KR20070070445A - 심근 조직 재생을 위한 세포의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포유류 심근 조직으로 이식하기 위한 세포의 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따라 유도되는 심근 아세포는, 여전히 분열할 수 있는 줄기세포의 특성을 갖고 있어 포유류의 심근 조직에 이식되었을 때 임상적으로 최적의 생착과 생존율을 나타내고 주변조직과 전기적 신호전달(electrical coupling)이 가능한 심근세포로 최종 분화할 수 있으므로, 불충분한 심근 기능으로 인한 이상증으로 진단된 포유류(예, 인간)를 치료하는 데 이용할 수 있다.

골수 줄기세포, 심근 아세포, 생물학적 성장인자, 분화.

Description

심근 조직 재생을 위한 세포의 생산 방법{METHOD OF PREPARING CELL FOR HEART TISSUE REGENERATION}

도 1은 Passage 0의 골수 줄기세포 표면 단백질 분석 사진,

도 2는 Passage 2의 언커미티드 골수 줄기세포 표면 단백질 분석 사진,

도 3은 Passage 2의 골수 줄기세포에 성장인자를 6∼7 일간 처리한 커미티드 골수 줄기세포 표면 단백질 분석 사진,

도 4는 언커미티드 골수 줄기세포(A∼D)와 커미티드 골수 줄기세포(E∼H)를 심근 아세포와 2 일간 혼합 배양하여 심근세포 특이 마커인 Connexin-43(녹색)과 cardiac Troponin I(적색)을 염색하여 골수 줄기세포의 분화를 측정한 형광 현미경 사진(400 배),

도 5는 심근 아세포와 혼합 배양에서 발현된 Connexin-43에 의하여 형성된 갭정션의 기능을 분석한 레이저 형광 현미경 사진(400 배)으로, (A)∼(C)는 언커미티드 골수 줄기세포와 혼합 배양한 사진, (D)∼(E)는 커미티드 골수 줄기세포와 혼합 배양한 사진, (G)∼(H)는 각각의 그룹에 헵탄올을 처리하여 Connexin-43에 의한 갭정션을 저해한 후 Calcein AM 염색액의 이동을 관찰한 사진이다.

도 6은 언커미티드 골수 줄기세포와 커미티드 골수 줄기세포를 웨스턴 블럿 실험을 통하여 심근세포 특이 마커인 Nkx2.5, GATA-4, 그리고 MEF2 단백질의 발현 을 나타낸 사진으로, 다섯 번째 줄은 래트의 심장에서 추출한 단백질로서 양성 대조군으로 사용한 것이다.

도 7은 심근경색 래트의 심장에 커미티드 골수 줄기세포를 주입하여 8주 후에 면역 염색 방법을 통하여 심근 아세포로 분화를 본 사진으로, 적색을 나타내는 것은 DiI 염색액으로 염색하여 주입한 커미티드 골수 줄기세포이고, 녹색은 심근 아세포 특이 마커인 Connexin-43(A, B; 200배), cardiac Troponin I(C∼D; 200배), 그리고 MF-20(E; 400배)를 나타내는 것이며, F는 각각의 마커 단백질을 발현하는 랫트의 빈도를 나타내는 그래프로 회색은 언커미티드, 흑색은 커미티드 골수 줄기세포의 경우이다.

도 8은 심근경색 래트의 심장에 언커미티드 골수 줄기세포(A)와 커미티드 골수 줄기세포(B)를 이식하고 8 주 후의 심장 초음파 사진으로, 래트의 확장기말과 수축기말 내축 거리를 나타낸 것이고, (C)는 좌심실 박출 계수(LVEF), 그리고 (D)는 좌심실 분획적 단축(LVFS)을 비교한 그래프이다.

도 9는 골수 줄기세포를 주입한 래트에 부정맥 유발 물질을 주입하여 부정맥 유발 정도를 측정한 결과로, (A)는 심실성 빈맥의 발생 빈도, (B)는 심실 조기수축을 보여준다.

본 발명은 포유류 심근 조직으로 이식하기 위한 세포의 생산 방법에 관한 것 으로, 보다 구체적으로는, 인간을 포함하는 포유류의 골수 줄기세포에 생물학적 성장인자를 처리하여 직접 심장 계통(cardiac lineage)으로 커미트먼트시키되 줄기세포의 성질을 그대로 유지시켜 손상된 심근에서 가장 좋은 생착과 생존율을 나타내도록 하기 위해, 특정 기간 동안 in vitro에서 처리하고, 그리고 유도된 골수 줄기세포를 심근경색이 있는 포유류의 심장에 이식하여 이식된 심장조직에서 주변조직과 상호 신호전달이 가능한 심근세포로의 분화 및 심기능 개선을 평가하는 방법에 관련된다.

성체의 골수에서 얻어진 중간엽 줄기세포는 지방 세포, 뼈 세포, 연골 세포, 간 세포, 그리고 심근세포 등을 포함하여 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 전분화 능력을 갖는다. 이와 같은 다양한 분화 능력 때문에 골수 줄기세포는 세포 이식 치료법에 사용하기 좋은 후보 물질이 될 수 있다.

한편, 심근경색은 전 세계적으로 사망을 일으키는 중요한 원인 중 하나로 알려져 있다. 성인 심장에서는 심근 아세포가 증식할 수 없기 때문에 심근경색으로 인한 심근세포의 죽음은 건강한 세포가 있던 자리에 상처를 남기게 된다.

따라서, 저하된 심장기능을 치료하기 위한 근본적인 치료법은 죽은 심장조직을 건강한 심근세포로 대체해 주는 것이다.

최근 연구 결과에 의하면 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포와 같은 줄기세포(stem cell)는 심장에 이식된 후 놀라운 유연성을 갖는 것으로 나타났다. 줄기세포가 심근에 이식되면 심근 아세포로 교차분화(transdifferentiation)되는 능력이 있으며, 이러한 능력이 줄기세포를 심근 재생 치료에 사용할 수 있도록 만든다. 그 러나, 이같은 결과가 가능성이 있다고는 하지만, 경색 후 유의성 있는 기능 개선을 보일 만큼 줄기세포가 심근 아세포로 전환되지는 않는다. 뿐만 아니라 배아 줄기세포와 같은 전분화세포(progenitor cell)를 이식할 경우 기형종(teratoma)으로 변환된다는 보고들이 있다. 이에 따라, 골수 줄기세포와 같은 성체 줄기세포를 심근세포로 분화시킨 후 이식에 이용하고자 하는 연구가 진행되고 있다.

골수 줄기세포에 디메틸화 시약(demethylating agent)인 5-아자사이티딘(5-azacytidine), TGF-beta1, 인슐린, 간세포성장인자(Hepatocyte Growth Factor) 등을 처리하는 것에 의해 골수 줄기세포를 심근세포로 분화시킬 수 있음이 보고되었다. 그러나, 5-아자사이티딘은 게놈 염기서열을 무작위로 디메틸화시켜 정상의 사일런트 유전자(silent genes)가 발현되게 하는 것으로, 5-아자사이티딘을 처리할 경우 심근세포 뿐만 아니라 많은 종류의 다른 세포(예를 들어, 근육 세포(MyoD 양성), 뼈 세포(osteocalcin 양성), 지방 세포(PPAR- 양성), 그리고 심근 아세포(cardiac troponin I 양성))가 유도되므로, 한 가지 세포형인 심근 아세포로의 유의성 있는 분화를 재현성 있게 보이지는 못한다. 또한, 5-아자사이티딘과 같은 화학 약품인 디메틸화 시약은 인체 사용시 안전성이 입증되어 있지 않다.

다른 한편으로는, 근육 아세포(skeletal myoblast) 또는 근육세포(skeletal myocyte)를 이용하여 죽은 심장조직을 대체하고자 하는 연구들이 진행 중에 있다. 이는 환자의 근육조직을 일부 채취하여 근육 아세포를 분리하고 증식시켜 심장에 이식하는 것인데, 이들 세포는 세포간 갭정션(intercellular gap junction)을 형성하지 못하므로 부정맥을 유발할 위험을 갖는다. 즉, 심장이 박동하기 위해서는 심 근세포간 상호 전기적 신호전달이 필요하며, 세포간 형성되어 있는 갭정션을 통해 물질이 이동하여 일정한 방향으로 신호전달이 이루어지는데, 근육 아세포가 이식될 경우 주변조직과의 전기적 신호전달이 일어나지 않게 되어 부정맥 유발의 원인이 될 수 있는 것이다.

세포 이식에 성공하기 위해서는 이식 후 세포의 생착율을 극대화하는 것이 중요하며, 이미 분화가 완료된 세포보다는 최종 분화까지 진행되지 않아 분열능력을 갖고 있는 세포가 이식 후 생착력, 적응력이 좋다고 알려져 있다. 또한, 심근세포의 경우 주변 조직과의 전기적 신호전달을 통해 일관성 있게 움직이는 특징을 갖고 있어, 심근에 세포를 이식하고 심기능 개선을 유도하기 위해서는 이식된 세포가 기존의 조직과 잘 융합하여 동일한 신호전달 체계로 움직이는 것이 중요하다.

이상과 같은 문제점을 고려하여, 본 발명에서는 발생학적으로 커미티드된 상태이지만 완전히 분화되지 않아 분열하는 줄기세포의 특징을 유지하고 있어 이식부위에서 잘 생착하고 주변조직과의 신호전달을 통해 심근세포로 최종 분화될 수 있는 한 가지 세포형(예를 들어, 심근 아세포)으로 유도하는 적절한 생물학적 성장인자와 조건을 모색하고자 하였다. 그 결과, 골수 줄기세포에 생물학적 성장인자를 처리하여 줄기세포의 특징을 유지하면서 심장 계통(cardiac lineage)으로 커미트먼트시키는 방법과, 더 나아가 손상된 심근에 이식했을 때 가장 좋은 생착과 생존율을 나타내는 단계의 세포를 수집하는 방법을 개발하였으며, 이러한 방법을 통하여 유도된 골수 줄기세포를 심근경색 쥐의 심근에 이식하여 이식한 세포가 심근세포로 완전히 분화되고 그 결과 심기능이 개선되는 것을 확인함으로써 본 발명에 이르게 되었다.

본 출원인에 의한 선출원인 국내특허공개 제10-2005-0055823호(2005년 6월 14일 공개)에서는 골수 줄기세포로부터 유도된 세포가 손상된 심근에서 좋은 생착과 생존율을 나타내도록, 이식하기 전 심장 특이적 배지에서 일정 기간 동안 배양하는 방법에 대하여 기술하고 있는데, 본 발명에서는 이 방법에 의해 유도되는 세포의 특징을 보다 구체적으로 제시함으로써 세포 이식 후 치료효과를 극대화하고자 한다.

본 발명의 목적은, 인간을 포함하는 포유류의 골수 줄기세포를 생물학적 성장인자를 이용하여 심근세포로 유도하되, 줄기세포의 특징을 그대로 유지하도록 하여, 유도된 골수 줄기세포가 손상된 심근에서 가장 좋은 생착과 생존율을 나타내고 최종적으로 심근세포로 분화되어 심기능을 개선의 목적을 달성할 수 있는 세포를 얻는 방법을 개발함으로써, 심근경색과 같은 불충분한 심근 기능으로 인한 이상증으로 진단된 포유류(예를 들어, 인간)에게 임상적으로 적절하게 유도된 골수 줄기세포를 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 포유류 심근 조직으로 이식하기 위한 세포의 생산 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 불멸화(immortalized)되지 않는 골수 줄기세포를 공급하는 단계;

(b) 상기 골수 줄기세포를 골수 줄기세포의 성격을 유지하는 상태에서 계대 배양하는 단계;

(c) 상기 골수 줄기세포를, 골수 중간엽 줄기세포의 성격을 유지하면서 심근 아세포로 커미트먼트시키도록 유도하는 심장 특이적 배지(cardiac specific media)에서, 상기 세포의 80 내지 90 %가 심근 아세포로 유도될 때까지 배양하는 단계; 및

(d) 상기 배양된 세포가 골수 중간엽 줄기세포의 특징적 마커를 발현할 때 단계 (c)의 세포를 수집하는 단계.

여기에서, 상기 골수 줄기세포는 이식 대상 포유류로부터 유래될 수 있으며, 상기 단계 (c)에서 배양은 1 시간 내지 21 일 동안이 바람직하고, 6∼7 일 동안 배양하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 심장 특이적 배지는 생물학적 성장인자인 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), BMP-2(Bone Morphogenic Protein-2) 및 IGF-I(Insulin-like Growth Factor-1)를 포함하는 배지로서, bFGF, BMP-2 및 IGF-1의 농도는 각각 1 내지 200 ng/㎖이고, 여기에 우혈청 2 내지 20 %, L-아스코르브산-2-PO₄ 1 내지 1000 μM, LIF 5 내지 15 ng/㎖, 및 덱사메타손 1 내지 200 nM를 더욱 포함하는 배지인 것이 바람직하다.

여기에서, 배양된 골수 줄기세포는 심근 아세포로 커미트먼트(commitment)된 것으로, 특히 MEF2 단백질을 발현하고, MF-20는 발현하지 않으며, 골수 중간엽 줄기세포의 특징적 마커인 CD29+, CD90+, CD44+, CD34-, CD45-를 표현하는 세포를 수 집하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 포유류 심근 조직으로 이식하기 위한 세포의 생산 방법은, 유도된 골수 줄기세포를 손상된 심근에서 최적의 생착과 생존율을 나타내며 심근세포로 최종 분화할 수 있도록 특정 기간 동안 유도하는 방법; 그리고, 이와 같이 유도된 세포를 포유류의 심근경색 모델에 이식하여 평가하는 방법으로 실시된다.

먼저, 유도된 골수 줄기세포가 손상된 심근에서 최적의 생착과 생존율을 나타내며 심근세포로 최종분화할 수 있도록 특정 기간 동안 유도하는 방법은 다음 단계를 포함한다:

(1) 불멸화(immortalized)되지 않는 골수 줄기세포를 공급하는 단계;

(2) 충분한 수의 세포를 얻기 위하여 상기 골수 줄기세포를 계대 배양하는 단계;

(3) 배양된 상기 골수 줄기세포를 생물학적 성장인자가 포함된 심장 특이적 배지(cardiac specific media)에서 1 시간 내지 21 일 동안 배양하여 심근 아세포로 유도하는 단계;

(4) 단계 (3)의 세포의 유도 상태를 특정 기간 단위로 수집하여 모니터링하는 단계; 및

(5) 상기 세포의 80∼90 %가 심근 아세포로 커미트먼트되고, 골수 중간엽 줄기세포의 특징을 유지할 때 단계 (3)의 세포를 수집하는 단계.

이와 같이 유도된 세포를 포유류의 심근경색 모델에 이식하여 평가하는 방법은 다음 단계를 포함한다:

(1) 심근경색 포유류 모델을 만드는 단계;

(2) 상기 포유류로부터 골수 줄기세포를 분리하는 단계;

(3) 충분한 수의 세포를 얻기 위하여 상기 골수 줄기세포를 계대 배양하는 단계;

(4) 배양된 상기 골수 줄기세포를 생물학적 성장인자가 포함된 심장 특이적 배지(cardiac specific media)에서 6∼7 일 동안 배양하는 단계;

(5) 상기 세포의 80∼90 %가 심근 아세포로 커미트먼트되고, 골수 중간엽 줄기세포의 특징을 유지할 때 단계 (4)의 세포를 표지하여 수집하는 단계;

(6) 상기 심근 아세포를 상기 포유류로 이식하는 단계; 및

(7) 이식세포가 상기 포유류의 심장에서 심근세포로 최종 분화되고 심기능이 개선됨을 확인하는 단계.

본 발명에서는 인간을 포함하는 포유류의 골수 줄기세포에 생물학적 성장인자를 처리하여 직접 심장 계통(cardiac lineage)으로 커미트먼트시키고, 유도된 골수 줄기세포가 손상된 심근에서 가장 좋은 생착과 생존률을 나타내며 최종 심근세포로 분화되도록 하기 위해 주사하기 전 특정 기간 동안 in vitro에서 처리하고, 그리고 유도된 골수 줄기세포를 심근경색이 있는 포유류의 심장에 이식하여 상태의 변화를 평가하였다. 이와 같은 방법을 통하여 유도된 심근 아세포는, 5-아자사이티딘과 같은 화학적 디메틸화 시약(demethylating agent)을 사용한 것보다 훨씬 임상적으로 적절하고, 이식후 심장조직에 잘 생착하여 주변조직과 융화하면서 심근세포로 분화하였으며, 그 결과 심기능이 획기적으로 개선되었음을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에 따라, 이식되는 세포는 활발하게 증식하거나 충분히 분화하여 주변조직과의 상호 전기적 신호전달이 가능할 수 있다. 즉, 이식되는 세포는 이식된 심장조직에서 심근세포 발생의 늦은 단계에서 발현되어 심근세포 간에 세포막 채널을 형성하여 전기신호 전달을 가능하게 하는 Connexin-43을 발현하는 세포로 분화할 수 있으며, 기능이 상실된 심장조직을 대체하여 심기능을 획기적으로 개선시킬 수 있다.

골수 줄기세포는 심장 특이적 마커를 이용하여 확인할 수 있는 심근세포계로 특이하게 유도되어 사용될 수 있다. 이때 마커들은 Nkx2.5, GATA4, MEF2(myosin enhancing factor), 그리고 SRF(serum response factor) 등을 포함하지만 이들만으로 제한되지는 않는다.

또한, 심근 아세포로 유도된 골수 줄기세포는 골수 중간엽 줄기세포의 표현형을 갖는 것으로 확인될 수 있다. 이를 확인하기 위해 사용되는 마커들은 CD13, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, CD133, c-kit 등을 포함하지만 이들만으로 제한되지는 않는다.

심장과 연관된 마커들과 골수 중간엽 줄기세포의 확인은 검출 가능한 어떠한 방법, 예를 들어 리포터 유전자 발현(심장 특이적 프로모터(promoter)로 유도된 LacZ), RNA 발현(RT-PCR, Northern blot, RNase protection 방법), 또는 단백질 발현(면역 형광 염색법, western blot, flow cytometry) 등을 포함하지만 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

상기 방법을 이용하여 이식되는 세포는 심근 아세포 분화 과정 중 어떤 단계의 세포라도 사용할 수 있다.

본 명세서에서 "골수 중간엽 줄기세포 또는 골수 줄기세포(BMSC)"는 CD45가 없는 골수 중간엽 유래 줄기세포를 의미한다. 골수 중간엽 줄기세포는 또한 골수 줄기세포나 골수 유래 다잠재성 전구 세포라고도 불린다.

"심장 세포(cardiac cell)"는 분화된 심장 세포(예를 들어, 심근세포) 또는 심장 세포를 생성하거나 심장 세포로 분화되도록 결정된 세포(예를 들어, 심근 모세포 또는 심근 아세포)를 의미한다.

"심근세포(cardiomyocyte)"는 심장에서 검출 가능한 양의 마커(예를 들어, 알파 미오신 heavy chain, cTnI, MLC2v, 알파 심장 액틴, in vivo에서 Cx43)를 발현하고, 수축하며, 증식은 하지 않는 근육 세포를 의미한다.

"심근 모세포(cardimyoblast)"는 심장에서 검출 가능한 양의 심장 마커를 발현하고, 수축하고, 증식하는 세포를 의미한다.

"심근 아세포(cardiomyogenic cell)"는 검출 가능한 양의 Csx/Nkx2.5 RNA 또는 단백질을 발현하고, 조직화된 육종 구조나 수축이 보이지 않고, 검출 가능한 양의 미오신 heavy chain 단백질이 발현되지 않는 세포를 의미한다.

"심장 특이적인(cardiac specific)"은 최종적으로 분화된 마커들이 발현되기 이전에 초기 심장 전사 인자들이 발현되는 심장 분화의 초기단계를 의미하며, "심장 특이적 배지(cardiac specific media)"는 골수 줄기세포를 심근세포로 유도하는 bFGF, BMP-2 및 IGF-1을 함유하는 배지를 의미한다.

"교차분화(transdifferentiation)"는 적절한 외부 환경에 의하여 배엽기원이 다른 타종의 세포로 분화하는 것을 의미한다.

"커미트먼트(commitment)"는 자가증식하는 줄기세포의 특징을 가지면서 최종적으로 분화된 마커들이 발현되기 이전에 초기 심장 전사 인자들이 발현되는 심장 분화의 초기단계로 처리함을 의미한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예만으로 한정되는 것은 아니다. 또한 본 실시예에서는 래트 골수에서 채취한 골수 줄기세포를 이용하고 있지만 본 발명은 이에 한정되지 않고, 인간, 개, 마우스(mouse), 원숭이 등을 포함하는 모든 종류의 포유류 종에서 채취한 골수 줄기세포에 유사하게 적용된다.

실시예 1: 생물학적 성장인자와 함께 배양된 커미티드 골수 줄기세포(Committed BMSC )의 세포 표면 마커의 확인

골수 줄기세포는 크게 두 가지 종류의 세포, 즉 조혈모세포(Hematopoetic stem cell)와 중간엽 줄기세포(Mesenchyma stem cell)로 나눌 수 있다. 쥐과 동물의 골수 줄기세포의 세포 표면 단백질은 조혈모세포 마커로 CD34, CD45, 그리고 CD133 등이 있고, 중간엽 줄기세포로 CD29, CD90, CD44, 그리고 CD105 등이 있고, 공통적으로 c-kit에 대하여 양성인 것으로 알려져 있다. 그러나, 세포 표면 단백질은 쥐과 동물 사이에서도 서로 다른 양상을 보이는 등, 상기 세포 표면 단백질에 대한 특징이 완전히 확립되진 않았으나 대개 조혈모세포는 CD45+이고 중간엽 줄기세포는 CD45-, CD90+, CD29+, CD44+인 것으로 알려져 있다.

본 출원인의 선출원을 통해, 골수 줄기세포에 성장인자를 처리하여 심근 아세포로 커미트먼트시킬 수 있음을 확인하였는데, 이와 같이 커미트먼트된 골수 줄기세포(committed BMSC)와, 성장인자를 처리하지 않고 배양한 골수 줄기세포(uncommitted BMSC) 사이에 세포 표면 단백질의 특성을 비교하였다.

F344 래트의 대퇴골을 분리하여 내부의 골수 줄기세포를 분리한 후 10 % 우혈청, 100M L-아스코르브산-2-PO₄, 5∼15 ng/㎖ mLIF(mouse leukemia inhibitory factor) 및 20 nM 덱사메타손과 함께 배양하였다. 이러한 in vitro 조건에서 골수 줄기세포는 자가 증식 성질을 유지하고 성장인자와 같은 분화 시약에 반응성을 잃지 않으면서 계대 배양을 통해 증식된다. 모든 배양기와 슬라이드는 골수 줄기세포를 넣기 전에 콜라겐(5 ng/㎖)으로 15 분간 상온에서 코팅하였다. 이러한 in vitro 조건은 골수 줄기세포의 자가 재생성(self-renewing)과 계대 배양에 의하여 성장인자와 같은 분화 물질에 반응성을 잃는 일이 없도록 하기 위하여 사용된다. 또한, 여러 계대 배양을 통해 배양된 골수 줄기세포는 줄기세포 형태(mesenchymal morphology)와 정상 핵형(karyotype)을 유지한다.

골수 줄기세포를 심근 아세포로 유도하는 방법으로, 2 회 계대 배양(passage 2) 후, DMEM에 2∼20 % 우혈청, 1∼1000 μM L-아스코르브산-2-PO₄, 5∼15 ng/㎖ mLIF, 1∼200 nM 덱사메타손, 1∼200 ng/㎖ bFGF, 1∼200 ng/㎖ BMP2, 그리고 1∼200 ng/㎖ IGF-I을 포함하는 배지를 6∼7 일간 처리하여 커미티드 골수 줄기세포를 생산하였다. 생물학적 성장인자를 처리하지 않는 언커미티드 골수 줄기세포는 10 % 우혈청, 100M L-아스코르브산-2-PO₄, 5∼15 ng/㎖ mLIF(mouse leukemia inhibitory factor) 및 20 nM 덱사메타손과 함께 배양하였다. 또한 다른 대조군으로 래트의 골수 줄기세포를 분리하여 10 % 우혈청, 100M L-아스코르브산-2-PO₄, 5∼15 ng/㎖ mLIF 및 20 nM 덱사메타손과 함께 배양하여 배양기 바닥에 붙어 자라는 골수 중간엽 줄기세포(Passage 0)를 사용하였다.

세포 표면 단백질 염색 방법은 다음과 같다: 세포를 0.05 % 트립신-EDTA로 분리하였다. 분리한 세포는 1×10⁵/100 μL의 농도로 항-래트-CD29-FITC, 항-래트-CD90-FITC(녹색), 항-래트-CD44-FITC, 항-래트-CD34-PE, 항-래트-CD45-FITC (이상 직접 염색법), 항-래트-CD133, 항-래트-CD105, 그리고 항-래트-c-kit (이상 간접 염색법)을 각각 10 ng씩 처리하였다. 30 분간 4 ℃에서 반응시키고, PBS로 1회 세척하였다. PBS를 제거하고 직접 염색법의 시료는 1 % 파라포름알데하이드로 고정하여 냉장 보관하였고, 간접법의 시료, CD105 그리고 c-kit은 고트-항-토끼-Alexa 488-항체를 넣고, CD133 시료에는 마우스-항-고트-Alexa 488-항체를 넣어주어 30 분간 4 ℃에서 반응시키고, PBS를 넣어 1회 세척하여 원심분리하였다. PBS를 제거하고 시료를 1 % 파라포름알데하이드로 고정하여 냉장 보관하였다. 제작된 샘플은 FACS Calibur(BD, USA)로 분석하였다.

도 1은 Passage 0의 골수 줄기세포 표면 단백질 분석 사진, 도 2는 Passage 2의 언커미티드 골수 줄기세포 표면 단백질 분석 사진, 그리고 도 3은 Passage 2의 골수 줄기세포에 성장인자를 6∼7 일간 처리한 커미티드 골수 줄기세포 표면 단백 질 분석 사진이다.

도 1에서 세포 표면 단백질 염색 실험 결과를 보면, 골수 줄기세포 배양 후 passage 0의 골수 줄기세포는 CD90(A), CD29(B), CD44(C) 및 CD45(F)에 대하여는 강한 양성 반응을 나타내었고, CD105(D), CD34(E), CD133(G) 및 c-kit(F)은 음성으로 나타났다. 그리고, 도 2에서 passage 2(두 번 계대 배양)의 언커미티드 골수 줄기세포는 CD90(A), CD29(B), CD44(C)에 대하여는 강한 양성 반응을 나타내었고, CD105(D), CD34(E), CD45(F), CD133(G) 및 c-kit(F)은 음성으로 나타났으며, 도 3의 커미티드 골수 줄기세포의 경우도 이와 큰 차이를 보이지 않았다.

이상의 결과를 보면, 성장인자를 처리하여 심근 아세포로 커미티드된 골수 줄기세포는 여전히 골수 줄기세포의 성질을 잃지 않은 세포인 것을 알 수 있다.

실시예 2: 래트 심근 아세포( CMC , cardiomyocyte )와의 혼합배양(co-culture)을 통한 커미티드 골수 줄기세포(committed bone marrow-derived mesenchymal stem cell)의 심근 아세포로의 최종 분화 확인

F344 래트의 대퇴골로부터 골수 줄기세포를 분리하여 10 % 우혈청, 100M L-아스코르브산-2-PO₄, 5∼15 ng/㎖ mLIF(mouse leukemia inhibitory factor) 및 20 nM 덱사메타손과 함께 배양하였다.

골수 줄기세포의 분화는, 두 번 계대 배양 후, DMEM에 2∼20 % 우혈청, 1∼1000 μM L-아스코르브산-2-PO₄, 5∼15 ng/㎖ mLIF, 1∼200 nM 덱사메타손, 1∼200 ng/㎖ bFGF, 1∼200 ng/㎖ BMP2, 그리고 1∼200 ng/㎖ IGF-I을 포함하는 배지를 사 용하였다. 이러한 조건에 의하여 배양된 골수 줄기세포는 심근 아세포의 마커 단백질인 MEF2 단백질의 발현을 유도한다는 것이 본 출원인의 선출원에 기술되어있다(국내특허공개 제10-2005-0055823호“세포이식을 위한 세포의 생산방법”).

혼합 배양에 사용되는 F344 래트의 심근 아세포를 얻기 위해 신생 래트(신생 2 일)의 심장을 분리하여 PBS로 세척하고 심실 부분만을 잘게 잘라내어 0.05 % 트립신-EDTA로 37 ℃에서 10 분간 처리하였다. 이후 상등액을 10 % 우혈청을 포함한 DMEM 배지에 넣어 4 ℃에서 보관하고, 이 과정을 7 회 반복하였다. 모아진 상등액을 원심분리하여 10 % 우혈청/DMEM 배지에 넣어, 5 % 이산화탄소를 포함한 37 ℃ 세포 인큐베이터에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양 1 시간 후 배양기 바닥에는 섬유 아세포만 부착되고 심근 아세포는 배양기에 붙지 않아 배양액에 남아있게 된다. 심근 아세포를 포함한 배양액을 모아 원심분리 후 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척한 후 우혈청이 없는 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하고, 이후 배지를 제거하고 10 % 우혈청/DMEM 배지를 넣어주었다. 여기에 성장인자와 함께 배양하여 심근 아세포로 커미트먼트된 세포를 래트 심장에서 분리한 심근 아세포와 각각 4:1의 비율로 섞어주고, 이 배양기를 5 % 이산화탄소를 포함하는 37 ℃ 세포 인큐베이터에서 배양하였다.

완전한 심근세포로 분화가 된 것을 증명할 수 있는 가장 중요한 단백질로서는 심근세포간 갭정션(gap junction)을 만들어 근세포의 동시적 수축을 가능케 하고 세포간 연락물질의 이동을 수행하는 단백질 마커인 Connexin-43과 심장근육 조직을 구성하는 cardiac Troponin I을 가장 많이 사용한다(Nature, Vol. 410, 701- 704, 2001).

혼합 배양에 의한 골수 줄기세포의 심근세포로의 분화를 알아보기 위하여, 혼합배양 2 일 후 심근세포의 최종분화를 나타내는 특이 마커인 Connexin-43(녹색), 그리고 cardiac Troponin I(적색) 항체를 사용하여 면역염색을 하였다.

도 4는 언커미티드 골수 줄기세포(A∼D)와 커미티드 골수 줄기세포(E∼H)를 심근 아세포와 2 일간 혼합 배양하여 심근세포 특이 마커인 Connexin-43(녹색)과 cardiac Troponin I(적색)을 염색하여 골수 줄기세포의 분화를 측정한 형광 현미경 사진(400 배)이다. 도 4로부터, 언커미티드 골수 줄기세포를 혼합 배양한(A∼D) 경우는 심근세포 특이 마커인 Connexin-43과 cardiac Troponin I 양성반응을 나타내는 빈도는 매우 낮지만, 커미티드 골수 줄기세포와 혼합 배양하였을 때(E∼F)는 거의 대부분의 세포에서 Connexin-43과 cardiac Troponin I 양성반응을 나타낸 것을 볼 수 있다. 이러한 결과로 볼 때, 본 발명의 방법으로 제조한 커미티드 골수 줄기세포는 심근 아세포와 혼합 배양을 통하여 심장에 존재하는 심근세포로 최종 분화될 수 있고, 그 분화 능력이 월등히 좋아진다는 것을 알 수 있다.

실시예 3: 커미티드 골수 줄기세포의 갭졍션 형성 및 기능 확인

상기 실험에 의해, 커미티드 골수 줄기세포가 심근 아세포와의 혼합배양을 통해 Connexin-43을 발현하는 심근 아세포로 최종 분화됨을 확인하였으므로, 다음에 새로 형성된 갭정션이 정상적인 기능을 나타내는지 확인하였다.

전술된 실험 방법에 따라 혼합 배양을 할 때, 언커미티드 골수 줄기세포 또는 성장인자를 6∼7 일간 처리한 커미티드 골수 줄기세포는 세포질을 염색하는 DiI(Molecular Probe) 염색약(적색으로 발색)으로 미리 염색하고, 동시에 Connexin-43에 의하여 형성된 갭정션을 통하여 이동이 가능한 Calcein AM(녹색으로 발색)을 세포에 처리하여 배양하였다. 혼합 배양 2 일 후 형광현미경(칼자이스 악시오 버트 200)으로 관찰하여 언커미티드 골수 줄기세포 또는 커미티드 골수 줄기세포의 Calcein AM 염색액이 래트 심근 아세포로 이동하였는지 보았다. 그리고, Calcein AM 염색액이 갭정션을 통하여 이동한 것인지 증명하기 위하여, 갭정션의 기능을 제한하는 특이적 물질인 헵탄올을 상기된 방법으로 세포를 배양할 때 배지에 첨가하여 갭정션을 통한 물질 이동을 저해한 후 관찰하였다

도 5는 심근 아세포와 혼합 배양에서 발현된 Connexin-43에 의하여 형성된 갭정션의 기능을 분석한 레이저 형광 현미경 사진(400 배)으로, (A)∼(C)는 언커미티드 골수 줄기세포와 혼합 배양한 사진, (D)∼(F)는 커미티드 골수 줄기세포와 혼합 배양한 사진, (G)∼(L)은 각각의 그룹에 헵탄올을 처리하여 Connexin-43에 의한 갭정션을 저해한 후 Calcein AM 염색액의 이동을 관찰한 사진이다.

도 5의 C(언커미티드 골수 줄기세포)와 F(커미티드 골수 줄기세포)에서 주황색을 나타내는 것은 골수 줄기세포이고, 녹색 형광을 나타내는 것이 갭정션에 의해 Calcein AM 염색액이 전이된 심근 아세포이다. 도 5의 (A)∼(F)에서 보았을 때, 언커미티드 골수 줄기세포와 혼합 배양한 세포에서는 물질의 이동이 거의 보이지 않았으나 커미티드 골수 줄기세포는 함께 혼합 배양된 심근 아세포로 물질의 이동이 활발하게 이루어졌음을 확인하였다. 도 5에서 (G)∼(I)는 언커미티드 골수 줄기세포 혼합 배양한 경우이고, (J)∼(L)은 커미티드 세포 혼합 배양한 경우로, 헵탄올 에 의한 갭정션 저해시에는 양쪽 그룹 모두에서 Calcein AM 염색액의 이동이 관찰되지 않았다.

이상의 실험 결과에 따라, 성장인자를 처리하여 커미트먼트된 골수 줄기세포가 그렇지 않은 골수 줄기세포보다 혼합 배양에 의한 심근 아세포로의 분화가 더 잘 이루어지며, 또한 정상적인 물질이동 기능을 가진 갭정션을 형성하는 것을 확인하였다.

실시예 4: 웨스턴 블러팅을 이용한 골수 줄기세포의 심근 아세포 커미트먼트 확인

래트의 대퇴골에서 분리한 골수 줄기세포를 계대 배양을 통하여 증식시켰다. 두 번의 계대 배양 후 세포를 8 개의 배양기에 나눠 배양하는데, 이 중 4 개 배양기의 세포 배양 배지는 10 % 우혈청, 100M L-아스코르브산-2-PO₄, 5∼15 ng/㎖ mLIF (mouse leukemia inhibitory factor) 및 20 nM 덱사메타손을 포함한 배지를 사용하고, 나머지 4 개는 심근 아세포 분화 배지인 DMEM에 2∼20 % 우혈청, 1∼1000 μM L-아스코르브산-2-PO₄, 5∼15 ng/㎖ mLIF. 1∼200 nM 덱사메타손, 1∼200 ng/㎖ bFGF, 1∼200 ng/㎖ BMP2, 그리고 1∼200 ng/㎖ IGF-I을 포함하는 배지를 사용하였다.

각각의 배양 배지는 2 내지 3 일마다 새롭게 만든 배지로 바꿔 주었고, 배지 처리 후 1 일, 3 일, 5 일, 7 일에 각각 세포를 수집하였다. 수집된 세포는 단백질 추출 용액(protein extraction reagent, Novagen)으로 단백질을 추출하였다. 추출 한 단백질은 10 % 아크릴아마이드 겔을 사용하여 40 mA에서 2 시간 동안 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 겔은 PVDF 멤브레인에 트렌스퍼하여 웨스턴 블럿을 실시하였다.

심근 아세포 특이적 단백질인 Nkx2.5, MEF2 그리고 GATA-4 단백질의 웨스턴 블럿에 의한 검출 방법은 다음과 같다: 단백질이 트랜스퍼된 PVDF 멤브레인을 블로킹 용액(5 % 탈지유, 0.05 % Tween-20이 함유된 트리즈마 완충용액)으로 4 시간 동안 상온에서 블로킹하고, 세척 용액(0.05 % Tween-20이 함유된 트리즈마 완충용액)으로 15 분간 3 회 상온에서 세척하였다. 멤브레인에 고트-항-Nkx2.5(1:200, SC-8697, Santa Cruz Biotechnonogy, Santa Cruz) 항체, 토끼-항-MEF2(1:200, SC-10794, Santa Cruz Biotechnonogy, Santa Cruz) 항체, 및 토끼-항-GATA-4(1:200, SC-9053, Santa Cruz Biotechnonogy, Santa Cruz) 항체를 넣어 4 ℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 세척 용액으로 15 분간 3 회 세척하고, HRP(horse radish peroxidase)가 부착된 2차 항원(Nkx2.5는 고트, MEF2 그리고 GATA-4는 토끼)을 1:10,000으로 넣어 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이후, 멤브레인을 세척 용액으로 15 분간 3 회 세척하고, 세척 용액을 깨끗이 제거한 후 HRP 기질 용액을 첨가하여 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인을 X-ray 필름으로 감광하여 단백질의 발현을 분석하였다.

도 6은 언커미티드 골수 줄기세포와 커미티드 골수 줄기세포를 웨스턴 블럿 실험을 통하여 심근세포 특이 마커인 Nkx2.5, GATA-4, 그리고 MEF2 단백질의 발현을 나타낸 사진으로, 다섯 번째 줄은 래트의 심장에서 추출한 단백질로서 양성 대 조군으로 사용한 것이다. 도 6에서 보듯이, 생물학적 성장인자를 사용하여 배양한 커미티드 골수 줄기세포는 심근 아세포 특이 마커인 Nkx2.5와 GATA-4 단백질이 1 일, 3 일에는 발현이 없었으나 5 일부터 나타나기 시작하여 7 일째는 더욱 증가하는 현상을 보였다. 그러나, 생물학적 성장인자를 사용하지 않은 언커미티드 골수 줄기세포는 7 일까지 거의 단백질의 발현이 보이지 않았다. MEF2 단백질 또한 커미티드 골수 줄기세포에서 단백질 발현량이 확연히 증가함을 확인하였다.

실시예 5: 커미티드 골수 줄기세포의 심근경색 모델 래트 이식 및 분화 마커 단백질의 발현 평가

12 주령, 암컷 F344 래트(체중 200∼250 g, Daehan Biolink)를 사용하였으며, 심근경색 모델은 왼쪽 관상동맥을 45 분간 결찰하여 혈관을 폐색하고, 45 분 후 결찰을 풀어 만들어졌다. 경색은 1 주일 동안 안정화하였다. 또한, 근친 교배 래트인 F344를 사용하여 면역 거부반응을 방지하였다.

이식되는 골수 줄기세포는 F344 래트의 대퇴골에서 분리하여, DMEM 배지로 두 번 세척하고 배양 배지(2∼20 % 우혈청, 1∼1000 M L-아스코르브산-2-PO₄, 1∼200 nM 덱사메타손, 그리고 5∼15 ng/㎖ mLIF)를 사용하여 두 번 계대 배양 후, DMEM에 2∼20 % 우혈청, 1∼1000 μM L-아스코르브산-2-PO₄, 5∼15 ng/㎖ mLIF, 1∼200 nM 덱사메타손, 1∼200 ng/㎖ bFGF, 1∼200 ng/㎖ BMP2, 그리고 1∼200 ng/㎖ IGF-I을 포함하는 배지를 사용하여 6∼7 일간 배양해서 심근 아세포로 커미티드된 세포를 생산하였다. 언커미티드 골수 줄기세포는 생물학적 성장인자를 포함하지 않 은 배양 배지를 사용하여 생산하였다. 세포 수집 때, 이식 후 세포의 생존과 분화를 추적하기 위하여 붉은색 형광 표지제인 DiI로 세포를 표지하였으며, 대략 1×10⁶ 개의 세포를 수집하여 심장의 경색부위 6∼10 군데에 26호 주사기를 이용하여 주입하였다. 대조군으로는 심근경색 모델 래트에 세포 대신 DMEM을 주입하였으며, 다른 대조군으로는 심근경색을 유발하지 않고 가슴 절개 수술만 진행한 래트를 사용하였다.

세포 이식 8 주 후, 심장을 적출한 후 냉동조직 절편 기법으로 심장조직을 유리 슬라이드에 부착하여 이식된 세포의 생존 여부를 DiI를 형광 현미경을 통하여 측정하였다. 심근경색 래트의 심장조직에 이식된 골수 줄기세포를 분석하기 위하여 면역 조직 항체 반응을 통하여 조사하였다.

도 7은 심근경색 래트의 심장에 커미티드 골수 줄기세포를 주입하여 8주 후에 면역 염색 방법을 통하여 심근 아세포로 분화를 본 사진으로, 적색을 나타내는 것은 DiI 염색액으로 염색하여 주입한 커미티드 골수 줄기세포이고, 녹색은 심근 아세포 특이 마커인 Connexin-43(A, B; 200배), cTnI(C∼D; 200배), 그리고 MF-20(E; 400배)를 나타내는 것이며, F는 각각의 마커 단백질을 발현하는 랫트의 빈도를 나타내는 그래프로 회색은 언커미티드, 흑색은 커미티드 골수 줄기세포의 경우이다. 도 7에서 보듯이, 커미티드 골수 줄기세포는 경색심근에 주입되면 심근에 생착하고 심근 아세포로 분화가 일어난다는 것을 알 수 있다. 이러한 분화의 비율을 도 7의 (F) 그래프를 통해서 보면, Connexin-43은 언커미티드 골수 줄기세포를 주입한 래트에서 약 12 % 정도의 비율로 나타났고, 커미티드 골수 줄기세포는 약 60 % 정도로 5 배 높은 비율로 나타났으며, cTnI은 각 32 %와 75 %로 2 배 이상 높았고, MF-20은 각 12 %와 50 %로 4 배 이상인 것으로 나타났다.

이상의 결과를 볼 때, 성장인자를 처리한 커미티드 골수 줄기세포가 언커미티드 골수 줄기세포보다 in vivo에서의 분화율이 획기적으로 증가함을 알 수 있다.

실시예 6: 심근경색의 개선

상기 래트 심근경색 모델은 심장 초음파 조영술을 이용하여 골수 줄기세포 이식에 따른 회복 회과를 측정하기 위하여 사용되었다. 심장 초음파 조영술은 세포 이식 전, 이식 후 4 주, 그리고 이식 후 8 주에 실시하였다.

실험에 사용된 래트는 모두 51 마리(sham operation 10 마리, 배지 주입 14 마리, 언커미티드 골수 줄기세포 주입 15 마리 그리고 커미티드 골수 줄기세포 12 마리)가 사용되었다.

도 8은 심근경색 래트의 심장에 언커미티드 골수 줄기세포(A)와 커미티드 골수 줄기세포(B)를 이식하고 8 주 후의 심장 초음파 사진으로, 래트의 확장기말과 수축기말 내축 거리를 나타낸 것이고, (C)는 좌심실 박출 계수(Left Ventricular Ejection Fraction, LVEF), 그리고 (D)는 좌심실 분획적 단축(Left Ventricular Fractional Shortening, LVFS)을 비교한 그래프이다. 도 8의 (A)로부터, 심근경색 후 언커미티드 골수 줄기세포가 주입된 래트의 심장은 좌심실 수축기말과 확장기말의 내축 거리가 많이 넓어져 심근경색으로 인하여 심장의 기능이 저해되어진 것을 볼 수 있다. 반면, 도 8의 (B)로부터, 커미티드 골수 줄기세포를 주입한 래트의 심 장은 좌심실 수축기말과 확장기말의 내축 거리가 줄어든 것을 볼 수 있다. 따라서, 커미티드 골수 줄기세포가 이식된 심근경색 부위에서 심근 아세포로 최종 분화하여 경색된 심근을 대체하여 심장의 수축작용을 향상시킨 것을 알 수 있다.

또한, 심근 기능을 수치적으로 나타낼 수 있는 도 8의 (C)에서 좌심실 박출 계수(LVEF), 그리고 (D)에서 좌심실 분획적 단축(LVFS)이 세포를 주입한 두 그룹 모두 배지만을 주입한 래트 보다 좋아졌으나, 커미티드 골수 줄기세포를 주입한 래트의 심근 기능이 훨씬 더 좋은 개선 효과를 나타낸 것을 볼 수 있다.

이상의 결과에서 보면, 각 동물에서 경색 부위의 수축력이 개선되어 심근층의 인접부위와 조화를 이루게 된 것을 알 수 있다. 심장 초음파 결과는 실시예 4의 조직 면역 염색 결과를 기능적으로 재확인하는 것이며 성장인자로 배양된 커미티드 골수 줄기세포의 이식이 경색 이후의 심장 조직을 획기적으로 회복시킨다는 것을 입증하고 있다.

실시예 7. 부정맥의 개선

심근경색에 의한 사망은 심장의 수축력이 감소하여 혈액을 체내에 공급하지 못하게 되는 것이 주된 원인이 된다. 이와 동시에, 심근경색에 의한 부정맥은 심장 근육의 이상으로 인하여 동시적인 수축을 저해하여 심장마비를 유발함으로써 사망케 하기도 한다. 따라서 골수 줄기세포가 이식된 이후, 갭정션을 통해 주변의 살아있는 심근세포와 세포간 연락(cell to cell communication)이 자유로이 이루어져 부정맥이 유발되지 않아야 한다(Nature, Vol. 410, 701-705, 2001).

실시예 4에 기술된 방법에 따라 래트 심근경색 모델을 만들어 언커미티드 골 수 줄기세포와 커미티드 골수 줄기세포를 1×10⁶ 개씩 주입하였다. 세포주입 8 주 후 대퇴골 혈관에 마취약을 주입하고, 30 분간 안정화시켰다. 이후 인위적으로 부정맥을 유도하는 아코니틴(aconitine)을 10 mg/ℓ의 농도로 8 분 30 초간 0.1 ㎖/분의 속도로 주입하였다. 아코니틴 주입 후 20 분간 심장 초음파로 부정맥을 기록하여, 심실 조기수축(Premature ventricular contractions, PVC's)을 계수하고, 심실성 빈맥(Ventricular tachycardia)의 발생 빈도를 기록하였다.

도 9는 골수 줄기세포를 주입한 래트에 부정맥 유발 물질을 주입하여 부정맥 유발 정도를 측정한 결과로, (A)는 심실성 빈맥의 발생 빈도, (B)는 심실 조기수축을 보여준다. 도 9에서 보듯이, 심실 조기수축(B)은 언커미티드 골수 줄기세포를 주입한 래트에서는 2,205±414회가 발생한 반면, 커미티드 골수 줄기세포를 주입한 래트에서는 655±302 회로 상당히 줄어들었다. 또한, 심실성 빈맥의 발생 빈도(A)에서도 각각 75 %와 67 %로 커미티드 골수 줄기세포를 주입한 래트가 더 낮게 나타난 것을 볼 수 있다.

이상의 결과로부터, 생물학적 성장인자와 함께 배양된 커미티드 골수 줄기세포는 이식부위에서 심근 아세포로 최종 분화하면서 심근경색 주변부위의 심근과 조화를 이루어 심장의 수축이 이루어질 수 있게 되고, 따라서 부정맥의 유발 위험을 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 생산되는 세포는 줄기세포의 특징을 유지하면서 심근 아세포로 커미트먼트되어 있어서, 심장에 이식하였을 때 기존의 주변조직과 상호 전기적 신호전달이 가능한 심근세포로 최종적으로 분화되므로 심근 조직 재생을 위해 임상적으로 유효적절하다. 본 발명의 방법에 의하면, 임상적으로 최적의 생착과 생존율을 나타내며 심근세포로서의 기능을 충분히 발휘하여 심기능을 개선할 수 있는 커미티드 골수 줄기세포를 제공하여, 불충분한 심근 기능으로 인한 이상증으로 진단된 포유류(예, 인간)를 치료하는 데 이용할 수 있다.

Claims (9)

1. (a) 불멸화(immortalized)되지 않는 골수 줄기세포를 공급하는 단계;

   (b) 상기 골수 줄기세포를 골수 줄기세포의 성격을 유지하는 상태에서 계대 배양하는 단계;

   (c) 상기 골수 줄기세포를, 골수 중간엽 줄기세포의 성격을 유지하면서 심근 아세포로 커미트먼트시키도록 유도하는 심장 특이적 배지(cardiac specific media)에서, 상기 세포의 80 내지 90 %가 심근 아세포로 유도될 때까지 배양하는 단계; 및

   (d) 상기 배양된 세포가 골수 중간엽 줄기세포의 특징적 마커를 발현할 때 단계 (c)의 세포를 수집하는 단계를 포함하는,

   포유류 심근 조직으로 이식하기 위한 세포의 생산 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 골수 줄기세포가 이식 대상 포유류로부터 유래되는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 포유류가 인간인 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 6∼7 일 동안 배양하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 심장 특이적 배지는 생물학적 성장인자를 포함하는 배지인 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 생물학적 성장인자가 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), BMP-2(Bone Morphogenic Protein-2) 및 IGF-I(Insulin-like Growth Factor-1)인 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 bFGF, BMP-2 및 IGF-1의 농도는 1 내지 200 ng/㎖이고, 여기에 우혈청 2 내지 20 %, L-아스코르브산-2-PO₄ 1 내지 1000 μM, LIF 5 내지 15 ng/㎖, 및 덱사메타손 1 내지 200 nM를 더욱 포함하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, MEF2 단백질은 발현하고, MF-20는 발현하지 않는 단계의 세포를 수집하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 골수 중간엽 줄기세포의 특징적 마커가 CD29+, CD90+, CD44+, CD34-, CD45-인 방법.

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