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KR20070114209A - 리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법 - Google Patents

리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법 Download PDF

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KR20070114209A
KR20070114209A KR1020077023368A KR20077023368A KR20070114209A KR 20070114209 A KR20070114209 A KR 20070114209A KR 1020077023368 A KR1020077023368 A KR 1020077023368A KR 20077023368 A KR20077023368 A KR 20077023368A KR 20070114209 A KR20070114209 A KR 20070114209A
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KR
South Korea
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ala
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val
thr
Prior art date
Application number
KR1020077023368A
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English (en)
Inventor
마티 살버그
카타리나 헐트그렌
Original Assignee
트리펩 아베
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Filing date
Publication date
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Abstract

본 명세서에서는 가축, 스포츠용 동물 또는 애완 동물 및 인간 등의 동물에서 백신의 효과를 증강시키기 위한 조성물 및 방법에 대해 개시한다. 보다 구체적으로, 질병, 바람직하게는 HCV 감염을 치료 및 예방하는 데 사용하기 위한 리바비린 및 항원, 바람직하게는 간염 C 바이러스(HCV)에 존재하는 에피토프를 보유하는 항원을 함유하는 백신 조성물에 대해 개시한다.

Description

리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법{VACCINES CONTAINING RIBAVIRIN AND METHODS OF USE THEREOF}
본 발명은 가축, 스포츠용 동물 또는 애완 동물과 인간 등의 동물에게서 백신 효과를 증강시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 바람직한 구체예는 리바비린의 면역 보강제(adjuvant)로서의 용도 및 리바비린과 항원을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
인간, 사육 가축, 스포츠용 동물, 및 가정 애완 동물의 질병을 예방하기 위해 백신을 사용하는 것은 일반적인 일이다. 그러나, 백신에 사용되는 항원은 추후의 항원에의 노출에 대한 보호를 제공하기에 충분한 농도로 항체 역가를 높이거나 또는 장기간에 걸쳐 그러한 농도를 나타낼 수 있는 잠재력을 유지하기에 충분한 면역원성을 보유하지 못한 경우가 빈번하다. 또한, 다수의 백신은 대체로 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 1차 면역 방어 작용인 세포 매개 면역을 유도하는 기능이 부족하다. 더 강력한 백신의 개발 및 항원 함유 제제의 면역원성을 증강시키는 방법에 대해 현재 상당히 많은 연구가 집중되고 있다[참고 문헌의 예: 미국 특허 제6,056,961호; 제6,060,068호; 제6,063,380호; 및 Li 등의 문헌, Science 288:2219- 2222(2000)].
그러한 "약한" 백신 중에서도 악명이 높은 것은 간염 B 백신이다. 예를 들어, 간염 B 바이러스에 대한 재조합 백신, 예컨대 Genhevacb(Pasteur Merieux Serums et Vaccines, 58, Avenue Leclerc 69007 Lyon, France), Engerixb(스미스, 클라인 앤드 심볼 프렌치) 및 Recombivaxhb(머크, 샤프, 앤드 돔)는 0일, 30일, 및 60일 또는 80일 째 3회 이상 접종한 후 1년 후에 반드시 추가 접종하는 경우에만 효력이 나타난다(Chedid 등, 미국 특허 제6,063,380호). 또한, 이들 백신을 접종받은 다수의 피험자들은 반응을 나타낸다고 하더라도 미미하게 반응한다. HBV 감염은 세계 여러 지역의 풍토병이기 때문에, 기존의 HBV 백신이 지닌 낮은 면역원성 특성은 매우 심각한 문제로 대두되었다.
더 강력한 체액 및/또는 세포 반응을 얻기 위해, 백신에 존재하는 항원에 대한 환자의 면역 반응을 증강시키는 물질 중에 함유된 백신을 투여하는 것은 보편적인 일이다. 백신 프로토콜에 가장 일반적으로 사용되는 면역 보강제는 오일 제제와 명반이다(Chedid 등, 미국 특허 제6,063,380호). 더 많은 종류의 안전하고 효과적인 면역 보강제가 요구되고 있다.
뉴클레오사이드 유사체는 바이러스 복제를 감소시킬 수 있는 능력으로 인해 항-바이러스 요법에 널리 사용되어 왔다[Hosoya 등, J. Inf. Dis., 168:641-646(1993)]. 리바비린 (1-β-D-리보푸라노실-1,2,4-트리아졸-3-카르복사미드)는 RNA 및 DNA 바이러스 복제를 억제하기 위해 사용되어 온 합성 구아노신 유사체이다(Huffman 등, Antimicrob. Agents. Chemother., 3:235(1973); Sidwell 등, Science, 177:705(1972)]. 리바비린은 IMP를 IMX(IMX는 후에 GMP로 전환된다)전환시키는 이노시톨 모노-포스페이트(IMP) 디하이드로게나제(IMPDH)의 경쟁적 억제제인 것으로 밝혀졌다. 이에 대해서는 De Clercq의 문헌[Anti viral Agents: characteristic activity spectrum depending on the molecular target with which they interact, Academic press, Inc., New York N.Y., pp. 1-55(1993)]을 참조할 수 있다. GTP의 세포내 풀은 장기간의 리바비린 치료로 인해 고갈되었다.
연구자들은 일부 구아노신 유사체가 항바이러스 활성을 지닐 뿐 아니라 면역계에도 영향을 미친다는 것을 알게 되었다(미국 특허 제6,063,772호 및 제4,950,647호). 리바비린은 기능성 체액 면역 반응을 억제하고[Peavy 등, J. Immunol., 126:861-864(1981); Powers 등, Antimicrob. Agents. Chemother., 22:108-114(1982)], 비만 세포 분비의 IgE-매개 조절을 억제하는 것으로 확인되었다[Marquardt 등, J. Pharmacol. Exp. Therapeutics, 240:145-149(1987)]. 몇몇 연구자들은 리바비린의 일일 경구 요법은 인간과 마우스에 면역 조절 효과를 나타낸다고 보고하였다[Hultgren 등, J. Gen. Virol., 79:231-2391(1998) 및 Cramp 등, Gastron. Enterol., 118:346-355(2000)]. 그러나, 리바비린이 면역계에 미치는 영향에 관한 현재의 지식은 아직 미미한 수준이다.
본 발명은 가축, 스포츠용 동물 또는 애완 동물과 인간 등의 동물에게서 백신 효과를 증강시키기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 구체적으로, 바람직한 구체예는 리바비린의 면역 보강제(adjuvant)로서의 용도 및 리바비린과 항원을 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명자들은 리바비린이 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 면역 보강제로서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 명세서에서 개시하는 본 발명의 구체예는 항원 및 리바비린을 함유하는 "강력한" 백신 제제를 포함한다. 일반적으로 이들 제제는 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하기에 충분한 양의 리바비린을 함유한다. 본 발명의 다른 양태는 인간을 비롯한 동물의 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 방법을 포함한다. 한 방법의 예를 들어 보면, 항원에 대한 유효 면역 반응이 필요한 동물을 먼저 확인한 다음, 항원과 함께 일정량의 리바비린을 투여한다. 어떤 방법에서는, 리바비린과 항원을 함께(예컨대, 단일 조성물로서) 투여하고, 다른 방법에서는 리바바린과 항원을 개별적으로 투여한다. 몇몇 구체예는 또한 리바비린과 항원을 함유하는 조성물의 제조 방법과 그 용도에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 리바비린 및 사실상 어떠한 종류의 항원 또는 에피토프 도 포함하지만, 바람직한 조성물은 리바비린과 간염 바이러스 항원 또는 에피토프를 함유한다. 항원 또는 에피토프는 펩티드 또는 핵산계(예컨대, 펩티드 항원을 암호화하는 RNA 또는 피험체에 도입되면 펩티드 항원을 발현하는 작제물)일 수 있다. 리바비린 및 간염 A 바이러스(HAV) 유래의 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물이 한 구체예가 된다. 리바비린 및 간염 B 바이러스(HBV) 유래의 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물 역시 한 구체예가 된다. 적절한 HBV 항원의 예로는 간염 B 표면 항원(HBsAg), 간염 코어 항원(HBcAg), 간염 e 항원(HBeAg) 및 이들 분자를 암호화하는 핵산을 들 수 있다. 그 밖에도 리바비린 및 간염 C 바이러스(HCV) 유래의 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물도 한 구체예가 된다. 적절한 HCV 항원으로는 HCV 서열(예컨대, NS3 및/또는 NS4A)의 하나 이상의 도메인 및 이들 분자를 암호화하는 핵산을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
새로운 HCV 서열 역시 발견되었다. HCV에 감염된 환자로부터 HCV 게놈의 신규 NS3/4A 단편을 클로닝하고 그 서열을 분석하였다(서열 번호 16). 이 서열은 가장 밀접하게 관련된 HCV 서열과의 상동성이 93%에 불과한 것으로 확인되었다. 이 신규 펩티드(서열 번호 17) 및 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편들, 이들 분자를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 보유하는 벡터, 및 상기 벡터, 핵산 또는 펩티드를 보유하는 세포 역시 본 발명의 한 구체예가 된다. 특히 바람직한 구체예는 리바비린 및 서열 번호 17의 HCV 펩티드 또는 아미 노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편들(서열 번호 25) 또는 상기 펩티드 또는 단편들을 암호화하는 핵산을 함유하는 백신 조성물이다.
또한, 본 발명자들은 NS3/4A 펩티드의 절두형 돌연변이체 및 단백질 분해 절단 부위가 없는 돌연변이체가 면역원성이 크다는 사실을 발견하였다. 이들 신규 펩티드(서열 번호 29-32 및 43-49) 및 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이들의 단편들(예, 서열 번호 26, 17 및 33-42), 이들 분자들을 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 보유하는 벡터, 및 상기 벡터, 핵산 또는 펩티드를 보유하는 세포 역시 한 구체예가 된다. 특히 바람직한 구체예는 리바비린 및 서열 번호 29-32및 43-49의 하나 이상의 HCV 펩티드 또는 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편들(서열 번호 26, 27 및 33-42) 또는 상기 펩티드 또는 단편들을 암호화하는 핵산을 함유하는 백신 조성물이다.
또한, 상기 항원의 혼합물을 함유한 조성물도 본 발명의 한 구체예가 된다. 예를 들어, 몇몇 조성물은 HBV 항원, HAV 항원 및 리바비린; 또는 HBV 항원, HCV 항원 및 리바비린; 또는 HAV 항원, HCV 항원 및 리바비린; 또는 HBV 항원, HAV 항원, HCV 항원 및 리바비린을 포함한다. 다른 구체예는 리바비린 및 전술한 항원의 혼합물을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예는 비제한적인 예로 명반, 오일 및 면역 반응을 증강시키는 기타 화합물을 비롯하여 당업계에 공지된 다른 면역 보강제, 결합제, 유화제, 캐리어 및 충전제를 포함하기도 한다.
본 명세서에 개시된 조성물의 제조 방법 및 사용 방법 역시 본 발명의 한 양 태이다. 몇몇 방법은 단일 조성물(예, 백신 조성물)로 제제화하기 위해 펩티드 또는 핵산 항원(예, HAV, HBV, HCV 항원)과 리바비린을 혼합하여 실시한다. 바람직한 방법은 HCV의 하나 이상의 도메인 상에 존재하는 에피토프를 갖는 HCV 항원(예, NS3 및/또는 NS4A)과 리바비린을 혼합하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 조성물을 사용하는 바람직한 방법은 이를 필요로 하는 동물에게 충분한 양의 리바비린 및 간염 바이러스 항원(예, HBV 항원, HAV 항원, HCV 항원, 이들 항원 중 하나를 암호화하는 핵산 또는 이들의 임의의 조합물)을 투여하는 것을 포함한다. 한가지 실시 방법의 예를 들면, 간염 바이러스 항원에 대한 유효 면역 반응이 필요한 동물(예컨대, 간염에 감염될 위험이 있거나 이미 감염된 동물)을 먼저 확인하고, 간염 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하기에 유효한 양의 리바비린 및 간염 바이러스 항원(단일 조성물로 또는 개별적으로)을 투여한다. 바람직하게는, HCV에 대한 유효 면역 반응이 필요한 동물을 확인한 후, 상기 동물에게 리바비린 및 서열 번호 1, 6, 7, 또는 17에 존재하는 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물을 투여한다. 특히 바람직한 방법은 HCV에 대한 유효 면역 반응이 필요한 동물을 확인한 후, 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하기에 충분한 양의 리바비린 및 HCV 항원[예, NS3/4A(서열 번호 17), 돌연변이 NS3/4A(서열 번호 29-32 및 43-49), 또는 아미노산 길이가 최소한 3, 4-10, 10-20, 20-30, 또는 30-50개인 이들의 단편(예, 서열 번호 25-27 및 33-42), 또는 이들 분자 중 하나 이상을 암호화하는 핵산]을 함유하는 조성물을 상기 동물에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 조성물은 가축, 스포츠용 동물 또는 애완 동물과 인간 등의 동물에게서 백신 효과를 증강시키는 효과가 있고, 본 발명의 신규 펩티드 및 이 펩티드를 암호화하는 핵산은 수용체에게 유효 면역 반응을 제공하는 조성물을 제조할 수 있는 강력한 면역원으로서 작용하는 효과가 있다.
본 발명자들은 리바비린 및 항원(예컨대, 바이러스, 박테리아, 사상균, 효모 또는 기생충 등의 병원균의 에피토프를 포함하는 분자)을 함유하는 조성물이 항원에 대한 동물의 면역 반응을 증강 및/또는 촉진한다는 사실을 발견하였다. 즉, 리바비린은 효과적인 "면역 보강제(adjuvant)"라는 사실을 발견하였는데, "면역 보강제"는 본 명세서에서 특정 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 능력을 보유한 물질을 의미하는 용어로 사용된다. 리바비린의 면역 보강 활성은 항원에 대한 면역-매개 보호작용의 현저한 증가, 항원에 대해 생성된 항체 역가의 증가 및 증식성 T 세포 반응의 증가에 의해 분명히 확인되었다.
본 명세서에서는 리바비린 및 항원 또는 에피토프를 함유하는 몇 가지 조성물(예, 백신)에 대해 기술한다. 리바비린을 함유하는 백신 조성물은, 예컨대 리바비린의 양, 리바비린의 형태, 및 항원의 종류에 따라 다양할 수 있다. 항원은 펩티드 또는 핵산(예컨대, 펩티드 항원을 암호화하는 RNA 또는 피험체에 도입되면 펩티드 항원을 발현하는 작제물)일 수 있다. 바람직한 조성물은 리바비린 및 간염 바이러스 항원(예, HAV 항원, HBV 항원, HCV 항원, 이들 분자들을 암호화하는 핵산, 또 는 이들의 임의의 조합물)을 함유한다. 특히, 서열 번호 1에 존재하는 하나 이상의 HCV 항원 또는 에피토프, 또는 상기 HCV 항원을 암호화하는 핵산을 리바비린과 혼합하여 상기 조성물을 제조하는 것이 바람직하다. 즉, 일부 비제한적인 구체예는 리바비린 및 서열 번호 1을 포함하는 펩티드, 또는 서열 번호 1의 연속 아미노산 길이가 최소한 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 또는 3개인 이들의 단편을 함유하는 조성물을 포함한다. 또 다른 구체예는 리바비린 및 서열 번호 13을 암호화하는 핵산, 또는 서열 번호 13의 연속 뉴클레오타이드의 길이가 최소한 9, 12, 15, 20, 30, 50, 75, 100, 200, 500개인 이의 단편들을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
다른 구체예는 리바비린 및 서열 번호 1의 특정 단편을 함유하는 조성물(예, 백신)을 포함하는데, 이때 상기 단편은 HCV의 특정 도메인에 해당한다. 일부 구체예는, 예컨대 서열 번호 1의 아미노산 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1917, 또는 1972-3011에 상응하는 HCV의 단편을 포함한다. 리바비린 및 상기 단편들 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물 역시 본 발명의 한 구체예가 된다.
그 밖에도, 새로운 HCV 서열을 발견하였다. HCV에 감염된 환자로부터 HCV의 NS3/4A 도메인에 상응하는 새로운 핵산 및 단백질을 클로닝하였다(서열 번호 16). 진뱅크(Genebank) 검색을 통해 클로닝된 서열이 HCV 서열과 최대 상동성을 가졌으나, 가장 밀접하게 관련된 HCV 계통(수탁 번호 AJ 278830)과의 상동성이 93%에 불과하다는 것을 알게 되었다. 이러한 신규 펩티드(서열 번호 17) 및 아미노산 길이 가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편들, 이들 분자를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 보유하는 벡터, 상기 벡터, 핵산 또는 펩티드를 보유하는 세포 역시 본 발명의 한 구체예가 된다. 또한, 본 명세서에서 개시하는 백신 예 중 일부는 리바비린 및 이들 신규 NS3/4A 펩티드 또는 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편(예, 서열 번호 25), 또는 이들 분자 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 포함한다.
신규 NS3/4A 펩티드의 돌연변이체 역시 생성하였다. 본 발명자들은 절두형 돌연변이체(예, 서열 번호 29) 및 단백질 분해 절단 부위가 없는 돌연변이체가 면역원성이 크다는 것을 발견하였다. 이들 신규 펩티드 서열 번호 29-32 및 43-49 및 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편(예, 서열 번호 26, 27 및 33-42), 이들 분자를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 보유하는 벡터, 및 상기 벡터, 핵산 또는 펩티드를 보유하는 세포 역시 한 구체예가 된다. 또한, 본 명세서에 기술된 조성물 중 일부는 리바비린 및 전술한 돌연변이 HCV 펩티드 중 하나 이상, 또는 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편을 포함한다. 다른 백신 예는 리바비린 및 전술한 펩티드 중 하나 이상을 암호화하는 핵산(예, DNA)을 포함한다.
이러한 조성물의 제조 방법 및 사용 방법 역시 구체예가 된다. 예를 들어, 전술한 조성물은 리바비린을 제공하는 단계, 항원(예, HCV 항원을 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 핵산)을 제공하는 단계, 및 상기 리바비린과 상기 항원을 혼합하여 피험체에서 상기 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 데 사용될 수 있는 조성물을 제제화함으로써 제조할 수 있다. 바람직한 방법은 바람직한 항원 또는 에피토프(예, 서열 번호 1, 6, 7, 또는 17을 포함하는 펩티드 또는 이의 특정 단편들, 예컨대 서열 번호 1의 아미노산 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971, 1972-3011 및 이들 분자를 암호화하는 핵산)과 리바비린을 혼합하는 것을 포함한다. 다른 항원 또는 에피토프 역시 리바비린과 혼합할 수 있는데, 그 예로는 연속 아미노산 길이가 최소한 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 또는 3개인 서열 번호 1의 단편과 이들 단편을 암호화하는 핵산을 들 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 특히 바람직한 방법은 새로 발견된 NS3/4A 단편 또는 NS3/4A 돌연변이체(예, 절두형 돌연변이체 또는 단백질 분해 절단 부위가 없는 돌연변이체), 또는 아미노산 길이가 4개 이상인 이의 단편 또는 이들 분자들 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.
인간을 비롯한 동물의 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 방법은 본 발명의 한 구체예가 된다. 이러한 방법은, 예를 들어 항원/에피토프에 대한 유효 면역 반응이 필요한 동물을 확인하는 단계 및 항원/에피토프와 항원/에피토프에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하기에 유효한 양의 리바비린을 함유하는 조성물을 상기 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서는, 리바비린 및 항원을 단일 혼합물 형태로가 아니라 개별적으로 투여한다. 이 경우 리바비린은 항원 투여 직전 또는 직후에 투여하는 것이 바람직하다. 바람직한 방법은 필요로 하는 동물에게 리바비린 및 간염 항원(예, HAV 항원, HBV 항원, HVC 항원, 이들 분자를 암호화하는 핵산, 또는 이들의 임의의 조합물)을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법 중 일부는 HCV 항원, 예컨대 서열 번호 1을 포함하는 펩티드, 서열 번호 1의 연속 아미노산을 최소한 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 또는 3개 갖는 이의 단편들을 포함한다. 또 다른 방법은 리바바린 및 서열 번호 13을 암호화하는 핵산 또는 상기 단편들 중 하나 이상의 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물을 포함한다.
일부 바람직한 방법은, 예컨대 리바바린 및 서열 번호 1을 포함하는 펩티드 또는 HCV 도메인에 상응하는 이의 특정 단편(비제한적인 예로 서열 번호 1의 아미노산 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971, 또는 1972-3011을 포함하는 펩티드가 있음)을 함유하는 조성물(예, 백신)의 용도에 관한 것이다. 특히 바람직한 방법은 서열 번호 17의 NS3/4A 단편 또는 단백질 분해 절단 부위가 없는 돌연변이 NS3/4A(예, 서열 번호 29-32 및 43-49), 또는 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편들(예, 서열 번호 26, 27 및 33-42)을 함유하는 백신 조성물의 용도에 관한 것이다. 리바비린 및 상기 단편들을 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물 역시 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
다른 구체예는 HCV 감염을 치료 및 예방하는 방법에 관한 것이다. 한 방법의 예를 들면, 리바비린 및 HCV 항원 또는 에피토프를 HCV 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 약제를 제조하는 데 사용한다. 다른 방법으로는, HCV 감염을 예방 및/또는 치료하는 약제를 필요로 하는 개체를 확인하고, 이 개체에 리바비린 및 HCV 항원 또는 에피토프, 바람직하게는 서열 번호 1에 존재하는 에피토프, 보다 바람직하게 는 연속 아미노산 길이가 최소한 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10, 또는 3개인 서열 번호 1의 단편, 또는 가장 바람직하게는 1-182, 183-379, 380-792, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971, 또는 1972-3011과 같은 서열 번호 1의 단편, 또는 서열 번호 1 또는 상기 단편들을 암호화하는 핵산을 포함하는 약제를 투여한다. 특히 바람직한 방법은 리바비린 및 서열 번호 17의 NS3/4A 단편 또는 단백질 분해 절단 부위가 없는 돌연변이 NS3/4A(예, 서열 번호 29-32 및 43-49) 또는 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편(예, 서열 번호 25-27 및 33-42) 또는 이들 분자 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 백신 조성물의 용도에 관한 것이다. 하기 섹션에서는 리바비린의 면역 보강제로서의 용도에 대해 더 상세히 설명한다.
리바비린
본 명세서에 기술된 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에게 투여하기 위한 약제를 제조하는 종래의 생약 조제술에 따라 제조할 수 있다. 리바비린은 시판업체(예컨대 시그마 및 ICN)로부터 구입할 수 있다. 리바비린 및/또는 항원은 변형을 가하거나 가하지 않고 백신으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 리바비린 및/또는 항원을 변형시키거나 유도체화하여 보다 안정한 분자 및/또는 보다 강력한 면역 보강제를 제조할 수 있다. 한 방법으로, 리바비린 및/또는 항원의 안정성은 친수성 중합체(예, 폴리에틸렌 글리콜)와 같은 지지체에 이 분자들을 결합시켜서 증강시킬 수 있다.
합리적 약물 디자인 및 조합 화학법에서의 통상적인 기법을 이용하여 더 많 은 리바비린 유도체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 몰리큘러 시뮬레이션즈 인코포레이티드(MSI)와 다수의 기타 공급업체는 기술자들이 유기 분자의 조합 라이브러리를 구축할 수 있도록 하는 소프트웨어를 제공한다. 예를 들어 C2.아날로그 빌더 (C2.Analog Builder) 프로그램과 세리우스2 분자 다이버시티(Cerius2 molecular diversity) 소프트웨어의 MSI 스위트를 통합하여 본 명세서에 기술된 구체예와 함께 사용될 수 있는 리바비린 유도체의 라이브러리를 제작할 수 있다(참조 사이트 예: http://msi.com/life/products/cerius2/index.html).
한 방법으로서, 리바비린의 화학 구조를 컴퓨터로 판독가능한 매체 상에서 기록하고, 하나 이상의 모델링 소프트웨어 응용 프로그램으로 그 정보를 호출한다. C2.아날로그 빌더 프로그램과 C2 다이버시티 프로그램을 함께 사용하면, 사용자가 예컨대 각 치환기 위치에 대한 R-기의 다양성을 기초로 하여 대규모의 가상 라이브러리를 생성할 수 있다. 그 후 가상 라이브러리에서 생성된 모델링된 리바비린 유도체와 구조가 동일한 화합물을 통상적인 화학적 방법을 이용하여 제조하거나, 또는 시판업체로부터 구입할 수 있다.
그 후 새로 제조된 리바비린 유도체를, 분자의 면역 보강 활성 정도 및/또는 면역 반응을 조절할 수 있는 능력의 정도를 측정하는 분석을 통해 스크리닝한다. 몇몇 분석은 C2.루디(C2.Ludi)와 같은 가상 약물 스크리닝 소프트웨어를 포함할 수 있다. C2.루디는 사용자로 하여금, 관심있는 단백질(예, RAC2 또는 다른 GTP 결합 단백질)의 활성 부위와 상호작용하는 능력에 대해 분자들(예, 리바비린 유도체)의 데이터베이스를 검색할 수 있게 하는 소프트웨어 프로그램이다. 가상 약물 스크리 닝 소프트웨어를 사용하여 발견한 예측 상호작용을 기초로 하여, 분자의 면역 보강 활성 및/또는 면역 반응을 조절하는 정도를 측정하는 통상적인 분석을 통한 추가 특성 규명을 위해 리바비린 유도체에 우선 순위를 매길 수 있다. 실시예 1에서는 리바비린의 면역 보강 활성을 평가하는 데 사용된 몇 가지 분석법에 대해 설명한다.
[실시예]
실시예 1
하기 분석에서는 특정 조성물의 면역 보강 활성의 정도를 측정하기 위해 임의의 리바비린 유도체 또는 리바비린 유도체의 조합물을 사용할 수 있다. 제1 세트의 실험에서는, 3∼5 마리의 Balb/c 마우스(BK 유니버설, 스웨덴 웁살라 소재) 그룹에 재조합 간염 C 바이러스 비구조 3(rNS3) 단백질 10 ㎍ 또는 100 ㎍을 0주 및 4주 째에 복강 또는 피하(예컨대, 꼬리 밑둥에) 주사로 접종하였다. rNS3는 단독의 인산염 완충 염수(PBS) 또는 1 mg의 리바비린을 함유하는 PBS(캘리포니아주 코스타 메사 소재의 ICN으로부터 입수)에 용해시켰다. 마우스에 1회 접종당 총 용량 100 ㎕를 주사하였다.
1차 복강 접종 후 2주, 4주 및 6주 째에, 모든 마우스로부터 안와후방 샘플링으로 채혈하였다. 혈청 샘플을 모아서, rNS3에 대한 항체의 존재에 대해 분석하였다. 항체 역가를 측정하기 위해, 효소면역분석(EIA)을 실시하였다[참고 문헌의 예: Hultgren 등, J. Gen. Virol. 79:2381-91(1998) 및 Hultgren 등, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:630-632(1997)]. 항체 농도는 405 nm에서의 흡광도가 비접종 마우 스의 것의 2배 이상으로 나타난 최고 혈청 희석액으로 기록하였다.
PBS 중에서 1 mg 리바비린과 함께 혼합된 10 ㎍ 또는 100 ㎍의 rNS3를 접종한 마우스는 고농도의 NS3 항체를 지속적으로 나타내었다. 접종 후 2주 째에 EIA로 검출된 항체 역가를 도 1에 도시하였다. 1 mg의 리바비린 및 10 ㎍ 또는 100 ㎍의 rNS3를 함유하는 백신 조성물은 rNS3만으로 이루어진 백신 조성물보다 현저히 더 높은 항체 역가를 유도하였다.
제2 세트의 실험에서는, 8 마리의 Balb/c 마우스 그룹에 0주 및 4주에 0 mg, 1 mg, 3 mg, 또는 10 mg의 리바비린(시그마)을 함유하는 인산염 완충 염수 100 ㎕ 중의 10 ㎍ 또는 50 ㎍의 rNS3를 복강 주사하였다. 4주, 6주 및 8주 째에, 마우스로부터 채혈하고 혈청을 분리하여 동결시켰다. 실험 완료 후, 전술한 바와 같이 재조합 NS3에 대한 항체의 농도에 대해 혈청을 테스트하였다. rNS3에 대한 평균 항체 농도를 스튜던트 t-테스트(모수 분석) 또는 맨-휘트니(비-모수 분석) 및 소프트웨어 패키지 StatView 4.5(아바쿠스 컨셉츠, 캘리포니아주 버클리 소재)를 이용하여 그룹들간에 서로 비교하였다. rNS3를 최대 10 ㎍까지 3가지 용량으로 첨가하였을 때의 리바비린의 면역 보강 효과를 표 1에 기재하였다. rNS3를 최대 50 ㎍까지 3가지 용량으로 첨가하였을 때의 리바비린의 면역 보강 효과는 표 2에 기재하였다. 10 ㎍ 또는 50 ㎍의 상이한 양의 rNS3와 상이한 양의 리바비린을 접종한 마우스에서의 평균 rNS3 항체 역가의 모수 비교를 각각 표 3 및 4에 기재하였다. 10 ㎍ 또는 50 ㎍의 상이한 양의 rNS3와 상이한 양의 리바비린을 접종한 마우스에서의 평균 NS3 항체 역가의 비-모수 비교 결과는 각각 표 5 및 6에 기재하였다. 제시된 값은 재조 합 rNS3에 대한 종점 역가를 나타낸다.
Figure 112007073080177-PAT00001
Figure 112007073080177-PAT00002
Figure 112007073080177-PAT00003
Figure 112007073080177-PAT00004
Figure 112007073080177-PAT00005
Figure 112007073080177-PAT00006
상기 데이터는 리바비린이 HCV 항원 또는 HCV 에피토프에 대한 면역 반응을 촉진 또는 증강시킨다는 것을 입증하는 것이다. 1 mg 정도의 리바비린과 10 ㎍의 rNS3 항원을 함유하는 백신 조성물을 접종한 후에 rNS3에 대한 강력한 면역 반응이 유도되었다. 상기 데이터는 또한 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 데 충분한 리바비린의 양이 25∼30 g의 Balb/c 마우스의 경우 1회 접종당 1∼3 mg이라는 증거를 제시한다. 그러나, 이러한 양은 단지 기준을 위해 제시한 것이며, 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든지 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 하지만, 데이터는 약 1∼3 mg의 리바비린을 함유하는 백신 조성물이 리바비린 없이 유도된 면역 반응보다 12배 더 강력한 면역 반응을 유도한다는 것을 나타낸다(표 3 및 4). 따라서, 리바비린은 동물의 체액 면역 반응에 대해 현저한 면역 보강 효과를 나타냄으로써, 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진한다. 하기 실시예에서는 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 데 필요한 리바비린의 양에 대해 더 쉽게 이해하기 위해 실시된 실험에 대해 설명한다.
실시예 2
면역 보강 효과를 제공하기에 충분한 리바비린의 양을 결정하기 위해, 아래의 실험을 수행하였다. 제1 세트의 실험에서는, 마우스 그룹(그룹당 3 마리)에 20 ㎍ rNS3 단독 또는 20 ㎍ rNS3와 0.1 mg, 1 mg 또는 10 mg의 리바비린의 혼합물을 접종하였다. 그 후 항원에 대한 항체의 농도를 EIA로 측정하였다. 1주 및 3주 째의 평균 종점 역가를 그래프로 작성하여 도 2에 나타내었다. 본 발명자들은 리바비린에 의한 면역 보강 효과는 투여된 리바비린의 양에 따라 상이한 키네틱을 나타낸다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 적은 용량(< 1 mg)의 리바비린은 1주 째 항체 농도를 증가시켰으나 3주 째에는 증가시키지 못한 반면, 더 많은 용량(1∼10 mg)은 3주 째에 항체 농도를 증가시키는 것으로 확인되었다.
제2 세트의 실험 역시 수행하였다. 이 실험에서는, 마우스 그룹에 다양한 양의 리바비린과 rNS3를 함유하는 백신 조성물을 주사하였고, 이 동물들에서 IgG 반응을 모니터하였다. 백신 조성물은 약 100 ㎕의 인산염 완충 염수 및 20 ㎍의 rNS3를 포함하고, 0.1 mg, 1.0 mg 또는 10 mg의 리바비린(시그마)을 함유하거나 함유하지 않았다. 6주 째에 마우스로부터 채혈하여, 전술한 바와 같이 EIA로 rNS3-특이적 IgG 농도를 측정하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 지속적 항체 농도에 대한 면역 보강 효과는 25∼30 g 마우스의 경우 1회 주사당 1∼10 mg을 투여하였을 때 가장 두드러졌다.
Figure 112007073080177-PAT00007
제3 세트의 실험에서는, 1차 백신 접종 및 추가 접종 후의 리바비린의 면역 보강 효과를 조사하였다. 이 실험에서는, 리바비린을 함유하거나 함유하지 않고, 10 ㎍의 rNS3를 함유하는 백신 조성물을 마우스에게 2회 복강 주사하고, 전술한 바와 같이 항원에 대한 IgG 서브클래스 반응을 모니터하였다. 따라서, 마우스에게 0.1 또는 1.0 mg의 리바비린(시그마)을 함유하거나 함유하지 않고, 재조합 NS3 10 ㎍만을 함유하는 인산염 완충 염수 100 ㎕를 0주와 4주 째에 접종하였다. 6주 째에 마우스로부터 채혈하여, 전술한 바와 같이 EIA로 NS3-특이적 IgG 서브클래스를 측정하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, 백신 접종 전에 면역원에 리바비린을 첨가하는 것은 NS3-특이적 면역 반응에 있어서 IgG 서브클래스 반응을 변화시키지 않는다. 따라서, 리바비린 및 항원을 함유하는 백신 조성물의 면역 보강 효과는 Th1/Th2 균형의 이동에 의해서는 설명될 수 없다. 리바비린의 면역 보강 효과에는 또 다른 메카니즘이 관여하는 것으로 보인다.
Figure 112007073080177-PAT00008
이 실시예에 제시된 데이터는 리바비린이 면역 보강제로서 투여될 수 있다는 것을 추가로 확인해 주고, 리바비린의 양이 면역 보강 효과의 키네틱을 조절할 수 있다는 것을 입증한다. 하기 실시예에서는 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 리바비린의 능력을 평가하기 위해 수행된 또 다른 분석에 대해 설명한다.
실시예 3
이 분석은 특정 백신 조성물이 세포 면역 반응을 조절하는 정도를 측정하기 위해 임의의 리바비린 유도체 또는 리바비린 유도체의 조합물을 사용하여 실시할 수 있다. 리바비린 함유 백신에 대한 CD4+ T 세포 반응을 측정하기 위해, 마우스 그룹에 PBS 중의 100 ㎍ rNS3 또는 PBS 중의 100 ㎍ rNS3 및 1 mg 리바비린을 피하 주사하였다. 마지막 접종한 후 10일 째 마우스를 죽이고, 이들의 림프절을 회수하여 배액시켰다. 그 후 시험관내 리콜 분석을 실시하였다(참고 문헌의 예: Hultgren 등, J. Gen. Virol. 79:2381-91(1998) 및 Hultgren 등, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:630:632(1997)]. 배양 96시간 째에 [3H] 티미딘의 혼입 정도를 통해 CD4+ T 세포 증식의 양을 측정하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 1 mg의 리바비린과 혼합된 100 ㎍의 rNS3를 접종한 마우스는 PBS 중의 100 ㎍ rNS3를 접종한 마우스보다 더 큰 T 세포 증식성 반응을 나타내었다. 이러한 데이터는 리바비린이 세포 면역 반응을 증강 또는 촉진한다(예컨대, T 세포의 효과적인 프라이밍을 촉진함으로써)는 또 다른 증거를 제시하는 것이다. 하기 섹션에서는 본 발명의 구체예에 사용될 수 있는 항원 및 에피토프 중 몇 가지에 대해 설명한다.
항원 및 에피토프
동물의 면역 반응을 유발하는 데 사용될 수 있는 사실상 모든 항원을 리바비린과 함께 사용하여 본 발명의 조성물을 제조할 수 있다. 즉, 이러한 조성물(예, 백신)에 혼입될 수 있는 항원은 박테리아 항원 또는 에피토프, 진균 항원 또는 에피토프, 식물 항원 또는 에피토프, 사상균 항원 또는 에피토프, 바이러스 항원 또는 에피토프, 암 세포 항원 또는 에피토프, 독소 항원 또는 에피토프, 화학적 항원 또는 에피토프 및 자가 항원 또는 에피토프를 포함한다. 이들 분자 중 다수는 면역 보강제 없이도 현저한 면역 반응을 유도하지만, 상기 항원 또는 에피토프에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하기 위해 리바비린을 "강력한" 또는 "약한" 항원 또는 에피토프와 병용하여 투여하거나, 또는 함께 혼합하여 투여할 수 있다. 또한, 리바비린을 면역 보강제로서 사용하면 더 적은 양의 항원을 사용하면서도 면역원성을 유지할 수 있게 된다.
본 발명의 백신 조성물에는 펩티드 항원 외에도, 핵산계 항원을 사용할 수 있다. 각종 핵산계 백신이 공지되어 있으며, 이러한 면역요법 조성물 및 방법은 리바비린을 포함하도록 재구성함으로써 확대될 수 있다(참고 문헌의 예: 미국 특허 제5,589,466호 및 제6,235,888호). 한 방법의 예를 들면, 목적 폴리펩티드 항원을 암호화하는 유전자를, 피험체에 도입되면 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터내로 클로닝한다. 발현 작제물을 리바비린과의 혼합물로서, 또는 리바비린과 병용하여(예컨대, 리바비린 투여 직후 동일 부위에 발현 작제물을 투여한다) 피험체에 투여한다. 대안으로, 목적 폴리펩티드 항원을 암호화하는 RNA를 리바비린과의 혼합물로서, 또는 리바비린과 병용하여 피험체에 투여한다.
항원이 DNA(예컨대, DNA 백신 조성물 제제)일 경우, 적절한 프로모터는 유인원 바이러스 40(SV40), 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍증 바이러스(HIV), 예컨대 HIV 롱 터미널 리피트(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, ALV, 사이토메갈로바이러스(CMV), 예컨대 CMV 초기 발현 프로모터, 엡슈타인 바 바이러스(EBV), 라우스 육종 바이러스(RSV)를 포함할 뿐 아니라, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 인간 메탈로티오네인 등의 인간 유전자 유래의 프로모터를 포함한다. 몇몇 구체예, 특히 인간을 위한 유전자 백신의 제조에 유용한 폴리아데닐화 시그널의 비제한적인 예로는 SV40 폴리아데닐화 시그널 및 LTR 폴리아데닐화 시그널이 있다. 특히, SV40 폴리아데닐화 시그널로서 불리는, pCEP4 플라스미드(인비트로겐, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에 존재하는 SV40 폴리아데닐화 시그널이 사용된다.
유전자 작제물에는 유전자 발현에 필요한 조절성 요소 외에도 다른 요소를 포함시킬 수 있다. 이러한 추가적인 요소에는 인핸서가 포함된다. 비제한적인 인핸서의 예로는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 유래의 인핸서 등의 인간 유래 인핸서 및 바이러스 인핸서, 예컨대 CMV, RSV 및 EBV 유래의 인핸서를 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 유전자 작제물에는 포유동물 복제 기점을 포함시켜서, 세포 내에서 작제물을 염색체 외부에 유지시키고 작제물을 여러 카피 생산할 수 있도록 할 수 있다. 인비트로겐(캘리포니아주 샌 디에고 소재)에서 시판하는 pCEP4 및 pREP4는 엡슈타인 바 바이러스의 복제 기점과 핵 항원 EBNA-1 암호화 영역을 포함하는데, 이 플라스미드는 염색체로 통합되지 않고 많은 카피수의 에피좀 복제를 유도한다. 복제되는 것이든 복제되지 않는 것이든 간에 게놈으로 통합되지 않고 발현될 수 있는 모든 형태의 DNA가 사용될 수 있다. 하기 실시예에서는 핵산계 항원 및 리바비린을 함유하는 조성물의 용도에 대해서 설명한다.
실시예 4
다음은 핵산계 항원 및 리바비린을 함유하는 백신을 동물에게 접종하는 것에 대한 설명이다. 5∼6주령의 암컷 및 수컷 Balb/C 마우스에 2.5% 아버틴 0.3 ㎖를 복강 주사하여 마취시킨다. 전방 대퇴부에 1.5 cm를 절제하여, 사두근이 직접 보이게 한다. 제1 그룹의 마우스에, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 발현이 유도되는 gp-120 유전자를 보유한 발현 작제물 약 20 ㎍을 주사하고, 제2 그룹에는 gp-120을 암호화하는 시험관내에서 전사되고 캡핑된 RNA[예컨대, SP6, T7, 또는 T3, (암비온)] 약 5 ㎍을 주사한다. 이들 두 그룹은 대조군이다. 제3 그룹의 마우스에는 1 mg의 리바비린과 혼합된 gp-120 유전자 및 CMV 프로모터를 보유한 발현 벡터 약 20 ㎍을 주사하고, 제4 그룹의 마우스에는 1 mg의 리바비린과 혼합된 시험관내에서 전사되고 캡핑된 RNA 약 5 ㎍을 주사한다. 1 cc 주사기 내 용액(PBS) 0.1 ㎖의 백신을 27 게이지 바늘을 통해 근육의 말단 삽입 부위로부터 무릎 쪽으로 약 0.5 cm 위치에 약 0.2 cm 깊이로 1분 동안 주사하였다. 나중의 위치 확인을 위해 주사 부위에 봉합사를 올려 둔 후, 스테인레스 스틸 클립으로 피부를 닫는다.
접종 전(0일)과 접종 후 40일 이상까지 혈액 샘플을 채취한다. 각 샘플로부터 얻은 혈청을 연속 희석시키고, 효모에서 제조된 재조합 gp-120 단백질을 항원으로서 사용하여 항체의 검출을 위한 표준 ELISA 기법으로 분석한다. gp-120에 대해 특이적인 IgG 및 IgM 항체 둘 다 모든 샘플에서 검출되겠지만, 리바비린을 함유하는 그룹 3 및 4는 혈청에서 검출된 항체의 양 및/또는 역가에 의해 측정시 gp-120에 대해 더 큰 면역 반응을 나타낼 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 리바비린과 바이러스, 바람직하게는 간염 바이러스 상에 존재하는 바이러스 항원 또는 에피토프를 포함한다. 조성물은, 예컨대 리바비린 및 HAV 항원, HBV 항원, HCV 항원 또는 이들 바이러스 중 하나 이상에 존재하는 이들 항원 또는 에피토프의 임의의 조합물을 포함한다. 간염 항원은 펩티드 또는 핵산일 수 있다. HAV 감염에 대한 백신 접종에 사용될 수 있는 조성물은, 예컨대 리바비린 및 서열 번호 12의 아미노산 길이가 최소한 3-10개인 연속 아미노산, 10-50개인 연속 아미노산, 50-100개인 연속 아미노산, 100-200개인 연속 아미노산, 200-400개인 연속 아미노산, 400-800개인 연속 아미노산, 800-1200개인 연속 아미노산, 1200-1600개인 연속 아미노산, 1600-2000개인 연속 아미노산 및 2000-2227개인 연속 아미노산으로 이루어진 HAV 펩티드를 포함한다.
또한, 리바비린 및 전술한 HAV 펩티드 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물은 HAV 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 핵산계 항원은 HAV 서열의 연속 뉴클레오타이드 길이가 9개 이상인 뉴클레오타이드 서열(예, 서열 번호 15)을 포함한다. 즉, 핵산계 항원은 서열 번호 15의 뉴클레오타이드 길이가 최소한 9-25개인 연속 뉴클레오타이드, 25-50개인 연속 뉴클레오타이드, 50-100개인 연속 뉴클레오타이드, 100-200개인 연속 뉴클레오타이드, 200-500개인 연속 뉴클레오타이드, 500-1000개인 연속 뉴클레오타이드, 1000-2000개인 연속 뉴클레오타이드, 2000-4000개인 연속 뉴클레오타이드, 4000-8000개인 연속 뉴클레오타이드 및 8000-9416개인 연속 뉴클레오타이드 또는 이들 서열에 상응하는 RNA를 포함한다.
유사하게, 바람직한 HBV 백신 예는 리바비린 및 HBsAg(서열 번호 10) 또는 HBcAg 및 HBeAg(서열 번호 11)의 3개 이상의 연속 아미노산으로 이루어진 HBV 펩티드를 포함한다. 즉, 일부 구체예는 리바비린 및 서열 번호 10 또는 서열 번호 11의 아미노산 길이가 최소한 3-10개인 연속 아미노산, 10-50개인 연속 아미노산, 50-100개인 연속 아미노산, 100-150개인 연속 아미노산, 150-200개인 연속 아미노산 및 200-226개인 연속 아미노산으로 이루어진 HBV 펩티드를 포함한다.
또한, 리바비린 및 전술한 HBV 펩티드 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물은 HBV 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 핵산계 항원은 HBV의 9개 이상의 연속 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 서열(예, 서열 번호 14)을 포함한다. 즉, 핵산계 항원은 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 길이가 최소한 9-25개인 연속 뉴클레오타이드, 25-50개인 연속 뉴클레오타이드, 50-100개인 연속 뉴클레오타이드, 100-200개인 연속 뉴클레오타이드, 200-500개인 연속 뉴클레오타이드, 500-1000개인 연속 뉴클레오타이드, 1000-2000개인 연속 뉴클레오타이드, 2000-4000개인 연속 뉴클레오타이드, 4000-8000개인 연속 뉴클레오타이드 및 8000-9416개인 연속 뉴클레오타이드 또는 이들 서열에 상응하는 RNA를 포함한다. 하기 실시예에서는 리바비린을 시판되는 HBV 백신 제제와 병용하여 사용하는 것에 대해 설명한다.
실시예 5
HBsAg 및 명반을 함유하는 시판되는 백신(엥게릭스, SKB)의 2가지 용량과 혼합하였을 때의 리바비린의 면역 보강 효과를 테스트하였다. 엥게릭스 백신 약 0.2 ㎍ 또는 2 ㎍을 PBS 또는 PBS 중의 1 mg 리바비린과 함께 혼합하고, 이 혼합물을 마우스 그룹(그룹당 3 마리)에 복강 주사하였다. 4주 째에 동일한 혼합물을 함유하는 추가 접종분을 주사하고 6주 째 모든 마우스로부터 채혈하였다. 혈청 샘플을 1:60∼1:37500으로 희석시키고, 희석액을 전술한 바와 같이 EIA로 테스트하였는데, 단, 정제된 인간 HBsAg는 고체상 항원 상태로 사용하였다. 하기 표 9에 나타낸 바와 같이, 리바비린을 함유하는 백신 조성물은 백신이 이미 명반을 함유하고 있음에도 불구하고 기존 백신 2 ㎍에 대한 반응을 증강시켰다. 즉, 최적 용량보다 적은 백신 용량(즉, 검출가능한 항체를 단독으로는 유도하지 못하는 용량)에 리바비린을 첨가함으로써 항체를 검출가능한 정도로 생성할 수 있으며, 이는 리바비린의 첨가가 면역 반응을 감소시키지 않으면서 백신 조성물에 더 적은 양의 항원을 사용할 수 있도록 한다는 증거가 된다.
Figure 112007073080177-PAT00009
몇몇 HCV 백신 조성물은 리바비린 및 서열 번호 1의 3개 이상의 연속 아미노산으로 이루어진 HCV 펩티드 또는 상기 HCV 펩티드를 암호화하는 핵산을 함유한다. 즉, 백신 조성물은 리바비린 및 서열 번호 1의 아미노산 길이가 최소한 3-10개인 연속 아미노산, 10-50개인 연속 아미노산, 50-100개인 연속 아미노산, 100-200개인 연속 아미노산, 200-400개인 연속 아미노산, 400-800개인 연속 아미노산, 800-1200개인 연속 아미노산, 1200-1600개인 연속 아미노산, 1600-2000개인 연속 아미노산, 2000-2500개인 연속 아미노산, 및 2500-3011개인 연속 아미노산인 HCV 펩티드 중 하나 이상 또는 상기 단편들 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유할 수 있다.
바람직한 HCV 조성물은 리바비린 및 HCV 코어 단백질(서열 번호 2), HCV E1 단백질(서열 번호 3), HCV E2 단백질(서열 번호 4), HCV NS2(서열 번호 5), HCV NS3(서열 번호 6), HCV NS4A(서열 번호 7), HCV NS4B(서열 번호 8), 또는 HCV NS5A/B(서열 번호 9)의 3개 이상의 연속 아미노산으로 이루어진 펩티드 또는 이들 도메인의 조합으로 이루어진 펩티드를 함유한다. 즉, 바람직한 HCV 백신은 리바비린 및 서열 번호 2∼9 중 하나 이상의 아미노산 길이가 최소한 3-10개인 연속 아미노산, 10-50개인 연속 아미노산, 50-100개인 연속 아미노산, 100-200개인 연속 아미노산, 200-400개인 연속 아미노산, 400-800개인 연속 아미노산 및 800-1040개인 연속 아미노산인 펩티드를 함유한다. 이들 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 잔기 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971, 또는 1972-3011에 상응한다. 따라서, 바람직한 구체예는 또한 서열 번호 1의 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971, 또는 1972-3011 중 하나 이상 또는 이들의 단편을 포함한다.
리바비린 및 전술한 펩티드 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 백신 조성물 역시 한 구체예가 된다. 바람직한 핵산계 항원은 HCV의 9개 이상인 연속 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 13)을 포함한다. 즉, 핵산계 항원은 서열 번호 13 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 길이가 최소한 9-25개인 연속 뉴클레오타이드, 25-50개인 연속 뉴클레오타이드, 50-100개인 연속 뉴클레오타이드, 100-200개인 연속 뉴클레오타이드, 200-500개인 연속 뉴클레오타이드, 500-1000개인 연속 뉴클레오타이드, 1000-2000개인 연속 뉴클레오타이드, 2000-4000개인 연속 뉴클레오타이드, 4000-8000개인 연속 뉴클레오타이드, 및 8000-9416개인 연속 뉴클레오타이드 또는 이들 서열에 상응하는 RNA를 포함한다. 하기 섹션에서는 리바비린 및 항원을 함유하는 조성물 중 몇 가지에 대해 설명한다.
리바비린 및 항원을 함유하는 조성물
리바비린 및 병원균(예, 바이러스, 박테리아, 사상균, 효모 및 기생충)의 항원 또는 에피토프를 함유하는 조성물(예, 백신)은 비제한적인 예로 면역 보강제, 결합제, 부형제, 예컨대 안정화제(장기간 보관을 촉진하기 위한 것), 유화제, 증점제, 염, 방부제, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 물질 및 흡수 지연제 등의 기타 성분들을 함유할 수 있다. 이들 조성물은 질병 또는 증상을 피하기 위한 예방적 조치로서, 또는 이미 질병 또는 증상이 있는 동물을 치료하기 위한 치료제로서 동물을 치료하는 데 적합하다.
다수의 기타 성분들이 백신에 함유될 수 있다. 예를 들어, 리바비린 및 항원은 통상적인 부형제(예컨대, 리바비린 및/또는 항원과 해로운 반응을 하지 않는 비경구, 장(예, 경구) 또는 국소 투여에 적합한 약학적 허용 유기 또는 무기 캐리어 성분)과 함께 사용될 수 있다. 적절한 약학적 허용 캐리어로는 물, 염 용액, 알코올, 아라비아 검, 식물유, 벤질 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물, 예컨대 락토스, 아밀로스 또는 전분, 스테아르산마그네슘, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 방향유, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 펜타에리트리톨 지방산 에스테르, 히드록시 메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 등이 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 더 많은 적절한 캐리어가 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 15판, Easton:Mack Publishing Company, 1405-1412 및 1461-1487쪽(1975)] 및 국립 약전 XIV 14판(Washington, American Pharmaceutical Association(1975))에 개시되어 있다.
본 발명의 유전자 작제물은 이 물질 없이 동일한 유전자 백신을 투여한 경우 발생하는 세포에 의한 유전자 작제물의 업테이크 및/또는 발현에 비해 세포에 의한 유전자 작제물의 업테이크 및/또는 발현을 증가시키는 물질과 함께 제제화하거나, 또는 병용 투여할 수 있다. 이러한 물질 및 유전자 작제물과 이러한 물질을 병용 투여하는 데 대한 프로토콜은 1993년 1월 26일에 출원된 미국 출원 제08/008,342호, 1993년 3월 11일에 출원된 미국 출원 제08/029,336호, 1993년 9월 21일에 출원된 미국 출원 제08/125,012호, 1994년 1월 26일에 출원된 PCT 특허 출원 번호 PCT/US94/00899 및 1994년 4월 1일에 출원된 미국 출원 제08/221,579호에 기술되어 있다. 이러한 물질의 예로는 CaPO4, DEAE 덱스트란, 음이온 지질; 세포외 기질-활성 효소; 사포닌; 렉틴; 에스트로겐 화합물 및 스테로이드 호르몬; 히드록실화 저급 알킬; 디메틸 설폭시드(DMSO); 우레아; 및 벤조산 에스테르, 아닐리드, 아미딘, 우레탄 및 이의 염산염, 예컨대 국소 마취제 계열의 것을 들 수 있다. 또한, 유전자 작제물은 지질/다중 양이온 복합체 내로 캡슐화되거나, 또는 이와 병용 투여될 수 있다.
백신은 멸균시킬 수 있으며, 필요에 따라 리바비린 또는 항원과 해로운 반으을 하지 않는 보조제, 예컨대 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주는 염, 완충제, 착색제, 풍미제 및/또는 방향 성분 등과 혼합될 수 있다.
특정 백신 조성물의 유효 투여량 및 투여 방법은 환자 개개인과 질병의 유형 및 단계에 따라 달라질 뿐 아니라 당업자에게 잘 알려져 있는 기타 요인들에 따라 달라진다. 백신의 치료 효능과 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해, 예컨대 ED50(집단의 50%에서 치료 효과를 나타내는 용량)에 의해 측정할 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 실험으로부터 얻은 데이터는 인간에 사용할 수 있는 용량 범위로 제제화하는 데 이용될 수 있다. 백신의 투여량은 독성을 나타내지 않고 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 속하는 것이 바람직하다. 투여량은 상기 범위 내에서 리바비린 유도체 및 항원의 유형, 사용되는 제형, 환자의 감수성 및 투여 경로에 따라 달라진다.
리바비린은 수년간 시판되어 왔기 때문에, 다수의 제형과 투여 경로가 공지되어 있다. 본 명세서에 개시된 구체예에는 공지된 모든 제형과 투여 경로가 제공될 수 있다. 동물에서 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기에 효과적인 리바비린의 양은 그 동물에서, 약 0.25∼12.5 ㎍/㎖, 바람직하게는 약 2.5 ㎍/㎖의 항원의 혈청 농도를 달성하기에 충분한 양인 것으로 간주할 수 있다. 몇몇 구체예에서는 리바비린의 양은 백신을 접종하는 동물의 체중에 따라 결정된다. 따라서 백신 조성물 중의 리바비린의 양은 체중 1 kg당 약 0.1∼6.0 mg일 수 있다. 즉, 몇몇 구체예는 동물의 체중 1 kg당 약 0.1-1.0 mg, 1.1-2.0 mg, 2.1-3.0 mg, 3.1-4.0 mg, 4.1-5.0 mg, 5.1-6.0 mg에 해당하는 양의 리바비린을 함유한다. 보다 일반적으로는 백신은 약 0.25-2000 mg의 리바비린을 함유한다. 즉, 몇몇 구체예는 약 250 ㎍, 500 ㎍, 1 mg, 25 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 1.1 g, 1.2 g, 1.3 g, 1.4 g, 1.5 g, 1.6 g, 1.7 g, 1.8 g, 1.9 g 및 2 g의 리바비린을 함유한다.
통상적인 백신 조성물은 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 데 충분한 양의 리바비린을 첨가함으로써 개질시킬 수 있다. 즉, 기존의 통상적인 백신 조성물은 이 조성물에 단순히 리바비린을 첨가하거나, 또는 통상적인 백신과 리바비린을 병용 투여함으로써(예컨대, 항원 투여 직전 또는 직후에) 개질시킬 수 있다. 당업자라면 백신 내 항원의 양은 항원의 종류와 그 면역원성에 따라 달라질 수 있음을 알 것이다. 따라서, 백신 중의 항원의 양은 다양할 수 있다. 그러나, 대체적으로 백신은 약 0.25-5 mg, 5-10 mg, 10-100 mg, 100-500 mg 및 최대 2000 mg의 항원(예, 간염 바이러스 항원)을 함유할 수 있다.
본 명세서에 개시된 몇몇 방법에서는, 리바비린 및/또는 항원의 정확한 양은 치료 대상 환자의 개별 주치의가 선택한다. 또한, 리바비린의 양은 동일한 또는 동등한 양의 항원과 함께 또는 이와 별도로 첨가할 수 있으며, 이들 양은 환자 특이적 또는 항원 특이적으로 고려하여 충분한 농도를 제공하도록 특정 백신 접종 프로토콜 실시 중에 조절할 수 있다. 이러한 상황에서, 고려될 수 있는 환자 특이적 요인과 항원 특이적 요인에는 환자의 질병 상태의 심각도, 나이, 환자의 체중, 식이요법, 투여 시기 및 빈도, 병용 약물, 반응 감수성 및 치료법에 대한 내성/반응을 들 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 다음 섹션에서는 신규 HCV 유전자의 발견 및 본 명세서에 개시된 구체예에 사용될 수 있는 돌연변이 HCV 서열의 생성에 대해 설명한다.
신규 NS3/4A 및 돌연변이 NS3/4A 서열
HCV에 감염된 환자로부터 HCV의 NS3/4A 도메인에 상응하는 신규 핵산 및 단백질을 클로닝하였다(서열 번호 16 및 17). 진뱅크 검색을 통해 클로닝된 서열이 HCV 서열과 가장 큰 상동성을 지녔으나, 가장 밀접하게 관련된 HCV 서열(수탁 번호 AJ 278830)과의 상동성이 93%에 불과하다는 것을 알게 되었다. 신규 NS3/4A 펩티드의 절두형 돌연변이체 및 단백질 분해 절단 부위가 없는 NS3/4A 돌연변이체 역시 생성하였다. 이들 신규 펩티드 및 이 펩티드를 암호화하는 핵산은 리바비린과 혼합하여 수용체에게 HCV에 대한 유효 면역 반응을 제공하는 조성물을 제조할 수 있는 강력한 면역원임을 발견하였다. 신규 NS3/4A 도메인의 클로닝 및 각종 NS3/4A 돌연변이체의 생성에 대해서는 하기 실시예에서 설명한다.
실시예 6
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 HCV에 감염된 환자의 혈청(HCV 유전자형 1a)으로부터 NS3/4A 서열을 증폭하였다. 혈청으로부터 전체 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하고, 표준 프로토콜에 따라 PCR을 수행하였다[Chen M 등, J. Med. Virol. 43:223:226(1995)]. cDNA 합성은 안티센스 프라이머 "NS4KR"(5'-CCG TCT AGA TCA GCA CTC TTC CAT TTC ATC-3'(서열 번호 18))을 이용하여 개시하였다. 이 cDNA로부터 NS3 및 NS4A 유전자를 포함하는, 아미노산 1007∼1711에 상응하는 HCV의 2079 염기쌍 DNA 단편을 증폭하였다. 정확도가 높은 폴리머라제(Expand High Fidelity PCR, 독일 만하임 소재의 뵈링거-만하임)를 "NS3KF" 프라이머(5'-CCT GAA TTC ATG GCG CCT ATC ACG GCC TAT-3'(서열 번호 19)) 및 NS4KR 프라이머와 함께 사용하였다. NS3KF 프라이머는 EcoRI 제한 효소 절단 부위와 출발 코돈을 포함하였고, 프라이머 NS4KR은 XbaI 제한 효소 절단 부위와 종결 코돈을 포함하였다.
그 후 증폭된 단편을 서열을 분석하였는데, 그 서열이 서열 번호 16의 서열이다. 서열 비교 분석을 통해 그 유전자 단편이 정말 유전자형 1a의 바이러스 균주로부터 유래된 것임을 알게 되었다. NCBI 웹사이트를 이용하여 진뱅크 데이터베이스에 대해 전산화된 BLAST 검색을 통해 가장 가까운 HCV 상동체와의 뉴클레오타이드 서열 동일성이 93%임을 알게 되었다.
그 후 증폭된 DNA 단편을 EcoRI 및 XbaI으로 분해하여, 같은 효소로 분해한 pcDNA3.1/His 플라스미드(인비트로겐)에 삽입하였다. 그 후 NS3/4A-pcDNA3.1 플라스미드를 EcoRI 및 XbaI으로 분해하고, 삽입물을 QiaQuick 키트(퀴아젠, 독일 함부르크)를 이용하여 정제하고, EcoRI/XbaI으로 분해한 pVAX 벡터(인비트로겐)에 결찰시켜서 NS3/4A-pVAX 플라스미드를 생성하였다.
NS3/4A DNA로부터 NS4A 서열을 결실시켜서 rNS3 절두형 돌연변이체를 얻었다. 따라서, EcoRI 및 NotI 제한 부위를 각각 포함하는 프라이머 NS3KF 및 3'NotI(5'-CCA CGC GGC CGC GAC GAC CTA CAG-3'(서열 번호 20))를 이용하여 NS3/4A-pVAX의 NS3 유전자 서열을 PCR로 증폭하였다. 그 후 NS3 단편(1850 bp)을 EcoRI 및 NotI으로 분해한 pVAX 플라스미드에 결찰시켜서 NS3-pVAX 벡터를 생성하였다. 플라스미드를 BL21 E. 콜라이 세포에서 증폭시켰다. 플라스미드의 서열을 분석하고, 제한 절단으로 검증하였으며, 그 결과는 원래 서열을 기초로 한 예상 결과와 동일하였다.
NS3와 NS4A 사이의 단백질 분해 절단 부위를 변화시키기 위해, QUICKCHANGETM 돌연변이 유발 키트(스트라타진)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서 NS3/4A-pVAX 플라스미드를 돌연변이시켰다. "TPT" 돌연변이를 유발하기 위해, 프라이머 5'-CTGGAGGTCGTCACGCCTACCTGGGTGCTCGTT-3'(서열 번호 21) 및 5'-ACCGAGCACCCAGGTAGGCGTGACGACCTCCAG-3'(서열 번호 22)을 이용하여 플라스미드를 증폭시켜서 NS3/4A-TPT-pVAX를 얻었다. "RGT" 돌연변이를 생성하기 위해서는 프라이머 5'-CTGGAGGTCGTCCGCGGTACCTGGGTGCTCGTT-3'(서열 번호 23)과 5'-ACCGAGCACCCAGGTACC-GCGGACGACCTCCAG-3'(서열 번호 24)를 이용하여 플라스미드를 증폭시켜서 NS3/4A-RGT-pVAX를 얻었다.
모든 돌연변이된 작제물의 서열을 분석하여 돌연변이가 정확히 생성되었는지를 확인하였다. 플라스미드는 컴피턴트 BL21 E. 콜라이에서 증폭시켰다. 생체내 주입에 사용된 플라스미드 DNA는 퀴아젠(Quiagen) DNA 정제 컬럼을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 정제하였다(퀴아젠 게엠베하, FRG 힐덴 소재). 얻어진 플라스미드 DNA의 농도는 분광광도법으로 측정하였고(Dynaquant, 파마시아, 스웨덴 웁살라 소재), 정제된 DNA를 1 mg/㎖의 농도로 멸균 인산염 완충 염수(PBS)에 용해시켰다. 야생형과 돌연변이의 접합점의 아미노산 서열을 하기 표 10에 나타내었다. 하기 섹션에서는 HCV 펩티트를 암호화하는 몇 가지 핵산에 대해 설명한다.
Figure 112007073080177-PAT00010
HCV 펩티드를 암호화하는 핵산
핵산 구체예는 전술한 HCV 펩티드(예컨대, 서열 번호 17, 29, 31, 32 및 43-49) 또는 아미노산 길이가 최소한 4, 6, 8, 10, 12, 15, 또는 20개인 그 단편(예컨대, 서열 번호 25-27 및 32-42)을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 몇 가지 구체예는, 예를 들어 이들 HCV 펩티드를 암호화하는 게놈 DNA, RNA 및 cDNA를 포함한다. HCV 뉴클레오타이드의 구체예는 서열 목록에 제시된 DNA 서열(예, 서열 번호 16) 뿐만 아니라 서열 목록에 제시된 아미노산 서열(예, 서열 번호 17)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 엄중 조건(예컨대, 0.5 M NaHPO4, 7.0% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1 mM EDTA 중에서 50℃에서, 필터에 결합된 DNA에 대해 하이브리드화하고, 0.2 x SSC/0.2% SDS 중에서 50℃에서 세척하는 조건) 하에 서열 목록에 제시된 DNA 서열에 하이브리드화하는 임의의 뉴클레오타이드 서열 및 덜 엄중한 조건(예컨대, 0.5 M NaHPO4, 7.0% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1 mM EDTA 중에서 37℃에서 하이브리드화하고, 0.2 x SSC/0.2% SDS 중에서 37℃에서 세척하는 조건) 하에 서열 목록에 제시된 아미노산 서열(서열 번호 17)을 암호화하는 DNA 서열에 하이브리드화하는 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
핵산 구체예는 또한 전술한 서열의 단편, 변형체, 유도체 및 변이체를 포함한다. 바람직한 구체예로는 신규 HCV 서열 또는 이의 상보 서열 중 하나의 12개 이상의 연속 염기를 포함하는 핵산을 들 수 있으며, 바람직한 단편은 서열 번호 17의 NS3/4A 분자를 암호화하는 핵산 또는 이의 상보 서열의 12개 이상의 연속 염기를 포함하는 것이다.
이러한 점에서, 본 발명의 핵산 구체예는 12∼약 2079개의 연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 DNA 단편은, 예컨대 서열 번호 16의 연속 뉴클레오타이드가 최소한 12-15, 15-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-200, 200-500, 500-1000, 1000-1500, 1500-2079개인 핵산 또는 이의 상보 서열을 포함한다. 핵산 구체예는 또한 치환, 추가, 또는 결실과 같은 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. 뉴클레오타이드 암호화 서열의 축퇴성으로 인해, 예컨대 서열 번호 17에 제시된 것과 실질적으로 동일한 HCV 아미노산 서열을 암호화하는 다른 DNA 서열이 몇몇 구체예에 사용될 수 있다. 이러한 것의 비제한적인 예로는 서열 내에서 기능적으로 동등한 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈으로 치환시켜서 침묵 변화를 유도하거나, 또는 서열 내에서 기능적으로 동등하지 않는 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈으로 치환시켜서 검출가능한 변화를 생성함으로써 변형시킨, NS3/4A의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열(서열 번호 16) 또는 이러한 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 핵산을 들 수 있다.
전술한 핵산 서열을 이용함으로써, 이들 분자에 상보적인 프로브를 디자인하여 이를 올리고뉴클레오타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 바람직한 프로브는 이러한 HCV 분리물 고유의 핵산 서열(서열 번호 16)을 포함한다. 이러한 프로브는 HCV의 천연 공급원(이 중 일부는 그 자체가 신규 HCV일 수 있다)을 분리하기 위해 환자로부터 cDNA를 스크리닝하는 데 이용할 수 있다. 스크리닝은, 예컨대 필터 하이브리드화 또는 PCR로 실시할 수 있다. 필터 하이브리드화로 실시하려면, 표지된 프로브는 이 NS3/4A 펩티드 고유의 핵산 서열(서열 번호 16)의 15-30개 이상의 염기쌍을 포함하는 것이 바람직하다. 이용되는 하이브리드화 세척 조건은 중간 정도에서 높은 정도의 엄중도로 하는 것이 바람직하다. 하이브리드화는 0.5 M NaHPO4, 7.0% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1 mM EDTA 중에서 42℃에서 밤새 수행할 수 있으며, 세척은 0.2 x SSC/0.2% SDS 중에서 42℃에서 수행할 수 있다. 이러한 조건에 관한 정보에 대해서는, 예컨대 Sambrook 등의 문헌[1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.]; 및 Ausubel 등의 문헌[1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Intersciences, N.Y.]을 참고로 할 수 있다.
HCV 핵산은 또한 전술한 핵산을 사용하여 HCV에 감염된 환자로부터 분리할 수 있다(역시 실시예 6 참조). 따라서, HCV에 감염된 환자로부터 얻은 RNA를 역전사시키고, 얻어진 cDNA를 PCR 또는 다른 증폭 기법을 이용하여 증폭시킨다. 프라이머는 NS3/4A 서열(서열 번호 16)로부터 얻은 것이 바람직하다.
PCR 기법의 개요에 대해서는 문헌[Molecular Cloning to Genetic Engineering, White, B.A. Ed. in Methods in Molecular Biology 67: Humana Press, Totowa(1997)] 및 "PCR Methods and Applications"이라의 표제의 문헌(1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press)을 참고로 할 수 있다. mRNA 증폭에 대해서는, mRNA를 cDNA로 역전사시킨 후 PCR(RT-PCR)을 수행하는 방법이나, 또는 미국 특허 제5,322,770호에 기술된 바와 같이 상기 두 단계에 한가지 효소를 사용하는 방법은 본 발명의 범위에 속하는 것이다. 또 다른 기법은 Marshall R.L. 등의 문헌[PCR Methods and Applications 4:80-84, 1994]에 기술된 바와 같이 역전사효소 비대칭 갭 리가제 연쇄 반응(RT-AGLACR)을 이용하는 것을 포함한다.
요약하면, 하기 표준 절차에 따라서 RNA를 분리한다. 첫번 째 가닥 합성의 프라이머로서 증폭된 단편의 5' 최말단에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 RNA 상에서 역전사 반응을 수행한다. 그 후 얻어진 RNA/DNA 하이브리드를 표준 말단 트랜스퍼라제 반응을 이용하여 구아닌으로 "테일링(tailed)"한다. 이어서 하이브리드를 RNAse H로 분해하고, 폴리-C 프라이머를 사용하여 제2 가닥 합성을 프라이밍한다. 이렇게 하면 증폭된 단편의 상류의 cDNA 서열이 쉽게 분리된다. 이용될 수 있는 클로닝 기법의 개요에 대해서는, 예컨대 상기 Sambrook 등의 문헌(1989)을 참고로 할 수 있다.
이러한 증폭 방법 각각에서는 증폭시킬 서열의 어느 한 쪽 상의 프라이머를 dNTP 및 열에 안정한 폴리머라제, 예컨대 Taq 폴리머라제, Pfu 폴리머라제 또는 Vent 폴리머라제와 함께 적절히 제조된 핵산 샘플에 추가한다. 샘플 내의 핵산을 변성시키면 프라이머가 샘플 내의 상보적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화한다. 이어서 하이브리드화된 프라이머를 연장시킨다. 그 후 변성, 하이브리드화, 및 연장 반응으로 이루어진 사이클을 한번 더 실시한다. 프라이머 부위 사이의 핵산 서열을 포함하는 증폭된 단편이 생성되도록 사이클을 다수회 반복한다. PCR에 대해서는 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,965,188호를 비롯하여 여러 특허에 추가로 설명되어 있다.
프라이머는 NS3/4A 분자 고유의 핵산 서열(서열 번호 16)의 일부분에 실질적으로 상보적이 되도록 선택함으로써 프라이머 사이의 서열이 증폭되도록 한다. 프라이머의 뉴클레오타이드 길이는 최소한 16-20, 20-25, 또는 25-30개인 것이 바람직하다. 안정한 하이브리드의 형성은 DNA의 융점(Tm)에 의존한다. Tm은 프라이머의 길이, 용액의 이온 강도 및 G+C 함량에 의해 결정된다. 프라이머의 G+C 함량이 더 많을수록, 융점은 더 높아지는데, 그 이유는 G:C 쌍은 3개의 H 결합에 의해 유지되는 반면, A:T 쌍은 2개의 H 결합에 의해서만 유지되기 때문이다. 본 명세서에 개시된 증폭 프라이머의 G+C 함량은 10∼75%인 것이 바람직하고, 35∼60%인 것이 보다 바람직하며, 40∼55%인 것이 가장 바람직하다. 특정한 분석 조건 설정 하의 적절한 프라이머의 길이는 당업자가 실험에 의해 결정할 수 있다.
프라이머의 간격은 증폭될 세그먼트의 길이와 관련이 있다. 본 명세서에 기술된 구체예에서 HCV 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 보유하는 증폭된 세그먼트의 크기는 약 25 bp 이상에서 HCV 게놈의 전체 길이에 이를 수 있다. 25∼1000 bp의 증폭 단편이 일반적이며, 50∼1000 bp의 단편이 바람직하고, 100∼600 bp가 가장 바람직하다. 증폭 프라이머로는 NS3/4A 영역의 특이적 증폭이 일어나게 하는 어떠한 서열도 가능하며, 예컨대 클로닝을 용이하게 하는 제한 부위와 같은 변형을 포함할 수 있다.
PCR 생성물을 서브클로닝하고 서열을 분석하여 증폭된 서열이 HCV 펩티드의 서열을 나타내는지를 확인할 수 있다. 그 후 PCR 단편을 이용하여 다양한 방법에 의해 전체 길이 cDNA를 분리할 수 있다. 예를 들어, 증폭된 단편을 표지하여 cDNA 라이브러리, 예컨대 박테리오파지 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 데 이용할 수 있다. 또는, 게놈 라이브러리의 스크리닝을 통해 게놈 클론을 분리하는 데 표지된 단편을 이용할 수도 있다. 또한, 예컨대 감염된 환자로부터 분리한 RNA로부터 합성한 cDNA를 이용하여 발현 라이브러리를 작제할 수 있다. 이와 같은 방식으로, HCV 유전자 생성물에 대해 생성된 항체와 함께 표준 항체 스크리닝 기법을 이용하여 HCV 유전자 생성물을 분리할 수 있다(스크리닝 기법에 대해서는, 예컨대 Harlow, E. 및 Lane 편저, 1998, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor]를 참조로 할 수 있다).
구체예는 또한 (a) 선행 핵산 및/또는 이의 상보 서열(즉, 안티센스) 중 임의의 것을 포함하는 DNA 벡터; (b) 핵산의 발현을 지령하는 조절성 요소와 작동가능하게 결합된 선행 핵산 서열 중 임의의 것을 포함하는 DNA 발현 벡터; (c) 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 지령하는 조절성 요소와 작동가능하게 결합된 선행 핵산 서열 중 임의의 것을 보유하는 유전자 조작된 숙주 세포를 포함한다. 이들 재조합 작제물은 숙주 세포에서 스스로 복제할 수 있다. 또는, 재조합 작제물은 숙주 세포의 염색체 DNA에 통합될 수 있다. 이러한 재조합 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 HCV 게놈 또는 인간의 조작에 의한 반합성 또는 합성에 의해 생성된 cDNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 자연적으로 발생하지 않는 서열 및 이의 상보 서열을 포함하는 재조합 핵산이 제공된다.
HCV 펩티드를 암호화하는 핵산 또는 HCV 유전자의 상보 서열인 서열을 갖는 핵산은 자연 상태로 이용될 수도 있지만, 이들을 때로, 예컨대 결실, 치환 또는 삽입에 의해 변형시킬 수 있으며, 인간에 존재하지 않는 서열을 부가시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 조절성 요소에는 유도성 및 비유도성 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 및 발현을 유도 및 조절하는 당업자에게 공지된 기타 요소가 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 조절성 요소의 비제한적인 예로는 사이토메갈로바이러스 hCMV 이른 초기 발현 유전자, SV40 아데노바이러스의 초기 또는 후기 발현 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, 파지 A의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 및 효모 α-접합 인자의 프로모터를 들 수 있다.
또한, 재조합 HCV 펩티드 암호화 핵산 서열 및 이의 상보 서열을 조작하여 이들의 프로세싱 또는 발현을 변형시킬 수 있다. 비제한적인 예로, 본 발명의 HCV 핵산을 프로모터 서열 및/또는 리보좀 결합 부위와 결합시키거나, 또는 시그널 서열을 HCV 펩티드 암호화 서열의 상류에 삽입시켜서 펩티드의 분비를 가능하게 함으로써 회수 또는 생체 이용률을 촉진시킬 수 있다. 그 밖에도, 번역, 개시 및/또는 종결 서열을 생성 및/또는 파괴하거나, 또는 암호화 영역 내에 변형을 유발하고/유발하거나, 새로운 제한 부위를 형성하거나 기존의 제한 부위를 파괴하거나, 또는 시험관내 변형을 더 촉진하기 위해 특정 HCV 핵산을 시험관내 또는 생체내에서 돌연변이시킬 수 있다(실시예 6 참조). 당업계에 공지된 임의의 돌연변이 유발 기법을 이용할 수 있으며, 이의 비제한적인 예로 시험관내 특정 부위 지정 돌연변이 유발이 있다[Hutchinson 등, J. Biol. Chem., 253:6551(1978)].
또한, 다른 단백질 또는 다른 단백질의 도메인을 암호화하는 핵산을 HCV 펩티드를 암호화하는 핵산에 결합시켜서 융합 단백질을 생성할 수 있다. 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드는 전체 길이 NS3/4A 서열(서열 번호 16), 절두형 NS3/4A 서열 또는 비관련 단백질 또는 펩티드, 예컨대 후술하는 바와 같은 폴리 히스티딘, 헤마글루티닌, 효소, 형광 단백질, 또는 발광 단백질에 융합된 NS3/4A 서열의 펩티드 단편을 포함할 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
놀랍게도, 본 발명자들은 NS3-pVAX 및 NS3/4A-pVAX 벡터를 면역 경쟁력이 있는 포유동물에게 주사하면 강력한 면역 반응을 유발할 수 있다는 사실을 발견하였다. 하기 실시예에서는 이러한 실험에 대해 더 상세히 설명한다.
실시예 7
체액 면역 반응이 NS3-pVAX 및 NS3/4A-pVAX 벡터에 의해 유발되는지를 확인하기 위해, 실시예 6에서 설명한 발현 작제물을 퀴아젠 DNA 정제 시스템을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 정제하고, 정제된 DNA 벡터를 4∼10 마리로 구성된 Balb/c 마우스 그룹에 접종하는 데 사용하였다. 전술한 바와 같이 플라스미드를 재생 전경골(TA) 근육에 직접 주사하였다[Davis 등, Human Gene Therapy 4(6):733(1993)]. 요약하면, 마우스에 0.9% 멸균 NaCl 중의 0.01 mM 카디오톡신(cadiotoxin)(라톡산, 프랑스 로잔 소재) 50 ㎕/TA로 근육 주사하였다. 5일 후, 각 TA 근육에 rNS3 또는 DNA를 함유하는 PBS 50 ㎕를 주사하였다.
덴마크의 묄레가드, 스웨덴 웁살라의 찰스 리버, 스웨덴의 B&K 솔렌투나에 있는 분양소로부터 동종 교배한 마우스 종 C57/BL6(H-2b), Balb/C(H-2d) 및 CBA(H-2k) 입수하였다. 모든 마우스는 암컷이었으며, 4∼8주령에 사용하였다. 체액 반응의 모니터를 위해, 모든 마우스에 4주마다 플라스미드 DNA 50 ㎕/TA를 추가 접종하였다. 또한, 일부 마우스에는 전술한 바와 같이 정제한 재조합 NS3(rNS3) 단백질을 주사하였다. rNS3를 접종한 마우스는 2회 이상 접종하지 않았다. 모든 마우스로부터 한달에 2회 채혈하였다.
마우스 중 NS3 항체의 존재를 검출하기 위해 효소 면역흡착 분석(EIA)을 이용하였다. 이들 분석은 Chen 등의 문헌[Hepatology 28(1):219(1998)]에 기술된 것과 사실상 동일하게 수행하였다. 요약하면, 96-웰 미량역가 플레이트(넌크, 덴마크 코펜하겐 소재)에서 50 mM 탄산나트륨 완충액(pH 9.6) 중 1 ㎍/㎖ 농도로 rNS3를 4℃에서 밤새 수동적으로 흡착시켰다. 그 후 PBS, 2% 염소 혈청 및 1% 소 혈청 알부민을 함유하는 희석 완충액과 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하여 플레이트를 블로킹시켰다. 그 후 1:60에서부터 시작한 마우스 혈청의 연속 희석액을 플레이트 상에서 1시간 동안 항온처리하였다. 결합된 마우스 혈청 항체는 알칼라인 포스파타제 접합 염소 항-마우스 IgG(시그마 셀 프로덕츠, 미주리주 세인트 루이스 소재)로 검출한 다음, 기질 pNPP(0.5 M MgCl2를 함유한 1 M 디에탄올 아민 완충액 5 ㎖당 1 정제)를 첨가하였다. 반응을 1 M NaOH를 첨가하여 중단시키고, 405 nm에서 흡광도를 읽었다.
4주 후, NS3/4A-pVAX를 접종한 마우스는 5 마리 마우스 중 4 마리가 NS3 항체를 생성한 반면, NS3-pVAX를 접종한 마우스는 5 마리 마우스 중 1 마리가 항체를 생성하였다(도 4). 6주 후, NS3/4A-pVAX를 접종한 5 마리 마우스 중 4 마리가 고농도(>104)의 NS3 항체(평균 농도 10800 ±4830)를 생성하였고, 1 마리는 역가가 2160이었다. NS3-pVAX를 접종한 모든 마우스가 NS3 항체를 생성하였으나, 이들 중 어느 것도 NS3/4A-pVAX 작제물에 의해 생성된 정도의 농도로 항체를 생성하지는 않았다(평균 농도 1800 ±805). NS3/4A 융합 작제물에 의해 생성된 항체 농도는 6주 째 NS3-pVAX에 의해 유도된 항체의 농도보다 훨씬 높았다(평균 계수 7.6 대 3.4, p<0.05, 맨-휘트니 계수 합 테스트, 및 p<0.01, 스튜던트 t-테스트). 따라서, NS3-pVAX 또는 NS3/4A-pVAX의 접종은 항-NS3 항체의 생성을 유도하였으나, NS3/4A 융합 유전자가 더 강력한 면역원이었다. 하기 실시예에서는 NS3/4A-TPT-pVAX 작제물이 강력한 면역 반응을 유발하는지를 확인하기 위해 수행한 실험에 대해 설명한다.
실시예 8
NS3/4A의 증강된 면역원성이 단지 NS4A의 존재에 의한 것인지, 또는 그 밖에도 NS3/4A 융합 단백질이 NS3/4A 접합점에서 절단되어야만 하는지를 테스트하기 위해 새로운 실험을 수행하였다. 첫번 째 실험에서는, Balb/c 마우스에서 NS3-pVAX, NS3/4A-pVAX 및 NS3/4A-TPT-pVAX 벡터의 면역원성을 비교하였다. 0주에 전술한 바와 같이 마우스에 접종하고, 2주 후 모든 마우스로부터 채혈하여 1:60의 혈청 희석액에서 NS3에 대한 항체의 존재를 확인하였다(표 11). 4주 째 다시 마우스로부터 채혈하였다. NS3/4A-TPT-pVAX 벡터는 NS3-pVAX 벡터와 유사하였지만(4/10 대 0/10; NS, 피셔 정확성 테스트), NS3/4A-pVAX 벡터는 지속적으로 가장 강력한 면역원이 되었다. 따라서, 마우스에 접종된 HCV 작제물 모두는 NS3에 대한 면역 반응을 유발할 수 있었으나, NS4A 서열 및 NS3와 NS4A 서열 사이의 기능적 단백질 분해 절단 부위가 가장 강력한 면역 반응을 유발하였다.
Figure 112007073080177-PAT00011
만성 감염 단계시에는 HCV는 간세포에서 복제되어 간 내로 확산된다. 만성 및 지속성 바이러스 감염을 퇴치하는 데 있어서 주된 요소는 세포 매개 면역 방어 시스템이다. CD4+ 및 CD8+ 림프구는 만성 HCV 감염기 동안 간에 침윤하지만, 바이러스를 제거하거나 간 손상을 예방하지는 못한다. 또한, 지속성 HCV 감염은 간세포 암종(HCC)의 발병과 연관이 있다. 하기 실시예에서는 NS3 및 NS3/4A 작제물이 NS3에 대한 T-세포 매개 면역 반응을 유발할 수 있는지를 확인하기 위해 수행한 실험에 대해 설명한다.
실시예 9
전술한 작제물이 NS3에 대한 세포 매개 반응을 유발할 수 있는지를 조사하기 위해, 생체내 종양 성장 분석을 수행하였다. 이 목적을 위해, NS3/4A 유전자를 안정하게 형질감염시킨 SP2/0 종양 세포주를 제조하였다. NS3/4A 유전자를 보유하는 pcDNA3.1 플라스미드를 BglII 분해로 선형화시켰다. 선형화된 플라스미드 DNA 총 5 ㎍을 형질감염 시약(Superfect, 퀴아젠, 독일) 60 ㎍과 혼합하고, 이 혼합물을 35 mm 디쉬 중의 SP2/0 세포의 50% 융합층에 첨가하였다. 형질감염된 SP2/0 세포(NS3/4A-SP2/0)를 제네티신 800 ㎍/㎖의 존재 하에 14일간 배양하고, 개개의 클론을 분리하였다. 안정한 NS3/4A-발현 SP2/0 클론을 PCR과 RTPCR로 확인하였다. 클로닝된 세포주를 10% 태아 소 혈청, L-글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 중에서 유지시켰다.
그 후 Balb/c 마우스에서 SP2/0 및 NS3/4A-SP2/0 세포주의 생체내 성장 속도를 평가하였다. 마우스의 오른 쪽 옆구리에 2 x 106개의 종양 세포를 피하 주사하였다. 매일 피부를 통해 종양의 크기를 측정하였다. 2가지 세포주의 성장 속도를 비교하였다. 예를 들어, 매 시점 평균 종양 크기는 2가지 세포주에 있어서 서로 다르지 않았다(표 12a 및 표 12b 참조). 하기 실시예에서는 NS3/4A 작제물을 접종한 마우스가 NS3에 대한 T-세포 반응을 나타내는지를 확인하기 위해 수행한 실험에 대해 설명한다.
Figure 112007073080177-PAT00012
Figure 112007073080177-PAT00013
실시예 10
T-세포 반응이 NS3/4A 접종에 의해 유발되는지를 조사하기 위해, 면역화시킨 마우스의 면역 방어 시스템이 NS3-발현 종양 세포주를 공격하는 능력을 분석하였다. Balb/c 마우스에서 SP2/0 골수종 세포주의 종양 성장의 생체내 억제율을 테스트하기 위한 프로토콜은 이미 상세히 개시된 바 있다[Encke 등, J. Immunol. 161:4917(1998)]. 이 모델에서의 종양 성장 억제는 세포독성 T 림프구(CTL)의 프라이밍에 의존한다. 요약하면, 10 마리의 마우스 그룹에 NS3-pVAX 100 ㎍ 또는 NS3/4A-pVAX 100 ㎍을 한달 간격으로 5회 근육 주사하였다. 마지막 접종 2주 후, 2 x 106 SP2/0 또는 NS3/4A-SP2/0 세포를 각 마우스의 오른 쪽 옆구리에 주사하였다. 2주 후, 마우스를 죽이고, 최대 종양 크기를 측정하였다. NS3-pVAX를 접종한 마우스에서의 SP2/0와 NS3/4A-SP2/0의 평균 종양 크기에는 차이가 없었다(표 13a 및 표 13b 참조).
Figure 112007073080177-PAT00014
Figure 112007073080177-PAT00015
다음의 실험에서는 NS3/4A-pVAX를 접종한 Balb/c 마우스에서 SP2/0 또는 NS3/4A-SP2/0 종양 성장의 억제를 평가하였다. NS3/4A-pVAX 플라스미드를 접종한 마우스에서 NS3/4A-SP2/0 종양 세포의 성장은 비형질감염 SP2/0 세포의 성장과 비교하여 현저히 억제되었다(표 14a 및 표 14b 참조). 따라서, NS3/4A-pVAX 접종은 생체내에서 NS3/4A를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 CTL을 유도한다. 하기 실시예에서는 NS3에 대한 세포 매개 반응을 유발하는 데 있어서의 각종 NS3 함유 조성물의 효능을 분석하기 위해 수행한 실험에 대해 설명한다.
Figure 112007073080177-PAT00016
Figure 112007073080177-PAT00017
실시예 11
각종 NS3 함유 조성물의 투여가 세포 매개 면역 반응의 유발에 영향을 미치는지를 분석하기 위해서 마우스에 PBS, rNS3, 비관련 DNA 또는 NS3/4 작제물을 접종하고, 전술한 바와 같이 종양 크기를 측정하였다. NS3/4A 작제물은 종양 크기를 통계학적으로 유의적인 수준으로 감소시키기에 충분한 T-세포 반응을 유발할 수 있었다(표 15a 및 표 15b 참조). 하기 실시예에서는 종양 크기의 감소가 NS3-특이적 T-림프구의 생성에 의한 것인지를 확인하기 위해 수행된 실험에 대해 설명한다.
Figure 112007073080177-PAT00018
Figure 112007073080177-PAT00019
실시예 12
NS-3 특이적 T-세포가 NS3/4A 접종에 의해 생성된 것인지를 확인하기 위해 시험관내 T-세포 매개 종양 세포 용해 분석을 이용하였다. 이 분석에 대해서는 기존의 문헌[Townsend 등, J. Virol. 71:3365(1997)]에 상세히 개시되어 있다. 요약하면, 5 마리의 Balb/c 마우스 그룹에 NS3/4A-pVAX 100 ㎍을 3회 근육 주사하였다. 마지막 접종 2주 후 마우스를 죽이고 비장 세포를 회수하였다. 3 x 106개의 비장 세포 및 3 x 106개의 NS3/4A-SP20 세포를 사용하여 재자극 배양을 시작하였다. 5일 후, NS3/4A-SP2/0 또는 SP2/0 세포를 표적으로 사용하여 표준 Cr51-방출 분석을 수행하였다. NS3/4A-SP2/0 세포의 용해와 SP2/0 세포의 용해간의 비로서 특이적 용해율(%)을 계산하였다. 이펙터 대 표적의 비를 20:1로 하였을 때, NS3/4A-pVAX를 접종한 마우스만이 테스트한 5 마리 중에서 4 마리에서 10% 이상의 특이적 용해율을 나타내었다(도 5A 및 B 참조). 따라서, NS3/4A를 접종한 마우스는 암 세포 증식 감소를 나타내고/나타내거나, NS3/4A는 암 세포의 용해를 유발하였다. 하기 섹션에서는 HVC 폴리펩티드의 몇 가지 예에 대해 더 상세히 설명한다.
HCV 펩티드
이전 섹션에서 기술한 바와 같이 HCV 펩티드를 암호화하는 핵산을 분자생물학의 통상적인 기법을 이용하여 조작하여 HCV 펩티드를 발현하는 재조합 작제물을 생성할 수 있다. 본 발명의 HCV 펩티드 또는 이의 유도체는 실질적으로 서열 목록에 제시된 것과 같은 모든 아미노산 서열의 1차 아미노산 서열(서열 번호 17, 29-32 및 43-49) 및 기능적으로 동등한 아미노산 잔기가 서열 내에서 침묵 변화를 초래하는 잔기로 치환된 변형된 서열을 비롯하여 아미노산 길이가 4개 이상인 이의 단편(예컨대, 서열 번호 25-27 및 33-42)을 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 서열 번호 17, 29-32 및 43-49의 서열의 바람직한 단편은 4개 이상의 아미노산이며, 기능적으로 동등한 아미노산 잔기가 서열 내에서 침묵 변화를 초래하는 잔기로 치환된 변형된 서열을 비롯하여 발견된 NS3/4A 펩티드 고유의 아미노산 서열(서열 번호 17)을 포함한다. HCV 펩티드는, 예컨대 아미노산의 길이가 최소한 12-15, 15-20, 20-25, 25-50, 50-100, 100-150, 150-250, 250-500 또는 500-704개일 수 있다. 다른 단편(예컨대, 서열 번호 25-27 및 33-42) 역시 본 발명의 또 다른 양태이다.
본 발명의 구체예는 또한 전술한 것과 실질적으로 동일한 HCV 펩티드를 포함한다. 즉, 서열 번호 17 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 HCV 펩티드 및 기능적 등가물로서 작용하는 유사한 극성의 또 다른 아미노산으로 치환되어 침묵 변형이 일어난 이의 단편이다. 서열 내에서의 아미노산의 치환체는 그 아미노산이 속하는 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산에는 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함된다. 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함된다. 양전하(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 포함된다. 음전하(산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다. 방향족 아미노산에는 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 포함된다.
본 발명의 HCV 펩티드는 화학적 합성 방법(예컨대, 고체상 펩티드 합성)에 의해 문헌[Merrifield 등, J. Am. Chem. Soc. 85:2149(1964), Houghten 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:51:32(1985), Stewart and Young(Solid phase peptide syntheis, Pierce Chem Co., Rockford, IL(1984) and Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freemand & Co., N.Y.]에 개시된 기법 등의 당업계에 공지된 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 아미노산 말단 상에 메티오닌을 포함시키거나 포함시키지 않고 합성할 수 있다. 화학적으로 합성된 HCV 펩티드는 상기 참고문헌에 개시된 방법을 이용하여 산화시켜서 이황화 다리를 형성할 수 있다.
본 발명의 HCV 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있지만, 재조합 DNA 기법에 의해 이들 폴리펩티드를 제조하는 것이 더 효과적일 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 전술한 바와 같은 HCV 뉴클레오타이드 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 서열을 함유하는 발현 벡터를 작제하는 데 이용될 수 있다. 이러한 방법에는, 예컨대 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합이 포함된다. 대안으로, HCV 뉴클레오타이드 서열을 암호화할 수 있는 RNA를, 예컨대 합성기를 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 예컨대 문헌[Oligonucleotide Synthesis, 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford]에 기술된 기법을 참고할 수 있다. 따라서, 몇몇 구체예는 본 발명의 HCV 펩티드를 발현하도록 조작한 세포주에 관한 것이다. 예를 들어, 몇몇 세포는 서열 번호 17, 23-32 및 43-49의 HCV 펩티드 또는 이들 분자의 단편을 발현하도록 제조된다.
본 발명의 HCV 펩티드를 발현하기 위해 각종 숙주-발현 벡터 시스템을 이용할 수 있다. 적절한 발현 시스템의 비제한적인 예로는 미생물, 예컨대 HCV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 박테리아(예컨대, E. 콜라이 또는 B. 서브틸리스); HCV 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환시킨 효모(예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia)); HCV 서열을 보유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 배큘로바이러스)로 감염시킨 곤충 세포 시스템; HCV 서열을 보유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염시키거나 또는 HCV 서열을 보유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예, Ti 플라스미드)로 형질전환시킨 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈 유래의 프로모터(예컨대, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스 유래의 프로모터(예컨대, 아데노바이러스 후기 발현 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 발현 작제물을 보유하는 포유동물 세포 시스템(예컨대, COS, CHO, BHK, 293, 3T3)을 들 수 있다.
박테리아 시스템에서는 발현시킨 HCV 유전자 생성물의 사용 목적에 따라서 다수의 발현 벡터를 유리하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 다량의 단백질을 생산하고자 하는 경우, HCV 펩티드의 약학 조성물의 생성 또는 HCV 펩티드에 대한 항체의 생성을 위해, 예컨대 정제가 용이한 고농도의 융합 단백질 생성물의 발현을 유도하는 벡터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 벡터의 비제한적인 예로는 E. 콜라이 발현 벡터 pUR278[Ruther 등, EMBO J., 2:1791(1983)](이 벡터에서는 HCV 암호화 서열을 lacZ 암호화 영역과 리딩 프레임이 맞게 벡터에 개별적으로 결찰시켜서 융합 단백질을 생성할 수 있다); pIN 벡터[Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res., 13:3101-3109(1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem., 264:5503-5509(1989)] 등을 들 수 있다. pGEX 벡터는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 이종 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수도 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 글루타티온-아가로스 비이드에 흡착시킨 후 유리 글루타티온의 존재 하에 용리시켜서 용해된 세포로부터 정제할 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인하여 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 부분으로부터 방출되도록 할 수 있다.
곤충 시스템에서는, 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)를 이종 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용한다. 이 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 증식한다. HCV 암호화 서열을 바이러스의 비필수 영역(예컨대, 폴리헤드린 유전자)에 개별적으로 클로닝하고, AcNPV 프로모터(예컨대, 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 배치한다. HCV 유전자 암호화 서열을 성공적으로 삽입하면 폴리헤드린 유전자가 불활성화되고 비폐색 재조합 바이러스(즉, 폴리헤드린 유전자에 의해 암호화되는 단백질 코트가 없는 바이러스)가 생성된다. 그 후 이러한 재조합 바이러스를 사용하여 스포돕테라 프루기페르다 세포를 감염시키며, 이 세포에서 삽입된 유전자가 발현된다[참고 문헌의 예: Smith 등, J. Virol. 46:584(1983) 및 Smith의 미국 특허 제4,215,052호].
포유동물 숙주 세포에서는 다수의 바이러스계 발현 시스템을 이용할 수 있다. 아데노바이러스를 발현 벡터로서 사용하는 경우, 목적하는 HCV 뉴클레오타이드 서열을 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예컨대 후기 발현 프로모터 및 3분열(tripartite) 리더 서열에 결찰시킬 수 있다. 그 후 이러한 키메라 유전자를 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입시킬 수 있다. 바이러스 게놈을 비필수 영역(예컨대, 영역 E1 또는 E3)으로 삽입하면 감염된 숙주에서 생존할 수 있고 HCV 유전자 생성물을 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 얻어진다[참고 문헌의 예: Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659(1984)]. 삽입된 HCV 뉴클레오타이드 서열의 효율적인 번역에는 특이적 개시 시그널이 필요할 수도 있다. 이러한 시그널은 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다.
그러나, HCV 암호화 서열의 일부분만이 삽입되는 경우, 아마도 ATG 개시 코돈을 비롯하여 외생 번역 조절 시그널이 제공될 수 있다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입체의 번역을 확실히 하기 위해 목적 암호화 서열의 리딩 프레임과 일치하도록 삽입할 수 있다. 이러한 외생 번역 조절 시그널 및 개시 코돈은 그 기원이 다양할 수 있으며, 천연 및 합성된 것일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결서열 등을 포함시켜서 증대시킬 수 있다[참고 문헌의 예: Bittner 등, Methods in Enzymol., 153:516-544(1987)].
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하고, 원하는 특이적인 방식으로 유전자 생성물을 변형 및 프로세싱하는 숙주 세포주를 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형(예, 글리코실화) 및 프로세싱(예, 절단)은 단백질의 기능에 있어서 중요한 것이다. 서로 다른 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 프로세싱 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메카니즘을 보유한다. 발현된 이종 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하도록 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이 목적을 위해, 1차 전사체의 적절한 프로세싱, 유전자 생성물의 글리코실화 및 인산화를 위한 세포 소기관을 보유하는 진핵생물 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포의 비제한적인 예로는 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 및 WI38이 있다.
장기간의 고수율 재조합 단백질 생산을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 전술한 HCV 펩티드를 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스 복제 기점을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것보다는 숙주 세포를 적절한 발현 조절 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서 서열, 전자 종결서열, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선별 마커에 의해 제어된 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 이종 DNA의 도입 후, 조작된 세포를 농축 배지에서 1∼2일간 배양하고 나서, 배지를 선별 배지로 교환한다. 재조합 플라스미드 내의 선별 마커는 선별에 대한 내성을 부여하여, 세포가 그 플라스미드를 자신의 염색체에 안정하게 통합시켜서 성장하게 함으로써 성장점을 형성하게 되며, 이를 클로닝하여 세포주로 증폭시킨다. 이 방법은 HCV 유전자 생성물을 발현하는 세포주를 조작하는 데 편리하게 이용된다.
허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제[Wigler 등, Cell 11:223(1977)], 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제[Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026(1962)] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[Lowy 등, Cell 22:817(1980)]를 비롯하여 다수의 선별 시스템을 이용할 수 있으며, 유전자들은 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 이용될 수 있다. 또한, 하기 유전자에 대한 선별의 기초로서 항대사물질 내성을 이용할 수 있다: dhfr; 이는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다[Wigler 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567(1980); O'Hare 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527(1981)]; gpt, 이는 미코페놀산에 대한 내성을 부여한다[Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072(1981); neo, 이는 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여한다[Colberre-Garapin 등, J. Mol. Biol. 150:1(1981)]; 및 hygro, 이는 하이그로마이신에 대한 내성을 부여한다[Santerre 등, Gene 30:147(1984)].
대안으로, 발현되는 융합 단백질에 특이적인 항체를 이용함으로써 임의의 융합 단백질을 쉽게 정제할 수 있다. 예를 들어, Janknecht 등에 의해 기술된 시스템은 인간 세포주에서 발현되는 비변성 융합 단백질의 즉석 정제를 가능하게 한다[Janknecht 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976(1991)]. 이 시스템에서는, 목적 유전자를 백시니아 재조합 플라스미드에 서브클로닝하여, 유전자의 오픈 리딩 프레임이 6개의 히스티딘 잔기로 이루어진 아미노 말단 태그에 번역 가능하게 융합되도록 한다. 재조합 백시니아 바이러스에 감염된 세포로부터의 추출물을 Ni2+ 니트릴로아세트산-아가로스 컬럼 상에 로딩하고, 이미다졸-함유 완충액을 사용하여 히스티딘-태그 단백질을 선택적으로 용리시킨다. 하기 실시예에서는 본 발명의 핵산에 의해 암호화된 HCV 펩티드를 발현하는 데 이용된 방법에 대해 설명한다.
실시예 13
NS3/4A 융합 단백질, 이의 절두형 및 돌연변이형의 특성을 규명하기 위해, 실시예 6에 기술된 벡터 작제물을 생체내에서 전사 및 번역시키고, 생성된 폴리펩티드를 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 시각화하였다. 시험관내 전사 및 번역은 T7이 결합된 망상적혈구 용해물 시스템(프로메가, 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 발현 작제물의 모든 시험관내 번역 반응은 35S-표지 메티오닌(아머샴 인터내셔널, Plc, 영국 버킹엄셔 소재)을 사용하여 30℃에서 수행하였다. 표지된 단백질은 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, X-선 필름(Hyper Film-MP, 아머샴)에 6∼18시간 동안 노출시켜서 시각화하였다.
시험관내 분석 결과 모든 단백질이 그 개개의 발현 작제물로부터 다량 발현되었음이 확인되었다. rNS3 작제물(NS3-pVAX 벡터)은 약 61 kDa의 단일 펩티드를 생성한 반면, TPT 작제물(NS3/4A-TPT-pVAX) 및 RGT 작제물(NS3/4A-RGT-pVAX)은 약 67 kDa의 단일 폴리펩티드를 생성하였으며, 이는 NS3/4A-pVAX 작제물로부터 생성된 절단되지 않은 NS3/4A 펩티드의 분자량과 동일한 것이다. 발현된 NS3/4A 펩티드로부터 생성된 절단된 생성물은 약 61 kDa였으며, 이는 NS3-pVAX 벡터로부터 생성된 rNS3와 크기가 동일하였다. 이러한 결과는 발현 작제물이 기능을 나타내었고, NS3/4A 작제물은 효소 활성이 있으며, rNS3는 예상 크기의 펩티드를 생성하였고, TPT 및 RGT 돌연변이는 NS3-NS4A 접합점에서의 절단을 완전히 파괴하였음을 입증하는 것이었다.
본 발명의 HCV 핵산 및 펩티드를 포함하는 서열, 작제물, 벡터, 클론 및 기타 물질은 농축된 형태이거나 분리된 형태일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "농축된(enriched)"이란 용어는 물질의 농도가 자연 상태의 농도의 약 2, 5, 10, 100, 또는 1000배 이상인 것을 의미하며, 예를 들어 유용하게는 0.01 중량%, 바람직하게는 약 0.1 중량% 이상인 것을 의미한다. 약 0.5 중량%, 1 중량%, 5 중량%, 10 중량% 및 20 중량%의 농축 제제 역시 고려될 수 있다. "분리된"이란 용어는 물질이 원래 환경(예컨대, 자연 발생적인 것이라면 자연 환경)으로부터 제거될 것을 요한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생적 폴리뉴클레오타이드는 분리된 상태가 아니지만, 자연계에 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 격리시킨 동일한 폴리펩티드는 분리된 상태이다. 서열은 정제된 형태로 존재하는 것이 유용할 수 있다. "정제된"이란 용어는 절대 순도를 요하지는 않으며, 상대적 개념으로 사용된 것이다. 분리된 단백질은 통상적으로, 예를 들어 전기영동 결과가 코마시 염색법에 의해 균질한 상태로 확인될 정도로 정제된다. 출발 물질 또는 천연 물질을 적어도 1배 이상, 바람직하게는 2∼3배, 보다 바람직하게는 4배 또는 5배 정도로 정제하는 것은 분명히 포함된다.
본 발명의 HCV 유전자 생성물을 식물, 곤충 및 동물에서 발현시켜서 형질전환 생물체를 생성할 수도 있다. HCV 펩티드를 보유하는 바람직한 형질전환 식물체로는 아라비돕시스(Arabidopsis), 옥수수 및 클라마이도모나스(Chlamydomonas)가 있다. HCV 펩티드를 보유하는 바람직한 곤충 시스템의 비제한적인 예로는 D. 멜라노개스터(D. melanogaster) 및 C. 엘레간스(C. elegans)가 있다. 비제한적인 예로서 양서류, 파충류, 조류, 마우스, 햄스터, 래트, 토끼, 기니 피그, 돼지, 소형 돼지, 염소, 개, 고양이 및 비인간 영장류, 예컨대 버분, 원숭이 및 침팬지를 비롯하여 임의의 종의 동물을 본 발명의 HCV 분자를 보유하는 형질전환 동물을 생성하는 데 이용할 수 있다. 이러한 형질전환 생물체는 바람직하게는 본 발명의 HCV 펩티드의 생식 세포 전달을 나타낸다.
형질전환 동물의 기초 혈통을 구축하기 위해 동물에 HCV 트랜스유전자를 도입하거나, 또는 기존의 HCV 유전자를 넉 아웃시키거나 대체하는 데에는 당업계에 공지된 임의의 기법이 바람직하게 이용된다. 이러한 기법의 비제한적인 예로는 전핵 마이크로인젝션[Hoppe, P.C. 및 Wagner, T.E., 1989, 미국 특허 제4,873,191호]; 레트로바이러스를 매개로 생식 세포에 유전자를 전달하는 방법[Van der Putten 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152(1985)]; 배아 줄기 세포로의 유전자 표적화[Thompson 등, Cell 56:313-321(1989)]; 배아의 일렉트로포레이션[Lo, Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814(1983)]; 및 정자를 매개로 한 유전자 전달[Lavitrano 등, Cell 57:717-723(1989); Gordon, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229(1989)]이 있다. 하기 섹션에서는 본 발명의 HCV 펩티드와 상호작용하는 항체의 제조에 대해 설명한다.
항-HCV 항체
HCV 펩티드의 합성 또는 발현 및 분리 또는 정제 후에, 분리된 또는 정제된 펩티드를 항체를 생성하는 데 사용할 수 있다. 문맥에 따라서 "항체"란 용어는 폴리클로널 항체, 모노클로널 항체, 키메릭 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편들을 포괄할 수 있다. HCV 펩티드를 인식하는 항체는 비제한적인 예로서 생물공학적 용도, 치료/예방 용도 및 진단 용도를 비롯하여 다수의 용도에 사용될 수 있다.
항체의 생산을 위해서는, 염소, 토끼, 래트, 마우스 및 인간 등의 각종 숙주에 HCV 펩티드를 주사하여 면역화시킬 수 있다. 숙주의 종에 따라서 다양한 면역 보강제를 사용하여 면역 반응을 증대시킬 수 있다. 이러한 면역 보강제로는 리바비린, 프로인트, 미네랄 겔, 예컨대 수산화알루미늄, 및 표면 활성 성분, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀을 들 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. BCG(바실러스 칼멧-구에린) 및 코리네박테리움 파르범(Corynebacterium parvum) 역시 유효하게 사용될 수 있는 면역 보강제이다.
특이적 항체를 유도하는 데 사용된 펩티드는 4개 이상의 아미노산, 바람직하게는 최소한 10∼15개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 방법의 예로, NS3/4A의 단편을 암호화하는 아미노산의 짧은 스트레치를 키홀 림펫 헤모시아닌 등의 다른 단백질에 융합시켜서 항체가 키메라 분자에 대해 생성되도록 한다. 또한, 리바비린 및 NS3/4A(서열 번호 17), 아미노산 길이가 최소한 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편, 이들 분자 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물을 동물에게 투여한다. HCV 펩티드에 상응하는 합성 3-머, 10-머, 및 15-머 펩티드를 마우스에 주사함으로써 HCV를 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 생성할 수 있지만, 전술한 바와 같이 제조한 재조합 HCV 펩티드를 사용하여 더 다양한 종류의 항체를 생성할 수 있다.
HCV 펩티드에 대한 항체를 생성하기 위해, 형질감염 또는 형질전환된 세포로부터 실질적으로 순수한 펩티드를 분리한다. 최종 제조물 내의 펩티드의 농도를, 예컨대 아미콘 필터 장치 상에서 농축시켜서 수 ㎍/㎖가 되도록 조정한다. 그 후 아래와 같이 목적 펩티드에 대한 모노클로널 또는 폴리클로널 항체를 제조할 수 있다.
HCV 펩티드에 대한 모노클로널 항체는 배양시 연속 세포주에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 기법에는 Koehler 및 Milstein의 문헌[Nature 256:495-497(1975)]에서 처음 개시된 하이브리도마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법[Kosbor 등, Immunol. Today 4:72(1983); Cote 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030(1983)] 및 EBV 하이브리도마 기법[Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., New York N.Y., pp 77-96(1985)]을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기법, 적절한 항원 특이성과 생물학적 활성을 갖는 분자를 얻기 위해 마우스 항체 유전자를 인간 항체 유전자에 스플라이싱하는 기법을 이용할 수도 있다[Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855(1984); Neuberger 등, Nature 312:604-608(1984); Takeda 등, Nature 314:452-454(1985)]. 대안으로, 단일 쇄 항체의 생산에 대해 기술된 기법(미국 특허 제4,946,778호)을 HCV-특이적 단일 쇄 항체를 생산하는 데 이용할 수 있다. Orlandi 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837(1989)] 및 Winter G. 및 Milstein C의 문헌[Nature 349:293-299(1991)]에 개시된 바와 같이, 항체는 림프구 군집에서의 생체내 생산을 유도하거나, 재조합 면역글로불린 라이브러리 또는 고도로 특이적인 결합 반응물질류를 스크리닝함으로써 생산할 수도 있다.
HCV 펩티드에 대한 특이적 결합 부위를 포함하는 항체 단편 역시 생성할 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편의 비제한적인 예로는 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 이황화 다리를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편을 들 수 있다. 또는, Fab 발현 라이브러리는 목적하는 특이성을 갖는 모노클로널 Fab 단편을 신속하고 쉽게 확인할 수 있도록 하기 위해 제작될 수 있다[Huse W.D. 등, Science 256:1275-1281(1989)].
한 방법으로서, HCV 펩티드에 대한 모노클로널 항체를 다음과 같이 제조한다. 요약하면, 선별된 단백질 또는 이로부터 유래된 펩티드 몇 마이크로그램을 수주일에 걸쳐서 마우스에 반복적으로 접종한다. 그 후 마우스를 죽이고, 비장의 항체 생산 세포를 분리한다. 폴리에틸렌 글리콜의 존재 하에 마우스 골수종 세포와 비장 세포를 융합시키고, 아미노프테린을 포함하는 선별 배지(HAT 배지) 상에서 세포를 성장시켜 과량의 비융합 세포를 파괴한다. 성공적으로 융합된 세포를 희석시키고, 희석물 분약을 미량역가 플레이트의 웰에 넣고 거기에서 배양을 계속한다. Engvall, E. 등의 문헌[Meth. Enzymol. 70:419(1980)]에 처음 개시된 ELISA 등의 면역분석 방법 및 이 방법의 변형 방법에 의해 웰의 상청액 중에서 항체를 검출함으로써 항체-생산 클론을 확인한다. 선별된 양성 클론을 증폭시키고, 이의 모노클로널 항체 생성물을 사용 목적으로 회수할 수 있다. 모노클로널 항체 생산에 대한 상세한 절차는 Davis 등의 문헌[Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York, 섹션 21-2]에 기술되어 있다.
단일 단백질의 이종 에피토프에 대한 항체를 함유하는 폴리클로널 항혈청은 전술한 것으로부터 유래된 발현된 단백질 또는 펩티드를 적절한 동물에 접종함으로써 제조할 수 있으며, 면역원성을 증강시키기 위해 이를 변형시킬 수도 있고 변형시키지 않을 수도 있다. 효율적인 폴리클로널 항체 생산은 항원 또는 숙주 종 둘 다와 관련된 다수의 요인에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 작은 분자들은 다른 것보다 면역원성이 더 적은 경향이 있으며, 캐리어 및 면역 보강제의 사용이 필요할 수 있다. 또한, 숙주 동물은 접종 부위와 투여량에 따른 반응이 다양하며, 부적절한 양이나 과량의 항원은 항혈청의 역가를 떨어뜨리게 된다. 소량(ng 수준)의 항원을 여러 부위에 피내 주사하는 것이 가장 확실한 것으로 보인다. 토끼에 대한 면역화 프로토콜에 대해서는 Vaitukaitis 등의 문헌[J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991(1971)]에서 찾아볼 수 있다.
정기적으로 추가 접종을 실시하고, 반정량적으로, 예컨대 아가에서 알고 있는 농도의 항원에 대해 이중 면역확산을 실시하여 측정한 항체 역가가 떨어지기 시작할 때 항혈청을 회수한다. 이에 대해서는, 예를 들어 Ouchterlony, O. 등의 문헌[Handbook of Experimental Immunology, 19장, D. Wier(ed) Blackwell(1973)]을 참조로 할 수 있다. 항체의 안정기 농도는 일반적으로 혈청 1 ㎖당 0.1∼0.2 mg(약 12 μM)이다. 항원에 대한 항혈청의 친화력은, 예컨대 Fisher, D.의 문헌[Manual of Clinical Immunology, 42장, 2판(Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C.(1980)]에 기술된 바와 같이 경쟁적 결합 곡선을 작성하여 결정한다. 어느 프로토콜에 따라 제조된 항체 제조물이라도 생물학적 샘플 중의 항원-보유 물질의 농도를 측정하는 정량적 면역분석에 유용하며, 이들은 또한 반정량적으로 또는 정성적으로(예컨대, 생물학적 샘플 중의 HCV의 존재를 확인하기 위한 진단적 목적으로) 사용되기도 한다. 하기 섹션에서는 진단 구체예 몇 가지를 더 상세히 설명한다.
진단 구체예
일반적으로, 본 발명의 진단법은 핵산을 이용하는 분석인지 단백질을 이용한 분석인지에 따라 분류된다. 일부 진단적 분석은 환자로부터 얻은 샘플 중의 본 발명의 HCV 핵산 서열의 존재 또는 부재를 검출하지만, 다른 분석은 본 발명의 HCV 펩티드가 환자로부터 얻은 생물학적 샘플 중에 존재하는지를 확인하고자 하는 것이다. 또한, HCV의 신속한 검출 및 확인을 가능하게 하는 본 명세서에 기술된 시약 및 방법을 포함시킨 키트의 제조 역시 본 발명의 구체예가 된다. 이러한 진단 키트는, 예를 들어 HCV를 특이적으로 검출하는 본 발명의 핵산 프로브 또는 항체를 포함한다. 이러한 키트의 검출 성분은 일반적으로 하기 시약 중 하나 이상과 함께 제공된다. DNA, RNA 또는 단백질을 흡착 또는 결합시킬 수 있는 지지체가 종종 제공된다. 유용한 지지체로는 니트로셀룰로스 멤브레인, 나일론 멤브레인 또는 양전하 치환기의 어레이를 보유함으로써 특성화될 수 있는 유도체화된 나일론 멤브레인을 포함한다. 1종 이상의 제한 효소, 조절 시약, 완충액, 증폭 효소 및 비인간 폴리뉴클레오타이드 유사 송아지-흉선 DNA 또는 연어 정자 DNA를 이들 키트에 제공할 수 있다.
유용한 핵산 기초 진단법에는 직접 DNA 시퀀싱, 서든 블롯 분석, 닷 블롯 분석, 핵산 증폭 및 이러한 방법의 병용법을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 분석을 위한 출발점은 HCV에 감염된 것으로 의심되는 환자 또는 HCV 감염 위험이 있는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플로부터 분리 또는 정제된 핵산이다. 이 샘플로부터 핵산을 추출하고, 본 발명의 HCV 핵산 서열[예컨대, NS3/4A(서열 번호 16)]에 인접한 영역에 상응하는 프라이머를 사용하여 RT-PCR 및/또는 DNA 증폭에 의해 핵산을 증폭시킬 수 있다.
몇몇 구체예에서는, HCV 서열과 특이적으로 하이브리드화하는 핵산 프로브를 정렬된 어레이로 지지체 상에 부착시키는데, 이때 핵산 프로브를 서로 중첩되지 않도록 지지체의 서로 다른 영역에 부착시킨다. 바람직하게는, 이러한 정렬된 어레이는, 프로브의 개별 위치를 기록하고, 분석 절차의 일부로서 그 기록을 호출할 수 있는 "어드레서블(addressable)"이 되도록 디자인한다. 이러한 프로브를 지지체의 서로 다른 알고 있는 지점에 결합시킨다. 각 핵산 프로브의 정확한 위치를 알고 있기 때문에 이들 "어드레서블" 어레이가 결합 분석에서 특히 유용하게 된다. 그 후 여러 생물학적 샘플 제제로부터의 핵산을 통상적인 방법(예컨대, 방사능 또는 형광)에 의해 표지하고, 표지된 샘플을 하이브리드화가 일어날 수 있는 조건하에 상기 어레이에 적용한다.
샘플 중의 핵산이 어레이 상의 프로브에 하이브리드화한다면, 하이브리드의 위치에 상응하는 지지체 상의 지점에서 시그널이 검출될 것이다. 각 표지된 샘플의 실체를 알고 있고, 표지된 샘플이 적용된 지지체 상의 영역을 알고 있기 때문에, 다형 변이체의 존재 확인은 신속하게 결정될 수 있다. 이러한 방법은 고처리량 진단 분석 또는 검출 분석 분야의 기술자에게 공지되어 있는 기법을 이용하면 쉽게 자동화된다.
또한, 앞서 제시한 것과 반대 방법을 이용할 수도 있다. 생물학적 샘플 중에 존재하는 핵산을 지지체 상에 배치하여 어드레서블 어레이를 형성할 수 있다. 샘플은 지지체 상의 알고 있는 지점에 중첩되지 않도록 배치하는 것이 바람직하다. 각 샘플 중의 HCV 핵산의 존재는, 생물학적 샘플이 배치된 지점에 상응하는 어레이 상의 위치에 HCV 펩티드를 암호화하는 핵산에 대해 상보 서열인 표지된 핵산 프로브를 적용함으로써 결정한다. 생물학적 샘플의 실체 및 어레이 상의 그 위치를 알고 있기 때문에, HCV에 감염된 환자의 확인은 신속하게 결정될 수 있다. 이러한 방법 역시 고처리량 진단 분석 분야의 기술자에게 공지되어 있는 기법을 이용하면 쉽게 자동화된다.
당업계에 공지된 임의의 어드레서블 어레이 기법을 이용할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 어레이의 한 특정 구체예가 GenechipsTM로서 알려져 있으며, 이는 미국 특허 제5,143,854호; PCT 공개 공보 WO 90/15070 및 92/10092에 개괄적으로 기술되어 있다. 이러한 어레이는 일반적으로 기계적 합성 방법 또는 광 유도 합성 방법을 이용하여 제조되며, 이 방법은 포토리소그래피 및 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성의 병용법을 포함한다[Fodor 등, Science, 251:767-777(1991)]. 고체 지지체 상에 올리고뉴클레오타이드 어레이를 고정시키는 것은 "Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis"(VLSPISTM)로서 일반적으로 알려진 기법의 개발에 의해 가능하게 되었으며, 이 기법에서는 통상 프로브를 칩의 고체 표면 상에 고밀도 어레이로 고정시킨다. VLSPISTM 기법의 예는 미국 특허 제5,143,854호 및 제5,412,087호 및 PCT 공개 공보 WO 90/15070, WO 92/10092 및 WO 95/11995에 제시되어 있으며, 이 문헌들은 광 유도 합성 기법 등의 기법을 통해 올리고뉴클레오타이드 어레이를 형성하는 방법에 대해 설명한다. 고체 지지체 상에 고정된 뉴클레오타이드의 어레이를 제공하기 위한 목적의 방법을 고안하는 데 있어서, 하이브리드화 패턴 및 진단 정보를 최대화하기 위한 시도로 칩 상에 올리고뉴클레오타이드 어레이를 정렬 및 배치하기 위한 추가의 프리젠테이션 기법을 개발하였다. 이러한 프리젠테이션 기법의 예는 PCT 공개 공보 WO 94/12305, WO 94/11530, WO 97/29212, 및 WO 97/31256에 개시되어 있다.
다양한 표지 및 접합 기법이 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 다양한 핵산 분석에 사용될 수 있다. 올리고표지법, 닉(nick) 번역, 말단 표지법 또는 표지된 뉴클레오타이드를 사용하는 PCR 증폭을 비롯하여 하이브리드화 또는 PCR을 위한 표지된 핵산을 제조하기 위한 여러 방법이 존재한다. 대안으로, HCV 펩티드를 암호화하는 핵산을 mRNA 프로브의 생성을 위한 벡터에 클로닝할 수 있다. 이러한 벡터들은 당업계에 공지되어 있으며, 시판되기도 하고, 적절한 RNA 폴리머라제, 예컨대 T7, T3 또는 SP6 및 표지된 뉴클레오타이드를 첨가하여 시험관내에서 RNA 프로브를 합성하는 데 이용할 수 있다. 파마시아 바이오테크(뉴저지주 피스카타웨이 소재), 프로메가(위스콘신주 매디슨 소재) 및 U.S. 바이오케미칼 코포레이션(오하이오주 클리브랜드 소재) 등의 다수의 회사가 상기 절차를 위한 상업용 키트 및 프로토콜을 공급한다. 적절한 리포터 분자 또는 표지로는 방사성 핵종, 효소, 형광, 화학발광 또는 색원체는 물론, 기질, 보조 인자, 억제제, 자기 입자 등을 포함된다.
환자로부터 얻은 단백질 샘플 중의 HCV 펩티드의 존재 역시 통상적인 분석 및 본 명세서에 개시된 구체예에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 HCV 펩티드와 면역반응성인 항체를 사용하여 HCV 감염의 존재에 대해 생물학적 샘플을 스크리닝할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 HCV 펩티드에 반응성인 항체를 사용하여 생물학적 샘플로부터 얻은 본 발명의 HCV 펩티드를 면역침전시키거나, 또는 웨스턴 또는 이뮤노블롯 상에서 생물학적 샘플로부터 얻은 단백질과 반응시킨다. 바람직한 진단 구체예는 또한 효소-결합 면역흡착분석(ELISA), 방사선면역분석(RIA), 면역방사계측법(IRMA) 및 면역효소분석(IEMA)을 포함하며, 여기에는 본 발명에 개시된 HCV 펩티드에 대해 특이적인 모노클로널 및/또는 폴리클로널 항체를 이용하는 샌드위치 분석도 포함된다. 대표적인 샌드위치 분석에 대해서는 David 등의 미국 특허 제4,376,110호 및 4,486,530호에 기술되어 있다. 다른 구체예는 미국 특허 제5,290,678호; 제5,604,105호; 제5,710,008호; 제5,744,358호 및 제5,747,274호에 개시된 면역-스트립 기법의 양태를 이용한다.
또 다른 바람직한 단백질계 진단법에서는, 전술한 항체를 정렬된 어레이로 지지체 상에 부착시키는데, 이때 다수의 항체가 서로 중첩되지 않도록 지지체 상의 서로 다른 영역에 부착시킨다. 핵산을 이용한 어레이에서와 마찬가지로, 단백질을 이용한 어레이는, 서로 다른 위치를 기록하고, 분석 절차의 일부로서 그 기록을 호출할 수 있도록 "어드레서블" 어레이가 되도록 디자인된 정렬된 어레이이다. 이러한 프로브를 지지체 상의 알고 있는 서로 다른 위치에 결합시킨다. 각 프로브의 정확한 위치를 알고 있기 때문에 이러한 "어드레서블" 어레이는 특히 결합 분석에 유용하게 된다. 예를 들어, 어드레서블 어레이는 생물학적 샘플 중에 존재하는 HCV 펩티드를 특이적으로 인식하는 다수의 항체 프로브가 결합되어 있는 여러 영역을 갖는 지지체를 포함할 수 있고, 그 안에서 확인된 HCV의 아이소타입을 구별할 수 있다.
한 방법으로서, 생물학적 샘플로부터 단백질을 입수한 다음, 통상적인 방법(예컨대, 방사능, 색채 또는 형광)에 의해 표지한다. 그 후 표지된 샘플을 결합이 가능한 조건에서 어레이에 적용한다. 샘플 중의 단백질이 어레이 상의 항체 프로브에 결합한다면, 항체-단백질 복합체의 위치에 해당하는 지지체 상의 지점에서 시그널이 검출될 것이다. 각 표지된 샘플의 실체를 알고 있고, 표지된 샘플이 적용된 지지체 상의 영역을 알고 있기 때문에, 존재의 확인, 농도 및/또는 발현 수준을 신속히 결정할 수 있다. 즉, 알고 있는 농도의 표지된 HCV 펩티드 스탠더드를 사용함으로써 연구자들은 테스트 샘플 중의 특정 펩티드의 단백질 농도를 정확히 측정할 수 있으며, 또한 HCV 펩티드의 발현 수준을 평가할 수 있다. HCV 펩티드의 농도 또는 발현 수준을 보다 정확히 측정하기 위해 통상적인 농도 측정법을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 고처리량 진단 분석 분야의 기술자에게 공지된 기법을 이용하면 쉽게 자동화된다.
또 다른 구체예에서, 전술한 방법과 반대 방법을 이용할 수 있다. 생물학적 샘플 중에 존재하는 단백질을 지지체 상에 배치하여 어드레서블 어레이를 형성할 수 있다. 바람직하게는 단백질 샘플은 지지체 상에 서로 중첩되지 않도록 알고 있는 지점에 배치한다. 그 후 HCV 펩티드에 특이적인 에피토프를 인식하는 표지된 항체 프로브를 적용함으로써 각 샘플 중의 HCV 펩티드의 존재를 확인한다. 생물학적 샘플의 실체와 어레이 상의 그 지점을 알고 있기 때문에, HCV 펩티드의 존재의 확인, 농도 및/또는 발현을 신속히 결정할 수 있다.
즉, 알고 있는 농도의 표지된 HCV 펩티드 스탠더드를 사용함으로써, 연구자들은 샘플 중의 펩티드 농도를 정확히 측정할 수 있고, 이 정보로부터 펩티드의 발현 수준을 평가할 수 있다. 또한, 통상적인 농도 측정법을 이용하여 HCV 펩티드의 농도 또는 발현 수준을 보다 정확히 측정할 수 있다. 이러한 방법 역시 고처리량 진단 분석 분야의 기술자에게 공지된 기법을 이용하면 쉽게 자동화된다. 앞서 상세히 설명한 바와 같이, 당업계에 공지된 임의의 어드레서블 어레이 기법을 이용할 수 있다. 하기 섹션에서는 본 발명의 HCV 핵산 또는 HCV 펩티드 중 하나 이상의 함유할 수 있는 조성물 중 몇 가지에 대해 설명한다.
본 발명의 HCV 핵산 또는 펩티드를 함유하는 조성물
몇몇 구체예는 지지체에 결합된 HCV 핵산 또는 펩티드 중 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는 이러한 지지체는 다량체를 형성하기 위해 제조된다. 이러한 다량체는 HCV 펩티드 또는 핵산을 분자에 대한 충분한 친화력이 얻어지는 형태 또는 방식이 되도록 한다. HCV 핵산 또는 펩티드를 지닌 다량체는 목적 분자를 고분자 지지체 상에 결합시킴으로써 얻을 수 있다. "지지체"란 캐리어, 단백질, 수지, 세포 막, 또는 이러한 분자들을 결합 또는 고정시키는 데 사용되는 임의의 고분자 구조를 칭할 수 있다. 고체 지지체의 비제한적인 예로는 반응 트레이의 웰의 벽, 시험관, 폴리스티렌 비이드, 자기 비이드, 니트로셀룰로스 스트립, 멤브레인, 미립자, 예컨대 라텍스 입자, 동물 세포, Duracyte
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, 인공 세포 등이 있다. HCV 핵산 또는 펩티드를 무기 캐리어, 예컨대 산화규소 재료(예컨대, 실리카 겔, 제올라이트, 규조토 또는 아민화된 유리)에, 예를 들어 캐리어 상의 히드록시기, 카르복시기 또는 아미노기 및 반응성 기를 통한 공유 결합에 의해 결합시킬 수도 있다.
몇몇 다량체에서는, 고분자 지지체는 소수성 비공유 결합에 의해 HCV 핵산 또는 펩티드의 일부분과 상호작용하는 소수성 표면을 가진다. 몇몇 경우, 지지체의 소수성 표면은 플라스틱 또는 소수성 기가 결합되어 있는 임의의 다른 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 폴리에틸렌 또는 폴리비닐이다. 또한, HCV 핵산 또는 펩티드는 단백질 및 올리고당류/다당류(예컨대, 셀룰로스, 전분, 글리코겐, 키토산 또는 아민화된 세파로스)를 비롯한 캐리어에 공유 결합시킬 수 있다. 상기한 후자의 다량체에서는 분자 상의 반응성 기, 예컨대 히드록시기 또는 아미노기를 이용하여 캐리어 상의 반응성 기에 결합시켜서 공유 결합을 형성할 수 있다. 그 밖의 다량체는 HCV 핵산 또는 펩티드를 부착시키기 위해 화학적으로 활성화된 다른 반응성 기를 가진 지지체를 포함한다. 예를 들어, 브롬화시아노겐 활성화 매트릭스, 에폭시 활성화 매트릭스, 티오 및 티오프로필 겔, 니트로페닐 클로로포르메이트 및 N-히드록시 숙신이미드 클로로포르메이트 결합, 또는 옥시란 아크릴 지지체가 사용된다(시그마).
체내에 사용하기 위한(즉, 예방용 또는 치료용) 캐리어는 생리적이고 비독성이어야 하며, 면역 반응성이 없는 것이 바람직하다. 체내에 사용하기 위한 적절한 캐리어에는 폴리-L-리신, 폴리-D, L-알라닌, 리포좀 및 Chromosorb
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(존스-맨빌 프로덕츠, 덴버 컴퍼니)가 있다. 리간드 접합된 Chromosorb
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(Sybsorb-Pk)는 용혈성 요독증의 예방에 대해 인간에서 테스트되었으며, 부작용을 나타내지 않는 것으로 보고되었다[Amstrong 등, J. Infectious Diseases 171:1042-1045(1995)]. 몇몇 구체예의 경우, 생물체의 체내에서 HCV 핵산 또는 펩티드에 대한 결합 능력을 보유하는 "네이키드(naked)" 캐리어(즉, HCV 핵산 또는 펩티드가 결합되지 않은 것)를 투여한다. 한 방법으로서, 네이키드 캐리어를 HCV 핵산 또는 펩티드와 별도로 투여하고, 생물체의 체내에 이 둘다가 존재하게 되면, 캐리어와 HCV 핵산 또는 펩티드가 다중결합 복합체로 조립되도록 "전구약물형" 요법을 고안한다.
또한, 링커, 예컨대 HCV 핵산 또는 펩티드와 지지체 사이에 적절한 길이의 링커(예컨대, λ파지의 가요성 영역을 모방하도록 제작된 "λ링커")를 삽입함으로써 HCV 펩티드, 하이브리드, 또는 결합 파트너의 가요성을 더욱 증가시켜서 지지체에 의해 부과될 수 있는 임의의 공간적 장애를 극복하는 것도 고려된다. 최적 세포 반응 또는 이의 부족을 정하는 링커의 길이의 결정은 본 명세서에 상세히 설명된 분석에서 다양한 링커를 사용하여 HCV 핵산 또는 펩티드를 스크리닝함으로써 결정할 수 있다.
한 종류 이상의 HCV 핵산 또는 펩티드를 포함하는 복합 지지체 역시 고려된다. "복합 지지체"는 캐리어, 수지, 또는 2종 이상의 상이한 HCV 핵산 또는 펩티드를 결합 또는 고정시키는 데 사용되는 임의의 고분자 구조일 수 있다. 전술한 바와 같이, HCV 핵산 또는 펩티드와 지지체 사이에 적절한 길이의 λ링커 등의 링커를 삽입함으로써 분자 내의 가요성을 증가시켜서 발생할 수 있는 임의의 공간적 장애를 극복하는 것도 고려된다. 최적 세포 반응 또는 이의 부족을 정하는 링커의 길이의 결정은 본 명세서에 상세히 설명된 분석에서 다양한 링커를 사용하여 HCV 핵산 또는 펩티드를 스크리닝함으로써 결정할 수 있다.
다른 구체예에서는, 전술한 다량체 지지체 및 복합 지지체는 다량체화된 HCV 핵산 또는 펩티드를 결합시켜서 각각 "다량체화된-다량체 지지체"와 "다량체화된-복합 지지체"를 형성할 수 있다. 다량체화된 리간드는, 예컨대 분자생물학의 통상적인 기법을 이용하여 2 이상의 HCV 핵산 또는 펩티드를 직렬로 결합시켜서 얻을 수 있다. HCV 핵산 또는 펩티드의 다량체 형태는, 예를 들어 더 큰 친화력을 갖는 물질을 얻을 수 있는 능력으로 인해 다수의 용도에서 유용하게 사용될 수 있다. 다량체화된 물질을 보완하기 위해 개개의 도메인 사이에 링커 또는 스페이서, 예컨대 가요성 λ링커를 병입하는 것 역시 몇몇 구체예에서 유용할 수 있다. 예를 들어 단백질 결합 도메인 사이에 적절한 길이의 λ링커를 삽입하면 분자 내의 가요성을 더욱 증가시켜서 공간적 장애를 극복할 수 있다. 유사하게, 다량체화된 HCV 핵산 또는 펩티드와 지지체 사이에 링커를 삽입하면 가요성을 더욱 증가시키고 지지체에 의해 부과되는 공간적 장애를 제한할 수 있다. 적절한 링커 길이의 결정은 본 명세서에서 상세히 설명한 분석에서 HCV 핵산 또는 펩티드를 스크리닝함으로써 결정할 수 있다.
본 발명의 구체예는 전술한 바와 같이 유전자 백신을 포함하기도 있다. 이러한 조성물은 리바비린 및 NS3/4A(서열 번호 17), NS3(서열 번호 29), 또는 돌연변이(예컨대, 서열 번호 30-32 및 43-49) 또는 이의 단편(예컨대, 서열 번호 25-27 및 33-42)을 암호화하는 핵산을 함유한다. 하기 실시예에서는 인간에게 사용하기에 적합한 유전자 백신의 제조에 대해 설명한다.
실시예 14
HCV 발현 플라스미드는 NS3/4A 펩티드를 발현하도록 조작된다. NS3/4A-pVAX의 NS3/4A 암호화 서열을 EcoRI 및 XbaI으로 분해한 후, 분리된 단편을 플라스미드 A에 삽입시켜서 이것이 CMV 프로모터와 RSV 인핸서 요소의 전사 제어 범위에 들도록 한다(Pachuk 등의 미국 특허 제6,235,888호 참조). 플라스미드 골격 A는 그 길이가 3969 염기쌍이고, 이 플라스미드는 E. 콜라이에서의 복제를 위한 PBR 복제 기점 및 가나마이신 내성 유전자를 보유하고 있다. NS3/4A와 같은 삽입체를 폴리링커 영역에 클로닝하면, 이는 삽입체를 프로모터와 폴리아데닐화 시그널 사이에 배치하여 작동가능하게 결합시킨다. 클로닝된 삽입체는 CMV 프로모터와 RSV 인핸서 요소의 제어 범위에 든다. 클로닝 부위의 바로 옆 3'쪽에 위치한 SV40 폴리 A 시그널의 존재에 의해 폴리아데닐화 시그널이 제공된다. 그 후 rNS3/4A 작제물 500 ㎍과 리바비린 1 mg을 혼합하여 NS3/4A 함유 백신을 제조한다.
상기 백신 조성물은 포유동물(예컨대, 마우스 또는 토끼)에서 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 바람직하게는 HCV 바이러스에 만성 감염된 인간에게서 항체를 생성하기 위해 근육 주사할 수 있다. 역시 수용체에게는 바람직하게는 4주 간격으로 혼합물을 3회 추가 접종한다. 3차 접종시까지 HCV에 특이적인 항체의 역가는 현저히 증가할 것이다. 또한, 이 시점에서, 상기 피험체는 NS3에 대한 항체 및 T-세포 매개 면역 반응의 증가를 나타낼 것이며, 이는 EIA로 검출시 NS3 특이적 항체의 증가된 분획 및 RT-PCR로 검출시 바이러스 로드의 감소에 의해 입증이 가능하다.
구체예는 또한 NS3/4A 융합 단백질 또는 이들 분자를 암호화하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 재조합 단백질의 생산 및 정제는 보조 아미노산을 첨가하여 "태그"를 형성함으로써 촉진할 수 있다. 이러한 태그의 비제한적인 예로는 His-6, Flag, Myc 및 GST가 있다. 태그는 C-말단, N-말단에 부가할 수 있거나, 또는 NS3/4A 아미노산 서열 내에 부가할 수 있다. 또 다른 구체예는 아미노 또는 카르복시 말단이 절단되거나, 내부 결실이 있거나, 또는 추가의 폴리펩티드 서열이 아미노 또는 카르복시 말단, 또는 내부에 부가된 NS3/4A 융합 단백질을 포함한다. 다른 구체예는 NS3/4A 단백질 분해 절단 부위의 잔기가 치환된 NS3/4A 융합 단백질, 또는 이의 절두형 또는 돌연변이형을 포함한다. 상기 치환의 비제한적인 예로는 P1' 부위가 Ser, Gly, 또는 Pro이거나, P1 지점이 Arg이거나, 또는 P8∼P4' 서열이 Ser-Ala-Asp-Leu-Glu-Val-Val-Thr-Ser-Thr-Trp-Val(서열 번호 28)인 서열이 있다.
다른 구체예는 NS3에 대한 증강된 면역 반응을 유발할 수 있는 NS3/4A 융합 단백질, 또는 이의 절두형 또는 변형을 포함하는 면역원에 관한 것이다. 면역원은 실질적으로 정제된 형태로 제공될 수 있는데, 실질적으로 정제된 형태란 면역원에 다른 단백질, 지질, 탄수화물 또는 자연 상태에서 결합되어 있는 기타 화합물이 실질적으로 없도록 했음을 의미한다. 구체예는 또한 NS3/4A 융합 단백질(서열 번호 17) 또는 이의 절두형 또는 돌연변이형(예컨대, 서열 번호 29-32 및 43-49) 또는 이의 단편(예컨대, 서열 번호 25-27 및 33-42) 및 면역 보강제, 예컨대 리바비린을 함유하는 백신 조성물을 포함한다. 하기 실시예에서는 NS3/4A 융합 단백질 및 면역 보강제를 함유하는 백신 조성물을 제조하는 한 방법에 대해 설명한다.
실시예 15
태깅된 NS3/4A 작제물을 생성하기 위해, NS3/4A-pVAX의 NS3/4A 암호화 서열을 EcoRI 및 XbaI으로 분해하고, 분리된 단편을 Xpress 벡터(인비트로겐)에 삽입한다. Xpress 벡터를 사용하면 2가 양이온에 대한 친화력이 높은 짧은 N-말단 리더 펩티드를 보유한 재조합 융합 단백질의 생산이 가능하다. 니켈-킬레이트화 수지(인비트로겐)를 사용하여 재조합 단백질을 1 단계로 정제할 수 있으며, 그 후 엔테로키나제를 사용하여 리더를 절단할 수 있다. 바람직한 벡터는 pBlueBacHis2 Xpess이다. pBlueBacHis2 Xpess 벡터는 다중 클로닝 부위, 암피실린 내성 유전자 및 lac Z 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터이다. 따라서, 분해된 증폭 단편을 pBlueBacHis2 Xpess 벡터로 클로닝하고, 이 벡터로 SF9 세포를 감염시킨다. 그 후 제조업자의 지시에 따라 발현 단백질을 분리하거나 정제한다. 그 후 rNS3/4A 100 ㎍과 리바비린 1 mg을 혼합하여 NS3/4A 함유 백신 조성물을 제조한다.
상기 백신 조성물은 포유동물(예컨대, 마우스 또는 토끼)에서 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 바람직하게는 HCV 바이러스에 만성 감염된 인간에게서 항체를 생성하기 위해 근육 주사할 수 있다. 수용체에는 바람직하게는 4주 간격으로 혼합물을 3회 추가 접종한다. 3차 접종시까지 HCV에 특이적인 항체의 역가는 현저히 증가할 것이다. 또한, 이 시점에서, 상기 피험체는 NS3에 대한 항체 및 T-세포 매개 면역 반응의 증가를 나타내게 될 것이며, 이는 EIA로 검출시 NS3 특이적 항체의 증가된 분획 및 RT-PCR로 검출시 바이러스 로드의 감소에 의해 확인이 가능하다. 하기 섹션에서는 본 명세서에 개시된 조성물을 사용하는 방법에 대한 추가 설명을 제공한다.
리바비린 및 항원을 함유하는 조성물의 사용 방법
본 명세서에서 기술된 백신의 투여 경로에는 경피, 비경구, 위장관, 경기관지 및 경폐포가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 경피 투여는 크림, 린스, 겔 또는 리바비린 및 항원이 피부에 침투할 수 있게 하는 기타 화합물을 도포하여 이루어질 수 있다. 비경구 투여 경로의 예로는 전기적 또는 직접 주사, 예컨대 중앙 정맥류로의 직접 주사, 정맥 주사, 근육 주사, 복강 주사, 피내 주사 또는 피하 주사가 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 위장관 투여 경로의 예로는 섭취 및 직장 투여가 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 경기관지 및 경폐포 투여 경로로는 구강 또는 비강을 통한 흡입이 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.
경피 투여에 적합한 리바비린 및 항원을 함유하는 조성물은 피부에 직접 도포하거나, 보호성 캐리어, 예컨대 경피 디바이스("경피 패치")에 혼입하여 사용하는 약학적 허용 현탁액, 오일, 크림 및 연고를 포함하지만, 이들에만 국한되는 것은 아니다. 적절한 크림, 연고 등의 예는, 예컨대 문헌[Physician's Desk Reference]에서 찾아볼 수 있다. 적절한 경피 디바이스의 예는 1989년 4월 4일에 등록된 Chinen 등의 미국 특허 제4,818,540호에 기술되어 있다.
비경구 투여에 적합한 리바비린 및 항원을 함유하는 조성물은 비제한적인 예로 약학적 허용 멸균 등장성 용액을 포함한다. 이러한 용액은 염수, 인산염 완충 염수 및 중앙 정맥류 주사, 정맥 주사, 근육 주사, 복강 주사, 피내 주사 또는 피하 주사용 오일 제제를 포함하나 이것에만 국한되는 것은 아니다.
경기관지 및 경폐포 투여에 적합한 리바비린 및 항원을 함유하는 조성물은 흡입을 위한 다양한 유형의 에어로졸을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 것들의 경기관지 및 경폐포 투여에 적합한 디바이스 역시 본 발명의 구체예가 된다. 이러한 디바이스의 비제한적인 예로는 분무기와 증발기가 있다. 현재 사용되고 있는 분무기 및 증발기의 여러 형태를 리바비린 및 항원을 함유하는 백신을 전달하는 데 쉽게 적용할 수 있다.
위장관 투여에 적합한 리바비린 및 항원을 함유하는 조성물은 비제한적인 예로 약학적 허용 분말, 환약 또는 내복액 및 직장 투여용 좌약을 포함한다.
특히 본 명세서에서 기술한 유전자 작제물은 전통적인 주사기, 무바늘 주입 디바이스, 또는 "마이크로프로젝타일 충격 유전자 총" 등을 비롯하여 여러 수단에 의해 투여할 수 있다. 대안으로, 유전자 백신은 개체로부터 분리한 세포에 다양한 수단을 통해 도입할 수 있다. 이러한 수단의 예로는 체외 형질감염, 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션 및 마이크로프로젝타일 충격을 들 수 있다. 유전자 작제물은 세포에 의해 업테이크된 후, 이는 개체로 재이식된다. 백신화된 세포가 원래 다른 개체로 취한 것일지라도 유전자 작제물이 혼입된 다른 비면역원성 세포를 개체에 이식할 수도 있다.
몇몇 구체예에 따르면, 유전자 작제물을 무바늘 주입 디바이스를 사용하여 개체에 투여한다. 일부 구체예에 따르면, 유전자 작제물은 무바늘 주입 디바이스를 사용하여 피내, 피하 및 근육에 동시에 투여한다. 무바늘 주사 디바이스는 널리 공지되어 있고 널리 이용되고 있다. 당업자라면 본 명세서의 교시에 따라 유전 물질을 개체의 세포에 전달하는 데 무바늘 주사 디바이스를 이용할 수 있다. 무바늘 주사 디바이스는 유전 물질을 모든 조직에 전달하는 데 매우 적합하다. 이들은 특히 유전 물질을 피부 및 근육 세포에 전달하는 데 유용하다. 몇몇 구체예에서는 DNA 분자를 함유하는 액체를 개체의 피부 표면을 향하여 추진시키는 데 무바늘 주사 디바이스를 사용할 수 있다. 액체는 피부에 충돌시 액체가 피부 표면을 침투하고 피부 및 그 아래의 근육 조직을 관통할 수 있을 정도의 충분한 속도로 추진된다. 이로써, 유전 물질이 피내, 피하 및 근육으로 동시에 투여된다. 몇몇 구체예에서는 핵산 분자를 기관의 세포에 도입하기 위해 다른 기관의 조직에 유전 물질을 전달하는 데 무바늘 주사 디바이스를 사용할 수 있다.
리바비린 및 항원을 함유하는 백신은 다양한 질병을 치료 및 예방하고, 항원에 대한 동물의 면역 반응을 증강시키는 데 사용될 수 있다. 당업자라면 박테리아 질병, 바이러스 질병, 진균 질병 및 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 피험체에게 통상적인 백신을 투여했음을 알 것이다. 본 명세서에 개시된 백신은 리바비린을 첨가하여 변형시킨 종래의 백신을 포함하기 때문에 본 명세서에 개시된 방법은 항원 및 리바비린을 함유하는 백신을 사용하여 질병을 치료 및 예방하는 방법을 포함한다.
바람직한 구체예는 간염 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 이러한 구체예에서, 치료 또는 예방을 요하는 동물에게 간염 항원(예컨대, 펩티드 항원 또는 핵산계 항원)과 상기 동물에서 면역 보강 활성을 나타내기에 충분한 양의 리바비린을 투여한다. 따라서, 현재 이용되고 있는 진단 테스트 또는 임상적 평가방법을 이용하여 동물이 치료 또는 예방이 필요한지를 확인할 수 있다. 이러한 구체예에 이용될 수 있는 간염 바이러스 항원의 범주는 다양하다. 바람직한 간염 바이러스 항원에는 HBV 항원, HAV 항원, HCV 항원, 이들 항원을 암호화하는 핵산, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 매우 바람직한 구체예는 간염 B 표면 항원(HBsAg), 간염 코어 항원(HBcAg) 및 간염 E 항원(HBeAg)으로 구성된 군에서 선택된 HBV 항원, 특히 전술한 펩티드 및 핵산계 항원을 포함한다. 리바비린 및 항원은 별도로, 또는 함께 투여할 수 있으며, 다른 면역 보강제(예, 오일, 명반 또는 면역 반응을 증강시키는 기타 물질)를 필요로 하는 동물에게 투여할 수도 있다. 따라서, 바람직한 구체예는 감염된 동물 또는 감염 위험이 있는 동물을 확인하고, 상기 동물에 간염 항원(예컨대, HBsAg, HBcAg 및 HBeAg) 및 면역 보강 활성을 나타내기에 충분한 양의 리바비린을 투여함으로써 동물의 간염(예컨대, HBV)을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.
다른 구체예는 필요로 하는 동물에게 면역 반응을 증강시키기에 유효한 양의 리바리린과 함께 항원을 투여함으로써 면역 반응을 증강시키는 방법을 포함한다. 이러한 구체예에서, 항원에 대한 면역 반응 증강이 필요한 동물은 현재 이용되고 있는 진단 테스트 또는 임상적 평가 방법을 이용하여 확인한다. 종종 이들 개체는 질병(예컨대, 박테리아, 진균, 사상균, 바이러스 또는 암)을 앓고 있거나, 또는 이들 질병에 걸릴 위험이 있다. 그러나, 증강된 면역 반응을 요하는 동물은 중독된 동물(예컨대, 독이 있는 곤충이나 동물에게 물린 동물)이나, 독소 또는 기타 독성 화합물에 노출된 동물일 수 있다. 일단 필요한지가 확인되면, 그 동물에서 면역 반응을 증강시키기에 유효한 양의 리바비린 및 적절한 항원을 이들 동물에게 투여한다.
전술한 바와 같이, 상기 구체예에 이용될 수 있는 간염 바이러스 항원의 비제한적인 예는 HBV 항원, HAV 항원, HCA 항원, 이들 분자를 암호화하는 핵산, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 매우 바람직한 구체예는 간염 B 표면 항원(HBsAg), 간염 코어 항원(HBcAg) 및 간염 E 항원(HBeAg)으로 구성된 군에서 선택된 HBV 항원, 특히 전술한 펩티드 및 핵산계 항원을 포함한다. 리바비린 및 항원은 별도로, 또는 함께 투여할 수 있으며, 다른 면역 보강제(예, 오일, 명반 또는 면역 반응을 증강시키는 기타 물질)를 필요로 하는 동물에게 투여할 수도 있다. 따라서, 바람직한 구체예는 치료를 요하는 동물을 확인하고, 상기 동물에 간염 항원(예컨대, HBsAg, HBcAg 및 HBeAg) 및 그 동물에서 면역 반응을 증강시키기에 유효한 양의 리바비린을 투여함으로써 동물의 간염 항원(예컨대, HBV)에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법을 포함한다.
한 방법의 예로서, 개체가 HCV에 감염되는 것으로부터 보호하기 위해 NS3에 대한 세포 및 체액 면역 반응을 유발하기에 충분한 양의 상기 백신 조성물을 비감염 개체에 투여한다. 다른 구체예에서는, HCV-감염 개체를 확인하고, HCV 감염을 감소 또는 제거하기 위해 NS3에 대한 세포 및 체액 면역 반응을 증강시키기에 충분한 양의 NS3 및 리바비린을 함유하는 백신 조성물을 투여한다. 이러한 개체의 감염 단계는 만성 또는 급성 단계일 수 있다. 또 다른 구체예에서는, HCC를 앓고 있는 HCV에 감염된 개체에게 NS3-발현 종양 세포에 대한 세포 및 체액 면역 반응을 유발하기에 충분한 양의 NS3/4A 융합 유전자 및 리바비린을 함유하는 조성물을 투여한다.
본 발명을 구체예와 실시예를 참조로 하여 설명하였으나, 본 발명의 발명 사상으로부터 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 특허청구범위에 의해서만 한정된다.
도 1은 리바비린 1 mg의 단일 용량과 재조합 간염 C 바이러스(HCV) 비구조 3 단백질(NS3) 10 및 100 ㎍을 동시에 투여하였을 때 이에 대한 체액 반응을 평균 종점 역가로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 리바비린 0.1, 1.0, 또는 10 mg의 단일 용량과 재조합 간염 C 바이러스(HCV) 비구조 3 단백질(NS3) 20 ㎍을 동시에 투여하였을 때 이에 대한 체액 반응을 평균 종점 역가로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 NS3-특이적 림프절 증식 반응에 리바비린 1 mg의 단일 용량이 미치는 효과를 시험관내 리콜(recall) 반응으로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 1차 접종 후 시간이 경과함에 따른 H-2d 마우스에서의 NS3에 대한 항체 역가를 나타낸 그래프이다. ◇는 NS3/4A-pVAX를 접종한 마우스에서의 항체 역가를 나타내고, □는 NS3-pVAX를 접종한 마우스에서의 항체 역가를 나타낸다.
도 5A는 이펙터 대 표적의 비가 변화함에 따른 SP2/0 표적 세포의 특이적 CTL-매개 용해의 비율(%)을 나타낸 그래프이다. 대조군 면역원으로 인산염 완충 염수(PBA)를 사용하였다.
도 5B는 이펙터 대 표적의 비가 변화함에 따른 SP2/0 표적 세포의 특이적 CTL-매개 용해의 비율(%)을 나타낸 그래프이다. 면역원으로 플라스미드 NS3/4A-pVAX를 사용하였다.
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His Leu Ile Phe 355 360 365 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 400 Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 480 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 485 490 495 Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val 500 505 510 Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 515 520 525 His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr 545 550 555 560 Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro 565 570 575 Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn 595 600 605 Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met 610 615 620 Ser Ala Asp Leu Glu Val Ser Ser Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly 625 630 635 640 Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val 645 650 655 Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp 660 665 670 Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 675 680 685 <210> 49 <211> 686 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A <400> 49 Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 20 25 30 Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp 65 70 75 80 Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala 100 105 110 Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys 145 150 155 160 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr 210 215 220 Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly 225 230 235 240 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 245 250 255 Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile 290 295 300 Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn 325 330 335 Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 400 Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 480 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys 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Claims (32)

  1. 서열 번호 16의 서열로 이루어진 정제 또는 단리된 핵산 또는 이의 상보물.
  2. 서열 번호 16의 100개 이상의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 정제 또는 단리된 핵산 또는 이의 상보물.
  3. 제2항에 있어서, 서열 번호 16의 200개 이상의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 정제 또는 단리된 핵산.
  4. 제2항에 있어서, 서열 번호 16의 500개 이상의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 정제 또는 단리된 핵산.
  5. 제2항에 있어서, 서열 번호 16의 1000개 이상의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 정제 또는 단리된 핵산.
  6. 제1항의 핵산을 포함하는 벡터.
  7. 제1항의 핵산을 포함하는 단리된 세포.
  8. 제1항의 핵산을 포함하는 면역원성 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 면역 보강제(adjuvant)를 더 포함하는 면역원성 조성물.
  10. 제2항의 핵산을 포함하는 벡터.
  11. 제2항의 핵산을 포함하는 단리된 세포.
  12. 제3항의 핵산을 포함하는 벡터.
  13. 제3항의 핵산을 포함하는 단리된 세포.
  14. 제4항의 핵산을 포함하는 벡터.
  15. 제4항의 핵산을 포함하는 단리된 세포.
  16. 제5항의 핵산을 포함하는 벡터.
  17. 제5항의 핵산을 포함하는 단리된 세포.
  18. 제1항의 핵산을 포함하는 조성물.
  19. 제2항의 핵산을 포함하는 조성물.
  20. 제3항의 핵산을 포함하는 조성물.
  21. 제4항의 핵산을 포함하는 조성물.
  22. 제5항의 핵산을 포함하는 조성물.
  23. 제18항에 있어서, 면역 보강제를 더 포함하는 조성물.
  24. 제19항에 있어서, 면역 보강제를 더 포함하는 조성물.
  25. 제20항에 있어서, 면역 보강제를 더 포함하는 조성물.
  26. 제21항에 있어서, 면역 보강제를 더 포함하는 조성물.
  27. 제22항에 있어서, 면역 보강제를 더 포함하는 조성물.
  28. 제18항에 있어서, 리바비린을 더 포함하는 조성물.
  29. 제19항에 있어서, 리바비린을 더 포함하는 조성물.
  30. 제20항에 있어서, 리바비린을 더 포함하는 조성물.
  31. 제21항에 있어서, 리바비린을 더 포함하는 조성물.
  32. 제22항에 있어서, 리바비린을 더 포함하는 조성물.
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