KR20070107072A - 모액으로부터의 ｃｃｉ-７７９의 회수 - Google Patents

Abstract

본 발명은 모액으로부터의 CCI-779의 회수를 위한 방법을 제공한다.

Description

모액으로부터의 ＣＣＩ-７７９의 회수 {RECOVERY OF CCI-779 FROM MOTHER LIQUORS}

본 발명은 모액으로부터의 CCI-779의 회수에 관한 것이다.

CCI-779 (3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸프로피온산을 사용한 라파마이신 42-에스테르) 는 라파마이신의 에스테르이고, 시험관 내 및 생체 내 모델 모두에서 종양의 성장에 대한 상당한 억제력을 보여주고 있다. CCI-779는 세포질 단백질 FKBP에 결합하고 복합체를 형성하는데, 이는 효소인, mTOR(포유동물에서의 라파마이신 표적이며, 또한 FKBP12-라파마이신 연관 단백질인 [FRAP]라고도 알려져 있음)을 억제한다. mTOR의 키나아제의 활성의 억제는 사이토카인-자극 세포 증식, 세포주기의 G1 기를 조절하는 다수의 주요 단백질을 위한 mRNA의 번역, 및 IL-2 유도 전사를 포함하는 각종 신호 전달 경로를 억제하여, G1으로부터 S로의 세포주기 진행을 억제시킨다. CCI-779는 중추신경계암, 백혈병, 유방암, 전립선암, 흑색종, 신경아교종, 및 신경교아세포종의 억제를 포함하는 다수의 적용에서 유효한 것으로 나타나 있다.

CCI-779를 포함하여 라파마이신의 히드록시에스테르의 제조 및 이용은 미국 특허 제 5,362,718 호에 개시되어 있다. CCI-779의 위치선택적 합성 방법은 미국 특허 제 6,277,983 호에 기재되어 있다. 그러나, 생성된 CCI-779의 수율은 단지 70 ~ 80%의 범위 내에 있다. 더욱 또다른 위치선택적 합성 방법은 미국 특허 공개 번호 US 2005-0033046 A1에 기재되어 있다. CCI-779의 재결정은 임상적 적용에서의 용도를 위한 결정성 생성물을 수득하기 위해 필요하다.

필요한 것은 CCI-779 결정화 부산물로서 수득되는 모액으로부터 추가의 결정성 CCI-779를 회수하기 위한 방법이다.

[발명의 개요]

본 발명은 모액으로부터 CCI-779의 회수를 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 모액을 농축시키는 것, 농축된 CCI-779를 완충액으로 처리하는 것, 유기층을 건조시키고 농축시키는 것, 및 바람직하게는 에테르로부터 CCI-779를 재결정화하는 것을 포함한다.

다른 구현예에서, 이 방법으로부터 수득된 모액은 추가의 수율을 수득하기 위한 방법에서 사용된다. 다른 구현예에서, 이 방법은 여러 번 반복된다.

본 발명의 다른 측면 및 이점은 하기 본 발명의 상세한 설명에서 명백해질 것이다.

본 발명은 모액으로부터의 CCI-779의 회수를 위한 신규 방법을 제공한다.

CCI-779 (3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸프로피온산을 이용한 라파마이신 42-에스테르) 는 하기 반응식 2에서 설명된 두 이성질체의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명에 상응하는 모액으로부터 회수된 CCI-779는 일반적으로 약 95 중량%의 CCI-779 이성질체 B 및 약 3 중량% 이성질체 C를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 조합된 수율 또는 총 조합된 수율은 통상의 기술에 의한 초기 재결정화를 포함하는, 모든 재결정화 단계로부터 회수된 총 CCI-779, 및 본 발명의 방법에 의해 모액으로부터 회수된 CCI-779를 의미한다.

하나의 구현예에서, CCI-779는 미국 특허 제 5,362,718 호에서 기재된 바와 같이 제조된다. 다른 구현예에서는, CCI-779는 미국 특허 공개 번호 US 2005-0033046 A1에 기재된 바와 같이 제조된다.

다른 구현예에서, CCI-779는 2,2,5-트리메틸[1,3-디옥산]-5-카르복실산을 이용한 라파마이신 42-에스테르의 산성 가수분해로부터 수득된다. 하나의 구현예에서, 이는 황산을 사용한 후 실리카겔 크로마토그래피에 의해 달성된다. 산성 가수분해는 미국 특허 제 6,277,983 호 (Shaw 등)에 기재되어 있다. 본원의 반응식 1은 가수분해 방법을 요약한다. 가수분해 후, 재결정화는 통상의 기술을 이용하여 달성된다. 하나의 구현예에서, 재결정화는 에테르와 함께 수행된다. 전형적으로, 재결정화로부터 수득된 CCI-779는 약 30:1 내지 약 35:1 의 범위의 B:C 이성질체 비를 가지고, 약 70% 내지 약 80%, 또는 약 72% 내지 약 76%의 범위의 수율을 가진다. 하나의 구현예에서, 재결정화로부터 수득되는 CCI-779는 약 32:1 의 B:C 이성질체 비 및 약 74%의 수율을 가진다.

재결정화 방법의 부산물은 추가의 CCI-779를 포함하는 모액이다. 전형적으로, 모액에 존재하는 CCI-779의 양은 재결정화 후의 생성물의 20% 이상이다. 하나의 구현예에서, 25 내지 26%의 CCI-779 생성물은 모액에 존재한다. 또한, 본 모액에서의 CCI-779는 전형적으로 CCI-779에서 발견되는 것보다 더 높은 비율로 즉, 더 낮은 B:C 비로 CCI-779의 이성질체 C를 포함한다. 하나의 구현예에서, 모액에서의 B:C 이성질체 비는 약 1.5:1 내지 3:1, 약 1.5:1 내지 2.5:1, 약 2:1 또는 약 1.6:1 의 범위이다.

결정성 CCI-779에서의 것과 반대로, 이성질체 C가 모액에서 더 큰 %로 존재하는 것은, 결정화 용매에서 이성질체 C의 용해도가 더 높음을 나타낸다. 이론에 의해 한정되지 않는 한, 이성질체 C가 이성질체 B보다 덜 결정성이어서, 모액에서 이성질체 C의 존재가 증가되는 것으로 여겨진다. 출원자들은 이성질체 비를 증가시켜 pH의 변경에 의해 모액으로부터 부가적인 수율로 회수할 수 있음을 발견하였다. 본원에서 반응식 2는 원하는 이성질체 이동을 설명한다.

CCI-779의 결정으로부터 수득된 모액은, 상기 기재한 바와 같이, 감압하에 우선 농축된다. 생성 폼(foam)은 완충계, 즉, pH 조절 완충제 (완충액) 및 용매와 조합된다. 하나의 구현예에서, 완충제의 pH는 대략 5 내지 6.5이다. 다른 구현예에서, 완충제의 pH는 대략 5 내지 5.5이다.

하나의 구현예에서, 완충액은 아세트산 나트륨을 포함한다. 기타 구현예에서, 완충액은 아세트산 칼륨 또는 아세트산 아연을 포함한다. 더욱 기타 구현예에서, 완충액은 아세트산 나트륨, 아세트산 칼륨, 및/또는 아세트산 아연의 혼합물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 용매는 유기 용매이다. 추가적인 구현예에서, 유기 용매는 아세톤이다. 더욱 기타 구현예에서는, 유기 용매는 테 트라히드로푸란, 아세토니트릴, 또는 아세트산이다. 기타 구현예에서, 용매는 용매의 혼합물, 예컨대, 아세톤, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 및/또는 아세트산의 혼합물이다. 하나의 구현예에서, 용매 대 완충제의 부피비는 1.5 ~ 1.1:1.0 이다. 다른 구현예에서, 부피비는 1.1:1.0 이다. 기타 완충계, 용액, 용매, 및 pH를 조정하는 부피비는 본 발명에 의해 고찰되고 당업자에게 알려질 것이다.

모액으로부터의 잔류 폼의 용액, 및 완충계 (즉, 완충액 및 용매)는 혼합된다. 하나의 구현예에서, 상기 용액은 질소 하에 대략 20 내지 25℃의 온도에서 24 시간 동안 혼합된다. 기타 구현예에서, 용액은 48 시간 동안 혼합된다. 시간의 길이는 이성질체 B 대 이성질체 C의 비를 최대화하기 위해서 조정될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 비율은 예를 들면, HPLC에 의해, 혼합되는 동안에 모니터링된다.

혼합 후에, 생성물은 통상의 수단에 의해 분리된다. 하나의 구현예에서, 혼합물은 에틸 아세테이트로 희석되고 염수로 세정된다. 이후에는 유기층(또는 조합된 유기층)이 물 및 염수로 세정된다. 그 후, 유기층은 황산나트륨으로 건조되고 감압하에 농축되어, 폼을 생성한다. 생성물을 분리하는 기타 방법은 당업자에게 알려져 있을 것이고, 본 발명에 의해 고찰된다. 생성물을 분리하는 방법은 유기층을 형성하기 위해서 유기 매질을 첨가하는 것을 포함한다. 분리 후에, 폼은 예를 들면, 침전과 같은 통상의 기술에 의해 재결정화된다. 하나의 구현예에서, 폼은 에테르로부터 재결정화된다. 추가적인 구현예에서, 에테르는 디에틸 에테르, 또는 t-부틸 메틸 에테르이다. 재결정화를 위한 용매로서, 아세토니트릴, 헥산 또는 헵탄과 에테르의 혼합물, 또는 헥산 또는 헵탄과 t-부틸 메틸 에테르의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 더욱 추가적인 구현예에서는, 에테르는 디에틸 에테르이다. 하나의 구현예에서, 침전된 CCI-779는 예를 들면 통상의 기술에 의해 진공하에 건조될 수 있다.

하나의 구현예에서, 재결정화된 CCI-779는 약 30:1 보다 더 큰 B:C 이성질체 비를 가지고 있다. 기타 구현예에서는, 재결정화된 CCI-779는 약 45:1 또는 약 49:1 이상의 B:C 이성질체 비를 가지고 있다. 더욱 다른 구현예에서는, 재결정화된 CCI-779는 약 55:1 또는 약 57:1 이상의 B:C 이성질체 비를 가지고 있다.

기타 구현예에서, 상기 방법으로부터 수득된 모액을 이용하여 이 방법을 반복함으로써, 원하는 총 수율의 CCI-779를 수득한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 달성된 총 조합된 수율은 약 90% 또는 약 95% 이상이다. 기타 구현예에서, 달성된 총 조합된 수율은 약 98% 이상이다. 하기 반응식 3은 이 방법을 설명한다.

하기 실시예로 본 발명을 설명하지만, 이에 한정되지 않는다.

모액으로부터의 CCI -779의 회수 :

400 ml의 물을 적합한 용기에 첨가하고 그 후 5.5 g의 아세트산 나트륨을 첨가하여 아세테이트 완충제 (pH 5 ~ 5.5) 를 제조하고, 교반하여 용액을 형성하였다. 0.05 M의 아세트산 (300 ml)을 이 용액에 첨가하고, 교반하여 아세테이트 완충제를 형성하였다 (pH 5 ~ 5.5). 2ℓ의 플라스크에 600 ml의 아세톤을 채운 후, 545 ml의 아세테이트 완충제를 채웠다 (pH 5 ~ 5.5). 상기 혼합물을 교반 하여, 1.1:1 아세톤-아세테이트 완충제 (pH 5 ~ 5.5)로서 균일액을 형성하였다.

1ℓ 플라스크에 500 g의 CCI-779 모액(디에틸 에테르 용매)을 채웠다 (이성질체 비 B:C = 1.6:1 을 갖는 CCI-779를 7.9% 함유한 검정). 모액을 감압하에 농축시켜 49.85 g의 생성물을 폼으로서 수득하였다. HPLC에 의해 모니터링되는 반응의 진행에 따라, 상기 폼을 750 ml의 1.1:1의 아세톤-아세테이트 완충제에 용해시키고 질소하에 20 내지 25℃에서 최소 24 시간 동안 혼합하였다. 1일 후에, 반응이 종결된 시료의 B:C의 비율은 8.1:1 이었고, 48 시간 후에는 9:1 이었다. 두 이성질체의 비율은 48 시간 후에 동일하게 유지되었다.

반응 혼합물을 1200 ml의 에틸 아세테이트로 희석시키고, 300 ml의 염수로 세정하였다. 수층을 분리시키고, 300 ml의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 조합하고, 물 (300 ml) 및 염수 (300 ml)로 세정하였다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조시키고, 그 후 감압하에 농축시켜 45.45 g의 생성물을 담황색 폼으로서 수득하였다. 폼을 에테르로부터 재결정시켰다 (180ml). 상기 생성물을 진공 오븐에서 50 내지 55℃로 일정한 중량까지 건조시켜서, 순도 93.2% (이성질체 B+C) 및 B:C = 57:1 의 이성질체비를 가진 백색 결정성 고체로서의 22.5 g의 생성물을 수득하였다. 회수율은 57%이었다.

모액을 감압하에 농축시켜서, 약 3.3:1 의 B:C 이성질체를 가진 담황색 폼으로서의 19.5 g의 생성물을 수득하였다. 폼을 48 시간 동안 20 내지 25℃에서 300 ml의 아세톤-아세테이트 완충제로 처리하였다. 반응 혼합물을 450 ml의 에틸 아세테이트로 희석시키고, 150 ml의 염수로 세정하였다. 수층을 분리하고, 150 ml의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 조합하고, 물 (200 ml), 염수로 (200ml) 세정하고, 황산 나트륨으로 건조시켰다. 감압하에 농축 후, 9:1 의 B:C 이성질체 비를 가지는 담황색 폼으로서 17.24 g의 생성물을 수득하였다. 상기 물질은 재결정화하여 상기 방법 주기에서 기재된 바와 같이, 에테르로부터 더욱 결정성인 CCI-779로 수득될 수 있다.

모든 특허, 출원, 및 본원에서 확인된 기타 서류는 참조로서 삽입되었다. 당업자는 본원에 기재된 특정한 구현예에서 기재된 조건 및 기술에 대한 작은 변경이 본 발명에서 벗어남 없이 변화할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그러한 작은 변경 및 변화는 하기 청구항에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 존재한다.

Claims (15)

1. 하기를 포함하는, 모액으로부터 CCI-779를 회수하는 방법:

   (a) 모액을 농축시킴;

   (b) 모액을 농축시킴으로써 수득된 CCI-779를 pH가 약 5 내지 약 5.5 범위인 pH 조정 완충제로 처리함;

   (c) 혼합물을 용매 추출시킴;

   (d) 생성 유기층을 건조시키고 농축시킴; 및

   (e) CCI-779를 재결정화함.
2. 제 1 항에 있어서, 단계 (a) 내지 (d)를 단계 (e)에서 수득된 모액을 이용하여 반복하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 최종 조합된 수율이 95%를 초과하는 방법.
4. 제 2 항에 있어서, 최종 조합된 수율이 98%를 초과하는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, pH 조정 완충제가 아세트산 나트륨, 아세트산 칼륨, 또는 아세트산 아연을 포함하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, pH 조정 완충제가 아세트산 나트륨을 포함하는 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, pH 조정 완충제를 아세톤, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴, 또는 아세트산과 함께 용매로서 이용하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, pH 조정 완충제를 아세톤과 함께 용매로서 이용하는 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 에테르를 재결정화에서 이용하는 방법.
10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 디에틸 에테르, t-부틸 메틸 에테르, 아세토니트릴, 헥산 또는 헵탄과 에테르의 혼합물, 또는 헥산 또는 헵탄과 t-부틸 메틸 에테르의 혼합물을 재결정화를 위한 용매로서 이용하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 용매가 디에틸 에테르인 방법.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 추가적으로 포함하는 방법:

    (f) CCI-779를 침전시키는 단계; 및

    (g) 진공하에 CCI-779를 건조시키는 단계.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 이에 의해 제조된 CCI-779가 30:1 초과의 B:C 이성질체 비를 가지는 방법.
14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 이에 의해 제조된 CCI-779가 45:1 초과의 B:C 이성질체 비를 가지는 방법.
15. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 에틸 아세테이트를 용매 추출을 위한 용매로서 이용하는 방법.