KR20080076622A - 올리고머화된 단백질 전달체와 이를 이용한 세포내바이러스 벡터 전달 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 전달체(protein transduction domain, PTD)를 올리고머화한 새로운 형태의 단백질 전달체 올리고머 및 이를 이용해 목적 물질을 세포 내로 전달하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 단백질 전달체 올리고머의 적은 양으로도 목적 물질을 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있으며, 바이러스 백신 및 약리학적 또는 의학적으로 유용한 단백질의 생산 또는 이를 이용한 유전자 치료법 등에 사용할 수 있다.

PTD, 단백질 전달체 올리고머, 세포내 전달

Description

올리고머화된 단백질 전달체와 이를 이용한 세포내 바이러스 벡터 전달 방법 {Oligomerizaed Protein Transduction Domains and method for the intracellular transduction of viral vectors}

도 1은 세포내 물질전달 능력이 있는 펩타이드(PTD)인 Tat_{48 -60}, Mph-1, HP4의 아미노산 서열 및 이들이 이량체, 사량체, 팔량체의 형태로 올리고머화된 구조를 도식으로 나타낸 그림이다.

도 2는 쥐의 뇌종양 세포 C6Bu1에서 Tat_{48 -60}, Mph-1, HP4 및 이들이 올리고머화된 펩타이드의 아데노바이러스 전달효율의 최대값(%), 이때 필요한 펩타이드의 농도(uM), 50%의 세포독성을 보이는 펩타이드의 농도(uM), 그리고 세포독성을 보이지 않는 최대농도(uM)를 나타낸 테이블이다.

도 3은 생쥐 대장암 동물실험모델에서 단량체 PTD인 Tat_{48 -60}과 사량체 PTD인 4Tat_48-60에 의해 증가된 인터류킨-12 아데노바이러스의 항암효과를 비교한 그래프이다.

본 발명은 단백질 전달체(protein transduction domain, PTD)를 올리고머화한 새로운 형태의 단백질 전달체 올리고머 및 이를 이용해 바이러스 벡터를 세포 내에 전달하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 살아있는 세포는 단백질 및 핵산과 같은 거대 분자에 대해서 불투과성이다. 일부 작은 물질들만이 매우 낮은 비율로 살아있는 세포의 세포막을 통과하여 세포 내부의 세포질 또는 핵으로 들어갈 수 있는 반면에, 거대분자는 세포 내부로 들어갈 수 없다는 사실은, 단백질 또는 핵산을 포함하는 거대분자를 이용한 치료, 예방 및 진단에 대한 제한 요인이 되고 있다. 한편, 대부분의 치료, 예방 및 진단의 목적으로 제조되는 물질들은, 이것의 진단, 예방 및 치료학적 유효량이 세포내로 전달되어야 하므로 이들을 세포 외부나 표적 세포의 표면에서 작용시켜 세포내로 전달시키기 위한 여러 가지 방법들이 개발되었다. 이와 같이, 생체외(in vitro)에서 세포내로 거대 분자를 전달하는 방법에는, 전기충격(electroporatio), 리포좀을 이용한 막 융합, 표면에 DNA가 코팅된 미세 투사체를 이용한 고농도 투사법, 칼슘-인-DNA 침전체를 이용한 배양법, DEAE-덱스트란을 이용한 트랜스펙션(trasnfection), 변형된 바이러스 핵산을 이용한 감염, 단일 세포로 직접 미세 주입하는 방법 등이 있다. 그러나, 이러한 방법들은 전형적으로 거대 분자를 주입시키고자 하는 전체 세포 수 중의 단지 일부에만 전달할 수 있을 뿐이며, 다른 많은 수의 세포에 바람직하지 않은 영향을 주는 경향을 나타낸다. 또한, 생체 내에서 세포 내로 거대 분자를 실험적으로 이동시키는 방법으로서, 칼 슘-인 침전, 라이포좀을 이용하는 방법 등이 있으나, 이러한 기술들은 생체 내에서 세포내로 물질을 전달함에 있어 그 사용이 극히 제한적이라는 문제점이 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 연구의 결과로서 제시된 것으로 단백질 전달체(Protein Transduction Domain, PTD)가 있다. 이러한 단백질 전달체(Protein Transduction Domain, PTD)는 양전하를 띄는 짧은 길이의 펩타이드로서 세포막을 통과할 수 있다고 알려져 있으며, PTD는 단백질뿐 아니라 DNA, RNA, 지방, 탄수화물, 화합물 또는 바이러스를 효율적으로 세포 내로 전달할 수 있는 것으로 알려져 있다. PTD가 세포막을 투과하는 원리는 아직 밝혀지지 않았으나, 수용체 비의존적이고, 엔도사이토시스(endocytosis)나 파고사이토시스(phagocytosis)에 비의존적이라고 생각되고 있다. 가장 널리 알려진 PTD로는 HIV Tat, 초파리의 Antp, 쥐의 전사인자의 Mph-1 (대한민국 특허공개번호 제2004-0083429호), HSV-1 VP22, 그리고 최근에 밝혀진 HP4 (PCT특허 출원번호 PCT/KOR2006/000759, PCT/KOR2006/000790) 등이 있다. 그중 HIV Tat은 가장 먼저 발견된 PTD로써 (Schwarze. S.R., Science, 285(3):1569-1572, 1999), 현재 DNA의 전달, 목적 단백질과의 융합을 통한 치료제의 개발 등에 많은 연구가 진행되고 있다.

유전자 치료의 가장 중요한 관심은 치료용 유전자를 얼마나 효율적으로 목적 세포에 전달할 수 있는가에 있다. 이러한 이유에서 최근에 들어 높은 발현률을 가지는 바이러스 벡터를 이용한 유전자의 전달이 많이 시도되고 있다. 예를 들어 아 데노바이러스, 레트로바이러스, 백시니아바이러스가 유전자 치료에 많이 이용되고 있다. 하지만 이러한 바이러스 벡터들은 세포의 종류와 수용체의 발현 정도에 의존적이기 때문에, 암세포나 줄기세포 등으로의 바이러스 벡터 전달은 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해서 바이러스를 수용체와 융합시키거나 리포좀, 양이온, PTD를 이용하는 등의 전략을 사용하기도 한다. 그 중, PTD를 이용한 바이러스 벡터의 세포내 전달의 경우, Antp와 Tat이 아데노바이러스와 레트로바이러스 벡터의 세포내 전달을 향상시킬 수 있다고 보고된바 있다 (Gratton. JP., Nature Medicine, 9(3):357-362, 2003). 그러나, 2배 정도의 세포내 전달효율을 증가시키는데 0.5mM이라는 많은 양의 PTD가 필요하다는 점에서 기존의 PTD를 이용한 바이러스의 전달 방법은 매우 비실용적이라는 한계가 있다.

이에, 본 발명자들은 여러 종류의 단백질 전달 부위(PTD)를 올리고머화한 새로운 형태의 펩타이드를 합성하였고, 이 올리고머 PTD의 사용을 통해 바이러스 벡터를 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있다는 사실을 발견하고, 이 펩타이드를 세포내 바이러스 벡터 전달용 펩타이드로 사용함으로써 목적 유전자의 세포내 전달 및 발현을 현저히 증가 시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은, 단량체 형태의 단백질 전달체(Protein transduction domain; PTD)를 두 개 이상 연결하여 다량체 형태로 올리고머화한 단 백질 전달체 올리고머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 진핵 또는 원핵세포의 세포질 또는 핵 내로 전달하고자 하는 목적 물질과 결합된 상기의 단백질 전달체 올리고머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 단백질 전달체 올리고머를 이용하여 바이러스 벡터를 진핵 또는 원핵세포내로 효율적으로 전달하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 단량체 형태의 단백질 전달체(Protein Transduction Domain; PTD)를 다량체 형태로 올리고머화한 단백질 전달체 올리고머에 관한 것이다.

구체적 양태로서, 본 발명은 단량체 형태의 단백질 전달체(PTD)를 다량체 형태로 올리고머화한 하기 화학식 1로 표현되는 단백질 전달체 올리고머에 관한 것이다.

(PTD)n-branch

상기 식에서,

n은 2 이상의 정수이며,

브랜치(branch)는 다중 항원 펩타이드(Multiple Antigenic Peptide, MAP), 시스테인 및 펩타이드 링커(peptide linker)로 연결된 캐리어 프로테인(carrier protein)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결자이다.

바람직한 양태에서, 상기 화학식 1은

n은 2, 4 또는 8의 정수이며,

브랜치(branch)는 다중 항원 펩타이드(Multiple Antigenic Peptide, MAP) 또는 시스테인이다.

보다 바람직한 양태에서, 상기 화학식 1의 단백질 전달체 올리고머는 하기 화학식 2 내지 8로 표현되는 단백질 전달체 올리고머로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 전달체 올리고머이다.

보다 더 바람직한 양태에서, 상기 화학식 1의 하기 화학식 3, 6 및 8로 표현되는 단백질 전달체 올리고머로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 전달체 올리고머이다.

(GRKKRRQRRRPPQ)₂-K-βA-OH

(GRKKRRQRRRPPQ)₄-K₂-K-βA-OH

(GRKKRRQRRRPPQ)₈-K₄-K₂-K-βA-OH

(YARVRRRGPRR)₂-K-βA-OH

(YARVRRRGPRR)₄-K₂-K-βA-OH

(YARVRRRGPRR)₈-K₄-K₂-K-βA-OH

(RRRRPRRRTTRRRR)₄-K₂-K-βA-OH

본 발명의 단백질 전달체(Protein Transduction Domain, PTD)는 이들과 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 간접적으로 연결된 특정 단백질, 바이러스, DNA, RNA, 지방, 탄수화물 또는 화학적 화합물을 진핵 또는 원핵 세포의 세포질 또는 핵내로 전달가능한 물질 펩타이드를 말한다. 본 발명의 단백질 전달체는 이에 한정되는 것은 아니나, 예시적으로 인간 면역결핍 바이러스 타입 I(HIV-1)에서 유래한 Tat 단백질, 초파리의 안테나페디아 호메오도메인(Antennapedia Homeodomain)인 Antp(Antennapedia 또는 penetratin) 펩타이드, 쥐의 전사인자의 Mph-1, HSV-1의 VP22 및 청어 프로타민의 HP4를 포함한다. 또한, 본 발명의 단백질 전달체는 특정 세포 타입 혹은 상태에 특이성을 갖는 세포-특이적 PTD를 포함한다. 이러한 세포-특이적 PTD의 한 예는 미국 출원공개 제2002-0102265호에 기재된 Hn1 합성 펩타이드이다. 또한, 본 발명의 단백질 전달체는 합성 펩타이드를 포함한다. 이러한 합성 펩타이드의 한 예는 Ho 등이 HIV의 Tat 단백질이 단백질 전달 능력을 최적화하도록 Tat 단백질의 47-57 잔기를 변형한 펩타이드이다(Ho et al. (2001) Cancer Res 61(2):474-7).

본 발명의 구체적인 실시에서, 단백질 전달체는 상기 화학식 2 내지 4의 단백질 전달체 올리고머는 HIV의 Tat_48-60(서열번호 1) 단백질 전달체를 포함하고 있으며, 상기 화학식 5 내지 7의 단백질 전달체 올리고머는 Mph-1(서열번호 2) 단백질 전달체를 포함하고 있으며, 상기 화학식 8의 단백질 전달체 올리고머는 HP4(서열번호 3) 단백질 전달체를 포함하고 있다.

본 발명의 단백질 전달체는 펩타이드를 합성하는 당해 분야의 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템 또는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관내에서 합성하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 단백질 전달체는 펩타이드를 연결하는 공지된 다양한 방법에 의하여 단량체 형태의 단백질 전달체를 2개 이상 연결하여 다량체 형태의 단백질 전달체 올리고머로 사용한다. 본원에서는 상기 펩타이드를 연결하는 물질을 브랜치(branch)로 표현한다.

본 발명의 상기 브랜치(branch)는 이에 한정되는 것은 아니나, 다중 항원 펩타이드(Multiple Antigenic Peptide, MAP), 시스테인(cysteine), 캐리어 프로테인(carrier protein)를 포함한다.

상기 “다중 항원 펩타이드(Multiple Antigenic Peptide, MAP)”는 다중 라이신을 블록으로 하여 2개 이상의 단백질 전달체를 연결하는 펩타이드를 말하고, 상기 “시스테인(cysteine)”은 황을 함유한 중성 아미노산으로서 시스테인 사이의 이황화 결합(disulfied bond)에 의해 2개 이상의 단백질 전달체를 연결하는 아미노산을 말한다. 상기 “캐리어 단백질(carrier protein)”은 2개 이상의 단백질 전달체와 결합하여 세포막을 가로질러 단백질 전달체를 운반하는 막단백질로서, 캐리어 단백질과 단백질 전달체를 연결하기 위하여는 MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimide ester) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 등의 펩타이드 링커(peptide linker)를 필요로 한다. 상기 캐리어 단백질은 이에 한정되는 것은 아니나, KLH(Keyhole limpet hemocyanin) 및 BSA(Bovine Serum Albumin) 등을 포함한다.

상기 “다량체”는 2개 이상의 단위체(또는 단량체)가 모여서 만들어진 펩타 이드를 말한다.

본 발명에 있어서, “올리고머화(oligomerization)”는 2개 이상의 펩타이드(또는 단량체)를 연결하여 다량체 형태로 만드는 것을 말한다. 본 발명의 단백질 전달체(PTD)의 올리고머화는 다중 항원 펩타이드(Multiple Antigenic Peptide, MAP), 시스테인(cysteine) 및 펩타이드 링커(peptide linker)와 연결된 캐리어 단백질(carrier protein)을 이용하여 2개 이상의 단백질 전달체(PTD)를 연결하여 다량체 형태로 올리고머화 한다. 구체적으로, 상기 다중 항원 펩타이드를 이용하여 한 분자내에 2개 이상의 단백질 전달체를 도입하여 단량체 형태의 단백질 전달체를 올리고머화할 수 있으며, 시스테인 또는 펩타이드 링커와 연결된 캐리어 단백질을 이용하여 2개 이상의 단백질 전달체를 연결함으로써 단량체 형태의 단백질 전달체를 올리고머화할 수 있다. 보다 구체적으로, 다중 항원 복합체의 2개 내지 4개 내지 8개 등의 라이신 블록에 각각의 펩타이드의 카르복시 말단을 연결시켜 이량체 내지 사량체 내지 팔량체 등의 형태로 올리고머화 할 수 있으며, 시스테인을 단백질 전달체 말단에 연결해 두 시스테인 사이의 이황화 결합(disulfied bond)의 형성을 유도함으로써 단백질 전달체를 다량체 형태로 올리고머화 할 수 있다. 또한 캐리어 프로테인(carrier protein) 및 펩타이드 링커(peptide linker)를 이용해서 단백질 전달체를 여러 개 연결하여 다량체 형태로 올리고머화 할 수 있다.

본 발명의 “단백질 전달체 올리고머”는 단량체 형태의 단백질 전달체(PTD)를 상기 방법에 의하여 올리고머화하여 다량체 형태로 이루어진 단백질 전달 체(PTD)로서, 세포 내로 전달하려는 목적 물질과 결합하여 목적 물질을 세포 내로 전달하는 단백질 전달체를 말한다. 상기 “목적 물질”은 인간을 포함한 개체의 질환 치료 또는 예방을 위하여 세포 내로 전달하기 위한 치료 또는 예방용 물질로서, 예를 들면 바이러스, DNA, RNA, 단백질, 지방, 탄수화물 또는 화합물 등이 있다.

본 발명의 구체적 실시에서, 단량체 형태의 단백질 전달체보다 다량체 형태의 단백질 전달체 올리고머가 적은 양으로도 목적 물질, 예를 들어 바이러스 벡터를 개체의 세포 내로 보다 효과적으로 전달하였다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 단백질 전달체 올리고머는 세포 내로 목적 물질, 예를 들어 바이러스, DNA, RNA, 단백질, 지방, 탄수화물 또는 화합물 등을 효과적으로 전달할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 세포 내로 전달하고자 하는 목적 물질과 화학적 또는 물리적 방법에 의해 융합되거나 결합된 본 발명의 단백질 전달체 올리고머를 목적 물질을 전달하고자 하는 진핵 또는 원핵세포와 혼합 배양 및 접촉시키는 단계를 포함하는, 목적 물질을 세포 내로 전달하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 세포 내로 전달하고자 하는 목적 물질은 바이러스, DNA, RNA, 단백질, 지방, 탄수화물 또는 화합물이며, 바람직하게는 바이러스 벡터이다. 상기 바이러스 벡터는 생체 내의 모든 생리 현상을 조절하는 생물학적 활성을 갖는 기능 조절 물질을 합성하는 유전자를 전달하는 바이러스로서, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 백시니아바이러스 등을 예로 들 수 있다.

상기 목적 물질과 단백질 전달체 올리고머가 융합되거나 결합된 형태의 복합체를 제조하는 방법은 공지된 다양한 방법, 예를 들어 미국 등록특허 제7,166,692호 등에 개시된 방법을 이용할 수 있다. 구체적으로, 동종이작용기성 교차연계자(homobifunctional cross-linker) 또는 이중이작용기성 교차연계자(heterobifunctional cross-linker)와 같은 화학적 교차연계자를 이용하거나, 글루타치온 및 글루타치온-에스-트랜스퍼라제 등의 가교분자쌍(pairs of bridging molecule)을 이용하여 상기 복합체를 제조할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, “접촉”이란 목적 물질과 융합하거나 결합된 단백질 전달체 올리고머가 근육내(intramuscular), 복막내(intraperitoneal), 정맥내(intravein), 경구(oral), 비내(nasal), 피하(subcutaneous), 피내(intradermal), 점막(mucosal) 또는 흡입(inhale) 등의 경로에 의해 진핵 또는 원핵세포와 접하는 것을 의미하며, 이에 의하여 상기 목적 물질과 융합되거나 결합된 단백질 전달체 올리고는 진핵 또는 원핵세포의 세포질 또는 핵 내로 목적 물질을 전달한다.

본 발명의 구체적 실시에서, 본 발명의 화학식 2 내지 8로 표현되는 단백질 전달체 올리고머를 이용하여 아데노바이러스 벡터를 C6Bul 세포주 내로 전달하였을 때, 단량체 형태의 단백질 전달체(PTD)인 Tat_{48 -60} (서열번호 1), Mph-1 (서열번호 2), HP4 (서열번호 3)을 처리한 경우 보다 우수한 비율로 세포 내로 전달하였으며, 단백질 전달체 올리고머에 포함된 단백질 전달체(PTD)의 수가 증가할수록 아데노바이러스 벡터의 세포 내 전달 효율이 더욱 증가하는 양상을 나타내었다. 또한 양적인 측면에서, 단백질 전달체 올리고머에 포함된 단백질 전달체(PTD)의 수가 증가할수록 세포 내 최대전달효율을 나타내는데 필요한 단백질 전달체의 양이 감소하였다(도 2). 이러한 결과와 더불어 사량체 형태의 단백질 전달체 올리고머인 4Tat_48-60(화학식 3)을 이용한 동물실험에서도 단량체 단백질 전달체(PTD)보다 더욱 우수한 항암효과를 유도하였다(도 3). 상기와 같은 결과로부터 본 발명의 단백질 전달체 올리고머는 종래 문제시 되었던 단량체 형태의 단백질 전달체를 사용할 경우 많은 양이 필요하다는 문제점을 해결할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 조제된, 세포 내로 전달하고자 하는 목적 물질과 화학적 또는 물리적 방법에 의해 융합되거나 결합된 본 발명의 단백질 전달체 올리고머를 포함하는 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 사용된 용어, “약제학적으로 허용되는 담체”는 임의의 또는 모 든 용매, 분산 매체, 코팅, 등장성 및 흡수 지연제, 및 생리적으로 호환될 수 있는 유사한 것을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추, 상피의 투약 (예를 들어, 주사 또는 주입)에 적합한 것이다. 투약의 경로에 따라, 활성 물질은 그 물질을 불활성화할 수 있는 산 혹은 다른 자연적 환경의 작용으로부터 그 물질을 보호하기 위한 재료 내에 코팅될 수 있다.

상기 세포 내로 전달하고자 하는 목적 물질은 바이러스, DNA, RNA, 단백질, 지방, 탄수화물 또는 화합물이며, 바람직하게는 바이러스 벡터이다. 상기 바이러스 벡터는 생체 내의 모든 생리 현상을 조절하는 생물학적 활성을 갖는 기능조절 물질을 합성하는 유전자를 전달하는 바이러스로서, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 백시니아바이러스 등을 예로 들 수 있다.

상기 목적 물질을 세포 내로 전달함으로써 목적 물질의 작용에 의하여 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 상기 질환은 세포 내로 전달하는 목적 물질과 관련하여 결정된다. 예를 들어, 목적 물질이 간염 예방 또는 치료를 위한 약독화 바이러스인 경우 이를 본 발명의 단백질 전달체 올리고머와 결합한 상태로 세포 내 전달하여 간염을 치료 또는 예방할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 염을 추가로 더 포함할 수 있다. “약제학적으로 허용되는 염”은 원 물질의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고 어떠한 바람직하지 않은 독성 효과(Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm . Sci . 66:1-19 참조)를 주지 않는 염을 지칭한다.

상기 약제학적 조성물은 다양한 형태가 될 수 있다. 이들은 예를 들어, 액체 용액 (예를 들어, 주사 또는 주입 가능한 용액), 분산제 또는 현탁제, 정제, 환제, 분말제, 리포좀 및 좌약과 같은 액체, 반고체 및 고체 제형을 포함한다. 상기 제형은 목적하는 투여의 방법과 치료적 적용에 따라 달라진다.

통상적인 조성물은 인체에 항체를 투여하기 위해 사용되는 것과 유사한 조성물과 같은 주사 또는 주입 가능한 용액의 형태이다. 통상적인 투여 방법으로 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 투여가 있다. 바람직한 투여 방법으로는 근육 내 또는 피하 주사에 의한 투여이다. 예시적인 투여 경로는 경구 투여, 표피 조직(예, 피부) 또는 점막(예, 눈) 투여, 또는 흡입을 포함한다. 또한 다른 투여 경로가 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 “비경구 투여” 또는 “비경구로 투여되다”라는 문장은 주사에 의한 방법, 및 정맥내, 근육내, 동맥내, 간층(뇌, 척추)내, 포피내, 안와내(intraorbital), 심장내(intracardiac),, 피부내, 복강내, 호흡관내, 피하내, 상피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막오 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 약제학적 조성물의 투여량은 치료 또는 예방되어야 하는 질환의 종류와 심각성에 따라 변화될 수 있다. 임의의 특정 대상에 대하여 특이적 투여계획은 개 인의 필요와 투여하는 사람 또는 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 충분한 시간을 두고 조정되어야 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1: PTD 펩타이드의 제조

본 발명에서 사용되는 펩타이드를 제조하기 위하여 (주)펩트론(대전광역시 유성구 도룡동 385-19)에 주문하여 유기합성법에 의하여 제조하였으며, 제조된 펩타이드는 RP-HPLC를 통해 70% 이상의 순도를 확인하였다. 합성된 펩타이드는 다음과 같다.

Tat_48-60 : GRKKRRQRRRPPQ (서열번호 1)

2Tat_{48 -60} : (GRKKRRQRRRPPQ)₂-K-βA-OH (화학식 2)

4Tat_{48 -60} : (GRKKRRQRRRPPQ)₄-K₂-K-βA-OH (화학식 3)

8Tat_{48 -60} : (GRKKRRQRRRPPQ)₈-K₄-K₂-K-βA-OH (화학식 4)

Mph-1 : YARVRRRGPRR (서열번호 2)

2Mph-1 : (YARVRRRGPRR)₂-K-βA-OH (화학식 5)

4Mph-1 : (YARVRRRGPRR)₄-K₂-K-βA-OH (화학식 6)

8Mph-1 : (YARVRRRGPRR)₈-K₄-K₂-K-βA-OH (화학식 7)

HP4 : RRRRPRRRTTRRRR (서열번호 3)

4HP4 : (RRRRPRRRTTRRRR)₄-K₂-K-βA-OH (화학식 8)

실시예 2: 올리고머화된 PTD의 아데노바이러스 벡터의 전달 효율 증진 효과

올리고머화된 PTD가 아데노바이러스 벡터의 전달 효율의 향상에 효과적인지를 확인하기 위해 자체 생산한 형광 표지 인자인 GFP(Green Fluorescent Protein)를 발현하는 아데노바이러스 벡터인 rAd/EGFP를 이용하였다. 우선 rAd/EGFP를 0.1~300uM의 단량체(서열번호 1, 2 및 3) 및 이량체 PTD(화학식 2 및 5), 0.003~3uM의 사량체(화학식 3, 6 및 8) 및 팔량체 PTD(화학식 4 및 7)와 각각 섞어서 실온에서 30분 정도 둔 후 쥐의 뇌종양 세포인 C6Bu1에 2시간 동안 감염시켰다. 본 실험에서 사용한 농도를 초과하는 PTD의 사용은 매우 낮은 실용성 때문에 실질적으로 의미가 없었다. 감염 시 사용한 아데노바이러스의 양은 100 MOI (multiplicity of infection)이었다. 2시간 후 바이러스 혼합물을 제거하고, DMEM 배양 배지로 갈아준 후 이틀 동안 CO₂ 배양기( CO₂ water Jacketed Incubator, Forma Scientific^TM)에서 배양하고, 감염된 세포를 트립신(trypsin)으로 떼어내어 세포 내 GFP 레벨을 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter, BD)를 이용하여 측정하였다.

그에 대한 결과로 얻은 ‘최대전달효율’과 ‘최적농도’를 도 2에 나타내었다. 단량체와 이량체 PTD의 경우 300uM이하의 농도까지 농도 의존적으로 전달효율이 증가했기 때문에 최대전달효율의 값과 그때의 농도(최적농도)를 결정할 수 없었다. 사량체와 팔량체 PTD의 경우 0.1~0.3uM의 농도에서 유사한 정도의 최대전달효율을 보였다. 한편, 일정농도 하에서 사량체와 팔량체 PTD의 전달효율은 단량체와 이량체 PTD의 전달효율 보다 낮은 수치를 나타냈다. 또한, HP4의 경우에도 사량체 PTD(4HP4)가 단량체 PTD(HP4)보다 낮은 농도에서도 월등히 높은 전달효율을 보였다.

실시예 3: 단량체 PTD 및 올리고머 PTD의 세포독성 비교

PTD가 올리고머화되면서 세포독성이 어떻게 변화하는지 알기 위해 쥐의 뇌종양 세포인 C6Bu1 세포에 0.01~300uM의 단량체 및 이량체 PTD, 0.01~100uM의 사량체 및 팔량체 PTD를 처리한 후 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 PTD 용액을 제거한 후 MTT 용액을 4시간 동안 처리하고, 0.04N 염산/이소프로판올 용액을 실온의 어두운 장소에서 15시간 동안 처리하여 세포를 용해시켰다. ELISA Reader를 이용해 O.D.570값을 측정한 후, 이 값을 아무것도 처리하지 않은 샘플의 값으로 나누어 세포 생존률을 계산하였다.

그에 대한 결과로 얻은 ‘50%의 세포독성을 보이는 PTD의 농도’와 ‘세포독성을 보이지 않는 최대농도’를 도 2에 나타내었다. 그 결과, 팔량체 PTD(8Tat, 8Mph-1)와 하나의 사량체 PTD(4HP4)만이 가용한 농도범위 내에서 50%의 세포독성을 보였다. 하지만 단량체 PTD, 이량체 PTD, 일부의 사량체 PTD(4Tat_{48 -60}, 4Mph-1)의 경우, 실험의 농도 범위 내에서 50% 이하의 세포독성을 보이지 않았기 때문에, 세포독성을 보이지 않는 최대농도를 표시하였다. 또한, 도 2에 표시된 농도 이외의 다른 농도에서도 전반적으로 팔량체, 사량체, 이량체, 단량체 순으로 높은 세포독성을 보였다.

도 2에 나타낸 최대전달효율, 최적농도, 세포독성의 세 가지 요소를 모두 종합해 보았을때 사량체, 팔량체, 이량체, 단량체 순의 우수성을 보였다. 결과적으로, 사량체 PTD가 가장 최적한 형태의 PTD임을 알아냈다.

실시예 4: 올리고머 PTD 에 의한 바이러스 백신의 항암효과 증진

실시예 3의 사량체 PTD가 가장 최적의 PTD라는 결과를 바탕으로, 대표적인 사량체 PTD인 4Tat_{48 -60과} 단량체 PTD인 Tat_{48 -60}를 이용해 동물실험을 수행하였다. 먼저 생쥐 대장암 세포 CT26을 인터류킨-12를 발현하는 아데노바이러스 300MOI로 2시 간 동안 감염시켰다. 이때 아데노바이러스는 세포에 처리하기 전에 상기 2종류의 PTD(300uM의 Tat_{48 -60} 내지 0.3uM의 4Tat_{48 -60})와 섞어 30분 동안 실온에 두었다. 2시간 동안 감염시킨 후 바이러스 혼합물을 제거하고, DMEM 배양 배지로 갈아준 후 4시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양한 후 트립신으로 세포를 떼어내 PBS로 세 번 세척하였다. 이렇게 전이된 CT26 세포를 BALB/c종의 생쥐에 5×10⁵씩 피하주사 하였다. 그 후 약 30일 동안 3일 간격으로 종양의 크기를 측정하였다.

그에 대한 결과로 얻은 시간에 따른 종양의 성장을 도 3에 나타내었다. Tat_{48 -60}보다 4Tat_{48 -60}이 더욱 향상된 인터류킨-12 아테노바이러스의 항암효과를 보였다. 사량체 PTD의 경우 단량체 PTD에 비해 약 250배 정도의 낮은 농도를 사용한 것을 감안한다면 사량체 PTD가 단량체 PTD 보다 질적인 성질뿐만 아니라 양적으로도 우수한 성질을 가진다고 할 수 있다. 따라서 올리고머화된 PTD는 아데노바이러스 항암 백신과 같은 아데노바이러스를 이용한 치료제 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 단백질 전달체 올리고머는 단량체 형태의 단백질 전달체보다 적은 양으로도 세포 내로 아데노바이러스 항암 백신과 같은 바이러스 백신을 전달할 수 있으며, 이에 따라 효과적으로 유전자 치료 및 백신 치료제를 개발할 수 있다.

Claims (11)

1. 단량체 형태의 단백질 전달체(Protein transduction domain; PTD)를 두 개 이상 연결하여 다량체 형태로 올리고머화한 하기 화학식 1로 표현되는 단백질 전달체 올리고머.

   화학식 1

   (PTD)n-branch

   상기 화학식 1에서,

   n은 2 이상의 정수이며,

   브랜치(branch)는 다중 항원 펩타이드(Multiple Antigenic Peptide, MAP), 시스테인 및 펩타이드 링커(peptide linker)로 연결된 캐리어 프로테인(carrier protein)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결자이다.
2. 제1항에 있어서,

   n은 2, 4 또는 8의 정수이며,

   브랜치(branch)는 다중 항원 펩타이드(Multiple Antigenic Peptide, MAP) 또는 시스테인인 단백질 전달체 올리고머.
3. 제2항에 있어서, 단백질 전달체 올리고머가 화학식 2 내지 8로 표현되는 단백질 전달체 올리고머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질 전달체 올리고머.

   화학식 2

   (GRKKRRQRRRPPQ)₂-K-βA-OH

   화학식 3

   (GRKKRRQRRRPPQ)₄-K₂-K-βA-OH

   화학식 4

   (GRKKRRQRRRPPQ)₈-K₄-K₂-K-βA-OH

   화학식 5

   (YARVRRRGPRR)₂-K-βA-OH

   화학식 6

   (YARVRRRGPRR)₄-K₂-K-βA-OH

   화학식 7

   (YARVRRRGPRR)₈-K₄-K₂-K-βA-OH

   화학식 8

   (RRRRPRRRTTRRRR)₄-K₂-K-βA-OH
4. 제3항에 있어서, 단백질 전달체 올리고머가 화학식 3, 6 및 8로 표현되는 단백질 전달체 올리고머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질 전달체 올리고머.

   화학식 3

   (GRKKRRQRRRPPQ)₄-K₂-K-βA-OH

   화학식 6

   (YARVRRRGPRR)₄-K₂-K-βA-OH

   화학식 8

   (RRRRPRRRTTRRRR)₄-K₂-K-βA-OH
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단량체 단백질 전달체가 Tat, Antp, Mph-1, VP22 및 HP4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질 전달체 올리고머.
6. 진핵 또는 원핵세포의 세포질 또는 핵 내로 전달하고자 하는 목적 물질과 결합된 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단백질 전달체 올리고머.
7. 제6항에 있어서, 상기 목적 물질이 바이러스 벡터, DNA, RNA, 단백질, 지방, 탄수화물 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질 전달체 올리고머.
8. 제7항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 백시니아바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스인 단백질 전달체 올리고머.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단백질 전달체 올리고머를 세포 내로 목적 물질을 전달하고자 하는 세포와 혼합 배양 및 접촉시키는 단계를 포함하는, 목적 물질을 세포 내로 전달하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 목적 물질이 바이러스 벡터, DNA, RNA, 단백질, 지방, 탄수화물 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 백시니아바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스인 방법.

Images