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KR20090011557A - 미세유로형 센서 복합 구조물 - Google Patents

미세유로형 센서 복합 구조물 Download PDF

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KR20090011557A
KR20090011557A KR1020070075254A KR20070075254A KR20090011557A KR 20090011557 A KR20090011557 A KR 20090011557A KR 1020070075254 A KR1020070075254 A KR 1020070075254A KR 20070075254 A KR20070075254 A KR 20070075254A KR 20090011557 A KR20090011557 A KR 20090011557A
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김영훈
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남학현
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주식회사 아이센스
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Abstract

본 발명은 미세유로형 센서 복합 구조물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 기준 전극, 작동 전극 및 전극연결부가 구비되어 있는 하부기판과; 시료도입부와 상기 시료도입부로부터 T형으로 갈라지도록 설계되고 기준 전극 및 작동 전극이 노출되는 검출부에 연결되되 각각 선택적으로 효소접합체 저장소 또는 기질 저장소가 배치되어 있는 2개의 미세유로, 시료 용액에 의해 용해된 기질 용액이 상기 검출부에 시간적으로 후에 도달되도록 상기 기질 저장소가 배치되어 있는 미세유로 상에 부가되는 통기부 및 공기배출구를 구비한 혼합부, 상기 검출부를 통과한 유체가 흡수되는 흡수부, 상기 흡수부 말단에 통기부가 구비되고 상기 하부기판 위에 적층되는 중간기판과; 상기 중간기판에 형성된 미세유로에 모세관 현상을 유도하도록 적층되는 상부기판을 포함하여 구비되는 미세유로형 센서 복합 구조물에 관한 것이다. 본 발명의 미세유로형 센서 복합 구조물은 한 번의 시료주입으로 면역반응, 세척, 전기화학 측정까지 가능하기 때문에 측정 시간이 짧고 간편하며 우수한 민감도 및 선택성을 가지며, 간단한 방법으로 제작이 가능하여 대량생산에 용이하고, 소형측정기로 측정이 가능하여 현장 측정용 센서로 이용될 수 있다.
미세유로형 센서, 랩온어칩, 전기화학 효소 면역 분석, 바이오 센서

Description

미세유로형 센서 복합 구조물{Microfluidic sensor complex structures}
본 발명은 한번의 시료 주입으로 미세유로 내에서 면역반응, 세척, 측정이 가능한 미세유로형 센서 복합형 구조물에 관한 것이다.
최근 과학기술의 발달과 더불어 삶의 질에 대한 관심이 증대되면서 인간의 생활에 있어서 질병 진단 및 예방, 식품과 환경의 중요성은 날로 확대되고 있다. 그 결과, 인간의 질병을 진단하거나 식품화학과 공업화학 분야에서 특정 공정을 위하여 또는 환경 분야에서 오염물질을 분석하기 위하여 시료 중의 유기물 또는 무기물 농도 측정에 대한 필요성이 증대되고 있으며 이를 위한 많은 노력이 이루어지고 있다. 그 중 임상실험, 식품의 신선도 및 오염도 측정, 생물공정 제어, 환경 모니터링 등 여러 분야에서 기존의 전통적인 시험 방법의 대안의 하나로서 여러 성분에 대해 연속적이며 신속한 시험을 가능케 하는 바이오센서의 개발에 상당한 관심이 집중되고 있다.
바이오센서는 효소, 미생물, 항체, 리셉터(receptor), DNA 프로브(DNA probe) 등의 생체물질을 전기적, 물리화학적 소자(transducer)에 결합시키고 측정 분석물질과의 반응으로부터 발생되는 전극활성물질이나 물리적인 변화를 전기화학식(electrochemical), 광학식(optical), 열식(thermal), 압전식(piezoelectric)으로 신호를 감지하여 농도를 측정하는 장치를 말한다. 그 중 항체를 이용한 면역센서는 항원과 항체의 특이적 인식으로 인하여 높은 선택성과 낮은 검출한계를 가지기 때문에 의료용 진단센서로 큰 관심을 받고 있다.
면역센서는 주로 고체상 샌드위치 효소면역분석법을 이용하여 측정된다. 고체상 샌드위치 효소면역분석법은 고정된 항체에 항원이 결합되고 이후 항원의 다른 면역결합 부위에 2차 항체-효소접합체가 결합되는데, 반응이 특이적으로 일어나므로 다른 효소면역분석법보다 더 뛰어난 민감성을 보인다. 즉 고체상 경쟁 효소면역분석법의 경우 반응이 일어나는 매트릭스 내에서 다른 물질의 입체장애에 의한 방해 작용이 생길 수 있어 신호를 방해할 수 있지만 샌드위치 효소면역분석법의 경우 면역결합이 일어나는 부위에만 면역반응이 일어나기 때문에 매트릭스 내에서 다른 물질에 의한 방해 작용을 덜 받게 되므로 신호에 영향이 없어 특이적인 반응이라 할 수 있다. 주어진 시료 및 표준물질 내의 분자량이 큰 단백질 분석물질인 병원균, 바이러스, 세포 등은 고정된 항체에 결합되고, 세척 후 2차 항체-효소접합체가 결합하게 된다. 따라서 고체상에 남는 표지효소의 양은 분석물질의 양에 비례하게 된다. 그 후 결합하지 않은 2차 항체-효소접합체를 세척하여 제거한 뒤 고체상에 면역결합으로 남아 있는 표지효소의 양을 기질과의 반응속도 측정으로 알 수 있다. 샌드위치 효소면역분석법은 특히 단백질 분석물질을 정량할 때 더 좋은 특이성과 민감성을 보이기 때문에 임상적으로 중요한 혈액단백질을 분석하는데 일반적으로 사용되고 있다.
랩온어칩(Lab-on-a-chip)은 반도체 제작에 사용되는 식각기술을 이용하여 유리, 실리콘 또는 플라스틱으로 된 수 ㎠ 크기의 칩 위에 분석에 필요한 여러 가지 장치들을 마이크로 머시닝(micro machining) 기술을 이용하여 집적시킨 화학 마이크로프로세서로 고속, 고효율, 저비용의 자동화된 분석이 가능하다. 이 기술은 최근 급속히 성장하는 제약산업 분야에서 신약탐색에 필요한 비용과 시간을 줄일 수 있는 중요한 기술로 부상하고 있다. 뿐만 아니라 의료 진단장비, 가정이나 병상에서의 건강 검진기기, 화학이나 생물공정 모니터링, 휴대 가능한 환경오염물질 분석기기, 화생방용 무인 화학/생물 작용제 탐지/식별 장치 등의 다양한 분야에 응용될 수 있는 핵심기반 기술이다. 랩온어칩 기술은 1990년 초에 해리슨(Harrison) 등이 개발한 모세관 전기영동을 이용한 방법에 기초를 두고 있다. 이들은 용액이 채워진 미세한 채널 양단에 전압을 걸어 용액의 흐름을 만드는 모세관 전기삼투현상을 이용하여 별도의 펌프나 밸브 없이 용액의 흐름을 제어할 수 있고 모세관 전기영동을 이용하여 분리분석을 할 수 있어 작은 실험실을 칩 위에 제작하는 것이 가능하다는 것을 보였다. 그러나 상기 재료들은 모세관을 미세하게 형성하기는 좋으나 대량생산에서 많은 문제점을 안고 있다. 대부분의 랩온어칩 응용이 일회용 생화학적 센서라는 점에서 상기 재료들은 재현성 있고 값싸게 생산하기에 곤란하다. 또한 상기 챔버들 사이에 유체를 이동시키기 위하여 미세 밸브 장치 등을 사용하고, 세정 과정이 필요하여 장치가 복잡한 문제가 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명자는 제조가 간편하고 휴대하기 용이하며 구조가 단순하여 저렴하게 대량생산 할 수 있는 바이오 센서를 개발하기 위하여 연구하던 중, 미세 유체를 이용하여 한번의 샘플 주입으로 면역반응, 세척 및 전기화학 측정이 가능한 미세유로형 센서 복합 구조물을 개발하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 미세유로형 센서 복합 구조물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
기준 전극, 작동 전극 및 전극연결부가 구비되어 있는 하부기판과;
시료도입부와 상기 시료도입부로부터 T형으로 갈라지도록 설계되고 기준 전극 및 작동 전극이 노출되는 검출부에 연결되되 각각 선택적으로 효소접합체 저장소 또는 기질 저장소가 배치되어 있는 2개의 미세유로, 시료 용액에 의해 용해된 기질 용액이 상기 검출부에 시간적으로 후에 도달되도록 상기 기질 저장소가 배치되어 있는 미세유로 상에 부가되는 통기부 및 공기배출구를 구비한 혼합부, 상기 검출부를 통과한 유체가 흡수되는 흡수부, 상기 흡수부 말단에 통기부가 구비되고 상기 하부기판 위에 적층되는 중간기판과;
상기 중간기판에 형성된 미세유로에 모세관 현상을 유도하도록 적층되는 상부기판을 포함하여 구비되는 미세유로형 센서 복합 구조물을 제공한다.
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 미세유로형 센서 복합 구조물은 별도의 조작 없이 모세관 현상만으로 시료가 이동하고, 한 번의 시료주입으로 면역반 응, 세척, 전기화학 측정까지 가능하기 때문에 측정 시간이 짧고 간편하며 우수한 민감도 및 선택성을 가진다. 또한 보편적으로 사용되는 유기 고분자를 사용하여 간단한 방법으로 제작이 가능하여 대량생산에 용이하고, 전기화학 검출법을 이용하기 때문에 소형측정기로 측정이 가능하여 현장 측정용 센서로 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물은
기준 전극, 작동 전극 및 전극연결부가 구비되어 있는 하부기판과;
시료도입부와 상기 시료도입부로부터 T형으로 갈라지도록 설계되고 기준 전극 및 작동 전극이 노출되는 검출부에 연결되되 각각 선택적으로 효소접합체 저장소 또는 기질 저장소가 배치되어 있는 2개의 미세유로, 시료 용액에 의해 용해된 기질 용액이 상기 검출부에 시간적으로 후에 도달되도록 상기 기질 저장소가 배치되어 있는 미세유로 상에 부가되는 통기부 및 공기배출구를 구비한 혼합부, 상기 검출부를 통과한 유체가 흡수되는 흡수부, 상기 흡수부 말단에 통기부가 구비되고 상기 하부기판 위에 적층되는 중간기판과;
상기 중간기판에 형성된 미세유로에 모세관 현상을 유도하도록 적층되는 상부기판을 포함하여 구비된다.
이때, 미세유로의 길이는 변형될 수 있으며 유로에 배치된 효소접합체 저장소와 기질 저장소의 위치, 크기 및 개수도 달라질 수 있다. 상기 작동 전극에는 항체 및 분자인지물질이 고정되고, 분석물질의 종류에 따라 시료도입부, 효소접합 체 저장소 및 기질 저장소에는 다른 제재들이 배치될 수 있다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물에 있어서, 상기 하부기판은 중간기판의 흡수부 말단에서의 시료 도달을 감지하는 유동성 감지 전극이 더 구비되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물에 있어서, 상기 유동성 감지 전극은 시료의 도달을 감지함으로써 기질 용액의 주입 시점을 알려주는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물에 있어서, 상기 하부기판은 검출 신호의 편차를 최소화할 수 있는 단수 또는 복수의 검정전극이 더 구비되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물에 있어서, 상기 검정전극은 바탕신호를 측정하는 검정전극(검정1전극)과 포화 또는 일부 포화된 효소접합체의 포화 신호를 측정하는 검정전극(검정2전극)인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물에 있어서, 상기 중간기판은 분석 물질만을 선별하여 시료 도입부에 공급할 수 있는 필터 패드부 및 필터 패드를 더 구비하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물에 있어서, 상기 필터 패드는 혈액의 혈청만을 선별하여 시료도입부에 공급하는 혈액 필터패드인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물에 있어서, 상기 작동 전극에 시료가 도달하는 순서는 시료 용액에 의해 용해된 효소접합체 용액이 도달하고, 일정시간 경과 후 기질 용액이 도달하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물에 있어서, 상기 작동 전극에는 시료 내의 분석물질과 면역반응을 유도할 수 있는 항체 또는 분자인지물질이 고정화되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물에 있어서, 상기 검출부는 항체 또는 분자인식물질과 시료 내의 분석물질간의 면역반응 후 효소접합체 및 기질 용액간의 효소-기질반응에 의해 발생되는 전기화학적 신호를 검출장치로 송신하여 분석물질의 정량적인 정보를 얻는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물에 있어서, 상기 흡수부는 모세 관 현상에 의해 시료의 흐름을 지속적으로 유지시킴으로써 검출부에서의 반응을 지속시키고, 미반응된 물질에 대한 세척효과를 높여 고감도의 검출 신호를 얻는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물에 있어서, 상기 상부기판은 미세유로형 센서 복합 구조물 전체에서 모세관 현상이 유지되도록 시료도입부와 통기부가 개방되도록 적층되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 미세유로형 센서 복합 구조물을 이용한 분석물질 농도의 고감도 및 정량적 측정 방법을 제공한다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 일실시 형태에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물의 분해사시도이고, 도 2는 이의 결합도 및 평면도이다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물은 전극부(작동 전극(101), 기준전극(102) 및 전극연결부(103))가 형성된 하부기판(100); 시료가 시료도입부(203)로부터 상기 전극을 지나 상기 흡수부(209)로 이르도록 구성된 미세유로를 포함하는 중간기판(200); 및 상부기판(또는 커버)(300)이 적층된 구조로 이루어진다.
상기 하부기판(100)은 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리에틸렌 텔레프탈레이 트(poly-ethylene terephthalate;PET), 폴리카보네이트(polycarbonate) 등의 유기 고분자 재료를 사용하며, 그 위의 전극부는 스크린 인쇄법 또는 물리적/화학적 증기 증착법을 이용하여 전극형성물질을 하부기판 위에 형성시킴으로써 이루어진다.
다음으로, 미세유로를 포함하는 중간기판(200)은 상기 하부기판(100) 재료에 프레스를 이용한 성형을 통해 형성시킬 수 있으며, 상기 유기 고분자 재료로 만들어진 양면테이프에 프레스 금형을 이용하여 형성할 수도 있고, 바람직하게는 감광제(dry photoresist) 필름을 사용하고 식각법을 이용하여 도안에 따라 미세유로를 형성시킬 수 있다. 일례로, 감광제 필름을 사용 시 상기 감광제 필름을 하부기판(100)과 70 ℃의 열로 압착시킨 후 미세유로가 도안된 포토마스크(photopmask) 필름을 올려 노광하고, 에칭(etching)용액으로 노광된 부분을 제거하면 하부기판(100)과 미세유로가 형성된 중간기판(200)이 적층되어 완성된다(도 9 참조).
상부기판(300)은 모세관 현상을 유도할 수 있는 유로를 형성할 수 있도록 중간기판 위에 적층하는 커버이다. 상기 상부기판(300)은 투명하거나 불투명할 수 있으며, 유로를 형성하는 방법에 따라 그 종류는 달라질 수 있다. 예를 들면 감광제 필름을 사용하여 중간기판(200)을 제작할 경우, 상부기판(300)은 중간기판(200)과 적층될 면이 점착제로 처리된 유기 고분자 재료를 사용할 수 있다.
모세관 현상을 유도할 수 있도록 시료가 주입되는 시료도입부(203) 및 흡수부(209)의 유로의 말단은 통기부(210)를 형성시키고 상기 통기부(210)를 제외한 부분은 상부기판을 적층시킨다.
도 3은 상기 도 1의 미세유로형 센서 복합 구조물에서 상부기판(300)을 제외하고 하부기판(100)과 중간기판(200)이 적층된 평면도이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 미세유로가 형성되어 있는 중간기판(200)에는 시료가 도입되는 시료도입부(203)부터 반응에 필요한 효소접합체 저장소(204) 및 기질 저장소(205), 공기배출구(207), 검출부(208) 및 시료의 흐름을 유지시켜 반응 및 세척효과를 지속시키는 흡수부(209)가 포함된다. 시료도입부(203) 이후의 유로는 두 개의 유로로 갈라지며 갈라진 유로 상에 각각 효소접합체 저장소(204)와 상기 효소접합체에 반응하는 기질이 저장되어 있는 기질 저장소(205)가 위치한다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물에서 시료 내의 분석 물질의 반응 경로를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 시료도입부를 통해 주입된 시료는 모세관 현상으로 두 개의 유로로 동시에 이송된다. 상기 시료는 효소접합체 저장소(204)가 포함되어 있는 유로와 상기 효소접합체에 반응하는 기질이 저장되어 있는 기질 저장소(205) 유로로 시료가 동시에 이송되어 효소접합체 저장소(204)에 도포되어 있는 효소접합체 및 기질 저장소(205)에 도포되어 있는 기질을 용해시키며 유로를 따라 계속 이송된다. 이때 효소접합체 저장소에서 용해된 효소접합체는 시료 내 분석물질의 특정부위와 결합한다. 그러나 전극이 형성되어 있는 검출부(208) 접점입구에서 두 개의 유로를 따라 이송되던 시료의 흐름은 달라진다. 효소접합체와 결합된 분석물질을 포함하는 시료는 검출부(208)에 포함되어 있는 전극으로 이동되는 반 면, 기질을 용해시키며 흐르던 시료는 검출부와 가까운 위치에 있는 효소접합체 저장소 유로에 의해 이송된 시료로 공기배출이 막혀 모세관 현상을 유지할 수 없게 된다. 이때, 전극 중 항체 또는 분자인지물질이 고정되어 있는 작동 전극(101)에서는 면역반응이 일어난다. 상기 면역 반응 후, 공기배출구(207)를 개방하면 용해된 기질이 혼합부(206)에서 시료와 섞인 후 흡수부(209)에 의한 모세관 현상의 지속으로 작동 전극(101)으로 이송된다. 주입된 기질은 검출부(208)에서 반응하지 못한 효소접합체를 세척함과 동시에 신호발생을 유도시키며, 분석물질에 따라 신호세기가 달라지게 되어 이를 통하여 전기화학방법으로 측정할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물은 그 미세유로의 구조로 인하여 한 번의 시료주입으로 면역반응, 세척 및 전기화학 측정을 가능하게 한다.
도 5는 본 발명의 다른 일실시형태에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물의 분해사시도이다. 도 6은 이의 결합도 및 평면도이며, 도 7은 이의 미세유로의 평면도를 나타낸다.
본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물은 중간기판에 분석물질만을 선별하여 시료 도입부에 공급할 수 있는 필터패드부 및 필터패드를 더 구비하는 것이 바람직하다.
도 5 내지 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물은 시료도입부(203)에 혈액필터패드부(201)와 혈액필터패드(202)와 같은 필 터패드부 및 필터패드를 도입할 수 있다. 상기 혈액필터패드(202)는 혈액의 혈구를 걸러주고 혈청만을 시료도입부(203)에 주입할 수 있도록 한다. 상기 분석물질은 주로 혈청 내에 존재하며, 혈구는 부피가 커서 분석물질의 측정을 방해하므로 상기 혈액필터패드를 통하여 혈구를 미리 걸러내면 분석물질을 더욱 정확하게 측정할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물은 하부기판에 중간기판의 흡수부 말단에서의 시료도달을 감지하는 감지 수단을 구비하는 것이 바람직하다.
시료가 시료도입부(203)로 이동되고 유로를 따라 흘러들어가 효소접합체 저장소(204), 검출부(208)를 지나 흡수부(209)까지 채워지면 기질 저장소(205) 유로에 머물러 있는 기질을 검출부(208)로 이동시켜 신호를 검출할 수 있다. 이때, 기질을 검출부(208)로 이동시키는 시점을 알려주는 감지 수단을 구비하는 것이 바람직하며, 상기 감지 수단으로는 일례로 유동성 감지 전극을 사용할 수 있다. 흡수부(209) 내에 배치되어 있는 유동성감지전극(104)은 시료의 유입을 감지하였을 때 미세신호를 읽어 소리로 변환시켜 주입시점을 알려줄 수 있다. 상기 감지 수단으로 인해 측정 결과의 재현성을 높일 수 있다. 이때, 감지 수단은 흡수부(209)의 구조에 따라 일정 위치에 배치될 수 있으며, 바람직하게는 면역반응이 끝나고 세척작용이 목적하는 대로 일어날 수 있도록 흡수부(209)의 말단에 위치시킨다. 또한 기질이 주입되는 양을 파악하여 감지 수단을 구비한 이후의 유로 길이와 폭을 조절 할 수 있다.
상기 감지 수단이 시료의 유입을 감지하고 주입시점을 알려주면, 물리적으로 예를 들면, 바늘과 같은 날카로운 도구로 공기배출구(207)를 형성시키거나 또는 이미 형성시켜 놓은 공기배출구(207)를 개방시켜 기질을 주입시킨 후 검출부에서 전기화학방법으로 측정하면 혈액 내 존재하는 진단 물질을 농도별로 측정할 수 있다.
이때, 상기 검출부는 항체 또는 분자인식물질과 시료 내의 면역반응 후 효소접합체 및 기질 용액간의 효소-기질 반응에 의해 발생되는 전기화학적 신호를 검출장치로 송신하여 분석물질의 정량적인 정보를 얻을 수 있도록 하는 역할을 한다.
또한 상기 흡수부는 모세관 현상에 의해 시료의 흐름을 지속적으로 유지시킴으로써 검출부에서의 반응을 지속시키고, 미반응된 물질에 대한 세척효과를 높여 고감도의 검출 신호를 얻을 있도록 하는 역할을 한다.
나아가, 본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물은 상기 하부기판에 검출 신호의 편차를 최소화할 수 있는 단수 또는 복수의 검정전극을 더 구비하는 것이 바람직하다.
도 8은 본 발명의 또 다른 일실시형태에 따른 검출부(208)에 자체 검정 기능의 검정전극(검정1전극(105), 검정2전극(106)이 포함된 미세유로형 센서 복합 구조물의 평면도를 나타낸 것이다.
검정전극을 이용하여 반복적인 신호를 측정하고 그들의 평균치를 구해 그 값을 표준신호값(바탕신호값, 포화신호값)이라고 결정한 후에 작동 전극(101)에서 얻 어지는 검출신호를 표준신호값과 비교, 보정하면 실험 개체 간에 생기는 편차를 줄일 수 있다.
예를 들면, 도 8에 있어서 검정1전극(105)은 바탕신호를 측정하는 전극이고, 작동 전극(101)은 분석하고 하는 분석물질의 항체를 고정화시키고 분석물질의 농도별 검출신호를 측정하는 전극이며, 검정2전극(106)은 포화된 혹은 일부 포화된 효소접합체의 포화신호를 측정하는 전극이다. 검정1전극(105)을 통해 효소접합체의 비특이적 흡착의 문제인지 파악할 수 있으며, 검정2전극(106)을 통해 효소접합체의 양 혹은 용해되는 정도의 문제인지를 파악할 수 있다. 세 개의 전극(작동 전극(101), 검정1전극(105), 검정2전극(106))은 한 개의 기준전극(102)에 연결되어 측정하게 되는데, 이는 이러한 측정이 가능한 검출장치로 측정할 수 있다. 이때, 검정전극의 개수와 위치는 한정되지 않는다.
상기 미세유로형 센서 복합 구조물은 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다.
먼저 하부기판(100)의 상부에 탄소 또는 금속 도체 재질을 인쇄 또는 증착방법을 통해 전극(작동 전극(101), 기준전극(102), 전극연결부(103), 유동성감지전극(104))을 형성한다. 그리고 중간기판을 통해 시료도입부(203), 효소접합체 저장소(204), 기질 저장소(205), 혼합부(206), 공기배출구(207), 검출부(208), 흡수부(209)를 포함하는 미세유로를 형성시킨다. 이때, 미세유로는 프레스를 이용한 성형을 통해 형성할 수 있으며, 상기 유기 고분자 재료로 만들어진 양면테이프에 프레스 금형을 이용하여 형성할 수도 있고, 감광제(dry photoresist) 필름을 사용 하고 식각법을 이용하여 형성할 수 있다. 이후, 노출된 작동 전극(101) 위에 항체 또는 분자인지물질을 고정화시키고, 효소접합체 저장소(204)에는 효소접합체를, 기질 저장소(205)에는 기질을 도포시켜준다. 적절한 조건으로 제재들의 분산 후 고착이 이루어졌으면 상부기판(300)을 미세유로형 복합 구조물 전체에서 모세관 현상이 유지되도록 시료도입부와 통기부가 개방되도록 부착시켜준다.
상기 작동 전극(101) 표면에 항체 또는 분자인지물질을 전극에 고정화하는 방법은 물리적, 화학적 방법이 병행될 수 있으며, 상기 물리적 흡착방법은 전극표면과 항체 사이의 친유성 결합력을 이용하며 항체를 희석하여 작동 전극(101) 상에 적하한 후, 적정 조건에서 건조하는 것으로 수행되므로 간단하고 고정화시키는 시간이 짧다. 또한, 화학적 방법은 1차 아민, 싸이올, 탄화수소기를 이용하여 전극표면과 항체사이의 공유결합을 유도하여 높은 밀도의 기능 분자들이 오랫동안 전극표면에 배열될 수 있도록 한다.
상기 효소접합체 저장소(204)에 도포된 효소접합체는 시료에 의해 용해되어 그 기능을 발휘해야 한다. 가장 바람직한 도포 방법은 급속 동결 건조이며, 여러 가지 첨가제를 사용하여 용해를 촉진시킬 수 있다. 항체의 활성 보존과 단백질 분해 효소로부터 항체를 보호하고 비특이적 흡착을 감소하는 기능을 가지는 단백질류(BSA, Nonfat dry milk, Casein)와 단백질 건조 시 결정화 예방 및 단백질 구조 유지하여 안정제로 사용되는 단당류(glucose), 다당류(sucrose, trehalose)등을 포함시켜 효소접합체 용액을 제조한다. 또한 비특이적 흡착을 막아주고 효소 활성을 높여주는 계면활성제류(tween 20, tween 80, triton X-100)를 포함하며 효소의 종류에 따라 활성에 필요한 금속이온을 포함시킬 수도 있다. 효소접합체에 사용되는 효소는 다양하게 선택할 수 있다. 일예로, 글루코오스 산화효소(glucose oxidase)를 사용하면 글루코오스를 기질로 사용하여 칩에 적용할 수 있고, 알칼리 포스페이트 수화효소(alkaline phosphatase)를 사용하면 기질로 4-아미노 페닐포스페이트(p-aminophenyl phosphate)를 사용하여 측정할 수 있다. 또한 고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)는 기질인 과산화수소를 사용하여 환원전류를 측정할 수 있다. 이러한 효소들을 표지로 이용할 경우 전기화학적 검출이 가능하며 다양한 항체 및 분자인식물질을 사용하면 본 발명인 미세유로형 센서 복합 구조물에 각각 적용하여 생체시료와 환경시료, 농공업시료 또는 식품시료 중의 다양한 유기물 또는 무기물 농도도 또한 동일한 방법으로 정량할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미세유로형 복합 구조물을 이용한 분석물질 농도의 고감도 및 정량적 측정방법을 제공한다.
이렇게 제조된 미세유로형 센서 복합 구조물을 이용하여 일례로 마이오글로빈의 양에 따라 전류값을 측정한 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 마이오글로빈의 양에 전류값이 비례하는 것을 확인하였으며, 그 표준편차도 0.02~0.18로 낮음으로써 고감도로 정량적 측정이 가능함을 확인하였다. 따라서, 상기 구조를 갖는 미세유로형 센서 복합 구조물은 여러 가지 분석물질에 적용할 수 있는 바이오센서에 유용하게 사용될 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물은 보편적으로 사용되는 유기 고분자를 사용하여 간단한 방법으로 제작이 가능하여 대량생산에 용이하고, 시료도입부에 시료가 도입되면 모세관 현상만으로 이동이 가능하며, 그 동일한 시료로 제재들의 용해를 통한 면역반응, 세척 및 측정이 가능한 면역센서의 제작이 가능하여 비교적 빠르고 정확한 결과를 얻을 수 있다. 또한 흐름의 제어를 벨브나 펌프없이 모세관 유로의 구조에 의해서 고안함으로써 값싸게 제작할 수 있으며 간단한 조작과정으로 측정이 가능하므로 여러 가지 분석물질에 적용할 수 있는 바이오센서에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 마이오글로빈 측정용 미세유로형센서 제작
(1) 전극 및 미세유로 제작
미세유로의 제작은 반도체 제작 공정의 일부인 광식각법을 사용하여 제작하였다. 사용되는 필름은 보편적으로 사용되는 아크릴 코팅된 폴리에틸렌 텔레프탈레이트(poly-ethylene terephthalate;PET) 필름을 사용하였고, 그 필름 위에 탄소반죽으로 스크린 인쇄법을 사용하여 작동 전극, 전극연결부 및 유동성감지전극을, 은반죽으로 기준전극과 전극연결부를 형성하였다. 이후 액상이 아닌 건조된 감광 제 필름을 사용하여 전극이 형성된 필름과 열 압착하였고 노광기를 이용하여 원하는 미세유로를 형성시켰다. 원하는 모세관 유로는 CAD 프로그램을 이용하여 디자인하였고, OHP 필름에 인쇄하여 패턴 마스크로 사용하였다. 일정한 광량으로 노광을 시킨 후 2% 소듐 카보네이트(sodium carbonate)로 에칭 과정을 거쳐 패턴을 정밀화하였다. 에칭액은 30 ℃ 정도로 유지시켰다. 제작된 센서칩을 음조건에서 건조시켜 보관하였다.
(2) 항체, 효소접합체, 기질 고정화
작동 전극에 물리적인 흡착방법으로 항체를 고정화시키기 위하여 마이오글로빈 항체를 0.01M 포스페이트 완충용액(phosphate buffer) pH 7.2에 희석하여 작동 전극 표면에 적하하여 25 ℃에서 건조시켰다. 효소접합체 저장소에 도포하는 효소접합체는 알카리 포스페이트 수화효소(alkaline phosphatase)를 이용한 2차 마이오글로빈 항체 접합체를 사용하여 샌드위치면역분석법을 적용하기로 하였다. 효소접합체 저장소 위에 효소접합체를 고농도로 희석하여 적정량을 올려서 25 ℃에서 건조하였다. 효소접합체를 희석하는 완충용액은 20mM 포스페이트 완충용액(phosphate buffer) pH 7.2에 0.5% BSA, 1% Trehalose, 0.1% 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol;PVA), 0.01% Tween 20이 첨가된 용액을 사용하였다. 건조된 효소접합체가 수화되어 흘러가는 것이 용이하도록 효소접합체 희석버퍼에 여러 가지 첨가제를 포함시켰다. 기질 저장소에는 알카리 포스페이트 수화효소의 기질인 4-아미노페닐포스페이트(4-aminophenyl phosphate)를 건조시켰다. 기질 역시 짧은 시간 내에 수화시키기 위해 1.0M 카보네이트 완충용액(carbonate buffer)에 0.5% Trehalose, 0.05% Tween 20, 0.5% CMC(carboxy methyl cellulose)등 여러 가지 첨가제를 포함시켰다.
이후, 상부기판으로서 폴리에틸렌 텔레프탈레이트(poly-ethylene terephthalate;PET) 필름의 한쪽면이 접착테이프로 이루어진 커버테이프를 부착시키고 압착시켜 미세유로형 센서를 제작하였다.
< 실시예 2> 마이오글로빈 측정용 미세유로형센서 제작 2
시료도입부에 혈액분리 필터패드를 도입하고, 흡수부 말단에 유동감지전극을 구비한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 미세유로형센서를 제작하였다.
이때 사용된 혈액분리 필터패드는 Lydall Filtration의 LyPore Grade 9389를 구입하였으며, 유동감지전극은 작동 전극과 동일하게 탄소반죽을 이용하여 제작하였다.
< 실시예 3> 마이오글로빈 측정용 미세유로형센서 제작 3
작동 전극 외에 두 개의 검정전극을 추가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 미세유로형센서를 제작하였다. 이때, 상기 검정전극은 탄소반죽으로 전극을 제조한 뒤, 검정1전극은 그 위에 BSA를 도포하고, 검정2전극은 IgG를 도포하였다.
검정1전극은 BSA를 도포함으로써 바탕신호를 확인할 수 있었고, 검정2전극은 래피드 키트의 control 라인과 같은 IgG를 도포함으로써 반응에 참여하지 않은 효소접합체와의 결합을 통해 효소접합체의 용해정도, 즉 포화신호를 살펴볼 수 있었다.
< 실험예 1> 마이오글로빈 농도 측정
본 발명에 따른 미세유로형센서 복합형 구조물을 이용하여 제작한 미세유로형센서의 바이오 센서로서의 작용을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
마이오글로빈을 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5m 1 ㎍/㎖의 농도로 변화시켜 상기 농도의 마이오글로빈이 존재하는 플라즈마를 실시예 1에서 제작된 마이오글로빈 미세유로형센서의 시료주입구에 주입하였다. 시료가 흡수부의 유동성감지전극에 도달했을 때 공기배출구에 바늘로 구멍을 만들어 수화된 기질이 전극으로 유입될 수 있도록 하였다. 이후 각 전극을 EZ 정전압 프로그램(EZ potentiostat program)으로 +150mV의 전압을 걸어주어 60초 동안 전류값을 측정하였다. 그 결과를 도 10 및 표 1에 나타내었다.
Myo (㎍/㎖)
0 0.05 0.1 0.5 1
전류 (μA) -0.37 -0.52 -1.01 -2.01 -2.88
-0.32 -0.50 -1.06 -1.95 -2.68
-0.35 -0.47 -1.08 -2.11 -3.09
-0.33 -0.63 -0.97 -2.05 -2.76
-0.34 -0.48 -1.18 -1.89 -3.07
평균값 -0.34 -0.52 -1.06 -2.00 -2.90
표준편차 0.02 0.06 0.08 0.09 0.18
CV (%) 5.62 12.39 7.52 4.27 6.30
도 10 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 마이오글로빈의 농도에 따라 전류값은 달라지며 감응 기울기는 0~0.1 ㎍/㎖ 농도에서 선형성 0.786을, 0.1~1 ㎍/㎖에서 선형성 0.977을 보임으로써 바이오센서로의 정량적 검출이 가능함을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물은 여러 가지 분석물질에 적용할 수 있는 바이오센서에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시 형태에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물의 분해사시도이다.
도 2는 도 1의 미세유로형 센서 복합 구조물의 결합사시도 및 평면도이다.
도 3은 도 1의 미세유로형 센서 복합 구조물의 미세유로의 평면도이다.
도 4는 본 발명의 일실시형태에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물의 반응 경로를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일실시 형태에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물의 분해사시도이다.
도 6은 도 5의 미세유로형 센서 복합 구조물의 결합사시도 및 평면도이다.
도 7은 도 5의 미세유로형 센서 복합 구조물의 미세유로의 평면도이다.
도 8은 본 발명의 일실시 형태에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물의 미세유로의 평면도이다.
도 9은 본 발명의 일실시형태에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물의 미세유로를 제작하는 방법을 나타내는 도면이다.
도 10은 본 발명의 일실시형태에 따른 미세유로형 센서 복합 구조물을 사용하여 마이오글로빈의 양에 따라 전류값을 측정한 검정곡선이다.
<주요 부분에 대한 부호의 설명>
100: 하부기판 101: 작동 전극
102: 기준 전극 103: 전극연결부
104: 유동성 감지전극 105: 검정1전극
106: 검정2전극 200: 중간기판
201: 혈액필터패드부 202: 혈액필터패드
203: 시료도입부 204: 효소접합체 저장소
205: 기질 저장소 206: 혼합부
207: 공기배출구 208: 검출부
209: 흡수부 210: 통기부
300: 상부기판

Claims (13)

  1. 기준 전극, 작동 전극 및 전극연결부가 구비되어 있는 하부기판과;
    시료도입부와 상기 시료도입부로부터 T형으로 갈라지도록 설계되고 기준 전극 및 작동 전극이 노출되는 검출부에 연결되되 각각 선택적으로 효소접합체 저장소 또는 기질 저장소가 배치되어 있는 2개의 미세유로, 시료 용액에 의해 용해된 기질 용액이 상기 검출부에 시간적으로 후에 도달되도록 상기 기질 저장소가 배치되어 있는 미세유로 상에 부가되는 통기부 및 공기배출구를 구비한 혼합부, 상기 검출부를 통과한 유체가 흡수되는 흡수부, 상기 흡수부 말단에 통기부가 구비되고 상기 하부기판 위에 적층되는 중간기판과;
    상기 중간기판에 형성된 미세유로에 모세관 현상을 유도하도록 적층되는 상부기판을 포함하여 구비되는 미세유로형 센서 복합 구조물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하부기판은 중간기판의 흡수부 말단에서의 시료 도달을 감지하는 유동성 감지 전극이 더 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 미세유로형 센서 복합 구조물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유동성 감지 전극은 시료의 도달을 감지함으로써 기질 용액의 주입 시점을 알려주는 것을 특징으로 하는 미세유로형 센서 복합 구조물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하부기판은 검출 신호의 편차를 최소화할 수 있는 단수 또는 복수의 검정전극이 더 구비되는 것을 특징으로 하는 미세유로형 센서 복합 구조물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 검정전극은 바탕신호를 측정하는 검정전극(검정1전극)과 포화 또는 일부 포화된 효소접합체의 포화 신호를 측정하는 검정전극(검정2전극)인 것을 특징으로 하는 미세유로형 센서 복합 구조물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 중간기판은 분석 물질만을 선별하여 시료 도입부에 공급할 수 있는 필터 패드부 및 필터 패드를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 미세유로형 센서 복합 구조물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 필터 패드는 혈액의 혈청만을 선별하여 시료도입부에 공급하는 혈액 필터패드인 것을 특징으로 하는 미세유로형 센서 복합 구조물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 작동 전극에 시료가 도달하는 순서는 시료 용액에 의해 용해된 효소접합체 용액이 도달하고, 일정시간 경과 후 기질 용액이 도달하는 것을 특징으로 하는 미세유로형 센서 복합 구조물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 작동 전극에는 시료 내의 분석물질과 면역반응을 유도할 수 있는 항체 또는 분자인지물질이 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 미세유로형 센서 복합 구조물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 검출부는 항체 또는 분자인식물질과 시료 내의 분석물질간의 면역반응 후 효소접합체 및 기질 용액간의 효소-기질반응에 의해 발생되는 전기화학적 신호를 검출장치로 송신하여 분석물질의 정량적인 정보를 얻는 것을 특징으로 하는 미세유로형 센서 복합 구조물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 흡수부는 모세관 현상에 의해 시료의 흐름을 지속적으로 유지시킴으로써 검출부에서의 반응을 지속시키고, 미반응된 물질에 대한 세척효 과를 높여 고감도의 검출 신호를 얻는 것을 특징으로 하는 미세유로형 센서 복합 구조물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 상부기판은 미세유로형 센서 복합 구조물 전체에서 모세관 현상이 유지되도록 시료도입부와 통기부가 개방되도록 적층되는 것을 특징으로 하는 미세유로형 센서 복합 구조물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 미세유로형 센서 복합 구조물을 이용한 분석물질 농도의 고감도 및 정량적 측정 방법.
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