KR20090119910A

KR20090119910A - 외떡잎 식물에서 배-특이적 발현의 조절을 위한 핵산 서열

Info

Publication number: KR20090119910A
Application number: KR1020097019284A
Authority: KR
Inventors: 희-숙 송; 크리스천 담만
Original assignee: 바스프 플랜트 사이언스 게엠베하
Priority date: 2007-02-16
Filing date: 2008-02-15
Publication date: 2009-11-20
Also published as: WO2008099013A1; AU2008214568A1; ZA200906367B; CN101631868A; BRPI0808008B1; CA2675926A1; AU2008214568B2; EP2074219B1; CN101631868B; US20110035840A1; EP2074219A1; BRPI0808008A2

Abstract

본 발명은 농업 생물공학 분야에 관한 것이다. 발아하는 배 (embryo)에 특이적인 발현을 위한 방법, 핵산 분자 및 발현 구성체 또는 그의 벡터, 상기 핵산, 벡터, 발현 구성체를 포함하는 트랜스제닉 (transgenic) 식물 및 세포, 및 상기 DNA 구성체 및 트랜스제닉 식물의 제조 및 사용 방법을 본원에서 개시한다.

트랜스제닉 식물, DNA 구성체, 배-특이적 발현, 스트레스, 내성

Description

외떡잎 식물에서 배-특이적 발현의 조절을 위한 핵산 서열 {NUCLEIC ACID SEQUENCES FOR REGULATION OF EMBRYO-SPECIFIC EXPRESSION IN MONOCOTYLEDONOUS PLANTS}

본 발명은 농업 생물공학 분야에 관한 것이다. 발아하는 배 (embryo)에 발현 특이성을 갖는 발현 구성체, 상기 발현 구성체를 포함하는 트랜스제닉 (transgenic) 식물, 및 상기 DNA 구성체 및 트랜스제닉 식물의 제조 및 사용 방법을 본원에서 개시한다.

농경학상 중요한 곡물 작물에서, 종자 형성이 식물 개발의 궁극적인 목표이다. 종자는 식품, 사료 및 산업 제품에서 사용하기 위해 수확된다. 이들 종자의 효용 및 가치는 그에 함유된 단백질, 오일 및 전분의 양과 품질에 의해 결정된다. 차례로, 생산되는 종자의 품질과 양은 수정 전에서 종자 성숙 전체의 임의의 시점의 환경 조건에 의해 영향을 받을 수 있다. 특히, 수정 시점 또는 그 즈음의 스트레스는 종자 발생에 실질적인 영향을 미칠 수 있다. 곡식 곡물을 포함하는 초본과 (벼과)의 멤버들은 단-종자 건과실을 생산한다. 상기 종류의 과실은 엄격히 말하자면 영과 (caryopsis)이지만, 일반적으로 종실 (kernel) 또는 곡물로 불린다. 영과의 과실피 또는 과피는 종자를 둘러싸고, 종피에 단단히 부착한다. 종자는 주심 (nucellar) 표피 및 종피에 의해 에워싸인 배 또는 눈 (germ) 및 배유 (endosperm)로 이루어진다. 따라서, 곡물은 종자 및 그의 종피 또는 과피를 포함한다. 종자는 배 및 배유를 포함한다.

수정가능한 옥수수 식물은 일반적으로 각각 웅수 (tassel)와 이삭 (ear)으로 알려진 웅성 (male) 및 자성 (female) 생식 조직을 모두 포함한다. 웅수 조직은 각각의 곡물 내에 2개의 핵을 갖는 반수체 화분립 (pollen grain)을 형성하고, 이는 개화시에 떨어질 때 자성 이삭의 수염 (silk)과 접촉한다. 이삭은 떨어진 화분과 동일한 식물에 또는 다른 식물에 있을 수 있다. 화분 세포는 화분관으로 알려진 구조를 발달시키고, 이는 개별 자성 수염을 통해 배주 (ovule)를 향하여 아래로 신장한다. 2개의 웅핵은 상기 관을 통해 이동하여 수염의 기부에서 반수체 자란 (female egg)에 도달한다. 웅핵 중 하나는 반수체 자란핵과 융합하고 수정하여 접합자 (zygote)를 형성하고, 이는 염색체 수에서 2배체이고 종실 내에서 배가 될 것이다. 나머지 웅핵은 제2 자핵과 융합하고 수정하여 1차 배유핵을 형성하고, 이는 수에서 3배체이고 옥수수 식물의 종실, 또는 종자의 배유가 될 것이다. 수정되지 않은 배주는 종실을 생산하지 않고, 수정되지 않은 조직은 궁극적으로 퇴화한다.

종실은 많은 부분으로 이루어지고, 그 중 일부는 모식물 조직으로부터 유래하고 다른 것은 수정 과정에서 유래한다. 모식물으로부터, 종실은 보호적인 둘러싸는 과피 및 꽃자루 (pedicel)를 포함한 많은 조직을 물려받는다. 꽃자루는 종실을 속대 (cob)에 부착시키고 모식물 조직으로부터 종실로 영양분 전달을 제공하는 짧은 줄기-유사 조직이다. 종실은 새로운 배 및 배유를 포함한 수정 활동으로부터 생성되는 조직을 포함한다. 배는 새로운 어린 옥수수 식물의 뿌리 및 싹 (shoot) 성장을 위한 세포를 함유하는 다음 세대의 축소형 선조이다. 이는 또한 종실 내에서 오일 및 단백질이 저장되는 하나의 조직이다. 배유는 영양 조직으로서 더욱 기능하고, 배의 발아 및 초기 성장에 필요한 에너지를 저장된 전분, 단백질 및 오일의 형태로 제공한다.

고등 식물에서 배 및 종실 발달 동안 일어나는 복잡한 조절을 고려하고, 일반적으로 곡물이 동물 및 인간을 위한 1차 영양원인 점을 고려하여, 상기 영양원을 개선하기 위해 필요한 핵심 도구는 영양 향상 유전자의 발현을 구동할 수 있는 유전자 프로모터를 포함한다. 그 반면에, 배는 스트레스에 대해 고도로 감수성이다. 식물에 대한 스트레스는 생물적 (biotic) 및 비생물적 물질 모두에 대해 유발될 수 있다. 예를 들어, 스트레스의 생물적 원인은 병원체의 감염, 곤충 섭식, 겨우살이와 같은 다른 식물에 의한 기생, 및 반추 동물의 방목을 포함한다. 비생물적 스트레스는 예를 들어, 과도하거나 불충분한 이용가능한 물, 불충분한 빛, 온도 극한, 합성 화학물질, 예를 들어 제초제, 과도한 바람, 토양 pH의 극한, 제한된 영양분 이용가능성, 및 공기 오염을 포함한다. 그러나, 식물은 스트레스를 피하거나 견디기 위한 다양한 내부 및 외부 메카니즘을 이용하여 불리한 조건 하에서도 생존하고 종종 번성한다. 스트레스에 대한 식물의 생리학적 반응은 유전자 발현에서의 변화를 반영한다.

스트레스-유도된 유전자의 조작이 스트레스에 대한 식물 내성 (tolerance)을 개선하는데 중요한 역할을 할 수 있지만, 스트레스-유도가능 유전자의 구성적 발현 은 스트레스가 존재하지 않을 때 식물 성장 및 발달에 심각한 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다 (Kasuga 1999). 따라서, 특히 스트레스 내성 또는 회피를 제공하기 위해 중대한 시간에 특수한 세포 또는 조직 내에서 유전자 발현을 제어하고 지시하기 위한 수단을 제공하기 위해서 시간적으로- 및/또는 공간적으로-분화된 발현을 구동하는 프로모터가 당업계에서 필요하다. 특히, 옥수수의 가뭄 및/또는 밀도 스트레스는 종종 수확량을 감소시킨다. 불리한 환경 하에 식물 발달 및 곡물 수확량을 안정화하기 위해, 종자 발아 동안 배 (배축 및 배반 (scutellum))에 호르몬 및 영양 공급을 조작하는 것이 중요하다. 따라서, 비생물적 스트레스 조건 하에 배 또는 배반에서 유전자 발현을 제공하는 전사 조절 서열이 필요하다.

식물 생물공학 업계의 다른 하나의 잘 공지된 문제는 마커 (marker)-결실이다. 선택가능 마커는 형질전환된 유기체에 대해 선택하고 확인하기 위해 형질전환 과정 동안 유용하지만, 대개 일단 형질전환된 유기체가 확인되면 유용한 기능을 제공하지 않고, 실질적으로 소비자들이 이들 "유전자 식품" 제품을 수용하지 않도록 작용하고 (Kuiper 2001), 이들 메카니즘에 기반하지 않는 몇몇 마커가 이용가능하다 (Hare 2002). 따라서, 마커 DNA를 식물 게놈으로부터 절제할 수 있는 기술을 개발하기 위해 많이 시도되었다 (Ow 1995; Gleave 1999). 당업자는 재조합 방식으로 도입된 핵산 서열의 부위-지정된 제거를 위한 다양한 시스템을 잘 알고 있다. 이들은 주로 서열 특이적 재조합효소의 사용에 기반한다. 다양한 서열-특이적 재조합 시스템, 예를 들어 박테리오파지 P1의 Cre/lox 시스템 ([Dale 1991]; [Russell 1992]; [Osborne 1995]), 효모 FLP/FRT 시스템 ([Kilby 1995]; [Lyznik 1996]), Mu 파지 Gin 재조합효소, 이. 콜라이 (E. coli) Pin 재조합효소, 플라스미드 pSR1의 R/RS 시스템 ([Onouchi 1995]; [Sugita 2000]), attP/박테리오파지 람다 시스템 (Zubko 2000)이 설명되어 있다. 선행 기술에 공지된 이들 방법의 하나의 공지된 단점은 절제가 전체 식물을 통해 균일하지 않아서, 모자이크-유사 절제 패턴을 생성시키고, 이는 힘든 추가의 라운드의 선택 및 재생을 요구한다는 점이다.

종자 또는 곡물 성숙 동안 향상된 발현을 부여하는 프로모터는 설명되어 있다 (예를 들어 보리 호르데인 프로모터; 미국 특허 출원 20040088754 참조). 쌍떡잎식물에서 배-특이적 또는 종자-특이적 발현을 지시하는 프로모터 (예를 들어, 대두 콘글리시닌 프로모터, [Chen 1988]; 나핀 프로모터, [Kridl 1991])는 일반적으로 외떡잎식물에서 유사한 발현을 지시할 수 없다. 불행하게도, 상기 측면의 생리학을 특이적으로 지시할 수 있는 비교적 적은 프로모터가 확인되었다 (예를 들어 US20040163144 참조).

설명되는 종자- 또는 곡물-특이적 프로모터는 식물 종자 저장 단백질을 코딩하는 유전자, 예를 들어 보리 호르데인, 벼 글루텔린, 오리진, 프롤라민, 또는 글로불린; 밀 글리아딘 또는 글루테닌; 옥수수 제인 또는 글루텔린; 귀리 글루텔린; 사탕수수 카피린; 기장 페니세틴; 또는 호밀 세칼린을 코딩하는 유전자와 연관된 것을 포함한다. 그러나, 한편으로, 이들 프로모터의 발현은 종종 누설 (leakiness)되거나 낮은 발현 수준이다. 또한, 다수의 트랜스젠 (transgene)을 사용한 작물 식물의 개선 ("스태킹 (stacking)")은 중요성이 증가하고 있는 것으로 알려졌다. 예를 들어, 단일 옥수수 하이브리드 (hybrid)는 곤충 저항성 (resistance) 뿐만 아니라 특정한 제초제에 대한 저항성을 부여하는 재조합 DNA 구성체를 포함할 수 있다. 중요하게는, 각각의 이들 트랜스젠 또는 다른 관심있는 트랜스젠의 목적하는 발현을 구동하기 위해 적절한 조절 서열이 필요하다. 또한, 조절 요소들은 서로 구분되는 것이 중요하다. 다수 유전자의 발현을 구동시키기 위해 유사한 조절 서열의 활용과 연관된 관심사는 (a) 통합 전에 플라스미드 내에서 또는 통합 후에 식물 게놈 내에서 상동성 구역을 따른 페어링 (pairing), 교차 (crossing-over) 및 개재하는 구역의 상실; (b) 다시 이들 조절 구역의 절제 및 상실의 가능성을 갖는, 서로 인접한 반대 배향의 서열의 2개의 카피 (copy)에 의해 유발된 헤어핀 (hairpin) 루프; (c) 프로모터-특이적 전사 인자 또는 다른 조절 DNA-결합 단백질의 결합에 대한 동일한 프로모터 구역의 상이한 카피들 사이의 경쟁을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

따라서, 경제상 중요한 식물, 특히 외떡잎 식물에서 선택된 트랜스젠의 발현을 위해 사용될 수 있는 신규한 서열의 확인이 당업계에서 매우 필요하다. 조생 발아하는 종자 동안에 배 또는 배반 내에서 발현을 허용하는 전사 조절 서열이 또한 당업계에서 필요하다. 따라서, 본 발명의 목적은 배-우선적 또는 특이적 발현을 위한 새롭고 대안적인 발현 카세트를 제공하는 것이다. 상기 목적은 본 발명에 의해 해결된다.

<발명의 개요>

본 발명은

i) 도 4에 정의된, 가뭄, 저온 (cold) 반응성 및/또는 ABA 조절된 유전자, 예를 들어 건조 (desiccation)-반응성 rd29 또는 저온-유도된 단백질 78 유전자 식물 유전자 또는 그의 기능적 동등물 또는 상동체의 프로모터 서열 (이하에서 "cor78 프로모터")을 포함하는 제1 핵산 서열, 및

이에 작동가능하게 연결된

ii) 도 5에 정의된, 메탈로티오네인 1 (이하에서 "MET1")을 코딩하는 식물 유전자 또는 그의 기능적 동등물 또는 상동체의 제1 인트론 (이하에서 "MET1 인트론")을 포함하는 제2 핵산 서열

을 포함하는 식물 전사 조절 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.

가뭄, 저온 반응성 및/또는 ABA 조절된 유전자의 프로모터 서열은 잘 알려진 클래스의 단백질의 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 이는 가뭄, 저온 반응성 및 ABA 조절된 유전자의 프로모터 서열이다. 가뭄, 저온 반응성 및/또는 ABA 조절된 유전자에 의해 제어되는 유전자의 예는 rd29A, rd29B, Iti 또는 cor78이다.

도 4의 서열은 RD29A 및 저온-유도된 단백질 78을 나타낸다. cor78 프로모터는 또한 rd29 프로모터 서열로서 알려져 있다. Genbank 데이타베이스에서 BLAST는 예를 들어 기탁 번호 Genbank AB019226을 나타내고, 이는 추가의 유전자를 포함한다. 상기 게놈 서열 내에서, cor78 프로모터는 5'-3' 방향으로 bp11743 내지 bp12328에 존재한다. 상기 프로모터 구역의 하류에 존재하는 유전자는 저온-유도된 단백질 78 (예를 들어 bp 12650 내지 12698, 12784 내지 12966, 13063 내지 13536, 및 13621 내지 15047)이다.

건조-반응성 RD29 식물 유전자는 예를 들어 2131 bp mRNA를 갖는 기탁 번호 NM_001036984 (기탁일 PLN 09-JUN-2006, 버전 NM_001036984.1 GI:79330663)로 공개되었고, 저온, 고염분 및 건조와 같은 물 고갈에 반응하여 발현이 유도되는 단백질을 코딩하는 유전자로서 설명되어 있다. 반응은 압시스산 (abscisic acid)을 통하는 것으로 보인다. 프로모터 구역은 시스 (cis)-작용 요소로서 rd29B의 탈수-반응성 발현에 요구되는 2개의 ABA-반응성 요소 (ABRE)를 함유한다. 단백질은 식물, 동물 및 진균에서 발견되는 다른 멤버를 갖는 유전자 패밀리의 한 멤버이다. 이는 스트레스-반응성 단백질-관련 [아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)] (TAIR:At4g25580.1)와 유사한 것으로 설명된다. RD29는 또한 cor78로서 기탁 번호 GB:AAA32776.1 하에 공개되었다.

따라서, 한 실시태양에서, 식물에서 상기 단백질 중 하나를 코딩하는 mRNA의 전사를 제어하는 프로모터, 예를 들어 아라비돕시스 탈리아나 (TAIR:At4g25580.1)의 스트레스-반응성 단백질, 예를 들어 rd29A, rd29B, lti 또는 cor78 (GB:AAA32776.1)을 코딩하는 유전자의 프로모터가 사용된다. 바람직하게는, 프로모터는 도 4에 제시된 서열 또는 그의 상동체, 예를 들어 오르토로그 (ortholog)의 서열을 갖는다.

바람직하게는, cor78 프로모터는 쌍떡잎 식물로부터 유래된다. 한 실시태양에서, 상동체는 식물문 (Viridiplantae)에서 발견되는; 바람직하게는 스트렙토피타 (Streptophyta), 보다 바람직하게는 유배식물아계 (Embryophyta); 관속식물문 (Tracheophyta), 훨씬 더 바람직하게는 종자식물문 (Spermatophyta)에서 발견되는 오르토로그로서 예측된 상동체이다. 보다 바람직한 상동체는 피자식물문 (Magnoliophyta)로부터, 보다 바람직하게는 유디코틸레돈스 (eudicotyledons)로부터, 훨씬 더 바람직하게는 상동체는 코어 유디코틸레돈스로부터 확인된다. 따라서, 이는 바람직하게는 장미군 (rosids)으로부터; 보다 바람직하게는 진정장미군 (eurosids) II으로부터; 훨씬 더 바람직하게는 십자화목 (Brassicales)으로부터, 훨씬 더 바람직하게는 상동체는 예를 들어 십자화과 (Brassicaceae)로부터, 바람직하게는 아라비돕시스 (Arabbidopsis)로부터의 것이다. 한 실시태양에서, 상동체는 아라비돕시스 탈리아나 재배종으로부터, 예를 들어 C24로부터, 또는 "콜럼비아 (Columbia)"와 같은 생태형 (ecotype)으로부터의 것이다

2개의 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 기능을 갖는 것 외에 실질적으로 서로 유사하다는 하나의 추가의 표시는 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어, 항체가 또한 다른 것에 특이적으로 결합하는 것이다. 따라서, 한 실시태양에서, RD29의 상동체는 각각 도 4에 제시된 아미노산을 갖는 단백질에 특이적인 결합을 위해 생성된 모노클로날 항체에 결합시킴으로써 웨스턴 블롯 (Western Blot) 분석으로 확인될 수 있는 단백질이다.

한 실시태양에서, 그의 프로모터가 사용되는 유전자의 백분율은 도 4에 제시된 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 예를 들어, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 및 심지어 90% 이상, 예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 적어도 99%까지의 아미노산 서열 또 는 핵산 동일성을 갖는 핵산 또는 단백질이다.

바람직하게는, 그의 프로모터가 사용되는 유전자는 저온-유도된 단백질 78 또는 RD29 유전자의 발현 패턴을 보여주는 유전자이다. 바람직하게는, 상기 유전자에 연결된 프로모터 서열은 서열 1에 기재된 핵산 서열에 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 예를 들어, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 및 심지어 90% 이상, 예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 적어도 99% 동일하다. 상기 프로모터는 데이타베이스 탐색, 혼성화 또는 PCR 기반 기술과 같은 핵산 서열의 확인 또는 클로닝을 위한 표준 기술 (다른 것을 배제하지 않음)을 이용하여 서열 1, 5 또는 6의, 또는 예를 들어 도 4a 내지 4c에 제시된 바와 같은 저온-유도된 단백질 78 또는 RD29 유전자의 적어도 10, 15, 20, 30개 이상의 연속적 뉴클레오티드를 사용함으로써 얻을 수 있다.

Met1 유전자는 문헌 [Sasaki, T., et al., Nature 420 (6913), 312-316 (2002)]에 249 bp DNA를 갖는 기탁 번호 AP002540 (선형, PLN 19-OCT-2004, 버전 AP002540.2 GI:13872872) 하에 공개되었다. 서열은 2000년 6월 21일에 제출되었고, 2001년 4월 27일에 상기 서열 버전이 gi:8698578을 교체하였다. 유전자는 GENSCAN, FGENESH, GeneMark.hmm, GlimmerM, RiceHMM, SplicePredictor, sim4, gap2, BLASTN 및 BLASTX의 통합된 결과로부터 예측되었다. 게놈 서열은 NCBI NonRedundant Protein 데이타베이스, nr 및 cDNA 서열 데이타베이스에 대해 RGP 또는 DDBJ에서 탐색하였다. 코딩 구역의 단백질 상동성은 BLASTP를 이용하여 NCBI NonRedundant Protein 데이타베이스에 대해 탐색하였다. EST는 상응하는 DDBJ 기탁 번호 및 RGP 클론 ID를 갖는 BLASTN을 이용하여 확인된 cDNA 서열을 나타낸다. 전장 cDNA는 상응하는 DDBJ 기탁 번호를 갖는 BLASTN을 이용하여 확인된 cDNA 서열을 나타낸다. 단백질에 동일성 또는 유의한 상동성을 갖는 유전자는 동일한 명칭, '추정-' 및 '-유사 단백질'과 같이 상동성 수준을 나타내도록 단백질 명칭에 기반하여 분류된다. 임의의 단백질에 유의한 상동성이 없지만 전장 cDNA 또는 EST 상동성 (부분 서열의 거의 전체 길이를 덮는)을 갖는 유전자는 '미지의' 단백질로서 분류된다. 2개 이상의 유전자 예측 프로그램에 의해 예측된 유전자는 IRGSP 표준에 따라 '가설' 단백질로서 분류된다. 단일 유전자 예측 프로그램에 의해 예측된 유전자는 또한 유망한 '가설' 단백질로서 분류되고, 서열의 다방면 특색으로서 포함된다. 서열의 배향은 PAC 클론의 T7로부터 SP6까지이다. P0434B04 클론의 상기 서열은 5' 단부에서 P0416D03 (DDBJ: AP002872) 클론 및 3' 단부에서 P0009G03 (DDBJ: AP002522) 클론과 오버랩 (overlap)을 갖는다. 상기 엔트리 (entry)의 주석과 함께 오버랩 및 조립 품질에 대한 상세한 정보는 GenomeSeq에서 이용가능하다.

바람직하게는, 도 5에 제시된 MET1 유전자 또는 그의 상동체, 예를 들어 오르토로그의 인트론이 사용된다.

바람직하게는, 상기 제1 인트론은 외떡잎 식물로부터의 MET1 유전자로부터 유래한다. 상동체는 바람직하게는 예를 들어 식물문으로부터; 예를 들어 스트렙토피타, 보다 바람직하게는 유배식물아계, 훨씬 더 바람직하게는 관속식물문으로부터 의 오르토로그이다. 상동체는 예를 들어 종자식물문으로부터, 바람직하게는 피자식물문, 보다 바람직하게는 백합아강 (Liliopsida), 훨씬 더 바람직하게는 벼목 (Poales), 훨씬 더 바람직하게는 벼과 식물로부터의 것이다. 한 실시태양에서, 상동체는 BEP, 분기군 (clade)으로부터, 예를 들어 에르하토이데아에 (Ehrhartoideae), 보다 바람직하게는 벼족 (Oryzeae), 예를 들어 벼속 (Oryza)으로부터의 것이다.

한 실시태양에서, 오리자 사티바 (Oryza sativa), 예를 들어 자포니카 (japonica) 재배종-군과 같은 재배종으로부터 유래하는 오르토로그가 사용된다.

바람직하게는, 상동체는 오르토로그이고, 고갈 분석에서 야생형과 실질적으로 동일한 표현형을 보여준다.

2개의 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 기능을 갖는 것 외에 실질적으로 서로 유사하다는 하나의 추가의 표시는 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어, 항체가 또한 다른 것에 특이적으로 결합하는 것이다. 따라서, 한 실시태양에서, MET1의 상동체는 도 5에 제시된 아미노산을 갖는 단백질에 특이적인 결합을 위해 생성된 모노클로날 항체에 결합시킴으로써 웨스턴 블롯 분석으로 확인될 수 있는 단백질이다.

한 실시태양에서, 인트론, 예를 들어 제1 인트론이 사용되는 유전자의 상동체의 백분율은 도 5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 예를 들어, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 및 심지어 90% 이 상, 예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 적어도 99%까지의 아미노산 서열 또는 핵산 동일성을 갖는 단백질을 코딩한다.

바람직하게는, 인트론이 사용되는 유전자의 상동체는 MET1 유전자의 발현 패턴을 보여주는 단백질을 코딩한다. 바람직하게는, 상기 유전자의 인트론의 핵산 서열은 서열 3에 기재된 것과 같은 핵산 서열에 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 예를 들어, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 및 심지어 90% 이상, 예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 적어도 99%까지 동일하다. 상기 프로모터는 데이타베이스 탐색, 혼성화 또는 PCR 기반 기술과 같은 핵산 서열의 확인 또는 클로닝을 위한 표준 기술 (다른 것을 배제하지 않음)을 이용하여 서열 3, 7 또는 8의, 또는 예를 들어 도 5에 제시된 바와 같은 MET1 유전자의 적어도 10, 15, 20, 30개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 사용하여 얻을 수 있다.

서열 비교는 스미쓰-워터만 (Smith-Waterman) 서열 정렬 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, Waterman 1995 참조). 매치 (match): 1, 미스매치 페널티 (penalty): 0.33, 개방-갭 (open-gap) 페널티: 2, 연장된-갭 페널티: 2의 파라미터를 갖는 localS 프로그램, 버전 1.16이 바람직하게 사용된다.

cor78 프로모터와 인트론, 예를 들어 MET1의 제1 인트론 사이의 거리는 바람직하게는 짧다. 한 실시태양에서, 예를 들어, 핵산 분자는 예를 들어 0 bp 내지 100 bp, 예를 들어 10 bp 내지 90 bp 또는 20 내지 80 bp, 예를 들어 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 bp의 길이를 갖는, cor78 프로모터와 상기 인트론의 제1 뉴클레오티드 사이에 위치하는 링커 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 상기 인트론, 예를 들어 MET1의 제1 인트론은 전사 조절 뉴클레오티드 서열의 제어 하에 전사된 뉴클레오티드 서열의 다른 인트론의 서열 내에 위치한다. 또한, 한 실시태양에서, 상기 핵산 분자는 예를 들어, cor78 프로모터 서열과 MET1 인트론의 제1 뉴클레오티드 사이에 위치하는 5'UTR을 포함한다.

하나의 가능한 배열은 cor79 프로모터 및 MET1 유전자의 제1 인트론을 포함하는 서열 2의 염기쌍 8199 내지 9656에 의해, 또는 cor79 프로모터, MET1 유전자의 제1 인트론 및 5'UTR을 포함하는 염기쌍 8134 내지 9656에 의해 나타난다.

전사 조절 뉴클레오티드 서열의 제어 하에 전사된 뉴클레오티드 서열의 인트론은 예를 들어 5'UTR 내에 또는 cor78 프로모터 서열에 가까운 다른 위치 내에 위치하고, 예를 들어 코딩 구역의 5' 단부의 처음 100 bp 내에 또는 전사 개시 코돈 후의 처음 100 bp 내에 위치한다.

따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은

i) a) 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드;

b) 서열 1의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

c) 서열 1의 폴리뉴클레오티드의 적어도 50개의 연속적 염기, 바람직하게는 적어도 100개의 연속적 염기, 보다 바람직하게는 200개의 연속적 염기의 단편; 및

d) 2xSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군 중에서 선택된 제1 핵산, 및

ii) a) 서열 3에 정의된 폴리뉴클레오티드;

b) 서열 3의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

c) 서열 3의 폴리뉴클레오티드의 적어도 50개의 연속적 염기, 바람직하게는 적어도 100개의 연속적 염기, 보다 바람직하게는 200개의 연속적 염기의 단편; 및

d) 2xSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 3에 제시된 서열의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군 중에서 선택된 제2 핵산

을 포함하며, 여기서 상기 제1 및 상기 제2 핵산 서열은 기능적으로 연결되고 서로 이종성인, 식물 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.

바람직하게는, 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는 식물 또는 식물 세포 내에서 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 매개할 수 있다. 보다 바람직하게는, 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티 드를 포함하는 핵산 분자는 외떡잎 식물 또는 외떡잎 식물 세포 내에서 핵산 서열의 전사를 매개할 수 있다. 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 조직-특이적인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는 배 또는 배반 내에서 우선적으로 발현된다. 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 비생물적 또는 생물적 스트레스 조건 하에 우선적으로 발현되는 것이 또한 바람직하다. 생물적 스트레스 조건은 진균, 선충 (nematode), 곤충, 바이러스 및 세균과 이들의 조합으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 비생물적 스트레스 조건은 가뭄, 저온, 열, 염분, 염도, 높은 식물 집단 밀도, 질소, UV광 및 이들의 조합으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는 가뭄 조건 하에 우선적으로 발현된다.

본 발명의 다른 실시태양은 상기 설명한 바와 같이 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이고, 여기서 핵산은 서열 10, 12, 14, 17, 20, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 53, 55, 57, 59, 63, 66, 68, 70, 72, 74, 77, 79, 82, 84, 86, 88, 90, 94, 96, 98, 102, 104, 108, 112, 114, 117, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 137 및 138에 정의된 서열로 이루어지는 군 중에서 선택된 코어 프로모터 모티프를 적어도 2개, 바람직하게는 그 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상, 예를 들어 모두 포함한다. 바람직하게는, 상기 프로모터 모티프는 표 8 및 9에 기재된 바와 같 은 전사 조절 서열의 마이너스 또는 플러스 스트랜드 상에 배열된다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 프로모터 모티프는 표 8 및 9에 기재된 바와 같은 전사 조절 서열 내에 동일하거나 유사한 위치에 위치한다.

본 발명의 또다른 실시태양은 상기 설명한 바와 같이 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이고, 여기서 핵산은 서열 9, 11, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 60, 61, 62, 64, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 80, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 95, 97, 99, 100, 101, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 118, 119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 133, 134, 135 및 136에 정의된 서열로 이루어지는 군 중에서 선택된 프로모터 모티프를 적어도 2개, 바람직하게는 그 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상, 예를 들어 모두 포함한다. 바람직하게는, 상기 프로모터 모티프는 표 8 및 9에 기재된 바와 같은 전사 조절 서열의 마이너스 또는 플러스 스트랜드 상에 배열된다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 프로모터 모티프는 표 8 및 9에 기재된 바와 같은 전사 조절 서열 내에 동일하거나 유사한 위치에 위치한다.

본 발명의 다른 실시태양은 핵산 서열에 기능적으로 연결된 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 구성체에 관한 것이다. 바람직하게는, 기능적으로 연결된 핵산 서열은 식물에 증가된 수확량, 스트레스 조건 하에서 증가된 저항성, 종자 또는 새싹 (sprout)의 증가된 영양적 품질 및/또는 오일 함량, 및 선택 마커 절제로 이루어지는 군 중에서 선택된 형질 (trait) 또는 특성을 부여한다. 증가된 영양적 품질 및/또는 오일 함량은 증가된 함량의 비타민, 카로티노이드, 항산화제, 불포화 지방산, 다가-불포화 지방산, 또는 변경된 아미노산 함량을 갖는 단백질로 이루어지는 군 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함할 수 있다. 발현 구성체 내에서 기능적으로 연결된 핵산 서열의 전사가 단백질의 발현, 또는 표적 식물 내에 적어도 하나의 유전자의 기능을 부여할 수 있는 기능적 리보뉴클레오티드 서열의 발현을 일으키는 것이 또한 바람직하다. 기능적 RNA는 안티센스 RNA, 센스 RNA, dsRNA, 마이크로RNA, ta-siRNA, snRNA, RNAi 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군 중에서 선택된 적어도 하나를 포함한다.

본 발명의 실시태양은 핵산에 기능적으로 연결된 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자로 형질전환된 트랜스제닉 식물에 의해 생산된 식물 또는 종자를 제공한다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 트랜스제닉 식물에 의해 생산된 종자는 단백질, 또는 표적 식물 내에 적어도 하나의 유전자의 기능을 부여할 수 있는 기능성 RNA 서열을 발현하고, 여기서 종자 또는 식물은 스트레스 조건 하에 증가된 저항성 및/또는 증가된 수확량, 및/또는 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질 및/또는 오일 함량을 갖는다. 보다 바람직하게는, 종자 또는 식물은 외떡잎식물이다. 바람직하게는, 종자 또는 식물은 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 호밀, 사탕수수, 호밀풀 (ryegrass) 또는 율무로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 종자 또는 식물은 옥수수, 밀, 보리, 벼, 귀리, 호밀 및 사탕수수로 이루어지는 군 중에서 선택된 곡식 식물이고, 훨씬 더 바람직하게는 옥수수, 밀 및 벼 중에서 선택되고, 가장 바람직하게는 종자 또는 식물은 옥수수이다. 본 발명의 추가의 실시태양은 본 발명의 외떡잎 식물의 종자, 부분 및 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 식물 부분은 세포, 원형질체 (protoplast), 세포 조직 배양액, 캘러스 (callus), 세포 덩어리, 배, 화분, 배주, 종자, 꽃, 종실, 이삭, 속대, 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥 (anther) 및 수염으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

본 발명의 다른 실시태양은

A) 식물 내로

i) a) 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드;

d) 2xSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군 중에서 선택된 제1 핵산, 및 이에 작동가능하게 연결된

ii) a) 서열 3에 정의된 폴리뉴클레오티드;

d) 2xSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 3에 제시된 서열의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군 중에서 선택된 제2 핵산, 및

이들이 작동가능하게 연결된, 상기 제1 또는 제2 핵산 서열에 대하여 이종성이고 식물에 증가된 수확량 및/또는 증가된 스트레스 내성을 부여할 수 있는 적어도 하나의 핵산

을 포함하는 발현 구성체를 도입하는 단계, 및

B) 트랜스제닉 식물을 선택하는 단계

를 포함하며, 여기서 식물은 야생형 또는 무효 분리개체 (null segregant) 식물에 비해 증가된 수확량 및/또는 스트레스 조건 하에 증가된 스트레스 내성을 갖는 것인, 상기 식물에서 증가된 수확량 및/또는 증가된 스트레스 내성을 위한 방법에 관한 것이다.

수확량 및/또는 스트레스 저항성을 얻기 위한 다양한 핵산이 당업자에게 공지되어 있다. 핵산은 식물호르몬 생합성, 식물호르몬 조절, 세포 주기 조절, 또는 탄수화물 대사에 관여하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 실시태양은

A) 식물 내로

i) a) 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드;

ii) a) 서열 3에 정의된 폴리뉴클레오티드;

이들에 작동가능하게 연결된, 상기 제1 또는 상기 제2 핵산 서열에 대하여 이종성이고 식물에 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질 및/또는 오일 함량을 부여하기에 적합한 적어도 하나의 핵산

을 포함하는 발현 구성체를 도입하는 단계 및

B) 트랜스제닉 식물을 선택하는 단계

를 포함하며, 여기서 식물은 야생형 또는 무효 분리개체 식물에 비해 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질 및/또는 오일 함량을 갖는 것인, 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질 및/또는 오일 함량을 상기 식물에 부여하기 위한 방법에 관한 것이다.

영양적 품질 및/또는 오일 함량은 상기 규정된 바와 같다. 보다 구체적인 예는 본원에서 아래에 주어진다. 전사 조절 서열은 상기 기재되고, 보다 바람직하게는 전사 조절 서열은 배-특이적이다.

본 발명의 또다른 실시태양은

A) i) a) 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드;

b) 서열 1의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클 레오티드;

ii) a) 서열 3에 정의된 폴리뉴클레오티드;

을 포함하는 전사 조절 뉴클레오티드 서열을, 상기 제1 또는 상기 제2 핵산 서열에 대하여 이종성이고 식물로부터 표적 서열, 예를 들어 마커 서열의 절제를 유도하기에 적합한 적어도 하나의 핵산에 작동가능하게 연결함으로써 발현 카세트를 구성하는 단계,

B) 상기 발현 카세트를 적어도 하나의 표적 서열, 예를 들어 마커 서열을 포함하는 식물 내로 삽입하여 트랜스제닉 식물을 제공하고, 여기서 상기 식물은 상기 이종성 핵산 서열을 발현하는 것인 단계, 및

C) 상기 표적 서열, 예를 들어 마커 서열의 절제를 나타내는 트랜스제닉 식물을 선택하는 단계

를 포함하는, 식물로부터 표적 서열, 예를 들어 마커 서열을 절제하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게는 표적 서열은 마커 서열, 예를 들어 항생제 또는 제초제 저항성 유전자이다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 키메라 (chimera) 전사 조절 서열로부터 발현된 뉴클레오티드 서열은 베타-글루쿠로니다제 (GUS)를 코딩하지 않거나, GUS-매개 염색을 달성하기 위한 GUS 유전자의 발현을 위한 것이 아니다.

도 1. 플라스미드 pBPSMM368:At.Cor78::BPS1.1::GUS::NOS의 지도.

도 2. At.Cor78 프로모터 구성체의 조직화학적 GUS 염색. 구성체의 전형적인 염색 패턴에 대한 대표적인 예를 도시한다. A: At.Cor78::BPS1.1::GUS::NOS (pBPSMM368); B: At.Cor78::GUS::NOS (pBPSMM250); C: At.Cor78::Ubi-인트론 1::GUS::NOS (pBPSMM346).

도 3. 옥수수에서 pBPSMM346 프로모터 구성체에 의해 제어된 가뭄-스트레스-유도된 또는 안정한 발현. 5엽 단계에서 트랜스제닉 식물에 물을 공급하지 않음으로써 가뭄-스트레스를 주었다. 지시된 시점에 잎으로부터 샘플을 취하였다. 잎 샘플로부터 RNA를 단리하고, 정량적 RT-PCR로 분석하였다. GUS 발현을 각각의 샘플에서 내부 대조 유전자에 대해 표준화하였다. 결과를 1로 설정한 0-시점에 대해 비교한 발현 수준의 증가 배수로서 나타낸다.

도 4a 내지 4c: RD29A 유전자 및 저온-유도된 단백질 78 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열.

도 5: MET1 유전자의 뉴클레오티드 서열.

정의

달리 주지하지 않으면, 기술 용어는 통상적인 용도에 따라 사용된다. 분자 생물학에서 일반적인 용어의 정의는 문헌 ([Lewin, Genes V published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854187-9)]; [Kendrew et al (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]; 및 [Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)])에서 찾을 수 있다.

본 발명은 그 자체로 설명된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 식물 종 또는 속, 구성체, 및 시약에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 용어학은 단지 특정 실시태양을 설명하는 목적을 위한 것이고, 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하려고 의도되지 않는 것으로 또한 이해되어야 한다. 본원에서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용될 때, 단수형 "부정관사 (a)" 및 "정관사 (the)"은 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않으면 복수의 참조를 포함하는 것을 알아야 한다. 따라서, 예를 들어, "벡터"에 대한 참조는 하나 이상의 벡터에 대한 참조이고, 당업자에게 공지된 그의 동등물을 포함하는 등등이다.

용어 "약"은 대략, 대충, 대체로, 또는 그 구역 내를 의미하도록 본원에서 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때, 기재된 수치 값 상하의 경계를 연장함으로써 그 범위를 변형한다. 일반적으로, 용어 "약"은 언급된 값 상하의 수치 값을 20%, 바람직하게는 10%의 변이량으로 상하로 (더 높게 또는 더 낮게) 변형하도록 본원에서 사용된다.

본원에서 사용될 때, 단어 "또는"은 특정 목록의 임의의 하나의 멤버를 의미하고, 또한 그 목록의 멤버들의 임의의 조합을 포함한다.

용어 "유전자"는 생물학적 기능과 연관된 핵산의 임의의 세그먼트를 나타내도록 넓은 의미로 사용된다. 따라서, 유전자는 코딩 서열 및/또는 그들의 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. 예를 들어, 유전자는 mRNA 또는 기능성 RNA를 발현하거나 특이적 단백질을 코딩하고, 조절 서열을 포함하는 핵산 단편을 나타낸다. 유전자는 비-코딩 DNA 서열 및/또는 조절 서열을 포함할 수 있고, 여기서 비-코딩 구역은 예를 들어 마이크로RNA로 전사될 수 있다. 유전자는 또한 예를 들어, 다른 단백질 및/또는 RNA에 대한 인식 서열을 형성하는 비-발현된 세그먼트를 포함한다. 유전자는 관심있는 공급원으로부터 클로닝, 또는 공지된 또는 예측된 서열 정보로부터 화학적 또는 분자 생물학적 방안을 통한 합성을 포함한 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있고, 바람직한 파라미터를 갖도록 설계된 서열을 포함할 수 있다.

용어 "천연" 또는 "야생형" 유전자는 형질전환되지 않은 세포, 즉, 공지의 돌연변이를 갖지 않는 세포의 게놈 내에 존재하는 유전자를 나타낸다.

"마커 유전자" 또는 "마커 서열"은 선택가능한 또는 스크리닝가능한 (screenable) 형질을 코딩한다.

용어 "키메라 유전자"는

1) 자연에서 함께 발견되지 않는, 조절 및 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열, 또는

2) 자연적으로 접합하지 않는 코딩 서열의 일부를 코딩하는, 예를 들어 단백질을 코딩하는 서열, 또는

3) 자연적으로 접합하지 않는 조절 서열의 부분, 예를 들어 프로모터를 함유하는 임의의 유전자를 나타낸다.

따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원으로부터 유래하는 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 동일한 공급원으로부터 유래하지만 자연에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다.

"트랜스젠"은 형질전환에 의해 게놈 내로 도입되고 안정하게 유지되는 유전자를 나타낸다. 트랜스젠은 예를 들어, 형질전환시킬 특정 식물의 유전자에 이종성 또는 상동성인 유전자를 포함할 수 있다. 추가로, 트랜스젠은 비-천연 유기체 내로 삽입된 천연 유전자 , 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. 용어 "내인성 유전자"는 유기체의 게놈 내의 그의 천연 위치 내의 천연 유전자를 나타낸다. "외래" 유전자는 숙주 유기체에서 정상적으로 발견되지 않지만 유전자 전달에 의해 도입된 유전자를 나타낸다.

예를 들어, 프로빙 (probing) 또는 증폭 반응에서 사용하기 위한 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 "올리고뉴클레오티드"는 약 30개 이하의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 9, 12, 15, 18, 20, 21 또는 24개, 또는 9 내지 30의 임의의 수)일 수 있다. 일반적으로, 특이적인 프라이머는 14개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 최적 특이성 및 비용 효과를 위해, 16 내지 24개 뉴클레오티드 길이의 프라이머가 바람직할 수 있다. 당업자는 PCR과 같은 과정을 사용하기 위한 프라이머의 설계에 대해 잘 알고 있다. 요구되는 경우에, 프로빙은 100 또는 심지어 1,000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있는 본원에 개시된 유전자의 전체 제한 단편을 사용하여 이루어질 수 있다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드", "올리고펩티드", "폴리펩티드", "유전자 산물", "발현 산물" 및 "단백질"은 연속적 아미노산 잔기의 중합체 또는 올리고머를 나타내도록 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 사용될 때, 용어 "아미노산 서열" 또는 "폴리펩티드 서열"은 아미노산 잔기를 나타내는 약어, 문자, 글자 또는 단어의 목록을 나타낸다. 아미노산은 본원에서 그들의 일반적으로 공지된 3-문자 부호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회 (Biochemical Nomenclature Commission)에서 권장되는 1-문자 부호에 의해 칭할 수 있다. 본원에서 사용된 약어는 아미노산에 대한 통상적인 1문자 코드이다: A, 알라닌; B, 아스파라긴 또는 아스파르트산; C, 시스테인; D 아스파르트산; E, 글루타메이트, 글루탐산; F, 페닐알라닌; G, 글라이신; H 히스티딘; I 이소류신; K, 라이신; L, 류신; M, 메티오닌; N, 아스파라긴; P, 프롤린; Q, 글루타민; R, 아르기닌; S, 세린; T, 트레오닌; V, 발린; W, 트립토판; Y, 타이로신; Z, 글루타민 또는 글루탐산 ([L. Stryer, Biochemistry, 1988, W. H. Freeman and Company, New York] 참조). 본원에서 사용되는 아미노산 서열 내의 문자 "x"는 임의의 아미노산 잔기를 의미할 수 있다.

"코딩 서열"은 특이적인 아미노산 서열을 코딩하고, 비-코딩 서열을 배제하는 DNA 또는 RNA 서열을 나타낸다. 이는 cDNA에서와 같이 "중단되지 않는 (uninterrupted) 코딩 서열", 즉, 인트론이 결여된 서열을 구성할 수 있거나, 적절한 스플라이스 정션 (splice junction)에 의해 경계 짓는 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다. "인트론"은 1차 전사체 내에 함유되지만 단백질로 번역될 수 있는 성숙 mRNA를 생성하기 위해 세포 내에서 RNA의 절단 및 재-라이게이션을 통해 제거되는 RNA의 서열이다.

용어 "개방 판독 프레임" 및 "ORF"는 코딩 서열의 번역 개시와 종료 코돈 사이에서 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. 용어 "개시 코돈" 및 "종료 코돈"은 단백질 합성 (mRNA 번역)의 각각 개시 및 사슬 종료를 지정하는 코딩 서열 내의 3개의 인접한 뉴클레오티드의 단위 ('코돈')를 나타낸다.

"기능성 RNA"는 안티센스 RNA, 리보자임, 또는 번역되지 않는 다른 RNA를 나타낸다.

용어 "RNA 전사체"는 DNA 서열의 RNA 폴리머라제 촉매된 전사로부터 생성되는 산물을 나타낸다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완벽한 상보성 카피일 때 1차 전사체로서 칭하고, 또는 1차 전사체의 전사후 처리로부터 유래하는 RNA 서열일 수 있고 이는 성숙 RNA로서 칭한다. "메신저 (Messenger) RNA" (mRNA)는 인트론이 없고, 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 나타낸다. "cDNA"는 mRNA에 상보성이고 그로부터 유래하는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA를 나타낸다.

"전사 조절 뉴클레오티드 서열", "조절 서열" 및 "적합한 조절 서열"은 각각 전사, RNA 처리 또는 안정성, 또는 전사시킬 연합된 (또는 기능적으로 연결된) 뉴클레오티드 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 전사시킬 뉴클레오티드 서열에 관하여 다양한 위치를 가질 수 있다. 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 전사시킬 서열 (예를 들어, 코딩 서열)의 상류 (5' 비-코딩 서열), 내부, 또는 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치할 수 있다. 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 인핸서, 프로모터, 번역 리더 (leader) 서열, 인트론, 5'-비번역 서열, 3'-비번역 서열, 및 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한 군 중에서 선택될 수 있다. 이들은 천연 및 합성 서열뿐만 아니라, 합성 및 천연 서열의 조합일 수 있는 서열을 포함한다. 상기한 바와 같이, 용어 "전사 조절 뉴클레오티드 서열"은 프로모터에 제한되지 않는다. 그러나, 바람직하게는, 본 발명의 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 프로모터 서열 (예를 들어, 하류 서열의 전사를 유도할 수 있는 유전자의 전사 개시의 상류에 위치하는 서열)을 포함한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 상응하는 유전자의 프로모터 서열, 및 임의로 및 바람직하게는 상기 유전자의 천연의 5'-비번역 구역을 포함한다. 또한, 3'-비번역 구역 및/또는 상기 유전자의 폴리아데닐화 구역이 또한 사용될 수 있다.

"프로모터"는 RNA 폴리머라제 및 적절한 전사를 위해 요구되는 다른 인자 (예를 들어, 트랜스 작용 (transacting) 전사 인자)에 대한 인식을 제공함으로써 코딩 서열의 발현을 제어하는, 대체로 그의 코딩 서열에 대해 상류 (5')의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. "프로모터"는 TATA 박스로 이루어지는 짧은 DNA 서열인 최소 프로모터, 및 그에 발현의 제어를 위해 조절 요소 (예를 들어, 시스-요소)가 부가되는 전사 개시의 부위를 지정하는 역할을 하는 다른 서열을 포함한다. "프로모터"는 또한 최소 프로모터 + 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 조절 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 상기 종류의 프로모터 서열은 근접한 및 보다 먼 상류 요소로 이루어지고, 후자의 요소는 종종 인핸서로서 칭해진다. 따라서, "인핸서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있고, 프로모터의 고유한 요소, 또는 프로모터의 수준 또는 조직 특이성을 향상시키도록 삽입된 이종성 요소일 수 있는 DNA 서열이다. 이는 2가지 배향 (정상 또는 뒤집는 (flipped)) 모두로 작용할 수 있고, 프로모터로부터 상류 또는 하류로 이동할 때에도 기능할 수 있다. 인핸서 및 다른 상류 프로모터 성분은 모두 그들의 효과를 매개하는 서열-특이적 DNA-결합 단백질에 결합한다. 프로모터는 그의 전체가 천연 유전자로부터 유래할 수 있거나, 또는 상이한 요소들로 이루어지거나, 자연에서 발견된 상이한 프로모터들로부터 유래하거나, 심지어 합성 DNA 세그먼트로 이루어질 수 있다. 프로모터는 또한 생리학적 또는 발달적인 조건에 반응하여 전사 개시의 유효성을 제어하는 단백질 인자의 결합에 관여하는 DNA 서열을 함유할 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 "시스-요소"는 유전자 발현의 전체 제어의 일면을 부여하는 시스-작용성 전사 조절 요소를 나타낸다. 시스-요소는 전사 인자, 전사를 조절하는 트랜스 작용 단백질 인자에 결합하는 기능을 할 수 있다. 일부 시스-요소는 하나 초과의 전사 인자에 결합하고, 전사 인자는 하나 초과의 시스-요소와 상이한 친화도로 상호작용할 수 있다. 본 발명의 프로모터는 바람직하게는 유전자 발현을 부여하거나 조정할 수 있는 시스-요소를 함유한다. 시스-요소는 많은 기술에 의해, 예를 들어 결실 분석, 즉, 5' 단부 또는 내부로부터 프로모터로 하나 이상의 뉴클레오티드를 결실시키는 분석; DNase I 풋-프린팅 (foot-printing)을 이용하는 DNA 결합 단백질 분석, 메틸화 간섭, 전기영동 이동도 (mobility-shift) 분석, 라이게이션-매개 PCR에 의한 생체내 (in vivo) 게놈 풋프린팅, 및 다른 통상적인 분석; 또는 통상적인 DNA 서열 비교 방법에 의한 공지의 시스-요소 모티프와의 DNA 서열 유사성 분석에 의해 확인할 수 있다. 시스-요소의 미세 구조는 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이 유발 (또는 치환)에 의해 또는 다른 통상적인 방법에 의해 추가로 연구될 수 있다. 시스-요소는 화학 합성에 의해 또는 그러한 효소를 포함하는 프로모터로부터 단리에 의해 얻을 수 있고, 이들은 후속적인 조작을 용이하게 하기 위해 유용한 제한 효소 부위를 함유하는 추가의 플랭킹 (flanking) 뉴클레오티드를 사용하여 합성될 수 있다.

"개시 부위"는 또한 위치 +1로서 규정되는, 전사된 서열의 일부인 제1 뉴클레오티드를 둘러싸는 위치이다. 유전자 및 그의 조절 구역의 모든 다른 서열들은 상기 부위에 관하여 넘버링된다. 하류 서열 (즉, 3' 방향으로 추가의 단백질 코딩 서열)은 포지티브 (positive)로 부르는 반면, 상류 서열 (5' 방향으로 대부분의 제어 구역)은 네가티브 (negative)로 부른다.

상류 활성화의 부재 시에 불활성이거나 크게 감소된 프로모터 활성을 갖는 프로모터 성분, 특히 TATA 요소는 "최소 또는 코어 프로모터"로서 언급된다. 적합한 전사 인자의 존재 하에, 최소 프로모터는 전사를 허용하는 기능을 한다. 따라서, "최소 또는 코어 프로모터"는 전사 개시에 필요한 모든 기초적인 요소, 예를 들어 TATA 박스 및/또는 개시자로만 이루어진다.

용어 "인트론"은 유전자가 생산하는 단백질의 일부를 코딩하지 않고, 세포 핵으로부터 배출되기 전에 유전자로부터 전사되는 mRNA로부터 스플라이싱 제거되는, 유전자 내의 DNA의 섹션 (개재하는 서열)을 나타낸다. 인트론 서열은 인트론의 핵산 서열을 나타낸다. 따라서, 인트론은 코딩 서열 (엑손)과 함께 전사되지만 성숙 mRNA의 형성 동안 제거되는 DNA 서열의 구역이다. 인트론은 실제 코딩 구역 내에, 또는 전-mRNA (비스플라이싱된 mRNA)의 5' 또는 3' 비번역 리더에 위치할 수 있다. 1차 전사체 내의 인트론은 절제되고, 코딩 서열은 동시에 정밀하게 라이게이팅되어 성숙 mRNA를 형성한다. 인트론 및 엑손의 연결부는 스플라이스 부위를 형성한다. 인트론의 서열은 GU로 시작하고 AG로 끝난다. 또한, 식물에서, AU-AC 인트론의 2개의 예가 설명되었다: 아라비돕시스 탈리아나로부터의 RecA-유사 단백질 유전자의 인트론 14와 G5 유전자의 인트론 7은 AT-AC 인트론이고, 인트론을 함유하는 전-mRNA는 다른 서열 이외에 정확하게 스플라이싱시킬 인트론에 필수적인 3개의 짧은 서열을 갖는다. 이들 서열은 5' 스플라이스-부위, 3' 스플라이스-부위 및 분지점이다. mRNA 스플라이싱은 1차 mRNA 전사체 내에 존재하는 개재하는 서열 (인트론)의 제거, 및 엑손 서열의 연결 또는 라이게이션이다. 이는 또한 개재하는 서열 (인트론)의 제거로 동일한 RNA 상의 2개의 엑손을 연결하는 시스-스플라이싱으로서 공지되어 있다. 인트론의 기능적 요소는 스플라이시오좀 (spliceosome)의 특이적 단백질 성분에 의해 인식되고 결합되는 서열 (예를 들어, 인트론의 단부에서 스플라이싱 컨센서스 (consensus) 서열)을 포함한다. 기능적 요소와 스플라이시오좀의 상호작용은 조숙 mRNA로부터 인트론 서열의 제거 및 엑손 서열의 재연결을 일으킨다. 인트론은 정확하게 스플라이싱시킬 인트론에 대한, 충분하지는 않지만 필수적인 3개의 짧은 서열을 갖는다. 이들 서열은 5' 스플라이스 부위, 3' 스플라이스 부위 및 분지점이다. 분지점 서열은 식물에서 스플라이싱 및 스플라이스-부위 선택에 중요하다. 분지점 서열은 대체로 3' 스플라이스 부위의 10-60개 뉴클레오티드 상류에 위치한다. 식물 서열은 분지점에서 서열 일탈을 보이고, 컨센서스 서열은 CURAY 또는 YURAY이다.

"구성적 발현"은 구성적 또는 조절된 프로모터를 사용한 발현을 나타낸다. "조건적" 및 "조절된 발현"은 조절된 프로모터에 의해 제어된 발현을 나타낸다.

"구성적 프로모터"는 식물의 모든 또는 거의 모든 발달 단계 동안 모든 또는 거의 모든 식물 조직에서 제어하는 개방 판독 프레임 (ORF)을 발현할 수 있는 프로모터를 나타낸다. 각각의 전사-활성화 요소는 절대적인 조직-특이성을 나타내지 않지만, 대부분의 식물 부분에서 전사적 활성화를 전사가 가장 활성인 식물의 부분에서 도달되는 수준의 적어도 1%의 수준으로 매개한다.

"조절된 프로모터"는 유전자 발현을 구성적이 아니라 시간적으로 및/또는 공간적으로 조절된 방식으로 지시하는 프로모터를 나타내고, 조직-특이적 및 유도가능 프로모터를 모두 포함한다. 이는 천연 및 합성 서열뿐만 아니라, 합성 및 천연 서열의 조합일 수 있는 서열을 포함한다. 상이한 프로모터는 상이한 조직 또는 세포 종류에서, 또는 발달의 상이한 단계에서, 또는 상이한 환경 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 식물 세포에 유용한 다양한 종류의 새로운 프로모터가 지속적으로 발견되고 있고, 많은 예를 문헌 [Okamuro et al., 1989]에서 찾을 수 있다. 식물에서 유용한 전형적인 조절된 프로모터는 세이프너 (safener)-유도가능 프로모터, 테트라사이클린-유도가능 시스템으로부터 유래된 프로모터, 살리실레이트-유도가능 시스템으로부터 유래된 프로모터, 알콜-유도가능 시스템으로부터 유래된 프로모터, 글루코코르티코이드-유도가능 시스템으로부터 유래된 프로모터, 병원체-유도가능 시스템으로부터 유래된 프로모터, 및 엑디손-유도가능 시스템으로부터 유래된 프로모터를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

"조직-특이적 프로모터"는 모든 식물 세포에서 발현되는 것이 아니라, 특이적 기관 (예를 들어 잎 또는 종자), 특이적 조직 (예를 들어 배 또는 떡잎), 또는 특이적인 세포 종류 (예를 들어 잎 실질 (parenchyma) 또는 종자 저장 세포) 내의 하나 이상의 세포 종류에서만 발현하는 조절된 프로모터를 나타낸다. 이들은 또한 초기 또는 후기 배발생에서, 발달하는 종자 또는 과실에서 과실 성숙 (ripening) 동안, 완전 분화된 잎에서, 또는 노화의 개시에서와 같이 시간적으로 조절되는 프로모터를 포함한다.

"유도가능 프로모터"는 하나 이상의 세포 종류에서 화학, 빛, 호르몬, 스트레스 또는 병원체와 같은 외부 자극에 의해 작동될 수 있는 조절된 프로모터를 나타낸다.

"작동가능하게 연결된" 또는 "기능적으로 연결된"은 바람직하게는 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 핵산 서열의 연합을 나타낸다. 보다 구체적으로, 이는 제1 서열(들)이 제2 서열(들)에 충분히 근접하게 위치하여 제1 서열(들)이 제2 서열(들) 또는 제2 서열의 조절 하에 있는 구역에 대하여 영향을 발휘할 수 있는 것을 나타낸다. 예를 들어, 조절 DNA 서열이 코딩 DNA 서열의 발현에 영향을 미치도록 (즉, 코딩 서열 또는 기능적 RNA가 프로모터의 전사 제어 하에 있도록) 2개의 서열이 위치하는 경우에, 조절 DNA 서열은 RNA 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열"에 작동가능하게 연결된" 또는 "와 연합된" 것으로 말해진다.

대부분의 활성화 서열, 예를 들어 인트론은 향상되는 프로모터의 약 300 내지 400 염기쌍 내에 존재한다.

한 실시태양에서, 인트론, 예를 들어 INME 인트론의 위치는 제어된 유전자의 5' UTR 내이다 ([Rose et al. RNA 2002, 8:1444-1453]; [Callis et al., 1987, Genes & Dev 1:1183-1200]; PF56400).

프로모터 구역과 인트론 사이의 링커는 예를 들어 400개 미만의 염기쌍, 예를 들어 200, 100, 50개 이하이다. 바람직하게는, 핵산 분자의 제1 서열은 약 100개 이하의 뉴클레오티드 링커에 의해 제2 서열에 연결된다.

본 발명의 추가의 실시태양에서, 하나 초과의 활성화 서열이 사용되고, 활성화 서열은 서로 약 16 내지 약 80개의 염기쌍 내에 존재한다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있어서, 예를 들어 폴리펩티드 또는 단백질의 단편을 코딩하는 mRNA로 전사되거나 또는 조절 또는 효소적 RNA 분자, 예를 들어 안티센스 RNA, RNAi, 리보자임, miRNA, ta-siRNA, dsRNA, snRNA 또는 본원 또는 관련 문헌에 설명된 다른 것 또는 이들의 조합으로 전사될 수 있다.

"발현"은 식물에서 내인성 유전자, ORF 또는 그의 일부, 또는 트랜스젠의 전사 및/또는 번역을 나타낸다. 예를 들어, 안티센스 구성체의 경우에, 발현은 단지 안티센스 DNA의 전사를 나타낼 수 있다. 또한, 발현은 센스 (mRNA) 또는 기능성 RNA의 전사 및 안정한 축적을 나타낸다. 발현은 또한 단백질의 생산을 나타낼 수 있다.

"특이적 발현"은 하나 또는 수개의 식물 조직에 (공간적 제한) 및/또는 하나 또는 수개의 식물 발달 단계에 제한되는 (시간적 제한) 유전자 산물의 발현이다. 진정한 특이성이 존재하는 것 같지 않음이 알려져 있다: 프로모터는 바람직하게는 일부 조직에서 작동하지만, 다른 조직 내에서는 활성이 전혀 또는 단지 조금 있을 수 있는 것으로 보인다. 이 현상은 누설 발현으로서 알려져 있다. 그러나, 본 발명에서 특이적 발현은 하나 또는 수개의 식물 조직 내에서 바람직한 발현을 의미한다.

프로모터 (인핸서와 함께 또는 없이)의 "발현 패턴"은 식물 내의 어디에서 및 어떠한 발달 단계에서 전사가 상기 프로모터에 의해 개시되는지를 보여주는 발현 수준의 패턴이다. 프로모터의 세트의 발현 패턴은 하나의 프로모터의 발현 패턴이 다른 프로모터의 발현 패턴과 적은 중첩을 보여줄 때 상보성인 것으로 말해진다. 프로모터의 발현의 수준은 표준 전사된 리포터 (reporter) mRNA의 '정상 상태' 농도를 측정함으로써 결정할 수 있다. 리포터 mRNA의 농도는 그의 합성 속도에만 의존적인 것이 아니라, mRNA이 분해되는 속도에도 의존적이므로 상기 측정은 간접적이다. 따라서, 정상 상태 수준은 합성 속도 및 분해 속도의 곱이다. 그러나, 전사된 서열이 동일할 때 분해의 속도는 고정된 속도로 진행하는 것으로 간주할 수 있고, 따라서 상기 값은 합성 속도의 척도로서 역할을 할 수 있다. 프로모터를 상기 방식으로 비교할 때, 당업자에게 이용가능한 기술 혼성화, S1-RNAse 분석, 노던 (Northern) 블롯 및 경쟁적 RT-PCR이다. 상기 기술 목록은 어떠한 방식으로도 모든 이용가능한 기술을 나타내지 않고, 대신 mRNA의 전사 활성 및 발현 수준을 분석하기 위해 일반적으로 사용되는 절차를 설명한다. 실질적으로 모든 프로모터에서 전사 시작 지점의 분석에 의해 대체로 전사가 시작하는 단일 염기가 없고, 대신에 다소간의 개시 부위의 모인 세트가 존재하고, 그 각각은 mRNA의 일부 시작 지점을 담당하는 것으로 밝혀졌다. 상기 분포는 프로모터마다 다르므로, 각각의 집단 내의 리포터 mRNA의 서열은 서로 상이할 것이다. 각각의 mRNA 종은 다소 분해하는 경향이 있으므로, 상이한 리포터 mRNA에 대해 단일 분해 속도가 예상되지 않는다. 다양한 진핵생물 프로모터 서열에 대해, 개시 부위를 둘러싸는 서열 ('개시자')가 그 특이적 프로모터에 의해 지시된 RNA 발현의 수준을 결정하는데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 이는 또한 전사된 서열의 일부를 포함한다. 따라서, 리포터 서열에 대한 프로모터의 직접 융합은 최적 미만의 전사를 일으킬 것이다. 발현 패턴 및 수준을 분석하기 위해 일반적으로 사용되는 절차는 세포에서 단백질 축적의 '정상 상태' 수준의 결정을 통한 것이다. 당업자에게 공지된 리포터 유전자에 대해 일반적으로 사용되는 후보는 베타-글루쿠로니다제 (GUS), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT) 및 형광 특성을 갖는 단백질, 예를 들어 애쿠오라 빅토리아 (Aequora victoria)로부터의 초록 형광 단백질 (GFP)이다. 그러나, 단백질이 필수적인 식물 기능을 저해하지 않는다면 원칙적으로 더욱 많은 단백질이 상기 목적에 적합하다. 위치의 정량 및 결정을 위해, 많은 도구 (tool)가 적합하다. 예를 들어, 면역화학적, 효소적, 형광 검출 및 정량에 기반한 검출 시스템은 쉽게 생성될 수 있거나 이용가능하다. 식물 조직 추출물 내에서 또는 무손상 조직 내에서 단백질 수준은 단백질 발현의 계내 분석을 이용하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 하나의 키메라 프로모터 리포터 구성체를 갖는 개별 형질전환된 주는 그들의 리포터 유전자의 발현의 수준이 변할 것이다. 그러한 형질전환체가 임의의 검출가능한 산물 (RNA 또는 단백질)을 발현하지 않는 현상이 또한 종종 관찰된다. 발현의 가변성은 흔히 '위치 효과'에 기인한 것이지만, 상기 불활성도의 기반이 되는 분자 메카니즘은 대체로 명확하게 밝혀지지 않았다.

"과다발현"은 정상 또는 형질전환되지 않은 (비-트랜스제닉) 세포 또는 유기체에서 발현의 수준을 초과하는 트랜스제닉 세포 또는 유기체에서 발현의 수준을 나타낸다.

"5' 비-코딩 서열" 또는 "5'-비번역 서열" 또는 "-구역"은 코딩 서열에 대해 5' (상류)에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이는 개시 코돈의 상류의 완전 처리된 mRNA 내에 존재하고, 1차 전사체의 mRNA로의 처리, mRNA 안정성 또는 번역 효율에 영향을 미칠 수 있다 (Turner 1995).

"3' 비-코딩 서열" 또는 "3'-비번역 서열" 또는 "-구역"은 코딩 서열에 대해 3' (하류)에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 폴리아데닐화 신호 서열, 및 mRNA 처리 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 코딩하는 다른 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 대체로 mRNA 전구체의 3' 단부에 폴리아데닐산 트랙트 (tract)의 첨가에 작용함으로써 특성화된다. 상이한 3' 비-코딩 서열의 사용은 문헌 [Ingelbrecht et al., 1989]에 예시되어 있다.

용어 "번역 리더 서열"은 프로모터와 RNA로 전사되는 코딩 서열 사이의 유전자의 DNA 서열 부분을 나타내고, 번역 개시 코돈의 상류 (5')의 완전 처리된 mRNA 내에 존재한다. 번역 리더 서열은 1차 전사체의 mRNA로의 처리, mRNA 안정성 또는 번역 효율에 영향을 미칠 수 있다.

"신호 펩티드"는 폴리펩티드의 아미노 말단 연장을 나타내고, 이는 전구체 펩티드를 형성하는 폴리펩티드와 함께 번역되고, 분비 경로 내로 그의 도입을 위해 요구된다. 용어 "신호 서열"은 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 용어 "통과 (transit) 펩티드"는 본원에서 사용될 때 발현된 폴리펩티드의 일부 (바람직하게는 폴리펩티드의 아미노 말단 연장)을 나타내고, 이는 전구체 펩티드를 형성하는 폴리펩티드와 함께 번역되고 세포 소기관 (예를 들어 색소체 (plastid) (예를 들어, 엽록체) 또는 미토콘드리아) 내로 그의 도입을 위해 요구된다. 용어 "통과 서열"은 통과 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

"안티센스 억제"는 내인성 유전자 또는 트랜스젠으로부터 단백질의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 RNA 전사체의 생산을 나타낸다.

"유전자 침묵 (silencing)"은 바이러스 유전자, 트랜스젠, 또는 내인성 핵 유전자의 상동성-의존 억제를 나타낸다. 유전자 침묵은 억제가 영향을 받은 유전자의 감소된 전사로 인한 것일 때에는 전사적일 수 있고, 또는 억제가 영향을 받은 유전자에 상동성인 RNA 종의 증가된 턴오버 (turnover) (분해)로 인한 것일 때에는 전사후 침묵일 수 있다 (English 1996). 유전자 침묵은 바이러스-유도된 유전자 침묵을 포함한다 (Ruiz et al. 1998).

용어 "이종성 DNA 서열", "외인성 DNA 세그먼트" 또는 "이종성 핵산"은 본원에서 사용될 때 각각 특정 숙주세포에 대해 외래인 공급원으로부터 기인하거나, 동일한 공급원의 경우에 그의 본래 형태로부터 변형된 서열을 나타낸다. 따라서, 숙주세포 내의 이종성 유전자는 특정 숙주세포에 내인성이지만 예를 들어, DNA 셔플링 (shuffling)의 사용을 통해 변형된 유전자를 포함한다. 상기 용어는 또한 자연 발생의 DNA 서열의 비-자연 발생의 다수의 카피를 포함한다. 따라서, 상기 용어는 세포에 대해 외래이거나 이종성인, 또는 세포에 대해 상동성이지만 요소가 보통 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에 있는 DNA 세그먼트를 나타낸다. 외인성 DNA 세그먼트는 발현되어 외인성 폴리펩티드를 생성한다. "상동성" DNA 서열은 그가 도입되는 숙주세포와 자연적으로 연합되는 DNA 서열이다. 뉴클레오티드 서열 동일성의 문맥에서 "~에 상동성"은 2개의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열들 사이 또는 2개의 단백질 분자의 아미노산 서열들 사이의 유사성을 나타낸다. 그러한 상동성의 추정은 당업자가 잘 이해할 바와 같이 엄격도의 조건 하에 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화에 의해 (문헌 [Haines and Higgins (eds.), Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, U.K.]에 기재된 바와 같이), 또는 2개의 핵산 또는 단백질 사이의 서열 유사성의 비교에 의해 제공된다.

용어 "실질적으로 유사한"은 본원에 개시된 서열, 특히 본원에 개시된 오리자 사티바, 아라비돕시스 탈리아나 또는 브라시카 나푸스 (Brassica napus) 서열의 기능적 및/또는 구조적 동등체 또는 오르토로그를 나타내는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다.

가장 넓은 의미에서, 뉴클레오티드 서열에 관하여 본원에서 사용될 때 용어 "실질적으로 유사한"은 뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열에 대한 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 구조 및 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 일부임을 의미하고, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 참조 뉴클레오티드 서열에 상응하는 유전자의 오르토로그인 유전자로부터의 프로모터뿐만 아니라 특히 본원에서 예시된 프로모터 서열에 구조적으로 관련되는 프로모터 서열을 포함하고, 즉, 실질적으로 유사한 프로모터 서열은 고엄격도 또는 매우 고엄격도 조건 하에 본원에 예시된 프로모터 서열의 상보체에 혼성화한다. 예를 들어, 단순히 유전자 코드의 다의성 (degeneracy)을 반영하지만 그럼에도 불구하고 특정 아미노산 서열에 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 변경된 뉴클레오티드 서열은 특정 서열에 실질적으로 유사하다. 용어 "실질적으로 유사한"은 또한 서열이 예를 들어, 특정 세포 내에서 발현을 최적화하기 위해 변형된 뉴클레오티드 서열, 및 참조 서열에 의해 코딩되는 (비변형된) 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (상기 치환(들)은 비변형된 폴리펩티드에 비해 변이체 폴리펩티드의 활성을 변경시키지 않는다)을 포함한다.

가장 넓은 의미에서, 폴리펩티드에 관하여 본원에서 사용될 때 용어 "실질적으로 유사한"은 폴리펩티드가 참조 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 구조 및 기능을 갖는 것을 의미한다. 바람직하게는, 상동체는 오르토로그이다. 실질적으로 유사한 서열을 갖는 유전자가 유전자의 오르토로그이든 아니든, 예를 들어 cor78 또는 Met1 유전자는 간단한 분석으로 시험될 수 있다. 내인성 유전자, 예를 들어 cor78 또는 Met를 먼저 결실시킨 후, 잠재적인 오르토로그를 결핍된 세포 또는 식물 내로 도입한다. 오르토로그는 야생형과 유사하거나 실질적으로 유사한 표현형을 재확립하여야 하고, 바람직하게는 표현형은 야생형과 동일하다. 한 실시태양에서, 상기 용어는 특정 서열에 실질적으로 유사한 아미노산 서열이 전체 아미노산 동일성이 그 서열에 대해 적어도 60% 이상인 것임을 의미할 수 있다. 동등한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 생성시키는 변형은 당업계의 일상적인 기술 범위에 포함된다. 한 실시태양에서, 실질적으로 유사한 폴리펩티드와 참조 폴리펩티드 사이의 아미노산 서열 동일성 %는 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 예를 들어, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 및 심지어 90% 이상, 예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 적어도 99%까지이다. 2개의 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 기능을 갖는 것 외에 실질적으로 서로 유사하다는 하나의 추가의 표시는 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어, 항체가 또한 다른 것에도 특이적으로 결합하는 것이다.

서열 비교는 스미쓰-워터만 서열 정렬 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, [Waterman 1995] 참조). 다음 파라미터: 매치: 1, 미스매치 페널티: 0.33, 개방-갭 페널티: 2, 연장된-갭 페널티: 2를 갖는 localS 프로그램, 버전 1.16이 바람직하게 사용된다.

또한, 참조 뉴클레오티드 서열에 "실질적으로 유사한" 뉴클레오티드 서열은 참조 뉴클레오티드 서열에 "동등한" 것으로 말해진다. 당업자는 본 발명에 포함되는 동등한 뉴클레오티드 서열이 또한 낮은, 중등도 및/또는 엄격한 조건 (예를 들어, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 65℃) 하에 청구 범위의 문자 그대로의 범위 내에 있는 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 그들의 능력에 의해 규정될 수 있음을 알 것이다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 단편에 관하여 사용될 때 "실질적으로 동일한 활성"은 단편이 전장 폴리뉴클레오티드 또는 전장 폴리펩티드의 활성의 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 예를 들어, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 및 심지어 90% 이상, 예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 적어도 99%까지의 활성을 갖는 것을 의미한다.

"표적 유전자"는 목적하는 표적 코딩 서열, 기능적 RNA, 또는 단백질을 발현하는 유전자, 예를 들어 레플리콘 (replicon) 상의 유전자를 나타낸다. 한 실시태양에서, 표적 유전자는 레플리콘 복제에 필수적이지 않다. 추가로, 표적 유전자는 비-천연 유기체 내로 삽입된 천연 비-바이러스 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있고, 적합한 조절 서열의 제어 하에 놓일 것이다. 따라서, 표적 유전자 내의 조절 서열은 바이러스를 포함한 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있다. 표적 유전자는 형질전환시킬 특정 식물의 유전자에 이종성 또는 상동성인 코딩 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 한 실시태양에서, 표적 유전자는 천연 바이러스 유전자를 포함하지 않는 유전자일 수 있다. 전형적인 표적 유전자는 구조 단백질, 종자 저장 단백질, 제초제 저항성을 보유하는 단백질, 및 곤충 저항성을 보유하는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 표적 유전자에 의해 코딩된 단백질은 "외래 단백질"로서 알려져 있다. 식물 내에서 표적 유전자의 발현은 대개 변경된 식물 형질을 생성시킬 것이다.

용어 "변경된 식물 형질"은 야생형 또는 비-트랜스제닉 식물 숙주에 비해 트랜스제닉 식물 내의 임의의 표현형 또는 유전자형 변화를 의미한다.

용어 "형질전환"은 유전학상 안정한 유전을 일으키는 숙주세포의 게놈 내로의 핵산 단편의 전달을 나타낸다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주세포를 "트랜스제닉" 세포로 칭하고, 트랜스제닉 세포를 포함하는 유기체를 "트랜스제닉 유기체"로 칭한다. 식물 및 식물 세포의 형질전환 방법의 예는 아그로박테리움 (Agrobacterium)-매개된 형질전환 (De Blaere 1987) 및 입자 폭격 기술 (US 4,945,050)을 포함한다. 전체 식물이 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 트랜스제닉 세포로부터 재생될 수 있다 (예를 들어, Fromm 1990 참조).

"형질전환된", "트랜스제닉", 및 "재조합"은 이종성 핵산 분자가 도입된 세균 또는 식물과 같은 숙주 유기체를 나타낸다. 핵산 분자는 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있다. 예를 들어, "형질전환된", "형질전환체", 및 "트랜스제닉" 식물 또는 캘러스는 형질전환 과정을 통한 것이고, 그들의 염색체 내로 통합된 외래 유전자를 함유한다. 용어 "형질전환되지 않은"은 형질전환 과정을 거치지 않은 정상 식물을 나타낸다.

"일시적으로 형질전환된"은 트랜스젠 및 외래 DNA가 도입되지만 (예를 들어, 아그로박테리움-매개된 형질전환 또는 바이올리스틱 폭격 (biolistic bombardment)과 같은 방법에 의해), 안정한 유지를 위해 선택되지 않은 세포를 나타낸다.

"안정하게 형질전환된"은 형질전환 후에 선택 배지 상에서 선택되고 재생된 세포를 나타낸다.

"염색체에 통합된"은 외래 유전자 또는 DNA 구성체가 공유결합에 의해 숙주 DNA 내로 통합되는 것을 나타낸다. 유전자가 "염색체에 통합되지" 않은 경우에, 유전자는 "일시적으로 발현될" 수 있다. 유전자의 일시적 발현은 숙주 염색체 내로 통합되지 않지만, 예를 들어 자가 복제 플라스미드 또는 발현 카세트의 일부로서, 또는 바이러스와 같은 또다른 생물학적 시스템의 일부로서 독립적으로 기능하는 유전자의 발현을 의미한다.

"일시적 발현"은 바이러스 또는 트랜스젠이 바이러스 감염에 의해 또는 아그로박테리움-매개된 형질전환, 전기천공, 또는 바이올리스틱 폭격과 같은 방법에 의해 도입되지만, 그의 안정한 유지를 위해 선택되지 않은 세포 내의 발현을 나타낸다.

"유전학상 안정한" 및 "유전가능한"은 식물 내에서 안정하게 유지되고 연속적인 세대를 통해 자손체에 의해 안정하게 유전되는 염색체에 통합된 유전적 요소를 나타낸다.

"1차 형질전환체" 및 "T0 세대"는 처음에 형질전환된 (즉, 형질전환 이후 감수분열 및 수정을 거치지 않은) 조직과 동일한 유전 세대의 것인 트랜스제닉 식물을 나타낸다.

"2차 형질전환체" 및 "T1, T2, T3 등의 세대"는 하나 이상의 감수분열 및 수정 사이클을 통해 1차 형질전환체로부터 유래하는 트랜스제닉 식물을 나타낸다. 이들은 1차 또는 2차 형질전환체의 자가-수정 또는 1차 또는 2차 형질전환체와 다른 형질전환되거나 형질전환되지 않은 식물의 교배에 의해 유래할 수 있다.

"야생형"은 임의의 공지의 돌연변이가 없는 자연에서 발견된 바이러스 또는 유기체를 나타낸다.

무효 분리개체는 멘델 (Mendelian) 분리로 인한 트랜스젠을 함유하지 않는 트랜스제닉 식물의 자손체 (또는 자손체로부터 유래된 주)이다.

용어 "게놈" 또는 "게놈 DNA"는 숙주 유기체의 유전가능한 유전자 정보를 나타낸다. 상기 게놈 DNA는 핵의 DNA (염색체 DNA로도 칭함)뿐만 아니라 색소체 (예를 들어, 엽록체) 및 다른 세포 소기관 (예를 들어, 미토콘드리아)의 DNA를 포함한다. 바람직하게는, 용어 게놈 또는 게놈 DNA는 핵의 염색체 DNA를 나타낸다.

용어 "염색체 DNA" 또는 "염색체 DNA-서열"은 세포 주기 상태에 독립적인 세포 핵의 게놈 DNA로서 이해되어야 한다. 그러므로, 염색체 DNA는 염색체 또는 염색분체 (chromatid) 내에서 조직화될 것이고, 이들은 압축되거나 풀릴 수 있다. 염색체 DNA 내로의 삽입은 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 분석, 서던 블롯 (Southern blot) 분석, 형광 계내 혼성화 (FISH), 및 계내 PCR과 같은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 입증되고 분석될 수 있다.

용어 "핵산"은 당, 포스페이트, 및 퓨린 또는 피리미딘인 염기를 함유하는 단량체 (뉴클레오티드)로 이루어진, 단일가닥 또는 이중가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 나타낸다. 구체적으로 제한하지 않으면, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖거나 자연 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지의 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지시하지 않으면, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 퇴보 코돈 치환) 및 상보성 서열뿐만 아니라 명시적으로 나타낸 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 퇴보 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성할 수 있다 ([Batzer 1991]; [Ohtsuka 1985]; [Rossolini 1994]). "핵산 단편"은 주어진 핵산 분자의 파편이다. 고등 식물에서, 데옥시리보핵산 (DNA)은 유전 물질인 반면, 리보핵산 (RNA)은 DNA 내에 함유된 정보의 단백질로의 전달에 관여한다. 용어 "뉴클레오티드 서열"은 임의로 DNA 또는 RNA 중합체 내로 통합되리 수 있는 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 함유하는, 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있는 DNA 또는 RNA의 중합체를 나타낸다. 또한, 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 유전자, cDNA, DNA 및 유전자에 의해 코딩되는 RNA와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

본 발명은 단리된 또는 실질적으로 정제된 핵산 또는 단백질 조성물을 포함한다. 본 발명의 문맥에서, "단리된" 또는 "정제된" DNA 분자 또는 "단리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드는 인간에 의해 그의 천연 환경으로부터 떨어져 존재하고, 따라서 자연의 산물이 아닌 DNA 분자 또는 폴리펩티드이다. 단리된 DNA 분자 또는 폴리펩티드는 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어, 트랜스제닉 숙주세포와 같은 비-천연 환경 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, "단리된" 또는 "정제된" 핵산 분자 또는 단백질, 또는 그의 생물학적 활성부에는 재조합 기술에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 바람직하게는, "단리된" 핵산에는 핵산이 유래되는 유기체의 게놈 DNA 내의 핵산을 자연적으로 플랭킹하는 서열 (즉, 핵산의 5' 및 3' 단부에 위치하는 서열) (바람직하게는 단백질 코딩 서열)이 없다. 예를 들어, 다양한 실시태양에서, 단리된 핵산 분자는 핵산이 유래되는 세포의 게놈 DNA 내의 핵산 분자를 자연적으로 플랭킹하는 뉴클레오티드 서열을 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 미만으로 함유할 수 있다. 세포성 물질이 실질적으로 존재하지 않는 단백질은 약 30%, 20%, 10%, 5% (건조 중량 기준) 미만의 오염 단백질을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드의 제제를 포함한다. 본 발명의 단백질 또는 그의 생물학적 활성부가 재조합 방식으로 생산될 때, 바람직하게 배양 배지는 약 30%, 20%, 10% 또는 5% (건조 중량 기준) 미만의 화학 전구체 또는 관심있는 화학물질의 비-단백질을 나타낸다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 자연 발생하는 서열뿐만 아니라 돌연변이체 (변이체) 형태를 모두 포함한다. 상기 변이체는 목적하는 활성, 즉, 프로모터 활성 또는 비-변이체 뉴클레오티드 서열의 개방 판독 프레임에 의해 코딩되는 산물의 활성을 계속 가질 것이다.

서열 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산 서열, 예를 들어 본 발명의 전사 조절 뉴클레오티드 서열)에 관하여 용어 "변이체"는 실질적으로 유사한 서열을 의미하도록 의도된다. 개방 판독 프레임을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 경우에, 변이체는 유전자 코드의 다의성 때문에 천연 단백질의 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함한다. 이들과 같은 자연 발생하는 대립유전자 변이체는 잘 공지된 분자 생물학 기술을 사용하여, 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 혼성화 기술을 사용하여 확인할 수 있다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 또한 예를 들어, 부위-지정된 돌연변이 유발을 사용함으로써 생성된 것 및 개방 판독 프레임을 대하여, 천연 단백질을 코딩하는 것뿐만 아니라 천연 단백질에 비해 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것과 같은 합성적으로 유도된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 변이체는 천연 (야생형 또는 내인성) 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 40, 50, 60 내지 70%, 예를 들어, 바람직하게는 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% 내지 79%, 일반적으로 적어도 80%, 예를 들어, 81%-84%, 적어도 85%, 예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 내지 98% 및 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가질 것이다.

특정 핵산 서열의 "보존적으로 변형된 변이"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, 또는 핵산 서열이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 나타낸다. 유전자 코드의 다의성 때문에, 매우 많은 기능적으로 동일한 핵산들이 임의의 제시된 폴리펩티드를 코딩한다. 예를 들어, 코돈 CGT, CGC, CGA, CGG, AGA 및 AGG는 모두 아미노산 아르기닌을 코딩한다. 따라서, 아르기닌이 하나의 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 단백질을 변경시키지 않으면서 설명된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이는 "보존적으로 변형된 변이"의 일종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원에 설명된 모든 핵산 서열도 또한 달리 주지한 경우를 제외하고는 모든 가능한 침묵 변이를 설명한다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈 (보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 ATG 제외)이 표준 기술에 의해 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성시킬 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 "침묵 변이"는 각각의 기재된 서열에 함축된다.

본 발명의 핵산 분자는 관심있는 식물 내에서 향상된 발현을 위해 "최적화될" 수 있다 (예를 들어, WO 91/16432; [Perlak 1991]; [Murray 1989] 참조). 상기 방식으로, 유전자 또는 유전자 단편 내의 개방 판독 프레임은 식물에 바람직한 코돈을 이용하여 합성될 수 있다 (숙주에 바람직한 코돈 사용의 논의에 대해서는 예를 들어, [Campbell & Gowri, 1990] 참조). 따라서, 뉴클레오티드 서열은 임의의 식물에서 발현을 위해 최적화될 수 있다. 유전자 서열의 전부 또는 임의의 일부는 최적화되거나 합성될 수 있는 것으로 인정된다. 즉, 합성 또는 부분 최적화된 서열이 또한 사용될 수 있다. 변이체 뉴클레오티드 서열 및 단백질은 또한 DNA 셔플링과 같은 돌연변이유발 및 재조합발생 절차로부터 유래되는 서열 및 단백질을 포함한다. 상기 절차를 사용하여, 하나 이상의 상이한 코딩 서열이 조작되어 목적하는 특성을 갖는 새로운 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 상기 방식으로, 재조합 폴리뉴클레오티드의 라이브러리가 실질적인 서열 동일성을 갖는 서열 구역들을 포함하는 관련 서열 폴리뉴클레오티드의 집단으로부터 생성되고, 시험관 내에서 또는 생체 내에서 상동성 재조합될 수 있다. 그러한 DNA 셔플링을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, [Stemmer 1994]; [Stemmer 1994]; [Crameri 1997]; [Moore 1997]; [Zhang 1997]; [Crameri 1998]; 및 US 5,605,797, 9, 11, 13, 15, 및 17,837,458 참조).

"변이체" 폴리펩티드는 천연 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단 단부에 하나 이상의 아미노산의 결실 (소위 말단절단 (truncation)) 또는 부가; 천연 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 부가; 또는 천연 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 천연 단백질로부터 유래된 폴리펩티드를 의도한다. 그러한 변이체는 예를 들어, 유전적 다형성 또는 인간 조작으로부터 생성될 수 있다. 그러한 조작을 위한 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.

따라서, 폴리펩티드는 아미노산 치환, 결실, 말단절단 및 삽입을 포함한 다양한 방식으로 변경될 수 있다. 그러한 조작을 위한 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 DNA에서 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이 유발 및 뉴클레오티드 서열 변경을 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, [Kunkel 1985]; [Kunkel 1987]; US 4,873,192; [Walker & Gaastra, 1983]과 여기에 인용된 문헌 참조). 관심있는 단백질의 생물학적 활성을 해치지 않는 적절한 아미노산 치환에 관한 지침은 문헌 [Dayhoff et al. (1978)]의 모델에서 찾을 수 있다. 하나의 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 것으로 교환하는 것과 같은 보존적 치환이 바람직하다. 코딩된 서열 내에서 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산 (전형적으로 5% 미만, 보다 전형적으로 1% 미만)을 변경, 부가 또는 결실시키는 개별적인 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이"이고, 여기서 변경은 아미노산을 화학상 유사한 아미노산으로 치환시킨다. 기능상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 공지되어 있다. 다음 5개의 군은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 지방족: 글라이신 (G), 알라닌 (A), 발린 (V), 류신 (L), 이소류신 (I); 방향족: 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y), 트립토판 (W); 황-함유: 메티오닌 (M), 시스테인 (C); 염기성: 아르기닌 (R), 라이신 (K), 히스티딘 (H); 산성: 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q). 또한, 문헌 [Creighton, 1984]을 참고한다. 또한, 코딩된 서열 내에서 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 개별적인 치환, 결실 또는 부가가 또한 "보존적으로 변형된 변이"이다.

"발현 카세트" 또는 "발현 구성체"는 본원에서 사용될 때, 임의로 종료 신호 및/또는 다른 조절 요소에 작동가능하게 연결되는 관심있는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 적절한 숙주세포 내에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 발현 카세트는 또한 뉴클레오티드 서열의 적합한 번역을 위해 요구되는 서열을 포함할 수 있다. 코딩 구역은 대체로 관심있는 단백질을 코딩하지만, 또한 관심있는 기능성 RNA, 예를 들어 안티센스 RNA 또는 비번역 RNA를 센스 또는 안티센스 방향으로 코딩할 수 있다. 관심있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있고, 이는 적어도 하나의 그의 성분이 적어도 하나의 그의 다른 성분에 대하여 이종성임을 의미한다. 발현 카세트는 또한 자연 발생하지만 이종성 발현을 위해 유용한 재조합 형태로 얻어진 것일 수 있다. 발현 카세트는 전적으로 세포 외에서 (예를 들어, 재조합 클로닝 기술에 의해) 조립될 수 있다. 그러나, 발현 카세트는 또한 부분적으로 내인성 성분을 사용하여 조립될 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트는 내인성 서열의 상류의 프로모터 서열을 배치 (또는 삽입)하여, 상기 프로모터 서열에 의해 기능적으로 연결되고 제어되도록 함으로써 얻어질 수 있다. 마찬가지로, 발현시킬 핵산 서열은 내인성 프로모터 서열의 하류에 배치 (또는 삽입)되어, 발현 카세트를 형성할 수 있다. 일반적으로, 발현 카세트 내에서 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터의, 또는 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극에 노출될 때에만 전사를 개시시키는 유도가능 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있다. 본 발명의 발현 카세트, 전사 조절 서열 또는 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관 또는 발달의 단계에, 특히 배 또는 배반에 특이적일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 발현 카세트는 관심있는 뉴클레오티드 서열에 연결된 본 발명의 전사 개시 구역을 포함할 것이다. 그러한 발현 카세트에는 바람직하게는 조절 구역의 전사 조절 하에 있도록 관심있는 유전자의 삽입을 위한 복수의 제한 부위가 제공된다. 발현 카세트는 추가로 선택가능 마커 유전자를 함유할 수 있다. 카세트는 전사의 5'-3' 방향으로 식물에서 기능적인 전사 및 번역 개시 구역, 관심있는 DNA 서열, 및 전사 및 번역 종료 구역을 포함할 것이다. 종료 구역은 전사 개시 구역과 천연적일 수 있거나, 관심있는 DNA 서열과 천연적일 수 있거나, 다른 공급원으로부터 유래할 수 있다. 편리한 종료 구역은 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 Ti-플라스미드로부터 옥토파인 합성효소 및 노팔린 합성효소 종료 구역으로서 및 아래 설명된 다른 것으로서 이용가능하다 (또한 [Guerineau 1991]; [Proudfoot 1991]; [Sanfacon 1991]; [Mogen 1990]; [Munroe 1990]; [Ballas 1989]; [Joshi 1987] 참조).

"벡터"는 특히 임의의 플라스미드, 코스미드, 파지 또는 아그로박테리움 이원 (binary) 벡터를 이중가닥 또는 단일가닥의 선형 또는 원형 형태로 포함하는 것으로 규정되고, 이는 자가 전달가능하거나 이동가능할 수 있거나 그렇지 않을 수 있고, 세포 게놈 내로의 통합 또는 염색체 외에 존재에 의해 원핵생물 또는 진핵생물 숙주를 형질전환시킬 수 있다 (예를 들어 복제 기점을 갖는 자가 복제 플라스미드).

구체적으로 셔틀 (shuttle) 벡터가 포함되고, 이는 예를 들어 방선규 (actinomycetes) 및 관련 종, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애 (Sacharomyces cerevisiae), 세균 및 진핵생물 (예를 들어 고등 식물, 포유동물, 효모 또는 진균 세포)로부터 선택될 수 있는 2개의 상이한 숙주 유기체 내에서 천연적으로 또는 설계에 의해 복제할 수 있는 DNA 비히클을 의미한다.

바람직하게는, 벡터 내의 핵산은 미생물, 예를 들어 세균, 또는 식물 세포와 같은 숙주세포 내에서 전사를 위한 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소의 제어 하에 있고 이에 작동가능하게 연결된다. 벡터는 다수의 숙주 내에서 기능하는 이중-기능적 발현 벡터일 수 있다. 게놈 DNA의 경우에 벡터는 그 자신의 프로모터 또는 다른 조절 요소를 함유할 수 있고, cDNA의 경우에 숙주 세포 내에서 발현을 위한 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소의 제어 하에 놓일 수 있다.

"클로닝 벡터"는 대개 외래 DNA 서열이 벡터의 필수적인 생물학적 기능의 손실 없이 결정가능한 방식으로 삽입될 수 있는 하나의 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위, 및 클로닝 벡터로 형질전환된 세포의 확인 및 선택에서 사용하기에 적합한 마커 유전자를 함유한다. 마커 유전자는 대개 테트라사이클린 저항성, 히그로마이신 저항성 또는 암피실린 저항성을 제공하는 유전자를 포함한다.

"트랜스제닉 식물"은 발현 벡터 또는 본 발명의 발현 카세트와 같은 재조합 발현 카세트를 함유하는 하나 이상의 식물 세포를 갖는 식물이다.

"식물 조직"은 뿌리, 줄기, 싹, 잎, 화분, 종자, 종양 조직 및 다양한 형태의 세포 및 배양물, 예를 들어 단일 세포, 원형질체, 배, 및 캘러스 조직을 포함하지만 이로 제한되지 않는 분화된 및 미분화된 조직 또는 식물을 포함한다. 식물 조직은 식물 내에 또는 기관, 조직 또는 세포 배양액 내에 존재할 수 있다.

2개 이상의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 서열 관계를 설명하기 위해 다음 용어를 사용한다: (a) "참조 서열", (b) "비교창", (c) "서열 동일성", (d) "서열 동일성 %" 및 (e) "실질적인 동일성".

(a) 본원에서 사용될 때 "참조 서열"은 서열 비교의 기초로서 사용되는 규정된 서열이다. 참조 서열은 특정된 서열의 하위세트 또는 전체; 예를 들어, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 세그먼트, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열일 수 있다.

(b) 본원에서 사용될 때, "비교창"은 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 폴리뉴클레오티드 서열의 연속적이고 특정된 세그먼트를 나타내고, 여기서 비교창 내의 폴리뉴클레오티드 서열은 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않는)에 비해 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 비교창은 적어도 20개의 연속적 뉴클레오티드 길이이고, 임의로 30, 40, 50, 100개 이상일 수 있다. 당업자는 폴리뉴클레오티드 서열 내의 갭의 포함으로 인한 참조 서열에 대한 높은 유사성을 피하기 위해, 갭 페널티가 대개 도입되고 매치의 수로부터 빼지는 것을 이해할 것이다.

비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 따라서, 임의의 2개의 서열 사이의 서열 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. 그러한 수학적 알고리즘의 바람직한 비-제한적인 예는 문헌 [Myers and Miller, 1988]의 알고리즘; 문헌 [Smith et al. 1981]의 국소 상동성 알고리즘; 문헌 [Needleman and Wunsch 1970]의 상동성 정렬 알고리즘; 문헌 [Pearson and Lipman 1988]의 유사성 탐색 방법; 문헌 [Karlin and Altschul, 1993]에서와 같이 변형된 문헌 [Karlin and Altschul, 1990]의 알고리즘이다.

서열 동일성을 결정하기 위한 서열 비교를 위해 이들 수학적 알고리즘의 컴퓨터 실행 프로그램을 사용할 수 있다. 그러한 실행 프로그램은 PC/Gene 프로그램의 CLUSTAL (인텔리제네틱스 (Intelligenetics, 미국 캘리포니아주 마운튼 뷰)로부터 이용가능함); 위스콘신 제네틱스 (Wisconsin Genetics) 소프트웨어 패키지, 버전 8의 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 및 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA (제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group; GCG, 미국 위스콘신주 매디슨 575 사이언스 드라이브)로부터 이용가능함)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이들 프로그램을 사용하는 정렬은 디폴트 파라미터를 사용하여 수행할 수 있다. CLUSTAL 프로그램은 잘 설명되어 있다 ([Higgins 1988, 1989]; [Corpet 1988]; [Huang 1992]; [Pearson 1994]). ALIGN 프로그램은 문한 [Myers and Miller, 상동]의 알고리즘에 기초한다. 문헌 [Altschul et al., 1990]의 BLAST 프로그램은 문헌 [Karlin and Altschul, 상동]의 알고리즘에 기초한다. 다수의 정렬 (즉, 2개 초과의 서열)은 바람직하게는 디폴트 세팅 (갭 개방 페널티 15/19, 갭 연장 페널티 6.66/0.05; 갭 분리 페널티 범위 8; 정렬 지연을 위한 동일성 % 40; 잔기 특이적인 갭 및 친수성 잔기 갭을 사용)을 갖는 측정 행렬 (scoring matrix) BLOSUM62MT2를 사용하는 Clustal W 알고리즘 (Thompson 1994; 예를 들어, 소프트웨어 VectorNTI™, 버전 9 (인비트로겐 인크. (Invitrogen Inc.)에서)을 이용하여 수행된다.

BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 이용가능하다. 상기 알고리즘은 먼저 질의 서열에서 길이 W의 짧은 단어 (word)를 확인함으로써 높은 스코어링 서열쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함하고, 이는 데이타베이스 서열 내의 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 포지티브-값의 역치 스코어 T에 매칭하거나 만족한다. T는 확장 단어 (neighborhood word) 스코어 역치로서 언급된다 (AItschul 1990). 이들 초기 확장 단어 일치 (hit)는 그를 함유하는 보다 긴 HSP를 찾기 위한 탐색을 개시하기 위한 근원으로서 작용한다. 이어서, 단어 일치는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있을 때까지 각각의 서열을 따라 두 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라미터 M (한 쌍의 매칭하는 잔기에 대한 보상 스코어; 항상 >0) 및 N (미스매치하는 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 누적 스코어를 계산하기 위해 측정 행렬이 사용된다. 각 방향으로 단어 일치의 연장은 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성된 값으로부터 양 X로 하락하거나, 누적 스코어가 하나 이상의 네가티브-스코어링 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 또는 그 미만으로 가거나, 두 서열의 단부가 닿을 때 중지된다.

서열 동일성 %을 계산하는 것에 추가로, BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다 (예를 들어 [Karlin & Altschul (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 하나의 척도는 최소 합 확률 (P(N))이고, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 일어날 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 시험 핵산 서열은 참조 핵산 서열에 대한 시험 핵산 서열의 비교에서 최소 합 확률이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 참조 서열에 유사한 것으로 간주된다.

비교 목적을 위한 갭드 (gapped) 정렬을 얻기 위해, 갭드 BLAST (BLAST 2.0에서)를 문헌 [Altschul et al. 1997]에 설명된 바와 같이 사용할 수 있다. 별법으로, PSI-BLAST (BLAST 2.0에서)를 사용하여 분자들 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 탐색을 수행할 수 있다 (문헌 [Altschul et al., 상기 문헌] 참조). BLAST, 갭드 BLAST, PSI-BLAST를 사용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTN, 단백질에 대해 BLASTX)를 사용할 수 있다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대해)에서는 디폴트로서 11의 단어길이 (W), 10의 기대값 (E), 100의 컷오프 (cutoff), M=5, N=-4, 및 두 스트랜드의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우에, BLASTP 프로그램에서는 디폴트로서 3의 단어길이 (W), 10의 기대값 (E), 및 BLOSUM62 측정 행렬을 사용한다 (문헌 [Henikoff & Henikoff, 1989] 참조). http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다. 또한, 정렬은 검사에 의해 수동으로 수행할 수도 있다.

본 발명의 목적에서, 본원에 개시된 프로모터 서열에 대한 서열 동일성 %의 결정을 위한 뉴클레오티드 서열의 비교는 바람직하게는 그의 디폴트 파라미터를 갖는 BlastN 프로그램 (버전 1.4.7 또는 나중의 버전) 또는 임의의 동등한 프로그램을 사용하여 이루어진다. "동등한 프로그램"은 질문되는 임의의 2개의 서열에 대해, 바람직한 프로그램에 의해 생성된 상응하는 정렬에 비교할 때 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 매치 및 동일한 서열 동일성 %을 갖는 정렬을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램을 의도한다.

(c) 본원에서 사용될 때, 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 특정된 비교창 위에서 최대 상응성에 대해 정렬될 때 동일한 2개의 서열 내의 잔기를 나타낸다. 서열 동일성 %가 단백질에 관하여 사용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종 보존적 아미노산 치환에 의해 상이한 것으로 인정되고, 여기서 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성 (예를 들어, 전하 또는 소수도)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 따라서 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는다. 서열이 보존적 치환으로 상이한 경우에, 서열 동일성 %는 치환의 보존 성질에 대해 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 그러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는 것으로 말해진다. 상기 조정을 하는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이는 보존적 치환을 전체 미스매치보다 부분으로서 스코어링하여, 서열 동일성 %를 증가시키는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산에는 1의 스코어가 주어지고, 비-보존적 치환에는 0의 스코어가 주어지고, 보존적 치환에는 0과 1 사이의 의 스코어가 주어진다. 보존적 치환의 스코어링은 예를 들어, 프로그램 PC/GENE (인텔리제네틱스)에서 실행되는 바와 같이 계산된다.

(d) 본원에서 사용될 때, "서열 동일성 %"는 비교창 위에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값을 의미하고, 여기서 비교창 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않는)에 비해 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열 모두에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 얻고, 매칭된 위치의 수를 비교창 내의 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 %을 얻음으로써 계산한다.

(e) (i) 폴리뉴클레오티드 서열의 용어 "실질적인 동일성"은 폴리뉴클레오티드가 표준 파라미터를 사용하여 설명된 정렬 프로그램 중의 하나를 이용하여 참조 서열에 비교할 때 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% 또는 79%, 바람직하게는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함함을 의미한다. 당업자는 이들 값을 코돈 다의성, 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치 등을 고려하여 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 상응하는 동일성을 결정하기 위해 적절하게 조정할 수 있음을 이해할 것이다. 이를 위해, 아미노산 서열의 실질적인 동일성은 보통 적어도 60% 또는 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 의미한다.

뉴클레오티드 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 2개의 분자가 엄격한 조건 (아래 참조) 하에 서로에 혼성화하는 경우이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정한 서열에 대한 열 융점 (T_m)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. 그러나, 엄격한 조건은 본원에서 달리 정량되는 목적하는 정도의 엄격도에 따라 약 1℃ 내지 약 20℃ 범위의 온도를 포함한다. 엄격한 조건 하에 서로에 혼성화하지 않는 핵산은 그들이 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하면 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들어, 핵산의 카피가 유전자 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 다의성을 사용하여 생성될 때 발생할 수 있다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 하나의 표시는 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드와 면역학상 교차 반응성일 때이다.

(ii) 펩티드의 문맥에서 용어 "실질적인 동일성"은 펩티드가 특정된 비교창 위에서 참조 서열과 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% 또는 79%, 바람직하게는 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%, 또는 훨씬 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 최적 정렬은 문헌 [Needleman and Wunsch (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘을 사용하여 수행한다. 2개의 펩티드 서열이 실질적으로 동일하다는 표시는 하나의 펩티드가 제2 펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학상 반응성이라는 것이다. 따라서, 펩티드는 예를 들어, 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에 제2 펩티드에 실질적으로 동일하다.

서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우에 후속 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 비해 시험 서열(들)에 대한 서열 동일성 %를 계산한다.

상기한 바와 같이, 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 2개의 분자가 엄격한 조건 하에 서로에 혼성화하는 것이다. 어구 "~에 특이적으로 혼성화하는"은 서열이 복합체 혼합형 (예를 들어, 총 세포) DNA 또는 RNA 내에 존재할 때 엄격한 조건 하에 특정 뉴클레오티드 서열에 대해서만 분자의 결합, 이중체 형성 (duplexing), 또는 혼성화를 나타낸다. "실질적으로 결합하는"은 프로브 핵산과 표적 핵산 사이의 상보적인 혼성화를 나타내고, 표적 핵산 서열의 목적하는 검출을 달성하기 위해 혼성화 배지의 엄격도를 감소시킴으로써 수용될 수 있는 경미한 (minor) 미스매치를 포함한다.

서던 및 노던 (Northern) 혼성화와 같은 핵산 혼성화 실험의 문맥에서 "엄격한 혼성화 조건" 및 "엄격한 혼성화 세척 조건"은 서열 의존적이고, 상이한 환경 파라미터 하에 상이하다. T_m은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭된 프로브에 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도 및 pH 하에)이다. 특이성은 대개 혼성화 후 세척의 함수이고, 중대 인자는 최종 세척 용액의 이온 강도 및 온도이다. DNA-DNA 하이브리드에 대해, T_m은 문헌 [Meinkoth and Wahl, 1984]의 등식으로부터 어림할 수 있다:

T_m = 81.5℃ + 16.6 (log₁₀ M)+0.41 (%GC) - 0.61 (% 포름) - 500/L

식에서, M은 1가 양이온의 몰농도이고, %GC는 DNA 내의 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 백분율이고, % 포름은 혼성화 용액 내의 포름아미드의 백분율이고, L은 염기쌍 내의 하이브리드의 길이이다. T_m은 각각의 1%의 미스매칭에 대해 약 1℃ 감소되고; 따라서, T_m, 혼성화, 및/또는 세척 조건은 목적하는 동일성의 서열에 혼성화하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, >90%의 동일성을 갖는 서열이 추구되면, T_m은 10℃ 감소될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정한 서열 및 그의 상보체에 대한 열 융점 I보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. 그러나, 매우 엄격한 조건은 열 융점 I보다 1, 2, 3 또는 4℃ 더 낮은 온도에서 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고; 중등도로 엄격한 조건은 열 융점 I보다 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 더 낮은 온도에서 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고; 낮은 엄격도 조건은 열 융점 I보다 11, 12, 13, 14, 15 또는 20℃ 더 낮은 온도에서 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다. 등식, 혼성화 및 세척 조성물, 및 목적하는 T를 사용하여, 당업자는 혼성화 및/또는 세척 용액의 엄격도의 변동이 고유하게 설명되는 것을 이해할 것이다. 목적하는 정도의 미스매칭이 45℃ 미만 (수용액) 또는 32℃ 미만 (포름아미드 용액)의 T를 생성시키면, 보다 높은 온도가 사용될 수 있도록 SSC 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범한 지침은 문헌 [Tijssen, 1993]에서 발견된다. 일반적으로, 고도로 엄격한 혼성화 및 세척 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정한 서열에 대한 열 융점 T_m보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다.

고도로 엄격한 세척 조건의 한 예는 72℃에서 약 15분 동안 0.15 M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 예는 65℃에서 15분 동안 0.2XSSC 세척액 (SSC 버퍼의 설명에 대해 문헌 [Sambrook, 아래 참조] 참조)이다. 종종, 배경 프로브 신호를 제거하기 위해 고엄격도 세척이 낮은 엄격도 세척에 앞선다. 예를 들어, 100개 초과의 뉴클레오티드의 이중체에 대한 중간 엄격도 세척의 예는 45℃에서 15분 동안 1XSSC이다. 예를 들어, 100개 초과의 뉴클레오티드의 이중체에 대한 낮은 엄격도 세척의 예는 40℃에서 15분 동안 4 내지 6XSSC이다. 짧은 프로브 (예를 들어, 약 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해, 엄격한 조건은 대개 약 1.5 M 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 다른 염)의 염 농도를 pH 7.0 내지 8.3에서 포함하고, 온도는 대개 적어도 약 30℃ 및 긴 프로브 (예를 들어, >50개의 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성할 수 있다. 일반적으로, 특정 혼성화 분석에서 비관련 프로브에 대해 관찰된 것보다 2X (또는 더 높은) 신호 대 노이즈 (noise) 비는 특이적인 혼성화의 검출을 나타낸다. 엄격한 조건 하에 서로에 혼성화하지 않는 핵산은 그들이 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하면 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들어, 핵산의 카피가 유전자 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 다의성을 사용하여 생성될 때 발생할 수 있다.

매우 엄격한 조건은 특정 프로브에 대한 T_m에 동일하도록 선택된다. 서던 또는 노던 블롯에서 필터 상에서 100개 초과의 상보성 잔기를 갖는 상보성 핵산의 혼성화를 위한 엄격한 조건의 예는 50% 포름아미드, 예를 들어, 50% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS 내에서 37℃에서 혼성화, 및 0.1XSSC 내에서 60 내지 65℃에서 세척이다. 예시적인 낮은 엄격도 조건은 30 내지 35% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS (나트륨 도데실 술페이트)의 버퍼 용액을 사용한 37℃에서 혼성화, 및 1X 내지 2XSSC (20XSSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산삼나트륨) 내에서 50 내지 55℃에서 세척이다. 예시적인 중등도의 엄격도 조건은 40 내지 45% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 1% SDS 내에서 37℃에서 혼성화, 및 0.5X 내지 1XSSC 내에서 55 내지 60℃에서 세척을 포함한다.

다음은 본 발명의 참조 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 동일한 오르토로그 뉴클레오티드 서열을 클로닝하기 위해 사용할 수 있는 혼성화/세척 조건의 세트의 예이다: 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 2XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서 참조 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다.

"DNA 셔플링"은 DNA 분자 내에 돌연변이 또는 재배열을 바람직하게는 무작위로 도입하거나, 2개 이상의 DNA 분자 사이에 DNA 서열의 교환을 바람직하게는 무작위로 생성하는 방법이다. DNA 셔플링에서 생성되는 DNA 분자는 적어도 하나의 주형 DNA 분자로부터 유도되는 비-자연 발생하는 DNA 분자인 셔플링된 DNA 분자이다. 셔플링된 DNA는 바람직하게는 주형 DNA에 의해 코딩된 폴리펩티드에 관하여 변형된 변이체 폴리펩티드를 코딩하고, 주형 DNA에 의해 코딩된 폴리펩티드에 관하여 변경된 생물학적 활성을 가질 수 있다.

"재조합 DNA 분자"는 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 설명된 바와 같이 DNA 서열을 함께 연결시키기 위해 사용된 재조합 DNA 기술 및 절차를 이용하여 함께 연결되는 DNA 서열의 조합물이다.

본 발명은 외떡잎 식물에서 사용하기에 특히 유용하다. 용어 "외떡잎 식물"은 이수체 (aneuploid), 다배체, 2배체, 반수체 및 반접합체를 포함한 다양한 배수성 수준의 식물을 포함한다. 또한 성숙 식물, 종자, 싹 및 묘목, 및 그로부터 유도된 일부, 증식 물질 (예를 들어 종자 및 과실) 및 배양액, 예를 들어 세포 배양액이 또한 포함된다. 1년생 및 다년생 외떡잎 식물이 트랜스제닉 식물의 생성을 위한 바람직한 숙주 유기체이다.

또한, 본 발명은 성숙 식물, 종자, 싹 및 묘목, 및 그로부터 유도된 일부, 증식 물질 및 배양액, 예를 들어, 세포 배양액을 포함한다. 성숙 식물은 묘목의 단계를 넘어선 임의의 발달 단계의 식물을 나타낸다. 용어 묘목은 초기 발달 단계에서 어린 미성숙 식물을 나타내고, 이때에는 종자 내에 (예를 들어 배유, 외배유 또는 떡잎 내에) 저장된 동화물에 여전히 의존적이다. 대나무아과 (Bambusoideae)의 모든 속 (예를 들어, 대나무속), 쇠풀족 (Andropogonoideae) (예를 들어, 개사탕수수속 (Saccharum), 수수속 (Sorghum), 또는 옥수수속 (Zea)), 물대족 (Arundineae) (예를 들어, 갈대속 (Phragmites)), 벼아과 (Oryzoideae) (예를 들어, 벼속), 기장아과 (Panicoideae) (예를 들어, 기장속 (Panicum), 수크령속 (Pennisetum) 및 강아지풀속 (Setaria)), 포아풀아과 (Pooideae) (페스투시아데아에 (Festuciadeae)) (예를 들어, 포아풀속 (Poa), 김의털속 (Festuca), 호밀풀속 (Lolium), 잠자리피속 (Trisetum), 겨이삭속 (Agrostis), 산조아재비속 (Phleum), 오리새속 (Dactylis), 뚝새풀속 (Alopecurus), 귀리속 (Avena), 밀속 (Triticum), 호밀속 (Secale) 및 보리속 (Hordeum))이 포함된다. 아베나 사티바 (Avena sativa) (귀리), 밤부사 (Bambusa) 종 및 밤부사 밤보스 (Bambusa bambos) (대나무), 사카룸 오피시나룸 (Saccharum officinarum) (사탕수수), 트리티쿰 디코쿰 (Triticum dicoccum) (에머 (Emmer) 밀), 트리티쿰 모노코쿰 (Triticum monococcum) (외알 (Einkorn) 밀), 트리티쿰 스펠타 (Triticum spelta) (스펠트밀), 트리티쿰 두룸 (Triticum durum) (밀), 트리티쿰 터기둠 (Triticum turgidum), 트리티쿰 애스티붐 (Triticum aestivum) (밀), 제아 메이즈 (Zea mays) (옥수수), 파니쿰 밀리아세움 (Panicum miliaceum) (일반 기장), 페니세텀 티포이데스 (Pennisetum thiphoides) (벌러시 (Bulrush) 기장), 호르데움 불가레 (Hordeum vulgare) 또는 에이치. 사티붐 (H. sativum) (보리), 오리자 사티바 (벼), 지자니아 아쿠아티카 (Zizania aquatica) (야생벼), 세칼레 세레알레 (Secale cereale) (호밀), 소르검 비콜라 (Sorghum bicolor) (에스. 불가레 (S. vulgare)) (사탕수수)이 바람직하다. 밀 (트리티쿰 종), 벼 (오리자 종), 보리 (호르데움 종), 귀리 (아베나 종), 호밀 (세칼레 종), 옥수수 (제아 메이즈), 사탕수수 및 기장 (페니세툼 종)이 더 바람직하다. 특히 트리티쿰과 (겨울밀과 봄밀 모두 포함), 보다 특히 트리티쿰 종: 일반 밀 (티. 애스티붐), 두룸밀 (티. 두룸), 스펠트밀 (티. 스펠타), 트리티쿰 디코쿰 (에머 밀), 트리티쿰 터기둠 및 트리티쿰 모노코쿰 (외알밀)의 모든 밀 종이 바람직하고, 티. 애스티붐이 특히 바람직하다. 본 발명의 방법은 봄밀, 예를 들어, 밥화이트 (Bobwhite), 마샬 (Marshall), PIVOT1, UC702 및 페인와와 (Panewawa)로부터 및 겨울밀, 예를 들어, HY368, 니일리 (Neeley), FL302, RH91, R332, R1269 및 R585로부터 트랜스제닉 식물을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 다른 적합한 밀 유전자형은 예코라 로조 (Yecora Rojo), 칼 (Karl) 및 안자 (Anza)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 그러나, 본 발명은 특정 변종에 제한되지 않고, 고도로 유전자형-독립적임을 유의해야 한다.

단어 "식물"은 임의의 식물, 특히 농경학상 유용한 식물 (예를 들어, 종자 식물)을 나타내고, "식물 세포"는 식물의 구조적 및 생리학적 단위이고, 이는 세포벽을 포함하지만 또한 원형질체를 나타낼 수도 있다. 식물 세포는 단리된 단일 세포 또는 배양된 세포의 형태로, 또는 보다 고도로 조직화된 단위, 예를 들어, 식물 조직, 또는 식물의 발달 임의의 단계에 존재하는 구조체로 분화된 식물 기관의 일부로서 존재할 수 있다. 그러한 구조체는 과실, 싹, 줄기, 잎, 꽃잎 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 식물 기관을 포함한다. 바람직하게는, 용어 "식물"은 전체 식물, 싹 영양 기관/구조 (예를 들어 잎, 줄기 및 괴경 (tuber)), 뿌리, 꽃 및 꽃 기관/구조 (예를 들어 포엽, 꽃받침 조각, 꽃잎, 수술, 암술잎, 꽃밥 및 배주), 종자 (배, 배유 및 종피 포함) 및 과실 (성숙 씨방), 식물 조직 (예를 들어 관 조직, 기본 조직 등) 및 세포 (예를 들어 공변 (guard) 세포, 난세포, 모용 (trichome) 등), 및 그의 자손체를 포함한다.

"유의한 증가"는 측정 기술에 고유한 오차 한계보다 더 큰 증가, 바람직하게는 약 2배 이상의 증가이다.

"유의하게 더 적은"은 측정 기술에 고유한 오차 한계보다 더 큰 감소, 바람직하게는 약 2배 이상의 감소를 의미한다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 하나의 제1 실시태양은

a) i) 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드;

ii) 서열 1의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 또는 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드; 및

iii) 2xSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 가장 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군 중에서 선택된 제1 핵산 분자, 및 이에 작동가능하게 연결된

b) i) 서열 3에 정의된 폴리뉴클레오티드;

ii) 서열 3의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 또는 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드; 및

iii) 2xSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 가장 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 3에 제시된 서열의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군 중에서 선택된 제2 핵산 분자, 및

이들에 작동가능하게 연결된, 전사 조절 서열의 제1 또는 제2 핵산 서열에 대하여 이종성이고 식물에 증가된 수확량 및/또는 증가된 스트레스 내성 및/또는 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질 및/또는 오일 함량을 부여하기에 적합할 수 있는 적어도 하나의 핵산

을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 식물 또는 식물 세포에 관한 것이다.

바람직하게는, 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 상기 이종성 DNA가 발아하는 배에서 우세하게 발현되도록 한다. 상기 발현 프로필은 다음 용도에 특히 유용하다:

i) 스트레스 인자에 대한 향상된 저항성: 선행 기술 섹션에서 상기한 바와 같이, 배는 모든 종류의 생물적 및 비생물적 스트레스 인자 (가뭄, 저온, 질병 등)에 대해 고도로 감수성이다. 이들 스트레스 인자는 수확량 및 작물 품질에 대해 즉각적인 효과를 갖는다. 당업계에 공지된 대부분의 프로모터는 상기 단계 동안 발현 능력이 없거나 적다. 본원에 개시된 전사 조절 특이성은 스트레스-저항성 유전자를 "요구시 (on-demand)"에, 즉 적시에 높은 수준으로 발현시키기 위해 특히 유용하다. 또한, 전분질 배유 내에서의 특이성 때문에, 스트레스-저항성의 새로운 방식을 추구하는 것이 가능하다. 전분질 배유는 배에 영향을 주는 조직이기 때문에, 영양분을 사용한 배에 대한 개선된 보충을 통해 스트레스-저항성을 증가시킬 수 있다.

ii) 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질: 키메라 전사 조절 핵산 서열의 발현 프로필은 종자 (종실) 성분의 전환을 허용하거나, 종자 내의 성분의 분포를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 탄수화물 (전분)을 오일 또는 다른 고가치 성분 (예를 들어, 비타민)으로 전환시킬 수 있거나, 성분의 위치를 배유로부터 배로 이동시켜, 새싹에 개선된 영양 가치를 제공할 수 있다.

iii) 증가된 수확량: 증가된 수확량은 부분적으로 스트레스 저항성 (상기 i) 아래를 참조한다)에 관련된다. 그러나, 키메라 전사 조절 핵산 서열의 발현 프로필은 스트레스 인자 없이도 묘목의 성장이 직접 영향을 미칠 배의 성장을 최적화함으로써 수확량을 증가시킨다. 또한, 경작지 조건 및 다른 형질 하에 보다 조기 발아를 달성할 수 있고, 이는 보다 많거나 보다 조기 수확을 일으킬 것이다.

iv) 표적화된 서열 절제. 상기 설명된 바와 같이, 서열, 특히 마커 서열의 균일한 절제는 생물공학의 분야에서 아직 해결되지 않은 문제이다. 대부분의 식물은 성공적인 절제의 영역 및 절제가 없는 영역이 있는 모자이크-유사 절제 패턴을 나타낸다. 균일한 또는 실질적으로 균일한 절제를 달성하기 위해, 절제 메카니즘은 바람직하게는 유기체가 많은 식물로 이루어지지 않을 때인 발달의 초기 단계에서 활성화될 필요가 있다. 추가로, 활성화 (즉, 절제 매개 효소의 발현)은 강할 필요가 있다. 두 요건은 본원에 개시된 키메라 전사 조절 핵산 서열의 발현 프로필에 의해 충족된다. 초기 배 발아에서 강한 전사 활성은 상기 단계에서 효율적인 마커 절제를 허용하고, 그로부터 표적 서열 없는 (예를 들어, 마커가 없는) 식물이 생성된다.

본 발명의 문맥에서 "발아하는 배-특이적 전사"는 발아하는 식물, 바람직하게는 발아하는 배에서 핵산 서열의 전사가 특정된 발달 단계 동안 전체 식물, 종자 또는 새싹에서 상기 핵산 서열로부터 전사된 RNA의 전체 양의 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과, 보다 바람직하게는 99% 초과에 기여하는 방식으로, 전사 조절 요소에 의한 핵산 서열의 전사를 의미한다.

1. 키메라 전사 조절 핵산 서열

대부분의 일반적인 형태에서, 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는

i) a) 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드;

b) 서열 1의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 또는 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드; 및

c) 2xSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 가장 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군 중에서 선택된 제1 핵산 분자, 및

ii) a) 서열 3에 정의된 폴리뉴클레오티드;

b) 서열 3의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 또는 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드; 및

c) 2xSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 가장 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 3에 제시된 서열의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군 중에서 선택된 제2 핵산 분자

를 포함하고, 여기서 상기 제1 핵산 서열 및 상기 제2 핵산 서열은 서로 기능적으로 연결되고 이종성이다.

용어 "유도된"은 프로모터, 전사 조절 핵산 서열, 또는 상류 활성화 서열과 같은 DNA 구역의 문맥에서 사용될 때 "유도된" DNA 구역이 자연 발생하는 DNA 구역 또는 다른 공급원 DNA 구역으로부터 얻어지거나 그에 기반하는 상황을 나타낸다. "유도된" DNA 구역은 대체로 인공적인 돌연변이를 통해 자연 발생하는 DNA 구역 또는 다른 공급원 DNA 구역과 상이할 수 있다.

1.1 본 발명의 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열 및 그의 기능적 요소의 유도체 및 변이체

본원에 개시된 본 발명은 본원에 개시된 특이적 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열 및 그들의 특이적 요소에 추가로, 상기 서열의 유도체 및 변이체가 사용될 수 있음을 고려한다.

특이적 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열 및 그들의 특이적인 요소의 유도체는 서열의 결실, 단일 또는 다수 점 돌연변이, 특정 제한 효소 부위에서 변경, 기능적 요소의 부가, 또는 분자 변형의 다른 수단을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 상기 변형은 상기 서열의 전사 조절 활성을 향상시키거나 달리 변경시킬 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.

예를 들어, 당업자는 기능적 요소를 서열 내에 한계짓고, 임의의 비-필수 요소를 결실시킬 수 있다. 기능적 요소는 임의의 특정 용도를 위해 본 발명의 서열의 효용 또는 발현을 증가시키기 위해 변형되거나 조합될 수 있다. 본 발명의 전사 조절 뉴클레오티드 서열의 기능적으로 동등한 단편은 필수 서열을 결실시키지 않으면서 비-필수 서열을 제거하거나 결실시킴으로써 또한 얻어질 수 있다. 전사 조절 뉴클레오티드 서열을 그의 필수 전사 매개 요소로 한정하는 것은 시험관 내에서 시행착오 (trial-and-error) 결실 돌연변이에 의해, 또는 컴퓨터에서 (in silico) 프로모터 성분 탐색 루틴 (routine)을 사용하여 실현될 수 있다. 프로모터 활성에 필수적인 구역은 종종 공지의 특정 프로모터 성분의 클러스터 (cluster)를 나타낸다. 그러한 분석은 이용가능한 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 PLACE ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements"; Higo 1999), BIOBASE 데이타베이스 "Transfac" (바이올로지쉬 다텐방켄 게엠베하 (Biologische Datenbanken GmbH, 독일 브라운슈바이크); Wingender 2001) 또는 데이타베이스 PlantCARE (Lescot 2002)를 사용하여 수행할 수 있다. mRNA의 5'-비번역 구역을 코딩하는 구역을 결실시켜, (전사되지 않는) 프로모터 구역만을 제공함으로써 얻어지는 전사 조절 뉴클레오티드 서열의 동등한 단편이 특히 바람직하다. 5'-비번역 구역은 당업계에 공지된 방법 (예를 들어 5'-RACE 분석)에 의해 쉽게 결정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 전사 조절 뉴클레오티드 서열의 일부는 다른 서열의 동등한 단편이다.

상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프로모터의 결실 돌연변이체를 무작위로 제조한 후 분석할 수 있다. 상기 방법을 사용하여, 각각 클론 (서브클론)의 상이한 부분을 함유하는 일련의 구성체를 제조한 후, 이들 구성체를 활성에 대해 스크리닝한다. 활성에 대해 스크리닝하기 위한 적합한 수단은 결실된 세그먼트를 함유하는 결실된 프로모터 구성체를 선택가능하거나 스크리닝가능한 마커에 부착하고, 마커 유전자를 발현하는 세포만을 단리하는 것이다. 상기 방식으로, 목적하는 또는 심지어 향상된 활성을 여전히 보유하는 많은 상이한 결실된 프로모터 구성체가 확인된다. 그에 의해, 선택된 구성체의 비교를 통해 활성에 요구되는 최소 세그먼트가 확인된다. 이어서, 상기 세그먼트는 외인성 유전자의 발현을 위한 벡터의 제조에 사용될 수 있다.

임의의 프로모터 서열을 코딩하는 DNA 세그먼트를 돌연변이유발시키거나 결실을 생성시키기 위한 수단은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 그 전문이 본원에 참고로 포함된 US 6,583,338에 개시되어 있다. 본 발명의 특정 변이체 뉴클레오티드 서열은 생물학적 활성을 보유한다 (즉, 상기 규정된 바와 같은 프로필로 전사를 조절한다). 조절 서열 변이체의 일례는 보다 큰 프로모터로부터 하나 이상의 결실에 의해 형성된 프로모터이다. 전사 시작 부위 부근의 TATA 박스까지의 프로모터의 5' 부분은 문헌 [Zhu et al., (1995) The Plant Cell 7:1681-1689]에 설명된 바와 같이 때때로 프로모터 활성을 제거하지 않으면서 결실될 수 있다. DNA 서열의 일부를 제거하기 위한 통상적인 방법은 엑소뉴클레아제를 DNA 증폭과 조합하여 사용하여, 이중가닥 DNA 클론의 단일방향 네스팅된 (nested) 결실을 생성하는 것이다. 상기 목적을 위한 시판 키트는 상표 Exo-Size™ (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 베벌리)) 하에 시판된다. 생물학적 활성 변이체는 또한 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 본 발명의 천연 프로모터 서열을 포함한다.

또한, 유도체 및 변이체는 비제한적으로 세균, 진균 및 식물과 같은 다른 종으로부터의 상동체, 파라로그 (paralog) 및 오르토로그를 포함한다. "상동체"는 참조 서열에 대한 고도의 서열 관련성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 나타내도록 당업계에서 사용되는 일반적인 용어이다. 상기 관련성은 상기 규정된 바와 같이 2개의 서열 사이의 동일성 및/또는 유사성의 정도를 결정함으로써 정량할 수 있다. 용어 "오르토로그" 및 "파라로그"가 상기 일반 용어 내에 포함된다. "파라로그"는 기능적으로 유사한 동일한 종 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 나타낸다. "오르토로그"는 다른 종 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 기능적 동등물인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 오르토로그 유전자는 바람직하게는 오르토로그 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 보다 구체적으로, 용어 "오르토로그"는 상이한 종으로부터의 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적 상대물인 하나의 종으로부터 얻은 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 오르토로그들 사이의 서열 차이는 종분화의 결과이다.

바람직하게는, 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열의 변이체 또는 유도체의 전사 조절 활성은 본원에 구체적으로 개시된 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열에 대한 것과 실질적으로 동일하고 (또는 동등하고), 즉, 발현은 상기 설명된 바와 같이 발아하는 배-특이적 방식으로 조절된다. 이에 추가로, 유도체 또는 변이체의 전사 조절 활성은 특히 발현 수준에 관하여 그의 모 서열의 활성으로부터 변할 수 있다. 발현 수준은 모 서열의 발현 수준보다 더 높거나 더 낮을 수 있다. 두 유도가 모두 발현시킬 목적하는 핵산 서열에 따라 유리할 수 있다. 그의 모 서열에 비해, 상기 모 서열의 발현 수준으로부터 50%, 바람직하게는 25%, 보다 바람직하게는 10% 초과 (바람직하게는 mRNA 발현 또는 단백질 (예를 들어, 리포터 유전자) 발현에 의해 판단될 바와 같이)로 유래하지 않는 그러한 기능적 동등물 서열이 바람직하다. 그의 모 서열에 비해 증가된 발현, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 100%, 가장 바람직하게는 적어도 500% 증가를 나타내는 동등한 서열이 더욱 바람직하다. 그러한 발현 프로필은 바람직하게는 상기 전사 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 사용하여 입증된다. 본 문맥에서 바람직한 리포터 유전자 (Schenborn 1999)는 초록 형광 단백질 (GFP) (Chui 1996; Leffel 1997), 클로람페니콜 트랜스퍼라제, 루시퍼라제 (Millar 1992), β-글루쿠로니다제 또는 υ-갈락토시다제이다. β-글루쿠로니다제가 특히 바람직하다 (Jefferson 1987). 전사 조절을 분석하기 위한 다른 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 노던 블롯 및 RT-PCR을 포함한다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌] 참조).

하나의 바람직한 실시태양에서, 전사 조절 뉴클레오티드 서열은

i) 서열 1에 제시된 서열;

ii) 서열 1에 제시된 서열의 적어도 50개의 연속적 염기, 바람직하게는 적어도 100개의 연속적 염기, 보다 바람직하게는 200개의 연속적 염기의 단편,

iii) 서열 1에 제시된 서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70% 또는 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열,

iv) (바람직하게는 상기 정의 부분에 정의된 바와 같은 낮은 엄격도 조건 하에, 보다 바람직하게는 중간 엄격도 조건 하에, 가장 바람직하게는 고엄격도 조건 하에; 예를 들어 2XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에) 서열 1에 제시된 서열, 또는 그의 상보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열;

v) (바람직하게는 상기 정의 섹션에 정의된 바와 같은 낮은 엄격도 조건 하에, 보다 바람직하게는 중간 엄격도 조건 하에, 가장 바람직하게는 고엄격도 조건 하에; 예를 들어 2XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에) 서열 1에 제시된 서열의 50 내지 200개 이상의 연속적 뉴클레오티드 (예를 들어 50 또는 100개, 바람직하게는 150 또는 200개, 보다 바람직하게는 250 또는 400개의 연속적 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 전체 서열), 또는 그의 상보체를 포함하는 핵산에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열;

vi) 항목 i) 내지 v) 하에 언급된 임의의 뉴클레오티드 서열의 상보체 또는 역상보체 (reverse complement)인 뉴클레오티드 서열

로 이루어지는 군 중에서 선택된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자에 의해 설명된다.

다른 바람직한 실시태양에서, 상류 활성화 서열은

i) 서열 3에 제시된 서열,

ii) 서열 3에 제시된 서열의 적어도 50개의 연속적 염기, 바람직하게는 적어도 100개의 연속적 염기, 보다 바람직하게는 200개의 연속적 염기의 단편,

iii) 서열 3에 제시된 서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70% 또는 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열,

iv) (바람직하게는 상기 정의 섹션에 규정된 바와 같은 낮은 엄격도 조건 하에, 보다 바람직하게는 중간 엄격도 조건 하에, 가장 바람직하게는 고엄격도 조건 하에; 예를 들어 2XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에) 서열 3에 제시된 서열, 또는 그의 상보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열;

v) (바람직하게는 상기 정의 섹션에 규정된 바와 같은 낮은 엄격도 조건 하에, 보다 바람직하게는 중간 엄격도 조건 하에, 가장 바람직하게는 고엄격도 조건 하에; 예를 들어 2XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에) 서열 3에 제시된 서열의 50 내지 200개 이상의 연속적 뉴클레오티드 (예를 들어 50 또는 100개, 바람직하게는 150 또는 200개, 보다 바람직하게는 250 또는 400개의 연속적 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 전체 서열), 또는 그의 상보체를 포함하는 핵산에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열;

vi) 항목 i) 내지 v) 하에 언급된 임의의 뉴클레오티드 서열의 상보체 또는 역상보체인 뉴클레오티드 서열

로 이루어지는 군 중에서 선택된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자에 의해 설명된다.

상기 정의된 임의의 특정된 키메라 전사 조절 서열의 항목 ii), iii), iv), v) 및 vi) 하에 특정된 서열은 바람직하게는 외떡잎 식물 세포 또는 유기체 내에서 전사를 변형시킬 수 있고, 보다 바람직하게는 이들은 배 특이적 발현을 유도할 수 있다. 바람직하게는, 항목 iv) 또는 v) 하에 특정된 서열은 엄격한 조건 하에 특정된 표적 서열과 혼성화된다.

바람직하게는, 뉴클레오티드 서열 동일성은 그의 디폴트 파라미터 (11의 단어길이 (W), 10의 기대값 (E), 100의 컷오프, M=5, N=-4, 및 두 스트랜드의 비교)를 갖는 BlastN 프로그램 (버전 1.4.7 또는 나중의 버전) 또는 임의의 동등한 프로그램을 사용하여 결정된다.

혼성화 기술에서, 공지의 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부는 선택된 유기체로부터의 클로닝된 게놈 DNA 단편 또는 cDNA 단편 (즉, 게놈 또는 cDNA 라이브러리)의 집단 내에 존재하는 다른 상응하는 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화하는 프로브로서 사용된다. 혼성화 프로브는 게놈 DNA 단편, cDNA 단편, RNA 단편, 또는 다른 올리고뉴클레오티드일 수 있고, ³²P와 같은 검출가능한 기 또는 임의의 다른 검출가능한 마커로 표지될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 혼성화를 위한 프로브는 본 발명의 서열에 기초하여 합성 올리고뉴클레오티드를 표지함으로써 제조할 수 있다. 혼성화 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 제작을 위한 프로브의 제조 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있고, 문헌 [Sambrook et al. (1989)]에 개시되어 있다. 일반적으로, 본원에 개시된 서열에 혼성화하는 서열은 개시된 서열과 적어도 약 60% 내지 70%, 심지어 약 80% 85%, 90%, 95% 내지 98% 또는 그보다 높은 동일성을 가질 것이다. 즉, 서열의 서열 유사성은 적어도 약 60% 내지 70%, 심지어 약 80%, 85%, 90%, 95% 내지 98% 서열 유사성일 수 있다.

표 8 및 9에 제시된 바와 같이, 본 발명의 전형적인 코어 프로모터 모티프는 프로모터 모티프의 5' 및 3' 단부 모두에서 임의의 뉴클레오티드의 스트링 (string)에 의해 플랭킹된 4개의 잘 정의된 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, GAPB/GAP.01 프로모터 모티프는 서열 26에 정의된 15개 뉴클레오티드 "aaaaATGAatagaaa"를 포함하고, 여기서 "nnnnATGAnnnnnnn"은 서열 27에 제시된 바와 같은 코어 GAPB/GAP.01 프로모터 모티프이다 (여기서 n은 a, c, t 및 g로 이루어지는 군 중에서 선택된다). 코어 프로모터 모티프의 5' 단부 또는 3' 단부에서 n의 수는 각각 5' 또는 3' 단부에서 상응하는 프로모터 모티프 내의 코어 프로모터 모티프를 플랭킹하는 뉴클레오티드의 수에 상응한다. 상응하는 프로모터 모티프에 대한 코어 프로모터 모티프의 동일성 %은 예를 들어 아래에 예시된 바와 같이 계산된다. 서열 26의 코어 GAPB/GAP.01 프로모터 모티프 내의 2개의 "n"이 서열 27의 GAPB/GAP.01 프로모터 모티프의 상응하는 위치에서 뉴클레오티드에 동일할 때, 예를 들어, n(2)=a 및 n(4)=a일 때, 동일성 %는 동일한 뉴클레오티드 (4개의 코어 뉴클레오티드 포함)의 총수를 프로모터 모티프의 전체 길이로 나누어 결정되고, 즉, 6/15 = 40%이다. 서열 26의 코어 GAPB/GAP.01 프로모터 모티프 내의 5개의 "n"이 서열 27의 GAPB/GAP.01 프로모터 모티프의 상응하는 위치에서 뉴클레오티드에 동일할 때, 예를 들어, n(1)=a, n(3)=a, n(10)=t, n(12)=g 및 n(14)=a일 때, 동일성 %는 9/15 = 60%이다.

Ar.cor78에서 확인된 프로모터 모티프 및 코어 프로모터 모티프를 표 8과 표 9에 제시한다. 보다 구체적으로, 서열 10, 12, 14, 17, 20, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 53, 55, 57, 59, 63, 66, 68, 70, 72, 74, 77, 79, 82, 84, 86, 88, 90, 94, 96, 98, 102, 104, 108, 112, 114, 117, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 137 및 138은 At.cor78 프로모터에서 확인된 코어 프로모터 모티프이다. 서열 9, 11, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 60, 61, 62, 64, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 80, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 95, 97, 99, 100, 101, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 118, 119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 133, 134, 135 및 136은 At.sor78 프로모터에서 확인된 프로모터 모티프이다. 아라비돕시스 cor78 프로모터 (서열 1)은 예를 들어 문헌 ([Horvath 1993], [Gilmour et al. 1991]; [Nordin et al. 1991])에 기재되어 있다. 일부 경우에, 하나의 코어 프로모터 모티프는 표 9에 제시된 바와 같이 상이한 플랭킹 5' 및 3' 뉴클레오티드를 갖는 At.cor78의 상이한 위치에 위치하는 프로모터 모티프에 상응한다.

본 발명은 추가로 서열 10, 12, 14, 17, 20, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 53, 55, 57, 59, 63, 66, 68, 70, 72, 74, 77, 79, 82, 84, 86, 88, 90, 94, 96, 98, 102, 104, 108, 112, 114, 117, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 137 및 138에 정의된 서열로 이루어지는 군 중에서 선택된 적어도 2개의 코어 프로모터 모티프를 포함하는 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 서열 10, 12, 14, 17, 20, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 53, 55, 57, 59, 63, 66, 68, 70, 72, 74, 77, 79, 82, 84, 86, 88, 90, 94, 96, 98, 102, 104, 108, 112, 114, 117, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 137 및 138의 코어 프로모터 모티프는 각각 서열 9, (11, 18), 13, (15, 16), 19, (21, 23, 61, 92), (24, 75), (26, 40), 28, 30, (32, 51, 80, 105, 109), 34, 36, 38, 41, (43, 64, 132), 45, 47, 49, 52, (54, 99), (56, 119), (58, 60), 62, 65, 67, 69, 71, 73, 76, 78, 81, 83, 85, (87, 100, 106, 110), (89, 91), 93, 95, 97, 101, 103, 107, 111, (113, 115), (116, 118), 120, 122, 124, 126, 128, (130, 134, 135), 136 및 133에 30-40%, 바람직하게는 40-50%, 보다 바람직하게는 50-60% 또는 그보다 큰 비율로 동일하다. 보다 바람직하게는, 서열 10, 12, 14, 16, 19, 22, 24, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 44, 46, 48, 50, 52, 55, 57, 59, 61, 65, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 81, 84, 86, 88, 90, 92, 96, 98, 100, 104, 106, 110, 114, 116, 119, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 139 및 140의 코어 프로모터 모티프는 각각 서열 9, (11, 18), 13, (15, 16), 19, (21, 23, 61, 92), (24, 75), (26, 40), 28, 30, (32, 51, 80, 105, 109), 34, 36, 38, 41, (43, 64, 132), 45, 47, 49, 52, (54, 99), (56, 119), (58, 60), 62, 65, 67, 69, 71, 73, 76, 78, 81, 83, 85, (87, 100, 106, 110), (89, 91), 93, 95, 97, 101, 103, 107, 111, (113, 115), (116, 118), 120, 122, 124, 126, 128, (130, 134, 135), 136 및 133에 60-70%, 바람직하게는 70-80%, 보다 바람직하게는 80-90% 또는 그보다 큰 비율로 동일하다. 가장 바람직하게는, 서열 10, 12, 14, 16, 19, 22, 24, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 44, 46, 48, 50, 52, 55, 57, 59, 61, 65, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 81, 84, 86, 88, 90, 92, 96, 98, 100, 104, 106, 110, 114, 116, 119, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 139 및 140의 코어 프로모터 모티프는 각각 서열 9, (11, 18), 13, (15, 16), 19, (21, 23, 61, 92), (24, 75), (26, 40), 28, 30, (32, 51, 80, 105, 109), 34, 36, 38, 41, (43, 64, 132), 45, 47, 49, 52, (54, 99), (56, 119), (58, 60), 62, 65, 67, 69, 71, 73, 76, 78, 81, 83, 85, (87, 100, 106, 110), (89, 91), 93, 95, 97, 101, 103, 107, 111, (113, 115), (116, 118), 120, 122, 124, 126, 128, (130, 134, 135), 136 및 133에 90-95%, 바람직하게는 95-99% 동일하다.

1.2 본 발명의 발현 카세트 및 벡터에 대한 추가의 조절 및 기능적 요소

본 발명의 발현 카세트는 추가의 조절 요소를 포함할 수 있다. 본 문맥에서 상기 용어는 발현 카세트의 제조 또는 기능에 영향을 줄 수 있는 모든 서열을 포함하는 넓은 의미로 이해되어야 한다. 조절 요소는 예를 들어 원핵생물 또는 진핵생물 유기체에서 전사 및/또는 번역을 변형시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 발현 카세트는 각각 발현시킬 핵산 서열 (또는 전사 조절 뉴클레오티드 서열)에 작동가능하게 연결된 전사 조절 서열 및 임의로 추가의 조절 요소를 포함하였다.

본 발명에서 사용하기 위한 다양한 5' 및 3' 전사 조절 서열은 이용가능하다. 전사 터미네이터 (terminator)는 전사의 종료 및 정확한 mRNA 폴리아데닐화를 책임진다. 3'의 비번역 조절 DNA 서열은 바람직하게는 약 50 내지 약 1,000개, 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 1,000개의 뉴클레오티드 염기쌍을 포함하고, 식물 전사 빛 번역 종료 서열을 함유한다. 적절한 전사 터미네이터 및 식물에서 기능하는 것으로 알려진 것은 CaMV 35S 터미네이터, tml 터미네이터, 노팔린 합성효소 터미네이터, 완두 rbcS E9 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인 합성효소 유전자로부터의 T7 전사체에 대한 터미네이터, 및 감자 또는 토마토로부터의 프로테아제 억제제 I 또는 II 유전자의 3' 단부를 포함하지만, 당업자에게 공지된 다른 3' 요소도 사용될 수 있다. 별법으로, 율무속 (Coix)으로부터의 감마 코익신, 올레오신 3 또는 다른 터미네이터를 또한 사용할 수 있다.

전사 개시 부위와 코딩 서열의 출발부 사이의 DNA 서열, 즉, 비번역 리더 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있으므로, 특정 리더 서열의 사용이 원해질 수 있다. 바람직한 리더 서열은 부착된 유전자의 최적 발현을 지시하도록 예측된 서열을 포함하는 것으로, 즉, 바람직한 컨센서스 리더 서열을 포함하는 것으로 고려되고, 이는 mRNA 안정성을 증가 또는 유지시키고, 번역의 부적절한 개시를 방지할 수 있다. 그러한 서열의 선택은 본 명세서에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 식물에서 고도로 발현되는 유전자로부터 유도된 서열이 가장 바람직할 것이다.

또한, 바람직한 조절 요소는 유전자의 5'-비번역 구역, 인트론 및 3'-비번역 구역을 포함한다.

트랜스제닉 식물에서 유전자 발현을 향상시키는 것으로 밝혀진 그러한 서열은 인트론 서열 (상세한 내용은 아래 참조) 및 바이러스 리더 서열 (예를 들어, TMV, MCMV 및 AMV로부터의 것; [Gallie 1987])을 포함한다. 예를 들어, 바이러스로부터 유도된 많은 비번역된 리더는 발현을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 옥수수 황색 반점 바이러스 (MCMV), 및 알팔파 모자이크 바이러스 (AMV)로부터의 리더 서열은 발현을 향상시키는데 효과적인 것으로 나타났다 (예를 들어, [Gallie 1987]; [Skuzeski 1990]). 당업계에 공지된 다른 리더는 피코르나바이러스 리더, 예를 들어, EMCV 리더 (뇌심근염 5' 비코딩 구역) (Elroy-Stein 1989); 포티바이러스 리더, 예를 들어, TEV 리더 (담배 식각 바이러스); MDMV 리더 (옥수수 왜소 모자이크 바이러스); 인간 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 (BiP) 리더 (Macejak 1991); 알팔파 모자이크 바이러스의 코트 단백질 mRNA로부터의 비번역 리더 (AMV RNA 4) (Jobling 1987); 담배 모자이크 바이러스 리더 (TMV) (Gallie 1989); 및 옥수수 황색 반점 바이러스 리더 (MCMV) (Lommel 1991)를 포함하고 이로 제한되지 않는다 (또한, 문헌 [Della-Cioppa 1987] 참조). TMV 오메가 요소 (Gallie 1989)와 같은 조절 요소가 필요한 경우에 추가로 포함될 수 있다. 인핸서의 추가의 예는 CaMV 35S 프로모터, 옥토파인 합성효소 유전자 (Ellis et al., 1987), 벼 액틴 I 유전자, 옥수수 알콜 데히드로게나제 유전자 (Callis 1987), 옥수수 쉬렁큰 (shrunken) I 유전자 (Vasil 1989), TMV 오메가 요소 (Gallie 1989)로부터의 요소 및 비-식물 진핵생물로부터의 프로모터 (예를 들어 효모; [Ma 1988])를 포함한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 벡터는 ocs 인핸서 요소를 포함하도록 제조될 수 있다. 상기 요소는 울티란의 옥토파인 합성효소 (ocs) 유전자로부터의 16 bp 회문 (palindromic) 인핸서로서 처음 확인되었고 (Ellis 1987), 적어도 10개의 다른 프로모터로 존재한다 (Bouchez 1989). 인핸서 요소, 예를 들어 ocs 요소 및 특히 요소의 다수의 카피의 사용은 식물 형질전환의 맥락에서 적용될 때 인접한 프로모터로부터의 전사 수준을 증가시키는 작용을 할 것이다.

추가의 바람직한 조절 요소는 인핸서 서열 또는 폴리아데닐화 서열이다. 바람직한 폴리아데닐화 서열은 식물 유전자 또는 아그로박테리움 T-DNA 유전자로부터 유도된 서열 (예를 들어, OCS (옥토파인 합성효소) 또는 NOS (노팔린 합성효소) 유전자의 터미네이터 서열)이다.

본 발명의 발현 카세트 (또는 그로부터 유도된 벡터, 즉, 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 벡터)는 추가의 기능적 요소를 포함할 수 있고, 넓은 의미로 발현 카세트 또는 그를 포함하는 벡터 또는 트랜스제닉 유기체의 제조, 증식 또는 기능에 영향을 끼치는 모든 요소로서 이해되어야 한다. 그러한 기능적 요소는 복제 기점 (세균에서 복제를 허용하기 위해; pBR322의 ORI 또는 P15A ori; [Sambrook 1989]), 또는 아그로박테리움 T-DNA 전달에 필요한 요소 (예를 들어 T-DNA의 좌측 및/또는 우측 경계)를 포함할 수 있다.

추가로, 발현 카세트는 제조되어, 트랜스제닉 식물의 세포 내에서 특이적 유전자 산물의 세포내 표적화에 또는 단백질을 세포외 환경으로 유도시키는데 사용될 수 있다. 이것은 일반적으로 통과 또는 신호 펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 특정 유전자의 코딩 서열에 연결함으로써 달성될 것이다. 생성되는 통과 또는 신호 펩티드는 단백질을 각각 특정 세포내 또는 세포외 목적지로 수송할 것이고, 이어서 번역 후에 제거될 것이다. 통과 또는 신호 펩티드는 세포내 막, 예를 들어, 액포 (vacuole), 소포 (vesicle), 색소체 및 미토콘드리아 막을 통한 단백질의 수송을 용이하게 함으로써 작용하는 반면, 신호 펩티드는 단백질을 세포외 막을 통해 유도시킨다. 단백질의 세포 내외의 구획 (compartment)으로의 수송을 용이하게 함으로써, 이들 서열은 단백질 가수분해에 의한 분해로부터 이들을 보호하여 유전자 산물의 축적을 증가시킬 수 있다. 이들 서열은 또한 고도로 발현되는 유전자로부터의 추가의 mRNA가 유전자의 코딩 서열에 부착되도록 허용한다. 리보좀에 의해 번역되는 mRNA는 네이키드 (naked) mRNA보다 더 안정하기 때문에, 유전자 앞에 번역가능한 mRNA가 존재하면 유전자로부터 mRNA 전사체의 전체 안정성이 증가하고, 따라서 유전자 산물의 합성이 증가할 수 있다. 통과 및 신호 서열은 대체로 초기 번역 산물로부터 번역 후에 제거되므로, 이들 서열을 사용하면 최종 폴리펩티드 상에 나타나지 않을 수 있는 별도의 번역된 서열을 부가할 수 있다. 단백질의 안정성을 향상시키기 위해 특정 단백질의 표적화가 바람직할 수 있다 (US 5,545,818).

1.3 본 발명의 키메라 전사 조절 핵산 서열, 발현 카세트 및 벡터의 조립

본 발명의 임의의 키메라 전사 조절 핵산 서열, 발현 카세트 또는 벡터에 관련하여 작동가능한 연결은 시험관내 및 생체내 절차 모두를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 임의의 키메라 전사 조절 핵산 서열, 발현 카세트 또는 벡터는 당업계에 잘 공지된 표준 재조합 및 클로닝 기술을 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어, [Maniatis 1989]; [Silhavy 1984]; [Ausubel 1987] 참조). 유전자 클로닝을 위한 많은 방안 또는 방법이 개발되고 사용되었다. 이들의 예는 제한 효소 소화 및 상호적합한 단부의 라이게이션에 의한 클로닝, PCR 산물로부터 직접적으로 T-A 클로닝, TOPO-부착된 단일방향 클로닝, 및 재조합-기반 클로닝이다. 재조합-기반 클로닝은 이용가능한 제한 효소 부위에 무관하게 다양한 유전자를 클로닝하기 위한 그의 높은 클로닝 효율 및 그의 넓은 용도로 인해 이용가능한 가장 다재다능한 클로닝 방법 중 하나이다. 재조합 클로닝에서는 람다 재조합효소 기구를 위한 재조합 서열을 함유하는 벡터 내로 유전자를 클로닝하기 위해 람다 재조합 시스템을 사용한다. 재조합 클로닝에서는 일부 경우에 회합된 단백질과 함께 핵산 분자 내의 염기의 특이적인 서열을 인식하고 이들 서열을 플랭킹하는 핵산 세그먼트를 교환하는 부위 특이적 재조합효소를 사용한다. 재조합효소 및 회합된 단백질은 "재조합 단백질"로서 총칭한다. 부위 특이적 재조합효소는 많은 유기체 (예를 들어, 바이러스 및 세균)에 존재하는 단백질이고, 엔도뉴클레아제 및 리가제 특성을 모두 갖는 것으로 특성화되었다. 많은 공지의 부위 특이적 재조합효소는 박테리오파지 람다로부터의 인테그라제/att 시스템을 포함하는 인테그라제 패밀리의 재조합효소에 속한다. 인테그라제/att 시스템의 용도의 일례는 모두 본원에 참고로 포함된 US 5,888,732 및 US 6,277,608과 미국 특허 출원 공개 2002/0007051 A1 및 국제 특허 출원 WO 02/081711 A1에 개시된 LR 클로닝 반응이다. LR 클로닝 반응은 GATEWAY™ 클로닝 기술 (인비트로겐 코퍼레이션 (Invitrogen Corporation, 미국 캘리포니아주 칼스바드)로부터 이용가능함)로서 상업적으로 이용가능하다. LR 클로닝 반응은 람다 재조합 단백질 Int, Xis, 및 이. 콜라이-코딩된 단백질 IHF를 포함하는, LR 클로나제 효소 믹스 (Clonase Enzyme mix)에 의해 촉매된다.

발현 카세트는 또한 본 발명의 키메라 전사 조절 핵산 서열을 식물 게놈 내로 삽입함으로써 조립될 수 있다. 그러한 삽입은 그 자체로 게놈 내에 이미 존재하는 목적하는 핵산 서열에 작동가능한 연결을 생성시킬 것이다. 삽입에 의해, 관심있는 핵산은 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열의 전사 조절 특성으로 인해 발아하는 배-특이적 방식으로 발현된다. 삽입은 유도되거나 우연히 발생할 수 있다. 바람직하게는, 삽입은 예를 들어 상동성 재조합에 의해 유도되고 실현된다. 상기 절차에 의해, 천연 프로모터가 본 발명의 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열에 대해 교환될 수 있어서, 내인성 유전자의 발현 프로필을 변형시킬 수 있다. 또한, 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 내인성 유전자의 안티센스 mRNA이 발현되어, 유전자 침묵을 유도하는 방식으로 삽입될 수 있다.

작동가능한 연결은 예를 들어 전사 조절 뉴클레오티드 서열이 적절한 조건 하에 관심있는 핵산 서열의 발현 과정에서 그의 기능을 충족할 수 있는 방식으로, 본 발명의 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열 (예를 들어 수퍼-프로모터 (super-promoter))과 발현시킬 핵산 서열 및 임의로 예를 들어 폴리아데닐화 또는 전사 종료 요소, 인핸서, 인트론 등과 같은 추가의 조절 요소의 순차적인 배열을 포함할 수 있다. 용어 "적절한 조건"은 바람직하게는 식물 세포 내에 발현 카세트가 존재함을 의미한다. 발현시킬 관심있는 핵산 서열이 두 서열이 공유 연결되는 방식으로 본 발명의 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열의 하류에 (즉, 3'-방향에) 놓이는 배열이 바람직하다. 임의로, 추가의 서열은 2개의 서열 중간에 삽입될 수 있다. 그러한 서열은 예를 들어 링커 또는 다수 클로닝 부위일 수 있다. 또한, 융합 단백질의 일부를 코딩하는 서열이 삽입될 수 있다 (관심있는 핵산에 의해 코딩된 단백질의 융합 단백질을 발현시키고자 의도하는 경우). 바람직하게는, 발현시킬 관심있는 핵산 서열과 본 발명의 전사 조절 뉴클레오티드 서열 사이의 거리는 200개 이하의 염기쌍, 바람직하게는 100개 이하의 염기쌍, 보다 바람직하게는 50개 이하의 염기쌍이다.

궁극적으로 본 발명에 따라 수정가능한 트랜스제닉 식물을 생산하기 위해, 수여체 외떡잎 식물 또는 식물 세포에 전달하기 위해 실질적으로 임의의 DNA 조성물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 식물 내에서 발현시킬 DNA 요소만을 함유하는 벡터 및 플라스미드 형태의 DNA 세그먼트 또는 단편, 또는 선형 DNA 세그먼트 또는 단편 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 벡터의 제조는 본 명세서에 비추어 당업자가 알 수 있을 것이다 (예를 들어, [Sambrook 1989]; [Gelvin 1990]).

본 발명은 추가로 본 발명의 발현 카세트를 함유하는, 식물 형질전환을 위해 적합한 재조합 벡터 또는 다른 DNA 구성체 (비제한적인 예를 들어 코스미드, YAC (효모 인공 염색체), BAC (세균 인공 염색체), 및 식물 인공 염색체), 및 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는, 예를 들어, 플라스미드를 포함하는 외떡잎식물 숙주 세포를 제공한다. 발현 카세트 또는 벡터는 (바람직하게는) 형질전환된 외떡잎 식물의 게놈을 증대시킬 수 있거나, 염색체 외에서 유지될 수 있다. 본 발명의 발현 카세트 또는 벡터는 식물의 세포의 핵, 엽록체, 미토콘드리아 및/또는 색소체 내에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 발현 카세트 또는 벡터는 식물 핵의 염색체 DNA 내에 포함된다. 특정 실시태양에서, 외떡잎식물 형질전환에서 복제-전능 (competent) 바이러스 벡터를 사용하기를 원할 수 있음이 고려된다. 그러한 벡터는 예를 들어, 밀 왜소 바이러스 (WDV) "셔틀" 벡터, 예를 들어 pW1-11 및 PW1-GUS (Ugaki 1991)를 포함한다. 이들 벡터는 옥수수 세포뿐만 아니라 이. 콜라이 내에서 자가 복제할 수 있고, 따라서 트랜스제닉 세포에 전달된 DNA를 검출하기 위한 증가된 감도를 제공할 수 있다. 복제하는 벡터는 또한 유전자 전위가능 (transposable) 요소, 예를 들어 Ac, Ds 또는 Mu로부터의 DNA 서열에 의해 플랭킹된 유전자의 전달을 위해 유용할 수 있다.

본 발명에 따른 DNA 구성체 및 그로부터 유래된 임의의 벡터는 추가의 기능적 요소를 포함할 수 있다. 용어 "추가의 기능적 요소"는 넓은 의미에서 이해되어야 한다. 이것은 바람직하게는 상기 DNA 구성체 또는 상기 DNA 구성체를 포함하는 벡터, 또는 상기 언급된 것을 포함하는 세포 또는 유기체의 생성, 복제, 기능, 용도 또는 가치에 영향을 주는 모든 요소를 의미한다. 이들 추가의 기능적 요소는 다음을 포함할 수 있지만 이로 제한되어서는 안 된다:

i) 예를 들어, 이. 콜라이 내에서 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 벡터의 복제를 보장하는 복제 기점. 언급할 수 있는 예는 ORI (DNA 복제 기점), pBR322 ori 또는 P15A ori이다 (Sambrook et al. 1989).

ii) 하나 이상의 핵산 서열의 삽입을 가능하게 하고 용이하게 하는 다수 클로닝 부위 (MCS).

iii) 숙주 유기체의 게놈 내로 상동성 재조합 또는 삽입을 가능하게 하는 서열.

iv) 식물 게놈 내로 전달 및 통합을 위해 식물 세포 내의 아그로박테리움-매개 전달을 가능하게 하는 요소, 예를 들어 경계 서열, 예를 들어, T-DNA 또는 vir 구역의 좌측 및/또는 우측 경계.

본원에서 형질전환을 위해 사용되는 도입된 재조합 DNA 분자는 원형 또는 선형, 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다. 일반적으로, DNA는 생성되는 식물 내에서 재조합 DNA의 발현을 촉진시키는 조절 서열에 의해 플랭킹된 코딩 구역을 또한 함유할 수 있는 키메라 DNA, 예를 들어 플라스미드 DNA의 형태로 존재한다. 일반적으로, 도입된 재조합 DNA 분자는 뉴클레오티드 분자의 크기가 증가함에 따라 증가하는 것으로 알려진 물리적, 화학적, 또는 효소적 분해에 대한 임의의 감수성을 최소화하기 위해 비교적 작고, 즉, 약 30 kb 미만일 것이다. 상기한 바와 같이, 식물 게놈 내로 도입되는 단백질, RNA 전사체 또는 그의 혼합물의 수는 바람직하게는 예비선택되고 규정되고, 예를 들어, 도입된 DNA의 1 내지 약 5-10개의 그러한 산물이 형성될 수 있다.

본 발명은 또한 외떡잎 식물 (바람직하게는 트랜스제닉 식물), 상기 식물로부터의 종자 및 일부, 및 하이브리드 및 동계교배체 (inbred)를 포함하는 상기 식물로부터의 자손체 식물을 제공한다.

본 발명은 또한 예를 들어, 타화 수정가능한 트랜스제닉 식물을 생산하기 위한 식물 육종 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 특정 발현 카세트를 포함하는 수정가능한 트랜스제닉 식물을 그 자신과 또는 제2 식물, 예를 들어, 특정 발현 카세트가 결핍되는 식물과 교배하여, 특정 발현 카세트를 포함하는 타화 수정가능한 트랜스제닉 식물의 종자를 제조하는 것을 포함한다. 이어서, 종자를 심어 타화 수정가능한 트랜스제닉 식물을 얻는다. 식물은 바람직하게는 외떡잎식물 (바람직하게는 상기 정의된)일 수 있다. 타화 수정가능한 트랜스제닉 식물은 자성 모체를 통해 또는 웅성 모체를 통해 유전되는 특정 발현 카세트를 가질 수 있다. 제2 식물은 동계교배체 식물일 수 있다. 타화 수정가능한 트랜스제닉 식물은 하이브리드일 수 있다. 임의의 이들 타화 수정가능한 트랜스제닉 식물의 종자도 또한 본 발명에 포함된다.

2. 본 발명의 발현 카세트에 의해 발현시킬 유리한 형질 또는 특성

본 발명의 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 식물의 표현형을 변형하기 위해 유용하다. 트랜스제닉 식물의 표현형의 다양한 변화가 바람직하고, 이는 본원에 개시된 전사 조절 뉴클레오티드 서열의 유리한 발현 프로필 (즉, 발아하는 배-특이적 발현)을 이용하여 달성할 수 있다. 이들 결과는 식물에서 이종성 산물의 발현 또는 내인성 산물의 증가된 발현을 제공함으로써 달성할 수 있다. 별법으로, 결과는 식물에서 하나 이상의 내인성 산물, 특히 효소 또는 보조인자의 발현의 감소를 제공함으로써 달성할 수 있다. 일반적으로, 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 식물에서 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 세그먼트, 예를 들어, 개방 판독 프레임, 또는 그의 일부, 안티센스 서열, 센스 또는 이중가닥 RNA 서열을 코딩하는 서열, 마이크로RNA 서열을 코딩하는 서열, 또는 트랜스젠을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 이들 변화는 형질전환된 식물의 표현형을 변경시킨다.

본 발명에 따른 외떡잎 식물 숙주 세포에서 발현시키기 위한 이종성 DNA의 선택은 형질전환의 목적에 따라 결정될 것이다. 작물 식물의 형질전환의 주목적 중 하나는 상업적으로 요망되거나, 농경학상 중요하거나 최종-산물 형질을 식물에 부가하는 것이다.

많은 핵산 서열이 본 발명의 키메라 전사 조절 핵산 서열에 의해 발현시키기에 적합하지만, 가장 바람직하게는 핵산은 발현 시에 외떡잎 식물에

i) 적어도 하나의 스트레스 인자에 대한 향상된 저항성,

ii) 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질,

iii) 증가된 수확량, 및

iv) 표적 서열의 절제, 예를 들어 선택 마커 서열의 절제로 이루어진 군 중에서 선택된 형질 또는 특성을 부여한다.

2.1 기본 원리

발현의 제어를 위한 2가지 원칙적인 방법, 즉, 과다발현 및 과소발현이 공지되어 있다. 과다발현은 선택된 유전자의 하나 또는 하나 초과의 별도의 카피의 삽입에 의해 달성할 수 있다. 그러나, 원래 뉴클레오티드 서열의 하나 또는 하나 초과의 별도의 카피로 형질전환된 식물 또는 그들의 자손체가 과소발현 및 과다발현의 효과를 나타내는지는 알려져 있지 않다. 과소발현을 위해, 2개의 원친적인 방법이 존재하고, 이는 당업계에서 "안티센스 하향조절" 및 "센스 하향조절"로서 일반적으로 칭해진다 (센스 하향조절은 "동시 억제"로도 언급된다). 일반적으로, 이들 과정은 "유전자 침묵"으로서 언급된다. 이들 두 방법은 모두 표적 유전자의 발현을 억제시킨다.

따라서, 키메라 전사 조절 서열 하에 핵산 서열의 발현은 mRNA의 전사 및 단백질의 발현, 또는 안티센스 RNA, 센스 RNA, dsRNA, 마이크로RNA, ta-siRNA, snRNA, RNAi의 발현, 또는 이들의 임의의 조합의 발현을 일으킬 수 있다.

본 발명의 방법에서 발현/전사되는 mRNA 또는 조절 RNA는 예를 들어 다음 서열일 수 있다:

a) 상기 설명된 바와 같은 이중가닥 RNA 핵산 서열 (dsRNA);

b) 안티센스 핵산 서열. 안티센스 핵산 서열이 5' 및 3' 비-번역된 구역을 포함하는 유전자 (즉, 프로모터 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열) 또는 유전자 전사체 (즉, RNA 서열)에 대해 지정되는 방법이 포함된다. α-아노머 (anomeric) 핵산 서열이 또한 포함된다;

c) 리보자임과 조합된 안티센스 핵산 서열;

d) 동시 억제를 유도하는 센스 핵산 서열;

e) 우성 음성 인자를 코딩하는 핵산 서열;

f) DNA-, RNA- 또는 단백질-결합 인자, 또는 유전자, RNA 또는 단백질에 대해 생성된 항체;

g) RNA의 분해를 일으키는 바이러스 핵산 서열;

h) 관심있는 유전자의 mRNA의 붕괴 또는 번역 억제를 유도하여 유전자 발현을 침묵시키기 위해 관심있는 유전자를 표적화하도록 설계된 마이크로RNA 또는 마이크로-RNA (miRNA);

i) 관심있는 유전자의 mRNA의 붕괴 (또는 아마도 번역 억제)를 유도하여 유전자 발현을 침묵시키기 위해 관심있는 유전자를 표적화하도록 설계된 ta-siRNA.

다음은 개별적인 바람직한 방법의 간략한 설명이다. 일반적으로, 본원에서, 용어 "발현"의 의미는 적절한 경우에 용어 "전사" 및/또는 "번역"의 의미를 포함할 것이다.

a) 본 발명의 방법으로 발현되는 조절 RNA는 예를 들어, 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 활성의 감소 또는 결실을 위한, 예를 들어 이중가닥 RNA 핵산 서열 (dsRNA)일 수 있다.

안티센스 폴리뉴클레오티드 및 센스 폴리뉴클레오티드에 대한 대안으로서, 이중가닥 RNA (dsRNA)는 유전자의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 용어 dsRNA는 본원에서 사용될 때 RNA의 2개의 스트랜드를 포함하는 RNA 하이브리드를 나타낸다. dsRNA는 구조가 선형 또는 원형일 수 있다. 혼성화하는 RNA는 실질적으로 또는 완전히 상보성일 수 있다. "실질적으로 상보성"은 2개의 혼성화하는 RNA가 상기 설명된 바와 같은 니들만 (Needleman) 및 분쉬 (Wunsch) 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 혼성화하는 부분이 적어도 95% 상보성인 것을 의미한다. 바람직하게는, dsRNA는 적어도 100개의 염기쌍 길이일 것이다. dsRNA를 제조하고 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 하나의 방법은 생체 내에서 2개의 상보성 DNA 스트랜드의 동시 전사를 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 5,795,715).

dsRNA는 표준 형질전환 절차에 의해 직접 식물 또는 식물 세포 내로 도입시킬 수 있다. 별법으로, dsRNA는 2개의 상보성 RNA를 전사시킴으로써 식물에서 발현시킬 수 있다.

이중가닥 RNA에 의한 유전자를 조절하는 방법 ("이중가닥 RNA 간섭"; dsRNAi)은 동물, 효모, 진균 및 식물 유기체에 대해, 예를 들어 네우로스포라 (Neurospora), 제브라피쉬 (Zebrafish), 초파리, 마우스, 플라나리아, 인간, 트리파노소마 (Trypanosoma), 페추니아 또는 아라비돕시스에 대해 광범하게 설명되었다 (예를 들어, [Matzke MA et al. (2000) Plant Mol. Biol. 43: 401-415]; [Fire A. et al. (1998) Nature 391: 806-811]; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). 또한, RNAi는 또한 예를 들어 문헌 [Tchurikov et al., J. Biol. Chem., 2000, 275 (34): 26523-26529]에 의해 이. 콜라이와 같은 세균에서 유전자의 억제를 위한 유리한 도구로서 증명된다. 파이어 (Fire) 등은 RNA 간섭에 대해 현상 RNAi로 명명하였다. 상기 참조문에 기재된 기술 및 방법은 명백하게 참조된다. 효율적인 유전자 억제는 일시적 발현의 경우에 또는 일시적 형질전환 후에, 예를 들어, 바이올리스틱 형질전환의 결과로서 또한 관찰될 수 있다 (Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903). dsRNAi 방법은 유전자 전사체의 상보성 스트랜드 및 역스트랜드의 동시 도입이 목적하는 유전자의 발현의 고도로 효과적인 억제를 야기하는 현상을 기초로 한 것이다. 생성되는 표현형은 유사한 녹아웃 (knockout) 돌연변이체와 매우 유사하다 (Waterhouse PM et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-64).

문헌 [Tuschl et al., Gens Dev., 1999, 13(24): 3191-3197]에서는 RNAi 방법의 효율이 이중체의 길이, 3'-단부 오버행 (overhang)의 길이, 및 이들 오버행 내의 서열의 함수임을 보여줄 수 있었다.

문헌 [Tuschl et al.]의 작업에 기초하고, 기본이 되는 원리는 상이한 종들 사이에서 보존되는 것을 가정하면, 당업자에게 다음 지침이 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또는 본 발명의 과정에서 바람직하게 사용되는 dsRNA 분자는 다음 원리 중 적어도 하나를 충족시킨다:

- 우수한 결과를 달성하기 위해, 사용 중인 핵산 서열의 5' 및 3' 비번역 구역 및 개시 코돈에 가까운 구역은 이들 구역이 조절 단백질 결합 부위에서 더 풍부하고, RNAi 서열과 상기 조절 단백질 사이의 상호작용은 바람직하지 않은 상호작용을 일으킬 수도 있으므로 일반적으로 피해져야 한다;

- 식물에서, 사용 중인 핵산 서열의 5' 및 3' 비번역 구역 및 개시 코돈에 가까운 구역, 바람직하게는 개시 코돈의 상류의 50 내지 100 nt는 우수한 결과를 제공하고, 따라서 피해지지 않아야 한다;

- 바람직하게는, AUG 개시 코돈으로부터 하류의 50 내지 100 nt (= 뉴클레오티드 또는 염기)인 사용된 mRNA의 구역이 선택된다;

- 인트론으로부터의 서열은 효과가 없으므로 엑손으로부터의 dsRNA (= 이중가닥 RNA) 서열만이 방법에 유용하다;

- 상기 구역 내의 G/C 함량은 30% 초과 및 70% 미만, 이상적으로는 대략 50%이어야 한다;

- 표적 mRNA의 가능한 2차 구조는 RNAi 방법의 효과에 덜 중요하다.

dsRNAi 방법은 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 핵산 분자의 발현을 감소시키기 위해 특히 효과적이고 유리할 수 있다. 특히 WO 99/32619에 설명된 바와 같이, dsRNAi 방안은 전통적인 안티센스 방안보다 명백하게 우월하다.

따라서, 본 발명은 유기체 내로, 유리하게는 식물 (또는 그로부터 유도된 세포, 조직, 기관 또는 종자) 내로 도입될 때, 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 핵산 분자의 발현의 감소에 의해 변경된 대사 활성을 야기하는 이중가닥 RNA 분자 (dsRNA 분자)의 발현을 위해 사용될 수 있다.

이중가닥 RNA 분자, 예를 들어 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 감소시키기 위한 dsRNA에서, 2개의 RNA 스트랜드 중 하나는 핵산 서열의 적어도 일부에 본질적으로 동일하고, 각각의 다른 RNA 스트랜드는 핵산 서열의 상보성 스트랜드의 적어도 일부에 본질적으로 동일하다.

용어 "본질적으로 동일한"은 dsRNA 서열이 여전히 발현을 효과적으로 감소시키면서, 표적 서열에 비해 삽입, 결실 및 개별적인 점 돌연변이를 또한 포함할 수 있다는 사실을 나타낸다. 바람직하게는, 상기 규정된 상동성은 억제성 dsRNA의 "센스" 스트랜드와 본 발명의 바람직한 실시태양에서 그들의 내인성 5'- 및 3'-비번역 구역을 포함하는 본 발명의 핵산 서열의 부분-세그먼트 사이에서, 또는 "안티센스" 스트랜드와 핵산 서열의 상보성 스트랜드 사이에서 각각 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%, 특히 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 100%이다. 부분-세그먼트는 적어도 10개 염기, 바람직하게는 적어도 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 염기, 특히 바람직하게는 적어도 40, 50, 60, 70, 80 또는 90개 염기, 보다 특히 바람직하게는 적어도 100, 200, 300 또는 400개 염기, 가장 바람직하게는 적어도 500, 600, 700, 800, 900개 또는 그 이상의 염기, 또는 적어도 1000 또는 2000개 염기 또는 이보다 많은 염기의 길이이다. 본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, 부분-세그먼트는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27개 염기, 바람직하게는 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 염기이다. 이들 짧은 서열은 동물 및 식물에서 바람직하다. 보다 긴 서열, 바람직하게는 200 및 800개의 염기는 비포유동물에서, 바람직하게는 무척추동물, 효모, 진균 또는 세균에서 바람직하지만, 식물에서 또한 유용하다. 긴 이중가닥 RNA는 예를 들어 ds-특이적 Rnase III 효소인 단백질 다이서 (Dicer)에 의해 유기체 내에서 많은 siRNA (= 짧은/짧은 간섭 RNA)로 가공된다. 대안으로서, "본질적으로 동일한" dsRNA는 또한 (예를 들어 400 mM NaCl, 40 mM PIPES (pH 6.4), 1 mM EDTA 내에서 50℃에서 또는 70℃에서 12 내지 16 h 동안) 유전자 전사체의 일부와 혼성화할 수 있는 핵산 서열로서 정의될 수 있다.

dsRNA는 중합화된 리보뉴클레오티드의 하나 이상의 스트랜드로 이루어질 수 있다. 당-포스페이트 백본 (backbone) 및 뉴클레오시드 모두의 변형이 추가로 존재할 수 있다. 예를 들어, 천연 RNA의 포스포디에스테르 결합은 적어도 하나의 질소 또는 황 헤테로원자를 포함하는 방식으로 변형될 수 있다. 염기는 예를 들어, 아데노신 데아미나제의 활성이 제한되는 방식으로 변형을 거칠 수 있다. 이들 및 다른 변형은 본원에서 아래에 안티센스 RNA를 안정화시키기 위한 방법에서 설명된다.

dsRNA는 효소를 이용하여 제조할 수 있고; 또한 전체 또는 부분을 화학적으로 합성할 수 있다. RNA 간섭을 효과적으로 매개하는 30 bp까지의 짧은 dsRNA는 예를 들어, 이. 콜라이 리보뉴클레아제 III (RNase III)을 사용하는 긴 dsRNA 주형의 부분적 소화에 의해 효율적으로 생성할 수 있다 (Yang, D., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 9942).

이중가닥 구조는 단일의 자가상보성 스트랜드를 출발 물질로 사용하거나 2개의 상보성 스트랜드를 출발 물질로 사용하여 형성시킬 수 있다. 단일의 자가상보성 스트랜드에서, "센스" 및 "안티센스" 서열은 연결 서열 ("링커")에 의해 연결될 수 있고, 예를 들어, 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 바람직하게는, 연결 서열은 dsRNA 합성 후에 스플라이싱 제거되는 인트론 형태일 수 있다. dsRNA를 코딩하는 핵산 서열은 추가의 요소, 예를 들어, 전사 종료 신호 또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. dsRNA의 2개의 스트랜드가 세포 또는 유기체 내에서, 유리하게는 식물 내에서 조합되어야 하면, 이는 다음의 다양한 방식으로 일어날 수 있다:

a) 2개의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 사용하는 세포 또는 유기체, 유리하게는 식물의 형질전환;

b) 하나는 "센스" 스트랜드를 갖는 발현 카세트를 포함하고, 다른 하나는 "안티센스" 스트랜드를 갖는 발현 카세트를 포함하는 2개의 벡터를 사용하는 세포 또는 유기체, 유리하게는 식물의 동시형질전환;

c) 세포 또는 유기체가 "안티센스" 스트랜드를 갖는 발현 카세트를 포함하는 벡터로 이미 형질전환된 후 "센스" 스트랜드를 갖는 발현 카세트를 포함하는 벡터를 사용하는, 또는 그 반대로 사용하는 세포 또는 유기체, 유리하게는 식물의 초 (super) 형질전환;

d) 각각 하나는 "센스" 스트랜드를 갖는 발현 카세트를 포함하고, 다른 하나는 "안티센스" 스트랜드를 갖는 발현 카세트를 포함하는 하나의 벡터를 사용하여 형질전환된 2개의 유기체, 유리하게는 식물의 혼성화, 예를 들어 교배;

e) 양 방향으로부터 목적하는 서열의 전사를 일으키는 2개의 프로모터를 포함하는 구성체의 도입; 및/또는

f) 목적하는 dsRNA 분자를 생산할 수 있는 공학처리된 바이러스로 세포 또는 유기체, 유리하게는 식물을 감염시킴.

RNA 이중체의 형성은 세포 외에서 또는 내에서 개시시킬 수 있다. dsRNA가 표적 세포 또는 유기체 외에서 합성되면, 이것은 주사, 미세주사, 전기천공, 고속 입자에 의해, 레이저 빔에 의해 또는 화학적 화합물 (DEAE-덱스트란, 인산칼슘, 리포좀)에 의해 매개되어 유기체 또는 유기체의 세포 내로 도입될 수 있다.

따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 상기 이중가닥 RNA 핵산 분자의 센스 스트랜드가 핵산 서열과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60%, 바람직하게는 65%, 70%, 75% 또는 80%, 보다 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 갖는 dsRNA에 관한 것이다.

본 발명의 다른 실시태양은 핵산 분자에 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 바람직하게는 100%의 상동성을 갖는 핵산 분자의 적어도 10개의 염기쌍 (= 염기, nt, 뉴클레오티드), 바람직하게는 적어도 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 또는 50개, 특히 바람직하게는 적어도 55, 60, 70, 80 또는 90개의 염기쌍, 보다 특히 바람직하게는 적어도 100, 200, 300 또는 400개의 염기쌍, 가장 바람직하게는 적어도 500, 600, 700, 800, 900개 또는 이보다 많은 염기쌍 또는 적어도 1000 또는 2000개의 염기쌍을 갖는 단편을 포함하는 dsRNA 분자에 관한 것이다.

본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, dsRNA 분자의 코딩된 서열 또는 그의 부분-세그먼트는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27개 염기, 바람직하게는 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 염기이고, 서열의 상동성은 본질적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 바람직하게는 99% 또는 100%이다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 이중가닥 RNA의 센스 및 안티센스 스트랜드는 공유 결합되거나, 다른, 예를 들어 약한 화학 결합, 예를 들어 수소 결합에 의해 서로에 결합되고, 안티센스 스트랜드는 본질적으로 센스-RNA 스트랜드의 상보체이다.

WO 99/53050에 제시된 바와 같이, dsRNA는 또한 "링커" (예를 들어 인트론)에 의해 "센스" 및 "안티센스" 스트랜드를 연결함으로써 헤어핀 구조를 포함할 수 있다. 단지 구성체의 발현을 요구하고 항상 상보성 스트랜드를 등몰비로 포함하기 때문에 자가-상보성 dsRNA 구조가 바람직하다.

dsRNA의 "안티센스" 또는 "센스" 스트랜드, 또는 dsRNA의 자가상보성 스트랜드를 코딩하는 발현 카세트는 바람직하게는 dsRNA의 영구적인 발현을 보장하기 위해서 본원에서 아래 설명된 방법 (예를 들어 선택 마커를 사용하는 방법)을 이용하여 벡터 내로 삽입되고 식물의 게놈 내로 안정하게 삽입된다. 세균 또는 바이러스 벡터를 사용한 일시적 발현이 유사하게 유용하다.

dsRNA는 세포당 적어도 하나의 카피를 가능하게 하는 양을 사용하여 도입될 수 있다. 보다 많은 양 (예를 들어 세포당 적어도 5, 10, 100, 500 또는 1,000개 카피)은 보다 효율적인 감소를 야기할 수 있다.

이미 설명된 바와 같이, 발현의 효과적인 감소를 야기하기 위해 dsRNA와 감소시킬 핵산 분자의 유전자 전사체 사이에 100%의 서열 동일성이 반드시 요구되는 것은 아니다. 따라서, 방법이 유전적 돌연변이, 다형성 또는 진화적 분기 (divergence)의 결과로서 존재할 수 있는 서열 일탈에 대해 허용성인 것이 유리하다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 과정에 따라 감소시킬 핵산 분자를 출발 물질로 사용하여 생성된 dsRNA를 사용한다.

dsRNA는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 합성할 수 있다. 이를 위해, dsRNA를 코딩하는 DNA 서열을 적어도 하나의 유전자 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일렌서 (silencer), 스플라이스 공여자 또는 스플라이스 수용자 또는 폴리아데닐화 신호)의 제어 하에 발현 카세트 내로 도입할 수 있다. 유리한 적합한 구성체를 본원에서 아래에 설명한다. 폴리아데닐화가 요구되지 않고, 번역 개시를 위한 요소도 존재할 필요가 없다.

dsRNA는 화학적으로 또는 효소를 이용하여 합성할 수 있다. 세포성 RNA 폴리머라제 또는 박테리오파지 RNA 폴리머라제 (예를 들어, T3, T7 또는 SP6 RNA 폴리머라제)를 상기 목적을 위해 사용할 수 있다. RNA의 시험관내 발현을 위한 적합한 방법은 문헌에 기재되어 있다 (WO 97/32016; US 5,593,874; US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693). 세포, 조직 또는 유기체 내로 도입하기 전에, 화학적 또는 효소를 사용하여 시험관 내에서 합성된 dsRNA를 예를 들어, 추출, 침전, 전기영동, 크로마토그래피 또는 이들 방법의 조합법에 의해 반응 혼합물로부터 보다 높거나 보다 낮은 수준으로 단리할 수 있다. dsRNA는 직접 세포 내로 도입되거나, 세포 외에서 (예를 들어 간질 공간 내로) 적용될 수 있다. 본 발명의 한 실시태양에서, RNAi 방법은 단지 유전자 기능의 부분 상실만을 유도하고, 따라서 당업자는 목적하는 유기체에서 유전자 투여 효과를 연구하고 본 발명의 과정을 미세하게 조정할 수 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, dsRNA는 기능을 완전히 상실시키고, 따라서 정밀 화학물질의 생산을 증가시킨다. 또한, 이를 통해 당업자가 유전자의 다수 기능을 연구할 수 있다.

그러나, dsRNA의 발현을 야기하는 발현 구성체를 사용한 식물의 안정한 형질전환이 바람직하다. 적합한 방법을 본원에서 아래에 설명한다.

b) 본 발명의 방법으로 발현되는 조절 RNA는 예를 들어, 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 감소 또는 결실을 위한 예를 들어, 안티센스 핵산 서열일 수 있다.

외인성 DNA 서열은 특이적 핵산 서열을 하향조절하도록 설계될 수 있다. 이는 예를 들어, 본 발명의 키메라 전사 조절 핵산 서열을 사용하여 안티센스 배향의 외인성 DNA 또는 전사 시에 헤어핀-형성 RNA 분자가 생성되도록 설계된 DNA를 작동가능하게 연결함으로써 달성된다. 유전자 억제는 예를 들어, 식물에서 천연 유전자에 의해 코딩된 단백질의 수준을 감소시키기 위해 또는 영향을 받은 대사산물의 수준을 향상 또는 감소시키기 위해 형질과 연관된 천연 식물 유전자에 대해 효과적일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키메라 전사 조절 핵산 서열은 옥수수 배에서 천연 유전자의 억제를 위해 헤어핀-형태의 RNA가 형성되도록 설계된 이종성 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 유전자 억제를 일으키는 상이한 종류의 외인성 DNA 배열이 당업자에게 공지되어 있고, 이는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 국제 특허 출원 공개 WO 94/01550에는 안티센스 RNA가 자가상보성 3' 세그먼트로 안정화된 DNA 구성체가 개시되어 있다. 전사된 RNA 내의 다른 이중가닥 헤어핀-형성 요소는 WO 98/05770에 개시되어 있고, 여기서 안티센스 RNA는 폴리(CG) 뉴클레오티드의 헤어핀 형성 반복체에 의해 안정화되고, 특허 출원 공개 2002/0048814 A1에는 폴리(T)-폴리(A) 테일에 의해 안정화된 센스 또는 안티센스 RNA가 기재되어 있다. 미국 특허 출원 공개 2003/0018993 A1에는 NOS 유전자의 3' 비번역 구역의 하위서열의 역위 (inverted) 반복체에 의해 안정화된 센스 또는 안티센스 RNA가 개시되어 있다. 미국 특허 출원 공개 2003/0036197 A1에는 표적 서열에 상동성인 2개의 상보성 RNA 구역에 의해 안정화된 RNA가 기재되어 있다.

"안티센스" 기술에 의해 그의 mRNA의 축적을 방지함으로써 특이적 단백질을 억제하는 방법이 널리 사용될 수 있고, 식물에 대한 것을 포함하여 광범하게 문헌에 설명되었다 ([Sheehy et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8805-8809]; US 4,801,34100; [Mol JN et al. (1990) FEBS Lett 268(2): 427-430]). 안티센스 핵산 분자는 억제시킬 표적 단백질을 코딩하는 세포성 mRNA 및/또는 게놈 DNA에 혼성화하거나 결합한다. 상기 과정은 표적 단백질의 전사 및/또는 번역을 억제한다. 혼성화는 안정한 이중체의 형성을 통해 통상적인 방식으로, 또는 게놈 DNA의 경우에 DNA 나선의 큰 그루브 (groove) 내에서 특이적 상호작용에 의해 게놈 DNA의 이중체에 대한 안티센스 핵산 분자의 결합에 의해 야기될 수 있다.

한 실시태양에서, "안티센스" 핵산 분자는 단백질을 코딩하는 "센스" 핵산 분자에 적어도 부분적으로 상보성인, 예를 들어, 이중가닥 cDNA 분자의 코딩 스트랜드에 상보성이거나 코딩 mRNA 서열에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 안티센스 핵산 분자는 수소 결합을 통해 센스 핵산 분자에 결합할 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 본 발명의 과정으로 감소시킬 폴리펩티드의 발현을 부여하거나, 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자의 전체 코딩 스트랜드에 또는 단지 그의 일부에 상보성일 수 있다. 따라서, 안티센스 핵산 분자는 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열의 코딩 스트랜드의 "코딩 구역"에 안티센스일 수 있다.

용어 "코딩 구역"은 아미노산 잔기로 번역되는, 코돈을 포함한 뉴클레오티드 서열의 구역을 나타낸다.

다른 실시태양에서, 안티센스 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열의 코딩 구역을 플랭킹하는 mRNA의 "비코딩 구역"에 안티센스이다. 용어 "비코딩 구역"은 폴리펩티드로 번역되지 않는 코딩 구역, 즉 5' 및 3' 비번역 구역 (5'-UTR 또는 3'-UTR)으로도 불리는 구역을 플랭킹하는 5' 및 3' 서열을 나타낸다. 유리하게는, 비코딩 구역은 코딩 구역으로부터 50 bp, 100 bp, 200 bp 또는 300 bp, 바람직하게는 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp 또는 1000 bp 상류 및/또는 하류 영역에 존재한다.

본 발명의 과정으로 감소시킬, 예를 들어 상기 언급된 활성, 예를 들어 활성이 본원에 개시된 바와 같이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 단백질의 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 코딩하는 코딩 스트랜드 서열을 가정하면, 안티센스 핵산 분자는 왓슨과 크릭 (Watson and Crick) 염기쌍 형성 규칙에 따라 설계될 수 있다.

추가의 실시태양에서, 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 핵산일 수 있다. 그러한 α-아노머 핵산 분자는 상보성 RNA와 특이적 이중가닥 하이브리드를 형성하고, 여기서 통상적인 β-핵산과 반대로, 2개의 스트랜드는 서로 평행이다 (Gautier C et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6625-6641). 또한, 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-O-메틸리보뉴클레오티드 (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148), 또는 키메라 RNA-DNA 유사체 (Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215: 327-330)를 포함할 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 전형적으로 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 단백질의 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하거나 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 핵산 분자의 활성을 갖는 핵산 분자를 코딩하는 세포성 mRNA 및/또는 게놈 DNA와 혼성화하거나 결합하여, 예를 들어, 전사 및/또는 번역을 억제하고 앞서 언급된 정밀 화학물질의 활성을 증가시킴으로써 단백질의 발현을 억제하도록 세포에 투여되거나 계내에서 생성된다.

본 발명의 안티센스 분자는 또한 예를 들어 표적 세포에서 유전자의 전사를 방지하는 삼중 나선 구조를 형성하도록 본 발명의 천연 발생 폴리펩티드, 예를 들어 서열 목록에 제시되거나 본원에 설명된 방법에 따라 확인된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 조절 구역, 예를 들어, 그의 프로모터 및/또는 인핸서에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다 (일반적으로 문헌 ([Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84]; [Helene, C. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36]; 및 [Maher, L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-15]) 참조).

c) 본 발명의 방법으로 발현되는 조절 RNA는 예를 들어, 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 활성의 감소 또는 결실을 위한, 예를 들어 리보자임과 조합된 안티센스 핵산 서열일 수 있다.

상기 설명된 안티센스 방법을 리보자임 방법과 조합하는 것이 유리하다. 촉매적 RNA 분자 또는 리보자임은 임의의 표적 RNA에 적응되고 특이적 위치에서 포스포디에스테르 백본을 절단할 수 있어서, 표적 RNA를 기능적으로 탈활성화시킨다 (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol. Rev. 23(3): 257-275). 리보자임 자체는 변형되지 않지만, 표적 RNA 분자를 유사한 방식으로 추가로 전달할 수 있어서, 효소의 특성을 획득한다. "안티센스" RNA 내로 리보자임 서열을 통합시키면 이들 "안티센스" RNA에 정밀한 상기 효소-유사 RNA-절단 특성을 부여하고, 따라서 표적 RNA를 불활성화시킬 때 그들의 효율을 증가시킨다. 적합한 리보자임 "안티센스" RNA 분자의 제조 및 사용은 예를 들어 문헌 [Haseloff et al. (1988) Nature 33410: 585-591]에 기재되어 있다.

또한, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 또한 리보자임일 수 있다. 리보자임은 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA 분자이고, 이는 그들이 상보성 구역을 갖는 mRNA과 같은 단일가닥 핵산을 절단할 수 있다. 이러한 방식으로, 리보자임 (예를 들어 "해머헤드 (Hammerhead)" 리보자임; [Haselhoff 및 Gerlach (1988) Nature 33410: 585-591])은 억제시킬 효소의 mRNA를 촉매적으로 절단하고 번역을 방지하도록 사용될 수 있다. 리보자임 기술은 안티센스 방법의 효능을 증가시킬 수 있다. 특이적 단백질을 감소시키기 위한 리보자임의 발현 방법은 EP 0 291 533, EP 0 321 201, EP 0 360 257에 기재되어 있다 . 리보자임 발현은 또한 식물 세포에 대해 설명되었다 ([Steinecke P et al. (1992) EMBO J 11(4): 1525-1530]; [de Feyter R et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 250(3): 329-338]). 적합한 표적 서열 및 리보자임은 예를 들어, 문헌 [Steinecke P, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds, Academic Press, Inc. (1995), pp. 449-460]에 설명된 바와 같이 리보자임 RNA 및 표적 RNA의 2차 구조를 계산함으로써 및 그들의 상호작용에 의해 확인할 수 있다 ([Bayley CC et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18(2): 353-361]; [Lloyd AM and Davis RW et al. (1994) Mol. Gen. Genet. 242(6): 653-657]). 예를 들어, 억제시킬 단백질의 mRNA에 상보성 구역을 갖는 테트라하이메나 (tetrahymena) L-19 IVS RNA의 유도체가 구성될 수 있다 (또한 US 4,987,071 및 US 5,116,742 참조). 대안으로서, 그러한 리보자임은 또한 선택 과정을 통해 다양한 리보자임의 라이브러리로부터 확인될 수 있다 (Bartel D and Szostak JW (1993) Science 261: 1411-1418).

d) 본 발명의 방법으로 발현되는 조절 RNA는 예를 들어, 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 활성의 감소 또는 결실을 위한, 예를 들어 동시 억제를 유도하기 위한 (센스) 핵산 서열일 수 있다.

본원에서 사용될 때, "유전자 억제"는 전사후 유전자 억제 및 전사 억제를 포함한, RNA 전사체 또는 RNA 전사체로부터 번역된 단백질의 생산을 억제하는 임의의 잘 공지된 방법을 의미한다. 전사후 유전자 억제는 억제를 위해 표적화된 유전자에 상동성을 갖는 이중가닥 RNA에 의해 매개된다. 전사 단위의 적어도 일부의 역위 반복체를 포함하는 외인성 DNA 구성체로부터 전사된 RNA에 의한 유전자 억제는 안티센스 억제, 동시 억제 및 RNA 간섭으로서 공지된 유전자 억제 방법의 공통적인 특색이다. 보다 특히, 식물 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위해 안티센스 배향의 DNA를 갖는 외인성 DNA 구성체의 삽입에 의한 전사후 유전자 억제는 US 5,107,065 및 US 5,759,829에 개시되어 있다. 전사 억제는 소위 프로모터 트랜스 (trans)-억제를 수행하기 위해 프로모터 DNA 서열에 상동성을 갖는 전사된 이중가닥 RNA에 의해 매개될 수 있다. 식물에서 유전자 발현을 조절하기 위해 센스 배향의 DNA를 갖는 외인성 DNA 구성체의 삽입에 의한 전사후 유전자 억제는 US 5,283,184 및 US 5,231,020에 개시되어 있다.

센스 배향으로 핵산 서열의 발현은 상응하는 상동성, 내인성 유전자의 동시 억제를 일으킬 수 있다. 내인성 유전자에 대해 상동성을 갖는 센스 RNA의 발현은 다음 문헌의 안티센스 방법에 대해 설명된 바와 유사한 방식으로 내인성 유전자의 발현을 감소시키거나 실제로 제거할 수 있다 ([Jorgensen et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31(5): 957-973], [Goring et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1770-1774], [Smith et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 447-481], [Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279-289] 또는 [Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2: 291-99]). 본 문맥에서, 도입된 구성체는 감소시킬 상동성 유전자를 완전히 또는 단지 부분적으로만 나타낼 수 있다. 식물에 대한 상기 기술의 적용은 예를 들어 문헌 [Napoli et al. (1990) The Plant Cell 2: 279-289] 및 US 5,03410,323에서 설명되었다. 또한, 상기 설명된 동시 억제 방법은 문헌 [Brummell et al., 2003, Plant J. 33, pp793-800]에 설명된 바와 같이 RNAi 방법과 유리하게 조합될 수 있다. 적어도 식물에서, 동시 억제 방안에서 강한 또는 매우 강한 프로모터를 사용하는 것이 유리하다. 예를 들어, 문헌 [Schubert et al., Plant Journal 2004, 16, 2561-2572]의 최근 연구에서는 동시 억제 효과가 그를 초과할 때 동시 억제가 일어나는 유전자 특이적 역치 수준에 의존적임을 보여주었다.

e) 본 발명의 방법으로 발현되는 mRNA는 예를 들어, 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 폴리펩티드의 활성의 감소 또는 결실을 위한, 예를 들어 우성 음성 단백질을 코딩하는 핵산 서열일 수 있다.

단백질의 기능 또는 활성은 또한 상기 단백질의 우성 음성 변이체를 발현시킴으로써 효율적으로 감소될 수 있다. 당업자는 그의 우성 음성 형태의 동시발현에 의해 단백질의 기능 또는 활성을 감소시키는 방법을 잘 알고 있다 ([Lagna G and Hemmati-Brivanlou A (1998) Current Topics in Developmental Biology 36: 75-98]; [Perlmutter RM and Alberola-lla J (1996) Current Opinion in Immunology 8(2): 285-90]; [Sheppard D (1994) American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology 11(1): 1-6]; [Herskowitz I (1987) Nature 329 (6136): 219-22]).

우성 음성 변이체는 예를 들어 폴리펩티드의 아미노산의 변화에 의해 달성할 수 있다.

상기 변화는 예를 들어 컴퓨터를 통한 비교 ("정렬")에 의해 결정할 수 있다. 우성 음성 변이체를 달성하기 위한 이들 돌연변이는 바람직하게는 핵산 서열의 수준에서 수행된다. 상응하는 돌연변이는 예를 들어, 그에 의해 목적하는 돌연변이가 도입되는 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 PCR-매개 시험관내 돌연변이 유발에 의해 수행할 수 있다. 이를 위해, 당업자가 잘 알고 있는 방법이 사용된다. 예를 들어, "LA PCR 시험관내 돌연변이 유발 키트" (다카라 슈조 (Takara Shuzo, 일본 교토))가 상기 목적을 위해 사용될 수 있다. 기능적 도메인, 예를 들어 TF, 또는 결합할 수 있지만 활성화시키지 않는 다른 신호전달 성분의 결실 또는 변화가 단백질 활성의 감소를 달성할 수 있는 것이 또한 가능하고 당업자에게 공지되어 있다.

f) 본 발명의 또 다른 실시태양에서 제어된 mRNA는 DNA- 또는 단백질-결합 인자를 코딩한다.

이들 인자는 내인성 표적 유전자의 게놈 서열에, 바람직하게는 조절 구역에서 부착하고, 내인성 유전자의 억제를 야기한다. 그러한 방법의 사용으로 후자의 서열을 재조합 방식으로 조작할 필요 없이 내인성 유전자의 발현의 감소가 가능하게 된다. 관련 인자의 제조 방법은 문헌 ([Dreier B et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(31): 29466-78] 및 [(2000) J. Mol. Biol. 303(4): 489-502], [Beerli RR et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(25): 14628-14633]; [(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4): 1495-1500] 및 [(2000) J. Biol. Chem. 275(42): 32617-32627]), [Segal DJ and Barbas CF, 3rd (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4(1): 3410-39], [Kang JS and Kim JS (2000) J. Biol. Chem. 275(12): 8742-8748], [Kim JS et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(8): 3616-3620], [Klug A (1999) J. Mol. Biol. 293(2): 215-218], [Tsai SY et al. (1998) Adv. Drug Deliv. Rev. 30(1-3): 23-31], [Mapp AK et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(8): 3930-3935], [Sharrocks AD et al. (1997) Int. J. Biochem. Cell Biol. 29(12): 1371-1387] 및 [Zhang L et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43): 33850-33860])에 기재되어 있다. 식물에 상기 기술을 적용하는 예는 문헌 (WO 01/52620, [Ordiz Ml et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99, Issue 20, 13290-13295, 2002] 또는 [Guan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99, Issue 20, 13296-13301, 2002])에 기재되어 있다.

이들 인자는 유전자의 임의의 부분을 사용하여 선택할 수 있다. 상기 세그먼트는 바람직하게는 프로모터 구역에 위치한다. 그러나, 유전자 억제의 목적을 위해, 이는 코딩하는 엑손 또는 인트론의 구역 내에 위치할 수도 있다. 당업자는 Genbank로부터 데이타베이스 탐색에 의해, 또는 상응하는 게놈 클론에 대한 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 그의 유전자가 Genbank에 존재하지 않는 cDNA로부터 출발하여 관련 세그먼트를 입수할 수 있다.

먼저 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 핵산 분자를 포함하거나 폴리펩티드를 코딩하는 표적 작물 내의 서열을 확인한 후, 프로모터를 찾고 상기 언급된 인자를 사용함으로써 발현을 감소시키는 것도 또한 가능하다.

당업자는 그를 수행하기 위해 필요한 방법을 잘 알고 있다.

또한, 세포 내로 도입되는 인자는 또한 자체가 표적 단백질을 억제하는 것일 수 있다. 단백질-결합 인자는 예를 들어 앱타머 (aptamer) (Famulok M and Mayer G (1999) Curr. Top Microbiol. Immunol. 243: 123-36) 또는 항체 또는 항체 단편 또는 단일쇄 항체일 수 있다. 이들 인자를 얻는 것은 문헌에 기재되어 있고, 당업자는 이를 잘 알고 있다. 유적학상 변형된 담배 식물에서 피토크롬 단백질의 활성을 조정하기 위해 예를 들어 세포질 scFv 항체가 사용되었다 ([Owen M et al. (1992) Biotechnology (NY) 10(7): 790-794]; [Franken E et al. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8(4): 411-416]; [Whitelam (1996) Trend Plant Sci. 1: 286-272]).

또한, 유전자 발현은 예를 들어 폴리아미드형의 맞춤 제조된 (tailor-made) 저분자량 합성 화합물에 의해 또한 억제될 수 있다 ([Dervan PB and Burli RW (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3: 688-693]; [Gottesfeld JM et al. (2000) Gene Expr. 9(1-2): 77-91). 이들 올리고머는 단위 3-(디메틸-아미노)프로필아민, N-메틸-3-히드록시피롤, N-메틸이미다졸 및 N-메틸-피롤로 이루어지고; 이들은 큰 그루브에 서열-특이적으로 결합하고 상기 위치에 존재하는 유전자 서열의 발현을 차단하는 방식으로 이중가닥 DNA의 각각의 부분에 적응될 수 있다. 적합한 방법은 문헌 ([Bremer RE et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9(8): 2093-103], [Ansari AZ et al., (2001) Chem. Biol. 8(6): 583-92], [Gottesfeld JM et al. (2001) J. Mol. Biol. 309(3): 615-29], [Wurtz NR et al. (2001) Org. Lett 3(8): 1201-3], [Wang CC et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9(3): 653-7], [Urbach AR and Dervan PB (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(8): 434103-8] 및 [Chiang SY et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(32): 24246-54])에 기재되어 있다.

g) 본 발명의 방법으로 발현되는 조절 RNA는 예를 들어, 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 활성의 감소 또는 결실을 위한, 예를 들어 RNA의 분해를 야기하는 바이러스 핵산 서열일 수 있다.

불활성화 또는 하향조절은 또한 바이러스 발현 시스템 (Amplikon)의 도움으로 유기체, 유리하게는 식물에서 특이적인 RNA 분해를 유도함으로써 효율적으로 야기될 수 있다 (Angell, SM et al. (1999) Plant J. 20(3): 357-362). 억제시킬 전사체에 상동성을 갖는 핵산 서열은 바이러스 벡터의 도움으로 "VIGS" (바이러스 유도된 유전자 침묵)으로도 불리는 이들 시스템에 의해 식물 내로 도입된다. 이어서, 전사는 아마도 바이러스에 대한 식물 방어 기전에 의해 매개되어 종료된다. 적합한 기술 및 방법은 문헌 ([Ratcliff F et al. (2001) Plant J. 25(2): 237-45], [Fagard M and Vaucheret H (2000) Plant Mol. Biol. 43(2-3): 285-93], [Anandalakshmi R et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(22): 13079-84] 및 [Ruiz MT (1998) Plant Cell 10(6): 937-46])에 기재되어 있다.

h) 본 발명의 방법으로 발현되는 조절 RNA는 예를 들어, 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 활성의 감소 또는 결실을 위한, 예를 들어 관심있는 유전자의 mRNA의 붕괴 또는 번역 억제를 유도하여 유전자 발현을 침묵시키기 위해 또는 전자의 발현을 보장하도록 발현 카세트의 mRNA의 붕괴 또는 번역 억제를 유도하기 위해 관심있는 유전자를 표적화하도록 설계된 마이크로RNA (또는 마이크로-RNA)일 수 있다.

유전자 발현의 조절은 또한 마이크로RNA의 발현을 변형시켜 달성할 수도 있다. 식물 miRNA가 분열조직 (meristem) 동일성, 세포 분열, 기관 분리, 기관 극성 및 비생물적 스트레스 반응에서 광범위한 조절 기능을 갖는 것을 입증하는 증거가 많아지고 있다 (Bartel D 2004). 많은 식물 miRNA는 특유한 공간적 또는 시간적 발현 패턴을 갖는다. 식물 miRNA의 과다발현 또는 이소성 (ectopic) 발현은 식물의 형태 및 생리학을 변화시킬 수 있다. 식물 miRNA 전구체는 또한 아라비돕시스 내에서 리포터 유전자를 표적화하도록 공학처리될 수 있다 (Parizotto E A et al., 2004).

마이크로RNA (miRNA)는 식물 및 동물에서 유전자 발현의 진화상 보존된 RNA-기반 조절인자로서 나타났다. miRNA (~21 내지 25 nt)는 비-단백질-코딩 유전자로부터 전사되는 스템 (stem) 루프 구조를 갖는 보다 큰 전구체로부터 발생한다. miRNA는 전사 후에 (즉, mRNA를 분해시키도록) 또는 번역 수준에서 (즉, 단백질 합성을 억제하도록) 유전자 발현을 억제하도록 특이적 mRNA를 표적화한다 (Bartel D 2004, Cell 116, 281-297). miRNA는 선택된 유전자를 특이적으로 표적화하고 하향조절하도록 효율적으로 설계될 수 있다. 천연 식물 miRNA의 표적 선택의 결정은 스왑 (Schwab)과 공동작업자들 (Schwab et al. 2005,. 2005 Dev. Cell 8, 517-527)에 의해 분석되었다. 상기 작업은 표적 유전자를 효율적으로 하향조절하기 위해 인공 miRNA (amiRNA)의 설계 및 사용으로 연장되었고, 이는 지시된 유전자 침묵을 위한 효과적인 amiRNA의 설계를 위한 개념과 규칙 (Highly Specific Gene Silencing by Artificial microRNA in Arabidopsis, Schwab et al., Plant Cell 2006 18(4)) 및 효율적인 amiRNA 설계를 위한 웹 기반 도구 (http://wmd.weigelworld.org))를 생성하였다.

i) 본 발명의 방법으로 발현되는 조절 RNA는 예를 들어, 활성이 본 발명의 과정으로 감소되어야 하는 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 활성의 감소 또는 결실을 위한 예를 들어 트랜스 작용 작은 간섭 RNA (ta-siRNA) 또는 전자의 발현을 보장하는 발현 카세트일 수 있다.

트랜스 작용 siRNA (ta-siRNA)는 최근에 확인된 내인성 siRNA이다 ([Peragine et al. 2004]; [Vazquez et al. 2004]). ta-siRNA의 생성에는 miRNA-매개 mRNA 절단, 및 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 (RdRP), RDR6에 의한 후속적인 dsRNA 합성이 필요하다 (Allen et al. 2005). ta-siRNA는 miRNA와 유사한 방식으로 유전자 발현을 조절한다.

트랜스 작용 작은 간섭 RNA (ta-siRNA)는 관심있는 유전자의 mRNA의 붕괴를 유도하여 유전자 발현을 침묵시키기 위해 관심있는 유전자를 표적화하도록 설계될 수 있다.

본 발명의 과정에 따른 유전자 산물의 억제 또는 불활성화를 위해 유용한 ta-siRNA를 사용하는 방법은 US 60/672976 및 60/718645에 기재되어 있다.

상기 항목에서 설명된 바와 같이 핵산 서열은 세포 또는 유기체의 형질전환/형질감염에 의해 세포 또는 유기체 내에서 발현되거나, 예를 들어 항목 A)에 개시된 바와 같이 공지의 방법에 의해 세포 또는 유기체 내에 도입된다.

2.2 농경학상 관련 형질

키메릭 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 형질전환된 외떡잎 식물에 농경학상 관련 형질을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 상기 형질은 제초제 저항성, 제초제 내성, 곤충 저항성, 곤충 내성, 질병 저항성, 질병 내성 (바이러스, 세균, 진균, 선충), 가뭄, 열, 냉각, 냉동, 과도한 습기, 염 스트레스 및 산화 스트레스에 대한 저항성 또는 내성으로 예시되는 스트레스 내성, 스트레스 저항성, 증가된 수확량, 식품 함량 및 가치, 증가된 사료 함량 및 가치, 물리적인 외형, 웅성 불임 (male sterility), 자성 불임, 건조화 (drydown), 직립성 (standability), 다작성 (prolificacy), 전분 양과 품질, 오일 양과 품질, 단백질 품질과 양, 아미노산 조성 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 많은 핵산 서열이 본 발명의 키메라 전사 조절 핵산 서열 (예를 들어, 바람직한 프로모터, 예를 들어 수퍼-프로모터와 조합되어)에 의해 발현되기에 적합하지만, 가장 바람직하게는 핵산은 발현시에 외떡잎 식물에

i) 적어도 하나의 스트레스 인자에 대한 향상된 저항성 또는 내성,

ii) 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질,

iii) 증가된 수확량으로 이루어진 군 중에서 선택된 농경학상 관련 형질을 부여한다.

가장 경제적인 관련 형질 중 하나는 수확량이다. 수확량은 임의의 종류에서 배 및 어린 묘목에 대한 손상에 의해 크게 영향을 받는다. 따라서, 어린 묘목 및 배를 보호하거나 그의 성능을 향상시키는 임의의 종류의 형질이 수확량에 관하여 유리하다. 따라서, 스트레스 저항성 (아래 참조)을 생성시키는 형질이 또한 수확량을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 실시태양은

A) 식물 내로

i) a) 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드;

b) 서열 1의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70% 또는 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

d) 2XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 가장 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군 중에서 선택된 제1 핵산 분자, 및 이에 작동가능하게 연결된

ii) a) 서열 3에 정의된 폴리뉴클레오티드;

b) 서열 3의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70% 또는 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

d) 2XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 가장 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 3에 제시된 서열의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군 중에서 선택되는 제2 핵산 분자를 포함하는 식물 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및

상기 전사 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, 상기 전사 조절 서열의 제1 또는 제2 핵산 서열에 대하여 이종성이고 식물에 증가된 수확량 및/또는 증가된 스트레스 내성을 부여할 수 있는 적어도 하나의 핵산

을 포함하는 발현 구성체를 도입하는 단계, 및

B) 트랜스제닉 식물을 선택하는 단계

를 포함하며, 여기서 식물은 야생형 또는 무효 분리개체 식물에 비해 증가된 수확량 및/또는 증가된 스트레스 내성을 갖는 것인, 증가된 수확량 및/또는 증가된 스트레스 내성을 식물에 부여하기 위한 방법에 관한 것이다.

증가된 수확량 및/또는 증가된 스트레스 내성 및 발현시킬 상응하는 이종성 핵산 서열은 상기 정의된 바와 같다. 보다 구체적인 예는 본원에서 아래에 주어진다. 바람직한 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 상기 설명한 바와 같다.

2.2.1 스트레스 저항성 또는 내성의 증가

전사 조절 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 형질전환된 외떡잎 식물에 증가된 (또는 향상된) 스트레스 저항성을 부여하기 위해 사용될 수 있다 (바람직하게는 스트레스-저항성 또는 스트레스 내성 식물을 달성하기 위해). "저항성"은 식물이 물질 투여, 병원체 감염, 또는 스트레스에 노출의 결과로서 실질적으로 표현형 변화를 보이지 않는 것을 의미한다. "내성"은 식물이 감염의 결과로서 일부 표현형 변화를 보일 수 있지만, 실질적으로 감소된 생식 능력 또는 실질적으로 변경된 대사를 갖지 않는 것을 의미한다.

그러한 스트레스 저항성을 얻기 위한 다양한 핵산 서열이 당업자에게 공지되어 있다. 상기 서열은 식물호르몬 생합성, 식물호르몬 조절, 세포 주기 조절, 또는 탄수화물 대사에 관여하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 스트레스 인자는 바람직하게는 상기 정의된 바와 같다. 발현시킬 이종성 핵산 서열 (예를 들어, 센스, 안티센스 또는 이중가닥 RNA로서)은 상기 기재된 바와 같은 스트레스-관련 폴리펩티드 (또는 그의 일부; 바람직하게는 적어도 5개, 보다 바람직하게는 적어도 10개, 가장 바람직하게는 적어도 30개의 연속적 아미노산으로 이루어진 일부)를 코딩할 수 있다. 바람직한 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 상기 기재되어 있다.

스트레스 인자 및 발현시킬 이종성 핵산 서열은 바람직하게는 상기 정의된 바와 같다. 바람직한 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 상기 기재되어 있다.

유리하게 얻어질 수 있는 스트레스 저항성은 바람직하게는 비생물적 또는 생물적 스트레스 인자에 대한 것이다. 생물적 스트레스 인자는 진균 저항성, 선충 저항성, 곤충 저항성, 바이러스 저항성 및 세균 저항성으로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 생물적 스트레스 인자는 종자 전염병 (주로 진균 질병, 예를 들어 주로 밀에서 깜부기병 (틸레티아 트리티시 (Tilletia tritici)); 주로 보리에서 줄무니병 (파이레노포라 그라미네아 (Pyrenophora graminea)), 및 겉깜부기병 (우스틸라고 누다 (Ustilago nuda)))이다.

비생물적 스트레스 인자는 가뭄, 과도한 습기, 열, 냉각, 냉동, 저온, 염분, 질소, 높은 식물 집단 밀도, UV광 및 산화 스트레스로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 스트레스 저항성은 조기 강세 (vigor)를 유도함으로써 달성된다.

그러한 스트레스 저항성을 얻기 위한 다양한 핵산 서열이 당업자에게 공지되어 있다. 상기 서열은 식물호르몬 생합성, 식물호르몬 조절, 세포 주기 조절, 또는 탄수화물 대사에 관여하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 보다 구체적인 예는 아래에 제시된다.

본 발명은 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 호밀, 사탕수수, 기장, 라이밀, 호밀풀 또는 율무와 같은 모든 외떡잎 식물에 적용가능하지만, 바람직하게는 포아풀아과 패밀리의 종실 생산 곡식 식물, 예를 들어 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 호밀, 사탕수수, 기장, 또는 라이밀에, 바람직하게는 옥수수, 보리 및 밀에, 가장 바람직하게는 옥수수에 적용가능하다.

본 발명의 추가의 실시태양은 본 발명의 외떡잎 식물의 종자, 일부 및 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 식물의 일부는 세포, 원형질체, 세포 조직 배양물, 캘러스, 세포 덩어리, 배, 화분, 배주, 종자, 꽃, 종실, 이삭, 속대, 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥 및 수염으로 이루어진 군 중에서 선택된다.

간접적으로, 증가된 스트레스 내성은 향상된 곡물 농경학 특징, 곡물 충전, 감소된 종실 이단 (abortion), 영양분의 증가된 전달 등의 측면을 촉진하는 하나 이상의 형질을 야기할 수 있다.

2.2.1.1 곤충 저항성 및 내성

본 발명의 중요한 측면은 식물 내로 곤충 저항성-부여 유전자의 도입에 관한 것이다. 도입될 수 있는 잠재적인 곤충 저항성 유전자는 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis) 결정 독소 유전자 또는 Bt 유전자를 포함한다 (Watrud 1985). Bt 유전자는 나비목 또는 딱정벌레목 해충, 예를 들어 유럽 조명충나방 (European Corn Borer; ECB) 및 옥수수 뿌리벌레 (CRW)에 대한 저항성을 제공할 수 있다. 상기 실시태양에서 사용하기에 바람직한 Bt 독소 유전자는 CryIA(b) 및 CryIA(c) 유전자를 포함한다. 곤충 성장 또는 발달에 영향을 미치는 다른 종의 비. 투링기엔시스로부터의 내독소 유전자가 또한 상기한 점에서 사용될 수 있다. 프로테아제 억제제가 또한 곤충 저항성을 제공할 수 있고 (Johnson 1989), 따라서 식물 형질전환에서 효용을 가질 것이다. 토마토 또는 감자로부터 프로테아제 억제제II 유전자, pinII의 사용이 특히 유용한 것으로 고안되었다. pinII 유전자를 Bt 독소 유전자와 조합으로 사용하는 것이 훨씬 더 유리하고, 그의 조합 효과는 본 발명자들에 의해 상승적 살충 활성을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 곤충의 소화계의 억제제를 코딩하거나, 억제제의 생산을 용이하게 하는 효소 또는 보조인자를 코딩하는 다른 유전자가 또한 유용할 수 있다. 밀 및 보리의 것과 같은 시스타틴 및 아밀라제 억제제가 상기 군의 예일 수 있다.

또한, 렉틴을 코딩하는 유전자는 추가의 또는 별도의 살충 특성을 부여할 수 있다. 렉틴 (처음에 피토헤마글루티닌으로 명명됨)은 다가 탄수화물-결합 단백질이고, 광범위한 종으로부터 적혈구를 응집시키는 능력이 있다. 렉틴은 최근에 바구미, ECB 및 뿌리벌레에 대해 활성을 갖는 살충제로서 확인되었다 ([Murdock 1990]; [Czapla & Lang, 1990]). 유용한 것으로 고려되는 렉틴 유전자는 예를 들어, 보리 및 밀 눈 응집소 (WGA) 및 벼 렉틴을 포함하고 (Gatehouse 1984), WGA가 바람직하다.

예를 들어, 용해성 펩티드, 펩티드 호르몬 및 독소 및 독액과 같은 곤충 해충에 도입될 때 곤충에 대해 활성을 갖는 큰 또는 작은 폴리펩티드의 생산을 조절하는 유전자가 본 발명의 또다른 측면을 형성한다. 예를 들어, 특이적 곤충 해충을 향해 생성된 유충 호르몬 에스테라제의 발현이 또한 살충 활성을 생성시킬 수 있거나, 아마도 변태를 중지시키는 것으로 고려된다 (Hammock 1990).

곤충 큐티클의 통합성에 영향을 미치는 효소를 코딩하는 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물이 본 발명의 또 다른 측면을 형성한다. 그러한 유전자는 예를 들어, 키티나제, 프로테아제, 리파제를 코딩하는 것을 포함하고, 또한 키틴 합성을 억제하는 화합물인 니코마이신의 생산을 위한 유전자를 포함하고, 이들 중 임의의 것의 도입은 곤충 저항성 옥수수 식물을 생산하는 것으로 고려된다. 엑디스테로이드 UDP-글루코실 트랜스퍼라제의 생산에 영향을 미치는 것과 같이 곤충 탈피에 영향을 미치는 활성을 코딩하는 유전자가 또한 본 발명의 유용한 트랜스젠의 범위 내에 포함된다.

곤충 해충에 대한 숙주 식물의 영양적 품질을 감소시키는 화합물의 생산을 용이하게 하는 효소를 코딩하는 유전자가 또한 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 그의 스테롤 조성을 변화시킴으로써 식물에 대해 살충 활성을 부여하는 것이 가능할 수 있다. 스테롤은 곤충이 그들의 먹이로부터 얻어, 호르몬 합성 및 막 안정성을 위해 사용하는 것이다. 따라서, 예를 들어, 바람직하지 않은 스테롤의 생산을 직접 촉진하는 것 또는 바람직한 스테롤을 바람직하지 않은 형태로 전환시키는 것과 같은 신규한 유전자의 발현에 의한 식물 스테롤 조성의 변경은 곤충 성장 및/또는 발달에 부정적인 영향을 가질 수 있고, 따라서 식물에 살충 활성을 부여한다. 리폭시게나제는 곤충에 대해 항-영양 효과를 나타내고 그들의 먹이의 영양적 품질을 감소시키는 것으로 나타난 자연 발생의 식물 효소이다. 따라서, 본 발명의 추가의 실시태양은 곤충 섭식에 대해 저항성일 수 있는 향상된 리폭시게나제 활성을 갖는 트랜스제닉 식물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 식물 2차 대사산물에 대해 정성적 또는 정량적 변화를 달성시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 하나의 예는 유럽 조명충나방, 뿌리벌레 및 몇몇 다른 옥수수 곤충 해충에 대해 저항성을 부여할 것으로 고려되는 DIMBOA를 생산하도록 식물을 형질전환시키는 것이다. 이러한 점에서 사용하기 위해 특히 고려되는 후보 유전자는 합성적 DIMBOA 경로에 관여될 bx 로커스에서 유전자를 포함한다 (Dunn 1981). 메이신의 생산을 조절할 수 있는 유전자, 및 사탕수수에서 듀린 (dhurrin)의 생산에 관련되는 유전자의 도입도 또한 각각 큰담배밤나방 유충 (earworm) 및 뿌리벌레에 대한 저항성을 촉진시키는데 유용한 것으로 고려된다.

트립사쿰 닥틸로이데스 (Tripsacum dactyloides)는 옥수수 뿌리벌레를 포함한 특정 곤충에 대해 저항성인 풀의 종이다. 곤충에 독성이거나 곤충에 독성인 화합물의 생합성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자가 트립사쿰으로부터 단리되고, 이들 신규한 유전자는 곤충에 대한 저항성을 부여하는데 유용할 것으로 예상된다. 상기 저항성이 유성 교배를 통해 제아 메이즈에 전달되기 때문에, 트립사쿰에서 곤충 저항성의 기초는 유전적인 것으로 알려져 있다 (Branson & Guss, 1972).

또한, 잠재적인 살충 활성을 갖는 것으로서 특성화된 단백질을 코딩하는 유전자도 본 발명에 따라 트랜스젠으로 사용될 수 있다. 그러한 유전자는 예를 들어 뿌리벌레 방제제로서 사용될 수 있는 광저기 (cowpea) 트립신 억제제 (CpTI; [Hilder 1987]); 옥수수 뿌리벌레 방제제로서 특히 유용한 것으로 입증될 수 있는 아베르멕틴을 코딩하는 유전자 ([Campbell 1989]; [Ikeda 1987]); 단백질 유전자를 불활성화시키는 리보좀; 및 심지어 식물 구조를 조절하는 유전자를 포함한다. 또한, 항-곤충 항체 유전자, 및 식물 외부에 도포된 비-독성 살충제 (프로-살충제 (pro-insecticide))를 식물 내부에서 살충제로 전환할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 트랜스제닉 옥수수도 또한 고려된다.

2.2.1.2 환경 또는 스트레스 저항성 및 내성

비제한적으로 가뭄, 과도한 습기, 질소, 냉각, 냉동, 높은 온도, 염 및 산화 스트레스를 포함하는 각종 환경 스트레스에 견디는 식물의 능력의 개선도 또한 이종성 유전자의 발현, 또는 상동성 유전자의 과다발현을 통해 달성할 수 있다. 이익은 "항동결 (antifreeze)" 단백질, 예를 들어 가자미 (Winter Flounder)의 것 (Cutler 1989) 또는 그의 합성 유전자 유도체의 도입을 통한 냉동 온도에 대한 증가된 저항성의 측면에서 실현될 수 있다. 개선된 냉각 내성은 또한 엽록체에서 글리세롤-3-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 증가된 발현을 통해 부여될 수 있다 ([Murata 1992]; [Wolter 1992]). 산화 스트레스 (종종 높은 빛 강도와 조합된 냉각 온도와 같은 조건에 의해 악화되는)에 대한 저항성은 수퍼옥시드 디스뮤타제의 발현에 의해 부여될 수 있고 (Gupta 1993), 글루타티온 리덕타제에 의해 개선될 수 있다 (Bowler 1992). 그러한 방법은 새로 나타난 경작지에서 냉동에 대한 내성뿐만 아니라 보다 조기의 상대적 성숙 지역에 대한 변종을 더 많이 수확시키는 보다 후기 성숙의 연장을 허용할 수 있다.

식물 함수량, 총 수분 포텐셜 (water potential), 삼투 포텐셜 (osmotic potential), 및 팽압에 유리한 영향을 주는 신규 유전자의 발현은 가뭄에 견디는 식물의 능력을 향상시킬 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 "가뭄 저항성" 및 "가뭄 내성"은 정상 상황에 비해 물 이용가능성의 감소에 의해 유도된 스트레스에 대한 식물의 증가된 저항성 또는 내성, 및 보다 물이 적인 환경에서 기능하고 생존하고, 비교적 우수한 방식으로 수행하는 식물의 능력을 나타내도록 사용된다. 본 발명의 상기 측면에서, 예를 들어, 삼투적 활성 용질의 생합성을 코딩하는 유전자의 발현은 가뭄에 대한 보호를 부여할 수 있음이 제안된다. 상기 클래스의 유전자 내에 만니톨 데히드로게나제 (Lee 및 Saier, 1982) 및 트레할로스-6-포스페이트 합성효소 (Kaasen 1992)를 코딩하는 DNA가 있다. 세포 내에서 천연 포스파타제의 후속적인 작용을 통해 또는 도입 및 특이적 포스파타제의 동시발현에 의해, 이들 도입된 유전자는 각각 만니톨 또는 트레할로스의 축적을 일으킬 것이고, 이들은 모두 스트레스의 효과를 완화시킬 수 있는 보호 화합물로서 잘 증명되었다. 트랜스제닉 담배에서 만니톨 축적은 입증되었고, 예비적인 결과는 높은 수준의 상기 대사산물을 발현하는 식물은 적용된 삼투적 스트레스를 견딜 수 있음을 나타낸다 (Tarczynski 1992).

유사하게, 효소 기능 (예를 들어 알라노핀 또는 프로피온산) 또는 막 완전성 (예를 들어, 알라노핀)을 보호하는데 있어서 다른 대사산물의 효능이 문헌에 보고되었고 (Loomis 1989), 따라서 이들 화합물의 생합성을 코딩하는 유전자의 발현은 만니톨과 유사하거나 그에 보완적인 방식으로 가뭄 저항성을 부여할 수 있다. 삼투적 활성이고/이거나 가뭄 및/또는 건조 동안 일부 직접적 보호 효과를 제공하는 자연 발생하는 대사산물의 다른 예는 당 및 당 유도체, 예를 들어 프럭토스, 에리트리톨 (Coxson 1992), 소르비톨, 둘시톨 (Karsten 1992), 글루코실글리세롤 ([Reed 1984]; [Erdmann 1992]), 수크로스, 스타키오스 ([Koster & Leopold 1988]; [Blackman 1992]), 오노니톨 및 피니톨 (Vernon & Bohnert 1992), 및 라피노스 (Bernal-Lugo & Leopold 1992)를 포함한다. 당이 아닌 다른 삼투적 활성 용질은 프롤린 및 글라이신-베타인을 포함하고 이로 제한되지 않는다 (Wyn-Jones and Storey, 1981). 스트레스의 시간 동안 계속된 캐노피 (canopy) 성장 및 증가된 생식 적합성 (fitness)은 하나의 예시적인 실시태양에서 효소 미오이노시톨 O-메틸트랜스퍼라제에 의해 나타나는 바와 같이, 상기 논의된 삼투적 활성 화합물 및 다른 그러한 화합물을 제어하는 것과 같은 유전자의 도입 및 발현에 의해 증대될 수 있다.

특이적 단백질의 발현은 또한 가뭄 내성을 증가시킬 수 있는 것으로 고려된다. 3개의 클래스의 후기 배발생 단백질 (Late Embryogenic Protein)이 구조적 유사성에 기초하여 배정되었다 ([Dure 1989] 참조). 3개의 모든 클래스의 이들 단백질은 종자를 숙성시키는데 (즉, 건조시키는데) 나타났다. 이들 3 종류의 단백질 내에서, 타입-II (데히드린형)은 일반적으로 영양 식물 부분에서 가뭄 및/또는 건조 내성에 관련되었다 (예를 들어 [Mundy and Chua, 1988]; [Piatkowski 1990]; [Yamaguchi-Shinozaki 1992]). 최근에, 담배에서 타입-III LEA (HVA-1)의 발현이 식물 키, 성숙 및 가뭄 내성에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다 (Fitzpatrick, 1993). 따라서, 3개의 군 모두로부터 구조 유전자의 발현은 가뭄 내성을 부여할 수 있다. 물 스트레스 동안 유도된 다른 종류의 단백질은 티올 프로테아제, 알도라제 및 막관통 수송제를 포함하고 (Guerrero 1990), 이들을 가뭄 스트레스 동안 다양한 보호 및/또는 복구형 기능을 부여할 수 있다. 지질 생합성 및 따라서 막 조성에 영향을 미치는 유전자의 발현이 또한 식물에 가뭄 저항성을 부여하는데 유용할 수 있다.

가뭄 저항성을 개선하는 많은 유전자는 상보성 작용 방식을 갖는다. 따라서, 이들 유전자의 조합은 옥수수에서 가뭄 저항성을 개선하는데 있어서 상가적 및/또는 상승적 효과를 가질 수 있을 것이다. 많은 이들 유전자는 또한 냉동 내성 (또는 저항성)을 개선하며; 냉동 및 가뭄 동안 초래된 물리적인 스트레스는 성질이 유사하고, 유사한 방식으로 완화될 수 있다. 이들 유전자의 구성적 발현 또는 조직-특이적 발현을 통해 이익일 부여될 수 있지만, 이들 신규한 유전자를 발현하는 바람직한 수단은 팽압-유도된 프로모터 (예를 들어, 문헌 ([Guerrero et al. 1990] 및 [Shagan 1993])에 기재된 팽압-유도된 유전자용 프로모터)의 사용을 통한 것일 수 있다. 이들 유전자의 공간적 및 시간적 발현 패턴으로 인해 옥수수는 스트레스를 더 잘 견딜 수 있다.

건조하는 토양으로부터 증가된 물 추출을 허용하는 특이적 형태학적 형질과 관련되는 유전자의 발현이 유익할 수 있다. 예를 들어, 뿌리 특성을 변경시키는 유전자의 도입 및 발현이 물 흡수를 향상시킬 수 있다. 스트레스 시간 동안 생식 적합성을 향상시키는 유전자의 발현이 유의하게 유용할 것이다. 예를 들어, 화분 날림과 암꽃 부분, 즉, 수염의 수용의 동시성을 개선하는 DNA의 발현이 유익할 것이다. 또한, 스트레스 시간 동안 종실 이단을 최소화하는 유전자의 발현은 수확될 곡물의 양을 증가시키고, 따라서 유용할 것이다. 적절한 조절 서열을 사용하는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 유전자의 도입 및 발현에 의한 외떡잎식물, 예를 들어 옥수수에서 시토키닌 수준의 조절은 외떡잎식물 스트레스 저항성 및 수확량을 개선할 수 있다 (Gan 1995).

수확량을 결정하는데 있어서 물의 전체적인 역할을 감안하면, 신규한 유전자의 도입 및 발현을 통해 식물이 물을 보다 효율적으로 활용할 수 있도록 하면 토양수 이용가능성이 제한될 때에도 전체 성능을 개선할 것으로 고려된다. 물 이용가능성에 관련하는 전체 범위의 스트레스에 걸쳐 물 사용을 최대화하는 식물의 능력을 개선하는 유전자를 도입함으로써, 수확량 안정성 또는 수확 성능의 일관성이 실현될 수 있다.

가뭄, 열 또는 냉각과 같은 비생물적 스트레스 인자에 대한 식물의 개선된 보호는 예를 들어 미옥소세팔루스 스코르피우스 (Myoxocephalus Scorpius) (WO 00/00512), 미옥소세팔루스 옥토데셈스피노수스 (M. octodecemspinosus)로부터의 항동결 폴리펩티드, 아라비돕시스 탈리아나 전사 활성인자 CBF1, 글루타메이트 데히드로게나제 (WO 97/12983, WO 98/11240), 칼슘-의존 단백질 키나제 유전자 (WO 98/26045), 칼시네우린 (WO 99/05902), 효모 유래의 카제인 키나제 (WO 02/052012), 파르네실트랜스퍼라제 (WO 99/06580; [Pei ZM et al. 1998]), 페리틴 (Deak M et al. 1999), 옥살레이트 옥시다제 (WO 99/04013; [Dunwell JM 1998]), DREB1A 인자 ("탈수 반응 요소 B 1A"; [Kasuga M et al. 1999]), 만니톨 또는 트레할로스 합성의 유전자, 예를 들어 트레할로스-포스페이트 합성효소 또는 트레할로스-포스페이트 포스파타제 (WO 97/42326)를 과다발현시킴으로써, 또는 트레할라제 (WO 97/50561)와 같은 유전자를 억제함으로써 또한 달성할 수 있다.

키메라 전사 조절 서열에 대한 하나의 용도는 발아 동안 저온 손상으로부터 배를 보호하기 위한 것이다. 하나의 중요한 인자는 산화적 손상이다. 수퍼-프로모터는 즉, 카탈라제, 아스코르베이트 페록시다제, 수퍼옥시드 디스뮤타제 등을 가동시킬 수 있다. 저온은 또한 단단한 막을 통해 COX 효소 활성을 해친다. 가뭄-스트레스에 대해, 글루타민 합성효소 및 글라이신 베타인 합성효소의 발현이 유익할 수 있다.

2.2.1.3 질병 저항성 및 내성

식물 내로 유전자의 도입을 통해 질병에 대한 증가된 저항성이 실현될 수 있는 것으로 제안되었다. 바이러스, 세균, 진균, 뿌리 병원체, 곤충 및 선충에 의해 유발된 질병에 대해 저항성을 생성하는 것이 가능하다. 진균독소 생산 유기체의 제어가 도입된 유전자의 발현을 통해 실현될 수 있는 것이 또한 고려된다.

바이러스에 대한 저항성은 신규한 유전자의 발현을 통해 생성될 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 식물에서 바이러스 코트 단백질의 발현이 해당 바이러스 및 아마도 다른 밀접하게 관련된 바이러스에 의한 식물의 감염에 대해 저항성을 부여할 수 있음이 입증되었다 ([Cuozzo 1988], [Hemenway 1988], [Abel 1986]). 필수적인 바이러스 기능을 표적으로 하는 안티센스 유전자의 발현은 상기 바이러스에 대한 저항성을 부여할 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 바이러스 핵산의 복제를 담당하는 유전자를 표적으로 하는 안티센스 유전자는 상기 복제를 억제하여 바이러스에 대한 저항성을 생성할 수 있다. 안티센스 유전자의 사용을 통해 다른 바이러스 기능을 간섭하면 바이러스에 대한 저항성을 또한 증가시킬 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 비제한적으로 위성 바이러스의 사용을 포함한 다른 방안을 통해 바이러스에 대한 저항성을 달성하는 것이 가능할 수 있음이 제안된다.

신규한 유전자의 도입을 통해 세균 및 진균에 의해 유발된 질병에 대한 증가된 저항성이 실현될 수 있는 것으로 제안된다. 소위 "펩티드 항생제", 발병 기전 관련 (PR) 단백질, 독소 저항성, 및 형태학적 특성과 같은 숙주-병원체 상호작용에 영향을 미치는 단백질을 코딩하는 유전자가 유용할 것으로 고려된다. 펩티드 항생제는 세균 및 다른 미생물의 성장에 억제성인 폴리펩티드 서열이다. 예를 들어, 세크로핀 및 마게이닌으로 언급되는 펩티드의 클래스가 많은 종의 세균 및 진균의 성장을 억제한다. 식물에서 PR 단백질의 발현은 세균성 질병에 대한 저항성을 부여하는데 유용할 수 있음이 제안된다. 이들 유전자는 숙주 식물에 대한 병원체 공격 후에 유도되고, 적어도 5개 클래스의 단백질로 나누어진다 (Bol 1990). PR 단백질 중에는 베타-1,3-글루카나제, 키티나제 및 오스모틴, 및 질병 유기체에 대해 저항성인 식물에서 기능하는 것으로 생각되는 다른 단백질이 포함된다. 항진균 특성을 갖는 다른 유전자, 예를 들어, UDA (쐐기풀 렉틴) 및 헤베인이 확인되었다 ([Broakgert 1989]; [Barkai-Golan 1978]). 특정 식물 질병은 식물독소의 생산에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. 이들 질병에 대한 저항성은 식물독소를 분해하거나 불활성화할 수 있는 효소를 코딩하는 신규한 유전자의 발현을 통해 달성될 수 있다. 숙주 식물과 병원체 사이의 상호작용을 변경시키는 신규한 유전자의 발현이 숙주 식물의 조직에 침입하는 질병 유기체의 능력을 감소시키는데, 예를 들어, 잎 큐티클의 왁스성 (waxiness)의 증가 또는 다른 형태학적 특성을 위해 유용할 수 있다.

식물 기생성 선충은 많은 식물에서 질병의 원인이다. 신규한 유전자의 발현을 통해 식물을 이들 유기체에 대해 저항성으로 만드는 것이 가능할 것으로 제안된다. 선충 침입의 제어는 숙주 식물을 인식하거나 부착하는 선충의 능력을 변경함으로써 및/또는 식물이 비제한적으로 단백질을 포함한 살선충 화합물을 생산하도록 함으로써 달성될 것으로 예상된다.

또한, 진균, 곤충, 선충 및 질병에 대한 저항성은 특정 대사산물 또는 단백질의 표적화된 축적에 의해 달성될 수 있다. 그러한 단백질은 글루코시놀레이트 (초식동물에 대한 방어), 키티나제 또는 글루카나제, 및 기생충의 세포벽을 파괴하는 다른 효소, 리보좀-불활성화 단백질 (RIP) 및 식물이 상처가 생기거나 미생물에 의해 공격받을 때, 또는 예를 들어, 살리실산, 자스몬산 또는 에틸렌에 의해 화학적으로 유도되는 식물 저항성 및 스트레스 반응의 다른 단백질, 또는 비식물 공급원으로부터의 리소자임, 예를 들어, T4-리소자임, 또는 다양한 포유동물로부터의 리소자임, 살충 단백질, 예를 들어 바실러스 투링기엔시스 내독소, 알파-아밀라제 억제제 또는 프로테아제 억제제 (광저기 트립신 억제제), 렉틴, 예를 들어 밀 눈 응집소, RNAse 또는 리보자임을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 추가의 예는 트리코더마 하르지아눔 (Trichoderma harzianum) chit42 엔도키티나제 (GenBank 기탁 번호: S78423) 또는 소르검 비콜라로부터의 N-히드록실화 다기능성 시토크롬 P-450 (CYP79) 단백질 (GenBank 기탁 번호: U32624), 또는 이들의 기능적 동등물을 코딩하는 핵산이다. 해충으로부터의 보호로서 글루코시놀레이트의 축적 ([Rask L et al. 2000]; [Menard R et al. 1999]), 바실러스 투링기엔시스 내독소의 발현 (Vaeck et al. 1987) 또는 예를 들어 콩으로부터 키티나제의 발현에 의해 진균에 의한 공격에 대한 보호 (Broglie et al. 1991)가 유리하다. 벼 식물에서 예를 들어, 벼 해충 벼멸구 (Nilaparvata lugens)와 같은 해충에 대한 저항성은 스노드롭 (갈란터스 니발리스 (Galanthus nivalis)) 렉틴 응집소를 발현시킴으로써 (Rao et al. 1998) 달성할 수 있다. 나비목-특이적 바실러스 투링기엔시스 D-내독소를 코딩하는 합성 CryIA(b) 및 CryIA(c) 유전자의 발현은 각종 식물에서 곤충 해충에 대한 저항성을 야기할 수 있다 (Goyal RK et al. 2000). 병원체 방어에 적합한 추가의 유전자는 "폴리갈락투로나제-억제 단백질" (PGIP), 타우마틴, 인버타제 및 항미생물 펩티드, 예를 들어 락토페린을 포함한다 (Lee TJ et al. 2002). 본 발명에서 유리하게 사용될 수 있는 다른 핵산 서열은 곤충 제어 (미국 특허 6,063,597; 6,063,756; 6,093,695; 5,942,664; 및 6,110,464), 진균 질병 저항성 (미국 특허 5,516,671; 5,773,696; 6,121,436; 6,316,407; 및 6,506,962), 바이러스 저항성 (미국 특허 5,304,730 및 6,013,864), 선충 저항성 (US 6,228,992), 및 세균 질병 저항성 (US 5,516,671)을 위한 형질을 포함한다.

발현시킬 이종성 핵산 서열은 스트레스-관련 폴리펩티드 (또는 그의 일부; 바람직하게는 적어도 5개, 보다 바람직하게는 적어도 10개, 가장 바람직하게는 적어도 30개의 연속적 아미노산의 일부)를 코딩할 수 있다. 바람직한 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 상기 기재되어 있다.

2.2.2 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질

키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 형질전환된 외떡잎 식물에 종자 또는 새싹의 증가된 (또는 향상된) 영양적 품질을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 다른 실시태양은

A) 식물 내로

i) a) 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드;

b) 서열 1의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70% 또는 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드; 및

c) 2XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 가장 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군 중에서 선택된 제1 핵산 분자, 및 이에 작동가능하게 연결된

ii) a) 서열 3에 정의된 폴리뉴클레오티드;

b) 서열 3의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70% 또는 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드; 및

c) 2XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 가장 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 3에 제시된 서열의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군 중에서 선택된 제2 핵산 분자를 포함하는 식물 전사 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및

상기 전사 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, 상기 제1 또는 제2 핵산 서열에 대하여 이종성이고 식물 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질 및/또는 오일 함량을 부여하기에 적합한 적어도 하나의 핵산

을 포함하는 발현 구성체를 도입하는 단계, 및

B) 트랜스제닉 식물을 선택하는 단계

영양적 품질 및/또는 오일 함량은 비타민, 카로티노이드, 항산화제, 불포화 지방산 및 다가-불포화 지방산으로 이루어지는 군 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물의 증가된 함량을 포함할 수 있다. (예를 들어, 센스, 안티센스 또는 이중가닥 RNA로서) 발현시킬 이종성 핵산 서열은 아래에 설명된 바와 같은 형질-관련 폴리펩티드 (또는 그의 일부; 바람직하게는 적어도 5개, 보다 바람직하게는 적어도 10개, 가장 바람직하게는 적어도 30개의 연속적 아미노산의 일부), 또는 임의의 상기 폴리펩티드과 동일한 표현형을 야기할 수 있는 그의 기능적 동등물을 코딩할 수 있다. 바람직한 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 상기한 바와 같다.

영양적 품질 및 발현시킬 상응하는 이종성 핵산 서열은 본원에서 아래에 정의되어 있다. 바람직한 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 상기 설명되고, 수퍼-프로모터가 가장 바람직하다. 본 발명의 방법이 바람직하게 적용되는 외떡잎 식물은 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 호밀, 사탕수수, 호밀풀 또는 율무로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 식물은 옥수수, 밀, 보리, 벼, 귀리, 호밀 및 사탕수수로 이루어지는 군 중에서 선택된 곡식 식물이고, 훨씬 더 바람직하게는 옥수수, 밀 및 벼이고, 가장 바람직하게는 식물은 옥수수 식물이다.

증가된 영양적 품질은 예를 들어 하나 이상의 다음 특성을 야기할 수 있다: 식물에서 지방산 조성의 변화, 식물의 아미노산 함량의 변경, 식물 대사산물의 농도의 증가.

유전자는 곡식이 주로 재배되는 곡물을 개선하기 위해 외떡잎 식물, 특히 옥수수, 밀 또는 벼와 같은 상업적으로 중요한 곡식 내로 도입될 수 있다. 상기 방식으로 생산된 광범위한 신규한 트랜스제닉 식물은 곡물의 특정 최종 용도에 따라 계획될 수 있다.

예를 들어, 옥수수 곡물의 가장 큰 용도는 사료 또는 식품이다. 곡물의 조성을 변경하는 유전자의 도입은 사료 또는 식품 가치를 크게 향상시킬 수 있다. 옥수수 곡물의 주요 성분은 전분, 단백질 및 오일이다. 옥수수 곡물의 각각의 이들 주요 성분은 그의 수준 또는 조성을 변경함으로써 개선될 수 있다. 예시의 목적으로 몇몇 예가 언급될 수 있지만, 가능성의 총망라한 목록을 제공하지 않는다.

많은 곡식 곡물의 단백질은 특히 돼지, 가금류 및 인간에게 공급될 때 사료 및 식품 목적을 위한 최적량 미만으로 존재한다. 단백질은 이들 종의 먹이에 필수적인 몇몇 아미노산이 결여되어, 곡물에 보충물의 첨가를 필요로 한다. 제한적인 필수 아미노산은 라이신, 메티오닌, 트립토판, 트레오닌, 발린, 아르기닌 및 히스티딘을 포함할 수 있다. 일부 아미노산은 곡물이 사료 제형에 다른 투입물을 보충된 후에만 제한적으로 된다. 예를 들어, 곡물이 라이신 요건을 만족하기 위해 대두 가루 (soybean meal)로 보충될 때, 메티오닌이 제한적으로 된다. 종자 및 곡물에서 이들 필수 아미노산의 수준은 비제한적으로 아미노산의 생합성을 증가시키거나, 아미노산의 분해를 감소시키거나, 단백질로 아미노산의 저장을 증가시키거나, 종자 또는 곡물로 아미노산의 전달을 증가시키는 유전자의 도입을 포함한 메카니즘에 의해 상승시킬 수 있다.

아미노산의 생합성을 증가시키는 하나의 메카니즘은 식물이 생산되는 수준을 더 이상 적절하게 제어할 수 없도록 아미노산 생합성 경로를 탈조절시키는 유전자를 도입하는 것이다. 이는 경로의 아미노산 최종 산물의 수준에 의해 정상적으로 조절되는 아미노산 생합성 경로의 단계들을 탈조절하거나 우회함으로써 이루어질 수 있다. 그 예는 라이신 및 트레오닌 생산을 증가시키기 위해 효소 아스파르토키나제 또는 디히드로디피콜린산 (DHDP)-합성효소, 및 트립토판 생산을 증가시키기 위해 안트라닐레이트 합성효소의 탈조절된 버전을 코딩하는 유전자의 도입을 포함한다. 아미노산의 이화작용 (catabolism)의 감소는 효소 라이신-케토글루타레이트 리덕타제와 같은 이화 경로에서 단계를 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 감소 또는 제거하는 DNA 서열의 도입에 의해 달성할 수 있다.

곡물의 단백질 조성은 천연 단백질의 발현을 상승시키거나, 불량한 조성을 갖는 것의 발현을 감소시키거나, 천연 단백질의 조성을 변화시키거나, 우월한 조성을 갖는 전적으로 새로운 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하는 것을 포함한 다양한 방식으로 아미노산의 균형을 개선하도록 변경될 수 있다. 제인 패밀리의 저장 단백질의 멤버의 발현을 감소시키는 DNA가 도입될 수 있다. 상기 DNA는 리보자임, 또는 제인 단백질의 발현 또는 오페이크 (opaque)-2 유전자 산물과 같은 제인 발현의 조절인자의 발현을 손상시키도록 생성된 안티센스 서열을 코딩할 수 있다. 곡물의 단백질 조성은 동시 억제의 현상, 즉, 형질전환을 통해 도입된 동일한 구조 유전자 또는 유전자 단편의 발현을 통한 내인성 유전자의 발현의 억제를 통해 변형될 수 있다 (Goring 1991). 추가로, 도입된 DNA는 제인을 분해하는 효소를 코딩할 수 있다. 달성될 수 있는 제인 발현의 감소에는 보다 바람직한 아미노산 조성을 갖는 단백질의 증가 또는 전분과 같은 다른 주요 종자 성분의 증가가 동반될 수 있다. 별법으로, 글로불린 단백질 중 하나 또는 옥수수의 10 kD 제인에 대한 것과 같은 적절한 아미노산 조성의 천연 단백질에 대한 코딩 서열, 및 프로모터 또는 상기 단백질의 발현을 상승시키기 위해 설계된 다른 조절 서열을 포함하는 키메라 유전자가 도입될 수 있다. 상기 유전자의 코딩 서열은 필수 아미노산에 대한 추가의 또는 대체 코돈을 포함할 수 있다. 또한, 다른 종으로부터 얻은 코딩 서열, 또는 종자의 아미노산 조성을 향상시키도록 설계된 완전한 특유의 펩티드 서열을 코딩하는 부분적 또는 완전한 합성 서열을 사용할 수 있다.

곡물의 오일 함량을 변경시키는 유전자의 도입이 유용할 수 있다. 오일 함량의 증가는 사료 및 식품에 사용하기 위한 종자의 대사가능한 에너지 함량 및 밀도를 증가시킬 수 있다. 도입된 유전자는 지방산 또는 지질 생합성에서 속도-제한 또는 조절 단계를 제거하거나 감소시키는 효소를 코딩할 수 있다. 그러한 유전자는 아세틸-CoA 카르복실라제, ACP-아실트랜스퍼라제, 베타-케토아실-ACP 합성효소 + 다른 잘 공지된 지방산 생합성 활성을 코딩하는 것을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 다른 가능성은 아실 운반 단백질과 같은 효소 활성을 갖지 않는 단백질을 코딩하는 유전자이다. 추가의 예는 2-아세틸트랜스퍼라제, 올레오신 피루베이트 데히드로게나제 복합체, 아세틸 CoA 합성효소, ATP 시트레이트 리아제, ADP-글루코스 피로포스포릴라제, 및 카르니틴-CoA-아세틸-CoA 셔틀의 유전자를 포함한다. 오일 생합성에 관련된 유전자의 발현은 색소체 통과 펩티드 서열을 사용하여 색소체에 표적화되고 바람직하게는 종자 배에서 발현될 것으로 예상된다. 보다 건강하거나 영양성인 사료를 제공하는 오일 내에 존재하는 지방산의 균형을 변경시키는 유전자가 도입될 수 있다. 도입된 DNA는 또한 아래 설명된 것과 같이 지방산 생합성에 관여된 효소의 발현을 차단하여, 곡물 내에 존재하는 지방산의 비율을 변경시키는 서열을 코딩할 수 있다.

예를 들어 분지 정도를 증가시켜, 그의 대사를 지연시킴으로써 소에서 전분의 활용을 개선함으로써 곡물의 전분 성분의 영양 가치를 향상시키는 유전자가 도입될 수 있다.

곡물의 주요 성분에 영향을 미치는 것 외에, 다양한 다른 영양분, 처리, 또는 사료 또는 식품에 사용될 때 곡물의 다른 품질 측면에 영향을 미치는 유전자가 도입될 수 있다. 예를 들어, 곡물의 색소 형성이 증가되거나 감소될 수 있다. 일부 동물 사료에서 황색 색소 형성의 향상 및 안정성이 바람직하고, 이는 그들의 생산에서 속도-제한 단계를 제거함으로써 크산토필 및 카로텐의 생산을 향상시키는 유전자의 도입에 의해 달성할 수 있다. 그러한 유전자는 변경된 형태의 효소 피토엔 합성효소, 피토엔 탈포화효소, 또는 라이코펜 합성효소를 코딩할 수 있다. 별법으로, 많은 식품 제품의 생산을 위해 무색소의 백색 옥수수가 바람직하고, 이는 색소 생산 경로에서 단계를 차단하거나 제거하는 DNA의 도입에 의해 생산할 수 있다.

일부 곡식 곡물을 포함하는 사료 또는 식품은 불충분한 양의 비타민을 갖고, 적절한 영양 가치를 제고하기 위해서는 보충되어야 한다. 예를 들어, 비타민s A, E, B₁₂, 콜린 등을 포함한, 종자에서 비타민 생합성을 향상시키는 유전자의 도입이 계획될 수 있다. 예를 들어, 옥수수 곡물은 또한 최적 영양 가치에 대해 충분한 무기질 함량을 갖지 않는다. 특히 인, 황, 칼슘, 망간, 아연, 및 철을 함유하는 화합물의 축적 또는 이용가능성에 영향을 미치는 유전자가 유용할 것이다. 그 예는 피트산 (phytic acid) 생산을 감소시키거나 피트산 붕괴를 향상시키는 효소 피타제 (phytase)를 코딩하는 유전자의 도입일 수 있다. 이들 유전자는 먹이에서 이용가능한 포스페이트의 수준을 증가시켜, 무기질 포스페이트를 보충해야 하는 필요를 감소시킬 것이다.

사료 및 식품 목적을 위한 곡식의 개선의 수많은 다른 예가 설명될 수도 있다. 개선은 반드시 곡물을 포함하지 않을 수 있고, 예를 들어, 가축사료용 곡물의 가치를 개선할 수 있다. 이를 달성하기 위한 DNA의 도입은 가축을 위한 우수한 사료 가치와 연관된 "갈색 주맥 (brown midrib)" 표현형을 생성시키는 것과 같은 리그닌 생산을 변경시키는 서열을 포함할 수도 있다.

사료 또는 식품 가치에서 직접적인 개선에 추가로, 곡물의 처리를 개선하고 처리로부터 생성되는 산물의 가치를 개선하는 유전자가 또한 도입될 수 있다. 옥수수와 같은 특정 곡물을 처리하는 1차 방법은 습식제분 (wetmilling)을 통한 것이다. 옥수수는 수침 (steeping) 시간을 감소시킴으로써 처리의 효율을 증가시키고 비용을 감소시키는 신규한 유전자의 발현을 통해 개선될 수 있다.

습식제분 산물의 가치를 개선하는 것은 전분, 오일, 옥수수 글루텐 가루, 또는 옥수수 글루텐 사료의 성분의 양 또는 품질을 변경시키는 것을 포함할 수 있다. 전분의 상승은 전분 생합성에서 속도 제한 단계의 확인 및 제거를 통해, 또는 곡물의 다른 성분의 수준을 감소시켜 전분의 비율을 증가시킴으로써 달성할 수 있다. 전자의 예는 변경된 조절 활성을 갖거나 보다 높은 수준으로 발현되는 ADP-글루코스 피로포스포릴라제 효소를 코딩하는 유전자의 도입일 수 있다. 후자의 예는 예를 들어, 종실 발달의 보다 후기 단계 동안 발현된 단백질 또는 오일 생합성의 선택적 억제제를 포함한다.

오일은 옥수수 및 다른 곡물의 습식제분의 또다른 산물이고, 그의 가치는 유전자의 도입 및 발현에 의해 개선될 수 있다. 습식제분에 의해 추출될 수 있는 오일의 양은 상기 사료 및 식품에 대해 설명된 바와 같은 방안에 의해 상승될 수 있다. 오일 특성은 또한 요리용 오일, 쇼트닝, 윤활유 또는 다른 오일-유래 산물의 생산 및 사용에서 그의 성능을 개선하도록 또는 식품-관련 용도로 사용될 때 그의 건강 속성의 개선을 위해 변경될 수 있다. 추출 시에 화학 합성을 위한 출발 물질로서 역할을 할 수 있는 신규한 지방산이 또한 합성될 수 있다. 오일 특성의 변화는 오일 내에 존재하는 지방산의 종류, 수준 또는 지질 배열을 변경함으로써 달성할 수 있다. 이는 다시 신규한 지방산 및 이들을 갖는 지질의 합성을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자의 첨가에 의해 또는 가능하게는 전구체의 수준을 감소시키면서 천연 지방산의 수준을 증가시킴으로써 달성할 수 있다. 별법으로, 지방산 생합성에서 단계를 느리게 하거나 차단하여 전구체 지방산 중간체를 증가시키는 DNA 서열이 도입될 수 있다. 첨가될 수 있는 유전자는 탈포화효소, 에폭시다제, 수화효소, 탈수효소, 및 지방산 중간체를 포함하는 반응을 촉매하는 다른 효소를 포함한다. 차단시킬 수 있는 촉매 단계의 대표적인 예는 각각 스테아르산 및 올레인산을 축적시키는 스테아르산으로부터 올레인산으로 및 올레인산으로부터 리놀렌산으로의 탈포화를 포함한다.

다른 주요 곡식 습식제분 산물, 글루텐 가루 및 글루텐 사료에서의 개선은 또한 신규한 식물을 얻기 위해 유전자의 도입에 의해 달성할 수 있다. 대표적인 가능성은 식품 및 사료 가치의 개선에 대해 상기 설명된 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

또한, 식물은 이전에는 식물에서 전혀 생산되지 않거나 동일한 수준으로 생산되지 않은 유용한 생물학적 화합물의 생산 또는 제조를 위해 사용되는 것으로 추가로 고려될 수 있다. 이들 화합물을 생산하는 신규한 식물은 형질전환 방법에 의한 유전자의 도입 및 발현에 의해 가능해진다. 가능성은 단백질, 핵산, 1차 및 중간 대사산물, 탄수화물 중합체 등과 같은 임의의 유기체에 의해 현재 생산되는 임의의 생물학적 화합물을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 화합물은 식물에 의해 생산되고, 수확 시에 추출되고/되거나 처리되고, 임의의 현재 인정되는 유용한 목적, 예를 들어 일부 예로서 약품, 향료, 산업용 효소로 사용될 수 있다.

트랜스제닉 식물에서 도입된 유전자에 의해 잠재적으로 코딩되는 곡물 형질 또는 특성의 범위를 예시하는 추가의 가능성은 감마-제인 합성을 향상시키는 유전자의 도입을 통한 수출 목적을 위해 파손 감수성이 더 적은, 또는 건식 제분에 의해 처리될 때 그릿 (grit) 크기가 보다 큰 곡물, 과피 두께를 증가시키는 유전자를 통해 터짐, 품질 및 팽창 부피가 개선된 팝콘, 색소 생산 경로에 관여된 효소의 발현을 효과적으로 차단하는 유전자의 도입을 통해 식품 용도를 위한 보다 백색의 곡물을 갖는 옥수수, 및 스위트콘에 대해 쉬렁큰 유전자 (수크로스 합성효소를 코딩함)과 같이 향미에 영향을 미치는 유전자의 도입을 통해 알콜 음료 또는 스위트콘 (sweet corn)의 개선된 품질을 포함한다.

본 발명의 프로모터 핵산 서열과 조합되고 개선된 최종-산물 형질을 제공할 수 있는 유용한 핵산 서열은 비제한적으로 종자 저장 단백질, 지방산 경로 효소, 토코페롤 생합성 효소, 아미노산 생합성 효소, 및 전분 분지 효소를 코딩하는 것을 포함한다. 식물 표현형의 변형을 위해 유용한 예시적인 이종성 DNA에 관한 논의는 예를 들어 각각 그 전문이 본원에 참고로 구체적으로 포함된 미국 특허 6,194,636; 6,207,879; 6,232,526; 6,426,446; 6,429,357; 6,433,252; 6,437,217; 6,515,201; 및 6,583,338과 WO 02/057471에 기재되어 있다. 그러한 형질은 다음의 것들을 포함하지만 이로 제한되지 않는다:

- 식품 및 사료 부문에서 사용하기 위한 대사 효소, 예를 들어 피타제 및 셀룰라제의 발현. 핵산, 예를 들어 미생물 피타제를 코딩하는 인공 cDNA (GenBank 기탁 번호 A19451) 또는 그의 기능적 동등물이 특히 바람직하다.

- 정밀 화학물질, 예를 들어 토코페롤, 토코트리에놀 또는 카로테노이드의 축적을 야기하는 유전자의 발현. 언급할 수 있는 예는 피토엔 탈포화효소이다. 나르시수스 슈도나르시수스 (Narcissus pseudonarcissus) 피토엔 탈포화효소를 코딩하는 핵산 (GenBank 기탁 번호 X78815) 또는 그의 기능적 동등물이 바람직하다. 바람직한 토코페롤 생합성 효소는 tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGPPS, HPPD, GMT, MT1, tMT2, AANT1, sir 1737, 및 호모젠티스산 디옥시게나제에 대한 안티센스 구성체를 포함한다 (모두 본원에 참고로 포함된 문헌 [Kridl et al. (1991)]; [Keegstra (1989)]; [Nawrath et al. (1994)]; [Xia et al. (1992)]; [Lois et al. (1998)]; [Takahashi et al. (1998)]; [Norris et al. (1998)]; [Bartley and Scolnik (1994)]; [Smith et al. (1997)]; WO 00/32757; WO 00/10380; [Saint Guily et al. (1992)]; [Sato et al. (2000)] 참고).

- 전분 생산 (미국 특허 5,750,876 및 6,476,295), 높은 단백질 생산 (US 6,380,466), 과실 성숙 (US 5,512,466), 향상된 동물 및 인간 영양 (미국 특허 5,985,605 및 6,171,640), 생체중합체 (US 5,958,745 및 미국 특허 공개 2003/0028917), 환경 스트레스 저항성 (US 6,072,103), 제약 펩티드 (US 6,080,560), 개선된 처리 형질 (US 6,476,295), 개선된 소화성 (US 6,531,648), 적은 라피노스 (US 6,166,292), 산업적 효소 생산 (US 5,543,576), 개선된 향미 (US 6,011,199), 질소 고정 (US 5,229,114), 하이브리드 종자 생산 (US 5,689,041), 및 바이오 연료 생산 (US 5,998,700), 상기 나열된 특허에 기재된 유전적 요소 및 트랜스젠은 본원에 참고로 포함된다. 바람직한 전분 분지 효소 (전분 특성의 변형을 위해)는 모두 본원에 참고로 포함된 미국 특허 6,232,122 및 6,147,279; 및 WO 97/22703에 기재된 것을 포함한다.

- 변형된 오일류 생산 (US 6,444,876), 높은 오일 생산 (미국 특허 5,608,149 및 6,476,295), 또는 변형된 지방산 함량 (US 6,537,750). 바람직한 지방산 경로 효소는 티오에스테라제 (미국 특허 5,512,482; 5,530,186; 5,945,585; 5,639,790; 5,807,893; 5,955,650; 5,955,329; 5,759,829; 5,147,792; 5,304,481; 5,298,421; 5,344,771; 및 5,760,206), 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (미국 특허 공개 20030115632A1 및 20030028923A1), 및 탈포화효소 (미국 특허 5,689,050; 5,663,068; 5,614,393; 5,856,157; 6,117,677; 6,043,411; 6,194,167; 5,705,391; 5,663,068; 5,552,306; 6,075,183; 6,051,754; 5,689,050; 5,789,220; 5,057,419; 5,654,402; 5,659,645; 6,100,091; 5,760,206; 6,172,106; 5,952,544; 5,866,789; 5,443,974; 및 5,093,249)를 포함하고, 상기 문헌은 모두 본원에 참고로 포함된다.

- 바람직한 아미노산 생합성 효소는 안트라닐레이트 합성효소 (US 5,965,727 및 WO 97/26366, WO 99/11800, WO 99/49058), 트립토판 데카르복실라제 (WO 99/06581), 트레오닌 데카르복실라제 (미국 특허 5,534,421 및 5,942,660; WO 95/19442), 트레오닌 데아미나제 (WO 99/02656 및 WO 98/55601), 디히드로디피콜린산 합성효소 (US 5,258,300), 및 아스파르테이트 키나제 (미국 특허 5,367,110; 5,858,749; 및 6,040,160)를 포함하고, 상기 문헌은 모두 본원에 참고로 포함된다.

- 예를 들어, 지방산 연장효소 (elongase) 및/또는 탈포화효소에 발현에 의한 다가불포화 지방산 (예를 들어 아라키돈산, 에이코사펜타엔산 또는 도코사헥사엔산)과 같은 건강 기능식품 (nutraceutical)의 생산, 또는 예를 들어, 고함량의 필수 아미노산 (예를 들어 브라질 넛 (brazil nut)의 고-메티오닌 2S 알부민 유전자)과 같은 영양 가치가 개선된 단백질의 생산. 베르톨레티아 엑스켈사 (Bertholletia excelsa) 고-메티오닌 2S 알부민 (GenBank 기탁 번호 AB044391), 피스코미트렐라 파텐스 (Physcomitrella patens) υ6-아실-지질 탈포화효소 (GenBank 기탁 번호 AJ222980; Girke et al. 1998), 모르티에렐라 알피나 (Mortierella alpina) υ6-탈포화효소 (Sakuradani et al. 1999), 카에노르합디티스 엘레간스 (Caenorhabditis elegans) υ5-탈포화효소 (Michaelson et al. 1998), 카에노르합디티스 엘레간스 υ5-지방산 탈포화효소 (des-5) (GenBank 기탁 번호 AF078796), 모르티에렐라 알피나 υ5-탈포화효소 (Michaelson et al. JBC 273:19055-19059), 카에노르합디티스 엘레간스 υ6-연장효소 (Beaudoin et al. 2000), 피스코미트렐라 파텐스 υ6-연장효소 (Zank et al. 2000), 또는 이들의 기능적 동등물을 코딩하는 핵산이 바람직하다.

- 산업 목적 (예를 들어 리파제와 같은 효소)을 위한 또는 약품 (예를 들어, 문헌 [Hood EE and Jilka JM 1999]에 기재된 바와 같이 항체, 혈액 응고 인자, 인터페론, 림포킨, 콜로니 자극 인자, 플라스미노겐 활성인자, 호르몬 또는 백신)으로서 고-품질 단백질 및 효소의 생산. 예를 들어, 계란 흰자위로부터 재조합 아비딘 및 세균 υ-글루쿠로니다제 (GUS)를 트랜스제닉 옥수수 식물에서 대규모로 생산하는 것이 가능하였다 (Hood et al. 1999).

- 예를 들어 아세틸-CoA 카르복실라제의 발현에 의해 이들 물질의 수확량을 증가시키는 목적으로 정상적으로 보다 적은 저장 단백질 또는 저장 지질을 포함하는 세포에서 증가된 저장성을 얻음. 바람직한 핵산은 메디카고 사티바 (Medicago sativa) 아세틸-CoA 카르복실라제 (ACCase) (GenBank 기탁 번호 L25042), 또는 그의 기능적 동등물을 코딩하는 것이다. 별법으로, 일부 시나리오에서, 증가된 저장 단백질 함량은 고-단백질 산물 생산을 위해 유리할 수 있다. 바람직한 종자 저장 단백질은 제인 (미국 특허 4,886,878; 4,885,357; 5,215,912; 5,589,616; 5,508,468; 5,939,599; 5,633,436; 및 5,990,384; WO 90/01869, WO 91/13993, WO 92/14822, WO 93/08682, WO 94/20628, WO 97/28247, WO 98/26064 및 WO 99/40209), 7S 단백질 (US 5,003,045 및 5,576,203), 브라질 넛 단백질 (US 5,850,024), 페닐알라닌 유리 단백질 (WO 96/17064), 알부민 (WO 97/35023), 베타-콘글리시닌 (WO 00/19839), 11S (US 6,107,051), 알파-호르도티오닌 (US 5,885,802 및 5,885,801), 아르셀린 종자 저장 단백질 (US 5,270,200), 렉틴 (US 6,110,891) 및 글루테닌 (US 5,990,389 및 5,914,450)을 포함하고, 상기 문헌은 모두 본원에 참고로 포함된다.

- 바람직하게는 감자 괴경 내에서 υ-글루칸 L형 괴경 포스포릴라제 (GLTP) 또는 υ-글루칸 H형 괴경 포스포릴라제 (GHTP) 효소 활성의 수준을 감소시킴 (US 5,998,701 참고). 특히 7℃ 미만의 온도에서 저장될 때 감자 괴경 내에서 전분의 당으로의 전환은 감소된 GLTP 또는 GHTP 효소 활성을 보이는 괴경에서 감소된다. 감자에서 저온-감미의 감소는 보다 저온에서 감자 저장을 허용하여, 휴면을 연장시키고, 질병 발생을 감소시키고, 저장 수명을 증가시킨다. 감자 괴경 내에서 GLTP 또는 GHTP 활성의 감소는 상동성 안티센스 또는 이중가닥 RNA를 사용하는 유전자 발현의 억제, 동시 억제, 조절 침묵 서열의 사용과 같은 기술에 의해 달성할 수 있다. 저온-저장 특성이 개선된 감자 식물은 υυ글루칸 L형 괴경 포스포릴라제 (GLTP) 및 υ-글루칸 H형 포스포릴라제 (GHTP)로 이루어진 군 중에서 선택된 υ-글루칸 포스포릴라제를 코딩하는 유전자의 적어도 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 TPT 프로모터 서열을 갖는 발현 카세트로 형질전환된 감자 식물을 포함한다.

유리한 유전자의 추가의 예는 예를 들어 문헌 [Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; pages 487-96]에 언급되어 있다. 식물 표현형의 변형에 유용한 예시적인 이종성 DNA에 관한 논의는 예를 들어 US 6,194,636에서 찾을 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 전분성-배유 및/또는 발아하는 배-특이적 또는 -우선적인 발현을 갖는 프로모터가 예를 들어 아미노산 이화 효소를 억제하기 위해 유전자 억제 DNA 요소를 구동시키는 DNA 구성체를 제공한다.

종자 성숙 또는 곡물 발달은, 대사가능한 식품 비축물 (예를 들어, 단백질, 지질, 전분 등)이 발달하는 종자, 특히 종자의 저장 기관, 예를 들어 배유, 종피, 호분층, 배, 및 배반 상피 내에 퇴적되어 종자의 확대 및 충전을 일으키는, 수정과 함께 시작하고 종자 건조와 함께 끝나는 기간을 나타낸다.

본 발명의 배-특이적 프로모터는 수확량 감소, 및 식물에서 트랜스제닉 단백질 또는 다른 분자의 고-수준의 비-유도가능한 구성적 발현에 의해 겪게 될 수 있는 옥수수 성장 및 발달에 대한 다른 잠재적인 불리한 생리학적 효과를 최소화하는데 유용할 수 있다. 각각의 트랜스젠이 본 발명의 프로모터에 융합될 때, DNA 서열 상동성 의존성 트랜스젠 불활성화 (동시 억제)의 위험이 최소화될 수 있다.

세포 내에서 DNA 자체를 표적화하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 핵에 도입된 DNA를 표적화하는 것이 유용할 수 있고, 이는 형질전환의 빈도를 증가시킬 수 있기 때문이다. 핵 자체 내에서, 부위 특이적 통합을 달성하기 위해 유전자를 표적화하는 것이 유용할 것이다. 예를 들어, 형질전환을 통해 도입된 유전자가 세포 내의 기존의 유전자를 대체하도록 하는 것이 유용할 것이다. 다른 요소는 내인성 또는 외인성 물질에 의해, 예를 들어, 징크 핑거 (zinc finger) 단백질, 예를 들어 자연 발생하는 징크 핑거 단백질 또는 키메라 징크 핑거 단백질 (예를 들어, US 5,789,538, WO 99/48909; WO 99/45132; WO 98/53060; WO 98/53057; WO 98/53058; WO 00/23464; WO 95/19431; 및 WO 98/54311 참조) 또는 myb-유사 전사 인자에 의해 조절될 수 있는 것을 포함한다. 예를 들어, 키메라 징크 핑거 단백질은 특이적 DNA 서열에 결합하는 아미노산 서열 (징크 핑거), 및 특이적 DNA 서열에 연결된 서열의 전사를 활성화하거나 (예를 들어, GAL 4 서열) 억제하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 목적을 위한 관심있는 유전자의 일반적인 범주는 예를 들어, 정보에 관여하는 유전자, 예를 들어 징크 핑거, 소통에 관여하는 유전자, 예를 들어 키나제, 및 하우스키핑 (housekeeping)에 관여하는 유전자, 예를 들어 열 충격 단백질을 포함한다. 트랜스젠의 보다 특이적 범주는 농경학 품질, 곤충 저항성, 질병 저항성, 제초제 저항성, 및 곡물 특성에 중요한 형질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 트랜스젠의 또 다른 카테고리는 식물 및 다른 진핵생물뿐만 아니라 원핵생물 유기체로부터 효소, 보조인자, 및 호르몬과 같은 외인성 산물의 발현을 유도하기 위한 유전자를 포함한다. 관심있는 임의의 유전자는 본 발명의 프로모터에 작동가능하게 연결되고 스트레스 하에 발현될 수 있는 것으로 인정된다.

보다 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 프로모터는 세포 주기 조절인자로서 작용하거나, 다른 조직-바람직한 프로모터를 갖는 담배 및 캐놀라 (canola)에서 나타난 바와 같이 탄수화물 대사 또는 식물호르몬 수준을 제어하는 단백질을 코딩하는 유전자를 조정한다 ([Ma, Q.H. et al., 1998]; [Roeckel, P. et al., 1997]). 예를 들어, 이소펜테닐 트랜스퍼라제 또는 IAA-M을 코딩하는 유전자는 암꽃 소화 (female floret)의 발달을 조정하는데 유용할 수 있다. 다른 중요한 유전자는 성장 인자 및 전사 인자를 코딩한다. 프로모터의 지시 하에 선택된 내인성 또는 이종성 뉴클레오티드의 발현은 불리한 조건 하에 암꽃 소화의 계속된 또는 개선된 발달을 일으킬 수 있다.

종자 생산은 환경 스트레스 동안 종자 성장 및 발달의 반응에 영향을 미치는 유전자 (Cheikh-N et al. 1994) 및 옥수수에서 종자 이단을 감소시키기 위해 탄수화물 대사를 조절하는 유전자 (Zinselmeier et al. 1995)의 발현을 변경함으로써 개선될 수 있다.

2.3 표적화된 서열 절제

외떡잎 식물에서 본 발명의 키메라 전사 조절 핵산 서열의 특이성으로 인해 상기 외떡잎 식물의 게놈으로부터 서열 (예를 들어 마커 서열)의 표적화된 절제 또는 결실에 특히 유용하다. 선행 기술에 공지된 방법의 하나의 공지된 단점은 절제가 전체 식물을 통해 균일하지 않아서, 모자이크-유사 절제 패턴을 생성하고, 이는 힘든 추가의 라운드의 선택 및 재생을 요구한다는 점이다. 초기 배에서 본 발명의 프로모터의 특이성으로 인해 전체 배를 통해 균일한 절제가 가능하고, 이는 이어서 식물 동종성 표적-서열 (예를 들어, 마커)이 없는 식물을 제공할 것이다.

본 발명의 다른 실시태양은 식물, 바람직하게는 외떡잎 식물로부터 표적 서열 (예를 들어, 마커 서열)의 절제를 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은

A) i) a) 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드;

ii) a) 서열 3에 정의된 폴리뉴클레오티드;

b) 서열 3의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50% 바람직하게는 적어도 60%, 70% 또는 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

d) 2XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.5XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 보다 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서 50℃에서, 가장 바람직하게는 0.1XSSC, 0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 3에 제시된 서열의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군 중에서 선택된 제2 핵산 분자

를 포함하는 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 상기 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열에 대하여 이종성이고 외떡잎 식물로부터 표적 서열의 절제 유도에 적합한 적어도 하나의 핵산 서열에 작동가능하게 연결함으로써 발현 카세트를 구성하는 단계,

B) 상기 발현 카세트를 적어도 하나의 표적 서열을 포함하는 외떡잎 식물 내로 삽입하여 트랜스제닉 식물을 제공하고, 여기서 상기 식물은 상기 이종성 핵산 서열을 발현하는 것인 단계 및

C) 상기 마커의 절제를 나타내는 트랜스제닉 식물을 선택하는 단계를 포함한다.

절제는 비제한적으로 다음을 포함하는 다양한 수단에 의해 실현된다:

- 부위 특이적 재조합효소를 사용하는 부위 특이적 재조합에 의한 서열 결실의 유도, 여기서 상기 부위 특이적 재조합효소는 본 발명의 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열에 의해 발현된다,

- 유도된 상동성 재조합에 의한 서열 결실의 유도, 여기서 결실시킬 서열은 서열에 의해 플랭킹되고, 상기 서열들은 그들 사이에 상동성 재조합을 허용하기 위한 서로에 대한 배향, 충분한 길이 및 상동성을 갖고, 여기서 상동성 재조합은 부위 특이적 엔도뉴클레아제 (바람직하게는 귀소 (homing) 엔도뉴클레아제, 보다 바람직하게는 귀소 엔도뉴클레아제 I-SceI)에 의해 제조된 부위 특이적 이중가닥 파단에 의해 유도되고, 상기 부위 특이적 엔도뉴클레아제는 본 발명의 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열에 의해 발현된다.

본 발명의 다른 실시태양은

A) 서열 특이적 절제-매개 효소와 상호작용시에 식물 게놈으로부터 표적 서열의 절제를 매개할 수 있는 절제-서열에 의해 플랭킹된, 식물 게놈 내로 안정하게 삽입되는 적어도 하나의 표적 서열, 및

B) i) a) 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드;

ii) a) 서열 3에 정의된 폴리뉴클레오티드;

를 포함하는 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, 항목 i)의 상기 절제-서열과 상호작용할 수 있는 절제-매개 효소를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트

를 포함하는 식물, 바람직하게는 외떡잎 식물 또는 식물 세포에 관한 것이다.

키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바람직한 핵산 분자는 상기 설명되어 있다. 서열 절제를 달성하기 위해 발현시킬 바람직한 이종성 핵산 서열 (예를 들어, 부위 특이적 재조합효소 또는 엔도뉴클레아제를 코딩하는)은 본원에서 아래에 설명된다.

본 발명의 방법이 바람직하게 적용될 수 있는 외떡잎 식물은 옥수수, 밀, 벼, 보리, 호밀, 기장, 사탕수수, 호밀풀 또는 율무, 라이밀 또는 귀리 및 사탕수수로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 식물은 옥수수, 밀, 보리, 벼, 귀리, 호밀 및 사탕수수로 이루어진 군 중에서, 훨씬 더 바람직하게는 옥수수, 밀 및 벼로 이루어진 군 중에서 선택된 곡식 식물이고, 가장 바람직하게는 식물은 옥수수 식물이다.

키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 상기 정의된 바와 같다. 상기 정의된 외떡잎 식물 또는 식물 세포에서 표적 서열은 상기 식물의 종자가 발아되고 배가 성장하기 시작하자 마자 절제될 것이다. 상기 배로부터 표적-서열이 없는 식물이 생성될 것이다.

표적-서열, 및 절제-매개 효소를 위한 발현 카세트는 하나의 DNA 상에서 또는 상이한 구성체 상에서 조합될 수 있다. 상이한 DNA 구성체들은 예를 들어 각각 상기 표적 서열 및 절제-매개 효소를 위한 상기 발현 카세트를 포함하는 구별되는 모 라인 (parental line)들의 교배, 또는 동시-형질전환 또는 후속적인 형질전환과 같은 다른 수단에 의해 외떡잎 식물 또는 식물 세포의 게놈 내에서 조합될 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 실시태양은

A) 게놈 핵산 구성체 내로, 서열 특이적 절제-매개 효소와 상호작용시에 식물 게놈으로부터 상기 표적 서열의 절제를 매개할 수 있는 절제-서열에 의해 플랭킹된, 식물 게놈 내로 안정하게 삽입되는 적어도 하나의 표적 서열을 안정하게 삽입하는 단계,

B) 상기 외떡잎 식물 또는 식물 세포 내로,

i) a) 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드;

b) 서열 1의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드; 및

c) 2XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군 중에서 선택된 제1 핵산 분자, 및 이에 작동가능하게 연결된

ii) a) 서열 3에 정의된 폴리뉴클레오티드;

b) 서열 3의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드; 및

c) 2XSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 3에 제시된 서열의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군 중에서 선택된 제2 핵산 분자

를 포함하는 키메라 전사 조절 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 항목 i)의 상기 절제-서열과 상호작용할 수 있는 절제-매개 효소를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 도입시키는 단계,

C) 상기 표적 서열 및 상기 발현 카세트를 모두 포함하는 상기 외떡잎 식물 또는 식물 세포의 종자를 생성하고, 상기 종자를 발아시키고, 그로부터 식물을 성장시키고,

D) 상기 표적 서열이 절제된 식물을 선택하는 단계

를 포함하는, 외떡잎 식물 또는 식물 세포의 게놈으로부터 적어도 하나의 표적 서열을 절제하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 수정가능한 식물의 재생 단계를 추가로 포함한다. 방법은 상기 식물 세포로부터 재생된 식물의 자손 또는 자손체를 유성 또는 무성적으로 증식 또는 성장시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.

바람직하게는, 표적 서열의 절제 (또는 결실)은 비제한적으로 하나 이상의 다음 방법을 포함하는 그 자체로 당업계에 공지된 다양한 수단에 의해 실현할 수 있다:

a) 서열 특이적 재조합효소에 의해 유도된 재조합, 여기서 상기 표적 서열은 플랭킹 재조합 부위들 사이의 재조합이 게놈으로부터 개재하는 표적-서열을 결실시키는 방식으로 상응하는 재조합 부위에 의해 플랭킹된다,

b) 바람직하게는 서열 특이적 엔도뉴클레아제에 의해 유발된 상동성 서열 사이의 서열-특이적 이중가닥 파단에 의해 유도된, 상기 표적 서열을 플랭킹하는 상동성 서열 A 및 A' 사이의 상동성 재조합, 여기서 상기 상동성 서열 A 및 A'는 A와 A' 사이에 상동성 재조합을 보장하기 위해 충분한 길이 및 상동성을 갖고, A와 A' 사이의 재조합 시에 상기 식물의 게놈으로부터 상기 표적 서열의 절제를 일으키는 배향을 갖는다.

바람직한 절제 서열 및 절제 효소는 아래에 특정된다. 다른 바람직한 실시태양에서, 결실/절제의 메카니즘은 이중 기능 마커의 조기 결실/절제를 억제하는 방식으로 유도 또는 활성화될 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 바람직하게 사용된 서열-특이적 재조합효소 또는 엔도뉴클레아제의 발현 및/또는 활성은 바람직하게 다음으로 이루어지는 군 중에서 선택된 방법에 의해 유도 및/또는 활성화될 수 있다:

a) 상기 절제 효소 (예를 들어, 재조합효소 또는 엔도뉴클레아제)를 코딩하는 서열을 유도가능 프로모터 또는 프로모터 성분과 조합된 키메라 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결하는 것에 의한 유도가능한 발현,

b) 예를 들어, 리간드 결합 도메인을 포함하는 유도가능한 변형된 절제 효소 (예를 들어, 재조합효소 또는 엔도뉴클레아제)의 사용에 의한 유도가능한 활성화(여기서 상기 변형된 절제 효소의 활성은 상기 리간드 결합 도메인에 대한 결합 활성을 갖는 화합물로 처리함으로써 변형될 수 있다).

바람직하게는, 표적 서열은 마커, 보다 바람직하게는 선택 마커이다 (바람직한 마커 서열은 아래에 특정된다). 따라서, 본 발명의 방법은 선택 마커가 없는 외떡잎 식물 세포 또는 식물을 생성시킨다.

2.3.1 바람직한 절제 서열 및 절제 효소

표적 서열 결실/절제를 보장하기 위해, 표적 서열은 서열 특이적인 절제-매개 효소와의 상호작용 시에 식물 게놈으로부터 상기 표적 서열의 절제를 매개할 수 있는 절제 서열에 의해 플랭킹된다. 바람직하게는, 표적 서열의 결실은 비제한적으로 하나 이상의 다음 방법을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 수단에 의해 실현할 수 있다:

따라서, 표적 서열 결실/절제를 보장하기 위해, 표적 서열은 상기 발현 카세트의 특이적 결실을 허용하는 서열에 의해 플랭킹된다. 상기 서열은 상기 플랭킹 재조합 부위들 사이에서 유도된 재조합이 게놈으로부터 상기 표적 서열을 결실시키는 방식으로 배치되는 서열 특이적 재조합효소에 대한 재조합 부위일 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 재조합 부위 및 상응하는 서열 특이적 재조합효소 (본원에서 아래에 설명됨)가 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.

또다른 바람직한 실시태양에서, 표적 서열의 결실/절제는 분자내 (바람직하게는 염색체내) 상동성 재조합에 의해 수행된다. 상동성 재조합은 자발적으로 일어날 수 있지만, 바람직하게는 서열-특이적 이중가닥 파단 (예를 들어, 상동성 서열 사이에서)에 의해 유도된다. 기본 원리는 WO 03/004659에 개시되어 있다. 상기 목적을 위해, 표적 서열은 상동성 서열 A 및 A'에 의해 플랭킹되고, 상기 상동성 서열은 A와 A' 사이에 상동성 재조합을 보장하기 위해 충분한 길이 및 상동성을 갖고, A와 A' 사이의 재조합 시에 절제 게놈으로부터 상기 표적 서열을 절제시키는 배향을 갖는다. 또한, 상기 상동성 서열에 의해 플랭킹된 서열은 리간드-결합 도메인과 함께 서열 특이적 DNA 이중가닥 파단 유도 효소, 바람직하게는 서열-특이적 DNA-엔도뉴클레아제, 보다 바람직하게는 귀소-엔도뉴클레아제, 가장 바람직하게는 I-SceI, I-CpaI, I-CpaII, I-CreI 및 I-ChuI 또는 그의 키메라로 이루어진 군 중에서 선택된 엔도뉴클레아제에 의한 DNA 이중가닥 파단의 부위-지정 유도를 위해 적어도 10개 염기쌍의 적어도 하나의 인식 서열을 추가로 포함한다. 적합한 엔도뉴클레아제는 아래에 설명된다.

2.3.1.1 재조합 부위 및 재조합효소

본 발명에서 적합한 서열-특이적 재조합효소 및 그들의 상응하는 재조합 부위는 박테리오파지 P1의 Cre/lox 시스템 ([Dale EC and Ow DW 1991]; [Russell SH et al. 1992]; [Osborne BI et al. 1995]), 효모 FLP/FRT 시스템 ([Kilby NJ et al. 1995]; [Lyznik LA et al. 1996]), Mu 파지 Gin 재조합효소, 이. 콜라이 Pin 재조합효소 또는 플라스미드 pSR1의 R/RS 시스템 ([Onouchi H et al. 1995]; [Sugita Ket et al. 2000])을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 재조합효소 (예를 들어 Cre 또는 FLP)는 개입된 서열을 결실 또는 전화시키기 위해 그의 상응하는 재조합 서열 (각각 34 bp lox 서열 및 47 bp FRT 서열)과 특이적으로 상호작용한다. Cre에 의한 2개의 lox 서열에 의해 플랭킹된 식물에서 표준 선택 마커의 결실은 설명되어 있다 (Dale EC and Ow DW 1991). 적합한 재조합효소에 바람직한 재조합 부위를 하기 표 1에 기재한다:

2.3.1.2 상동성 서열

상동성 서열 (예를 들어, A, A')를 언급할 때, "충분한 길이"는 바람직하게는 적어도 20개 염기쌍, 바람직하게는 적어도 50개 염기쌍, 특히 바람직하게는 적어도 100개 염기쌍, 보다 특히 바람직하게는 적어도 250개 염기쌍, 가장 바람직하게는 적어도 500개 염기쌍의 길이를 갖는 서열을 나타낸다.

상동성 서열 (예를 들어, A, A')를 언급할 때, "충분한 상동성"은 적어도 20개 염기쌍, 바람직하게는 적어도 50개 염기쌍, 특히 바람직하게는 적어도 100개 염기쌍, 보다 특히 바람직하게는 적어도 250개 염기쌍, 가장 바람직하게는 적어도 500개 염기쌍의 길이에 걸쳐 이들 상동성 서열 내에서 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 보다 특히 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100% 상동성을 갖는 서열을 나타낸다.

상동성 서열 A 및 A'는 바람직하게는 직접 반복체의 형태로 조직화된다. 용어 "직접 반복체"는 동일한 배향인 DNA 분자의 동일한 스트랜드 상의 2개의 서열의 후속적 배치를 의미하고, 여기서 이들 2개의 서열은 상기 2개 서열들 사이에서 상동성 재조합을 위한 상기 주어진 요건을 충족시킨다.

바람직한 실시태양에서, 상동성 서열은 DNA 구성체 내에 추가의 용도를 갖는 서열의 복제물일 수 있다. 예를 들어, 상동성 서열은 2개의 전사 터미네이터 서열일 수 있다. 이들 터미네이터 서열 중 하나는 농경학상 유익한 또는 관련 형질에 작동가능하게 연결될 수 있는 반면, 다른 하나는 형질 유전자의 3'-방향으로 놓인 이중 기능 선택 마커에 연결될 수 있다. 2개의 터미네이터 서열들 사이의 재조합은 표적 서열 (예를 들어, 마커 유전자)을 절제할 것이지만, 형질 유전자의 터미네이터를 재구성할 것이다. 또 다른 예에서, 상동성 서열은 2개의 프로모터 서열일 수 있다. 이들 프로모터 서열 중 하나는 농경학상 유익한 또는 관련 형질에 작동가능하게 연결될 수 있는 반면, 다른 것은 형질 유전자의 5'-방향으로 놓인 표적 서열 (예를 들어, 선택 마커)에 연결될 수 있다. 2개의 프로모터 서열들 사이의 재조합은 표적 서열 (예를 들어, 마커 유전자)을 절제할 것이지만, 형질 유전자의 프로모터를 재구성할 것이다. 당업자는 상동성 서열이 단일 기능적 요소 (예를 들어 프로모터 또는 터미네이터)로 제한될 필요가 없고, 대신 다른 서열 (예를 들어, 형질 유전자 및 상기 형질 유전자의 각각의 터미네이터 서열의 코딩 구역의 일부임)을 포함하거나 그 서열로 연장할 수 있음을 알 것이다.

2.3.1.3. 이중가닥 파단 유도 효소

바람직하게는, 표적 서열 (예를 들어, 마커 유전자)의 결실/절제는 바람직하게는 재조합시킬 상동성 서열들 사이에 서열-특이적 이중가닥 파단에 의해 유도된 상기 특정된 상동성 서열들 사이에서 상동성 재조합에 의해 실현된다. 일반적인 방법은 예를 들어 전문이 본원에 참고로 포함된 WO 03/004659에 개시되어 있다. 서열-특이적 이중가닥 파단의 유도에 적합한 각종 효소 (이하 함께 "엔도뉴클레아제")는 당업계에 공지되어 있다. 엔도뉴클레아제는 예를 들어, 다음을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다:

1. 제한 엔도뉴클레아제 (타입 II), 바람직하게는 아래에서 상세히 설명되는 바와 같은 귀소 엔도뉴클레아제.

2. 트랜스포사제 (transposase), 예를 들어 P-요소 트랜스포사제 (Kaufman PD and Rio DC 1992) 또는 AcDs (Xiao YL and Peterson T 2000). 원칙적으로, 서열 특이성을 갖는다면 모든 트랜스포사제 또는 인테그라제가 적합하다 ([Haren L et al. 1999]; [Beall EL, Rio DC 1997]).

3. 아래에서 상세히 설명되는 바와 같은 키메라 뉴클레아제.

4. 면역계, 예를 들어 RAG1/RAG2 시스템에서 이중가닥 파단을 유도하는 효소 (Agrawal A et al. 1998).

5. 그룹 II 인트론 엔도뉴클레아제. 인트론 서열의 변형은 그룹 II 인트론이 이중가닥 DNA에서 실질적으로 임의의 서열에 대해 지정되도록 허용하고, 여기서 그룹 II 인트론은 후속적으로 역 스플라이스 메카니즘에 의해 삽입될 수 있다 ([Mohr et al. 2000]; [Guo et al. 2000]). 상기 역 스플라이스 메카니즘 동안, 이중가닥 파단이 표적 DNA 내로 도입되고, 절제된 인트론 RNA는 센스 스트랜드를 절단하는 한편, 그룹 II 인트론 엔도뉴클레아제의 단백질 부분은 안티센스 스트랜드를 가수분해한다 (Guo et al. 1997). 본 발명의 경우에서와 같이 완전 역 스플라이싱을 달성하지 않으면서 이중가닥 파단을 유도하는 것만을 원하는 경우에는, 예를 들어, 역전사효소 활성이 결여된 그룹 II 인트론 엔도뉴클레아제에 의지하는 것이 가능하다. 이는 이중가닥 파단의 생성을 방지하지 않지만, 역 스플라이싱 메카니즘이 완료까지 진행할 수 없다.

천연 효소뿐만 아니라 합성 효소도 또한 적합한 효소이다. 바람직한 효소는 인식 서열이 공지되고, 그들의 단백질 형태로 (예를 들어, 정제에 의해) 얻어지거나 그들의 핵산 서열을 사용하여 발현될 수 있는 모든 엔도뉴클레아제이다.

바람직한 실시태양에서, 서열-특이적 엔도뉴클레아제는 이중가닥 파단의 특이적 유도 및 후속적인 유도된 상동성 재조합을 위해 사용된다. 용어 "서열 특이적 DNA-엔도뉴클레아제"는 일반적으로 하나 이상의 인식 서열에서 서열-특이적 방식으로 이중가닥 DNA에서 이중가닥 파단을 생성할 수 있는 모든 효소를 나타낸다. 상기 DNA 절단은 DNA의 블런트 (blunt) 말단, 또는 소위 "점착성 (sticky)" 말단 (5'- 또는 3'-오버행을 갖는)을 생성시킬 수 있다. 절단 부위는 인식 서열 내부에 또는 외부에 위치할 수 있다. 다양한 종류의 엔도뉴클레아제가 사용될 수 있다. 엔도뉴클레아제는 예를 들어, 클래스 II 또는 클래스 IIs 형일 수 있다. 클래스 IIs R-M 제한 엔도뉴클레아제는 인식 서열 이외의 서열에서 DNA 절단을 촉매하고, 즉 이들은 인식 서열로부터 특정 수의 뉴클레오티드에서 DNA 서열을 절단한다 (Szybalski et al. 1991). 예로서 비제한적으로 다음의 것이 언급될 수 있다:

1. 제한 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 타입 II 또는 IIs), 바람직하게는 아래에서 상세히 설명되는 바와 같은 귀소 엔도뉴클레아제.

2. 아래에서 상세히 설명되는 바와 같은 키메라 또는 합성 뉴클레아제.

재조합효소와 달리, 제한 효소는 대개 DNA를 라이게이션하지 않고, 단지 DNA를 절단한다. 제한 효소는 예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스 온라인 카탈로그 (www.neb.com), 프로메가 (Promega) 온라인 카탈로그 (www.promega.com) 및 문헌 [Rao et al., 2000]에 기재되어 있다. 본 발명에서 엔도뉴클레아제에 의한 절단으로부터 생성되는 DNA 말단의 "라이게이션"은 상동성 서열의 상동성 재조합에 의한 융합에 의해 실현된다.

바람직하게는, 엔도뉴클레아제는 그의 상응하는 인식 서열이 표적 식물 유기체의 비변형된 게놈 내에 있기는 하지만 드물게 발견되는 방식으로 선택된다. 이상적으로는, 게놈 내의 인식 서열의 유일한 카피 (또는 카피들)는 본 발명의 DNA 구성체에 의해 도입된 것(들)이어서, 서열-특이적 엔도뉴클레아제가 발현될 때 게놈 내의 다른 DNA가 절제되거나 재배열되는 기회를 제거한다.

적합한 엔도뉴클레아제를 선택하는 하나의 기준은 그의 상응하는 인식 서열의 길이이다. 상기 인식 서열은 드문 절단, 보다 바람직하게는 본 발명의 DNA 구성체 내에 포함된 인식 서열(들)에서만 절단을 허용하기 위해 적절한 길이를 갖는다. 상기 인식 서열의 최소 길이를 결정하는 하나의 인자는 통계학 관점에서 숙주 유기체의 게놈의 크기이다. 바람직한 실시태양에서, 인식 서열은 적어도 10개 염기쌍, 바람직하게는 적어도 14개 염기쌍, 보다 바람직하게는 적어도 16개 염기쌍, 특히 바람직하게는 적어도 18개 염기쌍, 가장 바람직하게는 적어도 20개 염기쌍의 길이를 갖는다.

10개 염기쌍 인식 서열을 절단하는 제한 효소는 문헌 [Huang B et al. 1996]에 기재되어 있다.

천연 효소뿐만 아니라 합성 효소도 또한 적합한 효소이다. 바람직한 효소는 그의 인식 서열이 공지되고, 그들의 단백질 형태로 (예를 들어 정제에 의해) 얻어지거나 그들의 핵산 서열을 사용하여 발현될 수 있는 모든 서열 특이적 DNA-엔도뉴클레아제이다.

특정 진핵생물 유기체의 염색체 DNA 서열 내에, 트랜스제닉 재조합 구성체 내에 존재하는 인식 서열 외에, 인식 서열이 없거나 단지 적은 제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)가 특히 바람직하다. 이는 게놈 내의 바람직하지 않은 로커스에서 추가의 이중가닥 파단을 방지한다. 이것이 귀소 엔도뉴클레아제가 특히 바람직한 이유이다 (검토: [Belfort M and Roberts RJ 1997]; [Jasin M 1996]; http://rebase.neb.com/rebase/rebase.homing.html). 그들의 긴 인식 서열 때문에, 이들은 대부분의 경우에 진핵생물 유기체의 염색체 DNA 내에 추가의 인식 서열을 갖지 않거나 단지 적게 갖는다.

그러한 귀소 엔도뉴클레아제를 코딩하는 서열은 예를 들어 클라미도모나스 (Chlamydomonas)의 엽록체 게놈으로부터 단리할 수 있다 (Turmel M et al. 1993). 이들은 작고 (18 내지 26 kD), 그들의 개방 판독 프레임 (ORF)는 진핵생물에서 핵 발현을 위해 직접적으로 적합한 "코돈 사용 빈도"를 갖는다 (Monnat RJ Jr et al. 1999). 보다 특히 바람직하게는 단리되는 귀소 엔도뉴클레아제는 귀소 엔도뉴클레아제 I-SceI (WO96/14408), I-SceII (Sarguiel B et al. 1990), I-SceIII (Sarguiel B et al. 1991), I-CeuI (Marshall 1991), I-CreI (Wang J et al. 1997), I-ChuI (Cote V et al. 1993), I-TevI (Chu et al. 1990; Bell-Pedersen et al. 1990), I-TevII (Bell-Pedersen et al. 1990), I-TevIII (Eddy et al. 1991), Endo SceI (Kawasaki et al. 1991), I-CpaI (Turmel M et al. 1995a) 및 I-CpaII (Turmel M et al. 1995b)이다.

추가의 귀소 엔도뉴클레아제는 상기 언급된 인터넷 웹사이트에 상세히 기재되고, 언급할 수 있는 예는 귀소 엔도뉴클레아제, 예를 들어 F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HspNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NcIIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PpbIP, I-PpoI, I-SPBetaIP, I-ScaI, I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiS3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPA1P, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP, PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-PspI, PI-Rma43812IP, PI-SPBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, PI-TliII, H-DreI, I-BasI, I-BmoI, I-PogI, I-TwoI, PI-MgaI, PI-PabI, PI-PabII이다.

유전자 서열이 이미 공지되어 있는 귀소 엔도뉴클레아제, 예를 들어, F-SceI, I-CeuI, I-ChuI, I-DmoI, I-CpaI, I-CpaII, I-CreI, I-CsmI, F-TevI, F-TevII, I-TevI, I-TevII, I-AniI, I-CvuI, I-DdiI, I-HmuI, I-HmuII, I-LlaI, I-NanI, I-MsoI, I-NitI, I-NjaI, I-PakI, I-PorI, I-PpoI, I-ScaI, I-Ssp6803I, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-PspI, PI-TfuI, PI-TliI가 본 문맥에서 바람직하다. 상업적으로 이용가능한 귀소 엔도뉴클레아제, 예를 들어 I-CeuI, I-SceI, I-DmoI, I-PpoI, PI-PspI 또는 PI-SceI가 특히 바람직하다. 특히 긴 인식 서열을 갖고, 따라서 게놈 내에서 (있기는 하지만) 단지 드물게 절단하는 엔도뉴클레아제는 I-CeuI (26 bp 인식 서열), PI-PspI (30 bp 인식 서열), PI-SceI (39 bp 인식 서열), I-SceI (18 bp 인식 서열) 및 I-Ppol (15 bp 인식 서열)를 포함한다. 효소는 당업자가 잘 알고 있는 방식으로 그들의 기원 유기체로부터 단리될 수 있고/있거나 그들의 코딩 핵산 서열은 클로닝될 수 있다. 각종 효소의 서열은 GenBank에 기탁되어 있다. 귀소 엔도뉴클레아제 I-SceI, I-CpaI, I-CpaII, I-CreI 및 I-ChuI가 특히 바람직하다. 상기 뉴클레아제를 코딩하는 서열은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, WO 03/004659에 특정되어 있다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함된 WO 03/004659의 서열 2, 4, 6, 8 및 10으로서).

발현시킬 이종성 핵산 서열은 바람직하게는 임의의 서열 22로 제시된 폴리펩티드 또는 임의의 상기 폴리펩티드와 동일한 표현형을 야기할 수 있는 그의 기능적 동등물을 코딩할 수 있다. 가장 바람직하게는, 발현시킬 핵산 서열은 서열 21 또는 23에 제시된다.

바람직한 실시태양에서, 상기 귀소 엔도뉴클레아제를 코딩하는 서열은 인트론 서열의 삽입에 의해 변형될 수 있다. 이는 원핵 숙주 유기체에서 기능성 효소의 발현을 방지하여, 클로닝 및 형질전환 절차 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 아그로박테리움에 기반한)를 용이하게 한다. 식물은 인트론을 인식하고 및 "스플라이싱"에 의해 제거할 수 있으므로 식물 유기체에서 기능성 효소의 발현이 실현된다. 바람직하게는, 인트론은 상기 바람직한 것으로 언급된 귀소 엔도뉴클레아제 내에 (예를 들어, I-SceI 또는 I-CreI 내로) 삽입된다.

본 발명의 일부 측면에서, 개선된 엔도뉴클레아제를 생성하기 위해 분자 진화가 사용될 수 있다. 후보 엔도뉴클레아제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, DNA 셔플링 프로토콜을 사용하여 조정될 수 있다. DNA 셔플링은 관련 유전자의 무작위 단편화에 이어, 폴리머라제 연쇄 반응-유사 과정에 의한 단편의 재조립에 의해 수행되는 순환적 재조합 및 돌연변이의 과정이다 (예를 들어, [Stemmer (1994)]; [Stemmer (1994)]; 및 US 5,605,793, US 5,837,458, US 5,830,721 및 US 5, 811,238 참조).

예로서 언급될 수 있는 다른 합성 엔도뉴클레아제는 비특이적인 뉴클레아제 도메인, 및 징크 핑거로 이루어지는 서열-특이적 DNA 결합 도메인으로 이루어지는 키메라 뉴클레아제이다 (Bibikova M et al. 2001). 이들 DNA-결합 징크 핑거 도메인은 임의의 DNA 서열에 적합하도록 개조될 수 있다. 적합한 징크 핑거 도메인을 제조하기 위한 적합한 방법은 설명되고 당업자에게 공지되어 있다 ([Beerli RR et al. 2000]; [Beerli RR et al. 2000]; [Segal DJ and Barbas CF 2000]; [Kang JS and Kim JS 2000]; [Beerli RR et al. 1998]; [Kim JS et al. 1997]; [Klug A 1999]; [Tsai SY et al. 1998]; [Mapp AK et al. 2000]; [Sharrocks AD et al. 1997]; [Zhang L et al. 2000]).

엔도뉴클레아제는 바람직하게는 핵 배치 서열 (NLS)과 융합 단백질로서 발현된다. 상기 NLS 서열은 핵 내로 용이한 전달을 가능하게 하고, 재조합 시스템의 효능을 증가시킨다. 다양한 NLS 서열이 당업자에게 공지되어 있고, 특히 문헌 [Jicks GR and Raikhel NV 1995]에 설명되어 있다. 예를 들어, SV40 큰 항원의 NLS 서열이 식물 유기체에 바람직하다. 그 예는 WO 03/060133에 제공된다. 그러나, 많은 DSBI 효소 (예를 들어, 귀소 엔도뉴클레아제)의 작은 크기 때문에, NLS 서열이 반드시 요구되지는 않는다. 이들 효소는 임의의 도움 없이도 핵공을 통해 통과할 수 있다.

추가의 바람직한 실시태양에서, 엔도뉴클레아제의 활성이 유도될 수 있다. 서열-특이적 재조합효소에 대한 적합한 방법이 설명되었다 ([Angrand PO et al. 1998]; [Logie C and Stewart AF 1995]; [Imai T et al. 2001]). 이들 방법에서는 엔도뉴클레아제 및 스테로이드 호르몬 수용체 (예를 들어 인간 안드로겐 수용체, 또는 여기에 기재된 바와 같은 인간 에스트로겐 수용체의 돌연변이된 변이체)에 대한 리간드 결합 도메인의 융합 단백질을 사용한다. 유도는 예를 들어, 에스트라디올, 덱사메타손, 4-히드록시타목시펜 또는 랄록시펜과 같은 리간드를 사용하여 수행할 수 있다. 일부 엔도뉴클레아제는 이량체 (동종이량체 또는 이종이량체; I-CreI는 동종이량체를 형성하고; I-SecIV는 이종이량체를 형성한다)로서 활성을 보인다 (Wernette CM 1998). 이량체화는 예를 들어, 저분자량 리간드의 결합 도메인에 대해 천연 이량체화 도메인을 교환함으로써 유도가능한 특징으로서 설계될 수 있다. 이어서, 이량체 리간드의 첨가는 융합 단백질의 이량체화를 야기한다. 상응하는 유도가능 이량체화 방법, 및 이량체 리간드의 제조는 설명되어 있다 ([Amara JF et al. 1997]; [Muthuswamy SK et al. 1999]; [Schultz LW and Clardy J 1998]; [Keenan T et al. 1998]).

서열 특이적 DNA 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 귀소 엔도뉴클레아제)에 대한 인식 서열은 당업계에 설명되어 있다. "인식 서열"은 본 발명의 서열-특이적 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 DNA 서열을 나타낸다. 인식 서열은 대개 적어도 10개 염기쌍, 보다 대체로 10 내지 30개 염기쌍, 대부분의 실시태양에서 50개 미만의 염기쌍 길이이다.

"인식 서열"은 일반적으로 본 발명 내에서 사용되는 식물 세포 내의 조건 하에 서열 특이적 DNA-엔도뉴클레아제에 의한 인식 및 절단을 가능하게 하는 서열을 나타낸다. 각각의 서열 특이적 DNA-엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열은 제한하는 것이 아니라 단지 예로서 하기 표 2에 언급된다.

해당 서열 특이적 DNA-엔도뉴클레아제에 의한 인식 및 절단을 여전히 가능하게 하는 인식 서열의 경미한 일탈 (degeneration)이 또한 포함된다. 상기 일탈 (또한 예를 들어, 칼슘 또는 마그네슘 농도와 같은 상이한 프레임워크 조건과 함께)은 문헌에서 설명된 바 있다 (Argast GM et al. 1998). 이들 인식 서열의 코어 서열 및 여기에서 경미한 일탈이 또한 포함된다. 인식 서열의 내부 부분은 유도된 이중가닥 파단을 충족시키고, 외부 부분은 절대적으로 관련되지는 않지만, 절단 효능을 동시에 결정할 수 있음이 알려져 있다. 따라서, 예를 들어, 18bp 코어 서열이 I-SceI에 대해 규정될 수 있다.

2.3.2 결실/절제의 개시

표적 서열의 결실/절제를 적절하게 개시하기 위한 다양한 수단이 존재한다. 바람직하게는, 결실은 표적 서열의 식물 게놈 내로의 성공적인 통합 후에만 개시된다. 예를 들어, 표적 서열이 선택 마커인 경우에, 절제는 바람직하게는 마커가 그의 기능을 성공적으로 수행하여 DNA 구성체를 형질전환되는 식물 세포 또는 유기체의 게놈 내로 삽입시킨 후에 개시된다.

당업자가 절제 효소를 절제 서열에 의해 플랭킹된 표적 서열과 조합하기 위해 다양한 수단이 이용가능하다. 바람직하게는, 절제 효소 (예를 들어, 재조합효소 또는 엔도뉴클레아제)는

a) 절제 효소 (예를 들어, 재조합효소 또는 서열-특이적 엔도뉴클레아제)의 발현 카세트를, 바람직하게는 상기 절제 서열에 의해 플랭킹된 표적 서열 (예를 들어, 마커 유전자)과 함께 DNA 구성체 내로 도입하기,

b) 절제 효소 (예를 들어, 재조합효소 또는 서열-특이적 엔도뉴클레아제)의 발현 카세트를 상기 절제 서열에 의해 플랭킹된 표적 서열 (예를 들어, 마커 유전자)을 이미 포함하는 식물 세포 또는 식물 내로 도입하기,

c) 상기 절제 서열에 의해 플랭킹된 표적 서열 (예를 들어, 마커 유전자)을 포함하는 구성체를 사용한 형질전환을 위한 숙주 식물 또는 세포로서 추후에 사용되는 식물 세포 또는 식물 내로 절제 효소 (예를 들어, 재조합효소 또는 서열-특이적 엔도뉴클레아제)의 발현 카세트를 도입하기,

d) 상기 절제 서열에 의해 플랭킹된 표적 서열 (예를 들어, 마커 유전자)을 포함하는 별개의 DNA 구성체를 사용한 동시 형질전환에 의해 형질전환되는 별개의 DNA 구성체 내로 절제 효소 (예를 들어, 재조합효소 또는 서열-특이적 엔도뉴클레아제)의 발현 카세트를 도입하기

로 이루어진 군 중에서 선택된 방법에 의해 각각 발현되거나 그의 상응하는 절제 서열 (예를 들어, 재조합 또는 인식 부위)과 조합될 수 있다.

따라서, 표적 서열 및 절제 효소 (예를 들어, 재조합효소 또는 엔도뉴클레아제)는 예를 들어 다음과 같이 식물 유기체, 세포, 세포 구획 또는 조직에서 조합될 수 있다:

1.) 절제 서열에 의해 플랭킹된 표적 서열 (예를 들어, 마커 유전자)이 그의 게놈 내로 (바람직하게는 염색체 DNA 내로) 삽입된 식물을 통상적인 방식으로 생성시킨다. 이어서, 절제 효소의 추가의 발현 카세트를 다음 방법에 의해 상기 DNA 구성체와 조합한다:

a) 상기 제2 발현 카세트를 사용한 제2 형질전환, 또는

b) 표적 서열을 포함하는 식물과 절제 효소의 발현 카세트를 포함하는 숙주 식물과의 교배.

2.) 절제 효소를 코딩하는 발현 카세트는 이미 표적 서열을 보유하는 DNA 구성체 내로 통합될 수 있다. 절제 효소를 코딩하는 서열을 결실을 허용하는 서열 사이에 삽입하고, 이를 그의 기능 수행 후에 게놈 DNA로부터 결실시키는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는, 엔도뉴클레아제의 발현은 이 경우에 (예를 들어 아래에서 설명되는 유도가능 프로모터 중의 하나의 조절 하에) 발달-의존 프로모터를 사용하여 발달-의존 방식으로 유도가능하거나, 또는 그의 게놈 내로의 삽입 전에 이중 기능 마커의 조기 결실을 방지하기 위해 그 활성이 유도가능한 다른 절제 효소가 사용된다.

3.) 동시-형질전환 기술에 따라, 절제 효소의 발현 카세트는 표적 서열을 포함하는 DNA 구성체와 동시에, 그러나 별개의 DNA 분자 (예를 들어, 벡터) 상에서 세포 내로 형질전환될 수 있다. 동시-형질전환은 안정하거나 일시적일 수 있다. 이 경우에, 비변형된 수퍼-프로모터의 발달-의존 발현 패턴이 조기 절제를 이미 억제하지만, 절제 효소의 발현은 바람직하게는 유도가능하다 (예를 들어 상기 설명된 바와 같은 유도가능 키메라 전사 조절 서열 중의 하나의 조절 하에).

4.) 또한, 절제 효소를 발현하는 식물은 모 개체로서 작용할 수 있다. 절제 효소를 발현하는 식물과 표적 서열을 보유하는 식물 사이의 교배에 의한 자손체에서, 목적하는 표적 서열 절제 (예를 들어, 이중가닥 파단 및 상동성 서열 사이의 재조합에 의한)가 관찰된다.

본 발명의 바람직한 실시태양은 표적 서열 (예를 들어, 선택 마커의 발현 카세트; 제1 발현 카세트) 및 절제 효소의 제2 발현 카세트 (예를 들어, 식물 프로모터에 연결된 엔도뉴클레아제 또는 재조합효소 코딩 서열)를 모두 포함하는 DNA 구성체에 관한 것으로, 바람직하게는 상기 제2 발현 카세트는 상기 절제 서열에 의해 플랭킹된 상기 제1 발현 카세트와 함께 특이적인 표적 서열 결실을 허용하도록 존재한다.

다른 바람직한 실시태양에서, 결실/절제의 메카니즘은 이중 기능 마커의 조기 결실/절제를 억제하는 방식으로 유도 또는 활성화될 수 있다. 바람직하게는, 바람직하게 사용되는 절제 효소의 발현 및/또는 활성은 바람직하게는 다음으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법에 의해 유도될 수 있다:

a) 상기 절제 효소 (예를 들어, 재조합효소 또는 엔도뉴클레아제)를 코딩하는 서열을 유도가능 프로모터에 작동가능하게 연결하는 것에 의한 유도가능 발현,

b) 리간드 결합 도메인을 포함하는 변형된 절제 효소 (예를 들어, 재조합효소 또는 엔도뉴클레아제)의 사용에 의한 유도가능 활성화 - 상기 변형된 절제 효소의 활성은 상기 리간드 결합 도메인에 대한 결합 활성을 갖는 화합물의 처리에 의해 변형될 수 있다.

절제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현은 바람직하게는 이중 기능 마커가 절제되기 전에 음성 선택 마커로서의 그의 기능을 수행할 수 있도록 적시에 발현을 허용하는 절제 프로모터에 의해 제어된다. 적합한 프로모터는 예를 들어 독일 특허 출원 DE 03028884.9에 기재되어 있다. 상기 프로모터는 예를 들어 생식 조직과 같은 후기 발달 단계에 대한 발현 특이성을 가질 수 있다. 절제 프로모터는 다음 프로모터 군 중의 하나로부터 선택될 수 있다:

2.3.3 절제시킬 표적 서열

다양한 서열이 본원에서 고려되지만, 절제가 유리할 수 있는 경우, 절제시킬 가장 바람직한 표적 서열은 마커 서열이다. 다양한 선택가능 및 스크리닝가능한 마커 서열은 일반 용어 마커 서열에 포함된다. 따라서, 본 발명의 방법은 마커가 없는 외떡잎 식물 세포 또는 식물을 생성시킨다. 세포 또는 유기체에 대해 본원에서 사용되는 용어 "마커가 없는" 또는 "선택 마커가 없는"은 기능성 마커 단백질을 발현할 수 없는 세포 또는 유기체를 의미하고자 한 것이다. 상기 마커 단백질을 코딩하는 서열은 부분적으로 존재하지 않거나 또는 바람직하게는 완전히 존재하지 않을 수 있다.

2.3.3.1 마커 유전자

마커 유전자 (예를 들어, 선택가능한 또는 스크리닝가능한 마커)는 형질전환체를 확인하는 능력을 개선하기 위해 종종 사용된다. "마커 유전자"는 마커 유전자를 발현하는 세포에 구분되는 표현형을 부여하여, 상기 형질전환된 세포를 마커를 갖지 않는 세포와 구분되도록 하는 유전자이다. 상기 유전자는 마커가 화학적 수단에 의해, 즉 선택제 (예를 들어, 제초제, 항생제 등)의 사용을 통해 선택될 수 있는 형질을 부여하는지, 또는 단순히 관찰 또는 시험을 통해, 즉 '스크리닝' (예를 들어, R-로커스 형질, 초록 형광 단백질 (GFP))에 의해 확인할 수 있는 형질인지에 따라 선택가능한 또는 스크리닝가능한 마커를 코딩할 수 있다. 물론, 적합한 마커 유전자의 많은 예가 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 용어 선택가능한 또는 스크리닝가능한 마커 유전자에는, 그의 분비가 형질전환된 세포를 확인 또는 선택하기 위한 수단으로서 검출될 수 있는 "분비가능 마커"를 코딩하는 유전자도 포함된다. 그 예는 항체 상호작용에 의해 확인될 수 있는 분비가능 항원, 또는 심지어 촉매 활성에 의해 검출될 수 있는 분비가능 효소를 코딩하는 마커를 포함한다. 분비가능 단백질은 예를 들어 ELISA에 의해 검출가능한 작은 확산가능 단백질; 세포외 용액에서 검출가능한 작은 활성 효소 (예를 들어, 알파-아밀라제, 베타-락타마제, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제); 및 세포벽에 삽입되거나 포획되는 단백질 (예를 들어, 연장 발현 단위 또는 담배 PR-S에서 발견되는 것과 같은 리더 서열을 포함하는 단백질)을 포함하여 많은 클래스로 분류된다.

선택가능한 분비가능 마커에 대해, 세포벽에 격리되는, 특유한 에피토프를 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자의 사용이 특히 유리한 것으로 고려된다. 상기 분비되는 항원 마커는 이상적으로는 식물 조직에서 낮은 배경을 제공하는 에피토프 서열, 효율적인 발현 및 형질막을 가로지는 표적화를 부여하는 프로모터-리더 서열을 이용하고, 세포벽에 결합되지만 항체에 접근할 수 있는 단백질을 생산할 것이다. 특유한 에피토프를 포함하도록 변형된 정상적으로 분비된 벽 단백질은 상기 모든 요건을 충족할 것이다. 상기 방식의 변형에 적합한 단백질의 일례는 엑스텐신, 또는 히드록시프롤린 풍부 당단백질 (HPRG)이다. 예를 들어, 옥수수 HPRG (Steifel 1990) 분자는 분자 생물학, 발현 및 단백질 구조 측면에서 그 특성이 잘 분석되었다. 그러나, 다양한 울티란 및/또는 글라이신-풍부 벽 단백질 (Keller 1989) 중의 임의의 하나가 스크리닝가능한 마커를 생성시키기 위해 항원 부위의 부가에 의해 변형될 수 있다.

분비가능한 스크리닝가능 마커의 하나의 예시적인 실시태양은 쥐의 인터루킨의 프로 (pro)-구역으로부터의 15개 잔기의 에피토프를 포함하도록 변형된 벽 단백질 HPRG를 코딩하는 옥수수 서열의 용도에 관한 것이지만, 당업자에게 알려진 극히 다양한 항원-항체 조합물로부터 선택된 실질적으로 임의의 검출가능한 에피토프가 상기 실시태양에 사용될 수 있다. 이어서, 특유한 세포외 에피토프는 발색 또는 형광 보조제와 함께 항체 표지를 사용하여 직접 검출할 수 있다.

본원 명세서의 요소는 bar 및/또는 GUS 유전자의 사용을 통해, 및 다양한 다른 마커의 사용을 통해 상세하게 예시될 수 있다. 물론, 본원 명세서의 개시내용에 비추어, 아래에서 제시되는 것 이외에 수많은 다른 가능한 선택가능한 및/또는 스크리닝가능한 마커 유전자가 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 다음 논의는 총망라한 것이라기보다는 예시적인 것으로 이해될 것이다. 본원에 개시된 기술 및 당업계에 공지된 일반적인 재조합 기술에 비추어, 본 발명은 마커 유전자를 포함한 임의의 유전자를 수여 세포 내로 도입하여 형질전환된 식물을 생성하는 것을 가능하게 한다.

마커 서열은 식물 세포에서 발현 능력을 갖는 임의의 전사 조절 서열 또는 프로모터를 보유함으로써 발현될 수 있다 (적합한 프로모터 서열은 아래에서 설명한다). 식물 형질전환, 스크리닝 및 선택에 사용되는 마커 서열이 가장 바람직하다. 마커를 통해, 트랜스제닉 세포 또는 유기체 (예를 들어, 식물 또는 식물 세포)를 형질전환 후에 확인할 수 있다. 이들은 각각 양성 선택 마커 (선택적 잇점 부여), 음성 선택 마커 (선택적 단점 보상), 및 역-선택 마커 (선택적 단점 부여)로 분류된다. 상기 마커는 다음을 포함하고, 이로 제한되지 않는다:

2.3.3.1.1 음성 선택 마커

음성 선택 마커는 살생물 화합물, 예를 들어 대사 억제제 (예를 들어, 2-데옥시글루코스-6-포스페이트, WO 98/45456), 항생제 (예를 들어, 카나마이신, G 418, 블레오마이신 또는 히그로마이신) 또는 제초제 (예를 들어, 포스피노트리신 또는 글리포세이트)에 대한 저항성을 부여한다. 마커 유전자를 발현하는 형질전환된 식물 물질 (예를 들어, 세포, 조직 또는 묘목)은 형질전환되지 않은 야생형 조직의 성장을 억제하는 상응하는 선택 화합물 (예를 들어, 항생제 또는 제초제)의 농축액의 존재 하에 발달할 수 있다. 특히 바람직한 음성 선택 마커는 제초제에 대한 저항성을 부여하는 것이다. 언급할 수 있는 예는 다음과 같다:

- 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT; Bialophos® 저항체로도 칭함; bar; [de Block 1987]; [Vasil 1992, 1993]; [Weeks 1993]; [Becker 1994]; [Nehra 1994]; [Wan & Lemaux 1994]; EP 0 333 033; US 4,975,374). 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus)로부터의 bar 유전자 또는 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스 (Streptomyces viridochromogenes)로부터의 pat 유전자가 바람직하다. PAT는 제초제 비알라포스의 활성 성분인 포스피노트리신 (PPT)을 불활성화시킨다. PPT는 글루타민 합성효소를 억제하여 ([Murakami 1986]; [Twell 1989]), 암모니아의 신속한 축적 및 세포 사멸을 야기한다.

- Glyphosate® (N-(포스포노메틸)글라이신)에 대한 저항성을 부여하는 변경된 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS) ([Hinchee 1988]; [Shah 1986]; [Della-Cioppa 1987]). 돌연변이체 EPSP 합성효소 유전자가 사용되는 경우, 추가의 이익은 적합한 엽록체 통과 펩티드인 CTP (EP-A1 0 218 571)의 통합을 통해 달성될 수 있다.

- Glyphosate® 분해 효소 (Glyphosate® 옥시도리덕타제; gox)

- Dalapon® 불활성화 데할로게나제 (deh)

- 술포닐우레아- 및/또는 이미다졸리논-불활성화 아세토락테이트 합성효소 (ahas 또는 ALS; 예를 들어, S4, XI12, XA17, 및/또는 Hra 돌연변이를 갖는 돌연변이된 ahas/ALS 변이체 (EP-A1154 204)

- Bromoxynil® 분해 니트릴라제 (bxn; [Stalker 1988])

- 예를 들어 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 ([Fraley 1983]; [Nehra 1994])를 코딩하는 카나마이신- 또는 게네티신 (G418) 저항성 유전자 (NPTII; NPT 또는 neo; [Potrykus 1985])

- 2-데속시글루코스 (Randez-Gil 1995)에 대한 저항성을 부여하는 2-데속시글루코스-6-포스페이트 포스파타제 (DOG^R1-유전자 산물; WO 98/45456; EP 0 807 836)

- 히그로마이신 (Vanden Elzen 1985)에 대한 저항성을 매개하는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT)

- 메토트렉세이트 (Thillet 1988)에 대한 저항성을 부여하는 변경된 디히드로폴레이트 리덕타제 (Eichholtz 1987)

- 5-메틸 트립토판에 대한 저항성을 부여하는 돌연변이된 안트라닐레이트 합성효소 유전자.

항생제에 대한 저항성을 부여하는 세균 기원의 추가의 음성 선택가능 마커 유전자는 항생제 스펙티노마이신에 대한 저항성을 부여하는 aadA 유전자, 겐타마이신 아세틸 트랜스퍼라제, 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제 (SPT), 아미노글리코시드-3-아데닐 트랜스퍼라제 및 블레오마이신 저항성 결정인자 ([Hayford 1988]; [Jones 1987]; [Svab 1990]; [Hille 1986])를 포함한다.

예를 들어, D-알라닌 및 D-세린과 같은 D-아미노산에 의해 야기되는 독성 효과에 대한 저항성을 부여하는 음성 선택 마커가 특히 바람직하다 (WO 03/060133; [Erikson 2004]). 상기 측면에서, 효모 로도토룰라 그라실리스 (Rhodotorula gracilis) (로도스포리듐 토룰로이데스 (Rhodosporidium toruloides))로부터의 dao1 유전자 (EC: 1.4.3.3: GenBank 기탁 번호 U60066) 및 이. 콜라이 유전자 dsdA (D-세린 탈수효소 (D-세린 데아미나제)) [EC: 4.3.1.18; GenBank 기탁 번호 J01603]가 음성 선택 마커로서 특히 바람직하다.

상기 마커 유전자를 발현하는 형질전환된 식물 물질 (예를 들어, 세포, 배, 조직 또는 묘목)은 형질전환되지 않은 야생형 조직의 성장을 억제하는 상응하는 선택 화합물 (예를 들어, 항생제 또는 제초제)의 농축액의 존재 하에 발생할 수 있다. 생성되는 식물은 통상적인 방식으로 번식 및 교배시킬 수 있다. 게놈 통합이 안정하고 유전되는 것을 보장하기 위해 2 이상의 세대를 성장시켜야 한다. 이에 대한 방법이 문헌에 설명되어 있다 ([Jenes 1993]; [Potrykus 1991]).

또한, (리포터 유전자의 종류에 따라) 선택 화합물로서 기질의 보충을 필요로 하거나 필요로 하지 않을 수 있는 리포터 유전자가 가시적인 스크리닝을 허용하기 위해 사용될 수 있다.

다양한 음성 선택 마커 유전자에 대해 다양한 시간 방식을 사용할 수 있다. 저항성 유전자 (예를 들어, 제초제 또는 D-아미노산에 대한)의 경우에, 선택은 바람직하게는 약 4주 동안의 캘러스 유도기 내내 및 적어도 4주 이상의 재생 동안 적용된다. 상기 선택 방식은 모든 선택 방식에 적용될 수 있다. 또한, 발근을 포함하여 전체 재생 방식에 걸쳐 선택을 유지하는 것도 가능하다 (명백하게 바람직하지는 않지만).

예를 들어, 선택 마커로서 포스피노트리신 저항성 유전자 (bar)를 사용할 때, 약 1 내지 50 mg/L의 포스피노트리신을 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어, 선택 마커로서 dao1 유전자를 사용할 때, 약 3 내지 100 mg/L의 D-세린 또는 D-알라닌을 배지에 첨가할 수 있다. 선택을 위한 전형적인 농도는 20 내지 40 mg/L이다. 예를 들어, 선택 마커로서 돌연변이된 ahas 유전자를 사용할 때, 약 3 내지 100 mg/L의 PURSUIT™을 배지에 첨가할 수 있다. 선택을 위한 전형적인 농도는 20 내지 40 mg/L이다.

2.3.3.1.2 양성 선택 마커

또한, 양성 선택 마커를 사용할 수 있다. 양성 선택 마커는 살생물 화합물의 해독을 유발하지 않지만, 상기 종류의 마커를 포함하는 세포 또는 유기체의 증가 또는 개선된 재생, 성장, 증식, 번식 등의 잇점을 부여하는 마커이다. 그 예는 이소펜테닐트랜스퍼라제 (시토키닌 미함유 배지 상에서의 선택에 의한 형질전환된 식물 세포의 재생을 촉진시키는 시토키닌 생합성의 핵심 효소; Ebinuma 2000a; Ebinuma 2000b; 예를 들어 균주 PO22로부터 유도됨; Genbank 기탁 번호 AB025109)이다. 형질전환되지 않은 것에 비해 형질전환된 식물 세포에게 성장 측면의 잇점을 부여하는 추가의 양성 선택 마커는 예를 들어 EP-A 0 601 092에 기재되어 있다. 성장 자극 선택 마커는 υ-글루쿠로니다제 (예를 들어 시토키닌 글루쿠로니드와 조합), 만노스-6-포스페이트 이소머라제 (만노스와 조합), UDP-갈락토스-4-에피머라제 (예를 들어, 갈락토스와 조합)를 포함할 수 있고 (이로 제한되지 않음), 만노스와 조합된 만노스-6-포스페이트 이소머라제가 특히 바람직하다.

2.3.3.1.3 역-선택 마커

절제시킬 표적 서열은 음성 선택 마커 또는 양성 선택 마커 (성공적으로 형질전환된 식물의 선택 및 단리를 용이하게 하기 위한) 뿐만 아니라, 성공적인 후속적인 마커 절제를 평가하기 위한 역-선택 마커를 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 음성 및/또는 양성 선택 마커 및 역-선택 마커는 모두 절제 서열에 의해 플랭킹되고, 절제 효소의 작용에 의해 결실/절제된다. 역-선택 마커는 상기 마커를 포함하는 규정된 결실 서열을 갖는 유기체의 선택에 특히 적합하다 (Koprek 1999). 역-선택 마커는 비-독성 화합물을 독성 화합물로 전환시킬 수 있는 효소를 코딩하는 서열이다. 그 결과, 상기 역-선택 마커가 결여된 세포만이 상기 비-독성 화합물 처리시에 생존하고, 따라서 성공적으로 서열 (예를 들어, 마커) 결실이 이루어진 세포의 선택이 가능하게 된다. 당업계에 공지된 전형적인 역-선택 마커는 예를 들어 다음과 같다:

a) 5-플루오로시토신 (5-FC)과 조합된 시토신 데아미나제 (CodA) (WO 93/01281; US 5,358,866; [Gleave AP et al. 1999]; [Perera RJ et al. 1993]; [Stougaard J 1993]; EP-A1 595 837; [Mullen CA et al. 1992]; [Kobayashi T et al. 1995]; [Schlaman HRM & Hooykaas PFF 1997]; [Xiaohui Wang H et al. 2001]; [Koprek T et al. 1999]; [Gleave AP et al. 1999]; [Gallego ME 1999]; [Salomon S & Puchta H 1998]; [Thykjaer T et al. 1997]; [Serino G 1997]; [Risseeuw E 1997]; [Blanc V et al. 1996]; [Corneille S et al. 2001]).

b) 술포닐우레아 프로-제초제 R7402 (2-메틸에틸-2,3-디히드로-N-[(4,6-디메톡시피리미딘-2-일)아미노카르보닐]-1,2-벤조이소티아졸-7-술폰아미드-1,1-디옥사이드)와 조합된 시토크롬 P-450 효소 ([O'Keefe DP et al. 1994]; [Tissier AF et al. 1999]; [Koprek T et al. 1999]; [O'Keefe DP 1991]).

c) 나프탈아세트아미드 (NAM)와 조합된 인돌아세트산 히드롤라제, 예를 들어 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 tms2 유전자 산물 ([Fedoroff NV & Smith DL 1993]; [Upadhyaya NM et al. 2000]; [Depicker AG et al. 1988]; [Karlin-Neumann GA et al. 1991]; [Sundaresan V et al. 1995]; [Cecchini E et al. 1998]; [Zubko E et al. 2000]).

d) 1,2-디클로로에탄 (DCE)과 조합된, 잔토박터 오토트로피쿠스 (Xanthobacter autotropicus) GJ10으로부터의 할로알칸 데할로게나제 (dhlA 유전자 산물) ([Naested H et al. 1999]; [Janssen DB et al. 1994]; [Janssen DB 1989]).

e) 아시클로비르, 간시클로비르 또는 1,2-데옥시-2-플루오로-υ-D-아라비노푸라노실-5-요오도우라실 (FIAU)과 조합된, 예를 들어 1형 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 (TK) (TK HSV-1) ([Czako M & Marton L 1994]; [Wigler M et al. 1977]; [McKnight SL et al. 1980]; [McKnight SL et al. 1980]; [Preston et al. 1981]; [Wagner et al. 1981]; [St. Clair et al. 1987]).

몇몇 다른 역선택 시스템은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 국제 특허 출원 WO 04/013333; 개요에 대해서는 13 내지 20 페이지 참조; 본원에 참고로 포함됨).

2.3.3.1.4. 스크리닝가능한 마커

사용될 수 있는 스크리닝가능한 마커 (또한 리포터 유전자 또는 단백질로도 불림; [Schenborn E, Groskreutz D. 1999])는 베타-글루쿠로니다제 (GUS; [Jefferson et al. 1987]) 또는 그에 대한 다양한 발색 기질이 알려진 효소를 코딩하는 uidA 유전자; 식물 조직에서 안토시아닌 색소 (적색)의 생산을 조절하는 산물을 코딩하는 R-로커스 유전자 (Della-porta 1988); 그에 대한 다양한 발색 기질이 알려진 효소를 코딩하는 베타-락타마제 유전자 (Sutcliffe 1978) (예를 들어, PADAC, 발색 세팔로스포린); 발색 카테콜을 전환시킬 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xyIE 유전자 (Zukowsky 1983); υ-아밀라제 유전자 (Ikuta 1990); 타이로신을 DOPA 및 도파퀴논 (이는 다시 축합되어 쉽게 검출가능한 화합물 멜라닌을 형성함)으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 타이로시나제 유전자 (Katz 1983); 그에 대한 발색 기질이 존재하는 효소를 코딩하는 υ-갈락토시다제 유전자; 생물발광 검출을 허용하는 루시퍼라제 (lux) 유전자 (Ow 1986; [Millar et al. 1992]); 또는 심지어 칼슘-감수성 생물발광 검출에 사용될 수 있는 에쿼린 유전자 (Prasher 1985), 또는 초록 형광 단백질 유전자 (GFP) ([Niedz 1995]; [Chui WL et al. 1996]; [Leffel SM et al. 1997]; [Sheen et al. 1995]; [Haseloff et al. 1997]; [Reichel et al. 1996]; [Tian et al. 1997])를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

옥수수 R 유전자 복합체로부터의 유전자가 스크리닝가능한 마커로서 특히 유용한 것으로 고려된다. 옥수수에서 R 유전자 복합체는 대부분의 종자 및 식물 조직에서 안토시아닌 색소의 생산을 조절하는 작용을 하는 단백질을 코딩한다. R 유전자 복합체로부터의 유전자는 옥수수 형질전환에 적용되었고, 그 이유는 형질전환된 세포에서 이 유전자의 발현이 세포에 해를 끼치지 않기 때문이다. 따라서, 상기 세포 내로 도입된 R 유전자는 적색 색소의 발현을 유도하고, 안정적으로 통합될 경우 적색 섹터 (red sector)로서 가시적으로 평가될 수 있다. 옥수수 세포주가 안토시아닌 생합성 경로에서 효소적 중간체를 코딩하는 유전자 (C2, A1, A2, Bz1 및 Bz2)에 대해 우성이지만, R 로커스의 열성 대립유전자를 보유할 경우, R을 갖는 상기 세포주로부터의 임의의 세포의 형질전환은 적색 색소를 형성시킬 것이다. 예시적인 세포주는 rg-Stadler 대립유전자 및 TR112 (r-g, b, P1인 K55 유도체)를 함유하는 Wisconsin 22를 포함한다. 별법으로, C1 및 R 대립유전자가 함께 도입된다면 옥수수의 임의의 유전자형이 사용될 수 있다.

R 유전자 조절 구역이 키메라 유전자의 발현을 조절하는 메카니즘을 제공하기 위해 키메라 구성체에 사용될 수 있음이 추가로 제안된다. 보다 다양한 표현형 발현은 임의의 다른 로커스보다 R 로커스에서 알려져 있다 (Coe 1988). 구조적 R 유전자의 5'에 위치하는 구역으로부터 얻은 조절 구역이 유전자, 예를 들어, 곤충 저항성, 가뭄 저항성, 제초제 내성 또는 다른 단백질 코딩 구역의 발현의 유도에 유용할 것이 고려된다. 본 발명의 목적에서, 임의의 다양한 R 유전자 패밀리 멤버가 성공적으로 사용될 수 있다고 생각된다 (예를 들어, P, S, Lc 등). 그러나, 일반적으로 Sn (특히 Sn:bol3)이 가장 바람직할 것이다. Sn은 R 유전자 복합체의 우성 멤버이고, Sn이 특정 묘목 및 식물 세포에서 안토시아닌 색소의 조직 특이적 침착을 조절하고, 따라서 그의 표현형이 R과 유사하다는 점에서 R 및 B 로커스와 기능적으로 유사하다.

본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 추가의 스크리닝가능한 마커는 lux 유전자에 의해 코딩되는 반딧불이 루시퍼라제이다. 형질전환된 세포 내의 lux 유전자의 존재는 예를 들어 X-선 필름, 섬광 계수 (scintillation counting), 형광 분광광도법, 저조도 비데오 카메라, 광자 계수 카메라 또는 멀티웰 발광 측정법 (multiwell luminometry)을 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 상기 시스템이 조직 배양 플레이트 상의 생물발광에 대한 집단 스크리닝, 또는 심지어 전체 식물 스크리닝을 위해 개발될 수 있음도 생각된다. 스크리닝가능한 마커 유전자, 예를 들어 lux 또는 GFP의 사용이 필요한 경우, 스크리닝가능한 마커 유전자와 선택가능 마커 유전자 사이의 유전자 융합, 예를 들어 GFP-NPTII 유전자 융합을 생성시킴으로써 유리하게 수행할 수 있다. 이를 통해, 예를 들어 형질전환된 세포의 선택, 이어서 트랜스제닉 식물 또는 종자의 스크리닝을 수행할 수 있다.

2.3.3.1.5. 이중 기능 마커

본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 표적 서열은 이중 기능 마커이다. 용어 이중 기능 마커는 음성 또는 역-선택 마커로서 사용될 기회를 하나의 서열에 조합한 마커에 관한 것이다. 어떠한 효과가 달성되는지에 대한 선택은 스크리닝 과정에 사용되는 기질에 따라 결정되다. 가장 바람직하게는, 이중 기능 마커는 D-아미노산 옥시다제이다. 상기 효소는 D-아미노산을 전환시킬 수 있다. 일부 D-아미노산은 식물에 독성이고, 효소의 작용에 의해 해독된다. 다른 D-아미노산은 식물에 무해하지만, 효소에 의해 독성 화합물로 전환된다.

용어 D-아미노산 옥시다제 (약어 DAAO, DAMOX, 또는 DAO)는 바람직하게는 기질로서 산소 (O₂)를 사용하고 부산물로서 과산화수소 (H₂O₂)를 생산함으로써 D-아미노산을 2-옥소산으로 전환시키는 효소를 나타낸다 ([Dixon M & Kleppe K Biochim. Biophys. Acta 96 (1965) 357-367]; [Dixon M & Kleppe K Biochim. Biophys. Acta 96 (1965) 368-382]; [Dixon M & Kleppe Biochim. Biophys. Acta 96 (1965) 383-389]; [Massey V et al. Biochim. Biophys. Acta 48 (1961) 1-9]; [Meister A & Wellner D Flavoprotein amino acid oxidase. In: Boyer, P. D., Lardy, H. and Myrback, K. (Eds.), 1963])

DAAO는 EC (Enzyme Commission) 넘버 EC 1.4.3.3.와 함께 생화학 및 분자 생물학 국제 연맹의 명명 위원회 (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB))에 의해 설명될 수 있다. 일반적으로, EC 1.4.3.3. 클래스의 DAAO 효소는 중성 및 염기성 D-아미노산의 그의 상응하는 케토산으로의 산화를 촉매하는 FAD 플라보효소 (flavoenzyme)이다. DAAO는 DAAO가 퍼옥시좀에 위치하는 것으로 알려진 진균 및 척추동물에서 특성화 및 서열결정되었다. 용어 D-아미노 옥시다제는 추가로 동일한 반응을 촉매하는 DAAO에 구조적으로 관련되지만 디카르복실 D-아미노산에 대해서만 활성을 보이는 효소인 D-아스파르테이트 옥시다제 (EC 1.4.3.1) (DASOX)를 추가로 포함한다 (Negri A et al. 1992). 본 발명에서, EC 1.4.3.3. 클래스의 DAAO가 바람직하다.

DAAO에서, 보존된 히스티딘이 효소의 촉매 활성에 중요한 것으로 나타났다 (Miyano M et al. 1991). 본 발명의 바람직한 실시태양에서, DAAO는 다음 컨센서스 모티프를 포함하는 단백질로 언급된다:

[LIVM]-[LIVM]-H^*-[NHA]-Y-G-x-[GSA]-[GSA]-x-G-x₅-G-x-A

여기서, 중괄호 내의 아미노산 잔기는 각각의 위치에 대한 선택적인 잔기를 나타내고, x는 임의의 아미노산 잔기이고, 첨자는 연속적인 아미노산 잔기의 각각의 숫자를 나타낸다. 개별 아미노산 잔기의 약어는 상기 규정된 그의 표준 IUPAC 의미를 갖는다. 상기 모티프를 포함하는 추가의 가능한 DAAO 효소를 표 3에 기재한다.

다양한 유기체로부터의 적합한 D-아미노산 옥시다제. 기탁 번호는 SwisProt 데이타베이스로부터의 단백질 서열을 의미한다.

기탁 번호	유전자 명칭	설명	공급 유기체	길이
Q19564	F18E3.7	추정 D-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO)	카에노르합디티스 엘레간스	334
P24552		D-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO)	푸사리움 솔라니 (아종 pisi) (넥트리아 해마토코카) (Nectria haematococca)	361
P14920	DAO, DAMOX	D-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO)	호모 사피엔스 (인간)	347
P18894	DAO, DAO1	D-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO)	무스 무스쿨루스 (마우스)	346
P00371	DAO	D-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO)	수스 스크로파 (돼지)	347
P22942	DAO	D-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO)	오릭톨라구스 쿠니쿨루스 (토끼)	347
O35078	DAO	D-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO)	라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus) (래트)	346
P80324	DAO1	D-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO)	로도스포리듐 토룰로이데스(효모)(로도토룰라 그라실리스)	368
U60066	DAO	D-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO)	로도스포리듐 토룰로이데스, 균주 TCC26217	368
Q99042	DAO1	D-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO)	트리고놉시스 바리아빌리스 (효모)	356
P31228	DDO	D-아스파르테이트 옥시다제 (EC 1.4.3.1) (DASOX) (DDO)	보스 타우루스 (소)	341
Q99489	DDO	D-아스파르테이트 옥시다제 (EC 1.4.3.1) (DASOX) (DDO)	호모 사피엔스 (인간)	341

기탁 번호	유전자 명칭	설명	공급 유기체	길이
Q9C1L2	NCU06558.1	(AF309689) 추정 D-아미노산 옥시다제 G6G8.6 (가상 단백질)	네우로스포라 크라사 (Neurospora crassa)	362
Q7SFW4	NCU03131.1	가상 단백질	네우로스포라 크라사	390
Q8N552		D-아스파르테이트 옥시다제와 유사	호모 사피엔스 (인간)	369
Q7Z312	DKFZP686F0 4272	가상 단백질 DKFZp686F04272	호모 사피엔스 (인간)	330
Q9VM80	CG11236	CG11236 단백질 (GH12548p)	드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (과일파리)	341
O01739	F20H11.5	F20H11.5 단백질	카에노르합디티스 엘레간스	383
O45307	C47A10.5	C47A10.5 단백질	카에노르합디티스 엘레간스	343
Q8SZN5	CG12338	RE73481p	드로소필라 멜라노가스터 (과일파리)	335
Q9V5P1	CG12338	CG12338 단백질 (RE49860p)	드로소필라 멜라노가스터 (과일파리)	335
Q86JV2		보스 타우루스 (소)와 유사 D-아스파르테이트 옥시다제 (EC 1.4.3.1) (DASOX) (DDO)	딕티오스텔리움 디스코이데움 (Dictyostelium discoideum) (점균류)	599
Q95XG9	Y69A2AR.5	가상 단백질	카에노르합디티스 엘레간스	322

기탁 번호	유전자 명칭	설명	공급 유기체	길이
Q7Q7G4	AGCG53627	AgCP5709 (단편)	아노펠레스 감비아에 (Anopheles gambiae) 균주 PEST	344
Q7PWY8	AGCG53442	AgCP12432 (단편)	아노펠레스 감비아에 균주 PEST	355
Q7PWX4	AGCG45272	AgCP12797 (단편)	아노펠레스 감비아에 균주 PEST	373
Q8PG95	XAC3721	D-아미노산 옥시다제	잔토모나스 악소노포디스 (Xanthomonas axonopodis) (pv. citri)	404
Q8P4M9	XCC3678	D-아미노산 옥시다제	잔토모나스 악소노포디스 (pv. campestris)	405
Q9X7P6	SCO6740, SC5F2A.23C	추정 D-아미노산 옥시다제	스트렙토마이세스 코엘리콜로르	320
Q82M18	DAO, SAV1672	추정 D-아미노산 옥시다제	스트렙토마이세스 아버르미틸리스 (Streptomyces avermitilis)	317
Q8VCW7	DAO1	D-아미노산 옥시다제	무스 무스쿨루스 (마우스)	345
Q9Z302		D-아미노산 옥시다제	크리세툴루스 그리세우스 (Cricetulus griseus) (차이니즈 햄스터)	346
Q9Z1M5		D-아미노산 옥시다제	카비아 포르셀루스 (Cavia porcellus) (기니아 피그)	347
Q922Z0		D-아스파르테이트 옥시다제와 유사	무스 무스쿨루스 (마우스)	341
Q8R2R2		가상 단백질	무스 무스쿨루스 (마우스)	341
P31228		D-아스파르테이트 옥시다제	비. 타우루스	341

D-아미노산 옥시다제 (EC-넘버 1.4.3.3)는 돼지, 인간, 래트, 효모, 세균 또는 진균을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 유기체로부터 단리될 수 있다. 유기체의 예는 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 트리고놉시스 바리아빌리스 (Trigonopsis variabilis), 네우로스포라 크라사, 클로렐라 불가리스, 및 로도토룰라 그라실리스이다. 적합한 D-아미노산 대사 폴리펩티드는 예를 들어 효모 (예를 들어 로도토룰라 그라실리스), 진균, 또는 동물로부터의 진핵생물 효소일 수 있거나 또는 예를 들어 세균, 예를 들어 이. 콜라이로부터의 원핵생물 효소일 수 있다. D-아미노산을 대사하는 적합한 폴리펩티드의 예를 표 4에 제시한다.

GenBank 기탁 번호	공급 유기체
Q19564	카에노르합디티스 엘레간스. F18E3.7
P24552	푸사리이 솔라니 (아종. pisi) (넥트리아 해마토코카)
JX0152	푸사리움 솔라니
P14920	호모 사피엔스 (인간)
P18894	무스 무스쿨루스 (마우스)
P00371	수스 스크로파 (돼지)
P22942	오릭톨라구스 쿠니쿨루스 (토끼)
O35078	라투스 노르베기쿠스 (래트)
P80324	로도스포리듐 토룰로이데스 (효모) (로도토룰라 그라실리스)
Q99042	트리고놉시스 바리아빌리스
Q9Y7N4	쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (분열 효모) SPCC1450
O01739	카에노르합디티스 엘레간스. F20H11.5
Q28382	수스 스크로파 (돼지)
O33145	미코박테리움 레프라에 (Mycobacterium leprae)
Q9X7P6	스트렙토마이세스 코엘리콜로르. SCSF2A.23C
Q9JXF8	네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis) (혈청군 B)
Q9Z302	크리세툴루스 그리세우스 (차이니즈 햄스터)
Q921M5	D-아미노산 옥시다제. 카비아 포르셀루스 (기니아 피그)

바람직하게는, D-아미노산 옥시다제는 다음 표 5로부터 선택된 핵산 서열에 의해 코딩되는 효소 또는 상응하는 아미노산 서열로부터 선택된다.

다양한 유기체로부터의 적합한 D-아미노산 옥시다제. 기탁 번호는 GenBank 데이타베이스로부터의 단백질 서열을 나타낸다.

GenBank 기탁 번호	유기체
U60066	로도스포리듐 토룰로이데스 (효모)
Z71657	로도토룰라 그라실리스
A56901	로도토룰라 그라실리스
AF003339	로도스포리듐 토룰로이데스
AF003340	로도스포리듐 토룰로이데스
U53139	카에노르합디티스 엘레간스
D00809	넥트리아 해마토코카
Z50019	트리고놉시스 바리아빌리스
NC_003421	쉬조사카로마이세스 폼베 (분열 효모)
AL939129	스트렙토마이세스 코엘리콜로르 A3(2)
AB042032	칸디다 보이디니이 (Candida boidinii)

DAAO는 잘 특성화된 효소이고, 그의 결정 구조 및 그의 촉매 메카니즘은 고해상 X-선 분광법에 의해 결정되었다 (Umhau S. et al. 2000). DAAO는 퍼옥시좀 내에 존재하는 플라보효소이고, 그의 동물에서 인정된 기능은 D-아미노산의 해독이다 (Pilone MS 2000). 또한, 이것은 효모가 성장을 위해 D-아미노산을 이용하는 것을 가능하게 한다 (Yurimoto H et al. 2000). 상기 입증된 바와 같이, 몇몇의 상이한 종으로부터의 DAAO가 특성화되었고, 이들은 기질 친화도가 약간 상이한 것으로 밝혀졌지만 (Gabler M et al. 2000), 일반적으로 넓은 기질 특이성을 나타내고, 모든 D-아미노산을 산화적으로 탈아민화시킨다 (EC 1.4.3.3. 크래스 DAAO 효소에 대해서는 D-글루타메이트 및 D-아스파르테이트 제외; [Pilone MS 2000]).

DAAO 활성이 많은 진핵생물에서 발견되었지만 (Pilone MS 2000), 식물에서는 DAAO 활성이 보고되지 않았다. 식물에서 D-아미노산 대사를 위한 낮은 능력은 식물이 D-아미노산에 반응하는 방식에 크게 중요하다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 DNA-구성체로부터 발현된 D-아미노산 옥시다제는 바람직하게는 D-알라닌, D-세린, D-이소류신, D-발린, 및 그의 유도체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산에 대한 효소 활성을 갖는다.

적합한 D-아미노산 옥시다제는 또한 상기 예시된 폴리펩티드의 단편, 돌연변이체, 유도체, 변이체 및 대립유전자를 포함한다. 적합한 단편, 돌연변이체, 유도체, 변이체 및 대립유전자는 상기 규정된 D-아미노산 옥시다제의 기능적인 특성을 보유하는 것이다. 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 생성시키기 위한 서열에 대한 변경은 핵산 내의 하나 이상의 뉴클레오티드의 하나 이상의 부가, 삽입, 결실 또는 치환에 의해, 코딩되는 폴리펩티드에 하나 이상의 아미노산의 부가, 삽입, 결실 또는 치환을 형성시킴으로써 이루어질 수 있다. 물론, 코딩된 아미노산 서열에 대한 차이를 만들지 않는 핵산에 대한 변경도 포함된다.

본 발명의 D-아미노산 옥시다제는 시토졸, 퍼옥시좀, 또는 식물 세포의 다른 세포내 구획에서 발현될 수 있다. D-아미노산 대사 폴리펩티드의 구획화는 DAAO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 통과 펩티드를 코딩하는 서열에 융합시켜 융합 단백질을 생성시킴으로써 달성될 수 있다. 상기 통과 펩티드 없이 발현된 유전자 산물은 일반적으로 시토졸에 축적된다. 발현된 DAAO가 퍼옥시좀에 편재하면 H₂O₂ 분해 효소인 카탈라제에 의해 대사될 수 있는 H₂O₂가 생성된다. 따라서, 손상 수준의 H₂O₂를 생성하기 위해 보다 높은 수준의 D-아미노산이 필요할 수 있다. 카탈라제 활성 수준이 보다 낮은 시토졸에서 DAAO가 발현되면 손상 수준의 H₂O₂를 생성하기 위해 필요한 D-아미노산의 양이 감소한다. 시토졸에서의 DAAO의 발현은 코딩 핵산 서열로부터 퍼옥시좀 표적화 신호 또는 통과 펩티드를 제거함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 효모 로도토룰라 그라실리스 (로도스포리듐 토룰로이데스)의 dao1 유전자 (EC: 1.4.3.3: GenBank 기탁 번호 U60066)를 문헌에 기재된 바와 같이 클로닝하였다 (WO 03/060133). 마지막 9개의 뉴클레오티드는 단백질을 퍼옥시좀 하위 세포 소기관으로 유도하는 신호 펩티드 SKL을 코딩한다. 시토졸과 퍼옥시좀에서 발현된 DAAO 사이에서 유의한 차이가 관찰되지 않았지만, 퍼옥시좀에서 발현된 구성체가 시토졸에서 발현된 버전보다 30 mM D-Asn의 DAAO 트랜스제닉 식물의 발아 억제에 대해 약간 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 두 구성체 모두는 야생형보다 유의하게 억제되고, 따라서 조건적 역선택에 사용될 수 있다.

이중 기능 마커의 추가의 변형 및 용도는 EP 특허 출원 04006358.8 (SweTree Technologies AB & BASF; IMPROVED CONSTRUCTS FOR MARKER EXCISION BASED ON DUAL-FUNCTION SELECTION MARKER) 및 이를 기초로 한 우선권을 주장하는 추가의 국가 및 국제 특허 출원에 개시되어 있다.

2.3.4. 마커 유전자 및 다른 서열의 발현

마커 유전자 (또는 본 발명의 DNA 구성체 중의 하나로부터 발현될 수 있는 다른 서열)는 식물에서 기능성인 임의의 프로모터에 의해 발현될 수 있다. 이들 프로모터는 구성적, 유도가능, 시간적으로 조절된, 발달 단계에서 조절된, 공간적으로-조절된, 화학적으로 조절된, 스트레스-반응성, 조직-특이적, 바이러스 및 합성 프로모터를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 프로모터는 감마 제인 프로모터, 올레오신 ole16 프로모터, 글로불린 프로모터, 액틴 1 프로모터, 액틴 cl 프로모터, 수크로스 합성효소 프로모터, INOPS 프로모터, EXM5 프로모터, 글로불린2 프로모터, υ-32, ADPG-피로포스포릴라제 프로모터, Ltp1 프로모터, Ltp2 프로모터, 올레오신 ole17 프로모터, 올레오신 ole18 프로모터, 액틴 2 프로모터, 화분-특이적 단백질 프로모터, 화분-특이적 펙테이트 리아제 프로모터, 꽃밥-특이적 단백질 프로모터, 꽃밥-특이적 유전자 RTS2 프로모터, 화분-특이적 유전자 프로모터, 테이프턴 (tapeturn)-특이적 유전자 프로모터, 테이프턴-특이적 유전자 RAB24 프로모터, 안트라닐레이트 합성효소 알파 서브유닛 프로모터, 알파 제인 프로모터, 안트라닐레이트 합성효소 베타 서브유닛 프로모터, 디히드로디피콜리네이트 합성효소 프로모터, Thil 프로모터, 알콜 데히드로게나제 프로모터, cab 결합 단백질 프로모터, H3C4 프로모터, RUBISCO SS 전분 분지 효소 프로모터, ACCase 프로모터, 액틴3 프로모터, 액틴7 프로모터, 조절 단백질 GF14-12 프로모터, 리보좀 단백질 L9 프로모터, 셀룰로스 생합성 효소 프로모터, S-아데노실-L-호모시스테인 히드롤라제 프로모터, 수퍼옥시드 디스뮤타제 프로모터, C-키나제 수용체 프로모터, 포스포글리세레이트 뮤타제 프로모터, 뿌리-특이적 RCc3 mRNA 프로모터, 글루코스-6 포스페이트 이소머라제 프로모터, 피로포스페이트-프럭토스 6-포스페이트포스포트랜스퍼라제 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 베타-케토아실-ACP 합성효소 프로모터, 33 kDa 광시스템 (photosystem) 11 프로모터, 산소 방출 단백질 프로모터, 69 kDa 액포 ATPase 서브유닛 프로모터, 메탈로티오네인-유사 단백질 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 프로모터, ABA- 및 성숙-유도가능-유사 단백질 프로모터, 페닐알라닌 암모니아 리아제 프로모터, 아데노신 트리포스파타제 S-아데노실-L-호모시스테인 히드롤라제 프로모터, υ-튜불린 프로모터, cab 프로모터, PEPCase 프로모터, R 유전자 프로모터, 렉틴 프로모터, 집광 (light harvesting) 복합체 프로모터, 열 충격 단백질 프로모터, 칼콘 합성효소 프로모터, 제인 프로모터, 글로불린-1 프로모터, ABA 프로모터, 옥신-결합 단백질 프로모터, UDP 글루코스 플라보노이드 글리코실-트랜스퍼라제 유전자 프로모터, NTI 프로모터, 액틴 프로모터, 오페이크 2 프로모터, b70 프로모터, 올레오신 프로모터, CaMV 35S 프로모터, CaMV 34S 프로모터, CaMV 19S 프로모터, 히스톤 프로모터, 팽압-유도가능 프로모터, 완두콩 작은 서브유닛 RuBP 카르복실라제 프로모터, Ti 플라스미드 만노핀 합성효소 프로모터, Ti 플라스미드 노팔린 합성효소 프로모터, 페투니아 칼콘 이소머라제 프로모터, 콩 글라이신 풍부 단백질 I 프로모터, CaMV 35S 전사체 프로모터, 감자 파타틴 프로모터, 또는 S-E9 작은 서브유닛 RuBP 카르복실라제 프로모터일 수 있다.

3. 트랜스젠 발현의 분석

재생된 식물에서 외인성 DNA의 존재를 확인하기 위해서, 다양한 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석은 예를 들어, 분자 생물학적 분석, 예를 들어 서던 및 노던 블로팅 및 PCR; 생화학적 분석, 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의한 또는 효소 기능에 의한 단백질 산물의 존재 검출; 식물의 일부 분석, 예를 들어 잎 또는 뿌리 분석; 및 일부 경우에 재생된 전체 식물의 표현형 분석을 포함한다. 트랜스젠 발현 및 프로모터 기능의 효율 결정에 유용한 추가의 분석은 또한 형광 계내 혼성화 (FISH), 직접적인 DNA 서열결정, 간헐 전기장 (pulsed field) 겔 전기영동 (PFGE) 분석, 단일가닥 입체형태 분석 (SSCA), RNase 보호 분석, 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO), 도트 (dot) 블롯 분석, 변성 구배 겔 전기영동, RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RFLP 및 PCR-SSCP를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기 분석은 당업자에게 알려져 있다 (또한, 상기 참조).

4. 본 발명의 형질전환된 (트랜스제닉) 식물 및 제조 방법

외떡잎 식물 종은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 본 발명의 DNA 구성체로 형질전환될 수 있다. 기관발생 또는 배발생에 의해 후속 클론 증식이 가능한 임의의 식물 조직이 형질전환될 수 있다. 용어 "기관발생"은 본원에서 사용될 때 싹 및 뿌리가 분열조직 중심으로부터 순차적으로 발생하는 과정을 의미하고; 용어 "배발생"은 본원에서 사용될 때 싹 및 뿌리가 체세포 또는 생식세포로부터 일시적인 방식으로 (비순차적으로) 함께 발생하는 과정을 의미한다. 선택된 특정 조직은 형질전환되는 특정 종에 대해 이용가능하고 이 종에 가장 적합한 클론 증식 시스템에 따라 상이할 것이다. 예시적인 조직 표적은 잎 절편, 화분, 배, 떡잎, 배축, 대배우체, 캘러스 조직, 존재하는 분열 조직 (예를 들어, 정단 분열조직, 액아, 및 뿌리 분열조직), 및 유도된 분열조직 조직 (예를 들어, 떡잎 분열조직 및 울티란 분열조직)을 포함한다.

본 발명의 식물은 다양한 형태를 취할 수 있다. 식물은 형질전환된 세포 및 형질전환되지 않은 세포의 키메라일 수 있고; 식물은 클론 형질전환체 (예를 들어, 발현 카세트를 포함하도록 형질전환된 모든 세포)일 수 있고; 식물은 형질전환된 및 형질전환되지 않은 조직의 이식편 (예를 들어, 감귤 종에서 형질전환되지 않은 접순에 접목된 형질전환된 근경)을 포함할 수 있다. 형질전환된 식물은 다양한 수단에 의해, 예를 들어 클론 증식 또는 전통적인 번식 기술에 의해 증식될 수 있다. 예를 들어, 제1 세대 (또는 T1) 형질전환된 식물은 자가수분되어 동종접합성 제2 세대 (또는 T2) 형질전환된 식물을 생성시킬 수 있고, T2 식물은 전통적인 번식 기술을 통해 추가로 증식할 수 있다. 우성 선택가능 마커 (예를 들어 nptII)는 번식을 돕기 위해 발현 카세트와 연합될 수 있다.

따라서, 본 발명은 식물체 내에 또는 식물체 외에 형질전환된 색소체 또는 다른 소기관, 예를 들어, 핵, 미토콘드리아 또는 엽록체를 포함하는 형질전환된 (트랜스제닉) 외떡잎 식물 및 외떡잎 식물 세포를 제공한다. 본 발명은 상기 정의 섹션에서 특정된 식물 종으로부터의 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 외떡잎 식물 종의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 트랜스제닉 식물은 작물 식물, 특히 곡식 (예를 들어, 옥수수, 알팔파, 벼, 보리, 사탕수수, 밀, 기장 등), 훨씬 더 바람직하게는 옥수수, 밀 및 벼이다. 본 발명의 다른 실시태양은 상기 외떡잎 식물의 세포, 세포 배양액, 조직, 일부 (예를 들어 식물 기관, 잎, 뿌리 등) 및 증식 물질 (예를 들어 종자)에 관련된다.

외떡잎 식물의 형질전환은 단일 DNA 분자 또는 다수의 DNA 분자들 (즉, 동시-형질전환)을 사용하여 실시될 수 있고, 상기 두 기술은 본 발명의 발현 카세트와 함께 사용하기 적합하다. 수많은 형질전환 벡터가 식물 형질전환에 이용가능하고, 본 발명의 발현 카세트는 임의의 상기 벡터와 함께 사용될 수 있다. 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술 및 형질전환을 위한 표적 종에 따라 결정될 것이다.

식물 세포 숙주 내로 구성체를 도입하기 위한 다양한 기술이 이용가능하고, 당업자에게 알려져 있다. 이들 기술은 일반적으로 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 에이. 리조게네스 (A. rhizogenes)를 형질전환제로서 사용하는 DNA를 이용한 형질전환, 리포좀, PEG 침전, 전기천공, DNA 주사, 직접 DNA 흡수, 미세발사 (microprojectile) 폭격, 입자 가속 등을 포함한다 (예를 들어, EP 295959 및 EP 138341 참조). 그러나, 식물 세포 이외의 세포도 본 발명의 발현 카세트로 형질전환될 수 있다. 식물 발현 벡터 및 리포터 유전자, 및 아그로박테리움 및 아그로박테리움-매개 유전자 전달에 대한 일반적인 설명은 문헌 [Gruber et al. (1993)]에서 볼 수 있다.

게놈 또는 합성 단편을 함유하는 발현 벡터가 원형질체 내로 또는 무손상 조직 또는 단리된 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 발현 벡터는 무손상 조직 내로 도입된다. 식물 조직을 배양하는 일반적인 방법은 예를 들어 문헌 ([Maki et al., (1993)]; 및 [Phillips et al. (1988)])에 제시되어 있다. 바람직하게는, 발현 벡터는 직접적인 유전자 전달 방법, 예를 들어 미세발사-매개 전달, DNA 주사, 전기천공 등을 사용하여 옥수수 또는 다른 식물 조직 내로 도입된다. 보다 바람직하게는, 발현 벡터는 바이올리스틱 장치에 의해 미세발사 매질 전달을 사용하여 식물 조직 내로 도입된다 (예를 들어, [Tomes et al. (1995)] 참조). 본 발명의 벡터는 구조 유전자의 발현에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 조직의 변종에서 차별적인 유전자 발현을 검출하기 위한 엑손-포획 클로닝, 또는 프로모터 포획 절차에도 사용될 수 있다 ([Lindsey 1993]; [Auch & Reth 1990]).

아그로박테리움 spp의 Ti 및 Ri 플라스미드의 이원형 벡터를 사용하는 것이 특히 바람직하다. Ti-유도된 벡터는 외떡잎식물 및 쌍떡잎 식물, 예를 들어 대두, 면화, 평지, 담배, 및 벼를 포함하는 매우 다양한 보다 고등한 식물을 형질전환시킨다 ([Pacciotti 1985]; [Byrne 1987]; [Sukhapinda 1987]; [Lorz 1985]; [Potrykus, 1985]; [Park 1985]; [Hiei 1994]). 식물 세포를 형질전환시키기 위한 T-DNA의 사용에 대해 심도있게 연구되었고, 문헌에 상세하게 기재되어 있다 (EP 120516; [Hoekema, 1985]; [Knauf, 1983]; 및 [An 1985]). 식물 내로의 도입을 위해, 본 발명의 키메라 유전자는 실시예에서 설명되는 바와 같이 이원 벡터 내로 삽입될 수 있다.

다른 형질전환 방법, 예를 들어 외래 DNA 구성체의 직접 흡수 (EP 295959 참조), 전기천공 기술 (Fromm 1986) 또는 핵산 구성체로 코팅된 금속 입자를 사용한 고속 탄도 (ballistic) 폭격 ([Kline 1987], 및 US 4,945,050)이 당업자에게 이용가능하다. 일단 형질전환되면, 세포는 당업자에 의해 재생될 수 있다.

당업자는 방법의 선택이 형질전환을 위해 표적화된 외떡잎 식물의 종류에 따라 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 식물 세포의 형질전환에 적합한 방법은 미세주사 (Crossway 1986), 전기천공 (Riggs 1986), 아그로박테리움-매개 형질전환, 직접적인 유전자 전달 (Paszkowski 1984) 및 아그라세터스, 인크. (Agracetus, Inc., 미국 위스콘신주 매디슨) 및 바이오라드 (BioRad, 미국 캘리포니아주 허큘레스)로부터 입수가능한 장치를 사용한 탄도 입자 가속 (예를 들어, US 4,945,050; 및 [McCabe 1988] 참조)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, [Datta 1990 (벼)]; [Klein 1988 (옥수수)]; [Klein 1988 (옥수수)]; [Klein 1988 (옥수수)]; [Fromm 1990 (옥수수)]; 및 [Gordon-Kamm 1990 (옥수수)]; [Koziel 1993 (옥수수)]; [Shimamoto 1989 (벼)]; [Christou 1991 (벼)]; 유럽 특허 출원 EP 0 332 581 (새발풀 및 다른 포아풀아과); [Vasil 1993 (밀)]; [Weeks 1993 (밀)], [Li 1993] 및 [Christou 1995 (벼)]; [Osjoda 1996 (아그로박테리움 투메파시엔스를 통한 옥수수)], [Hiei 1994 (벼)], 및 [Gordon-Kamm 1990]; [Fromm 1990 (옥수수)] (모두 본원에 참고로 포함된다)를 참조한다.

본 발명의 발현 카세트를 포함하는 벡터 (Ti 플라스미드를 포함함)를 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스 세포는 형질전환된 식물의 제조 방법에서 유용하다. 식물 세포는 상기한 바와 같이 아그로박테리움 투메파시엔스로 감염되어 형질전환된 식물 세포를 생산하고, 이어서, 식물은 형질전환된 식물 세포로부터 재생된다. 본 발명을 수행하는데 유용한 수많은 아그로박테리움 벡터 시스템이 공지되어 있다. 다양한 아그로박테리움 균주, 바람직하게는 병원성을 잃은 (disarmed) 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 리조게네스 균주가 사용될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 실시에 사용하기 위한 아그로박테리움 균주는 옥토파인 균주, 예를 들어, LBA4404 또는 아그로핀 균주, 예를 들어, EHA101 또는 EHA105를 포함한다. DNA 전달에 적합한 아그로박테리움 투메파시엔스의 균주는 예를 들어 EHA101[pEHA101] (Hood 1986), EHA105[pEHA105] (Li 1992), LBA4404[pAL4404] (Hoekema 1983), C58C1[pMP90] (Koncz & Schell 1986), 및 C58C1[pGV2260] (Deblaere 1985)이다. 다른 적합한 균주는 노팔린 균주인 아그로박테리움 투메파시엔스 C58이다. 다른 적합한 균주는 아그로박테리움 투메파시엔스 C58C1 (Van Larebeke 1974), A136 (Watson 1975) 또는 LBA4011 (Klapwijk 1980)이다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 토양 세균은 아그로박테리움 리조게네스 균주 K599 (NCPPB 2659)의 병원성을 잃은 변이체이다. 바람직하게는, 상기 균주는 식물 세포 내로 T-DNA의 전달에 필요한 기능 (예를 들어, vir 유전자)을 제공하는 Ti- 또는 Ri-플라스미드의 병원성을 잃은 플라스미드 변이체를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 식물 페놀계 화합물과 함께 예비 배양된 식물 조직을 형질전환하기 위해 사용된 아그로박테리움 균주는 바람직하게는 병원성을 잃은 L,L-숙신아모핀 타입 Ti-플라스미드, 예를 들어 pEHA101을 함유한다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 식물 페놀계 화합물과 함께 예비 배양된 식물 조직을 형질전환하기 위해 사용된 아그로박테리움 균주는 바람직하게는 병원성을 잃은 옥토파인형 Ti-플라스미드, 예를 들어 pAL4404를 함유한다. 일반적으로, 옥토파인형 Ti-플라스미드 또는 헬퍼 플라스미드를 사용할 때, virF 유전자가 결실되거나 불활성화되는 것이 바람직하다 (Jarschow 1991).

본 발명의 방법은 또한 형질전환 효율을 보다 증가시키기 위해서 특정 아그로박테리움 균주, 예를 들어 vir 유전자 발현 및/또는 그의 유도가 돌연변이체 또는 키메라 virA 또는 virG 유전자의 존재 때문에 변경된 아그로박테리움 균주와 조합되어 사용될 수 있다 (예를 들어 [Hansen 1994]; [Chen and Winans 1991]; [Scheeren-Groot, 1994]). 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 LBA4404 (Hiei 1994)를 초독성 (super-virulent) 플라스미드와 조합하는 것이 바람직하다. 상기 플라스미드는 바람직하게는 pTOK246-기반 벡터이다 (Ishida 1996).

이원 벡터 또는 임의의 다른 벡터는 통상적인 DNA 재조합 기술에 의해 변형되고, 이. 콜라이에서 증식되고, 예를 들어, 전기천공 또는 다른 형질전환 기술에 의해 아그로박테리움 내로 도입될 수 있다 (Mozo & Hooykaas 1991).

아그로박테리움을 성장시키고, 문헌 [Ishida (1996)]에 기재된 바와 유사한 방식으로 사용한다. 벡터를 포함하는 아그로박테리움 균주는 예를 들어 적절한 항생제 (예를 들어, 50 mg/L 스펙티노마이신)를 보충한 YP 배지 (5 g/L 효모 추출물, 10 g/L 펩톤, 5 g/L NaCl, 15 g/L agar, pH 6.8) 상에서 3일 동안 성장시킬 수 있다. 세균은 고체 배지로부터 루프를 사용하여 수집하고 재현탁시킨다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 아그로박테리움 배양은 -80℃에서 동결된 분취액의 사용에 의해 개시된다.

아그로박테리움에 의한 표적 조직 (예를 들어, 미성숙 배)의 형질전환은 단순히 표적 조직을 아그로박테리움과 접촉시켜 수행할 수 있다. 감염 및 동시 배양을 위해 사용된 아그로박테리움의 농도는 변경될 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 집단 밀도가 약 10⁵ - 10¹¹, 바람직하게는 10⁶ 내지 10¹⁰, 보다 바람직하게는 약 10⁸ 세포 또는 cfu/ml인 아그로박테리움의 세포 현탁액을 제조하고, 표적 조직을 상기 현탁액 내에 약 3 내지 10분 동안 침지시킨다. 이어서, 생성되는 표적 조직을 고체 배지 상에서 수일 동안 아그로박테리움과 함께 배양한다.

바람직하게는, 세균은 10⁶ 내지 10¹⁰ cfu/mL의 농도로 사용된다. 바람직한 실시태양에서, 동시 배양 단계를 위해 동시 배양 배지 내의 토양 세균 (예를 들어, 아그로박테리움)의 약 1 내지 10 ㎕의 현탁액을 각각의 표적 조직 체외식편에 직접 적용하고, 공기 건조시킨다. 이것은 노동력과 시간을 절감시키고, 과도한 아그로박테리움 사용에 의한 의도하지 않은 아그로박테리움-매개 손상을 감소시킨다.

아그로박테리움 처리를 위해, 세균을 식물 적합성 동시 배양 배지 내에 재현탁한다. 동시 배양 배지를 식물 방어 기전 (페놀계 산화처럼)에 의한 조직 괴사를 감소시킬 수 있는 항산화제 (예를 들어, 질산은), 페놀-흡수 화합물 (폴리비닐피롤리돈, [Perl 1996]) 또는 티올 화합물 (예를 들어, 디티오트레이톨, L-시스테인, [Olhoft 2001])로 보충하면, 아그로박테리움-매개 형질전환의 효율을 추가로 개선시킬 수 있다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 동시 배양 배지는 바람직하게는 나트륨 티올술페이트, 디티오트레이톨 (DTT) 및 시스테인으로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 티올 화합물을 포함한다. 바람직하게는, 농도는 약 1 mM 내지 1O mM의 L-시스테인, 0.1 mM 내지 5 mM의 DTT, 및/또는 0.1 mM 내지 5 mM의 나트륨 티올술페이트이다. 바람직하게는, 동시 배양 동안 사용된 배지는 약 1 μM 내지 약 10 μM의 질산은 및 약 50 mg/L 내지 약 1,000 mg/L의 L-시스테인을 포함한다. 이것은 아그로박테리움-매개된 손상 (예를 들어 유도된 괴사)에 대한 취약성을 크게 감소시키고, 전체적인 형질전환 효율을 크게 개선시킨다.

다양한 벡터 시스템이 아그로박테리움과 조합되어 사용될 수 있다. 이원 벡터 시스템이 바람직하다. 통상적인 이원 벡터는 P-타입 플라스미드 RK2로부터 유도된 pRK252 (Bevan 1984) 또는 pTJS75 (Watson 1985)와 같은 "넓은 숙주 범위"-플라스미드를 기초로 한다. 대부분의 이들 벡터는 pBIN19의 유도체이다 (Bevan 1984). 다양한 이원 벡터가 공지되어 있고, 그 중 일부, 예를 들어, pBI101.2 또는 pBIN19 (클론테크 래보래토리스, 인크. 유에스에이 (Clontech Laboratories, Inc. USA)는 상업적으로 이용가능하다. 추가의 벡터는 크기 및 취급성이 개선되었다 (예를 들어 pPZP; [Hajdukiewicz 1994]). 개선된 벡터 시스템은 또한 WO 02/00900에 설명되어 있다.

직접적인 유전자 전달 또는 아그로박테리움-매개된 전달의 형태를 사용하는 방법은 반드시는 아니지만, 대체로 항생제 (예를 들어, 카나마이신, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트) 또는 제초제 (예를 들어, 포스피노트리신)에 대한 저항성을 제공할 수 있는 선택가능 마커를 사용하여 수행한다. 그러나, 식물 형질전환을 위한 선택가능 마커의 선택은 본 발명에서 중요하지 않다.

특정 식물 종에 대해, 상이한 항생제 또는 제초제 선택 마커가 바람직할 수 있다. 형질전환에서 일상적으로 사용되는 선택 마커는 카나마이신 및 관련 항생제에 대한 저항성을 부여하는 nptII 유전자 ([Messing & Vierra, 1982]; [Bevan 1983]), 제초제 포스피노트리신에 대한 저항성을 부여하는 bar 유전자 ([White 1990], [Spencer 1990]), 항생제 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hph 유전자 (Blochlinger & Diggelmann), 및 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr 유전자 (Bourouis 1983)를 포함한다.

5. 안정하게 형질전환된 식물의 생산 및 특성화

이어서, 트랜스제닉 식물 세포를 트랜스제닉 세포의 선택을 위한 적절한 선택 배지에 위치시킨 후, 캘러스로 성장시킨다. 싹은 캘러스로부터 성장한다. 묘목은 발근 배지에서 성장시킴으로써 싹으로부터 생성된다. 다양한 구성체가 식물 세포의 선택을 위한 마커에 연결될 것이다. 편리하게는, 마커는 살생물제 (특히 항생제, 예를 들어 카나마이신, G418, 블레오마이신, 히그로마이신, 클로람페니콜, 제초제 등)에 대해 저항성일 수 있다. 사용되는 특정 마커는 도입된 DNA가 결여된 세포에 비해 형질전환된 세포의 선택을 허용할 것이다. 본 발명의 전사 카세트를 포함하는 DNA 구성체의 성분은 숙주의 천연 (내인성) 또는 외래 (외인성) 서열로 제조될 수 있다. "외래"는 서열이 구성체가 그 내부로 도입되는 야생형 숙주에서 발견되지 않는 것임을 의미한다. 이종성 구성체는 그로부터 전사 개시 구역이 유도되는 유전자에 천연성이 아닌 적어도 하나의 구역을 함유할 것이다.

트랜스제닉 세포 및 식물에서 트랜스젠의 존재를 확인하기 위해서, 다양한 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석은 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 분석, 예를 들어 서던 및 노던 블로팅, 계내 혼성화 및 핵산-기반 증폭 방법, 예를 들어 PCR 또는 RT-PCR 또는 TaqMan; "생화학적" 분석, 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯) 또는 효소 기능에 의한 단백질 산물의 존재 검출; 식물의 일부 분석, 예를 들어 종자 분석; 및 예를 들어 질병 또는 해충 저항성에 대한 재생된 전체 식물의 표현형 분석을 포함한다.

DNA는 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 예비선택된 핵산 세그먼트의 존재를 결정하기 위해 세포주 또는 임의의 식물의 일부로부터 단리될 수 있다. 아마도 세포 내에서의 서열의 재배열 또는 결실에 의해 무손상 서열이 항상 존재하는 것은 아님을 유의해야 한다.

본 발명의 방법을 통해 도입된 핵산 요소의 존재는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 결정할 수 있다. 이 기술을 사용하여, 핵산의 별개의 단편을 증폭하고, 겔 전기영동에 의해 검출한다. 이러한 종류의 분석을 통해 예비선택된 핵산 세그먼트가 안정한 형질전환체에 존재하는지를 결정할 수 있지만, 도입된 예비선택된 핵산 세그먼트의 숙주 세포 게놈 내로의 통합을 입증할 수는 없다. 또한, 형질전환체가 게놈 내의 상이한 부위 내로 도입된 외인성 유전자를 갖는지, 즉, 형질전환체가 독립적인 기원에서 유래한 것인지는 PCR 기술을 사용하여 결정할 수 없다. PCR 기술을 사용하여, 도입된 예비선택된 DNA 세그먼트에 인접한 숙주 게놈 DNA의 단편을 클로닝할 수 있음이 고려된다.

DNA의 숙주 게놈 내로의 통합에 대한 확증 및 형질전환체의 독립적인 정체는 서던 혼성화 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 이 기술을 사용하여, 숙주 게놈 내로 도입되고 숙주 DNA 서열을 플랭킹하는 특이적인 DNA 서열을 확인할 수 있다. 따라서, 제시된 형질전환체의 서던 혼성화 패턴은 형질전환체를 확인하는 특성으로서 기능한다. 또한, 서던 혼성화를 통해, 도입된 예비선택된 DNA 세그먼트가 고분자량 DNA로 존재함을 입증하는 것, 즉, 도입된 예비선택된 DNA 세그먼트가 숙주 세포 게놈 내로 통합되었음을 확인하는 것이 가능하다. 서던 혼성화 기술은 PCR을 사용하여 얻은 정보, 예를 들어 예비선택된 DNA 세그먼트의 존재를 제공하고, 게놈 내로의 통합을 입증하고, 각각의 개별 형질전환체의 특성을 제시한다.

서던 혼성화 기술의 변형인 도트 또는 슬롯 (slot) 블롯 혼성화 기술을 사용하여, PCR로부터 유도된 동일한 정보, 예를 들어 예비선택된 DNA 세그먼트의 존재를 입수할 수 있음이 고려된다.

PCR 및 서던 혼성화 기술은 모두 예비선택된 DNA 세그먼트의 자손체로의 전달을 입증하기 위해 사용될 수 있다. 대부분의 경우에, 제시된 형질전환체의 특징적인 서던 혼성화 패턴은 하나 이상의 멘델 유전자로서 자손체에서 분리되고 ([Spencer 1992]; [Laursen 1994]), 이것은 유전자의 안정한 유전을 나타낸다. 캘러스 및 모 형질전환체 (R_o)의 비-키메라 성질은 형질전환된 유전자에 대해 분리되는 캘러스, R_o 식물 및 R₁ 자손체에서의 생식선 (germline) 전달 및 형질전환 DNA의 동일한 서던 블롯 혼성화 패턴 및 강도에 의해 제시되었다.

DNA 분석 기술은 식물의 임의의 일부로부터 단리된 DNA를 사용하여 수행할 수 있지만, RNA는 특정 세포 또는 조직 종류에서만 발현될 수 있고, 따라서 상기 조직으로부터 분석을 위한 RNA를 제조하는 것이 필요할 것이다. 또한, PCR 기술은 도입된 예비선택된 DNA 세그먼트로부터 생산된 RNA의 검출 및 정량을 위해 사용될 수 있다. 상기 PCR 적용시에, 역전사효소와 같은 효소를 사용하여 RNA를 DNA로 역전사한 후, 통상적인 PCR 기술을 사용하여 DNA를 증폭하는 것이 필요하다. 대부분의 경우에, PCR 기술은 유용하지만, RNA 산물의 통합성을 제시하지 않을 것이다. RNA 산물의 성질에 관한 추가의 정보는 노던 블로팅에 의해 얻을 수 있다. 상기 기술은 RNA 종의 존재를 보여주고, RNA의 통합성에 대한 정보를 제공할 것이다. 또한, RNA 종의 존재 또는 부재는 도트 또는 슬롯 블롯 노던 혼성화를 사용하여 결정할 수 있다. 상기 기술은 노던 블로팅의 변형이고, 단지 RNA 종의 존재 또는 부재만을 보여줄 것이다.

서던 블로팅 및 PCR은 목적하는 예비선택된 DNA 세그먼트를 검출하기 위해 사용될 수 있지만, 이들은 예비선택된 DNA 세그먼트가 발현되고 있는지에 대한 정보를 제공하지 않는다. 발현은 도입된 예비선택된 DNA 세그먼트의 단백질 산물을 특이적으로 확인하거나 또는 그의 발현에 의해 야기된 표현형 변화를 평가함으로써 평가할 수 있다.

특이적인 단백질의 생산 및 확인을 위한 분석은 단백질의 물리적-화학적, 구조적, 기능적, 또는 다른 특성을 이용할 수 있다. 특유한 물리-화학적 또는 구조적 특성을 통해 단백질을 분리하고, 전기영동 절차, 예를 들어 천연 또는 변성 겔 전기영동 또는 등전 포커싱 (isoelectric focusing)에 의해, 또는 크로마토그래피 기술, 예를 들어 이온 교환 또는 겔 배제 크로마토그래피에 의해 확인할 수 있다. 개별 단백질의 특유한 구조는 ELISA 분석과 같은 포맷으로 그의 존재를 검출하기 위해 특이적인 항체를 사용할 기회를 제공한다. 전기영동 기술에 의해 분리된 개별 유전자 산물을 밝혀내기 위해 항체가 사용되는 웨스턴 블로팅과 같은 방법의 조합이 훨씬 더 큰 특이성으로 사용될 수 있다. 정제 후 아미노산 서열결정에 의한 평가와 같은 추가의 기술은 목적하는 산물의 실체를 절대적으로 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이들이 가장 일반적으로 사용되지만, 다른 절차가 추가로 사용될 수 있다.

또한, 그의 기능에 의한 단백질의 발현, 특히 특이적인 기질 및 산물을 수반하는 특이적인 화학 반응을 촉매하는 효소의 능력을 확인하기 위한 분석 절차도 사용될 수 있다. 상기 반응 후에, 물리적 또는 화학적 절차에 의해 기질의 제공 및 기질 상실 또는 반응 산물 생성의 정량화를 수행할 수 있다. 그 예는 분석되는 효소에 따라 상이하다.

유전자 산물의 발현은 매우 종종 그의 발현의 표현형 결과를 평가함으로써 결정된다. 또한, 상기 분석은 식물의 화학 조성, 형태, 또는 생리학적 특성의 변화를 분석하는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는 많은 형태를 취할 수 있다. 형태학적 변화는 보다 큰 키 또는 보다 두꺼운 줄기를 포함할 수 있다. 제시된 처리에 대한 식물 또는 식물 부분의 반응의 가장 빈번한 변화는 생물학적 분석의 신중히 조절된 조건 하에 평가된다. 목적하는 조건 하에서 목적하는 표현형 특성의 조직-바람직한 발현이 안정하게 유지되고 유전되는 것을 보장하기 위해 2 이상의 세대를 성장시킬 수 있다.

6. 트랜스제닉 식물의 사용

일단 본 발명의 발현 카세트가 특정 식물 종 내로 형질전환되면, 이것은 전통적인 번식 기술을 사용하여 그 종에서 증식하거나 또는 특히 상업적인 변종을 포함하여 동일한 종의 다른 변종 내로 이동할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 식물은 농경학상 유용한 식물 또는 농경학상 중요한 작물, 특히 상기 식물이 외떡잎식물이면 특히 상기 나열된 곡식 식물을 포함한다. 상기 설명된 트랜스제닉 종자 및 식물 내로 공학처리되어 도입된 유전적 특성은 유성 생식에 의해 유전되고, 따라서 자손체 식물에서 유지 및 증식될 수 있다. 또한, 본 발명은 트랜스제닉 식물로부터 얻은 트랜스제닉 식물 세포, 조직, 기관, 종자 또는 식물의 일부에 관한 것이다. 또한, 식물의 트랜스제닉 자손체, 및 자손체로부터 얻은 트랜스제닉 식물 세포, 조직, 기관, 종자 및 식물의 일부가 본 발명에 포함된다.

바람직하게는, 트랜스제닉 식물 내의 발현 카세트는 유성 전달된다. 한 바람직한 실시태양에서, 코딩 서열은 R0 식물의 완전한 정상적인 유성 사이클을 통해 R1 세대로 유성 전달된다. 추가로 바람직한 발현 카세트는 발현 카세트가 존재하지 않는다는 점에서만 상이한 식물의 세포, 조직, 종자 또는 식물 내의 양과 상이한 양으로 트랜스제닉 식물의 세포, 조직, 종자 또는 식물에서 발현된다. 따라서, 본원에서 생산된 트랜스제닉 식물은 다양한 상업 및 연구 목적을 위해 유용할 것으로 예상된다. 트랜스제닉 식물은 전통적인 농업에 사용하기 위해 재배자에게 유익한 형질 (예를 들어, 농경학적 형질, 예를 들어 물 부족에 대한 저항성, 해충 저항성, 또는 증가된 수확량), 식물로부터 수확한 곡물의 소비자에게 유익한 형질 (예를 들어, 인간 식품 또는 동물 사료 내의 개선된 영양 함량; 증가된 비타민, 아미노산, 및 항산화제 함량; 항체 (수동 면역화) 및 영양 기능식품 (nutriceutical)의 생산), 또는 식물 가공업자에게 유리한 형질 (예를 들어, 개선된 가공 형질)을 갖도록 생성시킬 수 있다. 상기 용도에서, 식물은 일반적으로 인간 또는 동물 식품에 그의 곡물을 사용하기 위해 성장시킨다. 추가로, 트랜스제닉 식물에 배-특이적 프로모터를 사용하면 식물의 소비가능한 (동물 및 인간에 의해) 종자, 예를 들어 가루, 열매 (cernel), 견과 또는 종자 오일을 포함하고 이로 제한되지 않는 부분에 위치하는 유익한 형질을 제공할 수 있다. 그러나, 줄기, 껍질, 영양 부분 등을 포함하는 식물의 다른 부분도 동물 사료의 일부로서 또는 장식 목적을 위한 용도를 포함하는 효용을 가질 수 있다. 종종, 옥수수 및 다른 작물의 화학 성분 (예를 들어, 오일 또는 전분)이 식품 또는 산업적인 용도를 위해 추출되고, 상기 성분의 향상된 또는 변형된 수준을 갖는 트랜스제닉 식물을 생성시킬 수 있다.

또한, 트랜스제닉 식물은 목적하는 분자가 식물의 일부, 종자 등으로부터 추출되거나 정제되는, 단백질 또는 다른 분자의 상업적 제조에서 유용할 수 있다. 식물로부터의 세포 또는 조직은 배양되거나, 시험관 내에서 성장하거나, 또는 상기 분자를 제조하기 위해 발효될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 식물은 상업적 번식 프로그램에서 사용될 수 있거나, 또는 관련 작물 종의 식물과 교배 또는 번식시킬 수 있다. 발현 카세트에 의해 코딩되는 개선 특질은 예를 들어 옥수수 세포로부터 다른 종의 세포로, 예를 들어 원형질체 융합에 의해 전달될 수 있다.

트랜스제닉 식물은 전통적인 돌연변이 및 선택에 의해 추후 생성될 수 있는 유익한 돌연변이체를 확인하기 위해서 삽입 돌연변이 유발을 통한 새로운 돌연변이체 식물의 생성을 포함하여 연구 또는 번식에서 많은 용도를 가질 수 있다. 그 예는 유전자 변이를 생성시키기 위해 사용될 수 있는 유전자 전위가능 요소를 코딩하는 재조합 DNA 서열의 도입일 것이다. 본 발명의 방법은 또한 사유 라인 (proprietary line) 또는 변종을 확인하기 위해 사용될 수 있는 특유한 "시그너쳐 (signature) 서열" 또는 다른 마커 서열을 갖는 식물을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물 및 종자는 발현 카세트에 의해 부여되는 개선된 특성, 예를 들어 가뭄, 질병, 또는 다른 스트레스에 대한 내성을 갖는 식물의 개발을 목적으로 하는 식물 번식에 사용될 수 있다. 다양한 번식 단계는 교배되는 라인의 선택, 모 라인의 수분 유도, 또는 적절한 자손체 식물의 선택과 같은 잘 규정된 인간 개입에 의해 특성화된다. 목적하는 특성에 따라, 상이한 번식 수단을 사용한다. 관련 기술은 당업계에 잘 공지되어 있고, 혼성화, 동종번식, 역교배 번식, 다중선 (multilane) 번식, 변종 혼합 (variety blend), 종간 혼성화, 이수체 기술 등을 포함하고,이로 제한되지 않는다. 또한, 혼성화 기술은 기계적, 화학적 또는 생화학적 수단에 의해 웅성 또는 자성 불임성 식물을 생성시키기 위한 식물의 불임화를 포함한다. 상이한 라인의 화분을 사용한 웅성 불임성 식물의 타가 수분은, 웅성 불임성이지만 자성 수정가능한 식물의 게놈이 두 모 라인 모두의 특성을 균일하게 얻는 것을 보장한다. 따라서, 본 발명에 따른 트랜스제닉 종자 및 식물은 예를 들어 통상적인 방법, 예를 들어 제초제 또는 살충제 처리의 유효성을 증가시키거나 또는 그의 변형된 유전적 특성 때문에 상기 방법을 불필요하게 만드는 개선된 식물주의 번식을 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 그의 최적화된 유전적 "장비 (equipment)" 때문에 대등한 유해한 발달 조건을 견딜 수 없는 산물보다 더 우수한 품질의 수확 산물을 생산하는, 개선된 스트레스 내성을 갖는 새로운 작물은 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명은 추가의 실시태양에서 목적하는 유전자를 배 조직 또는 세포에서 우선적으로 또는 특이적으로 발현하기 위한, 본원의 핵산 분자의 용도에 관한 것이다.

또한, 다른 실시태양에서, 본 발명은 스트레스 조건 하에 식물에서 핵산 분자의 전사를 증가시키기 위한, 본 발명의 핵산 분자의 용도에 관한 것이다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 증가된 수확량, 및/또는 증가된 스트레스 내성, 및/또는 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질, 및/또는 증가된 또는 변형된 오일 함량을 갖는 식물을 생산하기 위한 방법에 관한 것이고, 이 방법은

A) 식물 내로 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 발현 카세트, 또는 본 발명의 발현 벡터를 도입하고, 여기서 핵산 분자는, 그 서열이 상기 제1 또는 상기 제2 핵산 서열에 대하여 이종성이고 식물에 증가된 수확량, 및/또는 증가된 스트레스 내성, 증가된 영양적 품질, 및/또는 증가된 또는 변형된 오일 함량을 부여할 수 있는 적어도 하나의 핵산 분자에 작동가능하게 연결되고;

B) 트랜스제닉 식물을 선택하는 단계

를 포함하고, 여기서 식물은 야생형 또는 무효 분리개체 식물에 비해 증가된 수확량 및/또는 스트레스 조건 하에 증가된 스트레스 내성, 및/또는 식물의 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질 및/또는 증가된 또는 변형된 오일 함량을 갖는다.

서열

서열 1: 아라비돕시스 탈리아나 Cor78 유전자의 전사 조절 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 핵산 서열

서열 2: pBPSMM368 이원 벡터의 핵산 서열

서열 3: Os.BPSI.1 인트론을 코딩하는 핵산 서열

서열 4: Zm.유비퀴틴 인트론을 코딩하는 핵산 서열

서열 5: Cor78 프로모터 정프라이머

5'-gcaagaatct caaacacgga gatctca-3'

서열 6: Cor78 프로모터 역프라이머

5'-atttgtgagt aaaacagagg agggtctca-3'

서열 7: BPSI.1-5' 프라이머

5'-cccgggcaccctgcggagggtaagatccgatcacc-3'

서열 8: BPSI.1-3' 프라이머

5'-cggaccggtacatcttgcatctgcatgtac-3'

서열 9: At.cor78의 위치 4-18에 놓인 CCAF/CCA1.01 모티프

gccgcaagaa tctca

서열 9-138: 표 9에 제시함.

서열 139-144: 도 4a 내지 4c 및 도 5에 제시함.

실시예 및 일반적인 방법

달리 나타내지 않으면, 실시예에서 화학물질 및 시약은 시그마 케미컬 컴퍼니 (Sigma Chemical Company, 미국 미저리주 세인트루이스)로부터 입수하고, 제한 엔도뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 또는 로슈 (Roche, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)로부터 입수하고, 올리고뉴클레오티드는 엠더블유지 바이오테크 인크. (MWG Biotech Inc., 미국 노쓰캐롤리나주 하이 포인트)에서 합성되었고, 생화학 및 분자 생물학 분석에 관한 다른 변형 효소 또는 키트는 클론테크 (Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로 알토), 파마시아 바이오테크 (Pharmacia Biotech, 미국 뉴저지주 피츠카타웨이), 프로메가 코퍼레이션 (Promega Corporation, 미국 위스콘신주 매디슨), 또는 스트라타젠 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라)로부터 입수하였다. 세포 배양 배지를 위한 물질은 깁코/비알엘 (Gibco/BRL, 미국 매릴랜드주 게이터스버그) 또는 디프코 (DIFCO, 미국 미시건주 디트로이트)로부터 입수하였다. 본 발명의 목적을 위해 수행된 클로닝 단계, 예를 들어 제한 절단, 아가로스 겔 전기영동, DNA 단편의 정제, 니트로셀룰로스 및 나일론 막으로의 핵산의 전달, DNA 단편의 연결, 이. 콜라이 세포의 형질전환, 세균 성장, 파지의 번식 및 재조합 DNA의 서열 분석은 문헌 [Sambrook (1989)]에 기재된 바와 같이 수행한다. 재조합 DNA 분자의 서열결정은 문헌 (Sanger 1977)의 방법에 따라 ABI 레이저 형광 DNA 서열을 사용하여 수행한다.

트랜스제닉 식물을 생성시키기 위해, 아그로박테리움 투메파시엔스 (균주 C58C1 [pMP90])를 다양한 프로모터::GUS 벡터 구성체 (아래 참조)로 형질전환시킨다. 생성되는 아그로박테리움 균주는 후속적으로 트랜스제닉 식물을 얻기 위해 사 용된다. 상기 목적을 위해, 단리된 형질전환된 아그로박테리움 콜로니를 4 mL 배양액 (배지: 50 ㎍/mL 카나마이신 및 25 ㎍/mL 리팜피신이 존재하는 YEB 배지)에서 28℃에서 철야 인큐베이팅한다. 상기 배양액과 함께 동일한 배지의 400 ml 배양액을 접종하고 철야 (28℃, 220 rpm) 인큐베이팅한다. 세균을 원심분리 (GSA-Rotor, 8000 U/min, 20 min)에 의해 침전시키고, 펠렛을 침윤 배지 (1/2 MS-Medium; 0,5 g/L MES, pH 5,8; 50 g/L 수크로스) 내에 재현탁한다. 현탁액을 식물 박스 (두쉐파 (Duchefa))에 놓고, 100 mL SILVET L-77 (오시 스페셜티즈 인크. (Osi Specialties Inc.), Cat. P030196)을 0.02%의 최종 농도로 첨가한다. 8 내지 12개의 식물이 있는 식물 박스를 진공 하에 데시케이터에 10 내지 15 min 동안 위치시킨 후, 자연 환기시킨다 (팽창). 이 과정을 2-3회 반복한다. 이후에, 모든 식물을 습기가 있는 토양이 담긴 화분에 옮기고, 긴 일광 조건 (16 h 빛; 주간 온도 22-24℃, 야간 온도 19℃; 65% 상대 습도) 하에서 성장시킨다. 종자를 6주 후에 수확한다.

실시예 1. 벡터 구성

BPSI.1 인트론이 존재하거나 (pBPSMM368; 도 1) 또는 존재하지 않는 (pBPSMM250) (표 6) 아라비돕시스 cor78 프로모터 구성체를 제조하였다. BPSI.1 인트론은 비교 목적을 위해 옥수수 유비퀴틴 인트론으로 교체되었다 (pBPSMM346). 인트론-매개된 향상 (IME)-부여 인트론, 예를 들어 BPSI.1 및 Zm.유비퀴틴 인트론을 발현 카세트의 5' 비번역 구역 (UTR) 내로 서브클로닝하였다.

GUS 키메라 구성체

이원 벡터	발현 카세트의 조성 (프로모터::인트론::리포터 유전자::터미네이터)
pBPSMM250	At.cor78 프로모터::GUS::NOS3'
pBPSMM346	At.cor78 프로모터::Zm.유비퀴틴 인트론::GUS::NOS3'
pBPSMM368	At.cor78 프로모터::BPSI.1 인트론::GUS::NOS3'

실시예 2. 외떡잎 식물 형질전환

표준 형질전환 및 재생 기술을 사용한 아그로박테리움-매개된 식물 형질전환도 작물 식물을 형질전환시키기 위해 수행될 수 있다 ([Gelvin 1995]; [Glick 1993]).

옥수수 또는 다른 외떡잎 식물의 형질전환은 예를 들어, US 5,591,616에 기재된 기술을 사용하여 수행할 수 있다.

입자 폭격, 폴리에틸렌 글리콜-매개된 DNA 흡수 또는 탄산규소 섬유 기술을 통한 식물의 형질전환은 예를 들어 문헌 [Freeling & Walbot 1993]에 기재되어 있다.

실시예 3. 리포터 유전자 발현의 검출

프로모터의 특성 및 그의 조직 특이성을 유발하는 필수적인 요소를 확인하기 위해, 발현 활성의 결정을 가능하게 하는 리포터 유전자로 알려진 요소 앞에 프로모터 자체 및 그의 다양한 단편을 위치시키는 것이 필요하다. 언급할 수 있는 예는 세균 β-글루쿠로니다제 (Jefferson 1987a)이다. β-글루쿠로니다제 활성은 활성 염색에서 발색 기질, 예를 들어 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠론산에 의해 식물 내에서 검출될 수 있다 (Jefferson 1987b). 조직 특이성을 연구하기 위해, 문헌에 기재된 바와 같이 식물 조직을 절단하고, 포매하고, 염색하고 분석한다 (예를 들어, [Baeumlein 1991b]).

제2 분석은 연구된 조직에서 GUS 활성의 정량적 결정을 허용한다. 정량적 활성 결정을 위해, MUG (4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로니드)를 β-글루쿠로니다제에 대한 기질로서 사용하고, MUG는 MU (메틸움벨리페론) 및 글루쿠론산으로 절단된다.

이를 수행하기 위해, 목적하는 조직의 단백질 추출물을 먼저 제조한 후, GUS의 기질을 추출물에 첨가하였다. 기질은 GUS가 반응한 후에만 형광 분석에 의해 측정될 수 있다. 형광계로 후속적으로 측정되는 샘플을 다양한 시점에 채취하였다. 상기 분석은 예를 들어 다양한 발달 단계 (개화 21, 24 또는 30일 후)의 아마씨 배를 사용하여 수행할 수 있다. 이를 위해, 각각의 경우에 1개의 배를 진동 연마 밀 (타입: Retsch MM 2000)을 사용하여 액체 질소 중의 2 ml의 반응 용기에서 분말로 연마하였다. 100 ㎕의 EGL 버퍼 (0.1 M KPO₄, pH 7.8; 1 mM EDTA; 5% 글리세롤; 1 M DTT)의 첨가 후에, 혼합물을 10분 동안 25℃ 및 14,000 x g에서 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 재원심분리하였다. 다시, 상등액을 새로운 반응 용기에 옮기고 추가로 사용할 때까지 얼음 상에 유지하였다. 25 ㎕의 상기 단백질 추출물을 65 ㎕의 EGL 버퍼 (DTT를 함유하지 않음)로 처리하고, GUS 분석에서 사용하였다. 10 ㎕의 기질 MUG (10 mM 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로니드)를 첨가하고, 혼합물을 볼텍싱 (vortexing)하고, 30 ㎕을 즉시 분리하고, 470 ㎕의 중지 버퍼 (0.2 M Na₂CO₃)로 처리하였다. 상기 절차를 모든 샘플에 대해 30초 간격으로 반복하였다. 채취한 샘플을 측정시까지 냉장고에 보관하였다. 추가로 1 h 및 2 h 후에 판독하였다. 0.1 mM 내지 10 mM MU (4-메틸움벨리페론)를 함유하는 교정 (calibration) 시리즈를 형광 분석에 의한 측정을 위해 확립하였다. 샘플 값이 상기 농도를 벗어나면, 보다 적은 단백질 추출물을 사용하고 (1:10 희석액으로부터의 10 ㎕, 1 ㎕, 1 ㎕), 보다 짧은 간격에서 측정하였다 (0 h, 30 min, 1 h). 측정은 플루오로스캔 II 장비 (랩시스템 (Labsystem))에서 365 nm의 여기 및 445 nm의 방출로 수행하였다. 대안으로서, 기질 절단은 문헌 [Bustos (1989)]에 기재된 바와 같이 알칼리성 조건 (365 nm에서 여기, 455 nm에서 방출 측정; 분광 형광계 BMG Polarstar+) 하에 형광 분석에 의해 모니터링할 수 있다. 모든 샘플의 단백질 농도를 문헌 [Bradford (1976)]의 방법에 의해 결정하여, 다양한 조직 및 식물에서 프로모터 활성 및 프로모터 강도를 확인하였다.

실시예 4. 옥수수에서의 배-특이적 발현

구성체 pBPSMM368은 배, 특히 배반에서 고도로 발현되었지만, 배유의 염색은 GUS 조직화학 분석을 사용하여 거의 검출가능하지 않았다 (도 2). 이러한 강력한 배-특이적 발현은 발아 동안 유지되었다. 구성체 pBPSMM368은 뿌리 또는 잎에서 발현되지 않았다. 그러나, 이러한 배-특이적 발현은 At.cor78 프로모터와 Zm.유비퀴틴 인트론 구성체 (pBPSMM346)의 조합시에는 검출되지 않았다. pBPS346으로 형질전환된 트랜스제닉 옥수수 식물은 구성적 발현을 보였지만, 전체적으로 매우 약한 발현을 나타내었다. 구성체 pBPSMM250은 분석된 어떠한 조직에서도 발현되지 않았다.

외떡잎식물 구성적 프로모터 후보에 의해 제어되는 GUS 발현

조직/발달 단계	프로모터 (GUS 발현 수준)
	pBPSMM232¹	pBPSMM250	pBPSMM346	pBPSMM368
동시 배양 3일후	+++++	ND	ND	-
5엽 단계의 잎	+++++	-	-	-
5엽 단계의 뿌리	+++++	-	-	-
개화 단계의 잎	+++++	-	++	-
줄기	+++++	-	ND	-
수분 전	+++++	-	ND	-
수분 20일 후 [DAP]
배반	+++++	-	ND	+++
배축	+++++	-	ND	+²
배유	+++++	-	ND	-
30 DAP
배반	+++++	-	++++	++++
배축	+++++	-	++++	+²
배유	+++++	-	+++	-
마른 종자
배반	++++	-	+++	+++
배축	++++	-	+++	+²
배유	++++	-	+++	-
침윤/발아 (72hr)³
배반	+++++	-	++++	++++
배축	+++++	-	++++	+²
배유	+++++	-	++++	-

¹구성적 프로모터로서의 양성 대조군 (pBPSMM232=Zm.유비퀴틴 프로모터::Zm.유비퀴틴 인트론::GUS (PIV2)::NOS 터미네이터); 조직화학 분석에 의해 측정된 광범위한 GUS 발현 수준 (- 내지 +++++), ND: 결정되지 않음,

²pBPSMM368을 함유하는 트랜스제닉 식물은 배축의 제1 절간 절 (internodem node) 영역에서 약한 발현을 보였지만, 1차 뿌리, 어린 싹, 줄기, 잎, 및 초엽 (coleoptile)을 포함하여 배축의 다른 구역에서는 거의 발현을 보이지 않았다.

³침윤 (발아) 삼일 (72 hr) 후에, pBPSMM346을 함유하는 트랜스제닉 식물은 어린 뿌리 및 전체 종자에서 발현을 보였지만, pBPSMM368을 함유하는 식물은 대부분 배반에서 제한된 발현을 보였다.

실시예 5. 가뭄-유도가능한 발현

pBPSMM250을 함유하는 트랜스제닉 옥수수 식물 (인트론-매개된 향상을 부여하는 인트론 불포함)은 가뭄 스트레스 (5옆 단계에서, 물을 공급하지 않은 후 4, 8, 13일) 하에 유도가능 발현을 보이지 않았다. 트랜스젠의 발현을 향상시키기 위해, Zm.유비퀴틴 인트론을 At.cor78 프로모터 구성체의 5'UTR 내에 부가하여 pBPSMM346 구성체를 생성시켰다. 5엽 단계에서 pBPSMM346을 함유하는 트랜스제닉 옥수수 식물을 가뭄 스트레스에 대해 사용하였다. 가뭄-유도가능 발현이 정량적 RT-PCR을 사용하여 TO 식물에서 검출되었다. 상기 감수성 분석을 기초로 하여, 약 3.5배 유도가 가뭄 스트레스 하에 검출되었다. 유도는 정량적 PCR을 사용하여 결정시에 3.5배 이하이었다 (도 3).

실시예 6. 트랜스제닉 작물의 활용

pBPSMM368 내의 리포터 유전자는 배-특이적 방식으로 발현하고 생물적 및 비생물적 환경 스트레스에 대한 내성을 부여하기 위해 목적하는 유전자로 대체될 수 있다. 키메라 구성체는 외떡잎 식물로 형질전환된다. 당업계의 형질전환을 위한 표준 방법이 필요한 경우 사용될 수 있다. 형질전환된 식물은 공지의 방법을 이용하여 재생된다. 생물량, 수확량, 지방산 조성, 고급 오일, 질병 내성의 개선, 또는 수확량 향상 또는 안정성과 연결된 임의의 다른 표현형을 결정하기 위해서 다양한 표현형을 측정한다. 유전자 발현 수준은 상이한 발달 단계에서 및 상이한 세대 (T₀ 내지 T₂ 식물 또는 추가의 세대)에서 결정한다. 식물에서의 평가 결과를 통해, 수확량 증가, 질병 내성 개선, 및/또는 비생물적 스트레스 내성 개선을 위해 적절한 유전자를 상기 프로모터와 조합하여 결정할 수 있다.

실시예 7. 외떡잎 식물에서 선택가능 마커 유전자의 발현

pBPSMM368 내의 리포터 유전자는 선택가능 마커 유전자로 대체되고, 외떡잎 식물, 예를 들어 옥수수, 밀, 벼, 보리, 호밀, 기장, 사탕수수, 호밀풀 또는 율무, 라이밀 사탕수수, 또는 귀리 (이들 식물 종으로 제한되지 않음) 내로 형질전환될 수 있다. 당업계의 형질전환을 위한 표준 방법이 필요한 경우에 사용될 수 있다. 형질전환된 식물은 목적하는 선택제 하에 선택되고, 공지의 방법을 이용하여 재생된다. 선택 방식은 조직 또는 조직 배양 세포의 초기 발달 단계에서 조사된다. 유전자 발현 수준은 상이한 발달 단계에서 및 상이한 세대 (T₀ 내지 T₂ 식물 또는 추가의 세대)에서 결정할 수 있다. 식물에서의 평가 결과를 통해, 적절한 유전자를 상기 프로모터와 조합하여 결정할 수 있다.

실시예 8. 결실 분석

클로닝 방법은 문헌 [Rouster (1997) 및 Sambrook (1989)]에 기재되어 있다. 이들 프로모터의 상세한 매핑 (mapping) (즉, 그의 특이성에 관련된 핵산 세그먼트의 한정)은 먼저 전체 프로모터 구역을, 이어서 그의 각종 단편을 함유하는 다양한 리포터 유전자 발현 벡터를 생성시킴으로써 수행한다. 먼저, 전체 프로모터 구역 또는 그의 단편을 GUS 또는 다른 리포터 유전자를 함유하는 이원 벡터 내로 클로닝한다. 이를 위해, 전장 프로모터 서열 내의 내부 제한 절단 부위에 대한 제한 효소를 사용하여 얻은 단편을 먼저 사용한다. 다음으로, 프라이머에 의해 도입된 절단 부위가 제공된 PCR 단편을 사용한다. 다양한 결실된 프로모터를 함유하는 키메라 GUS 구성체를 현재 실시되는 형질전환 방법을 사용하여 제아 메이즈, 아라비돕시스 및 다른 식물 종 내로 형질전환시킨다. 프로모터 활성은 상이한 발달 단계에서 다양한 조직 및 기관에서 GUS 조직화학 분석 또는 다른 적절한 방법을 사용하여 분석한다. 프로모터 서열의 변형은 본 발명자들의 필요성을 기초로 하여 누설을 제거할 수 있다.

실시예 9. 생체내 돌연변이 유발

당업자는 프로모터 활성의 변형 또는 중요한 프로모터 성분의 확인을 위한 다양한 방법을 잘 알고 있다. 이들 방법 중 하나는 무작위 돌연변이, 이어서 상기 설명된 바와 같은 리포터 유전자를 사용한 시험을 기초로 한다. 미생물의 생체내 돌연변이 유발은 유전 정보의 통합성 유지능이 붕괴된 이. 콜라이 또는 다른 미생물 (예를 들어 바실러스 spp. 또는 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애)을 통한 플라스미드 (또는 또다른 벡터) DNA의 계대배양을 통해 달성될 수 있다. 통상적인 돌연변이자 (mutator) 균주는 DNA 복구 시스템의 유전자 (예를 들어 mutHLS, mutD, mutT 등; 문헌 [Rupp 1996] 참고)에 돌연변이를 갖는다. 당업자는 이들 균주를 잘 알고 있다. 이들 균주의 사용은 예를 들어 문헌 [Greener (1994)]에 예시되어 있다. 돌연변이된 DNA 분자를 식물 내로 전달하는 것은 바람직하게는 미생물의 선택 및 시험 후에 수행한다. 트랜스제닉 식물은 상기 설명된 바와 같이 생성되어 분석된다.

실시예 10. 과다발현을 위한 벡터 구성 및 유전자 "녹아웃" 실험

10.1 과다발현

식물에서 목적하는 전장 "후보 유전자"의 발현을 위해 사용되는 벡터 (과다발현)는 목적하는 단백질을 과다발현하도록 설계되고, 사용될 식물 형질전환 방법에 따라 2개의 일반적인 종류, 즉 바이올리스틱 및 이원 벡터이다.

바이올리스틱 형질전환을 위해 (바이올리스틱 벡터), 필요 조건은 다음과 같다:

1. 에스케리치아 콜리 (이. 콜라이; 예를 들어, CoIEI)에서 기능성인 세균 선택가능 마커 (전형적으로, 항생제 저항성 유전자) 및 복제 기점을 갖는 백본, 및

2. 다음으로 이루어진 식물-특이적 부분:

a. 프로모터 (예를 들어 ZmUBIint MOD), 목적하는 유전자 (전형적으로, 전장 cDNA) 및 전사 터미네이터 (예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스 nos 터미네이터)로 이루어진 유전자 발현 카세트;

b. 적합한 프로모터, 선택가능 마커 유전자 (예를 들어, D-아미노산 옥시다제; dao1) 및 전사 터미네이터 (예를 들어, nos 터미네이터)로 이루어진 식물 선택가능 마커 카세트.

다음으로 이루어진, 아그로박테리움 투메파시엔스에 의한 형질전환을 위해 설계된 벡터 (에이. 투메파시엔스; 이원 벡터):

1. 이. 콜라이 및 아그로박테리움 투메파시엔스에서 기능성인 세균 선택가능 마커 (예를 들어, aadA 유전자에 의해 매개된 스펙티노마이신 저항성) 및 상기 언급된 각각의 세균 숙주에서 기능성인 2개의 복제 기점 + 아그로박테리움 투메파시엔스 virG 유전자를 갖는 백본;

2. 아그로박테리움 투메파시엔스 우측 및 좌측 경계 서열에 의해 플랭킹된 DNA의 식물에 대한 전달을 매개하는 상기 2개의 서열이 식물-특이적 부분에 플랭킹되는 것을 제외하고는, 상기 바이올리스틱 벡터에 대해 설명된 식물-특이적 부분.

10.2 유전자 침묵 벡터

또한, 단일 유전자 또는 패밀리 또는 관련 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 설계된 벡터 (유전자 침묵 벡터)도 유전자 발현을 하향 조절하기 위해 사용되는 방법에 대응하는 2개의 일반적인 종류이다: 안티센스 또는 이중가닥 RNA 간섭 (dsRNAi).

(a) 안티센스

안티센스 벡터에 대해, 전장 또는 부분적인 유전자 단편 (전형적으로, cDNA의 일부)이 유전자 발현 카세트의 일부로서 전장 발현에 대해 설명된 바와 동일한 벡터에 사용될 수 있다. 유전자 발현의 안티센스-매개 하향 조절을 위해, 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 구역은 프로모터에 대해 반대 배향으로 위치할 것이고; 따라서, mRNA는 식물 내에서 비-코딩 (안티센스) 스트랜드로부터 제조될 것이다.

(b) dsRNAi

dsRNAi 벡터에 대해, 부분적인 유전자 단편 (전형적으로, 300 내지 500개 염기쌍 길이)이 유전자 발현 카세트에 사용되고, 스페이서 (spacer) 구역 (전형적으로, 식물 인트론, 예를 들어 OsSH1 인트론 1, 또는 예를 들어 카나마이신 내성을 부여하는 선택가능 마커)에 의해 분리된 센스 및 안티센스 배향 모두에서 발현된다. 상기 종류의 벡터는 식물 내에서 2개의 상보성 유전자 단편의 10개의 염기쌍으로부터 이중가닥 mRNA 줄기를 형성하도록 설계된다.

과다발현 또는 녹아웃을 위해 설계된 바이올리스틱 또는 이원 벡터는 예를 들어 식물 및 세균에 사용되는 선택가능 마커, 유전자 발현에 사용되는 전사 터미네이터 및 식물 선택가능 마커 카세트, 및 목적하는 유전자 또는 유전자 단편의 클로닝을 위해 사용되는 방법 (전형적으로, 통상적인 제한 효소-매개된 또는 Gateway™ 재조합효소-기반 클로닝)을 포함하여 많은 상이한 방식으로 다를 수 있다.

실시예 11. At.Cor78 프로모터 (서열 1)에 대한 추정 전사 인자 결합 부위 분석

아래 주어진 Genomatixs 결과를 기초로 하여, 잠재적인 TATA 박스는 서열 1의 염기쌍 790 내지 804에 위치할 수 있다.

실시예 12. 적어도 하나의 스트레스 인자에 대한 향상된 저항성, 종자 또는 새싹의 영양적 품질, 수확량, 또는 선택 마커 절제 빈도

pBPSMM368 내의 리포터 유전자를 발아 동안 배에서 발현되는

(1) 비생물적 스트레스 저항성 유전자 (14-3-3 단백질 & 포스포이노시티드-특이적 포스포리파제 C: WO0177355 및 US6720477),

(2) 비타민 E 생합성에 관여하는 유전자 (타이로신 아미노트랜스퍼라제 (BT000782: WO02072848), 추정 포르포빌리노겐 데아미나제, 추정 오메가-3 지방산 데새쳐라제 (desaturase) [NM 185577]),

(3) 생물적 스트레스 저항성 유전자 (오리자 사티바 푸사리움 (Oryza sativa Fusarium) 저항성 단백질 I2C-5-유사 [NM194161], 발병 기전 관련 유전자 5의 구성적 발현자 (expressor) (cpr5: NM185577)), GTPase [WO03020939], 액틴 해중합 인자 3 [WO2004035798], ROR2 및 신탁신 (Syntaxin)의 t-SNARE 상호작용자, SNAP34의 상호작용자 [WO2004081217],

(4) 귀소 엔도뉴클레아제 유전자 (예를 들어 귀소 엔도뉴클레아제 I-SceI을 코딩하는 서열)

로 대체하여, 예를 들어 비생물적 환경 스트레스에 대한 내성, 잠재적인 수확량 향상을 일으키는 조기 강세, 비타민 E의 양, 생물적 스트레스에 대한 내성 및 마커 절제의 빈도를 개선시킬 수 있다. 키메라 구성체는 외떡잎 식물로 형질전환된다. 당업계의 형질전환을 위한 표준 방법이 필요한 경우에 사용될 수 있다. 형질전환된 식물은 공지의 방법을 이용하여 재생된다. 생물량, 수확량, 지방산 조성, 고급 오일, 질병 내성의 개선, 또는 수확량 향상 또는 수확량 안정성을 나타내는 임의의 다른 표현형을 결정하기 위해서 다양한 표현형을 측정한다. 유전자 발현 수준은 상이한 발달 단계에서 및 상이한 세대 (T₀ 내지 T₂ 식물 또는 추가의 세대)에서 결정한다. 식물에서의 평가 결과를 통해, 수확량, 질병 내성 개선, 및/또는 비생물적 스트레스 내성 개선 및/또는 종자 또는 새싹의 영양적 품질 증가를 유도하는 적절한 유전자를 상기 프로모터와 조합하여 확인할 수 있다.

실시예 13. 외떡잎 식물에서 사료, 식품, 또는 수확량 형질을 개선하기 위한 트랜스젠의 발현

pBPSMM368 내의 리포터 유전자는 외떡잎 식물, 예를 들어 벼, 보리, 옥수수, 밀, 또는 호밀풀 (이들 식물 종으로 제한되지 않음) 내로 형질전환될 때 배에서 영양 가치를 개선하기 위해 배에서 대부분 과다발현되는 목적하는 유전자로 대체될 수 있다. 목적하는 유전자는 하나 이상의 표적 유전자를 하향 조절하기 위한 비-코딩 서열 (예를 들어 miRNA 전구체, 또는 ta-siRNA)일 수 있다. 당업계의 형질전환을 위한 표준 방법이 필요한 경우에 사용될 수 있다. 형질전환된 식물은 목적하는 선택제 하에 선택되고, 공지의 방법을 이용하여 재생된다. 선택 방식은 조직 또는 조직 배양 세포의 초기 발달 단계에서 조사된다. 유전자 발현 수준은 상이한 발달 단계에서 및 상이한 세대 (T₀ 내지 T₂ 식물 또는 추가의 세대)에서 결정할 수 있다. 식물에서의 평가 결과를 통해, 적절한 유전자를 상기 프로모터와 조합하여 결정할 수 있다.

참고문헌

모든 공개, 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 포함된다. 상기 명세서에서 본 발명은 그의 바람직한 특정 실시태양에 관하여 설명되고, 많은 상세한 내용이 예시의 목적으로 기재되었지만, 본 발명은 추가의 실시태양이 가능하고, 본원에 설명된 특정 상세한 내용은 본 발명의 기본 원리로부터 벗어나지 않으면서 상당히 변화될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> BASF Plant Science GmbH Song, Hee-Sook Dammann, Christian <120> Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants <130> PF58489 <160> 144 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 833 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> promoter <222> (1)..(833) <223> Arabidopsis cor78 promoter regionTATA box: nt 790-804 <400> 1 gcaagaatct caaacacgga gatctcaaag tttgaaagaa aatttatttc ttcgactcaa 60 aacaaactta cgaaatttag gtagaactta tatacattat attgtaattt tttgtaacaa 120 aatgttttta ttattattat agaattttac tggttaaatt aaaaatgaat agaaaaggtg 180 aattaagagg agagaggagg taaacatttt cttctatttt ttcatatttt caggataaat 240 tattgtaaaa gtttacaaga tttccatttg actagtgtaa atgaggaata ttctctagta 300 agatcattat ttcatctact tcttttatct tctaccagta gaggaataaa caatatttag 360 ctcctttgta aatacaaatt aattttcgtt cttgacatca ttcaatttta attttacgta 420 taaaataaaa gatcatacct attagaacga ttaaggagaa atacaattcg aatgagaagg 480 atgtgccgct tgttataata aacagccaca cgacgtaaac 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gctgtcgatc 120 ttgagaacta tgccgacata ataggaaatc gctggataaa gccgctgagg aagctgagtg 180 gcgctatttc tttagaagtg aacgttgacg atcgtcgacc gtaccccgat gaattaattc 240 ggacgtacgt tctgaacaca gctggatact tacttgggcg attgtcatac atgacatcaa 300 caatgtaccc gtttgtgtaa ccgtctcttg gaggttcgta tgacactagt ggttcccctc 360 agcttgcgac tagatgttga ggcctaacat tttattagag agcaggctag ttgcttagat 420 acatgatctt caggccgtta tctgtcaggg caagcgaaaa ttggccattt atgacgacca 480 atgccccgca gaagctccca tctttgccgc catagacgcc gcgcccccct tttggggtgt 540 agaacatcct tttgccagat gtggaaaaga agttcgttgt cccattgttg gcaatgacgt 600 agtagccggc gaaagtgcga gacccatttg cgctatatat aagcctacga tttccgttgc 660 gactattgtc gtaattggat gaactattat cgtagttgct ctcagagttg tcgtaatttg 720 atggactatt gtcgtaattg cttatggagt tgtcgtagtt gcttggagaa atgtcgtagt 780 tggatgggga gtagtcatag ggaagacgag cttcatccac taaaacaatt ggcaggtcag 840 caagtgcctg ccccgatgcc atcgcaagta cgaggcttag aaccaccttc aacagatcgc 900 gcatagtctt ccccagctct ctaacgcttg agttaagccg cgccgcgaag cggcgtcggc 960 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ggattcgata acgtgctgat ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat tggggccaac 8580 tcctaccgta cctcgcatta cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat 8640 ggcatcgtgg tgattgatga aactgctgct gtcggcttta acctctcttt aggcattggt 8700 ttcgaagcgg gcaacaagcc gaaagaactg tacagcgaag aggcagtcaa cggggaaact 8760 cagcaagcgc acttacaggc gattaaagag ctgatagcgc gtgacaaaaa ccacccaagc 8820 gtggtgatgt ggagtattgc caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc acgggaatat 8880 ttcgcgccac tggcggaagc aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat cacctgcgtc 8940 aatgtaatgt tctgcgacgc tcacaccgat accatcagcg atctctttga tgtgctgtgc 9000 ctgaaccgtt attacggatg gtatgtccaa agcggcgatt tggaaacggc agagaaggta 9060 ctggaaaaag aacttctggc ctggcaggag aaactgcatc agccgattat catcaccgaa 9120 tacggcgtgg atacgttagc cgggctgcac tcaatgtaca ccgacatgtg gagtgaagag 9180 tatcagtgtg catggctgga tatgtatcac cgcgtctttg atcgcgtcag cgccgtcgtc 9240 ggtgaacagg tatggaattt cgccgatttt gcgacctcgc aaggcatatt gcgcgttggc 9300 ggtaacaaga aagggatctt cactcgcgac cgcaaaccga agtcggcggc ttttctgctg 9360 caaaaacgct ggactggcat gaacttcggt gaaaaaccgc agcagggagg caaacaatga 9420 atcaacaact ctcctggcgc accatcgtcg gctacagcct cgggaattgc taccgagctc 9480 gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc 9540 cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 9600 catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 9660 catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc 9720 ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt 9780 tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc 9840 cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt 9900 tgcgcagcct gaatggcgaa tgctagagca gcttgagctt ggatcagatt gtcgtttccc 9960 gccttcagtt taaacgatag cggtgaaggg ggcggccgcg gagcctgctt ttttgtacaa 10020 acttgtgata aacgggccgc tctagattag tgtacggaat aaaagtccta attcattctt 10080 tttcttatac gtcaccgttt tctacattta gaaaaatgaa gtgggaatca attgaaacaa 10140 ttgatagctt taaatatcaa gctgtcttct ccaggaccag gccccagcac atcggcgtgg 10200 aaagcgctag gccccagaac aactcgtcaa tcgtcatggc aaataatgac acattgagcc 10260 gatttgatgc atggaacaga ctaataagga actcaaatct ctttggagat tgaatgattg 10320 agatgaaaat gaattaatat tttttctcaa tcccctccaa tgctaagaaa gtttgagttt 10380 ccaaattagc tttagagggc gtttagatcc cttcgtttta gagaaattag aattcactca 10440 ataaaataac ttatttaatt tggaatttga tattcaacca cttttcaaag tttagatata 10500 ggtctatctc aaattcatag ggtggatgat ggaaatgatt ttatgcatta atagaatttg 10560 tttctactgt gtaacttaca tgacactctt catctcactc ctgtatagta aaaatgtagc 10620 atataaatat ctccgacatc ttgataataa tagtatacaa atatattttg cataaaaccg 10680 aattaactta attgatatat gccaaaatta ctattattag aatggaattt aattccaatg 10740 atccaaacca cgaaaatgga tcaggtaact aattcagtca aatgcctcat tttttttcac 10800 tcccctcaaa ccacgaaaat gccattctgg tttgtaaaat agtttgaaat tgcagcccta 10860 gcattattcc atacatcata tgttgagttg aaattaccaa tataataata actaaaaaag 10920 gaaaaaaata gcgaaaacaa aagcaaggac cagttggaca cttaaatttg gcaacagaag 10980 ccaattcaga accactgcat agcagtgctt attatcttat ttatatgtag caaaaggcac 11040 ttaaatgatc tcttatgaca catgccagaa ggaaaacaac agactacaca attacaaggt 11100 cggaagctac ataggattac cataacagat agctgacggc ctacaaaaaa agatagaata 11160 caggagaaca tcacacagat aaaaacatat cacccttgta ctagcaggga ggcggtgctt 11220 gctggatttt agatcagttg cttgctggat tttagatcag tacacagtcc tgccatcacc 11280 atccaggatc atatccttga aagccccacc attagggatc ataggcaaca catgctcctg 11340 gtgtgggacg attatatcca agaggtacgg ccctggagtc tcgagcatct tctttatcgc 11400 tgcgcggact tcgttcttct ttgtcacacg gaccgctgga atgttgaacc ctttggcgat 11460 cgtcacgaaa tctggatata tctcactttc attctctggg tttcccaagt atgtgtgcgc 11520 tctgttggcc ttatagaacc tgtcctccca ctgcaccacc atccccaggt gctggttgtt 11580 tagcacaaag accttcaccg ggaggttctc aattcggatc atagctagct cctgaacgtt 11640 catgagaaag ctaccatctc catcgatgtc aacaacagta acacctgggt tggccacaga 11700 agcaccagca gcagccggca aaccaaatcc catagcccca agaccagctg aagacaacca 11760 ctgccttggc cgcttgtaag tgtagtactg tgccgcccac atctggtgct gcccaacacc 11820 tgtgccgatg atggcctcgc ctttcgtcag ctcatcaaga acctgaatag catattgtgg 11880 ctggatctcc tcattagatg ttttataccc aagggggaat tccctcttct gctgatccaa 11940 ctcatcgttc catgagccaa agtcaaagct cttctttgat gtgcttcctt caagaagagc 12000 attcatgccc tgcaaagcaa gcttaacatc tgcacagatg gacacatgtg gctgcttgtt 12060 cttgccaatc tcagccggat caatatcaac gtgcacaatc ttagccctgc ttgcaaaagc 12120 ctcaatcttc cctgtcacac gatcatcaaa ccgcacacca agtgcaagca acagatcggc 12180 cttatccact gcataatttg catacaccgt gccatgcata cctagcatgc gcagagacag 12240 tgggtcgtcg ctggggaagt tgccgaggcc cataagagta gttgtgaccg ggattccagt 12300 cagctccaca aagcgtcgca actcctcacc agatgctgcg cagccaccgc caacataaag 12360 aacagggcgc cgggattcac caacaagacg cagcacctgc tcaagcaact cagtcgcagg 12420 gggcttggga aggcgcgcaa tgtacccagg cagactcatg ggcttgtccc agacaggcac 12480 cgccatctgc tgctggatgt ccttggggat gtcgacaagc accggccccg gtcgaccaga 12540 ggaggcgagg aagaaagcct cctgcacgac gcgggggatg tcgtcgacgt cgaggaccag 12600 gtagttgtgc ttggtgatgg agcgggtgac ctcgacgatg ggcgtctcct ggaaggcgtc 12660 ggtgccaatc atgcgtcgcg gcacctgtcc cgtgatggcg accatgggga cggaatcgag 12720 cagcgcgtcg gcgagcgcgg agacaaggtt ggtggcgccg gggccggagg tggcgatgca 12780 gacgccgacg cggcccgagg agcgcgcgta gccggaggcc gcaaaggcct ccccttgctc 12840 gtggcggaag aggtggttgg cgatgacggg ggagcgggtg agtgcctggt ggatctccat 12900 ggacgcgccg ccggggtagg cgaagacgtc gcggacgccg cagcgctcga gggactcgac 12960 gaggatgtcg gcgcccttgc ggggatcggt ggggccccac ggccggagcg gggtggccgg 13020 gggagccatc ggcatggcgg gtgacgccgc tgagcacctg atgggcgcgg cgagggcgcg 13080 gcgggtggcc aggaggtgcg cccggcgcct cgccttgggc gcagcggtag tggcgccagt 13140 gagcgcggta gacgcggcgg cggcggtggc catggtttct agaactagtg gatcccccgg 13200 gggtaccctg cagaagtaac accaaacaac agggtgagca tcgacaaaag aaacagtacc 13260 aagcaaataa atagcgtatg aaggcagggc taaaaaaatc cacatatagc tgctgcatat 13320 gccatcatcc aagtatatca agatcgaaat aattataaaa catacttgtt tattataata 13380 gataggtact caaggttaga gcatatgaat agatgctgca tatgccatca tgtatatgca 13440 tcagtaaaac ccacatcaac atgtatacct atcctagatc gatatttcca tccatcttaa 13500 actcgtaact atgaagatgt atgacacaca catacagttc caaaattaat aaatacacca 13560 ggtagtttga aacagtattc tactccgatc tagaacgaat gaacgaccgc ccaaccacac 13620 cacatcatca caaccaagcg aacaaaaagc atctctgtat atgcatcagt aaaacccgca 13680 tcaacatgta tacctatcct agatcgatat ttccatccat catcttcaat tcgtaactat 13740 gaatatgtat ggcacacaca tacagatcca aaattaataa atccaccagg tagtttgaaa 13800 cagaattcta ctccgatcta gaacgaccgc ccaaccagac cacatcatca caaccaagac 13860 aaaaaaaagc atgaaaagat gacccgacaa acaagtgcac ggcatatatt gaaataaagg 13920 aaaagggcaa accaaaccct atgcaacgaa acaaaaaaaa tcatgaaatc gatcccgtct 13980 gcggaacggc tagagccatc ccaggattcc ccaaagagaa acactggcaa gttagcaatc 14040 agaacgtgtc tgacgtacag gtcgcatccg tgtacgaacg ctagcagcac ggatctaaca 14100 caaacacgga tctaacacaa acatgaacag aagtagaact accgggccct aaccatggac 14160 cggaacgccg atctagagaa ggtagagagg gggggggggg gggaggacga gcggcgtacc 14220 ttgaagcgga ggtgccgacg ggtggatttg ggggagatct ggttgtgtgt gtgtgcgctc 14280 cgaacaacac gaggttgggg aaagagggtg tggagggggt gtctatttat tacggcgggc 14340 gaggaaggga aagcgaagga gcggtgggaa aggaatcccc cgtagctgcc ggtgccgtga 14400 gaggaggagg aggccgcctg ccgtgccggc tcacgtctgc cgctccgcca cgcaatttct 14460 ggatgccgac agcggagcaa gtccaacggt ggagcggaac tctcgagagg ggtccagagg 14520 cagcgacaga gatgccgtgc cgtctgcttc gcttggcccg acgcgacgct gctggttcgc 14580 tggttggtgt ccgttagact cgtcgacggc gtttaacagg ctggcattat ctactcgaaa 14640 caagaaaaat gtttccttag tttttttaat ttcttaaagg gtatttgttt aatttttagt 14700 cactttattt tattctattt tatatctaaa ctattaaata aaaaaactaa aatagagttt 14760 tagttttctt aatttagagg ctaaaataga ataaaataga tgtactaaaa aaattagtct 14820 ataaaaacca ttaaccctaa accctaaatg gatgtactaa taaaatggat gaagtattat 14880 ataggtgaag ctatttgcaa aaaaaaagga gaacacatgc acactaaaaa gataaaactg 14940 tagagtcctg ttgtcaaaat actcaattgt cctttagacc atgtctaact gttcatttat 15000 atgattctct aaaacactga tattattgta gtactataga ttatattatt cgtagagtaa 15060 agtttaaata tatgtataaa gatagataaa ctgcacttca aacaagtgtg acaaaaaaaa 15120 tatgtggtaa ttttttataa cttagacatg caatgctcat tatctctaga gaggggcacg 15180 accgggtcac gctgcactgc agccgcggaa gcttgcatgc ctgcaggcat gcaagcttgg 15240 cgcgccttaa ttaacacgtg ggcgcgccac tagtcaattc agtacattaa aaacgtccgc 15300 aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac cacaatatat cctgccacca 15360 gccagccaac agctccccga ccggcagctc ggcacaaaat caccactcga tacaggcagc 15420 ccatcagtcc gggacggcgt cagcgggaga gccgttgtaa ggcggcagac tttgctcatg 15480 ttaccgatgc tattcggaag aacggcaact aagctgccgg gtttgaaaca cggatgatct 15540 cgcggagggt agc 15553 <210> 3 <211> 583 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> Intron <222> (1)..(583) <223> BPSI.1 intron <400> 3 gtaagatccg atcaccatct tctgaatttc tgttcttgat ctgtcatgta taataactgt 60 ctagtcttgg tgttggtgag atggaaattc ggtggatctc ggaagggata ttgttcgttt 120 gctggggttt tttttgtgtg ttgtgatccg tagagaattt gtgtttatcc atgttgttga 180 tcttggtatg tattcatgac atattgacat gcatgtgttg tatgtgtcat atgtgtgcct 240 ctccttggga tttgttttgg ataatagaac atgttatgga ctcaatagtc tgtgaacaaa 300 tcttttttta gatggtggcc aaatctgatg atgatctttc ttgagaggaa aaagttcatg 360 atagaaaaat cttttttgag atggtggctt aatgtgatga tgatctttct tgagaggaaa 420 aaaaagattc attataggag attttgattt agctcctttc caccgatatt aaatgaggag 480 catgcatgct gattgctgat aaggatctga tttttttatc ccctcttctt tgaacagaca 540 agaaataggc tctgaatttc tgattgatta tttgtacatg cag 583 <210> 4 <211> 1006 <212> DNA <213> Zea mays <220> <221> Intron <222> (1)..(1006) <400> 4 gtacgccgct cgtcctcccc cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg 60 tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt 120 gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg 180 attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca 240 gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc 300 ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg 360 tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattctgt 420 ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca 480 tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat 540 gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg 600 tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct 660 ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt 720 taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat 780 gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct 840 attataataa acaagtatgt tttataatta tttcgatctt gatatacttg gatgatggca 900 tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg 960 gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg ttactt 1006 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> arabidopsis thaliana <220> <221> primer_bind <222> (1)..(27) <400> 5 gcaagaatct caaacacgga gatctca 27 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> primer_bind <222> (1)..(29) <400> 6 atttgtgagt aaaacagagg agggtctca 29 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> primer_bind <222> (1)..(35) <400> 7 cccgggcacc ctgcggaggg taagatccga tcacc 35 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> primer_bind <222> (1)..(30) <400> 8 cggaccggta catcttgcat ctgcatgtac 30 <210> 9 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> AG-motif binding protein <400> 9 ggagatctca a 11 <210> 10 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> AG-motif binding protein 1 core seq <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 nnngatcnnn n 11 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Petunia hybrida <400> 11 gtaagtttgt tttgagt 17 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Petunia hybrida <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 12 nnnnnnttgt nnnnnnn 17 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 13 acttacgaaa tttaggtaga a 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 14 nnntacgnnn nnnnnnnnnn n 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 15 aattacaata taatgtatat a 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 16 atatacatta tattgtaatt t 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 17 nnntacannn nnnnnnnnnn n 21 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Petunia hybrida <400> 18 aacattttgt tacaaaa 17 <210> 19 <211> 11 <212> DNA <213> Glycine max <400> 19 tgtttttatt a 11 <210> 20 <211> 11 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (7)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 20 nnttttnnnn n 11 <210> 21 <211> 11 <212> DNA <213> Helianthus annuus <400> 21 tttattatta t 11 <210> 22 <211> 11 <212> DNA <213> Helianthus annuus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 22 nnnnnnatta n 11 <210> 23 <211> 11 <212> DNA <213> Helianthus annuus <400> 23 attattatta t 11 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> SBF-1 <400> 24 ttactggtta aattaaa 17 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> SBF-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 25 nnnnnnntta annnnnn 17 <210> 26 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> GAP-1 <400> 26 aaaaatgaat agaaa 15 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Cis-element <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 27 nnnnatgann nnnnn 15 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> prolamin box <400> 28 tgaatagaaa aggtgaa 17 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> prolamin box <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 29 nnnnnnnnaa agnnnnn 17 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> I-box in rbc genes and other light regulated genes <400> 30 gaatagaaaa ggtgaat 17 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> I-BOX in rbcS genes and other light regulated genes <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 31 nnnnngaaan nnnnnnn 17 <210> 32 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> nodulin consensus sequence 1 <400> 32 gaaaaggtga a 11 <210> 33 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> nodulin consensus sequence 1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 33 naaaannnnn n 11 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> unknown <220> <223> OCS-like elements <400> 34 agaagaaaat gtttacctcc t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> unknown <220> <223> OCS-like elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 35 nnnnnnnnnn nnnnacctnn n 21 <210> 36 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> nodulin consensus sequence 1 <400> 36 aaaatgttta c 11 <210> 37 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> nodulin consensus sequence 1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 37 naaatnnnnn n 11 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> unknown <220> <223> MADS-box protein <400> 38 ttcttctatt ttttcatatt t 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> unknown <220> <223> MADS-box protein <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 39 nnnnnnnatt tnnnnnnnnn n 21 <210> 40 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> cis-element in the GAPDH promoters conferring light inducibility <400> 40 aaatatgaaa aaata 15 <210> 41 <211> 17 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <400> 41 taatttatcc tgaaaat 17 <210> 42 <211> 17 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 42 nnnnnnatcc nnnnnnn 17 <210> 43 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> class I GATA factors <400> 43 ttcaggataa attattg 17 <210> 44 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> class I GATA factors <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 44 nnnnngatan nnnnnnn 17 <210> 45 <211> 11 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 45 taaattattg t 11 <210> 46 <211> 11 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 46 nnnattannn n 11 <210> 47 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> HDZip class I protein ATHB5 <400> 47 acaataattt a 11 <210> 48 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> HDZip class I protein ATHB5 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 48 nnnataannn n 11 <210> 49 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> trihelix DNA-binding factor GT-3a <400> 49 taaactttta caataat 17 <210> 50 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> trihelix DNA-binding factor GT-3a <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 50 nnnnnnttta nnnnnnn 17 <210> 51 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> nodulin consensus sequence 1 <400> 51 taaaagttta c 11 <210> 52 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> GAAA motif <400> 52 aaatggaaat cttgtaa 17 <210> 53 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> GAAA motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 53 nnnnngaaan nnnnnnn 17 <210> 54 <211> 17 <212> DNA <213> Spinacia oleracea <400> 54 tcaaatggaa atcttgt 17 <210> 55 <211> 17 <212> DNA <213> Spinacia oleracea <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 55 nnnnatggnn nnnnnnn 17 <210> 56 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> WRKY plant specific zinc-finger-type factor <400> 56 tccatttgac tagtgta 17 <210> 57 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> WRKY plant specific zinc-finger-type factor <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 57 nnnnnttgan nnnnnnn 17 <210> 58 <211> 17 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 58 gagaatattc ctcattt 17 <210> 59 <211> 17 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 59 nnnnatatnn nnnnnnn 17 <210> 60 <211> 17 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 60 aggaatattc tctagta 17 <210> 61 <211> 11 <212> DNA <213> Helianthus annuus <220> <221> misc_feature <223> n is a, c, g, or t <400> 61 aagatcatta t 11 <210> 62 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> motif involved in carotenoid and tocopherol biosynthesis and in the expression of photosynthesis related genes <400> 62 tcatctactt c 11 <210> 63 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> motif involved in carotenoid and tocopherol biosynthesis and in the expression of photosynthesis-related genes <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (7)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 63 nnatctnnnn n 11 <210> 64 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> classs I GATA factors <400> 64 tagaagataa aagaagt 17 <210> 65 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> heat shock element <400> 65 agaagataaa agaag 15 <210> 66 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> heat shock element <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 66 nnnnnnnnnn agaan 15 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 67 ttattcctct actggtagaa g 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 68 nnnttccnnn nnnnnnnnnn n 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 69 ttctaccagt agaggaataa a 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 70 nnntaccnnn nnnnnnnnnn n 21 <210> 71 <211> 17 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 71 ttgtttattc ctctact 17 <210> 72 <211> 17 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 72 nnnnttatnn nnnnnnn 17 <210> 73 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> prolamin box, conserved in cereal seed storage protein gene promoters <400> 73 tcctttgtaa atacaaa 17 <210> 74 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> prolamin box, conserved in cereal seed storage protein gene promoters <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 74 nnnnnnnnaa atnnnnn 17 <210> 75 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> SBF-1 <400> 75 cgtaaaatta aaattga 17 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 76 cttttatttt atacgtaaaa tta 23 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 77 nnnnnnnnnn ntacgnnnnn nnn 23 <210> 78 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> high mobility group I/Y-like proteins <400> 78 cttttatttt atacg 15 <210> 79 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> high mobility group I/Y like proteins <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 79 nnnntattnn nnnnn 15 <210> 80 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> nodulin consensus sequence 1 <400> 80 taaaagatca t 11 <210> 81 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> homeodomain protein WUSCHEL <400> 81 ctccttaatc g 11 <210> 82 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> homeodomain protein WUSCHEL <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 82 nnnnntaatn n 11 <210> 83 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> GT1-Box binding factors with a trihelix DNA-binding domain <400> 83 catgtggtca ttttacg 17 <210> 84 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> GT1-Box binding factors with a trihelix DNA-binding domain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 84 nnnnnngtca nnnnnnn 17 <210> 85 <211> 13 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 85 attggcccat cat 13 <210> 86 <211> 13 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 86 nnnngcccnn nnn 13 <210> 87 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> C-repeat/dehydration response element <400> 87 atggaccgac tacta 15 <210> 88 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> C-repeat/dehydration response element <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 88 nnnnnccgan nnnnn 15 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 89 acttactatt attagtagtc g 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 90 nnntactnnn nnnnnnnnnn n 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 91 gactactaat aatagtaagt t 21 <210> 92 <211> 11 <212> DNA <213> Helianthus annuus <400> 92 actattatta g 11 <210> 93 <211> 13 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <400> 93 cttactatta tta 13 <210> 94 <211> 13 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (7)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 94 nntactnnnn nnn 13 <210> 95 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> trihelix DNA-binding factor GT-3a <400> 95 tagtaagtta catttta 17 <210> 96 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> trihelix DNA-binding factor GT-3a <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 96 nnnnnngtta nnnnnnn 17 <210> 97 <211> 9 <212> DNA <213> unknown <220> <223> TEIL <400> 97 atgtaactt 9 <210> 98 <211> 9 <212> DNA <213> unknown <220> <223> TEIL <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(9) <223> n is a, c, g, or t <400> 98 ntgtannnn 9 <210> 99 <211> 17 <212> DNA <213> Spinacia oleracea <400> 99 taggatggaa taaatat 17 <210> 100 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> C-repeat/dehydration response element <220> <221> misc_feature <223> n is a, c, g, or t <400> 100 tcataccgac atcag 15 <210> 101 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> PBF <400> 101 ttgaaagaaa agggaaa 17 <210> 102 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> PBF <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 102 nnnnnnnnaa agnnnnn 17 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> unknown <220> <223> TEF cis acting elements <400> 103 aaaagggaaa aaaagaaaaa a 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> unknown <220> <223> TEF cis acting elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (7)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 104 nnaaggnnnn nnnnnnnnnn n 21 <210> 105 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> nodulin consensus sequence 1 <400> 105 taaaagatat a 11 <210> 106 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> C-repeat/dehydration response elements <400> 106 tactaccgac atgag 15 <210> 107 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Dof3-single zinc finger transcription factor <400> 107 agttccaaaa agcaaaa 17 <210> 108 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> DOF3-single zinc finger transcription factor <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 108 nnnnnnnnaa agnnnnn 17 <210> 109 <211> 11 <212> DNA <213> unknown <220> <223> nodulin consensus sequence 1 <400> 109 aaaaagatca a 11 <210> 110 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> C-repeat/dehydration response element <400> 110 tcaagccgac acaga 15 <210> 111 <211> 19 <212> DNA <213> unknown <220> <223> coupling element 3 (CE3) <400> 111 tctctacgcg tgtctgtgt 19 <210> 112 <211> 19 <212> DNA <213> unknown <220> <223> coupling element 3 (CE3) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 112 nnnnnncgcg nnnnnnnnn 19 <210> 113 <211> 11 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 113 ctacgcgtgt c 11 <210> 114 <211> 11 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 114 nnncgcgnnn n 11 <210> 115 <211> 11 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 115 acacgcgtag a 11 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 116 gtggtgtgac gtcaaagtca t 21 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 117 nnnnnntgac nnnnnnnnnn n 21 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 118 tgactttgac gtcacaccac g 21 <210> 119 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> WRKY plant specific zinc-finger-type factor associated with pathogen defence <400> 119 tgactttgac gtcacac 17 <210> 120 <211> 17 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 120 actttgacgt cacacca 17 <210> 121 <211> 17 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 121 nnnnnnacgt nnnnnnn 17 <210> 122 <211> 15 <212> DNA <213> Medicago sativa <400> 122 ttttcgtggt gtgac 15 <210> 123 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Zinc-finger protein core motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 123 nnnnngtggn nnnnn 15 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> unknown <220> <223> bZIP protein G-Box binding factor 1 <400> 124 cgcttcatac gtgtcccttt a 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> unknown <220> <223> bZIP protein G-Box binding factor 1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 125 nnnnnnnnac gtnnnnnnnn n 21 <210> 126 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> ABA response elements <400> 126 gcttcatacg tgtccct 17 <210> 127 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> ABA response elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 127 nnnnnnnacg tnnnnnn 17 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> unknown <220> <223> OCS-like elements <400> 128 agagataaag ggacacgtat g 21 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> unknown <220> <223> OCS-like elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 129 nnnnnnnnnn nnnnacgtnn n 21 <210> 130 <211> 25 <212> DNA <213> unknown <220> <223> (GA)n/(CT)n binding proteins <400> 130 actgagagag ataaagggac acgta 25 <210> 131 <211> 25 <212> DNA <213> unknown <220> <223> (GA)n/(CT)n binding proteins <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(25) <223> n is a, c, g, or t <400> 131 nnnnnnagag nnnnnnnnnn nnnnn 25 <210> 132 <211> 17 <212> DNA <213> unknown <220> <223> class I GATA factors <400> 132 agagagataa agggaca 17 <210> 133 <211> 25 <212> DNA <213> unknown <220> <223> (GA)n/(CT)n binding proteins <400> 133 atagagagac tgagagagat aaagg 25 <210> 134 <211> 25 <212> DNA <213> unknown <220> <223> (GA)n/(CT)n binding proteins <400> 134 ttatagagag actgagagag ataaa 25 <210> 135 <211> 25 <212> DNA <213> unknown <220> <223> (GA)n/(CT)n binding proteins <400> 135 gtttatagag agactgagag agata 25 <210> 136 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> plant TATA box <400> 136 tctctataaa cttag 15 <210> 137 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> plant tata box <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 137 nnnntatann nnnnn 15 <210> 138 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> core motif of GAGA/GAGABP.01 motif2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(25) <223> n is a, c, g, or t <400> 138 nnnnnnagac nnnnnnnnnn nnnnn 25 <210> 139 <211> 1800 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 139 atggagtcac agttgacacg tccttatggt catgagcaag cagaagaacc aatcagaatt 60 caccatccag aagaagagca tcatgagaag ggagcatcca aagtgttgaa gaaagtaaaa 120 gaaaaggcta agaaaatcaa gaacagtctc actaaacatg gaaatggtca tgatcacgat 180 gtggaagatg atgatgatga gtatgacgag caagacccag aagttcacgg cgcaccagtg 240 tatgaatcct ctgccgtgag aggtggtgta acgggtaaac ctaagtctct tagtcatgcc 300 ggagaaacta atgttccggc atcggaggag attgttcctc cagggacaaa agtttttcct 360 gtcgtgtctt ctgaccacac caaacccatt gagcctgtat cattacaaga tacctcttac 420 ggacatgagg cactggctga tcctgtaaga acgacggaaa catcggactg ggaagcgaaa 480 agagaggcac cgactcatta tcctctcgga gtgtcagaat tttcagacag aggagagagc 540 agagaggctc atcaagagcc attgaacact cctgtgtctc tgctttcagc aacagaggac 600 gtgactagga cgtttgctcc tggtggtgaa gatgactatc tcggtggtca acggaaagtc 660 aacgtcgaga cgccaaaacg tttggaggaa gatccggctg ctccaggagg aggatcggat 720 tatctcagtg gtgtatctaa ttatcagtcc aaagttactg atcccacgca taaaggtgga 780 gaagctggag taccagagat tgctgagtct cttggtagaa tgaaagtgac tgatgagtct 840 cctgatcaga aatcaagaca aggacgcgaa gaagactttc cgacgagaag ccatgagttt 900 gatctgaaga aggaatctga tatcaacaag aattctccgg caagatttgg aggggaatca 960 aaagctggga tggaggaaga ttttccgaca agaggtgatg tgaaagtaga gagtggattg 1020 ggaagagact taccgacggg aactcatgat cagttctcac cagaactatc tcgtcccaaa 1080 gagagagatg attctgagga aaccaaagat gagtcgacac atgagacaaa accaagcacc 1140 tacacagagc agttagcttc agctacatca gccataacta acaaagctat agccgcaaag 1200 aacgtcgttg cctcaaagct aggttacacc ggagagaatg gcggcgggca aagcgagagc 1260 cctgtaaaag atgaaactcc gagatctgtt actgcttacg ggcagaaagt ggcgggaact 1320 gttgctgaga agttgactcc ggtttacgaa aaagtcaaag aaacaggatc aacggtgatg 1380 acaaagctac ctctctccgg aggtggaagt ggagtgaagg agacgcaaca aggggaagag 1440 aaaggtgtga cggctaaaaa ttatatatca gagaagctga aacctggaga agaggacaaa 1500 gctttatcgg aaatgatagc tgagaaactt cattttggag gaggaggaga gaagaagaca 1560 acggctacaa aggaggtgga agtgacggtt gagaagatac cttccgacca gatagcggag 1620 gggaaaggac atggtgaggc ggttgcagag gaaggaaaag gtggagaagg aatggtgggg 1680 aaagttaaag gagcggtcac ttcttggctc ggtggtaaac cgaagtcgcc acggtccgtt 1740 gaagagtctc cacaatcact tggcaccacc gttgggacta tggggttttc ggattccggt 1800 <210> 140 <211> 618 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 140 Met Glu Ser Gln Leu Thr Arg Pro Tyr Gly His Glu Gln Ala Glu Glu 1 5 10 15 Pro Ile Arg Ile His His Pro Glu Glu Glu His His Glu Lys Gly Ala 20 25 30 Ser Lys Val Leu Lys Lys Val Lys Glu Lys Ala Lys Lys Ile Lys Asn 35 40 45 Ser Leu Thr Lys His Gly Asn Gly His Asp His Asp Val Glu Asp Asp 50 55 60 Asp Asp Glu Tyr Asp Glu Gln Asp Pro Glu Val His Gly Ala Pro Val 65 70 75 80 Tyr Glu Ser Ser Ala Val Arg Gly Gly Val Thr Gly Lys Pro Lys Ser 85 90 95 Leu Ser His Ala Gly Glu Thr Asn Val Pro Ala Ser Glu Glu Ile Val 100 105 110 Pro Pro Gly Thr Lys Val Phe Pro Val Val Ser Ser Asp His Thr Lys 115 120 125 Pro Ile Glu Pro Val Ser Leu Gln Asp Thr Ser Tyr Gly His Glu Ala 130 135 140 Leu Ala Asp Pro Val Arg Thr Thr Glu Thr Ser Asp Trp Glu Ala Lys 145 150 155 160 Arg Glu Ala Pro Thr His Tyr Pro Leu Gly Val Ser Glu Phe Ser Asp 165 170 175 Arg Gly Glu Ser Arg Glu Ala His Gln Glu Pro Leu Asn Thr Pro Val 180 185 190 Ser Leu Leu Ser Ala Thr Glu Asp Val Thr Arg Thr Phe Ala Pro Gly 195 200 205 Gly Glu Asp Asp Tyr Leu Gly Gly Gln Arg Lys Val Asn Val Glu Thr 210 215 220 Pro Lys Arg Leu Glu Glu Asp Pro Ala Ala Pro Gly Gly Gly Ser Asp 225 230 235 240 Tyr Leu Ser Gly Val Ser Asn Tyr Gln Ser Lys Val Thr Asp Pro Thr 245 250 255 His Lys Gly Gly Glu Ala Gly Val Pro Glu Ile Ala Glu Ser Leu Gly 260 265 270 Arg Met Lys Val Thr Asp Glu Ser Pro Asp Gln Lys Ser Arg Gln Gly 275 280 285 Arg Glu Glu Asp Phe Pro Thr Arg Ser His Glu Phe Asp Leu Lys Lys 290 295 300 Glu Ser Asp Ile Asn Lys Asn Ser Pro Ala Arg Phe Gly Gly Glu Ser 305 310 315 320 Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp Phe Pro Thr Arg Gly Asp Val Lys Val 325 330 335 Glu Ser Gly Leu Gly Arg Asp Leu Pro Thr Gly Thr His Asp Gln Phe 340 345 350 Ser Pro Glu Leu Ser Arg Pro Lys Glu Arg Asp Asp Ser Glu Glu Thr 355 360 365 Lys Asp Glu Ser Thr His Glu Thr Lys Pro Ser Thr Tyr Thr Glu Gln 370 375 380 Leu Ala Ser Ala Thr Ser Ala Ile Thr Asn Lys Ala Ile Ala Ala Lys 385 390 395 400 Asn Val Val Ala Ser Lys Leu Gly Tyr Thr Gly Glu Asn Gly Gly Gly 405 410 415 Gln Ser Glu Ser Pro Val Lys Asp Glu Thr Pro Arg Ser Val Thr Ala 420 425 430 Tyr Gly Gln Lys Val Ala Gly Thr Val Ala Glu Lys Leu Thr Pro Val 435 440 445 Tyr Glu Lys Val Lys Glu Thr Gly Ser Thr Val Met Thr Lys Leu Pro 450 455 460 Leu Ser Gly Gly Gly Ser Gly Val Lys Glu Thr Gln Gln Gly Glu Glu 465 470 475 480 Lys Gly Val Thr Ala Lys Asn Tyr Ile Ser Glu Lys Leu Lys Pro Gly 485 490 495 Glu Glu Asp Lys Ala Leu Ser Glu Met Ile Ala Glu Lys Leu His Phe 500 505 510 Gly Gly Gly Gly Glu Lys Lys Thr Thr Ala Thr Lys Glu Val Glu Val 515 520 525 Thr Val Glu Lys Ile Pro Ser Asp Gln Ile Ala Glu Gly Lys Gly His 530 535 540 Gly Glu Ala Val Ala Glu Glu Gly Lys Gly Gly Glu Gly Met Val Gly 545 550 555 560 Lys Val Lys Gly Ala Val Thr Ser Trp Leu Gly Gly Lys Pro Lys Ser 565 570 575 Pro Arg Ser Val Glu Glu Ser Pro Gln Ser Leu Gly Thr Thr Val Gly 580 585 590 Thr Met Gly Phe Ser Asp Ser Gly Gly Ser Glu Leu Gly Gly Ser Gly 595 600 605 Gly Gly Lys Gly Val Gln Asp Ser Gly Asn 610 615 <210> 141 <211> 844 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 141 cgcgccgcaa gaatctcaaa cacggagatc tcaaagtttg aaagaaaatt tatttcttcg 60 actcaaaaca aacttacgaa atttaggtag aacttatata cattatattg taattttttg 120 taacaaaatg tttttattat tattatagaa ttttactggt taaattaaaa atgaatagaa 180 aaggtgaatt aagaggagag aggaggtaaa cattttcttc tattttttca tattttcagg 240 ataaattatt gtaaaagttt acaagatttc catttgacta gtgtaaatga ggaatattct 300 ctagtaagat cattatttca tctacttctt ttatcttcta ccagtagagg aataaacaat 360 atttagctcc tttgtaaata caaattaatt ttcgttcttg acatcattca attttaattt 420 tacgtataaa ataaaagatc atacctatta gaacgattaa ggagaaatac aattcgaatg 480 agaaggatgt gccgcttgtt ataataaaca gccacacgac gtaaacgtaa aatgaccaca 540 tgatgggcca atagacatgg accgactact aataatagta agttacattt taggatggaa 600 taaatatcat accgacatca gtttgaaaga aaagggaaaa aaagaaaaaa taaataaaag 660 atatactacc gacatgagtt ccaaaaagca aaaaaaaaga tcaagccgac acagacacgc 720 gtagagagca aaatgacttt gacgtcacac cacgaaaaca gacgcttcat acgtgtccct 780 ttatctctct cagtctctct ataaacttag tgagaccctc ctctgtttta ctcacaaatt 840 taat 844 <210> 142 <211> 710 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 142 Met Asp Gln Thr Glu Glu Pro Pro Leu Asn Thr His Gln Gln His Pro 1 5 10 15 Glu Glu Val Glu His His Glu Asn Gly Ala Thr Lys Met Phe Arg Lys 20 25 30 Val Lys Ala Arg Ala Lys Lys Phe Lys Asn Ser Leu Thr Lys His Gly 35 40 45 Gln Ser Asn Glu His Glu Gln Asp His Asp Leu Val Glu Glu Asp Asp 50 55 60 Asp Asp Asp Glu Leu Glu Pro Glu Val Ile Asp Ala Pro Gly Val Thr 65 70 75 80 Gly Lys Pro Arg Glu Thr Asn Val Pro Ala Ser Glu Glu Ile Ile Pro 85 90 95 Pro Gly Thr Lys Val Phe Pro Val Val Ser Ser Asp Tyr Thr Lys Pro 100 105 110 Thr Glu Ser Val Pro Val Gln Glu Ala Ser Tyr Gly His Asp Ala Pro 115 120 125 Ala His Ser Val Arg Thr Thr Phe Thr Ser Asp Lys Glu Glu Lys Arg 130 135 140 Asp Val Pro Ile His His Pro Leu Ser Glu Leu Ser Asp Arg Glu Glu 145 150 155 160 Ser Arg Glu Thr His His Glu Ser Leu Asn Thr Pro Val Ser Leu Leu 165 170 175 Ser Gly Thr Glu Asp Val Thr Ser Thr Phe Ala Pro Ser Gly Asp Asp 180 185 190 Glu Tyr Leu Asp Gly Gln Arg Lys Val Asn Val Glu Thr Pro Ile Thr 195 200 205 Leu Glu Glu Glu Ser Ala Val Ser Asp Tyr Leu Ser Gly Val Ser Asn 210 215 220 Tyr Gln Ser Lys Val Thr Asp Pro Thr Lys Glu Glu Thr Gly Gly Val 225 230 235 240 Pro Glu Ile Ala Glu Ser Phe Gly Asn Met Glu Val Thr Asp Glu Ser 245 250 255 Pro Asp Gln Lys Pro Gly Gln Phe Glu Arg Asp Leu Ser Thr Arg Ser 260 265 270 Lys Glu Phe Lys Glu Phe Asp Gln Asp Phe Asp Ser Val Leu Gly Lys 275 280 285 Asp Ser Pro Ala Lys Phe Pro Gly Glu Ser Gly Val Val Phe Pro Val 290 295 300 Gly Phe Gly Asp Glu Ser Gly Ala Glu Leu Glu Lys Asp Phe Pro Thr 305 310 315 320 Arg Ser His Asp Phe Asp Met Lys Thr Glu Thr Gly Met Asp Thr Asn 325 330 335 Ser Pro Ser Arg Ser His Glu Phe Asp Leu Lys Thr Glu Ser Gly Asn 340 345 350 Asp Lys Asn Ser Pro Met Gly Phe Gly Ser Glu Ser Gly Ala Glu Leu 355 360 365 Glu Lys Glu Phe Asp Gln Lys Asn Asp Ser Gly Arg Asn Glu Tyr Ser 370 375 380 Pro Glu Ser Asp Gly Gly Leu Gly Ala Pro Leu Gly Gly Asn Phe Pro 385 390 395 400 Val Arg Ser His Glu Leu Asp Leu Lys Asn Glu Ser Asp Ile Asp Lys 405 410 415 Asp Val Pro Thr Gly Phe Asp Gly Glu Pro Asp Phe Leu Ala Lys Gly 420 425 430 Arg Pro Gly Tyr Gly Glu Ala Ser Glu Glu Asp Lys Phe Pro Ala Arg 435 440 445 Ser Asp Asp Val Glu Val Glu Thr Glu Leu Gly Arg Asp Pro Lys Thr 450 455 460 Glu Thr Leu Asp Gln Phe Ser Pro Glu Leu Ser His Pro Lys Glu Arg 465 470 475 480 Asp Glu Phe Lys Glu Ser Arg Asp Asp Phe Glu Glu Thr Arg Asp Glu 485 490 495 Lys Thr Glu Glu Pro Lys Gln Ser Thr Tyr Thr Glu Lys Phe Ala Ser 500 505 510 Met Leu Gly Tyr Ser Gly Glu Ile Pro Val Gly Asp Gln Thr Gln Val 515 520 525 Ala Gly Thr Val Asp Glu Lys Leu Thr Pro Val Asn Glu Lys Asp Gln 530 535 540 Glu Thr Glu Ser Ala Val Thr Thr Lys Leu Pro Ile Ser Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Val Glu Glu Gln Arg Gly Glu Asp Lys Ser Val Ser Gly Arg 565 570 575 Asp Tyr Val Ala Glu Lys Leu Thr Thr Glu Glu Glu Asp Lys Ala Phe 580 585 590 Ser Asp Met Val Ala Glu Lys Leu Gln Ile Gly Gly Glu Glu Glu Lys 595 600 605 Lys Glu Thr Thr Thr Lys Glu Val Glu Lys Ile Ser Thr Glu Lys Ala 610 615 620 Ala Ser Glu Glu Gly Glu Ala Val Glu Glu Glu Val Lys Gly Gly Gly 625 630 635 640 Gly Met Val Gly Arg Ile Lys Gly Trp Phe Gly Gly Gly Ala Thr Asp 645 650 655 Glu Val Lys Pro Glu Ser Pro His Ser Val Glu Glu Ala Pro Lys Ser 660 665 670 Ser Gly Trp Phe Gly Gly Gly Ala Thr Glu Glu Val Lys Pro Lys Ser 675 680 685 Pro His Ser Val Glu Glu Ser Pro Gln Ser Leu Gly Ser Thr Val Val 690 695 700 Pro Val Gln Lys Glu Leu 705 710 <210> 143 <211> 3533 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 143 gatctcaaag tttgaaagaa aatttatttc ttcgactcaa aacaaactta cgaaatttag 60 gtagaactta tatacattat attgtaattt tttgtaacaa aatgttttta ttattattat 120 agaattttac tggttaaatt aaaaatgaat agaaaaggtg aattaagagg agagaggagg 180 taaacatttt cttctatttt ttcatatttt caggataaat tattgtaaaa gtttacaaga 240 tttccatttg actagtgtaa atgaggaata ttctctagta agatcattat ttcatctact 300 tcttttatct tctaccagta gaggaataaa caatatttag ctcctttgta aatacaaatt 360 aattttcgtt cttgacatca ttcaatttta attttcgtat aaaataaaag atcataccta 420 ttagaacgat taaggagaaa tacaattcga atgagaagga tgtgccgttt gttataataa 480 acagccacac gacgtaaacg taaaatgacc acatgatggg ccaatagaca tggaccgact 540 actaataata gtaagttaca ttttaggatg gaataaatat cataccgaca tcagtttgaa 600 aagaaaaagg gaaaaaaaga aaaaataaat aaaagatata ctaccgacat gagttccaaa 660 aagcaaaaaa aaagatcaag ccgacacaga cacgcgtaga gagcaaaatg actttgacgt 720 cacaccacga aaacagacgc ttcatacgtg tccctttatc tctctcagtc tctctataaa 780 cttagtgaga ccctcctctg ttttactcac aaatatgcaa actagaaaac aatcatcagg 840 aataaagggt ttgattactt ctattggaaa gaaaaaaact ttggaaaatg gatcaaacag 900 aggaaccacc actcaacaca caccagcagc acccaggtag attctaattt cagaaactta 960 tatttttttt aagtgacaat cctctgaatt tacttaaact tattgtgatt tatggataca 1020 gaagaagttg aacatcatga gaatggtgcg actaagatgt ttaggaaagt aaaggctaga 1080 gctaagaagt tcaagaacag tctcactaaa catggacaaa gcaatgagca tgagcaagat 1140 catgatttgg ttgaagaaga tgatgatgat gacgagctag aacctgaagt gatcgatgca 1200 ccaggttact ttcttttgta gtttcattca acttatgatc taaaaactat tggttattca 1260 attttgcgtg acattaacgg tttggtatct gtatatgcag cgtaacaggt aaacctagag 1320 aaactaatgt tccagcatcg gaggaaatta ttccaccagg gacaaaggtg tttcctgtcg 1380 tgtcttccga ttacaccaaa cccactgaat ctgtaccagt acaagaggcc tcttacggac 1440 acgatgcacc ggctcattct gtaaggacga cgtttacatc ggacaaggaa gagaaaagag 1500 atgtaccgat tcatcatcct ctgtccgaat tgtcagacag agaagagagt agagagactc 1560 atcatgagtc attgaacact ccggtctctc tgctttctgg aacagaggat gtaacgagta 1620 cgtttgctcc aagtggtgat gatgaatatc ttgatggtca acggaaggtc aacgtcgaga 1680 ccccgataac gttggaggaa gagtcggctg tttcagacta tcttagtggt gtatctaatt 1740 atcagtccaa agttactgat cccaccaaag aaggtaagaa ctttgacctt ttaagattgt 1800 gtttttcttt agtgattatg aatatgtaat aactctgtta cgttgtgttt ggtttagaaa 1860 ctggaggagt accggagatt gctgagtctt ttggtaatat ggaagtgact gatgagtctc 1920 ctgatcagaa gccaggacaa tttgaaagag acttgtcgac gagaagcaaa gaattcaaag 1980 agtttgatca ggactttgac tctgttctcg gtaaggattc gccggcgaaa tttccaggtg 2040 aatcaggagt tgttttcccg gtgggctttg gtgacgagtc aggagctgag ctggaaaaag 2100 attttccgac gagaagtcat gattttgata tgaagactga aactggaatg gacacgaatt 2160 ctccatcaag aagccatgaa tttgatctga agactgaatc tggaaacgac aagaattctc 2220 cgatgggctt tggtagtgaa tcaggagctg agctggaaaa agaatttgat cagaagaacg 2280 attctggaag aaacgagtat tcgccggaat ctgacggcgg tttaggagct ccgttgggag 2340 gaaattttcc ggtgagaagt catgagttgg atctgaagaa cgaatctgat atcgacaagg 2400 atgtgccgac gggatttgac ggagaaccag attttctggc gaagggaaga cctggatacg 2460 gtgaggcatc agaagaggat aaatttccgg cgagaagtga tgatgtggaa gtagagactg 2520 agctgggaag agacccaaag acggagactc ttgatcaatt ctcaccggaa ctttctcatc 2580 ctaaagaaag agatgagttt aaggagtcca gagatgattt tgaggagacg agagatgaga 2640 aaacagagga gccaaaacag agcacttaca cagagaagtt tgcttcaatg ctaggttact 2700 ccggagaaat tccggtggga gatcaaactc aagtggcggg aactgttgat gagaggttga 2760 ctccggtcaa tgagaaggat caagaaacag agtctgccgt gacgacgaag ttacctatct 2820 ccggaggtgg aagtggagta gaggagcaac gaggggaaga taaaagtgtg tcgggtagag 2880 attatgtggc ggagaaactg acaactgaag aagaagacaa agccttttct gatatggttg 2940 ccgagaaact tcagattgga ggagaagaag agaagaagga aacgacgaca aaggaagtgg 3000 agaagatctc taccgagaag gcagcatcgg aggagggtga ggcggtggaa gaggaagtga 3060 aaggaggagg aggaatggtt gggaggatta aaggatggtt cggtggtggt gcgactgatg 3120 aggtgaagcc agaatcgcca cattctgttg aagaggctcc aaaatcatct ggctggtttg 3180 gtggtggtgc gacggaggag gtgaagccaa aatcgcctca ttccgttgaa gagtctccac 3240 aatcacttgg ctccactgtt gttccggtgc agaaggagct ttaagaatat gagaactgag 3300 attttcaagt ttcactttgg atgtttatgt gtgttttgtt tgacgtcttt gatgtattat 3360 ggtataattc cttgtttgtg tgaaaaaagg acatttggtt aataaattgt tcggctttgg 3420 attaagaagt tcctccatac cagctactag gtctaaagtg ggtaaaatca ttggatttat 3480 tcccttcaaa gttcttagaa ttattcacag gatttacatt atgagctagt agt 3533 <210> 144 <211> 249 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 144 atgtcgtgct gcggaggaaa ctgcggctgc ggatccggct gccagtgcgg cagcggctgc 60 ggaggatgca agatgtaccc ggagatggct gaggaggtga ccactaccca gactgtcatc 120 atgggtgttg caccttccaa gggtcatgcc gaggggttgg aggccggcgc cgccgccgga 180 gcaggagcag agaacgggtg caagtgcggc gacaactgca cctgcaaccc ctgcaactgc 240 ggcaagtga 249

Claims

i) 가뭄, 저온 반응성 및/또는 ABA 조절된 유전자의 프로모터 서열 ("cor78 프로모터")을 포함하는 제1 핵산 서열, 및

이에 작동가능하게 연결된

ii) 도 5에 정의된 메탈로티오네인 1 (MET1)을 코딩하는 식물 유전자 또는 그의 기능적 동등물 또는 상동체 ("MET1 유전자")의 제1 인트론을 포함하는 제2 핵산 서열

을 포함하는 식물 전사 조절 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
제1항에 있어서, cor78 프로모터 서열과 상기 인트론의 제1 뉴클레오티드 사이에 위치하는 0 bp 내지 100 bp의 링커 서열을 포함하는 핵산 분자.
제1항 또는 2항에 있어서, cor78 프로모터 서열과 상기 인트론의 제1 뉴클레오티드 사이에 위치하는 5'UTR을 포함하는 핵산 분자.
제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MET1의 제1 인트론이 전사 조절 뉴클레오티드 서열의 제어 하에 전사된 뉴클레오티드 서열의 인트론의 서열 내에 위치하는 것인 핵산 분자.
제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 인트론이 외떡잎 식물로부터의 MET1로부터 유래하는 것인 핵산 분자.
제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, cor78 프로모터가 쌍떡잎 식물로부터 유래하는 것인 핵산 분자.
제1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서,

i) a) 서열 1의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열;

b) 서열 1의 폴리뉴클레오티드의 적어도 50개의 연속적 염기, 바람직하게는 적어도 100개의 연속적 염기, 보다 바람직하게는 200개의 연속적 염기의 단편을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열;

c) 2xSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 1에 정의된 폴리뉴클레오티드의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열; 및

d) 항목 a) 내지 c) 하에 언급된 임의의 뉴클레오티드 서열의 상보체 또는 역상보체인 폴리뉴클레오티드 서열

로 이루어지는 군 중에서 선택되는 제1 핵산 서열, 및

ii) a) 서열 3의 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열;

b) 서열 3의 폴리뉴클레오티드의 적어도 50개의 연속적 염기, 바람직하게는 적어도 100개의 연속적 염기, 보다 바람직하게는 200개의 연속적 염기의 단편을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열; 및

c) 2xSSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 세척하면서 7% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA 내에서의 50℃에서의 혼성화와 동등한 조건 하에 서열 3에 제시된 서열의 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열; 및

d) 항목 a) 내지 c) 하에 언급된 임의의 뉴클레오티드 서열의 상보체 또는 역상보체인 폴리뉴클레오티드 서열

로 이루어지는 군 중에서 선택되는 제2 핵산 서열

을 포함하며, 상기 제1 및 상기 제2 핵산 서열이 서로 작동가능하게 연결되고 이종성인 식물 전사 조절 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 서열이 서열 10, 12, 14, 17, 20, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 53, 55, 57, 59, 63, 66, 68, 70, 72, 74, 77, 79, 82, 84, 86, 88, 90, 94, 96, 98, 102, 104, 108, 112, 114, 117, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 137, 및 138에 정의된 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 코어 프로모터 모티프를 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 서열이 서열 9, 11, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 60, 61, 62, 64, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 80, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 95, 97, 99, 100, 101, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 118, 119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 133, 134, 135, 및 136에 정의된 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 프로모터 모티프를 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 서열이 서열 1에 정의된 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 핵산 서열이 서열 3에 정의된 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 조절 서열이 식물 또는 식물 세포에서 조절 또는 단백질 코딩 RNA 분자의 발현을 제시하는 핵산 서열 또는 유전자에 작동가능하게 연결되는 것인 핵산 분자.
제11항에 있어서, 식물 또는 식물 세포가 외떡잎 식물인 핵산 분자.
제1항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 조직-특이적 발현을 조절하는 핵산 분자.
제13항에 있어서, 전사 조절 서열이 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 배-특이적 발현을 조절하는 것인 핵산 분자.
제13항에 있어서, 전사 조절 서열이 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 배반-특이적 발현을 조절하는 것인 핵산 분자.
제1항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 조절 서열이 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 스트레스-유도가능 발현을 조절하는 것인 핵산 분자.
제1항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 조절 서열이 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 가뭄-유도가능 발현을 조절하는 것인 핵산 분자.
제1항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 작동가능하게 연결된 핵산 서열이 안티센스 RNA, 센스 RNA, dsRNA, 마이크로RNA, ta-siRNA, snRNA, RNAi, 또는 이들의 조합물의 발현을 제시하거나 이들을 코딩하는 것인 핵산 분자.
i) 제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 및 ii) 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트.
제19항에 있어서, 상기 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사가 표적 식물 내에서 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현 또는 적어도 하나의 유전자의 기능을 부여할 수 있는 리보뉴클레오티드 서열의 발현을 일으키는 것인 발현 카세트.
제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제19항 또는 20항에 따른 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터.
제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제19항 또는 20항에 따른 발현 카세트 또는 제21항에 따른 발현 벡터를 포함하는 식물 또는 식물 세포.
제22항에 있어서, 식물 또는 식물 세포가 외떡잎 식물 또는 식물 세포인 식물 또는 식물 세포.
제22항 또는 23항에 있어서, 식물이 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 호밀, 사탕수수, 호밀풀, 및 율무 식물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 식물 또는 식물 세포.
제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제19항 또는 20항에 따른 발현 카세트 또는 제21항에 따른 발현 벡터를 포함하는, 제22항 내지 24항 중 어느 한 항에 따른 식물에 의해 생산된 식물 종자.
A) 제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를, 제1항 내지 18항 중 어느 한 항에서 특성화된 상기 제1 또는 상기 제2 핵산 서열에 대하여 이종성이고 식물 또는 식물 세포로부터 표적 서열의 절제를 제공할 수 있는 적어도 하나의 핵산 분자에 작동가능하게 연결함으로써 발현 카세트를 구성하는 단계,

B) 상기 발현 카세트를, 이종성인 핵산 분자의 발현 산물에 의해 절제가능한 적어도 하나의 표적 서열을 포함하는 식물 세포 또는 식물 내로 직접적으로 또는 간접적으로 안정하게 또는 일시적으로 도입하며, 여기서 상기 식물 세포 또는 식물은 이종성인 상기 핵산 서열을 발현하는 것인 단계, 및

C) 상기 표적 서열의 절제를 나타내는 트랜스제닉 식물을 선택하는 단계

를 포함하는, 상기 식물로부터 표적 서열을 절제하는 방법.
제26항에 있어서, 제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 상기 핵산 분자에 이종성이고 이에 작동가능하게 연결된 상기 핵산 분자가 부위 특이적 재조합효소의 발현을 제시하는 핵산 분자인 방법.
제27항에 있어서, 제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자에 이종성이고 이에 작동가능하게 연결된 상기 핵산 분자가 표적 서열에 특이적인 DNA 이중가닥 파단을 유도할 수 있는 부위 특이적 엔도뉴클레아제의 발현을 제시하는 핵산 분자이고, 결실시킬 표적 서열이, 그들 사이에 상동성 재조합을 허용하도록 하는 배향, 충분한 길이 및 서로에 대한 상동성을 갖는 서열에 의해 플랭킹되어 있는 것인 방법.
A) 식물 내로 제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제19항 또는 20항에 따른 발현 카세트 또는 제19항에 따른 발현 벡터를 도입하며, 여기서 핵산 분자는, 그 서열이 상기 제1 또는 상기 제2 핵산 서열에 대하여 이종성이고 식물에 증가된 수확량, 및/또는 증가된 스트레스 내성, 증가된 영양적 품질, 및/또는 증가된 또는 변형된 오일 함량을 부여할 수 있는 적어도 하나의 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 것인 단계; 및

B) 트랜스제닉 식물을 선택하는 단계

를 포함하며, 여기서 식물은 야생형 또는 무효 분리개체 식물에 비해 증가된 수확량 및/또는 스트레스 조건 하에 증가된 스트레스 내성, 및/또는 식물의 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질 및/또는 증가된 또는 변형된 오일 함량을 갖는 것인,

증가된 수확량, 및/또는 증가된 스트레스 내성, 및/또는 식물의 종자 또는 새싹의 증가된 영양적 품질, 및/또는 증가된 또는 변형된 오일 함량을 갖는 식물을 생산하기 위한 방법.
목적하는 유전자를 배 조직 또는 세포에서 우선적으로 또는 특이적으로 발현하기 위한, 제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자의 용도.
스트레스 조건 하에 식물에서 핵산 분자의 전사를 증가시키기 위한, 제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자의 용도.