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KR20060108640A - 신규한 플라스미드 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 플라스미드 및 이의 용도 Download PDF

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Publication number
KR20060108640A
KR20060108640A KR1020067008382A KR20067008382A KR20060108640A KR 20060108640 A KR20060108640 A KR 20060108640A KR 1020067008382 A KR1020067008382 A KR 1020067008382A KR 20067008382 A KR20067008382 A KR 20067008382A KR 20060108640 A KR20060108640 A KR 20060108640A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
dna
group
set forth
plasmid
Prior art date
Application number
KR1020067008382A
Other languages
English (en)
Inventor
에이토라 야마무라
노보루 후지모토
Original Assignee
다이이치 파인 케미칼 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다이이치 파인 케미칼 가부시키가이샤 filed Critical 다이이치 파인 케미칼 가부시키가이샤
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Abstract

로도코커스 속 균 유래의 서열번호 73에 기재된 염기서열을 갖는 플라스미드 및 서열번호 74에 기재된 염기서열을 갖는 플라스미드 또는 이의 DNA 단편으로부터 로도코커스 속 균내에서 복제할 수 있는 DNA 영역을 조제하며 대장균 유래의 플라스미드 또는 이의 DNA 단편으로부터 대장균내에서 복제할 수 있는 DNA 영역을 조제하며 셔틀 벡터를 작제한다. 셔틀 벡터에 아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자를 삽입하여 벡터를 작제하고 당해 벡터를 함유하는 형질전환체를 작제하며 아미노케톤 비대칭 환원효소 및 광학활성 아미노알콜을 제조한다.
로도코커스 속, 플라스미드, 셔틀 벡터, 아미노케톤 비대칭 환원효소

Description

신규한 플라스미드 및 이의 용도{Novel plasmids and utilization thereof}
본 발명은 로도코커스(Rhodococcus) 속에 속하는 미생물(이하, 로도코커스 속 균이라고 한다) 유래의 신규한 플라스미드 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 플라스미드 및 이의 일부인 DNA 단편(이하, 단순히 DNA 단편이라고 한다) 및 이들을 이용하는 셔틀 벡터, 벡터, 형질전환체, 아미노케톤 비대칭 환원효소의 제조방법 및 광학활성 아미노알콜의 제조방법에 관한 것이다.
로도코커스 속 균은 니트릴류의 대사에 관여하는 효소를 생산하는 것 또는 아미노케톤을 비대칭적으로 환원시키는 효소를 생성하는 것으로 공지되어 있다. 특히, 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis)는 대단히 높은 아미노케톤 비대칭 환원활성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 이러한 미생물 및 효소는 α-아미노케톤에 작용하여, 광학활성 β-아미노알콜을 고수율이면서 또한 고선택적으로 생산한다(예: 특허 문헌 1 및 5). 따라서 로도코커스 속 균에서 유용한 효소 등의 대량생산을 목적으로 하는 숙주-벡터계의 개발이 이전부터 기대되고 있다. 그러나 로도코커스 속 균을 숙주로 하는 적합한 벡터의 개발은 지연되고 있는 것이 현재 상황이다. 로도코커스 속 균에 있어서 플라스미드가 발견된 미생물은 로도코커스 종. H13-A주(비특허 문헌1), 로도코커스 로도크러스(Rhodococcus rhodochrous) ATCC 4276주(특허 문헌 2), 로도코커스 로도크러스 ATCC 4001주(특허 문헌3) 및 로도코커스 에리트로폴리스 IFO 12320주(특허 문헌4) 등의 수주에 불과하다.
특허 문헌 1: 국제공개공보 WO 01/73100
특허 문헌 2: 일본 공개특허공보 제(평)4-148685호
특허 문헌 3: 일본 공개특허공보 제(평)4-330287호
특허 문헌 4: 일본 공개특허공보 제(평)9-28379호
특허 문헌 5: 국제공개공보 WO 02/070714
비특허 문헌 1: J. Bacteriol., 170, 638, 1988
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
상기한 바와 같이 로도코커스 속 균으로부터 공업적으로 이용할 수 있는 균주를 육종, 개량(변이주)하기 위한 새로운 벡터의 개발이 요망되고 있다. 특히, 재조합 DNA 미생물 및 이의 산물인 식품이나 첨가물의 안전성의 면에서 자가 클로닝계에 의한 것이 바람직하다고 되어 있다. 본 발명은 이러한 숙주-벡터계에서의 벡터로서 이용할 수 있는 신규한 플라스미드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
아미노케톤 비대칭 환원활성을 갖는 로도코커스 에리트로폴리스에서, 공업적으로 이용할 수 있는 재조합 미생물의 창출이 요망되고 있다. 특히, 이러한 재조합 미생물의 창출에 이용할 수 있는 신규한 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편을 제공하는 것을 본 발명의 제1의 목적으로 한다.
상기 플라스미드가 수득되면, 다른 미생물에서도 복제할 수 있는 셔틀 벡터를 작제하는 것도 용이해진다. 본 발명은 이러한 셔틀 벡터 작제에 필요한 DNA 복제에 관한 염기서열 정보(복제 영역 등)을 제공하는 것을 제2의 목적으로 한다.
본 발명은 로도코커스 속 균 및 대장균의 어떤 것에서도 복제할 수 있는 셔틀 벡터를 제공하는 것을 제3의 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 셔틀 벡터의 아미노케톤 비대칭 환원효소에 대한 적용을 제4의 목적으로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자 등은 로도코커스 속 균주에서 벡터 작제를 위한 플라스미드를 예의 스크리닝한 결과, 숙주-벡터계에서의 벡터로서 이용할 수 있는 몇가지의 신규한 플라스미드를 밝혀냈다.
또한, 본 발명자 등은 상기 플라스미드에 약제 내성 유전자, 대장균 내에서 복제할 수 있는 유전자 영역 등을 도입함으로써 셔틀 벡터를 작제할 수 있는 것을 밝혀냈다. 이와 같이 상기 과제를 달성하는 염기서열 정보, 플라스미드 및 셔틀 벡터를 수득하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명에 따르면 하기의 (1) 내지 (39)에 기재된 DNA단편, DNA, 플라스미드, 셔틀 벡터, 벡터, 형질전환체, 아미노케톤 비대칭 환원효소의 제조방법 및 광학활성 아미노알콜의 제조방법이 제공된다.
(1)서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 단편.
(2)서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
(3)서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 14, 서열번호 17 및 서열번호 22에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 단편.
(4)서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 14, 서열번호 17 및 서열번호 22에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
(5)서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 14, 서열번호 17 및 서열번호 22에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역을 함유하며, 또한 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
(6)서열번호 76에 기재된 염기서열을 갖는 DNA 단편.
(7)서열번호 76에 기재된 염기서열을 갖는 프로모터 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
(8)서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 14, 서열번호 17 및 서열번호 22에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역을 함유하며, 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 영역을 함유하며, 또한 서열번호 76에 기재된 염기서열을 갖는 프로모터 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
(9)(1) 내지 (8)의 어느 하나에 기재된 플라스미드 또는 DNA 단편을 가지며 제한효소 절단 부위수가 BamHI: 2, EcoRI: 2, KpnI: 1, PvuII: 1, SacI: 1 및 SmaI: 1이며, 크기가 약 5.4kbp인 것을 특징으로 하는 환상 플라스미드.
(10)서열번호 73에 기재된 염기서열을 갖는 플라스미드.
(11)로도코커스 속 균 유래인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (10)의 어느 하나에 기재된 플라스미드 또는 DNA 단편.
(12)서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 72에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 단편.
(13)서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 72에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
(14)서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 62 및 서열번호 69에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 단편.
(15)서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 62 및 서열번호 69에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
(16)서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 62 및 서열번호 69에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역을 함유하며, 또한 서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 72에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
(17)서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 62 및 서열번호 69에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역을 함유하며, 서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 72에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 영역을 함유하며, 또한 서열번호 76에 기재된 염기서열을 갖는 프로모터 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
(18)서열번호 67 및 서열번호 47에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 단편.
(19)서열번호 67 및 서열번호 47에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 접합 단백질 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
(20)서열번호 75에 기재된 염기서열을 갖는 DNA 단편.
(21)서열번호 75에 기재된 염기서열을 갖는 접합에 관한 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
(22)(12) 내지 (21)의 어느 하나에 기재된 플라스미드 또는 DNA 단편을 가지며 제한효소 절단 부위수가 BamHI: 2, PvuII: 4, SacI: 3 및 SmaI: 4이며, 크기가 약 5.8kbp인 것을 특징으로 하는 환상 플라스미드.
(23)서열번호 74에 기재된 염기서열을 갖는 플라스미드.
(24)로도코커스 속 균 유래인 것을 특징으로 하는 (12) 내지 (23)의 어느 하나에 기재된 플라스미드 또는 DNA 단편.
(25)서열번호 77에 기재된 염기서열을 갖는 DNA 단편.
(26)서열번호 77에 기재된 염기서열을 갖는 프로모터 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
(27)(1) 내지 (26)의 어느 하나에 기재된 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편과 대장균 내에서 복제할 수 있는 DNA 영역을 함유하고, 로도코커스 속 균 및 대장균 내에서 복제할 수 있는 셔틀 벡터.
(28)(27)에 기재된 셔틀 벡터를 사용하여 작제하는 것을 특징으로 하는 벡터.
(29)(6), (7), (25) 또는 (26)의 어느 하나에 기재된 플라스미드 또는 DNA 단편을 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
(30)아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 (28) 또는 (29)에 기재된 벡터.
(31)아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자가 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 핵산 또는 서열번호 78의 아미노산 서열에서 1개 또는 복수의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며 또한 아미노케톤 비대칭 환원활성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산인 것을 특징으로 하는 (30)에 기재된 벡터.
(32)아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자가 서열번호 79에 기재된 염기서열로 이루어진 핵산 또는 서열번호 79와 상보적인 염기서열로 이루어진 핵산과 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 아미노케톤 비대칭 환원활성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산인 것을 특징으로 하는 (30)에 기재된 벡터.
(33)(28) 또는 (29)에 기재된 벡터를 포함하는 형질전환체.
(34)(30) 내지 (32)의 어느 하나에 기재된 벡터를 포함하는 형질전환체.
(35)(34)에 기재된 형질전환체를 당해 형질전환체가 증식할 수 있는 배지속에서 배양되는 배양공정과, 상기 배양공정에서 수득되는 당해 형질전환체로부터 아미노케톤 비대칭 환원효소를 정제하는 정제공정을 함유하는 아미노케톤 비대칭 환원효소의 제조방법.
(36) 화학식 1의 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물에 (35)에 기재된 제조방법으로 수득되는 아미노케톤 비대칭 환원효소를 작용시켜 화학식 2의 원하는 광학활성을 갖는 아미노알콜 화합물을 제조하는 방법.
Figure 112006030365759-PCT00001
Figure 112006030365759-PCT00002
상기식에서,
X는 동일하거나 상이할 수 있으며 할로겐 원자, 저급 알킬기, 보호기로 보호될 수 있는 하이드록실기, 니트로기 및 설포닐기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며;
n은 0 내지 3의 정수이며;
R1은 저급 알킬기이며;
R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있으며 수소원자 및 저급 알킬기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며;
*는 비대칭탄소이다.
(37) 화학식 1의 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물에 (34)에 기재된 형질전환체를 작용시켜 화학식 2의 원하는 광학활성을 갖는 아미노알콜 화합물을 제조하는 방법.
화학식 1
Figure 112006030365759-PCT00003
화학식 2
Figure 112006030365759-PCT00004
상기식에서,
X는 동일하거나 상이할 수 있으며 할로겐 원자, 저급 알킬기, 보호기로 보호될 수 있는 하이드록실기, 니트로기 및 설포닐기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며,
n은 0 내지 3의 정수이며,
R1은 저급 알킬기이며,
R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있으며 수소원자 및 저급 알킬기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며,
*는 비대칭탄소이다.
(38) (37)에 기재된 광학활성 아미노알콜의 제조방법에서 화학식 3의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 용매화물을 추가로 첨가하여 광학활성 아미노알콜을 제조하는 방법.
Figure 112006030365759-PCT00005
상기식에서,
A는 화학식 Y 또는 화학식 Z이며,
Figure 112006030365759-PCT00006
Figure 112006030365759-PCT00007
R4는 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, R8과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환 또는 R8과 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이고,
R5는 수소원자, 탄소수 1 내지 3의 알킬기 또는 R6 또는 R9와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며,
R6은 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, R8과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환, R5 또는 R9와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며,
R7은 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이고,
R8은 수소원자, 카복실기, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기, R4와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격, R6과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환이며,
R9는 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시카보닐기, 치환기를 가질 수 있는 아실기, R5 또는 R6과 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며,
R10은 수소원자 또는 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이다.
(39)서열번호 89 내지 서열번호 100에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 염기서열을 갖는 (27)에 기재된 셔틀 벡터.
발명의 효과
본 발명의 플라스미드는 종래에는 공지되어 있지 않은 신규한 플라스미드이며, 공업적으로 유용한 로도코커스 속에 속하는 숙주-벡터계에서의 벡터로서 가치가 있다. 특히, 아미노케톤의 비대칭 환원을 공업적으로 실시할 수 있는 재조합 미생물의 창출에 유용하다. 이러한 미생물이 공헌하는 아미노케톤의 비대칭 환원으로서는 1,2-메틸아미노-1-페닐-1-프로파논으로부터 d-(1S,2S)-슈도에페드린을 제조하는 반응을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 플라스미드는 단일한 로도코커스 세포에 공존하는 점으로부터, 복제 기능을 이용한 단독 사용 이외에 각각 화합성 플라스미드로서 이용할 수 있다. 즉, 별도의 단백질(효소 등) 유전자를 각각의 플라스미드에 삽입함으로써 별도의 단백질을 동시에 동일 세포내에서 발현할 수 있도록 된다.
또한, 본 발명의 셔틀 벡터는 로도코커스 속 균 및 대장균(에스케리치아 속 균)에서 공업적으로 이용할 수 있는 재조합 미생물의 창출에 유용하다.
본 발명의 플라스미드로부터 수득되는 DNA 복제에 관한 염기서열 정보는 이에 기초하여 상기 셔틀 벡터를 작제할 수 있게 하며, 구체적으로는 벡터의 구성요 소인 DNA 단편 등을 제공한다.
도 1은 플라스미드 pRET1100의 제한효소 절단 지도이다.
도 2는 플라스미드 pRET1000의 제한효소 절단 지도이다.
도 3은 셔틀 벡터 pRET1101의 작제에 관한 개요를 도시하는 도면이다.
도 4는 셔틀 벡터 pRET1102의 작제에 관한 개요를 도시하는 도면이다.
도 5는 셔틀 벡터 pRET1103의 작제에 관한 개요를 도시하는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명을 적합한 실시 형태에 따라서 설명한다.
본 발명의 제1 플라스미드는 로도코커스 속 균으로부터 분리되는 플라스미드 또는 이의 유도체이다. 구체적으로는 예를 들면, 로도코커스 에리트로폴리스 IAM1400, IAM1503, JCM2893 및 JCM2894주 등의 균주로부터 분리할 수 있으며 이의 크기가 약 5.4kbp이며, 또한 표 1에 기재된 제한효소에 대한 분해특성을 갖는 환상 플라스미드이다. 이하, 각각의 균주로부터 분리되는 플라스미드를 pRET1100, pRET1300, pRET1500 및 pRET1700이라고 칭한다. 또한, 공시 균주로부터 본 발명의 플라스미드를 조제하는 데는 공지된 방법(예: 보일법, 알칼리 용해법, 염화세슘 밀도 구배 초원심법: 연구실 매뉴얼 유전공학, 제3판, 제10장, 55-59페이지, 마루젠가부시키가이샤)를 사용할 수 있다.
제한효소 절단 부위 수 생성단편의 크기(kbp)
BamHI 2 0.4, 5.0
EcoRI 2 0.3, 5.1
KpnI 1 5.4
PvuII 1 5.4
SacI 1 5.4
SmaI 1 5.4
플라스미드 pRET1100의 제한효소 지도를 도 1에 도시한다. 이러한 플라스미드에 관해 공지된 방법(예: 형광식 자동 서열분석기)에 의해 서열분석한 바, 이의 전체 염기서열은 서열 목록의 서열번호 73에 기재되는 5444bp인 것을 알았다.
또한, 본 발명의 제2 플라스미드도, 로도코커스 속 균으로부터 분리되는 플라스미드 또는 이의 유도체이다. 구체적으로는 예를 들면, 로도코커스 로드니(Rhodococcus rhodnii) JCM3203주로부터 분리할 수 있으며 이의 크기가 약 5.8kbp이며, 또한 표 2에 기재되는 제한효소에 대한 분해특성을 갖는 환상 플라스미드이다. 이하, 본 플라스미드를 pRET1000이라고 칭한다.
제한효소 절단 부위 수 생성단편의 크기(kbp)
BamHI 2 2.0, 3.8
PvuII 4 0.1, 1.4, 2.0, 2.3
SacI 3 0.9, 1.0, 3.9
SmaI 4 0.1, 1.2, 1.6, 2.9
플라스미드 pRET1000의 제한효소 지도를 도 2에 도시한다. 이러한 플라스미드에 관해서도, 공지된 방법에 따라 서열분석한 바, 서열 목록의 서열번호 74에 기재되는 5813bp의 염기서열을 갖는 것을 알았다.
이상과 같이 본 발명의 플라스미드류(천연형 또는 야생형)은 표 1 또는 표 2에 기재되는 제한효소 절단 패턴에 의해서도 특정될 수 있는 환상 플라스미드이다. 따라서 본 발명은 다음 2종류의 환상 플라스미드를 포함한다.
(1)로도코커스 속 균 유래의 환상 플라스미드이며, 이의 크기가 약 5.4kbp이며, 제한효소 절단 부위수가 BamHI: 2, EcoRI: 2, KpnI: 1, PvuII: 1, SacI: 1 및 SmaI: 1인 것을 특징으로 하는 환상 플라스미드.
(2)로도코커스 속 균 유래의 환상 플라스미드이며, 이의 크기가 약 5.8kbp이며, 제한효소 절단 부위수가 BamHI: 2, PvuII: 4, SacI: 3 및 SmaI: 4인 것을 특징으로 하는 환상 플라스미드.
플라스미드 pRET1100 및 pRET1000의 염기서열(즉, 서열번호 73 및 서열번호 74)를 해석한 결과, DNA 복제나 기타 기능을 갖는 단백질을 암호화하고 있는 1군의 염기서열(개방 판독 프레임, 이하, orf라고 한다)이 존재하는 것으로 추측된다.
당해 기술분야에서, 「DNA 복제」란 DNA 자신이 주형으로 되어, 기존의 2본쇄 DNA(모 DNA)와 완전히 동일한 2개의 2본쇄 DNA가 형성되는 것을 가리킨다. 이러한 복제 기구는 복제 개시점(복제 기점)으로부터의 개시, DNA쇄의 신장, 종결의 3단계로 이루어진다. 복제할 때에는 DNA 2본쇄의 일부가 해리되며 각각의 1본쇄에 상보적인 새로운 DNA쇄가 합성된다. DNA 2본쇄를 해리시키는 것은 리가제와 나선 불안정화 단백질(1본쇄 DNA 결합 단백질이라고도 한다)이며, 해리된 부분은 복제 분기라고 호칭된다. 복제 분기에 대하여 3'→ 5'방향의 주형 DNA를 리딩쇄, 이와 반대로 5'→ 3'방향을 래깅쇄라고 호칭한다. DNA 폴리머라제는 5'→ 3' 방향으로 DNA쇄를 신장시킨다. 따라서 리딩쇄를 주형으로 하는 경우, 복제 분기의 방향으로 DNA가 합성된다. 그러나, 반대측의 래깅쇄를 주형으로 하면 복제 분기와 역방향으로 DNA쇄를 신장하지 않으면 안된다. 따라서 래깅쇄의 복제는 오카자키 단편이라고 호칭하는 200염기 정도의 단편마다 실시된다. 약 200염기마다 RNA 폴리머라제가 DNA를 주형으로 하여 10염기의 RNA를 5'→ 3'의 방향으로 합성한다. 이러한 RNA를 프라이머로 하여 래깅쇄를 주형으로 DNA 폴리머라제가 5'→ 3'방향으로 DNA쇄를 합성한다. 복제된 200염기 정도의 DNA 단편은 다음에 RNA가 제거되어 1본쇄의 DNA에 결합된다. 이러한 복제 기구 중에서, DNA에 대해 리가제, 나선 불안정화 단백질 등의 각종 단백질이 협동하여 복제장치를 형성하고 있다. 관여하고 있는 다른 단백질로서, DNA 토포이소머라제(DNA 복제할 때에 비틀림을 방지한다), 복제 개시 단백질이나 복제 종료 단백질 등을 들 수 있다. DNA 복제 기구에 관해서는 예를 들면, 「세포의 분자생물학, 제3판, 나카무라 가이코 등 번역, 251-262페이지, 교이쿠사, 1996년」에 상세하게 해설되어 있다.
그래서 다시 플라스미드 pRET1100 및 pRET10O0의 염기서열을 해석한 결과, 상기 DNA 복제에 관여하는 orf의 부근에 AT가 풍부한 상동성 또는 유사성이 있는 반복 서열이나 DNA의 2차 구조를 갖는다고 생각되는 서열, 즉 DNA 복제 영역(DNA의 복제에 관여하는 단백질이 인지하는 염기서열 영역 또는 DNA의 복제 개시점이 존재하는 영역)으로 추측되는 염기서열이 발견됐다.
이상, DNA 복제에는 DNA 복제 영역 및 DNA 복제에 관여하는 단백질(이하, DNA 복제 관련 단백질이라고 한다)을 암호화하는 영역이 필수적이다. 본 발명에 따르면, pRET1100 및 pRET1000의 양쪽 플라스미드에 관해 이들 영역의 염기서열에 관한 정보를 취득할 수 있다.
우선, 플라스미드 pRET1100에서 DNA 복제 영역으로서는 서열번호 35 내지 37에 기재된 염기서열이 동정된다. 또한, DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역으로서는 서열번호 1 내지 3에 기재된 염기서열(orf1), 서열번호 4에 기재된 염기서열(orf2), 서열번호 5 내지 16에 기재된 염기서열(orf3), 서열번호 17-21에 기재된 염기서열(orf4), 서열번호 22 내지 26에 기재된 염기서열(orf5), 서열번호 27 또는 28에 기재된 염기서열(orf6), 염기서열번호 29 또는 30에 기재된 염기서열(orf7), 서열번호 31 또는 32에 기재된 염기서열(orf8), 서열번호 33 또는 34에 기재된 염기서열(orf9)이 동정된다.
pRET1100으로부터 DNA 복제할 수 있는 플라스미드를 작제하기 위해서는 이러한 재조합 플라스미드는 상기 DNA 복제 영역을 1개 이상과 상기 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역(orf)을 1개 이상 구비하는 것이 필요하다. 따라서 본 발명의 플라스미드(재조합형)은 이러한 DNA 복제 영역을 1개 이상과 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역을 1개 이상 포함하는 것을 특징으로 한다. 여기서, DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역은 서열번호 1, 4, 14, 17 및 22에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.
서열번호 76에 기재된 염기서열의 영역은 복제에 관계하는 단백질의 발현에 관여하는 프로모터인 것이 시사되어 있으며 본 발명의 플라스미드는 서열번호 76에 기재된 염기서열을 갖는 프로모터 영역을 함유하고 있는 것이 바람직하다.
플라스미드 작제에서는 상기한 염기서열 정보에 기초하여, DNA 단편을 적절하게 선택하여, 작제할 수 있다. 또한, 본 발명은 당해 플라스미드의 유도체 또는 기능적인(DNA 복제) 단편을 함유한다.
다음에 플라스미드 pRET1000에서 DNA 복제 영역으로서는 서열번호 70 내지 72에 기재된 염기서열이 동정된다. 또한, DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역으로서는 서열번호 38 내지 41에 기재된 염기서열(orf10), 서열번호 42 또는 43에 기재된 염기서열(orf11), 서열번호 44에 기재된 염기서열(orf12), 서열번호 45 또는 46에 기재된 염기서열(orf13), 서열번호 48 내지 50에 기재된 염기서열(orf14), 서열번호 51 또는 52에 기재된 염기서열(orf15), 서열번호 53 또는 54에 기재된 염기서열(orf16), 서열번호 55에 기재된 염기서열(orf17), 서열번호 56 내지 60에 기재된 염기서열(orf18), 서열번호 61에 기재된 염기서열(orf19), 서열번호 62에 기재된 염기서열(orf20), 서열번호 63 내지 69에 기재된 염기서열(orf21)이 동정된다.
pRET1000으로부터 DNA 복제할 수 있는 플라스미드를 작제하기 위해서는 이러한 재조합 플라스미드는 상기 DNA 복제 영역을 1개 이상과 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역(orf)을 1개 이상 구비하는 것이 필요하다. 따라서, 본 발명의 플라스미드(재조합형)은 이러한 DNA 복제 영역을 1개 이상과 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역을 1개 이상 포함하는 것을 특징으로 한다. 여기서, DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역은 서열번호 40, 42, 44, 45, 53, 55, 56, 61, 62 및 69에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.
서열번호 67 및 47에 기재된 염기서열의 영역은 접합 단백질(mobilization protein)과 상동성이 있으며 접합에 관여하는 것으로 시사되어 있다. 또한, 서열번호 75에 기재된 염기서열의 영역은 접합 단백질 유전자의 발현에 관여하는 것 또는 발현 단백질의 인지 부위인 것으로 시사되어 있다. 따라서, 본 발명의 플라스미드는 서열번호 67 및 47에 기재된 염기서열을 갖는 접합 단백질 영역을 함유하고 있는 것 또는 서열번호 75에 기재된 염기서열을 갖는 접합에 관한 영역을 함유하고 있는 것이 바람직하다.
플라스미드 작제에서는 상기한 염기서열 정보에 기초하여, DNA 단편을 적절하게 선택하여, 작제할 수 있다. 또한, 본 발명은 당해 플라스미드의 유도체 또는 기능적인(DNA 복제) 단편을 함유한다.
본 발명의 플라스미드 또는 DNA 단편은 DNA 복제 영역, DNA 복제 관련 단백질 암호화 영역, 프로모터 영역, 접합 단백질 영역, 접합에 관한 영역 또는 이들의 일부에서, 각각의 영역의 기능이 손상되지 않는 한, 1 또는 복수개의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 염기서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 셔틀 벡터는 본 발명의 DNA 복제 영역, DNA 복제 관련 단백질 암호화 영역, 프로모터 영역, 접합 단백질 영역, 접합에 관한 영역의 어느 하나에 기재된 플라스미드 또는 DNA 단편과 대장균 내에서 복제할 수 있는 DNA 영역을 함유하며, 로도코커스 속 균 및 대장균 내에서 복제할 수 있는 것이면 양호하며, 예를 들면, 서열번호 89 내지 서열번호 100의 염기서열을 갖는 것을 들 수 있다. 본 발명의 셔틀 벡터는 로도코커스 속 균 및 대장균 내에서 복제할 수 있는 것이면, 당해 염기서열에 1 또는 복수개의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 염기서열을 가질 수 있다.
상기 「복수개」란 영역의 종류에 따라서도 상이하지만, 구체적으로는 2 내지 1100개, 바람직하게는 2 내지 800개, 보다 바람직하게는 2 내지 300개이다. 더욱 바람직하게는 2 내지 100개, 보다 더욱 바람직하게는 2 내지 20개, 가장 바람직하게는 2 내지 10개이다.
또한, 상기와 같은 DNA 복제 영역, DNA 복제 관련 단백질 암호화 영역, 프로모터 영역, 접합 단백질 영역, 접합에 관한 영역 또는 이들의 일부와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 플라스미드 또는 DNA 단편으로서 구체적으로는 DNA 복제 영역, DNA 복제 관련 단백질 암호화 영역, 프로모터 영역, 접합 단백질 영역, 접합에 관한 영역 또는 이들의 일부와 엄중 조건하에 하이브리드화하는 염기서열을 들 수 있다. 「엄중 조건」이란 소위 특이적인 하이브리드가 형성되며, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 이러한 조건을 명확하게 수치화하는 것은 곤란하지만, 일례를 기재하면, 상동성이 높은 DNA끼리, 예를 들면, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA끼리는 하이브리드화하며, 이보다 상동성이 낮은 DNA끼리는 하이브리드화하지 않는 조건을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 통상적인 서던 하이브리드화의 세정 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염농도로 하이브리드화하는 조건을 들 수 있다. DNA 복제 영역, DNA 복제 관련 단백질 암호화 영역, 프로모터 영역, 접합 단백질 영역, 접합에 관한 영역의 일부가 300bp 정도의 길이의 DNA 단편을 사용하는 경우에는 하이브리드화의 세정 조건으로서는 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS를 들 수 있다.
상기와 같은 DNA 복제 영역, DNA 복제 관련 단백질 암호화 영역, 프로모터 영역, 접합 단백질 영역, 접합에 관한 영역 또는 이들의 일부와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 플라스미드 또는 DNA 단편은 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 따라 특정한 부위의 뉴클레오타이드에서 치환, 결실 또는 삽입을 함유하도록 DNA 복제 영역, DNA 복제 관련 단백질 암호화 영역, 프로모터 영역, 접합 단백질 영역, 접합에 관한 영역 또는 이들의 일부를 변화시킴으로써 취득할 수 있다. 또한, 상기와 같은 변형된 DNA는 종래부터 공지되어 있는 변이처리에 의해 취득될 수 있다. 변이처리로서는 DNA 복제 영역, DNA 복제 관련 단백질 암호화 영역, 프로모터 영역, 접합 단백질 영역, 접합에 관한 영역 또는 이들의 일부를 포함하는 DNA를 하이드록실아민 등으로 시험관내 처리하는 방법 및 동 DNA를 유지하는 미생물, 예를 들면, 에스케리치아 속 세균을 자외선 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 EMS 등의 통상적인 변이처리에 사용되고 있는 변이제에 의해 처리하는 방법을 들 수 있다.
또한, 상기와 같은 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입에는 로도코커스 속 균의 균주에 따른 상이함 등의 천연 변이(돌연변이체 또는 변이체)도 포함된다.
본 발명의 셔틀 벡터는 상기한 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편(A) 및 대장균 내에서 복제할 수 있는 DNA 영역(B)을 함유한다. 또한, 이러한 셔틀 벡터는 경우에 따라 약제 내성 유전자를 포함하는 DNA 영역을 함유할 수 있으며 이것이 바람직하다. 당해 기술분야에서, 일반적으로 「셔틀 벡터」란 2종류의 세포의 DNA 복제 기구를 포함하며, 바람직하게는 또한 선택마커로서 약제 내성 유전자 등을 함유하는 이의 2종류의 세포속에서 자율복제할 수 있는 벡터를 말한다. 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편(A)은 로도코커스 속 균 중에서 복제할 수 있는 DNA 영역이다. 대장균 내에서 복제할 수 있는 DNA 영역(B)은 대장균 내에서 복제 증식할 수 있는 플라스미드이면, 플라스미드 전체라도 양호하며 또는 이의 일부라도 양호하다. 대장균 내에서 복제할 수 있는 DNA 영역으로서는 예를 들면, pUC18, pHSG299, pHSG398 등의 플라스미드를 사용할 수 있다.
본 발명의 셔틀 벡터가 약제 내성 유전자를 포함하는 경우, 암피실린 내성 유전자, 가나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자 등이 적합하게 사용되지만, 숙주로 되는 로도코커스 속 균 및 대장균 내에서 발현하여, 숙주 세포에 약제 내성을 부여할 수 있으며 양쪽 균 속 간에 약제 내성능에 의해 플라스미드의 존재를 확인할 수 있는 것이면, 약제의 종류에 한정은 없다. 또한, 이러한 약제 내성 유전자를 복수개, 사용할 수 있다.
셔틀 벡터에는 복수의 클로닝 부위(멀티클로닝 부위)가 포함되는 것이 바람직하며 이러한 클로닝 부위와 약제 내성 유전자는 예를 들면, 대장균 플라스미드로부터 유도될 수 있다. 즉, 상기에서 열거한 공지된 대장균 플라스미드를 적당한 제한효소에 의해 절단하여, 클로닝 부위와 약제 내성 유전자를 포함하는 DNA 영역을 작제하며, 다른쪽의 DNA 단편(로도코커스 속 균 중에서 복제할 수 있는 DNA 영역)과 연결한다.
실례로서, 셔틀 벡터 작제의 개략을 도 3 내지 5에 도시한다. 셔틀 벡터는 상기 플라스미드 및 대장균 유래의 플라스미드를 적절한 제한효소로 처리한 다음, 양자를 연결함으로써 작제할 수 있다. 이와 같이 하여, 본 발명자 등은 로도코커스 속 균의 플라스미드 pRET1000, pRET1100 및 pRET1200과 대장균의 플라스미드 pUC18, pHSG299 및 pHSG398을 사용하여 18종류의 셔틀 벡터(표 5)를 작제한다.
본 발명의 셔틀 벡터는 로도코커스 속 균 또는 대장균을 숙주로 할 수 있으며 이들의 어떤 것도 복제할 수 있으며 공업적으로 이용할 수 있다. 본 발명의 셔틀 벡터에 의해 형질전환된 로도코커스 속 균 또는 대장균, 또한 기타 미생물의 형질전환체는 이와 같이 유용하며, 이들 형질전환체도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 벡터는 본 발명의 셔틀 벡터를 사용하여 작제하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명의 셔틀 벡터에 도입하고 싶은 표적 DNA가 삽입되어 있는 벡터이다. 도입하고 싶은 DNA 및 본 발명의 셔틀 벡터를 적절한 제한효소로 처리한 다음, 양자를 연결하는 것으로, 이러한 벡터를 작제할 수 있다. 이러한 벡터를 이용하는 것으로, 원하는 DNA를 도입한 형질전환체를 수득할 수 있다.
삽입하는 DNA로서는 예를 들면, 아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자나 보효소 재생계 효소 유전자를 들 수 있다. 아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자는 WO 02/070714에 기재되어 있는 아미노케톤 비대칭 환원효소를 암호화하는 유전자이며, 보다 구체적으로는 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질(알. 에리트로폴리스 MAK-34주 유래의 아미노케톤 비대칭 환원효소)을 암호화하는 DNA이며, 특히 서열번호 79에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA이다. WO 02/070714에 기재되어 있는 내용도 모두 본 명세서에 포함된다.
아미노케톤 비대칭 환원효소는 WO 02/070714에 기재되어 있는 성질을 가지고 있으면 양호하며, 서열 목록의 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 아미노산 서열에서 1개 또는 복수의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며 또한, 아미노케톤 비대칭 환원활성을 갖는 단백질도 포함된다. 여기서, 아미노케톤 비대칭 환원활성이란 화학식 1의 α-아미노케톤을 기질로 하여 화학식 2의 광학활성인 아미노알콜을 생성하는 활성을 말한다.
이러한 결실, 삽입, 치환, 부가를 실시하는 방법으로서는 특별한 제한은 없으며 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 일본생화학회편, 「속생화학실험 강좌1, 유전자연구법II」, p105(히로세 스스무), 도쿄화학동인(1986); 일본생화학회편, 「신생화학실험 강좌2, 핵산III(재조합 DNA 기술)」, p233(히로세 스스무), 도쿄화학동인(1992); R. Wu, L. Grossman편, "Methods III Enzymology", Vol. 154, p.350 & p.367, Academic Press, New York(1987); R. Wu, L. Grossman편, "Methods III Enzymology", Vol. 100, p.457 & p.468, Academic Press, New York(1983); J.A. Wells 등, "Gene", Vol. 34, p.315(1985); T. Grundstroem 등, "Nucleic Acids Res, Vol. 13, p.3305(1985); J. Taylor 등, "Nucleic Acids Res.", Vol. 13, p.8765(1985); R. Wu편, "Methods III Enzymology", Vol. 155, p.568, Academic Press, New York(1987); A.R. Oliphant 등, "Gene", Vol. 44, p.177(1986)에 기재된 방법을 들 수 있다. 구체적으로는 예를 들면, 합성 올리고 뉴클레오타이드 등을 이용하는 위치 지정 변이 도입법(부위 특이적 변이 도입법), Kunkel법, dNTP[αS]법(Eckstein)법, 아황산이나 아질산 등을 사용하는 영역 지정 변이 도입법 등의 방법을 들 수 있다.
또한, 다수의 단백질에는 당쇄가 부가되어 있는 경우가 있으며 아미노산을 1개 또는 복수 치환함으로써 당쇄의 부가를 조절할 수 있다. 따라서, 서열 목록의 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열에서 당쇄가 조절된 단백질도 상기한 아미노케톤 비대칭 환원활성을 갖는 한, 본 발명의 아미노케톤 비대칭 환원효소에 포함된다.
또한 본 발명의 아미노케톤 비대칭 환원효소는 화학적인 수법으로 여기에 함유되는 아미노산 잔기를 개질할 수 있으며 펩티다제, 예를 들면, 펩신, 키모트립신, 파파인, 브로멜라인, 엔도펩티다제, 엑소펩티다제 등의 효소를 사용하여 개질하거나, 부분 분해하거나 하여 이의 유도체로 변형시킬 수 있다.
또한, 유전자 재조합법으로 제조할 때에 융합 단백질로서 발현시켜 생체내 또는 생체외에서 천연의 아미노케톤 비대칭 환원효소와 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖고 있는 것으로 변환·가공할 수 있다. 이 경우, 유전공학적으로 상용되는 융합생성법을 사용할 수 있지만, 이러한 융합 단백질은 이의 융합부를 이용하여 친화성 크로마토그래피 등으로 정제할 수 있다. 단백질의 구조의 개질·변형 등은 예를 들면, 일본생화학회편, 「신생화학실험 강좌1, 단백질VII, 단백질공학」, 도쿄화학동인(1993)을 참고로 하여, 여기에 기재된 방법 또는 여기에 인용된 문헌 기재된 방법, 또한 이들과 실질적으로 동일한 방법으로 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 아미노케톤 비대칭 환원효소는 1개 이상의 아미노산 잔기가 동일성 측면에서 천연의 것과 상이한 것, 1개 이상의 아미노산 잔기의 위치가 천연의 것과 상이할 수 있다. 본 발명은 천연의 아미노케톤 비대칭 환원효소에 특유한 아미노산 잔기가 1개 이상(예: 1 내지 80개, 바람직하게는 1 내지 60개, 보다 바람직하게는 1 내지 40개, 더욱 바람직하게는 1 내지 20개, 특히는 1 내지 10개 등) 결실되어 있는 결실 유연체, 특유의 아미노산 잔기의 1개 이상(예: 1 내지 80개, 바람직하게는 1 내지 60개, 보다 바람직하게는 1 내지 40개, 더욱 바람직하게는 1 내지 20개, 특히는 1 내지 10개 등)이 다른 잔기로 치환되어 있는 치환 유연체, 1개 이상(예: 1 내지 80개, 바람직하게는 1 내지 60개, 보다 바람직하게는 1 내지 40개, 더욱 바람직하게는 1 내지 20개, 특히는 1 내지 10개 등)의 아미노산 잔기가 부가되어 있는 부가 유연체도 포함된다. 천연의 아미노케톤 비대칭 환원효소의 특징인 도메인 구조를 갖는 것도 포함될 수 있다. 또한, 동질의 아미노케톤 비대칭 환원효소 활성을 갖는 것도 들 수 있다.
천연의 아미노케톤 비대칭 환원효소의 특징인 도메인 구조가 유지되어 있으면, 상기한 바와 같이 변이체는 모두 본 발명의 아미노케톤 비대칭 환원효소에 포함된다. 또한 본 발명의 천연의 아미노케톤 비대칭 환원효소와 실질적으로 동등한 1차 구조 형태 또는 이의 일부를 갖고 있는 것도 포함될 수 있다고 생각되며, 또한 천연의 아미노케톤 비대칭 환원효소와 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖는 것도 포함될 수 있다고 생각된다. 또한 천연에서 생기는 변이체의 하나일 수 있다. 이러한 본 발명의 아미노케톤 비대칭 환원효소는 하기에서 설명한 바와 같이 분리·정제처리될 수 있다. 한편에서는 이와 같이 해서 본 발명은 상기한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편, 그리고 천연의 특성의 전부 또는 일부를 갖는 아미노케톤 비대칭 환원효소의 폴리펩타이드, 또한 이의 유연체 또는 유도체를 암호화하는 DNA 단편도 포함된다. 당해 아미노케톤 비대칭 환원효소의 뉴클레오타이드는 개질(예: 부가, 제거, 치환 등)될 수 있으며 이러한 개질된 것도 포함될 수 있다.
본 발명의 아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자는 상기한 아미노케톤 비대칭 환원효소를 암호화하는 핵산이다. 대표적으로는 서열 목록의 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산, 특히 서열번호 79에 기재된 염기서열을 갖는 핵산을 들 수 있지만, 하나의 아미노산을 암호화하는 염기서열(코돈)은 복수 존재하므로 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산은 다수 존재한다. 따라 이러한 핵산도 본 발명의 아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자에 포함된다. 여기서, 「단백질을 암호화한다」란 DNA가 2본쇄인 경우에는 상보 2본쇄의 어느 한쪽이 단백질을 암호화하는 염기서열을 갖는 것을 함유하는 것을 의미하므로, 본 발명의 핵산에는 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열을 직접 암호화하는 염기서열로 이루어진 핵산 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 핵산도 포함된다. 또한, 본 발명에 따른 아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자는 서열번호 79와 상보적인 염기서열로 이루어진 핵산과 엄중 조건하에 하이브리드화하며, 또한 아미노케톤 비대칭 환원활성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산일 수 있다. 여기서, 「엄중 조건」이란 상기 정의와 동일하다.
보효소 재생계 효소 유전자는 각종 탈수소 효소, 즉 글루코스 탈수소 효소, 글루코스6인산 탈수소 효소, 알데히드 탈수소 효소, 알콜 탈수소 효소, 유기산 탈수소 효소 및 아미노산 탈수소 효소 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 아세트알데히드 탈수소 효소, 에탄올 탈수소 효소, 프로판올 탈수소 효소, 글리세롤 탈수소 효소, 포름산 탈수소 효소, 아세트산 탈수소 효소, 부티르산 탈수소 효소, 락트산 탈수소 효소, 말산 탈수소 효소 및 글루탐산 탈수소 효소 등이 적절하게 이용된다.
본 발명의 형질전환체는 상기 벡터를 포함하는 것을 특징으로 한다. 형질전환체는 숙주 세포에 상기 벡터를 도입함으로써 수득된다. 벡터의 도입방법은 공지된 방법, 예를 들면, 인산칼슘법, 리포펙션법, 전기천공법, 미세주입법 등으로 실시할 수 있다.
예를 들면, 아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자가 삽입된 벡터를 포함하는 본 발명의 형질전환체는 아미노케톤 비대칭 환원활성을 갖고 있으며 하기의 아미노케톤 비대칭 환원효소의 제조방법이나 광학활성 아미노알콜의 제조방법에 응용할 수 있다.
본 발명의 아미노케톤 비대칭 환원효소의 제조방법은 아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자가 삽입된 벡터를 포함하는 형질전환체를 당해 형질전환체가 증식할 수 있는 배지에서 배양하는 배양공정과, 상기 배양공정에서 수득되는 당해 형질전환체로부터 아미노케톤 비대칭 환원효소를 정제하는 정제공정을 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 배양 방법으로서는 사용하는 균체가 생육할 수 있는 조건이면 특별한 제한은 없으며 공지된 방법을 사용할 수 있으며 통상적으로 탄소원, 질소원, 기타 양분을 함유하는 액체 배지가 사용된다. 배지의 탄소원으로서는 상기 균체를 이용할 수 있으면 어떤 것도 사용할 수 있다. 구체적으로는 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 덱스트린, 전분, 소르비톨 등의 당류, 메탄올, 에탄올, 글리세롤 등의 알콜류, 푸마르산, 시트르산, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산류 및 이의 염류, 파라핀 등의 탄화수소류 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다. 질소원으로서는 균체가 이용할 수 있으면 어떤 것도 사용할 수 있다. 구체적으로는 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산의 암모늄염; 푸마르산암모늄, 시트르산암모늄 등의 유기산의 암모늄염; 질산나트륨, 질산칼륨 등의 질산염; 고기 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 펩톤 등의 무기 또는 유기 질소 함유 화합물 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다. 또한, 배지에는 무기염, 미량 금속염, 비타민류 등의 통상적인 배양에 사용되는 영양원을 적절하게 첨가할 수 있다. 또한, 필요에 따라 배지에는 균체의 증식을 촉진하는 물질, 배지의 pH 유지에 효과적인 완충물질 등을 첨가할 수 있다.
균체의 배양은 생육에 적합한 조건하에 실시할 수 있다. 구체적으로는 배지의 pH 3 내지 10, 바람직하게는 4 내지 9, 온도 0 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃에서 할 수 있다. 균체의 배양은 호기적 또는 혐기적 조건하에 실시할 수 있다. 배양시간은 10 내지 150시간이 바람직하지만, 각각의 균체에 의해 적절하게 결정되어야 한다.
이와 같이 배양된 균체의 배양액을 여과 또는 원심분리하여, 이러한 균체를 물 또는 완충액으로 잘 세정한다. 세정한 균체는 적량의 완충액에 현탁하며 균체를 파쇄한다. 파쇄방법으로서는 특별한 제한은 없지만, 예를 들면, 유발, 다이노밀, 프렌치 프레스, 초음파 파쇄기 등의 기계적 파쇄법을 들 수 있다. 수득된 균체의 파쇄액 중에서, 고형물을 여과 또는 원심분리에 의해서 제거하여 수득된 무세포 추출액 중의 아미노케톤 비대칭 환원효소는 효소 분리의 통상적인 방법에 따라 채취된다.
이러한 효소 분리방법으로서는 특별한 제한은 없으며 공지된 방법을 사용할 수 있지만, 예를 들면, 황산암모늄 침전법 등의 염석; 세파덱스 등에 의한 겔 여과법; 디에틸아미노에틸기 또는 카복시메틸기 등을 가지는 담체 등을 사용하는 이온교환 크로마토그래피법; 부틸기, 옥틸기, 페닐기 등의 소수성기를 가지는 담체 등을 사용하는 소수성 크로마토그래피법; 색소 겔 크로마토그래피법; 전기영동법; 투석; 한외여과법; 친화성 크로마토그래피; 고속 액체 크로마토그래피법 등에 의해 정제할 수 있다.
또한, 상기 효소를 고정화 효소로서 사용할 수 있다. 이러한 방법으로서는 특별한 제한은 없으며 공지된 방법을 사용할 수 있지만, 효소 또는 효소 생성세포를 고정화한 것을 들 수 있으며 공유결합법이나 흡착법이라는 담체 결합법, 가교법, 포괄법 등에 의해 고정화할 수 있다. 또한, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌디이소시아네이트, 헥사메틸렌디이소티오시아네이트 등의 축합제를 필요에 따라 사용할 수 있다. 또한, 다른 고정화법으로서는 예를 들면, 단량체를 중합반응으로 겔화시켜 실시하는 단량체법; 통상적인 단량체보다 큰 분자를 중합시키는 예비 중합체법; 중합체를 겔화시켜 실시하는 중합체법; 폴리아크릴아미드를 사용하는 고정화; 알긴산, 콜라겐, 젤라틴, 한천, κ-카라기난 등의 천연 고분자를 사용하는 고정화, 광경화성 수지, 우레탄 중합체 등의 합성 고분자를 사용하는 고정화를 들 수 있다.
이와 같이 정제된 효소는 전기영동(SDS-PAGE 등)에 의해 단일 밴드가 확인되면 정제가 충분하게 실시된 것으로 판단된다.
본 발명의 광학활성 아미노알콜의 제조방법은 화학식 1의 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물에 본 발명에 따르는 제조방법으로 수득되는 아미노케톤 비대칭 환원효소를 작용시켜 화학식 2의 원하는 광학활성을 갖는 아미노알콜 화합물을 생성시키는 것을 특징으로 한다.
화학식 1
Figure 112006030365759-PCT00008
화학식 2
Figure 112006030365759-PCT00009
상기식에서,
X는 동일하거나 상이할 수 있으며 할로겐 원자, 저급 알킬기, 보호기로 보호될 수 있는 하이드록실기, 니트로기 및 설포닐기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며;
n은 0 내지 3의 정수이며;
R1은 저급 알킬기이며;
R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있으며 수소원자 및 저급 알킬기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며;
*는 비대칭탄소이다.
우선 본 발명에 따른 화학식 1의 α-아미노케톤에 관해서 설명한다.
치환기 X에 관해서 설명한다. 할로겐 원자로서는 불소원자, 염소원자, 브롬원자 및 요오드 원자 등을 들 수 있다.
또한 저급 알킬기로서는 탄소수 1 내지 6의 알킬기가 바람직하며 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, s-부틸기, t-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기 및 헥실기 등을 들 수 있다. 이들은 직쇄상 또는 측쇄상의 어느 하나의 구조를 취할 수 있다. 또한, 치환기로서, 불소원자나 염소원자 등의 할로겐 원자, 하이드록실기, 알킬기, 아미노기 또는 알콕시기 등을 가질 수 있다.
보호기로 보호될 수 있는 하이드록실기의 보호기로서는 물로 처리하여 제거할 수 있는 것, 산 또는 약염기로 제거할 수 있는 것, 수소를 첨가하여 제거할 수 있는 것, 루이스산 촉매 및 티오요소 등으로 제거할 수 있는 것 등을 들 수 있으며 상기 보호기에는 치환기를 가질 수 있는 아실기, 치환기를 가질 수 있는 실릴기, 알콕시알킬기, 치환기를 가질 수 있는 저급 알킬기, 벤질기, p-메톡시벤질기, 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐기, 알릴옥시카보닐기 및 트리틸기 등이 포함된다.
또한, 상기 아실기에는 아세틸기, 클로로아세틸기, 디클로로아세틸기, 피발로일기, 벤조일기 및 p-니트로벤조일기 등이 포함된다. 또한, 치환기로서 하이드록실기, 알킬기, 알콕시기, 니트로기 및 할로겐 원자 등을 가질 수 있다. 상기 실릴기에는 트리메틸실릴기, t-부틸디메틸실릴기 및 트리아릴실릴기 등이 포함된다. 또한, 치환기로서 알킬기, 아릴기, 하이드록실기, 알콕시기, 니트로기 및 할로겐 원자 등의 치환기를 가질 수 있다. 알콕시알킬기에는 메톡시메틸기 및 2-메톡시에톡시메틸기 등이 포함된다. 저급 알킬기에는 탄소수 1 내지 6의 알킬기가 포함되며, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, s-부틸기, t-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기 및 헥실기 등을 들 수 있다. 이들은 직쇄상 또는 측쇄상의 어느 하나의 구조를 취할 수 있다. 또한, 치환기로서, 불소원자나 염소원자 등의 할로겐 원자, 하이드록실기, 알킬기, 아미노기 및 알콕시기 등을 가질 수 있다.
또한, X는 니트로기 또는 설포닐기일 수 있으며 구체적으로는 메틸설포닐기 등을 들 수 있다.
또한, X의 수 n은 0 내지 3의 정수이며, 바람직하게는 O이다.
또한, 화학식 1 중의 R1은 저급 알킬기이다. 이러한 저급 알킬기로서는 탄소수 1 내지 6의 알킬기가 바람직하며 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, s-부틸기, t-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기 및 헥실기 등을 들 수 있다. 이들은 직쇄상 또는 측쇄상의 어느 하나의 구조를 취할 수 있다.
R2 및 R3은 수소원자 또는 저급 알킬기이다. 저급 알킬기에는 탄소수 1 내지 6의 알킬기가 포함되며 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, s-부틸기, t-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기 및 헥실기 등을 들 수 있다. 이들은 직쇄상 또는 측쇄상의 어느 하나의 구조를 취할 수 있다.
또한, α-아미노케톤 화합물의 염으로서는 염산염, 황산염, 질산염, 인산염, 탄산염 등의 무기산의 염 또는 아세트산, 시트르산 등의 유기산의 염을 들 수 있다.
α-아미노케톤은 대응하는 1-페닐케톤 유도체의 α 탄소를 할로겐화, 예를 들면, 브롬화한 후, 브롬기 등의 할로겐을 아민에 치환함으로써 용이하게 합성할 수 있다[Ger.(East), 11, 332, Mar. 12, 1956].
다음에 본 발명에 따른 화학식 2의 광학활성 아미노알콜에 관해서 설명한다. 화학식 2에서 X, n, R1, R2, R3 및 *은 화학식 1에서의 정의와 동일하다. 또한 원하는 광학활성을 갖는 β-아미노알콜로서는 (1S,2S)아미노알콜을 들 수 있다. (1S,2S)아미노알콜의 구체적인 예로서 d-트레오-2-메틸아미노-1-페닐프로판올(d-슈도에페드린), d-트레오-2-디메틸아미노-1-페닐프로판올(d-메틸슈도에페드린), (1S,2S)-α-(1-아미노에틸)-벤질알콜(d-노르슈도에페드린), (1S,2S)-1-(p-하이드록시페닐)-2-메틸아미노-1-프로판올, (1S,2S)-α-(1-아미노에틸)-2,5-디메톡시-벤질알콜, (1S,2S)-1-(m-하이드록시페닐)-2-아미노-1-프로판올, (1S,2S)-1-(p-하이드록시페닐)-2-아미노-1-프로판올, (1S,2S)-1-페닐-2-에틸아미노-1-프로판올, (1S,2S)-1-페닐-2-아미노-1-부탄올, (1S,2S)-1-페닐-2-메틸아미노-1-부탄올 등을 들 수 있다.
원하는 광학활성을 갖는 화학식 2의 광학활성 아미노알콜이 생성되는 한, 아미노케톤 비대칭 환원효소를 작용시키는 조건은 특별히 한정되지 않지만, 당해 효소의 최적 pH는 8.1이며, 최적온도는 55℃인 점으로부터, pH 7-9 및 온도 30 내지 65℃의 조건에서 실시하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 광학활성 아미노알콜의 제조방법은 화학식 1의 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물에 본 발명의 형질전환체를 작용시켜 화학식 2의 원하는 광학활성 아미노알콜 화합물을 생성시키는 것을 특징으로 한다.
화학식 1
Figure 112006030365759-PCT00010
화학식 2
Figure 112006030365759-PCT00011
상기 반응을 실시할 때의 반응조건으로서는 예를 들면, 액체 배지에서 진탕 배양한 형질전환균을 집균하여, 수득된 균체에 아미노케톤 수용액(0.1 내지 10% 농도)를 가하며, pH를 6 내지 8로 조정하면서 온도 20 내지 40℃에서 수시간 내지 1일 동안 반응시키면 양호하다. 반응 종료후, 균체를 분리하여 반응액 중의 생성물을 분리함으로써 광학활성 아미노알콜을 수득할 수 있다. 여기서, 형질전환균의 처리 균체(건조 균체나 고정화 균체 등)이나 형질전환균으로부터 수득된 효소 또는 고정화 효소 등도 동일하게 하여 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 광학활성 아미노알콜의 제조방법에서는 화학식 3의 화합물 또는 약제학적으로 허용 되는 이의 염 또는 용매화물을 추가로 첨가하여 반응을 실시함으로써 보다 효율적으로 광학활성 아미노알콜을 제조할 수 있다.
화학식 3
Figure 112006030365759-PCT00012
상기식에서,
A는 화학식 Y 또는 화학식 Z이며,
화학식 Y
Figure 112006030365759-PCT00013
화학식 Z
Figure 112006030365759-PCT00014
R4는 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, R8과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환 또는 R8과 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이고,
R5는 수소원자, 탄소수 1 내지 3의 알킬기 또는 R6 또는 R9와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며,
R6은 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, R8과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환, R5 또는 R9와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며,
R7은 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이고,
R8은 수소원자, 카복실기, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기, R4와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격, R6과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환이며,
R9는 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시카보닐기, 치환기를 가질 수 있는 아실기, R5 또는 R6과 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며,
R10은 수소원자 또는 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이다.
화학식 3에서 탄소수 1 내지 3의 알킬기로서는 직쇄상 또는 측쇄상의 어느 하나의 기일 수 있으며 구체적으로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기 등을 들 수 있다. 또한, 탄소수 1 내지 6의 알킬기로서는 직쇄상, 측쇄상의 어느 하나일 수 있으며 구체적으로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, i-부틸기, s-부틸기, t-부틸기, 펜틸기 및 헥실기 등을 들 수 있다. 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환으로서는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐 및 사이클로데카닐 등을 들 수 있다.
헤테로 원자 1 내지 3개를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격에서 헤테로 원자로서는 질소원자, 산소원자, 황원자 등을 들 수 있으며 특히 바람직하게는 질소원자, 산소원자를 들 수 있으며 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격으로서는 피롤리딘, 피페리딘, 이미다졸리딘, 피페라진, 테트라하이드로푸란, 테트라하이드로피란, 테트라하이드로티오펜 및 모르폴린 등을 들 수 있다.
또한, 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시카보닐기로서는 메틸옥시카보닐기, 에틸옥시카보닐기, 이소프로필옥시카보닐기, 이소부틸옥시카보닐기 및 t-부틸옥시카보닐기 등을 들 수 있다. 아실기로서는 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 피발로일기, 벤조일기 및 발레릴기 등을 들 수 있다. 상기한 탄소수 1 내지 3 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시카보닐기 또는 아실기가 치환기를 갖는 경우에는 치환기의 종류, 치환 위치 및 치환기의 수에서 한정되지 않지만, 치환기로서는 예를 들면, 불소원자나 염소원자 등의 할로겐 원자, 하이드록실기, 알킬기, 카복실기, 아미노기, 알콕시기, 니트로기 및 아릴기 등을 들 수 있다. 또한, 약제학적으로 허용되는 염으로서는 염산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산의 염, 아세트산, 시트르산 등의 유기산의 염, Na, K, Mg, Ca, 암모니아 등의 무기 염기의 염 및 트리에틸아민, 사이클로헥실아민 등의 유기 염기의 염을 들 수 있다.
이러한 화학식 3의 화합물로서는 예를 들면, 1-아세틸아미노-2-하이드록시프로판, 1-메틸아미노-2-하이드록시프로판, 1-아미노-2-옥소프로판, 1-아미노-2-하이드록시사이클로펜탄, 1-아미노-2,3-디하이드록시프로판, L-트레오닌, 4-아미노-3-하이드록시부탄산, 1-아미노-2-옥소사이클로헥산, 모르폴린, 3-하이드록시피롤리딘, 3-하이드록시피페리딘, 2-아미노메틸-테트라하이드로푸란, 1-(2-하이드록시프로필)아미노-2-하이드록시프로판, 1-t-부틸옥시카보닐아미노-2-하이드록시프로판, 2-아미노-3-하이드록시부탄, DL-세린, 1-아미노-2-하이드록시프로판, 1-아미노-2-하이드록시부탄, 1-아미노-2-하이드록시사이클로헥산을 들 수 있다. 이들 중에서 비대칭 탄소원자를 갖는 화합물에서는 특별한 기재가 없는 한, 광학활성체 또는 라세미체일 수 있다.
이들 활성 유도제를 배지중에 첨가함으로써 균체의 활성이 유도되며, 다음에 광학활성인 β-아미노알콜의 생성은 무첨가시와 비교하여 효율적으로 진행된다. 활성 유도제는 각각 단독으로 사용하거나 또는 복수의 유도제의 혼합물로 사용할 수 있다. 이러한 활성 유도제의 첨가량은 배지에 대해 O.01 내지 10중량%가 바람직하다.
본 발명에 따른 β-아미노알콜의 제조에서의 반응방법으로서는 화학식 1의 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물에 상기 균체 또는 균체로부터 수득된 효소가 작용하여, 상응하는 화학식 2의 광학활성 β-아미노알콜 화합물을 생성하는 방법이면 특별히 한정되지 않으며 원료인 α-아미노케톤의 수용액에 완충액 또는 물 등으로 세정한 균체를 혼합하는 것으로 반응을 개시한다.
또한, 반응조건은 화학식 2의 광학활성 β-아미노알콜 화합물의 생성을 손상하지 않는 범위에서 선택할 수 있다. 균체량은 건조 균체로서, 라세미 아미노케톤에 대하여 바람직하게는 100분의 1 내지 1000배, 보다 바람직하게는 10분의 1 내지 100배이다. 또한, 기질인 라세미 아미노케톤의 농도는 바람직하게는 0.01 내지 20%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10%이다. 또한, 반응액의 pH는 바람직하게는 5 내지 9, 보다 바람직하게는 6 내지 8이며, 반응온도는 바람직하게는 10 내지 50℃, 보다 바람직하게는 20 내지 40℃이다. 또한, 반응시간은 5 내지 150시간이 바람직하지만, 각각의 균체에 따라 적절하게 결정되어야 한다.
또한, 반응을 보다 효율적으로 진행시키기 위해 글루코스 등의 당류, 아세트산 등의 유기산, 글리세롤 등의 에너지 물질을 첨가할 수 있다. 이들은 각각 단독으로 사용할 수 있으며 이들의 혼합물로 사용할 수 있다. 첨가량은 기질에 대하여 바람직하게는 100분의 1 내지 10배량이다. 또한, 보효소 등을 첨가할 수 있다. 보효소로서는 니코틴아미드아데닌디뉴클레오타이드(NAD), 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오타이드(NADH), 니코틴아미드아데닌디뉴클레오타이드인산(NADP), 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오타이드인산(NADPH) 등을 단독 또는 혼합물로 사용할 수 있으며 첨가량은 라세미 아미노케톤에 대하여 바람직하게는 1000분의 1 내지 5분의 1배량이다. 또한, 이들 보효소에 추가하여, 보효소 재생효소, 예를 들면, 글루코스데하이드로게나제를 첨가할 수 있으며 첨가량은 라세미 아미노케톤에 대하여 바람직하게는 1000분의 1 내지 5분의 1배량이다. 또한, 보효소 재생효소의 기질, 예를 들면, 글루코스를 첨가할 수 있으며 첨가량은 라세미 아미노케톤에 대하여 바람직하게는 100분의 1 내지 10배량이다. 또한, 글루코스 등의 당류, 아세트산 등의 유기산, 글리세롤등의 에너지물질, 보효소, 보효소 재생효소 및 보효소 재생효소의 기질을 각각 조합하여 사용할 수 있다. 이들은 원래, 균체중에 축적되어 있지만, 필요에 따라 이들 물질을 첨가함으로써 반응속도, 수율 등을 상승시킬 수 있는 경우가 있으며 적절하게 선택될 수 있다.
또한, 반응액이 상기한 바와 같이 되도록 특정한 염을 가하여, 당해 조건하에 반응시키면 미반응의 α-아미노케톤 이성체의 라세미화가 촉진되며, 균체 또는 균체로부터 수득된 효소의 기질로 되는 에난티오머로의 변환을 보다 효율적으로 진행시킬 수 있다. 이에 따라 원료로부터 50% 이상의 고수율로 목적하는 아미노알콜이 수득되는 경향이 있다.
미반응의 α-아미노케톤의 라세미화를 촉진하는 염으로서는 아세트산염, 타르타르산염, 벤조산염, 시트르산염, 말론산염, 인산염, 탄산염, 파라니트로페놀염, 아황산염 및 붕산염 등의 약산의 염이면 양호하지만, 바람직하게는 인산염(예: 인산2수소나트륨, 인산2수소칼륨, 인산2수소암모늄), 탄산염(예: 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산칼륨, 탄산암모늄), 시트르산염(예: 시트르산나트륨, 시트르산칼륨, 시트르산암모늄) 등이 사용된다. 또한, 이들의 혼합물도 사용할 수 있으며 pH 6.0 내지 8.0의 완충액으로서, 최종 농도가 0.01 내지 1M로 되도록 첨가하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 인산염의 경우, 인산2수소나트륨 및 인산1수소나트륨을 9:1 내지 5:95의 비율로 혼합하면 양호하다.
반응에 따라 생성된 광학활성 α-아미노알콜은 일반적으로 사용되는 분리 정제수단에 의해 정제할 수 있다. 예를 들면, 반응액으로부터 직접 또는 균체를 분리한 다음, 막 분리, 유기용매(예: 톨루엔, 클로로포름 등)에 의한 추출, 칼럼 크로마토그래피, 감압 농축, 증류, 결정 석출, 재결정 등의 통상적인 정제방법에 제공함으로써 광학활성 β-아미노알콜을 수득할 수 있다. 생성된 광학활성 β-아미노알콜의 광학순도는 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정할 수 있다.
이하, 실시예에 따라 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 하기의 실시예는 본 발명의 기술 범위를 한정하는 것이 아니다.
(실시예 1) 플라스미드의 분리 정제
(1)방법
로도코커스 속 균을 5mL의 GPY 배지(1% 글루코스, 0.5% 박토펩톤, 0.3% 효모 추출물)에 식균(植菌)하여, 25℃에서 진탕 배양한다. 대수 증식기에 100mg/mL의 암피실린 용액을 250μL 첨가하여, 25℃에서 2시간 동안 진탕 배양한다. 원심분리(12krpm, 5분 동안)로 집균하여, 상등액을 제거한 다음, 1mL의 50mM Tris(pH 7.5)로 현탁하며, 다시 원심분리(12krpm, 5분 동안)로 집균하고, 상등액을 제거한다. TE 용액[10mM Tris(pH 7.5), 1M M EDTA]에 용해된 250μL의 10mg/mL 리소자임 용액 으로 현탁하여, 37℃에서 30분 동안 방치한다. 다음에 100μL의 3M 식염수와 25μL의 10% SDS를 가하여, -20℃에서 밤새 방치한다. 원심분리(12krpm, 5분 동안)한 상등액에 50μg/mL 프로테이나제 K 및 50μg/mL RNase A를 각각 0.5μL 가하여, 37℃에서 15분 동안 방치한다. 다음에 등량의 페놀/클로로포름/이소아밀알콜 용액을 첨가하여, 원심분리(12krpm, 5분 동안)를 실시한다. 상등액에 2.5배량의 에탄올을 가하여, 원심분리(12krpm, 5분 동안)하며, 50μL의 멸균수에 침전을 용해한다. 플라스미드의 확인은 0.8% 아가로스 겔로 전기영동하여, 브롬화에티듐으로 염색한 후, UV 조사로 실시한다.
(2)공시(供 試) 균주 및 결과
본 실시예에서는 로도코커스 속 및 이의 유연균인 마이코박테리움(Mycobacterium) 속의 각종 입수할 수 있는 균주로부터 상기(1) 방법에 따라 플라스미드의 유무에 대해 스크리닝을 실시한다.
스크리닝한 균주중에서 플라스미드의 유지를 확인할 수 있는 것을 표3에 기재한다. 즉, 로도코커스 에리트로폴리스(IAM1400, IAM1503, JCM2893, JCM2894 및 JCM2895) 및 로도코커스 로드니(JCM3203)에서 각각 약 5.4kbp 및 약 5.8kbp의 플라스미드를 확인할 수 있다. 이들 플라스미드를 표3에 열거된 명칭과 같이 pRET1100, pRET1200, pRET1300, pRET1400, pRET1500, pRET1600, pRET1700, pRET1800, pRET0500, pRET1000이라고 명명한다(표 3).
또한, 알. 에리트로폴리스 IAM1400 및 IAM1503은 도쿄대학 분자세포생물학연구소가 발행한 「IAM Catalogue of StraIIIs, Third Edition, 2004」에 기재되어 있으며 당해 연구소에서 입수할 수 있다. 또한, 알. 에리트로폴리스 JCM2893, JCM2894 및 JCM2895, 및 알. 로드니 JCM3203은 독립행정법인 이화학연구소가 발행한 「JCM Catalogue of StraIIIs, Eighth Edition 2002」에 기재되어 있으며 당해 연구소에서 입수할 수 있다.
Figure 112006030365759-PCT00015
(실시예 2) 제한효소 부위의 특정
표 3에 기재된 플라스미드를 분류하기 위해 각종 제한효소를 사용하여, 제한효소 절단 부위를 조사한다. 각 플라스미드를 실시예1에 기재된 방법으로 분리한 다음, EcoRI, HindIII, PvuII, ScaI, SpHI, SmaI, SacI, BamHI 및 KpnI로 분해하며, 0.8% 아가로스 겔로 전기영동함으로써 DNA 단편을 확인한다. 크기 마커는 로딩 퀵 DNA 크기 마커 로딩 퀵 DNA 크기 마커(Loading Quick DNA size Marker) λ/EcoRI+HindIII 이중 분해(도요보)를 사용한다. 크기 마커를 기에 제한효소로 절단되는 부위의 수와 이의 단편의 크기를 결정한다. 결과를 표4에 정리한다.
Figure 112006030365759-PCT00016
()안은 크기 kbp
상기 해석의 결과, 표 3의 플라스미드는 pRET1100과 동일한 제한효소 부위를 유지하는 플라스미드류, pRET1200과 동일한 제한효소 부위를 유지하는 플라스미드류 및 pRET1000의 3종류로 분류된다.
(실시예 3) 플라스미드의 서열 및 상동성 검색
실시예 2의 결과로부터, 플라스미드가 3종류, 즉 pRET1000, pRET1100 및 pRET1200으로 분류되므로 각각의 플라스미드의 서열 분석을 수행한다.
우선, 염기서열을 결정하기 위해 이들 플라스미드류의 클로닝을 실시한다. 로도코커스 에리트로폴리스(IAM1400)에 관해서는 플라스미드(pRET1100, pRET1200)를 분리한 후, SmaI와 SacI로 분해한다. 0.8% 아가로스 겔로 전기영동하여, DNA 단편을 확인한 바, 약 0.5kbp, 약 1.7kbp, 약 3.7kbp, 약 4.9kbp의 DNA 단편을 확인할 수 있다. 이들 DNA 단편을 GFXTM PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트(Gel Band Purification Kit)(아마샴바이오사이언스사제)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하며, 삽입 DNA로 한다. 한편, 벡터 DNA로서는 pBluescriptII KS(-)를 SmaI 단독 또는 SmaI 및 SacI로 분해한 것을 사용한다. 삽입 DNA와 벡터 DNA를 Ligation high(도요보)를 사용하여 연결하여, 대장균 JM109를 형질전환시킨다. 수득된 형질전환체를 GFX 마이크로 플라스미드 프렙 키트(GFX Micro Plasmid Prep Kit)(아마샴바이오사이언스사제)를 사용하여 스크리닝하며, 각각의 클론을 수득한다.
한편, 로도코커스 로드니(JCM3203)에 관해서는 플라스미드(pRET1000)를 분리한 다음, BamHI로 분해한다. 0.8% 아가로스 겔로 전기영동한 바, 약 2.0kbp, 약 3.8kbp의 DNA 단편을 확인할 수 있다. 이들 DNA 단편을 상기한 키트를 사용하여 겔로부터 회수하며, 삽입 DNA로 한다. 벡터 DNA는 pBluescriptII KS(-)를 BamHI로 분해한 것을 사용한다.
플라스미드의 삽입체의 염기서열 결정은 프라이머 워킹법으로 실시한다. 기기는 ABI PRISMTM 31ONT 유전자 분석기, 효소는 빅 다이 터미네이터(Big Dye Terminator v3.1) 주기 서열분석 키트(Cycle Sequencing Kit)(ABI제)를 사용한다.
우선, P7(M13 정배향, 도요보) 프라이머 및 P8(M13 역배향, 도요보) 프라이머를 사용하여 삽입체의 염기서열의 일부를 해독한다. 다음에 해독한 서열내에 프라이머를 설계(서열 해석 소프트웨어인 DNA SIS Pro를 사용; 히타치소프트웨어사)하며, 설계한 프라이머(합성 올리고 DNA)를 사용하여 다시 염기서열을 해독한다. 이러한 순서를 삽입체의 염기서열이 모두 해독될 수 있을 때까지 반복한다. 삽입체의 염기서열 해독이 종료된 후, 이들 삽입체가 어떻게 연결되어 있느냐를 해석하기 위해 각각의 삽입체의 말단 방향으로 반응이 실시되도록 프라이머를 설계하여, 로도코커스 에리트로폴리스(IAM1400)로부터 분리한 플라스미드를 주형으로 하여 PCR을 실시한다(KOD Plus를 사용). 이러한 PCR 산물을 GFXTM PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 정제하며, PCR에 사용되는 프라이머와 동일한 프라이머를 사용하여 서열분석을 실시하며 삽입체의 정렬을 해석한다.
서열분석 결과, pRET1100은 5444bp로 이루어지며 이의 G+C 함량은 59%인 것을 알았다. 결정된 전체 염기서열을 서열 목록의 서열번호 73에 나타낸다. pRET1200은 5421bp로 이루어지고, G+C 함량은 62%이다. pRET1000은 5813bp로 이루어지고, G+C 함량은 67%이다. 결정된 전체 염기서열을 서열 목록의 서열번호 74에 기재한다.
이들의 결정된 염기서열을 DNA SIS Pro를 사용하여, 상동성 검색을 실시한 바, pRET1000 및 pRET1100은 신규한 플라스미드인 것이 판명됐다. 한편, pRET1200은 pN30(진 뱅크 승인 번호 AF312210)과 약 99.6%(pRET1200을 기초하여 계산) 상동성이 있다.
또한, pRET1000 및 pRET1100에 관해 결정된 염기서열을 기초하여 DNA SIS Pro를 사용하여, 공지된 플라스미드와 비교한다. 그 결과, 양쪽의 플라스미드에 관해 모든 제한효소 부위가 일치하는 플라스미드는 검출되지 않는다.
(실시예 4) 염기서열의 해석
pRET1100 및 pRET1000의 염기서열을 해석한 결과를 하기에 기재한다.
pRET1100에는 하기의 orf가 발견된다:
서열번호 73에 기재된 염기서열 위에 202번째, 238번째 또는 337번째로부터 480번째까지의 염기서열로 이루어진 orf1(서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3);
서열번호 73에 기재된 염기서열 위에 477번째로부터 758번째까지의 염기서열로 이루어진 orf2(서열번호 4);
서열번호 73에 기재된 염기서열 위에 862번째, 1294번째, 1450번째, 1462번째, 1486번째, 1489번째, 1513번째, 1630번째, 1645번째, 1687번째, 2224번째 또는 2227번째로부터 2409번째까지의 염기서열로 이루어진 orf3(서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16);
서열번호 73에 기재된 염기서열 위에 1875번째, 1734번째, 1701번째, 1674번째 또는 1581번째로부터 1444번째까지의 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 orf4(서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 또는 서열번호 21);
서열번호 73에 기재된 염기서열 위에 2828번째, 2792번째, 2747번째, 2594번째 또는 2540번째로부터 2406번째까지의 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 orf5(서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25 또는 서열번호 26);
서열번호 73에 기재된 염기서열 위에 2971번째 또는 3049번째로부터 3306번째까지의 염기서열로 이루어진 orf6(서열번호 27 또는 서열번호 28);
서열번호 73에 기재된 염기서열 위에 3577번째 또는 3571번째로부터 3053번째까지의 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 orf7(서열번호 29 또는 서열번호 30);
서열번호 73에 기재된 염기서열 위에 3339번째 또는 3648번째로부터 각각 3902번째까지의 염기서열로 이루어진 orf8(서열번호 31 또는 서열번호 32); 및
서열번호 73에 기재된 염기서열 위에 4366번째 또는 4477번째로부터 5034번째까지의 염기서열로 이루어진 orf9(서열번호 33 또는 서열번호 34).
pRET1000에는 하기의 orf가 발견된다:
서열번호 74에 기재된 염기서열 위에 3350번째, 3251번째, 2945번째 또는 2849번째로부터 2412번째까지의 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 orf10(서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40 또는 서열번호 41);
서열번호 74에 기재된 염기서열 위에 2365번째 또는 2332번째로부터 2159번째까지의 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 orf11(서열번호 42 또는 서열번호 43);
서열번호 74에 기재된 염기서열 위에 3197번째로부터 3526번째까지의 염기서열로 이루어진 orf12(서열번호 44);
서열번호 74에 기재된 염기서열 위에 4035번째 또는 3996번째로부터 3679번째까지의 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 orf13(서열번호 45 또는 서열번호 46);
서열번호 74에 기재된 염기서열 위에 4621번째, 4654번째 또는 4666번째로부터 4830번째까지의 염기서열로 이루어진 orf14(서열번호 48, 서열번호 49 또는 서열번호 50);
서열번호 74에 기재된 염기서열 위에 5161번째 또는 5062번째로부터 4709번째까지의 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 orf15(서열번호 51 또는 서열번호 52);
서열번호 74에 기재된 염기서열 위에 2331번째 또는 2334번째로부터 2618번째까지의 염기서열로 이루어진 orf16(서열번호 53 또는 서열번호 54);
서열번호 74에 기재된 염기서열 위에 2907번째로부터 3242번째까지의 염기서열로 이루어진 orf17(서열번호 55);
서열번호 74에 기재된 염기서열 위에 1650번째, 1689번째, 1713번째, 1827번째 또는 1875번째로부터 2162번째까지의 염기서열로 이루어진 orf18(서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59 또는 서열번호 60);
서열번호 74에 기재된 염기서열 위에 1906번째로부터 2169번째까지의 염기서열로 이루어진 orf19(서열번호 61);
서열번호 74에 기재된 염기서열 위에 810번째로부터 553번째까지의 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 orf20(서열번호 62);
서열번호 74에 기재된 염기서열 위에 117번째, 147번째, 306번째, 456번째, 5144번째, 5276번째 또는 5534번째로부터 656번째까지의 염기서열로 이루어진 orf21(서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68 또는 서열번호 69).
pRET1100에서 DNA 복제 영역은 서열번호 35에 기재된 염기서열(2410번째로부터 3200번째), 서열번호 36에 기재된 염기서열(1000번째로부터 1500번째) 또는 서열번호 37에 기재된 염기서열(5000번째로부터 500번째)로 나타내는 영역이다. pRET1000에서 DNA 복제 영역은 서열번호 70에 기재된 염기서열(3355번째로부터 3507번째), 서열번호 71에 기재된 염기서열(4290번째로부터 4350번째) 또는 서열번호 72에 기재된 염기서열(3570번째로부터 3894번째)로 나타내는 영역이다.
pRET1000(서열번호 74)의 염기서열 위에 5144번째로부터 656번째의 염기서열(서열번호 67)의 영역 및 4381번째로부터 4830번째의 염기서열(서열번호 47)의 영역은 접합 단백질과 상동성이 있으며 접합에 관여하는 것으로 시사된다.
또한, pRET1000(서열번호 74)의 염기서열 위에 4260번째로부터 4339번째의 염기서열(서열번호 75)의 영역에서는 DNA의 2차 구조가 추정되며, 상기 접합 단백질 유전자의 발현이나 발현된 단백질의 인지 부위인 것으로 시사된다.
한편, pRET1100(서열번호 73)의 염기서열 위에 761번째로부터 868번째의 염기서열(서열번호 76)의 영역은 복제에 관계되는 단백질의 발현에 관여하는 프로모터인 것으로 시사된다.
(실시예 5) 셔틀 벡터의 작제
로도코커스 속 균과 대장균 간의 셔틀 벡터를 작제하기 위해 로도코커스 속 균의 플라스미드 pRET1000, pRET1100 및 pRET1200과 대장균의 플라스미드 pUC18, pHSG299 및 pHSG398을 사용하여 하기의 실험을 실시한다.
우선, 알. 에리트로폴리스의 플라스미드로부터 DNA 단편을 조제한다. 즉, 알. 에리트로폴리스(IAM1400)로부터 플라스미드 pRET1100 및 pRET1200을 취득한 다음, Alw44I를 사용하여 pRET1100을 37℃에서 2시간 동안 분해하여, Blunting high(도요보)를 사용하여 평활 말단화함으로써, 한편 pRET1200은 BspLU11I를 사용하여 48℃에서 2시간 동안 분해하고, Blunting high를 사용하여 평활 말단화함으로써 알. 에리트로폴리스 플라스미드의 DNA 단편을 수득한다. 각각의 DNA 단편을 TE 용액에 용해한다.
한편, pRET1000에 관해서는 알. 로드니(JCM3203)로부터 플라스미드 pRET1000을 취득한 다음, DrdI를 사용하여 pRET1000을 37℃에서 2시간 동안 분해하며 Blunting high를 사용하여 평활 말단화함으로써 pRET1000의 DNA를 수득하며 이것을 TE 용액에 용해한다.
다음에 이. 콜리 플라스미드로부터 DNA 단편을 조제한다. 즉, pUC18[암피실린 내성 유전자(Ampr) 함유]는 SmaI를 사용하여 30℃에서 2시간 동안 분해함으로써 pHSG299[가나마이신 내성 유전자(Kmr) 함유] 및 pHSG398[클로람페니콜 내성 유전자(Cmr) 함유]는 HincII를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 분해함으로써 이. 콜리의 플라스미드의 DNA 단편을 수득하여 TE에 용해한다.
상기한 바와 같이 조제한 로도코커스 속 균 및 대장균의 플라스미드로부터 DNA 단편을 연결한 다음, 이를 사용하여 이. 콜리 DH5α를 형질전환시키고, 30μL의 0.1M IPTG(이소프로필-β-갈락토시드)와 4%의 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌-β-D-갈락토피라노시드)를 도포한다, 100μg/mL의 가나마이신, 100μg/mL의 암피실린 또는 30μg/mL의 클로람페니콜을 함유하는 LB(1% 트립토판, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨; pH 7.2) 한천 배지에 도말하여, 30℃에서 60시간 동안 방치한다. 출현된 콜로니 중에서 백색 콜로니를 선택하여 100μg/mL의 가나마이신, 100μg/mL의 암피실린 또는 30μg/mL의 클로람페니콜을 함유하는 LB 액체 배지에서 30℃, 60시간 동안 진탕 배양한다. 수득된 배양액으로부터 GFXTM 마이크로 플라스미드 프렙 키트(Micro Plasmid Prep Kit)(아마샴바이오사이언스사제, 상품 첨부 자료의 조건으로 정제)를 사용하여 DNA를 정제한다. 수득된 DNA를 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 확인한다. 수득된 셔틀 벡터를 표 5에 나타내고, pRET1100을 사용하는 각 셔틀 벡터의 작제방법을 도 3 내지 5에 기재한다.
Figure 112006030365759-PCT00017
pRET1100과 pUC18, pHSG299 또는 pHSG398로 구성되는 셔틀 벡터를 각각, pRET1101(서열번호 89), pRET1102(서열번호 90) 또는 pRET1103(서열번호 91)으로 명명한다. 또한, pRET1101은 암피실린 내성, pRET1102는 가나마이신 내성, pRET1103은 클로람페니콜 내성을 나타내는 셔틀 벡터이다. 또한, pRET1101 내지 1103의 각각의 대장균 유전자와 pRET1100의 결합 방법이 반대(Rv)인 셔틀 벡터를 각각 pRET1101Rv(서열번호 92), pRET1102Rv(서열번호 93) 및 pRET1103Rv(서열번호 94)로 명명한다.
동일하게 pRET1000 및 pRET1200을 사용하여 작제한 셔틀 벡터를 각각 pRET1001 내지 pRET1003(서열번호 95 내지 서열번호 97) 및 pRET1001Rv 내지 pRET1003Rv(서열번호 98 내지 서열번호 100) 및 pRET1201 내지 pRET1203 및 pRET1201Rv 내지 pRET1203Rv로 명명한다(표 5).
(실시예 6) 알. 에리트로폴리스로의 형질전환 방법의 검토
실시예 5에서 수득된 로도코커스 속 균-이. 콜리의 셔틀 벡터를 사용하여, 알. 에리트로폴리스 MAK-34주[MAK-34; 수탁번호 FERM BP-7451, 경제산업성 산업기술종합연구소 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터)로써 평성13년 2월15일에 수탁]를 형질전환시켰다. 유전자 도입방법으로서 전기천공법을 검토한다.
우선, 5mL의 GPY 배지에 알. 에리트로폴리스 MAK-34주를 식균하여, 30℃에서 36시간 동안 진탕 배양한다. 이러한 배양액 1mL를 100mL의 LB 배지에 계속 식균하고, 30℃에서 10시간 동안, 200rpm에서 배양한다. 배양한 균체를 원심분리(12krpm, 5분 동안, 4℃)에 의해 회수하며, 회수한 균체를 초순수로 2회 세정한다. 세정 종료된 균체를 원심분리(12krpm, 5분 동안, 4℃)에 의해 회수하고, 2.4mL의 10% 글리세롤 용액에 현탁한다. 현탁액을 300μL씩 분주하며, -80℃에서 동결하여 컴피턴트 세포로 한다.
작제한 컴피턴트 세포 90μL와 셔틀 벡터(pRET1001, pRET1002, pRET1003, pRET1101, pRET1102, pRET1103, pRET1201, pRET1202 및 pRET1203) 5μL를 빙상에서 혼합한다. 혼합 용액을 빙상에서 냉각한 0.1cm의 큐벳에 조용하게 흘려 넣고, 유전자 펄서 II 전기천공 시스템(Gene Pulser II Electroporation System)(BIO-RAD제)에 고정한다. 20kV/cm, 400Ω, 25μF에서 펄스한 즉시 300μL의 LB 배지를 가하여, 25℃에서 3시간 동안 방치한다.
당해 균 현탁액의 일부를 항생물질을 함유하는 LB 플레이트(100μg/mL의 가나마이신, 100μg/mL의 암피실린 또는 30μg/mL의 클로람페니콜)에 도말한다. 그 결과, 가나마이신 내성 유전자를 가지는 pRET1002, pRET1102 및 pRET1202를 사용하는 경우에 콜로니가 수득된다. 또한, 이와 같이 수득된 콜로니가 플라스미드를 유지하고 있느냐를 확인하기 위해 플라스미드를 분리하여 확인한 바, 전부 셔틀 벡터를 유지하고 있다.
이상으로부터, 전기천공에 의해 알. 에리트로폴리스를 형질전환할 수 있다는 것 및 pRET1002, pRET1102 및 pRET1202가 셔틀 벡터로서 기능하고 있는 것이 시사된다.
(실시예 7) 아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자(mak gene)의 취득
표 5에 기재된 셔틀 벡터에 mak 유전자를 삽입하기 위해 알. 에리트로폴리스 MAK-34주로부터 mak 유전자를 분리한다.
최초에 알. 에리트로폴리스 MAK-34주의 게놈 DNA의 취득을 실시한다. 5mL의 GPY 배지에 알. 에리트로폴리스 MAK-34주를 식균하여, 30℃에서 48시간 동안 진탕 배양한 다음, 이러한 배양액을 100mL의 GPY 배지에 계속 식균하고, 30℃에서 10시간 동안, 200rpm에서 배양한다. 게놈 DNA 완충액 세트(Genomic DNA Buffer set) 및 게놈 팁(Genomic-tip) 500/G(QIAGEN)를 사용하여 게놈 DNA를 취득한다.
다음에 취득한 게놈 DNA를 주형으로 하여 KOD-plus-를 사용하여 PCR을 실시한다. 프라이머는 MAKF1(5'-GAATCTTCTCGTTGATGCAGATCAGGTC-3'; 서열번호 80)과 MAKR2(5'-CTGACTCCGTAGTGTTCTGCCAGTTC-3'; 서열번호 81), 어닐링 온도 68℃, 신장 반응 1분 50초로 PCR을 실시한다. 수득된 PCR 산물을 페놀/클로로포름 처리 및 에탄올 침전시킨 다음, SmaI를 사용하여 30℃에서 2시간 동안 분해한 pUC18과 혼합하며, Ligation High를 사용하여 연결한다. Competent high(도요보)를 사용하여 이. 콜리 DH5α를 형질전환시키고, 30μL의 0.1M IPTG와 4%의 X-gal을 도포한 LB 한천 배지(100μg/mL의 암피실린을 함유)에 도말하여, 30℃에서 60시간 동안 방치한다. 출현된 콜로니 중에서 백색 콜로니를 선택하여 100μg/mL의 암피실린을 함유하는 LB 액체 배지에서 30℃, 60시간 동안 진탕 배양한다. 수득된 배양액으로부터 GFXTM 마이크로 플라스미드 프렙 키트를 사용하여 DNA 정제한다. 수득된 DNA를 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 확인한다. 수득된 클론을 pMAK-1로 명명한다.
(실시예 8) 발현 벡터의 작제-1
표 5에 기재된 셔틀 벡터에 프로모터 및 아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자(mak gene)를 삽입한다.
우선, mak 유전자의 상류 약 400bp를 포함하는 발현 벡터(외래 프로모터 없음)의 플라스미드를 작제한다.
pMAK-1을 SmaI를 사용하여 30℃에서 2시간 동안 분해한 다음, PstI를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 분해한다. 이러한 용액을 0.8% 아가로스 겔로 전기영동에 제공한다. DNA 크기 마커는 로딩 퀵 DNA 크기 마커 λ/EcoRI+HindIII 이중 분해를 사용한다. 전기 영동후, 약 1.4kbp의 DNA 단편을 GFXTM PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 정제하며, 이것을 삽입 DNA로서 사용한다. 한편, 벡터는 pRET1102를 HincII 및 PstI를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 분해한 것을 사용한다. 이들 DNA 단편을 Ligation High를 사용하여 연결하고, Competent high를 사용하여 이. 콜리 DH5α를 형질전환한다. 100μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하여, 30℃에서 60시간 동안 방치한다.
출현된 콜로니를 100μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB 액체 배지에서 30℃, 60시간 동안 진탕 배양한다. 수득된 배양액으로부터 GFXTM 마이크로 플라스미드 프렙 키트를 사용하여 DNA를 정제한다. 수득된 DNA를 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 확인한다.
스크리닝은 수득된 DNA를 제한효소 처리하지 않은 것 및 PstI를 사용하여 37℃ 2시간 동안 분해한 것을 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며, 수득된 DNA의 크기로부터 목적하는 플라스미드를 수득한다. 이때, 크기 마커는 로딩 퀵 DNA 크기 마커λ/EcoRI+HindIII 이중 분해, pRET1102 및 Psti를 사용하여 37℃ 2시간 동안 분해한 pRET1102를 사용한다. 이와 같이 하여 수득한 플라스미드를 pRET1104로 명명한다.
(실시예 9) 발현 벡터의 작제-2
발현 벡터의 개량, 유전자 변형, 형질전환 효율향상 및 균체내에서 복제 등에 있어서 벡터의 축소는 효과적이므로, 셔틀 벡터의 축소를 실시한다.
우선, 셔틀 벡터 pRET1102의 축소를 실시한다. pRET1102를 BamHI 및 HincII로 2시간 동안 분해한 다음, 0.8% 아가로스 전기영동에 제공하고, 약 2.7kbp의 DNA 단편을 GFXTM PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 회수하며 pRET1102의 DNA 단편을 조제한다. 이 때, 크기 마커는 로딩 퀵 DNA 크기 마커λ/EcoRI+HindIII 이중 분해를 사용한다.
한편, 대장균으로 복제하는 DNA 단편은 pHSG299를 BamHI 및 HincII로 2시간 동안 분해한 다음, 0.8% 아가로스 전기영동에 제공하고, 약 2.7kbp의 DNA 단편을 GFXTM PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 회수함으로써 조제한다.
이들 DNA 단편을 Ligation High를 사용하여 연결하며, Competent high를 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시키고, 30μL의 0.1M IPTG와 4%의 X-gal을 도포한 100μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하여, 30℃에서 48시간 동안 방치한다.
출현된 콜로니 중에서 백색 콜로니를 선택하여, 100μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB 액체 배지에서 30℃, 48시간 동안 진탕 배양한다. 수득된 배양액으로부터 GFXTM 마이크로 플라스미드 프렙 키트를 사용하여 DNA를 정제한다. 이와 같이 하여 수득한 pRET1102의 축소 셔틀 벡터를 pRET1123(약 5.3kbp)로 명명한다.
다음에 셔틀 벡터 pRET1202의 축소를 실시한다. 로도코커스 속 균 유래의 DNA 단편은 pRET1202를 EcoRI로 2시간 동안 분해한 다음, DraIII로 2시간 동안 분해한 후, Blunting High를 사용하여 평활 말단화하고, 0.8% 아가로스 전기영동에 제공한 후, 약 3.7kbp의 DNA 단편을 GFXTM PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 회수함으로써 조제한다. 이 때, 크기 마커는 로딩 퀵 DNA 크기 마커 λ/EcoRI+HindIII 이중 분해를 사용한다. 이러한 DNA 단편을 pHSG299의 HincII 부위에 삽입한다. 연결한 다음, Competent high를 사용하여 대장균 DH5α를 형질전환시키고, 30μL의 0.1M IPTG와 4%의 X-gal을 도포한 100μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하여, 30℃에서 72시간 동안 방치한다. 출현된 콜로니 중에서 백색 콜로니를 선택하여, 100μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB 액체 배지중에 30℃에서 72시간 동안 진탕 배양한다. 수득된 배양액으로부터 GFXTM 마이크로 플라스미드 프렙 키트를 사용하여 DNA 정제한다. 스크리닝에 의해 수득된 플라스미드를 SacI, BamHI, PstI 또는 EcoRI로 2시간 동안 분해한 바, 모든 클론이 로도코커스 속 균 유래의 영역중에서 EcoRI 부위측이 약 500bp 감소되어 있다. 이러한 플라스미드를 pRET1204(약 5.9kbp)로 명명한다. 또한, 로도코커스 속 균 복제 영역이 감소되어 있지 않은 클론에 관해서는 취득할 수 없다.
동일하게 셔틀 벡터 pRET1002의 축소를 실시하고, pRET1006(약 4.9kbp)을 수득한다.
이들 3종류의 축소 플라스미드, pRET1006, pRET1123 및 pRET1204로 알. 에리트로폴리스를 형질전환하여, 실시예6에 기재된 방법으로 셔틀 벡터 유지의 유무를 확인한 바, 셔틀 벡터를 유지하고 있는 것을 확인한다. 이러한 점으로부터, 3종류의 축소 플라스미드, pRET1006, pRET1123 및 pRET1204는 알. 에리트로폴리스에서 복제되는 것으로 시사된다.
(실시예 10) 발현 벡터의 작제-3
실시예 9에서 작제한 셔틀 벡터에 mak 유전자를 삽입하여 발현 벡터을 작제한다.
프로모터를 1단계에서 클로닝하기 위해 실시예 9에서 작제한 pRET1123의 PstI 부위를 결손시킨다. pRET1123을 PstI로 2시간 동안 분해한 다음, Blunting high를 사용하여 평활 말단화하며, Ligation High를 사용하여 연결한다. 이러한 용액을 Competent High를 사용하여 대장균 JM109을 형질전환시키며, 100μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB 플레이트에서 30℃, 36시간 동안 배양한다. 형성된 콜로니를 100μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB 액체 배지에 식균하여, 30℃에서 24시간 동안 배양한 다음, GFXTM 마이크로 플라스미드 프렙 키트를 사용하여 DNA를 정제하고, pRET1132로 명명한다.
또한, 취득한 pRET1132에 관해 PstI로 1시간 동안 분해한 다음, 0.8% 아가로스 전기영동에 제공하여, pRET1132가 PstI로 절단되지 않는 것을 확인한다. 이때에 대조군으로서, PstI 처리하지 않은 pRET1123 및 pRET1132와, PstI 처리한 pRET1123을 사용한다.
(실시예 11) 발현 벡터의 작제-4
상기한 셔틀 벡터에 프로모터 및 mak 유전자를 삽입한 클론을 작제한다.
프로모터를 삽입하기 위해 mak 유전자 상류에 PstI 부위를 가지는 클론을 작제한다. 아미노케톤 비대칭 환원효소의 C 말단에 His-Tag가 부가된 클론을 수득하기 위해 하기의 조작을 실시한다. 실시예7에서 수득된 pMAK-1을 주형으로 하여 MAKPstF(5'-GACCACTGCAGATCAATCAACTCTGATGAGGTCC-3'; 서열번호 82) 및 MAKHisBglIIR(5'--CGCTTAGATCTCAGTTCGCCGAGCGCCATCGCCG-3'; 서열번호 83)을 프라이머로 하며, KOD-plus-를 사용하여 어닐링 온도 68℃, 신장 반응 1분 50초로 PCR을 실시한다. 수득된 PCR 산물을 BglII를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 분해한 PCR 단편(삽입체)과, pQE70(SpHI를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 분해하며, Blunting high를 사용하여 평활 말단화하고 BglII를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 분해한다)을 Ligation High를 사용하여 연결하고, Competent high를 사용하여 이. 콜리 DH5α를 형질전환시키며, 100μg/mL의 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하여, 30℃에서 60시간 동안 방치한다. 출현된 콜로니를 100μg/mL의 암피실린을 함유하는 LB 액체 배지에서 30℃ 60시간 동안 진탕 배양한다. 배양액으로부터 GFXTM 마이크로 플라스미드 프렙 키트를 사용하여 DNA 정제한다. 수득된 DNA를 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 확인한다.
스크리닝은 수득된 DNA를 제한효소 처리하지 않은 것 및 PstI 및 BglII를 사용하여 37℃, 2시간 동안 분해한 것을 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하여, 수득된 DNA의 크기로부터 목적하는 플라스미드를 수득한다. 이와 같이 수득된 플라스미드를 pMAK-2로 명명한다. 크기 마커는 로딩 퀵 DNA 크기 마커λ/EcoRI+HindIII 이중 분해, pQE70 및 Bg1II를 사용하여 37℃, 2시간 동안 분해한 pQE70을 사용한다.
이 중에서 pMAK-2의 EcoRI-PstI 부위에 pRET1200의 RepA 프로모터[pRET1204 중에서 로도코커스 속 균 유래 DNA 단편에 암호화되어 있는 repA의 방향이 pHSG299에 암호화되어 있는 가나마이신 내성 유전자와 동일한 방향의 클론을 주형으로 하며, P1200rep-Pst5195(5'-AGCCGCTGCAGAAGCAACACCGCATCCGCCCATTG-3'; 서열번호 84)와 P7(5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'; 서열번호 85)를 프라이머로 하여, 어닐링 온도 60℃, 신장 반응 1분 동안으로 PCR 증폭한 다음, EcoRI 및 PstI를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 분해한 것]를 삽입한 클론을 작제한다(pMAK-19라고 명명한다).
다음에 pMAK-19를 주형으로 하며, pQE70F1(5'-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCACC-3'; 서열번호 86) 및 pQE70R1135Bm(5'-GGTTGGATCCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAG-3'; 서열번호 87)을 프라이머로 하여, PCR 효소에 KOD-plus-를 사용하여 어닐링 온도 60℃ 신장 반응 3분 동안으로 PCR을 실시한다. 이러한 반응액에서 GFXTM PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제하며, 정제한 PCR 산물을 EcoRI 및 BamHI로 2시간 동안 분해한 다음, 0.8% 아가로스 전기영동에 제공하며, DNA 단편을 GFXTM PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 정제한다. 이러한 DNA 단편을 삽입체로 한다.
한편, 발현 셔틀 벡터에 사용하는 벡터는 pRET1132를 EcoRI 및 BamHI로 2시간 동안 분해한 DNA 단편을 0.8% 아가로스 전기영동에 제공하며, GFXTM PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 정제한 DNA 단편을 사용한다. 이들 삽입체와 벡터를 혼합하며 Ligation High를 사용하여 연결한 다음, Competent High를 사용하여 이. 콜리 JM109를 형질전환하며, 100μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB 플레이트에 도말한다. 수득된 콜로니를 100μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양한 다음, GFXTM 마이크로 플라스미드 프렙 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 회수하고, 0.8% 아가로스 전기영동을 실시함으로써 스크리닝을 실시한다. 크기 마커는 로딩 퀵 DNA 크기 마커λ/EcoRI+HindIII 이중 분해 및 pRET1132를 사용한다. 이와 같이 수득한 발현 벡터를 pRET1133으로 명명한다.
또한, pMAK-19를 EcoRI 및 HindIII에서 37℃, 2시간 동안 분해한 다음, Blunting high를 사용하여 평활 말단화하고, 0.8% 아가로스 전기영동에 제공하며, 약 1.6kbp의 DNA 단편을 GFXTM PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 정제한다. 이러한 단편을 pRET1102의 HincII 부위에 삽입한 클론을 pRET1114로 명명한다.
또한, pRET1133의 프로모터의 개량을 실시한다. pRET1133에 암호화되어 있는 MAK 유전자를 발현시키는 프로모터는 pRET1200의 repA 유전자의 프로모터로 약 800bp의 길이이지만, 이러한 프로모터를 약 200bp 결손시킨 플라스미드를 작제한다. 이러한 클로닝에 사용하는 프로모터의 조제는 PCR로 실시한다. 플라스미드 pRET1200을 주형으로 하여, 프라이머에 P1204rep-Ec2958(5'-CGCGGAATTCGACCACCACGCACGCACACCGCAC-3'; 서열번호 88) 및 P1200rep-Pst5195(5'-AGCCGCTGCAGAAGCAACACCGCATCCGCCCATTG-3'; 서열번호 84)를 사용하여, PCR 효소에 KOD-plus-를 사용하여, 어닐링 온도 60℃, 신장 반응 50초 동안에 pCR을 실시한다. PCR 산물을 GFXTM PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 정제하고, 제한효소 EcoRI 및 PstI로 2시간 동안 분해한 다음, 1.6% 아가로스 전기영동에 제공하여, DNA 단편을 GFXTM PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 정제한다. 이러한 DNA 단편을 삽입체로 한다. 이러한 DNA 단편에 함유되는 프로모터 영역의 염기서열을 서열번호 77로 나타낸다.
한편, 벡터에 관해서는 pRET1133을 제한효소 EcoRI 및 PstI에서 2시간 동안 분해한 후, 0.8% 아가로스 전기영동에 제공하고, 약 7.2kbp의 DNA 단편을 GFXTM PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 정제한다. 크기 마커는 로딩 퀵 DNA 크기 마커λ/EcoRI+HindIII 이중 분해를 사용한다.
이와 같이 수득한 삽입체와 벡터를 Ligation High를 사용하여 연결하고, Competent high를 사용하여 이. 콜리 JM109를 형질전환시키며, 100μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB 플레이트에 도말한다. 수득된 콜로니를 100μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양한 다음, GFXTM 마이크로 플라스미드 프렙 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 회수하고, 0.8% 아가로스 전기영동을 실시함으로써 스크리닝한다. 크기 마커는 로딩 퀵 DNA 크기 마커 λ/EcoRI+HindIII 이중 분해 및 pRET1133을 사용한다.
또한, 수득된 DNA를 제한효소 EcoRI 및 PstI로 2시간 동안 분해한 다음, 1.6% 아가로스 전기영동을 실시하여, 약 600bp의 삽입체에 상당하는 DNA 단편을 확인한다. 크기 마커는 100bp DNA 래더(Ladder)를 사용한다. 이와 같이 수득한 발현 벡터를 pRET1138로 명명한다.
(실시예 12) 재조합 알. 에리트로폴리스의 형질전환 및 활성 측정
상기한 발현 벡터 pRET1102, pRET1104, pRET1114 및 pRET1138을 사용하여 알. 에리트로폴리스 MAK-34주 및 알. 에리트로폴리스 JCM2895(독립행정법인 이화학연구소에서 분양)을 형질전환하며, 활성 측정을 실시한다. MAK-34주로부터 정제되는 아미노케톤 비대칭 환원효소는 국제공개 WO 02/070714에 기재된 바와 같이 1,2-메틸아미노-1-페닐-1-프로파논에 작용하여, d-(1S,2S)-슈도에페드린을 생성하는 능력을 가지고 있다. 기타, 1,2-디메틸아미노푸로피오페논, 1-아미노-2-부타논 등에도 작용하여, 각각 대응하는 β-아미노알콜의 생성이 확인되어 있다.
활성 측정은 균량 O.D.= 5, 2% 글루코스 및 0.2M 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 되도록 반응액을 조제하며, 당해 반응중에 기질로서 3%의 (1S,2S)-2-(N-에틸아미노)-1-페닐-1-프로판올(EAM)을 함유하도록 한다. EAM은 문헌[참조: J. Am. Chem. Soc., Vol. 50, pp. 2287-2292, 1928]에 이의 합성방법이 기재되어 있다. 반응액을 30℃에서 16시간 동안 진탕반응한다. 반응 생성물의 β-아미노알콜인 (1S,2S)-2-(N-에틸아미노)-1-페닐-1-프로판올(EPE)의 확인은 HPLC에서 실시한다. 칼럼은 Inertsil PH-3 3.0×75mm, 용리액은 7% 아세토니트릴 수용액 및 0.05M의 인산나트륨 완충액(pH 6.0), 검출은 UV(220nm)으로 실시한다.
이와 같이 하여 활성 측정한 결과를 표 6에 기재한다. 외래 프로모터 영역을 갖지 않는 pRET1104를 도입한 재조합체는 대조군인 mak 유전자를 갖지 않는 pRET1102를 도입한 재조합체와 거의 동일한 활성을 나타내며, 재조합 효소의 발현은 확인되지 않는다.
MAK-34주에 pRET1114를 도입한 경우, pRET1104와 비교하여 높은 비활성이 확인된다. 이러한 점은 벡터에 삽입된 pRET1200의 repA 프로모터 영역이 프로모터로서 기능하고 있는 것으로 나타난다.
pRET1138을 도입하는 경우, 재조합 알. 에리트로폴리스 MAK-34주의 비활성은 37.7μg/h·mL/O.D.이며, 재조합 알. 에리트로폴리스 JCM2895주의 비활성은 34.9μg/h·mL/O.D.이며, 알. 에리트로폴리스주에서 효소의 발현이 확인된다.
Figure 112006030365759-PCT00018
비활성(단위: μg/h·mL/O.D.)
(실시예 13) 효소의 정제
실시예 12에서 수득된 재조합 균체를 100μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB배지 100mL에서 30℃, 4일 동안 배양하며, 12000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 집균하며, The QIA expressionist 키트(키아겐사제)에 의해 His-tag가 부가된 단백질을 정제한다. 구체적으로는 초음파 처리에 의해 균을 파쇄하며, 원심분리에 의해 이의 상등액을 수득하여 니켈 킬레이트 칼럼에 의해 단백질을 정제한다. 수득된 단백질을 SDS-PAGE에 제공한 바, 분자량 약 28000의 단백질 밴드가 확인된다. 이의 분자량은 국제공개공보 WO 02/070714에 기재된 아미노케톤 비대칭 환원효소의 분자량과 거의 동일하고, 아미노케톤 비대칭 환원효소가 재조합 로도코커스 균에서 생성된 것으로 나타난다.
(실시예 14) 효소에 의한 β-아미노알콜의 제조
실시예13에서 수득된 정제 효소(0.5μg/mL), 5mM NADPH, 120mM Tris-HC1(pH 7.5) 및 5mM EAM을 함유하는 반응액 0.5mL를 37℃에서 16시간 동안 반응시킨다. 기질 및 생성물(EPE)의 분석은 HPLC에서 실시한다. 칼럼은 Inertsil PH-3 3.0×75mm, 용리액은 7% 아세토니트릴 수용액 및 0.05M 인산나트륨 완충액(pH 6.0), 검출은 UV(220nm)으로 실시한다. 그 결과, EPE가 생성된 것을 확인했다.
동일하게 정제 효소 또는 실시예13에 기재된 배양으로 수득된 재조합체의 파쇄 효소 조추출액을 ℓ-2-디메틸아미노ㅍ프로피오페논, 1-아미노-2-부타논등에 작용시켜 대응하는 β-아미노알콜을 제조할 수 있는 것을 확인한다.
이상 설명한 바와 같이 본 발명의 플라스미드 및 셔틀 벡터는 로도코커스 속 균(특히, 로도코커스 크리트로폴리스(Rhodococcus crythropolis) 또는 로도코커스 로드니) 유래의 것이며, 이들을 이용하여 당해 균을 재조합에 의해 변형시켜, 보다 효율적으로 아미노케톤 비대칭 환원효소를 생성하는 균주를 작제할 수 있다. 또한, 아미노케톤 비대칭 환원효소를 함유하는 유용 효소를 형질전환체로 대량생산시 킬 수 있게 된다.
<110> Daiichi Fine Chemical Co., Ltd. <120> Novel plasmids and utilization thereof <130> FP04-0397 <150> JP 2003-373476 <151> 2003-10-31 <160> 100 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 279 <212> DNA <213> Rhodococcus erythropolis <220> <221> misc_feature <223> 202bp to 480bp pRET1100 <400> 1 atgactctga gggtggacga accggagtcg gtgagaatgc ttcatccgag cgcttccccg 60 gaagactgtg ccctggtcga gaccttcaag cctggtacct gccttttcga gaagccagga 120 gaaggccggc agattatgcg atgcgacttt gtcggcgagt acgggagata tgcgcgagcc 180 atcgagtctt cggatctgcg ttttctcgcc accctccagc aagaccaggc ccaacgcgaa 240 ttcttcgctg aggagttcgg tgtggtggat ccgtcatga 279 <210> 2 <211> 243 <212> DNA <213> Rhodococcus erythropolis <220> <221> misc_feature <223> 238bp to 480bp pRET1100 <400> 2 atgcttcatc cgagcgcttc cccggaagac tgtgccctgg tcgagacctt caagcctggt 60 acctgccttt tcgagaagcc aggagaaggc cggcagatta tgcgatgcga ctttgtcggc 120 gagtacggga gatatgcgcg agccatcgag tcttcggatc tgcgttttct cgccaccctc 180 cagcaagacc aggcccaacg cgaattcttc gctgaggagt tcggtgtggt ggatccgtca 240 tga 243 <210> 3 <211> 144 <212> DNA <213> Rhodococcus erythropolis <220> <221> misc_feature <223> 337bp to 480bp pRET1100 <400> 3 atgcgatgcg actttgtcgg cgagtacggg agatatgcgc gagccatcga gtcttcggat 60 ctgcgttttc tcgccaccct ccagcaagac caggcccaac gcgaattctt cgctgaggag 120 ttcggtgtgg tggatccgtc atga 144 <210> 4 <211> 282 <212> DNA <213> Rhodococcus erythropolis <220> <221> misc_feature <223> 477bp to 758bp pRET1100 <400> 4 atgactggac cacaggagag aaagcgcaag gcggcgaagc cgtcgcggga gcctcagttg 60 aactgctgtg aagcggacgt gccgaaacga gcaaaacagc ccccggttcc ctctacgttc 120 gacctgctca cggtgaagga gactgcgggg ctgctgagag tcagtcaggc aactctttac 180 cggctgcttc ggagtgggga aggacccaca tacacacgga tcggtggaca gatacgcgtt 240 caccgcgagt cgctgcgtcg gttcatcgaa ccgcgtggat aa 282 <210> 5 <211> 1548 <212> DNA <213> Rhodococcus erythropolis <220> <221> misc_feature <223> 862bp to 2409bp pRET1100 <400> 5 atgcacttcc acgataacgc agaggtcgga caagagggaa gaactgccgt tctctcgccg 60 ttgcgcggcg tagccgccaa 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aggccgtatt tccgggaagc tccaagcgat 960 ggattgaagt ttcgtccgtg gctttctgcg gtgtgggccg acgtcgtaga tcatccggac 1020 cccaaggaaa aagaaaagca cgtcagtgcc ggcactggag tggactacgc ggagggcacg 1080 cgagggtcag atccgaaaag gcttgcggtg tacttctcca agcatggaac ctttgccgac 1140 aaggaatatc agcacgtagt tcctgctcaa tggcagaaaa cgggtgcggg acctggcagg 1200 ttctggggct accgcggttt gtcgccggcc acggctgcca ccgagatttc ctgggatgag 1260 tacctgcttt tatctcgcac gttgcgacga ttgtcagcgc gaacgaagat ctgggacccg 1320 gctttacgag gcggtagcgg cggccacaga tggactaagg cgatgatgcg acgcacggtt 1380 acccggcacc gcttggacct cgtgaccggt gagattctgg gcacgaagac gcggaaggtt 1440 cgggcgccag tgaagaggtt tgtccggact tcgggatacc tgtgtgtcaa tgacgggccc 1500 gcactggctc gaaccctcag ccgtcttcgt acaagctgcc tgagctag 1548 <210> 6 <211> 1116 <212> DNA <213> Rhodococcus erythropolis <220> <221> misc_feature <223> 1294bp to 2409bp pRET1100 <400> 6 atggcggctg ccaggcataa ctcgccgtac gacttcgacg tggacgatga agagttggcg 60 gaactggctt ctctgcaagg cctcgaggac gacgacattg ggggctggtc tgcggagagg 120 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Rhodococcus erythropolis <220> <221> misc_feature <223> 1875bp to 1444bp pRET1100 <400> 17 atgatctacg acgtcggccc acaccgcaga aagccacgga cgaaacttca atccatcgct 60 tggagcttcc cggaaatacg gcctgcgacc tgggtcttca ccctctgcac gtgctatctc 120 ccatttcaag agctcagcat catgccgcag cttccgcgag tctcctgcct tcccatgagg 180 agggaccatg tacaggtgaa aatgcggagc gcctcggctt tggaactcca ttttccacgc 240 acccatccag gcaatgcccc aggcccgttg gaaccgtttg aagaacgtct ggagatgttt 300 tttgacctca gcgccggtgg gggcaaccgt aagccagtcc cccggatagg tgagggtcac 360 catcgcagga atgcccggca aatccatcat gggagcccag tcgagttctg ccattcgcaa 420 gatcatccgt ga 432 <210> 18 <211> 291 <212> DNA <213> Rhodococcus erythropolis <220> <221> misc_feature <223> 1734bp to 1444bp pRET1100 <400> 18 atgccgcagc ttccgcgagt ctcctgcctt cccatgagga gggaccatgt acaggtgaaa 60 atgcggagcg cctcggcttt ggaactccat tttccacgca cccatccagg caatgcccca 120 ggcccgttgg aaccgtttga agaacgtctg gagatgtttt ttgacctcag cgccggtggg 180 ggcaaccgta agccagtccc ccggataggt gagggtcacc atcgcaggaa tgcccggcaa 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tgcatttctt 6360 tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca 6420 aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcgatcg ctgttaaaag 6480 gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa 6540 tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa tgctgttttc ccggggatcg 6600 cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag 6660 gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc 6720 tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac aatcgataga 6780 ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt atacccatat aaatcagcat 6840 ccatgttgga atttaatcgc ggcttcgagc aagacgtttc ccgttgaata tggctcataa 6900 caccccttgt attactgttt atgtaagcag acagttttat tgttcatgat gatatatttt 6960 tatcttgtgc aatgtaacat cagagatttt gagacacaac gtggctttgt tgaataaatc 7020 gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca cgcatcttcc cgacaacgca gaccgttccg 7080 tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact ggtccaccta caacaaagct ctcatcaacc 7140 gtggctccct cactttctgg ctggatgatg gggcgattca ggcctggtat gagtcagcaa 7200 caccttcttc acgaggcaga cctctcgacg gatcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 7260 aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 7320 caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 7380 ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 7440 cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 7500 tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 7560 gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 7620 ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa 7680 gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 7740 caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 7800 ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 7860 tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 7920 ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 7980 agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 8040 aagcggaaga agctcgcaca ttcagcagcg tttttcagcg cgttttcgat cagcgtttca 8100 atgttggtat caacaccagg tttaactttg aacttatcgg cactgacggt tactgatttt 8160 gaacttttgc tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt 8220 caactcagca aaagttcgcc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 8280 taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 8340 aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 8400 atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 8460 tacgccaagc ttgcatgcct gcaggtc 8487 <210> 100 <211> 8038 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pRET1003Rv <400> 100 ccgtccacca cccggtgcct ggtctgcgtc tccctcggct cgttcctcgc ctatcctggt 60 gaccagacac cggagcgagc tatgcccagg gttgcgcagt gacttcgtca ctgcgtaacc 120 ctgggcgctc gcctcccatt cgcttcgctc acaggagggg gccgtcgatg gccgctgacg 180 ctgcatctga cgaccggcgg accgaggtcc gcgccgctgc ttcgcgggcc gctgacgcgg 240 ccccggcgaa gcgcacccgc accgtggcgg tgcggctgac cgatggggag gaggccgcgt 300 ggatcgacgc cgcgctggcc gatggccacc ggcagctcgg ggcgtgggtg cgtgagcggg 360 cggtggccgg ctatctcggg aaggtccgcc cgaagaccgg cagtggaatg tcggcggagg 420 cggccgcgga ggtcgccgcg atgcggcagc agatgacgaa ggtggggaac aacctgaacc 480 agatcgcgag ggcgatcaac gccgggcagg tgccgtcgca gatggccgag tccctgcaga 540 aggggtggct ggagaggtgg gggcaggagt tggggcggat ggcggatcgg ctcgacgcgc 600 tcgacgacca gggctgacgt gatcgcgaag atcagcacgg gcagcgaccc gaaggggttg 660 gcggcgtatc tgcacgggcc ggggaaggcc accccgcaca gctaccgcac cgaggcgggc 720 cggctgattg ccggcgggac ggtgatcgcg ggatcggtgc aggtcaccgc caaaaacccg 780 acccggtggg ggcgggactt cgagcgggcc gccgcgacga acgcgcgggt gggtaagccg 840 gtgtggcatt gctcgctgcg gtgcgcgccc ggggatcggc ggctgaccga taccgagttc 900 gcggacatcg cgcagacggt cgccgagcgg atgggcttcg agagtcatcc gtgggtggcg 960 gtgcggcacg acgacgacca catccacctg gctgtctccc gggtcgattt tcagggcgtg 1020 acctggaaga acagcaacga ccggtggaag gtcgtcgagg tgatgcgcga ggtcgaacgc 1080 gcgcacggcc tgatcgaggt ggcgagcccg gagcgggccc gtggccggca agccagcagc 1140 ggcgagcaac gccgcgcggt gcggaccggc aaggtggcgc agcgggacgg tctgagggaa 1200 attgtgaccg ccgcccgcga catcgccgca ggccagggtg tgggggcgtt cgaagtggcg 1260 ctcgtacaga acccgattac ccgagtgcag gtgcggcgca acgtcgcgaa gacgggccgg 1320 atgaatggct acagcttcaa cctgcccggc tacgtcgacg ccgccgggga gccgatctgg 1380 ttgccggcct ccaaactcga ccggggtttg tcctggtcac agctggaaaa gacgctgacc 1440 agaccccgcc cggaccgcct cgccggcgag gagacggtgc cgcggaagcg gctcgagcgc 1500 gccgccgcgt gggagcagcg ccgccgcgag gtcggcggcg agcagttcgc agctgcccgc 1560 tgggagcagg cccgcgcgaa tgttggtgag acggccgggc ggatccgcgc cgaacagtcc 1620 gcggacacga agtggaagca ggtgaacgag gcgttgacca gccaagaccg ggccgaggag 1680 caggctgccg aggcagcgcg ggtcgcctcc gctgtcatgg gaggccaccc gacaccgcta 1740 cgggacatgc tcgccgccca ggagcagcgc cggaagccgt ggactccgga gcagaaacgc 1800 cagtacgcga ccgcaaaagc ccaagcagaa cgcgccgcga aggccaagga cgccgcgaaa 1860 tggaccgagg tcgccggcgg cggctaccag cgggacgtgc gcgggatgaa cctgcgactg 1920 tgggtggctg aggacggcgc ctggtcgatc acctcgaaga aggaccccga ccgccagtac 1980 gccgcaggtc aggccgacac cgtcgcgcag gcccaagccg cggccacggc cacagcgaaa 2040 acgcaggccc aggcgatgtg gaagcaggtc ccggccgaca agcgcaccga gtcagccacc 2100 agagcggtcc ggcgcgtgat cgcggatctc acccccacca aacccgccga ggtcaaaccc 2160 ccggcccgcc gccagggacc aaccatgccg cagtcggccc cggggtatca gccacccggc 2220 cgcgaccgag gtcgagaatc cggaatggga ctgtgagcag agagcgagaa ggctttcgtg 2280 gagcgtaggg aacagacgca ggcctggcga agcatgtcca agaacaccat cgatcgctag 2340 aaggtcggtc gtgcccaggg tgcccaggat gcgtacataa cgcgcgaaag gtgcatacct 2400 cccatagcat cggcgcgtat ggtagggaaa atgatcttca aacgtattgc tgtggtcgtg 2460 ctcgctggtg gggctttggt agtgggaggc agccaggttg ctggtgctac cacggtttca 2520 gctccacagc cgagtccttc agcagcggtg gtgccgacgg ttcttccacc agtcactttc 2580 accgccgctt ctgcgcactg cgaggcccag tacgcgtcgg attcccggcg atgccgtctg 2640 attccacttc cacagggccg agcgatctgc tgggcggcag ccgctgcccg ttacgcagcg 2700 tgccgcgccg gaaactaggt agaacgtgag catggacgag cttcccacct tcatcgccga 2760 cgacatcgtg atggccagaa cgttcgacag ccctaacggc caggtggtgc tcgaggtgaa 2820 cactccgcgg ccgttcgatg ctgcggcccc ggagggtgac tactgctgca ccttccggat 2880 cagcgggaac atggatgccc cttacgacgg attcggtggc ggcgtcgacg cagtgcaggc 2940 gctgctactc gcattggcca tggcacacga ggaacttcgt caaacttcgc cagagttgac 3000 gtttctaggc gagacgaacc tcggtctacc ggtcttgaac atcaagcccg acaacgcgat 3060 cgaagccgtg gtctcattcc ccgctccctg atgtgacgca ctttcacccc tggcactcat 3120 gtaccgaagc tgggactgag aaagggctgc cgcgtcaccg cttcgcgttg acttgccact 3180 gaacgggggc gtgtcccggt cagggcgggg tgtgacctgg gttcatgaca ccgctaacac 3240 gctgcggaaa tgcggattga actagttcat ttggggaacg atgacctgat gaccggggat 3300 cgtgacctac ccatgctgac catcgccgag gcggtggacg cgacgcagac cagtgagagc 3360 acgatcaagc gccgcctgcg gtcgggcgcg ttcccgaacg cggtccgcac tgccgacggg 3420 aagtggatga ttcccctcgg tgacctatca gcggcagggc tgagaccagg gaaaatggcg 3480 aaacctgacc cggtgacccc ttcaaatgac cgggtccgtg acctggcagc tgagaacgcc 3540 gagctccgtc agcgcctggc cgtggccgaa gccctggcca gcgaacgcaa tcggatcatc 3600 gacgtgcagc aacagatgct ccggatgctc gaagcccggc cggtgtcggc cctggagccc 3660 gcggcggttc cagtggcggg tccgccgccg cccgtcccgg ccgccgatgg tcgggcagct 3720 acgggcgccc tggcccggat acgtcgacgg cttctcggct aggagctgac cgcgtacttg 3780 cgtgcgtcgt gcaggagctt tcccaccgtt ccggtggaga ttcccatctc ctcggcgatc 3840 tcgcggtact tcaggccctg ctcgcgcagc tcgacggccc ggcgacggtt ctcggctgcc 3900 cgtgcgagga actggtcccg cggctcggcc atgatgcgct ggatcgtgcg cgtggaggcc 3960 cccatcttct cggccagctc gcgagctgtc tgcttgcggc ggatcggtcg ttcagcgccc 4020 acggtctgcc tcccacaatg cgttccggtc gaccttcgtc gctcgtttcc ggtttgcctc 4080 gcgcttcttc tcactcatct tgcgaccgcg tgcggcttgt atggcgatga atgtggcctc 4140 gtagacagca gggccgtcgg cccacatccg ggactttgta gtgatccagc gggtaatgga 4200 ggccgcgacg gcgcgtagct cgcttgctgg cagtggatcg ggcctgcctg tgaccgggtt 4260 cctgaacgtg gcgttgatct gtgcggcttc cgcatagatc gcggccccga ggccggtcgg 4320 gtcgccccag tggaagcgga tttcgcggta ggcccaggtg cgtgcggttt cgaacagggc 4380 gcagtttcgg ccgaggccga tcgggttctc acggcgcgat cgggtttgcc gccagcgcgt 4440 tggcggcatg tggatgccga gttccgcctc gagctcggcg agggatcgcc gctcggtgtg 4500 cagccaatgg gtgtcccagt caccgtgagt cgggttcttg gtcatcaggc ccgaatagcc 4560 cttgtccccc tggacggcgc gccggaggcc ttcggtgacg gcggccgcat aggcgagcgg 4620 cttacgacgg gcgtactcgg tgcgggtgaa cggctctgcc agcgcccaca cagcgtgtgc 4680 gtgcccgtta cgggggttct ccacgatcgc gttcggcaga ggatgattcc cggccgccga 4740 cagcgcccgc agcgcggcgt ccgggtggtc aacgtccacg acgagcaggt tgctcaatgc 4800 ctgcgggttc gactcgatgt agcggcgatc cagtgcgtct gatcgccgca tccggtagac 4860 gccgtcgagg aaatcgtcgg ttgccagtgg ccacagcggt agccacagct gttcccaggc 4920 gccgcctgtg tgctcttcca ccgcaaccat ggggaacaca ctcacacaca agatcgattt 4980 attccggtac gacacgccag ccaagtcaga tgtttcggtt tctggagcgg tcctccagac 5040 ctttgagatc cgctccagaa acgtccacaa attattgggg tacgtcgaac caagccttat 5100 caggtatccc ggggttccgg gggtgaacac caccctccga ccggtccaga atccgtcgat 5160 ctcacctatc cgctcgaagt ccttgagtca gtgacaggac cactgctggg ctcccagcgc 5220 agaaggcaag tgaaggcaga cgactgcggg aggtaagtcg ggtacggcat gaggtccttc 5280 agaagcggcg tcgacgccag gcccacacgc acaatccgct tcccacgagg gacaccaccg 5340 gtagcgcccc ctgcaaccgg cgcagtgtca cgaggcgccg gtactgctcg tttgacagga 5400 actgcagggt cggtgagctc gcgctgggcg gatcccacca gtagctcccc gtgccggtaa 5460 ccgcttgggg ccaagcgaag acacccaccg cggcagcgat ggcaatgcac gtggatggga 5520 acaccaccca gaaccaggga aatcctggtg ccggcccgag acgatcccgg cgcggtaaga 5580 ccacaccggc caccatcgcc acggcccccg acgcaacaag caataaccac cccatgagcg 5640 gacggtacaa gcgccgacgc cgggtggccg ttaggtgcgc gccagcccgt gaccggaccg 5700 gcgaagcgtg ccgctgggcg gcccgccgtg gcgcccgtcc cgtgcccgtt ctgaccggtg 5760 gtctcggtcg ctcgttcctc gcgtcctcac ctgccggtca gcccgtgacc ggactctaga 5820 ggatccccgg gtaccgagct cgaattcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 5880 ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 5940 gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 6000 gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 6060 tttgcgtatt ggagcttggc actgggccaa gctgaatttc tgccattcat ccgcttatta 6120 tcacttattc aggcgtagca ccaggcgttt aagggcacca ataactgcct taaaaaaatt 6180 acgccccgcc ctgccactca tcgcagtact gttgtaattc attaagcatt ctgccgacat 6240 ggaagccatc acagacggca tgatgaacct gaatcgccag cggcatcagc accttgtcgc 6300 cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa cgggggcgaa gaagttgtcc atattggcca 6360 cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc agggattggc tgagacgaaa aacatattct 6420 caataaaccc tttagggaaa taggccaggt tttcaccgta acacgccaca tcttgcgaat 6480 atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt ggtattcact ccagagcgat gaaaacgttt 6540 cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag ggtgaacact atcccatatc accagctcac 6600 cgtctttcat tgccatacga aattccggat gagcattcat caggcgggca agaatgtgaa 6660 taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt tctttacggt ctttaaaaag gccgtaatat 6720 ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt gagcaactga ctgaaatgcc tcaaaatgtt 6780 ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg tggtatatcc agtgattttt ttctccattt 6840 tagcttcctt agctcctgaa aatctcgata actcaaaaaa tacgcccggt agtgatctta 6900 tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta cgtgccgatc aacgtctcat tttcgccaaa 6960 agttggccca gggcttcccg gtatcaacag ggacaccagg atttatttat tctgcgaagt 7020 gatcttccgt tcgacggagt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 7080 ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 7140 accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 7200 cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 7260 cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 7320 tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 7380 taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 7440 gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga 7500 agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 7560 ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 7620 acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 7680 caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 7740 tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 7800 tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagaagctca 7860 ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt 7920 acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt 7980 ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtc 8038

Claims (38)

  1. 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 단편.
  2. 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
  3. 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 14, 서열번호 17 및 서열번호 22에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 단편.
  4. 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 14, 서열번호 17 및 서열번호 22에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
  5. 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 14, 서열번호 17 및 서열번호 22에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역 또는 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
  6. 서열번호 76에 기재된 염기서열을 갖는 DNA 단편.
  7. 서열번호 76에 기재된 염기서열을 갖는 프로모터 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
  8. 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 14, 서열번호 17 및 서열번호 22에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역, 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 영역 또는 서열번호 76에 기재된 염기서열을 갖는 프로모터 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 기재된 플라스미드 또는 DNA 단편을 가지며 제한효소 절단 부위수가 BamHI: 2, EcoRI: 2, KpnI: 1, PvuII: 1, SacI: 1 및 SmaI: 1이고 크기가 약 5.4kbp인 것을 특징으로 하는 환상 플라스미드.
  10. 서열번호 73에 기재된 염기서열을 갖는 플라스미드.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 로도코커스(Rhodococcus) 속 균 유래인 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 DNA 단편.
  12. 서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 72에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 단편.
  13. 서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 72에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
  14. 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 62 및 서열번호 69에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 단편.
  15. 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 62 및 서열번호 69에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
  16. 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 62 및 서열번호 69에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역 또는 서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 72에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
  17. 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 62 및 서열번호 69에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 관련 단백질의 암호화 영역, 서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 72에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 복제 영역 또는 서열번호 76에 기재된 염기서열을 갖는 프로모터 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
  18. 서열번호 67 및 서열번호 47에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 DNA 단편.
  19. 서열번호 67 및 서열번호 47에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 갖는 접합 단백질 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
  20. 서열번호 75에 기재된 염기서열을 갖는 DNA 단편.
  21. 서열번호 75에 기재된 염기서열을 갖는 접합에 관한 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편.
  22. 제12항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 기재된 플라스미드 또는 DNA 단편을 가지며 제한효소 절단 부위수가 BamHI: 2, PvuII: 4, SacI: 3 및 SmaI: 4이며, 크기가 약 5.8kbp인 것을 특징으로 하는 환상 플라스미드.
  23. 서열번호 74에 기재된 염기서열을 갖는 플라스미드.
  24. 제12항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 로도코커스 속 균 유래인 것을 특징으로 하는 플라스미드 또는 DNA 단편.
  25. 서열번호 77에 기재된 염기서열을 갖는 DNA 단편.
  26. 서열번호 77에 기재된 염기서열을 갖는 프로모터 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
  27. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 기재된 플라스미드 또는 이의 일부인 DNA 단편과 대장균 내에서 복제할 수 있는 DNA 영역을 함유하며, 로도코커스 속 균 및 대장균 내에서 복제할 수 있는 셔틀 벡터.
  28. 제27항에 기재된 셔틀 벡터를 사용하여 작제하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  29. 제6항, 제7항, 제25항 또는 제26항 중의 어느 한 항에 기재된 플라스미드 또는 DNA 단편을 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자가 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 핵산 또는 서열번호 78의 아미노산 서열에서 1개 또는 복수의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며 또한 아미노케톤 비대칭 환원활성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산인 것을 특징으로 하는 벡터.
  32. 제30항에 있어서, 아미노케톤 비대칭 환원효소 유전자가 서열번호 79에 기재된 염기서열로 이루어진 핵산 또는 서열번호 79와 상보적인 염기서열로 이루어진 핵산과 엄중 조건하에 하이브리드화하는, 아미노케톤 비대칭 환원활성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산인 것을 특징으로 하는 벡터.
  33. 제28항 또는 제29항에 기재된 벡터를 포함하는 형질전환체.
  34. 제30항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 기재된 벡터를 포함하는 형질전환체.
  35. 제34항에 기재된 형질전환체를 당해 형질전환체가 증식할 수 있는 배지속에서 배양하는 배양공정과, 상기 배양공정에서 수득되는 당해 형질전환체로부터 아미노케톤 비대칭 환원효소를 정제하는 정제공정을 포함하는, 아미노케톤 비대칭 환원효소의 제조방법.
  36. 화학식 1의 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물에 제35항에 기재된 제조방법으로 수득되는 아미노케톤 비대칭 환원효소를 작용시켜 화학식 2의 원하는 광학활성을 갖는 아미노알콜 화합물을 제조하는 방법.
    화학식 1
    Figure 112006030365759-PCT00019
    화학식 2
    Figure 112006030365759-PCT00020
    상기식에서,
    X는 동일하거나 상이할 수 있으며 할로겐 원자, 저급 알킬기, 보호기로 보호될 수 있는 하이드록실기, 니트로기 및 설포닐기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며;
    n은 0 내지 3의 정수이며;
    R1은 저급 알킬기이며;
    R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있으며 수소원자 및 저급 알킬기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며;
    *는 비대칭탄소이다.
  37. 화학식 1의 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물에 제34 항에 기재된 형질전환체를 작용시켜 화학식 2의 원하는 광학활성을 갖는 아미노알콜 화합물을 제조하는 방법.
    화학식 1
    Figure 112006030365759-PCT00021
    화학식 2
    Figure 112006030365759-PCT00022
    상기식에서,
    X는 동일하거나 상이할 수 있으며 할로겐 원자, 저급 알킬기, 보호기로 보호될 수 있는 하이드록실기, 니트로기 및 설포닐기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며,
    n은 0 내지 3의 정수이며,
    R1은 저급 알킬기이며,
    R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있으며 수소원자 및 저급 알킬기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며,
    *는 비대칭탄소이다.
  38. 제37항에 있어서, 화학식 3의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 용매화물을 추가로 첨가하여 광학활성 아미노알콜을 제조하는 방법.
    화학식 3
    Figure 112006030365759-PCT00023
    상기식에서,
    A는 화학식 Y 또는 화학식 Z이며,
    화학식 Y
    Figure 112006030365759-PCT00024
    화학식 Z
    Figure 112006030365759-PCT00025
    R4는 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, R8과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환 또는 R8과 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이고,
    R5는 수소원자, 탄소수 1 내지 3의 알킬기 또는 R6 또는 R9와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며,
    R6은 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, R8과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환, R5 또는 R9와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며,
    R7은 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이고,
    R8은 수소원자, 카복실기, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기, R4와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격, R6과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환이며,
    R9는 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시카보닐기, 치환기를 가질 수 있는 아실기, R5 또는 R6과 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며,
    R10은 수소원자 또는 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이다.
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