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KR20080052512A - 아데노바이러스-무함유 재조합 아데노바이러스 벡터의 급속생산 - Google Patents

아데노바이러스-무함유 재조합 아데노바이러스 벡터의 급속생산 Download PDF

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KR20080052512A
KR20080052512A KR1020077030182A KR20077030182A KR20080052512A KR 20080052512 A KR20080052512 A KR 20080052512A KR 1020077030182 A KR1020077030182 A KR 1020077030182A KR 20077030182 A KR20077030182 A KR 20077030182A KR 20080052512 A KR20080052512 A KR 20080052512A
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KR
South Korea
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adenovirus
influenza
gene
recombinant
promoter
Prior art date
Application number
KR1020077030182A
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English (en)
Inventor
드-추 씨. 탕
지엔펑 장
켄트 알. 밴 캠펜
Original Assignee
박신, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 박신, 인크. filed Critical 박신, 인크.
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Abstract

본 발명은 일반적으로 면역학, 유전자 치료 및 백신 기술 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 복제가능 아데노바이러스(replication-competent adenovirus)(RCA)를 함유하지 않는 고역가(high titer)의 아데노바이러스 벡터를 급속하게 발생시킬 수 있는 신규의 시스템에 관한 것이다. 또한 이러한 RCA-무함유 아데노바이러스 벡터의 발생 방법, 상기 RCA-무함유 아데노바이러스 벡터를 함유하는 면역원성 또는 백신 조성물, 상기 아데노바이러스 벡터 내에 당해 이종 핵산을 발현시키는 방법 및 상기 아데노바이러스 벡터를 이용하여 면역원성반응을 유도하는 방법이 제공된다.
아데노바이러스, 인플루엔자, 면역원성반응, 벡터

Description

아데노바이러스-무함유 재조합 아데노바이러스 벡터의 급속 생산{RAPID PRODUCTION OF ADENOVIRUS-FREE RECOMBINANT ADENOVIRUS VECTORS}
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 2005년 5월 23일 출원된 미국 가출원 제 60/683,638호의 우선권을 주장한다.
2002년 1월 18일 출원된 미국 특허 출원 제10/052,323호, 2002년 4월 5일 출원된 10/116,963호; 2003년 1월 16일 출원된 제10/346,021호 및 미국 특허출원 제6,706,693호; 제6,716,823호; 제5,348,450호 및 1998년 8월 13일 출원된 PCT/US/98/16739호에 대한 언급도 있다.
본 명세서에 인용된 상기 출원, 특허, 및 각각의 문헌, 및 상기 출원, 특허, 및 문헌("문헌 인용 출원") 각각에서 인용된 문헌, 및 본문 또는 출원 및 이의 특허의 진행 동안 문헌 인용 출원에 참고 또는 인용된 각각의 문헌뿐만 아니라, 상기 출원 특허의 진행 동안 진행된 특허성에 관한 모든 논의는, 본원에서 참고인용되어 있다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 면역학, 유전자 치료 및 백신 기술 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 복제가능 아데노바이러스(replication- competent adenovirus)(RCA)를 함유하지 않는 고역가(high titer)의 아데노바이러스 벡터를 급속하게 발생시킬 수 있는 신규의 시스템에 관한 것이다. 또한 이러한 RCA-무함유 아데노바이러스 벡터의 발생 방법, 상기 RCA-무함유 아데노바이러스 벡터를 함유하는 면역원성 또는 백신 조성물, 상기 아데노바이러스 벡터 내에 당해 비상동성 핵산을 발현시키는 방법 및 상기 아데노바이러스 벡터를 이용하여 면역원성 반응을 유도하는 방법이 제공된다.
인플루엔자 바이러스(Influenza virus)는 발생뿐만 아니라 다시 부활하는 공중 보건에 대한 미생물적 위협이다. 바이러스에 의한 기도(氣道)의 감염 일반적으로 기침, 열 및 근육통을 동반한다. 치명적인 인플루엔자 스트레인(strain)의 출현(수바라오(Subbarao) 외, 1998) 및 디자이너(designer) 인플루엔자 바이러스를 발생시키는 기술을 가능하게 하는 것의 개발(호프만 외, 2002; 뉴만(Neumann) 외, 1999)은 치명적인 무기로서 또는 무능화 작용제(incapacitating agent)로서 악의있는 인간의 의도에 의해 외인성 독성을 인코딩(encoding)하는 치명적인 인플루엔자 스트레인 또는 인간이 제조한 바이러스의 접종은 한 지역을 무능화시킬 수 있다는 경고적 신호가 대두되어 왔다. 현재 이용가능한, 임상적으로 허가받은 인플루엔자 백신은 1940년대 초기 이래로 근육 내로 투여된 3가 불활성화 바이러스(trivalent inactivated viruses)로 구성된다(플라이더러(Pfleiderer) 외, 2001). 이러한 백신을 이용하는 매년 가을 예방접종은 이러한 전염성 질병에 대하여 인간을 보호하는데 효과적이다(니콜(Nichol) 외, 1995). 그러나, 백신을 생산하기 위한 수태된 계 란(embryonated chinken egg)에 대한 요구는 백신 생산의 속도에 제한을 가한다. 2004년과 같이 새로운 인플루엔자 바이러스 스트레인이 셀 수 없이 출현하고, 양계 농장이 조류 인플루엔자에 의해 무력화되고/되거나 생산 시설이 오염된 경우에는 인플루엔자 백신의 부족을 생각할 수 있다.
보다 최근에는, 약독화 인플루엔자 바이러스 생백신(live attenuated influenza virus vaccine)(FluMistTM)이 인플루엔자 백신을 위한 바늘 없는 대안으로서 개발되었다. 약독화 생백신은 건강한 어린이, 청소년 및 성인(연령 5-49세)에서 인플루엔자를 예방하기 위해 비강내 분사에 의해 기도로 직접 투여된다. 불활성화 인플루엔자 바이러스 백신처럼, 약독화 인플루엔자 바이러스 생백신은 또한 수태된 계란에서 생산된다. 계란 내에 계육 병원체의 존재가 포름알데히드-사멸성 바이러스 백신에 대해서는 문제가 되지 않는다고 할 지라도, 이는 약독성 인플루엔자 바이러스 생백신에 대하여는 생물학적 위험이다. 약독성 생바이러스와 야생의 인플루엔자 바이러스 사이에서 재조합(recombination)에 의해 발생되는 잠재적으로 유해한 재분류(reassortment)는 또 다른 생물학적 위험에 대한 걱정을 제공한다. 약독성 인플루엔자 생백신의 비강내 접종은 또한 약한 유해증상, 예컨대 콧물, 인후염, 또는 낮은 수준의 발열을 수반한다. 게다가, 약독성 생바이러스는 복제 동안에 기도 상부에 상피 세포를 파괴할 수 있어서, 폐 합병증과 함께 2차 감염을 유발할 수 있다(힐맨(Hillemen, 2002; 마르윅(Marwick), 2000).
수태된 계란 내에서 약독성 인플루엔자 바이러스 생백신 및 불활성화된 인플 루엔자 바이러스 백신을 생산하는 요구가 인플루엔자 백신의 능률적인 제조에 대하여 주된 장애물로 작용하는데, 왜냐하면 가공에 시간이 많이 소요되며 몇몇 인플루엔자 바이러스 스트레인은 계란 내에서 고역가로 증식하지 않기 때문이다(밴 캠펜(Van Kampen) 외, 2005). 사람이 아데노바이러스(Ad)-백터 인플루엔자 백신의 비강내 및 국소 도포에 의해 효율적으로 및 안전하게 면역될 수 있다는 예증은 수태된 계란에 의존하지 않고 신속하게 인플루엔자 백신의 제조에 대한 새로운 접근법을 나타낸다.
Ad 벡터가 유사분열 세포 및 세포분열 이후의 세포 모두의 그 자리에서 형질도입 가능하고, 고역가의 바이러스(ml 당 1011pfu 이상)를 하유하는 스톡(stock)이 제조될 수 있고, 높은 감염비(multiplicity of infection)(MOI)로 세포에 형질도입하는 것이 가능하기 때문에 아데노바이러스는 백신 담체로서 유리하다. 게다가, Ad 벡터는 백신으로서 장기간 이용되어 왔으므로 안전하다. 바이러스는 높은 수준의 이종(heterologous) 핵산 발현을 유도할 수 있으며, 벡터는 다용도로 확장되도록 설계될 수 있다. 비강 백신 담체로서 E1/E3-결여 Ad5 벡터의 효능이 동물 모델 내에 Ad5에 대하여 선재하는(preexisting) 임의의 면역원성에 의해 억제되지 않는다는 결과가 나타나 있다(스(Shi) 외, 2001; 시앙(Xiang) 외, 1996). 또한 Ad5-벡터 비강 인플루엔자 백신과 사람 내에 선재하는 항-Ad5 중화 항체 역가 사이의 관계는 없다(밴 캠펜 외, 2005). 유전자 치료와는 달라, Ad-벡터 백신은 이종조직의 핵산 발현의 임계적 수준을 요구하지 않고도 단계적인 면역학적 반응(immunologic reation)을 통하여 면역반응(immune responce)을 자극한다. 복제-결손(replication-defective) Ad-벡터 비강 인플루엔자 백신은 FluMistTM보다 더 안정해야만 하는데, 왜냐하면 FluMistTM은 기도 내에서 복제되고 다른 순환 스트레인 또는 재조합형을 이용한 유전적 재분열을 통해 새로운 인플루엔자 바이러스 스트레인의 발생에 기여할 수도 있기 때문이다. 게다가, Ad-벡터 인플루엔자 백신의 제조는 수태된 계란을 필요로 하지 않기 때문에 효율적이다.
복제-결손 재조합 Ad 벡터를 제조하기 위한 종래의 접근법은 포유류의 포장세포(packaging cell) 내의 2개의 트랜스펙팅된(transfected) 플라스미드 사이에 상동 재조합을 수반하는 일련의 시간-소요 및 노동력-집중 단계를 요구한다(그래햄(Graham) 및 프리벡(Prevec), 1995). 상동재조합(homologous recombination)이 이. 콜라이(E. coli)에서 수행될 수 있다는 발견(카르티에(Chartier) 외, 1996; 히(He) 외, 1998)은 박테리아 세포 내에서 재조합이 밤새 일어나게 하고, 플라크 정제의 요구를 미연에 방지함으로써 절차를 효율적이게 했다. AdEasy 시스템(히 외, 1998)은 이. 콜라이 내에서 상동재조합에 의한 재조합 Ad를 발생시키는 패스트-트랙(fast-track) 시스템의 좋은 예시가 된다. 도 6을 참조 바란다. 전형적으로, 카나마이신(Kan) 내성을 인코팅하는 선형화된 셔틀벡터(shuttle vector) 플라스미드는 앰피실린(Amp) 내성을 인코팅하는 아데노바이러스성 백본(backbone) 플라스미드(예, pAdEAsy1)와 혼합되고, 이어서 완전한 이. 콜라이 BJ5183 세포로 공동-형질전환된다. 재조합형은 순차적으로 Kan 내성을 위해 선택되고, 제한 엔도뉴클레아 제(endonuclease) 분석과 연계하여 크기에 따라 동정된다. 최종적으로, 재조합형 Ad 벡터는 재조합형 플라스미드를 포유류 포장세포주(예, 293 세포)에 트랜스팩팅하여 제조된다.
AdEasy 시스템에서 이. 콜라이 내에 재조합 벡터의 생산에 있어서 중요한 단계는 셔틀벡터 플라스미드의 전달 이전에 Ad 백본 플라스미드를 사전에 선별함으로써 증강될 수 있다(젱(Zeng) 외, 2001). 대형 플라스미드[pAdEasy1의 크기는 33kb이다(히 외, 1998)]가, 예컨대, 이의 긴 DNA 가닥을 따라 닉(nick)의 발생에 의해 결손될 기회가 많고/많거나 대형 플라스미드를 세포 복제 기계에 연결시키는 효율이 낮을 수 있기 때문에, 작은 단편의 pAdEAsy1 플라스미드 풀이 형질전환 후에도 이. 콜라이 세포 내에 잔존할 수 있다고 생각된다. 이. 콜라이 세포 내에 리플리콘(relicon)으로서 존재할 수 없는 셔틀벡터 플라스미드와 Ad 백본 플라스미드 사이의 상동 재조합(homologous recombination)은 선별용 재조합 플라스미드(selectable recombinant plasmid)를 발생시키는데에는 비효율적인데, 왜냐하면 그러한 재조합형은 비진행성이기 때문이다. 2단계 AdEasier 시스템(젱 외, 2001)은 결손성 및 비-복제성 Ad 백본 플라미드를 미리 제거하고, 이로써 재조합형의 선별 동안 보다 높은 성공율을 가능하게 함으로써 효율적인 방식으로 상동 재조합이 일어날 수 있게 한다(AdEasyTM XL 아데노바이러스 벡터 시스템; Strategies 15(3): 58-59, 2002). 전반적으로, 이러한 2-단계 형질전환 프로토콜(protocol)은 박테리아 내의 상동 재조합과 관련된 시스템에서 광범위하게 이용될 수 있다.
사람의 293 세포에서 발생하는 E1-결손 Ad 벡터에 대한 중대한 문제는 복제가능 아데노바이러스(RCA)의 발생이다. 이러한 오염은 293세포에 의해 드러나는, 동일 서열을 구조화하는 E1 유전자좌(locus)와 벡터 백본 사이의 상동 재조합을 통해 발생한다(로버트(Robert) 외, 2001; 주(Zhu) 외, 1999). RCA는 생물학적 위험을 나타내는데, 왜냐하면 야생형 Ad처럼, RCA는 감염된 숙주 내에서 복제될 수 있고 잠재적으로 질병을 유발할 수 있기 때문이다. RCA-무함유 Ad 벡터는 pAdApt와 같은 PER.C6-친화성 셔틀 플라스미드에서 생성되어왔다(팔락스(Fallaux) 외, 1998). PER.C6 게놈 내에 Ad5 뉴클레오티드 459-3510은 어떠한 오버래핑 서열을 함유하지 않은 pAdApt-기반 셔틀 플라스미드(크루셀(Crucell))를 이용한 이중 교차-유형의 상동 재조합을 저해한다. Ad 스톡 내 RCA를 제거하면 숙주 내에 Ad의 복제에 의해 유발되는 잠재적 암유전자 E1a 및 병인에 대한 노출의 위험을 감소시킨다.
그러나, PER.C6-영향성(amenable) pAdApt-기반 셔틀 플라스미드의 이용은 pAdEasy1과 이. 콜라이 내에서 상동 재조합에 영향을 받지 않는데, 왜냐하면 이. 콜라이의 "레프트 아암(left arm)" 아데노바이러스 서열이 결실되기 때문이다. pAdApt 및 Ad 백본 플라스미드를 PER.C6 세포로 공동-드렌스펙팅(co-transfecting)함에 의한 재조합형 Ad 벡터의 발생(팔락스 외, 1998)은 장시간이 소요되며 노동-집약형이다. 전형적으로, 2-3 사이클의 플라크 정제 없이 이. 콜라이 세포 내에서 상동 재조합이 일어나는 AdEasy 시스템을 이용하여 새로운 Ad 벡터를 생산하는데 대략 1-2개월의 시간이 절약될 수 있다.
결과적으로, 당해 기술분야에는 안전한 인플루엔자 백신을, 바람직하게는 아 데노바이러스 벡터 시스템을 이용하여 급속하게 제조하는 것에 대한 요구가 존재한다. 그러나, 현재 아데노바이러스 벡터, 특히 293 세포와 같은 사람 세포에서 발생한 아데노바이러스 벡터는 주로 RCA의 생산을 통해 질병의 위험을 수반할 수 있다. 본 발명은 아데노바이러스-기반 백신을 급속하게 생산하기 위한 또는 증대된 안전성이라는 추가된 이익을 포함하는 면역성 조성물을 위한 신규의 시스템을 제공함으로써 상기 문제점을 모두 처리한다.
발명의 개요
인플루엔자 백신을 생산하기 위한 급속 생산 시스템은 연례적인 인플루엔자의 발생에 대항한 싸움을 돕기 위해 오랫동안 탐구되어왔다. 치명적인 인플루엔자 스트레인의 발생(수바라오(Subbarao) 외, 1998) 및 생물무기로서 이용될 디자이너 인플루엔자 바이러스의 잠재성(호프만 외, 2002; 뉴만 외, 1999)은 인플루엔자 백신의 급속 생산을 위한 신규의 기법을 개발하는 것에 대한 급박함을 강조하고 있다. 본 발명은 당해 기술분야의 이러한 문제점을 해결하는데, 그 중에서도 신규의 아데노바이러스 벡터 및 이종 핵산을 인코딩하는 RCA(복제가능 아데노바이러스)-무함유 Ad 벡터, 예컨대 인플루엔자 항원(이에 국한되지는 않는다)을 적시에 발생시킴으로써 고역가의 백신을 생산하는 방법을 제공하여 상기 문제점을 처리한다. 본 방법은 수태된 달걀에서 인플루엔자 바이러스를 배양할 필요가 없고(밴 캠펜 외, 2005), 비-복제성 인플루엔자의 비강 스프레이에 의한 투여를 촉진하며(스 외, 2001; 밴 캠펜 외, 2005), 비용뿐만 아니라 생산 시간을 감축한다.
본 발명의 제1양태에 있어서, SEQ ID NO:1을 함유하는 제1 아데노바이러스 서열, 프로모터 서열, 다중 클로닝 부위(MCS), 전사 터미네이터(transcriptional terminator), SEQ ID NO:2를 함유하는 제2 아데노바이러스 서열, SEQ ID NO:4를 함유하는 제3아데노바이러스를 함유하고, 상기 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4는 원핵 세포 내에서 재조합 아데노바이러스 셔틀 플라스미드와 아데노바이러스 백본 플라스미드 사이에 상동 재조합이 일어날 수 있게 하는 오버래핑 서열을 함유하는 것인, 재조합 아데노바이러스 벡터가 제공된다.
일 구체예에서, 프로모터는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)(CMV) 메이저 극초기(major immeadiate-early) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV) 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, 연장인자 1-α(EF1-α) 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터, 헤르페스 바이러스(herpes virus) 프로모터, 라우스 육종바이러스 프로모터, 또는 임의의 기타 진핵 프로모터로 이루어진 그룹에서 선택된다.
전사 터미네이터는 SV40 폴리아데닐화 신호일 수 있거나, 또는 임의의 다른 진핵 폴리아데닐화 신호일 수 있다. 박테리아의 복제원점(origin of replication)은 pBR322 복제원점에서 유도될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 아데노바이러스 셔틀 및 백본 플라스미드 내의 항생제 내성 유전자는 앰피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 블레오마이신 내성 유전자, 및 지오신(zeocin) 내성 유전자로 이루어진 그룹에서 선택된다.
원핵세포는 이. 콜라이, 바람직하게는 이. 콜라이 BJ5183 세포일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 아데노바이러스 셔틀 벡터는 pAdHigh인데, 이는 아데노바이러스 혈청형 5에서 유도된 서열 1-454를 함유하는 제1 아데노바이러스 서열, 프로모터 서열, MCS, 전사 터미네이터, pIX 프로모터를 함유하는 아데노바이러스 혈청형 5에서 유도된 3511 내지 6055 서열을 함유하는 제2 아데노바이러스 서열, 박테리아 복제원점, 및 항생제 내성 유전자를 함유하고, 이때 상기 제1 및 제2 아데노바이러스 서열은 원핵세포 내에서 재조합 아데노바이러스 셔틀 플라스미드와 아데노바이러스 백본 플라스미드 사이에서 상동 재조합을 가능하게 하는 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 제1 아데노바이러스 서열 및 제1 항생제 내성 유전자를 함유하는 제1 셔틀 플라스미드, 및 제1 셔틀 플라스미드에는 존재하지 않는 추가적인 아데노 바이러스 서열을 함유하는 제2 아데노바이러스 서열 및 제1 항생제 내성 유전자와는 상이한 제2 항생제 내성 유전자를 함유하는 제2 셔틀 플라스미드를 원핵세포에 공동-형질전환하는 단계로서, 공동-형질전환은 제1 및 제2 셔틀 플라스미드 사이에서 상동 재조합이 일어나게 하고, 제1 및 제2 셔틀 플라스미드 내에 존재하는 항생제 내성 유전자를 모두 발현하는 원핵 형질전환주(transformant)가 제1의 재조합 아데노바이러스 셔틀 플라스미드를 포함하는 것인, 단계; 원핵세포에서 제1 재조합 셔틀 아데노바이러스 플라스미드(pAdHighβ)를 회수하는 단계; AdHigh 셔틀 플라스미드 및 아데노바이러스 백본 플라스미드를 원핵세포(예, 이. 콜라이 BJ5183)로 공동 형질전환시켜, 원핵 형질전환주가 트랜스유전자(transgene)을 인코딩하는 제2 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 생성하는 것인 단계; 원핵세포에서 상기 제2 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 회수하는 단계; 상기 제2 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 이용하여 PER.C6 세포를 트랜스펙팅하는 단계로서, 재조합 아데노바이러스가 실질적으로 RCA를 함유하지 않는 것인 단계를 포함하는, 실질적으로 복제가능 아데노바이러스(RCA)를 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.
Ad5 서열 459-3510을 함유하는 다른 세포는 또한 AdHigh 시스템으로 RCA-무함유 Ad 벡터를 생산하기 위한 포장세포주으로서 사용될 수 있다.
pAdHigh 셔틀 플라스미드를 생산하기 위한 일 구체예에서, 제1 플라스미드는 pShuttle-CMV이다. 또 다른 구체에에서, 제2 셔틀 플라스미드는 pAdApt이다(하벤가(havenga), 엠. 제이. 외, 2001; von der Thusen, J. H. 외, 2004)
pAdHigh 내에 존재하지만 pShuttleCMV(히 외, 1998) 내에는 결실된 추가적인 아데노바이러스 서열은 아데노바이러스 혈청형 5의 아데노바이러스 뉴클레오티드 342 내지 454 및 아세노바이러스 혈청형 5 유래의 아데노바이러스 뉴클레오티드 3511 내지 3533을 함유한다. 뉴클레오티드 3511-3533 사이의 단편은 아데노바이러스 pIX 프로모터의 일부이다. 기능성 pIX 프로모터의 결핍은 AdEasy 시스템이 PER.C6 세포가 아닌 293 세포에서 높은 역가의 Ad를 발생시키는 이용을 설명하는데, 이는 전자는 pIX를 발현하는 반면, 후자는 그렇지 않기 때문이다.
원핵세포는 이. 콜라이, 바람직하게는 이. 콜라이 BJ5183일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 제1 셔틀 플라스미드가 제1 아데노바이러스 서열을 함유하고 제2 셔틀 플라스미드아데노바이러스는 제1 셔틀 플라스미드에 존재하지 않는 추가적인 아데노바이러스 서열을 함유하는 제1 및 제2 셔틀 플라스미드를 1 이상의 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 분해하는 단계; 제2 셔틀 플라스미드 유래의 추가적 아데노바이러스 서열을 포함하는 절편(fragment)을 절단하는 단계; 상기 절편을 적절한 부위에 삽입하여 제1 셔틀 플라스미드의 대응하는 절편을 대체하고, 이로써 결과적으로 유전적 결함(예, 불완전 pIX 프로모터)를 보유한 제1 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 회복시키는 단계; 제1 아데노바이러스 셔틀 플라스미드(pAdHighα) 및 아데노바이러스 백본 플라스미드를 원핵세포로 공동-형질전환시켜, 원핵 형질전환주가 제2 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 생산하는 것인 단계; 원핵세포에서 제2 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 회수하는 단계; 제2 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 PER.C6 세포에 트랜스펙팅시키는 단계; 및 실질적으로 RCA를 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스를 세포로부터 회수하는 단계를 포함하는, 복제가능 아데노바이러스(RCA)를 실질적을 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 약학적 허용성의 부형제와 함께 혼합물 내에, 1 이상의 당해 이종 핵산을 발현하는 복제가능 아데노바이러스(RCA)를 실질적으로 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스를 함유하는 면역성 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 1 이상의 당해 이종 핵산은 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, 순환 재조합형(circulating recombinant form), 하이브리드형, 임상 분리주(clinical isolate), 및 야외 분리주(field isolate)를 함유한다. 인플루엔자 유전자는 인플루엔자 혈구응집소 유전자, 인플루엔자 매트릭스 유전자, 인플루엔자 뉴라미니다아제(nuraminidase), 및 인플루엔자 핵단백질 유전자를 함유할 수 있다. 면역성 조성물은 추가적으로 보조약을 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 약학적 허용성의 부형제와 함께, 1 이상의 인플루엔자 면역원을 발현하는, 복제가능 아데노바이러스(RCA)를 실질적으로 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스를 함유하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 1 이상의 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 본 발명의 아데노바이러스 벡터 DNA를 분해하고, 이로써 아데노바이러스 벡터를 선형화하는 단계; 프로모터 서열과 작동가능하게(operably) 연결된 1 이상의 이종 핵산을 아데노바이러스 벡터에 접합하는 단계; 아데노바이러스 벡터 DNA를 PER.C6 또는 다른 포장세포로 트랜스펙팅하는 단계; 및 당해 1 이상의 이종 핵산을 발련하는 재조합 아데노바이러스를 세포로부터 회수하는 단계를 포함하는, 복제가능 아데노바이러스(RCA)를 실질적으로 함유하지 않은 재조합 아데노바이러스 내에서 1 이상의 당해 이종 핵산을 발현시키는 방법이 제공된다.
본 발명은 또한, 면역학적으로 유효량의 본 발명의 조성물을 검체에 투여하는 것을 포함하는, 면역원성반응이 요구되는 검체 내에 인플루엔자에 대한 면역원성반응을 유발하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가적으로, 1 이상의 이종 핵산을 발현하는, 복제가능 아데노바이러스(RCA)를 실질적으로 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스를 세포와 접촉시키는 단계, 및 이종 핵산을 발현하기에 충분한 조건 하에서 상기 세포를 배양하거나 또는 상기 세포가 잠복하고 있는 동물을 유지시키는 단계를 포함하는, 당해 세포 내에서 1 이상의 이종 핵산을 도입 및 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 pAdHigh 셔틀 플라스미드, 아데노바이러스 백본 플라스미드, 및 이. 콜라이 BJ5183 세포를 함유하는 키트(kit)를 제공한다.
상기 구체예 및 다른 구체예들이 상세한 설명에 개시되고, 하기의 상세한 설명으로부터 자명해지며, 하기의 상세한 설명에 포함될 것이다.
예시적 방법으로 주어진 하기의 상세한 설명은 본 발명을 설명된 특정 구체예에 한정시키려는 의도가 아니며, 첨부된 도면과 함께, 본원에 참고된 참고인용과 함께 이해될 수 있다.
도 1은 pShuttleCMV 셔틀 플라스미드의 플라스미드 맵이다.
도 2는 pAdApt 셔틀 플라스미드의 플라스미드 맵이다.
도 3은 pShuttleCMV 셔틀 플라스미드와 pAdApt 셔틀 플라스미드 사이의 상동 재조합을 묘사한 것이다. pShuttle-CMV는 카나마이신(Kan) 내성 유전자를 인코팅하고, pAdApt-Tc는 앰피실린(Amp) 및 테트라사이클린(Tc) 내성 유전자를 인코딩한다. 재조합형만이 Kan 및 Tc 모두에 대한 내성이 있다. 플라스미드 내에 개개의 단편은 특정 색상으로 표지되어있고, 특정 색상 범례에 의해 표시된다.
도 4는 pAdHighβ 셔틀 플라스미드의 플라스미드 맵이다.
도 5는 pAdHigh 및 Ad 백본 플라스미드를 이용한 재조합 Ad 벡터의 생산을 묘사하는 전체적 개략도이다.
도 6은 293 세포 및 PER.C6 세포 내에 인플루엔자 HA 유전자를 인코팅하는 AdApt-, AdEasy-, 및 AdHighα-유래 아데노바이러스 벡터의 증식(propagation)을 나타내는 그래프이다.
도 7은 혈구응집-억제 항체 역가를 유도하는데 있어서 AdHighα 및 AdApt-유래 아데노바이러스 벡터의 효율성을 나타내는 그래프이다.
SEQ ID NO:1은 아데노바이러스 혈청형 5의 뉴클레오티드 1 내지 454를 의미한다.
SEQ ID NO:2는 아데노바이러스 혈청형 5의 뉴클레오티드 3511 내지 5796을 의미한다.
SEQ ID NO:3는 아데노바이러스 혈청형 5의 뉴클레오티드 3511 내지 6095를 의미한다.
SEQ ID NO:4는 아데노바이러스 혈청형 5의 뉴클레오티드 34931 내지 35935를 의미한다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에서, "함유하다", "함유하는", "포함하는" 및 "보유한" 및 이와 유사한 표현은 미국특허법에서 이들에 대하여 받아들여지는 의미를 가질 수 있으며, "포함되다", "포함하는" 및 이와 유사한 표현을 의미할 수 있으며; "본질적으로 구성하는" 또는 "본질적으로 구성하다"는 마찬가지로 미국특허법에서 인정하는 의미를 가지며, 용어는 개괄적이어서, 인용된 것이 인용된 것 이상의 존재에 의해 그 기본적 또는 신규의 특성이 변화하지 않는 한, 인용된 것보다는 많은, 그러나 종래 기술의 구체예는 배제하는 것을 의미한다.
"핵산" 또는 "핵산 서열"이라는 용어는 단일- 또는 이중-가닥 형태로 존재하는 데옥시리보핵 또는 리보핵 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이 용어는 공지된 천연 뉴클레오티드의 아날로그를 포함하는, 핵산, 예컨대 올리고뉴클레오티드를 포함하는 개념이다. 이 용어는 또한, 합성 백본을 보유하는 핵산-유사 구조를 포함하며, 이에 대해서는 문헌[Eckstein, 1991; Baserga et al., 1992; Milligan, 1993; WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, 1997; Strauss-Soukup, 1997; Samstag, 1996]을 참조하길 바란다.
본 명세서에서 사용하는, "재조합형"은 생체 외에서 합성 또는 그렇지 않으면 조작된 폴리뉴클레오티드(예, "재조합 폴리뉴클레오티드")를 의미하거나, 재조합 폴리뉴클레오티드를 이용하여 세포 내 또는 기타 생물학적 시스템 내에서 유전자 생성물을 생산하는 방법을 의미하거나, 또는 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드("재조합 단백질")을 의미한다. "재조합형 수단(recombinant means)"는 또한 상이한 공급원 유래의 다양한 코딩 영역 또는 도메인 또는 프로모터 서열을 보유하는 핵산을 발현 카세트(expression cassette) 또는 발현, 예컨대 본 발명의 벡터 내에 폴리펩타이드 코딩 서열의 유도가능 또는 구조적 발현을 위한 벡터를 절단 및 접합하는 것을 또한 포함한다.
핵산에 관하여 이용될 경우, "이종(heterologous)"이라는 용어는 핵산이 자연에서는 정상적으로 존재하지 않는 세포 또는 바이러스 내에 존재하는 것을 나타내거나; 또는, 자연에서 정상적으로 발견되는 바와 같은 상호 동알한 관계에서는 발견되지 않는 2 이상의 서열을 포함하거나, 또는 발현 수준, 또는 세포 내에 다른 핵산 또는 다른 분자와의 물리적 관계 또는 구조가 정상적으로는 자연에서 발견되지 않도록 재조합적으로 설계된 것을 의미한다. 예를 들어, 이종 핵산은 전형적으로 자연에서는 발견되지 않는 방식으로 배열된 비관련 유전자 유래의 2 이상의 서열을 보유하도록 재조합적으로 생성되며; 예를 들어, 사람의 유전자가 본 발명의 아데노바이러스-기반 벡터에 삽입된 프로모터 유전자와 동작가능하게 연결된 것이다. 일례로서, 당해 이종 핵산은 면역성 유전자 생성을 인코딩하며, 이때 아데노바이러스는 백신 또는 백신 조성물로서 치료적으로 또는 예방적으로 투여된다. 이종 서열은 프로모터 및 서열의 다양한 조합을 함유할 수 있으며, 이의 예는 본원에 상세하게 설명되어 있다.
"항원"은 면역 시스템에 의해 인식되고 면역 반응을 유발하는 물질이다. 본문에 이용되는 유사한 용어는 "면역원(immunogen)"이다.
"역위 말단 반복 서열(inverted terminal repeat sequence)" 또는 "ITR"은 아데노바이러스에 관하여 일반적으로 사용되는 의미를 가지며, 기능적으로 동등한 모든 ITR 서열 및 이의 변형을 포함하는데, 예를 들어, 이 용어는 선형 아데노바이러스 게놈을 플랭킹(flanking)(우측 및 좌측)하는 아데노바이러스 게놈 핵산의 복제에 필요한 서열의 집단(모티프(motif))를 의미한다. 본 발명의 벡터 및 벡터 시스템의 Ad 서열은 ITR에 의해 플랭킹되고, 바람직하게는 혈청형 5 아데노바이러스에서 유도된다. 상이한 혈청형의 아데노바이러스 사이에 ITR 내에는 서열 보존도가 높다(참고, 쉬미드(Schimid), 1995).
본 발명의 문맥에서 "검체"는 포유류, 조류, 파충류, 양서류 또는 어류와 같은 척추동물일 수 있으며; 보다 유리하게는 사람, 또는 친근한 동물 또는 식품-생산 또는 사료-생산을 위한 가축 또는 게임 또는 레이싱 또는 스포츠를 위한 동물이 포함되는데, 이에는 소, 개, 고양이, 염소, 양, 돼지, 말, 및 조류가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직하게는 척추동물은 사람이다. 모든 척추동물의 면역 시스템은 유사하게 작동하기 때문에, 설명되는 응용은 모든 척추동물 시스템에 유효할 수 있다.
유전자 또는 핵산의 "발현"은 세포적 유전자 발현뿐만 아니라, 클로닝 시스템 및 임의의 다른 문맥에서도 핵산(들)의 전사 및 번역을 포함한다.
"유전자 생성물"이라는 용어는 주로 기타 핵산(예, tRNA, sRNPs와 같은 비유전자(non-coding) 및 조절 RNA)에 의해 인코딩된 단백질 및 폴리펩타이드를 의미한다.
본 명세서에서 사용하는, "벡터"는 한 환경에서 다른 환경으로 엔티티(entity)의 전달을 가능 또는 촉진하는 도구이다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 이용되는 몇몇 벡터는 DNA의 단편(예컨대, 이종 DNA 단편)과 같은 엔티티가 표적 세포로 전달되게한다. 본 발명에서는 재조합 아데노바이러스 벡터를 포함한다.
"플라스미드"라는 용어는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 이의 재조합, Ad로의 복제, 및 숙주 내 형질전환유전자(transgene)의 발현에 요구되는 원소를 함유하는 DNA 전사 유닛을 의미한다. 초나선형(supercoiled)일 수 있거나 또는 초나선형이 아닐 수 있는 원형 플라스미드 형태가 바람직하다. 선형 형태도 본 발명의 범주에 포함된다.
벡터 내에 발현을 위한 외인성 DNA 및 그러한 외인성 DNA를 제공하는 문헌에 관계하여, 또한 핵산 분자의 발현을 증대시키기 위한 전사 및/또는 번역 요소의 발현과 관련하여, "당해 에피토프(epitope)", "치료적", "면역 반응", "면역학적 반응", "보호적 면역 반응", "면역학적 조성물", "면역원성 조성물", 및 "백신 조성물"에 대하여 199년 11월 23일에 허여된 미국특허 제5,990,091호, 및 WO 98/00166 및 WO 99/60164, 및 상기 문헌에 인용된 문헌 및 상기 특허 및 PCT 출원의 소송에 기록된 문헌이 참고인용되었고, 이들 모두는 본원에 참고인용되었다. 따라서, 미국특허 제5,990,091호 및 WO 98/00166 및 WO 99/60164, 및 상기 문헌에 인용된 문헌 및 상기 특허 및 PCT 출원의 소송에 기록된 문헌, 및 본원에 인용된 기타 문헌 또는 그렇지 않으면 참고인용으로 병합된 문헌은 본 발명의 실시에 있어서 고려될 수 있고; 상기 문헌들에 인용된 모든 외인성 핵산 분자, 프로모터, 및 벡터는 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 이러한 관계에서, 미국특허 제6,706,693호; 제6,716,823호; 제6,348,450호; 미국특허출원 제10,424,409호; 제10/052,323호; 제10/116,963호; 제10/346,021호; 및 PCT/US98/16739로부터 1999년 2월 25일 공개된 WO9908713호도 또한 언급될 수 있다.
본원에서 사용하는, "면역원성 조성물" 및 "면역학적 조성물" 및 "면역원성 또는 면역학적 조성물"은 본 발명의 아데노바이러스 벡터 및 바이러스에서 발현된 당해 이종 핵산에 대하여 면역 반응을 일으키는 임의의 조성물을 말하는데; 예를 들어, 검체에 투여한 후, 당해 표적 면역원 또는 항원에 대하여 면역 반응을 일으 키는 임의의 조성물이 포함된다. "백신 조성물" 및 "백신" 및 "백신 조성물"이라는 용어는 당해 항원(들)에 대하여 보호성 면역 반응을 유발하는 또는 항원에 대항하는 효능적인 보호를 하는 임의의 조성물을 말하는데; 예를 들어, 검체에 투여 또는 주입한 후에; 표적 항원 또는 면역원에 대항하는 보호성 면역 반응을 일으키거나 본 발명의 발명적 아데노바이러스 벡터에서 발현된 항원 또는 면역원에 대항하여 효능있는 보호를 제공하는 임의의 조성물을 포함한다. "약학적 조성물"이라는 용어는 예를 들어, 에리스로포이에틴(EPO) 또는 면역조절 단백질, 예컨대 GM-CSF와 같은 치료 단백질을 발현하는 벡터를 함유하는 임의의 조성물을 의미한다.
"면역학적 유효량"은 검체에 투여될 경우, 당해 유전자 생성물에 대한 면역원성반응을 생성하는 당해 유전자를 인코팅하는 재조합 벡터의 양 또는 농도이다.
"순환 재조합형(circulating recombinant form)"은 2 이상의 아형 또는 스트레인 중에서 유전적 재배열을 거친 재조합 바이러스를 의미한다. 본 발명의 명세서에 사용되는 또 다른 용어는 "하이브리드형"이다.
"임상 분리주"는, 예컨대 감염된 환자에서 분리되고, 고-성장 셔틀 바이러스의 실험실용으로 개조된 마스터 스트레인을 이용하여 실험실 세포 또는 검체 내에서 재발현된 바이러스의 자주 이용된 실험실 스트레인이다.
"야외 분리주"는 감염된 환자 또는 주변환경에서 분리된 바이러스를 의미한다.
본 발명의 방법은 예방 백신으로서 질병을 예방하는데 또는 치료 백신으로서 질병의 증상을 완화시키는데 적절하게 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 백터는 단독으로 또는 면역학적 조성물의 일부로서 검체에 투여될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 단백질의 생체 내 발현에 의해 당해 검체에 단백질을 전달 또는 투여하는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따라 수득된 면역학적 생성물 및/또는 항체 및/또는 발현된 생성물은 시험관 내에서 발현될 수 있고 그러한 면역학적 및/또는 발현된 생성물 및/또는 항체가 전형적으로 이용되는 방법으로 이용되며, 그러한 면역학적 및/또는 발현된 생성물 및/또는 항체를 발현하는 세포가 시험관내 및/또는 생체 외 용도로 이용될 수 있는데, 예를 들어 그러한 이용 및 용도에는 진단, 분석, 생체외 치료(예, 이때 유전자 생성물 및/또는 면역학적 반응을 발현하는 세포는 시험관 내로 확장되며 숙주 또는 동물로 재주입될 수 있다) 등이 포함될 수 있다는 것이 공지되어 있으며, 미국 특허 제5,990,091, WO 99/60164 및 WO 98/00166 및 이에 인용된 문헌을 참고로 할 수 있다. 또한, 본원의 방법으로 분리된, 또는 본원의 투여방법 후 시험관 내에서 확장된 세포에서 분리된 발현된 항체 또는 유전자 생성물은 조성물, 서브유닛 에피토프 또는 항원 또는 치료원(therapeutics) 또는 항체의 투여와 유사한 조성물로 투여하여 면역을 유발하고, 치료 반응을 자극하고/하거나 수동적 면역을 자극할 수 있다.
본원에 사용되는 "아데노바이러스"라는 용어는 아타데노바이러스(Atadenovirus), 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus), 및 아비아데노바이러스(Aviadenovirus) 속이 포함되는 모든 아데노바이러스를 포함하려고 의도되었다. 지금까지, 51종 이상의 아데노바이러스 사람 혈청형이 확인되었다(참고, 문헌 [Fields et al., Virology 2, Ch. 67(3d ed., Lippincott-Raven Publishers)]). 아데노바이러스는 혈청그룹(serogroup) A, B, C, D, E 또는 F 중 하나일 수 있다. 아데노바이러스는 혈청형 2(Ad2), 혈청형 11(Ad11), 혈청형 35(Ad35) 또는, 바람직하게는 혈청형 5(Ad5)일 수 있는데, 그러나 이러한 예에만 국한되지는 않는다.
아데노바이러스는 외피 비보유(non-enveloped) DNA 바이러스이다. 아데노바이러스에서 유도된 벡터는 이들을 유전자 치료에 특히 유용하게 만드는 많은 특징을 보유한다. 본원에서, "재조합 아데노바이러스 벡터"는 1 이상의 이종 뉴클레오티드 서열(예, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 이종 뉴클레오티드 서열)을 운반하는 아데노바이러스 벡터이다. 예를 들어, 아데노바이러스의 생물학은 세부적으로, 아데노바이러스는 심각한 사람 병원체와는 관계가 없다는 것, 바이러스가 숙주 세포에 DNA를 삽입하는 것이 매우 효율적이다는 것, 바이러스는 광범위한 세포를 감염시킬 수 있다는 것과 광범위한 숙주 범위를 보유한다는 것, 바이러스는 상대적으로 용이하게 대량으로 생산될 수 있다는 것 및 바이러스는 바이러스 게놈의 초기 영역 1("E1")에 있어서의 결실에 의해 복제를 결손시킬 수 있다는 것을 특징으로 한다.
아데노바이러스("Ad")의 게놈은 각 가닥의 5' 말단에 공유적으로 결합한 55-kDa의 말단 단백질을 보유하는 대략 36,000베이스 페어("bp")의 선형 이중-가닥 DNA 분자이다. Ad DNA는 약 100bp의 동일한 역위 말단 반복(Inverted Terminal Repeats)("ITRs")을 함유하는데, 이의 정확한 길이는 혈청형에 좌우된다. 바이러스의 복제원점(origin of replication)은 정확히 게놈의 끝에서 ITRs 내에 위치한다. DNA 합성은 2 단계로 일어난다. 먼저, 딸 중복 분자(dauter duplex molecule) 및 부모 치환 가닥을 발생시키는 가닥 치환에 의해 복제가 진행된다. 치환된 가닥은 단일 가닥이고 소위 "팬핸들(panhandle)" 중간체를 형성할 수 있는데, 이는 복제의 개시 및 딸 중복 분자의 발생을 가능하게 한다. 선택적으로, 복제는 게놈의 양 말단에서 동시에 진행될 수 있는데, 이는 팬핸들 구조의 형성에 대한 요구를 미연에 방지한다.
생산적 감연 사이클 동안에, 바이러스 유전자는 2시기로 발현된다: 바이러스 DNA 복제까지의 기간인 초기(early phase) 및 박이러스 DNA 복제의 개시와 동시에 일어나는 후기(late phase). 초기 동안에는, 영역 E1, E2, E3 및 E4에 의해 인코딩된 초기 유전자 생성물만이 발현되고, 이는 바이러스 구조 단백질의 합성을 위한 세포를 준비하는 다양한 기능을 수행한다(버크 에이.제이.(Berk, A.J.), 1986). 후기 동안에는, 초기 유전자 생성물 이외에도 후기 바이러스 유전자 생성물이 발현되고 숙주 세포 DNA 및 단백질 합성은 마감된다. 결과적으로, 세포는 바이러스 DNA 및 바이러스 구조 단백질의 생성에만 전념하게 되는 것이다(토즈, 제이.(Tooze, J.), 1981).
아데노바이러스의 E1 영역은 표적 세포의 감염 이후에 발현된 아데노바이러스의 최초 영역이다. 이러한 영역은 E1A 및 E1B 유전자인 2개의 전사 유닛으로 구성되는데, 양자는 초대(배아) 설치류 배양의 암유전자 형질전환에 요구된다. E1A 유전자 생성물의 주요 기능은 세포 사이클에 진입하고 세포 DNA 합성을 재개하기 위하여 정지세포를 유발시키고, 바이러스 게놈의 E1B 유전자 및 다른 초기 영역(E2, E3 및 E4)을 전사적으로 활성화시키는 것이다. E1A 유전자만을 이용한 1차 세포의 트랜스펙션은 비제한적인 증식(불멸화)을 유발할 수 있으나, 완전한 형질전환을 나타내지는 않는다. 그러나, 대부분의 경우 E1A의 발현은 프로그램화된 세포 사멸(아포토시스(apotosis))의 유발을 초래하고, 다만 때때로 불멸화가 수득된다(조켐센(Jochemsen) 외, 1987). 아포토시스의 유발을 예방 및 완전한 형태학상의 형질전환이 일어나게 하기 위하여 E1B 유전자의 공동-발현이 요구된다. 구축된 불멸화 세포주에 있어서, E1A의 고도 발현은 E1B의 부존재하에서 완전한 형질전환을 유발할 수 있다(로버츠(Roberts) 외, 1981).
E1B로 인코딩된 단백질은 바이러스 복제를 가능하게 하는 세포 기능을 재배향(redirecting)하는데 있어서 E1A를 보조한다. 핵산에 필수적으로 배치된 복합체(complex)를 형성하는 E1B 55kD 및 E4 33 kD 단백질은 숙주 단백질의 합성을 억제 및 바이러스 유전자의 발현을 촉진하는 기능을 한다. 이들의 주된 영향은 후기 감염의 발생과 동시에, 핵산에서 사이토플라즘(cytoplasm)까지 바이러스 mRNA의 선택적 수송을 확립하는 것이다. E1B 21kD 단백질은 생산적 감염 사이클의 정확한 일시적 제어를 위해 중요한데, 이로써 바이러스의 라이프 사이클이 완료되기 전에 숙주 세포의 영구적인 사멸을 예방한다. E1B 21 kD 유전자 생성물을 발현할 수 없는 돌연변이 바이러스는 숙주 세포 크로모좀 DNA(deg-표현형)의 과량의 분해 및 증강된 세포변성 효과(cytophatic effect)(cyto-표현형; 텔링(Telling) 외, 1994)와 동반하는 단축된 감염 사이클을 나타낸다. deg 및 cyt 표현형은 E1A 유전자가 또한 돌연변이화될 경우 억제되고, 이러한 표연형이 E1A의 기능이라는 것을 나타낸다(화이트(white) 외, 1998). 또한, E1B 21 kDa 단백질은 E1A가 다른 바이러스 유전자를 자극함으로써 속도를 감소시킨다. E1B 21kD이 상기 E1A 의존 기능을 어떤 기전으로 억제하는지는 아직 알려지지 않았다.
예를 들어, 레트로바이러스(retrovirus)와는 대조적으로, 아데노바이러스는 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않고, 비-분열 세포를 감염시킬 수 없으며, 생체내에서 재조합 유전자를 효율적으로 전달할 수 있다(브로디(Brody) 외, 1994). 이러한 특징은 아데노바이러스가, 예컨대 당해 이종 핵산을 세포, 조직 또는 아데노바이러스가 요구되는 검체로의 생체내 유전자 전달을 위한 매력적인 후보자로 되게한다.
아데노바이러스 재조합형을 이용하는 본 발명의 구체예는 E1-결손 또는 결실, E3-결손 또는 결실, 및/또는 E4-결손 또는 결실 아데노바이러스 벡터, 또는 모든 바이러스 유전자가 결실된 "유전자미함유(gutless)" 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 아데노 바이러스 벡터는 E1, E3, 또는 E4 유전자에 돌연변이를 함유할 수 있거나, 상기 또는 모든 아데노바이러스 유전자에 결실을 함유할 수 있다. E1 돌연변이는 벡터의 안전마진(safety margin)을 증가시키는데, 왜냐하면 E1-결실 아데노바이러스 돌연변이는 복제 비허용(non-permissive) 세포 내에 복제-결손이고, 적어도 매우 약화될 것이기 때문이다. E3 돌연변이는 아데노바이러스가 MHC I형 분자를 하향조절하는 기전을 혼란시킴으로써 항원의 면역성을 증대시킨다. E4 돌연변이는 후기 유전자 발현을 억제함으로써 아데노바이러스 벡터의 면역성을 감소시키고, 이로써 동일한 벡터를 이용하는 반복 재-예방접종을 가능하게 한다. 본 발명은 E1, E3, E4, E1 및 E3, 및 E1 및 E4에서 결실 또는 돌연변이된 임의의 혈청형 또는 혈청그룹의 아데노바이러스 벡터도 포함한다. 본 발명은 또한 사람 Ad5 스 트레인의 아데노바이러스도 포함한다.
"유전자 미함유" 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터 족에서 최근의 모델이다. 이를 복제하려면 Ela 및 Cre를 모두 발현하는 헬퍼 바이러스 및 특정 사람 293 세포, 자연 환경에서는 존재하지 않는 조건이 요구되며; 벡터는 모든 바이러스 유전자를 빼앗겨, 이로써 백신 담체로서 벡터가 비-면역성이고, 재-예방접종을 위해 복수의 횟수로 접종될 수 있다. "유전자 미함유"아데노 바이러스 벡터는 또한 당해 이종 핵산(들)을 수용하기 위한 36kb 공간을 포함하고, 이로써 대량의 항원 또는 면역원을 세포로 공동-운반을 가능하게 한다.
당해 기술분야에 공지된 다른 아데노바이러스 벡터 시스템에는 AdEasy 시스템(히 외,1998) 및 후속적으로 개조된 AdEasier 시스템(젱 외, 2001)이 포함되는데, 이들은 셔틀 플라스미드와 Ad 백본 플라스미드 사이의 상동 재조합이 에쉐리히아 콜라이 세포 내에서 밤새 일어나게 함으로써 급속하게 293 세포 내에서 재조합 Ad 벡터를 발생시키도록 개발되었다. 그러나, 사람에 적용할 경우 잠재적인 생물학적 위험을 나타내는 낮은 수준의 RCA가 293 세포 내에서 생산된 Ad 벡터를 오염시킨다. RCA의 생성은 Ad 벡터와 293 세포 게놈 사이의 오버래핑 서열에 기인한다(팔락스 외, 1998; 주 외, 1999).
RCA-무함유 Ad 벡터가 PER.C6 게놈과 오버래핑된 서열을 함유하지 않는 PER.C6-융화성 셔틀 플라스미드와 함께 Ad 백본 플라스미드를 트랜스펙팅 한 후에 PER.C6 세포 내에서 발생된다고 할 지라도(팔락스 외, 1998), 사람 세포를 배경으로 상동 재조합을 통한 Ad 벡터의 생산 방법은 이. 콜라이 세포 내에서 AdEasy 재 조합 시스템을 이용하는 경우보다 시간이 더 소요된다. AdEasy-유래의 Ad 벡터는 PER.C6 세포에서 급속하게 발생될 수 있으나, 이러한 방법은 낮은 역가[<108 플라크-형성 유닛(pfu)/ml]를 생성하는데, 이는 아마도 PER.C6 포장세포주에 의한 수송 중 보충되지 않는 pShuttleCMV 내에 결손 서열때문인 듯 하다(히 외, 1998).
RCA-무함유 Ad-벡터 인플루엔자 백신의 급속 및 고-역가의 생산은 pShuttleCMV 내에 결손 서열을 보완하여 본 발명의 구체예에서 정의된 신규의 셔틀 플라스미드, 즉 pAdHigh를 발생시킴으로써 달성될 수 있다. Ad-벡터 인플루엔자 백신은 AdEasy 만큼 급속하게 AdHigh에서 발생될 것으로 예상되는데, 왜냐하면 양 시스템 내에 셔틀 플라스미드는 이. 콜라이 백그라운드, 바람직하게는 이. 콜라이 BJ5183 내에서 아데노바이러스 백본 플라스미드 pAdEasy1(히 외, 1998)과 상동 재조합을 위한 동일한 성분을 함유하기 때문이다.
pAdEasy1는, 당해 이종 핵산을 발현하는 pShuttle-CMV 및 pAdHight와 같은 셔틀 플라스미드로 재조합될 경우, 아데노바이러스 캡시드(cpasid)로 포장된 이종 핵산(예, 면역원 및/또는 치료 유전자)을 인코팅하는 E1/E3-결손 아데노바이러스 게놈을 발생시킨다. pAdEasy1의 서열은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며 스트라타젠(Stratagene)을 통하여 공공연하게 및 상업적으로 입수가능하다. AdEasy-유래 Ad 벡터와는 대조적으로, AdHigh-유래 Ad 벡터는 PER.C6-융화성 벡터-유래의 대응물의 역가만큼 높은 역가를 전파하며, PER.C6 세포에서 생산될 경우 RCA 오염을 회피하는데, 이는 AdHigh-유래 Ad 벡터 내에 Ad 서열이 PER.C6-융화성 셔틀 플라스미 드 pAdApt에서 발생된 이들의 대응물과 동일하기 때문이다(크루셀(Crucell); 네덜란드 라이덴).
본 발명은, 아데노바이러스 서열의 서브절편(subfragment) 및 제1 항생제 내성 유전자를 함유하는 제1 셔틀 플라스 미드 및 제1 셔틀 플라스미드에는 존재하지 않는 아데노바이러스 서열을 함유하는 아데노바이러스 서열의 서브절편 및 제1 항생제 내성 유전자와는 상이한 제2 항생제 내성 유전자를 함유하는 제2 셔틀 플라스 미드를 원핵세포로 형질도입하는 단계를 포함하는, RCA-무함유 Ad 벡터의 생산에 적용될 수 있는 신규의 아데노바이러스 셔틀 플라스미드의 생산 방법이 제공된다. 이러한 방법에 있어서, pAdHigh는 RCA-뮤함유 아데노바이러스를 발생시키는데 필요한 아데노바이러스 서열을 함유하는 2종의 셔틀 플라스미드의 상동 재조합에 의해 발생된다.
제1 셔틀 플라스미드는 pShuttleCMV일 수 있고, 또는 또 다른 플라스미드에서 유래한 아데노바이러스 서열과의 상동 재조합에 유용한 아데노바이러스 서열을 함유하는 또 다른 셔틀 플라스미드일 수 있다. pShuttleCMV는 상업적으로 입수가능하고, 이의 서열은 공공영역에 존재한다(히 외, 1998). pShuttleCMV는 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결된, 1 이상의 당해 이종 핵산을 삽입하는데 이용되는 다중 클로닝 부위를 함유한다. pShuttleCMV는 또한 카나마이신 내성 유전자를 함유한다.
제1 셔틀 플라스미드에는 존재하지 않는 추가적인 아데노바이러스 서열을 함유하는 아데노바이러스 서열의 서브절편을 함유하는 제2 셔틀 플라스미드는 pAdApt일 수 있다(팔락스 외, 1998; 폰 데어 추센, 제이. 에이취. 외, 2004; 하벤가, 엠. 제이., 2001). pAdApt와 같은 제2 셔틀 플라스미드 내에 존재하는 추가 서열에는 Ad5 유래의 서열이 포함될 수 있으나, 또한 다른 아데노바이러스 혈청형 유래의 서열을 함유할 수 있다. 이러한 서열은 Ad5 유래의 아데노바이러스 서열 1 내지 454와 상응하는 SEQ ID NO:1, 및 Ad5 유래의 아데노바이러스 서열 3511 내지 6095와 상응하는 SEQ ID NO:3를 함유한다. 본 발명은 또한 Ad2, Ad7, Ad11, 및 Ad35가 포함되나, 이에 국한되지 않는 다른 아데노바이러스 혈청형 유래의 상응하는 서열의 이용도 포함한다. 당업자는 BLAST(알츠철(Altschul), 에스.에프. 외, 1990)와 같은 서열 정렬 방법과 친숙할 것인데, 상기 방법은 다른 아데노바이러스 혈청형 또는 혈청그룹 내에 적절한 서열을 확인할 수 있다. 이러한 서열 또는 이의 서열의 변형을 함유하는 임의의 셔틀 플라스미드가 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.
본 발명은 상기 설명한 바와 같은 제1 및 제2 셔틀 플라스미드의 상동 재조합에 의해, 또는 제2 셔틀 플라스미드 유래의 추가적인 아데노바이러스 서열을 절단하고 접합에 의해 상기 서열을 제1 셔틀 플라스미드로 삽입함으로써 재조합된 아데노바이러스 플라스미드를 발생시키는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명은 제1 아데노바이러스 서열 및 제1 항생제 내성 유전자를 함유하는 제1 셔틀 플라스미드 및 제1 셔틀 플라스 미드에는 존재하는 않는 추가적인 아데노 바이러스 서열을 함유하는 제2 셔틀 플라스미드를 1 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 분해하고, 제1 셔틀 플라스미드에 추가적인 아데노바이러스 서열을 삽입하여, 이로써 제1 재조합 아데노바이러스 셔틀 플라스미드 pAdHighα를 수득함으로써, pAdHigh를 생산하는 방법을 제공한다. 당업자는 과도한 실험 없이도, 핵산 클로닝 및 매니퓰레이 션(manipulation) 방법에 친숙할 것이다.
플라스미드의 회수는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 원핵 형질전환주의 라이시스(lysis)(그러한 방법에는 프렌치 프레스(French press), 알칼라인 라이시스, 질소 공동현상(cavitation)이 포함되나, 이에 국한되지는 않는다) 및 염화세슘 원심분리, 에탄올 침전, 컬럼 크로마토그래피(예, Qiagen prep) 등에 의한 플라스미드의 정제에 의해 달성될 수 있다. 세포를 트랜스펙팅하는 방법이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 그러한 방법은 인산칼슘 침전, 양이온성 지질, 리포좀, 마이크로인젝션, 및 바이러스 전달에 의한 감염의 이용을 포함한다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 핵산을 세포로 생체외 및 생체내로 전달하는데 모두 유용하다. 특히, 본 발명의 벡터는 핵산을 동물, 보다 바람직하게는 포유류 세포에 운반 또는 전달에 유리하게 이용될 수 있다. 당해 핵산에는 펩타이드 및 단백질, 바람직하게는 치료(예, 의료용 또는 수의학용) 또는 면역원성(예, 백신) 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 핵산이 포함된다.
바람직하게는 당해 이종 핵산을 인코딩하는 코돈(codon)은 "인간화된(humanized)" 코돈인데, 예를 들어, 상기 코돈은 예컨대 인플루엔자에 의해 종종 이용되는 코돈 대신에 상당히 발현된 인간유전자에 빈번하게 나타나는 코돈이다. 그러한 코돈의 이용은 사람 또는 다른 동물 세포 내에 이종 핵산의 효율적인 발현을 제공한다. 코돈 이용 패턴은 많은 종의 상당히 발현된 유전자에 대한 문헌에 공지되어있다(예, 나카무라(Nakamura) 외, 1996; 왕(Wang) 외, 1998; 맥이완(McEwan) 외, 1998).
추가적인 대안으로서, 아데노바이러스 벡터는 배양 중인 세포 또는 동물을 감염시켜 원하는 유전자 생성물을 발현시키는데 이용되는데, 예를 들어 당해 단백질 또는 펩타이드를 생산하는데 이용된다. 바람직하게는, 단백질 또는 펩타이드는 배지에 분비되고 당해 기술분야에 알려진 전형적인 기법을 이용하여 배지로부터 정제될 수 있다. 단백질의 세포외 분비를 지시하는 신호 펩타이드 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있고 동일한 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야에 알려진 전형적인 기법에 의해 당해 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 세포는 용해될 수 있으며, 발현된 재조합 단백질은 세포 용해물에서 정제될 수 있다. 세포는 진핵세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 동물 세포(예, 곤충, 조류 또는 포유류)이고, 보다 바람직하게는 포유류 세포이다. 또한 아데노바이러스에 의한 형질도입을 수행할 수 있는 세포도 바람직하다.
그러한 세포에는 PER.C6 세포, 911 세포, 및 HEK293 세포가 포함된다. PER.C6 세포는 RCA-무함유 Ad 벡터를 증식시키는 PER.C6 세포의 능력 때문에 유용하다. PER.C6 세포는 복제-불완전 아데노바이러스의 생성을 보완하지만, 상동 재조합에 의한 RCA의 발생을 방지하도록 고안된 E1 유전자 단편으로 형질도입된 1차 사람 망막아세포(retinoblast cell)이다. PER.C6는 1997년 1월 3일 공개된 WO97/00326에 설명되어 있으며, 상기 공부의 내용은 본원에 참고인용되어 있다. 추가적으로, HEK 293 세포(그래햄 외, 1997)도 RCA를 생성하는 본 발명의 아데노바이러스 서열과 재조합될 수 있는 오버래핑 서열을 운반한다는 것은 이해되어야 한다.
본 발명은 또한 백신으로서 유용한 벡터를 제공한다. 면역원 또는 항원은 아데노바이러스 캡시드에 존재할 수 있고, 선택적으로 항원은 재조합 아데노바이러스 게놈으로 주입된 이종 핵산에서 발현될 수 있으며 본 발명의 아데노바이러스에 의해 운반될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 임의의 당해 면역원을 제공할 수 있다. 당해 면역원은 당해 기술분야에 잘 알려져있으며, 사람 면역결핍 바이러스(예컨대, gp160, gp120, gp41과 같은 피막 단백질), 인플루엔자 바이러스, 구역 단백질(gag protein), 암 항원, HBV 표면 항원(간염에 대한 면역), 광견병 당단백질, 및 이들의 유사체가 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다. 면역원의 추가적인 예는 본원에 상세히 설명되어 있다.
이종 뉴클레오티드 서열(들)은 바람직하게는 적절한 발현 제어 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. 발현 벡터에는 발현 제어 서열, 예컨대 복제원점(박테리아의 원점일 수 있는, 예컨대 pBR322, 또는 진핵 원점, 예컨대 자발적 복제 서열(ARS)에서 유래될 수 있는), 프로모터, 인핸서(enhancer), 및 필요한 정보 처리 부위, 예컨대 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스(splice) 부위, 폴리아데닐화 부위, 포장 신호 및 전사 터미네이터 서열이 포함된다.
예를 들어, 바람직하게는, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터는 표적 세포에 전달될 이종 핵산 서열(들)과 작동가능하게 연결된, 적절한 전사/번역 제어 신호 및 폴리아데닐화 신호(예, 송아지 성장 호르몬에서 유래한 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호)를 함유한다. 다양한 프로모터/인핸서 원소가 원하는 발현 수준 및 조직-특이 발현에 따라 이용될 수 있다. 프로모터는 원하는 발현 패 턴에 따라 구조화될 수 있거나 유도될 수 있다(예, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터). 프로모터는 내재성 또는 외래성일 수 있고, 천연 또는 합성 서열일 수 있다. 외래성이란, 전사 개시 영역이 주입되는 야생형 숙주 내에서 전사 개시 영역이 발견되지 않는 것을 의미하는 것이다. 프로모터는 당해 표적 세포(들) 또는 조직(들)에서 기능하도록 선택된다. 뇌-특이성, 간-특이성, 및 근육-특이성(골격근, 심장근, 평활근(smooth) 및/또는 횡경막-특이성) 프로모터가 본 발명에서 고려된다. 포유류 프로모터도 또한 바람직하다.
프로모터는 유리하게는 "초기" 프로모터이다. "초기" 프로모터는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 최초 단백질 합성의 부존재하에 급속하게 및 과도하게 발현되는 유전자의 발현을 유도하는 프로모터로서 정의된다. 프로모터는 또한 "강한" 또는 "약한" 프로모터일 수 있다. "강한 프로모터" 및 "약한 프로모터"라는 용어는 당해 기술분야에 아려져 있으며, 프로모터에서 전사 개시의 상대적 빈도(1분당 횟수)로 정의된다. "강한" 또는 "약한" 프로모터는 또한 수두바이러스 RNA 폴리머라제(plymerase)에 대한 친화성으로 정의될 수 있다.
보다 바람직하게는, 이종 뉴클레오티드 서열(들)은 예컨대 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 메이저 즉시-초기 프로모터, 시미안 바이러스40(SV40) 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, 연장인자(enlongation factor) 1-α(EF1-α) 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터 또는 라우스육종 바이러스 프로모터와 자동가능하게 연결된다. 다른 발현 제어 서열에는 면역글로불린 유전자, 아데노바이러스, 송아지 유두종바이러스, 헤르페스 바이러스에서 유도된 프로모터가 포함된 다. 임의의 포유류 바이러스 프로모터도 또한 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. CMV 프로모터를 이용한 이종 뉴클레오티드 전사를 유도하는 것이 면역생성능력 동물에서 발현의 하향-조절을 초래한다는 것이 추측되어왔다(예, 구오(Guo) 외, 1996). 따라서, 이종 핵산 발현의 상기 하향-조절을 추래하지 않는 변형 CMV 프로모터를 이용하여 이종 뉴클레오티드 서열을 작동가능하게 연결시키는 것도 또한 바람직하다.
본 발명의 벡터는 또한 다중 클로닝 부위("MCS")를 함유할 수 있는데, 이는 유리하게도 제1 프로모터의 다운스트림에 위치될 수 있다. MCS는 프로모터 서열과 함께 "프레임 내에" 존재하는 이종 핵산 분자의 삽입을 위한 부위를 제공하여, 당해 이종 핵산에 프로모터 서열을 "작동가능하게 연결"시킨다. 다중 클로닝 부위는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본원에서 사용하는 "작동가능하게 연결된"이란 용어는 설명된 성분이 이들의 원하는 방식으로 기능하게 하는 관계로 존재하는 것을 의미한다.
벡터에 따라, 재조합 벡터의 시험관 내 증폭 및 정제에 이용될 경우 항생제 내성을 인코딩하는 선별성 마커(marker)가 존재할 수 있으며, 이는 셔틀 플라스미드와 아데노바이러스 벡터 사이의 상동 재조합을 모니터하기 위해 존재할 수 있다. 본 발명의 방법은 오버래핑 서열에서 셔틀 플라스미드와 아데노바이러스 벡터 사이의 상동 재조합을 촉진시키는 것을 설명하고 있다. 각 벡터는 상이한 항생제 내성 유전자를 함유하며, 이중 선별에 의해, 재조합형을 발현하는 재조합 벡터가 선별된다. 본 발명의 벡터에 혼합될 수 있는 그러한 항생제 내성 유전자의 예에는 앰피실 린, 테트라사이클린, 네오마이신, 지오신, 카나마이신, 블레오마이신(bleomycin), 하이그로마이신, 클로람페니콜 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
1 이상의 이종 뉴클레오티드 서열이 존재하는 구체예에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 단일 업스트림 프로모터 및 1 이상의 다운스트림 내부 리보좀 진입 부위(IRES) 서열(예, 피코르나바이러스 EMC IRES 서열)과 작동가능하게 연결될 수 있다.
이종 뉴클레오티드 서열(들)이 전사되고, 이후 표적 세포에서 번역되는 본 발명의 구체예에서, 특이적 개시 신호는 일반적으로 삽입된 단백질 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 요구된다. ATG 개시 코돈 및 인접 서열이 포함될 수 있는 상기 외인성 전사 제어 서열은 천연 및 합성의 다양한 원점일 수 있다.
치료 펩타이드 및 단백질에는 낭포성섬유종 트랜스멤브레인(Transmembrane) 조절 단백질(CFTR), 다이스트로핀(dystrophin)(다이스트로핀 미니-유전자의 단백질 생성물도 포함, 예컨대 빈센트 외, 1993 참조), 유트로핀(Utrophin)(틴슬리(Tinsley) 외, 1996), 응고인자(예, 인자 XII, 인자 IX, 인자 X, 등), 에리스로포이에틴(erythropoietin), LDL 수용체, 리포단백질 리파아제, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(transcarbamylase), β-글로불린, α-글로불린, 스펙트린, α-안티트립신, 아데노신 디아미나아제, 하이포잔틴 구아닌 포르포리보실 트랜스퍼라아제, β-글루코세레브로시다아제(β-glucocerebrosidase), 스핑고마이엘리나아제(sphingomyelinase), 리소좀 헥소사미니다아제(lysosomal hexosaminidase), 분지쇄 케토산 디하이드로지나아제(branched-chain keto acid dehydrogenase), 호르몬, 성장인자, 사이토킨(cytokine), 자살 유전자 생성물(suicide gene products)(예, 티미딘 키나아제(thymidine kinase), 사이토신 디아미나아제(cytosine deaminase), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 및 종양 괴사 인자), 암치료에 이용되는 약물에 내성을 부여하는 단백질, 종양 억제 유전자 생성물(예, p53, Rb, Wt-1 ), 및 이를 필요로하는 검체 내에 치료 효과를 보유하는 임의의 기타 펩타이드 또는 단백질이 포함되나, 이에 국한되지는 않는다.
본 발명에 의해 제공되는 재조합 벡터는 또한 면역조절 분자를 위해 코딩될 수 있는데, 이는 체액성 및/또는 세포 면역원성반응을 자극하는 보조약으로서 작용할 수 있다. 그러한 분자에는 사이토킨, 공동-자극성 분자, 또는 면역반으의 경로를 변화시킬 수도 있는 임의의 분자가 포함된다. 분자(들)은 그러한 면역조절 분자를 인코팅하는 유전자를 함유하는데, 이에는, 예컨대 GM-GSF 유전자, B7-1 유전자, B7-2 유전자, 인터루킨-2 유전자, 인터루킨-12 유전자 및 인터페론 유전자가 포함되나 그에 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 외인성 핵산 분자가 1 이상의 항원 또는 이의 부분, 예컨대 병원체 유래의 1 이상의 당해 에피토프, 예컨대, 알러지 반응을 개질하는 에피토프, 항원 또는 유전자 생성물, 예컨대, 생리학적 기능을 개질하는 에피토프, 항원 또는 유전자 생성물, 인플루엔자 혈구응집소, 인플루엔자 핵단백질, 인플루엔자 M2, 파상풍 독소 C-절편, 탄저균 보호 항원, 탄저균 치사 요인, 광견병 당단백질, HBV 표면 항원, HIV gpl20, HIV gpl60, 사람 암배항원(human carcinoembryonic antigen), 말라리아 CSP, 말라리아 SSP, 말라리아 MSP, 말라리아 pfg, 및 미코박테 리움 튜버쿨로시스(mycobacterium tuberculosis) HSP; 및/또는 치료원 또는 면역조절 유전자, 공동-자극성 유전자 및/또는 사이토킨(cytokine) 유전자를 인코딩하는 그러한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 재조합 벡터는 인플루엔자 면역원 또는 항원을 인코딩 또는 발현시키는 핵산 분자를 발현한다. 특히, 생성물을 인코딩하는 인플루엔자의 임의의 또는 모든 유전자 또는 해독틀(open reading frame)(ORFs)이 분리, 특성화 및 벡터 재조합형으로 삽입될 수 있다. 바람직한 인플루엔자 유전자 또는 ORFs에는 혈구응집소, 핵단백질, 매트릭스, 뉴라미니다아제(neuraminidase)가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 수득된 재조합 아데노바이러스 벡터는 검체를 면역화하거나 또는 접종하기 위해 이용된다.
본 발명은 또한 인플루엔자에 대한 면역원성반응을 유도하는 방법을 제공한다. 인플루엔자는 전세계적으로 심각한 호흡기 질환을 유발하는 외피보유, 단일-가닥, 음성-극성(negative-sense) RNA 바이러스이다. 이는 오로쏘믹소바이러스과 족(Orthomyxoviridae family)의 유일한 일원이고, A, B, 및 C 세종류의 아형으로 구분된다. 인플루엔자 비리온(virion)은 단일-가닥 RNA 게놈을 함유하는 내부 리보뉴클레오단백질 핵(나선형 뉴클레오단백질) 및 매트릭스 단백질(M)에 의해 내부에 라이닝된 외부 리포단백질 표피로 구성된다. 인플루엔자 A의 단편화된 게놈은 선형, 음성 극성, 단일-가닥 RNA의 8종 분자(7종은 인플루엔자 C에 대한 것이다)로 구성되는데, 이 RNA는 RNA-지향 RNA 폴리머라아제 단백질(PB2, PB1 및 PA) 및 뉴클레오캡시드를 형성하는 핵 단백질(NP)가 포함되는 10종의 폴리펩타이드; 매트릭스 단백질(M1, M2); 리포단백질 표피에서 돌출된 2표면의 당단백질: 혈소응집바이러스(HA) 및 뉴라미니다아제(NA); 및 기능이 밝혀지지 않은 비구조적 단백질(NS1 및 NS2)을 인코딩한다. 전사 및 게놈의 복제는 핵 내에서 일어나고, 조립(assembly)은 혈장 맴브레인 상의 버딩(budding)을 통해서 일어난다. 바이러스 유전자는 혼합된 감염 동안 재배열될 수 있다(예, 상동 재조합을 거칠 수 있다).
인플루엔자 바이러스는 HA를 통해 세포 맴브레인 당단백질 및 당지질 내에 시알릴올리고당(sialyloligosaccharide)에 흡착된다. 비리온의 엔도사이토시스(endocytosis) 후에, 맴브레인의 융합을 촉진하고 이로써 해체(uncoating)를 유발하는 세포 엔도좀 내에서 HA 분자 내에 형태적 변화가 일어난다. 뉴클레오캡시드는 바이러스 mRNA가 감염에서 필수적인 개시 단계로서 전사되는 핵으로 이동한다. 바이러스 mRNA는 차후에 바이러스 트랜스크립타아제(transcriptase)에 의해 바이러스 RNA 주형(template)의 전사를 위한 프라이머로 작용하는 세포 이종 mRNA에서 바이러스 엔도뉴클레아제가 캡핑된 5'-말단을 절단하는 독특한 기전에 의해 전사된다. 트랜스크립트(transcript)는 이들의 주형의 말단으로부터 15 내지 22 베이스의 부위에서 종결되는데, 상기 부위는 올리고(U) 서열이 폴리(A) 구역의 주형-비의존성 추가를 위한 신호로서 작용하는 곳이다. 그렇게 8종의 바이러스 mRNA 분자가 생성되는데, 6종은 HA, NA, NP 및 바이러스 폴리머라아제 단백질, PB2, PB1 및 PA를 나타내는 단백질로 직접 번역되는 단일시스트론성(monocistronic) 메시지이다. 다른 2종의 트랜스크립트는 스플라이싱(splicing)을 거쳐 2종의 mRNA를 생성하고, 이는 상이한 해독틀(reading frame)에서 번역되어 M1, M2, NS1 및 NS2를 생산한다. 다시 말해서, 8종의 바이러스 mRNA가 10종의 단백질을 코딩하는데: 8종은 구조 단백질이고 2종은 비-구조 단백질이다.
인플루엔자 A 게놈은 8종 단편의 음성 극성 단일-가닥 RNA를 함유하는데, 이는 9종의 구조 단백질 및 1종의 비구조 단백질을 코딩한다. 비구조 단백질 NS1은 인플루엔자로 감염된 세포에 풍부하며, 비리온에서 검출되지는 않았다. NS1은 감염 중 초기에 발견되고 또한 바이러스 사이클의 말기에 사이토플라즘에서 발견되는 인단백질이다(크루그(Krug) 외, 1975). 온도-민감성(ts) 인플루엔자 돌연변이가 NS 유전자 내에 손상을 운반한다는 것에 대한 연구는 NS1 단백질이 기전의 전사 및 전사-후 조절자라는 것을 제안하는데, 기전의 조절은 바이러스가 숙주 세포 유전자의 발현을 억제할 수 있고, 바이러스 단백질 합성을 자극할 수 있음에 의한 것이다. 전사-후 과정을 조절하는 많은 다른 단백질과 같이, NS1 단백질은 특정 RNA 서열 및 구조와 상호작용한다. NS1 단백질은 상이한 RNA 종에 결합하는 것으로 보고되어 있는데 RNA 종에는 하기의 것이 포함된다: vRNA, 폴리-A, U6(sn)RNA, 바이러스 mRNA에 5' 비번역 영역 및 ds RNA(퀴우(Qiu) 외, 1995; 퀴우 외, 1994). 트랜스팩팅된 세포 내에 cDNA 유래의 NS1 단백질의 발현은 하기의 몇몇 효과와 관계가 있다: mRNA의 뉴클리오-사이토플라즘성(nucleo-cytoplasmic) 수송의 억제, 예비-mRNA 스플라이싱의 억제, 숙주 mRNA 폴리아데닐화의 억제 및 바이러스 mRNA의 번역의 자극(포르테스(Fortes) 외, 1994, 에나미(Enami), 케이. 외, 1994; 드 라 루나(de al Luna) 외, 1995; 루(Lu) 와이. 외, 1994; 박(Park) 외, 1995).
인플루엔자 A 바이러스는 총 10종의 단백질을 인코딩하는 8종의 단일-가닥 음성-극성 바이러스 RNA(vRNA)의 게놈을 포유한다. 인플루엔자 바이러스의 라이프 사이클은 HA가 숙주 세포의 표면에 시알산(sialic acid)-함유 수용체에 결합하는 것으로 시작하여 이후, 수용체-매개 엔도사이토시스(endocytosis)가 일어난다. 후기 엔도좀(endosome) 내에 낮은 pH는 HA 내에서 형태적 이동을 유발하고, 이로써 HA2 서브유닛(소위 융합 펩타이드)의 N-말단을 노출시킨다. 융합 펩타이드는 바이러스 및 엔도좀 멤브레인의 융합을 개시하고, 매트릭스 단백질(M1) 및 RNP 복합체는 사이토플라즘으로 방출된다. RNPs는 vRNA를 단백질 막으로 싸는 핵단백질, 및 PA, PB1, 및 PB2 단백질에 의해 형성되는 바이러스 폴리머라아제 복합체로 구성된다. RNPs는 핵으로 수송되며, 여기에서 전사 및 복제가 일어난다. RNA 폴리머라아제 복합체는 하기의 3가지 상이한 반응을 촉매화한다: 5' 캡 및 3' 폴리A 구조를 보유한 mRNA의 합성, 완전한 길이의 상보적 RNA(cRNA)의 합성, 및 cDNA를 주형으로서 이용하는 게놈 vRNA의 합성. 새로이 합성된 vRNAs, NP, 및 폴리머라아제 단백질은 이후 RNPs로 통합되며, 핵으로부터 이탈되고, 플라즈마 멤브레인으로 수송되는데, 여기에서 자손(progeny) 바이러스 입자가 발생한다. 뉴라미니다아제(NA) 단백질은 시알릴올리고당에서 시알산을 제거하고, 이로써 새로 조립된 비리온을 세포 표면으로부터 방출하고 바이러스 입자의 자가 응집을 예방함으로써 감염 후기에 중대한 역할을 한다. 바이러스 조립은 단백질-단백질 및 단백질-vRNA 상호작용을 수반하고, 이러한 상호작용의 성질은 대부분 알려지지 않았다.
인플루엔자 B 및 C 바이러스가 구조적으로 및 기능적으로 인플루엔자 A 바이러스와 유사하다고 하더라도, 다소 차이가 있다. 예를 들어, 인플루엔자 B 바이러 스는 이온 채널 활성을 보유한 M2 단백질을 보유하지 않는다. 대신에, NA 유전자의 생성물인 NB 단백질이 이온 채널 활성을 보유하고 따라서 인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질과 유사한 기능을 보유한다. 유사하게도, 인플루엔자 C 바이러스는 이온 채널 활성을 갖는 M2 단백질을 보유하지 않는다. 그러나, CM1 단백질은 이러한 활성을 보유하는 경향이 있다.
그러한 인플루엔자 A 스트레인에는 서브타입 H10N4, H10N5, H10N7, H10N8, H10N9, H11N1, H11N13, H11N2, H11N4, H11N6, H11N8, H11N9, H12N1, H12N4, H12N5, H12N8, H13N2, H13N3, H13N6, H13N7, H14N5, H14N6, H15N8, H15N9, H16N3, H1N1, H1N2, H1N3, H1N6, H1N9, H2N1, H2N2, H2N3, H2N5, H2N7, H2N8, H2N9, H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N8, H4N1, H4N2, H4N3, H4N4, H4N5, H4N6, H4N8, H4N9, H5N1, H5N2, H5N3, H5N7, H5N8, H5N9, H6N1, H6N2, H6N4, H6N5, H6N6, H6N7, H6N8, H6N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N5, H7N7, H7N8, H8N4, H8N5, H9N1, H9N2, H9N3, H9N5, H9N6, H9N7, H9N8, H9N9, 하이브리드 서브타입, 순환 재조합형(circulating recombinant forms), 임상 분리주 및 야외 분리주가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이들의 서열은 젠뱅크(GenBank)에서 입수가능하고 바이러스 스톡은 메릴렌드주 록빌 소재 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection)에서 입수가능할 수 있고, 그렇지 않으면 공개적으로 입수 가능하다.
인플루엔자 B 스트레인에는 아이치(Aichi), 아키타(Akita), 알라스카(Alaska), 앤 아버(Ann Arbor), 아르헨티나(Argentina), 방콕(Bangkok), 베이징(Beijing), 벨기에(Belgium), 본(Bonn), 브라질(Brazil), 부에노스 아이레스, 캐 나다(Canada), 챠코(Chaco), 치바(Chiba), 총칭(Chongqing), CNIC, 코르도바(Cordoba), 체코슬로바키아(Czechoslovakia), 대구(Daeku), 더반(Durban), 핀란드(Finland), 푸지안(Fujian), 후쿠오카(Fukuoka), 제노아(Genoa), 광동(Guangdong), 광조우(Guangzhou), 하노버(Hannover), 하얼빈(Harbin), 하와이(Hawaii), 허베이(Hebei), 헤난(Henan), 히로시마(Hiroshima), 홍콩(Hong Kong), 휴스톤(Houston), 후난(Hunan), 이바라키(Ibaraki), 인디아(India), 이스라엘(Israel), 요하네스버그(Johannesburg), 가고시마(Kagoshima), 카나자와(Kanagawa), 켄자스(Kansas), 카즈코브(Khazkov), 고베(Kobe), 코우치(Kouchi), 라지오(Lazio), 리(Lee), 레닌그라드(Leningrad), 리스본(Lissabon), 로스앤젤레스(Los Angeles), 루사카(Lusaka), 리옹(Lyon), 말레이시아(Malaysia), 마퓨토(Maputo), 마르 델 플라타(Mar del Plata), 메릴렌드(Maryland), 멤피스(Memphis), 미시간(Michigan), 미에(Mie), 밀라노(Milano), 민스크(Minsk), 나가사키(Nagasaki), 나고야(Nagoya), 난창(Nanchang), 네쉬빌(Nashville), 네브라스카(Nebraska), 네덜란드(The Netherlands), 뉴욕(New York), NIB, 닝시아(Ningxia), 노르웨이(Norway), 오만(Oman), 오레곤(Oregon), 오사카(Osaka), 오슬로(Oslo), 파나마(Panama), 파리(Paris), 파르마(Parma), 페루기아(Perugia), 필리핀(Philippines), 부산(Pusan), 퀘벡(Quebec), 로체스터(Rochester), 로마(Roma), 사가(Saga), 서울(Seoul), 상동(Shangdong), 상하이(Shanghai), 센젠(Shenzhen), 시가(Shiga), 시즈오카(Shizuoka), 시추안(Sichuan), 시에나(Siena), 싱가포르(Singapore), 사우쓰 캐롤라이나(South Carolina), 사우쓰 다 코타(South Dakota), 스페인(Spain), 스톡홀름(Stockholm), 스위스(Switzerland), 타이완(Taiwan), 텍사스(Texas), 토쿠시마(Tokushima), 토쿄(Tokyo), 트렌토(Trento), 트리에스테(Trieste), 영국(United Kingdom), 우슈아이아(Ushuaia), USSR, 유타(Utah), 빅토리아(Victoria), 비엔나(Vienna), 우한(Wuhan), 수안우(Xuanwu), 야마가타(Yamagata), 야마나시(Yamanashi), 운난(Yunnan), 하이브리드 서브타입, 순환 재조합형, 임상 분리주 및 야외 분리주에서 유래한 스트레인이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이들의 서열은 젠뱅크(GenBank)에서 입수가능하고 바이러스 스톡은 메릴렌드주 록빌 소재 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection)에서 입수가능할 수 있고, 그렇지 않으면 공개적으로 입수 가능하다.
인플루엔자 C 스트레인은 아이치, 앤 아버, 아오모리, 베이징, 베를린(Berlin), 캘리포니아(California), 잉글랜드(England), 5대호(Great Lakes), 그리스(Greece), 히로시마(Hiroshima), 효고(Hyogo), JHB, 요하네스버그, 가나자와, 켄자스, 교토(Kyoto), 미시시피(Mississippi), 미야기(Miyagi), 나라(Nara), 뉴저지(New Jersey), 사이타마(Saitama), 사포로(Sapporo), 시즈오카, 테일러(Taylor), 야마가타(Yamagata), 하이브리드 서브타입, 순환 재조합형, 임상 분리주 및 야외 분리주에서 유래한 스트레인이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이들의 서열은 젠뱅크(GenBank)에서 입수가능하고 바이러스 스톡은 메릴렌드주 록빌 소재 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection)에서 입수가능할 수 있고, 그렇지 않으면 공개적으로 입수 가능하다.
본 발명의 바람직한 구체예는 상이한 지정학적 위치에서 유래한 또는 상이한 스트레인, 순환 재조합형, 임상 분리주, 또는 야외 분리주를 특정 년도에 표적으로 하는 혈구응집소와 같은 인플루엔자 면역원을 적어도 하나, 바람직하게는 3종 이상 함유하는 면역원성 조성물을 제공한다. 현재 상업적으로 입수가능한 인플루엔자 백신은 세계보건기구에 의해 결정된 바와 같이 3종의 가장 만연한 스트레인 또는 순환 재조합형 유래의 인플루엔자 혈구응집소 면역원을 함유하는 3가(trivalent) 백신이다. 그러한 백신은 본원에 개시된 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 본 발명의 일부로서 고려된다. 또한 특정 지정학적 위치에서 기원될 수 있는 적어도 3종의 상이한 뉴라미니다아제 또는 당해 스트레인 또는 순환 재조합형에서 유도된 핵단백질 인플루엔자를 함유하는 면역원 조성물도 포함된다.
이종 서열, 예컨대 인플루엔자 면역원의 검체 내에서의 발현은 이종 서열의 발현 생성물에 대한 검체 내에서의 면역원성반응을 초래한다. 따라서, 본 발명의 재조합 벡터는 면역학적 조성물 또는 백신에 이용되어 방어적일 수 있는, 그러나 반드시 방어적일 필요는 없는 면역원성반응을 유도하는 수단을 제공한다. 본 발명의 내용에 이용되는 분자생물학 기술은 샘브룩(Sambrook) 외(1989)에 의해 설명되어 있다.
나아가 선택적, 추가적으로 본 발명에 포함되는 면역원성 또는 면역학적 조성물에서, 항원을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 트랜스맴브레인 도메인을 인코팅하는 부분이 결실될 수 있다. 또한 더 나아가 선택적 또는 추가적으로, 벡터 또는 면역원성 조성물은 추가적으로 숙주 세포 내에 사람 tPA와 같은 이종 tPA 신호 서열 및/또는 래빗(rabbit) β-글로불린 유전자의 인트론 II와 같은 안정화 인트론을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유 및 발현할 수 있다.
본 발명은 또한 이종 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 시험관 내 또는 생체내 전달 및/또는 투여 방법을 제공한다. 본 방법에 따르면, 세포는 본 발명에 따라 적어도 하나의 결실된 아데노바이러스로 감염된다(본원에서 자세히 설명된다). 세포는 바이러스 형질도입의 자연적인 과정에 의해 아데노바이러스 벡터로 감염될 수 있다. 선택적으로, 벡터는 당해 기술분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 세포로 도입될 수 있다. 예를 들어, 세포는 표적 아데노바이러스 벡터와 (하기에 설명된 바와 같이) 접촉될 수 있고, 대안적인 기전, 예컨대 수용체-매개 엔도사이토시스에 의해 처리돌 수 있다. 또 다른 예로서, 벡터는 항체 또는 다른 결합 단백질을 이용하여 내면화(internalizing) 세포-표면 단백질에 대하여 표적이 될 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터가 주입될 세포는 임의의 유형일 수 있는데, 이에는 뉴런 세포(말초 신경 및 중추 신경계의 세포를 포함), 망막 세포, 상피 세포(진피, 장, 호흡기, 방광 및 흉부 조직 상피를 포함), 근육 세포(심장, 평활근, 골격근, 및 횡경막 근육을 포함), 췌장 세포(섬세포(islet cell) 포함), 간 세포(예, 유조직(parenchyma)), 섬유아세포, 내피 세포, 생식 세포, 폐 세포(기관지 세포 및 폐포 세포 포함), 전립선 세포, 및 이의 유사체가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 아데노바이러스에 의해 자연적으로 변환되는 세포가 바람직하다. 아데노바이러스에 의해 변환되는 그러한 세포의 예에는 HEK 293 세포, PER.C6 세포, 및 911 세포가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 일 구체예에서는, PER.C6 세포가 이 용된다.
2004년 4월 6일 허여된 미국특허 제6,716,823호; 2002년 2월 19일 허여된 미국특허 제6,348,450호; 미국특허출원 10/052,323 및 10,116,963; 및 10/346,021가 참고인용될 수 있으며, 이들의 내용은 특히 본원에 참고인용되어 있다.
발현된 유전자 생성물, 항체 및 이의 용도, 외인성 핵산 분자의 생체 내 및 시험관 내 발현을 위한 벡터, 발현을 유발하기 위한 프로모터 또는 발현될 핵산 분자에 작동가능하게 연결시키는 것, 그러한 벡터, 그러한 벡터 또는 핵산 분자 또는 항체를 함유하는 조성물을 생산하는 방법 및 문헌, 투약량, 및 투여 방식 및/또는 경로(비강 투여를 위한 조성물을 포함), 그중에서도 본 발명의 실시에 이용될 수 있는 정보를 위해서는 1999년 11월 23일 허여된, 미국특허 제5,990,091호(Einat et al. or Quark Biotech, Inc.), 1999년 5월 14일 출원된 PCT/US99/11066으로부터 199년 11월 25일에 공개된 WO 99/60164(Fisher or Rhone Merieux Inc.) 1997년 7월 30일 출원된 PCT/US/97/11486으로부터 1998년 1월 8일에 공개된 WO98/00166(미국특허 출원 제08/675,556 및 08/675,566의 우선권을 주장함)(van Ginkel et al., 1997, and Osterhose et al., 1992)을 참고할 수 있으며; 1999년 11월 23일에 허여된 미국 특허 5,990,091호(Einat et al. or Quark biotech, Inc.), 1999년 5월 14일 출원된 PCT/US99/11066으로부터 199년 11월 25일에 공개된 WO 99/60164(Fisher or Rhone Merieux Inc.) 1997년 7월 30일 출원된 PCT/US/97/11486으로부터 1998년 1월 8일에 공개된 WO98/00166(미국특허 출원 제08/675,556 및 08/675,566의 우선권을 주장함)(van Ginkel et al., 1997, and Osterhose et al., 1992)에 참고인용된 모든 문헌 및 참고인용 또는 1999년 11월 23일에 허여된 미국 특허 5,990,091호(Einat et al. or Quark biotech, Inc.), 1999년 5월 14일 출원된 PCT/US99/11066으로부터 199년 11월 25일에 공개된 WO 99/60164(Fisher or Rhone Merieux Inc.) 1997년 7월 30일 출원된 PCT/US/97/11486으로부터 1998년 1월 8일에 공개된 WO98/00166(미국특허 출원 제08/675,556 및 08/675,566의 우선권을 주장함)(van Ginkel et al., 1997, and Osterhose et al., 1992)에 참고인용된 모든 문헌 및 참고인용은 본원에 참고인용되어 있다. 1999년 11월 23일에 허여된 미국 특허 5,990,091호, WO 99/60164, WO98/00166(van Ginkel et al., 1997, and Osterhose et al., 1992)는 본 발명의 실시를 위해 의존할 수 있다(예, 발현된 생성물, 항체 및 이의 용도, 외인성 핵산 분자의 생체 내 및 시험관 내 발현을 위한 벡터, 당해 에피토프 또는 항원 또는 치료원 및 이의 유사체를 인코딩하는 외인성 핵산 분자, 프로모터, 그러한 벡터 또는 핵산 분자 또는 발현된 생성물 또는 항체를 함유하는 조성물, 투약량).
벡터는 유전자 생성물(예, 에피토프, 항원, 치료물질, 및/또는 항체) 조성물을 위해 지정된 양을 달성하기 위한 양으로 환자 또는 숙주에 투여될 수 있다. 물론, 본 발명은 본원에 예시된 것보다 다소 적고 많은 투약량을 고려하고, 동물 또는 사람에게 투여될 임의의 조성물 및 이의 성분에 대하여, 및 임의의 특정 투여 방법에 대하여, 하기의 요소에 따라 투약량을 결정하는 것이 바람직하다: 독성, 예컨대 적절한 동물 모델, 예컨대 쥐와 같은 설치류에서 치사량 50(LD50)을 측정하는 것에 의함; 및 적절한 반응을 유도하는 조성물(들)의 투약량, 이에 함유된 성분의 농도 및 조성물(들)을 투여하는 시기, 예컨대 혈청의 적정 및 이의 분석, 예를 들어 ELISA 및/또는 세로뉴트랄리제이션(seronutralization) 분석에 의함. 그러한 측정은 당업자의 지식, 본 개시물 및 본원에 인용된 문헌에서 벗어나는 실험을 요구하지 않는다.
본 발명의 조성물의 예에는 오리피스를 위한 액상 조제약, 또는 현탁액, 용액, 스프레이, 시럽 또는 엘릭시르와 같은 점막, 예컨대 경구, 비강, 항문, 질, 경구적, 위내 등의 투여를 위한 조제약; 및 장관외, 에피큐테니우스(epicutaneous), 피하, 근육내, 비강내, 또는 정맥내 투여(예, 주사 투여)를 위한 멸균 현탁액 또는 에멀션과 같은 조제약이 포함된다. 2004년 4월 6일 출원된 미국특허 제6,716,823호; 2004년 3월 16일에 출원된 6,706,793호; 2002년 2월 19일에 출원된 미국특허 제6,348,450호; 미국 특허출원 번호 10.052,323호 및 10,116,963호; 및 10/346,021호를 참고했으며, 이들의 내용은 본원에 참고인용되어 있고, 상기 특허문헌은 면역 및 면역원성 또는 백신 조성물을 비-침입성 운송 방식, 에컨대 에피큐테니우스 및 비강내 전달 방식을 통하여 전달하는 것을 개시하고 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물의 순차적인 투여 또는 본원의 방법의 순차적인 수행, 예컨대 본 발명 조성물의 주기적 투여, 예컨대 면역학적 조성물의 조건 및/또는 부스터(booster) 투여 및/또는 프라임-부스트 요법을 포함하며; 순차적 투여를 위한 시기 및 방식은 과도한 실험 없이도 확인될 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 벡터를 제조 및 이용하기 위한 조성물 및 방법을 포 함하는데, 이에는 생체 내 및/또는 시험관 내 및/또는 생체 외에서 유전자 생성물 및/또는 면역학적 생성물 및/또는 항체를 생산하는 방법(예컨대, 시험관 내 및 생체 외 생산은 예를 들어, 본 발명에 따른 비-침입성 투여된 숙주의 세포에서 분리한 후에 이루어지는 것이며, 예컨대 그러한 세포를 선택적으로 연장한 후에 이루어지기도 한다), 및 그러한 유전자 및/또는 면역학적 생성물 및/또는 항체를 진단, 분석, 요법, 치료, 및 이와 유사한 용도 등에 이용하는 방법을 포함한다.
벡터 조성물은 벡터와 적절한 담체 또는 희석제와 혼합하여 배합되고; 유전자 생성물 및/또는 면역학적 생성물 및/또는 항체 조성물은 유전자 및/또는 면역학적 생성물 및/또는 항체를 적절한 담체 또는 희석제와 혼합하여 유사하게 배합되는데; 이는, 예컨대 미국특허 제5,990,091호, WO 99/60164, WO 98/00166, 본원에 인용된 문헌, 및 본원에 인용된 다른 문헌, 및 본원의 다른 교시(예컨대 담체, 희석제 및 이의 유사체에 관한)를 참고할 수 있다.
그러한 조성물에서, 재조합 벡터는 적절한 담체, 희석제, 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리적 식염수, 글루코스 또는 이와 유사한 것과 혼합될 수 있다. 조성물은 또한 감압 동결건조될 수 있다. 조성물은 보조적 물질, 예컨대 침윤제 또는 유화제, pH 완충제, 보조약, 겔화 첨가제 또는 증점제, 방부제, 향료, 색소, 및 이와 유사한 것을 함유할 수 있는데, 이는 원하는 투여 및 조제의 경로에 좌우된다. 본원에 참고인용된 표준 교과서인 문헌["REMINGTON'S PHARACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985]는 과도한 실험 없이도 적절한 조제약을 제조하는데 참고가 될 것이다.
투여될 재조합 벡터의 양은 치료될 환자(숙주) 및 조건에 대하여 다양할 수 있고, 1 또는 수 마이크로 그램 내지 수백 또는 수천 마이크로그램까지 다양할 수 있는데, 예를 들어 1㎍ 내지 1mg, 즉 체중 1kg 당 하루에 약 100ng 내지 100mg이 될 수 있고, 바람직하게는 하루에 10pg/kg 내지 10mg/kg가 될 수 있다. 재조합 아데노바이러스에 투여할 경우에, 면역학적, 치료적, 또는 예방적 유효 투약량은 1×107 내지 1×1012 바이러스 입자 또는 플라크-형성 유닛(PFU)을 함유할 수 있다. 벡터는 환자 또는 숙주에 유전자 생성물(예, 에피토프, 항원, 치료원 및/또는 항체) 조성물에 대하여 정해진 양을 달성하기 위한 양으로 비-침입적으로 투여된다. 물론, 본 발명은 본원에 예시된 것보다 다소 적고 많은 투약량을 고려하고, 동물 또는 사람에게 투여될 임의의 조성물 및 이의 성분에 대하여, 및 임의의 특정 투여 방법에 대하여, 하기의 요소에 따라 투약량 결정하는 것이 바람직하다: 독성, 예컨대 적절한 동물 모델, 예컨대 쥐와 같은 설치류에서 치사량(LD) 및 치사량 50(LD50)을 측정하는 것에 의함; 및 적절한 반응을 유도하는 조성물(들)의 투약량, 이에 함유된 성분의 농도 및 조성물(들)을 투여하는 시기, 예컨대 혈청의 적정 및 이의 분석, 예를 들어 ELISA 및/또는 세로뉴트랄리제이션 분석에 의함. 그러한 측정은 당업자의 지식, 본 개시물 및 본원에 인용된 문헌에서 벗어나는 실험을 요구하지 않는다.
재조합 벡터는 본원에 및/또는 본원에 인용된 문헌에 기술되어 있는 투약량에 상응하는 생체 내 발현을 수득하기 위한 적절한 양으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 현탁액에 대한 적절한 범위는 실험적으로 측정될 수 있다. 1종 이상의 유전자 생성물이 1종 이상의 재조합형에 의해 발현된다면, 각각의 재조합형이 상기 양으로 투여될 수 있고; 또는, 각각의 재조합형은 상기 양을 함유하는 재조합형의 총합이 존재하도록 투여될 수 있다.
그러나, 적절한 면역학적 반응을 유도하는, 조성물(들)의 투약량, 이 경우 성분의 농도 및 조성물(들)을 투여하는 시기는 혈청의 항체 적정에 의한, 예컨대 ELISA 및/또는 세로뉴트랄리제이션 평가 분석에 의한 방법으로 측정될 수 있다. 그러한 측정은 당업자의 지식, 본 개시물 및 본원에 인용된 문헌에서 벗어나는 과도함 실험을 요구하지 않는다. 또한 순차적인 투여를 위한 시간은 본 개시물, 및 당업자의 지식에서 확신할 수 있는 방법으로 과도한 실험 없이 유사하게 확신할 수 있다.
본 발명에 의해 고려되는 면역성 또는 면역학적 조성물은 또한 보조약을 함유할 수 있다. 적절한 보조약에는 fMLP(N-포르밀-메티오닐-루실-페닐알라닌; 미국특허 제6,017,537) 및/또는 아크릴산 또는 메타크릴산 중합체 및/또는 말레산 무수물의 공중합체 및 알케닐 유도체의 공중합체가 포함된다. 아크릴산 또는 메타크릴산 중합체는 가교결합될 수 있는데, 예를 들어 당 또는 폴리알콜의 폴리알케닐 에테르와 가교결합될 수 있다. 이러한 화합물은 "카르보머(carbomer)"라는 용어로 알려져 있다(Pharmeuropa, Vol. 8, No2, June 1996). 당업자는 또한 적어도 3개의 하이드록실 그룹을 함유하는 폴리하이드록실화된 화합물과 가교결합된 그러한 아크릴산 중합체에 대하여 논의하는 미국 특허 제2,909,462호(본원에 참고인용됨)를 언급 할 수 있는데: 일 구체예에서, 폴리하이드록실화된 화합물은 8개 이하의 하이드록실 그룹을 함유하고; 또 다른 구체예에서, 적어도 3개의 하이드록실의 수소 원자가 적어도 2개의 탄소원자를 함유하는 불포화 지방족 라디칼로 치환되며; 다른 구체예에서는, 라디칼이 약 2 내지 약 4개의 탄소원자를 함유하는데, 예컨대 비닐, 알릴 및 기타 에틸렌계 불포화 그룹을 함유한다. 불포화 라디칼은 그 자체로 다른 치환체, 예컨대 메틸을 함유할 수 있다. 상표명 Carbopol®(미국, 오하이오주 소재 노베온 인크.(Noveon Inc.))로 판매되는 생성물은 보조약으로서 이용하기에 특히 적합하다. 이들은 알릴 수크로스 또는 알릴펜타에리스리톨과 가교결합되어 있으며, 이렇게 제조된 생성물에는 Carbopol® 974P, 934P, 및 971P가 있다.
말레산 무수물의 공중합체 및 알케닐 유도체의 공중합체에 대하여는, EMA® 생성물(몬산토(Monsanto))가 언급될 수 있는데, 이는 말레산 무수물의 공중합체 및 에틸렌의 공중합체이고, 이는 선형일 수 있거나 가교결합될 수 있는데, 예를 들어 디비닐 에테르와 가교결합 될 수 있다. 또한 미국특허 제6,713,068호 및 레겔슨(Regelson), 더블유. 외, 1960을 참조할 수 있으며; 이들은 모두 참고인용되어 있다.
4차 암모늄염을 함유하는 양이온성 지질은 미국특허 제6,713,068호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참고인용되어 있고, 또한 본 발명의 방법 및 조성물에 이용될 수 있다. 이러한 양이온성 지질 중에, 유리하게도 중성 지질, 유리하게는 DOPE(디올레오일-포스파티딜-에탄올 아민; 베르(Behr) 제이. 피. 외, 1994)와 연결되어 있는 N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로 판 암모늄; WO96/34109)이 형성한 DMRIE-DOPE가 바람직하다.
재조합 백신 또는 면역성 또는 면역학적 조성물은 또한 수중유(oil-in-water) 에멀션의 형태로 배합될 수 있다. 수중유 에멀션은, 예컨대 경성 액상 파라핀 오일(European Pharmacopea type); 스쿠알란, 스쿠알렌, EICOSANETM 또는 테트라테트라콘탄(tetratetracontane)과 같은 이소프레노이드 오일; 알켄(들), 예컨대 이소부텐 또는 데센의 올리고화에서 수득된 오일; 식물성 오일, 에틸 올레이트, 프로필렌 글리콜 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레이트와 같은 선형 알킬 그룹을 함유하는 산의 에스테르 또는 알콜의 에스테르; 분지 지방산 또는 알콜의 에스테르, 예컨대 이소스테아르산 에스테르를 기반으로 할 수 있다. 오일은 유리하게도 유화제와 혼합되어 에멸선을 형성한다. 유화제는 비이온성 계면활성제, 예컨대 소르비탄의 에스테르, 마나이드(mannide)(예, 안하이드로마니톨 올레이트), 글리세롤, 폴리글리레솔, 프로필렌 글리콜, 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산, 또는 하이드록스테아르산일 수 있는데, 이들은 경우에 따라 에톡실화되고, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록인데, 예를 들어 Pluronic® 생성물, 예컨대 L121이 있다. 보조약은 유화제(들), 미셀-형성제, 및 상표명 Provax®(캘리포니아 주, 샌디에고 소재 IDEC 파마세티갈즈)에 입수가능한 것과 같은 오일의 혼합물일 수 있다.
1 이상의 당해 이종 핵산을 발현하는 재조합 아데노바이러스, 또는 재조합 아데노바이러스 벡터, 에컨대 본 개시에 따른 벡터는 약 5℃에서 액상 형태 또는 감암동결 상태 또는 동결-건조 형태로 안정화제의 존재하에 보존 및/또는 유지 및 저장될 수 있다. 동결-건조는 잘 알려진 표준 동결-건조 절차에 따를 수 있다. 약학적 허용성의 안정화제는 SPGA(수크로스 포스페이트 글루타메이트 알부민; 보바닉(Bovarnik) 외, 1950), 탄수화물(예, 소르비톨, 마니톨, 락토스, 수크로스, 글루코스, 덱스트란, 트레할로스), 글루탐산나트륨(체페코프(Tsvetkov), 티. 외, 1983; 이스라엘리(Israeli), 이. 외, 1993), 펩톤, 알부민 또는 카제인과같은 단백질, 무지방 우유와 같은 제제를 함유하는 단백질(밀즈(Mills) 씨.케이. 외, 1998; 울프(Wolff), 이. 외, 1990), 및 완충제(예, 포스페이트 완중체, 알칼리 금속 포스페이트 완충제)일 수 있다. 보조약 및/또는 운반체 또는 부형제는 용해성 동결-건조 조제약을 제조하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 하기의 비-제한적 실시예의 방법에 의해 추가적으로 설명될 것인데, 이 실시예는 본 발명의 다양한 구체예를 예증하는 것이지 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1:인플루엔자 HA 를 발현하는 복제-결손 아데노바이러스의 생산
인플루엔자 HA를 발현하는 2개의 아데노바이러스(Ad) 벡터를 AdEasy 시스템을 이용하여 제조했다. 2003-2004년에 백신 생성을 위해 선택된 당해 2종의 인플루엔자 바이러스 스트레인[A/파나마/2007/99(H3N2) 및 B/홍콩/330/01]을 미국 질병관리본부(The Centers for Disease Control and Prevention)(CDC)에서 공급받았다. A/파나마/2007/99 HA 유전자는 인플루엔자 RNA의 역전사에 이어서, 하기의 프라이 머를 이용하는 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 HA 유전자를 증폭시켜 클로닝했다:
Figure 112007092747358-PCT00001
상기 프라이머는 A/파나마/2007/99 HA 유전자, HA 개시 ATG 코돈에서 바로 업스트림으로 존재하는 진핵 리보좀 결합 부위(코작(Kozak), 1986), 및 순차적 클로닝을 위한 KpnI 부위의 5' 및 3' 말단을 풀림한(anneal) 서열을 함유했다. 완전한 길이의 HA 유전자를 함유하는 KpnI 절편을 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터의 전사적 제어 하에 정확한 방향으로 pShuttleCMV의 KpnI 부위에 삽입했다. A/파나마/2007/99 HA를 인코팅하는 E1/E3-결손 Ad 벡터(AdPNM007/99.H3)를 AdEasy 시스템을 이용하여 사람 293 세포에서 발생시켰다. B/홍콩/330/01 HA 유저자를 인코딩하는 Ad 벡터(AdHK330/01.B)를 표 1의 프라이머 서열을 이용하여 유사하게 제조했다.
상기 두 Ad 벡터를 DNA 시퀀싱(sequencing)에 의해 유효성을 확인하고, 293 세포 내에서 역가 1011pfu/ml로 증식했다. A/파나마/2007/99 및 B/홍콩/33001에 대한 혈구응집소-억제(HI) 항체를 각각 AdPNM007/99.H3- 및 AdHK330/01.B-벡터 인플루엔자 백신의 비강내 주입 후에 쥐에서 유도했다. 그러나, 이. 콜라이 BJ5183 세포 내에서 발생된 재조합 플라스미드가 293 세포 대신에 PER.C6 세포로 트랜스펙팅된 경우에는 상기 두 벡터에 대하여 낮은 역가의 Ad 벡터(<108pfu/ml)가 생성되었다. PER.C6-발생 AdPNM007/99.H3 벡터를 PER.C6 세포 내에서의 대량 생산을 위해 몰레큘라 메디신 바이오서비시즈, 인크(Molecular Medicine BioServices, Inc.)(캘리포니아, 라 졸라 소재)로 보냈으며, 역가는 4회의 확장 후에 2×107pfu/ml였다. 낮은 역가로 Ad 벡터를 생산하는 것은 PER.C6 세포 내에서 종래의 문제점이 아니었는데, 왜냐하면 본 발명자(미공개 결과) 및 다른 사람(팔락스 외,, 1998; 무라카미 외, 2002)들은 pAdApt-기반 셔틀 플라스미드에 의해 발생된 Ad 벡터가 상기 세포주에서 높은 역가(>1011pfu/ml)로 성장한다는 것을 밝혔기 때문이다. AdEasy 시스템은 PER.C6 세포와 친화적일 수 없는 것으로 나타났으며, RCA-무함유 Ad 벡터의 고-역가 생성에 이용될 수 없다.
Ad-벡터 인플루엔자 백신의 생산이 종래의 계란-의존 생산 시스템보다는 신속하다할 지라도, AdEasy 시스템이 존재하지 않는 경우에도, AdEasy 시스템 또는 동등한 시스템은 셔틀 플라스미드와 Ad 백본 플라스미드 사이의 상동 재조합이 이. 콜라이 세포 내에서 밤새 일어나게 함으로써 추가적으로 가속화될 수 있다. 전반적으로, 종래의 Ad 생산 방법 대신에 AdEasy 시스템을 신규의 Ad 벡터를 생산하는데 이용한다면, 1 내지 2개월의 시간을 절약할 수 있다. 이러한 시간절약적 과정은 인플루엔자 백신의 생산에는 유의적인 것인데, 왜냐하면 신규의 인플루엔자 바이러스 스트레인은 이러한 시간의 틀 내에 전세계적으로 퍼질 수 있기 때문이다.
그러나, 293 세포 내에서 RCA의 발생 및 AdEasy 시스템과 PER.C6 세포주 사이의 비친화성은 RCA 오염 없이 Ad 벡터의 급속 및 고-역가 생산을 저해하는 장애물이다. PER.C6 세포 내에서 AdEasy-유래의 Ad 벡터의 저-역가 생산은 pShuttleCMV 벡터 내에 Ad 서열의 결손에 기인하는 것으로 생가되는데, 왜냐하면, pAdApt-기반 벡터는 상기 세포주에서 고-역가 및 RCA-무함유 Ad 벡터를 발생할 수 있기 때문이다. AdEasy과 PER.C6 사이의 비친화성에 대한 원인이 되는 Ad 서열은 Ad 뉴클레이트디 342-454 및 3511-3533인 것으로 확인되었고, 상기 두 단편은 pAdApt 내에는 존재하나(서열은 크루셀(Crucell)에서 제공), pShuttleCMV 내에는 결실된 것이다. Ad 뉴클레오티드 넘버링은 크로보첵의 넘버링 시스템(Chroboczek's numbering system)(크로보첵 외, 1992)에 따라 수행했다. pIX 프로모터(바비스(Babiss) 및 발레스(Vales), 1991)는 pAdApt 내에서는 손상되나 pShuttleCMV에서는 결손된다. 캡시드 시멘트(capside cement)로서 pIX는 Ad 입자를 안정화하는데 참여한다(로사-칼라트라바(Rosa-Calatrava) 외, 2001). pShuttleCMV 내에 결실된 Ad 서열에 의해 인코팅된 다른 기능이 또한 존재할 수 있다. pShuttleCMV 벡터는 이. 콜라이 BJ5183 세포 내에 상동 재조합을 통하여 pAdApt 내에 결손 서열을 대응하는 서열로 대체함으로써 회복될 수 있는 것으로 생각된다.
실시예 2: pAdHigh α의 생성
크루셀의 셔틀 플라스미드 pAdApt를 제한 효소 SgrAI + EcoRI, 및 BstXI + EcoRI으로 별도로 분해했다. 동시에 셔틀 플라스미드 pShuttleCMV를 SgrAI + BstXI으로 분해했다. 수득된 pAdApt SgrAI-EcoRI 및 BstXI-EcoRI 절편을 3-방향 접합(3-way ligation)에 의해 pShuttleCMV의 SgrAI-BstXI 부위로 삽입하여, 복제 결손 Ad 벡터를 수득했다. 인플루엔자 HA 유전자를 인코딩하는 복제-결손 Ad 벡터(AdHigh αPNM2007/99.H3)는 재조합 플라스미드를 PER.C6 세포에 트랜스펙팅하여 발생시켰다. 293 세포 내의 AdEasy 시스템에 요구되는 동일한 시간 틀 내인, 트랜스펙션 이후 대략 7일 후에 세포변성효과(CPE)가 나타났다(히 외, 1998).
실시예 3: pAdHigh β의 생산
결손 서열을 회복시키기 위하여, pShuttleCMV의 CMV 프로모터, 인접한 다중 클로닝 부위, 및 Ad 서열의 플랭킹(flanking)을 상동 재조합을 통해 pAdApt 유래의 대응물질로써 하나의 유닛으로 치환했는데, 왜냐하면 상기 2개의 셔틀 플라스미드는 광범위한 오버래핑 서열을 공유하기 때문이다. 그러나, 재조합형을 선별하기 위해 신규의 마커가 필요했다. 플라스미드 pBR322에서 유래한 완전한 길이의 테트라사이클린(Tc) 내성 유전자(백맨(Backman) 및 보이어(boyer, 1983; 페든(Peden), 1983)를 이미 내재된 KpnI 부위와 함께 프라이머 5'-GAGCTCGGTACCTTCTCATGTTTGACAGCTTATCAT-3' 및 5'- TCTAGAGGTACCAACGCTGCCCGAGATGCGCCGCGT-3'을 이용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭된 Tc 유전자를 Amp-내성 플라스미드 pAdAptd의 KpnI 부위에 삽입하여 신규의 플라스미드 pAdApt-Tc를 발생시켰는데, 이는 성장 배지에 Amp 및 Tc를 모두 도포하여 선별될 수 있다.
고-효율의 AdEasier 재조합 프로토콜(젱 외, 2001)을 이용하여 pShuttleCMv 내의 Ad 서열을 pAdApt-Tc 내에 대응서열로 치환했다. 요컨대 pShuttleCMV를 이. 콜라이 BJ5183으로 형질전환시켰고, 선별된 형질전환주는 카나마이신(kan) 내성을 보유했다. Kan-내성 세포를 즉시 pAdApt-Tc를 이용하여 형질전환시키고, 배양 배지에 Kan 및 Tc를 모두 도포하여 재조합형을 선별했다. 상동 재조합을 통해 pAdApt-Tc에서 대응 서열을 pShuttleCMV 내에 표시된 Ad 서열로 치환할 경우에만, 재조합형이 이. 콜라이 BJ5183 세포에 대하여 Kan 및 Tc 내성을 모두 나타낼 수 있었다. 수득된 pAdHighβ 플라스미드를 이. 콜라이 BJ5183 세포에서 정제하고, 설명한 바와 같이 이. 콜라이 DH10B로 형질전환했다(젱 외, 2001). 이후, 플라스미드를 DNA 시퀀싱에 의해 유효성을 확인했다.
실시예 4: AdHigh 시스템을 이용한 인플루엔자 HA 를 인코딩하는 아데노바이 러스 벡터의 생산
AdPNM2007/99.H3 벡터 내에 A/파나마/2007/99 HA 유전자를 함유하는 KpnI 절편을 pAdHigh-Tc의 KpnI 부위에 삽입하여 Tc 유전자를 치환했다. 수득된 플라스미드는 설명한 바와 같이(젱 외, 201) 이. 콜라이 BJ5183 세포 내에서 Ad 백본 플라스미드 pAdEasy1과 재결합이 가능했다. HA 유전자를 인코딩하는 Ad 벡터를 재조합 플라스미드의 트랜스펙션 이후 PER.C6 세포 내에서 발생시켰다. RCA 오염의 수준은 3×1011 입자 중에서 검출되지 않았다.
실시예 5: AdApt -, AdEasy -, 및 AdHigh α-유래 아데노바이러스 벡터의 비교
293 및 PER.C6 세포 내에서 인플루엔자 HA 유전자를 인코딩하는 AdApt-, AdEasy-, 및 AdHighα-유래 아데노바이러스 벡터의 증식을 측정했다. AdApt, AdEasy, 및AdHighα 중 하나를 이용하여 ifu-대-세포 비율 25:1에서 개발된 아데노바이러스 벡터에 의해 대략 106개의 세포를 감염시켰다. 감염 후에, 셀을 2일 동안 냉동시켰다. 해동 후에, 도 6에 나타낸 바와 같이 아데노-X 적정 키트에 의해 용해물을 분석했다. 데이타는 단일 웰(well)에서 생성된 평균 역가를 나타낸 것이다. AdApt 및 AdHigh에 의해 생성된 아데노바이러스 벡터는, 벡터가 PER.C6 세포 또는 293 세포에서 증식되었는지 여부와는 상관없이 평균 감염 유닛에 있어서 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 대조적으로, AdEasy에 의해 생산된 벡터는 평균 감염 유잇에 있어서 유의적인 차이를 나타냈는데, 293 세포에서 증식된 벡터는 PER.C6 세포 내에서 증식된 대응물과 비교할 경우, 평균 감염 유닛에 있어서 평균적으로 대략 3-로그 감소를 나타냈다.
혈구응집소-억제 항체 역가를 유발하는데 있어서 AdHighα-유래의 아데노바이러스 벡터의 효율성을 AdApt-유래 아데노바이러스 벡터와 비교했다. 2.5×108 ifu의 AdHPNM2007/99.H3(AdHighα-유래) 또는 AdPNM007/99.H3(AdApt-유래) 벡터를 이용한 비강내 투여를 통하여 ICR 쥐를 면역시켰으며, 이때 상기 각각의 벡터는 동일한 인플루엔자 HA 단백질을 인코딩한다. 면역 조치 1개월 후에, 혈구응집소-억제 분석을 위해 혈청을 수집했다.
도 7에서 보는 바와 같이, 양 벡터에서 거의 동일한 HI역가가 수득되었으며, 이는 AdApt-유래 아데노바이러스 벡터에 비하여 AdHighα-유래 아데노바이러스 벡터의 이용을 통해서도 아데노바이러스 벡터의 효율성이 감소되지 않는다는 것을 예증한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예를 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 첨부된 청구의 범위에 의해 한정되는 것이지, 본 발명의 사상 또는 범주를 벗어나지 않고도 명백하게도 많은 변형물이 가능하기 때문에, 상기 설명된 특정 세부 사항에 의해 제한되는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.
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serotype 5 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2286) <223> Nucleotides 3511 to 5796 of adenovirus serotype 5 <400> 2 tactgaaatg tgtgggcgtg gcttaagggt gggaaagaat atataaggtg ggggtcttat 60 gtagttttgt atctgttttg cagcagccgc cgccgccatg agcaccaact cgtttgatgg 120 aagcattgtg agctcatatt tgacaacgcg catgccccca tgggccgggg tgcgtcagaa 180 tgtgatgggc tccagcattg atggtcgccc cgtcctgccc gcaaactcta ctaccttgac 240 ctacgagacc gtgtctggaa cgccgttgga gactgcagcc tccgccgccg cttcagccgc 300 tgcagccacc gcccgcggga ttgtgactga ctttgctttc ctgagcccgc ttgcaagcag 360 tgcagcttcc cgttcatccg cccgcgatga caagttgacg gctcttttgg cacaattgga 420 ttctttgacc cgggaactta atgtcgtttc tcagcagctg ttggatctgc gccagcaggt 480 ttctgccctg aaggcttcct cccctcccaa tgcggtttaa aacataaata aaaaaccaga 540 ctctgtttgg atttggatca agcaagtgtc ttgctgtctt tatttagggg ttttgcgcgc 600 gcggtaggcc cgggaccagc ggtctcggtc gttgagggtc ctgtgtattt tttccaggac 660 gtggtaaagg tgactctgga tgttcagata catgggcata agcccgtctc tggggtggag 720 gtagcaccac tgcagagctt catgctgcgg ggtggtgttg tagatgatcc agtcgtagca 780 ggagcgctgg gcgtggtgcc taaaaatgtc tttcagtagc aagctgattg ccaggggcag 840 gcccttggtg taagtgttta caaagcggtt aagctgggat gggtgcatac gtggggatat 900 gagatgcatc ttggactgta tttttaggtt ggctatgttc ccagccatat ccctccgggg 960 attcatgttg tgcagaacca ccagcacagt gtatccggtg cacttgggaa atttgtcatg 1020 tagcttagaa ggaaatgcgt ggaagaactt ggagacgccc ttgtgacctc caagattttc 1080 catgcattcg tccataatga tggcaatggg cccacgggcg gcggcctggg cgaagatatt 1140 tctgggatca ctaacgtcat agttgtgttc caggatgaga tcgtcatagg ccatttttac 1200 aaagcgcggg cggagggtgc cagactgcgg tataatggtt ccatccggcc caggggcgta 1260 gttaccctca cagatttgca tttcccacgc tttgagttca gatgggggga tcatgtctac 1320 ctgcggggcg atgaagaaaa cggtttccgg ggtaggggag atcagctggg aagaaagcag 1380 gttcctgagc agctgcgact taccgcagcc ggtgggcccg taaatcacac ctattaccgg 1440 gtgcaactgg tagttaagag agctgcagct gccgtcatcc ctgagcaggg gggccacttc 1500 gttaagcatg tccctgactc gcatgttttc cctgaccaaa tccgccagaa ggcgctcgcc 1560 gcccagcgat agcagttctt gcaaggaagc aaagtttttc aacggtttga 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agcagcagca ggaggaagcc aggcggcggc ggcaggagca gagcccatgg aacccgagag 2220 ccggcctgga ccctcgggaa tgaatgttgt acaggtggct gaactgtatc cagaactgag 2280 acgcattttg acaattacag aggatgggca ggggctaaag ggggtaaaga gggagcgggg 2340 ggcttgtgag gctacagagg aggctaggaa tctagctttt agcttaatga ccagacaccg 2400 tcctgagtgt attacttttc aacagatcaa ggataattgc gctaatgagc ttgatctgct 2460 ggcgcagaag tattccatag agcagctgac cacttactgg ctgcagccag gggatgattt 2520 tgaggaggct attagggtat atgcaaaggt ggcacttagg ccagattgca agtacaagat 2580 cagcaaactt gtaaatatca ggaattgttg ctacatttct gggaacgggg ccgaggtgga 2640 gatagatacg gaggataggg tggcctttag atgtagcatg ataaatatgt ggccgggggt 2700 gcttggcatg gacggggtgg ttattatgaa tgtaaggttt actggcccca attttagcgg 2760 tacggttttc ctggccaata ccaaccttat cctacacggt gtaagcttct atgggtttaa 2820 caatacctgt gtggaagcct ggaccgatgt aagggttcgg ggctgtgcct tttactgctg 2880 ctggaagggg gtggtgtgtc gccccaaaag cagggcttca attaagaaat gcctctttga 2940 aaggtgtacc ttgggtatcc tgtctgaggg taactccagg gtgcgccaca atgtggcctc 3000 cgactgtggt tgcttcatgc tagtgaaaag cgtggctgtg attaagcata acatggtatg 3060 tggcaactgc gaggacaggg cctctcagat gctgacctgc tcggacggca actgtcacct 3120 gctgaagacc attcacgtag ccagccactc tcgcaaggcc tggccagtgt ttgagcataa 3180 catactgacc cgctgttcct tgcatttggg taacaggagg ggggtgttcc taccttacca 3240 atgcaatttg agtcacacta agatattgct tgagcccgag agcatgtcca aggtgaacct 3300 gaacggggtg tttgacatga ccatgaagat ctggaaggtg ctgaggtacg atgagacccg 3360 caccaggtgc agaccctgcg agtgtggcgg taaacatatt aggaaccagc ctgtgatgct 3420 ggatgtgacc gaggagctga ggcccgatca cttggtgctg gcctgcaccc gcgctgagtt 3480 tggctctagc gatgaagata cagattgagg tactgaaatg tgtgggcgtg gcttaagggt 3540 gggaaagaat atataaggtg ggggtcttat gtagttttgt atctgttttg cagcagccgc 3600 cgccgccatg agcaccaact cgtttgatgg aagcattgtg agctcatatt tgacaacgcg 3660 catgccccca tgggccgggg tgcgtcagaa tgtgatgggc tccagcattg atggtcgccc 3720 cgtcctgccc gcaaactcta ctaccttgac ctacgagacc gtgtctggaa cgccgttgga 3780 gactgcagcc tccgccgccg cttcagccgc tgcagccacc gcccgcggga ttgtgactga 3840 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cctaaagcgc aaacgcgccc gaccacccat ctatagtccc atcattgtgc 29700 tacacccaaa caatgatgga atccatagat tggacggact gaaacacatg ttcttttctc 29760 ttacagtatg attaaatgag acatgattcc tcgagttttt atattactga cccttgttgc 29820 gcttttttgt gcgtgctcca cattggctgc ggtttctcac atcgaagtag actgcattcc 29880 agccttcaca gtctatttgc tttacggatt tgtcaccctc acgctcatct gcagcctcat 29940 cactgtggtc atcgccttta tccagtgcat tgactgggtc tgtgtgcgct ttgcatatct 30000 cagacaccat ccccagtaca gggacaggac tatagctgag cttcttagaa ttctttaatt 30060 atgaaattta ctgtgacttt tctgctgatt atttgcaccc tatctgcgtt ttgttccccg 30120 acctccaagc ctcaaagaca tatatcatgc agattcactc gtatatggaa tattccaagt 30180 tgctacaatg aaaaaagcga tctttccgaa gcctggttat atgcaatcat ctctgttatg 30240 gtgttctgca gtaccatctt agccctagct atatatccct accttgacat tggctggaaa 30300 cgaatagatg ccatgaacca cccaactttc cccgcgcccg ctatgcttcc actgcaacaa 30360 gttgttgccg gcggctttgt cccagccaat cagcctcgcc ccacttctcc cacccccact 30420 gaaatcagct actttaatct aacaggagga gatgactgac accctagatc tagaaatgga 30480 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aaaaaaacca 31320 agtcaaacat aaacctggaa atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg 31380 tggctgccgc cgcacctcta atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggccc 31440 cgctaaccgt gcacgactcc aaacttagca ttgccaccca aggacccctc acagtgtcag 31500 aaggaaagct agccctgcaa acatcaggcc ccctcaccac caccgatagc agtaccctta 31560 ctatcactgc ctcaccccct ctaactactg ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag 31620 agcccattta tacacaaaat ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa 31680 cagacgacct aaacactttg accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactt 31740 ccttgcaaac taaagttact ggagccttgg gttttgattc acaaggcaat atgcaactta 31800 atgtagcagg aggactaagg attgattctc aaaacagacg ccttatactt gatgttagtt 31860 atccgtttga tgctcaaaac caactaaatc taagactagg acagggccct ctttttataa 31920 actcagccca caacttggat attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa 31980 acaattccaa aaagcttgag gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgcta 32040 cagccatagc cattaatgca ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaat gcaccaaaca 32100 caaatcccct caaaacaaaa attggccatg gcctagaatt tgattcaaac aaggctatgg 32160 ttcctaaact aggaactggc cttagttttg acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca 32220 aaaataatga taagctaact ttgtggacca caccagctcc atctcctaac tgtagactaa 32280 atgcagagaa agatgctaaa ctcactttgg tcttaacaaa atgtggcagt caaatacttg 32340 ctacagtttc agttttggct gttaaaggca gtttggctcc aatatctgga acagttcaaa 32400 gtgctcatct tattataaga tttgacgaaa atggagtgct actaaacaat tccttcctgg 32460 acccagaata ttggaacttt agaaatggag atcttactga aggcacagcc tatacaaacg 32520 ctgttggatt tatgcctaac ctatcagctt atccaaaatc tcacggtaaa actgccaaaa 32580 gtaacattgt cagtcaagtt tacttaaacg gagacaaaac taaacctgta acactaacca 32640 ttacactaaa cggtacacag gaaacaggag acacaactcc aagtgcatac tctatgtcat 32700 tttcatggga ctggtctggc cacaactaca ttaatgaaat atttgccaca tcctcttaca 32760 ctttttcata cattgcccaa gaataaagaa tcgtttgtgt tatgtttcaa cgtgtttatt 32820 tttcaattgc agaaaatttc aagtcatttt tcattcagta gtatagcccc accaccacat 32880 agcttataca gatcaccgta ccttaatcaa actcacagaa ccctagtatt caacctgcca 32940 cctccctccc aacacacaga gtacacagtc ctttctcccc ggctggcctt aaaaagcatc 33000 atatcatggg taacagacat attcttaggt gttatattcc acacggtttc ctgtcgagcc 33060 aaacgctcat cagtgatatt aataaactcc ccgggcagct cacttaagtt catgtcgctg 33120 tccagctgct gagccacagg ctgctgtcca acttgcggtt gcttaacggg cggcgaagga 33180 gaagtccacg cctacatggg ggtagagtca taatcgtgca tcaggatagg gcggtggtgc 33240 tgcagcagcg cgcgaataaa ctgctgccgc cgccgctccg tcctgcagga atacaacatg 33300 gcagtggtct cctcagcgat gattcgcacc gcccgcagca taaggcgcct tgtcctccgg 33360 gcacagcagc gcaccctgat ctcacttaaa tcagcacagt aactgcagca cagcaccaca 33420 atattgttca aaatcccaca gtgcaaggcg ctgtatccaa agctcatggc ggggaccaca 33480 gaacccacgt ggccatcata ccacaagcgc aggtagatta agtggcgacc cctcataaac 33540 acgctggaca taaacattac ctcttttggc atgttgtaat tcaccacctc ccggtaccat 33600 ataaacctct gattaaacat ggcgccatcc accaccatcc taaaccagct ggccaaaacc 33660 tgcccgccgg ctatacactg cagggaaccg ggactggaac aatgacagtg gagagcccag 33720 gactcgtaac catggatcat catgctcgtc atgatatcaa tgttggcaca acacaggcac 33780 acgtgcatac acttcctcag gattacaagc tcctcccgcg ttagaaccat atcccaggga 33840 acaacccatt cctgaatcag cgtaaatccc acactgcagg gaagacctcg cacgtaactc 33900 acgttgtgca ttgtcaaagt gttacattcg ggcagcagcg gatgatcctc cagtatggta 33960 gcgcgggttt ctgtctcaaa aggaggtaga cgatccctac tgtacggagt gcgccgagac 34020 aaccgagatc gtgttggtcg tagtgtcatg ccaaatggaa cgccggacgt agtcatattt 34080 cctgaagcaa aaccaggtgc gggcgtgaca aacagatctg cgtctccggt ctcgccgctt 34140 agatcgctct gtgtagtagt tgtagtatat ccactctctc aaagcatcca ggcgccccct 34200 ggcttcgggt tctatgtaaa ctccttcatg cgccgctgcc ctgataacat ccaccaccgc 34260 agaataagcc acacccagcc aacctacaca ttcgttctgc gagtcacaca cgggaggagc 34320 gggaagagct ggaagaacca tgtttttttt tttattccaa aagattatcc aaaacctcaa 34380 aatgaagatc tattaagtga acgcgctccc ctccggtggc gtggtcaaac tctacagcca 34440 aagaacagat aatggcattt gtaagatgtt gcacaatggc ttccaaaagg caaacggccc 34500 tcacgtccaa gtggacgtaa aggctaaacc cttcagggtg aatctcctct ataaacattc 34560 cagcaccttc aaccatgccc aaataattct catctcgcca ccttctcaat atatctctaa 34620 gcaaatcccg aatattaagt ccggccattg taaaaatctg ctccagagcg ccctccacct 34680 tcagcctcaa gcagcgaatc atgattgcaa aaattcaggt tcctcacaga cctgtataag 34740 attcaaaagc ggaacattaa caaaaatacc gcgatcccgt aggtcccttc gcagggccag 34800 ctgaacataa tcgtgcaggt ctgcacggac cagcgcggcc acttccccgc caggaacctt 34860 gacaaaagaa cccacactga ttatgacacg catactcgga gctatgctaa ccagcgtagc 34920 cccgatgtaa gctttgttgc atgggcggcg atataaaatg caaggtgctg ctcaaaaaat 34980 caggcaaagc ctcgcgcaaa aaagaaagca catcgtagtc atgctcatgc agataaaggc 35040 aggtaagctc cggaaccacc acagaaaaag acaccatttt tctctcaaac atgtctgcgg 35100 gtttctgcat aaacacaaaa taaaataaca aaaaaacatt taaacattag aagcctgtct 35160 tacaacagga aaaacaaccc ttataagcat aagacggact acggccatgc cggcgtgacc 35220 gtaaaaaaac tggtcaccgt gattaaaaag caccaccgac agctcctcgg tcatgtccgg 35280 agtcataatg taagactcgg taaacacatc aggttgattc atcggtcagt gctaaaaagc 35340 gaccgaaata gcccggggga atacataccc gcaggcgtag agacaacatt acagccccca 35400 taggaggtat aacaaaatta ataggagaga aaaacacata aacacctgaa aaaccctcct 35460 gcctaggcaa aatagcaccc tcccgctcca gaacaacata cagcgcttca cagcggcagc 35520 ctaacagtca gccttaccag taaaaaagaa aacctattaa aaaaacacca ctcgacacgg 35580 caccagctca atcagtcaca gtgtaaaaaa gggccaagtg cagagcgagt atatatagga 35640 ctaaaaaatg acgtaacggt taaagtccac aaaaaacacc cagaaaaccg cacgcgaacc 35700 tacgcccaga aacgaaagcc aaaaaaccca caacttcctc aaatcgtcac ttccgttttc 35760 ccacgttacg taacttccca ttttaagaaa actacaattc ccaacacata caagttactc 35820 cgccctaaaa cctacgtcac ccgccccgtt cccacgcccc gcgccacgtc acaaactcca 35880 ccccctcatt atcatattgg cttcaatcca aaataaggta tattattgat gatg 35934 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence for amplification of Influnza strain A/Panama/2007/99 HA gene <400> 6 cacacaggta ccgccatgaa gactatcatt gctttgagc 39 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence for amplification of Influnza strain A/Panama/2007/99 HA gene <400> 7 cacacaggta cctcaaatgc aaatgttgca cc 32 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence for amplification of Influenza strain B/HongKong/330/01 HA gene <400> 8 cacacaggta ccgccatgaa ggcaataatt gtactac 37 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence for amplification of Influenza strain B/HongKong/330/01 HA gene <400> 9 cacacaggta ccagtagtaa caagagcatt tttcaataac g 41 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification of tetracycline resistance gene from plasmid pBR322 <400> 10 gagctcggta ccttctcatg tttgacagct tatcat 36 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification of tetracycline resistance gene from plasmid pBR322 <400> 11 tctagaggta ccaacgctgc ccgagatgcg ccgcgt 36

Claims (69)

  1. SEQ ID NO:1을 함유하는 제1 아데노바이러스 서열, 프로모터 서열, 다중 클로닝 부위(MCS), 전사 터미네이터(transcriptional terminator), SEQ ID NO:2를 함유하는 제2 아데노바이러스 서열, SEQ ID NO:4를 함유하는 제3아데노바이러스 서열, 박테리아 복제원점(origin of replication) 및 항생제 내성 유전자를 함유하고, 상기 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4는 원핵 세포 내에서 재조합 아데노바이러스 셔틀 플라스미드와 아데노바이러스 백본(backbone) 플라스미드 사이에 상동 재조합이 일어나게 하여 포장세포(packaging cell)에서 RCA(replication-competent adenovirus)가 없는 Ad 벡터를 생성시킬 수 있는 서열을 포함하는, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)(CMV) 메이저 극초기(major immeadiate-early) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV) 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, 연장인자 1-α(EF1-α) 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터, 및 라우스 육종바이러스 프로모터로 이루어진 그룹에서 선택되는 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 전사 터미네이터가 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하는 진핵 폴리아데닐화 신호인 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 박테리아의 복제원점이 pBR322 복제원점에서 유도될 수 있는 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항생제 내성 유전자가 앰피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 블레오마이신 내성 유전자, 및 지오신(zeocin) 내성 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 원핵세포가 이. 콜라이(E. coli)인 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 이. 콜라이가 BJ5183인 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 pAdHigh인 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  9. 아데노바이러스 혈청형 5에서 유도된 서열 1-454를 함유하는 제1 아데노바이러스 서열, 프로모터 서열, 폴리링커(polylinker), 전사 터미네이터, 아데노바이러 스 혈청형 5에서 유도된 3511 내지 5796 서열을 함유하는 제2 아데노바이러스 서열, 서열 34931-35935를 함유하는 제3 아데노바이러스 서열, 박테리아 복제원점, 및 항생제 내성 유전자를 함유하고, 이때 상기 제2 및 제3 아데노바이러스 서열은 원핵세포 내에서 재조합 아데노바이러스 셔틀 플라스미드와 아데노바이러스 백본 플라스미드 사이에 상동 재조합을 가능하게 하는 서열을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV) 메이저 극초기 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV) 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, 연장인자 1-α(EF1-α) 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터, 헤르페스 바이러스 프로모터, 및 라우스 육종바이러스 프로모터로 이루어진 그룹에서 선택되는 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  11. 제9항에 있어서, 상기 전사 터미네이터가 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하는 진핵 폴리아데닐화 신호인 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  12. 제9항에 있어서, 상기 박테리아의 복제원점이 pBR322 복제원점에서 유도될 수 있는 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  13. 제9항에 있어서, 상기 항생제 내성 유전자는 앰피실린 내성 유전자, 카나마 이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 블레오마이신 내성 유전자, 및 지오신(zeocin) 내성 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  14. 제9항에 있어서, 상기 원핵세포가 이. 콜라이(E. coli)인 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 상기 이. 콜라이가 BJ5183인 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  16. 제9항에 있어서, 상기 벡터는 pAdHigh인 것이 특징인, 재조합 아데노바이러스 벡터.
  17. a. 제1 아데노바이러스 서열 및 제1 항생제 내성 유전자를 함유하는 제1 셔틀 플라스미드, 및 제1 셔틀 플라스미드에는 존재하지 않는 추가적인 아데노 바이러스 서열을 함유하는 제2 아데노바이러스 서열 및 제1 항생제 내성 유전자와는 상이한 제2 항생제 내성 유전자를 함유하는 제2 셔틀 플라스미드를 원핵세포에 공동-형질전환하는 단계로서, 공동-형질전환은 제1 및 제2 셔틀 플라스미드 사이에서 상동 재조합이 일어나게 하고, 제1 및 제2 셔틀 플라스미드에 존재하는 항생제 내성 유전자를 모두 발현하는 원핵 형질전환주(transformant)가 제1의 재조합 아데노바 이러스 플라스미드를 포함하는 것인, 단계;
    b. 원핵세포에서 제1 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 회수하는 단계;
    c. 제1 재조합 아데노바이러스 플라스미드 및 아데노바이러스 백본 플라스미드를 또 다른 원핵세포에 공동-형질전환시켜, 원핵 형질전환주가 제2 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 함유하는 것인 단계;
    d. 원핵세포에서 상기 제2 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 회수하는 단계;
    e. 상기 제2 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 이용하여 PER.C6 포장세포를 트랜스펙팅하는 단계; 및
    f. 실질적으로 RCA를 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스를 PER.C6 세포에서 회수하는 단계를 포함하는,
    복제가능 아데노바이러스(RCA)를 실질적으로 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스를 생산하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제1 셔틀 플라스미드는 pShuttle-CMV인 것이 특징인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 제2 셔틀 플라스미드는 pAdApt-Tc인 것이 특징인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 항생제 내성 유전자가 앰피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 블레오마이신 내성 유전자, 및 지오신(zeocin) 내성 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 것이 특징인, 방법.
  21. 제17항에 있어서, pShuttleCMV 내에 존재하지 않는 추가적 아데노바이러스 서열이 아데노바이러스 혈청형 5 유래의 아데노바이러스 서열 342 내지 454 및 아데노바이러스 혈청형 5 유래의 아데노바이러스 서열 3511 내지 3533을 함유하는 것이 특징인, 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 아데노바이러스 백본 플라스미드가 pAdEasy1인 것이 특징인 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기 원핵세포가 이. 콜라이인 것이 특징인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 이. 콜라이가 BJ5183인 것이 특징인 방법.
  25. 제17항에 기재된 방법에 의해 발생된 재조합 아데노바이러스 벡터.
  26. 제17항에 기재된 방법에 의해 발생된 재조합 아데노바이러스.
  27. a. 제1 아데노바이러스 서열을 함유하는 제1 셔틀 플라스미드 및 제1 셔틀 플라스미드에 존재하지 않는 추가적인 아데노바이러스 서열을 함유하는 제2 셔틀 플라스미드를 1 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 분해하는 단계;
    b. 제2 셔틀 플라스미드 유래의 추가적 아데노바이러스 서열을 포함하는 절편(fragment)을 절단하는 단계;
    c. 추가적 아데노바이러스 서열을 함유하는 단편을 제1셔틀 플라스미드에 접합하여(ligating) 대응하는 단편을 대체하고, 이로써 제1 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 수득하는 단계;
    d. 제1 재조합 아데노바이러스 플라스미드 및 아데노바이러스 백본 플라스미드를 또 다른 원핵세포에 공동-형질전환시켜, 원핵 형질전환주가 제2 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 함유하는 것인 단계;
    e. 원핵세포에서 제2 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 회수하는 단계;
    f. 제2 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 PER.C6 포장세포(packaging cell)에 트랜스펙팅시키는 단계; 및
    g. 실질적으로 RCA를 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스를 세포로부터 회수하는 단계를 포함하는,
    복제가능 아데노바이러스(RCA)를 실질적으로 함유하지 않는 재조합 아데노바 이러스를 발생시키는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 제1셔틀 플라스미드는 pShuttleCMV인 것이 특징인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 제2셔틀 플라스미드는 pAdApt인 것이 특징인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 항생제 내성 유전자가 앰피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 블레오마이신 내성 유전자, 및 지오신(zeocin) 내성 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 것이 특징인, 방법.
  31. 제27항에 있어서, pShuttleCMV 내에 존재하지 않는 추가적 아데노바이러스 서열이 아데노바이러스 혈청형 5 유래의 아데노바이러스 서열 342 내지 454 및 아데노바이러스 혈청형 5 유래의 아데노바이러스 서열 3511 내지 3533을 함유하는 것이 특징인, 방법.
  32. 제27항에 있어서, 상기 아데노바이러스 백본 플라스미드가 pAdEasy1인 것이 특징인 방법.
  33. 제27항에 있어서, 상기 원핵세포가 이. 콜라이인 것이 특징인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 이. 콜라이가 BJ5183인 것이 특징인 방법.
  35. 제27항에 기재된 방법에 의해 발생된 재조합 아데노바이러스 벡터.
  36. 제27항에 기재된 방법에 의해 발생된 재조합 아데노바이러스.
  37. 약학적 허용성의 부형제와 함께, 1 이상의 당해 이종 핵산을 발현하는, 복제가능 아데노바이러스(RCA)를 실질적으로 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스를 함유하는 면역원성 조성물.
  38. 제37항에 있어서, RCA를 실질적으로 함유하지 않는 아데노바이러스가 아데노바이러스 혈청형 5(Ad 5)인 것이 특징인, 면역원성 조성물.
  39. 제37항에 있어서, RCA를 실질적으로 함유하지 않는 아데노바이러스가 제17항에 기재된 방법에 의해 발생된 것이 특징인, 면역원성 조성물.
  40. 제37항에 있어서, RCA를 실질적으로 함유하지 않는 아데노바이러스가 제27항에 기재된 방법에 의해 발생된 것이 특징인, 면역원성 조성물.
  41. 제37항에 있어서, 상기 당해 1 이상의 이종 핵산에는 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, 순환 재조합형(circulating recombinant form), 하이브리드 형(hybrid form), 임상 분리주(clinical isolate), 및 야외 분리주(field isolate)를 포함하는 인플루엔자 스트레인에서 유도된 인플루엔자 유전자가 포함되는 것이 특징인, 면역원성 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 인플루엔자 유전자가 인플루엔자 혈구응집소(hemagglutinin) 유전자, 인플루엔자 매트릭스 유전자, 인플루엔자 뉴라미니다아제(neuraminidase) 유전자, 및 인플루엔자 핵단백질 유전자를 포함하는 것이 특징인, 면역원성 조성물.
  43. 제37항에 있어서, 추가로 보조약을 함유하는 것이 특징인, 면역원성 조성물.
  44. 약학적 허용성의 부형제와 함께, 1 이상의 당해 인플루엔자 면역원(immunogen)을 발현하는, 복제가능 아데노바이러스(RCA)를 실질적으로 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스를 함유하는 면역원성 조성물.
  45. 제44항에 있어서, RCA를 실질적으로 함유하지 않는 아데노바이러스가 아데노바이러스 혈청형 5(Ad 5)인 것이 특징인, 면역원성 조성물.
  46. 제44항에 있어서, RCA를 실질적으로 함유하지 않는 아데노바이러스가 제17항에 기재된 방법에 의해 발생된 것이 특징인, 면역원성 조성물.
  47. 제44항에 있어서, RCA를 실질적으로 함유하지 않는 아데노바이러스가 제27항에 기재된 방법에 의해 발생된 것이 특징인, 면역원성 조성물.
  48. 제44항에 있어서, 상기 1 이상의 인플루엔자 면역원이 인플루엔자 혈구응집소, 인플루엔자 매트릭스, 인플루엔자 뉴라미니다아제, 및 인플루엔자 핵단백질을 포함하는 것이 특징인, 면역원성 조성물.
  49. 제44항에 있어서, 상기 당해 1 이상의 인플루엔자 면역원이 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, 순환 재조합형, 하이브리드 형, 임상 분리주, 및 야외 분리주를 포함하는 인플루엔자 스트레인에서 유도된 것이 특징인, 면역원성 조성물.
  50. 제44항에 있어서, 추가로 보조약을 함유하는 것이 특징인, 면역원성 조성물.
  51. a. 제1항, 제9항, 제25항, 또는 제35항에 기재된 재조합 아데노바이러스 벡터를 1 이상의 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)로 분해하고, 이로써 아데노바이 러스 벡터를 선형화하는 단계;
    b. 프로모터 서열에 작동가능하게(operably) 연결된 1 이상의 이종 핵산을 아데노바이러스 벡터에 접합시키는 단계;
    c. 아데노바이러스 벡터를 포유류 포장세포로 트랜스펙팅하는 단계; 및
    d. 포유류 포장세포에서 1 이상의 이종 핵산을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 회수하는 단계를 포함하는,
    복제가능 아데노바이러스(RCA)를 실질적으로 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스에서 1 이상의 이종 핵산을 발현하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)에서 유도된 것이 특징인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 1 이상의 이종 핵산에는 인플루엔자 유전자가 포함되는 것이 특징인 방법.
  54. 제51항에 있어서, 상기 프로모터 서열이 사이토메갈로바이러스(CMV) 메이저 극초기 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV) 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, 연장인자 1-α(EF1-α) 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터, 헤르페스 바이러스 프로모터, 및 라우스 육종바이러스 프로모터로 이루어진 그룹에서 선택되는 것이 특징인, 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 인플루엔자 유전자에는 인플루엔자 혈구응집소 유전자, 매트릭스 유전자, 인플루엔자 뉴라미나다아제 유전자, 및 인플루엔자 핵단백질 유전자가 포함되는 것이 특징인, 방법.
  56. 제53항에 있어서, 상기 인플루엔자 유전자는 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, 순환 재조합형, 하이브리드형, 임상 분리주, 및 야외 분리주를 함유하는 인플루엔자 스트레인에서 유도된 것이 특징인 방법.
  57. 제44항에 기재된 조성물을 면역학적 유효량으로 검체에 투여하는 것을 포함하는, 면역원성반응(immunogenic response)을 필요로 하는 검체 내에 인플루엔자에 대한 면역원성반응을 유도하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 인플루엔자 면역원이 인플루엔자 혈구응집소, 인플루엔자 매트릭스, 인플루엔자 뉴라미니다아제, 및 인플루엔자 핵단백질을 포함하는 것이 특징인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 인플루엔자 면역원이 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, 순환 재조합 형태, 하이브리드 형태, 임상 분리주, 및 야외 분리주를 포함하는 인플루엔자 스트레인에서 유도되는 것이 특징인 방법.
  60. 제57항에 있어서, 추가로 보조약을 함유하는 것이 특징인 방법.
  61. 복제가능 아데노바이러스(RCA)를 실질적으로 함유하지 않으며 1 이상의 이종 핵산을 발현하는 재조합 아데노바이러스와 세포를 접촉시키는 단계, 및 1 이상의 이종 핵산을 발현하기에 충분한 조건 하에서 세포를 배양 또는 동물을 유지하는 단계를 포함하는, 당해 세포에서 1 이상의 이종 핵산을 도입 및 발현하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 세포가 사람 세포인 것이 특징인 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)에서 유도되는 것이 특징인 방법.
  64. 제61항에 있어서, 1 이상의 이종 핵산이 인플루엔자 유전자를 포함하는 것이 특징인 방법.
  65. 제61항에 있어서, 상기 인플루엔자 유전자가 인플루엔자 혈구응집소 유전자, 인플루엔자 매트릭스 유전자, 인플루엔자 뉴라미니다아제 유전자, 및 인플루엔자 핵단백질 유전자를 포함하는 것이 특징인 방법.
  66. 제61항에 있어서, 상기 인플루엔자 유전자가 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, 순환 재조합형, 하이브리드형, 임상 분리주, 및 야외 분리주를 포함하는 인플루엔자 스트레인에서 유도된 것이 특징인 방법.
  67. 제1항에 기재된 재조합 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스 백본 플라스미드, 및 이. 콜라이 BJ5183 세포를 함유한 키트(kit).
  68. 제67항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스 셔틀 벡터가 pAdHigh 또는 이의 유도체인 것이 특징인 키트.
  69. 제67항에 있어서, 상기 아데노바이러스 백본 플라스미드가 pAdEasy1인 것인 특징인 키트.
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