144 Gln Asn Asp Ser Ser Ser Ser Leu Thr Gln Val Asn Thr Thr Met Ser 35 40 45 gta cag atg gat aaa aag gct ctg ctc tgc tgc ttt tct agt cca ctg 192 Val Gln Met Asp Lys Lys Ala Leu Leu Cys Cys Phe Ser Ser Pro Leu 50 55 60 ata aat gca gta tta atc aca tgg ata ata aaa cac aga cac ctg cct 240 Ile Asn Ala Val Leu Ile Thr Trp Ile Ile Lys His Arg His Leu Pro 65 70 75 80 tcc tgc aca ata gca tac aac cta gat aaa aag acc aat gaa acc agc 288 Ser Cys Thr Ile Ala Tyr Asn Leu Asp Lys Lys Thr Asn Glu Thr Ser 85 90 95 tgc ttg ggc agg aac atc acc tgg gcc tcc aca cct gac cac agt cct 336 Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro Asp His Ser Pro 100 105 110 gaa ctt cag atc agt gca gtg gcc ctc cag cat gag ggg act tac aca 384 Glu Leu Gln Ile Ser Ala Val Ala Leu Gln His Glu Gly Thr Tyr Thr 115 120 125 tgt gag ata gta aca cct gaa ggg aat tta gaa aaa gtc tat gac ctc 432 Cys Glu Ile Val Thr Pro Glu Gly Asn Leu Glu Lys Val Tyr Asp Leu 130 135 140 caa gtg ctg gtg ccc cct gag gta acc tac ttt cca ggg aaa aac aga 480 Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Pro Gly Lys Asn Arg 145 150 155 160 act gca gtc tgt gag gca atg gca ggc aag cct gct gca cag atc tct 528 Thr Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser 165 170 175 tgg act cca gat ggg gac tgt gtc act aag agt gag tca cac agc aat 576 Trp Thr Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Lys Ser Glu Ser His Ser Asn 180 185 190 ggc act gtg act gtc agg agc acg tgc cac tgg gag cag aac aat gtg 624 Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu Gln Asn Asn Val 195 200 205 tct gtt gtg tcc tgc tta gtc tct cat tcg act ggt aat cag tct ctg 672 Ser Val Val Ser Cys Leu Val Ser His Ser Thr Gly Asn Gln Ser Leu 210 215 220 tcc ata gaa ctg agt caa ggt aca atg acc acc ccc cgt tcc ttg ctg 720 Ser Ile Glu Leu Ser Gln Gly Thr Met Thr Thr Pro Arg Ser Leu Leu 225 230 235 240 acc att ctc tat gtg aaa atg gcc ctt ttg gtg att att ctt ctt aac 768 Thr Ile Leu Tyr Val Lys Met Ala Leu Leu Val Ile Ile Leu Leu Asn 245 250 255 gta gga ttt gct ttc ttc cag aag aga aat ttt gcc aga aca 810 Val Gly Phe Ala Phe Phe Gln Lys Arg Asn Phe Ala Arg Thr 260 265 270 tga 813 <210> 23 <211> 270 <212> PRT <213> Unknown <400> 23 Met His Ala Leu Gly Arg Ile Pro Thr Leu Thr Leu Leu Ile Phe Ile 1 5 10 15 Asn Ile Phe Val Ser Gly Ser Ser Cys Thr Asp Glu Asn Gln Thr Ile 20 25 30 Gln Asn Asp Ser Ser Ser Ser Leu Thr Gln Val Asn Thr Thr Met Ser 35 40 45 Val Gln Met Asp Lys Lys Ala Leu Leu Cys Cys Phe Ser Ser Pro Leu 50 55 60 Ile Asn Ala Val Leu Ile Thr Trp Ile Ile Lys His Arg His Leu Pro 65 70 75 80 Ser Cys Thr Ile Ala Tyr Asn Leu Asp Lys Lys Thr Asn Glu Thr Ser 85 90 95 Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro Asp His Ser Pro 100 105 110 Glu Leu Gln Ile Ser Ala Val Ala Leu Gln His Glu Gly Thr Tyr Thr 115 120 125 Cys Glu Ile Val Thr Pro Glu Gly Asn Leu Glu Lys Val Tyr Asp Leu 130 135 140 Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Pro Gly Lys Asn Arg 145 150 155 160 Thr Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser 165 170 175 Trp Thr Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Lys Ser Glu Ser His Ser Asn 180 185 190 Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu Gln Asn Asn Val 195 200 205 Ser Val Val Ser Cys Leu Val Ser His Ser Thr Gly Asn Gln Ser Leu 210 215 220 Ser Ile Glu Leu Ser Gln Gly Thr Met Thr Thr Pro Arg Ser Leu Leu 225 230 235 240 Thr Ile Leu Tyr Val Lys Met Ala Leu Leu Val Ile Ile Leu Leu Asn 245 250 255 Val Gly Phe Ala Phe Phe Gln Lys Arg Asn Phe Ala Arg Thr 260 265 270 <210> 24 <211> 810 <212> DNA <213> reverse translation <220> <221> misc_feature <222> (1)..(810) <223> n may be a, c, g, or t <400> 24 atgcaygcny tnggnmgnat hccnacnytn acnytnytna thttyathaa yathttygtn 60 wsnggnwsnw sntgyacnga ygaraaycar acnathcara aygaywsnws nwsnwsnytn 120 acncargtna ayacnacnat gwsngtncar atggayaara argcnytnyt ntgytgytty 180 wsnwsnccny tnathaaygc ngtnytnath acntggatha thaarcaymg ncayytnccn 240 wsntgyacna thgcntayaa yytngayaar aaracnaayg aracnwsntg yytnggnmgn 300 aayathacnt gggcnwsnac nccngaycay wsnccngary tncarathws ngcngtngcn 360 ytncarcayg arggnacnta yacntgygar athgtnacnc cngarggnaa yytngaraar 420 gtntaygayy tncargtnyt ngtnccnccn gargtnacnt ayttyccngg naaraaymgn 480 acngcngtnt gygargcnat ggcnggnaar ccngcngcnc arathwsntg gacnccngay 540 ggngaytgyg tnacnaarws ngarwsncay wsnaayggna cngtnacngt nmgnwsnacn 600 tgycaytggg arcaraayaa ygtnwsngtn gtnwsntgyy tngtnwsnca ywsnacnggn 660 aaycarwsny tnwsnathga rytnwsncar ggnacnatga cnacnccnmg nwsnytnytn 720 acnathytnt aygtnaarat ggcnytnytn gtnathathy tnytnaaygt nggnttygcn 780 ttyttycara armgnaaytt ygcnmgnacn 810

Claims (7)

1. a) 성숙한 서열 4를 갖는 천연 서열 영장류 OX2 수용체 동족체(OX2RH) 1 폴리펩티드;

   b) 성숙한 서열 6을 갖는 천연 서열 설치류 OX2RH1 폴리펩티드;

   c) 성숙한 서열 8을 갖는 천연 서열 영장류 OX2RH2 폴리펩티드;

   d) 성숙한 서열 10을 갖는 천연 서열 설치류 OX2RH2 폴리펩티드;

   e) 성숙한 서열 12를 갖는 천연 서열 설치류 OX2RH3 폴리펩티드; 및

   f) 성숙한 서열 23을 갖는 천연 서열 설치류 OX2RH4 폴리펩티드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
2. 제1항에서 정의한 바와 같은, 서열 4의 OX2RH1, 서열 6의 OX2RH1, 서열 8의 OX2RH2, 서열 10의 OX2RH2, 서열 12의 OX2RH3 및 서열 23의 OX2RH4 폴리펩티드와 특이적으로 결합되고,

   a) 결합성 화합물이 용기 내에 있거나;

   b) 상기 OX2RH1, OX2RH2, OX2RH3 및 OX2RH4 폴리펩티드가 설치류 또는 영장류 기원이거나;

   c) 결합성 화합물이 Fv, Fab 또는 Fab2 단편이거나;

   d) 결합성 화합물이 또 다른 화학적 잔기에 접합되거나; 또는

   e) 항체가

   i) 서열 4의 OX2RH1, 서열 6의 OX2RH1, 서열 8의 OX2RH2, 서열 10의 OX2RH2, 서열 12의 OX2RH3 또는 서열 23의 OX2RH4의 성숙한 폴리펩티드의 펩티드 서열에 대해 생성되거나;

   ii) 정제된 서열 4의 OX2RH1 또는 서열 8의 OX2RH2 폴리펩티드에 대해 생성되거나;

   iii) 면역선별되거나;

   iv) 폴리클로날 항체이거나;

   v) 항원에 대한 Kd가 30μM 이상이거나;

   vi) 비드(bead) 또는 플라스틱 막을 포함한 고체 기질에 부착되거나;

   vii) 멸균 조성물 내에 함유되거나; 또는

   viii) 형광성 표지(fluorescent label)를 포함하여, 검출 가능한 수준으로 표지되는, 항체로부터의 항원 결합성 부위를 포함하는 결합성 화합물.
3. 핵산이,

   i) 발현 벡터이고;

   ii) 복제 기원(origin)을 추가로 포함하며;

   iii) 천연 공급원으로부터의 것이고;

   iv) 검출 가능한 표지를 포함하며;

   v) 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하고;

   vi) 6kb 미만, 바람직하게는 3kb 미만이며;

   vii) 영장류 또는 설치류 기원이고;

   viii) 천연의 완전한 길이의 암호화 서열을 포함하며;

   ix) 서열 4의 OX2RH1 폴리펩티드 및 서열 8의 OX2RH2 폴리펩티드를 암호화하는 유전자에 대한 하이브리드화 프로브이고;

   x) DAP12 또는 DAP10을 추가로 암호화하며; 및

   xi) PCR 프라이머, PCR 생성물 또는 돌연변이 유발 프라이머인,

   제1항에서 정의한 바와 같은, 서열 4의 OX2RH1 폴리펩티드, 서열 6의 OX2RH1 폴리펩티드, 서열 8의 OX2RH2 폴리펩티드, 서열 10의 OX2RH2 폴리펩티드, 서열 12의 OX2RH3 폴리펩티드 또는 서열 23의 OX2RH4 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
4. OX2RH에 대한 항체, 가용성 OX2RH 작제물, 가용성 OX2RH-Ig 융합물(여기서, OX2RH는 서열 4의 OX2RH1 또는 서열 8의 OX2RH2이다) 또는 OX2R 안티센스 핵산을 포함하는, 세포 또는 조직 배양 세포의 생리학 또는 발생을 조절하기 위한 약제학적 조성물.
5. 제4항에 있어서,

   a) 생리학을 조절하는 것이

   i) 골수 기능의 증진; 또는

   ii) 면역성의 증진이거나;

   b) OX2RH에 대한 항체, 가용성 OX2RH 작제물, 가용성 OX2RH-Ig 융합물(여기서, OX2RH는 서열 4의 OX2RH1 또는 서열 8의 OX2RH2이다) 또는 OX2R 안티센스 핵산이 상기 세포에 대한 OX2 매개된 시그널링을 약화시키는, 약제학적 조성물.
6. 제5항에 있어서,

   a) 생리학을 조절하는 것이 시험관내에서 골수 세포 기능을 증진시키는 것이거나; 또는

   b) 생리학을 조절하는 것이, 상기 OX2RH에 대한 항체, 가용성 OX2RH 작제물, 가용성 OX2RH-Ig 융합물(여기서, OX2RH는 서열 4의 OX2RH1 또는 서열 8의 OX2RH2이다) 또는 OX2R 안티센스 핵산으로 전신 치료된 동물에서 면역성을 증진시키는 것인, 약제학적 조성물.
7. OX2 녹아웃 마우스(knockout mouse)로부터의 유전자 라이브러리를 대상으로 하여, OX2R-Ig 융합 단백질에 대한 결합을 스크리닝하는 단계; 및 이러한 융합 단백질과 결합하는 유전자를 동정하는 단계를 포함하는, OX2R에 대한 비-OX2 리간드를 동정하는 방법.