KR20070061893A - 유방암 예후를 평가하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유방암, 특히 초기 단계의 유방암 환자의 예후를 평가하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법은 하나 이상, 특히 2종 이상의 바이오마커의 발현을 신체 샘플에서 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커 또는 바이오마커 조합의 발현은 암 예후를 나타낸다. 일부 예에 있어서, 상기 신체 샘플은 유방 조직 샘플, 특히 원발성 유방 조직 샘플이다. 본 발명의 바이오마커는 그것의 과다 발현이 양호한 또는 양호하지 않은 암 예후 중 어느 하나를 나타내는 단백질 및/또는 유전자이다. 대상 바이오마커로는 세포 주기 조절, DNA 복제, 전사, 신호 전달, 세포 증식, 침투, 단백질 분해 또는 전이에 관여하는 단백질 및 유전자를 포함한다. 본 발명의 일부 측면에서, 대상 바이오마커의 과다 발현은 바이오마커 특이적 항체를 이용하여 단백질 수준에서, 또는 핵산 혼성화 기법을 이용하여 핵산 수준에서 검출한다.

유방암, 초기 단계, 예후

Description

유방암 예후를 평가하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVALUATING BREAST CANCER PROGNOSIS}

본 발명은 유방암, 특히 초기 단계의 유방암 환자의 예후를 평가하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

미국 여성들에게서 유방암은 피부암 다음으로 두번째로 흔한 암이다. 미국 여성이 생애에 유방암에 걸릴 가능성은 1/8이며, 미국 암 학회에서는 유방암의 신규 발생 사례가 미국에서만도 올해 250,000건 이상일 것이라고 추산하였다. 유방암은 여성의 암 사망에 두번째 원인이며, 2004년에는 유방암으로 미국인 40,000명 이상이 사망할 것으로 예상된다.

개선된 검출 방법, 집단 스크리닝(mass screening) 및 과거 십년간에 걸친 치료 방법의 발달로 유방암으로 진단된 여성의 전망이 현저하게 개선되고 있다. 오늘날, 유방암 사례들중 약 80%는 생존율이 가장 높은 질병의 초기 단계에 진단되고 있다. 그 결과 유방암 환자의 약 85%는 진단후 적어도 5년 이상 생존한다.

이러한 발전에도 불구하고, 초기 단계의 유방암으로 진단받은 여성의 약 20%는 10년후 예후가 나빠, 재발, 전이되거나 또는 이 기간내에 사망하기도 한다. 그러나, 초기 단계에서 진단받은 나머지 80%의 유방암 환자는 10년후 예후가 우수하 여, 추가적인 적극적인 보조 요법(adjuvant therapy)(예, 화학치료)이 필요하거나 도움이 되지 않을 것이다. 현재, 임상적으로 합의된 의견은 초기 단계의 임파선-음성(node- negative)의 유방암 환자들중 적어도 일부는 보조 화학치료를 받아야 하지만, 환자에 대한 보다 적극적인 치료를 위해, 위험군별로 분류하는(risk stratify) 분석 방법이 없다. 이러한 초기 단계의 암환자 대다수는 수술 및/또는 방사선 치료 이후에 추가적인 치료없이도 장기간 생존하므로, 이러한 환자들 모두에게 특히 암 화학치료제와 관련된 현저한 부작용 측면에서, 적극적인 보조 요법을 추천하는 것은 부적절한 것임에 틀림없다. 이러한 초기 단계의 유방암 환자 집단을 초기 진단으로 예후가 양호한 그룹과 양호하지 않은 그룹으로 구분가능한 조성물 및 방법은 임상학자들이 적합한 치료 코스를 선정하는 것을 보조할 것이다. 따라서, 유방암, 특히 초기 단계의 유방암 환자의 예후 평가 방법이 필요한 실정이다.

상당수 연구는 유방암 예후를 분석하고 치료 반응을 예측하기 위한 방법 및 인자 동정에 집중되어 있다(Ross and Hortobagyi, eds.(in press) Molecular Oncology of Breast Cancer (Jones and Bartlett Publishers, Boston, MA)을 일반적으로 참조하며, 원용에 의해 그 전체가 본 발명에 포함됨). 예후 표시자(indicator)는 종양 크기, 림프절 상태 및 조직학적 등급 뿐만 아니라 예후에 대한 일부 정보를 제공하며 특정 치료제에 반응할 것 같은 분자 마커와 같은, 통상적인 많은 인자를 포함한다. 예컨대, 에스트로겐(ER) 및 프로게스테론(PR) 스테로이드 호르몬 리셉터 상태 측정법은 유방암 환자 평가에 일상적인 과정이 되었다. 예 로, Fitzgibbons et al.(2000) Arch. Pathol. Lab. Med. 124:966-978을 참조한다. 호르몬 리셉터 양성인 종양은 호르몬 요법에 반응할 것임이 틀림없으며, 또한 전형적으로 보다 덜 적극적으로 증식하므로, 따라서, ER+/PR+ 종양이 있는 환자의 예후는 보다 양호한 편이다.

인간 상피 성장 인자 리셉터2(HER-2/neu), 트랜스멤브레인 타이로신 키나제 리셉터 단백질의 과다 발현은 양호하지 않은 유방암 예후와 관련성이 있다. Ross et al. (2003) The Oncologist :307-325. 현재, 유방 종양에서의 Her2/neu 발현 수준을 이용하여, 항-Her-2/neu 항체 치료제 트라스투주맵(trastuzumab)(Herceptin®; Genentech)에 대한 반응을 예측한다. 예컨대, 상기 Id. 및 Ross et al을 참조한다. 또한, 유방암의 약 1/3은 종양 억제 유전자 p53에 돌연변이가 있으며, 이러한 돌연변이는 질병의 공격성 증가 및 양호하지 않은 예후와 연관되어 있다. 전술한 Fitzgibbons et al.을 참조한다. Ki-67은 세포 주기의 G1에서 발현되어 M 단계까지 가는 비-히스톤성 핵 단백질이다. 또한, 연구를 통해 세포 증식 마커 Ki-67 과다 발현은 유방암의 양호하지 않은 예후와 상관성이 있다는 것이 입증되었다.

현재 예후 기준 및 분자 마커는 환자의 운명을 예측하고 적정 치료 경로를 선정하는데 일부 지침을 제공하지만, 유방암 예후, 특히 초기 단계의 림프절 음성 환자를 평가하는 특이적이며 민감한 방법이 매우 필요한 실정이다. 이러한 방법은 양호한 예후를 가진 유방암 환자들과 예후가 양호하지 않은 유방암 환자들을 특이적으로 식별할 수 있어야 하며, 적극적인 보조 요법이 필요할 것 같은 고위험도의, 초기 단계의 유방암 환자를 식별할 수 있어야 한다.

발명의 개요

암 환자, 특히 유방암 환자의 예후를 평가하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 방법은 하나 이상, 더 바람직하기로는 2개 이상의 바이오마커의 발현을 신체 샘플로부터 검출하는 단계를 포함하며, 바이오마커 또는 바이오마커 조합의 발현은 암 예후를 나타낸다. 상기 바이오마커나 또는 바이오마커 조합의 발현은 양호한 예후(즉, 무병 생존) 또는 양호하지 않은 예후(즉, 암 재발, 전이 또는 암으로 사망) 중 어느 하나를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법은 예후가 양호한 유방암 환자를 예후가 양호하지 않은 환자와 구분가능하다. 본원에 개시된 방법은 통상적인 임상 인자(예, 종양 크기, 종양 분화도(TUMOR GRADE), 림프절 상태 및 가족력)의 평가 및/또는 Her2/neu, Ki67, p53, 에스트로겐 호르몬 리셉터 및 프로게스테론 호르몬 리셉터와 같은 분자 마커의 발현 수준 분석과 조합할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 방법은 유방암 예후에 대한 보다 정확한 평가가 가능하다.

본 발명의 바이오마커는 그것의 과다 발현이 암 예후를 나타내는 단백질 및/또는 유전자로, 이들로는 세포 주기 조절, DNA 복제, 전사, 신호 전달, 세포 증식, 침투 또는 전이에 관여하는 바이오마커를 포함한다. 본 발명의 바이오마커 유전자 또는 단백질의 과다 발현 검출로, 암 예후를 평가가능하며, 예컨대 치료법 선정을 위해 유방암 환자를 양호한 및 양호하지 않은 징후 위험군으로 분리하는 것을 용이하게 한다.

바이오마커 발현은 단백질 또는 핵산 수준으로 분석할 수 있다. 일부 예에서, 면역조직화학 기법은 항체를 이용하여 유방 종양 샘플내 바이오마커 단백질의 발현 검출을 제공한다. 본 발명의 이러한 측면에서, 특이적인 대상 바이오마커에 대한 하나 이상의 항체가 사용된다. 또한, 핵산을 이용한 기법, 예컨대 혼성화 및 RT-PCR을 포함한 기법으로 발현을 검출할 수 있다.

조성물은 본 발명의 바이오마커 단백질에 결합할 수 있는 단일클론 항체를 포함한다. 이러한 단일클론 항체의 항원 결합 단편 및 변이체, 이러한 항체들을 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이들 단일클론 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 분리된 핵산 분자 또한, 본 발명에 포함된다. 본 발명의 방법을 실시하기 위한 시약을 포함하는 키트도 제공한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 암 환자, 특히 유방암 환자, 보다 구체적으로는 초기 단계의 유방암 환자의 예후를 평가하는 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 방법은 환자 조직 또는 체액 샘플내 바이오마커의 발현을 검출하는 단계 및 상기 바이오마커가 과다 발현되었는지를 결정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 실시에 사용되는 바이오마커 또는 바이오마커의 조합의 과다 발현은 유방암 예후를 나타낸다(즉, 양호하지 않은 또는 양호한 예후). 따라서, 특정 바이오마커나 목적한 바이오마커의 조합의 과다 발현은 암이 완치될 것으로 보이는 환자와 질환이 재발(즉, 양호하지 않은 예후)할 것 같은 유방암 환자 구별을 가능하게 한다. 본 발명의 일부 측면에서, 상기 방법은 양호하지 않은 유방암 예후를 나타내는 유방암 샘플내 하나 이상의 바이오마커 과다 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 그에 따라 투병중인 암이 재발할 것 같은 환자를 구별한다. 본 발명의 방법은 적합한 치료 코스를 선택하는 것을 보조하고 보다 적극적인 치료가 이로운 환자를 구별하는데 사용할 수 있다. 특정 예에 있어서, 항체 및 면역조직화학 기법을 사용하여, 목적 바이오마커의 발현을 검출하고, 유방암 환자의 예후를 평가한다. 목적한 바이오마커에 특이적인 단일클론 항체 및 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트를 추가적으로 제공한다.

"유방암"은, 예컨대 생검(biopsy)에 의해 악성 병리상태로 분류되는 상태이다. 유방암 진단의 임상적인 기술은 의학 분야에서 잘 알려져 있다. 당업자라면 유방암이 예컨대 악성 종양 및 육종을 포함한, 유방 조직의 모든 악성을 나타냄을 이해할 것이다. 특정 예에 있어서, 유방암은 유방내암(ductal carcinoma in situ, DCIS), 상피내 소엽성 암종(lobular carcinoma in situ, LCIS), 또는 점액성 유방 암(mucinous carcinoma)이다. 또한, 유방암은 침윤성 관상피암(infiltrating ductal carcinoma, IDC) 또는 침윤성 소엽내암(infiltrating lobular carcinoma, ILC)이다. 본 발명의 대부분의 예에 있어서, 목적 대상자는 유방암으로 추측되거나 또는 실제 진단받은 인간 환자이다.

AJCC(American Joint Committee on Cancer)에서는 "TNM" 분류계를 이용하여 유방암 단계를 매기는 표준화된 시스템을 개발하였다. 환자는, 원발성 종양 크기(T), 국소 림프절 상태(N), 및 원위부 전이(M)의 존재 여부에 대해 평가되며, 이후 상기 인자의 조합을 기초로 단계 0 - IV로 분류된다. 이러한 시스템에서, 원발성 종양의 크기는 0-4(TO = 원발성 종양 증거 없음; Tl = < 2 cm; T2 = >2 cm - <5 cm; T3 = >5 cm; T4 = 흉벽 또는 피부쪽으로 직접 전파된 임의 크기의 종양) 범위로 분류된다. 림프절 상태는 N0-N3(NO = 국소 림프절에 전이가 없음; Nl = 이동가능한, 동일 방향의 겨드랑이 림프절(들)에 전이; N2 = 서로 또는 다른 구조에 고정된 동일 방향의 림프절(들)로 전이; N3 = 흉골밑에 있는 동일 방향의 림프절에 전이)로 카테고리화된다. 전이는 원위부 전이의 부재(MO) 또는 존재(Ml)로 카테고리화된다. 임의 임상 단계의 유방암 환자는 본 발명에 포함되지만, 초기 단계의 유방암 환자가 특히 관심 대상이다. "초기 단계의 유방암"은 단계 0(in situ breast cancer), I(Tl, NO, MO), IIA (TO-1, Nl, MO 또는 T2, NO, MO), 및 IIB (T2, Nl, MO 또는 T3, NO, MO)을 의미한다. 초기 단계의 유방암 환자에는 림프절 관여가 거의 또는 전혀 나타나지 않는다. 본원에서, "림프절 관여" 또는 "림프절 상태"는 암이 림프절로 전이되었는지를 나타낸다. 유방암 환자는 이를 토대로 "림프절 양성" 또는 "림프절 음성"으로 분류된다. 유방암 환자를 구별하는 방법과 질병의 단계를 매기는 방법은 잘 알려져 있으며, 수동 조사, 생검, 환자 및/또는 가족력 조사, 및 유방X선 조영법(mammography), 자기공명영상화(MRI) 및 양전자 단층 촬영술(positron emission tomography, PET)와 같은 영상화 기법을 포함할 수도 있다.

용어 "예후"는 당업계에서 인식되어지며, 질병 또는 질병의 진행에 대한 가능한 과정, 특히, 질병의 차도, 질병의 재생, 종양 재발, 전이 및 죽음 가능성 측면에서의 예측을 포함한다. "양호한 예후"는 암 환자, 특히 유방암 환자의 질병이 완치(즉, 암 완치)될 가능성을 의미한다. "양호하지 않은 예후"는 투병중인 암 또는 종양의 재생(relapse) 또는 재발(recurrence), 전이 또는 죽을 가능성이 있음을 의미한다. "양호한 결과는"를 가지는 것으로 분류된 암 환자는 투병중인 암 또는 종양이 없는 상태이다. 이와는 반대로, "양호하지 않은 결과"의 암 환자는 질병의 재생, 종양 재발, 전이 또는 죽음을 겪는다. 특정 예에서, 예후 또는 결과 분석에 있어 시간 프레임은, 예컨대 1년 미만, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 15년, 20년 또는 그 이상이다. 본원에서, 예후 또는 무질병 상태로 생존 기간을 분석과 관련된 시간은 종양의 외과적 제거나 종양 증식의 억제, 이동 또는 저해로 시작한다. 따라서, 예컨대, 특정 예에서, "양호한 예후"는 유방암 환자가 투병중인 암 또는 종양이 적어도 5년, 보다 구체적으로는 적어도 10년 이상동안 없는 상태로 있을 수 있음을 의미한다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, "양호하지 않은 예후"는 유방암 환자가 5년 미만내에, 보다 구체적으로는 10년 미만내에 질병 재생, 종양 재발, 전이 또는 사망을 경험할 수 있음을 의미한다. 상기 예후 및 결과를 분석에 있어서, 시간 프레임은 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

본원에 기재된 일부 예에서, 바이오마커 및/또는 다른 임상적인 파라미터의 예후 수행은 콕스의 비례 위험 모델 분석(Cox Proportional Hazards Model Analysis)을 이용하여 평가하며, 이는 유해비와 그의 신뢰구간 추정치를 제공하는 생존 데이타를 위한 회귀방법이다. Cox 모델은 환자 생존율과 특정 변수(particular variable) 사이의 관련성을 조사하기 위한 널리 인지되어 있는 통계학적 기법이다. 이러한 통계학적 방법은 소정의 예후 변수(예, 전술한 바와 같은 특정 바이오마커의 과다 발현)로 개체의 유해도(즉, 위험도)를 추정할 수 있게 한다. Cox 모델 데이타는 통상적으로 Kaplan-Meier 커브로서 나타낸다. "유해비"는 특정 예후 변수를 나타내는 환자의 임의의 소정 시점에서의 사망 위험성이다. 일반적으로 Spruance et al. (2004) Antimicrob. Agents & Chemo. 48:2787-2792를 참조한다. 특정 예에 있어서, 목적 바이오마커는 유방암이 재발하거나 겪고 있는 유방암으로 인해 사망할 가능성을 분석하는데 통계학적으로 유의한다. 통계학적인 유의성 분석 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 그 예로는 log-rank test Cox 분석 및 Kaplan-Meier 곡선을 이용하는 방법을 포함한다. 본 발명의 일부 측면에 있어서, 0.05 미만의 p 값은 통계적인 유의성이 있다.

전술한 바와 같이, 유방암의 임상적인 또는 예후 인자들 다수는 당업계에 공지되어 있으며, 이를 사용하여 치료 결과 및 질병의 재발 가능성을 예측한다. 이러한 인자로는 림프절 관여, 종양 크기, 조직학적 분화도, 가족력, 에스트로겐 및 프로게스테론 호르몬 리셉터 상태, Her 2/neu 농도, 및 종양 배수성(tumor ploidy)을 포함한다. 본원에서, 에스트로겐 및 프로게스테론 호르몬 리셉터 상태는 이들 리셉터들이 특정 유방암 환자의 유방 종양에서 발현되는지를 나타낸다. 따라서, "에스트로겐 리셉터 양성 환자"는 유방 종양에서 에스트로겐 리셉터의 발현을 보이지만, "에스트로겐 리셉터 음성 환자"는 그렇지 않다. 본 발명의 방법을 이용하여, 유방암 환자의 예후를 이들 또는 다른 임상 및 예후 인자를 이용한 분석과 독립적으로, 또는 조합하여 결정할 수 있다. 일부 예에서, 다른 예후 인자를 이용한 분석과 본 발명의 방법을 조합함으로써, 유방암 예후를 보다 정확하게 결정할 수 있다. 본 발명의 방법은 예컨대, Her2/neu, Ki67, 및/또는 p53 발현 수준의 분석과 커플링될 수 있다. 환자 임상력, 가족력 및 폐경기 상태(menopausal status)와 같은 다른 인자들을 본 발명의 방법을 통한 유방암 예후 평가시에 고려할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 방법을 통해 수득한 환자 데이타는 임상 정보 분석 및 기존의 유방암 예후 테스트와 커플링시켜, 기준 시험 예후 알고리즘을 개발할 수 있다. 이러한 알고리즘에서는 유방암 환자, 특히 초기 단계의 유방암 환자를 예후가 양호한 집단과 양호하지 않은 집단으로 분류하는데 사용된다. 예후가 양호하지 않은 것으로 분석된 환자는 보다 적극적인 유방암 치료로 옮겨갈 수 있다.

본 발명의 방법은 그외 공지된 예후 표시자(예, 림프절 관여, 종양 크기, 조직학적 등급, 에스트로겐 및 프로게스테론 리셉터 수치, Her2/neu 상태, 종양 배수성 및 가족력) 분석에 비하여, 유방암 예후 분석에 보다 우수하다. 본 발명의 특정 예에 있어서, 민감도 및 특이도는 공지된 암 예후 평가 방법과 동일하거나 보다 우수하다. 특이도 및 민감도를 분석하기 위한 최종 목적은 본 발명의 방법을 이용하여(즉, 진단시나 또는 진단후 가까운 시기에) 예측한 예후 또는 결과를 실제 임상 결과(즉, 특정 기간동안 환자가 완치 상태로 있거나 또는 재발할지)를 비교하는 것이다. 본원에서, "특이성"은 본 발명의 방법이 진음성을 정확하게 구별할 수 있는 수준을 나타낸다. 임상 연구에서, 특이도는 진음성과 위양성의 합으로 진음성을 나누어 계산한다. "민감도"는 본 발명의 방법이 진양성인 샘플을 정확하게 동정할 수 있는 수준을 의미한다. 민감도는 임상 연구에서 진양성과 위음성의 합으로 진양성을 나누어 계산한다. 일부 예에서, 본 발명의 유방암 평가 방법의 민감도는 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다. 나아가, 본 발명의 특이도는 바람직하게는 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다. 다른 예에 있어서, 본 발명의 예후 방법의 민감도 및 특이도 혼합치를 분석한다. "민감도 및 특이도 혼합치"는 전술한 바와 같이 개별적인 특이도 및 민감도 수치의 합이다. 본 발명의 민감도 및 특이도 혼합치는 바람직하기로는 적어도 약 105%, 110%, 115%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160% 또는 그 이상이다.

본원에서, "진" 및 "위" 양성 및 음성의 정의는 고려중인 바이오마커 또는 바이오마커의 조합물이 양호한 결과는 또는 양호하지 않은 결과를 보이는 바이오마커인지에 따라 결정된다. 즉, 양호한 결과는를 보이는 바이오마커(즉, 양호한 예후를 나타내는 것)의 경우, "진양성"은 본 발명의 방법에 의해 결정된(예, 면역조직화학에 의한 양성 염색) 목적 바이오마커의 과다 발현을 보이는 샘플로서, 실제 검증된 양호한 임상 결과를 갖는 샘플을 지칭한다. 반대로, "위양성"은 결과가 양호한 바이오마커(들)의 과다 발현을 보이지만, 실제 임상 결과는 나쁘다. 양호한 결과는를 나타내는 바이오마커의 "진음성" 및 "위음성"은 바이오마커의 과다 발현을 나타내지 않으며(예, 면역조직화학 방법에서 양성으로 염색되지 않으며), 각각 실제 검증된 양호하지 않은 및 양호한 임상 결과를 갖는다.

유사하게, 양호하지 않은 결과를 나타내는 바이오마커 경우에, "진양성"은 실제 검증된 양호하지 않은 임상 결과를 가지는 대상 바이오마커 또는 대상 바이오마커의 조합을 과다 발현하는 샘플을 나타낸다. 즉, 양호한 및 양호하지 않은 결과를 나타내는 바이오마커에서 "진양성"은 실제 임상 결과를 정확하게 (즉, 양호한 또는 양호하지 않은) 예측하는 샘플을 의미한다. "위양성"은 양호하지 않은 결과를 나타내는 바이오마커의 과다 발현을 보이지만, 실제는 검증된 양호한 임상 결과를 가진다. 양호하지 않은 결과를 나타내는 바이오마커에서 "진음성" 및 "위음성"은 바이오마커 과다 발현을 보이지 않으며, 각각 실제는 양호한 및 양호하지 않은 검증된 임상 결과를 가진다.

유방암은 예컨대, 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 또는 이의 일부 조합을 포함할 수 있는 여러가지 대안적인 전략에 의해 관리된다. 당업계에 알려진 바와 같이, 개별적인 유방암 환자에 대한 치료법 결정은 관련된 림프절 수, 에스트로겐 및 프로게스테론 리셉터 상태, 원발성 종양의 크기 및 진단시 질병 단계를 토대로 할 수 있다. 다양한 임상 인자 및 임상 시험 분석을 통해, St. Gallen Conference (2001)의 International Consensus Panel은 초기 단계의 유방암에 대한 권고안 및 치료 지침안을 개발시켰다. Goldhirsch et al. (200I) J. Clin. Oncol. 19:3817-3827을 참조하며, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 발명에 포함된다. 상기 지침안은 림프절 음성인 유방암 환자에 대한 치료법은 베이스라인 예후에 따라 실질적으로 다양함을 나타낸다. 보다 적극적인 치료법은 비교적 재발 위험성이 낮은 환자와 비교하였을때 비교적 재발 위험성이 높은 환자에게 권고된다. 고위험 집단에 대한 화학치료는 재발 위험성을 감소시키는 것으로 임증되었다. 저위험 범주의 여성은 일반적으로 방사선 및 호르몬 치료를 받는다. 본 발명의 방법을 이용하여 진단시에 환자를 예후가 양호하지 않은 또는 양호한 위험군으로 분류하는, 추가적인 또는 대안적인 치료 결정-형성 인자를 제공할 수도 있다. 본 발명의 방법은 재발할 가능성이 높은 환자(즉, 진단시에 추가적인 적극적인 치료가 필요하거나 이로울 수 있는 환자)로부터 예후가 양호한 유방암 환자를 구별한다. 본 발명의 방법은 초기 단계의 유방암 환자에 대한 적정 치료법을 선택하는데 특히 유용하다. 전술한 바와 같이, 질병의 초기 단계에서 진단된 유방암 환자 대부분은 수술 및/또는 방사선 요법 이후에도 추가적인 보조 요법 없이도 장기간 생존한다. 이러한 환자의 상당 %(약 20%)는 그러나, 암이 재발하거나 또는 사망에 이르게 되므로, 그 결과, 초기 단계 유방암 환자 일부 또는 전부에게 임상적으로 보조 요법(예, 화학요법)을 권고하게 된다. 본 발명의 방법은 고위험성, 양호하지 않은 예후를 갖는 초기 단계의 유방암 환자를 집단을 구별하여, 어떤 환자가 지속적 및/또는 보다 적극적인 요법으로 치료할 경우에 효과적인지 결정하고, 치료 후 면밀한 감시에 사용된다. 예컨대, 본 발명의 방법에 따라 양호하지 않은 예후를 가지는 것으로 분석된 초기 단계의 유방암 환자는 수술 및/또는 방사선 치료 이후에 보다 적극적인 보조 요법, 예컨대 화학치료에 선택될 수 있다. 특정 예에서, 본 발명의 방법은 St. Gallens Conference에서 수립된 치료 지침안과 병용 사용하여, 의사는 충분한 정보에 입각한 유방암 치료법을 결정할 수 있다. 유방암 예후를 평가하기 위한 본 발명의 방법은 또한 유방암 적정 치료법을 선별하기 위하여, 다른 예후 방법과 당업계에 공지된 분자 마커(예, Her2/neu, Ki67, 및 p53 발현 수준) 분석과 조합될 수 있다. 나아가, 본 발명의 방법은 당업계에 현재 공지되어 있지 않은 이후 개발된 예후 방법 및 분자 마커 분석 방법과 조합될 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 치료법을 선택하기 위해 유방암 환자의 반응을 예측하는데 사용된다. "선택적 치료법에 대한 유방암 환자의 반응 예측"은 환자가 특정 치료법으로 양성 또는 음성 결과를 보일 가능성을 분석하는 것을 의미한다. 본원에서, "양성 치료 결과를 나타내는"은 환자가 선택된 치료법(예, 완전 또는 부분 소강, 종양 크기 감소 등)으로 인해 이로운 결과를 경험할 가능성 증가를 의미한다. "음성 치료 결과를 나타내는"는 환자가 대상 유방암의 진행과 관련된 선택 치료법이 이롭지 않을 가능성 증가를 의미한다. 본 발명의 일부 측면에서, 선택한 치료법은 화학요법이다.

특정 예에서, 유방암 환자의 생존 가능성을 예측하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은 장기간, 무병 생존할 가능성을 예측하는데 사용될 수 있다. "유방암 환자의 생존 가능성 예측"에 의해 환자가 겪고 있는 유방암으로 인해 사망할 위험성을 평가한다. "장기간, 무병 생존"은 환자가 초기 진단 또는 치료 이후에 적어도 5년 이내에, 더 구체적으로는 적어도 10년 또는 그이상 기간내에 격고 있는 유방암이 재발하거나 유방암으로 죽지 않는 것을 의미한다. 유방암 환자의 생존 가능성을 예측하는 이러한 방법은 환자 샘플에서 다수개의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 생존 가능성, 특히 장기간, 무병 생존할 가능성은 환자의 샘플내 과다 발현되는 것으로 측정된 바이오마커의 수가 증가할수록 감소한다. 예컨대, 본 발명의 일 측면에서, 5개 이상의 바이오마커 발현이 측정되며, 모든 바이오마커의 과다 발현은 생존 가능성 증가를 나타내지 않으며, 2개 이상의 바이오마커의 과다 발현은 생존 가능성 감소를 나타낸다. 생존 가능성은 예컨대 당업계에서 유용한 유방암 생존 통계에 비교하여 평가될 수 있다. 다른 예에서, 유방암 환자의 생존 가능성 예측 방법은 6개 이상의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계, 및 과다 발현되는 이들 바이오마커의 수를 평가하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에 사용가능한 바이오마커는, 예컨대, E2F1, SLPI, MUC-1, src, p21ras, 및 PSMB9 중에서 선택될 수 있다. 일반적으로 실시예 8 및 9를 참조한다.

본 발명의 바이오마커는 유전자 및 단백질을 포함한다. 이러한 바이오마커는 바이오마커를 코딩하는 핵산 서열의 전장 또는 일부 서열이나, 또는 이러한 서열의 상보체를 포함하는 DNA를 포함한다. 또한, 바이오마커 핵산은 목적한 임의의 핵산 서열의 전장 또는 일부 서열을 포함하는 RNA를 포함한다. 바이오마커 단백질은 본 발명의 DNA 바이오마커에 의해 코딩되는 또는 대응하는 단백질이다. 바이오마커 단백질은 임의의 바이오마커 단백질 또는 폴리펩티드의 전장 또는 일부 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 바이오마커 유전자 및 단백질의 단편 및 변이체는 본 발명에 포함된다. "단편"은 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 아미노산 서열의 일부와 그로부터 코딩된 단백질을 의미한다. 바이오마커 뉴클레오티드 서열의 단편인 폴리뉴클레오티드는 적어도 10, 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 또는 1,400개의 연속 뉴클레오티드 또는 일반적으로 본원에 기재된 전장 바이오마커 폴리뉴클레오티드에 존재하는 최대 갯수의 뉴클레오티드를 포함한다. 바이오마커 폴리뉴클레오티드의 단편은 일반적으로 적어도 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 또는 250개의 연속 아미노산 또는 일반적으로 본 발명의 전장 바이오마커 단백질에 존재하는 아미노산 총 수를 최대로 코딩할 것이다. "변이체"는 실질적으로 동일한 서열을 의미한다. 일반적으로, 본 발명의 특정 바이오마커의 변이체는 서열 정렬 프로그램에 의해 결정된 바대로, 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 바이오마커의 서열과 서열 동일성을 가질 것이다.

"바이오마커"는 조직 또는 세포내 유전자나 단백질의 발현 수준이 정상 또는 건강한 세포 또는 조직의 유전자나 단백질에 비해 변형된 임의의 유전자 또는 단백질이다. 본 발명의 바이오마커는 그것의 과다 발현이 암, 특히 유방암 예후와 관련있는 유전자 및 단백질이다. 특정 예에서, 환자 샘플에서 대상 바이오마커나 바이오마커의 조합의 선택적인 과다 발현은 불량한 암 예후를 나타낸다. "불량한 예후를 나타내는"은 특정 바이오마커 또는 바이오마커의 조합 발현은 본원에서 원인 암 또는 종양의 재생 또는 재발, 전이 또는 사망 가능성 증가와 관련있음을 나타낸다. 예컨대, "불량한 예후를 나타내는"은 5년 이내에, 보다 구체적으로 10년 이내에 원인 암 또는 종양의 재생 또는 재발, 전이 또는 사망 가능성을 의미할 수 있다. 불량한 예후를 나타내는 바이오마커는 "양호하지 않은 예후를 나타내는 바이오마커"로 지칭할 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 대상 바이오마커 또는 바이오마커의 조합의 과다 발현 부재는 양호한 예후를 나타낸다. 본원에서, "양호한 예후를 나타내는"은 환자가 전술한 바와 같이 암이 없는 상태로 있게 될 가능성 증가를 의미한다. 일부 예에서, "양호한 예후를 나타내는"은 환자가 적어도 5년간, 보다 구체적으로는 적어도 10년간 암이 없는 상태로 있게 될 가능성 증가를 의미한다. 이러한 바이오마커는 "양호한 예후를 나타내는 바이오마커"라 할 수 있다.

본 발명의 바이오마커는 전술한 바와 같이, 유방암 예후와 그것의 과다 발현이 관련있는 임의의 유전자 또는 단백질을 포함한다. 바이오마커는 불량한 유방암 예후를 나타내는 유전자 및 단백질(즉, 양호하지 않은 예후를 나타내는 바이오마커) 뿐만 아니라 양호한 예후를 나타내는 유전자 및 단백질(즉, 양호한 예후를 나타내는 바이오마커)을 포함한다. 특정 대상 바이오마커는 세포 성장 및 증상의 조절, 세포 주기 조절, DNA 복제 및 전사, 세포자멸, 신호 전달, 혈관신생/림프구 형성 또는 전사에 관여하는 유전자 및 단백질을 포함한다. 일부 예에서, 바이오마커는 조직 리모델링, 세포외 기질 분해 및 인접 조직 침투에 관여할 프로테아제 시스템을 조절한다. 그 과다 발현이 유방암 예후를 나타내는 임의의 바이오마커를 사용하여, 본 발명을 실시할 수 있지만, 특정 예에서, 바이오마커는 SLPI, p21ras, MUC-1, DARPP-32, phospho-p27, src, MGC 14832, myc, TGFβ-3, SERHL, E2F1, PDGFRα, NDRG-1, MCM2, PSMB9, MCM6, 및 p53로 이루어진 군으로부터 선택된다. 표 43을 참조한다. 일부 예에서, 목적 바이오마커는 SLPI, PSMB9, phospho-p27, src, E2F1, p21ras, 또는 p53을 포함한다. 본 발명의 일 측면에서, 유방암 예후 평가 방법은 E2F1 및 SLPI의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 이러한 바이오마커중 하나 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타낸다. 다른 예에서, 상기 방법은 E2F1, src, 및 SLPI의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 2개 이상의 바이오마커의 과다 발현은 불량한 유방암 예후를 나타낸다. 다른 예에서, 본 발명의 방법은 E2F1, src, PSMB9, 및 SLPI의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 이들 2개 이상의 바이오마커의 과다 발현은 불량한 유방암 예후를 나타낸다. 본 발명의 다른 측면에서, E2F1, SLPI, PSMB9, p21ras, 및 src의 발현을 검출하며, 이들 2개 이상의 바이오마커의 과다 발현은 불량한 예후를 나타낸다. 다른 예에서, 상기 방법은 환자 샘플에서 SLPI, p21ras, E2F1, PSMB9, phospho-p27, 및 src의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 이들 4개 이상의 바이오마커의 과다 발현은 불량한 예후를 나타낸다.

다른 예에서, 목적 바이오마커는 E2F1, SLPI, MUC-1, src, p21ras, 및 PSMB9을 포함한다. 본 발명의 일 측면에서, 유방암 예후 평가 방법은 E2F1 및 SLPI의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커 중 1종 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타낸다. 다른 예에서, 상기 방법은 E2F1, SLPI, 및 PSMB9의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커 중 2종 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타낸다. 다른 예에서, 본 발명의 상기 방법은 E2F1, SLPI, MUC-1, 및 src의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커 중 2종 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타낸다. 본 발명의 다른 측면에서, E2F1, SLPI, MUC-1, src, 및 p21ras의 발현을 검출하며, 상기 바이오마커 중 2종 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타낸다. 또다른 예에서, 상기 방법은 환자 샘플에서 E2F1, SLPI, MUC-1, src, p21ras, 및 PSMB9의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커 중 4종 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타낸다.

분비성 백혈구 단백질분해효소 저해제(SLPI)는 백혈구 엘라스타제, 트립신, 키모트립신 및 카텝신(cathepsin)(예, 카텝신 G)를 포함하는 다수개의 프로테아제를 불활성화할 수 있는 비특이적인 저해제이다. SLPI은 염증 및 조직 재생과 관련된 염증 반응에 참여하는 것으로 알려져 있다. 프로테아제 저해제는 일반적으로 종양 예후 및 전이를 방해하는 것으로 고려되고 있다. 그러나, 종양내 세린 프로테아제 저해제(SPI)의 발현은 종종 암 환자의 불량한 예후와 관계있다. 카텝신 G는 유방암에서 과다 발현되며, 불량한 예후의 표시자이다. 이의 저해 효과는 내인성 단백질분해 효소에 의한 공격으로부터 상피 표면을 방어함으로써 면역 반응에 기여한다. SLPI의 유전자 위치는 20q12이며, 이 부위는 유방암 염색체 변형 및 비정배수(aneuploidy)와 관련있는 염색체 부위이다.

PSMB9는 T1B라고도 알려져 있는 20S 코어 베타 서브유닛인 프로테아좀 B 형 패밀리의 일원이다. 이 유전자는 MHC(주조직친화성 복합체)의 클래스 II 부위에 위치되어 있다. 이 유전자의 발현은 감마 인터페론에 의해 유도되며, 이 유전자 산물은 면역프로테아좀에서 촉매성 서브유닛1(프로테아좀 베타 6 서브유닛)을 대체한다. 단백질 분해 과정은 성숙형 서브유닛을 제조하는데 필요하다.

NDRG-1(N-Myc 하방 조절(downstream regulated))은 세포 분화중에 상향 조절되며, 배아 세포에서 N-myc 및 c-myc에 의해 억제되며, 그리고 몇 종의 종양 세포에서 억제된다. 과다 발현은 저산소증(hypoxia)과 이후의 혈관신생을 유발하는 시그널링과 관련있을 수 있다. 저산소증은 전사 인자 저산소증 유발성 인자1(HIF-1)의 축적을 초래하며, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 NDRG-1에 대한 유전자와 같은 저산소증 유발성 유전자가 발현되게 된다. NDRG-1은 일부 유방암에서 과다 발현된 mRNA로 발견된다. NDRG-1은 c-myc 유전자에 인접한 염색체 8q24에 위치되어 있다.

MUCl은 유선 및 일부 조혈 세포를 포함하는 대부분의 분비성 상피에서 발현되는 과하게 O-당화된 트랜스멤브레인 단백질이다. 이것은 수유기 유선에서 다량 발현되며, 90% 이상의 유방 종양 및 전이에서 과다 발현된다. 정상적인 유선에서, 이는 선 상피의 최정점 표면에서 발현된다.

p27은 세포 주기의 주요 조절자이며 G1에서 S 단계로의 진행에 관여한다. 인는 G1기 동안에 사이클린 E/cdk2 복합체와 특이적으로 상호작용하며, 또한 D 타입의 사이클린-cdks와도 상호작용한다. p27은 Cdks에 의해 트레오닌 187에서 인산화된다. p27의 트레오닌 187번의 인산화 또한 세포 주기 의존적이며, G1 세포에서는 검출되지 않지만 증식성 세포에는 존재하고 있다. p27 분해 활성화는 증식성 세포와 많은 공격적인 인간 종양 타입들에서 관찰된다. p27의 과다 발현은 세포자멸 저해 및 일부 화학요법에 대한 내성을 유도할 수 있다.

Src 계열의 단백질 티로신 키나제(Src, Lyn, Fyn, Yes, Lck, B1k, Hck, 등 포함)는 진핵 세포의 증식 및 분화 조절에 중요하다. Src 활성은 상반된 효과를 가지는 두가지 부위에서 타이로신 인산화에 의해 조절된다. 키나제 도메인의 활성화 루프에서의 Tyr416 인산화는 효소에 의해 상향 조절된다. Csk에 의한 C-말단 테일에서의 Tyr527 인산화는 효소의 활성을 약하게 한다.

E2F1은 G1 및 S기의 사이클린, 특히 사이클린 D1 조절에 관여하는 전사 인자 계열의 일원이다. 이들 단백질은 세포 주기 조절의 Rb 경로 및 DNA 합성 조절에 관여한다. 세포 주기의 G1기에서, E2F 전사 인자는 Rb 종양 억제자 단백질과 불활성 복합체 형태로 결합된다. 세포 주기 Gl/S 경계 시기에, Rb 단백질은 과다인산화되어 그것의 저해 복합체로부터 E2F 전사 인자를 방출한다. 이후, E2F 전사 인자는 세포 주기 S 기에 반응성이 있는 이들 유전자에 대한 전사를 활성화하며, 주로 DNA 합성을 개시하고 유사 분열과 이후의 세포 분열을 준비한다. E2F1의 과다 발현은 p16 관련된 전사체의 유도와 커플링된 사이클린 D1 의존적 키나제 활성의 저해를 통해 세포자멸을 유도할 것으로 보여졌다. 또한, 전사 수준에서의 E2F1, E2F1 단백질 수준의 조절 역시 유비퀴틴 프로테오좀 의존적 분해 경로에 의해 조절된다. 유비퀴틴화는 세포 주기 진행을 직접적으로 조절하는 Rb 및 E2F1 복합체에 의해 차단된다.

p21ras는 신호 전달에 참여하는 거대 세포질 단백질 군의 일원이다. 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질(G 단백질)은 신호 전달에 참여하는 진핵 세포에 존재하는 거대 세포질 단백질 군을 포함한다. 이는 큰 헤테로트리머 G 단백질과 좀더 작은 모노머 형태의, 2가지 형태가 있다. 3 ras 종양 유전자들, H-ras, K-ras 및 N-ras는 좀더 작은 G 단백질의 일원으로, 각각 염색체 11, 12 및 1에 위치되어 있다. 이들은 p21이라고 하는 21 kD 단백질을 코딩한다. p21 ras 단백질은 정상적인 세포 성장, 프로테아제 활성 및 세포 부착에 참여한다.

종합적으로, 3가지 형태의 p21 ras는 리간드 매개성 세포외 리셉터 활성화를 세포내 티로신 키나제 활성화와의 연결에 의해 기능하며, DNA 복제, 증식 및 고정 의존적 성장을 포함한 유방암 진행과 관련있는 다수의 세포 과정을 개시한다. K- 및 H-ras 유전자는 유방암에 가장 흔히 연루되어 있다. 이들 ras 유전자 모두, 코돈 12 및 13의 돌연변이가 일반적이다. 이러한 기능 획득(gain-of- function) 돌연변이는 ras 시그널링 경로내에서 정상적인 리간드-유도성 신호 전달과 커플링되지 않는 지속적인 활성을 초래한다. 유방암에서 N-ras의 관여는 흔하지 않다. 유방암에서 N-ras 관련된 변화에 대해 2가지 기전이 보고되어 있다: 전술한 K- 및 H-ras 돌연변이와 유사한, 종양 유전자의 지속적인 활성화를 형성하는 코돈 61번의 돌연변이 및 염색체 증폭. 더욱이, 세포내 신호 경로의 활성화 뿐만 아니라, ras 종양 유전자는 조직 리모델링 및 침입에 중요한 프로테아제 과다 발현을 유도하는 것으로 보고되었다. H-ras는 매트릭스 메탈로프로테아제-2(MMP-2) 과다 발현과 관계있고, N-ras는 MMP-9의 과다 발현과 관련있다. 일반적으로, Correll and ZoIl (1988) Human Genetics 79:225-259; Tong et al. (1989) Nature 337:90-93; Watson et al (1991) Breast Cancer Res. Treat. 17:161-169; Dati et al. (1991) Int. J. Cancer 47:833-838; Archer et al. (1995) Br. J. Cancer 72:1259-1266; Bland et al. (1995) Ann. Surg. 221:706-718; Shackney et al. (1998) Clin. Cancer Res. 4:913-928; 및 Gohring et al. (1999) Tumor Biol. 20:173-183을 참조하며, 이들 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. p21ras 단백질의 모든 형태(즉, H-, K-, N-ras) 검출은 본 발명에 포함된다.

미니크로좀 유지(minichromosome maintenance, MCM) 단백질은 진핵생물의 DNA 복제에 필수적인 역할을 수행한다. 각 MCM 단백질은 그것의 매우 보존적인 중추적인 도메인에 DNA 의존적 ATPase 모티프를 가지고 있다. MCM 단백질의 농도는 일반적으로 정상 세포가 G0에서 세포 주기의 Gl/S기로 진행됨에 따라 다양한 방식으로 증가된다. G0기에서, MCM2 및 MCM5 단백질은 MCM7 및 MCM3 단백질에 비해 훨씬 덜 풍부하다. MCM6은 MCM2, MCM4, 및 MCM7과 복합체를 형성하며, 히스톤 H3에 결합한다. 또한, MCM4, MCM6, 및 MCM7의 서브복합체는 헬리카제 활성을 가지며, 이는 MCM6의 ATP 결합 활성과 MCM4의 DNA 결합 활성에 의해 매개된다. 예컨대, Freeman et al (1999) CHn. Cancer Res. 5:2121-2132; Lei et al. (2001) J. Cell Sci. 114:1447-1454; Ishimi et al. (2003) Eur. J. Biochem. 270:1089-1101을 참조하며, 이들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.

DARPP32는 그 생물학적 기능 및 저해 활성이 DARPP32 단백질내 특이적인 아미노산 잔기의 인산화에 의해 조절되는 단백질 포스페타제 1 저해제이다. 트레오닌 34(T34) 인산화는 DARPP32 단백질을 특이적인 단백질 포스파타제 1 저해제로 만든다. 그러나, 트레오닌 75(T75) 인산화는 DARPP32를 단백질 키나제 A(PKA)의 저해제로 만든다. DARPP32의 유전자 위치는 17q21.2이며, 이는 17ql2의 her2/neu(c-erb-B2 리셉터 타이로신 키나제)에 인접해 있는 것으로 알려져 있다. 상기 부위는 25-35% 이내의 유방암 환자에서 유방암 염색체 증폭 및 불량한 결과와 관련있다. 수종의 공개문헌들은 유방암에서의 상기 17ql2-21 앰플리콘(amplicon)의 특이적인 전사 활성화와 이 앰플리콘에 위치한 다수의 유전자들이 과다 발현됨을 입증하였다.

p53은 세포에서 여러가지 기능을 한다. 천연형에서 높은 수준으로 발현되지만 돌연변이에서는 그렇지 않은, p53은 두가지 결과를 가져온다: 세포 주기 정지 및 세포자멸. DNA 손상물질이 세포에서의 p53의 농도 증가를 유도한다는 사실은 아마도 효모에서 fad9 유전자의 산물과 유사하게 p53의 체크포인트 인자로서의 기능을 끌어내었다. 유전자독성 스트레스에 대한 반응시, 생존에 중요하지 않지만, p53은 "긴급 브레이크(emergency brake)"로서 기능하여, 정지 또는 세포자멸중 어느 하나를 유도하여, 과도한 돌연변이의 축적으로부터 게놈을 보호한다. 이러한 맥락에 부합되게, p53 결핍성 세포는 유전자적으로 불안정하여, 종양으로 되기가 더욱 쉬운 것으로 나타났다. p53 단백질은 세포의 핵내에 위치하며, 매우 가변적이다. p53은 거의 인간 종양의 50%에서 주로 DNA 결합 도메인 코돈이 돌연변이되어 있다.

전술한 바이오마커는 상세하게 논의하였으나, 과다 발현이 유방암 예후를 나타내는 모든 바이오마커를 본 발명의 실시에 사용할 수 있으며, 당업계에서 아직 동정되지 않은 바이오마커도 포함한다. 이러한 바이오마커는 예컨대 세포 증식, 세포 주기 조절 또는 일반적인 암 이동성(motility) 및 침투 메카니즘에 참여하는 유전자 및 단백질이다. 가능성 있는 목적 바이오마커로는 사이클로옥시게나제-2(cox-2), rhoC, c-myc, 유로키나제 플라스미노겐 활성자 리셉터(urokinase plasminogen activator receptor, uPAR), 윌름씨 종양 억제자(Wilms' tumor suppressor), akt 키나제 및 오스테오폰틴을 포함한다. 예로, Perou et al. (2000) Nature 406:747-752; Sorlie et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sd. 98:10869-10874; Van't Veer et al. (2002) Nature 415:530-536; Huang et al. (2003) Lancet 361:1590-1596를 참조하며, 이들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.

특정 예에서, 바이오마커는 신호 전달 경로, 예컨대 PI3K 조절 a, LTk, Ser/thr 키나제 15, MAPK8IPI, MAPKAPK2 및 PK428, PRKR에 참여하는 키나제이다. 성장 인자, 세포외 신호 전달 단백질 및 세포외 기질 단백질 역시 목적 바이오마커이다. 이러한 단백질로는 EGFR, 펙터 4와 조합된 TNF 리셉터, 단백질 7에 결합된 GFR7, ErbB2 (her 2), VEGF, GDF1, IGFBP5, EGF8 ras 상동체, MMP 9, MMP 7, SLPI, 케라틴 5, 케라틴 17, 라미닌 감마 2(laminin V), 트로포닌 및 튜불린이 있다.

본 발명의 일부 측면에서, 바이오마커는 예컨대 Cc 관련, HMG 비-히스톤 크로모좀 11, MMD5, MCM5, MCM6, 및 Swi/snf 관련 액틴과 같이 염색체 축합 및 유지에 관여하는 유전자 및 단백질을 포함한다. 센트로미어 및 센트로좀 기능과 관련된, CENPA, CENPF, CENPE, Bub 1, polo계 키나제 및 HsEg5, MCAK, 및 HSET를 포함하는 바이오마커 역시 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 바이오마커는 또한 전사 인자, 특히 세포 주기 조절과 관련된 전사 인자를 포함할 수 있다. 관심있는 인자로는 E2F1, E2F4, NDRG-1, ORC6L, PCNA, 핵 인자 1, EZH2, 및 TFAP2A가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. CDC20, CDC 25B, 사이클린 A2, 사이클린 E, 및 사이클린 F와 같은 사이클린 또한 본 발명의 방법 실시에 사용할 수 있다.

본 발명의 방법은 유방암 예후 평가를 위해 환자 샘플에서의 하나 이상, 보다 상세하게는 2개 이상의 바이오마커의 검출 단계를 필요로 하지만, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 바이오마커를 사용하여 본 발명의 방법을 실시할 수 있다. 샘체 샘플에서 2개 이상의 바이오마커를 검출하는 단계를 사용하여, 암, 특히 유방암 예후를 평가할 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 2개 이상의 바이오마커가 사용되며, 더 바람직하기로는 2 이상의 상보적인 바이오마커가 사용된다. "상보적인"은 신체 샘플에서 바이오마커의 조합을 검출함으로써 단지 하나의 바이오마커를 사용한 경우에 확인되는 경우에 비해 보다 높은 백분율로 암 예후를 정확하게 결정하는 것을 의미한다. 따라서, 일부 경우들에서, 암 예후의 보다 정확한 측정은 적어도 2개 이상의 바이오마커를 이용하여 달성할 수 있다. 따라서, 2개 이상의 바이오마커 단백질이 사용되는 경우, 본 발명의 면역조직화학적인 방법을 실시하기 위해 개별적인 바이오마커 단백질에 대한 적어도 2 이상의 항체가 사용될 것이다. 항체는 신체 샘플과 동시에 또는 연속적으로 접촉될 수 있다.

2개 이상의 바이오마커 조합이 사용되는 경우, 바이오마커는 전형적으로 다른 것에 실질적으로 통계학적으로 독립적일 것이다. "통계학적으로 독립적인" 바이오마커는 그로부터 진행된 예후가 독립적이어서, 하나의 바이오마커가 상보적인 바이오마커에 대한 실질적으로 반복되는 정보를 제공하지 않음을 의미한다. 이는, 예컨대, 두개가 실질적으로 통계학적으로 독립적이지 않은 경우, 바이오마커는 제1 바이오마커와 병용으로 사용되지 않는 것을 의미할 수 있다. 2개의 바이오마커의 의존성은 이들이 중복적이며, 제2 바이오마커의 추가가 주어진 바이오마커 쌍의 예후력에 대한 추가적인 값을 부여하지 않는다는 것을 의미한다. 주어진 패널의 바이오마커의 예후력을 최적화하기 위해, 패널에서 다른 바이오마커와 비교하였을때 중복적인 예후 정보를 제공하는 바이오마커의 사용을 최소화함으로써, 신호 "노이즈" 정도를 감소시키는 것이 적합하다. 통계학적 독립성(Statistical independence)을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 목적 바이오마커의 통계학적 독립성은 예컨대 미국 출원, 표제 "암 예후에 대한 후보 마커 분석 및 최적화를 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램"에 개시된 방법을 포함한, 임의의 방법을 이용하여 평가할 수 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 독립적인, 예후 바이오마커를 사용하여 본 발명을 실시하는 경우, 예후 수치는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상의 바이오마커의 발현 검출에 의해 증가된다. 이러한 경우, 독립적인 바이오마커의 임의 조합이 사용될 수 있다.

또한, 당업자는 바이오마커 패널을 사용하여 본 발명에 따라 유방암 환자의 에후를 평가할 수 있음을 인지할 것이다. 일부 예에서, SLPI, p21ras, MUC-1, DARPP-32, phospho-p27, src, MGC 14832, myc, TGFβ-3, SERHL, E2F1, PDGFRα, NDRG-1, MCM2, PSMB9, MCM6, 및 p53로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 바이오마커를 포함하는 패널이 제공된다. 일 특정 패널 바이오마커는 예컨대 E2F1, SLPI, MUC-1, src, p21ras 및 PSMB9 모두 또는 이들의 서브세트를 포함할 수 있다. 바이오마커의 패널은 목적 바이오마커의 임의 갯수를 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에 있어서, 패널은 2개 이상의 통계적으로 독립적인 예후 바이오마커를 포함한다.

특정 예에서, 유방암 예후 평가 방법은 환자의 신체 샘플, 바람직하기로는 유방 조직 샘플, 더 바람직하기로는 원발성 유방종양 조직 샘플을 수집하는 단계, 상기 샘플을 목적 바이오마커에 특이적인 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계, 항체 결합성을 검출하는 단계 및 상기 바이오마커의 과다 발현을 결정하는 단계를 포함한다. 즉, 샘플은 항체-항원 복합체 형성을 허용하기에 충분한 시간동안 바이오마커 항체와 인큐베이션되며, 항체 결합성은 예컨대 표지된 이차 항체에 의해 검출된다. 항체 결합성에 의해 결정된 양호하지 않은 결과를 나타내는 하나 이상의 바이오마커의 과다 발현을 보이는 샘플은 예후 불량으로 분류된다. 유사하게, 양호한 결과는를 나타내는 하나 이상의 바이오마커의 과다 발현을 보이는 환자 샘플은 예후 좋음으로 분류된다. 나아가, 목적 바이오마커의 임의 조합의 과다 발현은 특이적으로 예후가 양호한 환자들로부터 예후가 불량한 유방암 환자를 식별하는데 사용된다. 본 발명의 일부 측면에서, 상기 방법은 환자 샘플에서 2개 이상의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계 및 상기 바이오마커의 과다 발현을 결정하는 단계를 포함하며, 이들 바이오마커의 전체 또는 일부 서브세트의 과다 발현은 유방암 예후를 나타낸다. 예컨대, 일 예에서, 상기 방법은 SLPI, p21ras, E2F1, PSMB9, phospho-p27 및 src의 발현 검출 단계를 포함하며, 4개 이상의 이들 바이오마커의 과다 발현은 불량한 예후를 나타낸다. 본 발명의 다른 측면에서, 상기 방법은 SLPI, E2F1, 및 src의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 이들 바이오마커의 2 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타낸다. 다른 예에 있어서, 상기 방법은 E2F1, SLPI, MUC-1, src, p21ras, 및 PSMB9의 발현 검출 단계를 포함하며, 이들 바이오마커의 4개 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타낸다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 방법은 SLPI, E2F1, 및 MUC-1의 발현 검출 단계를 포함하며, 이들 바이오마커의 2종 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타낸다.

"신체 샘플"은 바이오마커의 발현을 검출할 수 있는 세포, 조직 또는 체액의 임의 샘플링을 의미한다. 이러한 신체 샘플의 예로는, 혈액, 림프, 뇨, 부인과성 체액(gynecological fluid), 생검 및 스미어(smear)를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 사용가능한 체액으로는 혈액, 뇨, 땀, 유두 흡입물(nipple aspirate) 또는 그외 체액 분비물 또는 그것의 유래물을 포함한다. 혈액은 전혈액, 혈장, 혈청 또는 그외 혈액 유래물을 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 신체 샘플은 유방 세포, 특히 생검 유래의 유방 조직, 보다 구체적으로는 유방 종양 조직 샘플을 포함한다. 신체 샘플은 예컨대 부위를 스크랩핑 또는 스와핑하거나, 바늘을 이용하여 채액을 흡입하거나, 또는 조직 샘플(즉, 생검)를 떼어내거나 하는 방법을 포함한 여러가지 방법으로 환자로부터 수득할 수 있다. 다양한 신체 샘플 수집 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 일부 예에서, 유방 조직 샘플은 예컨대 가는 바늘을 이용한 흡입 생검, 코어 바늘을 이용한 생검 또는 생검 적출에 의해 수득된다. 검사물을 보존하고 시험을 용이하게 하기 위해, 고정 및 염색 용액을 세포 또는 조직에 적용할 수 있다. 신체 샘플, 특히 유방 조직 샘플은 확대 검경을 위해 글라스 슬라이드로 이동시킬 수 있다. 바람직한 예에서, 신체 샘플은 포르말린 고정시킨, 파라핀 포매한, 유방 조직 샘플, 특히 원발성 유방종양 샘플이다.

바이오마커 발현 검출을 위해 당업계에서 이용가능한 임의 방법은 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 바이오마커의 발현은 핵산 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있다. "발현 검출"은 바이오마커 유전자 또는 단백질의 양 또는 존재를 측정하는 것이다. 따라서, "발현 검출"은 바이오마커가 발현되지 않거나, 검출가능한 수준으로 발현되지 않거나, 낮은 수준으로 발현되거나, 정상 수준으로 발현되거나 또는 과다 발현되는 경우를 포함한다. 과다 발현을 결정하기 위해, 검사 대상인 생채 샘플은 건강한 사람 유래의 해당 신체 샘플과 비교할 수 있다. 즉, "정상" 수준 발현은 예컨대 유방암이 없는 인간 대상이나 환자 유래의 유방 종양 샘플에서의 바이오마커의 발현 수준이다. 이러한 샘플은 표준화된 형태로 존재될 수 있다. 일부 예에서, 바이오마커의 과다 발현 결정에는 신체 샘플과 건강한 사람 유래의 대응되는 신체 샘플 간의 비교가 필요한 것은 아니다. 예컨대, 유방 종양 샘플에서 불량한 예후를 나타내는 바이오마커의 과다 발현 검출에는 건강한 사람 유래의 대응되는 유방 조직 샘플과의 비교 필요성을 배제할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 일부 측면에서, 대상 바이오마커나 바이오마커 조합의, 무발현, 과소발현 또는 정상 발현(즉, 과다 발현 없음)은 유방암 환자의 예후에 대한 유용한 정보를 제공한다.

본 발명의 바이오마커 발현 검출 방법은 핵산 또는 단백질 수준 중 어느 하나로 바이오마커의 양 또는 존재를 결정하는 모든 방법을 포함한다. 이러한 방법들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 비제한적으로는 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 서던 블롯, ELISA, 면역침강, 면역형광, 유세포측정, 면역조직화학, 핵산 혼성화 기법, 핵산 역전사 방법 및 핵산 증폭 방법이 있다. 특정 예에서, 바이오마커의 발현은 예컨대 특이적인 바이오마커 단백질에 대한 항체를 이용하여 단백질 수준으로 검출된다. 이러한 항체들은 웨스턴 블롯, ELISA, 면역 침강 또는 면역조직화학 기술과 같은 여러가지 방법에서 사용될 수 있다. 이와 같이, 유방 조직, 특히 유방 종양 조직의 면역염색법은 당업계에 공지된 임상 정보 분석법, 기존의 예후 방법 및 분자 마커의 발현(예, Her2/neu, Ki67, p53, 및 호르몬 리셉터 상태)와 병용할 수 있다. 이러한 방법으로, 본 발명의 방법은 보다 정확한 유방암 예후 결정을 제공할 수 있다.

일 예에서, 바이오마커 단백질에 특이적인 항체를 활용하여 샘체 샘플내 바이오마커 단백질의 발현을 검출한다. 상기 방법은 환자로부터 신체 샘플을 수득하는 단계, 상기 신체 샘플을 SLPI, p21ras, MUC-1, DARPP-32, phospho-p27, src, MGC 14832, myc, TGFβ-3, SERHL, E2F1, PDGFRα, NDRG-1, MCM2, PSMB9, 또는 MCM6에 대한 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 결합성을 검출하여 바이오마커가 환자 샘플에서 과다 발현을 결정하는 단계를 포함한다. 바이오마커 단백질의 과다 발현은 예후, 보다 구체적으로는, 유방암의 양호하지 않은 예후를 나타낸다. 다른 예에서, 본 발명의 방법은 2개 이상의 바이오마커의 발현 검출단계를 포함하며, 상기 바이오마커의 하나 이상의 과다 발현은 예후를 나타낸다. 이러한 방법은 환자 샘플에서의 복수개의 바이오마커의 검출 단계를 포함할 수 있으며, 이는 유방암 예후를 나타내는 이들 바이오마커 전체 또는 그의 서브세트의 과다 발현이다.

본 발명의 일 측면은 유방암 환자의 예후 평가를 위한 면역조직화학 기법을 제공한다. 구체적으로는, 상기 방법은 유방 조직 샘플내에서, 더 구체적으로는 유방 종양 샘플내에서 예후를 나타내는 바이오마커를 항체로 염색하는 단계를 포함한다. 당업자라면 하기 기술한 면역조직화학적 방법은 수동으로, 또는 예컨대 Autostainer Universal Staining System (Dako)을 이용하여 자동화된 방법으로 수행할 수 있음을 알 것이다. 유방 조직 샘플의 항체 염색의 한가지 프로토콜은 실시예 1에 제공되어 있다.

한가지 면역조직화학적 방법에 있어서, 환자 유방 조직 샘플은 예컨대 당업계에 공지된 생검 기술에 의해 수집된다. 샘플은 이후 제조를 위해 동결되거나 또는 고정 용액에 즉시 위치시킬 수 있다. 조직 샘플은 포르말린, 글루테르알데하이드, 메탄올 또는 유사 물질과 같은 시약으로 처리하여 고정시키고, 파라핀으로 포매할 수 있다. 포르말린으로 고정시킨 파라핀 포매 조직 샘플로부터 면역조직 화학적 분석을 위한 슬라이드 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

일부 예, 특히 본 발명의 면역조직화학적 방법에서, 샘플은 바이오마커 항체를 항체 결합에 접근가능하게 하기 위해 변형될 필요가 있을 수 있다. 예컨대 조직 샘플의 포르말린 고정으로 항원 부위의 은폐(masking) 또는 파괴를 유도하여, 이후 불량한 항체 염색 결과를 형성할 수 있는 광범위의 단백질 가교가 발생된다. 본원에서, "항원 복구(antigen retrieval)" 또는 "항원 노출(antigen unmasking)"은 예컨대 포르말린 고정시킨 파라핀 포매의 조직 샘플에서 항원 접근성을 증가시키거나 항원성을 회복시키는 방법을 의미한다. 항체 결합에 보다 접근성이 높은 항원을 제조하는 모든 방법을 본 발명의 실시에 사용할 있으며, 당업계에 공지된 항원 복구 방법을 포함한다. 예로, Hanausek and Walaszek, eds. (1998) Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc., Totowa, New Jersey); and Shi et ah, eds. (2000) Antigen Retrieval Techniques: Immunohistochemistry and Molecular Morphology (Eaton Publishing, Natick, MA)을 참조하며, 이들 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 발명에 포함된다.

항원 복구 방법은 단백질분해 효소(예, 트립신, 키모트립신, 펩신, 프로나제 등) 또는 항원 복구 용액을 처리하는 방법이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 대상 항원 복구 용액으로는, 예컨대 시트레이트 완충액, pH 6.0 (Dako), 트리스 완충액, pH 9.5(Biocare), EDTA, pH 8.0(Biocare), L.A.B.("Liberate Antibody Binding Solution;" Polysciences), 항원 복구 Glyca 용액(Biogenex), 시트레이트 완충 용액, pH 4.0(Zymed), Dawn^® 세정제(Proctor & Gamble), 탈이온수 및 2% 빙초산(glacial acetic acid)이 있다. 일부 예에서, 항원 복구 방법은 항원 복구 용액을 포르말린 고정시킨 조직 샘플에 적용하는 단계 및 상기 샘플을 오븐(예, 6O℃), 스티머(예, 95℃), 또는 압력기(예, 12O℃)에서 정해진 기간동안 특정 온도에서 열처리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 항원 복구 방법은 실온에서 수행될 수도 있다. 인큐베이션 시간은 선정된 구체적인 항원 복구 용액 및 인큐베이션 온도에 따라 변경될 것이다. 예로, 항원 복구 용액은 적어도 5, 10, 20, 또는 30 분동안 또는 최대 하룻밤동안 샘플에 적용시킬 수 있다. 적합한 항원 복구 용액 및 최적 인큐베이션 시간과 온도를 결정하기 위한 분석 설계는 당업자의 일반적인 능력 범위내에서 표준적이며 자명하다

항원 복구 이후에, 적정 블롯킹제, 예로 하이드로겐 페록사이드를 이용하여 샘플을 블롯킹한다. 대상 바이오마커에 대한 항체를 이후 샘플과 항원-항체 결합이 가능한 충분한 시간동안 인큐베이션한다. 전술한 바와 같이, 당업자는 보다 정확한 유방암 예후는 일부 경우들에서 환자 샘풀내에서 2개 이상의 바이오마커의 과다 발현을 검출함으로써 수득할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 특정 예에서, 2 이상의 개별적인 바이오마커에 대한 2 이상의 항체를 사용하여 유방암 환자의 예후를 평가한다. 2 이상의 항체를 사용하는 경우, 이들 항체는 개별 항체 시약으로서 연속적으로 또는 항체 칵테일로서 동시에 단일 샘플에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 각각의 개별 항체는 단일 환자 샘플 유래의 분리한 조직 단편에 첨가하고, 수득되는 데이타를 모울 수 있다.

항체 결합 검출법은 당업계에 잘 알려져 있다. 대상 바이오마커의 항체 결합은 항체 결합 수준에 대응하는 검출가능한 신호를 형성하는 화학 시약을 사용함으로써 따라서 바이오마커 단백질 발현 수준을 검출할 수 있다. 예컨대, 항체 결합은 표지된 폴리머가 접합된 이차 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 표지된 폴리머의 예로는, 폴리머-효소 접합체가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이러한 복합체에서 효소는 전형적으로 항원-항체 결합부에서 발색단의 침착(deposition)을 촉매화하는데 사용되며, 그로 인해 대상 바이오마커의 발현 수준에 해당되는 세포 염색이 이루어진다. 구체적인 대상 효소로는 호르세라디시 페록시다제(HRP) 및 알칼린 포스파타제(AP)가 있다. 시중의 항체 검출 시스템, 예컨대 Dako Envision+ system 및 Biocare Medical's Mach 3 system을 본 발명의 실시에 사용할 수 있다.

본 발명의 한가지 면역조직화학적 방법에 있어서, 바이오마커에 결합하는 항체는 이차 항체가 접합된 HRP 표지된 폴리머를 사용함으로써 검출한다. 슬라이드는 발색단 3,3-디아미노벤지딘(DAB)을 이용하여 항체 결합에 대해 염색하고, 이후 헤마톡실린으로 대조 염색하며, 선택적으로 암모늄 하이드록사이드 청색화제(bluing agent)로 염색한다. 본 발명의 일부 측면에서, 병리학자는 세포 염색(즉, 바이오마커 과다 발현)을 분석하고 유방암 예후를 평가하기 위해 슬라이드를 현미경으로 검경한다. 대안적으로, 자동 현미경이나 개인이 양성 염색 세포 구별을 용이하게 하는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 슬라이드를 관찰할 수 있다.

용어 "항체" 및 "항체들"은 폭넓게 자연적으로 형성되는 항체 형태들 및 재조합 항체들, 예컨대 단쇄 항체들, 키메라 및 인간화된 항체들, 다중 특이성 항체들 및 전술한 것의 단편 및 유도체들을 포함하며, 상기 단편 및 유도체들은 항원 결합 부위를 1곳 이상 포함한다. 항체 유도체들은 항체에 접합된 단백질 또는 화학 모이어티를 포함할 수 있다.

"항체들" 및 "면역글로불린(Ig)"은 동일한 구조 특징을 가진 당단백질이다. 항체들이 항원에 대한 결합 특이성을 나타내지만, 면역글로불린은 항체 및 그외 항원 특이성이 결손된 그외 항체 유사 분자 둘다를 포함한다. 후자 종류의 폴리펩티드는 예컨대, 림프계에서 낮은 수준으로 생산되며, 골수종에서 높은 수준으로 생산된다.

용어 "항체"는 본원에서 광의의 의미로 사용되며, 완전히 조합된 항체, 항원에 결합할 수 있는 항체 단편(예, Fab', F'(ab)₂, Fv, 단쇄 항체, 디아바디(diabody)), 및 전술한 것을 포함하는 재조합 펩티드를 포괄한다.

용어 "단일클론 항체"는 본원에서 실질적으로 동종의 항체 집단, 즉 소량 존재할 수 있는 자연적인 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단을 포함하는 개별 항체로 구성된 집단으로부터 수득된 항체를 의미한다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하기로는 항원-결합부 또는 무손상 항체의 가변부를 포함한다. 항체 단편의 예는, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; DB(diabody); 선형 항체(Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적인 항체들이 있다. 항체를 파파인으로 분해하면, 각각이 단일 항원-결합부를 가지고 있는 두개의 동일한 항원-결합 단편, "Fab" 단편과, 그 이름에서 35 결정화 능력을 반영하는 "Fc"가 형성된다. 펩신 처리시 두개의 항원-조합 부위를 가지며 항원 교차 연결 가능한 F(ab')2 단편이 형성된다.

"Fv"는 완전한 항원 인지부 및 결합부를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 2쇄의 Fv 종에서, 이들 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 다변 도메인의 비공유성 조합에 의해 견고하게 이루어진 이량체로 구성되어 있다. 단쇄 Fv 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경좨 가변성 도메인은 유연한 펩티드 링커에 의해 공유결합으로 연결되어, 경쇄 및 중쇄가 2쇄 Fv 종과 유사한 "이량성" 구조로 조합될 수 있다. 각 가변성 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여, V_H-V_L 이량체의 표면에 항원-결합부를 규정한다. 종합적으로, 6개의 CDR은 항체의 항원-결합 특이도를 부여한다. 그러나, 전체 결합 부위에 대해 친화성은 낮지만, 하나의 가변성 도메인(또는 항원 특이적인 단지 3개의 CDR로 구성된 Fv 절반)도 항원을 인지 및 결합할 수 있는 능력을 가지고 있다.

또한, Fab 단편 역시 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인(C_H1)을 함유하고 있다. Fab 단편은 항체 힌지 부위 유래의 한가지 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 C_H1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기 부가에 의해 Fab' 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 자유 티올 기를 가지는 Fab'를 나타낸다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이의 힌지 시스테인을 가지는 Fab' 쌍으로 생성된다.

단일클론 항체는 Kohler et al. (1975) Nature 256:495-496나 이의 수정 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 전형적으로는, 항원이 함유된 용액으로 마우스를 면역화한다. 면역화는 식염수, 바람직하기로는 프레운드 완전 보강제와 같은 보강제 중에 항원 함유 용액을 혼합 또는 에멀젼화한 다음, 이 혼합물 또는 에멀켠을 비경구로 주사함으로써 수행된다. 당업계에 공지된 면역화 방법을 사용하여 본 발명의 단일클론 항체를 수득할 수 있다. 동물을 면역화한 다음, 비장(및 선택적으로, 여러개의 큰 림프절)을 적출하여 단일 세포로 분리한다. 비장 세포는 대상 항원으로 코팅된 플레이트나 웰에 세포 현탁물을 적용함으로써 스크리닝할 수 있다. 항원에 특이적인 면역글로불린이 결합된 막을 발현하는 B 세포는 상기 플레이트에 결합하여, 세정으로 제거되지 않는다. 수득된 B 세포 또는 모든 분리한 비장 세포는 이후 하이브리도마 제조를 외해 골수종 세포와 융합시키고, 이를 선별 배지에 배양한다. 제조된 세포는 연속 희석으로 도말하여 대상 항원에 특이적으로 결합하는(및 무관련 항원에는 결합하지 않는) 항체의 생산에 대해 분석한다. 선별한 단일클론 항체(mAb)-분비성 하이브리도마는 이후 시험관내(예, 조직 배양 용기나 속이 빈 섬유형 반응기) 또는 생체내(마우스의 복수)에서 배양한다.

하이브리도마의 다른 이용방법으로서, 항체는 미국 특허 5,545,403; 5,545,405; 및 5,998,144에 기재된 바와 같인 CHO 세포주와 같은 세포주에서 생산할 수 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 간략하게, 세포주는 각각 경쇄 및 중쇄를 발현할 수 있는 벡터로 형질전환한다. 개별 벡터상의 2개의 단백질을 형질감염시킴으로써, 키메라 항체를 제조할 수 있다. 다른 이점은 항체의 정확한 당화이다. 또한, 단일 클론 항체는 바이오마커 단백질을 이용하여 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리(예, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 검색한 다음, 바이오마커 단백질에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 일원을 분리함으로써, 동정 및 분리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 및 스크리닝 키트는 시중에서 구입가능하다(예, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; and the Stratagene SurfZAPS Phage Display Kit, Catalog No. 240612). 또한, 항체 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝에 특히 사용할 수 있는 방법 및 시약의 예로는, 미국 특허 제 5,223,409호; PCT 공개공보 WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; 93/01288; WO 92/01047; 92/09690; 및 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMSO J. 12:725-734가 있다.

다중 항체는 바이오마커 단백질 면역원으로 적합한 개체(예, 토끼, 염소, 마우스 또는 그외 포유류)를 면역화시켜 제조할 수 있다. 면역화된 개체의 항체 역가는 고정화된 바이오마커 단백질을 이용한 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)와 같은 표준 기법으로 경시적으로 모니터링할 수 있다. 면역화후 적정 시점에, 예컨대 항체 역가가 최고일 때, 항체 생산 세포를 개체에서 수득하여, Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497에 의해 최초 개시된 하이브리도마 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), EBV-하이브리도마 기법(Cole et al. (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld and Sell (Alan R. Liss, Inc., New York, NY), pp. 77-96) 또는 트리오마 기법과 같은 표준 기법에 의해 단일클론 항체를 제조할 수 있다. 하이브리도마 제조 기법은 잘 알려져 있다(Coligan et al., eds. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., New York, NY); Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52; Kenneth (1980) in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses (Plenum Publishing Corp., NY); and Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402).

본 발명의 조성물은 대상 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는, 단일클론 항체 및 그것의 변이체 및 단편을 더 포함한다. 예컨대, SLPI(designated clone 5G6.24), DARPP-32 (8G11.20), MGC 14832 (1F3.9 및 2D1.14), NDRG-1 (10A9.34), PSMB9 (3A2.4), 및 MUC-1(16E3.3)에 특이적인 단일클론 항체들이 제공된다. 단일클론 항체는 샘플내 바이오마커 단백질의 검출을 용이하게 하기 위해 하기 기술된 바와 같이 검출가능한 물질로 표지될 수 있다. 이러한 항체는 본 발명의 방법 실시에 이용된다. 본원의 항체 결합 특성을 가지는 단일클론 항체들 역시 본 발명에 포함된다. 조성물은 또한 상기 단일클론 항체의 항원-결합 변이체 및 단편, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 및 상기 단일클론 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 분리된 핵산 분자를 더 포함한다.

본 발명의 단일클론 항체의 결합 특성을 가지는 항체도 제공한다. "결합 특성" 또는 "결합 특이성"은 항체에 관련하여 사용하는 경우, 항체가 비교 항체로서 동일한 또는 유사한 항원성 에피토프를 인지하는 의미이다. 이러한 항체의 예로는, 경쟁적 결합 분석에서 본 발명의 단일클론 항체와 경쟁하는 항체가 있다. 당업자는 항체가 표준 방법을 이용하여 다른 항체를 경쟁적으로 간섭하는지를 결정할 수 있다.

"에피토프"는 항체가 생성되고 결합하게 될 항원성 분자 부분이다. 에피토프는 선형 아미노산 잔기(즉 에피토프내 잔기들은 서로 선형으로 연속 배열됨), 비선형의 아미노산 잔기("비선형 에피토프"라함; 이 에피토프는 연속적으로 배열되어 있지 않음), 또는 선형 및 비선형 아미노산 잔기 모두를 포함할 수 있다. 전형적으로, 에피토프는 예컨대 악 5개의 아미노산 길이로 짧은 아미노산 서열이다. 에피토프를 동정하기 위한 체계적인 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 4,708,871에 기술되어 있다. 간략하게, 항원 유래 중첩 올리고펩티드 세트는 합성할 수 있으며 각 핀에 독특한 올리고펩티드가 있는 핀의 고상 어레이에 결합될 수 있다. 핀 어레이는 96웰 마이크로타이터 플레이트를 포함할 수 있으며, 이는 바이오마커 특이적인 단일클론 항체 결합에 대해 96개의 올리고펩티드 모두를 동시에 분석가능하다. 대안적으로, 현재 펩티드 맵핑에 시중의 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리 키트(New England BioLabs)를 사용할 수 있다. 주어진 항체에 결합하는 에피토프를 동정하기 위해, 이러한 방법을 이용하여, 가능한 모든 연속적인 아미노산의 서브세트에 대한 결합 친화성을 결정할 수 있다. 또한, 에피토프 길이의 펩티드를 사용하여 항체가 수득되는 동물을 면역화할 경우에, 추론에 의해 에피토프를 동정할 수 있다.

본원의 단일클론 항체의 항원 결합 단편 및 변이체를 추가적으로 제공한다. 이러한 변이체는 모 항체의 원하는 결합 특성을 유지할 것이다. 항원 단편 및 변이체의 제조 방법은 일반적으로 당업계에서 이용가능하다. 예컨대, 본원의 단일클론 항체의 아미노산 서열 변이체는, 대상 항체를 코딩하는 클론 DNA 서열의 돌연변이에 의해 제조할 수 있다. 돌연변이 유발 및 뉴클레오티드 서열 변형 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 82:488- 492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); 미국 특허 4,873,192를 참조하며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 대상 폴리펩티드의 생리 활성에는 작용하지 않는 아미노산의 적정 치환에 대한 지침안은 Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C)의 모델에서 볼 수 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 보존 치환, 예컨대 유사항 특성을 가진 것으로 아미노산 하나를 채환하는 것이 바람직하다. 보존 치환의 예로는 Gly <=> Ala, Val <=> Ile <=> Leu, Asp <=> Glu, Lys <=> Arg, Asn <=> Gln, 및 Phe <=> Trp <=> Tyr이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

대상 항체 폴리펩티드의 변이체 구축에서, 변형은 변이체가 원하는 활성, 즉 바이오마커와 유사한 결합 친화성을 가지도록 한다. 분명한 것은 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 행해진 모든 돌연변이는 리딩 프래임을 벗어난 서열을 치환해서는 안되며, 바람직하기로는 mRNA의 이차 구조를 형성할 수 있는 상보적인 부위를 만들지 않아야 한다. 유럽 특허 공개번호 75,444를 참조한다.

바람직하기로는, 기준 바이오마커 항체의 변이체는 기준 항체 분자에 대한 아미노산이나 기준 항체 분자의 보다 짧은 부위에 대해 적어도 70% 또는 75%의 서열 동일성, 바람직하기로는 적어도 80% 또는 85%의 서열 동일성, 더 바람직하기로는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95%의 서열 동일성을 가진다. 더 바람직하기로는, 상기 분자는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유한다. 본 발명의 목적을 위해, 서열 동일성%는 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘을 이용하여, 갭 오픈 페널티 12, 갭 연장 페널티 2, BLOSUM 매트릭스 62로 결정된다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489에 개시되어 있다. 변이체는, 예컨대 1 내지 15개의 아미노산 잔기가, 1 내지 10개의 아미노산 잔기가, 예컨대 6-10, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 잔기로 적은 수가 상기 기준 항체와 상이하다.

2종의 아미노산 서열의 최적 정렬에 있어서, 변이체 아미노산 서열의 연속 세그멘트(contiguous segment)는 상기 기준 아미노산 서열에 대해 추가적인 아미노산 잔기를 가지거나 또는 아미노산 잔기가 결손될 수 있다. 기준 아미노산과의 비교에 사용된 연속 세그멘트는 적어도 20개의 연속 된 아미노산 잔기를 함유할 것이며, 30, 40, 50 또는 그 이상의 아미노산 잔기들일 수 있다. 보존적인 잔기 치환 또는 갭 관련된 서열 동일성은 정확하게 알 수 있다(참조, Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘).

본 발명의 실시에 사용되는 항체는 대상 바이오마커 단백질에 대한 특이성을 가지도록 선정된다. 항체 제조법 및 적정 항체 선별 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예로, Celis, ed. (in press) Cell Biology & Laboratory Handbook, 3rd edition (Academic Press, New York)를 참조하며, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 발명에 포함된다. 일부 예들에서, 특정 바이오마커 단백질에 대한 상업적인 항체를 사용하여 본 발명을 실시할 수 있다. 본 발명의 항체는 조직 샘플의 적합한 염색을 토대로 선택할 수 있다. 즉, 바람직한 예로, 항체는 최종 샘플 타입(예, 포르말린 고정시킨, 파라핀 포매한 유방 종양 조직 샘플)에 유념하여, 그리고 결합 특이도에 따라 선택한다.

본 발명의 일부 측면에서, 목적한 특정 바이오마커에 대한 항체를 선택하고, 다단계 스크리닝 과정을 통해 정제한다. 특정 예에서, 폴리도마를 스크리닝하여 원하는 특이도 및 민감도를 가진 바이오마커-특이 항체를 동정한다. 본 발명에서, "폴리도마"는 다중성 하이브리도마를 의미한다. 본 발명의 폴리도마는 전형적으로 멀티웰 조직 배양 플레이트내에 제공된다. 항체 스크리닝의 첫 단계로, 정상(즉, 비암성) 유방 조직 및 단계 I, II, III 및 IV의 유방 종양 샘플을 포함하는 개별 슬라이드 세트 또는 종양 조직 마이크로어레이 세트를 준비한다. Chemicon^® Advanced Tissue Arrayer와 같은 단일 슬라이드상의 멀티 조직 어레이 형성 방법 및 장비가 당업계에 공지되어 있다. 예로, 미국 특허 4,820,504를 참조한다. 폴리도마를 함유하고 있는 각 웰로부터 희석하지 않은 상층액을 취하여, 표준 면역조직화학적 기법을 이용한 양성 염색으로 분석한다. 스크리닝 첫 단계에서, 백그라운드, 비특이적 결합은 필히 무시된다. 양성 결과를 보이는 폴리도마를 선별하고, 항체 스크리닝 2번째 단계에서 사용한다.

제2 스크리닝 단계에서, 양성 결과를 보인 폴리도마로 한정 희석 공정을 수행한다. 5년 결과가 알려진 유방 종양 조직 샘플의 양성 염색을 위한 표준 면역조직화학 기법을 통해 수득한 미스크리닝 항체를 분석한다. 이를 위해, 정상 유방 조직, 5년 결과가 양호한 것으로 확인된 초기 단계의 유방 종양 샘플, 5년 결과가 양호하지 않은 것으로 확인된 초기 단계의 유방 종양 샘플, 정상적인 비유방 조직 및 암성 비-유방 조직을 포함하는 조직 마이크로어레이를 제조한다. 이 단계에서, 백그라운드 염색이 관련되며, 단지 비정상 세포(즉, 암 세포)에 대해서만 양성으로 염색되는 폴리도마 후보를 결과가 양호하고 양호하지 않은 환자 샘플을 구별하는 항체를 동정하기 위한 추가적인 분석을 위해 선택한다.

양성 염색 배양물은 각각의 단일클론 항체 후보를 선택하기 위해 각각의 클론으로 준비한다. 각각의 클론을 분리하는 방법 및 친화성 흡착 크로마토그래피를 통한 항체 정제 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 개별적인 클론은 추가적으로 분석하여 최적화된 항원 복구 조건 및 작동성 희석을 결정한다.

당업자는 염색 시약 및 조건, 예컨대 특정 항체에 대한 신호 대 노이즈를 최대화하기 위해 항체 역가 및 검출 화학 파라미터의 최적화가 필요함을 인지할 것이다. 본 발명의 바이오마커에 특이적인 결합을 최대화하고 비특이적인 결합(또는 "백그라운드")를 최소화하는 항체 농도가 결정될 것이다. 특정 예에서, 적정 항체 역가는 포르말린으로 고정한 파라핀 포매의 정상 및 암성 유방 조직 샘플에 대해 여러가지 항체 희석물을 먼저 테스트함으로써 결정된다. 항체 역가 및 검출 조건을 최적화하기 위한 분석 설계는 당업자의 일반적인 능력 범위내에서 표준적이며 자명하다. 일부 항체는 백그라운드 염색을 감소시키고/시키거나 염색 특이성 및 민감성을 증가시키기 위한 추가적인 최적화를 필요로 한다.

더욱이, 당업자는 본 발명의 실시에 사용되는 특정 항체의 농도는 바이오마커 단백질 항체의 결합 시간, 특이성 수준과 같은 인자 및 신체 샘플 제조 방법에 따라 변경될 것임을 인식할 것이다. 또한, 복수개의 항체를 단일 샘플에 사용하는 경우, 필수 농도는 항체를 샘플에 적용하는 순서에 따라, 즉 칵테일로서 동시에 또는 개별적인 항체 시약으로서 연속적으로 적용하는 가에 따라 영향을 받을 수 있다. 아울러, 대상 바이오마커에 항체 결합을 가시화하기 위해 사용되는 검출 화학법은 원하는 신호 대 노이즈 비가 형성되도록 최적화되어야 한다. 면역조직화학법의 염색 시약 및 조건의 최적화의 일예를 실시예 6에 나타낸다.

항체 결합 검출은 항체를 검출가능한 물질을 커플링시킴으로써 용이하게 할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는, 다양한 효소, 보결기(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질 및 방사능 물질이 있다. 적합한 효소의 예로는 호르세라디시 페록시다제, 알칼린 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 있으며, 적합한 보결기의 예로는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 있으며; 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있으며; 발광 물질의 예로는 루미놀이 있으며; 생발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린이 있으며; 적합한 방사능 물질의 예로는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H가 있다.

본 발명의 면역조직화학방법에서 항체 염색 검출에 있어서, 당업계에는 신체 샘플에서 복수개의 분자 종들(예, 바이오마커 단백질)의 양을 정량 측정하기 위한 비디오-마이크로스코피 및 소프트웨어 방법이 존재하고 있으며, 각 분자 종은 특이적인 색상을 가지는 대표적인 염료 마커에 의해 표시된다. 또한, 이러한 방법은 색도계 분석 방법으로서 당업계에 알려져 있다. 이러한 방법에서, 비디오-마이크로스코피를 이용하여, 염색하여 특정 대상 바이오마커의 존재를 가시적으로 표시한 후 신체 샘플의 이미지를 제공한다. 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 Marcelpoil et al.의 미국 특허 출원번호 09/957,446 및 Marcelpoil et al.의 미국 특허 출원번호 10/057,729에 개시된 방법과 같은, 이러한 방법들중 일부는 이미지 시스템 및 관련 소프트웨어의 사용을 개시하고 있으며, 이는 이미지 시스템 및 관련 소프트웨어에 의해 측정된 바와 같이 각각 상기 색 염료 마커의 최적 세기 또는 투과율(transmittance value)에 의해 표시되는, 대표적인 색 염료 마커의 존재를 토대로 각 분자 종들의 상대적인 존재 양을 결정한다. 이러한 기법은 그것의 색 구성 파트로 해체되는 단일 비디오 이미지를 이용하여 염색된 생물 샘플에서의 각 분자 종들의 상대적인 양의 정량 측정을 제공한다.

본 발명의 방법은 바이오마커 발현 검출용 이미지 시스템 및 관련 이미지 소프트웨어와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 이용되는 바이오마커는 동시 출원한 표제 "암 예후에 대한 마커 후보물질의 분석 및 최적화를 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램"의 미국 출원에 개시된 바와 같은 방법 및 컴퓨터 프로그램을 토대로 선택할 수 있으며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에 개시된 방법은 유방암 예후를 평가하기 위한 알고리즘 개발에 사용될 수 있다.

다른 예에서, 대상 바이오마커의 발현은 핵산 수준으로 검출한다. 발현을 평가하기 위한 핵산을 기본으로한 기법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 예컨대 신체 샘플내 바이오마커 mRNA의 수준을 결정하는 방법을 포함한다. 다수의 발현 검출 방법은 분리된 RNA를 이용한다. mRNA의 분리시 채택되지 않은 임의의 RNA 분리 기법은 RNA의 정제를 위해 활용할 수 있다(예, Ausubel et al, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999). 또한, 조직 샘플 다수개를 Chomczynski(1989, 미국 특허 4,843,155)의 한 단계 RNA 분리 공정과 같은 당업계에 공지된 기법으로 쉽게 처리할 수 있다.

용어 "프로브"는 특이적으로 의도된 표적 바이오분자, 예컨대 핵산 전사체 또는 바이오마커에 의해 또는 해당되는 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 프로브는 당업자가 합성하거나 또는 적절한 생물학적 조제물로부터 유래될 수 있다. 프로브는 표지되도록 특이적으로 설계할 수 있다. 프로브로서 활용될 수 있는 분자의 예로는, RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

분리된 mRNA는 비제한적으로 서던 또는 노던 분석, 중합효소 연쇄 반응 분석 및 프로브 어레이를 포함한 혼성화 또는 증폭 분석법에 이용할 수 있다. mRNA 수준 검출의 한가지 방법은, 검출중인 유전자에 의해 코딩된 mRNA에 혼성화할 수 있는 핵산 분자(프로브)를 분리한 mRNA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 예컨대, 핵산 프로브는 전장 cDNA 또는 적어도 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개 이상의 뉴클레오티드 길이를 가지는 올리고뉴클레오티드와 같은 그의 일부분일 수 있으며, 엄격 조건하에서 mRNA 또는 본 발명의 바이오마커를 코딩하는 게놈 DNA에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 것일 수 있다. 프로브와 mRNA의 혼성화는 대상 바이오마커가 발현되고 있음을 의미한다.

일 예에서, mRNA는 고체 표면에 고정하여, 예컨대 분리된 mRNA를 아가로스젤상에서 전개시킨 후 이를 겔에서 니트로셀룰로스와 같은 멤브레인으로 이동시킴으로써, 프로브와 접촉시킨다. 대안적인 예로, 프로브(들)를 고체 표면에 고정시키고, mRNA를, 예컨대 Affymetric 유전자 칩 어레이에서 프로브(들)과 접촉시킨다. 당업자는 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩된 mRNA 수준을 검출하는데 유용한 mRNA 검출 방법을 쉽게 적응시킬 수 있다.

샘플내 바이오마커 mRNA의 수준을 결정하기 위한 다른 방법에는 핵산 증폭 공정, 예컨대 RT-PCR(상기 Mullis, 1987의 실험예, 미국 특허 4,683,202), 리가제 연쇄 반응(Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189-193), 자기 지속성 서열 복제(self sustained sequence replication)(Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템(Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 리플리카제(Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), 롤링 서클 복제(Lizardi et al., 미국 특허 5,854,033), 또는 그외 다른 핵산 증폭 방법과, 이후 당업자에게 공지된 기법을 이용한 증폭된 분자 검출이 사용된다. 이러한 검출 방법은 이러한 분자가 매우 소수로 존재하는 경우에 핵산 분자를 검출하는데 매우 유용하다. 본 발명의 특정 예에서, 바이오마커 발현은 정량적 플루오로제닉 RT-PCR(즉, TaqMan^® 시스템)으로 평가한다.

바이오마커의 RNA 발현 수준은 멤브레인 블롯(예컨대 노던, 서던, 돗(dot) 같은 혼성화 분석에서 사용되는 바와 같이), 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 겔, 비드 또는 파이버(또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체)를 이용하여 모니터링할 수 있다. 미국 특허 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 및 5,445,934를 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 또한, 바이오마커 발현 검출은 용액중에 핵산 프로브를 이용하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 일예에서, 마이크로어레이를 바이오마커 발현 검출에 사용한다. 마이크로어레이는 여러가지 실험들간의 재현성으로 인해 본 목적에 특히 매우 적합하다. DNA 마이크로어레이는 다수 유전자의 발현 수준의 동시 측정 방법을 제공한다. 각 어레이는 고체 지지체에 접촉된 포획 프로브의 재현가능한 패턴을 구성한다. 표지된 RNA 또는 DNA는 어레이상에서 상보적인 프로브와 혼성화시켜, 이후 레이저 스캐닝에 의해 검출한다. 어레이상의 각 프로브에 대한 혼성화 세기를 측정하여, 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 정량적인 수치로 바꾼다. 미국 특허 6,040,138, 5,800,992, 6,020,135, 6,033,860, 및 6,344,316를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 고밀도의 올리고뉴클레오티드 어레이가 특히 샘플내 다수의 RNA에 대한 유전자 발현 프로파일을 측정하는데 유용하다.

기계적 합성 방법을 이용한 이러한 어레이 합성 기법은 예컨대, 미국 특허 5,384,261에 개시되어 있으며, 그 모든 목적으로 그 전체가 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 평면 어레이 표면이 바람직하지만, 어레이는 실제 모든 형태의 표면이나 또는 다중적인 표면상에 제조할 수 있다. 어레이는 비드, 겔, 폴리머 표면, 파이버, 예컨대 광섬유, 유리 섬유 또는 그외 적합한 기질상의 펩티드 또는 핵산일 수 있다. 미국 특허 5,770,358, 5,789,162, 5,708,153, 6,040,193 및 5,800,992를 참조하며, 이들은 그 모든 목적으로 그 전체가 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 어레이는 모든 포함 장치의 진단 또는 그외 조작이 가능하도록 그러한 방식으로 패키지될 수 있다. 예로, 미국 특허 5,856,174 및 5,922,591를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

한가지 접근 방법으로, 샘플에서 분리한 총 mRNA를 표지된 cRNA로 변환한 다음 올리고뉴클레오티드 어레이에 혼성화시킨다. 각 샘플은 분리된 어레이에서 혼성화시킨다. 상대적인 전사 수준은 어레이 및 샘플에 존재하는 적정 대조군을 참조하여 계산할 수 있다.

본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트를 추가적으로 제공한다. "키트"는 본 발명의 바이오마커를 특이적으로 검출하기 위한 한가지 이상의 시약, 예컨대 항체, 핵산 프로브 등을 포함하는 임의의 제조물(예, 패키지 또는 용기)이다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유닛(unit)으로서 조성하거나, 분배하거나 또는 판매할 수 있다. 부가적으로, 키트는 키트와 그의 사용 방법이 설명된 패키지 삽입물을 포함할 수 있다.

특정 예로, 본 발명의 면역조직화학 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 하기 실시예 1에 개시된 바와 같이, 수동 및 자동 면역조직화학 기법(예, 세포 염색)와 함께 사용할 수 있다. 이들 키트는 대상 바이오마커 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 포함한다. 선택적으로, 바이오마커에 대한 항체 결합을 검출하기 위한 화합물, 대조염색제 및 양성 염색 세포 동정을 용이하게 하기 위한 청색화제를 제공한다. 대안적으로 본 발명의 면역화학 키트는 예컨대, Dako Envision+system 및 Biocare Medical's Mach 3 system과 같은 통상적인 항체 결합 검출 시스템과 함께 사용한다. 항원-항체 결합을 검출하는 모든 화합물은 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 일부 예에서, 상기 검출 화합물은 이차 항체가 접합된 표지된 폴리머를 포함한다. 예컨대, 항원-항체 결합부에 발색단의 침착을 촉매화하는 효소가 접합되어 있는 이차 항체를 제공할 수 있다. 이러한 효소와 항체 결합 검출에 이의 이용 기법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 예에서, 키트는 HRP-표지 폴리머가 접합된 이차 항체를 포함한다. 접합된 효소(예, HRP 표지된 이차 항체의 경우에는 DAB)과 함께 사용가능한 발색단 및 비특이적 염색을 차단하기 위한 하이드로겐 페록사이드와 같은 용액이 추가적으로 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 예컨대 헤마톡실린과 같은 대조염색제를 포함할 수 있다. 양성 염색 세포 검출을 용이하게 하기 위해, 키트에 청색화제(예, 암모늄 하이드록사이드)가 추가적으로 제공될 수 있다.

다른 예에서, 본 발명의 면역조직화학 키트는 2개 이상의 개별적인 바이오마커의 발현을 특이적으로 검출하기 위해 적어도 2종 이상의 시약, 예컨대 항체를 포함한다. 각 항체는 키트에 개별 시약으로서, 또는 대안적으로는 여러가지 대상 바이오마커에 대한 항체 모두가 포함된 항체 칵테일로서 키트내에 제공될 수 있다. 또한, 키트 시약의 어떤 것 또는 모두는 밀폐된 용기내와 같이 외부 환경으로부터 이들을 보호하는 용액내로 제공될 수 있다. 본 발명에 채택되는 시얄의 활성 및 정확한 사용을 검증하기 위해, 키트에 양성 및/또는 음성 대조군이 함유될 수 있다. 대조군은 글라스 슬라이드에 고정된 조직 단편, 세포 등과 같이 대상 바이오마커의 존재가 양성 또는 음성인 것으로 알려진 샘플을 함유할 수 있다. 대조군의 설계 및 사용은 당업자의 일반적인 능력 범위내에서는 표준적이며 자명한 것이다.

다른 예로, 핵산 수준으로 바이오마커의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함하는 유방암 환자의 예후 평가용 키트를 또한 제공한다. 이러한 키트는 예로 바이오마커 핵산 또는 그것의 단편에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 핵산 프로브를 포함한다. 특정 예에서, 키트는 독립적인 바이오마커 핵산과 혼성화하는 2 이상의 핵산 프로브를 포함한다.

당업자라면 본 발명의 방법의 임의 또는 모든 단계를 수동으로 또는 대안적으로는 자동화 양상으로 수행할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 신체 샘플의 준비 단계, 샘플 염색 단계 및 바이오마커의 발현 검출 단계는 자동화될 수 있다. 또한, 일부 예에 있어서, 본 발명의 면역조직화학적 방법은 병리학자에 의한 양성 염색 세포의 검출 용이성을 위해 컴퓨터화된 이미징 장치 및 소프트웨어와 함께 사용된다. 또한, 본 발명의 방법은 그외 예후 방법 또는 분석법(예, 종양 크기, 림프절 상태, Her2/neu, Ki67와 p53의 발현 수준)과 조합할 수 있다. 이러한 방식으로 본 발명의 바이오마커 과다 발현 검출 방법은 유방암 환자의 예후에 대한 보다 정확한 결정을 내리게 한다.

"하나(a)" 및 "하나(an)"는 본원에서 품목의 문법적인 대상 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)를 의미한다. 예를 들어, "하나의 요소"는 하나 또는 그 이상의 요소를 의미한다.

본 명세서에서, 단어 "포함하는" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급한 요소, 정수 또는 단계나 요소, 정수 또는 단계 그룹을 포괄함을 의미하는 것으로 이해되며, 임의의 그외 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것은 아니다.

도 1은 급성 유방암의 결과에 대한 함수로서, 강도2로 염색된 세포의 백분율 분포를 나타낸다. 구체적인 실험 내용은 실시예 4에 나타나있다.

도 2는 SLPI/p21ras/E2Fl/PSMB9/src/phospho-p27 조합에 대한 서열을 이용한 해석 방법으로 수득한 ROC 곡선이다. 구체적인 실험 내용은 실시예 5에 나타나있다.

도 3은 SLPI, src, PSMB9, p21ras, 및 E2F1 바이오마커 패널의 예후 평가를 위한 Kaplan-Meier plot이다. 구체적인 실험 내용은 실시예 8에 나타나있다.

도 4는 바이오마커 과다 발현 분석과는 독립적인 일반적인 유방암 환자 집단에 대한 장기 생존 데이타를 나타낸 그래프이다. 구체적인 실험 내용은 실시예 8에 나타나있다.

도 5는 SLPI, src, PSMB9, p21ras, E2F1,및 MUC-1 바이오마커 패널의 예후 평가를 위한 Kaplan-Meier plot이다. 구체적인 실험 내용은 실시예 9에 나타나있다.

하기 실시예들은 예로서 제공되며, 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 면역조직화학을 이용한 바이오마커의 과다 발현 검출

슬라이드 준비

포르말린으로 고정시키고 파라핀으로 포매한 유방 종양 조직 샘플은 마이크로톰을 이용하여 4 ㎛ 단편으로 자른 다음 SuperFrost+ 슬라이드(VWR)에 두었다. 이 슬라이드는 20분간 강제 통풍하에 구운 다음 파라핀이 녹을때까지 Histo-Orienter에 접촉시켜 두었다. 슬라이드를 5분간 크실렌으로 3회 세정하여 파라핀을 제거하고, 무수 알코올로 각 2분씩 3번 헹구었다.

전처리 및 항원 복구

비특이적인 백그라운드 염색을 방지하기 위해, 슬라이드를 실온에서 5분간 하이드로겐 페록사이드/메탄올 블롯 중에 인큐베이션하였다. 이후, 슬라이드는 dH2O의 수차례 교체하면서 철저하게 헹구었다.

항원이 항원 결합에 접근가능하게 하기 위해, 슬라이드를 5분간 압력기내 항원 복구 용액중에 인큐베이션하였다. 슬라이드는 벤치상에서 20분간 실온으로 냉각되게 하였고, 시트레이트 완충액은 연속적인 희석에 의해 dH₂O, 트리스 완충화 염수(TBS), 또는 포스페이트 완충화 염수(PBS)로 서서히 교체하였다. 이후 슬라이드는 각 2분씩 TBS로 3번 헹구었다. 표면 장력을 없애개 위해, 각 슬라이드에 1% BSA/TBS를 750 ㎕/50 ml 첨가하였다.

수동식 면역조직화학법

비특이적인 백그라운드 염색을 방지하기 위해, 슬라이드는 염색 과정을 실시하는 동안에 건조되지 않게 하였다. 항원 복구 과정을 실시한 슬라이드를 수분 함유 페이퍼 타월이 채워져 있는 습도 챔버에 넣었다. SLPI 항체(클론 5G6.24; 1:100 희석)를, 조직 단편을 완전히 덮을 수 있는 충분한 함량으로 슬라이드에 실온에서 1시간 동안 적용하였다. 일차 항체로 인큐베이션한 다음, 슬라이드는 각각 2분씩 3번 TBS로 헹구었다. 최종 헹굼시에는 1% BSA/TBS를 750 ㎕/50 ml 첨가하였다.

Dako Envision+ HRP-표지된 폴리머 이차 항체를 실온에서 30분간 슬라이드에 적용한 다음, TBS로 헹구었다. HRP 기질 발색단 DAB를 10분간 적용한 다음, 슬라이드는 물로 5분간 헹구었다. 이후, 각 슬라이드는 5초간 헤마톡실린으로 대조 염색한 다음 투명해질때까지 물로 헹구었다. 대조염색 후, 10초간 암모니아수에 침지하여 슬라이드를 "청색화"하고, 이후 1분간 물로 헹구었다.

샘플을 1분간 95% 에탄올에 침지시킨 다음 수분간 무수 에탄올에 침지하여, 탈수하였다. 슬라이드를 회당 1분씩 크실렌으로 3회 세정하여 선명하게 하였다. 이후, 슬라이드를 불변의 고정 매질(permanent mounting media)을 이용하여 커버슬립하고 35 ℃에 두어 건조시켰다. 바이오마커 염색은 명시 현미경을 이용하여 가시화하였다. 수치 결정은 맹검 방식으로 전문 병리학자에 의해 수행되었다.

자동 면역조직화학

Dako 자동염색기 유니버셜 염색 시스템을 제조사의 설명서에 따라 프로그래밍하고, 전술한 수동 면역세포화학용 필수 염색 및 대조 염색 시약을 상기 기계에 적재하였다. 준비한 슬라이드를 자동염색기에 적재하고, 프로그램을 운영하였다. 프로그램 종료 시점에 슬라이드를 제거하고 5분간 물로 헹구었다. 슬라이드는 전술한 바와 같이, 탈수하고, 선명화하고, 커버슬립하고 분석하였다.

실시예 2: 임상 샘플에서의 개별적인 바이오마커의 과다 발현 검출

여러가지 질환 단계의 환자들로부터 약 130개의 유방 종양 조직 샘플을 수집하였다. 환자의 평균 연령은 77세이다. 각 환자에 대한 실제 임상 결과 데이타는 알고 있었으며, 각 환자는 양호한 또는 양호하지 않은 결과로 분류하였다. 본 실험에서, 양호한 결과는는 적어도 5년간 암이 없는 상태로 있는 것으로 정의되었으 며, 양호하지 않은 결과는 5년 이내에 질병 재생, 재발 또는 사망으로 정의되었다. 하기 표는 각 분석한 진단군의 샘플 수와, 실제 임상 결과 데이타를 나타낸다.

표 1: 분석한 임상 샘플

샘플들은 실시예 1의 자동 면역조직화학 방법으로 분석하여 그 발현이 암의 양호하지 않은 예후를 나타내는 바이오마커를 동정하였다. 즉, 본 임상 실험의 목적은 예후가 양호한 환자 샘플과 양호하지 않은 환자 샘플을 구별할 수있는 바이오마커를 동정하는 것이다. 8종의 대상 바이오마커의 과다 발현을 검출하기 위해 항체를 사용하였다: SLPI, PSMB9, NDRG-1, E2F1, p21ras, MUC-1, phospho-p27, 및 src. 품질 관리를 위해, 샘플은 또한 ER, PR, p53, Ki67 및 Her2/neu 발현에 대해서도 분석하였다.

본원에서와 같이, 폴리도마 스크리닝에 의해 동정한, 대상 바이오마커에 대한 상업적인 항체 또는 단일클론 항체를 표 2에 기재된 바와 같이 희석하여, 바이 오마커 과다 발현 검출에 사용하였다. 각 바이오마커의 항원 복구 조건 역시 하기에 기재되어 있다.

표 2: 항원 희석 및 항원 복구 조건

슬라이드 분석

실제 임상 환자 결과를 모르는 전문 임상의가 각 슬라이드를 관찰하여 점수를 매겼다. 바이오마커의 염색 세기에 따라 0-3으로 샘플에 점수를 매겼다. 예로, Hanausek and Walaszek, eds. (1998) Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc., Totowa, New Jersey); 및 Shi et al, eds. (2000) Antigen Retrieval Techniques: Immunohistochemistry and Molecular Morphology (Eaton Publishing, Natick, MA)를 참조하며, 이들 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함되낟. 각 바이오마커에 대한 역치(threshold) 염색 강도를 확립하였다. 특정 바이오마커에 대해 역치값 미만의 염색 강도를 나타내는 샘플은 바이오마커에 음성으로 하였다. 대상 바이오마커에 대한 염색 강도 역치값은 다음과 같다:

Src: >1

MUC-1: >3

Phospho-p27: >0.5

PSMB9: >0.5

NDRG-1: >1

E2F1: >3

p21ras: >0.5

SLPI: >2

염색 강도 결과는 각 환자에 대해 입수가능한 공지된 실제 임상 결과 데이타와 비교하였고, 각 슬라이드는 진양성(TP), 진음성(TN), 위양성(FP) 및 위음성 (FN)으로 하기 파라미터에 따라 최종 결과를 매겼다. 각 바이오마커에 대한 민감도 및 특이도도 계산하였다.

표 3: 양호하지 않은 결과를 나타내는 바이오마커에 대한 슬라이드 분류

* 양호한 임상 결과 = 적어도 5년간 암없이 생존

양호하지 않은 임상 결과 = 5년이내에 재발 또는 투병중인 암으로 사망

계산식

민감도 = TP / (TP+FN)

특이도 = TN / (FP+TN)

양성 예측력(PPP) = TP / (TP+FP)

음성 예측력(NPT) = TN / (FN+TN)

결과

각 바이오마커에 대한 결과는 하기에 종합하였다.

표 4: 각 바이오마커의 결과 요약

실시예 3: 임상 샘플-조합 바이오마커에서 바이오마커 과다 발현 검출

본 발명의 방법의 민감도 및 특이도가 복수개의 바이오마커를 조합한 경우에 개선될 수 있는 지를 보기 위해, 실시예 2의 데이타로 추가적인 분석을 실시하였다. 따라서, 다양한 조합의 바이오마커를 고려하였고, 조합에서 바이오마커들중 어느 것에 대해 양성으로 염색된 샘플은 양성으로 판단하였다. 이러한 결과는 각 환자로부터 입수할 수 있는 실제 임상 결과 데이타와 비교하였고, 이후 각 슬라이드는 상기와 같이 진양성(TP), 진음성(TN), 위양성(FP) 및 위음성 (FN)으로 최종 결과를 매겼다. 바이오마커의 각 조합에 대한 민감도, 특이도, 양성 예측력(PVPV) 및 음성 예측력(NPV)도 계산하였다.

결과

각 바이오마커 조합에 대한 결과는 하기에 요약하여 나타내었다.

표 5: SLPI, PSMB9. MUC-1, 및 phospho-p27

표 6: SLPI, PSMB9. MUC-1, phospho-p27, 및 src

표 7: SLPI, PSMB9, MUC-1, phospho-p27, src, p21ras, E2F1 및 NDRG-1

실시예 4: 마커 분석 검색 시스템(MARS)를 이용한 임상 샘플에서의 각 바이오마커의 과다 발현 검출

본 실험에서는 200명 이상의 환자들을 분석하였다. 표 8에 요약하여 나타낸 바와 같이, 이러한 환자 집단들은 매우 이종적이었으며, T1NO 내지 T3N0의 여러가지 단계의 종양을 가지고 있었다.

표 8: 분석한 환자 집단

환자들에 대한 표적으로 한 특징은 그들의 양호한 결과는 또는 양호하지 않은 결과였다. 본 실험에서, 양호한 결과는를 보이는 환자는 5년후에도 여전히 무병인 환자이고, 양호하지 않은 결과를 보이는 환자는 5년이내에 재발, 재생 또는 사망하는 환자로 정의내렸다.

바이오마커 선택

바이오마커 선택에 사용한 패러다임은 바이오마커의 과다 발현이 양호하지 않은 결과를 보이는 환자들중 일부에서 보이며, 매우 높은 특이도를 나타낸다는 것이다. 즉. 여러가지 조합 마커들은 예컨대 80% 민감도 및 80% 특이도에 이르는 높은 특이도 및 민감성 증가를 보장한다. 다단계 선택 과정을 거친 후, 9종의 바이오마커를 본 실험을 위해 선택하였다. 이들 마커는 표 9에 나타내었으며, 각각의 세포내 위치도 표시하였다.

표 9: 분석한 바이오마커

자동 면역조직화학

실시예 1에 개시된 바를 기본하여, 환자 샘플을 자동 면역조직화학법으로 분석하여, 그 발현이 암의 양호하지 않은 예후를 나타내는 바이오마커를 동정하였다. 즉, 본 임상 실험의 목적은 결과가 양호한 환자 샘플과 양호하지 않은 환자 샘플을 구별할 수 있는 바이오마커를 동정하는 것이다. 9종의 대상 바이오마커의 과다 발현을 검출하기 위해 항체를 사용하였다: SLPI, PSMB9, NDRG-1, E2F1, p21ras, p53, MUC-1, phospho-p27, 및 src. 또한, 샘플은 ER, PR, Ki67, 및 Her2/neu (CerbB2) 발현에 대해서도 분석하였다.

슬라이드를 실시예 1과 같이 준비한 다음 항원 복구를 실시하였다. 구체적으로, 준비한 슬라이드는 항원 복구 용액에 침지한 다음 5분간 압력기(120-125℃, 17-23 psi)에 두었다. 각 바이오마커에 대한 항원 복구 용액은 표 10에 나타내었다.

표 10: 항원 복구 용액

슬라이드는 탈이온수에서 실온으로 서서히 복귀시켰다. 슬라이드는 각 2분씩 3번 TBS/tween-20 용액으로 헹구었다. 각 슬라이드에 바이오마커 특이 항체 200 ㎕을 첨가하여 한시간동안 실온에서 인큐베이션하였다. 본원에서 폴리도마 스크리닝에 의해 동정된, 대상 바이오마커에 대한 상업적인 항체 또는 단일클론 항체를 사용하여 바이오마커의 과다 발현을 검출하였다.

일차 항체와 인큐베이션한 다음, 슬라이드는 TBS/tween-20으로 2번 헹구었다. 여기에 표지된 폴리머(Dako Envision+ HRP-표지된 이차 항체) 200 ㎕을 30분간 실온에서 첨가하였다. 이후 슬라이드는 TBS/tween-20으로 3번 헹군 다음 실온엣 5분간 200 ㎕의 DAB 용액을 첨가하였다. 이후, 슬라이드는 TBS/tween-20로 3번, 그리고 탈이온수로 한번 헹구었다. 여기에 200 ㎕의 헤마톡실린을 5분간 가하였다. 다시 슬라이드를 탈이온수로 3번, TBS/tween-20으로 1번, 다시 탈이온수로 2번 헹구었다. 이후 슬라이드는 실시예 1에서와 같이 탈수, 선명화한 다음 커버슬립을 덮었다.

병리학자의 평가

전문 병리학자가 수동으로 슬라이드에 점수를 매겼다. p53 발현은 0, 0.5, 1, 2, 또는 3으로 염색 강도, 표지된 세포의 백분율 및 임상적인 진단 수치를 매겼다. SLPI 및 PSMB9은 0, 0.5, 1, 2, 또는 3의 염색 강도 및 표지된 세포의 백분율을 수치로 매겼다. 또한, 병리학자가 결정을 내리는데 이용한 슬라아디의 종양 면적(ROI)을 표시하였다. 각 종양에 대한 선택부위를 단일 초점의 최대 20X 비율 이미지를 MARS를 이용하여 수득하였다. 각 샘플로부터 수득한 이미지의 실제 수는 각 종양의 크기에 의존적이었다. 환자의 결과, 림프절 상태 및 종양 크기와 같이 상기 점수 정보가 모두 기재된 엑셀 스프레드 시트를 만들었다. 데이타는 하기와 같이 추가적인 분석에 사용하였다.

데이타 추출

MARS를 이용하여, 각 파일에 대한 하기 단계를 시스템적으로 수행하였다:

- 발색단 분리는 가장 염색 품질이 좋은 이용가능한 슬라이드를 이용하여 각 바이오마커에 대해 최적화되었다.

- 분할 설정은 그것의 세포내 위치(핵, 세포질 또는 막)에 따라 각 바이오마커에 대해 만들하였다

- 항목은 한정된 ROI내에서 세포, 시야(field of view, FOV), 및 초점 정도(focus level)로 추출하였고, 출력 파일(XML 형식)로 만들었다.

데이타 분석

새로운 분석 알고리즘을 병합하고, 이러한 분석에 대한 강력한 계산 요구를 충족시키기 위해, 멀티 마커 분석기라고 하는 특수 프로그램이 개발되었다. 이러 한 소프트웨어는 TMA 또는 MARS로 생성시킨 조직 섹션 XML 파일 전체 또는 일부를 적재하기 위한 수단을 제공하여, TMA 키(TMA 분석의 경우에)를 나타내는 XML 파일 또는 환자의 임상 상태 및 환자 평가가 있는 엑셀 파일(조직 섹션 분석의 경우)을 이용하여 이러한 파일에 포함된 데이타를 병합하며, 모두 추가적인 분석된다. 이러한 병합 과정은 각 코어(또는 환자)에 대한 MARS로 측정된 파라미터의, 환자에 대한 TMA 키(또는 엑셀 파일)에 저장된 정보: 식별 번호 및 의학적 상태(결과 좋음 또는 나쁨)와의 조합, 및 XML 형식의 MARS 파일에 포함되어 있지 않은 병리학자의 평가가 포함된다.

일부 샘플들은 완전한 실험 과정을 수행하지 않았기 때문에 분석한 환자의 수가 상기 표 8에 기재한 환자의 수보다 작았으며, 하나의 바이오마커에서 다른 것으로 바꾸었다. 각 바이오마커에 대해 분석한 조직 단편의 수는 표 11에 나타내었다. 통상적인 유방암 마커(ER, PR, Ki67, Her2/neu (CerbB2))에 대해 분석한 환자 샘플 수는 표 12에 나타내었다.

표 11: 바이오마커 과다 발현에 대해 분석한 조직 단편의 수

표 12: 기존의 유방암 마커에 대해 분석한 조직 단편의 수

분할 및 디스패처(Dispatcher) 설정

MARS 분석을 슬라이드를 특징화하는 병리학자의 방식에 근접하게 하기 위해, 적어도 1+로 판단된 세포만 선택하였다. 표 13은 본 분석에서 MARS에 사용된 분할 설정을 요약한 것이다. 이러한 분할 설정은 대부분의 염색된 세포 검출을 도출한다. 분할 및 디스패처 투과(transmittance) 역치는 세포 입력치(cytologist input)를 토대로 하였다. 분할 설정은 컴퓨터 TPO-RDLAB5상의 Dage camera로 포착한 20 x 이미지를 이용한 픽셀을 토대로 한다.

표 13: 주 분할 설정 파라미터

세포의 표적 구역에서의 바이오마커 염색 강도를 기초로 선택 세포를 분류하기 위해, 분할 결과 유효한 세포는 3가지 카테고리로 두었다(dispatched):1(MARS: NegRef), 2(MARS: Test) 및 3(MARS: PosRef). 표 14는 이러한 디스패치를 수행하기 위한 마커의 세포 위치 함수로서 MARS 항목과 그 값을 나타낸다.

표 14: 선별 세포의 카테고리 1, 2 또는 3으로 할당하는 디스패치 세팅

카테고리 0("무염색 세포의 예상수"에 해당) 평가를 수행하였다. 이러한 세포의 대략적인 수를 염색 강도 1, 2 및 3을 나타내는 세포의 면적으로부터 구한 평균 종양 세포 면적(CELL_AREA이라고 하는 MARS 항목으로부터 추정된 1110 픽셀)을 이용하여 계산하였다:

N₀, N₁, N₂ 및 N₃을 이용하여, 0, 1, 2 및 3 염색 세포의 퍼센트를 계산하였 다. 표 15는 이러한 새로운 항목의 명칭을 나타낸다.

표 15: 퍼센트 요약 항목

이러한 항목은 예컨대 CELL_PERCENT_0의 경우 하나의 퍼센트로서, 계산되었다:

본 실험은 MARS 항목들, 이러한 새로운 요약 항목들 및 병리학자에 의한 점수화로 수행되었다. USER_TYPE은 병리학자가 점수를 매긴 경우에만 적용되는 MARS 항목 명칭이다.

다중 바이오마커 분석

민감도/특이도 둘다를 향상시키기 위해, 복수의 바이오마커로부터 수득한 데이타를 조합하여 분석하였다. 각 바이오마커에 대한 타겟 특이도는 조합한 바이오마커의 수에 의존적이었다. 예로서, 각 개별 마커의 특이도가 0.81/3 = 93% 이상이라면, 2종의 바이오마커 조합의 특이도는 80%에 이를 것이다. 표 16은 1-9종의 바이오마커는 조합된 수를 토대로한 필수 특이도 값을 나타낸다.

표 16: 최대 9종의 바이오마커의 조합에 대해, 총 특이도가 0.8일때, 바이오마커당 최소 필수 특이도

데이타 해석

본원에서, 용어 "마커 수행"은 마커의 참된 생물학적인 식별력 뿐만 아니라 생물 샘플의 기원 및 저장, 염색 프로토코르 스캔닝 과정 이미지화 및 데이타 마이닝(date mining) 과정과 관련된 전체 실험 수행을 포함한다.

결과

1. 바이오마커

A. 병리학자에 의해 점수 매기기

병리학자에 의한 점수화만을 고려하였을때, 최상의 민감도/특이도 쌍을 제공하는 역치를 계산하였다(USER_TYPE, MARS). 특이도 0.75를 목표로 하였을때의 유의한 대부분의 결과는 표 17에 나타내었다.

표 17: 바이오마커에 대한 최상의 민감도 및 특이도 쌍(병리학자에 의한 점수화)

또한, 기존의 유방 패널 마커(즉, ER, PR, Ki67, 및 Her2/neu (CerbB2))에 대한 병리학작의 평가만을 고려하였을때, 최상의 민감도/특이도를 주는 역치를 계산하였다. 특이도 0.75를 목표로 하였을때의 유의한 대부분의 결과는 표 18에 나타낸다.

표 18: 기존의 마커에 대한 최상의 민감도 및 특이도 쌍(병리학자에 의한 점수화)

각 바이오마커 및 기존의 유방암 마커(즉, ER, PR, Ki67, 및 Her2/neu (CerbB2)) 경우, 최상의 민감도/특이도 쌍을 보이는 역치를 병리학자 평가 단독에 대해서만 계산하였다(USER_TYPE). 대응하는 수신체 작동 특징(receiver operating characteristics, ROC) 곡선을 그렸다(데이타 미기재).

B. 단일 항목 분석

각 바이오마커의 경우, 분석한 바이오마커에 대해서 의미있는 것으로 정의된 각 MARS 항목을 고려하였을때, 항목 및 최상의 민감도/특이도 쌍을 보이는 역치를 계산하였다. 대응하는 ROC를 구하였다(데이타 미기재). 특이도 0.75를 목표로 하였을때의 유의한 대부분의 결과는 표 19에 나타낸다.

표 19: MARS 항목으로부터 수득한 각 바이오마커에 대한 최상의 민감도 및 특이도 쌍(단일 항목 알고리즘)

* 규정 1 결정은 역치 이상의 환자는 양성(즉, 실제 임상 결과가 나쁘다면 진양성)으로 판단됨을 의미하며, 반면에 규정 8은 역치 이상의 환자는 음성(즉, 실제 임상 결과가 나쁘다면 위 음성)으로 판단됨을 의미한다.

C. 다중 항목 분석

각 퍼센트 요약 항목은 둘씩 조합하였고, 최상의 민감도/특이도 쌍을 보이는 역치를 계산하였다. 특이도 0.75를 목표로 하였을때의 각 바이오마커에 대한 유의한 대부분의 결과는 표 20에 나타낸다.

표 20: MARS 항목들로부터 수득한 각 바이오마커에 대한 최상의 민감도/특이도 쌍(다중 항목 알고리즘)

* 규정 결정은 2가지 항목 스페이스에서 4분의 작용에 해당된다.

2. 바이오마커의 조합

1 내지 9종의 마커의 가능한 조합 전체 세트를 연속적으로 병리학작에 의한 점수화, MARS 항목 및 마커당 2개의 MARS 항목들을 이용하여 조사하였다. FDA계 및 서열을 이용한 해석 방법에 따라 특이도 및 민감도를 계산하였다. "FDA계"는 임의의 마커가 결과가 양호하지 않은 것으로 결정하는데 ON(1)임을 의미한다. 즉, 하나이상의 마커가 양성이라면 마커들의 조합은 양성으로 간주된다. 서열을 이용한 해석 방법은 각 특이적인 ON/OFF 조합의 민감도/특이도에 달려있다. 병리학자에 의한 점수화(표 21) 및 퍼센트 항목 평가(표 22)로 수득한 결과는 하기에 나타낸다.

표 21: 여러가지 목표 특이도(75% 및 95%) 및 여러가지 해석 알고리즘(병리학자에 의한 점수화)를 이용하여 바이오마커 조합에 대한 최상의 민감도/특이도 쌍

* 각 환자는 병리학자에 의한 점수화로 특징화됨

표 22: 여러가지 목표 특이도(75% 및 95%) 및 여러가지 해석 알고리즘(병리학자에 의한 점수화)를 이용하여 바이오마커 조합에 대한 최상의 민감도/특이도 쌍

* 각 환자는 1, 2 및 3개의 염색 세포의 퍼센트로 특징화됨

4종 및 6종의 바이오마커의 조합에 대한 구체적인 실시예는 실시예 5에 기재되어 있다.

침윤성 소엽암(ILC) 환자 데이타없이 분석

표 8에 기술한 환자 집단을 진단에 따라 다시 하위 분류하였다. 구체적으로, 침윤성 소엽암(ILC) 환자 데이타는 제외시키고, 수득되는 데이트 세트에 대한 상기 분석을 수행하였다. 본 실험에서 분석한 구체적인 환자 집단 사항은 표 23에 나타낸다.

표 23: 분석한 환자 집단(ILC 환자 제외)

결과

1. 바이오마커

A. 병리학자에 의한 점수화

표 24: ILC 환자 데이타를 제외한 바이오마커에 대한 최상의 민감도 및 특이도 쌍(병리학자에 의한 점수화)

표 25: ILC 환자 데이타를 제외한 기존 마커에 대한 최상의 민감도 및 특이도 쌍(병리학자에 의한 점수화)

B. 단일 항목 분석

표 26: ILC 환자 데이타를 제외한 MARS 항목으로부터 수득한 각 바이오마커에 대한 최상의 민감도 및 특이도 쌍(단일 항목 알고리즘)

* 규정 1 결정은 역치 이상의 환자는 양성(즉, 실제 임상 결과가 나쁘다면 진양성)으로 판단됨을 의미하며, 반면에 규정 8은 역치 이상의 환자는 음성(즉, 실제 임상 결과가 나쁘다면 위 음성)으로 판단됨을 의미한다.

C. 다중 항목 분석

표 27: ILC 환자 데이타를 제외한, MARS 항목들로부터 수득한 각 바이오마커에 대한 최상의 민감도/특이도 쌍(다중 항목 알고리즘)

* 규정 결정은 2가지 항목 스페이스에서 4분의 작용에 해당된다.

D. 분석간의 차이 : 모든 환자 대 ILC 환자를 제외한 경우

전체 환자(표 8) 및 ILC 환자를 제외한 집단(표 23) 분석으로 바이오마커마드 수득한 민감도 및 특이도 수치 차이를 결정하였다. 그 결과는 하기 표 28에 나타내었다. 합을 기재한 열(d²)은 ROC 곡선상의 2차 길이(quadratic distance) 차이, 즉 민감도 및 특이도에서의 전반적인 증가를 나타낸다.

표 28: 전체 환자 집단 및 ILC 환자 데이타를 제외한 집단의 민감도 및 특이도 차이(바이오마커 당)

2. 바이오마커의 조합

A. 병리학자에 의한 점수화

표 29: 여러가지 목표 특이도(75% 및 95%) 및 여러가지 해석 알고리즘을 이용한, ILC 환자 데이타를 제외한, 바이오마커 조합에 대한 최상의 민감도/특이도 쌍(병리학자에 의한 점수화)

* 각 환자는 병리학자에 의한 점수화로 특정화됨

B. 퍼센트 항목 분석

표 30: 여러가지 목표 특이도(75% 및 95%) 및 여러가지 해석 알고리즘을 이용한, ILC 환자를 제외한, 바이오마커 조합에 대한 최상의 민감도/특이도 쌍(퍼센트 항목)

* 각 환자는 1, 2 및 3개의 염색 세포의 퍼센트로 특정화됨

표 30은 단일 퍼센트 항목으로 ILC 환자를 제외한 5종의 바이오마커 조합을 고려하였을때의 특이도 증가를 나타낸다(0.81에 비해 0.88, 표 28 참조). 상기 연구에서 ILC 환자를 제외하였을때 5종의 바이오마커 서열 분석에 대한 2가지 항목(0.71 vs. 0.65, 표 28 참조)을 이용하였을때, 민감도 증가가 관찰되었다.

C. 분석 차이: 모든 환자 대 ILC 환자를 제외한 집단

전체 환자 집단과 ILC 환자를 제외한 집단 분석으로 바이오마커 조합에 대해 수득한 민감도 및 특이도 수치 차이를 결정하였다. 그 결과는 하기 표 31에 나타내었다. 합을 기재한 열(d²)은 ROC 곡선상의 2차 길이(quadratic distance) 차이, 즉 민감도 및 특이도에서의 전반적인 증가를 나타낸다. ILC 환자를 연구에 제외시켰을때, 1 또는 2 퍼센트 항목을 이용한 5 바이오마커 서열 분석에 대한 수행에서의 약간의 증가가 관찰되었다.

표 31: 전체 환자 집단 및 ILC 환자 데이타를 제외한 집단의 민감도 및 특이도 차이(바이오마커 조합)

실시예 5: 특이적인 바이오마커 조합

실시예 4의 연구에서 수득한 데이타를 추가적으로 분석하여, 특이적인 바이오마커 조합을 고려하였다. 4(SLPI/p21ras/E2Fl/src) 및 6(SLPI/p21ras/PSMB9/ E2Fl/src/phospho-p27) 바이오마커의 조합으로 수득한 결과를 하기에 나타낸다.

4개의 바이오마커 조합: SLPI/p21ras/E2Fl/src

표 32의 역치 및 결정 규정으로 SLPI, p21ras, E2F1, 및 src 에 대한 1% 항목만 이용하여 분석을 실시하였다. 60% 민감도 및 80% 특이도가 수득되었다: E2F1 이 ON(즉 1)이고 하나의 바이오마커만 ON이 아닌 경우, 환자는 결과 나쁨으로 판단되며, 그렇지 않은 경우에는 결과 좋음으로 판단된다. 도 1은 E2F1에 대해 결과가 좋음 및 양호하지 않은 환자의 함수로서 퍼센트 항목의 분포를 나타낸다. 2.46% 역치를 이용하여, 민감도 및 특이도 각각 0.54 및 0.75가 수득되었다.

표 32: 4종의 바이오마커 분석에 대한 퍼센트 요약 항목들

서열을 이용한 판정 방법을 이용하여 4종의 바이오마커 조합을 분석하였다. 서열을 이용한 판단 규정을 사용하였다: E2F1이 ON(즉 1)이고 하나의 바이오마커만 ON이 아닌 경우, 환자는 결과 나쁨으로 판단되며, 그렇지 않은 경우에는 결과 좋음으로 판단된다. 4종의 바이오마커의 가능한 조합 모두에 대한 민감도 및 특이도는 표 33에 나타내었다. SLPI/p21ras/E2Fl/src 조합에 대한 서열 판정 방법을 이용하여 수득한 ROC 곡선을 구하였다(데이타 미기재).

표 33: SLPL p21ras, E2F1 및 SRC 조합에 대한 서열 판정 방법을 이용한 민감도 및 특이도 쌍들

* 서열 S0110은 다음과 같이 판독된다: SLPI = OFF / p21ras = ON / E2F1 = ON / src = OFF.

E2F1 단독을 토대로한 판정의 민감도 및 특이도는 각각 54% 및 75%였다. 특이도 및 민감도 각각 60% 및 80%를 전술한 서열을 이용한 알고리즘으로 수득하였다(E2F1이 ON(즉 1)이고 하나의 바이오마커가 ON이 아니라면, 환자는 결과 나쁨으로 간주되지만, 그렇지 않으면 결과 좋음으로 간주됨).

6종의 바이오마커 조합: SLPI/p21ras/E2Fl/src/PSMB9/phospho-p27

표 34의 역치 및 판정 규정을 이용하여, SLPI, p21ras, E2F1, src, PSMB9, 및 phospho-p27의 6종의 바이오마커에 대한 단지 1% 항목으로 분석을 수행하였다.

표 34: 6종의 바이오마커 분석에 대한 퍼센트 요약 항목들

서열을 이용한 판정 방법을 이용하여 6종의 바이오마커 조합을 분석하였다. 서열을 이용한 판정 규정을 이용하였다: E2F1이 ON(즉 1)이고 SLPI 또는 21ras 중 하나, 또는 E2F1 및 임의의 2종의 바이오마커, 또는 SLPI 및 임의의 2종의 바이오마커, 또는 임의의 4종의 바이오마커 또는 그 이상이 ON이면, 환자는 결과 나쁨으로 간주되지만, 그렇지 않으면 결과 좋음으로 간주됨. 6종의 바이오마커의 가능한 조합 모두들에 대한 민감도 및 특이도를 표 35에 나타낸다. SLPI/p21ras/E2Fl/PSMB9/src/phospho-p27 조합에 대해 서열 판정 방법을 이용하여 수득한 ROC 곡선은 도 2에 나타내었다.

표 35: SLPI/p21ras/E2Fl/PSMB9/src/phospho-p27 조합에 대해 서열 판정 방법을 이용한 민감도 및 특이도 쌍

상기 서열을 이용한 알고리즘을 이용하여, 특이도 및 민감도를 각각 70& 및 77%로 구하였다.

실시예 6: 면역조직화학의 시약 및 염색 조건 최적화

본원의 면역조직화학 방법을 이용하여 특정 바이오마커의 발현을 검출하는대 있어 신호 대 노이즈 비를 최대화하기 위해, 최적 항원 복구 용액 및 조건, 항체 농도 및 희석제 제형 및 검출 화학 파라미터 선택 실험을 수행하였다. 각 실험 세트에서, 일정한 파라핀 블롯으로부터 실린더형의 조직 표준을 수득하고, 이를 단일 블롯으로 조합한 다음 복수개의 조직 표본을 포함하는 섹션을 제조함으로써, 바이오마커 특이적인 조직 마이크로어레이(TMA)를 주축하였다. 각 유방 바이오마커에 대해 2-3개의 미리 선택된 양성 및 음성이 공지된 종양이 있는 TMA를 사용하였다. 슬라이드를 준비하여, 실시예 1에 개시된 바와 같이 자동 면역조직화학을 수행하였다. 모든 최적화 실험에서, 하기 대조군을 사용하였다:

- 음성 대조군으로, 일차 항체는 비특이적인 마우스 또는 토끼 IgG중 어느 하나인 일반적인 음성 시약을 이용하기 위해 레디(ready)로 치환되었다.

- EFl -α를 양성 대조군으로 사용하였다.

- 양성 마커 대조 슬라이드는 각 항체에 대한 실현 가능성 테스트 중 표지 파라미터 최적화 수립 이후에 운용하였다.

- 양성 및 음성 종양 모두를 포함하는 TMA 특이적인 바이오마커를 각 유방 마커 항체 테스트에 사용하였다.

1. 항원 복구 최적화

A. 항원 복구 용액

하기 나열한 각 항원 복구 용액을 대상 바이오마커 항원 각각을 이용하여 테스트하였다. 사용한 시간 및 온도는 하기와 같이 표준적으로 수용되는 값이다.

표 36: 테스트 항원 복구 용액

슬라이드는 병리학자에 의해 점수를 매기고, 양성 및 음성 종양간의 표지 특이도 및 강도를 비교함으로써 최상의 항원 복구 시간 및 온도 조합을 결정하였다. 결과가 본래 음성이면, 대안적인 항원 복구 용액을 스크리닝 하였다. 결과가 양성, 즉 다른 항원 복구 용액보다 강도가 강하게 게 표지되면, 탑(1-3) 용액을 동정하여, 항원 복구 시간 및 온도 테스트에 사용하였다. 선택한 항원 복구 용액은 전체 조직 단편을 대표적인 양성 및 음성 샘플로 표지함으로써 검증하였다.

B. 항원 복구 조건 - 시간 및 온도

최상의 항원 복구 용액을 하기 시간 및 온도 조건으로 테스트 하였다.

표 37: 테스트 항원 복구 시간 및 온도 조건

슬라이드는 병리학자에 의해 점수를 매기고, 양성 및 음성 종양간의 표지 특이도 및 강도를 비교함으로써 최상의 항원 복구 시간 및 온도 조합을 결정하였다. 선택한 항원 복구 용액과 시간 및 온도 조합의 활성은 하기 대조군을 이용한 전체 조직 단편을 대표적인 양성 및 음성 샘플로 표지함으로써 검증하였다.

2. 항체 희석 및 희석제 제형의 최적화

A. 항체 희석

항체 희석 범위에서 각 유방암 바이오마커 항체를 테스트하였다. 표 38은 SLPI 5G6.24 항체에 대한 항체 희석 테스트 예를 나타낸다. 다른 유방 바이오마커 항체 모두 유사한 방법으로 테스트하였다.

표 38: 항원 희석 테스트

슬라이드는 병리학자가 점수를 매겼으며, 대조군들, 공지된 양성 및 공지된 음성 종양 간의 표지 세기를 분석하였다. 표지 데이타를 분석하여 각 항체의 이용 범위의 폭과 원하는 표지 강도를 유지하는 항체 희석 상한 및 하한 모두를 결정하였다. 테스트한 초기 희석 범위가 상한 및 하한 범위를 형성하지 않는다면, 다른 항체 희석을 테스트하였다.

B. 항체 희석제 제형

유방 바이오마커 항체 각각을 이용하여 여러가지 항체 희석제를 테스트하였다. 하기 표는 테스트한 희석제 파라미터의 내용을 나타낸다.

표 39: 항체 희석 테스트

병리학자는 표지 강도에 따라 슬라이드를 점수화하였다. 희석제 제형의 효능은 바이오마커 대조 슬라이드의 표지 등급을 실험 슬라이드와 비교하여 결정하였다. 양성 및 음성 종양 표지를 비교하여, 신호 대 노이즈 비율이 가장 특이적이고 높은 신호를 형성하는 것을 먼저 실시하였다. 최적의 표지 강도를 형성하는 희석제 제형(약 1 내지 3)을 이후의 최적화 및 안정성 실험에 투입하였다. 선택한 희석제의 활성은 대표적인 양성 및 음성 샘플로 전체 유방암 조직 섹션을 표지함으로써 검증하였다.

3. 검출 화학 최적화

아래 기재된 시간 및 농도 범위에서, DAKO Envision+ 검출 키트를 이용하여 각 유방 바이오마커 항체를 테스트하였다.

표 40: 테스트한 검출 화학 시간 및 농도 조건

슬라이드는 병리학자가 점수를 매겼으며, 대조군들, 공지된 양성 및 공지된 음성 종양 간의 표지 세기를 분석하였다. 전체 유방암 조직 단편을 대표적인 양성 및 음성 샘플로 표지함으로써, 선택한 검출 화학 시간 및 농도 조합의 활성을 검증하였다.

결과

최적화된 염색 시약 조건에서 현저한 신호 대 노이즈 비 향상이 관찰되었다(데이타 미기재).

실시예 7: 임상 샘플에서의 바이오마커의 실시간 PCR 검출

ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 TaqMan® 실시간 PCR을 수행하였다. 프라이머와 프로브는 Primer Express™ program, version 1.5 (Applied Biosystems, Foster City, CA)의 도움을 받아, 본 실험에서 유방암 단계 표적 마커(예, DARPP32 및 NDRG-1)의 특이적인 증폭용으로 제작하였다. 프라이머 및 프로브의 서열 정보는 하기에 나타낸다.

DARPP32:

프로브를 5'베이스에 형광 염료 FAM(6-carboxyfluorescein) 및 3'베이스에 퀀칭 염료 TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)로 표지하였다. 증폭 산물의 크기는 약 100 bp이었다. 18S 라이보좀 RNA는 내인성 대조군으로 사용하였다. 18S rRNA 프로브는 형광 염료 VIC로 표지하였다. Pre-Developed 18S rRNA 프라이머/프로브 혼합물을 Applied Biosystems (P/N: 4310893E)에서 구입하였다. 20개의 유방 내동 조직(즉, 예후가 양호하지 않은 종양 6개, 예후가 양호한 종양 12개, 정상 조직 2개)를 본 실험에서 분석하였다. 본 실험에서, 양호한 결과는는 적어도 5년간 암이 없는 상태로 있는 것을 의미하며, 양호하지 않은 결과는 5년이내에 질병 재생, 재발 또는 사망을 의미한다. 유방 냉도 조직으로부터 추출한 총 RNA 5 ㎍을 High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, P/N: 4322171)을 이용하여, 랜덤 헥사머(올리고-dT 아님)로 단일가닥 cDNA 형태로 정량적으로 변환시켰다. 하기 반응시약을 제조하였다.

2OX의 프라이머/프로브의 마스터 믹스(200 ㎕)

180 μM 정방향 프라이머 20 ㎕

180 μM 역방향 프라이머 20 ㎕

100 μM TaqMan 프로브 10 ㎕

H₂O 150 ㎕

최종 반응 혼합물(25 ㎕/웰)

2OX의 프라이머/프로브의 마스터 믹스 1.25 ㎕

2X TaqMan Universal PCR 마스터 믹스(P/N: 4304437) 12.5 ㎕

cDNA 주형 5.0 ㎕

H₂O 6.25 ㎕

2OX TaqMan Universal PCR 마스터 믹스는 Applied Biosystems(P/N: 4304437)에서 구입하였다. 최종 프라이머 및 프로브 농도는 총 부피 25 ㎕에서 각각 0.9 μM 및 0.25 μM이다. 총 RNA 10 ng을 각 반응 웰에 가하였다. 증폭 조건은 총 40 사이클로, 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 그리고 2단계 사이클의 95℃에서 15 초, 60℃에서 60초이다. 각 반응에서 주형이 없는 대조군 반응 혼합물 3종 이상을 사용하였다. 모든 실험은 3배수로 수행하였다.

반응 후에, 하기 계산에 형광 강도 기록 결과를 사용하였다: Rn⁺는 모두 성분을 함유하고 있는 반응의 Rn 값, Rn^-는 무반응 샘플의 Rn 값(베이스라인 값 또는 NTC에서 검출된 값)이다. ΔRn은 Rn⁺와 Rn^-의 차이다. PCR에서 수득한 신호 세기를 나타낸다. 표적 유전자의 발현율은 비교 C_T 방법에 의해 계산하였다. 이 방법은 함량을 모르는 표준물질을 사용하였고, 상대적인 함량의 표적 서열을 선택한 비교값과 비교하였다(18S rRNA는 본 실험에서 빅교군으로서 선택하였다). Applied Biosystems의 MS 엑셀 데이타 분석에 대한 구체적인 설명서가 포함된 TaqMan Human Endogenous Control Plate Protocol을 참조한다.

결과

각 바이오마커 및 특이적인 프라이머로 수득한 결과는 하기 표에 나타내었다. 정상적인 유방 조직 샘플로 수득한 결과는 N으로 기재하며, 유방암 샘플 결과는 T로 나타낸다.

표 41: DARPP32 TaqMan® 결과

DARPP32는 두가지 전사체 t1 및 t2를 가진다. TaqMan® 데이타는 t1 및 t2 모두 결과가 양호한 유방 종양에 비해 결과가 양호하지 않은 유방 종양에서 과다 발현됨을 보였다.

표 42: NDRG-1 TaqMan® 결과

NDRG-1은 하나의 전사체를 가진다. TaqMan® 데이타는 NDRG-1가 결과가 양호한 유방 종양에 비해 결과가 양호하지 않은 유방 종양(굵은 글씨로 표시)에서 과다 발현됨을 보였다.

실시예 8: 10년간 임상적인 추적으로 케모-나이브(chemo-naive) 환자 집단에서의 바이오마커 과다 발현 검출(5 바이오마커 패널)

255개의 초기 단계의 유방암 환자로부터 처음 진단 시기나 그 무렵에 수득한 유방 종양 조직 샘플을, 본 실험에서 바이오마커 과다 발현에 대해 분석하였다. 10년간 임상 추적 데이타는 본 실험에서 모든 환자들에 대해 이용가능하였다. 환 자 모두 유방암에 대한 치료 중 임의 시기에 세포독성의 화학요법을 받지 않았다. 환자 집단에 대한 임상적인 인구 통계학, 분포 및 표준 조직병리학적 파라미터(예, ER/PR 호르몬 리셉터 상태, 조직학적 등급 등)를 표 43에 요약하였다.

표 43: 케모-나이브 화학 집단의 임상적인 특징

SLPI, src, PSMB9, p21ras, 및 E2F1을 포함하는 5종의 바이오마커 패널의 발현 검출을 전술한 바와 같이 필수적으로 수행하였다. 즉, 유방 종양 샘플을 준비하여, 실시예 1에 기재된 바와 같이 Dako Autostainer를 이용하여 바이오마커 발현을 보기 위해 염색하였다. 바이오마커의 과다 발현은 실시예 4의 이미징 분석으로 결정하였다.

5종의 바이오마커 패널의 예후 수행은 콕스의 비례 위험 모형(Cox Proportional Hazards Model) 분석으로 평가하였다. 예컨대 전술한 Spruance et al을 참조한다. 10년이내에 질병이 재발 또는 사망하거나, 또는 10년 이후에 무병인 환자를 동정하기 위한 각 바이오마커의 예후 수치 및/또는 조직 특징을 계산하였다. 바이오마커 패널을 사용하지 않는 분석에서, 연령 및 종양 크기는 p<0.05인 독립적인 예후 인자로 확인되었다. 바이오마커를 본 분석에 적용하였을때, 통계학상 가장 유의한 독립적인 이용성을 보였으며, p값은 <0.0001이었다. 콕스의 비계 위험 모형 결과를 하기 표 44에 요약하였다.

표 44: 케모-나이브 환자 집단에 대한 콕스의 비례 위험 모형 분석 결과(SLPI, src, PSMB9, p21ras, 및 E2F1 바이오마커 패널)

SLPI, src, PSMB9, p21ras 및 E2F1 바이오마커 패널을 이용한 예후 수행은 도 3의 Kaplan-Meier 플롯에 그래프로 나타낸다. X 축은 첫 진단이후의 경과 년수 이고, y 축은 무병 생존율이다. 바이오마커 분석과 독립적인 일반적인 유방암 집단에 대한 그래프는 도 4로 나타낸다. 이들 플롯은, 상기 바이오마커 패널이 초기 단계 유방암 환자 집단을 질병 재발 및/또는 일차 질환으로의 사망할 위험성을 계층화할 수 있는 능력을 나타낸다. 재발 및/또는 일차 질환으로 사망할 위험성은 환자 샘츨에 과다 발현되는 바이오마커의 수가 증가할 수록 높아진다. 0 양성, 1 양성, 2 양성, 3 또는 그이상의 양성 바이오마커 그룹들의 비교에 대한 로그 랭크 테스트에 의해 결정된 바와 같이, 과다 발현된 바이오마커의 수로 구별한 환자의 서브그룹의 무병 생존율은, 서로 통계학적으로 유의하였으며 p는 <0.001이었다. 본원에 개시된 이미징 분석에 의해 과다 발현으로 분류된 바이오마커는 "양성"으로 판단한다.

유방암 환자의 진단에 가장 중요한 임상 항목들 중 하나는 에스트로겐 리셉터(ER) 상태이므로, SLPI, src, PSMB9, p21ras, 및 E2F1 바이오마커 패널의 예후 수행을 ER-양성 및 -음성 환자 서브그룹에 대해 콕스의 비례 위험 모형 분석법으로 더욱 분석하였다. ER-양성 환자는 타목시펜 요법의 후보자이지만 ER 음성 확자들은 그렇지 않기 때문에, 이러한 두가지 서브그룹의 임상적인 관리 및 예후는 상이하다. 분석 결과는 하기 표 45에 요약 개시하였다. 결과 데이타는, 5종의 대상 바이오마커가 ER 양성 및 음성인 유방암 환자 서브그룹 모두에서 예후 용도로 활용성이 있음을 나타낸다. 따라서, 바이오마커 SLPI, src, PSMB9, p21ras, 및 E2F1은 환자의 ER 상태와는 독립적으로 예후를 나타내지만, 이들 바이오마커는 또한 ER 상태와 서로 관련있다.

표 45: 케모-나이브 환자 집단에 대한 콕스의 비례 위험 모형 분석 결과(ER 양성 및 음성인 환자 서브그룹에서, SLPI, src, PSMB9, p21ras, 및 E2F1 바이오마커 패널)

실시예 9: 10년간 임상적인 추적으로 케모-나이브(chemo-naive) 환자 집단에서의 바이오마커 과다 발현 검출(6 바이오마커 패널)

실시예 8의 케모-나이브 환자 집단의 100명(50명은 결과 좋음, 50명은 결과 나쁨)으로부터 수득한 유방 종양 조직을, 6종의 대상 바이오마커(SLPI, src, PSMB9, p21ras, E2F1, 및 MUC-1)의 과다 발현에 대해 분석하였다. 6종의 바이오마 커 패널의 발현 검출은, 대체 염색 플랫폼인 Ventana BenchMark XT를 Dako Autostainer 대신 사용하는 것을 제외하고는 전술한 바를 기본으로 자동 면역조직화학법으로 수행하였다. Ventana BenchMark XT의 표준 조작 매뉴얼은 제조사로부터 쉽게 구할 수 있다. Ventana BenchMark XT 염색 플랫폼과 함께 사용한 면역조직화학 파라미터에 적용된 부가적인 변형은 하기 표 46에 요약 개시하였다. 실시예 4에 기재한 이미징 분석 방법을 이용하여 바이오마커 과다 발현을 측정하였다.

표 46: Ventana BenchMark XT 염색 프랫폼을 이용한 바이오마커 염색에서의 면역조직화학 파라미터

* CC1 및 CC2는 Ventana로부터 구입가능한 세포 컨디셔닝제이다. 항원 복구 시간: 단기 = 30분; 표준 = 60분; 및 연장 = 90분

6종의 바이오마커 패널의 예후 수행은 상기 콕스의 비례 위험 모델 분석법을 이용하여 조사하였다. 10년내에 질병이 재발하거나 사망하는 환자부터 10년후에도 무병한 환자를 동정하기 위한 각 바이오마커의 예후 수치 및/또는 조직학적 특징을 계산하였다. 대상 바이오마커(SLPI, src, PSMB9, p21ras, E2F1, 및 MUC-1)는 통계적으로 유의한 예후 유용성을 나타내었으며, p 값은 0.0220이었다. 콕스의 비례 위험 분석 결과는 하기 표 47에 요약 개시하였다.

표 47: 케모-나이브 환자 집단에 대한 콕스의 비례 위험 모형 분석 결과(SLPI, src, PSMB9, p21ras, E2F1 및 MUC-1 바이오마커 패널)

SLPI, src, PSMB9, p21ras, E2F1, 및 MUC-1 바이오마커 패널을 이용한 예후 수행은 도 5의 Kaplan-Meier 플롯에 그래프로 나타낸다. X 축은 첫 진단 이후의 경과 년수이고, y 축은 무병 생존율이다. 이 플롯은, 상기 바이오마커 패널이 초기 단계 유방암 환자 집단을 질병 재발 및/또는 일차 질환으로의 사망할 위험성을 계층화할 수 있는 능력을 나타낸다. 재발 및/또는 일차 질환으로 사망할 위험성은 환자 샘플에 과다 발현되는 바이오마커의 수가 증가할수록 높아진다. 0 양성, 1 양성, 2 양성, 3 또는 그이상의 양성 바이오마커 그룹들의 비교에 대한 로그 랭크 테스트에 의해 결정된 바와 같이, 과다 발현된 바이오마커의 수로 구별한 환자의 서브그룹의 무병 생존율은, 서로 통계학적으로 유의하였으며 p는 <0.0065이었다. 본원에 개시된 이미징 분석에 의해 과다 발현으로 분류된 바이오마커는 "양성"으로 판단한다.I

표 48: 바이오마커 핵산 및 아미노산 서열 정보

명세서에 기재된 모든 공개물 및 특허 출원들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자 수준을 나타낸다. 모든 공개물 및 특허 출원은 각각의 개별 공개물 또는 특허 출원이 구체적이고도 개별적으로 원용에 의해 통합되는 것으로 기재된 바와 같이 동일한 범위로 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

전술한 발명은 이해를 명확하게 하기 위해 예와 실시예를 들어 보다 구체적으로 설명하지만, 임의 변형 및 수정이 첨부된 예의 범위내에서 실시될 수 있음은 자명한 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> TriPath Imaging, Inc. Fischer, Timothy J. Whitehead, Clark M. Malinowski, Douglas P. Marcelpoil, Raphael Morel, Didier <120> Methods and Compositions for Evaluating Breast Cancer Prognosis <130> 46143/296716 <150> 60/612,073 <151> 2004-09-22 <150> 60/611,965 <151> 2004-09-22 <160> 41 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 598 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (23)...(421) <400> 1 cagagtcact cctgccttca cc atg aag tcc agc ggc ctc ttc ccc ttc ctg 52 Met Lys Ser Ser Gly Leu Phe Pro Phe Leu 1 5 10 gtg ctg ctt gcc ctg gga act ctg gca cct tgg gct gtg gaa ggc tct 100 Val Leu Leu Ala Leu Gly Thr Leu Ala Pro Trp Ala Val Glu Gly Ser 15 20 25 gga aag tcc ttc aaa gct gga gtc tgt cct cct aag aaa tct gcc cag 148 Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala Gln 30 35 40 tgc ctt aga tac aag aaa cct gag tgc cag agt gac tgg cag tgt cca 196 Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys Pro 45 50 55 ggg aag aag aga tgt tgt cct gac act tgt ggc atc aaa tgc ctg gat 244 Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu Asp 60 65 70 cct gtt gac acc cca aac cca aca agg agg aag cct ggg aag tgc cca 292 Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro 75 80 85 90 gtg act tat ggc caa tgt ttg atg ctt aac ccc ccc aat ttc tgt gag 340 Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu 95 100 105 atg gat ggc cag tgc aag cgt gac ttg aag tgt tgc atg ggc atg tgt 388 Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys 110 115 120 ggg aaa tcc tgc gtt tcc cct gtg aaa gct tga ttcctgccat atggaggagg 441 Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala * 125 130 ctctggagtc ctgctctgtg tggtccaggt cctttccacc ctgagacttg gctccaccac 501 tgatatcctc ctttggggaa aggcttggca cacagcaggc tttcaagaag tgccagttga 561 tcaatgaata aataaacgag cctatttctc tttgcac 598 <210> 2 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Ser Ser Gly Leu Phe Pro Phe Leu Val Leu Leu Ala Leu Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ala Pro Trp Ala Val Glu Gly Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala 20 25 30 Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys 35 40 45 Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys 50 55 60 Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn 65 70 75 80 Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys 85 90 95 Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys 100 105 110 Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser 115 120 125 Pro Val Lys Ala 130 <210> 3 <211> 1513 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (236)...(742) <400> 3 attcacttct cacaaggact gggtgaagag ttctgcagcc ttacagagac tggaaaagaa 60 gcccaaacca aggcccccag agaggtcccc caggcccctt tgggtccctg agcctcagct 120 ggaggtgggg ggtgcctgca gtgcgctggc tcagtctcct tctgaaaagc tggatccagc 180 ttgtttgaag cccttgagct gatcttagat ccggcgcagg agaccaacgc ctgcc atg 238 Met 1 ctg ttc cgg ctc tca gag cac tcc tca cca gag gag gaa gcc tcc ccc 286 Leu Phe Arg Leu Ser Glu His Ser Ser Pro Glu Glu Glu Ala Ser Pro 5 10 15 cac cag aga gcc tca gga gag ggg cac cat ctc aag tcg aag aga ccc 334 His Gln Arg Ala Ser Gly Glu Gly His His Leu Lys Ser Lys Arg Pro 20 25 30 aac ccc tgt gcc tac aca cca cct tcg ctg aaa gct gtg cag cgc att 382 Asn Pro Cys Ala Tyr Thr Pro Pro Ser Leu Lys Ala Val Gln Arg Ile 35 40 45 gct gag tct cac ctg cag tct atc agc aat ttg aat gag aac cag gcc 430 Ala Glu Ser His Leu Gln Ser Ile Ser Asn Leu Asn Glu Asn Gln Ala 50 55 60 65 tca gag gag gag gat gag ctg ggg gag ctt cgg gag ctg ggt tat cca 478 Ser Glu Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu Leu Arg Glu Leu Gly Tyr Pro 70 75 80 aga gag gaa gat gag gag gaa gag gag gat gat gaa gaa gag gaa gaa 526 Arg Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu 85 90 95 gaa gag gac agc cag gct gaa gtc ctg aag gtc atc agg cag tct gct 574 Glu Glu Asp Ser Gln Ala Glu Val Leu Lys Val Ile Arg Gln Ser Ala 100 105 110 ggg caa aag aca acc tgt ggc cag ggt ctg gaa ggg ccc tgg gag cgc 622 Gly Gln Lys Thr Thr Cys Gly Gln Gly Leu Glu Gly Pro Trp Glu Arg 115 120 125 cca ccc cct ctg gat gag tcc gag aga gat gga ggc tct gag gac caa 670 Pro Pro Pro Leu Asp Glu Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Glu Asp Gln 130 135 140 145 gtg gaa gac cca gca cta agt gag cct ggg gag gaa cct cag cgc cct 718 Val Glu Asp Pro Ala Leu Ser Glu Pro Gly Glu Glu Pro Gln Arg Pro 150 155 160 tcc ccc tct gag cct ggc aca tag gcacccagcc tgcatctccc aggaggaagt 772 Ser Pro Ser Glu Pro Gly Thr * 165 ggaggggaca tcgctgttcc ccagaaaccc actctatcct caccctgttt tgtgctcttc 832 ccctcgcctg ctagggctgc ggcttctgac ttctagaaga ctaaggctgg tctgtgtttg 892 cttgtttgcc cacctttggc tgatacccag agaacctggg cacttgctgc ctgatgccca 952 cccctgccag tcattcctcc attcacccag cgggaggtgg gatgtgagac agcccacatt 1012 ggaaaatcca gaaaaccggg aacagggatt tgcccttcac aattctactc cccagatcct 1072 ctcccctgga cacaggagac ccacagggca ggaccctaag atctggggaa aggaggtcct 1132 gagaaccttg aggtaccctt agatcctttt ctacccactt tcctatggag gattccaagt 1192 caccacttct ctcaccggct tctaccaggg tccaggacta aggcgttttt ctccatagcc 1252 tcaacatttt gggaatcttc ccttaatcac ccttgctcct cctgggtgcc tggaagatgg 1312 actggcagag acctctttgt tgcgttttgt gctttgatgc caggaatgcc gcctagttta 1372 tgtccccggt ggggcacaca gcggggggcg ccaggttttc cttgtccccc agctgctctg 1432 cccctttccc cttcttccct gactccaggc ctgaacccct cccgtgctgt aataaatctt 1492 tgtaaataac aaaaaaaaaa a 1513 <210> 4 <211> 168 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Leu Phe Arg Leu Ser Glu His Ser Ser Pro Glu Glu Glu Ala Ser 1 5 10 15 Pro His Gln Arg Ala Ser Gly Glu Gly His His Leu Lys Ser Lys Arg 20 25 30 Pro Asn Pro Cys Ala Tyr Thr Pro Pro Ser Leu Lys Ala Val Gln Arg 35 40 45 Ile Ala Glu Ser His Leu Gln Ser Ile Ser Asn Leu Asn Glu Asn Gln 50 55 60 Ala Ser Glu Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu Leu Arg Glu Leu Gly Tyr 65 70 75 80 Pro Arg Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu 85 90 95 Glu Glu Glu Asp Ser Gln Ala Glu Val Leu Lys Val Ile Arg Gln Ser 100 105 110 Ala Gly Gln Lys Thr Thr Cys Gly Gln Gly Leu Glu Gly Pro Trp Glu 115 120 125 Arg Pro Pro Pro Leu Asp Glu Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Glu Asp 130 135 140 Gln Val Glu Asp Pro Ala Leu Ser Glu Pro Gly Glu Glu Pro Gln Arg 145 150 155 160 Pro Ser Pro Ser Glu Pro Gly Thr 165 <210> 5 <211> 748 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (8)...(355) <400> 5 ggccgcg atg agc ggg gag ccg ggg cag acg tcc gta gcg ccc cct ccc 49 Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro 1 5 10 gag gag gtc gag ccg ggc agt ggg gtc cgc atc gtg gtg gag tac tgt 97 Glu Glu Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys 15 20 25 30 gaa ccc tgc ggc ttc gag gcg acc tac ctg gag ctg gcc agt gct gtg 145 Glu Pro Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val 35 40 45 aag gag cag tat ccg ggc atc gag atc gag tcg cgc ctc ggg ggc aca 193 Lys Glu Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr 50 55 60 ggt gcc ttt gag ata gag ata aat gga cag ctg gtg ttc tcc aag ctg 241 Gly Ala Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu 65 70 75 gag aat ggg ggc ttt ccc tat gag aaa gat ctc att gag gcc atc cga 289 Glu Asn Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg 80 85 90 aga gcc agt aat gga gaa acc cta gaa aag atc acc aac agc cgt cct 337 Arg Ala Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro 95 100 105 110 ccc tgc gtc atc ctg tga ctgcacagga ctctgggttc ctgctctgtt 385 Pro Cys Val Ile Leu * 115 ctggggtcca aaccttggtc tccctttggt cctgctggga gctccccctg cctctttccc 445 ctacttagct ccttagcaaa gagaccctgg cctccacttt gccctttggg tacaaagaag 505 gaatagaaga ttccgtggcc ttgggggcag gagagagaca ctctccatga acacttctcc 565 agccacctca tacccccttc ccagggtaag tgcccacgaa agcccagtcc actcttcgcc 625 tcggtaatac ctgtctgatg ccacagattt tatttattct cccctaaccc agggcaatgt 685 cagctattgg cagtaaagtg gcgctacaaa cactaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 745 aaa 748 <210> 6 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro Glu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys Glu Pro 20 25 30 Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val Lys Glu 35 40 45 Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr Gly Ala 50 55 60 Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu Glu Asn 65 70 75 80 Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg Arg Ala 85 90 95 Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro Pro Cys 100 105 110 Val Ile Leu 115 <210> 7 <211> 3020 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (111)...(1295) <400> 7 tgaagctcgt cagttcacca tccgccctcg gcttccgcgg ggcgctgggc cgccagcctc 60 ggcaccgtcc tttcctttct ccctcgcgtt aggcaggtga cagcagggac atg tct 116 Met Ser 1 cgg gag atg cag gat gta gac ctc gct gag gtg aag cct ttg gtg gag 164 Arg Glu Met Gln Asp Val Asp Leu Ala Glu Val Lys Pro Leu Val Glu 5 10 15 aaa ggg gag acc atc acc ggc ctc ctg caa gag ttt gat gtc cag gag 212 Lys Gly Glu Thr Ile Thr Gly Leu Leu Gln Glu Phe Asp Val Gln Glu 20 25 30 cag gac atc gag act tta cat ggc tct gtt cac gtc acg ctg tgt ggg 260 Gln Asp Ile Glu Thr Leu His Gly Ser Val His Val Thr Leu Cys Gly 35 40 45 50 act ccc aag gga aac cgg cct gtc atc ctc acc tac cat gac atc ggc 308 Thr Pro Lys Gly Asn Arg Pro Val Ile Leu Thr Tyr His Asp Ile Gly 55 60 65 atg aac cac aaa acc tgc tac aac ccc ctc ttc aac tac gag gac atg 356 Met Asn His Lys Thr Cys Tyr Asn Pro Leu Phe Asn Tyr Glu Asp Met 70 75 80 cag gag atc acc cag cac ttt gcc gtc tgc cac gtg gac gcc cct ggc 404 Gln Glu Ile Thr Gln His Phe Ala Val Cys His Val Asp Ala Pro Gly 85 90 95 cag cag gac ggc gca gcc tcc ttc ccc gca ggg tac atg tac ccc tcc 452 Gln Gln Asp Gly Ala Ala Ser Phe Pro Ala Gly Tyr Met Tyr Pro Ser 100 105 110 atg gat cag ctg gct gaa atg ctt cct gga gtc ctt caa cag ttt ggg 500 Met Asp Gln Leu Ala Glu Met Leu Pro Gly Val Leu Gln Gln Phe Gly 115 120 125 130 ctg aaa agc att att ggc atg gga aca gga gca ggc gcc tac acc cta 548 Leu Lys Ser Ile Ile Gly Met Gly Thr Gly Ala Gly Ala Tyr Thr Leu 135 140 145 act cga ttt gct cta aac aac cct gag atg gtg gag ggc ctt gtc ctt 596 Thr Arg Phe Ala Leu Asn Asn Pro Glu Met Val Glu Gly Leu Val Leu 150 155 160 atc aac gtg aac cct tgt gcg gaa ggc tgg atg gac tgg gcc gcc tcc 644 Ile Asn Val Asn Pro Cys Ala Glu Gly Trp Met Asp Trp Ala Ala Ser 165 170 175 aag atc tca gga tgg acc caa gct ctg ccg gac atg gtg gtg tcc cac 692 Lys Ile Ser Gly Trp Thr Gln Ala Leu Pro Asp Met Val Val Ser His 180 185 190 ctt ttt ggg aag gaa gaa atg cag agt aac gtg gaa gtg gtc cac acc 740 Leu Phe Gly Lys Glu Glu Met Gln Ser Asn Val Glu Val Val His Thr 195 200 205 210 tac cgc cag cac att gtg aat gac atg aac ccc ggc aac ctg cac ctg 788 Tyr Arg Gln His Ile Val Asn Asp Met Asn Pro Gly Asn Leu His Leu 215 220 225 ttc atc aat gcc tac aac agc cgg cgc gac ctg gag att gag cga cca 836 Phe Ile Asn Ala Tyr Asn Ser Arg Arg Asp Leu Glu Ile Glu Arg Pro 230 235 240 atg ccg gga acc cac aca gtc acc ctg cag tgc cct gct ctg ttg gtg 884 Met Pro Gly Thr His Thr Val Thr Leu Gln Cys Pro Ala Leu Leu Val 245 250 255 gtt ggg gac agc tcg cct gca gtg gat gcc gtg gtg gag tgc aac tca 932 Val Gly Asp Ser Ser Pro Ala Val Asp Ala Val Val Glu Cys Asn Ser 260 265 270 aaa ttg gac cca aca aag acc act ctc ctc aag atg gcg gac tgt ggc 980 Lys Leu Asp Pro Thr Lys Thr Thr Leu Leu Lys Met Ala Asp Cys Gly 275 280 285 290 ggc ctc ccg cag atc tcc cag ccg gcc aag ctc gct gag gcc ttc aag 1028 Gly Leu Pro Gln Ile Ser Gln Pro Ala Lys Leu Ala Glu Ala Phe Lys 295 300 305 tac ttc gtg cag ggc atg gga tac atg ccc tcg gct agc atg acc cgc 1076 Tyr Phe Val Gln Gly Met Gly Tyr Met Pro Ser Ala Ser Met Thr Arg 310 315 320 ctg atg cgg tcc cgc aca gcc tct ggt tcc agc gtc act tct ctg gat 1124 Leu Met Arg Ser Arg Thr Ala Ser Gly Ser Ser Val Thr Ser Leu Asp 325 330 335 ggc acc cgc agc cgc tcc cac acc agc gag ggc acc cga agc cgc tcc 1172 Gly Thr Arg Ser Arg Ser His Thr Ser Glu Gly Thr Arg Ser Arg Ser 340 345 350 cac acc agc gag ggc acc cgc agc cgc tcg cac acc agc gag ggg gcc 1220 His Thr Ser Glu Gly Thr Arg Ser Arg Ser His Thr Ser Glu Gly Ala 355 360 365 370 cac ctg gac atc acc ccc aac tcg ggt gct gct ggg aac agc gcc ggg 1268 His Leu Asp Ile Thr Pro Asn Ser Gly Ala Ala Gly Asn Ser Ala Gly 375 380 385 ccc aag tcc atg gag gtc tcc tgc tag gcggcctgcc cagctgccgc 1315 Pro Lys Ser Met 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aat gtg gtg aga aat atc agc tat aaa tat cga gag gac ttg 393 Ala Ala Asn Val Val Arg Asn Ile Ser Tyr Lys Tyr Arg Glu Asp Leu 100 105 110 tct gca cat ctc atg gta gct ggc tgg gac caa cgt gaa gga ggt cag 441 Ser Ala His Leu Met Val Ala Gly Trp Asp Gln Arg Glu Gly Gly Gln 115 120 125 130 gta tat gga acc ctg gga gga atg ctg act cga cag cct ttt gcc att 489 Val Tyr Gly Thr Leu Gly Gly Met Leu Thr Arg Gln Pro Phe Ala Ile 135 140 145 ggt ggc tcc ggc agc acc ttt atc tat ggt tat gtg gat gca gca tat 537 Gly Gly Ser Gly Ser Thr Phe Ile Tyr Gly Tyr Val Asp Ala Ala Tyr 150 155 160 aag cca ggc atg tct ccc gag gag tgc agg cgc ttc acc aca gac gct 585 Lys Pro Gly Met Ser Pro Glu Glu Cys Arg Arg Phe Thr Thr Asp Ala 165 170 175 att gct ctg gcc atg agc cgg gat ggc tca agc ggg ggt gtc atc tac 633 Ile Ala Leu Ala Met Ser Arg Asp Gly Ser Ser Gly Gly Val Ile Tyr 180 185 190 ctg gtc act att aca gct gcc ggt gtg gac cat cga gtc atc ttg ggc 681 Leu Val Thr Ile Thr Ala Ala Gly Val Asp His Arg Val Ile Leu Gly 195 200 205 210 aat gaa ctg cca aaa ttc tat gat gag tga accttcccca gacttctctt 731 Asn Glu Leu Pro Lys Phe Tyr Asp Glu * 215 tcttattttg taataaactc tctagggcca aaaaaaaaaa aaaaaaa 778 <210> 10 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Leu Arg Ala Gly Ala Pro Thr Gly Asp Leu Pro Arg Ala Gly Glu 1 5 10 15 Val His Thr Gly Thr Thr Ile Met Ala Val Glu Phe Asp Gly Gly Val 20 25 30 Val Met Gly Ser Asp Ser Arg Val Ser Ala Gly Glu Ala Val Val Asn 35 40 45 Arg Val Phe Asp Lys Leu Ser Pro Leu His Glu Arg Ile Tyr Cys Ala 50 55 60 Leu Ser Gly Ser Ala Ala Asp Ala Gln Ala Val Ala Asp Met Ala Ala 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Glu Leu His Gly Ile Glu Leu Glu Glu Pro Pro Leu Val 85 90 95 Leu Ala Ala Ala Asn Val Val Arg Asn Ile Ser Tyr Lys Tyr Arg Glu 100 105 110 Asp Leu Ser Ala His Leu Met Val Ala Gly Trp Asp Gln Arg Glu Gly 115 120 125 Gly Gln Val Tyr Gly Thr Leu Gly Gly Met Leu Thr Arg Gln Pro Phe 130 135 140 Ala Ile Gly Gly Ser Gly Ser Thr Phe Ile Tyr Gly Tyr Val Asp Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Lys Pro Gly 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Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln 5 10 15 20 gcg gag cac ccc aag ccc tcg gcc tgc agg aac ctc ttc ggc ccg gtg 573 Ala Glu His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val 25 30 35 gac cac gaa gag tta acc cgg gac ttg gag aag cac tgc aga gac atg 621 Asp His Glu Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met 40 45 50 gaa gag gcg agc cag cgc aag tgg aat ttc gat ttt cag aat cac aaa 669 Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Lys 55 60 65 ccc cta gag ggc aag tac gag tgg caa gag gtg gag aag ggc agc ttg 717 Pro Leu Glu Gly Lys Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Lys Gly Ser Leu 70 75 80 ccc gag ttc tac tac aga ccc ccg cgg ccc ccc aaa ggt gcc tgc aag 765 Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys Gly Ala Cys Lys 85 90 95 100 gtg ccg gcg cag gag agc cag gat gtc agc ggg agc cgc ccg gcg gcg 813 Val Pro Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Pro Ala Ala 105 110 115 cct tta att ggg gct ccg gct aac tct gag gac acg cat ttg gtg gac 861 Pro Leu Ile Gly Ala Pro Ala Asn Ser Glu Asp Thr His Leu Val Asp 120 125 130 cca aag act gat ccg tcg gac agc cag acg ggg tta gcg gag caa tgc 909 Pro Lys Thr Asp Pro Ser Asp Ser Gln Thr Gly Leu Ala Glu Gln Cys 135 140 145 gca gga ata agg aag cga cct gca acc gac gat tct tct act caa aac 957 Ala Gly Ile Arg Lys Arg Pro Ala Thr Asp Asp Ser Ser Thr Gln Asn 150 155 160 aaa aga gcc aac aga aca gaa gaa aat gtt tca gac ggt tcc cca aat 1005 Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn 165 170 175 180 gcc ggt tct gtg gag cag acg ccc aag aag cct ggc ctc aga aga cgt 1053 Ala Gly Ser Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg Arg 185 190 195 caa acg taa acagctcgaa ttaagaatat gtttccttgt ttatcagata 1102 Gln Thr * catcactgct tgatgaagca aggaagatat acatgaaaat tttaaaaata catatcgctg 1162 acttcatgga atggacatcc tgtataagca ctgaaaaaca acaacacaat aacactaaaa 1222 ttttaggcac tcttaaatga tctgcctcta aaagcgttgg atgtagcatt atgcaattag 1282 gtttttcctt atttgcttca ttgtactacc tgtgtatata gtttttacct 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atttatgtta 2182 aaagattttt tttaatctag acaatataca agccaaagtg gcatgttttg tgcatttgta 2242 aatgctgtgt tgggtagaat aggttttccc ctcttttgtt aaataatatg gctatgctta 2302 aaaggttgca tactgagcca agtataattt tttgtaatgt gtgaaaaaga tgccaattat 2362 tgttacacat taagtaatca ataaagaaaa cttccatagc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2422 <210> 12 <211> 198 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ser Asn Val Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met 1 5 10 15 Asp Ala Arg Gln Ala Glu His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu 20 25 30 Phe Gly Pro Val Asp His Glu Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His 35 40 45 Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe 50 55 60 Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Lys Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu 65 70 75 80 Lys Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys 85 90 95 Gly Ala Cys Lys Val Pro Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser 100 105 110 Arg Pro Ala Ala Pro Leu Ile Gly Ala Pro Ala Asn Ser Glu Asp Thr 115 120 125 His Leu Val Asp Pro Lys Thr Asp Pro Ser Asp Ser 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gac ctg 312 Pro Thr Gly Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly Pro Cys Asp Pro Asp Leu 50 55 60 ctg ctc ttc gcc aca ccg cag gcg ccc cgg ccc aca ccc agt gcg ccg 360 Leu Leu Phe Ala Thr Pro Gln Ala Pro Arg Pro Thr Pro Ser Ala Pro 65 70 75 cgg ccc gcg ctc ggc cgc ccg ccg gtg aag cgg agg ctg gac ctg gaa 408 Arg Pro Ala Leu Gly Arg Pro Pro Val Lys Arg Arg Leu Asp Leu Glu 80 85 90 95 act gac cat cag tac ctg gcc gag agc agt ggg cca gct cgg ggc aga 456 Thr Asp His Gln Tyr Leu Ala Glu Ser Ser Gly Pro Ala Arg Gly Arg 100 105 110 ggc cgc cat cca gga aaa ggt gtg aaa tcc ccg ggg gag aag tca cgc 504 Gly Arg His Pro Gly Lys Gly Val Lys Ser Pro Gly Glu Lys Ser Arg 115 120 125 tat gag acc tca ctg aat ctg acc acc aag cgc ttc ctg gag ctg ctg 552 Tyr Glu Thr Ser Leu Asn Leu Thr Thr Lys Arg Phe Leu Glu Leu Leu 130 135 140 agc cac tcg gct gac ggt gtc gtc gac ctg aac tgg gct gcc gag gtg 600 Ser His Ser Ala Asp Gly Val Val Asp Leu Asn Trp Ala Ala Glu Val 145 150 155 ctg aag gtg cag aag cgg cgc atc tat gac atc acc aac gtc ctt gag 648 Leu Lys Val Gln Lys Arg Arg Ile Tyr Asp Ile Thr Asn Val Leu Glu 160 165 170 175 ggc atc cag ctc att gcc aag aag tcc aag aac cac atc cag tgg ctg 696 Gly Ile Gln Leu Ile Ala Lys Lys Ser Lys Asn His Ile Gln Trp Leu 180 185 190 ggc agc cac acc aca gtg ggc gtc ggc gga cgg ctt gag ggg ttg acc 744 Gly Ser His Thr Thr Val Gly Val Gly Gly Arg Leu Glu Gly Leu Thr 195 200 205 cag gac ctc cga cag ctg cag gag agc gag cag cag ctg gac cac ctg 792 Gln Asp Leu Arg Gln Leu Gln Glu Ser Glu Gln Gln Leu Asp His Leu 210 215 220 atg aat atc tgt act acg cag ctg cgc ctg ctc tcc gag gac act gac 840 Met Asn Ile Cys Thr Thr Gln Leu Arg Leu Leu Ser Glu Asp Thr Asp 225 230 235 agc cag cgc ctg gcc tac gtg acg tgt cag gac ctt cgt agc att gca 888 Ser Gln Arg Leu Ala Tyr Val Thr Cys Gln Asp Leu Arg Ser Ile Ala 240 245 250 255 gac cct gca gag cag atg gtt atg gtg atc aaa gcc cct cct gag acc 936 Asp Pro Ala Glu Gln Met Val Met Val Ile Lys Ala Pro Pro Glu Thr 260 265 270 cag ctc caa gcc gtg gac tct tcg gag aac ttt cag atc tcc ctt aag 984 Gln Leu Gln Ala Val Asp Ser Ser Glu Asn Phe Gln Ile Ser Leu Lys 275 280 285 agc aaa caa ggc ccg atc gat gtt ttc ctg tgc cct gag gag acc gta 1032 Ser Lys Gln Gly Pro Ile Asp Val Phe Leu Cys Pro Glu Glu Thr Val 290 295 300 ggt ggg atc agc cct ggg aag acc cca tcc cag gag gtc act tct gag 1080 Gly Gly Ile Ser Pro Gly Lys Thr Pro Ser Gln Glu Val Thr Ser Glu 305 310 315 gag gag aac agg gcc act gac tct gcc acc ata gtg tca cca cca cca 1128 Glu Glu Asn Arg Ala Thr Asp Ser Ala Thr Ile Val Ser Pro Pro Pro 320 325 330 335 tca tct ccc ccc tca tcc ctc acc aca gat ccc agc cag tct cta ctc 1176 Ser Ser Pro Pro Ser Ser Leu Thr Thr Asp Pro Ser Gln Ser Leu Leu 340 345 350 agc ctg gag caa gaa ccg ctg ttg tcc cgg atg ggc agc ctg cgg gct 1224 Ser Leu Glu Gln Glu Pro Leu Leu Ser Arg Met Gly Ser Leu Arg Ala 355 360 365 ccc gtg gac gag gac cgc ctg tcc ccg ctg gtg gcg gcc gac tcg ctc 1272 Pro Val Asp Glu Asp Arg Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Asp Ser Leu 370 375 380 ctg gag cat gtg cgg gag gac ttc tcc ggc ctc ctc cct gag gag ttc 1320 Leu Glu His Val Arg Glu Asp Phe Ser Gly Leu Leu Pro Glu Glu Phe 385 390 395 atc agc ctt tcc cca ccc cac gag gcc ctc gac tac cac ttc ggc ctc 1368 Ile Ser Leu Ser Pro Pro His Glu Ala Leu Asp Tyr His Phe Gly Leu 400 405 410 415 gag gag ggc gag ggc atc aga gac ctc ttc gac tgt gac ttt ggg gac 1416 Glu Glu Gly Glu Gly Ile Arg Asp Leu Phe Asp Cys Asp Phe Gly Asp 420 425 430 ctc acc ccc ctg gat ttc tga cagggcttgg agggaccagg gtttccagag 1467 Leu Thr Pro Leu Asp Phe * 435 tagctcacct tgtctctgca gccctggagc cccctgtccc tggccgtcct cccagcctgt 1527 ttggaaacat ttaatttata cccctctcct ctgtctccag aagcttctag ctctggggtc 1587 tggctaccgc taggaggctg agcaagccag gaagggaagg agtctgtgtg gtgtgtatgt 1647 gcatgcagcc tacacccaca cgtgtgtacc gggggtgaat gtgtgtgagc atgtgtgtgt 1707 gcatgtaccg gggaatgaag gtgaacatac acctctgtgt gtgcactgca gacacgcccc 1767 agtgtgtcca catgtgtgtg catgagtcca tctctgcgcg tgggggggct ctaactgcac 1827 tttcggccct tttgctcgtg gggtcccaca aggcccaggg cagtgcctgc 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ctcggcacta agcat atg 58 Met 1 gac ctc gcg gcg gca gcg gag ccg ggc gcc ggc agc cag cac ctg gag 106 Asp Leu Ala Ala Ala Ala Glu Pro Gly Ala Gly Ser Gln His Leu Glu 5 10 15 gtc cgc gac gag gtg gcc gag aag tgc cag aaa ctg ttc ctg gac ttc 154 Val Arg Asp Glu Val Ala Glu Lys Cys Gln Lys Leu Phe Leu Asp Phe 20 25 30 ttg gag gag ttt cag agc agc gat gga gaa att aaa tac ttg caa tta 202 Leu Glu Glu Phe Gln Ser Ser Asp Gly Glu Ile Lys Tyr Leu Gln Leu 35 40 45 gca gag gaa ctg att cgt cct gag aga aac aca ttg gtt gtg agt ttt 250 Ala Glu Glu Leu Ile Arg Pro Glu Arg Asn Thr Leu Val Val Ser Phe 50 55 60 65 gtg gac ctg gaa caa ttt aac cag caa ctt tcc acc acc att caa gag 298 Val Asp Leu Glu Gln Phe Asn Gln Gln Leu Ser Thr Thr Ile Gln Glu 70 75 80 gag ttc tat aga gtt tac cct tac ctg tgt cgg gcc ttg aaa aca ttc 346 Glu Phe Tyr Arg Val Tyr Pro Tyr Leu Cys Arg Ala Leu Lys Thr Phe 85 90 95 gtc aaa gac cgt aaa gag atc cct ctt gcc aag gat ttt tat gtt gca 394 Val Lys Asp Arg Lys Glu Ile Pro Leu Ala Lys Asp Phe 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Asn Gln Met Thr Val Lys Glu Trp Glu Lys Val 325 330 335 ttt gag atg agt caa gat aaa aat cta tac cac aat ctt tgt acc agc 1114 Phe Glu Met Ser Gln Asp Lys Asn Leu Tyr His Asn Leu Cys Thr Ser 340 345 350 ctg ttc cct act ata cat ggc aat gat gaa gta aaa cgg ggt gtc ctg 1162 Leu Phe Pro Thr Ile His Gly Asn Asp Glu Val Lys Arg Gly Val Leu 355 360 365 ctg atg ctc ttt ggt ggc gtt cca aag aca aca gga gaa ggg acc tct 1210 Leu Met Leu Phe Gly Gly Val Pro Lys Thr Thr Gly Glu Gly Thr Ser 370 375 380 385 ctt cga ggg gac ata aat gtt tgc att gtt ggt gac cca agt aca gct 1258 Leu Arg Gly Asp Ile Asn Val Cys Ile Val Gly Asp Pro Ser Thr Ala 390 395 400 aag agc caa ttt ctc aag cac gtg gag gag ttc agc ccc aga gct gtc 1306 Lys Ser Gln Phe Leu Lys His Val Glu Glu Phe Ser Pro Arg Ala Val 405 410 415 tac acc agt ggt aaa gcg tcc agt gct gct ggc tta aca gca gct gtt 1354 Tyr Thr Ser Gly Lys Ala Ser Ser Ala Ala Gly Leu Thr Ala Ala Val 420 425 430 gtg aga gat gaa gaa tct cat gag ttt gtc att gag gct gga gct ttg 1402 Val Arg Asp Glu Glu Ser His Glu Phe Val Ile Glu Ala Gly Ala Leu 435 440 445 atg ttg gct gat aat ggt gtg tgt tgt att gat gaa ttt gat aag atg 1450 Met Leu Ala Asp Asn Gly Val Cys Cys Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met 450 455 460 465 gac gtg cgg gat caa gtt gct att cat gaa gct atg gaa cag cag acc 1498 Asp Val Arg Asp Gln Val Ala Ile His Glu Ala Met Glu Gln Gln Thr 470 475 480 ata tcc atc act aaa gca gga gtg aag gct act ctg aac gcc cgg acg 1546 Ile Ser Ile Thr Lys Ala Gly Val Lys Ala Thr Leu Asn Ala Arg Thr 485 490 495 tcc att ttg gca gca gca aac cca atc agt gga cac tat gac aga tca 1594 Ser Ile Leu Ala Ala Ala Asn Pro Ile Ser Gly His Tyr Asp Arg Ser 500 505 510 aaa tca ttg aaa cag aat ata aat ttg tca gct ccc atc atg tcc cga 1642 Lys Ser Leu Lys Gln Asn Ile Asn Leu Ser Ala Pro Ile Met Ser Arg 515 520 525 ttc gat ctc ttc ttt atc ctt gtg gat gaa tgt aat gag gtt aca gat 1690 Phe Asp Leu Phe Phe Ile Leu Val Asp Glu Cys Asn Glu Val Thr Asp 530 535 540 545 tat gcc att gcc agg cgc ata gta gat ttg cat tca aga att gag gaa 1738 Tyr Ala Ile Ala Arg Arg Ile Val Asp Leu His Ser Arg Ile Glu Glu 550 555 560 tca att gat cgt gtc tat tcc ctc gat gat atc aga aga tat ctt ctc 1786 Ser Ile Asp Arg Val Tyr Ser Leu Asp Asp Ile Arg Arg Tyr Leu Leu 565 570 575 ttt gca aga cag ttt aaa ccc aag att tcc aaa gag tca gag gac ttc 1834 Phe Ala Arg Gln Phe Lys Pro Lys Ile Ser Lys Glu Ser Glu Asp Phe 580 585 590 att gtg gag caa tat aaa cat ctc cgc cag aga gat ggt tct gga gtg 1882 Ile Val Glu Gln Tyr Lys His Leu Arg Gln Arg Asp Gly Ser Gly Val 595 600 605 acc aag tct tca tgg agg att aca gtg cga cag ctt gag agc atg att 1930 Thr Lys Ser Ser Trp Arg Ile Thr Val Arg Gln Leu Glu Ser Met Ile 610 615 620 625 cgt ctc tct gaa gct atg gct cgg atg cac tgc tgt gat gag gtc caa 1978 Arg Leu Ser Glu Ala Met Ala Arg Met His Cys Cys Asp Glu Val Gln 630 635 640 cct aaa cat gtg aag gaa gct ttc cgg tta ctg aat aaa tca atc atc 2026 Pro Lys His Val Lys Glu Ala Phe Arg Leu Leu Asn Lys Ser Ile Ile 645 650 655 cgt gtg gaa aca cct gat gtc aat cta gat caa gag gaa gag atc cag 2074 Arg Val Glu Thr Pro Asp Val Asn Leu Asp Gln Glu Glu Glu Ile Gln 660 665 670 atg gag gta gat gag ggt gcc ggt ggc atc aat ggt cat gct gac agc 2122 Met Glu Val Asp Glu Gly Ala Gly Gly Ile Asn Gly His Ala Asp Ser 675 680 685 cct gct cct gtg aac ggg atc aat ggc tac aat gaa gac ata aat caa 2170 Pro Ala Pro Val Asn Gly Ile Asn Gly Tyr Asn Glu Asp Ile Asn Gln 690 695 700 705 gag tct gct ccc aaa gcc tcc tta agg ctg ggc ttc tct gag tac tgc 2218 Glu Ser Ala Pro Lys Ala Ser Leu Arg Leu Gly Phe Ser Glu Tyr Cys 710 715 720 cga atc tct aac ctt att gtg ctt cac ctc aga aag gtg gaa gaa gaa 2266 Arg Ile Ser Asn Leu Ile Val Leu His Leu Arg Lys Val Glu Glu Glu 725 730 735 gag gac gag tca gca tta aag agg agc gag ctt gtt aac tgg tac ttg 2314 Glu Asp Glu Ser Ala Leu Lys Arg Ser Glu Leu Val Asn Trp Tyr Leu 740 745 750 aag gaa atc gaa tca gag ata gac tct gaa gaa gaa ctt ata aat aaa 2362 Lys Glu Ile Glu Ser Glu Ile Asp Ser Glu Glu Glu Leu Ile Asn Lys 755 760 765 aaa 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tacttctgaa tgtgagactt 2981 tccctttttg cttaacctgg agtgaagagg tagaactgtg gtattatgga tgaggtttct 3041 atgagaagga gtcattagag aactcatatg aaagctagag gccttagaga tgactttcca 3101 aggttaattc cagttttttt tttttttaag tttataaaag tttattatac ttttttaaaa 3161 ttactcttta gtaatttatt ttacttctgt gtcctaaggg taatttctca ggattgtttt 3221 caaattgctt ttttagggga aataggtcat ttgctatatt acaagcaatc cccaaatttt 3281 atggtcttcc aggaaaagtt attaccgttt atgatactaa cagttcctga gacttagcta 3341 tgatcagtat gttcatgagg tggagcagtt cctgtgttgc agcttttaac aacagatggc 3401 attcattaaa tcacaaagta tgttaaaggt cacaaaagca aaataactgt ctgaggctaa 3461 ggcccacgtg ggacagtcta atacccatga gtactcaact tgccttgatg tctgagcttt 3521 ccagtgcaat gtgaatttga gcagccagaa atctattagt agaaagcaag acagattaat 3581 ataggttaaa acaatgattt aaatatgttt ctcccaataa ttatctcttt ccctggaatc 3641 aacttgtatg aaaccttgtc aaaatgtact ccacaagtat gtacaattaa gtattttaaa 3701 aataaatggc aaacattaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 3744 <210> 16 <211> 821 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Asp Leu 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Ser Ala Ala Gly Leu Thr Ala Ala 420 425 430 Val Val Arg Asp Glu Glu Ser His Glu Phe Val Ile Glu Ala Gly Ala 435 440 445 Leu Met Leu Ala Asp Asn Gly Val Cys Cys Ile Asp Glu Phe Asp Lys 450 455 460 Met Asp Val Arg Asp Gln Val Ala Ile His Glu Ala Met Glu Gln Gln 465 470 475 480 Thr Ile Ser Ile Thr Lys Ala Gly Val Lys Ala Thr Leu Asn Ala Arg 485 490 495 Thr Ser Ile Leu Ala Ala Ala Asn Pro Ile Ser Gly His Tyr Asp Arg 500 505 510 Ser Lys Ser Leu Lys Gln Asn Ile Asn Leu Ser Ala Pro Ile Met Ser 515 520 525 Arg Phe Asp Leu Phe Phe Ile Leu Val Asp Glu Cys Asn Glu Val Thr 530 535 540 Asp Tyr Ala Ile Ala Arg Arg Ile Val Asp Leu His Ser Arg Ile Glu 545 550 555 560 Glu Ser Ile Asp Arg Val Tyr Ser Leu Asp Asp Ile Arg Arg Tyr Leu 565 570 575 Leu Phe Ala Arg Gln Phe Lys Pro Lys Ile Ser Lys Glu Ser Glu Asp 580 585 590 Phe Ile Val Glu Gln Tyr Lys His Leu Arg Gln Arg Asp Gly Ser Gly 595 600 605 Val Thr Lys Ser Ser Trp Arg Ile Thr Val Arg Gln Leu Glu Ser Met 610 615 620 Ile Arg Leu Ser Glu Ala Met Ala Arg 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gtg aac tat gag gac ttg gca gcc agg gag cac 723 Arg Glu Ser Leu Val Val Asn Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg Glu His 220 225 230 gtg ctg gcc tac ttc ctg cct gag gca ccg gcg gag ctg ctg cag atc 771 Val Leu Ala Tyr Phe Leu Pro Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu Gln Ile 235 240 245 ttt gat gag gct gcc ctg gag gtg gta ctg gcc atg tac ccc aag tac 819 Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu Val Val Leu Ala Met Tyr Pro Lys Tyr 250 255 260 265 gac cgc atc acc aac cac atc cat gtc cgc atc tcc cac ctg cct ctg 867 Asp Arg Ile Thr Asn His Ile His Val Arg Ile Ser His Leu Pro Leu 270 275 280 gtg gag gag ctg cgc tcg ctg agg cag ctg cat ctg aac cag ctg atc 915 Val Glu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Gln Leu His Leu Asn Gln Leu Ile 285 290 295 cgc acc agt ggg gtg gtg acc agc tgc act ggc gtc ctg ccc cag ctc 963 Arg Thr Ser Gly Val Val Thr Ser Cys Thr Gly Val Leu Pro Gln Leu 300 305 310 agc atg gtc aag tac aac tgc aac aag tgc aat ttc gtc ctg ggt cct 1011 Ser Met Val Lys Tyr Asn Cys Asn Lys Cys Asn Phe Val Leu Gly Pro 315 320 325 ttc tgc 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Thr Ala Tyr Val Gln Arg 540 545 550 cac cct gtc agc agg gag tgg acc ttg gag gct ggg gcc ctg gtt ctg 1731 His Pro Val Ser Arg Glu Trp Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu Val Leu 555 560 565 gct gac cga gga gtg tgt ctc att gat gaa ttt gac aag atg aat gac 1779 Ala Asp Arg Gly Val Cys Leu Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met Asn Asp 570 575 580 585 cag gac aga acc agc atc cat gag gcc atg gag caa cag agc atc tcc 1827 Gln Asp Arg Thr Ser Ile His Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser Ile Ser 590 595 600 atc tcg aag gct ggc atc gtc acc tcc ctg cag gct cgc tgc acg gtc 1875 Ile Ser Lys Ala Gly Ile Val Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys Thr Val 605 610 615 att gct gcc gcc aac ccc ata gga ggg cgc tac gac ccc tcg ctg act 1923 Ile Ala Ala Ala Asn Pro Ile Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser Leu Thr 620 625 630 ttc tct gag aac gtg gac ctc aca gag ccc atc atc tca cgc ttt gac 1971 Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg Phe Asp 635 640 645 atc ctg tgt gtg gtg agg gac acc gtg gac cca gtc cag gac gag atg 2019 Ile Leu Cys Val Val Arg Asp Thr Val Asp Pro Val Gln Asp Glu Met 650 655 660 665 ctg gcc cgc ttc gtg gtg ggc agc cac gtc aga cac cac ccc agc aac 2067 Leu Ala Arg Phe Val Val Gly Ser His Val Arg His His Pro Ser Asn 670 675 680 aag gag gag gag ggg ctg gcc aat ggc agc gct gct gag ccc gcc atg 2115 Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Ala Met 685 690 695 ccc aac acg tat ggc gtg gag ccc ctg ccc cag gag gtc ctg aag aag 2163 Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu Pro Leu Pro Gln Glu Val Leu Lys Lys 700 705 710 tac atc atc tac gcc aag gag agg gtc cac ccg aag ctc aac cag atg 2211 Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu Arg Val His Pro Lys Leu Asn Gln Met 715 720 725 gac cag gac aag gtg gcc aag atg tac agt gac ctg agg aaa gaa tct 2259 Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys Glu Ser 730 735 740 745 atg gcg aca ggc agc atc ccc att acg gtg cgg cac atc gag tcc atg 2307 Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro Ile Thr Val Arg His Ile Glu Ser Met 750 755 760 atc cgc atg gcg gag gcc cac gcg cgc atc cat ctg cgg gac tat gtg 2355 Ile Arg Met Ala Glu Ala His Ala Arg Ile His Leu Arg Asp Tyr Val 765 770 775 atc gaa gac gac gtc aac atg gcc atc cgc gtg atg ctg gag agc ttc 2403 Ile Glu Asp Asp Val Asn Met Ala Ile Arg Val Met Leu Glu Ser Phe 780 785 790 ata gac aca cag aag ttc agc gtc atg cgc agc atg cgc aag act ttt 2451 Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser Val Met Arg Ser Met Arg Lys Thr Phe 795 800 805 gcc cgc tac ctt tca ttc cgg cgt gac aac aat gag ctg ttg ctc ttc 2499 Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu Leu Phe 810 815 820 825 ata ctg aag cag tta gtg gca gag cag gtg aca tat cag cgc aac cgc 2547 Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala Glu Gln Val Thr Tyr Gln Arg Asn Arg 830 835 840 ttt ggg gcc cag cag gac act att gag gtc cct gag aag gac ttg gtg 2595 Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr Ile Glu Val Pro Glu Lys Asp Leu Val 845 850 855 gat aag gct cgt cag atc aac atc cac aac ctc tct gca ttt tat gac 2643 Asp Lys Ala Arg Gln Ile Asn Ile His Asn Leu Ser Ala Phe Tyr Asp 860 865 870 agt gag ctc ttc agg atg aac aag ttc agc cac 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<400> 18 Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln Arg Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr 1 5 10 15 Ser Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Thr Asp Ala Leu Thr Ser Ser 20 25 30 Pro Gly Arg Asp Leu Pro Pro Phe Glu Asp Glu Ser Glu Gly Leu Leu 35 40 45 Gly Thr Glu Gly Pro Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Glu Glu Leu Ile 50 55 60 Gly Asp Gly Met Glu Arg Asp Tyr Arg Ala Ile Pro Glu Leu Asp Ala 65 70 75 80 Tyr Glu Ala Glu Gly Leu Ala Leu Asp Asp Glu Asp Val Glu Glu Leu 85 90 95 Thr Ala Ser Gln Arg Glu Ala Ala Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp 100 105 110 Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu Gly Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr 115 120 125 Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu Glu Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln 130 135 140 Val Glu Arg Ala Thr Glu Asp Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met Ile Glu 145 150 155 160 Ser Ile Glu Asn Leu Glu Asp Leu Lys Gly His Ser Val Arg Glu Trp 165 170 175 Val Ser Met Ala Gly Pro Arg Leu Glu Ile His His Arg Phe Lys Asn 180 185 190 Phe Leu Arg Thr His Val Asp Ser His Gly His Asn Val Phe Lys Glu 195 200 205 Arg Ile Ser 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Asp Pro Ser Leu Thr Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu 625 630 635 640 Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg Phe Asp Ile Leu Cys Val Val Arg Asp 645 650 655 Thr Val Asp Pro Val Gln Asp Glu Met Leu Ala Arg Phe Val Val Gly 660 665 670 Ser His Val Arg His His Pro Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala 675 680 685 Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Ala Met Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu 690 695 700 Pro Leu Pro Gln Glu Val Leu Lys Lys Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu 705 710 715 720 Arg Val His Pro Lys Leu Asn Gln Met Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys 725 730 735 Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys Glu Ser Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro 740 745 750 Ile Thr Val Arg His Ile Glu Ser Met Ile Arg Met Ala Glu Ala His 755 760 765 Ala Arg Ile His Leu Arg Asp Tyr Val Ile Glu Asp Asp Val Asn Met 770 775 780 Ala Ile Arg Val Met Leu Glu Ser Phe Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser 785 790 795 800 Val Met Arg Ser Met Arg Lys Thr Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg 805 810 815 Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu Leu Phe Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala 820 825 830 Glu Gln Val Thr 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Pro Ala Ala His Gly 165 170 175 gtc acc tcg gcc ccg gac acc agg ccg gcc ccg ggc tcc acc gcc ccc 636 Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro 180 185 190 cca gcc cat ggt gtc acc tcg gcc ccg gac aac agg ccc gcc ttg gcg 684 Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala Leu Ala 195 200 205 tcc acc gcc cct cca gtc cac aat gtc acc tcg gcc tca ggc tct gca 732 Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Ser Gly Ser Ala 210 215 220 225 tca ggc tca gct tct act ctg gtg cac aac ggc acc tct gcc agg gct 780 Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly Thr Ser Ala Arg Ala 230 235 240 acc aca acc cca gcc agc aag agc act cca ttc tca att ccc agc cac 828 Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe Ser Ile Pro Ser His 245 250 255 cac tct gat act cct acc acc ctt gcc agc cat agc acc aag act gat 876 His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His Ser Thr Lys Thr Asp 260 265 270 gcc agt agc act cac cat agc acg gta cct cct ctc acc tcc tcc aat 924 Ala Ser Ser Thr His His Ser Thr 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Pro Ser Asp Ser Ile Gln Ala Glu Glu Trp Tyr 140 145 150 ttt ggc aag atc acc aga cgg gag tca gag cgg tta ctg ctc aat gca 953 Phe Gly Lys Ile Thr Arg Arg Glu Ser Glu Arg Leu Leu Leu Asn Ala 155 160 165 gag aac ccg aga ggg acc ttc ctc gtg cga gaa agt gag acc acg aaa 1001 Glu Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys 170 175 180 ggt gcc tac tgc ctc tca gtg tct gac ttc gac aac gcc aag ggc ctc 1049 Gly Ala Tyr Cys Leu Ser Val Ser Asp Phe Asp Asn Ala Lys Gly Leu 185 190 195 200 aac gtg aag cac tac aag atc cgc aag ctg gac agc ggc ggc ttc tac 1097 Asn Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Lys Leu Asp Ser Gly Gly Phe Tyr 205 210 215 atc acc tcc cgc acc cag ttc aac agc ctg cag cag ctg gtg gcc tac 1145 Ile Thr Ser Arg Thr Gln Phe Asn Ser Leu Gln Gln Leu Val Ala Tyr 220 225 230 tac tcc aaa cac gcc gat ggc ctg tgc cac cgc ctc acc acc gtg tgc 1193 Tyr Ser Lys His Ala Asp Gly Leu Cys His Arg Leu Thr Thr Val Cys 235 240 245 ccc acg tcc aag ccg cag act cag ggc ctg gcc aag gat gcc tgg gag 1241 Pro Thr Ser Lys Pro Gln Thr Gln Gly Leu Ala Lys Asp Ala Trp Glu 250 255 260 atc cct cgg gag tcg ctg cgg ctg gag gtc aag ctg ggc cag ggc tgc 1289 Ile Pro Arg Glu Ser Leu Arg Leu Glu Val Lys Leu Gly Gln Gly Cys 265 270 275 280 ttt ggc gag gtg tgg atg ggg acc tgg aac ggt acc acc agg gtg gcc 1337 Phe Gly Glu Val Trp Met Gly Thr Trp Asn Gly Thr Thr Arg Val Ala 285 290 295 atc aaa acc ctg aag cct ggc acg atg tct cca gag gcc ttc ctg cag 1385 Ile Lys Thr Leu Lys Pro Gly Thr Met Ser Pro Glu Ala Phe Leu Gln 300 305 310 gag gcc cag gtc atg aag aag ctg agg cat gag aag ctg gtg cag ttg 1433 Glu Ala Gln Val Met Lys Lys Leu Arg His Glu Lys Leu Val Gln Leu 315 320 325 tat gct gtg gtt tca gag gag ccc att tac atc gtc acg gag tac atg 1481 Tyr Ala Val Val Ser Glu Glu Pro Ile Tyr Ile Val Thr Glu Tyr Met 330 335 340 agc aag ggg agt ttg ctg gac ttt ctc aag ggg gag aca ggc aag tac 1529 Ser Lys Gly Ser Leu Leu Asp Phe Leu Lys Gly Glu Thr Gly Lys Tyr 345 350 355 360 ctg cgg ctg cct cag ctg gtg gac atg gct gct cag atc gcc tca ggc 1577 Leu Arg Leu Pro Gln Leu Val Asp Met Ala Ala Gln Ile Ala Ser Gly 365 370 375 atg gcg tac gtg gag cgg atg aac tac gtc cac cgg gac ctt cgt gca 1625 Met Ala Tyr Val Glu Arg Met Asn Tyr Val His Arg Asp Leu Arg Ala 380 385 390 gcc aac atc ctg gtg gga gag aac ctg gtg tgc aaa gtg gcc gac ttt 1673 Ala Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Leu Val Cys Lys Val Ala Asp Phe 395 400 405 ggg ctg gct cgg ctc att gaa gac aat gag tac acg gcg cgg caa ggt 1721 Gly Leu Ala Arg Leu Ile Glu Asp Asn Glu Tyr Thr Ala Arg Gln Gly 410 415 420 gcc aaa ttc ccc atc aag tgg acg gct cca gaa gct gcc ctc tat ggc 1769 Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ala Leu Tyr Gly 425 430 435 440 cgc ttc acc atc aag tcg gac gtg tgg tcc ttc ggg atc ctg ctg act 1817 Arg Phe Thr Ile Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Thr 445 450 455 gag ctc acc aca aag gga cgg gtg ccc tac cct ggg atg gtg aac cgc 1865 Glu Leu Thr Thr Lys Gly Arg Val Pro Tyr Pro Gly Met Val Asn Arg 460 465 470 gag gtg ctg gac cag gtg gag cgg ggc tac cgg atg ccc tgc ccg ccg 1913 Glu Val Leu Asp Gln Val Glu Arg Gly Tyr Arg Met Pro Cys Pro Pro 475 480 485 gag tgt ccc gag tcc ctg cac gac ctc atg tgc cag tgc tgg cgg aag 1961 Glu Cys Pro Glu Ser Leu His Asp Leu Met Cys Gln Cys Trp Arg Lys 490 495 500 gag cct gag gag cgg ccc acc ttc gag tac ctg cag gcc ttc ctg gag 2009 Glu Pro Glu Glu Arg Pro Thr Phe Glu Tyr Leu Gln Ala Phe Leu Glu 505 510 515 520 gac tac ttc acg tcc acc gag ccc cag tac cag ccc ggg gag aac ctc 2057 Asp Tyr Phe Thr Ser Thr Glu Pro Gln Tyr Gln Pro Gly Glu Asn Leu 525 530 535 tag gcacaggcgg gcccagaccg gcttctcggc ttggatcctg ggctgggtgg 2110 * cccctgtctc ggggcttgcc ccactctgcc tgcctgctgt tggtcctctc tctgtggggc 2170 tgaattgcca ggggcgaggc ccttcctctt tggtggcatg gaaggggctt ctggacctag 2230 ggtggcctga gagggcggtg ggtatgcgag accagcacgg tgactctgtc cagctcccgc 2290 tgtggccgca cgcctctccc tgcactccct cctggagctc tgtgggtctc tggaagagga 2350 accaggagaa gggctggggc cggggctgag ggtgcccttt tccagcctca gcctactccg 2410 ctcactgaac tccttcccca cttctgtgcc acccccggtc tatgtcgaga gctggccaaa 2470 gagcctttcc aaagaggagc gatgggcccc tggccccgcc tgcctgccac cctgcccctt 2530 gccatccatt ctggaaacac ctgtaggcag aggctgccga gacagaccct ctgccgctgc 2590 ttccaggctg ggcagcacaa ggccttgcct ggcctgatga tggtgggtgg gtgggatgag 2650 taccccctca aaccctgccc tccttagacc tgagggaccc ttcgagatca tcacttcctt 2710 gcccccattt cacccatggg gagacagttg agagcgggga tgtgacatgc ccaaggccac 2770 ggagcagttc agagtggagg cgggcttgga acccggtgct ccctctgtca tcctcaggaa 2830 ccaacaattc gtcggaggca tcatggaaag actgggacag cccaggaaac aaggggtctg 2890 aggatgcatt cgagatggca gattcccact gccgctgccc gctcagccca gctgttggga 2950 acagcatgga ggcagatgtg gggctgagct ggggaatcag ggtaaaaggt gcaggtgtgg 3010 agagagaggc ttcaatcggc ttgtgggtga tgtttgacct tcagagccag ccggctatga 3070 aagggagcga gcccctcggc tctggaggca atcaagcaga catagaagag ccaagagtcc 3130 aggaggccct ggtcctggcc tccttccccg tactttgtcc cgtggcattt caattcctgg 3190 ccctgttctc ctccccaagt cggcaccctt taactcatga ggagggaaaa gagtgcctaa 3250 gcgggggtga 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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 4145 <210> 24 <211> 536 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Gly Ser Asn Lys Ser Lys Pro Lys Asp Ala Ser Gln Arg Arg Arg 1 5 10 15 Ser Leu Glu Pro Ala Glu Asn Val His Gly Ala Gly Gly Gly Ala Phe 20 25 30 Pro Ala Ser Gln Thr Pro Ser Lys Pro Ala Ser Ala Asp Gly His Arg 35 40 45 Gly Pro Ser Ala Ala Phe Ala Pro Ala Ala Ala Glu Pro Lys Leu Phe 50 55 60 Gly Gly Phe Asn Ser Ser Asp Thr Val Thr Ser Pro Gln Arg Ala Gly 65 70 75 80 Pro Leu Ala Gly Gly Val Thr Thr Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu 85 90 95 Ser Arg Thr Glu Thr Asp Leu Ser Phe Lys Lys Gly Glu Arg Leu Gln 100 105 110 Ile Val Asn Asn Thr Glu Gly Asp Trp Trp Leu Ala His Ser Leu Ser 115 120 125 Thr Gly Gln Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Ser Asp 130 135 140 Ser Ile Gln Ala Glu Glu Trp Tyr Phe Gly Lys Ile Thr Arg Arg Glu 145 150 155 160 Ser Glu Arg Leu Leu Leu Asn Ala Glu Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu 165 170 175 Val Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Cys Leu Ser Val 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His Thr Phe Gln Pro Asn Gly Asp Ile Leu Glu Asn Ile His Glu Val 230 235 240 245 atg gaa atc aaa ttc aaa ggc gtg gac aat gag gat gac cat ggc cgt 883 Met Glu Ile Lys Phe Lys Gly Val Asp Asn Glu Asp Asp His Gly Arg 250 255 260 gga gat ctg ggg cgc ctc aag aag cag aag gat cac cac aac cct cat 931 Gly Asp Leu Gly Arg Leu Lys Lys Gln Lys Asp His His Asn Pro His 265 270 275 cta atc ctc atg atg att ccc cca cac cgg ctc gac aac ccg ggc cag 979 Leu Ile Leu Met Met Ile Pro Pro His Arg Leu Asp Asn Pro Gly Gln 280 285 290 ggg ggt cag agg aag aag cgg gct ttg gac acc aat tac tgc ttc cgg 1027 Gly Gly Gln Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg 295 300 305 tga gactgggccc acatgggaac caacatctac tgcctgccta ctgcccaatg 1080 * gctaggtcag gccccagagc caagccacac tcaacagagg gtccctgata ctattcacaa 1140 acatctccag gaagaagact gaaaatctct cacagagatt ttctctgtga aatctctttc 1200 tgttttcctg ggagtcccac tgtttttcca taggctaact ctggaaggag ctggctgaag 1260 taaatgagga aaactctgtg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 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Gly Leu Ser Leu Ile Leu Cys Gln Leu Ser Leu 15 20 25 ccc tct atc ctt cca aat gaa aat gaa aag gtt gtg cag ctg aat tca 268 Pro Ser Ile Leu Pro Asn Glu Asn Glu Lys Val Val Gln Leu Asn Ser 30 35 40 tcc ttt tct ctg aga tgc ttt ggg gag agt gaa gtg agc tgg cag tac 316 Ser Phe Ser Leu Arg Cys Phe Gly Glu Ser Glu Val Ser Trp Gln Tyr 45 50 55 ccc atg tct gaa gaa gag agc tcc gat gtg gaa atc aga aat gaa gaa 364 Pro Met Ser Glu Glu Glu Ser Ser Asp Val Glu Ile Arg Asn Glu Glu 60 65 70 75 aac aac agc ggc ctt ttt gtg acg gtc ttg gaa gtg agc agt gcc tcg 412 Asn Asn Ser Gly Leu Phe Val Thr Val Leu Glu Val Ser Ser Ala Ser 80 85 90 gcg gcc cac aca ggg ttg tac act tgc tat tac aac cac act cag aca 460 Ala Ala His Thr Gly Leu Tyr Thr Cys Tyr Tyr Asn His Thr Gln Thr 95 100 105 gaa gag aat gag ctt gaa ggc agg cac att tac atc tat gtg cca gac 508 Glu Glu Asn Glu Leu Glu Gly Arg His Ile Tyr Ile Tyr Val Pro Asp 110 115 120 cca gat gta gcc ttt gta cct cta gga atg acg gat tat tta gtc atc 556 Pro Asp Val Ala Phe Val Pro Leu Gly Met Thr Asp Tyr Leu Val Ile 125 130 135 gtg gag gat gat gat tct gcc att ata cct tgt cgc aca act gat ccc 604 Val Glu Asp Asp Asp Ser Ala Ile Ile Pro Cys Arg Thr Thr Asp Pro 140 145 150 155 gag act cct gta acc tta cac aac agt gag ggg gtg gta cct gcc tcc 652 Glu Thr Pro Val Thr Leu His Asn Ser Glu Gly Val Val Pro Ala Ser 160 165 170 tac gac agc aga cag ggc ttt aat ggg acc ttc act gta ggg ccc tat 700 Tyr Asp Ser Arg Gln Gly Phe Asn Gly Thr Phe Thr Val Gly Pro Tyr 175 180 185 atc tgt gag gcc acc gtc aaa gga aag aag ttc cag acc atc cca ttt 748 Ile Cys Glu Ala Thr Val Lys Gly Lys Lys Phe Gln Thr Ile Pro Phe 190 195 200 aat gtt tat gct tta aaa gca aca tca gag ctg gat cta gaa atg gaa 796 Asn Val Tyr Ala Leu Lys Ala Thr Ser Glu Leu Asp Leu Glu Met Glu 205 210 215 gct ctt aaa acc gtg tat aag tca ggg gaa acg att gtg gtc acc tgt 844 Ala Leu Lys Thr Val Tyr Lys Ser Gly Glu Thr Ile Val Val Thr Cys 220 225 230 235 gct gtt ttt aac aat gag gtg gtt gac ctt caa tgg act tac cct gga 892 Ala Val 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tca aac atc atc acg gag 1564 Thr Ser Trp Thr Ile Leu Ala Asn Asn Val Ser Asn Ile Ile Thr Glu 460 465 470 475 atc cac tcc cga gac agg agt acc gtg gag ggc cgt gtg act ttc gcc 1612 Ile His Ser Arg Asp Arg Ser Thr Val Glu Gly Arg Val Thr Phe Ala 480 485 490 aaa gtg gag gag acc atc gcc gtg cga tgc ctg gct aag aat ctc ctt 1660 Lys Val Glu Glu Thr Ile Ala Val Arg Cys Leu Ala Lys Asn Leu Leu 495 500 505 gga gct gag aac cga gag ctg aag ctg gtg gct ccc acc ctg cgt tct 1708 Gly Ala Glu Asn Arg Glu Leu Lys Leu Val Ala Pro Thr Leu Arg Ser 510 515 520 gaa ctc acg gtg gct gct gca gtc ctg gtg ctg ttg gtg att gtg atc 1756 Glu Leu Thr Val Ala Ala Ala Val Leu Val Leu Leu Val Ile Val Ile 525 530 535 atc tca ctt att gtc ctg gtt gtc att tgg aaa cag aaa ccg agg tat 1804 Ile Ser Leu Ile Val Leu Val Val Ile Trp Lys Gln Lys Pro Arg Tyr 540 545 550 555 gaa att cgc tgg agg gtc att gaa tca atc agc ccg gat gga cat gaa 1852 Glu Ile Arg Trp Arg Val Ile Glu Ser Ile Ser Pro Asp Gly His Glu 560 565 570 tat att tat gtg 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gaagtttgga gatagatgga taagggaata ataggccaca 3679 gaaggtgaac tttgtgcttc aaggacattg gtgagagtcc aacagacaca atttatactg 3739 cgacagaact tcagcattgt aattatgtaa ataactctaa ccaaggctgt gtttagattg 3799 tattaactat cttctttgga cttctgaaga gaccactcaa tccatccatg tacttccctc 3859 ttgaaacctg atgtcagctg ctgttgaact ttttaaagaa gtgcatgaaa aaccattttt 3919 gaaccttaaa aggtactggt actatagcat tttgctatct tttttagtgt taagagataa 3979 agaataataa ttaaccaacc ttgtttaata gatttgggtc atttagaagc ctgacaactc 4039 attttcatat tgtaatctat gtttataata ctactactgt tatcagtaat gctaaatgtg 4099 taataatgta acatgatttc cctccagaga aagcacaatt taaaacaatc cttactaagt 4159 aggtgatgag tttgacagtt tttgacattt atattaaata acatgtttct ctataaagta 4219 tggtaatagc tttagtgaat taaatttagt tgagcataga gaacaaagta aaagtagtgt 4279 tgtccaggaa gtcagaattt ttaactgtac tgaataggtt ccccaatcca tcgtattaaa 4339 aaacaattaa ctgccctctg aaataatggg attagaaaca aacaaaactc ttaagtccta 4399 aaagttctca atgtagaggc ataaacctgt gctgaacata acttctcatg tatattaccc 4459 aatggaaaat ataatgatca 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cattggcatt ctttgcaata ctgcttaatt gctgatacca 5359 tatgaatgaa acatgggctg tgattactgc aatcactgtg ctatcggcag atgatgcttt 5419 ggaagatgca gaagcaataa taaagtactt gactacctac tggtgtaatc tcaatgcaag 5479 ccccaacttt cttatccaac tttttcatag taagtgcgaa gactgagcca gattggccaa 5539 ttaaaaacga aaacctgact aggttctgta gagccaatta gacttgaaat acgtttgtgt 5599 ttctagaatc acagctcaag cattctgttt atcgctcact ctcccttgta cagccttatt 5659 ttgttggtgc tttgcatttt gatattgctg tgagccttgc atgacatcat gaggccggat 5719 gaaacttctc agtccagcag tttccagtcc taacaaatgc tcccacctga atttgtatat 5779 gactgcattt gtgggtgtgt gtgtgttttc agcaaattcc agatttgttt ccttttggcc 5839 tcctgcaaag tctccagaag aaaatttgcc aatctttcct actttctatt tttatgatga 5899 caatcaaagc cggcctgaga aacactattt gtgacttttt aaacgattag tgatgtcctt 5959 aaaatgtggt ctgccaatct gtacaaaatg gtcctatttt tgtgaagagg gacataagat 6019 aaaatgatgt tatacatcaa tatgtatata tgtatttcta tatagacttg gagaatactg 6079 ccaaaacatt tatgacaagc tgtatcactg ccttcgttta tattttttta actgtgataa 6139 tccccacagg cacattaact 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Ile Pro Cys Arg Thr Thr Asp Pro Glu Thr Pro Val Thr 145 150 155 160 Leu His Asn Ser Glu Gly Val Val Pro Ala Ser Tyr Asp Ser Arg Gln 165 170 175 Gly Phe Asn Gly Thr Phe Thr Val Gly Pro Tyr Ile Cys Glu Ala Thr 180 185 190 Val Lys Gly Lys Lys Phe Gln Thr Ile Pro Phe Asn Val Tyr Ala Leu 195 200 205 Lys Ala Thr Ser Glu Leu Asp Leu Glu Met Glu Ala Leu Lys Thr Val 210 215 220 Tyr Lys Ser Gly Glu Thr Ile Val Val Thr Cys Ala Val Phe Asn Asn 225 230 235 240 Glu Val Val Asp Leu Gln Trp Thr Tyr Pro Gly Glu Val Lys Gly Lys 245 250 255 Gly Ile Thr Met Leu Glu Glu Ile Lys Val Pro Ser Ile Lys Leu Val 260 265 270 Tyr Thr Leu Thr Val Pro Glu Ala Thr Val Lys Asp Ser Gly Asp Tyr 275 280 285 Glu Cys Ala Ala Arg Gln Ala Thr Arg Glu Val Lys Glu Met Lys Lys 290 295 300 Val Thr Ile Ser Val His Glu Lys Gly Phe Ile Glu Ile Lys Pro Thr 305 310 315 320 Phe Ser Gln Leu Glu Ala Val Asn Leu His Glu Val Lys His Phe Val 325 330 335 Val Glu Val Arg Ala Tyr Pro Pro Pro Arg Ile Ser Trp Leu Lys Asn 340 345 350 Asn Leu Thr Leu Ile Glu Asn Leu Thr Glu Ile Thr Thr Asp Val Glu 355 360 365 Lys Ile Gln Glu Ile Arg Tyr Arg Ser Lys Leu Lys Leu Ile Arg Ala 370 375 380 Lys Glu Glu Asp Ser Gly His Tyr Thr Ile Val Ala Gln Asn Glu Asp 385 390 395 400 Ala Val Lys Ser Tyr Thr Phe Glu Leu Leu Thr Gln Val Pro Ser Ser 405 410 415 Ile Leu Asp Leu Val Asp Asp His His Gly Ser Thr Gly Gly Gln Thr 420 425 430 Val Arg Cys Thr Ala Glu Gly Thr Pro Leu Pro Asp Ile Glu Trp Met 435 440 445 Ile Cys Lys Asp Ile Lys Lys Cys Asn Asn Glu Thr Ser Trp Thr Ile 450 455 460 Leu Ala Asn Asn Val Ser Asn Ile Ile Thr Glu Ile His Ser Arg Asp 465 470 475 480 Arg Ser Thr Val Glu Gly Arg Val Thr Phe Ala Lys Val Glu Glu Thr 485 490 495 Ile Ala Val Arg Cys Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gly Ala Glu Asn Arg 500 505 510 Glu Leu Lys Leu Val Ala Pro Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr Val Ala 515 520 525 Ala Ala Val Leu Val Leu Leu Val Ile Val Ile Ile Ser Leu Ile Val 530 535 540 Leu Val Val Ile Trp Lys Gln Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Arg 545 550 555 560 Val Ile Glu Ser Ile Ser Pro Asp Gly His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp 565 570 575 Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Arg Trp Glu Phe Pro Arg Asp Gly 580 585 590 Leu Val Leu Gly Arg Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val Val 595 600 605 Glu Gly Thr Ala Tyr Gly Leu Ser Arg Ser Gln Pro Val Met Lys Val 610 615 620 Ala Val Lys Met Leu Lys Pro Thr Ala Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala 625 630 635 640 Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Thr His Leu Gly Pro His Leu Asn 645 650 655 Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Ser Gly Pro Ile Tyr Ile 660 665 670 Ile Thr Glu Tyr Cys Phe Tyr Gly Asp Leu Val Asn Tyr Leu His Lys 675 680 685 Asn Arg Asp Ser Phe Leu Ser His His Pro Glu Lys Pro Lys Lys Glu 690 695 700 Leu Asp Ile Phe Gly Leu Asn Pro Ala Asp Glu Ser Thr Arg Ser Tyr 705 710 715 720 Val Ile Leu Ser Phe Glu Asn Asn Gly Asp Tyr Met Asp Met Lys Gln 725 730 735 Ala Asp Thr Thr Gln Tyr Val Pro Met Leu Glu Arg Lys Glu Val Ser 740 745 750 Lys Tyr Ser Asp Ile Gln Arg Ser Leu Tyr Asp Arg Pro Ala Ser Tyr 755 760 765 Lys Lys Lys Ser Met Leu Asp Ser Glu Val Lys Asn Leu Leu Ser Asp 770 775 780 Asp Asn Ser Glu Gly Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ser Phe Thr Tyr 785 790 795 800 Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His 805 810 815 Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Ala Gln Gly Lys Ile Val 820 825 830 Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Met His Asp Ser Asn 835 840 845 Tyr Val Ser Lys Gly Ser Thr Phe Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro 850 855 860 Glu Ser Ile Phe Asp Asn Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser 865 870 875 880 Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Thr Pro Tyr 885 890 895 Pro Gly Met Met Val Asp Ser Thr Phe Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Gly 900 905 910 Tyr Arg Met Ala Lys Pro Asp His Ala Thr Ser Glu Val Tyr Glu Ile 915 920 925 Met Val Lys Cys Trp Asn Ser Glu Pro Glu Lys Arg Pro Ser Phe Tyr 930 935 940 His Leu Ser Glu Ile Val Glu Asn Leu Leu Pro Gly Gln Tyr Lys Lys 945 950 955 960 Ser Tyr Glu Lys Ile His Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp His Pro Ala 965 970 975 Val Ala Arg Met Arg Val Asp Ser Asp Asn Ala Tyr Ile Gly Val Thr 980 985 990 Tyr Lys Asn Glu Glu Asp Lys Leu Lys Asp Trp Glu Gly Gly Leu Asp 995 1000 1005 Glu Gln Arg Leu Ser Ala Asp Ser Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Pro Asp 1010 1015 1020 Ile Asp Pro Val Pro Glu Glu Glu Asp Leu Gly Lys Arg Asn Arg His 1025 1030 1035 1040 Ser Ser Gln Thr Ser Glu Glu Ser Ala Ile Glu Thr Gly Ser Ser Ser 1045 1050 1055 Ser Thr Phe Ile Lys Arg Glu Asp Glu Thr Ile Glu Asp Ile Asp Met 1060 1065 1070 Met Asp Asp Ile Gly Ile Asp Ser Ser Asp Leu Val Glu Asp Ser Phe 1075 1080 1085 Leu <210> 29 <211> 2121 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (559)...(1878) <400> 29 ctgctcgcgg ccgccaccgc cgggccccgg ccgtccctgg ctcccctcct gcctcgagaa 60 gggcagggct tctcagaggc ttggcgggaa aaaagaacgg agggagggat cgcgctgagt 120 ataaaagccg gttttcgggg ctttatctaa ctcgctgtag taattccagc gagaggcaga 180 gggagcgagc gggcggccgg ctagggtgga agagccgggc gagcagagct gcgctgcggg 240 cgtcctggga agggagatcc ggagcgaata gggggcttcg cctctggccc agccctcccg 300 cttgatcccc caggccagcg gtccgcaacc cttgccgcat ccacgaaact ttgcccatag 360 cagcgggcgg gcactttgca ctggaactta caacacccga gcaaggacgc gactctcccg 420 acgcggggag gctattctgc ccatttgggg acacttcccc gccgctgcca ggacccgctt 480 ctctgaaagg ctctccttgc agctgcttag acgctggatt tttttcgggt agtggaaaac 540 cagcagcctc ccgcgacg atg ccc ctc aac gtt agc ttc acc aac agg aac 591 Met Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn 1 5 10 tat gac ctc gac tac gac tcg gtg cag ccg tat ttc tac tgc gac gag 639 Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu 15 20 25 gag gag aac ttc tac cag cag cag cag cag agc gag ctg cag ccc ccg 687 Glu Glu Asn Phe Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro 30 35 40 gcg ccc agc gag gat atc tgg aag aaa ttc gag ctg ctg ccc acc ccg 735 Ala Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro 45 50 55 ccc ctg tcc cct agc cgc cgc tcc ggg ctc tgc tcg ccc tcc tac gtt 783 Pro Leu Ser Pro Ser Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val 60 65 70 75 gcg gtc aca ccc ttc tcc ctt cgg gga gac aac gac ggc ggt ggc ggg 831 Ala Val Thr Pro Phe Ser Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly 80 85 90 agc ttc tcc acg gcc gac cag ctg gag atg gtg acc gag ctg ctg gga 879 Ser Phe Ser Thr Ala Asp Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly 95 100 105 gga gac atg gtg aac cag agt ttc atc tgc gac ccg gac gac gag acc 927 Gly Asp Met Val Asn Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr 110 115 120 ttc atc aaa aac atc atc atc cag gac tgt atg tgg agc ggc ttc tcg 975 Phe Ile Lys Asn Ile Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser 125 130 135 gcc gcc gcc aag ctc gtc tca gag aag ctg gcc tcc tac cag gct gcg 1023 Ala Ala Ala Lys Leu Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala 140 145 150 155 cgc aaa gac agc ggc agc ccg aac ccc gcc cgc ggc cac agc gtc tgc 1071 Arg Lys Asp Ser Gly Ser Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys 160 165 170 tcc acc tcc agc ttg tac ctg cag gat ctg agc gcc gcc gcc tca gag 1119 Ser Thr Ser Ser Leu Tyr Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu 175 180 185 tgc atc gac ccc tcg gtg gtc ttc ccc tac cct ctc aac gac agc agc 1167 Cys Ile Asp Pro Ser Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser 190 195 200 tcg ccc aag tcc tgc gcc tcg caa gac tcc agc gcc ttc tct ccg tcc 1215 Ser Pro Lys Ser Cys Ala Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser 205 210 215 tcg gat tct ctg ctc tcc tcg acg gag tcc tcc ccg cag ggc agc ccc 1263 Ser Asp Ser Leu Leu Ser Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro 220 225 230 235 gag ccc ctg gtg ctc cat gag gag aca ccg ccc acc acc agc agc gac 1311 Glu Pro Leu Val Leu His Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp 240 245 250 tct gag gag gaa caa gaa gat gag gaa gaa atc gat gtt gtt tct gtg 1359 Ser Glu Glu Glu Gln Glu Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val 255 260 265 gaa aag agg cag gct cct ggc aaa agg tca gag tct gga tca cct tct 1407 Glu Lys Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser 270 275 280 gct gga ggc cac agc aaa cct cct cac agc cca ctg gtc ctc aag agg 1455 Ala Gly Gly His Ser Lys Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg 285 290 295 tgc cac gtc tcc aca cat cag cac aac tac gca gcg cct ccc tcc act 1503 Cys His Val Ser Thr His Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr 300 305 310 315 cgg aag gac tat cct gct gcc aag agg gtc aag ttg gac agt gtc aga 1551 Arg Lys Asp Tyr Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg 320 325 330 gtc ctg aga cag atc agc aac aac cga aaa tgc acc agc ccc agg tcc 1599 Val Leu Arg Gln Ile Ser Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser 335 340 345 tcg gac acc gag gag aat gtc aag agg cga aca cac aac gtc ttg gag 1647 Ser Asp Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu 350 355 360 cgc cag agg agg aac gag cta aaa cgg agc ttt ttt gcc ctg cgt gac 1695 Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp 365 370 375 cag atc ccg gag ttg gaa aac aat gaa aag gcc ccc aag gta gtt atc 1743 Gln Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile 380 385 390 395 ctt aaa aaa gcc aca gca tac atc ctg tcc gtc caa gca gag gag caa 1791 Leu Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln 400 405 410 aag ctc att tct gaa gag gac ttg ttg cgg aaa cga cga gaa cag ttg 1839 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu 415 420 425 aaa cac aaa ctt gaa cag cta cgg aac tct tgt gcg taa ggaaaagtaa 1888 Lys His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala * 430 435 ggaaaacgat tccttctaac agaaatgtcc tgagcaatca cctatgaact tgtttcaaat 1948 gcatgatcaa atgcaacctc acaaccttgg ctgagtcttg agactgaaag atttagccat 2008 aatgtaaact gcctcaaatt ggactttggg cataaaagaa cttttttatg cttaccatct 2068 tttttttttc tttaacagat ttgtatttaa gaattgtttt taaaaaattt taa 2121 <210> 30 <211> 439 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr 1 5 10 15 Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr 20 25 30 Gln Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp 35 40 45 Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser 50 55 60 Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala 85 90 95 Asp Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn 100 105 110 Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile 115 120 125 Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu 130 135 140 Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly 145 150 155 160 Ser Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu 165 170 175 Tyr Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser 180 185 190 Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys 195 200 205 Ala Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu 210 215 220 Ser Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu 225 230 235 240 His Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln 245 250 255 Glu Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala 260 265 270 Pro Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser 275 280 285 Lys Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr 290 295 300 His Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro 305 310 315 320 Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile 325 330 335 Ser Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu 340 345 350 Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn 355 360 365 Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu 370 375 380 Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr 385 390 395 400 Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 405 410 415 Glu Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu 420 425 430 Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala 435 <210> 31 <211> 1374 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (103)...(1047) <400> 31 ggacagcttg gagatagggc ccggaattgc gggcgtcact ctgctcctgc gacctagcca 60 ggcgtgaggg agtgacagca gcgcattcgc gggacgagag cg atg agt gag aac 114 Met Ser Glu Asn 1 gcc gca cca ggt ctg atc tca gag ctg aag ctg gct gtg ccc tgg ggc 162 Ala Ala Pro Gly Leu Ile Ser Glu Leu Lys Leu Ala Val Pro Trp Gly 5 10 15 20 cac atc gca gcc aaa gcc tgg ggc tcc ctg cag ggc cct cca gtt ctc 210 His Ile Ala Ala Lys Ala Trp Gly Ser Leu Gln Gly Pro Pro Val Leu 25 30 35 tgc ctg cac ggc tgg ctg gac aat gcc agc tcc ttc gac aga ctc atc 258 Cys Leu His Gly Trp Leu Asp Asn Ala Ser Ser Phe Asp Arg Leu Ile 40 45 50 cct ctt ctc ccg caa gac ttt tat tac gtt gcc atg gat ttc gga ggt 306 Pro Leu Leu Pro Gln Asp Phe Tyr Tyr Val Ala Met Asp Phe Gly Gly 55 60 65 cat ggg ctc tcg tcc cat tac agc cca ggt gtc cca tat tac ctc cag 354 His Gly Leu Ser Ser His Tyr Ser Pro Gly Val Pro Tyr Tyr Leu Gln 70 75 80 act ttt gtg agt gag atc cga aga gtt gtg gca gcc ttg aaa tgg aat 402 Thr Phe Val Ser Glu Ile Arg Arg Val Val Ala Ala Leu Lys Trp Asn 85 90 95 100 cga ttc tcc att ctg ggc cac agc ttc ggt ggc gtc gtg ggc gga atg 450 Arg Phe Ser Ile Leu Gly His Ser Phe Gly Gly Val Val Gly Gly Met 105 110 115 ttt ttc tgt acc ttc ccc gag atg gtg gat aaa ctt atc ttg ctg gac 498 Phe Phe Cys Thr Phe Pro Glu Met Val Asp Lys Leu Ile Leu Leu Asp 120 125 130 acg ccg ctc ttt ctc ctg gaa tca gat gaa atg gag aac ttg ctg acc 546 Thr Pro Leu Phe Leu Leu Glu Ser Asp Glu Met Glu Asn Leu Leu Thr 135 140 145 tac aag cgg aga gcc ata gag cac gtg ctg cag gta gag gcc tcc cag 594 Tyr Lys Arg Arg Ala Ile Glu His Val Leu Gln Val Glu Ala Ser Gln 150 155 160 gag ccc tcg cac gtg ttc agc ctg aag cag ctg ctg cag agg tta ctg 642 Glu Pro Ser His Val Phe Ser Leu Lys Gln Leu Leu Gln Arg Leu Leu 165 170 175 180 aag agc aat agc cac ttg agt gag gag tgc ggg gag ctt ctc ctg caa 690 Lys Ser Asn Ser His Leu Ser Glu Glu Cys Gly Glu Leu Leu Leu Gln 185 190 195 aga gga acc acg aag gtg gcc aca ggt ctg gtt ctg aac aga gac cag 738 Arg Gly Thr Thr Lys Val Ala Thr Gly Leu Val Leu Asn Arg Asp Gln 200 205 210 agg ctc gcc tgg gca gag aac agc att gac ttc atc agc agg gag ctg 786 Arg Leu Ala Trp Ala Glu Asn Ser Ile Asp Phe Ile Ser Arg Glu Leu 215 220 225 tgt gcg cat tcc atc agg aag ctg cag gcc cat gtc ctg ttg atc aaa 834 Cys Ala His Ser Ile Arg Lys Leu Gln Ala His Val Leu Leu Ile Lys 230 235 240 gca gtc cac gga tat ttt gat tca aga cag aat tac tct gag aag gag 882 Ala Val His Gly Tyr Phe Asp Ser Arg Gln Asn Tyr Ser Glu Lys Glu 245 250 255 260 tcc ctg tcg ttc atg ata gac acg atg aaa tcc acc ctc aaa gag cag 930 Ser Leu Ser Phe Met Ile Asp Thr Met Lys Ser Thr Leu Lys Glu Gln 265 270 275 ttc cag ttt gtg gaa gtc cca ggc aat cac tgt gtc cac atg agc gaa 978 Phe Gln Phe Val Glu Val Pro Gly Asn His Cys Val His Met Ser Glu 280 285 290 ccc cag cac gtg gcc agt atc atc agc tcc ttc tta cag tgc aca cac 1026 Pro Gln His Val Ala Ser Ile Ile Ser Ser Phe Leu Gln Cys Thr His 295 300 305 atg ctc cca gcc cag ctg tag ctctgggcct ggaactatga agacctagtg 1077 Met Leu Pro Ala Gln Leu * 310 ctcccagact caacactggg actctgagtt cctgagcccc acaacaaggc cagggatggt 1137 ggggacaggc ctcactagtc ttgaggccca gcctaggatg gtagtcaggg gaaggagcga 1197 gattccaact tcaacatctg tgacctcaag ggggagacag agtctgggtt ccagggctgc 1257 tttctcctgg ctaataataa atatccagcc agctggagga aggaagggca ggctgggccc 1317 acctagcctt tccctgctgc ccaactggat ggaaaataaa aggttcttgt attctca 1374 <210> 32 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Met Ser Glu Asn Ala Ala Pro Gly Leu Ile Ser Glu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Val Pro Trp Gly His Ile Ala Ala Lys Ala Trp Gly Ser Leu Gln Gly 20 25 30 Pro Pro Val Leu Cys Leu His Gly Trp Leu Asp Asn Ala Ser Ser Phe 35 40 45 Asp Arg Leu Ile Pro Leu Leu Pro Gln Asp Phe Tyr Tyr Val Ala Met 50 55 60 Asp Phe Gly Gly His Gly Leu Ser Ser His Tyr Ser Pro Gly Val Pro 65 70 75 80 Tyr Tyr Leu Gln Thr Phe Val Ser Glu Ile Arg Arg Val Val Ala Ala 85 90 95 Leu Lys Trp Asn Arg Phe Ser Ile Leu Gly His Ser Phe Gly Gly Val 100 105 110 Val Gly Gly Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Glu Met Val Asp Lys Leu 115 120 125 Ile Leu Leu Asp Thr Pro Leu Phe Leu Leu Glu Ser Asp Glu Met Glu 130 135 140 Asn Leu Leu Thr Tyr Lys Arg Arg Ala Ile Glu His Val Leu Gln Val 145 150 155 160 Glu Ala Ser Gln Glu Pro Ser His Val Phe Ser Leu Lys Gln Leu Leu 165 170 175 Gln Arg Leu Leu Lys Ser Asn Ser His Leu Ser Glu Glu Cys Gly Glu 180 185 190 Leu Leu Leu Gln Arg Gly Thr Thr Lys Val Ala Thr Gly Leu Val Leu 195 200 205 Asn Arg Asp Gln Arg Leu Ala Trp Ala Glu Asn Ser Ile Asp Phe Ile 210 215 220 Ser Arg Glu Leu Cys Ala His Ser Ile Arg Lys Leu Gln Ala His Val 225 230 235 240 Leu Leu Ile Lys Ala Val His Gly Tyr Phe Asp Ser Arg Gln Asn Tyr 245 250 255 Ser Glu Lys Glu Ser Leu Ser Phe Met Ile Asp Thr Met Lys Ser Thr 260 265 270 Leu Lys Glu Gln Phe Gln Phe Val Glu Val Pro Gly Asn His Cys Val 275 280 285 His Met Ser Glu Pro Gln His Val Ala Ser Ile Ile Ser Ser Phe Leu 290 295 300 Gln Cys Thr His Met Leu Pro Ala Gln Leu 305 310 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan primer <400> 33 tacacaccac cttcgctgaa ag 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan primer <400> 34 ggcctggttc tcattcaaat tg 22 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan primer <400> 35 cgcattgctg agtctcacct gcagtc 26 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan primer <400> 36 cagccttaca gagactggaa aagaa 25 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan primer <400> 37 gaggctcagg gacccaaag 19 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan primer <400> 38 ccaaaccaag gcccccagag aggt 24 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan primer <400> 39 cctaccgcca gcacattgt 19 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan primer <400> 40 gctgttgtag gcattgatga aca 23 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan primer <400> 41 aatgacatga accccggcaa cctg 24

Claims (39)

1. 유방암 환자의 예후 평가 방법으로서,

   상기 방법은 상기 환자 샘플에서 SLPI, p21ras, MUC-1, DARPP-32, phospho-p27, src, MGC 14832, myc, TGFβ-3, SERHL, E2F1, PDGFRα, NDRG-1, MCM2, PSMB9, 및 MCM6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 과다 발현 검출 단계를 포함하며,

   상기 바이오마커의 과다 발현은 예후를 나타내며, 그에 따라 상기 환자의 예후를 평가하는 것을 포함하는, 유방암 환자의 예후 평가 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 바이오마커의 과다 발현은 불량한 예후를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 림프절-음성인 유방암 환자의 예후 평가 방법으로서,

   상기 방법은 상기 환자 샘플에서 2개 이상의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함하며,

   상기 바이오마커 검출 단계는 면역조직화학법, 핵산 혼성화법 또는 정량 RT-PCT 수행하는 단계를 포함하며,

   2개 이상의 상기 바이오마커의 과다 발현은 불량한 예후를 나타내며, 그에 따라 상기 환자의 예후를 평가하는 것을 포함하는, 림프절-음성인 유방암 환자의 예후 평가 방법.
4. 유방암 환자의 예후 평가 방법으로서,

   상기 방법은 상기 환자 샘플에서 2개 이상의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함하며,

   상기 바이오마커 검출 단계는 면역조직화학법, 핵산 혼성화법 또는 정량적 RT-PCT 수행하는 단계를 포함하며,

   상기 2개 이상의 바이오마커의 과다 발현의 부재는 양호한 예후를 나타내며, 그에 따라 상기 환자의 예후를 평가하는 것을 포함하는, 유방암 환자의 예후 평가 방법.
5. 제 3항에 있어서, 상기 2개 이상의 바이오마커의 과다 발현은 예후가 불량한 환자를 예후가 양호한 환자와 특이적으로 구별하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 3항에 있어서, 상기 바이오마커는 세포 주기 조절, DNA 복제, 전사, 신호 전달, 세포 증식, 침입, 세포자멸, 단백질분해 또는 전이에 관여하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 유방암 환자의 예후 평가 방법으로서,

   상기 방법은 상기 환자 샘플에서 SLPI, p21ras, MUC-1, DARPP-32, phospho- p27, src, MGC 14832, myc, TGFβ-3, SERHL, E2F1, PDGFRα, NDRG-1, MCM2, PSMB9, 및 MCM6으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함하며,

   상기 바이오마커의 하나 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타내며, 그에 따라 상기 환자의 예후를 평가하는 것을 포함하는, 유방암 환자의 예후 평가 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 바이오마커는 SLPI, PSMB9, MUC-1, src, E2F1 및 p21ras로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 7항에 있어서, 상기 방법은 샘플에서 SLPI 및 E2F1인 2종의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커들중 1종 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타내며, 그에 따라 유방암 환자의 예후를 평가하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 7항에 있어서, 상기 방법은 샘플에서 SLPI, E2F1 및 MUC-1인 3종의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커들중 1종 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타내며, 그에 따라 유방암 환자의 예후를 평가하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 7항에 있어서, 상기 방법은 샘플에서 SLPI, E2F1, MUC-1 및 src인 4종의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커들중 1종 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타내며, 그에 따라 유방암 환자의 예후를 평가하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 7항에 있어서, 상기 방법은 샘플에서 E2F1, SLPI, MUC-1, src 및 p21ras인 5종의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커들중 1종 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타내며, 그에 따라 유방암 환자의 예후를 평가하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 7항에 있어서, 상기 방법은 샘플에서 E2F1, SLPI, MUC-1, src, p21ras 및 PSMB9인 6종의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커들중 1종 이상의 과다 발현은 불량한 예후를 나타내며, 그에 따라 유방암 환자의 예후를 평가하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 림프절-음성인 유방암 환자의 예후 평가 방법으로서,

    상기 방법은 상기 환자 샘플에서 2종 이상의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함하며,

    상기 2종 이상의 바이오마커의 과다 발현은 불량한 예후를 나타내며,

    상기 바이오마커는 로그 순위 검정(log-rank test)을 사용하여 유방암 재발 또는 투병중인 유방암으로 사망할 가능성의 평가에 있어 통계학적으로 유의적인 것 으로 결정되며, 및

    그에 따라 상기 유방암 환자의 예후를 평가하는 것을 포함하는, 림프절-음성인 유방암 환자의 예후 평가 방법.
15. 제 3항에 있어서, 상기 유방암 환자의 예후 평가 방법은 임상 정보 분석 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 임상 정보는 종양 크기, 종양의 분화도(tumor grade), 림프절 상태 및 가족력을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 방법은 상기 유방암 환자에 대한 치료 전략 개발에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 3항에 있어서, 상기 유방암 환자의 예후 평가 방법은 Her2/neu 발현 수준 분석과 연계되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 3항에 있어서, 상기 유방암 환자의 예후 평가 방법은 환자의 에스트로겐 리셉터 또는 프로게스테론 리셉터 상태 분석과 연계되는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 3항에 있어서, 상기 유방암 환자의 예후 평가 방법은 환자의 에스트로겐 리셉터 상태와 독립적인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 3항에 있어서, 상기 방법은 에스트로겐 리셉터-양성 또는 에스트로겐 리셉터-음성 유방암 환자의 예후 평가에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 3항에 있어서, 상기 유방암 환자는 초기 단계의 유방암 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
23. (a) 유방암 환자 샘플을 수득하는 단계;

    (b) 상기 샘플을 SLPI, p21ras, MUC-1, DARPP-32, phospho-p27, src, MGC 14832, myc, TGFβ-3, SERHL, E2F1, PDGFRα, NDRG-1, MCM2, PSMB9, 및 MCM6으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계;

    (c) 상기 항체의 상기 바이오마커 단백질에 대한 결합을 검출하는 단계;

    (d) 상기 바이오마커 단백질의 상기 샘플에서의 과다 발현 여부를 결정하는 단계로, 상기 바이오마커 단백질의 과다 발현은 불량한 예후를 나타내며; 및

    (e) 그에 따라 상기 환자의 예후를 평가하는 단계;

    를 포함하는, 유방암 환자의 예후 평가 방법.
24. 제 23항에 있어서, 상기 바이오마커 단백질은 E2F1, SLPI, MUC-1, src, p21ras 및 PSMB9로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
25. (a) 유방암 환자 샘플을 수득하는 단계;

    (b) 상기 샘플을, 별개의 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 2 이상의 항체와 접촉시키는 단계;

    (c) 상기 항체의 상기 바이오마커 단백질에 대한 결합을 검출하는 단계;

    (d) 상기 바이오마커 단백질의 상기 샘플에서의 과다 발현 여부를 결정하는 단계로, 2개 이상의 상기 바이오마커 단백질의 과다 발현은 불량한 예후를 나타내며; 및

    (e) 그에 따라 상기 환자의 예후를 평가하는 단계;

    를 포함하는, 유방암 환자의 예후 평가 방법.
26. 제 25항에 있어서, 상기 바이오마커는 SLPI, p21ras, MUC-1, DARPP-32, phospho-p27, src, MGC 14832, myc, TGFβ-3, SERHL, E2F1, PDGFRα, NDRG-1, MCM2, PSMB9, 및 MCM6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 2 이상의 항체를 포함하는 키트로서, 각각의 상기 항체는 유방암 환자의 불량한 예후를 나타내는 별개의 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는, 키트.
28. 제 27항에 있어서, 상기 바이오마커 단백질은 세포 주기 조절, DNA 복제, 전사, 신호 전달, 세포 증식, 침입, 세포자멸, 단백질분해 또는 전이에 관여하는 것을 특징으로 하는 키트.
29. 제 27항에 있어서, 상기 바이오마커 단백질은 SLPI, p21ras, MUC-1, DARPP-32, phospho-p27, src, MGC 14832, myc, TGFβ-3, SERHL, E2F1, PDGFRα, NDRG-1, MCM2, PSMB9, 및 MCM6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
30. 제 29항에 있어서, 상기 바이오마커 단백질은 E2F1, SLPI, MUC-1, src, p21ras 및 PSMB9로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
31. 제 27항에 있어서, 상기 키트는 상기 바이오마커 단백질에 결합하는 항체 검출용 화합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
32. 제 27항에 있어서, 상기 키트는 판매되는 항체 결합 검출 시스템과 함께 사용되는 것을 특징으로 하는 키트.
33. 제 27항에 있어서, 상기 키트는 양성 대조군 샘플을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
34. 제 27항에 있어서, 상기 키트는 사용 설명서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
35. 선택된 치료법에 대한 유방암 환자의 반응성을 예측하는 방법으로서,

    상기 방법은 상기 환자 샘플에서 2개 이상의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함하며,

    2개 이상의 상기 바이오마커의 과다 발현은 긍정적인 치료 반응성을 나타내며, 그에 따라 상기 유방암 환자의 상기 치료법에 대한 반응성을 예측하는 방법.
36. 선택된 치료법에 대한 유방암 환자의 반응성을 예측하는 방법으로서,

    상기 방법은 상기 환자 샘플에서 2개 이상의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함하며,

    2개 이상의 상기 바이오마커의 과다 발현은 부정적인 치료 반응성을 나타내며, 그에 따라 상기 환자의 상기 치료법에 대한 반응성을 예측하는 방법.
37. 유방암 환자의 생존 가능성을 예측하는 방법으로서,

    상기 방법은 상기 환자 샘플에서 5종 이상의 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함하며,

    상기 바이오마커들 모두가 과다 발현되지 않는 것은 생존 가능성 증가를 의 미하며,

    상기 바이오마커들 중 2종 이상의 과다 발현은 생존 가능성 감소를 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제 37항에 있어서, 과다 발현되는 상기 바이오마커의 수 증가는 생존 가능성 감소를 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제 37항에 있어서, 상기 바이오마커는 SLPI, p21ras, MUC-1, DARPP-32, phospho-p27, src, MGC 14832, myc, TGFβ-3, SERHL, E2F1, PDGFRα, NDRG-1, MCM2, PSMB9, 및 MCM6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

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