KR20070047306A

KR20070047306A - 아이소프레노이드의 제조

Info

Publication number: KR20070047306A
Application number: KR1020077003783A
Authority: KR
Inventors: 알랜 베리; 크리스티안 마나르트; 페트라 시믹
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 2004-08-19
Filing date: 2005-08-11
Publication date: 2007-05-04
Also published as: KR101169824B1; JP2008509689A; EP1778843A1; US7572609B2; CN101044243A; EP1778843B1; WO2006018211A1; JP5074185B2; ES2394508T3; CN101044243B; US20070202579A1

Abstract

본 발명은 미생물에 의한 아이소프레노이드, 특히 코엔자인 Q10의 제조방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은, 상이한 미생물, 바람직하게는 파라코쿠스속, 보다 바람직하게는 파라코쿠스 제아크산틴파시엔으로부터 메발로네이트(mev) 오페론의 유전자 하나 이상으로 유전자변형된 로도박터속, 바람직하게는 로도박터 스파에로이드 종의 미생물에 의한 코엔자임 Q10의 증가된 제조방법에 관한 것이고, 이때 mev 오페론은 증가된 코엔자임 Q10 제조를 야기하게 돌연변이된다. 그러한 돌연변이를 갖는 서열, 및 돌연변이된 mev 오페론을 갖는 미생물 또한 포함된다.

Description

아이소프레노이드의 제조{PRODUCTION OF ISOPRENOIDS}

본 발명은 미생물에 의한 아이소프레노이드, 특히 코엔자임 Q10의 제조방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 상이한 미생물, 바람직하게는 파라코쿠스속, 보다 바람직하게는 파라코쿠스 제아크산틴파시엔(Paracoccus zeaxanthinifaciens)으로부터 메발로네이트(mev) 오페론의 유전자 하나 이상으로 유전자변형된 로도박터속, 바람직하게는 로도박터 스파에로이드 종의 미생물에 의한 코엔자임 Q10의 증가된 제조방법에 관한 것이고, 이때 mev 오페론은 증가된 코엔자임 Q10 제조를 야기하게 돌연변이된다. 그러한 돌연변이를 갖는 서열, 및 돌연변이된 mev 오페론을 갖는 미생물 또한 포함된다.

유비퀴논-10으로서 공지되어 있는 코엔자임 Q10 (2,3-다이메톡시-다이메틸-6-데카프로페닐-1,4-벤조퀴논)은 10개의 C5 아이소프레노이드 단위체로 구성된 아이소프레노이드 측쇄를 갖는 지용성 벤조퀴논이다. 코엔자임 Q10 (하기에서, 약어 CoQ10로 표기)은 미생물, 식물 및 동물에서 발견된다. 이는 인간 및 대부분의 포유동물에서 가장 빈번한 유비퀴논의 형태이다. CoQ10의 의학적 효과 및 건강상의 효과는 2가지 주요한 생리학적 기능, 즉 미토콘드리아의 전자 이동 사슬의 필수적인 공인자로서의 기능 및 지용성 항산화제로서의 작용과 연관되어 있다.

CoQ10의 건강상의 이점은 이 화합물의 화학적 중요도를 증가시킨다. CoQ10은 화학적 합성에 의해 제조될 수 있거나 미생물을 사용한 발효에 의해 제조될 수 있다. 이들 미생물은 유전 공학에 의한 CoQ10 제조를 위해 개선된 천연의 CoQ10 제조기일 수도 있거나, 이들은 CoQ10을 자연적으로 생성할 순 없지만 이를 합성할 수 있는 유전 공학에 의해 조작된 것이다.

박테리아에서, 퀴논의 퀴노이드 고리는 방향족 화합물의 생합성에서 중심 중간체인 코리스메이트로부터 유도되나, 유비퀴논의 아이소프레노이드 꼬리는 C5 화합물인 아이소펜테닐 피로포스페이트(IPP)로부터 유도된다. 퀴노이드 고리에 첨가된 아이소프레노이드 꼬리의 길이는 박테리아중에 존재하는 특정 프레닐트랜스퍼라제 효소에 의존적이다. 예를 들어, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)에서, 옥타프레닐 피로포스페이트 합성효소는 파네실 피로포스페이트(FPP, C15) 및 5개의 IPP 단위체로부터 옥타프레닐 피로포스페이트(C40)의 형성을 촉매한다. 이 분자가 퀴노이드 고리에 첨가되는 것은 유비퀴논-8의 형성을 초래한다. 파라코쿠스(Paracoccus) 및 로도박터(Rhodobacter) 종에서, 데카프레닐 피로포스페이트(DPP) 합성효소는 FPP (C15) 및 7개의 IPP 단위체로부터 DPP(C50)의 형성을 촉매한다. DPP를 퀴노이드 고리에 첨가하는 것은 유비퀴논-10(CoQ10)의 형성을 초래한다.

자연에서, IPP를 생합성하는 2개의 상이한 경로가 공지되어 있다(도 1). 메 발로네이트 경로는 그 명칭에서 보듯이, 중심 중간체로서 메발로네이트를 이용하고 진핵생물에서 연구되어 왔다. 메발로네이트 경로는 수년간 자연에서 IPP 합성의 보편적인 경로로 여겨졌다. 그러나, 최근 10년동안, 소위 비-메발로네이트 경로 또는 MEP 경로(중간체로서 2C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트를 갖기 때문)로 불리는 IPP 합성의 제 2 경로가 발견되었다. 지금까지 MEP 경로는 많은 진핵생물 및 보다 고등 식물의 색소체 구획에서 존재하는 것으로 밝혀졌다.

1-데옥시-D-자일룰로즈 5-포스페이트 환원이성질화효소를 암호화하는 yaeM 유전자(현재 ispC라 지칭됨)의 로도박터 스파에로이드중의 존재, 및 로도박터 스파에로이드의 거의 완료된 지놈 서열의 정밀 조사에 기초하면, 이 박테리아는 IPP의 생합성을 위한 MEP 경로를 배타적으로 사용하는 것으로 보인다. 로도박터 스파에로이드중의 MEP 경로의 배타적인 사용을 지지하는 추가의 증거는, 밀접하게 관련된 로도박터 캡슐터스종이 아이소프레노이드 생합성을 위해 오직 MEP 경로만을 사용한다는 것이다.

국제 공개 공보 제 WO 02/26933 A1 호는 MEP 경료의 효소의 몇몇을 암화하는 자연적인 및/또는 헤테로로거스 유전자 몇몇을 과다발현함으로써, 로도박터 스파에로이드중의 CoQ10의 생성을 증가시키는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 이들 유전자의 과다발현은 CoQ10 생성에서 오직 가장 적당하게 개선되는 것을 초래한다.

상기 언급된 바와 같이, 몇몇 박테리아는 IPP의 생합성을 위한 메발로네이트 경로만을 사용한다. 파라코쿠스 제아크산티니파시엔(Paracoccus zeaxanthinifaciens)은 그러한 박테리아의 예이다. 파라코쿠스 제아크산티니파시 엔에서, 메발로네이트 경로의 5개의 효소를 암호화하는 유전자, 및 IPP 이성질화효소를 암호화하는 유전자(도 1 참조)는 크로모좀(소위 하기에서 메발로네이트(mev) 오페론(문헌[Humbelin et al., Gene 297, 129-139, 2002])으로 지칭됨)상의 단일 전사 단위체중에서 함께 군집을 이루고 있다.

아이소프로페노이드(특히, CoQ10)의 제조는, mev 오페론의 유전자 하나 이상의 자연적으로 결핍되어 있는(자연적으로 아이소프레노이드를 제조하기 위해 비-메발로네이트 경로를 사용하는) 미생물에 돌연변이된 mev 오페론을 도입함으로써(완전한 mev 오페론, 또는 돌연변이 하나 이상을 포함하는 상기 mev 오페론의 유전자 하나 이상을 도입할 수도 있음) 현저하게 증가될 수 있다. 하나 이상의 돌연변이는 예를 들어, 하기 유전자 하나 또는 모두이다: 하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소를 암호화하는 mvaA, 아이소펜테닐 다이포스페이트 이성질화효소를 암호화하는 idi, 하이드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소를 암호화하는 hcs, 키나제를 암호화하는 mvk, 키나제를 암호화하는 pmk, 및 다이포스포메발로네이트 데카복실라제를 암호화하는 mvd.

도 1은 IPP 형성을 위한 MEP 경로를 사용하는, 로도박터 스파에로이드에서 CoQ10 생합성을 위한 경로를 나타낸다.

그러므로 본 발명은, 하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소 활성, 아이소펜테닐 다이포스페이트 이성질화효소 활성, 하이드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소 활성, 멜발로네이트 키나제 활성, 포스포메발로네이트 키나제 활성 및/또는 다이포스포메발로네이트 데카복실라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열로서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 미생물중에 존재할 때 아이소프레노이드의 개선된 제조를 야기하는 돌연변이 하나 이상을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 아이소프레노이드 제조에서의 향상은, 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 갖지 않는(즉, mev 경로를 사용하지 않는) 야생형 미생물중에서의 제조와 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 미생물중에서의 제조를 비교함으로써 측정될 수도 있다.

하나의 양태에서, 본 발명은 서열번호: 1 또는 2(즉, 야생형 mev 오페론의 유전자를 포함함), 또는 그의 분획으로부터 수득될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이고, 이때 분획은 mev 오페론의 유전자 하나 이상의 활성을 가지며, 이 예로는 하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소를 암호화하는 mvaA, 아이소펜테닐 다이포스페이트 이성질화효소를 암호화하는 idi, 하이드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소를 암호화하는 hcs, 키나제를 암호화하는 mvk, 키나제를 암호화하는 pmk, 및 다이포스포메발로네이트 데카복실라제를 암호화하는 mvd가 있다. 바람직하게는, 서열번호: 3 또는 그의 분획으로 표시되는 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 서열은 미생물중에 존재할 때 예를 들어 CoQ10 제조에서의 증가를 야기한다.

하나의 태양에서, 본 발명은 서열번호: 3으로 표시되는 상기 DNA 서열인 돌열변이를 갖는 mev 오페론을 포함하는 DNA 서열에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "개선된 아이소프레노이드 제조", 특히 개선된 CoQ10의 제조는 상기 기술된 바와 같은 돌연변이 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 미생물에 의해, 각 야생형 폴리뉴클레오티드를 갖는 각 미생물에 비해 약 10% 증가로 수득될 수 있는 것이다. 아이소프레노이드의 제조는 표준 방법, 예를 들어 HPLC(실시예 2 참조)에 의해 측정되고, mg/l 단위 도는 mg/l/OD₆₀₀으로서 표시될 수 있다(실시예 5 참조).

완전한 mev 오페론, 또는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 그의 유전자 하나 이상은 예를 들어, 완전히 합성되거나 부분적으로 단리되고 합성될 수도 있다. 단리된 mev 오페론 또는 그의 하나 이상의 유전자는 메발로네이트 경로를 사용하는 임의의 미생물, 즉 상기 오페론 내에 포함된 유전자 하나 이상이 자연적으로 발생되는 임의의 미생물로부터 기원할 수도 있다. 바람직하게는, 상기 미생물로는 파라코쿠스속, 보다 바람직하게는 파라코쿠스 제아크산티니파시엔, 예컨대 파라코쿠스 종 R114 또는 파라코쿠스 제아크산티니파시엔 ATCC 21588이 포함된다. 대립형질 변화 및 완전하게 기능하는 오페론의 DNA 서열의 돌연변이체 또한 상기 용어에 의해 포함된다. 파라코쿠스 제아크산티니파시엔 ATCC 21588의 완전한 mev 오페론은 서열번호: 1중에서 나타나고, 파라코쿠스 종 R114의 mev 오페론은 서열번호: 2(또한, 국제 공개 공보 제 WO 02/099095 호의 서열번호: 42 참조)에서 나타난다.

파라코쿠스 종 R114 균주는 파라코쿠스 제아크산티니파시엔스 ATCC 21588의 유도체이고, 2001년 4월 24일 특허 기탁 지정자 PTA-3335 하에 ATCC를 부다페스트 조약하에 기탁하였다. 본 발명에 사용될 수도 있는 파라코쿠스 종 및 균주 및 파라코쿠스 참조로서 플라보박테리아 종은 국제 공개 공보 제 WO 02/099095 호 47ff면에서 분류학적으로 재분류되었다. 그러한 종의 예로는 파라코쿠스 마커시(Paracoccus marcusii), 파라코쿠스 카로티니파시엔스, 파라코쿠스 솔벤티보란스(Paracoccus solventivorans), 파라코쿠스 제아크산티니파시엔스 또는 파라코쿠스 종 R114가 사용될 수 있다.

본 발명의 mev 오페론은 상기 오페론 내의 임의의 위치에 위치할 수도 있는 돌연변이 하나 이상을 갖고, 상기 오페론 내의 유전자 하나 이상의 활성에서 변화를 야기하여, 그러한 폴리뉴클레오티드를 갖는 미생물 내에 아이소프레노이드의 향상된 제조를 야기하게 된다.

하나의 양태에서, mev 오페론은 하나 이상의 돌연변이를 갖고, 이는 바람직하게는 mev 오페론의 hcs 유전자중에 위치하고, 그러한 유전자로는 예를 들어 파라코쿠스 종 R114 또는 파라코쿠스 제아크산티니파시엔스 ATCC 21588의 mev 오페론의 hcs 유전자가 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 돌연변이된 mev 오페론은 서열번호: 3으로 표시된다. 야생형 hcs 유전자의 서열 및 파라코쿠스 종 R114의 각 단백질은 각각 서열번호: 4 및 5에서 나타난다.

하나의 양태에서, 본 발명은 hcs 유전자중에서 돌연변이 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 서열번호: 5의 90 위치에 존재하는 글루타민이 라이신으로 대체된 서열번호: 7에 나타나는 하이드록시메틸글루타릴-CoA를 갖는 단백질은 암호화하는 서열번호: 6에서 나타나는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

그러므로, 본 발명의 목적은 mev 오페론의 유전자 하나 이상을 포함하는 상기 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기로 구성된 군에서 선택된다:

(a) 서열번호: 7에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호: 6에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드

(c) 폴리뉴클레오티드 (a) 또는 (b)에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 분획 또는 유도체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(이때, 상기 유도되는 하나 이상의 아미노산 잔기는 상기 폴리펩티드와 비교하여 보존적으로 치환되고, 상기 분획 또는 유도체는 하이드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소(hcs)의 활성을 갖는다);

(d) 엄중한 조건하에서 하이브리드하여 상기 (a) 내지 (c)중 어느 한 항목에서 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 수득하고 hcs 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 상보적인 가닥.

본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 단리된 형태, 바람직하게는 균질하게 정제된 형태로 제공된다.

용어 "단리된"이란 물질을 원래 환경(예: 자연적으로 발생하는 자연 환경)으로부터 제거하는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아 있는 미생물중에 존재하는 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 자연계에서 공동으로 존재하는 물질의 몇몇 또는 모두로부터 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부가 될 수 있고/거나 그러한 벡터 또는 조성물중에 여전히 단리되는 조성물의 일부가 될 수 있는 그러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 자연 환경의 일부가 아니다.

본원에 사용된 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 유래된 것으로부터 미생물에서 자연적으로 발생하는 지놈중에서 즉시 접종하는(하나는 5'-말단상에, 하나는 3'-말단상에) 암호화 서열 둘 모두를 갖는 즉시 접종하지 않는 DNA 또는 RNA일 수도 있다. 그러므로, 하나의 양태에서, 핵산은 암호화 서열에 즉시 접종하는 5'-비암호화 서열(예: 프로모터) 서열의 일부 또는 모두를 포함한다. 용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"란 예를 들어 벡터로, 자동적으로 복사되는 플라스미드 또는 바이러스로, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 지놈 DNA으로 혼입되는 DNA, 또는 다른 서열과 독립적으로 분리된 분자로서 존재하는 재조합 DNA(예: PCR 또는 제한적 엔도뉴클레아제 처리에 의해 제조된 cDNA 또는 지놈 DNA 분획)를 포함한다. 또한 포함되는 것은 다른 세포성 물질, 바이러스성 물질, 또는 배양 배지(재조합 DNA 기술에 의해 제조됨)매질이 실질적으로 없는 추가의 폴리펩티드를 암호화하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA, 또는 화학적 전구체 또는 다른 화학물(화학적으로 합성됨)이다. 또한, "단리된 핵산 분획"이란 자연 상태에서 발견되지 않고 분획으로서 자연적으로 발생하지 않는 핵산 분획이다.

유전자는 암호화 서열을 포함할 수도 있고, 비암호화서열, 예컨대 유전자의 암호화 영역의 3'- 및 5'-말단에 위치한 번역되지 않은 서열, 및 조절 서열을 포함한다. 또한, 유전자는 상기 정의된 바와 같은 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 추가로, 단백질의 아미노산 서열중에 변화를 야기하는 DNA 서열 다형성이 존재할 수도 있다는 것을 당업자는 숙지하고 있다.

또한, 본 발명은 엄중한 조건하에서, 바람직하게는 매우 엄중한 조건하에서 본발명의 폴리뉴클레오티드로 하이브리드 될 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드, 예컨대 서열번호: 6에 나타나는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "하이브리드"는 뉴클레오티드 서열이 서로 하이브리드되어 전형적으로 균질하게 남아 있는 것이 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 85% 내지 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상인 하이브리드 조건을 기술하는 것으로 의도된 것이다.

그러한 하이브리드 조건의 바람직한 비제한적 예로는 약 45℃에서 6배 염화 나트륨/시트르산 나트륨(SSC)중의 하이브리드 후, 50℃, 바람직하게는 55℃, 보다 바람직하게는 60℃, 보다 더 바람직하게는 65℃에서 1배 SSC 및 0.1% SDS로 세척하는 것이다.

매우 엄중한 조건으로는 예를 들어, 딕옥시제닌(DIG)-표지된 DNA 탐침기(DIG 탐침 시스템을 사용하여 제조된 독일 68298 만하임 소재의 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH)제)를 사용하여 연어의 정자 DNA 100㎍/ml의 존재 또는 부재하에 딕이지힙(DigEasyHyb) 용액(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하)과 같은 용액, 또는 50% 포름아마이드, 5배 SSC(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 삼나트륨), 0.02% 나트륨 도데실 설페이트, 0.1% N-라우로일사코신, 및 2% 블록킹 시약(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하)를 포함하는 용액중에서 42℃에서 2시간 내지 4일동안 배양한 후, 2배 SSC 및 0.1% SDS중에서 실온에서 5 내지 15분동안 2회 여과기를 세척한 다음 0.5배 SSC 및 0.1% SDS 또는 0.1배 SSC 및 0.1% SDS중에서 65 내지 68℃에서 15 내지 30분동안 2회 세척하는 것이다.

당업자는 엄중한 하이브리드 조건 및 매우 엄중한 하이브리드 조건에 적용되는 조건을 숙지하고 있다. 그러한 조건에 관한 추가의 지침은 당분야에서 용이하게 얻을 수 있고, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.; and Ausubel et al.(eds.), 1995, Current Protocols in Morecular Biology, (John Wiley & Sons, N. Y.)]을 참조한다. 물론, 오직 폴리 (A) 서열(예컨대 mRNA의 3'-말단 (A) 트랙)으로 하이브리드하는 폴리뉴클레오티는 본 발명의 핵산의 일부로 특정하게 하이브리드 하는데 사용되고, 이는 그러한 폴리뉴클레오티드가 폴리 (A) 스트레치 또는 그의 보완(예: 실질적으로 임의의 이중-가닥의 cDNA 클론)을 함유하는 임의의 핵산 분자로 하이브리드되기 때문이다.

본 발명의 이소프레노이트, 특히 유비퀴논, 바람직하게는 CoQ10의 제조에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 돌연변이, 즉 완전한 mev 오페론 또는 오직 그의 분획중 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 아이소프레노이드의 제조를 위해 오직 MEP 경로를 사용하는 자연적인, mev 오페론의 유전자 하나 이상이 본래 결핍된 적합한 미생물로 도입된다.

상기 기술된 바와 같은 돌연변이된 mev 오페론 또는 그의 분획은 예를 들어 로도박터속의 미생물에 도입될 수도 있다.

특히, 본 발명은 아이소프레노이드, 특히 유비퀴논, 바람직하게는 CoQ10의 제조방법에 관한 것으로, 이 방법은 (a) 상기 폴리뉴클레오티드가 본래 결핍되어 있는 미생물에, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계; 및 (b) 아이소프레노이드의 제조를 허용하는 조건하에서 단계 (a)의 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 파라코쿠스 속에 속하는 미생물의 돌연변이된 mev 오페론 또는 그의 분획은 로도박터속에 속하는 미생물에 도입된다. 보다 바람직하게는, 하이드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소를 암호화하는 유전자중에서 돌연변이 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 상기 미생물에 도입되고, 가장 바람직하게는 서열번호: 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 도입되는 것이다.

아이소프레노이트의 제조를 위해 MEP 경로를 사용하는, mev 오페론의 유전자 하나 이상이 본래 결핍된 임의의 미생물은 본 발명의 목적을 위해 사용될 수도 있다. 특히, 로도박터속의 특정 미생물은 본 발명의 돌연변이된 폴리뉴클레오티드의 도입을 위해 사용될 수도 있고, 이의 예로는 로도박터 스파에로이드, 로도박터 아드리아티쿠스(Rhodobacter adriaticus), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도박터 설피도필루스(Rhodobacter sulfidophilus), 또는 로도박터 벨드캄피(Rhodobacter veldkampii)가 있다. 바람직한 균주는 로도박터 스파에로이드, 보다 바람직하게는 로도박터 스파에로이드 ATCC 35053이다.

본원에 사용된 바와 같은 미생물은 동일한 물리학적 화학적 특징(진핵생물의 명명법의 국제 코드에 의해 정의된)을 갖는 그러한 종의 동의어 또는 파생어를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 도입된 폴리뉴클레오티드를 갖는(즉, 돌연변이 하나 이상을 갖는 mev 오페론의 유전자 하나 이상을 포함하는) 재조합 미생물을 제공하고, 이때 각 야생형의 미생물은 본래 mev 오페론의 유전자 하나 이상이 결핍되어 있고, 즉 아이소프레노이드의 제조를 위해 MEP 경로를 사용하여 아이소프레노이드, 특히 유비퀴논, 바람직하게는 CoQ10을 각 야생형의 미생물에 비해 향상되게 생성해낸다.

상기 기술된 바와 같은 mev 오페론의 유전자 하나 이상 내에 돌연변이 외에도, 재조합 미생물은 상기 미생물 내의 아이소프레노이드의 생성에 향상을 야기하는 한 추가의 변형/변경을 함유할 수도 있다.

하나의 양태에서, 그러한 추가의 변형은 상기 재조합 미생물로 데카프레닐 다이포스페이트 합성효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 도입이고, 바람직하게는 파라코쿠스 미생물(예: 파라코쿠스 제아크산티니파시엔스, 특히 파라코쿠스 제아크산티티파시엔스 ATCC 21588)로부터 수득될 수 있다. 가장 바람직한 것은 서열번호: 8의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호: 9로서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다.

그러므로, 본 발명은 아이소프레노이드(바람직하게는 CoQ10)의 제조방법에 관한 것이고, 데카프레닐 다이포스페이트 합성효소 활성을 암호화하는 DNA 서열이 MEP 경로를 자연적으로 사용하고 상기 기술된 바와 같이 도입된 돌연변이 하나 이상을 포함하는 mev 오페론의 유전자 하나 이상을 갖는 미생물(예: 로도박터속 미생물)에게 추가로 도입된다.

데카프레닐 다이포스페이트 합성효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 임의의 DNA 서열은 본 발명을 위해 사용될 수도 있다. 그러한 DNA의 예로는 파라코쿠스속의 미생물(예: 파라코쿠스 제아크산티니파시엔스, 보다 바람직하게는 파라코쿠스 제아크산티니파시엔스 ATCC 21588)의 데카프레닐 다이포스페이트 합성효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 ddsA 유전자 또는 그의 부분 서열이다. 가장 바람직한 것은 데카프레닐 다이포스페이트 합성효소(서열번호: 7)를 암호화하는 서열번호: 6으로 표시되는 파라코쿠스 제아크산티니파시엔스 ATCC 21588로부터의 ddsA 유전자이다.

그러므로, 본 발명의 태양은 (1) 파라코쿠스속에 속하는 미생물의 데카프레닐 다이포스페이트 합성효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 서열을, 로도박터속에 속하는 미생물에 도입되는 것은 포함하는, CoQ10의 제조방법을 제공하고, 이때 상기 mev 오페론은 돌연변이 하나 이상을 갖는 mev 오페론이고, (2) 변형된 로도박터 균주를 배양한다.

본원에 사용된 용어 "도입"은 예를 들어 로도박터속의 미생물 또는 숙주 유기체의 변형과 연계 연결되어, 유전 물질, 특히 돌연변이된 메발로네이트 오페론 또는 그의 하나 이상의 유전자를 숙주 유기체로 효과적으로 가져오는데 사용될 수도 있는(즉, 유기체에 의해 발현되는 방식으로), 당업자에게 잘 공지된 방법을 포함한다. 도입은 예를 들어 벡터, 바람직하게는 발현 플라스미드에 의해, 또는 표준 방법에 따른 숙주의 지놈으로 통합되는 것에 의해 수될 수도 있다. 플라스미드를 통해 유전자를 도입하는 바람직한 방법, 예컨대 PcrtE 프로모터의 제어하에 발현 플라스미드 pBBR-K-PcrtE(이 플라스미드의 구축은 국제 공개 공보 제 WO 02/099095 호의 91면 12행 내지 27행의 실시예 6에 상세히 기술됨)에서 복제되는 유전자의 도입이다. 로도박터속의 미생물로 DNA(예: 발현 플라스미드)를 도입하는 바람직한 방법은, 예를 들어 에스케리챠 콜라이(Escheritia coli)로부터 로도박터 균주로 플라스미드의 접합 전이이다(문헌[Nishimura et al., Nucl. Acids Res. 18, 6169, 1990; Simon et al., Bio/Technology 1983, 784-91]).

mev 오페론의 돌연변이 또는 그의 유전자 하나 이상은, 특정 이식을 필요로 하지 않고 당업자에게 친숙한 방법을 사용하여 PCR 사이트에 직접 돌연변이를 일으킴으로써 생성될 수 있다. 또한, 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있는 돌연변이 생성 방법은, 예를 들어 자외선 방사, 전이 또는 화학 돌연변이 생성을 포함한다. 증가된 아이소프레노이드(예: CoQ10)를 나타내는 돌연변이의 동정을 위한 스크리닝 방법의 예로는, 자외선 광, HPLC, NMR 또는 박층 크로마토그래피에 의해 아이소프레이드(예: CoQ10)를 직접 측정하는 것이 있다. 아이소프레노이드(예: CoQ10)의 제조는, 당업자에게 친숙한 색 카로티노이드 색 강도의 증가분을 측정함으로써 직접 측정될 수도 있다.

돌연변이된 mev 오페론 또는 그의 하나 이상의 유전자로 숙주 형질전환된 것은, 목적 생성물, 특히 CoQ10의 발현 및 효율적인 성장에 적합한 온도, pH 및 에어레이션 조건하에 숙주에 의해 동화될 수 있다.

발효 배양액 및/또는 형질전환체로부터 단리, 즉 예를 들어 파라코쿠스속에 속하는 미생물의 돌연변이된 메발로네이트 오페론을 갖는 미생물이 도입되고, 선택적으로, 인간 또는 동물을 위해 그렇게 제조된 CoQ10의 제형을 포함하는, 아이소프레노이드, 특히 CoQ10을 당분야에 잘 공지된 방법에 따라 정제하고 추가로 가공한다. 그러나, 동물 건강 및 영양에 사용하기 위해서는 특정 정제가 필요하지 않을 수도 있다. CoQ10과 같은 아이소프레노이드의 제조의 경우에, 생물량 및/또는 발효 배양액의 다른 성분은 추가로 가공되어 시판되는 매력적인 생성물이 수득될 수도 있다.

본 발명의 공정은 예를 들어 CoQ10을 위한 아이소프레노이드의 보다 높은 수율이 생성된다. 예를 들어 로도박터의 비-재조합 균주를 사용하거나, 예를 들어 파라코쿠스 균주의 mev 오페론의 야생형을 갖는 로도박터를 위한 재조합 균주를 사용하는 공정에 비해 약 10% 이상 증가될 수 있다.

도 1은 IPP 형성을 위한 MEP 경로를 사용하는, 로도박터 스파에로이드에서 CoQ10 생합성을 위한 경로를 나타낸다. 네모 표시 영역은 (IPP의 형성을 야기하는) 메발로네이트 경로, 및 IPP 이성질화효소 단계를 포함하는 반응 순서를 나타낸다. 메발로네이트 경로는 로도박터 스파에로이드에서 자연적으로 발생하지 않는다. 파라코쿠스 제아크산티니파시엔에서는, 메발로네이트 경로의 5개의 효소 및 IPP 이성질화효소를 암호화하는 유전자는 하기에서 메발로네이트 오페론이라 지칭된다.

하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하고, 이는 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1

박테리아 및 배양 조건

CoQ10의 제조가 향상된 재조합 균주의 구축을 위해 기본 숙주로서 로도박터 스파에로이드 균주 ATCC 35053(미국 버지니아주 마나사사스 소재의 미국표준균주(ATCC, American Type Culture Collection)로부터 수득)을 사용하였다. 모든 로도박터 스파에로이드 균주는 RS100 배지에서 30℃에서 배양하였다. 배지 RS100의 조성물 및 제제는 하기 표 1에 요약하였다. 재조합 균주의 성장을 위한 배지에 카나마이신 50 mg/l를 첨가하였다. 에스케리챠 균주를 LB 배지(미국 메릴랜드주 스팍스 소재의 벡튼 딕킨슨(Becton Dickinson))중에 37℃에서 배양하였다. 재조합 에스케리챠 콜라이 균주에서 플라스미드의 유지를 위해, 암피실린(100 mg/l) 및/또는 카나마이신(25 내지 50 mg/l, 플라스미드에 의존적)을 배양 배지에 첨가하였다. 에스케리챠 콜라이 및 로도박터 스파에로이드의 액체 배양을 200 rpm에서 회전 진탕기에서 일상적으로 에어로빅 배양하였다. 고체 배지가 요구되는 경우, 아가(1.5% 최종 농도)를 첨가하였다.

실시예 2

CoQ10를 위한 분석 평가

배양 배양액(실시예 5 참조) 전체 400㎕를 사용후 버릴 수 있는 폴리프로필렌 원심분리 튜브 15 ml에 옮겼다. 안정화 추출 용액 4ml(1:1(부피/부피) DMSO/THF중의 0.5 g/BHT ℓ)을 첨가하고 시료를 실험실 진탕기(독일 IKE)에서 20분동안 혼합하여 추출물을 강화하였다. 마지막으로, 시료를 원심분리하고, 상청액을 역전 상 HPLC에 의한 분석을 위한 앰버 유리병에 옮겼다. 이 방법은, 카로티노이드 피토엔, 스페로이데논, 스페로이덴 및 뉴로스포렌으로부터 CoQ10의 선명한 분리에 의한, 유비퀴논 및 그의 상응하는 하이드로퀴논의 동시 측정을 위해 개발된 것이다. 온도-제어된 자동샘플러 및 다이오드 정렬 검출기를 장착한 아길런트(Agilent) 1100 HPLC 시스템(미국 아길런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))를 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 방법의 파라미터는 하기와 같다:

실시예 3

파라코쿠스 제아크산티니파시엔으로부터 돌연변이된 mev 오페론의 복제

플라스미드 pBBR-K-mev-op-wt 및 pBBR-K-mev-op-R114의 구축

플라스미드 pBBR-K-mev-op-up-4(메발로네이트 오페론의 첫 번째 4개의 유전자를 함유하는 플라스미드)의 구축은 국제 공개 공보 제 02/099095 호의 실시예 13(105면 5행 내지 106면 8행)에서 기술하고 있다.

파라코쿠스 제아크산티니파시엔 R114 지놈 DNA를 주형으로 사용하여, PCR을 프라이머라제 hcs-5326(서열번호: 10) 및 mvd-9000(서열번호: 11)로 수행하였다. 프라이머 hcs-5326은 서열번호: 2의 뉴클레오티드 6977 내지 6996으로부터 서열의 역 상보에 상응한다. 수득된 3675 bp의 PCR 생성물을 pC2.1-TOPO(미국 캘리포니아주 카를스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))으로 복제하여, 플라스미드 TOPO-p-CR2.1-mev-op-d-3wt를 수득하였다. 따라서, 이 플라스미드는 hcs 3' 말단 및 마지막 3개의 유전자인 m파, pmk 및 mvd를 포함하는 메발로네이트 오페론의 다운스트림 절반을 함유한다.

플라스미드 pBBR-K-mev-op-up-4 및 TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt를 엔도뉴클레아제 SacI 및 NdeI로 증해하고, 생성된 TOPO-pCCR2.1-mev-op-d-3wt로부터 3319 bp는 pBBR-K-mev-op-up-4로부터 8027 bp로 잡아매었다. 생성된 플라스미드인 pBBR-K-mev-op-R114는 (추정상) 그의 프로모터를 포함하는 파라코쿠스 제아크산티니파시엔 R114로부터의 완전한 메발로네이트 오페론을 함유한다.

플라스미드 pBBR-K-mev-op-wt-PcrtE-crtE 및 pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtE의 구축

플라스미드 pBBR-K-Pcrt-crtE의 구축은 국제 공개 공보 제 WO 02/099095 호의 실시예 6(92면 10행 내지 17행)에서 상세히 기술하고 있다. 플라스미드 pBBR-K-PcrtE-crtE를 NaI로 자르고, 1.33 kb의 분획을 단리하고, pBBR-K-mev-op-up-4의 Ecl136II 위치로 삽입하였다. 삽입의 방향을 확인하고, crtE 유전자를 갖는 플라스미드를 메발로네이트 오페론 유전자로서, pBBR-K-mev-op-up-4-PcrtE-crtE와 동일한 방향으로 설계하였다.

플라스미드 pBBR-K-mev-op-up-4-PcrtE-crtE를 SphI로 자르고, SpeI 및 crtE 유전자를 함유하는 수득된 5566 bp 분획을 단리하였다. 이 분획을 SphI-SpeI 분획으로 잡아 매어, SpBBR-K-mev-op-wt 또는 동일한 효소를 사용하는 pBBR-K-mev-op-R114의 제한적인 소화후 수득하였고, pBBR-K-mev-op-wt-PcrtE-crtE 및 pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtE 각각을 수득하였다.

플라스미드 pBBR-K-mev-op-wt-PcrtE-ddsA _wt 및 pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsA _wt 의 구축

플라스미드 pBBR-K-PcrtE의 구축은 국제 공개 공보 제 WO 02/099095 호의 실시예 6(91면 12행 내지 27행)에서 상세히 기술하고 있다.

파라코쿠스 제아크산티니파시엔 균주 ATCC 21588로부터의 ddsA 유전자(ddsA_wt로 설계됨)를, dds-Nde 프라이머(서열번호: 21) 및 dds-Bam(서열번호: 13) 프라이머를 사용하는 PCR(독일 만하임 로슈 몰레큘라 바이오케미칼즈(Roche Molecular Biochemicals)제의 GC이 풍부한 PCR 시스템)로 증폭하였고, pCR2.1-TOPO(비국 캘리포니아주 카를스배드 소재의 인비트로겐)로 복제하여 플라스미드 TOPO-ddsA_wt를 수득하였다.

플라스미드 TOPO-ddsA_wt를 NdeI 및 BamHI로 자르고, ddsA 유전자를 함유한느 1005 bp의 수득된 분획을 NdeI 및 BamHI로 잘린 pBBR-K-PcrtE 플라스미드로 복제하였다. ddsA 유전자 내의 엔도뉴클레아제 EcoRI을 위한 인식 부위를, 올리고뉴클레오티드 dds-R-1(서열번호: 14) 및 dds-R2(서열번호: 15)를 사용하는 신속변환(QuikChange) XL 사이트-다이렉트 돌연변이 생성 키트로 침묵 돌연변이를 도입함으로써 제거하였다. 생성된 플라스미드 p-BBR-K-PcrtE-ddsAwt-R을 EcoI 및 MamI로 자르고, ddsA 유전자를 함유하는 1278 bp 분획을, EcoRI 및 EcoRV로 잘린 TOPO-ddsA_wt로 삽입하여, 플라스미드 pCR2.1-TOPO-ddsA_wt-R을 수득하였다. 이 플라스미드를 CelII 및 XbaI로 자르고 각각 CelI 및 BlnI를 갖는 각각 pBBR-K-mev-op-wt-PcrtE-crtE 및 pBBR-K-op-R114-PcrtE-crtE의 소화로부터 11.6 kb의 제한 분획으로 소화한 것으로부터 11.6 kb 제한 분획과 잡아맸다. 생성된 플라스미드는 각각 pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtE 및 pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsA_wt이다.

플라스미드 pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsA _wt 의 구축

신속변환 XL 사이트-다이렉트 돌연변이 생성 키트(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트레이트진(Strategnene)) 및 뮤트4-89-1-fw(서열번호: 16) 및 뮤트4-89-1-rev(서열변호: 17) 프라이머를 사용하여 PCR 사이트-다이렉트 돌연변이 생성의 2가지 라운드에 의해 플라스미드 pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsA_wt을 수득하였다. 상기 둘 모두의 프라이머는 서로 보완적이고, 서열번호: 4의 268 위치에 상응하는 서열번호: 3의 2949 위치에서 C 대신 A인 목적 돌연변이를 함유한다. 첫 번째 돌연변이 생성 반으은 제조자의 지시에 따른 하기로 설정하였다: 5㎕의 10배 반응 완충제, 10 ng 플라스미드 DNA pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsA_wt, 125 ng의 프라미더 뮤트4-89-1-fw, 125 ng 뮤트4-89-1rev, 1㎕의 dNTP 혼합물, 3㎕의 퀵솔루션 및 2.5 U pfu 터보 DNA 폴리머라제를 50㎕의 최종부피중에 혼합하였다. 하기 변수를 사용함으로써 사이클을 수행하였다: 1 사이클: 1분동안 95℃; 18사이클: 50초동안 95℃, 50초동안 60℃, 30분동안 68℃; 1사이클: 7분동안 68℃. 37℃로 반응 혼합물을 냉각한 후, 제한 엔도뉴클레아제 DpnI의 10U를 첨가하고 반응물을 2시간동안 37℃에서 배양하였다. 에스케리챠 콜라이 XL 10-골드 울트라컴포넌트 셀(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트레이트진)을 제조자의 프로토몰에 따른 DpnI-처리된 DNA로 형질전환하였다.

생성된 플라스미드 pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsA_wt을 단리하고, 서열번호: 3의 6948 위치에서 T 대신 C인 목적 돌연변이를 함유하는 프라이머 뮤트 4-89-2-fw(서열번호: 18) 및 뮤트4-89-2-rev(서열번호: 19)를 사용하는 PCR 사이트-다이렉트 돌연변이 생성의 제 2 라운드에서 DNA 주형으로서 사용하였다. 돌연변이 생성은 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 수득된 플라스미드 pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsA_wt을 단리하고 마이크로신트 게엠베하(스위스 발가흐 소재)에서 서열화하였다. 돌연변외된 mev 오페론의 완전한 서열은, 하기를 포함하는 서열번호: 3으로 표시된다: 617 내지 1639 위치의 mvaA(하이드록시메틸글루타릴-CoA를 암호화), 1636 내지 2685 위치의 idi(아이소펜테닐 다이포스페이트 이성질화효소를 암호화), 2682 내지 3848 위치의 hcs(하이드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소를 암호화), 3829 내지 4965 위치의 mva(메발로네이트 키나제를 암호화), 4965 내지 5882 위치의 pmk(포스포메발로네이트 키나제를 암호화), 및 5875 내지 6873 위치의 mvd(다이포스포메발로네이트 데카복실라제를 암호화).

실시예 4

돌연변이된 mev 오페론의 로도박터 스파에로이드 ATCC로의 도입

돌연변이된 mev 오페론을 갖는 플라스미드를 갖는 에스케리챠 콜라이 S17-1(문헌[Simon et al., Bio/Technology 11, 784-791, 1983])의 형질전환 및 에스케리챠 콜라이로부터 로도박터 스파에로이드 ATCC 35053으로의 플라스미드의 후속적인 전이를 표준 과장을 따라 접합함으로써 수행하였다(문헌[Nishimura et al., Nucl. Acids Res. 18, 6169, 1900; Simon et al., Bio/Technology 1983, 784-91]).

로도박터 스파에로이드 ATCC 35053의 일시적인 리팜피신 저항성의 돌연변이를, 100 mg/l 리팜피신을 갖는 RS100 액체 배지중의 균주 ATCC 35053을 배양하고, 100 mg/l 리팜피신을 함유하는 RS100 플레이트상의 셀을 플레이팅하고, 단일 콜로니를 단리함으로써 첫 번째로 단리하였다. 접합을 위해, 수용 세포(리팜피신-저항성의 로도박터 스파에로이드 ATCC 35053)을 100 mg/l 리팜피신을 함유하는 RS100 배지에 배양하고 도너 셀(50 mg/카나마이신을 함유하는 LB 배양액중에서 배양시켜 전이시킨 플라스미드를 갖는 에스케리챠 콜라이 S17-1)을 원심분리하여 펠릿화하였다. 상청액을 따라내고, 세포를 신선한 RS100 배지로 2회 세척하여 항생제를 제거하였다. 그 후, 각각의 펠릿을 신선한 RS100 배지의 1 ml중에 재현탁하였다. 도너 세포의 50㎕를 혼합하고, 원심분리로 펠릿화하여, 신선한 RS100 배지 0.03 ml중에서 재현탁하고 RS100상에 스팟팅하였다. 30℃에서 밤새 배양한 후, 세포를 배양 로프로 수확하고 RS100 배지 0.3 ml중에서 재현탁하였다. 이 현탁액의 희석물을 100 mg/리팜피신ℓ 및 50 mg/카나마이신ℓ를 함유하는 RS100 플레이트상에 퍼트리고 30℃에서 배양하였다. 플라스미드의 존재하에 50 mg/카나마이신ℓ를 함유하는 액체 RS100 배지중에서 배양된 콜로니(로도박터 스파에로이드 ATCC 35053의 형질전환된 세포로 추정됨)를 플레이트로부터 취하고, 56℃의 온도에서 어닐링하고 1분동안 신장하고 하기의 상이한 프라이머 쌍을 15초동안 사용하는 PCR 반응으로 시험하였다:

pBBR-K-up(서열번호: 20)/PcrtE-2442(서열번호: 21)

kan3out(서열번호: 22)/mvaA3256(서열번호: 23)

50 mg/카나마이신ℓ를 함유하는 RS100 플레이트상에서 양성 클론을 스트리킹하여 단일 콜로니를 수득하였다. 각 클론으로부터 단일 콜로니를 50 mg/카나마이신ℓ을 함유하는 액체 RS100 배지중에 다시 배양하였고, 예기된 플라스미드의 존재를 상기 기술된 바와 같은 PCR로 확인하였다. 생성된 재조합 균주는 ATCC 35053/pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsA_wt였다.

실시예 5

로도박터 스파에로이드 ATCC 35053의 형질감염된 균주중에서 CoQ10의 제조

로도박터 스파에로이드 균주 ATCC 35053, ATCC 35053/pBBR-K-op-R14-PcrtE-ddsA_wt 및 ATCC 35053/pBBR-K-op-4-89-PcrtE-ddsA_wt을 다시 RS100 배지중에서 진탕 플라스크에서 배양하였다. 50 mg/카나마이신ℓ를 함유하는 재조합 로도박터 스파에로이드를 배양하였다. 20개의 5ml 배양물을 200 rpm에서 진탕하면서 흐름이 멈춘 에를엔메이어 플라스크중에서 30℃에서 배양하였다. CoQ10 제조를 시험하기 위해, 로도박터 스파에로이드 균주의 동결된 글리세롤화된 스톡 배양물을 25 ml 시드 배양물을 접종하기 위해 사용하였다. 24 내지 28시간의 시드 배양 후, 적합한 부피의 배양물을 초기 광학 밀도가 660 나노미터(OD₆₆₀)에서 0.16이 되도록 실험실 플라스크를 접종하였다. 24시간 간격에서 20 ml 시료를 취하였다. 배양(OD₆₆₀에서 측정), pH, 배양 상청액중의 글루코스 및 CoQ10 및 카로티노이드(HPLC에 의해 측정)을 실시예 2에 기술된 바와 같다. 이들 결과는 파라코쿠스 제아크산티니파시엔으로부터 복제된 돌연변이된 메발로네이트 오페론의 발현이 로도박터 스파에로이드에서 CoQ10의 제조를 현저하게 향상시킨다는 것을 명백히 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> Production of isoprenoids <130> Case 22259 <160> 23 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 7096 <212> DNA <213> Paracoccus zeaxanthinifaciens ATCC 21588 <400> 1 cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa 60 gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat 120 tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt 180 tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg 240 ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc 300 agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccca tgggcaaata ttatacgcaa 360 ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtttg tgatggcttc 420 catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtttttat gcaacgcgtc gaaccgcccg 480 tccgacgccg gtttccgcac ggaaacgcgc ggcaagttga cataacttgc acgcgacgtc 540 tcgattctgc ccgcgaagaa tgcgatgcat ccagatgatg cagaacgaag aagcggaagc 600 gcccgtgaaa gaccagatga tttcccatac cccggtgccc acgcaatggg tcggcccgat 660 cctgttccgc ggccccgtcg tcgagggccc gatcagcgcg ccgctggcca cctacgagac 720 gccgctctgg ccctcgaccg cgcggggggc aggggtttcc cggcattcgg gcgggatcca 780 ggtctcgctg gtcgacgaac gcatgagccg ctcgatcgcg ctgcgggcgc atgacggggc 840 ggcggcgacc gccgcctggc agtcgatcaa ggcccgccag gaagaggtcg cggccgtggt 900 cgccaccacc agccgcttcg cccgccttgt cgagctgaat cgccagatcg tgggcaacct 960 gctttacatc cgcatcgaat gcgtgacggg cgacgcctcg ggtcacaaca tggtcaccaa 1020 ggccgccgag gccgtgcagg gctggatcct gtcggaatac ccgatgctgg cctattccac 1080 gatctcgggg aacctgtgca ccgacaagaa ggcgtcggcg gtcaacggca tcctgggccg 1140 cggcaaatac gccgtcgccg aggtcgagat cccgcgcaag atcctgaccc gcgtgctgcg 1200 caccagcgcc gagaagatgg tccgcctgaa ctacgagaag aactatgtcg ggggtacgct 1260 ggcggggtcg ctgcgcagtg cgaacgcgca tttcgccaac atgctgctgg gcttctacct 1320 ggcgacgggg caggacgcgg ccaacatcat cgaggccagc cagggcttcg tccattgcga 1380 ggcccgcggc gaggatctgt atttctcgtg cacgctgccc aacctcatca tgggctcggt 1440 cggtgccggc aagggcatcc cctcgatcga ggagaacctg tcgcggatgg gctgccgcca 1500 gccgggcgaa cccggcgaca 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R114 <400> 2 cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa 60 gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat 120 tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt 180 tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg 240 ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc 300 agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccca tgggcaaata ttatacgcaa 360 ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtttg tgatggcttc 420 catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtttttat gcaacgcgtc gaaccgcccg 480 tccgacgccg gtttccgcac ggaaacgcgc ggcaagttga cataacttgc acgcgacgtc 540 tcgattctgc ccgcgaagaa tgcgatgcat ccagatgatg cagaacgaag aagcggaagc 600 gcccgtgaaa gaccagatga tttcccatac cccggtgccc acgcaatggg tcggcccgat 660 cctgttccgc ggccccgtcg tcgagggccc gatcagcgcg ccgctggcca cctacgagac 720 gccgctctgg ccctcgaccg cgcggggggc aggggtttcc cggcattcgg gcgggatcca 780 ggtctcgctg gtcgacgaac gcatgagccg ctcgatcgcg ctgcgggcgc atgacggggc 840 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R114 <400> 3 atgaaagtgc ctaagatgac cgtgacagga atcgaagcga tcagcttcta caccccccag 60 aactacgtgg gactggatat ccttgccgcg catcacggga tcgaccccga gaagttctcg 120 aaggggatcg ggcaggagaa aatcgcactg cccggccatg acgaggatat cgtgaccatg 180 gccgccgagg ccgcgctgcc gatcatcgaa cgcgcgggca cgcagggcat cgacacggtt 240 ctgttcgcca ccgagagcgg gatcgaccag tcgaaggccg ccgccatcta tctgcgccgc 300 ctgctggacc tgtcgcccaa ctgccgttgc gtcgagctga agcaggcctg ctattccgcg 360 acggcggcgc tgcagatggc ctgcgcgcat gtcgcccgca agcccgaccg caaggtgctg 420 gtgatcgcgt ccgatgtcgc gcgctatgac cgcgaaagct cgggcgaggc gacgcagggt 480 gcgggcgccg tcgccatcct tgtcagcgcc gatcccaagg tggccgagat cggcaccgtc 540 tcggggctgt tcaccgagga tatcatggat ttctggcggc cgaaccaccg ccgcacgccc 600 ctgttcgacg gcaaggcatc gacgctgcgc tatctgaacg cgctggtcga ggcgtggaac 660 gactatcgcg cgaatggcgg ccacgagttc gccgatttcg cgcatttctg ctatcacgtg 720 ccgttctcgc ggatgggcga gaaggcgaac agccacctgg ccaaggcgaa caagacgccg 780 gtggacatgg ggcaggtgca gacgggcctg atctacaacc ggcaggtcgg gaactgctat 840 accgggtcga tctacctggc attcgcctcg ctgctggaga acgctcagga ggacctgacc 900 ggcgcgctgg tcggtctgtt cagctatggc tcgggtgcga cgggcgaatt cttcgatgcg 960 cggatcgcgc ccggttaccg cgaccacctg ttcgcggaac gccatcgcga attgctgcag 1020 gatcgcacgc ccgtcacata tgacgaatac gttgccctgt gggacgagat cgacctgacg 1080 cagggcgcgc ccgacaaggc gcgcggtcgt ttcaggctgg caggtatcga ggacgagaag 1140 cgcatctatg tcgaccggca ggcctga 1167 <210> 4 <211> 388 <212> PRT <213> Paracoccus sp. 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R114 <400> 6 Met Lys Val Pro Lys Met Thr Val Thr Gly Ile Glu Ala Ile Ser Phe 1 5 10 15 Tyr Thr Pro Gln Asn Tyr Val Gly Leu Asp Ile Leu Ala Ala His His 20 25 30 Gly Ile Asp Pro Glu Lys Phe Ser Lys Gly Ile Gly Gln Glu Lys Ile 35 40 45 Ala Leu Pro Gly His Asp Glu Asp Ile Val Thr Met Ala Ala Glu Ala 50 55 60 Ala Leu Pro Ile Ile Glu Arg Ala Gly Thr Gln Gly Ile Asp Thr Val 65 70 75 80 Leu Phe Ala Thr Glu Ser Gly Ile Asp Lys Ser Lys Ala Ala Ala Ile 85 90 95 Tyr Leu Arg Arg Leu Leu Asp Leu Ser Pro Asn Cys Arg Cys Val Glu 100 105 110 Leu Lys Gln Ala Cys Tyr Ser Ala Thr Ala Ala Leu Gln Met Ala Cys 115 120 125 Ala His Val Ala Arg Lys Pro Asp Arg Lys Val Leu Val Ile Ala Ser 130 135 140 Asp Val Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Ser Ser Gly Glu Ala Thr Gln Gly 145 150 155 160 Ala Gly Ala Val Ala Ile Leu Val Ser Ala Asp Pro Lys Val Ala Glu 165 170 175 Ile Gly Thr Val Ser Gly Leu Phe Thr Glu Asp Ile Met Asp Phe Trp 180 185 190 Arg Pro Asn His Arg Arg Thr Pro Leu Phe Asp Gly Lys Ala Ser Thr 195 200 205 Leu Arg 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gctggcaccc 60 gagatggagg ccgtgaacgc gctgatccgc gaacgcatgg ccagcaggca tgcgccgcgc 120 atccccgagg tgaccgccca cctgatcgag gccggcggca agcgcctgcg cccgatgctg 180 accctggccg cggcgaagct gcttggctat ggcggcccct atcacgtgca tctggccgcg 240 acggtcgaat tcatccacac cgcgaccctg ctgcatgacg acgtggtcga cgaaagccgc 300 cagcgccgcg ggcgtccgac ggcgaacctg ctgtgggaca acaagtccag cgtgctggtc 360 ggcgattacc tgttcgcgcg cagcttccag ctgatggtcg aacccggcag catgcgcacg 420 ctcgagatcc tgtcgaacgc cgccgccacc atcgccgagg gcgaggtgct gcagctgacc 480 gcggcgcagg atctggccac gaacgaggac atctatctgc aggtcgtgcg cggcaagacg 540 gcagcgctgt tctcggccgc gaccgaggtg ggcggcgtca tcgcgggcgt ccccgatgcg 600 caggtccgcg cgctgttcga ttacggcgac gcgcttggca tcgccttcca gatcgtggac 660 gacctgctgg attacggcgg caccgccgag gcgatcggca agaataccgg cgacgatttc 720 cgcgaacgca agctgacgct gccggtgatc aaggccgtgg cccgcgccac ccccgaggaa 780 cgcgccttct ggtcgcgcac catcgagaag ggcgaccaga aggacggcga ccttgaacac 840 gcgctggaac tgctggcccg ccacggcgcg atggccgatg cccgccgcga cgcgctggac 900 tgggcggcca gggcccgcgc ctccctgcag atcctgcccg agcatccgat ccgcgacatg 960 ctgtcggacc tggccgattt cgtggtcgaa cgcatcgcct ga 1002 <210> 8 <211> 333 <212> PRT <213> Paracoccus zeaxanthinifaciens ATCC 21588 <400> 8 Met Asn Val Gln Glu Asp Val Arg Lys Pro Leu Asp Arg Leu Ala Glu 1 5 10 15 Ala Leu Ala Pro Glu Met Glu Ala Val Asn Ala Leu Ile Arg Glu Arg 20 25 30 Met Ala Ser Arg His Ala Pro Arg Ile Pro Glu Val Thr Ala His Leu 35 40 45 Ile Glu Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Met Leu Thr Leu Ala Ala 50 55 60 Ala Lys Leu Leu Gly Tyr Gly Gly Pro Tyr His Val His Leu Ala Ala 65 70 75 80 Thr Val Glu Phe Ile His Thr Ala Thr Leu Leu His Asp Asp Val Val 85 90 95 Asp Glu Ser Arg Gln Arg Arg Gly Arg Pro Thr Ala Asn Leu Leu Trp 100 105 110 Asp Asn Lys Ser Ser Val Leu Val Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Arg Ser 115 120 125 Phe Gln Leu Met Val Glu Pro Gly Ser Met Arg Thr Leu Glu Ile Leu 130 135 140 Ser Asn Ala Ala Ala Thr Ile Ala Glu Gly Glu Val Leu Gln Leu Thr 145 150 155 160 Ala Ala Gln Asp Leu Ala Thr Asn Glu Asp Ile 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ggcggcgacc gccgcctggc agtcgatcaa ggcccgccag gaagaggtcg cggccgtggt 900 cgccaccacc agccgcttcg cccgccttgt cgagctgaat cgccagatcg tgggcaacct 960 gctttacatc cgcatcgaat gcgtgacggg cgacgcctcg ggtcacaaca tggtcaccaa 1020 ggccgccgag gccgtgcagg gctggatcct gtcggaatac ccgatgctgg cctattccac 1080 gatctcgggg aacctgtgca ccgacaagaa ggcgtcggcg gtcaacggca tcctgggccg 1140 cggcaaatac gccgtcgccg aggtcgagat cccgcgcaag atcctgaccc gcgtgctgcg 1200 caccagcgcc gagaagatgg tccgcctgaa ctacgagaag aactatgtcg ggggtacgct 1260 ggcggggtcg ctgcgcagtg cgaacgcgca tttcgccaac atgctgctgg gcttctacct 1320 ggcgacgggg caggacgcgg ccaacatcat cgaggccagc cagggcttcg tccattgcga 1380 ggcccgcggc gaggatctgt atttctcgtg cacgctgccc aacctcatca tgggctcggt 1440 cggtgccggc aagggcatcc cctcgatcga ggagaacctg tcgcggatgg gctgccgcca 1500 gccgggcgaa cccggcgaca acgcgcgccg tcttgcggcg atctgcgcgg gcgtcgtgct 1560 gtgtggtgaa ttgtcgctgc ttgcggccca gaccaacccc ggagagttgg tccgcaccca 1620 catggagatg gagcgatgac cgacagcaag gatcaccatg tcgcggggcg caagctggac 1680 catctgcgtg cattggacga cgatgcggat atcgaccggg gcgacagcgg cttcgaccgc 1740 atcgcgctga cccatcgcgc cctgcccgag gtggatttcg acgccatcga cacggcgacc 1800 agcttcctgg gccgtgaact gtccttcccg ctgctgatct cgtccatgac cggcggcacc 1860 ggcgaggaga tcgagcgcat caaccgcaac ctggccgctg gtgccgagga ggcccgcgtc 1920 gccatggcgg tgggctcgca gcgcgtgatg ttcaccgacc cctcggcgcg ggccagcttc 1980 gacctgcgcg cccatgcgcc caccgtgccg ctgctggcca atatcggcgc ggtgcagctg 2040 aacatggggc tggggctgaa ggaatgcctg gccgcgatcg aggtgctgca ggcggacggc 2100 ctgtatctgc acctgaaccc cctgcaagag gccgtccagc ccgaggggga tcgcgacttt 2160 gccgatctgg gcagcaagat cgcggccatc gcccgcgacg ttcccgtgcc cgtcctgctg 2220 aaggaggtgg gctgcggcct gtcggcggcc gatatcgcca tcgggctgcg cgccgggatc 2280 cggcatttcg acgtggccgg tcgcggcggc acatcctgga gccggatcga gtatcgccgc 2340 cgccagcggg ccgatgacga cctgggcctg gtcttccagg actggggcct gcagaccgtg 2400 gacgccctgc gcgaggcgcg gcccgcgctt gcggcccatg atggaaccag cgtgctgatc 2460 gccagcggcg gcatccgcaa cggtgtcgac atggcgaaat gcgtcatcct gggggccgac 2520 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gcgccatcgt cgccgggatc gagcagcgcg cccatgtgac gatcgtcccg cgtgccgacc 5100 gcatgtttcg catcacctcg cagatcgggg cgccgcagca ggggtcgctg gacgatctgc 5160 ctgcgggcgg gacctatcgc ttcgtgctgg ccgccatcgc gcgacacgcg ccggacctgc 5220 cttgcgggtt cgacatggac atcacctcgg ggatcgatcc gaggctcggg cttggatcct 5280 cggcggcggt gacggtcgcc tgcctcggcg cgctgtcgcg gctggcgggg cgggggaccg 5340 aggggctgca tgacgacgcg ctgcgcatcg tccgcgccat ccagggcagg ggcagcgggg 5400 ccgatctggc ggccagcctg catggcggct tcgtcgccta tcgcgcgccc gatggcggtg 5460 ccgcgcagat cgaggcgctt ccggtgccgc cggggccgtt cggcctgcgc tatgcgggct 5520 acaagacccc gacagccgag gtgctgcgcc ttgtggccga tcggatggcg ggcaacgagg 5580 ccgctttcga cgcgctctac tcccggatgg gcgcaagcgc agatgccgcg atccgcgcgg 5640 cgcaagggct ggactgggct gcattccacg acgcgctgaa cgaataccag cgcctgatgg 5700 agcagctggg cgtgtccgac gacacgctgg acgcgatcat ccgcgaggcg cgcgacgcgg 5760 gcgccgcagt cgccaagatc tccggctcgg ggctggggga ttgcgtgctg gcactgggcg 5820 accagcccaa gggtttcgtg cccgcaagca ttgccgagaa gggacttgtt ttcgatgact 5880 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cgcctgtggc aggcccgcgc ggacgggctt gcggcctttg cgacgatgga tgccggcccg 6780 aacgtcaagc tgatcttcga ggaaagcagc gccgccgacg tgctgtacct gttccccgac 6840 gccagcctga tcgcgccgtt cgaggggcgt tgaacgcgta agacgaccac tgggtaaggt 6900 tctgccgcgc gtggtctcga ctgcctgcaa agaggtgctt gagttgccgc gtgactgcgg 6960 cggccgactt cgtgggactt gcccgccacg ctgacgaagg gcgaattcca gcacactggc 7020 ggccgttact agttctagag cggccgccac cgcggtggag ggcggcacct cgctaacgga 7080 ttcaccgttt ttatca 7096

Claims

하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소 활성, 아이소펜테닐 다이포스페이트 이성질화효소 활성, 하이드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소 활성, 메발로네이트 키나제 활성, 포스포메발로네이트 키나제 활성 및/또는 다이포스포메발로네이트 데카복실라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열로서, 미생물중에 존재하는 경우 아이소프레노이드의 제조를 개선시키는 돌연변이 하나 이상을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열.
제 1 항에 있어서,

서열번호: 1 또는 2 또는 그의 분획으로부터 수득될 수 있고, 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

하이드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 hcs 유전자중에서 돌연변이 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,

서열번호: 3 또는 그의 분획으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열.
제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,

(a) 서열번호: 7에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드,

(b) 서열번호: 6에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,

(c) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 분획 또는 유도체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 유도체중에 하나 이상의 아미노산 잔기는 상기 폴리펩티드에 비교하여 보존적으로 치환되고, 상기 분획 또는 유도체는 하이드록시메틸클루타릴-CoA 합성효소의 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및

(d) (a) 내지 (c)중 정의된 바와 같은 폴리펩티드에 엄격한 조건하에 하이브리드화하고 Hcs 단백질을 암호화하는 상보성 가닥의 폴리뉴클레오티드

로 구성된 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열.
아이소프레노이드, 바람직하게는 코엔자임 Q10을 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도.
(a) 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을, 상기 폴리뉴클레오티드가 본래 결핍되어 있는 미생물에 도입하는 단계; 및

(b) 아이소프레노이드의 제조를 허용하는 조건하에서 단계 (a)의 미생물을 배양하 는 단계

를 포함하는 아이소프레노이드의 제조방법.
제 7 항에 있어서,

폴리뉴클레오티드가 도입되는 미생물이 로도박터(Rhodobacter)속으로부터 선택되는 것, 바람직하게는 로도박터 스파에로이드(Rhodobacter sphaeroides)인 제조방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,

도입되는 폴리뉴클레오티드가 파라코쿠스(Paracoccus)속으로부터 선택되는 미생물, 바람직하게는 파라코쿠스 제아크산틴파시엔(Paracoccus zeaxanthinifaciens)으로부터 수득되는 제조방법.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 미생물.
제 10 항에 있어서,

로도박터속으로부터 선택되는, 바람직하게는 로도박터 스파에로이드인 미생물.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,

파라코쿠스속으로부터 선택되는 미생물로부터 수득되는 제 1 항 내지 제 5 항중 어 느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드가 도입된 미생물.
아이소프레노이드의 제조를 위한, 제 10 항 내지 제 12 항중 어느 한 항에 따른 미생물의 용도.