KR20060131809A

KR20060131809A - 항혈청에 의한 삽입 돌연변이 라이브러리들의 스크리닝을통한 항원적으로 중요한 네이세리아 항원들의 확인

Info

Publication number: KR20060131809A
Application number: KR1020067014649A
Authority: KR
Inventors: 크리스토프 마셀 탕; 얀옌 리
Original assignee: 임페리얼 이노베이션스 리미티드
Priority date: 2003-12-23
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2006-12-20
Also published as: NO20062903L; JP2007517505A; EP1742708A2; WO2005060995A8; CA2550592A1; RU2006126692A; CN1925888A; GB0330007D0; WO2005060995A2; WO2005060995A3; US20070275017A1; AU2004305310A1

Abstract

미생물에 의해 종속된 동물에서 면역 반응과 연관된 상기 미생물의 폴리펩티드를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은: (1)상기 미생물의 복수의 상이한 돌연변이체를 제공하는 단계; (2)상기 복수의 돌연변이 미생물들을 상기 미생물 또는 그의 일부에 대해 면역 반응을 일으켰던 동물로부터 유래한 항체들과, 상기 항체들이 상기 돌연변이 미생물에 결합하면 상기 돌연변이 미생물은 죽게 되는 조건들 하에서 접촉시키는 단계; (3) 단계(2)로부터 생존하는 돌연변이 미생물들을 선택하는 단계; (4) 상기 생존하는 돌연변이 미생물에서 상기 돌연변이를 포함하는 유전자를 확인하는 단계; 및 (5) 상기 유전자에 의해 코딩되는 상기 폴리펩티드를 확인하는 단계;를 포함하는 방법이 개시된다. 확인된 폴리펩티드 그의 변이체 또는 단편 또는 이들의 융합체는 백신에서 유용하다. 폴리펩티드는 서열번호 4, 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 그의 단편 또는 변이체 또는 그와 같은 단편 또는 변이체의 융합체이고, 네이세리아 메닌기티디스( Neisseria meningitidis)에 대한 백신에서 유용하다.

백신, 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 면역화, 항원, 백 신 접종(vaccination).

Description

항혈청에 의한 삽입 돌연변이 라이브러리들의 스크리닝을 통한 항원적으로 중요한 네이세리아 항원들의 확인{Identification of antigenically important neisseria antigens by screening insertional mutant libraries with antiserum}

본 발명은 백신들에 관한 것이고, 보다 상세하게는 백신 후보들인 미생물 유래의 폴리펩티드류(microbial polypeptides)를 확인하는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에 포함된 선행-발표된 문헌의 목록 또는 논의는 반드시 해당 문헌이 첨단 기술의 일부이거나 공지된 지식이라는 것을 인정하는 것으로 인식되어서는 안된다. 본 명세서에 열거된 문헌들은 이에 의해 원용으로 포함된다.

미생물 감염들은 인간 및 동물의 건강에 대한 심각한 위험으로 남아있으며, 다수의 병원성 미생물들, 특히, 세균들은 항생제류와 같은 항-균제류(anti-microbial agents)에 내성을 갖거나 가질 수 있다는 사실을 고려할 때 특히 그러하다.

백신 접종(vaccination)은 미생물 감염들과 싸우는 대안적인 접근방법을 제공하나, 일련의 상이한 병원성 미생물, 특히, 유전적으로 다양한 미생물의 집단들에 대해 안전하고 효과적인 백신들로 이용할 적합한 면역원들을 확인하는 것은 종종 어렵다. 통상적으로 병독성(virulence)-결정 유전자에 하나 또는 그 이상의 돌 연변이들을 포함하는 약화된 생균과 같은 실질적으로 완전한 미생물들을 면역원으로 이용하는 백신들을 개발하는 것이 가능하나, 모든 미생물들이 이 방법에 이용가능한 것은 아니며, 안전성이 항상 보장될 수 없는 경우 특정 미생물에 대해 이 방법을 채택하는 것이 항상 바람직한 것은 아니다. 또한, 일부 미생물들은 숙주 단백질들을 닮은 분자들을 발현하며 이들은 백신으로는 바람직하지 않다.

추가적인 백신들을 개발하는 것이 중요한 특정 군의 미생물들은 접합 혈청군(conjugate serogroup) C 폴리사카라이드 백신의 도입에도 불구하고 유럽, 북미, 개발도상국 등에서 유아 사망의 중요한 원인으로 남아있는 생명을 위협하는 감염인 수막구균성 질환(meningococcal disease)을 유발하는 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)이다. 이는 α2-8에 연결된 폴리시알산(α2-8 linked polysialic acid) 캡슐을 발현하는, 혈청군 B 종들(NmB)에 의해 유발되는 감염들이 여전히 산재하기 때문이다. N. meningitidis와 관련하여 "혈청군(serogroup)"이라는 용어는 그 균에서 발현되는 폴리사카라이드 캡슐을 의미한다. 영국에서 질병을 유발하는 일반적인 혈청군은 B이고, 반면에 아프리카에서는 A이다. 수막구균성 패혈증은 여전히 높은 사망율을 가지며; 생존자들은 종종 주요한 심리적 및/또는 신체적 장애를 갖게 된다. 비-특이적 전구증 후에, 수막구균성 패혈증은 적합한 항균 요법 및 완전한 보완책들(full supportive measures)에 저항적인 전격성(fulminant) 질환으로 나타날 수 있다. 따라서, 수막구균성 질환의 공중보건 위협과 다투는 최상의 방법은 예방목적의 백신 접종을 통해서이다.

수막구균성 감염의 비-특이적 조기 임상적 징후들 및 전격성 진행은 치료법 이 종종 비효과적이라는 것을 의미한다. 따라서, 백신 접종은 이 병원균에 의해 유발되는 글로벌 질병 부하를 감소시키는 가장 효과적인 전략으로 고려된다(Feavers (2000) ABC of meningococcal diversity. Nature 404,451-2). 혈청군 A, C, W135, 및 Y N. menigitidis 감염들을 예방하기 위한 기존의 백신들은 세균의 표면 상에 위치한 폴리사카라이드 캡슐을 기반으로 한다(Anderson et al (1994) Safety and immunogenicity of meningococcal A and C polysaccharide conjugate vaccine in adults. Infect Immun . 62, 3391-33955; Leach et al (1997) Induction of immunologic memory in Gambian children by vaccination in infancy with a group A plus group C meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine. Jlnfect Dis . 175, 200-4; Lieberman et al (1996). Safety and immunogenicity of a serogroups A/C Neisseria meningitidis oligosaccharide-protein conjugate vaccine in young children. A randomized controlled trial. J. American Med . Assoc. 275, 1499-1503). 혈청군 B 감염들에 대한 백신 분야의 진전은 그 캡슐인 α2-8에 연결된 시알산의 단일 중합체가 인간에서는 비교적 열등한 면역원이기 때문에 더 어려웠다. 이는 혈청군 B 캡슐이 인간 세포 유착 분자인 N-CAM1 상에서 발현되는 에피토프들을 공유하기 때문이다(Finne et al (1983) Antigenic similarities between brain components and bacteria causing meningitis. Implications for vaccine development and pathogenesis. Lancet 2, 355-357). 실제로, 혈청군 B 캡슐에 대한 면역 반응들을 유발하는 것은 유해한 것으로 입증될 수 있다. 따라서, 혈청군 B N. meningitidis 감염들을 예방하기 위한 새로운 백신 들에 대한 요구가 있다.

수막구균성 질환에 대한 보호의 가장 입증된 면역학적 상관물(immunologic correlate)은 혈청 살균성 검사(Serum Bactericidal Assay:SBA)이다. SBA는 혈청에 있는 항체들(통상적으로 IgG2a 서브클래스)이 세균 세포 표면 상의 보체 침적(complement deposition), 막 공격 복합체(membrance attack complex)의 조립, 및 세균 용해를 매개하는 능력을 평가한다. SBA에서, 공지된 수의 세균들이 한정된 보체 원천(source)을 갖는 혈청들의 순차적 희석들에 노출된다. 생존하는 세균들의 수가 결정되고, SBA는 50% 사멸을 매개하는 혈청의 최고 희석율의 역수로서 정의된다. SBA는 혈청군 C 감염들에 대한 보호 여부를 예측하며 NmB 감염들에 대한 면역성의 대리(surrogate)로 광범위하게 이용된다. 중요한 것은, SBA는 백신들의 예비-임상적(pre-clinical) 평가를 위한 면역성의 용이한 마커(ready marker)이며, 임상 시험들에서 적합한 종점(endpoint)을 제공한다는 것이다.

NmB 백신 개발에 대한 대부분의 노력들은 유효한 단백질 서브유닛들을 정의하는 것에 관한 것이다. 이종(heterologous) 항원들로 발현되는 잠재적으로 표면 발현되는 단백질들에 대해 게놈 서열들을 조사하고 동물들에서 유의한 반응들을 생성하는 능력들에 대해 테스트하는 '역 백신학(reverse vaccinology)'에 대해 주요한 투자가 이루어지고 있다. 그러나, 이 방법은 1)표면에 발현되는 항원들을 예측하는 컴퓨터 알고리즘들, 2) 다수의 잠재적 면역원들의 발현 부족(결핍), 및 3) 쥐과 동물들의 면역 반응들에 대한 전적인 의존에 의해 제한된다.

성공적인 백신에 대한 핵심은 혈청군 또는 클론성(clonal) 군에 관계없이 광 범위한 질병 집단들(isolates)에 대한 보호를 유도하는 항원(들)을 정의하는 것이다.

본 발명의 목적은 미생물 종들의 유전적 다양성에 대해 보존된 항원들을 분리하기 위해 신규한 유전적 스크리닝 방법(본 발명자들은 면역원들에 대한 유전적 스크리닝(Genetic Screening for Immunogens) 또는 GSI로 칭함)을 이용하는 것이고 이는 수막구균성 종들을 기준으로 예시된다. 이는 이하에서 보다 상세하게 설명되는 GSI에 의해, N. meningitidis 항원과 같은 미생물성 항원들을 확인하는 것에 의해 수행되며; 재조합 항원들에 의해 유발되는 면역 반응의 기능을 평가하며 항원들의 보호적 효능을 평가하는 것에 의해 입증된다. 이전에는 백신 후보들의 탐색에서 유전학이 적용되었으나, 현재까지 고-처리량(high throughput) 분석들을 정립하는 것은 어렵고 면역원성(immunogenic) 항원들과 보호성(protective) 항원들을 구별하는 것은 어려웠다.

본 발명의 제1양태는 미생물에 의해 종속된 동물에서 면역 반응과 연관된 폴리펩티드인 미생물의 폴리펩티드를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:

(1) 상기 미생물의 복수 개의 상이한 돌연변이체들을 제공하는 단계;

(2) 상기 복수 개의 돌연변이 미생물들을 상기 미생물 또는 그의 일부에 대해 면역 반응을 일으켰던 동물에서 유래한 항체들과 접촉시키고, 이에 의해 상기 항체들이 상기 돌연변이 미생물에 결합하는 경우, 상기 돌연변이 미생물은 사멸되는 것인 단계;

(3) 단계(2)로부터 생존한 돌연변이 미생물들을 선택하는 단계;

(4) 임의의 생존한 돌연변이 미생물에서 상기 돌연변이를 포함하는 유전자를 확인하는 단계; 및

(5) 상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 확인하는 단계;를 포함한다.

폴리펩티드가 연관된 면역 반응은 미생물에 의한 동물의 감염과 싸우는 것과 연관될 수 있는 폴리펩티드라는 점에서 기능적으로 중요한 폴리펩티드이다.

미생물은 세균 또는 효모와 같은 임의의 미생물일 수 있다. 미생물이 병원성 미생물인 것이 바람직하며, 특히 수막구균성 질환을 유발하는 네이세리아 메닌기티디스, 또는 임질을 유발하는 네이세리아 고노로에아(Neisseria gonorrhoea), 또는 하나 이상의 종류의 독감 및 중이염을 유발하는 Haemophilus influenzae(헤모필루 스 인플루엔자)와 같은 병원성 세균이다.

"미생물에 의해 종속된 동물에서 면역 반응과 연관된 폴리펩티드(polypeptide associated with an immune response in an animal which has been subjected to the microorganism)"에 의해, 본 발명자들은 임의의 그와 같은 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 방법은 동물의 면역계가 미생물의 폴리펩티드와 접촉했을 때 그 동물에서 그에 대해 항체들이 생성되는 미생물들의 폴리펩티드들을 확인할 수 있다. 통상적으로, 그 폴리펩티드는 미생물의 표면상에 발현되는 것이다. 그 동물의 면역 반응은 항체 반응, 통상적으로는 IgG 반응이다.

본 발명의 일 구체예에서, 동물은 그 미생물에 의한 감염, 예를 들면, 자연 감염에 의해 미생물에 종속되게 되었다. 따라서, 동물은 통상적으로 그 미생물에 대한 숙주이다. 본 발명의 또 다른 일 구체예에서, 동물은 의도적으로 (살아있는 또는 죽은) 미생물 또는 그 일부로 접종되었다. 어느 방법에 의하든, 동물의 면역 반응은 그 미생물에 대한 항체들을 생성했고, 그들 중 일부는 미생물의 특정 폴리펩티드들에 대해 선택적이고 본 발명의 방법에 의해 폴리펩티드류를 확인하기 위해 이용될 수 있다.

"동물(animal)"이라는 용어는 사람을 포함하고 이하에서 보다 상세하게 논의될 본 발명의 특별히 바람직한 구체예에서, 단계 (2)에서 이용되는 항체들은 미생물에 의해 감염되거나 감염되었거나 또는 미생물의 일부로 면역화된 사람으로부터 유래된 항체들이다.

미생물 또는 그 일부에 대해 면역 반응을 일으켰던 동물로부터 유래된 항체들을 이용하여, (면역원성(immunogenicity) 및 백신 설계 및 특히 보호적인 폴리펩티드들의 관점에서) 면역적으로 적절한 폴리펩티드들이 확인될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 확인되는 폴리펩티드들은 통상적으로 표면에서 노출되는, 항원들 또는 면역원들(본 명세서에서 이 용어들은 호환적으로 사용되고 있음)이고, 이들은 동물에서 면역 반응을 생성하는 것들이므로 백신 후보들이 된다는 것이 이해될 것이다.

통상적으로 상이한 돌연변이 미생물들의 복수 개(또는 라이브러리)는 그 미생물 내의 각 유전자가 돌연변이될 높은 가능성(통상적으로 > 95%)을 주기에 충분히 큰 수이다. 요구되는 돌연변이들의 수는 미생물의 게놈 내의 유전자들의 수에 의존적일 것이다. 돌연변이들이 무작위 돌연변이들인 경우, 게놈 내에서 각 유전자의 돌연변이가 나타날 높은 가능성을 제공하기 위해 요구되는 돌연변이체들의 수는 유전자들의 수의 약 10배이다. 통상적으로, 따라서, 단계 (1)에서 제공되는 돌연변이 미생물들의 수는 미생물의 유전자들의 수의 약 10 내지 20배이다.

통상적으로, 세균은 500 내지 5000개의 유전자들을 가지며, 따라서 이용되는 무작위 돌연변이체들의 수는 5000 내지 100,000개의 수준이다. N. meningitidis의 경우, 무작위 돌연변이체들의 적합한 수는 약 40,000개이다.

무작위 돌연변이들은 화학적으로 유도되는 것들과 같은 임의의 종류의 무작위 돌연변이일 수 있다; 바람직하게는, 돌연변이들은 삽입들의 위치를 확인하는 것은 간단하기 때문에(예를 들면, 삽입된 요소, 예를 들면, 트랜스포손에 대해 선택적인 프로브들 또는 PCR 프라이머들을 이용함), 트랜스포손(transposon) 돌연변이들과 같은 삽입 돌연변이들이고, 통상적으로 트랜스포손은 트랜스포손을 포함하는 돌연변이들의 선택을 가능하게 하는 항체 내성 마커를 갖는다.

그람 음성 세균의 게놈으로의 융합에 적합한 트랜스포손들은 Tn5, TnlO 및 그 유도체류를 포함한다. 그람 양성 세균의 게놈으로의 융합에 적합한 트랜스포손들은 Tn916 및 유도체류 또는 그들의 유사체들을 포함한다. 스태필로콕코스 오레우스(Staphylococcus aureus)와의 사용에 특히 적합한 트랜스포손들은 Tn917 (Cheung et al(1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89, 6462- 6466) 및 Tn918 (Albus et al (1991) Infect . Immun . 59, 1008-1014)을 포함한다.

트랜스포손들이 Camilli et al(1990) J. Bacteriol . 172, 3738-3744에 의해 기재된 Tn917 유도체들의 성질들을 갖고 pE194Ts와 같은 온도-민감성 벡터에 의해 운반되면 특히 바람직하다(Villafane et al (1987) J. Bacteriol . 169, 4822-4829).

N. meningitidis의 경우, 임의의 트랜스포손 및 체외 (in vitro) 활성을 갖는 트랜스포사제(transposase)가 이용될 수 있으나, TnlO이 바람직한 프랜스포손이다(Sun et al (2000) Nature Med . 6, 1269-1273 참조).

트랜스포손들은 유전자를 삽입에 의해 불활성화시키기에 편리하나, 임의의 공지된 방법 또는 미래에 개발될 방법이 이용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 삽입에 의해 유전자, 특히 스트렙토콕코스(Streptococcus)와 같은 특정 세균의 유전자를 불활성화시키는 또 다른 편리한 방법은 스트렙토콕코스 뉴모니 에(Streptococcus pneumoniae)에 대해 Morrison et al(1984) J. Bacteriol 159, 870에 의해 기재된 것과 같은 삽입-중복 돌연변이 생성(insertion-duplication mutagenesis)를 이용한다. 일반적인 방법은 또한 다른 미생물들, 특히 세균에 적용될 수 있다.

균류(fungi)의 경우, 삽입 돌연변이들은 DNA 단편들 또는 플라스미드들, 바람직하게는 예를 들면, 히그로미신 B 또는 플레오미신에 대한 내성을 코딩하는 선택성 마커들을 운반하는 DNA 단편들 또는 플라스미드들을 이용하여 형질전환하는 것에 의해 생성된다(Smith et al(1994) Infect . Immunol . 62, 5247-5254 참조). 제한효소 매개 융합을 이용하여 히그로미신 B 내성을 코딩하는 DNA 단편들의 사상균류(filamentous fungi)의 게놈으로 무작위, 단일 융합하는 것(REMI; Schiestl & Petes (1991); Lu et al(1994) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91, 12649-12653)이 공지되어 있다.

균류에 대한 간단한 삽입에 의한 돌연변이 형성은 원용에 의해 본 명세서에 포함된 Schiestl & Petes (1994)에 의해 기재되며, 예를 들면, 효모에서 Ty 요소들 및 리보좀 DNA의 이용을 포함한다.

트랜스포손 또는 다른 DNA 서열의 무작위 융합은 각 돌연변이에서 상이한 유전자가 삽입에 의해 불활성화된 것인 복수 개의 독립적으로 돌연변이된 미생물들의 분리를 가능하게 한다.

일부 미생물들의 경우, 각 유전자가 트랜스포손 또는 다른 삽입 요소에 의해 돌연변이된 돌연변이들의 라이브러리들이 알려져 있다. 이 경우, 복수 개의 미생물들은 라이브러리의 각 구성물의 하나 이상의 대표들을 합치는 것에 의해 편리하게 생성될 수 있다. 예를 들면, 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 종합적인 트랜스포손 라이브러리는 Jacobs et al(2003) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 100, 14339-14344에 기재된다.

본 방법의 단계 (2)에서, 복수 개의 돌연변이 미생물들은 그 미생물 또는 그의 일부에 대한 면역 반응으로 동물로부터 생성된 항체들과 접촉된다. 항체들은 임의의 적합한 형태일 수 있으며 그 동물(인간 포함)로부터의 임의의 적합하고 편리한 원천(source)으로부터 유래될 수 있다. 통상적으로, 항체들은 동물로부터 유래된 혈청에 존재한다. 그러나, 그들은 IgG에 대해 농축된 분획과 같은 다른 형태들로 존재할 수 있다. 항체들이 IgG 항체인 것이 바람직하나, IgA 및 IgM과 같은 다른 종류의 항체들도 이용될 수 있다. 항체들이 혈청에 존재하거나 또는 혈청으로부터 유래되는 것이 바람직하나, 항체들은 타액과 같은 다른 체액들에 존재하거나 또는 그로부터 유래될 수 있다.

항체들은 통상적으로 미생물에 의해 감염되거나 감염되었던 동물로부터 유래된다. 본 발명의 이 구체예의 장점들 중 하나는 그 미생물에 의한 감염과 싸우기 위해 적절한 면역 반응을 일으켰던 동물로부터 유래된 항체들을 이용하는 것이고, 그와 같은 항체들은 백신들로 유용한 폴리펩티드류에 결합할 것이다. 따라서, 바람직한 항체들은 미생물로 감염되거나 감염되었던 사람들, 또는 그 미생물의 약화된(예를 들면, 백신) 종으로 접종되거나 또는 그 미생물의 일부(예를 들면, 외막 성분 부분들)를 포함하는 백신으로 접종되었던 사람들로부터 유래된 항체들이다. 통상적으로, 본 방법의 단계 (2)에서 이용되는 항체들은 미생물에 대한 보호성 반응을 일으켰던 동물(예를 들면, 사람)로부터 유래한다.

대안적으로, 항체들은 미생물로 접종되고 면역 반응, 바람직하게는 보호성 면역 반응을 생성할 수 있게 되는 생쥐(mouse), 토끼, 양 또는 말과 같은 실험용 동물과 같은 동물로부터 유래한다. 보호성 반응이 유발되었는지 여부는 접종 후에 그 동물을 생균으로 공격하는 것에 의해 결정될 수 있다. 실험용 동물들은 미생물의 병독성, 병원성 종으로 접종되거나, 또는 비병독성(avirulent) 또는 (살아있거나 또는 죽은) 약화된 종으로 접종되었을 수 있다.

바람직한 구체예에서, 항체들은 돌연변이 미생물을 생성하기 위해 이용되는 종에 "이종인(heterologous)" 미생물 종에 대해 생성된다. 다수의 병원성 미생물들이 상이한 혈청군들 또는 종들에 존재하며, 각 혈청군 또는 변종은 그 혈청군 또는 변종들에 고유한 폴리펩티드류뿐 아니라 다른 혈청군들 또는 변종들과 공통인 폴리핍티드류를 가질 수 있다. 하나 이상의 이종의 종(들)에 대해 유발된 항체들을 이용하는 장점은 미생물의 모든 혈청군들에 공통인(즉, 보존되고, 공통인 에피토프들) 폴리펩티드를 확인할 가능성을 높인다는 것이다. 그와 같은 폴리펩티드류(또는 그의 단편들 또는 변이체들(varients) 또는 융합체들(fusions))는 특정 미생물의 일련의 혈청군들에 대해 효과적일 가능성이 더 높다. 따라서, 미생물이 N. 메닌기티디스인 특히 바람직한 구체예에서, 복수의 돌연변이 미생물들은 모 혈청군(parent serogroup) B 종으로부터 유래하고, 반면에 항체들은 혈청군 A 및/또는 혈청군 C 종에 대해 반응을 일으켰던 동물(예를 들면, 사람)로부터 유래한다. 항체들은 하나 이상의 원천들로부터 합쳐질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들면, 혈청군 A 종으로 감염된 (또는 그 감염으로부터 회복 중인) 환자로부터의 혈청은 혈청군 C 종으로 감염된(또는 그 감염으로부터 회복 중인) 환자 유래의 혈청과 합쳐질 수 있다. 혈청군 B 종으로 감염된 (또는 그 감염으로부터 회복 중인) 환자로부터의 혈청도 합쳐질 수 있다. 일부 미생물들은 그들의 세포벽 또는 세포막의 폴리펩티드 성분들 외에, 종종 면역원성인 폴리사카라이드 성분들을 갖는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 폴리사카라이드 성분들의 일부 또는 모두가 제거된 미생물의 종을 그에 대한 항체들을 생성하기 위한 종으로 이용하는 것이 편리하다. 따라서, 다수의 세균들은 폴리사카라이드를 주성분으로 하는 캡슐을 가지나, 통상적으로 그 캡슐을 소실한 종들이 존재한다. 이 "캡슐 소실(capsule minus)" 종들이 본 발명의 제2 단계에서 항체들을 생성하기 위해 편리하게 이용될 수 있다.

N. meningitidis의 경우, 항체들은 다음과 같은 혈청원들에 편리하게 존재할 수 있다: N. meningitidis의 이종형 종들을 이용하여 전신 경로(systemic route)에 의해 면역화된 생쥐들(즉, 선택에서 이용된 돌연변이 종에 이종형임); N. meningitidis로 감염된 급성 및 회복기 사람 환자들; 및 혈청군 B NmB 집단 H44/76으로부터 유래한 한정된 외막 소포(outer membrance vesicle:OMV)로 면역화된 사람 환자들. 환자가 감염 세균에 대해 상당한 면역 반응을 일으켰을 것이기 때문에 회복기 환자의 혈청(convalescent sera)이 선호된다. 일부 경우들에서, 급성 환자들은 그와 같은 상당한 면역 반응을 일으키지 않았을 수 있기 때문에 급성 환자 혈청을 회복기 환자 혈청에 대한 대조구로서 이용하는 것이 유용할 수 있다. 상응하는 항체들의 원천들이 다른 미생물들에 대해 이용가능하다.

항체들이 돌연변이 미생물에 결합되면, 돌연변이 미생물이 죽고, 항체들이 돌연변이 미생물에 결합되지 않으면, 돌연변이 미생물이 죽지 않도록 조건들이 제공된다. 이에 의해, 항체에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 돌연변이되어 항체가 더 이상 결합하지 않는 돌연변이 미생물들이 생존하는 것이 관찰될 수 있다. 이는 그와 같은 돌연변이들에 대한 매우 강력한 선택을 제공하고 미생물들로 감염된 동물에서 면역 반응과 연관된 폴리펩티드류의 확인을 촉진한다. 대조구로서, 주어진 조건들 하에서 죽는 야생형 미생물들을 이용하거나 또는 모든 야생형 미생물들이 죽는 조건들을 개발하는 것이 편리할 수 있다.

편리하게는, 일단 항체들이 돌연변이 미생물과 접촉되면, 인간, 토끼, 생쥐, 양 및 말로부터의 보체와 같은 보체의 원천이 첨가된다. 편리하게는, 보체는 항체와 동일한 원천(즉, 동물의 종들)로부터 유래한다. 항체들(일반적으로 IgG 2a 서브클래스)은 미생물의 표면 상에 보체 침적, 막 공격 복합체의 조립 및 미생물의 용해를 매개한다. 보체-매개 살해(complement-mediated killing)는 혈액으로부터 유래한 세포들의 존재에 독립적이나, 혈청의 존재를 요구한다. 보체-매개 살해는 혈청을 가열하는 것에 의해 불활성화될 수 있다.

바람직하게는, 본 구체예에서, 미생물은 그람 양성 또는 그람 음성인 세균이다. 보체 매개 살해는 Walport(2001) N. Engl . J. Med . 344, 1140-1144, 및 Walport (2001) N. Eng J. Med . 344, 1058-1066에 기재된다.

항체들에 결합하는 능력을 유지하는 미생물들을 살해하기 위한 보체 침적 방식은 특히 동일한 원리에 기반한 혈청 살균성 검사(SBA; Goldsclmeider et al (1969) J. Exp . Med . 129, 1307-1326 참조)이 서두에서 논의된 바와 같이 이용되기 때문에, N. meningitidis와 사용하기에 특히 적합하다. 물론, SBA의 경우, 생존하는 세균들의 수가 혈청의 세균 살해에 대한 효과를 평가하기 위해 이용된다(그리고, 이용되는 항체들을 생성하기 위해 이용되었던 종에 의해 부여되는 보호의 정도의 마커로서 이를 이용함). 본 발명자들이 알고 있는 바에 의하면, 이 방법이 미생물들에서 항원들을 확인하기 위해 개조될 수 있다는 제안은 없었다.

항체들이 결합하는 세포들을 죽이기 위해 보체를 이용하는 것에 대한 대안으로서, (세포에 결합하는) 항체들에 선택적으로 결합하여 그 세포에 세포독성제(cytotoxic agent)를 전달하는 모이어티(moiety)가 이용될 수 있다. 예를 들면, 모이어티는 미생물에 결합된 항체들을 인식하고 그 세포에 세포독성제를 전달하는 다른 항체일 수 있다. 따라서, 그 다른 항체는 돌연변이 미생물에 결합하는 항체가 인간 항체일 때, 항-인간 항체(anti-human antibody)일 수 있다. 세포독성제는 직접적으로 세포독성이거나 또는 간접적으로 세포독성일 수 있다. 간접적으로 세포독성이라는(indirectly cytotoxic) 것에 의해, 본 발명자들은 비교적 비-독성인 화합물을 세포독성 화합물에로 활성화시킬 수 있는 효소를 포함시킨다. 종양-선택적 항체들을 이용하여 종양 세포들을 표적으로 공격하기 위해 유사한 기법이 이용되었고 ADEPT(항체지향성 효소-전구약물 치료법(antibody-directed enzyme prodrug therapy); 원용으로 본 명세서에 포함된 WO88/07378; Bagshawe(1987) Br . R. Cancer 56, 531-532; Bagshawe et al(1988) Br . J. Cancer 58, 700-703; 및 Senter et al(1988) Proc . Natl . Acad . Sci USA 85, 4842-4846 참조)로 불린다.

항체-전구약물 쌍들은 다음을 포함한다: 인산-함유 전구약물들의 유리 약물들로의 전환에 유용한 알칼리 포스파타아제, 황산-함유 전구약물들의 유리 약물들로의 전환에 유용한 아릴 술파타아제, 비-독성 5-플루오로시토신을 항암제인 5-플루오로우라실로 전환하는데 유용한 시토신 디아미나아제, 펩티드-함유 전구약물들을 유리 약물들로 전환하는데 유용한 세라티아 프로테아제, 서브틸리신, 카르복시펩티다아제 및 카텝신과 같은 프로테아제류, D-아미노산 치환기들을 포함하는 전구약물들을 전환하는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다아제류, β-갈락토시다아제와 같은 탄수화물-효소들 및 글리코실화된 전구약물들을 유리 약물들로 전환하는데 유용한 뉴라미니다아제(neuraminidase), β-락탐류로 유도체화된 약물들을 유리 약물들로 전환하는데 유용한 β-락타마아제 및 아민 질소들에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기들로 유도체화된 약물들을 유리 약물들로 전환하는데 유용한 페니실린 아미다아제류.

다른 효소들 및 전구약물들은 히드롤라아제류, 아미다아제류, 술파타아제류, 리파아제류, 글루쿠로니다아제류, 포스파타아제류 및 카르복시펩티다아제류를 포함하고, 전구약물들은 다양한 종류의 항암성 화합물들, 예를 들면, 시클로포스파미드, 비술판, 클로람부실 및 니트로 원천들(nitrosources)을 포함한 알킬화제류(alkylatinig agents)(질소 머스타드류); 아드리아미신 및 닥티노미신을 포함하는 삽입성 작용제류(intercalating agents); 빈카 알칼로이드와 같은 방추 독류(spindle poisons); 및 항-폴레이트류(anti-folates), 항-퓨린류, 항-피리미딘류 또는 히드록시우레아를 포함한 항-대사산물류로부터 제조될 수 있다.

탄수화물 분해 효소(carbohydrate cleaving enzyme)과 작용시 시아니드를 생성하는 아미그달린과 같은 시아노수소를 생성할 수 있는(cyanogenic) 전구약물들도 포함된다.

조건들, 예를 들면, 모든 야생형(또는 모균주) 미생물들(및 실제로 대부분의 돌연변이체들)을 사멸시킨 조건들에서 생존하는 돌연변이 미생물들은 항체들에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에서 돌연변이된 (따라서 면역 반응에 관여ㄷ된) 것으로 보이기 때문에, 그 돌연변이 미생물들은 추가적인 연구를 위해 선택될 수 있다. 일 구체예에서 및 생존하는 돌연변이체들에서 돌연변이들이 살해를 이겨내는 능력을 부여한다는 것을 확인하기 위해서, 각 돌연변이체의 돌연변이가 모균주(parent strain)에 역교배(backcross)되고 역교배된 돌연변이체가 살해 조건들에서 생존하는 것으로 확인될 수 있다.

돌연변이를 포함하는 유전자는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법들을 이용하여 확인된다. 예를 들면, 돌연변이가 삽입 돌연변이이면, 삽입으로부터 미생물의 측면(flanking) DNA로 서열을 결정하는 것이 편리하다. 트랜스포손이 돌연변이 미생물들을 생성하기 위해 이용되었다면, 단계 (3)에서 선택된 개별 돌연변이로부터의 게놈 DNA를 트랜스포손의 외부를 절단하는 제한효소로 처리하고 그 트랜스포손을 포함하는 크기-분획된(size-fractionated) DNA를 플라스미드로 연결시키고(ligate) 플라스미드가 아닌 트랜스포손에 의해 부여된 항생제 내성을 기준으로 플라스미드 재조합체들을 선택하는 것에 의해 트랜스포손 돌연변이를 포함하는 유전자를 확인하는 것이 편리하다. 트랜스포손에 인접한 미생물 게놈 DNA는 트랜스포손의 말단 영역들에 어닐링(aneal)되는 두 개의 프라이머들 및 플라스미드의 폴리링커(polylinker) 서열들에 인접하여 어닐링되는 두 개의 프라이머들을 이용하여 서열이 결정될 수 있다. 서열들은 트랜스포손이 공지된 유전자에 개입(interupt)했는지 여부를 결정하기 위해 DNA 데이터베이스 검색들의 대상이 될 수 있다. 따라서, 편리하게는, 본 방법에 의해 수득되는 서열은 EMBL 및 GenBank와 같은 공식적으로 이용가능한 데이터베이스들에 존재하는 서열들 또는 이용가능하다면, 완전한 게놈 서열과 비교된다.

"유전자(gene)"에 의해, 본 발명자들은 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 영영들 뿐 아니라 전사, 번역 및, 일부 미생물들의 경우, RNA의 스플라이싱(splicing)을 조절하는 DNA의 영역들을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터들, 전사 종결자들(transcription terminators), 리보좀-결합 서열들 및 일부 개체들의 경우는 인트론들 및 스플라이스 인식 부위들(splice recognition sites)를 포함한다.

통상적으로, 단계 (4)에서 수득되는 확인된 유전자의 서열 정보가 파악된다. 편리하게는, 트랜스포손의 말단부들에 가까운 서열들이 서열 결정(sequencing)용 프라이머의 혼성화(hybridization) 부위로 이용된다. 파악된 서열 또는 불활성화된 유전자 자체에 인접한 DNA 제한 절편(restriction fragment)이 야생형 개체로부터 상응하는 야생형 유전자를 확인하고 분리하기 위한 혼성화 프로브를 제조하기 위해 이용된다.

유전자를 확인할 때는 적어도, 관계된 것(relative)이 아닌, 그 유전자가 수득되는 것을 보장하기 위해 엄격한 조건들 하에서 혼성화 프로빙(hybridization probing)이 수행되는 것이 바람직하다.

표준 방법들을 이용하여 유전자의 서열이 결정될 수 있고 그 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 예를 들면, 그 유전자의 코딩 서열을 번역하는 것에 의해 확인되거나 또는 그 서열은 서열이 결정된 미생물 게놈의 일부로서 이미 이용가능할 수 있다.

실시예에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 확인된 특정 유전자들은 네이세리아 메닌기티디스의 NBM0341(TspA), NMB0338, NMB1345, NMB0738, NBM0792(NadC family), NMB0279, NMB2050, NMB1335(CreA), NMB2035, NMB1351(Fmu 및 Fmv), NMB1574(IIvC), NMB1298(rsuA), NMB1856(LysR family), NMB0119, NMB1705(rfak), NMB2065(HemK), NMB0339, NMB0401(putA), NMB1467(PPX), NMB2056, NMB0808, NMB0774(upp), NMB0078, NMB0337(분지형-사슬 아미노산 트랜스퍼라아제), NMB0191(ParA family), NMB1710(글루타메이트 디히드로게나아제(gdhA)), NMB0062(rfbA-1) 및 NMB1583(hisB) 유전자들이다. N. meningitidis의 게놈 서열은 예를 들면, 게놈 연구소(TIGR;www.tigr.org)로부터 입수가능하다. 이 유전자들은 서열이 결정된 게놈의 일부를 형성하나, 본 발명자들이 알고 있는 한, 그들은 분리된 바 없고, 그들이 코딩하는 폴리펩티드는 생산되지 않았으며, 그들이 코딩하는 폴리펩티드가 백신의 성분으로서 유용할 수 있다는 암시는 없다.

따라서, 본 발명은 전술된 바 및 실시예들에서 분리된 유전자들 및 변이체들 및 단편들 및 그와 같은 변이체들 및 단편들의 융합체들(fusions)을 포함하고 전술된 바와 같이 그 유전자들이 코딩하는 폴리펩티드류를 그의 변이체들 및 단편들, 및 그와 같은 단편들과 변이체들의 융합체들과 함께 포함한다. 변이체들, 단편들 및 융합체들은 이하에서 보다 상세하게 설명된다. 바람직하게는, 위에 주어진 유전자들의 변이체들, 단편들 및 융합체들은 N. meningitidis에 대한 항체들을 중화시키는 폴리펩티드를 코딩하는 것들이다. 마찬가지로, 바람직하게는, 그 서열이 위에 주어진 바와 같은 폴리펩티드의 변이체들, 단편들 및 융합체들은 N. meningitidis에 대한 항체들을 중화시키는 것들이다. 본 발명은 또한 서열들이 실시예에서 주어진 폴리펩테드류(바람직하게는 분리된 코딩 영역) 또는 변이체들, 단편들 또는 융합체들을 코딩하는 분리된 폴리펩티드류를 포함한다. 본 발명은 또한 그와 같은 폴리펩티드류를 포함하는 발현 벡터들 및 그와 같은 폴리펩티드류 및 벡터들(이하에서 보다 상세하게 기술됨)을 포함하는 숙주 세포들을 포함한다. 실시예들에서 기재되는 폴리펩티드류는 본 발명의 방법에 의해 확인된 항원들이다.

본 발명의 방법의 실시에서 이용되는 분자 생물학적 방법들은 본 발명이 속하는 기술 분야, 예를 들면, 원용에 의해 본 명세서에 포함된 Sambrook & Russell(2001) Molecular Cloning, a laboratory manual, third edition, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York에서 알려져 있다.

본 발명은 또한 미생물에 의해 종속된 동물에서 면역 반응과 연관된 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 확인될 수 있도록 본 발명의 단계들 (1) 내지 (4)(그러나, 단계 (5)는 필수적이지는 않음)를 수행하는 것을 포함한다. 그 유전자는 클로닝되고 서열이 결정되거나 또는 분리되거나 또는 예를 들면 그 서열에 기반한 프라이머들을 이용한 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 합성될 수 있다. 그 유전자의 변이체들은 예들 들면, 다른 미생물들 또는 그 미생물의 다른 종들에서 관련된 유전자들을 확인하고, 그 유전자를 클로닝, 분리하거나 또는 합성하는 것에 의해 제조될 수 있다. 통상적으로, 유전자의 변이체들은 본 발명의 방법에 의해 분리된 유전자들과 70% 이상의 서열 일치성(sequence identity), 보다 바람직하게는 85% 이상의 서열 일치성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 일치성을 갖는 것들이다. 물론, 치환들, 결실들 및 삽입들은 수용될 수 있다. 하나의 핵산 서열과 또 다른 서열 간의 유사성(similarity)의 정도는 위스콘신 대학교 컴퓨터 그룹의 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다.

유전자의 변이체들은 또한, 엄격한 조건들 하에 그 유전자에 혼성화되는 것들이다. "엄격한(stringent)"에 의해, 본 발명자들은 유전자가 막에 고정되고 프로브(이 경우, 길이가 >200 뉴클레오티드 이상임)가 용액에 있으며, 고정된 유전자/혼성화된 프로브가 65℃에서 0.1 x SSC로 10분간 세척될 때 그 유전자가 프로브에 혼성화되는 것을 의미한다. SSC는 0.15M NaCl/0.015M 시트르산 나트륨이다.

전체 유전자의 예를 들면, 20% 또는 30% 또는 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90%인 유전자(또는 변이체 유전자)의 단편들이 제조될 수 있다. 바람직한 단편들은 코딩 서열의 전체 또는 일부를 포함한다. 변이체 및 단편들은 다른, 무관한 폴리뉴클레오티드류에 융합될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 폴리펩티드를 제조하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 본 발명의 방법의 단계 (1) 내지 (4)를 수행하고 확인된 유전자 또는 그의 변이체 또는 단편 또는 그와 같은 유전자 또는 변이체 또는 단편의 융합체를 분리하거나 또는 합성하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 이 방법에 의해 수득될 수 있는 또는 수득되는 폴리펩티드를 포함한다.

바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 면역원성이고 확인된 유전자가 유래된 미생물에 의해 종속된 동물로부터 유래한 항체들과 반응하는 폴리펩티드류를 코드한다.

본 발명은 또한 미생물에 의해 종속된 동물에서 면역 반응과 연관된 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에서 돌연변이된 미생물을 선택하는 방법을 포함한다. 이 방법은 (단계 (4) 및 (5)의 수행 여부에 관계없이) 본 발명의 방법의 단계 (1) 내지 (3)을 수행하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 항체들에 결합할 수 없는, 본 발명에 의해 수득될 수 있거나 또는 수득되는 돌연변이 미생물을 포함한다.

전술된 바와 같이, 본 발명은 유전자들을 확인하고 돌연변이 미생물들을 선택하는 데 유용하나, 본 방법은 미생물로부터 면역 반응과 연관된 폴리펩티드류를 확인하기 위해 이용되는 것이 특히 바람직하다. 일단 확인되면, 그 폴리펩티드에 근거한 항원을 제조하는 것이 바람직하다.

항원은 확인된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있고, 그 폴리펩티드의 서열은 유전자 서열로부터 용이하게 유추될 수 있다. 다른 구체예들에서, 항원은 확인된 폴리펩티드의 단편이거나 확인된 폴리펩티드의 변이체이거나 또는 그 폴리펩티드 또는 단편 또는 변이체의 융합체일 수 있다.

전체 폴리펩티드의 예를 들면, 20% 또는 30% 또는 40 % 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90%인 확인된 폴리펩티드의 단편들이 제조될 수 있다. 통상적으로, 단편들은 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 이상이나, 500, 400, 300, 또는 200 미만의 아미노산들이다. 폴리펩티드의 변이체들이 제조될 수 있다. "변이체들(variants)"에 의해, 본 발명자들은 변화들이 단백질의 정상적 기능을 변화시키지 않는 경우, 보존적 또는 비-보존적인 삽입들, 결실들 및 치환들을 포함한다. "보존적 치환들(conservative substitutions)"은 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr과 같은 조합들을 의도한다. 그와 같은 변이체들은 단백질 공학 및 부위-지향적 돌연변이 생성(site-directed mutagenesis)의 공지된 방법들을 이용하여 제조될 수 있다.

특정 종류의 변이체들은 예를 들면, 관련된 미생물들 또는 그 미생물의 다른 종들로부터 유래한 전술된 바와 같은 변이체 유전자들에 의해 코딩되는 것들이다. 통상적으로 변이체 폴리펩티드류는 본 발명의 방법을 이용하여 확인된 폴리펩티드와 70% 이상의 서열 일치성, 보다 바람직하게는 85% 이상의 서열 일치성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 일치성을 갖는다.

두 개의 폴리펩티드들 간의 퍼센트 서열 일치성(percent sequence identity)은 유용한 컴퓨터 프로그램들, 예를 들면 University of Wisconsin Genetic Computing Group의 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있고 퍼센트 일치성은 그 서열이 최적으로 정렬된 폴리펩티드류에 대해 계산된다.

정렬(alignment)은 대안적으로는 Clustal W program (Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res 22, 4673-80)을 이용하여 수행될 수 있다. 이용되는 파라미터들은 다음과 같을 수 있다:

신속한 쌍별 정렬 파라미터들(Fast pairwise alignment parameters): K-투플(tuple)(워드) 크기; 1, 윈도우 크기; 5, 갭 페널티(gap penalty); 3, 톱 다이아고날의 수(number of top diagonals); 5. 스코어링 방법: x 퍼센트.

다중 정렬 파라미터들(Multiple alignment parameters): 갭 오픈 페널티(gap open penalty); 10, 갭 연장 페널티(gap extension penalty); 0.05. 스코어링 매트릭스: BLOSUM

융합체들은 임의의 적합한 폴리펩티드와의 융합체들일 수 있다. 통상적으로, 폴리펩티드는 그것이 융합되는 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있는 것이다. 융합 파트너는 예를 들면, 친화도 크로마토그래피 컬럼에 고정될 수 있는 모이어티에 대한 결합 부위를 구성하는 것에 의해, 정제를 촉진하는 폴리펩티드일 수 있다. 따라서, 융합 파트너는 코발트 또는 니켈 이온들에 결합하는 올리고-히스티딘 또는 다른 아미노산들을 포함할 수 있다. 이는 또한 Myc 에피토프와 같은 단일클론성 항체를 위한 에피토프일 수 있다.

본 발명은 또한 전술된 바와 같은 항원을 제조하는 방법, 및 그 방법에 의해 수득될 수 있거나 수득되는 항원들을 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드류는 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 바와 같이, 발현 벡터들과 같은 벡터들로 클로닝될 수 있다. 그와 같은 벡터들은 세균, 효모, 포유류 및 곤충 숙주 세포들과 같은 숙주 세포들에 존재할 수 있다. 본 발명의 항원들은 적합한 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드류로부터 용이하게 발현될 수 있고 백신으로의 이용을 위해 그로부터 분리될 수 있다.

통상적인 발현 시스템들은 상업적으로 이용가능한 pET 발현 벡터 시리즈 및 BL21과 같은 E. coli 숙주 세포들을 포함한다. 발현되는 폴리펩티드류는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 정제될 수 있다. 편리하게는, 항원은 전술된 바와 같은 친화도 컬럼에 결합하는 융합 파트너에 융합되고, 그 융합체는 친화도 컬럼(예를 들면, 니켈 또는 코발트 친화도 컬럼)을 이용하여 정제된다.

항원 또는 그 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들면, DNA 분자)는 백신으로서의 이용에 특히 적합하다는 것이 이해될 것이다. 그 경우, 항원은 그것이 생산된 숙주 세포로부터 정제된다(또는 펩티드 합성에 의해 생성되면, 합성의 오염물들로부터 정제된다). 통상적으로, 항원은 백신으로의 이용을 위해 제제되기 전에, 오염 물질을 5% 미만, 바람직하게는 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%미만으로 포함한다. 항원은 바람직하게는 실질적으로 발열원(pyrogen)을 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명은 항원을 포함하는 백신 및 항원을 인산 완충된 식염수(phosphate buffered saline)와 같은 적합한 담체와 결합하는 단계를 포함하는 백신 제조 방법을 더 포함한다. 본 발명의 항원이 단독으로 투여되는 것이 가능하나, 항원을 하나 이상의 허용가능한 담체들과 함께 약학적 제제로 제공하는 것이 바람직하다. 담체(들)은 본 발명의 항원과 융화가능하고 그의 수용자들에게 유해하지 않다는 점에서 "허용가능(acceptable)"해야 한다. 통상적으로, 담체들은 멸균 상태이고 발열원을 포함하지 않는 물 또는 식염수일 것이다.

백신은 또한 편리하게는 보조약(adjuvant)을 포함할 수 있다. 환자의 능동 면역화(active immunisation)가 선호된다. 이와 같은 방법에서, 하나 이상의 항원들이 적합한 보조약류 및 담체들을 포함하는 면역원성 제제(immunogenic formulation)로 제조되어 공지된 방식들로 환자에게 투여된다. 적합한 보조약류는 프로인트(Freund)의 완전 또는 불완전 보조약, 무라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), EP 109 942, EP 180 564 및 EP 231 039의 "Iscoms", 알루미늄 히드록시드, 사포닌, DEAE-덱스트란, 중성 오일류(예를 들면, 미글리콜), 식물성 오일류(예를 들면, 낙화생유), 리포좀류, 플루로닉(Pluronic) 폴리올류 또는 리비 보조약 시스템(Ribi adjuvant system)(예를 들면, GB-A-2 189 141 참조)을 포함한다. "플루로닉(Pluronic)"은 등록된 상표이다. 면역화 대상인 환자는 미생물에 의한 감염으로부터 보호되어야 하는 환자이다.

본 발명의 전술된 항원들(또는 그와 같은 항원들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드류) 또는 그들의 제제는 경구 및 비경구(예를 들면, 피하 또는 근육내) 주입을 포함한 임의의 통상적 방법에 의해 투여될 수 있다. 치료는 단일 투여량 또는 일정 기간 동안의 복수회의 투여량들로 구성될 수 있다.

본 발명의 백신은 그의 항원 성분(또는 폴리펩티드)에 따라, 인간 의학 및 수의학 부문에서 유용할 수 있다는 것이 이해될 것이다.

미생물들에 의해 유발되는 질병들은 가축들과 같은 다수의 동물들에서 발견된다. 본 발명의 백신들은 적합한 항원 또는 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다면, 인간뿐 아니라, 소, 양, 돼지, 말, 개 및 고양이들 및 닭, 칠면조, 오리 및 거위들과 같은 가금류에서 유용하다.

따라서, 본 발명은 또한 개별개체를 미생물에 대해 백신 접종하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 개별개체에게 전술된 바와 같은 항원(또는 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드) 또는 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 개별개체에게 백신 접종하기 위한 백신의 제조에서 전술된 바와 같은 항원(또는 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 용도를 포함한다.

본 발명의 항원은 백신에서 유일한 항원으로 이용되거나 또는 동일한 또는 상이한 질병 미생물들에 대한 것인지의 여부에 관계없이 다른 항원들과 조합되어 이용될 수 있다. N. meningitidis의 경우, NmB에 대해 반응성을 갖는 수득된 항원이 A 및/또는 C 혈청군에 대한 백신들에서 이용되는 성분들과 조합될 수 있다. 헤모필루스(Haemophilus) 및/또는 스트렙토콕코스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에 대한 보호를 제공하는 항원성 성분들과 편리하게 조합될 수 있다. 추가적인 항원성 성분들은 폴리펩티드류이거나 또는 그들은 폴리사카라이드와 같은 다른 항원성 성분들일 수 있다. 폴리사카라이드류는 또한 면역 반응을 증강시키기 위해 이용될 수 있다(예를 들면, Makela et al(2002) Expert Rev . Vaccines I, 399-410 참조).

항원이 NMB0338 유전자와 같은 전술된 바(및 실시예들)와 같은 유전자들에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 전술된 바와 같은 변이체 또는 단편들 또는 융합체 (또는 상기 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)이고 백신 접종 대상 질병이 네 이세리아 메닌기티디스 감염(수막구균성 질환)이면 전술된 백신들 및 백신 접종 방법들에서 특히 바람직하다.

본 발명은 이제 다음과 같은 비-한정적인 실시예들 및 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이다.

도 1은 본 발명의 방법의 바람직한 구체예의 개략적 표현이다.

실시예 1: N. meningitidis 에서 면역원들( GSI )에 대한 유전적 스크리닝

실시예에서 GSI의 응용은 살균성 항체들에 의한 살해에 덜 취약한 종들을 위해 N. 메닌기티디스의 삽입 돌연변이체들의 라이브러리들을 스크리닝하는 것을 포함한다.

본 발명자들은 서열이 결정된 NmB 집단인 MC58의 돌연변이체들의 라이브러리를 동일한 종의 캡슐 소실(capsule minus)에 대해 생쥐들에서 채취된 혈청으로 스크리닝하여 GSI의 효과를 입증하였다. 총 40,000개의 돌연변이체들을 동종형 종으로 복막내 면역화(intraperitoneal immunisation)하여 생쥐들에서 채취된 혈청들로 분석하였다; 이 혈청의 SBA는 야생형 종에 대해 약 2,000이었다. 라이브러리를 1:560 희석(모든 야생형 세균을 죽게 함)에 노출시켜 생존하는 돌연변이체들을 검출하였다. 생존하는 돌연변이체들에서 트랜스포손 삽입이 살해를 견디는 능력을 제공했다는 것을 정립하기 위해, 돌연변이체들을 모균주에 역교배시키고, 역교배된 돌연변이체가 SBA에서 야생형보다 살해에 보다 높은 내성을 갖는다는 것을 확인하였다. 트랜스포손에 의해 영향받는 유전자의 서열은 마커 구제(marker rescue)에 의해 트랜스포손 삽입 부위를 분리하여 조사하였다. 본 발명자들은 영향받은 유전자들 중 두 개가 TspA 및 NMB0338이라는 것을 발견했다. TspA는 강력한 CD4+ T 세포 반응들을 유도하고 환자로부터 유래한 혈청에 의해 인식되는 표면 항원이다(Kizil et al(1999) Infect Immun . 67, 3533-41). NMB0338은 두 개의 막관통 도메인들(transmembrance domains)을 포함하는 것으로 예측되며 세포 표면에 위치하는 폴리펩티드를 코딩하는, 이전에 기능이 알려지지 않았던 유전자이다. NMBO338에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 다음과 같다:

공중 보건적 필요 외에 GSI를 위해 NmB를 이용하는 여러 실용적인 장점들이 있다: a) 세균이 유전적으로 추적가능하고; b) 면역 메카니즘(effector immune mechanism)에 의한 세균의 살해를 검사하는 것이 간단하며; c) 상이한 혈청군들 및 클론성 계통들(각각 혈청군들 A, B, 및 C에 대한 IV-A, ET-5, 및 ET-37)의 3개의 집단들에 대한 게놈 서열들이 이용가능하며; d) 본 작업을 위해 특성이 잘 파악된 임상적 자원들(well-characterised clinical resources)이 이용가능하다.

GSI는 두 개의 잠재적인 한계들을 갖는다. 첫째, 살균성 항체들의 표적들이 필수적일 수 있다. NmB에서 살균성 항체들의 모든 공지된 표적들은 필수적이지 않고, 현재 허가된 세균용 백신 중 필수적인 유전자 생성물을 표적으로 하는 것은 없기 때문에 이는 가능성이 낮은 것으로 보인다. 둘째, 혈청은 복수 개의 항원들에 대한 항체들을 포함할 것이고, 단일 항원의 손실은 돌연변이체들의 생존에 영향을 미치지 않을 수 있다. 본 발명자들은 동종형 종에 대해 얻어진 혈청에 의한 선택 동안에도, 관련된 항원들은 혈청의 적합한 희석들을 이용하여 여전히 확인된다는 것을 이미 보여주었다.

GSI의 주요 장점들은 1) 고 처리량 단계들은 기술적으로 까다롭거나 고비용을 초래하는 절차들(예를 들면, 단백질 발현/정제 및 면역화)을 포함하지 않고, 2) 동물 데이터에만 의존하기보다는 사람 시료들이 이용될 수 있다는 것이다. GSI는 살균 활성을 유도하는 표면 단백질들의 서브 세트를 신속하게 정확히 찾아내어, 보다 작은 수의 후보들의 보다 상세한 분석들을 가능하게 할 것이다.

1. GSI 를 이용한 살균성 항체들의 표적들의 확인

이종형 종들에 대해 생성된 쥐 혈청(murine sera)과 사람 혈청이 교차-반응적인(cross-reactive) 항원들을 확인하기 위해 이용된다. 혈청들은 다음으로부터 수득된다:

i) 이종형 종들로 전신성 경로에 의해 면역화된 쥐들: 그 종들은 동일한 면역형 및 서브-혈청형(sub-serotype)을 가진 집단들을 피하기 위해 선택 및/또는 제조될 수 있다.

ii) N. meningitidis의 공지된 집단들(Dr R. Wall, Northwick Park에 의해 제공됨)로 감염된 환자들로부터의 급성 증상기 및 회복기 혈청들

iii) NmB 집단, H44/76으로부터 유래한 정의된 외막 소포들(OMVs)을 투여받은 지원자들로부터 유래한 면역화 전- 및 후-시료들(Meningococcal Reference Laboratory에 의해 제공됨).

이 혈청들의 원천들 각각은 구체적인 장점들 및 단점들을 갖는다.

혈청의 원천(Source)	장점	단점
쥐과 동물(Murine)	1)정의된 항원성 노출 2)면역 반응을 유발하기 위해 유전적으로 변형된 종들의 이용 3)실험을 경험하지 않은 순수한(naive) 시료가 이용가능함 4)개별적인 반응들을 조사함	1)동물에서 기원함
환자 혈청	1)사람 유래 재료 2)공지된 항원 노출 3)급성 및 회복기 환자의 혈청이 이용가능함	1)백그라운드 면역성 2)제한된 재료
H44/76 OMV에 의한 면역화 후의 혈청	1)사람 유래 재료 2)정의된 항원 노출 3)면역화 전 및 후의 혈청이 이용가능함 4)개별적인 반응들을 조사함	1)백그라운드 면역성 2)제한된 재료

a) MC58 돌연변이들의 라이브러리를 선택하기 위해 GSI에서 이종형 종들(즉, 서열이 결정된 혈청군 A 또는 C 종들)로 면역화된 동물로부터 유래한 혈청이 이용된다. 본 발명자들은 살아있는, 약화된(attenuated) NmB에 의한 면역화가 혈청군 A 및 C 종들에 대한 교차-반응적인 살균성 항체 반응들을 유도한다는 것을 보여주었다. 사람 혈청에서 증가된 생존을 보이는 돌연변이체들에 존재하지 않는 항원은 분열된(disrupted) 유전자의 마커 구제(marker rescue)에 의해 확인된다.

b) 이종형 혈청들에 의한 살해에 대한 내성을 제공하는 돌연변이들이 확인되고, 그 유전자 생성물이 또한 서열이 결정된, 혈청형 A 및 C 종들, 각각 Z2491 및 FAM18의 살해에 대한 표적인지 여부가 결정된다. 게놈 데이터베이스들은 유전자들의 동족체들(homologues)에 대해 조사된다. 동족체가 존재하면, 트랜스포손 삽입은 MC58 돌연변이로부터 증폭되어, 형질전환(transformation)에 의해 혈청군 A 및 C 종들로 삽입된다. 각 혈청군의 돌연변이 및 야생형 종의 상대적인 생존율이 비교된다. 따라서, GSI는 혈청군, 면역형 및 혈청형에 관계없이 살균 활성의 표적들이 N. meningitidis의 다양한 종들에서 보존되고 접근가능한지 여부에 대한 정보를 신속하게 제공할 수 있다.

c) 생쥐들에서 채취된 혈청들에 대해 증강된 생존율을 보이는 돌연변이체들을 이종형 OMV 백신들(H44/76 유래)을 투여받은 회복기 환자들 또는 백신 접종을 받은 사람들로부터의 사람 혈청들을 이용하여 테스트한다. 이는 표적들이 사람에서 살균성 항체들을 유도할 수 있는지 여부의 중요한 질문을 해소한다. 다른 백신 접근방법들의 경우, 이 정보는 백신 후보들의 GMP 제조를 요하는 임상 시험들의 말기, 고비용의 단계에서야 얻어진다.

장점들은 GSI가 간단하고, 이용가능한 기법들을 이용하여 수행되는 고-처리량(high-throughput) 분석이라는 것이다. 사람들에서 살균성 항체들을 유도하고 복수 종들의 살해를 매개하는 항원들은 GSI가 이용되는 세균 종 및 혈청에 대해 유연성이 있기 때문에 신속하게 확인될 수 있다. 사람 혈청을 이용하여 선택된 돌연변이들은 쥐의 혈청에 의해 선택된 것들과 동일한 방식으로 분석된다.

2. 재조합 GSI 항원들의 항체 반응의 평가

회복기 환자들로부터 유래한 혈청들 및 백신들에 의해 인식되는 살균성 항체들의 표적들인 단백질들은 상업적으로 입수가능한 벡터들을 이용하여 E. coli에서 발현된다. 상응하는 개방 해독 프레임(open reading frame)들은 MC58로부터 PCR에 의해 증폭되고 pCR Topo CT 또는 pBAD/His와 같은 벡터들로 연결되어, 단백질 발현이 각각 T7 또는 아라비노오스-유도성 프로모터의 제어 하에 놓이게 될 수 있다. 전체 세포 단백질로부터 재조합 단백질들의 정제는 니켈 또는 코발트 컬럼에서 단백질의 C 말단에 융합된 His Tag을 통해 수행된다.

성숙한 뉴질랜드 백색 토끼들(Adult New Zealand White rabbits)을 25㎍의 정제된 단백질을 프로인트 불완전 보조약과 함께 4주 간격으로 2회 피하 주사하여 면역화시킨다. 동물들로부터 유래한 혈청들은 면역화 전에 전체 세포 ELISA에 의해 이전에 존재하는 항-Nm 항체들에 대해 조사될 것이다. < 1:2의 초기 혈청 역가를 갖는 동물들이 면역화 실험들을 위해 이용된다. 면역화 이후의 혈청들은 제2차 면역화 후 2주 후에 수득된다. 특정 항체들이 증가되었다는 것을 확인하기 위해, 면역화 전- 및 후-혈청들은 i)정제된 단백질에 대한 웨스턴 분석 및 ii) 야생형 및 상응하는 돌연변이(GSI에 의해 생성됨)로부터 유래한 세포들을 이용한 ELISA에 의해 테스트된다.

SBA들은 MC58(동종형 종) 및 서열이 결정된 혈청군 A 및 C에 대해 토끼 면역 혈청(rabbit immumue serum)으로 수행될 것이다. 검사는 2회 이상 3배수로(in triplicate) 수행될 것이다. 8을 초과하는 SBA들은 유의한 것으로 간주될 것이다. 결과들은 단백질 후보들이 재조합 단백질로서 살균성 항체들을 유도할 수 있는지 여부에 대한 증거를 제공한다.

3. GSI 항원들의 보호적 효능( protective efficacy ) 정립

모든 후보들은 살아있는 세균 도전으로부터 동물들을 보호할 수 있는 능력에 대해 테스트되는데, 이는 단일 검사에서 (세포성 또는 체액성) 면역의 모든 양태들이 평가될 수 있게 하기 때문이다. 본 발명자들은 살아있는 세균 감염에 대한 능동 면역화 및 보호의 모델을 정립하였다. 이 모델에서, 성숙된 생쥐들은 0일차, 21일차에 면역화되고, 28일차에 철-덱스트란(iron-dextran)(보충적인 철 원천으로서)에 담긴 MC58의 10⁶ 또는 10⁷ CFU의 살아있는 세균 공격을 복막 내로 투여받는다. 이 모델은 Tbps(Danve et al(1993) Vaccines 11, 1214-1220)에 의한 면역화의 보호적 효능의 평가를 위해 기재된 것과 유사하다. 비-면역화된 동물들은 감염 후 4시간 내에 균혈증(bacteraemia)을 일으키고, 24시간 내에 전신성 질환(systemic illness)의 징후들을 보인다. 본 발명자들은 이미 살아있는 수막구균성 공격에 대 한 약화된 Nm 종들 및 단백질 항원의 보호적 효능을 입증할 수 있었다; PorA는 살균성 항체들을 유도하는 외막 단백질이나, 광범위한 항원성 변이 때문에 선도적인 백신 후보는 아니다(Bart et al (1999) Infect Immun, 67, 3832- 3846).

6주된, BALB/c 생쥐들(군 크기, 35 마리)이 0일차 및 21일차에 프로인트의 불완전 보조약과 함께 25㎍의 단백질을 피하로 투여받고, 28일차에 복막 내로 MC58의 10⁶(15마리) 또는 10⁷(15마리) CFU의 공격을 받는다. 두 개의 공격용 투여량들(challenge doses)이 고 투여량 및 저 투여량에서 백신 효능을 조사하기 위해 이용되고; 각 군의 5마리의 동물들로부터 1차 면역화 전에 및 각 군의 남아있는 5마리의 동물들로부터 28일차에 혈청을 얻고 추가적인 면역학적 검사들을 위해 -70℃에서 보존한다. 대조군들의 동물들은 i) 보조약만, ii) 재조합 재폴딩된(recombinant refolded) PorA, 및 iii) 살아있는 약화된 Nm 종을 투여받는다. 대조군들의 총 동물수를 감소시키기 위해, 한번에 5개의 후보들로 구성된 세트들을 테스트한다(군의 수= 5개의 후보들 + 3개의 대조구들). 군들에서 동물들의 생존율은 Mann Whitney U 테스트에 의해 비교된다. 15 마리/투여량의 군 크기들로, 실험들은 군들간 생존율에서 25% 차이를 보여주도록 강화된다(powered).

공격에 대해 상당한 보호를 보이는 백신들에 대해, 그 결과를 확인하기 위해 반복 실험을 수행한다. 또한, 후보에 의한 백신 접종이 또한 균혈증에 대한 보호를 유도한다는 것을 정립하기 위해, 균혈증의 수준들이 제2차 실험동안 결정되고; 혈액을 면역화된 동물들 및 면역화되지 않은 동물들에서 감염 후 22시간 차(균혈증은 이 때에 가장 최대임)에 채취하였다. 결과들은 백신 접종된 동물들에서 균혈증의 상당한 감소가 있는지 여부를 결정하기 위해 two-tailed Student-T test를 이용하여 분석된다.

이용된 추가적 물질들 및 방법들

네이세리아 메닌기티디스의 돌연변이 생성

네이세리아 메닌기티디스를 이용한 작업을 위해, 체외 돌연변이 생성(in vitro mutagenesis)에 의해 돌연변이체들을 제조하였다. N. meningitidis로부터 유래한 게놈 DNA를 카나마이신에 대한 내성을 코딩하는 마커 및 E. coli에서 작용하는 복제 원점(origin of replication)을 포함하는 Tn5 유도체에 의한 돌연변이 생성을 거치게 하였다. 이 요소들은 혼성(composite) Tn5 말단들에 의해 둘러싸인다. 전위(transposition) 반응들이 Tn5의 과반응성 변이체로 수행되고 DNA는 ATP 및 뉴클레오티드류의 존재 하에 T4 DNA 폴리머라아제 및 리가아제에 의해 치유된다. 치유된 DNA를 이용하여 N. meningitidis를 카나마이신 내성으로 전환시켰다. 서던 분석(Southern analysis)은 각 돌연변이가 트랜스포손의 단일 삽입만을 포함한다는 것을 확인했다.

혈청 살균성 검사들( SBAs )

고체 배지(Levanthals 보충물을 포함하는 브레인 하트 융합 배지(brain heart infusion media))에서 세균들을 밤새 키우고 실험을 수행하는 오전에 고체 배지에 재도말(re-streaked)하여 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 세균들을 인산 완충 식염수로 채취하여 그 수를 측정하였다. SBA들은 보체 원천(새끼 토끼 또는 사람) 및 약 10⁵ 콜로니 형성 단위들(CFU)을 포함하는, 1ml 용적에서 수행하였다. 배양의 종료 시에 세균들을 수집하고 생존 세균들을 회수하기 위해 고체 배지에 도말하였다.

트랜스포손 삽입 부위들의 분리

표준 방법들에 의해 원하는 돌연변이체로부터 게놈 DNA를 회수하고 PvuII , EcoRV, 및 DraI으로 3시간 동안 처리하고 페놀 추출에 의해 정제하였다. 그 후, DNA를 T4 리가아제의 존재 하에 16℃에서 10 마이크로리터의 용적으로 밤새 반응시켜 자가-연결(self-ligation)시키고, 침전시켜, 전기천공법(eletroporation)에 의해 E. coli를 카나마이신 내성으로 형질전환시키기 위해 이용하였다.

실시예 2: 추가적인 스크리닝 및 그 결과들

MC58의 약 40,000개의 삽입 돌연변이체들을 스크리닝하기 위해 GSI를 이용하였다. 체외 Tn5 돌연변이 생성에 의해, pACYC184로부터의 복제 원점을 포함하는 트랜스포손을 이용하여 라이브러리를 구축하였다.

MC58은 N. meningitidis의 혈청군 B 집단이고, 이 종의 완전한 게놈 서열이 알려져있기 때문에 선택하였다.

라이브러리는 항상 야생형 종을 대조구로 하여 병렬적으로 스크리닝되며, 라이브러리 및 야생형으로부터 형성된 콜로니들의 수가 표시된다.

쥐 혈청에 의한 선택

초기에는 약화된 종 YH102로 면역화된 동물들로부터 유래한 혈청을 이용하여 라이브러리를 분석하였다. 성숙된 생쥐들(Balb/C)에게 복강 내로 10⁸ 콜로니 형성 단위체들을 3회 투여하고, 최종 면역화 후 10일 차에 혈청을 채취하였다.

스크리닝으로 혈청 살해(serum killing)에 대해 증가된 내성을 가진 여러 돌연변이체들을 확인했다: 이는 개별 돌연변이체들을 분리하고, 원래의 유전적 배경에서 돌연변이체를 재구축하고, 개별 돌연변이체들을 야생형 대비 보체-매개 용해에 대한 취약성을 재테스트하여 확인하였다. 다음과 같은 유전자에 트랜스포손 삽입들이 있다:

폴리펩티드의 분석은 54 내지 7번 및 88 내지 107 잔기들로 구성된 두개의 막관통 도메인들을 갖는다는 것을 나타낸다. 따라서, 1 내지 53 및 108 내지 말단(C-말단) 영역들로부터의 단편들은 면역원들로서 특히 유용할 수 있다.

백신 접종된 혈청에 의한 선택

맨체스터에 있는 Meningococcal Reference Laboratory로부터의 혈청을 이용할 수 있었다. 이 혈청은 지원자들의 OMV 면역화의 임상 시험으로부터 유래했다.

백신 접종된 C1 혈청에 의해 선택된 돌연변이들(1회 스크리닝됨)

다음과 같은 서열들을 분리했다.

백신 접종된 지원자 17 D 혈청에 의해 선택된 돌연변이들(1회만 스크리닝됨)

환자 혈청에 의한 선택

본 발명자들은 스크리닝을 위해 급성 및 회복기 환자들로부터 유래한 혈청을 이용할 수 있었다. 이는 N. meningitidis의 상이한 혈청군으로 감염된 개인들로부터 유래한다. 스크리닝은 급성환자 유래(A) 또는 회복기환자 유래(C)의 혈청으로 수행하였다. 급성 감염과 혈청 채취 간의 기간은 2주 내지 3개월이었다.

서열번호 목록

56 NMB1583 단백질

SEQUENCE LISTING <110> Imperial College Innovations Limited <120> Vaccines <130> ICOBW/P32315PC <141> 22/12/04 <150> 0330007.6 <151> 23/12/03 <160> 56 <170> SeqWin99 <210> 1 <211> 2628 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis serogroup B NMB0341 (TspA) DNA sequence <400> 1 atgcccgccg gccgactgcc ccgccgatgc ccgatgatga cgaaatttac agactgtacg 60 cggtcaaacc gtattcagcc gccaacccac aggggataca tcttgaaaaa caacagacaa 120 atcaaactga ttgccgcctc cgtcgcagtt gccgcatcct ttcaggcaca tgctggactg 180 ggcggactga atatccagtc caaccttgac gaaccctttt ccggcagcat taccgtaacc 240 ggcgaagaag ccaaagccct gctaggcggc ggcagcgtta ccgtttccga aaaaggcctg 300 accgccaaag tccacaagtt gggcgacaaa gccgtcattg ccgtttcttc cgaacaggca 360 gtccgcgatc ccgtcctggt gttccgcatc ggcgcaggcg cacaggtacg cgaatacacc 420 gccatcctcg atcctgtcgg ctactcgccc aaaaccaaat ctgcactttc agacggcaag 480 acacaccgca aaaccgctcc gacagcagag tcccaagaaa atcaaaacgc caaagccctc 540 cgcaaaaccg ataaaaaaga cagcgcgaac gcagccgtca aaccggcata caacggcaaa 600 acccataccg tccgcaaagg cgaaacggtc aaacagattg ccgccgccat ccgcccgaaa 660 cacctgacgc tcgaacaggt tgccgatgcg ctgctgaagg caaacccaaa tgtttccgca 720 cacggcagac tgcgtgcggg cagcgtgctt cacattccga atctgaacag gatcaaagcg 780 gaacaaccca aaccgcaaac ggcgaaaccc aaagccgaaa ccgcatccat gccgtccgaa 840 ccgtccaaac aggcaacggt agagaaaccg gttgaaaaac ctgaagcaaa agttgccgcg 900 cccgaagcaa aagcggaaaa accggccgtt cgacccgaac ctgtacccgc tgcaaatact 960 gccgcatcgg aaaccgctgc cgaatccgcc ccccaagaag ccgccgcttc tgccatcgac 1020 acgccgaccg acgaaaccgg taacgccgtt tccgaacctg tcgaacaggt ttctgccgaa 1080 gaagaaaccg aaagcggact gtttgacggt ctgttcggcg gttcgtacac cttgctgctt 1140 gccggcggag gcgcggcatt aatcgccctg ctgctgcttt tgcgccttgc ccaatccaaa 1200 cgcgcgcgcc gtaccgaaga atccgtccct gaggaagagc ctgaccttga cgacgcggca 1260 gacgacggca tagaaatcac ctttgccgaa gtcgaaactc cggcaacgcc cgaacccgct 1320 ccgaaaaacg atgtaaacga cacacttgcc ttagatgggg aatctgaaga agagttatcg 1380 gcaaaacaaa cgttcgatgt cgaaaccgat acgccttcca accgcatcga cttggatttc 1440 gacagcctgg cagccgcgca aaacggcatt ttatccggcg cacttacgca ggatgaagaa 1500 acccaaaaac gcgcggatgc cgattggaac gccatcgaat ccacagacag cgtgtacgag 1560 cccgagacct tcaacccgta caaccctgtc gaaatcgtca tcgacacgcc cgaaccggaa 1620 tctgtcgccc aaactgccga aaacaaaccg gaaaccgtcg ataccgattt ctccgacaac 1680 ctgccctcaa acaaccatat cggcacagaa gaaacagctt ccgcaaaacc tgcctcaccc 1740 tccggactgg caggcttcct gaaggcttcc tcgcccgaaa ccatcttgga aaaaacagtt 1800 gccgaagtcc aaacaccgga agagttgcac gatttcctga aagtgtacga aaccgatgcc 1860 gtcgcggaaa ctgcgcctga aacgcccgat ttcaacgccg ccgcagacga tttgtccgca 1920 ttgcttcaac ctgccgaagc accgtccgtt gaggaaaata taacggaaac cgttgccgaa 1980 acacccgact tcaacgccac cgcagacgat ttgtccgcat tacttcaacc ttctaaagta 2040 cctgccgttg aggaaaatgc agcggaaacc gttgccgatg atttgtccgc actgttgcaa 2100 cctgctgaag caccggccgt tgaggaaaat gtaacggaaa ccgttgccga aacacccgat 2160 ttcaacgcca ccgcagacga tttgtccgca ttacttcaac cttctgaagc acctgccgtt 2220 gaggaaaatg cagcggaaac cgttgccgat gatttgtccg cactgttgca acctgctgaa 2280 gcaccggccg ttgaggaaaa tgcagcggaa atcactttgg aaacgcctga ttccaacacc 2340 tctgaggcag acgctttgcc cgacttcctg aaagacggcg aggaggaaac ggtagattgg 2400 agcatctacc tctcggaaga aaatatccca aataatgcag ataccagttt cccttcggaa 2460 tctgtaggtt ctgacgcgcc ttccgaagcg aaatacgacc ttgccgaaat gtatctcgaa 2520 atcggcgacc gcgatgccgc tgccgagaca gtgcagaaat tgctggaaga agcggaaggc 2580 gacgtactca aacgtgccca agcattggcg caggaattgg gtatttga 2628 <210> 2 <211> 875 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis serogroup B NMB0341 (TspA) protein sequence <400> 2 Met Pro Ala Gly Arg Leu Pro Arg Arg Cys Pro Met Met Thr Lys Phe 1 5 10 15 Thr Asp Cys Thr Arg Ser Asn Arg Ile Gln Pro Pro Thr His Arg Gly 20 25 30 Tyr Ile Leu Lys Asn Asn Arg Gln Ile Lys Leu Ile Ala Ala Ser Val 35 40 45 Ala Val Ala Ala Ser Phe Gln Ala His Ala Gly Leu Gly Gly Leu Asn 50 55 60 Ile Gln Ser Asn Leu Asp Glu Pro Phe Ser Gly Ser Ile Thr Val Thr 65 70 75 80 Gly Glu Glu Ala Lys Ala Leu Leu Gly Gly Gly Ser Val Thr Val Ser 85 90 95 Glu Lys Gly Leu Thr Ala Lys Val His Lys Leu Gly Asp Lys Ala Val 100 105 110 Ile Ala Val Ser Ser Glu Gln Ala Val Arg Asp Pro Val Leu Val Phe 115 120 125 Arg Ile Gly Ala Gly Ala Gln Val Arg Glu Tyr Thr Ala Ile Leu Asp 130 135 140 Pro Val Gly Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asp Gly Lys 145 150 155 160 Thr His Arg Lys Thr Ala Pro Thr Ala Glu Ser Gln Glu Asn Gln Asn 165 170 175 Ala Lys Ala Leu Arg Lys Thr Asp Lys Lys Asp Ser Ala Asn Ala Ala 180 185 190 Val Lys Pro Ala Tyr Asn Gly Lys Thr His Thr Val Arg Lys Gly Glu 195 200 205 Thr Val Lys Gln Ile Ala Ala Ala Ile Arg Pro Lys His Leu Thr Leu 210 215 220 Glu Gln Val Ala Asp Ala Leu Leu Lys Ala Asn Pro Asn Val Ser Ala 225 230 235 240 His Gly Arg Leu Arg Ala Gly Ser Val Leu His Ile Pro Asn Leu Asn 245 250 255 Arg Ile Lys Ala Glu Gln Pro Lys Pro Gln Thr Ala Lys Pro Lys Ala 260 265 270 Glu Thr Ala Ser Met Pro Ser Glu Pro Ser Lys Gln Ala Thr Val Glu 275 280 285 Lys Pro Val Glu Lys Pro Glu Ala Lys Val Ala Ala Pro Glu Ala Lys 290 295 300 Ala Glu Lys Pro Ala Val Arg Pro Glu Pro Val Pro Ala Ala Asn Thr 305 310 315 320 Ala Ala Ser Glu Thr Ala Ala Glu Ser Ala Pro Gln Glu Ala Ala Ala 325 330 335 Ser Ala Ile Asp Thr Pro Thr Asp Glu Thr Gly Asn Ala Val Ser Glu 340 345 350 Pro Val Glu Gln Val Ser Ala Glu Glu Glu Thr Glu Ser Gly Leu Phe 355 360 365 Asp Gly Leu Phe Gly Gly Ser Tyr Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gly Gly 370 375 380 Ala Ala Leu Ile Ala Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu Ala Gln Ser Lys 385 390 395 400 Arg Ala Arg Arg Thr Glu Glu Ser Val Pro Glu Glu Glu Pro Asp Leu 405 410 415 Asp Asp Ala Ala Asp Asp Gly Ile Glu Ile Thr Phe Ala Glu Val Glu 420 425 430 Thr Pro Ala Thr Pro Glu Pro Ala Pro Lys Asn Asp Val Asn Asp Thr 435 440 445 Leu Ala Leu Asp Gly Glu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Ala Lys Gln Thr 450 455 460 Phe Asp Val Glu Thr Asp Thr Pro Ser Asn Arg Ile Asp Leu Asp Phe 465 470 475 480 Asp Ser Leu Ala Ala Ala Gln Asn Gly Ile Leu Ser Gly Ala Leu Thr 485 490 495 Gln Asp Glu Glu Thr Gln Lys Arg Ala Asp Ala Asp Trp Asn Ala Ile 500 505 510 Glu Ser Thr Asp Ser Val Tyr Glu Pro Glu Thr Phe Asn Pro Tyr Asn 515 520 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Gly Cys Gly Ala Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Thr 820 825 830 Ala Cys Gly Gly Cys Cys Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Gly Cys Thr 835 840 845 Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala 850 855 860 Thr Ala Ala 865 <210> 54 <211> 288 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis serogroup B NMB0062 protein sequence <400> 54 Met Lys Gly Ile Ile Leu Ala Gly Gly Ser Gly Thr Arg Leu Tyr Pro 1 5 10 15 Ile Thr Arg Gly Val Ser Lys Gln Leu Leu Pro Val Tyr Asp Lys Pro 20 25 30 Met Ile Tyr Tyr Pro Leu Ser Val Leu Met Leu Ala Gly Ile Arg Asp 35 40 45 Ile Leu Val Ile Thr Ala Pro Glu Asp Asn Ala Ser Phe Lys Arg Leu 50 55 60 Leu Gly Asp Gly Ser Asp Phe Gly Ile Ser Ile Ser Tyr Ala Val Gln 65 70 75 80 Pro Ser Pro Asp Gly Leu Ala Gln Ala Phe Ile Ile Gly Glu Glu Phe 85 90 95 Ile Gly Asn Asp Asn Val Cys Leu Val Leu Gly Asp Asn Ile Phe Tyr 100 105 110 Gly Gln Ser Phe Thr Gln Thr Leu Lys Gln Ala Ala Ala Gln Thr His 115 120 125 Gly Ala Thr Val Phe Ala Tyr Gln Val Lys Asn Pro Glu Arg Phe Gly 130 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ccgtcccagc 180 ctgatggcaa aactcgaaaa acacaccggc aaacccaaag gctggctcga cagaaaacac 240 cgcgaacgca ctgtccccga aaccgccgca gaaagcaccg gaactgccga aacccaaatt 300 gccgaaaccg catctgctgc cggctgccgc agcgttaccg tcaaccgcaa tacctgcgaa 360 acccaaatca ccgtctccat caacctcgac ggcagcggca aaagcaggct ggataccggc 420 gtacccttcc tcgaacacat gatcgatcaa atcgcccgcc acggcatgat tgacatcgac 480 atcagctgca aaggcgacct gcacatcgac gaccaccaca ccgccgaaga catcggcatc 540 acactcggac aagcaatccg gcaggcactc ggcgacaaaa aaggcatccg ccgttacgga 600 cattcctacg tcccgctcga cgaagccctc agccgcgtcg tcatcgacct ttccggccgc 660 cccggactcg tgtacaacat cgaatttacc cgcgcactaa tcggacgttt cgatgtcgat 720 ttgtttgaag aatttttcca cggcatcgtc aaccacagta tgatgaccct gcacatcgac 780 aacctcagcg gcaaaaacgc ccaccatcag gcggaaaccg tattcaaagc cttcgggcgc 840 gccctgcgta tggcagtcga acacgacccg cgcatggcag gacagacccc ctcgaccaaa 900 ggcacgctga ccgcataa 918 <210> 56 <211> 305 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis serogroup B NMB1583 protein sequence <400> 56 Met Asn Leu Thr Lys Thr Gln Arg Gln Leu His Asn Phe Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ala Gln Glu Ala Gly Ser Leu Ser Lys Leu Ala Lys Leu Cys Gly Tyr 20 25 30 Arg Thr Pro Val Ala Leu Tyr Lys Leu Lys Gln Arg Leu Glu Lys Gln 35 40 45 Ala Glu Asp Pro Asp Ala Arg Gly Ile Arg Pro Ser Leu Met Ala Lys 50 55 60 Leu Glu Lys His Thr Gly Lys Pro Lys Gly Trp Leu Asp Arg Lys His 65 70 75 80 Arg Glu Arg Thr Val Pro Glu Thr Ala Ala Glu Ser Thr Gly Thr Ala 85 90 95 Glu Thr Gln Ile Ala Glu Thr Ala Ser Ala Ala Gly Cys Arg Ser Val 100 105 110 Thr Val Asn Arg Asn Thr Cys Glu Thr Gln Ile Thr Val Ser Ile Asn 115 120 125 Leu Asp Gly Ser Gly Lys Ser Arg Leu Asp Thr Gly Val Pro Phe Leu 130 135 140 Glu His Met Ile Asp Gln Ile Ala Arg His Gly Met Ile Asp Ile Asp 145 150 155 160 Ile Ser Cys Lys Gly Asp Leu His Ile Asp Asp His His Thr Ala Glu 165 170 175 Asp Ile Gly Ile Thr Leu Gly Gln Ala Ile Arg Gln Ala Leu Gly Asp 180 185 190 Lys Lys Gly Ile Arg Arg Tyr Gly His Ser Tyr Val Pro Leu Asp Glu 195 200 205 Ala Leu Ser Arg Val Val Ile Asp Leu Ser Gly Arg Pro Gly Leu Val 210 215 220 Tyr Asn Ile Glu Phe Thr Arg Ala Leu Ile Gly Arg Phe Asp Val Asp 225 230 235 240 Leu Phe Glu Glu Phe Phe His Gly Ile Val Asn His Ser Met Met Thr 245 250 255 Leu His Ile Asp Asn Leu Ser Gly Lys Asn Ala His His Gln Ala Glu 260 265 270 Thr Val Phe Lys Ala Phe Gly Arg Ala Leu Arg Met Ala Val Glu His 275 280 285 Asp Pro Arg Met Ala Gly Gln Thr Pro Ser Thr Lys Gly Thr Leu Thr 290 295 300 Ala 305 50

Claims

미생물에 의해 종속된 동물에서 면역 반응과 연관된 상기 미생물의 폴리펩티드를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은:

(1)상기 미생물의 복수의 상이한 돌연변이체를 제공하는 단계;

(2)상기 복수의 돌연변이 미생물들을 상기 미생물 또는 그의 일부에 대해 면역 반응을 일으켰던 동물로부터 유래한 항체들과, 상기 항체들이 상기 돌연변이 미생물에 결합하면, 상기 돌연변이 미생물은 죽게 되는 조건들 하에서 접촉시키는 단계;

(3) 상기 단계(2)로부터 생존하는 돌연변이 미생물들을 선택하는 단계;

(4) 상기 생존하는 돌연변이 미생물에서 상기 돌연변이를 포함하는 유전자를 확인하는 단계; 및

(5) 상기 유전자에 의해 코딩되는 상기 폴리펩티드를 확인하는 단계;를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 병원성 미생물인 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미생물에 의해 종속된 동물은 상기 미생물의 숙주인 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물에 의해 종속된 동물은 상기 미생물에 의해 감염되거나 또는 감염되었던 사람인 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 세균인 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 세균은 네이세리아 메닌기티디스( Neisseria meningitidis)인 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 미생물은 삽입 돌연변이들을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (3)에서 선택된 생존하는 돌연변이는 상기 미생물의 모균주(parental strain)로 역교배(backcross)되고, 상기 교배 결과물이 상기 단계(2)에 기재된 조건들 하에서 살해(killing)에 내성을 갖는지 여부를 결정하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계(2)에서, 보체(complement)가 상기 항체들이 결합되는 상기 미생물들의 살해를 매개하는 것인 방법.
미생물에 의해 종속된 동물에서 면역 반응과 연관된 상기 미생물의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항에서 정의된 바와 같은 상기 단계(1) 내지 (4)를 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
미생물에 의해 종속된 동물에서 면역 반응과 연관된 상기 미생물의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에서 돌연변이된 미생물을 선택하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항에서 정의된 바와 같은 상기 단계(1) 내지 (3)을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
항원을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하고 단계(5)에서 확인된 상기 폴리펩티드 또는 항원성 단편 또는 그의 변이체, 또는 그와 같은 폴리펩티드 또는 단편 또는 변이체의 융합체를 합성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 변이체는 관련된 미생물로부터 유래한 동종형(homologous) 폴리펩티드인 것인 방법.
미생물과 싸우는 백신을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제12항 또는 제13항의 방법에 따른 항원, 또는 상기 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하 는 단계 및 상기 항원 또는 폴리뉴클레오티드를 적합한 담체(carrier)와 조합(combine)하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 항원 또는 폴리뉴클레오티드는 보조약(adjuvant)과 조합되는 것인 방법.
제12항 또는 제13항의 방법에 의해 수득가능한 항원 또는 상기 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제14항 또는 제15항의 방법에 의해 수득 가능한 백신.
백신에서의 용도를 위한 제16항에 의한 항원 또는 폴리뉴클레오티드.
미생물에 대해 개별개체(individual)를 백신 접종하는 방법으로서, 상기 방법은 제16항에 따른 항원 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제17항에 따른 백신을 상기 개별개체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
미생물에 대해 개별개체를 백신 접종하기 위한 백신의 제조에서 제16항에 따른 항원 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제17항에 따른 백신의 용도.
폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제10항의 단계들을 수행하고 확인된 유전자 또는 그의 변이체 또는 단편 또는 그와 같은 유전자 또는 변이체 또는 단편의 융합체를 분리 또는 합성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제20항의 방법에 의해 수득 가능한 폴리뉴클레오티드.
제11항의 방법에 의해 수득 가능한 돌연변이 미생물.
본 명세서에 기재된 바와 같이 미생물들의 항원들을 확인하는 신규한 방법.
서열번호 4, 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 그의 단편 또는 변이체 또는 그와 같은 단편 또는 변이체의 융합체.
제25항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
의학에서의 용도를 위한 제25항에 따른 폴리펩티드 또는 제26항에 따른 폴리뉴클레오티드.
백신에서의 용도를 위한 제25항에 따른 폴리펩티드 또는 제26항에 따른 폴리뉴클레오티드.
제25항에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 숙주 세포에서 제26항의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계 및 상기 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제26항에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드를 화학적으로 합성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
네이세리아 메닌기티디스에 대해 개별개체를 백신 접종하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개별개체에게 제25항에 따른 폴리펩티드 또는 제26항에 따른 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
네이세리아 메닌기티디스에 대해 개별개체를 백신 접종하기 위한 백신의 제조에서 제25항에 따른 폴리펩티드 또는 제26항에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도.
본 명세서에 개시된 바와 같은 신규한 네이세리아 메닌기티디스 백신.