KR20060015658A - 클론닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된 호흡기 세포융합 바이러스 백신의 생산 - Google Patents
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Abstract
저온 계대배양에 의해서 불완전하게 약독화된 야생형이나 RSV에 대한 약독화된 표현형과 관련된 특이한 돌연변이를 도입함으로써, 또는 온도민감성(ts)이나 저온 적응성(ca) 표현형을 가진 바이러스를 생산하는 변이를 도입함으로써, 약독화된 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV)와 그의 백신 조성물을 생산한다. 혹은, 재조합 RSV 및 그의 백신 조성물은 약독화, 및 감염성 RSV에서 원하는 구조적 특성 및/또는 표현형적 특성을 특정하는 다른 돌연변이를 포함한다. 재조합 RSV는 감염성 RSV 클론에 선택된 뉴클레오타이드 서열, 유전자, 또는 유전자 단편을 삽입, 결실, 치환, 또는 재배열함으로써 특정되는 원하는 돌연변이를 포함한다. 개체의 면역체계가 자극되어 자연적인 RSV감염에 대한 보호, 또는 약독화된, 생물학적으로 유래되거나 재조합 RSV의 투여에 의한 PIV와 같은 다른 병원체 및 RSV 감염에 대한 다면적인 보호를 유도한다.
호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 재조합 RSV
Description
도 1은 일련의 서브그룹 A 호흡기 세포 융합 바이러스가 쥐의 폐에서의 복제와 침팬지에서의 복제간에 대체로 완전한 관계를 설명하는 그래프이다.
도 2 및 3은 RSV 안티게놈 RNA을 코딩하는 cDNA의 제조를 나타내며, 도 2는 cDNA 및 코드된 안티게놈 RNA(크기 눈금을 나타내지 않음)의 구조를 나타낸다. 본 도면을 위해서, 및 모든 다음의 실시예에서, 사용된 구체적인 cDNA 및 바이러스는 서브그룹 A RSV의 A2 균주의 것이다. 안티게놈의 도표는 다음 특징을 포함한다: T7 프로모터 유래의 5'-말단 비바이러스성 G 트리플렛, 1099(이는 그 길이에 하나의 뉴클레오타이드를 첨가한 것이다), 1139, 5611 및 7559위치의(번호는 새로운 제한효소부위의 첫 번째 염기를 기준으로 하였다) 4개 서열 표시자, 라이보자임 및 반복배열(tandem) T7 종결인자, 및 라이보자임의 절단(절단 부위는 화살표로 나타냄)에 의한 하나의 비바이러스성 3'-인산화된 U잔기. 비바이러스성 5'-GGG 및 3'-U 잔기는 여기서 나타낸 길이 및 이후의 안티게놈의 길이에 포함되지 않는다는 것에 주의하라. 그러나, 1099위치에 삽입된 뉴클레오타이드는 포함되므로, cDNA-유래 안티게놈의 번호는 생물학적으로 유래된 안티게놈보다 이 위치의 하류에서는 1 뉴클레 오타이드가 크다. 5'에서 3' 방향의 (+)-서열 D46 (게놈 그 자체는 (-)임)은 DEQ ID NO: 1로 나타냈으며, 여기서, 4위치에서 뉴클레오타이드는 C 또는 G이다. 또한 이 도면 및 전체에서 제한효소부위로 배당된 서열은 설명안내로 나타내며 단독으로 포함된 모든 뉴클레오타이드를 정의하지는 않음을 주의하라. 다음의 분해로 남겨진 접착성 말단으로서 그러한 인자에 따라 길이 할당이 달라지기 때문에, 여기 및 전체에서 제한효소단편으로 할당된 서열 길이도 또한 설명하고 있다. 완전한 안티게놈의 집합에서 타타낸는 클론된 cDNA 단편도 또한 나타낸다. 박스는 플라스미드 벡터로부터 BamHI 부위의 제거, 용이한 조합: 자연적으로 일어나는 BamHI-SalI 단편(BamHI 부위는 (+)에서 맨윗줄에 밑줄을 그어 나타냄)을 PCR-생성 BglII-SalI단편(BglII 부위는 맨아랫줄에 밑줄을 그어 나타냄; 이탤릭체로 나타낸 그의 4 뉴클레오타이드 접착성말단은 BamHI의 것과 호환성이 있다)으로 치환된 변형을 예시한다. 이로서 뉴클레오타이드 1개의 변화를(중간줄에 밑줄을 그음) 가져오며, 이는 아미노산 수준에서는 나타나지 않는다. 도 3은 (+)서열이며 리더 영역의 첫 번째 뉴클레오타이드를 1로서 정의한 서열인 cDNA-코드 안티게놈 RNA에서 서열 표시자가 포함되어 있음을 나타낸다; cDNA에서 제한효소부위를 나타내는 서열에 밑줄을 그었고; 유전자-개시(GS) 및 유전자-종료(GE) 전사 신호는 박스로 나타냈고; 위치 1141에서 N 번역 오픈리딩프레임의 개시코돈은 이탤릭체로 나타냈고 제한효소부위는 각 서열의 아래에 나타냈다. 맨위의 서열에서, 하나의 C잔기를 1099위치에 삽입하여 NS2-N 유전자간 영역에AflII 부위를 생성하였으며, N 번역 오픈리딩프레임의 바로 상류의 1139 및 1140위치에 있는 AG를 CC로 치환하여 새로운 NcoI부위를 생성하였 다. 중간줄 서열에서, 5612 및 5616위치에 G 및 U를 각각 치환시켜 G-F 유전자간 영역에 새로운 StuI부위르 생성하였다. 맨아랫줄 서열에서, 7560에서 C를 치환시켜 F-M2 유전자간 영역에서 새로운 SphI부위를 생성하였다.
도 4는 돌연변이 삽입, 완전한 안티게놈 제조물의 조합, 및 재조합 바이러스의 회수에 관련된 cDNA(approxinately to scale)의 구조를 예시한다. 4 유형의 돌연변이가 맨아랫줄에 나타낸 pUC 118- 또는 pUC119-유래 cDNA 서브클론에 삽입하였으며, 즉 L유전자에(맨위에 D53 도표위에 밑줄) 있는 6개 발현되지 않는 (silent) 제한효소부위, F 유전자상에 두 개의 HEK 변화(H), 5개의 cp 변화 (cp), 및 다양한 생물학적 돌연변이 야기 단계에 특이적인 돌연변이: 248, 404, 530, 1009 및 1030 (나타낸 바와 같음). 돌연변이 서브 클론을 중간중에 나타낸 중간 플라스미드 D50(리더로부터 리더의 바로 상류에 있는 T7프로모터를 갖는 M2-L 중복의 개시부까지의 RSV 안티게놈을 나타냄) 또는 D39(M2-L의 중복 내지 트레일러의 바로 하류에 있는 라이보자임과 T7 종결인자를 갖는 트레일러인 RSV 안티게놈을 나타낸다)에 삽입하였다. 적합한 D50와 D39를 조합하여 맨윗줄에 나타낸 완전한 길이의 D53 안티게놈 cDNA을 만들었다(RTT는 두 개의 T7 전사종결인자가 뒤에 있는 해머-해드 라이보자임의 위치를 나타낸다).
도 5는 재조합 RSV를 회수하는 데 사용되는 6 변이처리된 안티게놈 cDNA의 지도를 제공한다. 재조합체의 ts표현형을 도면의 오른쪽에 요약하였다.
도 6은 RSV 전사신호(not to scale, RSV-특이 단편을 채워진 박스로 나타냈으며 CAT 서열은 비워진 박스로 나타냄)로 둘러싸인 CAT-ORF를 함유하는 RSV 안티 게놈을 코딩하는 D46/1024CAT cDNA의 제조를 나타낸다. CAT유전자 전사 카세트의 출처는 RSV-CAT 미니게놈 cDNA 6196 (맨위의 도표)이다. RSV-CAT 미니게놈은 리더영역, GS 및 GE 신호, 비코딩(NC) RSV 유전자서열, 및 CAT ORF과, GS서열의 앞에 있고 GE신호가 뒤에 있는 XmaI제한효소부위를 가진다. 이러한 인자의 뉴클레오타이드 길이를 나타냈으며, XmaI을 둘러싼 그 서열((+))을 도표위에 나타냈다. 8-뉴클레오타이드 XmaI링커를 모 플라스미드 D46의 StuI부위에 삽입하여 플라스미드 D46/1024를 제조한다. D46은 환전한 안티게놈 cDNA이며, D53에 동등하다; 명명법에서의 차이점은 두가지 다른 배합물을 나타내는 것을 뜻한다. 플라스미드 6196의 XmaI-XmaI 단편을 플라스미드 D46/1024에 삽입하여 플라스미드 D46/1024CAT를 제조한다. D46 cDNA에 의해 코드되는 RNA는 맨아래에 나타냈으며, T7에 의한 3개의 5'-말단 비바이러스 G잔기 및 해머헤드 라이보자임의 절단에 의한 3'-말단 인산화된 U잔기를 포함한다; 안티게놈에 대한 주어진 뉴클레오타이드 길이는 이러한 비바이러스성 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. L 유전자는 그 유전자의 중복을 상쇄하여 그렸다.
도 7은 RSV 안티게놈 (맨윗줄에 있음)을 코딩하는 모 야생형 D46 플라스미드의 도표를 나타내며, D46/6368 유도체는 SH 유전자가 결실된 것이다(맨아랫줄). 각각 상류 및 하류 말단에 채워진 박스로서 나타낸 GS 와 GE를 가지는 비워진 네모로 RSV 유전자를 나타냈다. T7 파지 플로모터(왼쪽) 및 해머헤드 라이보자임 및 RNA 전사체의 3'말단을 생성하는 T7 종결인자를 작은 비워진 박스로 나타냈다. D46이 ScaI 및 PacI 단편을 짧은 합성 단편으로 치환하여 D46/6368을 만들었다. D46에서 SH유전자를 둘러싼 서열 및 D46/6368에서 재조합된 영역의 서열을 각각의 플라스미드 지도위에 박스로 처리하여 나타냈다. D46에서 ScaI-PacI단편의 서열 및 D46/6368에서의 그의 치환된 서열을 굵게하고 윗쪽으로 나타낸 화살표로서 구별하였다. M GE, SH GS, SH GE, 및 G GS 부위를 윗줄을 그어 나타냈다. D46/6368에서 새로운 M-G 유전자간 영역을 맨아래 도표에서 65로 표시하여 그의 뉴클레오타이드 길이를 나타냈다. SH-(-)센스 D46/6368 제조물의 (+)센스 T7 전사체를 맨아래에 나타냈다; T7에 의한 3개의 5'-말단 비바이러스성 G 잔기 및 3'-말단 U잔기를 나타낸다(Collins 등의 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 본명세서의 참고문헌으로 병합됨). 이러한 비바이러스성 뉴클레오타이드는 길이 측정에 포함되지 않는다.
도 8은 D46 야생형 또는 D46/6368 SH-(-)센스 바이러스로 감염된 세포로부터 전체 세포내 RNA의 RT-PCR 분석하여 SH 좌위의 결실을 확인을 나타낸다. SH유전자의 상부와 결합할 수 있는 (+)센스 프라이머로 RT를 수행하였고, 추가로 SH유전자의 하부와 결합할 수 있는 (-)센스 프라이머로 PCR을 수행하였다. 레인: (1 및 5) 1Kb의 DNA 래더(ladder)로 구성된 표시자(Life TEchnologies, Gaithersburg, MD); (2)RT-PCR로 얻은 D46/6368 RNA; (3) RT-PCR로 얻은 D46 RNA; (4) PCR만을 한 D46/6368 RNA. PCR산물을 2.5% 아가로스겔상에서 전기영동하고 에티디움 브로마이드로 염색한다. 몇몇 표시자 DNA 단편의 뉴클레오타이드 길이를 오른 쪽에 나타냈다.
도 9는 D46 야생형 및 D46/6368 SH-(-)센스 바이러스에의해 코드되는 RNA의 노던블랏혼성화를 나타낸다. 감염된 세포로부터 전체 세포내 RNA를 분리하고 변성단계이전에 선택된 RNA가 샌드위치 혼성화 때문에 게놈 RNA를 포함하는 조건하에 올리고(dT)크로마토그래피를 행한다. RNA를 포름알데히드-한천겔상에서 전기영동하고 니트로셀룰로스 막에서 블랏팅을 한다. 복사체 블랏을 나타난대로 M, SH, G, F, M2, 및 L 각각의 [32P]-표지된 DNA 탐지자와 혼성화한다. 레인들: (1) D46/6368 RNA; (2) D46 RNA; (3) 감염되지 않은 HEp-2세포의 RNA. 게놈 RNA(gen.), mRNA(큰 문자), 및 완전한 전사체를 왼쪽에 나타냈다. 완전한 전사체 P-M 및 M-G(M탐지자)의 위치는 완전한 전사체 G-F 및 F-M2(F탐지자)뿐만 아니라, 일치한다. 0.24-9.5 kb RNA래더 분자량 표시자의 위치(Life Technologies)는 오른쪽에 나타냈으며, 이는 람다 파지의 [32P]-표시된 DNA로 혼성화하여 볼 수 있으며 평행하다.
도 10은 D46 야생형이나 D46/6368 SH-(-)바이러스로 감염시킨 HEp-2 세포에서 합성된 [35S]표지된 RSV단백질의 SDS-PAGE 를 나타낸다. 정제된 비리온에 대한 항혈청으로 단백질을 면역침전시키고, 미리만든 4-20% 농도구배 트리스-글리신 겔에서 전기영동으로 분석하였다(Novex, San Diego, CA). 바리러스 단백질의 위치를 왼쪽에 나타내고; 표지 단백질(Kaleidoscope Prestained Standards, Bio-Rad, Richmond, CA)의 위치와 분자량(킬로달톤으로 표시)을 오른쪽에 나타냈다.
도 11-13은 HEp-2세포(도 11)와 AGMK-21 세포(도 13)에서 D46 야생형과 D46/6368 SH-(-)바이러스에 대한 성장곡선을 나타낸다. 25-cm2의 배양 플라스크에서 3중감염된 세포단층을 각 바이러스의 세포당 2 PFU로 감염시켰고, 37℃에서 배양하였다. 시간축에 약수를 취하고, -70℃에서 저장하고, 항체 염색의 플락분석으 로 평행하게 적정하였다. 나타낸 각 점은 3회 감염된 세포 단층의 평균역가이다.
도 14 및 15는 D 46 야생형 바이러스, D46/6368 SH-(-) 바이러스, 또는 생물학적으로 유래된 cpts248/404바이러스로 비강으로 접종된 쥐의 상부(도 14) 및 하부(도 15) 기도에서의 바이러스 복제 속도학(kinetic)을 나타낸다. 24 그룹의 쥐를 비강으로 106 PFU의 지시된 바이러스로 접종하였다. 정해진 날에 각 그룹에서 6마리의 쥐를 희생시켜 비개골과 폐조직을 제거하여 균질화했고, 각각 표분에서 플락 분석법으로 감염성 바이러스의 수준을 결정했으며 평균 log10양을 결정하였다.
도 16은 SH-(-)바이러스의 유전자 순서와 전사산물을 그의 야생형 대응물에 비해 비교를 나타낸다. 위쪽 패널은 야생형 모 재조합 바이러스에 비해 SH-(-)바이러스에 의해 생산되는 어떤 mRNA의 양 분석을 요약한 것이다.
SH-(-)바이러스나 야생형 바이러스로 감염된 세포로부터 세포내 mRNA를 분리하여 유전자-특히 탐지자로 노던 블랏 혼성법으로 분석하였다. 혼성화된 방사선양은 정량화하고, 야생형 모바이러스에 대한 SH-(-)바이러스에의한 각 mRNA의 상대적인 다량을 나타낸다. 아래쪽 패널은 M유전자(유전자 순서에서 5)에서부터 L유전자(유전자 순서에서 10위치)까지의 야생형 바이러스의 유전자 순서를 나타낸다. 이것은 SH-(-)바이러스의 것과 비교한 것으로서, G, F, M2 및 L유전자의 순서상의 위치는 SH유전자의 결실로 변화된 것이다.
도 17은 재조합 바이러스에 어떠한 이종 서열을 삽입하지 않는 방식으로 SH 유전자를 결실시킴으로써 변화된, D46 안티게놈 플라스미드를 설명한다. SH유전자 를 둘러싼 서열은 맨위에 나타냈다. MGE, M-SH 유전자간 영역(IG), SH GS, SH GE 및 SH-G IG 서열을 나타낸다. 결실로 제거된 영역은 밑줄을 그어 표시했으며, 결실부위는 위쪽으로 향한 삼각형으로 나타낸다. 이러한 결실의 결과인 안티게놈이 D46/6368이다.
도 18은 NS 2 단백질을 코딩하는 번역 개방해독구조(open reading frame)에 반복병렬(tandem) 번역 종료 코돈을 도입하는 것을 설명한다. T7 프로모터(그늘진 박스), 리더 영역, 및 NS1, NS 2, N, P, M 및 SH유전자을 포함하는 안티게놈cDNA의 왼쪽말단을 플라스미드 D13은 포함한다. D13의 cDNA의 삽입만을 나타냈다. T7 프로모터 및 NS1과 NS2 유전자를 포함하는 AatII-AflII 단편을 pGem 벡터에 서브클론했고, 부위 특이적 돌연변이을 사용하여 서열로 예시한 영역에서 NS2 ORF을 변형하였다. 코돈 18-26의 야생형 서열을 나타내고(코드되는 아미노산은 아래에 나타냈다), 위의 3 뉴클레오타이드는 2개의 종료코돈(ter)과 한 개의 표지자로서의 XhoI 부위(밑줄로 나타냄)을 도입하는 3 치환을 나타낸다. 결과적인 cDNA 및 회수된 바이러스는 NS2-녹아웃(KO)로 한다.
도 19는 HEp-2세포에서 NS2-녹아웃 RSV에 대한 야생형 RSV(D 53)에의한 감염성 바이러스의 생산을 비교하였다. 3중 단층을 상기 둘 중 어느 하나로 3 pfu/세포의 접종 moi로 감염하고, 정해진 간격으로 샘플을 취하여 플락 분석법과 면역염색법으로 정량화했다.
도 20은 NS1 및 NS2 유전자의 유전자-말단 (GE)신호를 나타낸다. T7플로모터(그늘지게 나타냄)에서부터 4623위치의 PacI부위까지인 안티게놈 cDNA의 왼쪽 말단 을 나타내는 플라스미드 D13을 나타낸다. T7 프로모터 및 NS1과 NS 2유전자를 포함하는 AatI-AflII 단편을 pGem벡터에 서브클론했다. 그것은 동시에 두 부위에서 부위특이적 돌연변이로 변형한 것을 나타내며, 즉 야생형 NS1과 NS2 GE 신호 서열을 나타내고(그리고 완전한 안티게놈 서열에 대한 서열 위치를 확인함), 뉴클레오타이드 치환을 줄위에 나타냈다. NS2 GE 신호의 야생형 서열에서 줄표는 1 뉴클레오타이드만큼 길이가 증가된 GE 신호의 돌연변이를 나타낸다.
도 21은 NS1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 결실을 나타낸다. D13 cDNA의 왼쪽 부분은 바닥에 나타냈고; D13은 안티게놈 cDNA의 왼쪽부분, 즉 리더의 바로 상류인 T7 프로모터를 가지는 리더에서부터 SH 유전자의 말단까지를 함유한다. 결실부위(위쪽 화살표)의 양쪽 서열을 맨위에 나타낸다. 결실은 NS1 ORF의 번역개시부위 바로 앞에서부터 NS2 ORF의 번역개시부위 바로앞까지 포합된다. 따라서, NS1 GS와 상류 비코딩 영역이 NS2 ORF에 융합되는 효과가 된다. 이것이 NS1의 리더-근처 위치로 인해 NS1유전자까지 확장되는 어떠한 cis-작용 서열 요소의 중단의 선도이다.
도 22는 NS 2 mRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 결실을 나타낸다. 상기에서 설명한 바와 같이, D13 cDNA의 왼쪽 부분을 결실부분(위쪽 화살표)의 양쪽 서열과 함께 나타냈다. 결실부위는 NS1 유전자의 바로 상부에서부터 NS2 유전자의 바로 하부까지이다. 따라서,NS2 mRNA를 코딩한 서열은 완전히 제거되었으나, 어떠한 서열도 중단되지 않았다. 결과적인 cDNA 및 회수된 재조합 바이러스는 △NS2라고 한다.
도 23은 분비형 G단백질의 번역개시부위의 제거를 나타낸다. 298 아미노산 G 단백질을 채워진 네모로 나타낸 앵커(anchor)신호 서열을 가진 네모로 나타낸다. 45위치에서 53에 대한 아미노산 서열은 위에 나타내어 두 개의 뉴클레오타이드 치환을 함으로써 아미노산 48을 메티오닌에서 이소루신으로 아미노산 49를 이소루신에서 발린으로 변화시켰다. 전자의 돌연변이는 분배형에 대한 번역개시부위를 제고하였다. 두 돌연변이는 또한 MfeI 부위를 생성하였으며, 이는 돌연변이를 탐지하는 편리한 방법을 제공한다. 결과적인 cDNA 및 회수된 바이러스는 M481(메티오닌-48에서 이소루신-48로 변화)라고 한다.
도 24는 야생형 RSV (D53)에 의한 감염성 바이러스의 생산과 회수된 D53/M481 막 G 돌연변이의 두 분리바이러스의 생산을 비교한 결과이다.
사람의 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV)는 1세 유아의 페렴 및 기관지염의 원인으로서 다른 모든 미생물 병원체보다도 중요하다. 실제로 모든 소아는 2세쯤에 감염되고, 그의 연령 및 성인의 초기에 상당한 빈도로 재감염이 발생한다(Chanock et al., in Viral Infections of Humans, 3rd ed., A.S. Evans, ed., Plenun Press, N.Y. (1989)). RSV는 기도 질환의 원인으로서 소아 입원의 다섯 가지 원인중 하나이며, 이로 인해 미국에서만 매년 91,000명이 입원하고 4,500명이 사망한다고 추정된다. 대부분의 건강한 성인은 RSV 감염으로 인한 심각한 질병에 걸리지 않지만, 중년의 환자와 면역 약화(immunocompromised)된 사람은 이 병원체로 인해 종종 심각하고 생명을 위협할 수도 있는 감염에 걸릴 수도 있다.
RSV에 대한 효과적인 백신을 개발하기 위해 수십 년간 노력했을지라도, RSV에 관련된 높은 질병율과 사망율을 방지하기 위한 안전하고도 효과적인 백신을 아직까지 개발하지 못했다. 성공적인 백신 개발의 실패는 부분적으로 유아가 혈청과 RSV 감염에 대한 분비성 항체 반응이 감소한다는 사실에 관련된다. 따라서, 더욱 심각한 RSV감염의 영향으로부터 성장한 어린이와 성인들을 보호하는 축적된 면역이 있는데 반해, 소아들은 RSV에 의한 더욱 심각한 감염을 겪게 된다. 입원기간의 단축이나 보조적인 치료(supportive therapy)의 필요성을 감소시켰다는 암시는 없을 지라도, 항바이러스 화합물의 하나인 리바바린은 심하게 감염된 소아를 치료할 수 있는 가능성을 보여주었다.
최근에 RSV 감염에 대한 면역 기작이 초점이 되었다. 분비성 항체가 상부 기도를 보호하는 데 중요한 것 같으나, 반면에 높은 수준의 혈청 항체는 하부 기도에서 RSV 감염에 대한 내성에서 주요한 역할을 하는 것 같다. RSV에 대한 항체를 무력화할 수 있는 다량의 정제된 사람 면역 글로불린은 소아와 어린이에 있어서 하부 기도의 심각한 질환에 대한 면역치료학적 접근의 유용한 몇 가지 예를 보여줄 수도 있다. 그러나, 면역글로불린 제제는 혈액-뼈 바이러스의 전달가능성, 및 바이러스 제조와 저장상의 어려움과 경비 등의 몇 가지 단점을 가지고 있다.
1960년대 중반에 포르말린 불활성화 바이러스 백신을 RSV에 대해 테스트하였으나, RSV감염 또는 질환에 대한 방어에 실패하였으며, 사실상 이후의 바이러스 감 염으로 더욱 악화된 징후가 나타났다(Kim et al., Am. J. Epdemiol., 89:422-434 (1969); Chin et al., Am. J. Epidemiol., 89:449-463(1969); kapikian et al., Am. J. Epidemiol., 89:405-421(1969)).
더욱 최근에는, RSV에 대한 백신의 개발은 약독화 RSV 변이에 초점을 두고 있다. Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694(1968)은 저온-계대배양된 RSV 변이주를 보고하고 있으며, 이러한 돌연변이는 백신후보로 충분하다고 생각된다. 이러한 변이주는 야생형 모 바이러스에 비해 26℃에서 성장율이 약간 증가되었나, 복제는 온도 민감성도 아니며 주요하게 저온 적합성도 아니다. 그러나, 저온-계대배양된 변이주는 성인용으로 적합하게 약독화되었다. 이전에 RSV로 감염된 적이 있는 소아나 어린이(즉 혈청반응이 양성인 사람)용으로 만족할 만큼 약독화되고 면역성을 야기할지라도, cpRSV 변이주는 혈청양성 반응인 소아의 하부 기도용으로는 낮은 수준의 병원성을 보유하였다.
이와 마찬가지로, Gharpure 등의 J. Virol. 3:414-421(1969)는 온도 민감성 RSV(tsRSV)의 분리원을 보고하였는데, 이 바이러스도 또한 백신 후보가 될 수 있다. 실험실 및 지원자에 대해 돌연변이주중 하나인 ts-1을 광범위한 평가하였다. 상기 변이주는 성인 지원자에서 무증후성(asymtomatic) 감염을 일으켰으며, 면역 후 45일째에 야생형 바이러스에 대한 내성을 부여하였다. 다시, 혈청양성반응인 소아 및 어린이는 무증후성 감염을 나타냈으며, 혈청양성반응인 소아는 비염(rhinitis)과 가벼운 증후를 나타냈다. 게다가, 비록 온도 민감성을 부분적으로나 완전히 상실한 바이러스는 소부분의 바이러스가 백신으로부터 복귀되었을 지라도, ts표현형의 불안정성이 발견되었으며, ts표현형의 불안정성은 가벼운 비염이외에 다른 질병의 암시와는 관련이 없었다.
상기의 연구와 다른 연구들에 의하면, 어떤 저온 계대배양 및 온도 민감성 RSV 균주가 약독화되었고 몇몇 백신에서 특히 혈청 양성 반응인 소아에 있어서 가벼운 질병의 증후를 야기하였으나, 다른 백신은 지나치게 약독화되어 보호 면역반응을 일으키기에 충분할 만큼 복제가 되지 않았다.(Wright et al., Infect. Immun., 37:397-400 (1982)). 또한, 백신 후보 돌연변이의 유전적인 안정성으로 인해 이들 돌연변이의 온도 민감성 표현형을 상실하거나, 더 나아가 효과적인 RSV백신의 개발을 저해하였다. 일반적으로 보면, Hodes 등의 Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145:1158-1164(1974), McIntosh 등의 Pediatr. Res. 8:689-696 (1974), 및 Belshe 등의 J. Med. Virol., 3:101-110 (1978)을 참조할 것이다.
약독화된 RSV백신 개발을 포기하고, 연구자들은 감염된 세포 용해물에서 얻은 정제된 RSV 외피(envelope) 당단백질을 사용하여 잠재적인 서브유니트 백신 후보를 테스트하였다. 상기 당단백질은 코튼랫(cotton rat)의 폐에서 RSV 감염에 대해 내성을 유도하였으나(Walsh et al., J. Infect. Dis. 155:1198-1204(1987)), 그 항체는 매우 약한 무력화 활성을 가지며, 정제된 서브유니트 백신으로 설치류를 면역화함으로써 질병에 대한 약효를 유도하였다(Murphy et al., Vaccine 8:497-502 (1990)).
F나 G 외피 당단백질을 발현하는, 백신 바이러스의 재조합에 근거한 백신도 또한 개발되었다. 이들 재조합체는 실제 바이러스의 대응부와는 구별되는 RSV 당단 백질을 발현하며, 백신-RSV의 F와 G 재조합 바이러스로 피내주사로 감염된, 작은 설치류는 높은 수준의 특이한 항체를 발달시켰으며, 이 항체는 바이러스 감염도를 무력화하였다. 실제로, 백신-F 재조합체로 코튼랫을 하부 기도에서 거의 완전한 내성을 촉진하였으며 상부 기도에서 상당한 내성을 촉진하였다(Olmsted등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7462-7466 (1986)). 그러나, 백신 F와 G 재조합체로 침팬지를 면역화한 결과, 상부 기도에서 RSV에 대한 보호가 없었으며(Collins et al., Vaccine 8:164-168 (1990)), 하부 기도에서 보호가 일관적이지 않았다(Crowe et al., Vaccine 11:1395-1404 (1993)).
약독화된 RSV 균주 서브유니트 백신을 개발하지 못했고, RSV 백신 개발을 위한 다른 전략은 새로운 RSV 백신의 재조합 공학을 위한 유전적인 목표를 확인할 방법과, 유전적 변화를 도입하여 생존하고 약화된 RSV 재조합체상에서 새로운 표현형적 특성을 야기하기 위해서 재조합 RSV를 다루는 방법을 개발하는 방법에 대한 필요성을 예고하였다. 그러나, RSV 및 다른 (-)-센스 RNA 바이러스의 게놈 RNA의 취급은 지금까지 어렵다는 것이 증명되었다. 이와 관련된 주요한 장애는 이들 바이러스의 게놈 RNA만으로는 감염할 수 없고, 조직배양에서 바이러스의 성장이 나쁘며, 복제주기가 길고, 비리온이 불안정하고, 게놈이 복잡하고, 그리고 유전자 산물의 구성성분을 다루기 어렵다는 것이다.
단편화되지 않은 (-)-사슬 RNA 바이러스의 직접적인 유전자 조작은 최근에야 비로소 개발되었다(재검토를 위해 다음을 참조, Conzelmann, J. Gen. Virol. 77:381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11354-58 (1996)). 감염성 광견병 바이러스(rabies virus), 소낭구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus), 홍역 바이러스 (measles virus) 및 센다이바이러스(Sendai virus)에 대해, 뉴클레오캡시드 N, 인단백질 P, 및 폴리머라제 큰 서브유니트 L이 존재할 때 cDNA가 코딩한 안티게놈 RNA로부터 회수를 성공적으로 달성하였다(Garcin et al., EMBO J. 14:6087-6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl. Acda. Sci. U.S.A. 92:4472-81 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14:5773-5784 (1995); Schnell et al., EMBO J. 13:4195-203 (1994); Whelan et al., Proc. Natl. Acal. Sci. U.S.A. 92:8388-92 (1995)). RSV의 성공적인 제조는 또한 추가적인 단백질, 즉 M2 ORF1 전산 연장인자를 필요로 한다(Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-7 (1995)).
다수의 인자 때문에 감염성 RSV의 구조가 복잡하다. 구체적으로, RSV는 그 자체로 뉴모바이러스 속의 다른 구성원과는 파라믹소바이러스, 루불라바이러스 및 모르빌리바이러스속 들중 잘 특징화된 파라믹소바이러스와는 구별되는 몇몇 특성을 가진다.
이러한 차이점에는 더 많은 수의 mRNA, 게놈의 3'말단에 독특한 유전자 순서, 당단백질과 M2 유전자의 순서에 있어서 종과 종간의 다양성, 속간 영역에서 더 큰 다양성, 뮤신-유사 특성을 나타내는 부착 단백질, 광범위한 균주대 균주간 서열의 다양성, 및 다른 비단편 (-)-사슬 RNA 바이러스에서는 나타나는 몇몇 단백질이 발견되지 않는다는 사실등이다.
이상의 기술로부터, RSV로 인한 심각한 건강문제, 특히 소아와 어린이에서의 질병을 완화시키기 위해서 안전하고 효과적인 백신을 제조하기 위한 도구와 방법에 대한 분야에서 여전히 긴급한 필요성이 남아있다. 매우 놀랍게도, 본 발명은 이러한 필요성과 관련된 다른 필요성을 만족시키고 있다.
본 발명은 분리되고 약독화된 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV)를 고안 및 제조하기 위한 신규한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 RSV는 야생형으로부터 생물학적으로 유래되거나 RSV 돌연변이 모균주 저장품에서 선택하거나, 또는 재조합기법으로 조작하여 표현형-특이한 유전적 변화를 포함하는 것이다. 백신용으로 고안되고 선택된 RSV는 적어도 두 가지, 종종 적어도 세 가지 약독화된 변이가 일어난다. 일예에서, 적어도 한가지 약독화된 변이가 RSV 폴리머라제 유전자에서 일어나며, 폴리머라제 단백질상에서 아미노산의 변화를 특정하는 뉴클레오타이드 치환을 포함함으로써, 온도 민감성 (ts) 표현형을 나타낸다. 생물학적 유래 및 재조합 RSV는 큰 폴리머라제 유전자(L)상에서 하나이상의 뉴클레오타이드 치환을 포함함으로써 아미노산 Phe521, Gln831, Met1169, 또는 Tyr1321상에서 아미노산 변화가 일어나는 결과가 되며, Phe521에 대해서는 Leu, Gln831에 대해서는 Leu, Met1169에 대해서는 Val, 또는 Tyr1321에 대해서는 Asn이 예이다. 혹은, 또는 부가적으로, 본 발명의 RSV는 다른 RSV 유전자, 예를 들면 M2 유전자에서 뉴클레오타이드 치환을 포함할 수도 있다.
약독화 변이를 RSV 유전자의 코딩 부분 또는 cis-조절 서열과 같이 비코딩 부분에서 선택할 수 있다. 전형적인 비코딩 부분의 돌연변이는 유전자 개시 서열에서 하나 또는 여러 개의 염기 변화를 포함할 수도 있으며, 예로는 M2 유전자 개시 서열의 뉴클레오타이드 7605위치에서 하나 또는 여러 개의 염기치환이다. 바람직하게는, 둘 또는 세가지 변이가 약독화 변이를 특정하는 코돈에 포함될 수 있으며, 예를 들면, 아미노산 Phe521, Gln831, Met1169, 또는 Tyr1321 에서 ts 변이를 특정하는 코돈에서 일어나며, 이로써 ts표현형의 복귀 가능성을 감소시킨다.
본 발명의 일례에서, 생물학적 유래 또는 재조합 RSV를 선택하거나 조작함으로써 적어도 두 가지의 약독화 ts 변이를 포함할 수 있으며, 그 예로는, 생물학적으로 유래한 신규한 백신 균주 cpts-530/1009, ATCC No. 2451 에서 예시되는 것과 같이 폴리머라제 유전자의 아미노산 Phe521, Met1169에서, 생물학적 유래 균주 cpts-530/1030, ATCC No. VR 2455에 의해 예시되는 바와 같이 Phe521과 Tyr1321에서, 생물학적 유래 RSV 균주 cpts-248/404, ATCC No. VR 2454에 의해 예시되는 바와 같이 뉴클레오타이드 7605에서 M2 유전자의 개시 돌연변이 또는 뉴클레오타이드 7605에서 M2 유전자의 개시 돌연변이, 및 재조합 RSV rA2cp/248/404/530에 의해 예시되는 바와 같이 Phe521등이다.
선택된 약독화 돌연변이가 도입된 생물학적 유래 RSV는 야생형RSV, 제한적-숙주범위 저온-계대배양 RSV, 제한적-숙주범위 저온-계대배양 RSV의 저온적응 돌연변이, 또는 온도민감성 돌연변이 균주도 포함한다. 예를 들면, 저온-계대배양 호흡기 세포 융합 바이러스는 cpRSV 균주일 수 있고, 적어도 두 가지 온도 민감성 변이 가 도입된 cpRSV를 포함한다. 약독화된 RSV 균주는 서브그룹A일 수 있으며, 그 예로는 cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts 248/404 (ATCC VR 2454), cpts 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC 2452), cpts 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts 530/1030 (ATCC 2455), 또는 서브그룹B일 수 있으며 예를 들면 B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542) 또는 B-1 cp-23이며, 각각은 부다페스트조약하에 Americal Type Culture Collection (ATCC), 미국 메릴랜드 20852, 록빌, 파크론 드라이드 12301 기탁되었고, 상기 증명 수탁번호를 부여받았다.
본 발명의 또 다른 일례에서, 분리된 감염성 재조합 RSV는 RSV 게놈이나 안티게놈, 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰(L) 폴리머라제 단백질, 및 RNA 폴리머라제 연장인자로 구성된 것이 제공된다. RNA 폴리머라제 연장인자는 RSV의 M2(ORF 1)일 수 있다. 분리된 감염성 RSV는 바이러스나 서브바이러스 입자일 수 있다. 게놈이나 안티게놈은 야생형 RSV 서열, 약독화된 표현형을 특정하는 생물학적 유래 변이 서열, 또는 야생형 RSV 게놈이나 안티게놈을 코딩하는 재조합 RSV 서열, 또는 어떠한 생물학적 유래의 RSV 균주에서 발견되지 않는 변이의 조합이나 유전공학적 돌연변이의 재조합으로 변형된 RSV 서열을 포함할 수 있다.
어떠한 RSV 또는 RSV-유사 바이러스, 예를 들면, 사람바이러스, 소바이러스, 쥐 바이러스( 쥐의 뉴모니아 바이러스(pnemonia virus)), 조류 바이러스(터키 리모트라췌티스 바이러스(turkey rhinotracheitis virus))로부터 유래되거나, 또는 다른 바이러스, 예를 들면, 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus (PIV))에 서 유래된, 코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 비코딩 뉴클레오타이드 서열을 감염성 RSV 클론은 병합할 수 있다. 전형적인 예에서, 재조합RSV는 사람의 RSV 게놈이나 안티게놈 서열이 이종의 RSV 서열과 재조합된 키메라(chimera)를 포함한다. 전형적인 이종 서열은 다른 사람의 RSV 균주(예, cpts RSV248, cpts 248/955, cpts RSV530, cpts 530/1009, 또는 cpts 530/1030으로 부터 선택된 둘 이상의 키메라 서열) 또는 서브그룹(예, RSV 서브그룹 A 및 서브그룹 B서열의 조합)와 조합된 사람의 RSV 규주로 부터, 사람이외의 RSV로 부터, 또는 PIV와 같은 또다른 바이러스로부터 유래된 RSV 서열을 포함한다.
본 발명의 일예에서, 예를 들면, 야생형이나 생물학적으로 유래된 돌연변이 서열에 비해서, 게놈이나 안티게놈이 재조합적으로 변형된 재조합 RSV를 제공한다. 재조합적으로 변형된 RSV 클론내에서 병합된 돌연변이는 선택된 RSV 단백질의 발현 및/또는 기능을 변화시키는 능력, 원하는 표현형의 변화의 야기, 또는 다른 여러 가지 목적에 기초하여 선택될 수 있다. 원하는 표현형 변화에는 예를 들면, 배양에서의 바이러스의 생장변화, 온도민감성, 플락 크기, 약독화 및 면역원성이 포함된다. 예를 들면, 게놈이나 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 뉴클레오타이드 삽입, 재배열, 결실 또는 치환으로 변화시켜 약독화, 온도민감성, 저온 적응, 작은 크기의 플락, 숙주범위의 제한, 유전자 발현상의 변화, 도는 면역성 에피토프의 변화를 특정할 수 있다.
다른 일예에서, RSV 폴리머라제 유전자 L상에서 적어도 하나의 약독화된 돌연변이가 일어난 재조합 RSV를 제공하며, 재조합 RSV는 (ts) 표현형을 특정하는 뉴 클레오타이드 치환을 포함한다. 전형적인 RSV 클론은 폴리머라제의 Phe521, Gln831, Met1169, 또는 Tyr1321위치에서의 아미노산의 변화를 가져오는 뉴클레오타이드 치환을 포함한다. 바람직하게는, 둘 또는 세 가지 돌연변이가 약독화 변이를 특정하는 코돈에 포함된다. 다른 전형적인 RSV 클론은 적어도 두 가지 약독화된 ts돌연변이를 포함한다.
생물학적으로 유래된 약독화 RSV상에서 일어나는 변이는 각각 도입되거나 완전한 길이의 RSV클론으로 결합하여 도입될 수 있으며, 도입된 변이를 포함하는 분리된 재조합 바이러스의 표현형을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적인 예에서, 야생형 바이러스에 비해 약독화된 생물학적-유래 바이러스가 나타내는 아미노산 변화, 예를 들면, 저온-계대배양RSV(cpRSV) 또는 cpRSV의 온도 민감성 유도체와 같이 추가로 약독화된 RSV 균주가 나타내는 아미노산 변화는 재조합 RSV 클론내에 병합된다. 야생형이나 생물학적으로 유래된 변이 RSV 서열의 이러한 변화는 결과적인 클론에서 원하는 특징, 예를 들면, 약독화 또는 추가로 약독화된 표현형을 특정한다. 야생형이나 생물학적으로 유래된 변이 서열에 비해 둘 또는 세가지 뉴클레오타이드 변화을 사용함으로써 이러한 변화를 재조합 바이러스로 도입하는 것이 바람직하며, 이것은 유전자 복귀에 대한 변이를 안정화시키는 효과를 가진다.
본 발명은 또한 다수의 야생형-특이 변이가 선택된 조합으로 감염성 클론의 게놈이나 안티게놈에 도입된, 재조합 RSV를 제공하는 것이다. 표현형 평가와 함께, 이러한 과정은 약독화, 온도민감성, 저온 적응성, 작은 크기의 플락, 숙주 범위제 한 등과 같은 원하는 특성을 지닌 변이주 재조합 RSV를 제공한다. 따라서, 동정된 돌연변이는 "메뉴(menu)"를 따르고, 선택된 수준의 약독화, 면역원성, 및 안정성으로 백신 바이러스를 정하기 위해서 다양한 조합으로 도입된다. 바람직한 일례에서, 본 발명은 동일하거나 상이한 유전자를 포함하는 추가적인 유형의 돌연변이로 예를 들면 cp 및 ts돌연변이와 같은 생물학적 RSV로부터 채택된 하나 이상의 변이의 보충물을 제공한다. 본 문맥에서 변이처리를 위한 표적 유전자는 부착(G) 단백질, 융합(F) 단백질, 작은 소수성(SH), RNA 결합 단백질(N), 인단백질(P), 큰 폴리머라제 단백질(L), 전사연장인자(M2), M2 ORF, 매트릭스(M)단백질, 및 두개의 비구조성 단백질, NS1 및 NS2를 포함한다. 신규한 RSV 재조합체를 얻기 위해서 이들 단백질 각각을 전체적으로 또는 부분적으로, 단독으로 또는 다른 원하는 변형과 조합하여, 선택적으로 결실, 치환 또는 재배열시킬 수 있다. 일례에서, 생체외(in vitro) 성장 증가 및/또는 생체내(in vivo) 약독화를 포함하는 신규한 표현형적 특징을 갖는 재조합 RSV를 생성하기 위해서 SH유전자를 결실시킨다. 관련된 예에서, 이 유전자 결실 또는 또 다른 선택된, 비-필수적인 유전자나 유전자 단편의 결실, 예를 들면, NS1이나 NS2 유전자의 결실은, 생물학적으로 유래된 약독화 RSV 돌연변이로부터 직접적으로 채택된(또는 변형된 형태로, 예를 들면, 다수의 뉴클레오타이드를 변이를 특정하는 코돈에 도입함으로써) 변이와 같은 약독화된 표현형을 특정하는 하나이상의 변이와 조합하여 재조합 RSV에서 일어난다. 예를 들면, cpts 248/404, cpts 530/1030으로부터 채택된 하나이상의 cp 및/또는 ts돌연변이 또는 다른 선택된 변이 RSV 균주와 조합하여 SH 유전자 또는 NS2 유전자를 결실시켜, 여러 가지 변이처 리의 조합된 효과 때문에 바이러스의 생산 증가, 약독화능의 향상, 약독화된 표현형으로부터 복귀에 대한 유전적인 내성을 가지는 재조합 RSV 를 생산한다.
이에 더하여, 생물학적으로 유래된 돌연변이주 RSV로부터 채택된 하나이상의 약독화 돌연변이와 단독 또는 조합으로 감염성 RSV에 포함시키기 위해서, 재조합 RSV 게놈이나 안티게놈에서 상이한 다양한 유전적 변이를 생성시킬 수 있다. 이종의 유전자(예를 들면, 다른 RSV 균주 또는 서브그룹 또는 비 RSV 유래)를 전체적으로나 부분적으로 삽입하거나, 유전자 순서를 변화시키거나, 유전자 중복을 제거하거나, RSV 게놈 프로모터를 그의 안티게놈 대응부로 치환하거나, 유전자중 일부분을 제거 또는 치환하거나, 심지어 유전자 전체를 결실시킬 수 있다. 서열상에 상이하거나 추가적인 변화를 야기하여 조작을 용이하게 할 수 있으며, 예로는 다양한 유전자간 영역(예를 들면, G유전자와 F유전자사이에 유일한 StuI 부위를 삽입 ) 또는 그 외 부위에 유일한 제한효소부위를 삽입하는 것이다. 비번역 유전자 서열을 제거함으로써 외부 서열의 삽입능을 증가시킬 수 있다.
전형적인 예에서, 하나의 RSV의 각 유전자, 유전자 단편, 또는 하나 또는 다수 뉴클레오타이드를 이종의 RSV나 다른 출처의 대응서열에 의해 치환시킬 수도 있다. 예를 들면, RSV로부터 선택된 단백질의 세포질쪽 꼬리부, 막관통 영역이나 엑토도메인, 에피토프 부위나 영역, 결합 부위나 영역, 활성부위나 활성부위를 포함하는 영역 등을 코딩하는 부분과 같은 선택된, 이종의 유전자 단편으로 또 다른 RSV의 대응 유전자 단편을 치환시킴으로써, 예를 들면, 또 다른 RSV의 엑토도메인(ectodomain)에 융합된 RSV의 세포질쪽 꼬리부 및/또는 막관통 영역을 가진 키메라 단백질을 발현하는 재조합체와 같은 신규한 재조합체를 생성한다. 일례에서, RSV 균주나 서브그룹의 F 및/또는 G 보호항원을 다른 균주나 서브그룹의 RSV 클론으로 치환시켜 면역화된 숙주에서 두 가지 균주나 서브그룹 모두에 대해서 교차- 보호 면역 반응을 자극할 수 있는 재조합 바이러스를 생산할 수 있다. 추가적인 예에서, 유전자나 유전자 단편, 예를 들면, 치환된 이종의 F 및/또는 G유전자나 유전자 단편의 변화를 포함하는 돌연변이를 가지는 키메릭 RSV 클론을, 생물학적으로 유래된 돌연변이 RSV 균주, 예를 들면, cpts248/404, cpts530/10098, 또는cpts530/1030로부터 채택된 하나이상의 약독화 ts 또는 cp 점돌연변이을 도입함으로써 추가로 변형시킬 수 있다. 추가의 예에서, 하나 이상의 사람 RSV 코딩 또는 비코팅 폴리뉴클레오타이드를 소나 쥐RSV의 대응부로, 단독이나 하나이상의 선택된 cp 또는 ts돌연변이와 조합하여 치환시킴으로써, 신규한 약독화된 백신 균주를 생성할 수 있다. 일예에서, 키메릭 소-사람 RSV는 소의 NP유전자나 유전자 단편에 의해 사람의 RSV NP 유전자나 유전자 단편의 치환을 포함할 수 있으며, 여기서 키메라는 임의로 SH유전자 결실, 하나이상의 cp나 ts 점돌연변이, 또는 이들 또는 본 명세서에 기재된 다른 돌연변이와 다양한 조합을 포함하도록 제조할 수 있다.
또는, RSV 게놈이나 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 변형시켜 비-RSV 서열, 예를 들면, 사이토키닌, T-헬퍼 에피토프, 제한효소부위 표시자, 또는 표적 숙주에서 보호면역반응을 유발할 수 있는 미생물 병원체의 단백질(예를 들면, 바이러스, 세균, 또는 곰팡이)을 코드하게 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에서, 감염성, 약독화된 백신 바이러스를 생성하기 위하여 전술한 구조적 변화 및 표현형적 변화를 재조합 RSV에 도입하는 신규한 방법을 제공한다. 일예에서, RSV 게놈이나 안티게놈을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 또한 N, P, L 및 RNA폴리머라제 연장인자 단백질을 코딩하는 하나이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 동일하거나 상이한 발현벡터를 제공한다. 상기 벡터(들)는 하나의 세포나 무세포 용해물(lysate)에서 함께 발현됨으로써, 감염성 RSV 입자를 제조한다. RSV 게놈이나 안티게놈 및 N, P, L 및 RNA폴리머라제 연장인자 단백질을 동일하거나 상이한 발현벡터에서 함께 발현할 수 있다. 몇몇 예에서, N, P, L, 및 RNA폴리머라제 연장인자단백질을 각각 다른 발현벡터에 코딩한다. RSV 게놈이나 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 사람, 소, 또는 쥐 RSV 서열에서 유래되었거나, 다른 RSV 또는 비-RSV 서열의 키메라일 수 있다. 예를 들면, 서브그룹 B RSV의 서열이 연결된 서브그룹 A RSV로부터 유래된 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 PIV 서열이 연결된 RSV 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. RSV 게놈이나 안티게놈을 야생형이나 생물학적으로 유래된 돌연변이주 RSV 에 하나이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 재배열, 결실 또는 치환, 예를 들면, 점돌연변이, 부위특이적 뉴클레오타이드 변형 및 전체 유전자나 유전자 단편을 포함하는 변화를 일으킬 수 있다. 이들 변화는 전형적으로 결과적인 재조합 RSV에서 선택된 표현형 변화, 예를 들면, 약독화, 온도민감성, 저온 적응성, 작은 크기의 플락, 숙주범위제한, 유전자 발현의 변화 또는 면역원성 에피토프상의 변화를 특정한다.
또 다른 일예에서, 본발명은 RSV게놈이나 안티게놈을 코딩하는 분리된 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터 및 RSV의 N, P, L 및 RNA폴리머라제 연자인자 단백질을 코딩하는 하나이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현벡터를 포함하는 세포나 무세포 용해물을 제공한다. 게놈이나 안티게놈, N, P, L 및 RNA폴리머라제 연장인자 단백질의 발현이 결합되어 바이러스 입자 또는 서브바이러스 입자 등의 감염성 RSV 입자를 생성한다.
본 발명의 약독화된 RSV는 감염된 사람 숙주에서 보호면역반응을 유발시킬 수 있으나, 면역화된 숙주에서 심각한 호흡장애 질병에 관련된 받아들이기 어려운 징후를 야기할 수 없도록 충분히 약독화되었다. 약독화된 바이러스는 세포배양 상징액에 존재하거나, 배양으로부터 분리되거나, 부분적으로나 완전히 정제된 형태로 존재할 수도 있다. 상기 바이러스를 또한 동결건조하고, 바람직하게 저장이나 숙주로의 전달을 위한 다른 다양한 성분과 결합될 수도 있다.
본 발명은 추가로 생리학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제 및 분리된 약독화 RSV 균주를 함유하는 신규한 백신을 제공한다. 일예에서, 상기 백신은 적어도 두 가지 및 종종 셋 이상의 약독화된 돌연변이, 호흡기 세포 융합 바이러스의 폴리머라제 유전자상에서 Phe521, Gln831, Met1169, Tyr1321의 아미노산에서 온도민감성 치환을 야기하는 적어도 하나의 돌연변이를 가지는 감염성 RSV으로 이루어진다. 다른 일예에서, 백신은 재약독화된 재조합체 RSV로 이로우진다. 상기 백신은 약독화된 바이러스의 103 내지 106 PFU의 량으로 제조될 수 있다. 상기 백신은 항원성 서브그룹 A 또는 B중 어느 하나의 약독화된 바이러스로 이루어지거나, 또는 더 광범위한 우세한 RSV 감염을 위해, 항원성 서브그룹 A 또는 B 둘 모두가 백신 제제에서 혼합될 수 있다.
다른 일예에서, 본 발명은 RSV에 대한 보호를 유도하는 우세한 RSV에 대해 더 넓은 보호를 위해 각 개체의 면역시스템을 자극하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본발명의 약독화된 호흡기 세포 융합 바이러스를 면역학적으로 충분한 양으로 제제화된 백신을 투여하는 것으로 이루어진다. 일예에서, 상기 백신은 다수의 약독화 돌연변이, L 유전자상에서 Phe521, Gln831, Met1169, Tyr1321 아미노산 위치에서 ts치환을 특정하는 하나이상의 것을 포함하는 감염성 RSV를 포함한다. 상기 바이러스는 전형적으로 허용가능한 담체 및/또는 보조제와 함께 투여될 수 있다. 상기 방법은 분무, 점적(droplet), 에어로졸 등과 같은 방법으로 서브그룹 A 및/또는 서브그룹 B의 약독화된 바이러스는 개체에게 103 내지 106 PFU의 양으로 상부 기도에 투여하는 것을 포함한다. 일반적으로, 상기 바이러스에 대한 항체에 대한 혈청음성 개체에게 또는 태반을 통해(transplacentrally) 획득한 어머니의 항-RSV 항체를 가진 개체에게 비강내로 약독화된 바이러스를 투여한다.
본 발명은 사람의 백신용으로 적합한, 생물학적으로 유래된 RSV 및 재조합 RSV을 제공한다. 불완전하게 약독화된 RSV 균주, 예를 들면, 온도민감성(ts) 또는 저온-계대(cp) RSV 바이러스, 또는 야생형 바이러스, 예를 들면, RSV 균주 A2에 특이한 약독화 돌연변이를 도입함으로써 본 명세서에서 기술된 약독화된 RSV를 제조 한다. 생물학적으로 유래된 RSV상에서의 돌연변이는 자연적으로 일어나거나, 공지된 돌연변이처리법이나 유사한 방법으로 선택된 RSV 균주에 도입될 수도 있다. 본 명세서에서 일반적으로 기술되고 USSN 08/327,263에서 기술되는 바와 같이(이들은 본 명세서의 참고문헌으로 삽입됨), 예를 들면, 화학적 돌연변이제가 첨가된 세포배양에서 바이러스가 성장하는 동안 화학적 변이처리를 함으로써, 성장 제한 돌연변이를 도입하기 위해서 최적온도이하에서(suboptimal temperature) 처리하여 바이러스를 선택함으로써, 또는 세포배양에서 작은 플락을 형성하는 돌연변이 바이러스를 선택함으로써 불완전하게 약독화된 모 RSV 균주를 제조할 수 있다.
"생물학적 유래 RSV"라 함은 재조합 수단에 의하여 제조되지 않은 어떠한 RSV를 의미한다. 따라서 생물학적 유래 RSV는 자연적에 존재하는 모든 RSV서브그룹 및 균주, 예를 들면, 야생형 게놈 서열을 가지는 자연적으로 존재하는 RSV 및 기준 야생형 RSV 서열로부터 변형된 게놈을 가지는 RSV, 예를 들면, 약독화된 표현형을 특정하는 돌연변이를 가지는 RSV를 포함한다. 이와 마찬가지로, 생물학적 유래 RSV는 특히, 인위적인 변이처리야기와 선택함으로써 모 RSV 균주에서 유래된 RSV 돌연변이를 포함한다.
만족할 만큼 약독화된 본 발명의 RSV를 제조하기 위해서, 불완전하거나 부분적으로 약독화된, 예를 들면, ts-1, ts-4 및 cpRSV에 돌연변이를 도입하는 것이 바람직하다. 서브그룹 A의 바이러스에 대해서는, 불완전하게 약독화된 모 바이러스는 ts-1, ts-1NG 또는 cpRSV가 바람직하며, 이는 서브그룹 A의 A2 균주의 널리 알려진 돌연변이, 또는 유도체나 그들의 서브클론이다. 다른 일례에서, 약독화된 표현형과 관련된 특이한 돌연변이를 확인하고 백신용으로 적합한 균주에 도입한다. 특히 약독화된 돌연변이가 도입된 균주는 야생형 바이러스 또는 이미 부분적으로 약독화된 바이러스일 수 있으며, 이미 부분적으로 약독화된 바이러스인 경우에 추가의 변이치리로 균주를 추가로 약독화시켜, 예를 들면, 포유동물 숙주에서 바람직한 수준의 제한된 복제를 야기하여 백신을 맞은 사람에게 보호를 부여하기에 충분한 면역성을 보유하도록 한다.
서브그룹 A 또는 B 바이러스의 부분적으로 약독화된 돌연변이를 야생형 바이러스를 수용가능한 세포기질에 생물학적으로 클로닝하고 그들은 저온-계대 돌연변이로 개발시킴으로써, 화학적 돌연변이로 바이러스를 처리하여 ts돌연변이를 제조함으로써, 또는 작은 크기의 플락이나 그들의 유사한 표현형 돌연변이를 선택함(예, Murphy 등의, International Publication WO 93/21310, 본 명세서의 참고문헌으로 병합됨)으로써 제조할 수 있다. 서브그룹 B 바이러스에 대하여, 부분적으로 약독화된 전형적인 모 바이러스는 cp 52/2B5이고, 이는 서브그룹 B의 B1 균주이다. 다양한 선택 기술을 결합하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 추가의 유도에 유용한 비 약독화 서브그룹 A 또는 B로부터 부분적으로 약독화된 변이주를 제조할 수도 있다. 추가로, 약독화 표현형을 특정하는 돌연변이를 단독으로 또는 결합하여 불완전하게 약독화된 서브그룹 A 또는 B 바이러스에 도입함으로써 원하는 수준의 약독화와 백신을 접종받은 사람에서 원하는 수준의 면역성을 부여하는 다수의 특정된 약독화 돌연변이를 가지는 백신 바이러스를 제조할 수도 있다.
일단 부분적으로 약독화된 원하는 모 균주를 선택한다면, 본 발명에 따라 사 람에게 유용한 수용가능한 백신을 제조하기에 추가의 약독화를 본 명세서에서 기술한 수가지 방법으로 달성할 수도 있다. 예를 들면, cpRSV 돌연변이주를 추가로 수가지 방법으로 돌연변이시킬 수 있다. 일례에서, 그 방법은 부분적으로 약독화된 돌연변이를 점차 더 낮은 약독화 온도에서 세포배양하는 것을 포함한다. 예를 들면, 야생형 바이러스는 일반적으로 약 34-37℃에서 성장하는 반면에, 부분적으로 약독화된 돌연변이주는 세포배양(예, 1차 소 신장세포 )을 최적온도이하, 예를 들면,20-26℃에서 처리함으로써 제조할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 한가지 방법에서, cp돌연변이나 다른 부분적으로 약독화된 균주, 예를 들면, ts-1 또는 sp는 MRC-5 또는 Vero세포에서 약 20-24℃, 바람직하게는 20-22℃에서 처리함으로써 더 낮은 온도에서 효과적으로 성장하도록 적응시킨다. 저온-계대배양 동안 돌연변이 RSV의 이러한 선택으로 부분적으로 약독화된 모 균주에 비해 유도 균주에 남아있는 어떠한 독성을 대체로 제거한다. 혹은, 돌연변이야기나 ts, sp, 또는 ca에 대한 돌연변이등의 cp돌연변이에 특이한 돌연변이를 추가로 도입함으로써 재조합 균주을 처리할 수도 있다.
본 발명의 일예에서, 불완전하게 약독화된 RSV 균주에 화학적 돌연변이야기를 일으켜 ts 돌연변이를 유도하며, 이미 ts돌연변이인 바이러스의 경우에는 약독화된 유도체에 ts표현형의 증가된 안정성을 부여하기에 충분한 추가의 ts돌연변이를 유도한다. ts 돌연변이를 RSV에 도입하는 방법은 5-플루오로우라딘이나 5-플루오로우라실과 같은 돌연변이제를 약 10-3 내지 10-5, 바람직하게는 10-4 농도의 존재 하에서 바이러스를 복제하거나, Gharpure et al., J. Virol. 3:414-421 (1969) 및 Richardson et al., J. Med. Virol. 3:91-100 (1978)등에 기술된 일반적인 방법에 따라 니트로소구아니딘 약 100μg/ml농도에 바이러스를 노출시키거나, 또는 특이한 ts 돌연변이를 유전적으로 도입하는 방법이 포함된다. 다른 화학적 돌연변이제도 또한 사용될 수도 있다. 약독화는 어떠한 RSV 유전자에서의 ts 돌연변이로부터 생성되고, 그리고 본 명세서에서 확인한 것과 같이 ts 돌연변이는 일반적으로 폴리머라제(L)유전자와 관련된다.
허용 온도에서 복제와 수가지 제한 온도에서의 복제를 비교함으로써 본 발명의 전형적인 약독화 RSV에서 복제의 온도민감성의 정도를 결정한다. 바이러스의 복제가 허용 온도에서의 복제에 비해 100배 또는 그이상의 감소가 일어나는 최저 온도를 차단 온도(shutoff temperature)라고 한다. 실험 동물 및 사람에서, RSV의 복제와 독성 모두가 돌연변이의 정지온도와 관련이 있다. 39℃인 정지온도를 가진 돌연변이의 복제는 중간정도로 제한되는 반면에, 38℃인 정지온도를 가진 돌연변이는 잘 복제되지 않으며 병든 징후가 주고 상부 기도에 제한된다. 정지온도가 35-37℃인 바이러스는 일반적으로 사람에서 완전히 약독화될 것이다. 따라서, ts인 본 발명의 약독화 RSV는 정지온도가 35-39℃이고, 바람직하게는 35-38℃이다. 부분적으로 약독화된 돌연변이에 ts돌연변이의 추가는 본 발명의 백신 조성물에 유용한 수배로 약독화된 돌연변이를 생성한다.
수회 화학적으로 처리하여 다수의 돌연변이를 이미 저온-계대(예, Conners et al., Virology 208:478-484 (1995); Crowe et al., Vaccine 12: 691-699 (1994); Crowe et al., Vaccine 12: 783-790 (1994), 본 명세서에 참고문헌으로 삽입됨)에서 약독화된 바이러스에 도입함으로써 비강내 투여용 백신 후보인 다수의 약독화된 RSV 균주를 개발해왔다. 설취루, 침팬지, 성인 및 유아에서의 평가에 의하면, 어떤 후보 백신균주는 상대적으로 유적적으로 안정하며, 면역성이 높으며, 만족할 만큼 약회되었을수도 있다. 하기에서 예를 드는 바와 같이, 이들 몇몇 약독화 바이러스의 뉴크레오타이드 서열 분석에 의하면, 증가된 각 수준의 약독화는 특이한 아미노산 및 뉴클레오타이드 치환과 관련된다. 본 발명은 발현되지 않는 중요하지 않은 돌연변이와, 단독으로나 여러 가지 조합으로 감염성 RSV 게놈이나 안티게놈에 돌연변이를 도입함으로써 표현형의 차이의 원인이 되는 돌연변이를 구별하는 방법을 제공한다. 모 바이러스와 유도체 바이러스의 표현형 특성의 평가와 결합된 이러한 방법으로 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성, 작은 크기의 플락, 숙주범위제한 등의 바람직한 특성의 원인이 되는 돌연변이를 확인한다. 따라서 확인된 돌연변이는 "메뉴(menu)"를 따르고 단독이나 조합하여 원하는 대로 도입되어, 바람직하게 적절한 수준의 약독화, 면역성, 약독화된 돌연변이로부터 복귀에 대한 유전적 내성으로 백신 바이러스를 조절한다.
일련의 임의적인 화학적 돌연변이로 ts 표현형을 가지는 약독화된 RSV를 추가로 생성시키는 특이한 돌연변이를 서열분석과 모 배경, 예를 들면, cpRSV 배경에 대한 비교함으로써 확인한다. 전형적인 예에서, 폴리머라제 유전자(L)내 뉴클레오타이드 10,989(A가 T로 변화된 결과, 아미노산 831위치에서 gln이 leu으로 치환됨)에서의 치환으로 cpts RSV 248을 생성하거나, 또는 뉴클레오타이드 10,060(C 가 A 로 변화한 결과, 아미노산 521에서 phe이 leu으로 치환됨)에서의 치환으로 phe을 leu으로 치환시켜 cptsRSV 530을 생성한다. 이들 조합된 약독화 돌연변이는 모 cpRSV에서 결정된 것보다 더 큰 약독화 표현형을 특정한다. cptsRSV 248은 정지온도가 38℃이며, 약독화, 면역성이 있고 혈청음성(seronegative) 침팬지에서 야생형 RSV의 감염에대해 완전히 보호하며, 그전에 평가된 RSV 돌연변이보다 생체외에서 복제동안 유전적으로 더 안정한다. 표현형 복귀에 대한 유전적 내성의 속성 및 생체외 복제의 제한은 또한 이러한 전형적인 균주가 추가의 돌연변이가 도입된 바람직한 모균주임을 나타낸다.
또다른 전형적인 일예에서, cpts RSV 248 돌연변이를 화학적 돌연변이처리를 하여 일련의 추가의 약독화된 돌연변이, 예를 들면, 모균주보다 증가된 온도민감성이나 작은 크기의 플락 표현형 특성을 가진 변이주를 제조했다. 그러한 변이주중 하나는 cpts RSV 248/404라고 하는 것으로서 7605 뉴클레오타이드에 추가의 돌연변이( T가 C로 변화)로 고도로 보존된 유전자 개시 cis-작용 조절 서열에서 일어나면 그 결과로 아미노산변화가 생기지 않는 돌연변이의 결과로서 차단온도가 36℃로 감소된 것이 특징이다.
본 발명의 또 다른 예에서, 둘 이상의 약독화된 돌연변이를 가지는 RSV 돌연변이를 제조한다. 예를 들면, 정지온도가 39℃인 다수의 약독화된 돌연변이 바이러스인 cptsRSV 530을 화학적인 변이처리를 하여 약독화되지 않은 배경에서 약독화된 표현형을 특정하는 하나이상의 추가의 돌연변이를 유도한다. 한 실시예에서, cpts RSV 530/1009클론을 분리하여 또한 폴리머라제(L) 유전자에서 12,002에서 하나의 뉴클레오타이드 치환(A가 G로 치환된 결과, 1169아미노산 위치에서 Met이 Val으로 변화됨)으로 차단온도가 36℃가 되도록 결정하였다.
본 발명은 또한 예를 들면, cDNA로부터 재조합 방법으로 제조된 감염성 RSV을 제공한다. 일예에서, 뉴클레오캡시드, 바람직하게는 주요 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질(P), 큰(L) 폴리머라제 단백질 및 전자 연장인자 M2 ORF1 단백질을 코딩하는 하나이상의 서열의 복제, 전사에 필요한 바이러스 단백질과 함께, RSV 게놈이나 안티게놈을 발현하는 cDNA을 함께 발현함으로써 감염성 RSV를 제조한다.
cDNA로부터 감염성 RSV를 생성하는 능력으로 인해 부위 특이적 약독화 돌연변이 및 광범위 스펙트럼의 다른 재조합 변화와 같은 특이적인 처리된 변화를 재조합 바이러스의 게놈으로 도입하여 안전하고 효과적인 RSV 백신을 제조하는 것이 가능하다.
본 발명의 감염성 재조합 RSV는 본 명세서에서 생물학적 유래, 약독화 RSV 균주, 예를 들면, ts, ca, att 및 다른 표현형을 특정하는 돌연변이에서 특이한 돌연변이를 확인하기 위해서 채택되었다. 따라서, 본 발명으로 인해 원하는 다른 광범위 변화와 함께 생물학적 유래 돌연변이를 재조합 백신 균주로의 병합이 가능하다. 예를 들면, cDNA로부터 바이러스를 제조하는 능력 때문에 유도된 약독화된 RSV 백신에서 일어나는 돌연변이를 단독으로나 다양한 선택된 조합으로 완전한 길이의 cDNA 클론에 병합하게 되었고, 도입된 돌연변이를 포함하는 회수된 재조합 바이러스의 표현형을 쉽게 결정할 수 있다. 전형적인 예에서, 약독화 생물학적 유래 바이 러스, 예를 들면, 저온-계대 RSV(cpRSV)에서 또는 그들로부터 유래된 추가의 약독화 돌연변이에서 확인된 아미노산 변화, 예를 들면, 온도민감성 유도체(cptsRSV)는 재조합 RSV클론내에 병합된다. 야생형이나 생물학적 유래 돌연변이 RSV 서열로부터 이러한 변화는 야생형이나 불완전하게 약독화된 모 RSV 표현형에비해 결과적인 클론, 예를 들면, 약독화 또는 추가의 약독화 표현형에서 원하는 특징을 특정한다.
원하는 표현형, 예를 들면, cp 또는 ts 표현형과 관련된 특이적인 생물학적인 유래돌연변이를 확인하고 감염성 RSV 클론에 도입함으로써, 본 발명은 다른, 부위 특이적인 변형, 또는 그 범위내에서, 확인된 돌연변이를 제공한다. 생물학적 유래 RSV에서 생성된 대부분의 약독화 돌연변이는 한 개 뉴클레오타이드의 변화이고, 다른 부위 특이적인 돌연변이도 또한 재조합 기술에 의해서 생물학적 유래 또는 재조합 RSV에 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 1 내지 3, 약 5-15 또는 그이상의 변화된 뉴클레오타이드의 부위-특이적인 돌연변이는 삽입, 치환, 결실 또는 재배열을 포함한다(예를 들면, 야생형 RSV 서열, 선택된 돌연변이 RSV 균주의 서열, 또는 돌연변이 처리된 모 재조합 RSV 클론으로부터 변형된 것). 이러한 부위 특이적 돌연변이를 선택된 생물학적 유래 점 돌연변이의 영역내 또는 그곳에서 병합될 수도 있다. 혹은, 그 돌연변이를 RSV클론내의 다양한 다른 서열에, 예를 들면, cis-작용 조절서열이나 단백질 활성부위, 결합부위, 면역성 에피토프 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이나 근처에 도입될 수 있다. 부위 특이적 RSV 돌연변이는 일반적으로 원하는 약독화 표현형을 포함하나, 대체로 약독화와 관련되지 않은 표현형적 특성, 예를 들면, 향상이나 확장된 면역성, 또는 향상된 성장 등을 나타낸다. 바람직한 추가의 실시예로는, 부위 특이적인 돌연변이는 약독화 점돌연변이를 특정하는 코돈에서 추가의 안정한 뉴클레오타이드 돌연변이를 포함한다. 가능한한, 둘 이상의 뉴클레오타이드 치환을 모 변이주나 재조합 RSV 클론에서 약독화 아미노산 변화를 특정하는 코돈에 도입되어, 약독화 표현형으로부터의 복귀에 대한 유전적 안정성을 지닌 생물학적 유래 또는 재조합 RSV을 생성한다. 다른 예에서, 부위 특이적 뉴클레오타이드 치환, 첨가, 결실 또는 재배열을 표적 뉴클레오타이드 위치에 상대적으로 상부(N-말단 방향)나 하부(C-말단 방향)에, 예를 들면, 1 내지 3, 5-10 및 15까지, 또는 5'이나 3'쪽으로 더 멀리 도입하여 존재하는 cis-작용 조절인자를 없애거나 제조할 수 있다.
단독 및 다수의 점돌연변이 및 부위 특이적인 돌연변이에 더하여, 본 명세서에서 기재하고 있는 재조합 RSV에서의 변화는 전체 유전자나 유전자 단편의 결실, 삽입, 치환 또는 재배열을 포함한다. 이러한 돌연변이는 변화의 성질에 의존적이며(즉, 작은 수의 염기가 변화되어 면역성 에피토프를 삽입하거나 제거하거나, 작은 유전자 단편을 변화시킬 수 있으나, 반면에 유전자단편이나 큰 유전자 단편이 삽입되거나, 치환되거나, 결실, 또는 재배열되는 경우에는 큰 블록의 염기가 관련된다), 소수의 염기(예, 15-30 염기쌍에에서부터 35-50염기쌍 이상까지), 또는 큰 블록의 뉴클레오타이드(예, 50-100bp, 100-300bp, 300-500bp, 500-1,000bp)에 영향을 미칠 수 있다.
추가적인 예에서, 본 발명은 재조합 RSV 클론에서 동일 또는 다른 유전자에 관련된 추가적인 유형의 돌연변이와 함께, L유전자에서 주로 일어나는 cp 및 ts 돌 연변이와 같은 생물학적 유래 RSV로부터 채택된 돌연변이의 추가를 제공한다. RSV는 10 mRNA와, 10 또는 11 단백질을 코딩한다. 이중 3가지는 막관통 표면 단백질, 즉 부착 G단백질, 관통에 관련된 융합 F 단백질, 및 작은 소수성 SH단백질이다. G와 F는 주요한 바이러스의 무력화 항원 및 보호항원이다. 4가지 추가의 단백질은 바이러스의 뉴클레오캡시드와 관련되며, 즉 RNA 결합 단백질 N, 인단백질 P, 큰 폴리머라제 단백질 L, 및 전사 연장인자 M2 ORF1이다. 기질 M단백질은 내부 비리온의 일부분이며 아마도 뉴클레오캡시드와 외피의 결합을 매개한다. 마지막으로, 두 가지 기능을 모르는 비구조단백질, NS1, NS2이 있다. 이들 단백질은 발현단계에서 선택적으로 변형할 수 있거나, 전체적으로나 부분적으로, 단독으로나 다른 원하는 변형과 결합하여, 재조합 RSV에서 삽입, 결실, 치환 및 재배열하여 신규한 감염성 RSV 클론을 얻을 수 있다.
따라서, 생물학적 유래 RSV에부터 채택된 약독화 돌연변이에 추가하거나 결합하여, 본 발명은 또한 감염성 RSV 클론의 재조합 공학에 기초한 완전히 새로운 약독화방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 예에 따라, 감염성 재조합 RSV에 병합하기 위한 RSV 게놈이나 안티게놈을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열상에서 현재 다양한 변화를 만들 수 있다. 더욱 자세하게는, 재조합 RSV에서 원하는 구조적 및 표현형 변화을 달성하기 위해서, 본 발명은 감염성 RSV 클론내에 전체 유전자(들)이나 유전자 단편(들)을 결실, 치환, 도입이나 재배열시키는 돌연변이뿐만 아니라 선택딘 뉴클레오타이드나 모 RSV 서열로부터 선택된 다수의 뉴클레오타이드를 결실, 치환 도입 또는 재배열시키는 변화를 도입하는 것을 설명한다.
원하는 표현형 변화, 예를 들면, 바이러스 성장의 변화, 온도민감성, 숙주면역반응을 유발하는 능력, 약독화 등을 특정하기 위해 감염성 재조합 RSV의 바람직한 변형을 일반적으로 선택한다. 예를 들면, 특정한 유전자나 유전자 영역(예, 세포질, 막관통도메인 또는 세포외 도메인, 면역성 에피토프, 결합 단백질, 활성부위 등과 같은 단백질 구조적 도메인을 코딩하는 유전자 단편)을 제거, 도입 또는 재배열한 모 RSV 클론의 돌연변이에 의해서 상기 변화를 야기한다. 이러한 점에서 주목되는 유전자로는 RSV 게놈의 모든 유전자가 포함된다:
본 명세서에서 나타낸바와 같이, 다른 RSV, 다른 바이러스 및 다양한 바른 비-RSV 출처의 이종의 유전자뿐만 아니라 3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5'.
예를 들면, 선택된 RSV 코딩 서열내에 종료코돈을 도입함으로써; 기능적으로 관련된 프로모터에 대하여 RSV 유전자의 위치를 변화시킴으로써; 상류 개시코돈을 도입하여 발현율을 변화시킴으로써; GE 및/또는 GS 전사신호를 변화시켜(예, 위치 변화, 기존의 서열 변화, 또는 이종의 서열으로 기존의 서열을 치환) 표현형(예, 성장, 전사의 온도 제한성 등)을 변화시킴으로써;및 선택된 유전자의 바이러스 복제, 전사, 또는 선택된 단백질의 번역상의 양적 또는 질적 변화를 특정하는 다른 다양한 결실, 치환, 삽입 및 재배열에 의해서 선택된 유전자의 발현을 단순히 제거시키거나 변형시키는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 기술한 바와 같이, cDNA-기초한 방법을 사용하여 백신용 약독화 및 면역성의 개선된 특성을 제공하는 일련의 재조합 바이러스를 제조한다. 이 문맥에서 원하는 표현형적 변형으로는 약독화된 표현형으로부터의 복귀에대한 내 성, 배양이나 선택된 숙주 환경에서 약독화의 향상, 면역성 특성(예, 제거된 면역반응의 향상이나 감소에 의해서 결정되는), 선택된 바이러스 산물 등이 전사 및/또는 번역의 증가 조절이나 감소조절이 포함된다. 전체적으로나 부분적으로 외래 유전자를 삽입시키거나, 유전자 순서를 변화시키거나, 유전자 중첩을 제거하거나, RSV 게놈 프로모터를 그의 안티게놈 프로모터로 치환시키거나, 일부분의 유전자(예, 당단백질 유전자의 세포질쪽 꼬리(tail)를 첨가(예, 기존의 서열을 중첩시키거나, 이종의 유전자를 병합시킴), 제거 또는 치환하거나, 및 심지어 전체 유전자를 결실시킨다.
본 발명의 일예에서, 예를 들면, 선택된 단백질이나 단백질 영역을 코딩하는 유전자 단편(예, 세포질 꼬리, 막관통 도메인이나 이종 에피토프 부위나 영역, 결합 부위나 영역, 활성부위나 활성부위를 포함하는 영역)과 같은 RSV로부터 선택된 유전자 단편을 동일하거나 상이한 RSV 또는 다른 출처의 대응 유전자 단편으로 치환하여 야생형이나 모RSV 균주에 비하여 원하는 표현형적 변화를 가진 신규한 재조합체를 생성한다. 예를 들면, 이러한 유형의 재조합체는 다른 RSV의 이종 에 융합된 RSV의 세포질쪽 꼬리 및/또는 막관통 도메인을 가지는 키메릭 단백질을 발현할 수 있다. 또 다른 전형적인 재조합체는 이중 면역성 영역과 같은 이중 단백질 영역을 발현할 수도 있다. 본 명세서에서 사용한 것과 같이, "대응부(counterpart)" 유전자, 유전자 단편, 단백질 또는 단백질 영역은 일반적으로 이종 출처(예, 다른 RSV 유전자, 또는 다른 RSV 균주에서 동일한 유전자(즉, 상동(homologous) 또는 대립의 (allelic)) 유전자나 유전자 단편을 나타낸다)로부터 유래된 것이다. 이 문맥 에서 선택된 일반적인 대응부는 일반적인 구조적 특징을 공유하는데, 예를 들면, 세포질 도메인, 막관통 도메인, 이종, 결합부위나 영역, 에피토프 부위나 영역 등과 같은 비교할 만한 구조적인 "도메인"을 코딩하는 각 대응부이다. 대응 도메인 및 그들의 코딩 유전자 단편은 크기 및 아미노산(또는 뉴클레오타이드)서열변화의 범위를 가지는 종의 조합을 포함되며, 이 범위는 도메인이나 유전자 단편 변형체사이에서 통상의 생물학적 활성으로서 정의된다. 예를 들면, 본 발명의 범위내에서 대응 유전자 단편에 의해 코드되는 선택된 두 단백질 도메인은 대체로 동일한 질적 활성도, 예를 들면, 막-스패닝(spanning) 기능의 제공, 특이한 결합 활성도, 면연적 인식 부위 등을 공유할 수 있다. 더욱 일반적으로, 예를 들면, 선택된 단백질 단편이나 단백질 상이와 같은 대응부분 차이에 공유된 특이한 생물학적 활성도는 대체로 양적인 측면에서 유사하며, 즉 그들은 30% 이상, 바람직하게는 20%이하, 더욱 바람직하게는 5-10%이하로 각각의 양적인 활성도 양상에서 변화가 없다.
본 발명의 범위내에서 재조합 RSV를 제조하는데 관련된 다른 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 대응 유전자와 유전자 단편들도 대체로 선택된 폴리뉴클레오타이드 참조 서열, 예를 들면, 선택된 또 다른 대응 서열과 서열 동일성을 공유하는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 사용하는 것과 같이, "참조 서열(reference sequence)"는 서열 비교의 기준으로 사용되는 서열로 정의되며, 예를 들면, 완전히 길이의 cDNA 또는 유전자의 단편, 또는 완전한 cDNA나 유전자 서열이다. 일반적으로, 참조서열은 적어도 20 뉴클레오타이드 서열, 종종 적어도 25 뉴클레오타이드, 및 적어도 50뉴클레오타이드길이이다. 두 폴뉴클레오타이드가 각각 (1) 폴리뉴 클레오타이드간에 유산한 서열(즉, 완전한 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부분)을 포함하는, 및 (2) 추가로 두 폴리뉴클레오타이드간에 차이가 있는 서열을 포함하기 때문에, 두(그 이상의) 폴리뉴클레오타이드 서열의 비교는 일반적으로 서열 유사성 영역을 확인하고 비교하는 "비교창(comparison window)"에 비하여 두 폴리뉴클레오타이드 성질을 비교함으로써 행해진다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "비교창"은 적어도 연속된 20뉴클레오타이드의 개념적인 단편를 말하며, 폴리뉴클레오타이드 서열을 연속적인 적어도 20 뉴클레오타이드 서열과 비교할 수 있으며, 비교창상에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부분은 두 서열의 최적 배열을 위해서 참조서열(이는 결실이나 첨가를 포함하지 않는다)에 비해 20%이하의 첨가나 결실(즉 갭(gap))을 포함할 수도 있다. 비교창과 맞추기 위한 서열의 최적 배열은 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)의 국소 동일성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 동일성 배열 알고리즘, Pearson & lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) (이들 각각은 본 명세서의 참고문헌으로 병합됨)의 유사한 방법을 위한 조사, 이들 알고리즘의 컴퓨터에 의한 보충(CAP, ESTFIT, 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, 본 명세서에 참고문헌으로 병합됨), 또는 조사에 의해서 행해질 수 있으며, 다양한 방법에 의한 최적의 배열((서열 유사성의 최고 퍼센트를 가져오는 배열)을 선택한다. "서열 동질성(sequence identity)"은 두 개의 폴리뉴클레오타이드 서열이 비교창에 비하여 동일함(즉, 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드에 기초하여)을 의미한다. "서열 동질성 의 퍼센트"는 비교창에 비해 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교하고, 맞추어진 위치의 수를 생산하는 두 서열에서 있는 동일한 뉴클레오타이드 염기(예, A, T, C, G, U 또는 I )의 위치수를 결정하고, 비교창에서의 전체 위치수(즉 창크기)로 맞추어진 위치수를 나눗고, 그 결과에 100을 곱하면 서열 동질성 퍼센트를 구할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, "실질적인 동질성"은 폴리뉴클레오타이드 서열의 특성을 의미하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 적어도 20뉴클레오타이드, 종종 25-50뉴클레오타이드의 비교창인 참조서열에 비해 적어도 85% 서열 동질성, 바람직하게는 적어도 90 내지 95% 서열동질성, 더욱 바람직하게는 적어도 99%의 서열동질성을 가진 서열을 포함하며, 그리고, 여기서 결실이나 첨가를 포함하여 비교창에 대해 참조서열의 전체 20%미만인 폴리뉴클레오타이드 서열과 참조서열을 비교하여 서열 동질성의 퍼센트를 계산한다. 참조서열은 큰 서열의 서브셋일 수 있다.
이러한 폴리뉴클레오타이드 서열의 관계에 더하여, 본 발명의 재조합 RSV가 코딩하는 단백질과 단백질 영역을 실질적인 서열 동질성이나 서열 유사성과 같은 보존적인 관계를 갖도록 선택된 참조 폴리뉴클레오타이드와 함께 선택할 수 있다. "서열 유사성"이란 대응 위치에서 동일하거나 유사한 아미노산(즉, 보존적인 치환)을 갖는 펩타이드를 의미한다. "실질적인 서열 유사성"이란 두 펩타이드 서열이 디폴트 갭 중량을 사용하는 프로그램G AP나 BESTFIT로서 최적 배열시에 적어도 80 % 서열 동질성, 바람직하게는 적어도 90% 서열동질성, 더욱 바람직하게는 95% 서열동질성이상(예, 99% 서열동질성)를 공유하는 것을 의미한다. "실질적인 유사성"이란 두 펩타이드 서열이 대응 퍼센트의 서열 유사성을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않는 잔기 위치가 보전 아미노산의 치환으로 다르다. 보전 아미노산 치환은 유사한 곁사슬을 갖는 잔기의 상호 변환성을 말하며, 예를 들면, 지방족 곁사슬을 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 및 이소루신이며; 지방족-히드록시 곁사슬을 갖는 그룹은 세린과 트레오닌이고; 아미드 함유 곁사슬을 갖는 그룹은 아스파라진과 글루타민이고; 방향족 곁사슬을 갖는 그룹은 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판이고; 염기성 곁사슬을 갖는 그룹은 아르기닌 및 히스티딘이고; 및 황함유 곁사슬을 갖는 그룹은 시스테인과 메티오닌이다. 바람직한 보존 아미노산 치환 그룹은 다음과 같다: 발린-루신-이소루신, 및 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닐-발린, 및 아스파라긴-글루타민. 20가지 아미노산의 입체이성질체(예, D-아미노산), 천연에 없는 아미노산, 예를 들면, α,α-치환 아미노산, N-알킬아미노산, 젖산, 및 다른 통상적이지 않는 아미노산이 본 발명의 폴리펩타이드에 적합한 수 있다. 통상적이지 않는 아미노산의 예로는 다음에 있다: 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타민, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예, 4-히드록시프롤린). 더욱이, 아미노산을 글리코실화, 인산화 등에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 또다른 예에서, cDNA-발현 게놈이나 안티게놈에서 생산된 감염성 RSV는 RSV나 RSV 유사 균주, 예를 들면, 사람, 소, 쥐 등일 수 있으며, 예를 들면, 쥐의 뉴모니아 바이러스나 칠면조의 리노트라케이티스 바이러스와 같은 뉴모바이러 스일 수 있다. 보호면역반응을 일으키기 위해서, RSV 균주는 면역화된 대상의 내생적인 균주, 예를 들면, 사람을 면역화하는데 사용되는 사람의 RSV일 수 있다. 그러나, 내생적인 RSV의 게놈이나 안티게놈을 변형시켜 다른 RSV종, 서브그룹, 또는 균주,또는 RSV 및 PIV와 같은 다른 호흡장애 병원균로부터의 유전자나 유전자단편의 결합과 같은 다른 출처의 결합으로부터 RSV 유전자나 유전자 단편을 발현시킬 수 있다(예를 들면, Hoffman et al., J. Virol. 71:4272-4277 (1997); Durbin et al., Birology (1997)(In Press); Murphy et al., U.S Patent Application Serial No. 60/047,634 entitled RECOVERY OF INFECTIOUS PARAINFLUENAS VIRUS FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES, filed May 23, 1997, 본 명세서의 참고문헌으로 병합됨, 그리고 감염성 PIV의 제조를 위한 다음의 플라스미드: p3/7(131))(ATCC 97990); p3/7(131)2G (ATCC 97889); p218(131) (ATCC 97991); 각각은 부다페스트조약에 따라 American Type Culture Collection(ATCC) of 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.기탁되었고 상기 수탁번호를 수여함)
본 발명의 일예에서, 사람 RSV의 각각의 내부 유전자를 예를 들면, 소, 쥐 또는 다른 RSV 대응부로 치환하거나, 또는 PIV와 같은 다른 호흡장애 병원체로부터 유래된 외래 유전자로 치환된 재조합 RSV를 제공한다. 이 문맥에서 RSV 유전자나 유전자 단편의 치환, 결실 등은 하나이상의 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2) 및 L유전자, 또는 G와 F유전자의 비-면역성 부분의 전체 또는 일부분을 포함한다. 또한, 사람 RSV cis-작용 서열, 예를 들면, 프로모터나 전사 신호를 예를 들면 그들의 소 RSV 대응부로 치환할 수 있다. 반대로, 사람의 약독화 유전자나 cis-작용 서열을 소 RSV 게놈이나 안티게놈 배경에 삽입함으로써 살아있는 약독화된 소 RSV을 제조하는 방법을 제공한다. 이종 유전자나 cis-작용 인자를 가진 재조합 RSV를 숙주범위제한 및 백신용에 적합한 다른 원하는 표현형으로 선택할 수 있다. 전형적인 예에서, 예를 들면, 다음에서 제공된 것과 같이, 소RSV의 구조 및 기능의 이용가능한 설명에 기초하여 사람RSV로 도입하기 위하여 소 RSV 서열을 선택할 수 있다: Pastey et al., J. Gen. Viol. 76:193-197 (1993); Pastey et al., Virus Res. 29:195-202 (1993); Zamora et al., J. Gen. Virol. 73:737-741 (1992); Malliped야 et al., J. Gen. Virol. 74:2001-2004 (1993); Malliped야 et al., J. Gen. Virol. 73:2441-2444 (1992); 및 Zamora et al., Virus Res. 24:115-121 (1992)이고 각각은 본 명세서의 참고문헌으로 병합되었으며, 본 명세서에 기재된 방법과 조성물에 따랐음. 다른 일예에서, G단백질의 세포질쪽 꼬리가 없는 쥐의 뉴모니아바이러스(사람RSV에 대한 쥐의 대응부)의 조직배양에서 채택된 비병원성 균주을 본따서 재조합 RSV내에서 도입을 위한 주목되는 돌연변이를 모델화하였다(Randhawa et al., Virology 207: 240-245 (1995)). 따라서, 본 발명의 일예에서, 하나이상의 사람 RSV 당단백질, F, G, S의 세포질 및/또는 막관통 도메인을 첨가, 결실, 변형 또는 이종 대응부(예, 소RSV나 쥐의 뉴모니아바이러스의 F, G 및 SH 단백질의 세포질 유래의 서열이나 막관통 도메인)로 치환시켜 원하는 약독화를 얻었다. 또다른 예에서, F 단백질의 절단자리나 그 근처의 뉴클레오타이드 서열, 또는 G 단백질의 추정 결합도메인을 점돌연변이, 부위-특이적 변화시킴으로써,또는 전체 유전자나 유전자 단편을 변화시킴으로써 조직배양에서의 바이러스의 성장 및/또는 실험동물에서 감염 및 발병에 새로운 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 사람 투여용 감염성 재조합 RSV는 약독화 등의 목적으로 예를 들면, 소나 쥐의 RSV 또는 PIV로부터 얻어진 유전자를 함유하도록 변형시킨 사람 RSV일 수 있다. 예를 들면, PIV의 유전자나 유전자 단편을 삽입함으로써, PIV 및 RSV에 대한 이가 백신을 제공한다. 혹은 이종 RSV 종, 서브그룹이나 균주, 또는 PIV와 같은 별개의 호흡 병원체을 예를 들면, 에피토프나 사람RSV 감염에 대한 보호를 없애는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하도록 변형시킬 수도 있다. 예를들면, 사람RSV 당단백질 유전자로 소 당단백질 유전자를 치환시켜, 사람의 RSV 표면 당단백질을 가지며 여전히 남아있는 소 유전전 배경 때문에 사람 숙주내에서 제한된 복제능을 가진 결과적인 소RSV가 사람RSV 균주에 대한 사람에서의 보호면역 반응을 유발한다.
다른 유형의 약독화 돌연변이를 백신 개발용 감염성 RSV에 도입하여 분석하는 능력은 RSV 클론에서 목표로 하는 변화의 광범위한 조합에까지 이른다. 예를들면, SH유전자의 결실로 인해, 성장 증가를 포함하는 신규한 표현형적 특성을 가지는 재조합RSV를 제조한다. 본 발명에서, SH유전자 결실(또는 다른 선택된, 비 필수적 유전자나 유전자 단편의 결실)은 재조합 RSV에서 생물학적 유래 약독화RSV 돌연변이로 부터 채택된 점 돌연변이등과 같은 약독화된 표현형을 특정하는 하나이상의 추가적인 돌연변이와 결합된다. 바람직한 예에서, cpts248/404, cpts530/1009, cpts530/1030, 또는 다른 선택된 돌연변이 RSV 균주로부터 책택된 하나이상의 cp 또는 ts돌연변이와 함께 SH 유전자 또는 NS2 유전자를 결실시켜 증가된 바이러스 생산, 향상된 약독화, 및 다른 돌연변이의 조합된 효과로 인한 표현형적 복귀에 대한 내성 증가 등의 특성을 가지는 재조합 RSV를 제조할 수 있다. 이러한 점에서, 성장에 비필수적인 어떠한 RSV 유전자, 예를 들면, SH, NP, NS1, NS2유전자를 제거하거나 변형시킴으로써, 독성, 병원성, 면역성, 및 다른 표현형적 특성에 바람직한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, SH 유전자와 같은 비필수적인 유전자의 제거로 인해 배양에서 바이러스 성장이 증가한다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 효과는 부분적으로 바이러스 게놈의 클레오타이드 길이가 감소하기 때문인 것 같다. SH-(-) 클론의 예에서, 변형된 바이러스 게놈은 14,825 nt길이로서, 398 nt가 야생형보다 짧다. 게놈 크기가 감소시키는 유사한 돌연변이, 예를 들면, RSV 게놈상에서 다른 코딩이나 비코딩영역, 예를 들면, P, M, F, M2 유전자등에서 재조합함으로써, 본 발명은 RSV 성장을 향상시키기 위해 용이하게 실행할 수 있는 수개의 방법과 물질을 제공한다.
추가로, 단독으로나 생물학적 유래 돌연변이 RSV로부터 채택된 하나이상의 약독화 점돌연변이와 함께 감염성 재조합 RSV에 병합하기 위해서, 다른 다양 유전자 변화를 재조합 RSV게놈이나 안티게놈에 만들 수 있다. 이종 유전자(예를 들면, 다른 RSV 균주나 유형이나, 비RSV 출처에서 유래한 것)을 전체나 부분적으로 삽입할 수도 있으며, 유전자 순서를 변화시키거나, 유전자 중복을 제거하거나, RSV 게놈 프로모터를 그의 안티게놈 대응부로 치환하거나, 유전자 부분을 제거하거나 치환하거나, 및 심지어 전체 유전자를 결실시킬 수도 있다. 서열상에서 상이한 변화나 추가적인 변화를 만듦으로써, 다양한 유전자간 영역 또는 그 밖의 부위에서의 유일한 제한 부위의 삽입(예를 들면, G와 F유전자사이의 유일한 StuI 부위)등의 조작을 용이하게 할 수 있다. 비번역 유전자 서열을 제거하여 외래 서열의 삽입능을 증가시킬수 있다.
바람직한 예에서, 하나의 RSV의 개개의 유전자, 유전자 단편, 또는 단독이나 다수의 뉴클레오타이드를 이종 RSV나 다른 출처의 대응서열로 치환할 수도 있다. 예를 들면, 선택된 이종 유전자 단편, 예를 들면, 하나의 RSV로부터 선택된 단백질이 세포질쪽 꼬리, 막관통 도메인이나 이종, 에피토프 부위나 영역, 결합부위나 영역, 활성부위나 활성부위를 함유하는 영역 등을 다른 RSV의 대응부로 치환함으로써, 신규한 재조합체, 예를 들면, 다른 RSV의 이종에 융합된 다른 하나의 RSV의 세폴질쪽 꼬리 및/또는 막관통 도메인을 가지는 키메란 단백질을 발현하는 재조합체을 제조할 수 있다. 이러한 점에서, 단백질의 작은 기능적 도메인을 코딩하는 유전자 단편, 예를 들면, 에피토프 부위, 유용한 게놈 단편은 약 15-35 뉴클레오타이드 범위에서 약 50, 75, 100, 200-500, 및 500-1,500 또는 더 큰 도메인이나 단백질 영역을 코딩하는 유전자 단편에 대한 더 큰 뉴클레오타이드까지이다. 일례에서, RSV 균주나 서브그룹의 F 및/또는 G 보호항원을 다른 균주나 서브그룹의 RSV 클론으로 치환하여 면역화된 숙주에 있어서 균주와 서브그룹 모두에 대해서 교차-보호 면역 반응을 자극할 수 있는 재조합 바이러스를 제조한다. 부가적인 예에서, 예를들면 치환된, 이종 F 및/또는 G 유전자나 유전자 단편과 같은 유전자나 유전자 단편의 변화를 포함하는 돌연변이를 가지는 키메라 RSV 클론을 추가로 예를 들면, cpts248/404, cpts530/1009, cpts530/1030과 같은 생물학적 유래 돌연변이 RSV 균 주로 부터 채택된 ts 또는 cp 점돌연변이를 야기시키는 하나 이상을 도입함으로써 변형시킬 수 있다.
부가적인 예에서, 하나이상의 사람RSV 코딩이나 비코딩 폴리뉴클레오타이드를 소나 쥐의 RSV의 대응 서열로서 단독이나 하나이상의 선택된 cp 또는 ts돌연변이와 함께 치환하여 신규한 약독화 백신 균주를 제조한다. 일예에서, 키메라 소-사람 RSV는 사람 RSV이 NP 유전자나 유전자 단편을 대응 소NP 유전자나 유전자 단편으로 치환하는 것을 포함하며, 이러한 키메라는 임의로 SH, NP, NS1, NS2 또는 다른 유전자의 결실, 하나이상의 cp 또는 ts점돌연변이, 또는 이들의 다양한 조합, 및 본명세서 기재된 다른 돌연변이를 포함하도록 제조된다. 사람RSV 코딩 서열(예, NS1, NS2, NP 등)도는 비 코딩 서열(예, 프로모터, 유전자 말단, 유전자-개시, 유전자간, 또는 다른 cis-작용 인자)를 소나 쥐RSV의 대응서열로 치환하여, 다양한 가능한 약독화 효과를 가진 약독화된 재조합체를 제조한다. 예를 들면, 다른 유용한 약독화 효과중에서, 숙주범위효과는 사람세포에서 효과적으로 기능하지 않는 이종 RSV 유전자로부터, 사람RSV 서열이나 단백질(예, 바이러스의 전사, 번역, 조합 등을 위해서 치환된 서열이나 단백질과 통상 협력하는 서열이나 단백질)과 생물학적으로 상호작용하는 이종 서열이나 단백질의 비양립성으로부터 생겨난다.
본 발명의 또 다른 예에서, 외래 유전자나 유전자 단편 및 몇몇 경우에 비코딩 뉴클레오타이드 서열의 RSV 게놈으로의 삽입으로 인해, 추가적인, 바람직한 표현형적 효과를 야기하는 게놈길이가 바람직하게 증가한다. 게놈 길이의 증가로 인해, 결과적인 RSV가 약독화되며, 삽입된 길이에 부분적으로 의존적이다. 추가로, 재조합RSV로 삽입된 유전자로 부터 어떤 단백질의 발현결과, 이 단백질의 작용으로 인해 바이러스가 약독화될 것이다. 백신 바이러스상에서 IL-2 발현에 대해 기재하고 있으며(예, Flexner et al., Nature 33:259-62(1987)), 또한 감마 인터페론에 대해서 예상될 수 있다. 본 발명의 재조합 RSV상에서 결실, 삽입, 치환 및 전체 바이러스 유전자나 유전자 단편의 변화를 포함하는 다른 돌연변이는 매우 안정한 백신 후보를 제조하며, 이 후보는 구체적으로 면역억압된(immunosuppressed) 대상에 있어서 특히 중요하다. 이러한 많은 돌연변이는 결과적인 백신 균주의 약독화를 가져오며, 반면에 다른 돌연변이는 다른 유형의 바람직한 표현형적 변화를 특정할 것이다. 예를 들면, 숙주 면역을 특이하게 방해하는 단백질을 코딩하는 어떤 바이러스 유전자가 알려져 있다(예, Kato et al., EMBO. J. 16:578-87 (1997), 본 명세서에 참고문헌으로 병합됨). 백신 바이러스에서 이러한 유전자의 제거는 독성 및 병원성을 감소, 및/또는 면역성을 증가시킬 것으로 예상된다.
또한, 본 발명은 RSV 클론으로부터 유전자나 유전자 단편을 제거하지 않고서 다음과 같은 방법으로 유전자나 유전자 단편의 발현을 제거 또는 변화와 같은 재조합 RSV상에서의 유전적 변화를 제공한다: 예를 들면, 선택된 코딩 서열내에 종료코돈을 삽입함으로써; 발현 속도를 변화시키기 위해서 유전자의 위치를 변화시키거나 상류 개시 코돈을 도입함으로써; 표현형(예, 성장, 전사에 대한 온도제한 등)을 변화시키기 위해서 GS 및/또는 GE 전사신호를 변화시킴으로써.
이러한 맥락에서, 바람직한 돌연변이로는 RSV 미니게놈의 돌연변이 분석 등으로 확인할 수 있는 cis-작용 신호에 관한 돌연변이도 포함된다. 예를 들면, 리 더, 고리 및 양측면 서열의 삽입 및 결실 분석으로 바이러스의 프로모터 및 전사 신호를 확인하고, RNA 복제나 전사의 다양한 정도의 감소와 관련된 일련의 돌연변이를 제공한다. 이들 cis-작용 신호의 포화 변이처리(Saturation mutagenesis)(여기서, 순서대로 각 위치는 각각 다른 뉴클레오타이드로 변형되었다)로 RNA 복제나 전사가 감소된(또는 어떤 경우에는 증가된) 많은 돌연변이를 확인한다. 완전한 안티게놈 cDNA을 이용한 trans-작용 단백질과 cis-작용 RNA서열의 측정과 조작은 RSV 미니게놈으로 도울수 있다(예, Grosfeld et al., J. Virol. 69:5677-5686 (1995)). RSV 미니게놈의 헬퍼-의존 상태(helper-dependent status)는 복제의존 감염성 바이러스의 회수 저해 돌연변이의 특성에서 유용하다.
본 발명의 범위내인 다른 RSV 돌연변이는 게놈의 3'말단을 그의 안티게놈의 대응부로 치환하는 것을 포함하며, 이는 RNA 복제와 전사의 변화와 관련된다. 추가로, 유전자간 영역(Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4594-4598 (1986), 본 명세서에 참고문헌으로 삽입됨)을 서열상에서 단축, 연장 또는 변화시키고, 자연적으로 발생하는 유전자 중복(Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5134-5138 (1987), 본 명세서에 참고문헌으로 삽입됨)을 본 명세서에서 기재된 방법으로 제거하거나 변화시켜 다른 유전자간 영역을 제조할 수 있다.
바람직한 일예에서, 합성하거나 효율적인 번역을 위해 고안된 서열로 천연의 서열을 치환함으로써, F 및 G의 보호 항원과 같은 특이한 RSV 단백질의 발현수준을 증가시킬 수 있다. 이러한 맥락에서, 포유동물의 바이러스 코돈 사용법(codon usage)은 포유동물 바이러스 단백질의 번역 수준에서 주요한 인자가 될 수 있다 (Haas et al., Current Biol. 6:315-24 (1996)). 주요 보호항원인 RSV의 F 및 G 단백질을 코딩하는 mRNA의 코돈 사용법에 의하면 코돈 사용법은 낮은 수준의 발현과 일치한다. 따라서, 본 발명의 재조합 방법을 사용하여 코돈 사용법을 향상시킴으로써, 선택된 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.
또 다른 바람직한 예에서, 선택된 RSV 유전자의 전사 개시부위를 둘러싼 서열(바람직하게는 3 위치의 뉴클레오타이드 포함)을 단독으로나 상류 개시 코돈의 삽입과 함께 변형하여 번역의 증가조절 또는 감소 조절을 특정함으로써 RSV 유전자 발현을 조절한다.
혹은, 본 명세서에 기재된 다른 RSV 변형과 함께, 바이러스의 선택된 유전자(들)의 전사 GS 신호를 변경함으로써 RSV 유전자 발현을 조절할 수 있다. 바람직한 예에서, 특정한 돌연변이(예, 본 명세서의 이하에서 기술한 404 (M2))를 포함하도록 NS2의 GS 신호를 변형하여 바이러스 복제에 있어서 ts제한을 이중으로 한다.
본 발명의 범위에 속하는 추가의 RSV 클론은 전사 GE신호에 변형을 포함한다. 예를 들면, N유전자의 GS신호로 NS1 및 NS2의 GS 신호를 치환하거나 변이처리시켜 완전히 (readthrough)통독하여 전사된 mRNA의 수준이 감소되고 하류 유전자로부터의 단백질 발현이 증가된 RSV 클론이 제공된다. 만약 RSV 게놈상에서 cis-작용 조절인자를 변화시켜 RSV 성장 특성이 변화되었다면, 결과적인 재조합 바이러스는 성장속도가 증가하고 플락 크기가 커진다.
또 다른 바람직한 예에서, G mRNA의 변형으로 G단백질의 발현이 증가한다. G단백질은 막결합형과 분비형으로 발현되며, 분비형은 G 전사 ORF내의 개시부위에서 전사를 개시하여 발현된다. 분비형은 발현된 G 단백질의 반이나 된다. 상류 개시부위의 서열의 변화와 함께 또는 단독으로 내부 개시 부위(예, 서열 변화, 결실 등에 의해서)을 제거함으로써 G단백질 발현상 원하는 변화를 만들 수 있다. 막결합형 G가 항체를 무력화시키는 "유인물(decoy)"로 작용하기 때문에, 분비형 G의 제거로 바람직한 제조합 RSV에 대한 숙주의 면역반응의 질을 향상시킬 수 있다. 또한, 수용성 G 단백질가 Th2-치우친 반응을 우선적으로 자극하기 때문에 수용성G단백질 향상된 면역병원성(immunopathology)에 관련되었다고 생각된다.
또 다른 예에서, RSV 유전자의 발현수준을 전사단계에서 변화시킨다. 일예에서, RSV 유전자 지도상에서 선택된 유전자의 위치를 프로모터-중앙이나 프로모터-말단 위치로 변화시킴으로써, 각각의 유전자를 더욱 효과적으로 발현할 수 있다. 이러한 점에 따라, 구체적인 유전자의 발현을 조절하여 야생형에 비해 두배, 더욱 바람직하게는 4배에서 10배나 그 이상까지 유전자 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 일예에서, NS2 유전자(RSV 유전자지도에서 순서로 두 번째)을 SH유전자에 대한 위치(여섯 번째 위치)로 치환하여 NS2 발현이 감소시켰다. 위치변화로 인한 선택된 RSV 유전자의 발현증가가 10배, 30배, 50배, 100배 이상까지 증가하며, 상호교환적으로 치환된 유전자에 대해서 유전자 수준의 완전한 감소가 종종 수반된다.
다른 일예에서, F 및 G유전자들은 단독으로나 공동으로 (재조합체) RSV 유전자 지도내에 위치한 프로모터-중앙이나 프로모터-말단 부위로 전위되어 각각 더 높거나 더 낮은 수준으로 발현된다. 이러한 전위와 다른 전위로 인해, 예를 들면 RNA 복제에 관련된 선택된 바이러스 단백질이 발현이 감소되어 약독화된 표현형을 가지 는 신규한 RSV 클론을 생성된다.
더 구체적으로 본 발명은, 예를 들면, 두 개의 나란한(tandem) 번역 종료 코돈을 번역ORF에 도입함으로써 NS2 유전자와 같은 바이러스 유전자의 발현을 유전자나 유전자 단편의 제거없이 전사수준에서 제거된 재조합 RSV를 제공한다. 이로 인해 선택된 유전자를 제거하지 않고서 번역단계에서 발현되지 않도록 하는 다양한 바이러스가 생산된다. 이러한 형태의 "녹아웃"(knok-out) 바이러스는 성장속도가 감소하고 조직배양에서 작은 크기의 플락을 형성한다. 따라서, 본 발명의 방법과 조성물은 주요한 바이러스 보호항원이 아닌 바이러스 유전자의 발현이 제거된 추가적이고 새로운 유형의 RSV 약독화 돌연변이를 제공한다. 이러한 맥락에서, 유전자나 유전자 단편의 결실없이 제조된 "녹아웃" 바이러스 표현형을 본 명세서에 기재된 결실 돌연변이로서 임의로 제조하여, 표적단백질의 합성을 회복할 수 있는 정정(correcting) 돌연변이의 발생을 효율적으로 방지할 수 있다. 교대 디자인(alternate design)을 사용하여 RSV에 대한 수 개의 다른 유전자 "녹아웃"을 제조할 수 있다. 예를 들면, ORF에 번역종료코돈의 삽입, 또는 RNA 에디팅(editing) 부위의 파괴는 대체하여 선택된 유전자의 발현이 없거나 약독화되도록 한다. 이러한 녹아웃과 다른 녹아웃을 제조하는 방법은 공지된 사실이다(예를 들면, Kretzschmar et al., Birology 216:309-316 (1996); Radecke et al., Virology 217:418-412 (1996); and kato et al., EMBO J> 16:178-587 (1987); and Schneider et al., Virology 277:314-322 (1996), 각각은 본 명세서에 참고문헌으로 병합됨).
다른 일예에서, 순환하는(circulating) 바이러스에 있어서 연속항원변이 (antigenic drift)을 수용하도록 백신 제제에 유용한 RSV를 편리하게 변화시킬 수 있다. 일반적으로 상기 변화는 G 및/또는 F 단백질에서 일어날 것이다. 감염성 클론에서 대응영역을 치환하거나 수 개의 항원 형태를 나타내는 유전자의 하나이상의 사본을 첨가함으로써, 전체 G 또는 F유전자, 또는 이들의 구체적인 면역성 영역을 코딩하는 단편을 RSV 게놈이나 안티게놈에 도입할 수 있다. 그 다음, 변형된 RSV cDNA로부터 제조된 자손 바이러스를 최근에 생겨난 균주에 대한 백신화 프로토콜에 사용할 수 있다. 추가로, 유전자 삽입으로서 RSV 서브그룹 B의 G단백질 유전자의 포함함으로써 사람에 있는 상대적으로 다양한 서브그룹 A 및 B균주의 보다 광범위한 스펙트럼을 포괄할 수 있도록 반응이 광범위해진다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라서 본 발명의 감염성 RSV 클론을 또한 가공하여 그의 면역원성을 증가시키고 야생형 RSV 또는 불완전하게 약독화된 모 바이러스나 클론의 감염으로 인한 것보다 더 높은 수준의 보호를 유도할 수 있다. 예를 들면, 이종 RSV 균주나 유형, 또는 PIV와 같은 비-RSV 출원로 부터 얻은 면역성 에피토프을 RSV게놈이나 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열상에서 적절한 뉴클레오타이드 변화로 첨가할 수도 있다. 혹은, 재조합 RSV를 가공하여 바람직하지 못한 면역원성 반응을 확인하고 제거(예, 아미노산 삽입, 치환 또는 결실)할 수도 있다. 다른 예에서, 독립적인 전사신호세트의 조절하에 있는 RSV 게놈이나 안티게놈내로 또는 근처로 추가적인 유전자를 삽입할 수 있다. 대상 유전자로는 사이토키닌을 코딩하는 유전자(예, IL-2 내지 IL-15, 특히 IL-2, IL-6 및 IL-12 등), 감마-인터페론 및 T 헬퍼세포 에피토프등 많은 단백질이 포함된다. 별개의 단 백질이나 SH와 같은 RSV 단백질 중의 하나인 두 번째 사본으로부터 가공된 키메라로 추가적인 단백질을 발현할 수 있다. 이것은 RSV 에 대한 면역반응을 양 및 질적으로 변화시키고 향상시킨다.
본 발명의 또 다른 예에서, 예를 들면, PIV유래의 보호항원을 코딩하는 서열을 본 명세서에 기재된 감염성 백신제조에 사용되는 RSV 게놈이나 안티게놈에 삽입함으로써 파라인플루엔자 바이러스(PIV)와 같은 다른 기도 병원체의 보호항원에 대한 벡터로서 재조합 RSV를 사용할 수 있다. PIV cDNA의 클론과 다른 문현은 1997년 5월 23일에 출원한 시리즈 번호 60/047575이고 발명의 명칭이 클론화된 뉴클레오타이드 서열로부터 파라인플루엔자 바이러스의 생산인 잠정적인 미국출원에 기재되어 있으며, 이 출원명세서는 본 명세서의 참고문헌으로 제출하였다. 다른 예에서, 적어도 하나의 PIV 서열, 예를 들면, RSV와 PIV1, PIV2, PIV3, 또는 소의 PIV의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 RSV 게놈이나 안티게놈 서열의 키메라로 이루어지는 변형된 RSV를 제공한다. 예를 들면, PIV1, PIV2, 또는 PIV3의 HN 및/또는 F 당단백질 유전자와 같은 사람의 PIV 유래의 대응 유전자로 RSV 유전자 각각을 치환할 수 있다. 또는, HPIV1, HPIV2, HPIV3의 HN이나 F의 세포질쪽 꼬리, 막관통 도메인이나 이종과 같은 선택된 이종 유전자 단편으로 RSV 클론에서 동일한 유전자와 같은 대응 유전자 단편, RSV 클론에서 다른 유전자내, 또는 RSV 게놈이나 안티게놈의 비-코딩 서열내로 치환할 수 있다. 일예에서, HPIV3의 HN또는 F유래의 유전자 단편으로 RSV 유형 A상의 대응 유전자 단편을 치환시켜 키메라 단백질을 코딩하는 산물을 제조할 수 있으며, 예를 들면, RSV의 이종에 융합된 RSV의 세포질쪽 꼬리 및/또는 막관통 도메인을 가지는 융합단백질로서 신규한 약독화 바이러스를 생산하며, 및/또는 PIV 및 RSV 모두에 대해서 면역성이 있는 다가 백신등이다. 재조합 RSV에 대한 상기의 변형에 더하여, RSV 클론에 다르거나 추가적으로 변화시켜 조작을 용이하게 할 수 있으며, 예로는 다양한 유전자간 영역이나 다른 자리에 유일한 제한효소부위의 삽입(예, G와 F유전자사이에 유일한 StuI 부위 )등이 있다. 비번역 유전자 서열을 제거하여 외부 서열의 삽입능을 향상시킬수 있다.
공지된 다양한 기술로 앞서 기술한 특정된 돌연변이를 감염성RSV에 도입할 수 있다. "감염성 클론"에 의하는 방법은 감염성 바이러스나 서브바이러스 입자의 게놈으 제고하기 위한 주형으로 작용할 수 있는 RSV 게놈이나 안티게놈으로 전사되는 합성 또는 그 외의 방법의 cDNA 또는 그의 산물을 의미한다. 따라서, 종래의 방법(예, 부위 특이적 돌연변이)으로 특정된 돌연변이를 게놈이나 안티게놈의 cDNA사본으로 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이 완전한 게놈이나 안티게놈 cDNA로 조합되는 게놈이나 안티게놈의 cDNA 서브단편의 사용의 잇점은 각각의 영역을 별개로 조작될 수 있고, 그런후 용이하게 완전한 cDNA로 조립될 수 있다. 따라서, 완전한 게놈이나 안티게놈 cDNA, 또는 이들의 어떠한 서브단편을 올리고뉴클레오타이드-특이적 돌연변이를 위한 주형으로 사용할 수 있다. 이것은 muta-gene(상표명) Kit of Bio-Rad Laboratories(Richmond, CA)을 사용하는 것과 같이 단일사슬 파지미드형태를 중간체로 경유하거나, Chameleon mutagenesis kit if Stratagene(La Jolla, CA)와 같은 주형으로서 이중사슬플라스미드를 직접 사용하거나, 또는 대상 돌연변이를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드 프라이머나 주형을 사 용하는 폴리머라제 연쇄반응(PCR)에 의해서 행해질 수 있다. 그런 다음, 돌연변이된 서브단편을 조립하여 완전한 안티게놈이나 게놈 cDNA를 만들 수 있다. 다양한 다른 돌연변이 기술이 알려져 있으며 RSV 게놈이나 안티게놈 cDNA상에서 원하는 돌연변이를 제조하는데 사용할 수 있다. 하나의 뉴클레오타이드 변화에서부터 하나이상의 유전자나 유전자 단편을 포함하는 큰 cDNA 조각까지 돌연변이는 다양할 수 있다.
따라서, 일예에서 Bio-Rad에서부터 구입할 수 있는 Muta-gene 파지미드 생체외 돌연변이 키트을 사용함으로써 돌연변이를 도입할 수 있다. 요약하면, RSV 게놈이나 안티게놈의 일부분을 코딩하는 cDNA를 플라스미드 pTZ18U에 클로닝하고, CJ236 세포(Life Technologies)를 형질전화시키기 위해서 사용된다. 제조자가 추천한대로 파지미드 제제를 제조할 수 있다. 게놈이나 안티게놈의 원하는 위치에 변형된 뉴크러레오타이드를 도입함으로써 돌연변이를 위한 올리고뉴클레오타이드를 제조한다. 그 다음, 유전적으로 변형된 게놈이나 안티게놈의 단편을 함유하는 플라스미드를 증폭한 후에, 돌연변이 조각을 완전한 길이의 게놈이나 안티게놈 클론에 재도입한다.
특정돌연변이를 감염성 RSV에 도입하는 능력은 RSV 분자생물학 및 병원성의 분석을 포함하는 매우 다양한 응용을 가진다. 단백질 발현수준이 감소되거나 제거되거나, 또는 돌연변이된 단백질을 생산하는 돌연변이를 도입함으로써, NS1, NS2, SH, M2(ORF1), M2(ORF2) 단백질 등을 포함하는 RSV 단백질의 기능을 조사하고 조작할 수 있다. 하기의 바람직한 일예에서, mRNA 코드 서열이나 전사신호측면서열을 제거함으로써 바이러스 유전자, 즉 SH 유전자의 발현이 제거된 RSV 바이러스를 제조한다. 놀랍게도, 이러한 바이러스를 회수할 수 있을 뿐만 아니라, 조직배양에서 효율적으로 성장시킬 수도 있다. 사실상, 감염성 바이러스의 생산이나 플락 크기에 기초하여 볼 때, 이러한 바이러스의 성장은 야생형에 비해 대체로 증가한다. SH 결실이나 본 발명의 다른 RSV유도체로 인한 조직배양에서 증가된 성장은 다른 시스템에서 백신 바이러스의 제조가 복잡한 조직배양에서 RSV의 수율이 낮은 문제점을 극복할 수 있는 RSV 백신 개발을 위한 유용한 도구가 된다. 이러한 결실은 유전적 복귀에 대해 매우 안정적이며, 이들로부터 유래된 RSV 클론이 백신제로서 유용하게 한다.
또한 본 발명은 하나이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면 하나이상의 cDNA로부터 감염성 RSV을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따라, 감염성 RSV를 형성하는 필요한 바이러스 단백질과 함께 세포내 또는 생체외 발현을 위해서 RSV 게놈이나 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 제조한다. "RSV 안티게놈"은 자손RSV 게놈의 합성을 위해 주형으로 작용하는 분리된 (+)-센스 폴리뉴클레오타이드을 의미한다. 바람직하게는, RNA 복제 중간체에 해당하는 RSV 게놈의 (+)-센스 버전(version)또는 안태게놈인 cDNA를 제조하여, 뉴클레오캡시드를 복제, 전사하는데 필요한 단백질을 코딩하는 상보서열, 즉 N, P, L M2(ORF 1)단백질을 코딩하는 서열의 (+)-센스 전사체와 혼성화 가능성을 최소화할 수 있다. RSV 미니게놈 시스템에서, 게놈과 안티게놈을 사용할 수 있으므로, 방법론적으로나 다른 근거로 선택할 수 있다.
자연의 RSV 게놈은 일반적으로 상보적인 바이러스 mRNA를 경유하여 11가지의 바이러스 단백질, 즉 비구조적 종인 NS1 및 NS2, N, P, 매트릭스(M), 작은 소수성(SH), 당단백질(G), 융합(F), M2(ORF1), M2(ORF2) 및 L을 코딩하는 (-)센스 폴리뉴클레오타이드 분자로 이루어지며, 상기 단백질은 대체로 Mink et al., Virology 185:615-624 (1991), Stec et al., Virology 183:273-287 (1991), Conner et al., Virol. 208:478-484 (1995)에 기재되어 있으며, 이들은 본명세서의 참고문헌으로 병합되어 있다. 본 발명의 위해서 본 발명의 재조합 RSV 게놈이나 안티게놈은 이에 의해 코드되는 바이러스나 서브바이러스 입자가 감염성이되게 한다. 추가로, 하나이상의 폴리뉴클레오타이드 분자로서 유전자나 이의 일부분을 제공할 수도 있으며, 즉, 별개의 뉴클레오타이드 분자로부터 대응부(complementation)나 이와 유사한 것으로 제공할 수도 있다. 재조합체 발현 시스템은 작동가능하게 연결된 전사 단위로 이루어진 재조합 발현 벡터을 사용할 것이며, 이러한 벡터는 RSV 유전자 발현에서 조절역할을 가지는 적어도 하나의 유전적 인자나 인자들, 예를 들면, 프로모터, RSV RNA로 전사되는 구조적인 또는 코딩 서열, 및 적절한 전사개시 및 종료 서열의 조합으로 이루어진다.
cDNA-발현 게놈이나 안티게놈으로부터 감염성 RSV를 제조하기 위해서는, I) RNA 복제를 할 수 있는 뉴클레오캡시드의 제조 및 ii) 자손 뉴클레오타이드가 RNA복제와 전사가 가능하도록 하는데 필요한 RSV 단백질과 함께 게놈이나 안티게놈을 발현시킨다. 게놈 뉴클레오캡시드에 의한 전사는 다른 RSV단백질을 제공하고 생산적인(productive) 감염을 개시한다. 또는, 생산적인 감염에 필요한 추가적인 RSV 단백질을 함께 발현함으로써 공급할 수 있다.
예를 들면, 클론된 cDNA 단편을 조합함으로써, 완전한 안티게놈을 조합체를 나타냄으로써, 또는 RSV mRNA 또는 게놈 RNA의 역전사체의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR; 예를 들면, US 특허번호 제 4,683,195 및 4,683,202에 기재되어 있고, PCR 프로토콜: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego (1990), 이는 본 명세서의 참고문헌으로 병합됨)에 의해서 본 발명에 사용하기위한 RSV 안티게놈을 제조할 수 있다. 예를 들면, 안티게놈의 왼쪽 말단을 함유하는 cDNA는 적절한 프로모터(예, T7 RNA 폴리머라제 프로모터)와 리더영역의 보충물에서부터 SH 유전자에까지 걸쳐있으며, 플라스미드(예, pBR322)나 다양한 이용가능한 코스미드, 파지, 또는 DNA 바이러스 벡터와 같은 적절한 발현벡터에 조합되어 있다. 돌연변이 및/또는 조합을 용이하도록 고안된 유일한 제한효소부위를 포함하는 합성 폴리링커의 삽입으로써 상기 벡터를 변형시킬 수 있다. 예를 들면, pBR322로부터 편리한 제한효소부위를 포함하는 합성 DNA로서 PstI-EcoRI 단편을 치환함으로써 본명세서에서 기재된 플라스미드 벡터를 제조한다. 벡터로서 pBR322을 사용함으로써 뉴클레오타이드 3716-3732를 안정화시켰으며, 그렇지 않았다면 지속적으로 뉴클레오타이드의 결실과 삽입이 있었을 것이며, 세균 DH10B에서 플라스미드를 증식시켜, 그렇지 않았다면 nt4499의 근처에서 일어났을 인위적인 중첩이나 삽입을 방지했다. 용이하게 제조하기 위해서, G, F, 및 M2유전자를 별개의 벡터에 조립하고, L과 트레일러(trailer)서열로 동일하게 하였다. 안티게놈 플라스미드의 오른쪽 말단(예, L과 트레일러 서열)은 바람직하게는 둘러싼 라미보자임과 나란한 T7 전사종결인자 등의 추가적인 서열을 포함한다. 라이보자임은 하나의 비바이러스성 뉴클레오타이드을 포함하는 3'말단을 생산하는 헤머헤드(hammer head)유형(예, Grosfeld et al., J. Virol. 69:5677-5686 (1995))일 수 있거나, 3' 말단이 없는 비RSV 뉴클레오타이드를 생산하는 헤파티티스델타 바이러스(Perrotta et al., nature 350:434-436 (1991))와 같은 다른 적합한 라이보자임중 어느 것일 수 있다. 교대로 L-트레일러-라이보자임-종결인자 조각에 대한 수용체가 되는 L에서 SH 플라스미드의 적절한 제한효소부위에 중간 단편(예, G에서 M2조각)을 삽입하여 완전한 안티게놈을 제조하였다. 본 명세서에 기재된 예시적인 일예에서, 최상의 활성을 위한 3개의 전사된 G잔기를 포함하는 T7 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터에 인접하도록 리더말단을 제조한다; 전사로 이들 3개의 비바이러스성 G'을 안티게놈의 5' 말단에 부여한다. 이러한 3개의 비바이러스성 G 잔기를 제거하여 5' 말단이 없는 비바이러스성 뉴클레오타이드를 제조한다. 거의 정확한 3'말단을 제조하기 위해서는, 절단으로 단독의 3'-인산화 U잔기를 코드된 RNA의 3'말단을 부여하는 헤머헤드 라이보자임에 인접하게 트레일러말단을 제조한다.
본 발명의 일예에서, RSV 뉴클레오캡시드을 복제, 전사하는데 필요한 단백질을 코딩하는 상보적인 서열을 하나이상의 헬퍼 바이러스로서 제공한다. 이러한 헬퍼 바이러스는 야생형이거나 돌연변이일 수 있다. 바람직하게는, 상기 헬퍼바이러스는 RSV cDNA가 코딩하는 바이러스와는 표현형 형태가 구별된다. 예를 들면, 헬퍼 바이러스와 면역적으로 반응하나 RSV cDNA가 코딩하는 바이러스와는 반응하지 않는 단클론 항체를 제공하는 것이 바람직하다. 그러한 항체는 항체를 무력화시킬 수 있 다. 몇 가지 예에서, 친화성 크로마토그래피에서 재조합 바이러스와 헬퍼 바이러스를 분리하기 위해서 상기 항체를 사용할 수도 있다. 이러한 항체의 획득을 돕기 위해서는, RSV cDNA에 돌연변이를 도입하여 헬퍼 바이러스로부터 항원 다양성, 예를 들면, HN이나 F당단백질 유전자를 제공할 수 있다.
RSV 게놈이나 안티게놈에 다양한 뉴클레오타이드 삽입이나 결실을 만들 수 있다. 야생형 사람 RSV 게놈의 뉴클레오타이드 길이(15,222 뉴클레오타이드)는 6의 배수이고, 뉴클레오타이드의 길이가 6의 배수가 되는 경우에만(캡시드화 NP 단백질에 대해 뉴클레오타이드 잔기의 정확한 공간을 위한 요건이라고 생각된다) 게놈(또는 미니게놈)이 복제가 가능한, 즉 "6배수의 규칙"이 준수되는 파라믹소바이러스와 보르빌리바이러스 속의 일원이다. 하나의 잔기가 증가함으로써 RSV 게놈의 길이가 변하는 것은 복제효율에 아무런 영향이 없으며, 수 개의 다른 미니게놈 돌연변이의 서열분석에 의하면 길이차이는 보충적인 변화가 없다면 유지된다. 따라서, RSV는 6배수라는 게놈 길이의 엄격한 요구가 지켜지지 않으며, 본 발명의 재조합 RSV의 복제에는 손상시키지 않고 RSV 게놈이나 안티게놈상에서 뉴클레오타이드 삽입과 결실을 할 수 있다.
게놈이나 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 제조하는 또다른 방법에는 서브유니트 cDNA 성분의 수를 하나 또는 두 조각으로 줄이기 위해서 향상된 PCR조건을 사용하는 역전사-PCR (예, Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699 (1994); Samal et al., J. Virol 70: 5075-5082 (1996), 각각은 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)에 의한 것이 포함된다. 다른 예에서는 다른 프로모터(예, T3, SP6) 나 다른 라이보자임(예, 헤파티티스 델타 바이러스의 것)이 사용된다. 큰 크기의 게놈이나 안티게놈을 더 잘 수용하기 위해서는 증식을 위해서 다른 DNA 벡터(예, 코스미드)를 사용할 수 있다.
RNA복제에 필요한 N, P 및 L 단백질은 계속적인 전사를 위해서는 M2(ORF1)과 같은 RNA 폴리머라제 연장인자가 필요하다. 따라서, M2(ORF1) 또는 (-) 사슬 RNA을 전사용 대체로 동등한 전사연장인자가 감염성 RSV에 필요하며, 생산적인 감염동안에는 기능적인 뉴클레오캡시드의 필수적인 성분이다. M2(ORF1) 단백질의 필요성은 전사연장인자로서의 이 단백질의 기능과도 일치한다. (-)사슬 RNA 바이러스에대한 RNA폴리머라제 연장인자 단백질의 발현 필요성은 본 발명의 특징이다. 완전한 M2 유전자 형태에서 두 번째 ORF2가 도한 발현되어 RNA복제의 저해 효과를 가질지라도, 완전한 M2 유전자의 발현으로 M2(ORF1)를 공급할 수 있다. 따라서, 완전한 M2 유전자를 사용하여 감염성 바이러스를 생산하기 위해서는, M(ORF1)이 충분히 발현되어 RNA 복제를 저해하지 않으나 M2(ORF1)의 전사연장인자 활성을 제공하도록 두 ORF의 활성이 균형을 이루어야 한다. 또는, ORF2가 결여되도록 가공되거나 결함있는 ORF를 코딩하는 cDNA로부터 결함있는 ORF1 단백질을 제공한다. 또한, 외피 구성성분(즉, SH, M, G, F 단백질) 과 같은 추가적인 바이러스 유전자를 함께 발현시킴으로써 바이러스 생산의 효율성을 증가시킬 수 있다.
형질감염, 일레트로포레이션(electroporation), 기계적인 삽입, 형질도입 등 기타등등의 방법으로 게놈이나 안티게놈을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드(예, cDNA) 및 각각, N, P, L 및 M2 (ORF1)단백질을 생산적인 RSV 감염을 지속시킬 수 있는 세포, 예를 들면, HEp-2, FRhL-DBS2, MRC, 및 Vero 세포에 삽입할 수 있다. 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열의 형질감염을 예를 들면, 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염 (Wingler et al., Cell 14:725 (1978); Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603 (1981); Graham and Van der Eb, Virolgy 52: 456 (1973)), electroporation(Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845 (1982)), DEAE-덱스트린 매개 형질감염(Ausubel et al., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, INc., NY (1987))의 방법, 양이온 지질-매개 형질감염(Hqwley-Nelson et al., Focus 15:73-79 (1993)) 또는 상업적으로 구입가능한 형질감염 시약, 예를 들면, LipofectACE(상표명)(Life Technologies)(각각의 문헌은 본 명세서의 참고문헌으로 병합됨)에 의해서 배양된 세포에 도입할 수 있다. 게놈이나안티게놈을 코딩하는 같거나 별개의 하나이상의 발현벡터 및 이들의 다양한 조합으로 N, P, L 및 M2(ORF1)단백질을 코딩한다. 바람직하게는 그 자체의 벡터 또는 N, P, L 또는 M2(ORF1)단백질이나 완전한 게놈이나 안티게놈을 코딩하는 벡터에 의해서 코딩되는 추가적인 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 백신이나 바이러스 MVA 균주 재조합체(Wyatt et al., Virology 210:202-205 (1995), 본 명세서에 참고문헌으로 병합됨)와 같은 T7 RNA 폴리머라제의 발현시스템으로 차례대로 감염, 형질감염, 또는 형질도입에 의해서 공급되는 T7 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터의 조절하에 잇는 각 cDNA에 의해서 형질감염된 플라스미드의 게놈이나 안티게놈 및 단백질을 발현시킬 수 있다. 형질전환된 포유동물세포로부터 또는 미리 형성된 mRNA나 단백질의 형질감염으로 바이러스 단백질, 및/또는 T7 RNA 폴리머라제를 제 공할 수 있다.
또는, 생체외에서(무세포) 전사-번역이 결합된 반응에서 안티게놈이나 게놈을 합성하여 세포로 감염할 수 있다. 또는 생체외에서 안티게놈이나 게놈RNA을 합성하여 RSV 단백질 발현세포로 형질감염시킬 수 있다.
본 명세서에서 제공된 생물학적 유래 및 재조합 RSV 균주의 숙주로부터 백신 후보 바이러스를 선택하기 위해서는, 공지된 방법으로 약독화성과 면역성을 결정한다. 본 발명의 백신으로 가장 바람직한 바이러스는 생존능을 유지해야 하며, 안정화 약독화 표현형을 가져야 하고, 면역화된 숙주에서 복제를 해야 하며(비록 더 낮은 수준이기는 하나), 그리고 야생형 바이러스의 후속적인 감염으로 인한 심각한 질병에 대해 보호능을 부여하기에 충분한 백신상상에서 면역반응의 생산을 효율적으로 제거하여야 한다. 명백히, 이제까지 알려지고 보고된 RSV 돌연변이는 이러한 기준을 모두 만족하지는 못했다. 정말로, 알려진 약독화 RSV에 대해 보고된 결과에 근거한 예상과 달리, 본 발명의 바이러스는 생존하고 이전의 돌연변이보다 더 약독화되었을 뿐만 아니라, 이전에 연구된 돌연변이보다도 생체내에서 유전적으로 더욱 안정하며, 보호면역반응을 자극하는 능력은 여전히 보유하며 몇몇의 경우에 여러 가지 바이러스 균주나 서브그룹에 대한 보호를 유도하는 등 다수의 변형으로 보호를 확장하는 능력 또는 분비 대 혈청 면역글로블린, 세포의 면역, 기타등등의 여러 가지 면역적 근거에 의한 보호를 확장하는 능력을 보유하고 있다. 본 발명의 이전에, 생체내에서 복제에 수반되는 ts 표현형의 유전적 안정성은 ts바이러스에 대한 규칙이 되어왔다(Murphy et al., Infect. Immun. 37:235-242 (1982)).
백신용이나 다른 목적으로 RSV 바이러스를 증식시키기 위해서는, RSV 성장을 가능하게 하는 다수의 세포주가 사용될 수도 있다. RSV는 다양한 사람 및 동물세포에서 자란다. 백신용으로 약독화된 RSV을 증식시키기에 바람직한 세포주로는 DBS-FRhL-2, MRC-5, Vero세포가 포함된다. 최고의 바이러스 수율은 Vero 세포와 같은 상피세포주에서 얻어진다. 일반적으로 약 0.001-1.0이나 그이상의 범위의 감염빈도로 바이러스를 가진 세포를 바이러스의 복제가 허용되는 조건하에서, 예를 들면, 약 30-37℃ 및 약 3-5일, 적합한 농도의 바이러스를 얻기에 필요로 하는 한 오랫동안 배양한다. 세포배양에서 바이러스를 제거하고 공지된 분리절차, 예를 들면, 원심분리와 같은 방법으로 세포성분을 분리하고, 바람직하게는 본 기술분야에서 공지된 방법으로 추가로 정제할 수도 있다.
본 명세서에 기재된 대로 약독화된 RSV를 공지되고 일반적으로 받아들여지는 다양한 생체외 및 생체내 모델로 테스트하여 백신용으로 적합한 약독화, 표현형 복귀에 대한 내성, 및 면역성을 확인할 수 있다. 생체외 분석에서, 바일서스 복제의 온도민감성, 즉 ts표현형에 대해 그리고 작은 크기의 표현형에 대해 변형된 바이러스(예, 다수의 약독화된, 생물학적 유래 또는 재조합 RSV)를 테스트한다. 다양한 동물 모델을 다음의 문헌에 개시하고 요약하고 있다: Meignier et al., eds., Animal Models of Respiratory Syncytial Virus Infection, Merieux Foundation Publication (1991), 이는 본명세서의 참고문헌으로 병합됨.
RSV 감염의 코튼랫 모델은 US 제 4,800,078 및 Prince et al., Virus Res. 3:193-206 (1985)에 기재되어 있으며 이 문헌은 본 명세서의 참고문헌으로 병합되 어 있고, 약독화와 사람에서의 약효를 예시하는 것으로 믿어진다. 침팬지를 사용한 RSV 감염의 영장류 모델은 약독화와 사람에서의 약효를 예시하며 Richardson et al., J. Med. Virol. 3:91-100 (1978); Wright et al., Infect Immun., 37:397-400 (1982); Crowe et al., Vaccine 11:1395-1404 (1993)에 기재되어 있으며 이들 문헌은 본 명세서의 참고문헌으로 병합되어 있다. RSV 후보의 약독화 수준에 관련된 설치류와 침팬지로부터 얻은 결과의 상호관련성을 참고로서 도 1에 의해서 설명할 수 있으며, 도 1은 쥐의 폐에서 다양한 호흡기 세포 융합 바이러스 서브그룹 A의 복제와 침팬지에서의 이들의 복제와의 관계를 나타내는 그래프이다. wt RSV의 것에 비해 상대적인 복제 수준은 대체로 동일하며, 이는 백신 RSV 후보의 약독화 수준을 초기에 특징화하는 모델로서 쥐가 작용할 수 있음을 말한다. 쥐와 코튼랫 모델은 특히 RSV가 침팬지에서 부적절한 성장을 나타내는 경우에 유용하다. RSV 서브그룹 B 바이러스는 침팬지에서 성장이 좋지 않은 RSV의 예이다.
더욱이, 감염된 코튼랫에서 RSV 무력화 항체의 치료적 효과는 RSV에 의해 감염된 원숭이와 사람의 면역학적 치료법으로 이어서 치료한 것에 상당한 효과가 있는 것으로 나타난다. 정말로, 코튼랫은 RSV 무력화 항체로 하는 면역치료에 대한 감염된 원숭이나, 침팬지 및 사람의 반응에 대해 믿을 만한 실험용 혈청음성이라고 여겨진다. 예를 들면, 코튼랫의 혈청에서 그러한 항체의 수준을 측정한 코튼랫에서 치료적 효과와 관련된 RSV 무력화 항체의 양(즉, 1:302 내지 1:518의 혈청 RSV 무력화 농도)은 원숭이(즉, 1:539 농도)나 사람 소아나 어린이(즉, 1:877)에대해 설명되는 것과 동일한 범위이다. 코튼랫에서의 치료효과를 폐에서 바이러스 농도가 100배 이상의 감소에 의해서 증명되나(Prince et al., J. Virol. 61: 1851-1854), 반면에 원숭이에서 치료효과는 폐에 있는 바이러스 농도가 50배 감소함이 관찰된다(hemming et al., J. Infect. Dis. 152:1083-1987 (1985)).
마지막으로, 심각한 RSV 기관지염이나 폐렴으로 입원한 유아나 어린이에 대한 치료효과는 처리된 그룹에서 산소화(oxygenation)의 상당한 증가 및 처리된 환자의 상부 기도에서 회수할 수 있는 RSV양의 상당한 감소에 의해서 증명된다(Hemming et al., Antimicrob. Agents Chemother. 31:1882-1886 (1987)). 그러므로, 이러한 연구에 근거하여, 코튼랫은 유아와 어린이에서 RSV 백신의 성공을 예측하는 데 적절한 모델을 구성한다. 설치류가 RSV 복제에 허용적이고 사람과 같은 것보다 핵심 온도를 가지고 있기 때문에, 쥐를 포함하여 다른 설치류도 또한 유용할 것이다(Wright et al., J. Infect. Dis. 122:501-512 (1970) and anderson et al., J. /Gen. Virol. 71: (1990)).
앞서 기술한 내용에 따르고 다음의 실시예에 기초하여, 본 발명은 백신용 분리된 감염성 RSV 조성물을 제공한다. 백신의 성분인 약독화된 바이러스는 분리되고 일반적으로 정제된 형태이다. 분리된(isolated)라 함은 감염된 개체의 나소파린스과 같은 야생형 바이러스의 자연적인 환경이외의 것인 RSV을 말한다. 더욱 일반적으로는, "분리된"이란 세포배양이나 다른 인위적인 배지의 성분으로서 약독화된 바이러스를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, 감염된 세포배양을 하고, F단백질에 대한 단클론 항체를 무력화에 대한 내성으로서 약독화된 것을 선택하는 것과 같이 세포배양으로부터 분리하여 다른 비자연발생적 RSV를 포함하는 안전화제에 첨가 한다. 본 발명의 약독화된 바이러스를 제조할 수도 있다.
본 발명의 RSV 백신은 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조된 RSV를 활성성분으로서 면역학적 유효량으로 포함한다. 생물학적 유래 RSV나 재조합 RSV을 직접 백신제제에 사용할 수 있거나, 냉동건조하여 사용할 수 있다. 냉동건조된 바이러스를 일반적으로 약 4℃에서 유지한다. 사용할 준비가 된 냉동건조 바이러스를 예를 들면, 아래에 설명하는 바와 같이 추가의 부형제가 함유되거나 함유되지 않는 식염수 또는 SPG, Mg2+ 및 HEPES를 포함하는 용액등과 같은 안정화용액에서 재구성한다. 생물학적 유래 RSV 또는 재조합적으로 변형된 바이러스를 생물학적으로 수용할 수 있는 담체 및/또는 부형제와 함께 숙주세포로 도입한다. 유용한 담체가 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 기타 등등이 있다. 결과적인 수용액을 그 자체나 냉동건조상태로 포장할 수 있으며, 상술한 바와 같이 냉동건조된 제제는 투여하기 전에 무균용액과 혼합된다. 상기 조성물은 근사한 생물학적 조건의 조건에 필요한, pH조절제, 습윤제, 기타등등과 같은 약리적으로 허용되는 보조물질(auxiliary substance)을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 소디움 아세테이트, 소디움 락테이트, 소디움 클로라이드, 포타슘클로라이드, 칼슘클로라이드, 소르비탄 모노라루레이트, 트리에탄올아민올레이트, 기타등등이 있다. 허용되는 부형제로는 본 기술분야에서 공지된 물질로서 불완전한 Freund's부형제, 알루미늄포스페이트, 알루미늄히드록사이드, 또는 알룸이 포함된다. 바람직한 부형제는 또한 Stimulon(상표명) QS-21(Aquila Biopharmaceuticlas, Inc., Worcherster, MA), MPL(상표명)(3-0-디아실레이트 모노포스로릴 리피드A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) 및 인터루킨-12(Genetics Institute, canbridge, MA)가 포함된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 에어로졸, 점적(droplet), 경구, 국소 또는 다른 경로로 RSV 백신 조성물로서 면역화할 경우에, 숙주의 면역 시스템은 RSV 바이러스 단백질, 예를 들면, F 및 G당단백질 등에 대한 특이한 항체를 생산함으로써 백신에 반응한다. 백신화 결과로서 숙주는 RSV 감염에 대해 적어도 부분적으로나 완전히 면역하게 되거나, 중간정도나 심각한 RSV 질병, 특히 하부 기도의 RSV 질병의 발병에 대한 내성을 가진다.
백신이 투여된 숙주는 RSV 또는 밀접하게 관련된 바이러스에 의해 감염될 수 있으며 백신화 균주의 항원에 보호면역반응을 생성할 수 있는 어떠한 포유동물도 포함된다. 따라서, 적합한 숙주로는 사람, 사람을 제외한 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 라가모프(lagamorph), 설치류 기타등등이 포함된다. 따라서, 본 발명은 사람과 수의학의 다양한 용도로 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
RSV에 대한 개체의 면역반응을 유도하고 증가시키기에 충분한 "면역학적으로 유효한 투여량"으로 본 발명의 약독화된 RSV를 포함하는 백신 조성물을 RSV 감염의 위험이 있거나 감염되기 쉬은 환자에게 투여한다. 사람인 경우에는, 예를 들면, Wright et al., Infect Immun. 37:397-400 (1982), Kim et al, Pediatrics 52:56-63 (1973), Wright et al., J. Pedatr. 88:931-936 (1976)(이들 문헌을 참고문헌으로 병합됨)에 기재된 잘 확립된 사람 RSV 백신 프로토콜에 따라서 본 발명의 약독화된 바이러스를 투여한다. 요컨대, 성인이나 어린이는 일반적으로 0.5 ml 생리학 적으로 허용되는 희석제나 담체에 있는 RSV 백신을 면역학적 유효량으로 점적으로서 비강내로 접종한다. 이러한 방법의 잇점은 비복제 백신으로 비경구 면역화에 비해 간편성과 안정성에 있다. 또한 이 방법은 RSV 내성에서 중요한 역할을 하는 국소적인 기도 면역의 직접적인 자극을 제공한다. 추가로, 이 면역화방법은 일반적으로 영아에서 발견되는 RSV-특이적 어머니-유래 혈청 항체의 면역억제 효과를 효과적으로 우회시킨다. 또한, RSV 항체의 비경구투여가 때때로 면역병원성 합병증에 관련될 수 있는 데 반해, 이것이 살아있는 바이러스에서는 전혀 발견되지 않았다.
모든 대상에서, RSV 백신의 정확한 투여량과 투여시간 및 투여반복을 환자의 건강상태, 몸무게, 투여 방식, 제제의 특성 등에 기초하여 결정할 것이다. 투여량은 일반적으로 환자당 약 1-3-106 플락형성단위(PFU)바이러스 이상의 범위이다. 어떤 경우에, 백신 제제는 항-RSV 면역반응을 효과적으로 유도하거나 자극하기에 충분한 양으로 본 발명의 약독화된 RSV의 양을 제공되면, 예를 들면, 보체 고정(complement fixation), 플락무력화, 및/또는 효소결합면역탐지분석에 의해서 이러한 양을 결정할 수 있다. 이러한 점에서, 상부 기도 질병의 암시나 징후에 대해 개체를 모니터한다. 침팬지에 투여했을 때, 약독화된 백신 바이러스는 나소파릭스 백신에서 야생형에 비해 약 10배 이하의 수준으로 성장하거나, 불완전하게 약독화된 RSV의 수준에 비해 약 10배 이하의 수준으로 성장한다.
생후 1개월 이내의 신생아 및 영아에서, 충분한 수준의 면역화를 위해서 수회 투여가 필요하다. 투여의 시작을 1개월 이내에 이루어져야 하며, 유아기전체에 투여간격은 2개월, 6개월, 1년 및 2년 등과 같이 자연적인 (야생형) RSV감염에 대 한 충분한 보호수준을 유지하는 데 필요한 정도이다. 유사하게, 특히 반복적이고 심각한 RSV에 감염되기 쉬운 성인, 예를 들면, 건강에 대한 서비스업에 종사자, 데이케어 종사자, 어린이의 가족들, 노인, 심폐기능에 문제가 있는 개체는 보호면역반응을 확립 및/또는 유지하기 위해서 다수의 면역이 필요하다. 무력화 분비형 항체 및 혈청항체의 양을 측정함으로써 유도된 면역 수준을 모니터할 수 있으며, 원하는 수준의 보호를 유지하기에 필요한 투여량을 조절하거나 백신화 회수를 조절한 수 있다. 추가로, 다른 수용체 그룹에 투여하기 위해서 다른 백신 바이러스는 지시할 수도 있다. 예를 들면, 사이토키닌이나 T세포 에피토프가 풍부한 추가적인 단백질을 발현하는 가공된 RSV 균주는 특히 유아보다는 성인에게 유리하다. 다수의 RSV 서브그룹이나 균주에 대한 보호반응을 형성하기 위해 본 발명에 따라 제조된 RSV 백신을 다른 서브그룹이나 균주의 RSV와 혼합할 수도 있으며, 또는 예를 들면, 이들 균주의 보호 에피토프를 코딩하는 선택된 유전자 단편을 본 명세서에서 설명한 대로 하나의 RSV클론으로 가공하여 삽입할 수도 있다. 일반적으로 다른 바이러스들은 혼합상태로 동시에 투여하거나, 각각 투여할 수도 있다. 예를 들면, 두 RSV 서브그룹의 F 당단백질은 아미노산 서열이 11%만 다르기 때문에, 이러한 유사성은 RSV 나 F항체로 면역화되고 이종 균주로 감염된 동물에서 관찰되는 것과 같이 교차-보호 면역반응을 위한 근간이 된다. 따라서, 하나의 균주로 면역화는 같거나 다른 서브그룹의 다른 균주에 대해서도 보호할 수 있다.
야생형 RSV로 후속적인 감염된 개체의 경우에는, 본 발명의 백신은 폐렴이나 기관지염과 같은 심각한 하부 기도 질병에 대해 보호하는 면역반응의 생성을 제거 한다. 자연적으로 순회하는 바이러스는 특히 상부 기도에서 여전히 감염을 일으킬 수 있는 있기 때문에, 면역화와 야생형 바이러스의 이어진 감염에 의한 내성 증가의 결과로 비염의 발생 가능성이 매우 크게 감소한다. 백신화 후에, 생체외 및 생체외에서 동일한(동일한 서브그룹) 야생형 바이러스를 무력화시킬 수 있는, 숙주가 생산하는 혈청항체나 분비형 항체가 감지할 만한 수준이다. 많은 경우에 숙주 항체는 또한 백신 서브그룹이 아닌 다른 야생형 바이러스를 무력화 할 수 있을 것이다.
본 발명의 약독화된 RSV는 사람에서 순회하는 자연적인 야생형 바이러스에 비해 독성이 매우 많이 감소했음을 나타낸다. 약독화된 바이러스는 대부분의 면역화된 개체에서 감염의 징후가 나타나지 않을 정도로 약독화되었다. 몇몇 경우에 약독화 바이러스는 백신화되지 않은 개체에 여전히 분산된다. 그러나, 숙주에서 백신화되거나 우연히 일어나는 심각한 하부 기도 감염이 나타나지 않을 정도로 약독화된 바이러스의 독성이 충분히 없어졌다.
예를 들면, 면역화된 숙주의 기도에 있는 바이러스를 정량화하고 야생형 RSV 또는 백신균주 후보로 평가된 다른 약독화된 RSV에 의해 생성되는 양과 이 양을 비교함으로써, 백신바이러스의 약독화 수준을 결정할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 약독화 바이러스는 야생형 바이러스의 복제수준에 비해, 침팬지와 같은 감염가능성이 큰 숙주의 상부 기도에서 복제제한 정도가 예를 들면, 10 내지 1000배정도로 더 클 것이다. 또한 침팬지의 상부 기도에서 약독화 RSV 백신 균주의 복제수준은 혈청 음성 사람 유아에서 불완전하게 약독화된 것으로 이전에 기술한 RSV A2 ts-1돌연변이의 수준보다 낮아야 한다. 상부 기도에서의 바이러스 복제와 관련된 비루의 발생을 추가로 감소시키기 위해서, 이상적인 백신 후보 바이러스는 상부와 하부 기도 모두에서 제한된 수준의 복제를 나타내야 한다. 그러나, 본 발명의 약독화 바이러스는 백신화 개체에 보호를 부여하도록 사람에서 감염성과 면역성이 충분해야 한다. 감염된 숙주에서 나소파릭스에서 RSV 수준을 측정하는 방법은 문헌에 공지되어 있다. 비인강(卑咽腔) 분비를 빨아들이고 세척하고 실험실 방법으로 조직배양이나 다른 것에서 바이러스 정량화하에 의해서 표본을 얻는다. 예를 들면, Belshe et al., J. Med. Virology 1:157-162 (1977), Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694 (1968); Gharpure et al., J. Virol. 3:414-421 (1969); and Wright et al., arch. Ges. virusforsch. 41:238-247 (1973)에 기재도어 있다. 침팬지와 같은 숙주 동물의 비인강에서 바이러스를 편리하게 측정할 수 있다.
몇몇의 경우에, 본 발명의 RSV 백신과 다른 작용제에 보호면역반응을 유도하는 백신, 특히 다른 어린이 백신과 혼합하는 것이 바람직할 수도 있다. 예를 들면, Clements et al., J. Clin. Microbiol. 29:1175-1182 (1991)(본 문헌은 명세서에 참고문헌으로 병합됨)에 기재된 대로 본 발명의 RSV 백신을 파라인플루엔자 바이러스 백신과 함께 투여할 수 있다. 본 발명의 또 다른 예에서, 본 명세서에 기재된 것과 같이 감염성 RSV를 제조하기 위해서 사용된 RSV 게놈이나 안티게놈에 보호항원을 코딩하는 서열을 병합함으로써 파라인플루엔자와 같은 다른 기도 병원체의 보호항원용 벡터로 본 발명의 RSV를 사용할 수 있다.
본 발명의 또다른 예에서, 재조합 RSV를 기도의 일시적인 유전자요법용 벡터로 사용할 수 있다. 이 예에 따라서, 재조합 RSV 게놈이나 안티게놈은 대상 유전 자산물을 코드할 수 있는 서열을 병합한다. 대상 유전자 산물은 RSV 발현을 조절하는 프로모터와 동일하거나 다른 프로모터의 조절하에 있다. N, P, L 및 M2(ORF1)과 함께 재조합 RSV 게놈이나 안티게놈 감염성 RSV를 발현하여 제조되며 대상 유전자 산물을 코딩하는 서열을 함유하는 감염성 RSV을 환자에게 투여한다. 일반적으로 에어로졸, 분무기, 또는 다른 국소 적용방법으로 치료대상의 기도에 투여한다. 원하는 유전자 산물이 치료학적이나 예방적인 수준으로 발현되기에 충분한 양으로 재조합 RSV를 투여한다. 이러한 방법으로 투여될 수 있는 대표적인 유전자 산물에는 예를 들면, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 감마-인터페론, GM-CSF, G-CSF, 에리트로로이에틴, 및 다른 사이토키닌류, 클루코세레브로시다제, 페닐알라닌히드록사제, 포낭섬유형성 막관통 전도 조절자 (CFTR), 하이포산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 시토톡신, 종양억제유전자, 안티센스 RNA들, 및 백신 항원등과 같은 일시적인 발현에 특히 적합한 유전자 산물 등을 코딩하는 유전자 산물이 포함된다.
다음의 실시예는 예시적인 것으로서 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 저온처리된 RSV의 돌연변이 유도체를 분리 및 특징화
본 실시예는 불완전하게 약화된 숙주범위-제한 cpRSV를 화학적으로 돌연변이시켜 더 많이 약화되어 RSV 백신제제용으로 바람직한 유도체 ts 및 sp 돌연변이의 제조에 관한 것이다. 저온 처리된 RSV (cpRSV)의 모바이러스를 제조했다. 사람에서 불완전하게 약화된 Flow Laboratories Lot 3131 바이러스인 cpRSV 모 바이러스를 MRC-5세포에서 25℃로 두 번 처리하였고, MRC-5세포에서 25℃에서 두 번 마지막으 로 희석한 후에 MRC-5에서 3번 처리하여 돌연변이야기를 위한 cpRSV 현탁액을 제조하였다.
배지에 4X 10-4M농도의 5-플루오로우라실의 존재하에서 32℃에서 MRC-5세포에서 모바이러스를 성장시킴으로써 cpRSV를 돌연변이 시켰다. 5-플루오로우라실이 없는 배지에 비해 조직배양에서 5일 배양할 때 바이러스 농도가 100배가 감소함에 의해 증명되었기 때문에, 예비적인 연구에서 이러한 농도가 최적임을 설명하고 있다. 그 다음, 한청중층하에서 유지되는 Vero세포위에서 플락분석법으로 변이처리된 바이러스을 분석하였고, 적절한 배양 간격 후에 뉴트럴레드염료(neutral red dye)로 염색하였다. 854 플락을 선택하여 새로운 Vero세포 단층 배지에서 배양함으로써 각 플락의 자손을 별개로 증식하였다. Vero 세포에서 세포병리적 효과가 최대로 나타날 때, cpRSV-돌연변이된 바이러스의 플락 하나의 자손으로 접종된 각 조직배양의 내용물을 각각 별개로 수확하였다. 온도민감성(ts), 또는 작은 크기(sp)의 플락을 나타내는 자손 바이러스를 이들 플락풀을 HEp-2세포위에서 32℃ 및 38℃에서 배양하으로써 찾았다. sp표현형(플락의 크기가 32℃에서 모바이러스에 비해 50%이상이 감소) 또는 ts표현형(32℃에 비해 제한적인 온도[37℃-40]에서 농도가 100배이상 감소)을 나타내는 어떠한 바이러스를 추가로 평가하였다. 이러한 균주들을 Vero 세포에서 3회 일련의 플락-정제로서 생물학적으로 클로닝한 후에, Vero세포에서 증폭하였다. 클론화 균주를 32℃, 37℃, 38℃, 39℃, 및 40℃(플락 형성의 효율성(EOP) 분석법에서 )에서 배양하여 그들의 sp 및 ts표현형을 확인하였다. 몇몇 클론 화 균주의 농도는 상대적으로 허용온도(32℃)에서 훨씬 낮기 때문에, 이들 바이러스를 HEp-2세포에서 한 번 처리하여 생체외 분석을 위한 바이러스 현탁액을 제조한다. 돌연변이된 cpRSV의 자손의 표현형을 표 1에서 나타내고 있다.
돌연변이 자손중 하나는 작은 크기 표현형인 RSV cpsp143(sp는 작은 플락(small plaque) 표현형을 말함)를 가지며, 나머지 돌연변이 자손은 ts 표현형을 가진다. 대부분의 온도 민감성(ts) 바이러스인 cpts248이 38℃에서 플락을 형성할 수 없는 반면에, RSV cpts 돌연변이는 37℃ 내지 40℃온도 범위에서 생체외 단층 배양에서 플락형성능상의 변동을 나타내며, cpts368은 40℃에서 플락을 형성한다. 따라서, 몇몇의 cpRSV자손이 플락형성의 온도민감성측면에서 cpRSV 모 바이러스와 뚜렷한 차이를 나타낸다.
쥐에서
복제 및 유전적 안정성 실험
BALB/c쥐의 하부 및 상부 기도에 있는 cpRSV 유래 돌연변이의 복제수준을 다음(표 2)에서 연구했다. 최대의 온도민감성을 나타내는(표 1) 두 돌연변이 cpts530 과 cpts248는 쥐의 비개골에서 복제가 7배 내지 12배 제한되었다(표 2). 그러나, 어떠한 바이러스도 cpRSV 모 바이러스에 비해 폐에서 복제가 제한되지 않았다. 폐보다 비개골에서 더 크게 복제가 제한되는 것은 일반적으로 더 따뜻한 하부 기도에서 복제가 더 제한되는 ts 돌연변이의 특성이 아니다(Richman and Murphy, Rev. Infect. Dis. 1:413-433 (1979)). 페와 비개골에서 생성된 바이러스는 주입바이러스의 ts특성를 유지했다(자료는 제시하지 않았음). 본 발견은 cp모 바이러스의 돌연변이의 배경위에 ts 돌연변이의 결합은 이전에 연구된 ts 돌연변이에서 나타난 것보다 생체내 복제후에 ts 표현형을 유전적 안정성이 더 높은 cpRSV ts 자손을 얻어졌다.
cpRSV 유래 돌연변이의 ts 표현형의 유전적 안정성 수준을 더 개발하기 위해서는, 누드마우수(nude mice)의 폐와 비개골에 존재하는 바이러스의 플락형성의 효율성을 대부분의 ts 돌연변이중 두 가지 cpRSV 자손 돌연변이, 즉 cpts248 및 cpts530에 대해서 연구하였다. 기능적인 T세포가 선천적으로 없어 면역무방비상태이고 바이러스가 이들 숙주에서 더 장기간 복제할 수 있기 때문에, 누드마우스를 선택했다. 더 장기간의 복제는 변형된 표현형을 가진 바이러스 돌연변이의 생성에 유리하다. 12일째에 존재하는 바이러스(주해: 정상적인 쥐에서는, 바이러스가 이 시간에서 감지할 수 없다)를 특징화하고 변형되지 않은 ts 표현형을 유지하였음을 알았다(표 3). 예상한 바와 같이, 양성 조절인자로서 실험에 포함된 ts-1 돌연변이가 생체내에서 불안정한 ts 표현형을 나타냈다. 따라서, 설치류에서 ts 돌연변이 바이러스에 대한 이전의 평가와는 반대로, 상기 결과는 cpRSV 유래 돌연변이후에 설치류에서 연장된 복제의 ts 표현형의 높은 안정성 수준을 달성했으며, 이는 본 발명의 바이러스에서 상당하고도 이전의 얻을 수 없는 매우 바람직한 특성을 나타냄을 설명한다.
침팬지에서
복제 및 유전적 안정성 실험
사람에 가장 밀접하게 관련된 혈청음성 침팬지에서 cpRSV ts 유도체의 약화정도를 다음에 측정하였다. 본 명세서에 참고문헌으로 병합된 Richardson et al., J. Med. Virol. 3:91-100 (1979); Crowe et al., Vaccine 11:1395-1404 (1993)에 기재된 일반적인 프로토콜에 따라서 침팬지 또는 올빼미 원숭이(owl monkey)에서 시도를 했다. 돌연변이 처리된 약화 바이러스 약 104 PFU 를 함유 현탁액 1ml을 각 동물에 비강내로 투여하였다. 또다른 방법은 RSV를 각 부위에 104 PFU의 투여량으로 상부 및 하부 기도 모두에 접종하는 것이다. 침팬지에서 10일간 매일 샘플을 채취하고, 그후에는 매 3-4일에 채취하여 20일까지 하였다. Snyder et al., J. Infec. Dis. 154:370-371 (1986) 및 Crowe et al., Vaccine 11:1395-1404 (1993)에 기재된 프로토콜에 따라서 침팬지의 하부 기도을 기관세척함으로써 샘플링하였다. 4 내지 6주후에 야생형 바이러스로 몇몇 동물을 공격하였다. 비인강 표본을 매일 취하여 기도 질병의 징후에 대해 동물을 평가하였다. 비루(卑漏)를 0에서 4+로 점수를 매기로, 2+ 이상은 상당한 상부 기도 질병의 증거로 여겨진다.
상기한 바와 같이 RSV 민감성 HEp-2세포에 접종함으로써 코와 목구명의 면봉 표본 및 기관세척액에서부터 바이러스를 분리하였다. 본명세서에 참고문헌으로 병합된 Schnitzer et al., J. Virol. 17:431-438 (1976)에 기재된 HEp-2 세포을 사용하는 플락기술로 바이러스 양을 직접적으로 결정하였다. 바이러스를 투여하기전에 혈청 표본을 모았고 본명세서에 참고문헌으로 병합된 Mills et al., J. Immununlo. 107:123-130 (1970)에 기재된 대로 RSV무력화 항체의 결정을 위해 3-4주 후에 접종했다. 대부분의 ts 및 약화된 cpRSV 유도체 (cpts248)을 연구하였고 야생형 RSV 및 cpRSV 모 바이러스와 비교하였다(표 4). cpRSV 모 바이러스의 복제는 야생형에 비해 인비강에서 약간 감소하였으며, 야생형에 비해 비루의 양도 감소하였고, 그리고 야생형에 비해 하부 기도에서 바이러스 복제가 600배 감소하였다. 명백히, cp바이러스는 침팬지의 하부기도에서 복제가 상당히 제한되었고, 동물이나 삶에서 cpRSV의 이전의 평가에서부터 바람직한 특성이 확인되지 않았다. 더욱 상당하게는, cpts 248 바이러스는 야생형에 비해 비인강에서 복제가 10배 제한되었으며, 이러한 제한은 비루의 뚜렷한 감소와 관련된다. 이러한 발견은 cpRSV 유래 돌연변이가 살아있는 RSV백신용에 적합한 두 가지 매우 바람직한 특성을 가짐을 나타내며, 즉, 감염가능성이 높은 혈청음성 침팬지에의 상부 및 하부 기도 모두에서 약화의 증거이다. cpts 248로 면역화된 침팬지의 기도에 존재하는 바이러스의 유전적 안정성을 다음에 측정하였다(표 5). 기도 분비물에 존재하는 바이러스는 ts 표현형을 보유했으며, 이것은 심지어 40℃에서 100배 농도가 감소하고 40℃에서 작은 플락 표현형을 나타내는(이는 복제가 온도 민감성임을 나타냄), 8일째 침팬지 제 3호로부터 얻은 바이러스로부터 알수 있다. 이것은 이 테스트 이전에 대부분의 ts 돌연변이가 유전적으로 안정함을 나타낸다. 상기 cpts248 및 cpts530 바이러스의 ts표현형의 증가된 안정성은 생체내에서 ts 표현형에 기여하는 돌연변이의 유전적 안정성에 미치는 cp 돌연변이의 영향을 반영한다. 따라서, cp3131 모바이러스에 이미 존재하는 돌연변이의 이러한 맥락에서 ts 돌연변이는 그들이 없을 때 보다 더 안정한 것 같다. 이전에는 이러한 중요한 특성이 관찰되거나 보고된 적이 없다. cpts248 로 침팬지의 감염은 고농도의 혈청무력화 항체를 유도했으며, 그 이외에 F 및 G 당단백질에 대한 항체도 유도했다(표 6). 두드러지게, cpts248로의 면역화는 야생형RSV의 공격으로부터 동물을 보호하며(표 7), 이는 사람과 근접한 숙주에서 이러한 돌연변이가 효과적인 백신 바이러스로서 기능하다는 것을 의미한다. 상기에 제시된 발견은 cpts248 바이러스가 살아있는 RSV 백신용으로 많은 바람직한 특성을 가지고 있음을 나타내며, 이에는 다름이 포함된다: 1) 상부 및 하부 기도에 대한 약화; 2) 생체내 복제후, 심지어 면역억제된 동물에서 장기간의 복제후에도 증가된 유전적 안정성; 3) 만족할만한 면역성; 그리고 4) 야생형RSV의 공격에 대한 상당한 보호약효. cpts530 바이러스는 cpts248과 유사한 플락형성의 온도민감성, 유사한 정도의 쥐의 비개골에서의 복제 제한, 및 누드마우스에서의 높은 수준의 유전적 안정성을 공유함으로써, cpts530 바이러스도 또한 RSV 백신균주를 나타낸다.
추가의 약화
RSV는 실험에 사용된 1-2세 침팬지보다 사람 유아의 하부 기도에서 더 많은 징후를 만들고 침팬지에 대해서 만족할 만큼 약화된 돌연변이는 혈청음성 유아나 어린이에서 그렇지 않을 수도 있다는 것을 알기에, 하부 기도에서 복제제한과 약화, 및 높은 수준의 유전적 안정성등 ts 돌연변이 특성에 대한 특징이 없은, cpts 248 과 530 유도체를 추가적으로 돌연변이시켰다.
cpts 248보다 높은 정도의 생체외 온도민감성을 나타내거나 작은 플락 표현형을 가지는 자손 바이러스를 추가의 연구를 위해서 선택했다. 하나이상의 추가적인 ts 돌연변이를 가지는, cpts 248의 돌연변이 유도체를 5-플루오로우라실 돌연변이방법으로 제조했다(표 8). cpts 248 모균주보다 온도민감성이 증가된 ts 돌연변이를 확인했고, 이들중 몇몇은 작은 플락 표현형을 가졌다. 이러한 cpts 248 유도체를 마우수에 투여했다. cpts 248/804, 248/404, 248/26, 248/18 및 248/240 돌연변이는 그들의 모균주 cpts 248보다도 상부 및 하부 기도에서 복제가 더욱 제한되었다(표 9). 따라서, 그들의 모균주 cpts 248보다도 더욱 약화된 cpts 248의 살아있는 돌연변이를 확인했으며, cpts 248가 가장 제한되었던 것에 비해 이러한 cpts 248의 유도체들은 마우스에서 광범위한 복제 효율성을 나타냈다. 마우스의 폐와 비개골에 존재하는 바이러스의 ts 표현형은 유전적 안정성을 포함하여 주입 바이러스의 ts 표현형과 거의 동일하였다. cpts 248의 매우 약화된 돌연변이인 cpts 248/404 바이러스는 야생형에 비해 비인강에서의 복제가 1000배이상 제한되었다. 적어도 3가지 약화 돌연변이를 갖는 cpts 248/404 돌연변이는 또한 4마리의 혈청음성 침팬지의 상부 및 하부 기도에서 복제가 매우 제한되었으며, 감염은 비루를 유도하지 않았다(표 10). 다시, 이 바이러스는 야생형에 비해 높은 정도의 복제 감소, 비인강에서 60,000배 감소 및 폐에서 100,000배 감소를 나타냈다. 그럼에도 불구하고, 야생형 RSV 바이러스에 의한 후속적으로 공격된 두 침팬지는 내성이 높았다(표 11).
cpts 248/404 의 5 작은 플락 돌연변이을 상술한 것과 유사한 방식인 화학적 돌연변이로 제조하였다. 한 번 증폭된 플락 자손의 현탁액을 32℃에서 HEp-2세포상에서 플락농도에 의해서 작은 플락(sp) 표현형에 대해 선별하였고, 작업용 바이러스 현탁액을 상기한 바와 같이 제조하였다.
돌연변이 cpts 248/404 바이러스의 자손 플락중 5개는 안정한 sp표현형을 나타냈다. 각 돌연변이의 차단온도는 35℃이하이었으며(표 12), 이는 cpts 248/404의 이들 sp 유도체 각각은 또한 추가적인 ts 돌연변이를 획득했다. cpts 248/404 유도체를 106.3 p.f.u.으로 Balb/c마우스을 비강내로 접종한 후에, 이들 sp 유도체로 접종 마우스의 비개골에서 바이러스를 검출할 수 없었다. 그러나, 한가지 경우에 폐에서 낮은 농도로 바이러스를 검출했다. 이러한 결과는 야생형 RSV에 비해서 비개골에서 300배 이상 복제가 제한되었고 폐에서 10,000배 이상 제한되었음을 나타낸다.
cpts-530 바이러스의 추가적인 ts 돌연변이를 또한 제조했다(표 13). cpts 248 유도체와 마찬가지로, cpts-530 유도체는 cpts-530 모균주보다 마우스에서 복제가 더욱 제한되었다. 그중 하나의 돌연변이인, cpts-530/1009는 마우스의 비인강에서 복제가 30배나 감소하였다. 이 cpts-530 유도체는 또한 혈청음성 침팬지의 상부 및 하부 기도에서 복제가 매우 제한되었다(표 14). 비인강에서, cpts-530는 복제가 30배 제한되었고, cpts-530/1009는 야생형에 비해 100배 제한되었다. 심지어 이들 돌연변이가 기관에 직접 접종하는 경우에 조차도, 이 두가지 cpts 돌연변이 모두 야생형 바이러스에 비해 하부 기도에서 복제가 매우 제한되었다(20,000-32,000배). 또한 심지어 cpts-530/1009, cpts-530 또는 cpRSV에 의해 이전에 감염된 침팬지는 비인강에서 바이러스 복제가 상당히 제한되고 야생형 RSV에의한 후속적인 비걍내 및 기관내 공격에도 상당한 비루를 발생시키지 않았다(표 15). 추가로, 상기 돌연변이중 어떤 것으로 이전에 감염된 침팬지는 야생형 공격 바이러스의 복제에 대해 하부 기도에서 완전한 내성을 나타냈다.
종래의 연구에서 얻어지는 경험에 비추어 이러한 결과는 완전히 예기치 못한 것이다. 예를 들면, 더 이전이 연구의 결과에 의하면 5-플루오로우라실 1회 돌연변이로부터 유래된 RSV ts 돌연변이의 생체내 특성을 이전에는 예측할 수 없었다. 게다가, 이러한 방식으로 제조된 처음의 4가지 돌연변이중 하나가 다른 돌연변이와 동일한 플락형성 차단온도를 나타냈음에도 불구하고, 감염가능한 침팬지 및 유아와 어린이에서 테스트한 경우에 지나치게 약화되었다(Wrihgt et al., Infect Immun. 37:(1):397-400 (1982)). 이러한 사실에 의하면 플락형성 차단 온도가 37-38℃인 ts 표현형의 획득은 감염가능한 침팬지 및 유아와 어린이에서 바람직한 정도로 약화된 돌연변이를 신뢰성있는 정도로 생산하지 못했다. 정말로, 이전에 알려진 ts 돌연변이로 행한 연구결과는 완전히 세가지 독립적인 돌연변이(또는 돌연변이의 세트들)을 저온 계대배양후에 2회의 연속적인 화학적 돌연변이에 의해서 RSV로 도입하여 침팬지에 대한 감염성을 유지하며(및 보외법에 의한, 영아에서) RSV 질병을 방지하는데 사용되는 살아있는 바이러스백신에 필요한 약화, 면역성 및 보호효능을 바람직한 정도로 나타내는 것을 포함하는 것에 대한 어떠한 근거도 제공하지 못했다.
본 발명의 cpRSV의 어떤 ts 유도체는 만족할만한 수준의 감염성과 마우tm 및 침팬징에 대해 상당한 수준의 약화를 나타낸다는 것은 상기에 제시한 결과에 의해 명백히 설명된다. 이러한 돌연변이 유도체는 약화되었고, 생체내 복제후에도 유전적으로 매우 안정하였다. 이러한 돌연변이는 또한 침팬지에서 RSV 감염에대해 상당한 내성을 유도했다. 따라서, cpRSV의 이러한 유도체는 심각한 사람의 RSV질병을 방지하기 위해 고안된 살아있는 RSV 백신용으로 적합한 바이러스 균주를 나타낸다.
침팬지에서
수동적으로-얻어진
RSV
항체의
cpts
돌연변이에 미치는 영향
수동적으로 얻어진 혈청 RSV 항체가 침팬지에서 본 발명의 다양한 cpts 돌연변이의 약화, 면역성 보호 효능에 대한 영향을 조사하기 위해서, 면역화화기 2일전에 RSV 면역 글로빈이 주입된 혈청음성 침팬지에서 cpts248, cpts248/404 및 cpts530/1009를 평가하였다(표 16). 어머니-유래 RSV 항체를 갖는 영아에서 얻어진 조건을 공격하기 위해서 항체를 수동적으로 이동시켰다. 이러한 방식에서, 수동RSV 항체의 존재하에 각각의 지정된 돌연변이의 면역성을 추정하여, 보호면역반응의 유도를 예시할 만큼 고농도의 수동항체에 대해 온화한 바이러스를 갖는 유아에서 매우 약독화된 바이러스의 복제가 감소된 것인지의 여부를 결정할 수 있다. 또한 수동적으로 얻어진 항체의 존재하에 면역화에 대한 항체반응의 성질을 정의하고, 바이러스 공격에 대한 항체 반응의 정도와 기능적인 활성도를 정의할 수 있다. 동물의 감염을 주입된지 않은 혈청음성 침팬지와 비교한 경우에, 비인강에서 바이러스의 복제수준 및 약독화 돌연변이에 대한 관련 임상점수는 혈청 RSV 항체의 존재하에서 변하지 않거나 단지 알맞게 변했다. 이와 대조적으로, 수동적으로 얻은 항체가 존재함으로써 하부 기도에서 cpts248의 바이러스 복제를 효과적으로 방지했다. 다른 두 돌연변이는 이미 폐에서 복제가 매우 제한되었기 때문에, 수동 항체의 유사한 효과는 이들 돌연변이에 대해서 측정할 수 없었다.
사람 RSV 면역 글로블린의 주입으로 알맞게 높은 혈청수준의 RSV F항체(농도 1:640 내지 1:1600)와 무력화 항체를 생산했으나, 상기 배경위에서 검출할 수 있는 혈청 RSV G항체는 평가할 수 있는 양으로 생산하지 못했다(표 17). 주입받지 않고 면역화된 동물을 면역화후 28일째에 비하여, cpts 248/404, cpts530/1009, cpts248로 면역화하기전에 사람RSV 항체를 주입받은 침팬지는 면역후 42쯤에 단지 1/10 양의 RSV F 단백질과 약 1/2 농도의 무력화 항체를 나타냈다. 주입된 사람 면역글로빈은 상당량의 RSV F단백질과 RSV 무력화 항체를 포함하기 때문에, 42일째 혈청 샘플에 있는 주입물로부터 얻은 나머지 항체는 면역화에 반응하여 새로이 생성된 항체와 구별할 수 없었다. 침팬지에서 사람혈청면역글로빈의 반감기가 주어진다면(Prince et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6944-6948), cpts로 면역화한 후 42일째에 관찰된 F와 무력화 항체의 수준은 주입물의 나머지에 대해 예측할 수 있는 것보다 높은 것이다. 추가로, 주입된 동물의 면역화후에 RSV G항체반응은 이러한 침팬지가 면역화에 대해 변역반응을 증가시켰음을 뒷받침한다.
면역화후에 4 내지 6주후에 야생형 RSV로 침팬지를 공격하였다. 면역화하기 2일전에 사람 면역글로빈을 주입하든지 주입하지 않든지 간에, 각 동물은 그들의 하부기도에서 완전한 내성을 나타냈다(표 17). 이와 대조적으로, 바이러스 복제가 심각하게 제한되었음에도 불구하고, 비-주입 동물은 야생형 바이러스의 공격에 반응하여 RSV 무력화 항체를 현저하게 고농도로 일정하게 나타냈다(표 17 과 18). 게다가, 항체의 존재하에서 면역화후에, 최저수준의 바이러스복제와 면역화를 나타내는 대부분의 약화 바이러스, cpts 248는 공격후 최고 무력화항체농도를 가졌다(표 17). 이와 대조적으로, 최저로 약화된 바이러스, cpts 248는 세그룹의 주입된 동물에서 공격후 최저 무력화 항체 농도를 가졌다. 항체존재하에서 면역화에 의해 유도되는 항체의 양 증가에 더하여, ELISA F 항체 농도에 대한 무력화의 비율로써 측정된 항체의 질이 면역음성 동물에서 면역화에 의해 유도되는 것보다 상당히 높았다(표 17). 주입되어 면역화되고 이어서 공격된 동물에서 생산되는 항체의 무력화/ELISA F 비율은 비주입 동물보다 약 10 내지 20배 이상 높았으며, 면역화에 사용된 돌연변이에 관계없이 모든 그룹에서 일치하였다(표 17).
살아있는 바이러스 백신으로 면역화한 경우에 수동적으로 얻어지는 항체가 존재함으로써 3가지 다른 방식으로 백신에 대한 면역반응을 변화시킬 수 있다. 첫째, 백신 바이러스의 복제가 상당히 감소할 수 있으며 그 결과로 면역성이 감소한다. 수동적으로 이동된 RSV 항체는 백신 바이러스, 특히 대부분의 결함있는(defective) 바이러스 돌연변이의 복제를 제한할 수 있고, 이들의 면역성을 크게 감소시킬 수 있다. 여기서의 결과에 의하면 하부 기도에서 최저로 약화된 돌연변이(cpts248)의 복제는 수동적으로 얻어진 혈청 IgG RSV 항체의 존재로 인해 정말로 제거되었으며, 반면에 상부 기도에서의 복제는 상당한 영향을 받지 않은 것 같다. 테스트된 최저로 약화된 돌연변이, cpts248의 복제는 항체의 존재하에서 200배 이상(즉, 완전히) 제한되었다. 더욱 약화된 돌연변이, cpts 530/1009 및 cpts248/404의 하부기도에서의 복제수준은 혈청음성 동물에서 조차도 매우 제한되었다. 따라서, 수동 항체가 바이러스 복제에 미치는 상당한 효과를 검출할 수 없었다. 수동적으로 얻은 RSV 항체가 면역할 때 존재하든지 그렇지 않든 지에 관계없이, 3가지 약화 돌연변이 각각으로 면역화함으로써 상부 및 하부기도 모두에서 야생형 바이러스의 공격에 대하여 높은 정도의 보호를 유도하였다. 따라서, 수동적으로 면역화된 침팬지의 상부 기도에서 백신 바이러스의 복제수준은 비-주입된 동물에 비교할 만큼 야생형 RSV 공격에 대한 높은 정도의 내성을 유도하는 데 충분하였다.
둘째, 수동 항체는 유도된 항체의 양과 기능적인 활성을 감소시킴으로써 감염에 대한 면역반응을 변형시킬 수 있다. 이러한 이유로, 수동항체의 존재하에서 살아있는 바이러스 면역화에 대한 항체의 반응크기와 특성을 분석하였다. 면역되고 주입된 동물의 면역후 혈청 ELISA IgG F 항체의 양은 비-주입 혈청음성동물의 면역후 F 농도보다 10배이하였다. 항체반응을 무력화하는 혈청 RSV는 또한 주입된 동물에서 약간 감소했으며, 평균 비-주입된 동물보다 2배 이하였다. 면역후에 검출되는 몇몇의 ELISA F와 무력화 항체는 주입한 나머지 항체를 나타내기 때문에, 기존의 항체에 의하여 야기된 무력화 항체와 F 항체반응의 실제감소는 아마도 나타나는 것보다 더 클 것이다. 게다가, 사용된 사람 면역글로블린 제제는 RSV의 G당단백질에 대한 항체가 낮은 수준으로 함유한다(표 17). 이것은 후보 백신 바이러스로 인한 감염에 대한 침팬지의 IgG RSV G 당단백질 항체 반응0의 조사를 용이하게 한다. G 항체 반응이 적어도 4배 이상 증가한다는 사실은 백신바이러스로 감염된 수동적으로 면역화된 동물을 나타내며, 비루를 발생하지 않는 cpts248/404로 면역화된 침팬지를 포함한다. 각각의 수동적으로 면역화된 동물을 포함된다. 면역화에 대한 G 항체반응의 크기는 수동적으로 이동된 항체에 의하여 반대로 영향을 받지는 않는 것 같았다.
셋째, 수동적으로 얻은 항체의 존재하에 면역화된 동물의 RSV 야생형 바이러스 도전에 대한 항체 반응을 변화시킬 수 있다. 주입된 항체가 없는 경우에 면역화된 침팬지는 후속적인 RSV 공격에 대해 상당한 내성을 나타냈다. 추가적으로, 이러한 동물들은 바이러스 도전에 대하여 감지할 수 있을 정도의 항체 반응은 발생시키지 못하였다. 6개 주입된 면역화된 동물 각각이 또한 RSV에 대한 상당한 내성을 나타낼지라도, 공격에 대해 크게 증가된 항체반응이 관찰되었다. cpts530/1009 또는 cpts248/404로 면역된 치료동물에서 RSV 공격후 F 또는 G항체의 수준은 적어도 10배 증가하였으며, 무력화 항체반응은 800배나 증가하였다. 이러한 결과에 의하면 어머니의 항체를 가지는 유아를 살아있는 약화 돌연변이로 생후직후에 시작하여 반복된 면역화는 효과적인 내성 및 관련된 높은 질의 두 번째 항체반응의 향상을 공격할 수도 있었다. 공격바이러스의 감지할만한 복제가 없는 경우에 두 번째 감염에 대한 증가된 면역 반응을 설명하는 기작은 밝혀지지 않았다. 면역할 때 혈청 항체의 존재는 주입된 동물에서 면역화에 대한 온화한 항체반응을 가능하게 하며, 후 속의 RSV 공격에 대한 기능적인 활성이 높은 항체를 만드는 B세포군의 발달을 유리하게 한다.
본 명세서에서 보고된 결과에 의하면, 어머니로부터 태반을 통해 획득한 수동적으로 얻어진 RSV 무력화 항체를 갖는 6주된 영아, 즉 RSV 백신에 대한 표적대상을 모방한 동물모델에서 살아있는 약화 RSV 바이러스 백신이 약효가 있음이 최초로 밝혀졌다는 점에서 본 결과는 매우 중요하다. 위에서 상술한 바와 같이, 수동적으로 이동딘 RSV 항체가 cpts 백신의 복제를 저해할 것이고, 그것을 비면역성이고 비-보호적으로 만들 것이 높은 예상은 지지되지 않는다는 사실에서부터 이러한 발견의 중요성은 명백하다.
실시예 Ⅱ
cpRSV
돌연변이를
약화시키기위한
저온 적응법
본 실시예는 추가로 cpRSV 균주를 더욱 저온에서 처리함으로써 사람백신용으로 더욱 만족할 만큼 약화된 유도체 균주를 제조하기 위하여 약화된 숙주범위제한 cpRSV 균주에 성장제한 돌연변이를 도입하는 것을 설명하고 있다.
이러한 저온-적응(ca) 접근을 사용하여 혈청음성 어린이에서 불완전하게 약화된 cpRSV 3131에 추가의 약화를 도입했다.
첫 번째 방법으로, Flow Lavoratories로부터 얻은 저온처리 RSV A2의 모균주(cpRSV 3131)을 실시예 1과 같이 25℃에서 MRC-5세포에서 처리함으로써 제조했다. 요컨대, 저온 계대배양된 바이러스를 0.01이상의 moi로 MRC-5 또는 Vero세포 단층배양으로 접종시켰고 후속적인 처리를 하기 전에 감염된 세포를 3 내지 14일간 배양하였다. 바이러스를 20-22℃에서 20회 처리하여 더욱 약화된 바이러스를 유도하였다. 바이러스 복제의 첫 번째 증가가 명백하자마자(즉, 3-5일), 저온에서 효과적으로 복제할 수 있는 돌연변이의 선별을 위해서는 신속한 처리 기술이 바람직하다. 추가로, RSV 서브그룹 B 균주, St. Louis/14617/85 클론 1A1을 1차 아프리카 녹색 원숭이 신장세포에서 분리하고, MRC세포에서 처리하고 클로닝한 후에, MRC-5 또는 Vero세포에서 32 내지 22℃에서 저온 계대배양하였다.
두 번째 방법은 클로닝되지 않은 모 cpRSV 3131 바이러스의 생물학적으로 클로닝된 유도체를 사용하였다. 이 바이러스는 소 태아의 신장(BEK)세포에서 생물학적으로 클로닝되었다(Friedewld et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694(1968)참조). 이 클론된 바이러스는 그 다음에 저온에서 Vero세포에서 10일 간격으로 처리하였다. 또는 cpRSV 3131 바이러스를 MRC-5세포에서 두 번의 일련의 최종 희석으로 클로닝하였고, MRC-5 또는 Vero세포에서 10일 간격으로 처리하였다.
세 번째 방법은 저온에서 큰 플락을 형성하는 돌연변이를 선별하는 것을 포함한다. 25℃에서 큰 플락을 형성하는 플락 D1으로 지정된 RSV 3131 유도체 바이러스를 확인하였다. 이 바이러스를 cp 3131-1(BEK)계통, cp3131-17 (BEK) 계통의 세 번째 처리에서 유래되었다. P3 바이러스가 형성한 최고 큰 플락을 32℃에서 증폭한 후에, 25℃에서 다시 플락을 형성하였다. 다시 한 번 최고 큰 플락을 선별, 증폭 및 재플락형성을 하였다. 5회 반복한 후에, 큼 플락 돌연변이 바이러스 D1을 얻었다. D1은 25℃에서 2회의 추가적인 플락-대-플락 정제법에 의해서 생물학적으로 클로닝하였다.
생물학적으로 클로닝된 바이러스 D1은 cp 3131 또는 야생형 바이러스 A2보다 더 큰 플락을 뚜렷하고도 균일하게 형성하였다. 따라서, D1은 25℃에서 큰 플락을 형성하다는 기준으로 보면 저온에서 적응되었다. 플락 형성율 연구에 의하면, D1은 온도민감성이 아니다. 37℃에서, D1 플락은 야생형 RSV나 cp3131의 플락과 구별되었으며, 이는 D1의 성장이 이 온도에서 제한되지 않음을 나타낸다. 이와 일치하게도, D1은 37℃ 및 40℃(테스트한 최고 온도)에서 Vero세포 단층에서 광범위한 세포병원성 효과를 나타낸다.
실시예 Ⅲ
ts
RSV
에 추가적인 약화 돌연변이의 도입
이 실시예는 더욱 완전하게 약화된 균주를 제조하기 위해서 ts 돌연변이를 모 바이러스로 사용하는 것에 대하여 설명한다. 이 방법에 사용하기 위해서 두 RSVA2 ts 돌연변이, 즉 ts-4 및 ts-1 NG1을 선별하였다.
추가 돌연변이를 RSV ts 돌연변이에 도입하기 위해서 두 가지 다른 방법을 선택하였다. 첫째로, 불완전하게 약화된 RSV ts 돌연변이를 화화적으로 돌연변이시켜고, 추가의 분석을 위해 플락형성면에서 더욱더 온도에 민감한 돌연변이 자손을 선별하였다. 둘째로, RSV ts 돌연변이를 저온에서 처리하여 ca 표현형을 가진 RSV nts 돌연변이, 즉 야생형 모 바이러스에 비해 최적온도이하에서 복제능이 증가된 돌연변이를 선별하였다.
살아있는 호흡기 세포 융합 바이러스(A-2) ts-1 NG-1, MRC-5에서 자란 바이러스의 Flow Laboratories Lot M4로부터 ts-1 NG1의 모균주를 제조하였다. 이 돌연변이는 니트로소구아니딘을 사용하여 2회 돌연변이야기에 의하여 ts-1 돌연변이로부터 유도것으로서, 2이상의 독립적인 ts 돌연변이를 소요하나, 여전히 감염가능한 침팬지에서 상당한 비루를 유도한다. 이 바이러스를 Vero세포에서 32℃에 2회 처리하여 돌연변이를 위한 ts-1 NG1 현탁액을 제조하였다. 그 다음 상기 바이러스는4X10-4M 5-플루오로우라실의 존재하에서 배양하여 복제동안 추가의 돌연변이를 유도하거나, 5-플루오로우라실 처리 후에 36℃에서 5-아자시티딘에 노출하였다. 그 다음에 돌연변이된 균주를 한천 중층아래에 유지되는 Vero세포상에서 플락분석법에 의해서 분석하였고, 적절한 배양 간격 후에 현미경으로 플락을 확인하였다. 586플락을 선택하여 각 플락의 자손을 각각 별개로 Vero세포의 새로운 단층에서 증폭하였다. Vero세포에서 세포병원성 효과가 최고일 때, 돌연변이된 ts-1 NG-1 바이러스의 한 플락이 접종된 각 조직배양의 내용물을 별도로 수확하였다. 32 및 36℃에서 HEp-2세포에서 이들 플락풀을 배양함으로써 ts-1 NG-1보다 더 온도에 민감한 자손 바이러스를 조사했다. ts-1 NG-1보다 더 큰 온도민감성(즉, 32℃에 비해 제한온도(36℃)에서 100배이상 농도가 감소함)을 나타내는 어떠한 바이러스를 추가로 평가했다. ts-1 NG-1 몰바이러스보다 더 온도에 민감한 6 플락 자손을 확인하였고 이들 균주를 Vero세포에서 3회 일련의 플락정제법에 의해서 생물학적으로 클로닝하였고, Vero세포에서 증폭하였다. 클론된 균주를 32, 35, 36, 37, 및 38℃에서 농도를 측정하여(플락 형성율 분석법) 그들의 ts 표현형을 확인하였다. HEp-2세포상에서 분석한 플락형성율 자료는 추가로 6 돌연변이 표현형을 확인하였다(표 19).
두 개의 온도 민감성이 가장 큰 바이러스, A-20-4 및 A-37-8은 이들의 ts-1 NG-1모 바이러스에 비해 쥐에서 매우 약화되었으며, 이는 증가된 온도민감성의 획득이 증가된 약화를 수반함을 나타낸다(표 20). 이들 바이러스는 항체반응을 유도하기 때문에 쥐에서 감염성이 있다. ts-1 NG1/A-20-4 바이러스는 침팬지에 대해서 약화되었으며(표 21), ts-1 NG1/A-20-4로 침팬지를 감염시킴으로써 야생형 바이러스의 공격에 대한 내성을 유도하였다(표 22). 중요하게도, 비루는 발생하지 않았다.
ts-1 NG1 바이러스의 돌연변이와 동일한 방법으로 바이러스를 또한 돌연변이 시켰다. 또한 저온 처리로 ts-4 바이러스에 돌연변이를 도입하였다. 43회 저온처리후에 ts-4 바이러스는 22℃에서 높은 농도로 복제한다. RSV ts-4 모 바이러스보다도 더욱 온도에 민감한 6 플락 자손을 확인하였다(표 23). 상기 ts-4 cp-43 은 Balb/c쥐에서 복제가 훨씬 추가로 제한된다(표 24).
실시예 IV
RSV
서브그룹 B 백신 후보들
이 실시예는 RSV 서브그룹 B 바이러스 백신 후보들의 발달을 설명하는 것이다. 본 발명의 서브그룹 A 변이주들의 발달에 사용된 것과 동일한 접근방식을 서브그룹 B 바이러스에도 이용하였다. 야생형 B-1 RS 바이러스의 모액을 저온 (20-25℃)하에 Vero 세포에서 52회 저온-계대배양시키고 바이러스를 19 및 52차 계대시 플락을 정제하였다. 제 52차 현탁액으로부터 유도된 클론 중 세개를 독립적으로 평가하고, RSV B-1cp52/2B5로 표시된 한 클론을 선택하여 추후 평가에 이용하였는데, 이는 이 클론이 코튼랫의 상부 및 하부 기도에서 매우 약독화(attenuated) 되었기 때문이다 (표 25). cp RSV B-1 바이러스의 상이한 계대 수준의 몇몇 클론을 평가한 결과, RSV B-1cp52/2B5 변이주가 그의 약독화 표현형에 독립적으로 기여한 다중 변이를 유지한 것으로 나타났다. RSV B-1cp52/2B5 변이주는 면역억압된 코튼랫에서 연장된 복제에 이은 그의 약독화 표현형을 유지하였다 (표 26). 이러한 고도의 유전 안정성의 발견은 이것이 약독화 표현형에 기여한 세가지 변이를 보유한다는 사실과 일치하는 것이다.
서브그룹 A 변이주에서와 유사한 방식으로 서브그룹 B 변이주를 특징화시키기 위한 서브그룹 B 변이주의 추가 평가를 캐리비안 녹색 원숭이 (표 27 및 28)와 침팬지 (표 29)에 대해 수행하였다. RSV B-1 cp-23 또는 cp-52/2B5로 면역화된 원숭이들은 RSV B-1 야생형 바이러스 복제에 대해 내성을 나타냈는데, 이는 RSV B-1 야생형 바이러스의 고도로 약독화된 유도체들에 의한 감염이 야생형 공격에 대한 내성을 유도하는데 충분하였음을 나타내는 것이다 (표 27).
혈청 음성 침팬지에서의 결과는 녹색 원숭이에서와 마찬가지로, 상부 및 하부 기도에서의 RSV B-1 cp52/2B5의 약독화를 명확히 입증해준다.
RSV B-152/2B5 변이주를 5-플루오로우라실로 추가로 변이처리하고 얻어진 플락를 취하여 32℃ 및 38℃에서 ts 표현형을 선별하였다. 선택된 cpts 변이주들을 Vero 세포에서 3회 플락-정제한 다음 Vero 세포에서 2회 증폭시켰다. 그 결과, RSV-B1cp52/2B5의 7개의 cpts 변이주와 코튼랫에서의 이들의 복제 수준을 연구하였다 (표 31). 이들 변이주 중 하나, 즉 cpts176을 추가로 변이처리하여 RSV B-1 cpts 176 모 바이러스보다 생체외에서 더욱 온도에 민감한 일련의 변이주 유도체들을 얻었다 (표 32).
본 발명의 서브그룹 A 변이주들의 경우처럼, 서브그룹 B 변이주들은 코튼랫, 원숭이 및 침팬지에 대해 감염적이고 유의적인 정도의 약독화도를 나타낸다. 생체내에서의 약독화에도 불구하고, RSV B-1 cp 변이주 바이러스들은 야생형 의 공격에 대해 원숭이들에서 내성을 유도하였다. RSV B-1 cpts52/2B5 바이러스의 ts 변이주들을 약독화시키자 RSV B-1 52/2B5 모 바이러스에서보다 코튼랫의 비인강 및 폐에서 보다 제한된 복제 수준을 입증하였다.
RSV B 서브그룹 백신 후보들의 평가 및 조작을 돕기 위해, 야생형 B-1 바이러스의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다 [서열 2]. 상기한 바와 같이, 이 서열을 약독화된 B-1 유도체, cp-52/2B5 (cp-52)의 서열과 비교하였다. 이 서열 분석 결과 SH 및 G 유전자의 cp-52 스패닝에서 커다란 결실이 있는 것으로 밝혀졌으며, 두가지 유전자 중 어느 것에 대해서도 ORF는 예상되지 않았다. 보다 구체적으로, cp-52 바이러스의 SH 유전자와 G 유전자의 대부분의 스패닝 영역은 결실되었고, SH 유전자-개시 신호과 G 유전자의 3' (하류) 말단 및 그의 유전자-말단 신호 부분만 유지되었다. 나머지 SH:G 영역은 ORF 없이 ~ 91 뉴클레오타이드의 키메릭 전사를 코딩할 수 있었다. cp-52의 노던 블럿분석 결과 복수개의 독특한 중합전사체가 SH:G 통독mRNAs를 함유하고 있음이 확인되었는데, 이는, SH:G 유전자 접합부의 결실 변이 스패닝과 일치하는 것이다. 웨스턴 블럿 및 면역염색 분석 결과 고유의 G 당단백질은 cp-52 바이러스에 의해서는 생산되지 않은 것으로 확인되었다. 긴 결실에 더해, cp-52 바이러스는 7개의 뉴클레오타이드 차이 (표 33)를 나타내는데, 이 중 5개는 코딩 변경 (F 유전자 중 하나와 L 유전자 중 4개)이고, 하나는 번역되지 않는 것이고 (F 유전자), 다른 하나는 비코딩 G:F 유전자간 영역에 있다. 중요한 것은, 이 RSV 변이체가 SH 및 G 단백질의 부재에도 불구하고 조직 배양체에서 고도로 감염성인 것으로 남아있다는 사실이다. 이러한 데이터는 재조합 RSV 백신 후보들을 발달시키는데 있어서 대체적이거나 또는 조합적인 접근법을 제공한다.
cp-52 계대 히스토리 중 상이한 계대 수준에서 분리된 다른 서브그룹 B 변이체들은 계대 수준에 따라 여러 가지 cp-52 변이를 포함한다 (표 34). 여기서 예시적인 서브그룹 B 변이체에는 RSV B-1 cp-12, RSV B-1 cp-23, RSV B-1 cp-32, RSB B-1 cp-42가 포함된다. 표 34는 예시적인 서브그룹 B 변이체 중에서도 이들 특이적인 변이의 분포를 나타내는 것이다 ((-)센스로서). 이 다양한 변이 분포는 지정된 균주들에서 이 변이들의 약독화 효과를 보다 정밀하게 특징화시킬 수 있게 해준다. 예컨대, cp-23은 cp-52에서 발견되는 뉴클레오타이드 위치 5626, 6460, 14164 및 14596에서 변이를 일으키지만 (표 34), cp-52에 결실되어 있는 SH 및 G 유전자 영역에서는 모 B-1 야생형 균주와는 아무런 차이를 보이지 않는다. cp-42는 cp-52와 동일한 SH 및 G 결실을 갖는 반면, cp32는 SH 및 G 유전자 내에서 뚜렷한 서열 결실을 나타낸다.
실시예 V
이가 (bivalent)
RSV
서브그룹 A 및 B 백신
서브그룹 A 및 B 바이러스에 대한 연구 결과 생체외에서는, Vero 세포 단층 배양체 중 cpts530/1009와 RSV B-1 cp52/2B5 유도체 사이에서도, 야생형 A2와 B-1 바이러스 사이에서도 아무런 간섭이 일어나지 않음이 입증된다. 이 결과는 A-2와 B-1 야생형 RSV 사이, 그리고 cpts530/1009와 RSV B-1 cp52/2B5 사이에 아무런 간섭이 나타나지 않는다는 생체외 결과를 확인해주는 것이다. 따라서, 각각의 백신 바이러스는 야생형 바이러스에 대해 동형 (homotypic) 면역성을 유도할 것으로 기대되는데, 이는, 2가 백신의 각 성분이 단일 감염시 관찰되는 것과 필적하는 2중 감염의 수준으로 복제되기 때문이다. 각각의 바이러스는 RSV 야생형 공격에 대한 동형 내성을 단독으로 유도할 수 있다.
실시예 VI
폴리머라제
(L) 유전자에서의 단일 변이가 ts 표현형을 도출함
이 실시예는 RSV 백신 제제에서 사용하는데 적합하고 보다 고도로 약독화된 ts 균주, cpts248 및 cpts530을 생산하기 위해 불완전하게 약독화된 숙주 범위-제한된 cpRSV의 화학적인 돌연변이에 의해 생산된 폴리머라제 유전자 (L)에서의 특정 변이를 설명해준다. 상기 실시예에서 설명된 바와 같이, cpts248은 약독화 및 면역화되어 혈청음성 침팬지에서의 야생형 공격에 대해 완전히 보호적인 것으로 밝혀졌으며, 앞서 평가된 ts RSV 변이주보다 생체내 복제시 유전적으로 더욱 안정하다. 상기한 바와 같이, cpts248 균주를 화학적으로 돌연변이시켜 잔여 반응발생성(reactogenicity)을 감소시키고, cpts248/404를 비롯한, 작은 플락 표현형 또는 증가된 온도 감수성을 갖는 일련의 변이주를 생산한다. 이와 비슷한 방식으로, cpts530/1009를 cpts530으로부터 유도하였다.
약독화 증가를 위한 유전적 염기와 cpts248 및 cpts530의 ts 표현형을 이 바이러스들의 완전한 게놈 서열 및, 앞서 결정된 cpRSV 모 바이러스의 서열과 비교함으로써 결정하였다. cpRSV의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 결정하고 이를 RSV A2 야생형 바이러스 (직접적인 계대 계통의 일부는 아니었던 실험 균주)와 그의 저온 계대 모 바이러스 (RSV A2/HEK7)의 서열을 비교하였다. cpRSV는 그의 RSV A2/HEK7 모 바이러스와 5개의 뉴클레오타이드 변경만큼 상이한데, 즉, 뉴클레오단백질 (N)중 하나, 융합 단백질 (F) 유전자 중 2개, 그리고 폴리머라제 (L) 유전자 중 2개가 그것이다. 완전한 15,222 뉴클레오타이드 서열과 cpts248, cpts248/404, cpts530, cpts530/1009, 및 cpts530/1030의 아미노산 서열을 결정하였다.
무작위적인 화학적 돌연변이에 의한 cpRSV 모 바이러스로부터의 RSV 돌연변이주 cpts248과 cpts530의 파생과정을 실시예 1에 설명하였다. 정제된 바이러스 RNA의 소스로 사용될 바이러스를 생산하기 위해 세포를 감염시키는데 사용된 바이러스 현탁액은 Vero 세포 단층 배양체 중 액상 배지에서 4회 계대배양 후 (즉, 한천하, Vero 세포 단층에서 3회 플락-대-플락 계대시킴) 생물학적으로 클로닝시킨 바이러스를 함유하는 청정 조직 배양체 상등액이었다.
세포 단층을 cpts248, cpts248/404, cpts530, cpts530/1009, 또는 cpts530/1030 바이러스들에 의해 0.1의 moi( multiplicity of infection)로 감염시켰다. 적절한 cpE가 관찰되었을 때 (감염 후 평균 4-5일 경과시) 감염된 세포 단층으로부터 총 RNA를 제조하였다. 상등액을 흡입제거하고, 감염된 세포 단층을 구아니디늄 이소티오시아네이트로 용해시킨 다음, 이어서 페놀-클로로포름 추출에 로 수확하였다. 제조업자가 공급한 프로토콜에 설명된 반응조건에 따라 Superscript II TM 역전사효소 (Life Technologies) 무작위 헥사머 프라이머를 이용하여 RNA를 역전사시켰다.
얻어진 cDNA를 TE-100 스핀 칼럼 (Clontech, Palo Alto, CA)을 이용하여 프라이머로부터 분리하고 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)시 주형으로 사용하여 전체 RSV 게놈에 걸친 10개의 오버래핑 cDNA 클론을 제조하였다. PCR에 대한 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 원형 A2 바이러스의 뉴클레오타이드 서열로부터 디자인된 것이었으며 (Mink 외, Virology 185:615-624 (1991); Stec 외, Virology 183:273-287 (1991); Collins 외, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 88:9663-9667 (1991); Connors외, Virology 208:478-484 91995)), 이미 RSV A2 야생형 바이러스와 그의 유도체, cpRSV 모 바이러스의 두가지를 모두 증폭시키는 것으로 입증된 바 있다. 우라실-함유 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 CloneAmp 우라실 DNA 글리코실라제 시스템 (Life Technologies)을 이용하여 RSV 서열을 pAMP1 벡터내로 클로닝하는데 이용하였다. 제조업자의 프로토콜 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT)에 따라 PCR 반응을 수행하였는데, 92.5℃에서 1분, 55℃에서 1분, 그리고 72℃에서 3분간 34 사이클을 수행하였다. 1% 아가로스/TAE 겔에서 각 분획을 전기영동시켜 Geneclean II System (Bio101, Vista, CA)에 의해 회수하고 pAMP1 벡터내로 클로닝시켰다. 각 단편의 2가지 이상의 별도 클론들을 별도 PCR 반응으로부터 생산시켰다. 3' 리더 영역의 분석을 위해, 바이러스의 RNA (vRNA)를 Mink외, Viology 185:615-624 (1991)에 설명된 바와 같이 50μl 반응액 중에서 폴리아데닐화시켰다. 37℃에서 10분간 배양시킨 후, 반응을 0.5M EDTA 2μl로 중지시켰다. 폴리아데닐화된 RNA 생성물을 페놀 클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제시킨 다음, cDNA내로 역전사시키고, PCR에 의해 증폭시킨 후 3'RACE 시스템 (Life Technologies)에 의한 급속 증폭을 이용하여 클로닝시켰다. 마찬가지로, 5' 트레일러 영역의 분석을 위해, vRNA를 cDNA 내로 역전사시키고, 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라제와 dCTP를 이용하여 테일링한 다음, 컬럼 정제하여, 이중-사슬로 만들고 PCR에 의해 증폭 후 5' RACE 시스템 (Life Technologies)를 이용하여 클로닝시켰다.
합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (플라스미드 프라이머 또는 RSV 특이적 프라이머), [α35S]dATP 및 Sequenase 2.0 (United States Biochemicals, Cleveland, OH)를 이용하는 디데옥시뉴클레오타이드법에 의해 cpts248에 대해 클로닝된 cDNA를 이중 사슬 플라스미드로부터 서열화하였다. 관찰된 서열과 이미 공표된 모 바이러스 cpRSV의 서열과의 차이를 정방향 및 역방향의 두가지 모두에서 2 이상의 클로닝의 서열을 결정함으로써, 그리고 클로닝되지 않은 PCR 산물의 서열을 결정함으로써 확인하였다.
cpts248/404, cpts530, cpts530/1009 및 cpts530/1030의 뉴클레오타이드 서열을 서로 다른 기술을 이용하여 결정하였다. cptsRSV 변이 바이러스의 게놈을 나타내는 3 내지 10개의 중복 cDNA 클론들이 총 감염-세포 RNA 또는 vRNA의 RT-PCR에 의해 생산되었다. 각 클론의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 각 플라스미드 삽입물에 대해 파지 M13 중에서 구축된 M13 초음파처리된 무작위적인 라이브러리 상에서 Taq 키트 (ABI, Foster City, CA)를 이용하여 NCI Frederick Cancer (Frederick, MD)에서 자동화 DNA 서열에 의해 결정하였다. 양쪽 사슬 모두 서열을 결정하고 cpRSV와 cptsRSV 변이 서열 사이의 차이를 Sequenase 2.0 (USB, Cleveland, OH)를 이용하여 2차로 독립적으로 파생된 RT-PCR 산물을 수동 서열결정함으로써 확인하였다.
cpts248, cpts248/404, cpts530, cpts530/1009, 및 cpts530/1030의 15,222-뉴클레오타이드 RNA 게놈의 완전한 뉴클레오타이드 서열이 결정되었다. cpRSV 및 RSV A2/HEK7 (야생형) 모 바이러스의 공표된 서열(Conners 외, Virology 208:478-484 (1995))과의 상대적인 차이가 독립적으로 파생된 이들 cptsRSV 변이주의 cDNA 클론들에서 확인되었으며, 이들을 cpRSV의 부가적인 클론을 시퀀싱함으로써 cpRSV 바이러스에서 재검사하였다. cpRSV 바이러스 서열의 어떤 모호성 (A2/HEK7 야생형 바이러스와 비교하여)이 확인되었다. 모호성 (ambiguity)은 음성 센스 게놈의 3' 말단으로부터의 위치 1,938에서 발생하였으며 391 아미노산-뉴클레오캡시드 (N) 단백질의 아미노산 위치 267에서의 아미노산 변경 (Val 또는 Ile)를 코딩할 것으로 예측되는 뉴클레오타이드 이종성 ((+)센스에서 G 또는 A)로 구성되었다. 따라서, cpRSV는 실제로 혼합 바이러스 집단으로 구성된 것이다. 이는 Conners 등의 상기 문헌에서 위치 1938에서 변경이 감지되었다는 초기의 잘못을 설명해 주는 것이다. 위치 1,938에서의 A 변이를 갖는 바이러스는 cpts530 시스터 클론 뿐만 아니라 cpts248 유도체의 직접적인 모 바이러스였다. 따라서, cpts 유도체의 직접적인 모 바이러스인 cpRSV는 그의 A2/HEK 모 바이러스와 상이한 아미노산을 5개 함유한다.
cpRSV와 cpts248 변이주 사이의 단일의 뉴클레오타이드 차이가 뉴클레오타이드 위치 10,989 (A 내지 T 변경)에서 발견되었다 (표 36). 이 변이는 2,165 아미노산 L 단백질 중 아미노산 위치 831에서의 gln에서 leu로의 예상된 아미노산 변경을 코딩하는 폴리머라제 (L) 번역 오픈 리딩 프레임내에서 일어난다. cpts248/404 변이주는 그의 cpts248 모 바이러스와 2개의 뉴클레오타이드 상이점을 갖는데, 하나는 L 유전자 중 뉴클레오타이드 12,046에서 (T가 A로), 또 하나는 M2 유전자의 전사 개시 신호 서열 중 뉴클레오타이드 7605에서 (T가 C로)이다. L 유전자에서의 뉴클레오타이드 치환으로 인해, L 단백질 중 위치 1183에서 asp로부터 glu로의 아미노산 변경이 초래되었다. 따라서, cpRSV의 2차례 독립적인 돌연변이 후, cpts248/404 바이러스는 L 유전자에서 2개의 뉴클레오타이드 변경(2 아미노산 치환에 해당함)와 M2 유전자의 전사 개시 신호 중 하나의 뉴클레오타이드 변경을 획득하게 되었다. 야생형 조상과 비교할 때, A2/HEK7, cpts248/404 변이주는 7개의 아미노산 차이 (L에서 4개, F에서 2개, N에서 1개)를 보이며 M2 유전자의 전사 개시 신호 중 1개의 뉴클레오타이드 차이를 보인다.
cpts530은 모 균주인 cpRSV와는 위치 10,060에서 하나의 뉴클레오타이드를 부가적인 치환 (C에서 A로)에 의해 차이가 나며 그 결과 L 단백질의 위치 521에서 phe가 leu 아미노산으로 변경되게 된다 (표 37). cpts530/1009 변이주는 뉴클레오타이드 12,002에서 단일의 뉴클레오타이드 치환(A가 G로)을 가지며 이로 인해 L 단백질의 아미노산 위치 1169에서 Met이 Val로 치환된다. 야생형 선조와 비교하여, A2/HEK7, cpts530/1009 변이주는 아미노산이 7개 서로 다르다 (L에서 4개, F에서 2개, 그리고 N에서 1개).
cpts530/1030 변이주는 뉴클레오타이드 12458에서 단일의 부가적인 뉴클레오타이드 치환 (T가 A로)을 가지므로 L 단백질의 아미노산 1321에서 Tyr이 Asn으로 치환된다. 그의 야생형 선조와 비교할 때, A2/HEK, cpts530/1030 변이주는 7개의 아미노산 차이를 갖는다 (L에서 4개, F에서 2개, 그리고 N에서 1개).
따라서, cpts248 및 cpts530의 ts 및 약독화 표현형 각각은 폴리머라제 유전자에서의 하나의 뉴클레오타이드 변화와 관련된다. cpts530, 및 cpts530/1009 또는 cpts530/1030 간의 ts 및 약독화 표현형의 증분 증가 역시 L 중 하나의 아미노산 변경과 관련있다. 이들 4가지 예에서 (즉, cpts248, cpts530, cpts530/1009 및 cpts530/1030), L에서의 단일의 그러나 상이한 아미노산 치환은 선조 균주상의 약독화 표현형 및 ts를 부여하였다. 이러한 아미노산 치환은 5가지 cpRSV 변이와 공조적으로 작용하여 ts 표현형의 안정성 및 동물에서의 복제를 증진시킨다. cpts248과 cpts248/404 사이에서 관찰된 약독화 및 온도 민감성의 증분 증가는 2개의 뉴클레오타이드 변경과 관련있는데, 두가지 중 하나 또는 모두는 ts 및 약독화 표현형에 관여할 수 있다. ts 및 약독화 표현형과 단독으로 관련된 L 중 4개의 특정 부위 (즉 cpts530, cpts530/1009, cpts530/1030 및 cpts248 바이러스에 대한 것들) 및 cpts248/404 중 하나 또는 두가지 부위가 모두 L 단백질 또는 RSV 게놈의 코어 영역으로서 본문에 요약된 발견에 의해 동정되었는데 여기서의 변이는 약독화를 초래할 수 있다. L 단백질 중 상기 4개 부위에서의 특정 변이가 아미노산 치환에 특이적이긴 하지만, 이들 부위 및 특정 부위의 약 5개 아미노산 이내의 인접 아미노산에서의 프레임 삽입 또는 치환 및 기타 아미노산 치환 역시 약독화를 초래할 수 있을 것이다.
L에서의 코딩된 아미노산 변경은 파라믹소바이러스 폴리머라제 단백질 중의 가장 높은 서열 보존 영역, 즉 제안된 ATP 결합 부위 (Stec 외, Virology 183:273-287 (1991))와도, RNA-의존성 RNA 및 DNA 폴리머라제의 모티프와 동종인 것으로 제안된 영역 (Poch 외, EMBO J. 8:3867-3874 (1989))과도 관련이 없는 것으로 나타났다. 3'와 5' 게놈 말단 사이 또는 짧은 유전자-개시 및 유전자-종결 서열에서는 변이가 일어나지 않는 것을 고려할 때, 이들 변이의 효과는 뉴클레오타이드 수준에서보다는 아미노산 수준에서 더 클 것으로 여겨진다. 이러한 RNA 영역은 바이러스로의 인캡시데이션(encapsidation), 전사, 복제 및 패키지에 요구되는 시스-작용 RNA 서열을 모두 함유하는 것으로 생각된다 (Collins 외, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88;9663-9667 (1991); Collins 외, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:81-85 (1996). 두문헌 모두 본 발명에 참고됨).
이러한 결과는 tsRSV 변이주의 최초의 완전한 길이의 서열을 제공해준다. 이 결과는 또한 아미노산 변화 또는 예컨대 GS 서열에서의 변화를 일으키는 단일 뉴클레오타이드 치환에 의해 뉴모바이러스가 약독화될 수 있음을 가리키는 것이기도 하다. cpts248 및 cpts530 바이러스는 생체외 및 생체내 두가지 모두에서 고도로 안정한 ts 표현형을 가지므로, 이 표현형이 단일의 상이한 아미노산 변경과 관련있는 것으로 밝혀진 것은 실로 놀라운 일이다. 중요한 것은, cpts248/404, cpts530/1009, 및 cpts530/1030이 약독화 표현형, 2개의 ts 및 1개의 비-ts (예컨대 5개의 cp 변이)에 기여하는 3개 이상의 변이를 함유하고, 이것이 생체외 및 생체내에서 이들 바이러스의 고도의 안정성을 부분적으로 비제한적으로 설명해준다는 것이다.
RSV 백신 바이러스 균주 및 그들의 모 바이러스의 완전한 서열을 결정화하면 임상 시도에서 자원자들에 의한 확산시 그리고 백신 바이러스 생산시 백신 바이러스의 안정성을 유전적 수준에서 분석하는 것이 가능하다. cpts248, cpts530, cpts248/404, cpts530/1009 및 cpts530/1030 바이러스의 약독화 및 ts 표현형에 대한 유전 염기의 결정은 중요하고 새로운 기회를 제공한다. 이하에 설명하는 재조합 방법에 따라, 완전한-길이의 RSV cDNA의 부위-특이적 돌연변이에 의한 신규한 백신 후보를 쉽게 생산할 수 있으며 그로부터 감염성 바이러스를 회수할 수 있다. 예를 들면, 예컨대, cpts248/404 바이러스의 cDNA 클론에 아미노산 위치 521 (cpts530 변이주에서) 또는 1169 (cpts530/1009 변이주에서)에서의 ts 변이 중 하나 또는 두가지 모두 또는 설명된 바와 같은 기타 약독화 및 안정화 변이를 추가시키는 것이 가능하다. 이러한 방식으로, cpts248/404 바이러스의 약독화 수준을 증분 유형으로 증가시킬 수 있고 안정성 및 면역성 두가지 모두가 요구되는 특정 수준의 약독화를 갖는 백신 균주를 합리적인 방식으로 생산할 수 있다. 마찬가지로, cpts248/404 바이러스에서 한가지 이상의 약독화 변이를 특이적으로 도입함으로써 cpts530/1009 및 cpts530/1030 변이주의 약독화 수준을 높일 수 있다. 생물학적으로 파생된 변이 균주로부터의 다중 약독화 변이가 일어난 이들 조합적인 재조합 바이러스의 예는 종래의 접근방식의 사용에 의해, 유전적으로 안정하며, 만족스럽게 약독화된 바이러스의 분리 및 생산에 따르는 많은 어려움을 극복해준다. 뿐만 아니라, 이들 재조합 cpts RSV 변이주의 표현형의 안정성은 약독화 표현형에 기여하는 것으로 알려진 특정 아미노산을 특정하는 코돈에서 2개 이상의 뉴클레오타이드 치환을 도입함으로써 향상될 수 있다. 이러한 방식으로 완전한 길이의 RSV cDNA의 부위-지향된 돌연변이에 의해 약독화 표현형의 안정성이 증가될 수 있다.
실시예 VII
RSV
안티게놈을
코딩하는 cDNA의 구축
도 2에 도시된 바와 같이, RSV 균주 A2의 안티게놈을 코딩하는 cDNA 클론을 구축하였다. 프라이머로서 합성 올리고뉴클레오타이드, 주형으로서 정제 비리온으로부터 분리된 게놈 RNA 또는 세포내 RSV mRNA를 이용하여 역전사 (RT: reverse transciption) 및 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해 cDNA를 세그먼트 단위로 합성하였다. 최적 활성을 위해 3개의 전사 G 잔기를 포함하는 T7 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터에 의해 리더 말단에서 최종 cDNA를 플랭크시켰다; 전사에 의해 이들 세 개의 비바이러스성 G's가 안티게놈의 내지 5' 말단에 부여될 될 것이다. 거의 정확한 3' 말단을 생산하기 위해, cDNA 트레일러 말단을 전술한 해머헤드 라이보자임에 인접하게 구축하였으며, 이것은 절단시 코딩된 RNA의 3' 말단에 단일의 3'-포스포릴화 U 잔기를 부여할 것이다 (Grosfeld 외, J. Virol . 69:5677-5686 (1995), 본문에 참조됨). 라이보자임 서열 다음에는 T7 RNA 폴리머라제의 종료인자가 나란한 쌍이(tandem pair)가 뒤따른다. (클로로암페니콜 아세틸 트랜스페라제 (CAT) 리포터 유전자를 함유하는 cDNA-코딩 RSV 미니게놈에 3개의 5'G 잔기와 1개의 3'U 잔기를 첨가하는 것은 RSV에 의해 상보되었을 때 CAT의 발현에 아무런 영향을 미치지 않았다.)
도 2는 cDNA 및 코딩된 안티게놈 RNA의 구조를 도시한 것이다. 안티게놈의 다이아그램 (위쪽)은 다음을 포함한다: T7 프로모터에 의해 기여되는 5'-말단의 비바이러스성의 3개의 G 잔기, 위치 1099 (1 뉴클레오타이드의 길이를 더함), 1139, 5611, 및 7559에서의 4개 서열 마커, 라이보자임 및 나란한 T7 종료인자, 및 라이보자임 분해에 의한 3'-말단에 부여된 단일 비바이러스성 3'-포스포릴화 U 잔기 (절단 부위는 화살표로 표시됨). 집합체에서 완전한 안티게놈을 나타내는 클로닝된 cDNA 단편들 (도 2, 중간)은 게놈 RNA 또는 RSV mRNA의 RT-PCR에 의해 구축되었다. 완전한 안티게놈 cDNA를 D46 또는 D53이라 칭한다; 동일한 플라스미드의 상이한 제공은 상이한 이름으로 부른다. T7 프로모터와 SH 유전자에 상보적이고 D13으로 불리우는 리더 영역과 T7 프로모터로부터 펼쳐지는 안티게놈의 왼쪽 말단을 함유하는 cDNA를 pBR322 (여기서 자연 발생적인 BamHI 부위는 돌연변이에 의해 제거되었으며 PstI-EcoRI 단편은 유일한 제한 부위 (BstBI, BstXI, PacI, BamHI, MluI를 포함)를 함유하는 합성 폴리링커로 대체됨)중에서 조립하였다 (도 2 아래쪽). 도 2의 박스는 BamHI 부위의 제거를 나타낸다. 자연발생적인 BamHI-SalI 단편 (BamHI 부위는 양성 센스의 상부줄로 표시되며, 밑줄그음)을 PCR-생산 BglII-SalI 단편 (BglII 부위는 하부줄로 표시되고 밑줄그음; 그의 4-뉴클레오타이드 접착성 말단 [이탤릭체]는 BamHI의 그것과 호환성을 갖는다)으로 대체하였다. 그 결과 아미노산 수준에서는 아무 영향이 없는 단일의 뉴클레오타이드 변경 (중간줄, 밑줄 그음)이 결과되었다. 이러한 벡터의 변형은 안티게놈 cDNA에 독특한 BamHI 부위를 제공함으로써 cDNA의 구축을 쉽게 해준다.
L, 트레일러 및 플랭킹 리보자임 및 쌍두 T7 전사 터미네이터의 경우처럼 G, F 및 M2 유전자를 별도 플라스미드에서 조립하였다. 이어서 리더-투-SH (leader-to-SH) 플라스미드의 PacI-BamHI 윈도우 내로 G-투-M2 (G-to-M2) 단편을 삽입하였다. 이것은 MluI 윈도우로 BamHI 내로 삽입된 L-트레일러-리보자임-터미네이터 단편의 수용기였다.
네가지 제한 효소 마커 (도 3)을 RT-PCR에 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머내로 변경을 도입함으로써 오리지날 구축시 안티게놈 cDNA내로 도입하였다. 이것은 조립을 용이하게 하고, 재조합 바이러스를 동정하기 위한 수단을 제공하며, 감염성 RSV 내로 변경을 도입할 수 있는 능력을 설명하기 위해 수행하였다. 3 부위는 유전자간 영역에, 네 번째 영역은 비번역 유전자 영역에 있었으며, 이들은 도합 5개의 뉴클레오타이드 치환과 단일 뉴클레오타이드 삽입과 관련되어 있다. 이것은 코딩된 안티게놈의 길이를 총 14,223 뉴클레오타이드의 야생형의 그것보다 1 뉴클레오타이드만큼 증가시킨다 (서열 1, D46의 5' 내지 3' 양성-센스 서열을 가리키는 반면, 게놈 자신은 음성 센스이며; 네 번째의 위치는 G 또는 C일 수 있음).
도 3에 도시된 바와 같이 서열 마커를 cDNA-코딩된 안티게놈 RNA 내로 삽입하였다. 서열들은 양성 센스이며 리더 영역 컴플리멘트를 1로 하여 첫 번째 뉴클레오타이드에 대해 상대적으로 번호를 매긴다; 각각 서브그룹 A와 서브그룹 B를 나타내는 균주 A2 및 18537 사이의 동일성 (Johnson 및 Collins, J. Gen. Virol . 69:2901-2906 (1988)을 점선으로 나타내고l; cDNA에서 제한 부위를 나타내는 서열들은 밑줄그었으며; GS와 GE 전사 신호은 박스안에 나타내고; 위치 1141에서의 N 번역 오픈 리딩 프레임의 개시 코돈은 이탤릭체로, 서열 마커는 각 서열 아래에 표시하였다. 맨 위의 서열에서, 단일의 C 잔기를 위치 1099에 삽입하여 NS2-N 유전자간 영역 중에 AflII 부위를 만들고, N 번역 오픈 리딩 프레임의 바로 업스트림의 위치 1139 및 1140에서의 AG는 CC로 대체시켜 새로운 NcoI 부위를 만들었다. 중간 서열에서, 위치 5612와 5616 각각의 G와 U를 치환시켜 G-F 유전자간 영역 중 새로운 StuI 부위를 만들었다. 또한, 도 3의 맨 아래 서열에서 위치 7560에서 C를 대체하여 F-M2 유전자간 영역에서 새로운 SphI 부위를 만들었다.
대부분의 경우 조립 전에 몇몇 독립적인 cDNA로부터 모든 cDNA를 전체적으로 서열화하였다. 개별적인 RSV 단백질을 코딩하는 플라스미드는 Grosfeld 외, J. Virol . 69:5677-5686 91995) 및 Collins 외, 상기문헌 (1995)에 설명되어 있으며 두 문헌 모두 본문에 참조되었다. 완전한 cDNA 역시 전체적으로 조립하였다.
실시예 VIII
재조합
RSV
의 형질도입 및 회수
cDNA-발현된 안티게놈으로부터 감염성 RSV를 생산하기 위한 본 발명의 방법은 (i) RNA 복제를 할 수 있는 안티게놈 뉴클레오캡시드를 생산하고, (ii) 자손 게놈 뉴클레오캡시드로 하여금 RNA 복제와 전사의 두가지 모두에 대해 경쟁적이 되게 하는데 충분한 RSV 단백질과의 공동발현과 관련되어 있다. 게놈 뉴클레오캡시드에 의한 전사는 다른 모든 RSV 단백질을 제공하며 생산적인 감염을 개시한다.
안티게놈을 코딩하는 플라스미드-산생 cDNA를 단백질 N, P, L 및 M2(ORF1)을 코딩하는 플라스미드와 함께 T7RNA 폴리머라제를 발현하는 최근 설명된 백시니아 바이러스 MVA 재조합 균주 (Wyatt 외, Virol . 210:202-205 (1995), 본문에 참조됨)에 감염되어 있는 HEp-2 세포내로 형질도입시켰다. MVA 균주는 조류 세포에서는 잘 자라지만 포유류 세포에서는 그의 성장이 감염 바이러스의 생산을 크게 감소시키는 바이러스 성숙 단계의 후반기에 방해를 받게되는 숙주 범위의 변이주이다. HEp-2 세포에서, MVA 재조합 균주는 보다 흔히 이용되는 WR-기제 재조합 균주 (Fuerst 외 Proc. Natl . Acad . Sci . USA 83:8122-8126 (1986))와 비교할 때 T7 폴리머라제의 발현 수준 및 세포변성도 측면에서는 유사하였지만, 생산된 자손의 수준에서는 충분히 낮아서 그 상등액을 최소 세포변성도를 유지하면서 새로운 세포로 계대시킬 수 있다. 이로 인해 형질도입된 백시니아 바이러스-감염 세포에서 생산될 수 있는 여하한 재조합 RSV의 회수가 용이해진다.
재조합 RSV의 형질도입 및 회수는 다음과 같이 수행하였다. 5가지 플라스미드, 즉 0.4μg 씩의 안티게놈, N 및 P 플라스미드와 0.1μg씩의 L 및 M2 (ORF1) 플라스미드를 최종 부피 0.1 ml Opti-MEM (Life Technologies) 배지가 되도록 혼합하여 준비한 감염-형직도입 배지 1 ml를 6-웰 디쉬의 각 웰 당, HEp-2 세포의 단층 배양체에 첨가하였다. 이것을 12μl LipofectACE (Life Technologies)를 함유하는 0.1 ml의 Opti-MEM (LifeTechnologies)와 결합시켰다. 15분간 실온에서 인큐베이션시킨 후, 이것을 2% 열-불활성화 소의 태아 혈청 및 T7 RNA 폴리머라제를 코딩하는 MVA 백시니아 바이러스 균주 1.5 X 106 pfu를 함유하는 OptiMEM 0.8 ml와 결합시켰다 (Wyatt 외, 상기문헌). 이것을 세포에 첨가하고 1일 후 2% 혈청을 함유하는 Opti-MEM으로 대체시켰다. 배양체를 32℃에서 배양시키고 제 3일에 수확하였다. MVA 바이러스는 온도에 약간 민감하고 이 낮은 온도에서 훨씬 더 효율적인 것으로 밝혀졌기 때문에 32℃에서 배양하였다.
3일 후-전사 청정화 배양 상등액을 새로운 HEp-2 세포상에 계대시키고 메틸 셀룰로스 (후속적인 항체 염색을 위해) 또는 아가로스 (플라스 분리를 위해)와 함께 오버레이시켰다. 메틸 셀룰로스 하에서 5일간 배양시킨 후 RSV F 단백질에 대한 3개의 쥐의 모노클로날 항체 혼합물, 이어서 호스래디쥐 퍼옥시다제에 결합된 항-마우스 항체을 이용하는 간접 호스래디쉬 퍼옥시다제법 및 이어서 Murphy 등 (Vaccine 8:497-502 (1990))의 일반적인 공정을 이용하여 세포를 고정 및 염색시켰다. 수많은 RSV-유사 플락가 세포변성 배경에 대해 검색되었는데 이는 아마도 MVA-T7 재조합 바이러스의 저수준에 기인하는 것으로 추정된다. 흑갈색의 색상이 가리키듯, 플락들은 RSV F 단백질을 풍부하게 함유하였는데, 이들은 RSV에 특징적인 세포변성 효과, 그 중에서도 합포체 (syncytium) 형성 효과를 나타내었다.
한천하에 배양시키고 중성 레드로 염색시킨 RSV-유사 플락를 플레이트로부터 선별하였다. 이들을 증식시켜 플락 분석 및 항체 염색에 의해 RSV 균주 A2의 실험실 균주와 비교하였다. 형질도입된 배양체로부터 유도된 플락들은 실험 균주와 매우 유사하였다. 한가지 차이점은 형질도입된 배양체로부터 유도된 플락들이 실험실 균주로부터의 것보다 약간 작은 것으로 나타났으며, 그 중심이 덜 청정화 (clear)되었다는 것이다. 재조합 바이러스는 이 특정 야생형 분리균주와는 표현형질적으로 다를 수 있으며, 아마도 세포-대-세포 확산에 있어 보다 제한적이고 세포 사멸도가 감소된 것으로 나타날 것이다. 방출된 바이러스의 펄스와 관련하여, HEp-2 세포 중 재조합 바이러스 대 실험실 바이러스의 수율은 32℃ 또는 37℃에서 기본적으로 동일하였다. 예비 연구에 있어서, 재조합 바이러스와 실험실 바이러스들은 세포내 RSV mRNA 및 단백질 축적 측면에서는 구별이 불가능하였다.
플락-정제되고 3회 계대시킨 재조합 RSV를 4개의 삽입 표시자에 인접된 3개 플라이머쌍을 이용하여 RT-PCR에 의해 실험실 바이러스에 대해서처럼 분석하였다. 3개의 독립적인 플락-정제된 재조합 RSV 분리물을 증식시키고 비감염 대조군 배양체에 대해서도 동일하게 증식시켰다. 청정화된 배지 상등액을 폴리에틸렌 글리콜 및 하이 솔트 (Zoller 및 Smith, DNA 3:479-488 (1984))로 처리하여 바이러스를 조제하고 TrizolTM (Life Technologies)를 이용하여 RNA를 펠릿으로부터 추출하였다. A2 균주의 실험실 분리물로부터의 RNA 0.1 μg이 추가되거나 RNA가 추가되지 않은 부가적인 대조군과 함께 이들 RNA를 DNAse로 처리하고 재정제한 다음 50 ng의 랜덤 헥사머 각각으로 어닐링시키고 표준 RT 조건 하에 역전사효소(40μl 반응물) 존재 또는 부재 하에 배양시켰다 (Connors외, Virol . 208:478-484 (1995), 본문에 참조됨). 각 반응물의 분주액을 3가지 상이한 합성 데옥시올리고뉴클레오타이드 플라이머쌍을 이용하여 PCR시켰다 (45s 동안 94℃에서, 30s 동안 37℃에서, 1분 동안 72℃에서 35 사이클). 프라이머 쌍 (A): (+)센스, 위치 925-942 및 (-)센스, 위치 1421-1440, NS2와 N 유전자의 접합부 및 N 유전자에 각각 삽입된 AflII 및 NcoI 부위를 포함하는 516 bp(재조합 바이러스의 경우에는 517 bp)의 예상된 생성물을 생산함. 프라이머 쌍 (B): (-) 센스, 위치 5412-5429 및 음성 센스, 5930-5949, G와 F 유전자 사이의 접합부에 삽입된 StuI 부위에 걸친 538 bp의 예측 생성물을 생산함. 프라이머 쌍 (C): (+) 센스, 7280-7297 및 (-)-센스, 7690-7707, F와 M2 유전자 사이의 접합부에 삽입된 SphI 부위에 걸친 428 bp 단편을 생산함. 1% 한천와 2% 저융점 한천 및 HaeIII-절단 X174 DNA 분자길이 표시자를 함유하는 중성 겔상에서 전기영동에 의해 PCR 생성물을 분석한 다음 에티디움 브로마이드 염색에 의해 가시화시켰다. 예상된 크기의 PCR 생성물이 얻어졌다. 각각의 생성물은 RT 단계에 의존하였는데, 이는 이들 각각이 오염 cDNA 보다는 RNA로부터 유도되었음을 가리키는 것이다.
PCR 산물을 제한 효소 절단에 의해 분석하였다. 프라이머 쌍 A의 생성물을 AflII 또는 NcoI로 절단하자 예측된 177 및 340 bp (AflII) 또는 217 및 300 bp (NcoI)에 해당하는 단편들이 생산되었다. 프라이머 쌍 B의 생성물을 StuI로 절단하자 예측된 201 및 337 bp에 필적할만한 단편이 생산되었다. 프라이머 쌍 C와의 반응에 의한 생성물을 SphI로 절단하자 예측된 147 및 281 bp에 상응하는 생성물이 얻어졌다. 절단물을 상술한 바와 같이 겔 전기영동에 의해 분석하였다. AflII을 이용한 잔여 비절단 PCR 생성물이 존재하는 것은 재절단에 의해 확인되는 바와 같이 불완전 절단에 기인한 것이다. 따라서, 제한효소 절단은 재조합 바이러스를 나타내는 PCR 생성물은 예상된 제한효소 부위 표시자를 함유하는 반면 실섬실 균주를 나타내는 PCR 생성물은 그렇지 않음을 나타내 주었다. 클로닝된 PCR의 뉴클레오타이드 서열 분석 결과 서열들이 제한효소 부위 표시자에 걸쳐있음이 확인되었다.
표 38에 나타난 바와 같이, N, P, L 및 M2 (ORF1)에 의해 보완될 경우 RSV 생산 효율은 비교적 높아서, 세가지 실험에 있어서 인풋 안티게놈 cDNA 0.4 μg 및 1.5 X 106 세포 당 평균 9.9 내지 94.8 플락가 생산되었다. 이 플락들은 액상 오버레이로부터 유도된 것이었으므로, 본래 형질도입시 각 웰에 존재하는 감염 세포의 수는 알려지지 않았다. 형질도입 웰의 거의 모두 (표 38에서 56개 중 54개)가 바이러스를 생산하였다. 감염된 세포 당 방출된 RSV의 수율은 일반적으로 이상적인 조건 하에서조차 매우 낮고 (~ 10 pfu), 많은 웰들이 이러한 양 (169 플락까지)을 많이 생산하였기 때문에, 형질도입된 세포들의 많은 웰에 몇가지 RSV 생산 세포가 존재하는 것 같다.
표 38에 도시된 바와 같이 어떤 플라스미드라도 생략되면 RSV는 회수되지 않았다. M2 (ORF1)에 대한 요구도 역시 그의 인풋 cDNA 수준이 낮다면 (1.5 X 106 세포 당 0.016 μg 완전 유전자, M2 (ORF1+2)에 대해 만족되었다 (표 38). 보다 높은 수준에서, 바이러스의 생산은 크게 감소되었는데, 이는 M2(ORF2)와 관련된 미니게놈 RNA 합성 억제 역시 생산적인 감염 동안 완전 게놈에 대해 작동함을 시사하는 것이다.
이러한 결과는 감염성 RSV의 생산이 N, P 및 L에 더해 M2 (ORF1) 단백질 발현에 고도로 의존적이었음을 나타내었다. 또한, 두가지 ORFs를 모두 함유하는 완전한 cDNA 역시 RSV의 생산을 뒷받침하기는 하지만, M2 (ORF1)의 최적 발현법은 ORF2가 결실되어 있는 조작된 cDNA로부터의 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명은 본문에서 M2 (ORF1)으로 표시되고, 이전에는 22K 또는 M2 로 불리우던 (Collins 외, J. Virol . 54:65-71 (1985)) 4번째 단백질을 요구한다는 점에 있어서, RSV에 의한 전사가 상술한 비단편화된 음성 사슬 RNA 바이러스에 의한 것과 다름을 입증해준다. M2 (ORF1) 단백질은 진보적이고, 순차적인 전사에 필수적인 RNA 폴리머라제 연장 인자인 것으로 밝혀졌다. Collins 외, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 93:81-85 (1996). 이러한 요건은 본 발명의 일부로서 특정한 소정의 변화를 감염성 RSVdp 도입할 수 있는 능력을 제공해준다.
실시예 IX
RSV 균주 cpts 530 의 표현형-특이 돌연변이를 인코포레이션하기 위해 변형된 감염성 재조합 RSV의 구축
이 실시예는 본문에 설명된 재조합법을 이용하여 감염성 RSVfh 특이적인 소정의 변이를 도입하는 것을 설명해준다. 전기한 바와 같이, cpts530 RSV의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 결정하고 모 cpRSVdp 존재하는 것으로 알려진 5가지 변이를 추가적으로 약독화된 유도체인 cpts530에서 유지시켰다. 부가적인 하나의 뉴클레오타이드 변경이 뉴클레오타이드 (뉴클레오타이드) 위치 10060에서 동정되었으며 이로 인해 큰 폴리머라제 (L) 단백질의 아미노산 위치 521에서 페닐알라닌이 류신으로 변경되었다 (표 37, 39 참조). 이러한 단일 아미노산 치환은 야생형 A2 RSV의 완전한 길이의 cDNA에 단독으로 또는 cp 변이와 함께 도입되었다. 변이 cDNA로부터 회수된 감염성 바이러스를 분석한 결과 이 단일 변이는 40℃에서 HEp-2 세포 단층 배양물 중 재조합 cp530의 플락 형성의 완전한 제한을 특정하고, 온도 감응성 수준은 5 cpRSV 변이의 존재에 의해 영향받지 않은 것으로 나타났다. 이같은 발견은 cpts530의 ts 표현형을 특정하는 변이로서 L 단백질의 아미노산 위치 521에서 페닐알라닌이 류신으로 변경된 것을 확인해준다. 마찬가지로, 부가적인 또 하나의 뉴클레오타이드 변경이 cpts530 모 바이러스와 비교할 때 cpts530/1009 재조합 바이러스에서 동정되었다 (표 37). 위치 12002에서의 이러한 뉴클레오타이드 치환은 위치 1169에서 L의 아미노산 변화를 초래하는데 이 위치에서 야생형 바이러스의 메티오닌이 cpts530/1009 변이주에서는 발린에 의해 대체되었다. 이 변이는 또한 재조합 RSVdpeh 도입되었으며, 재조합 바이러스는 온도 민감성이었다. 이러한 발견은 cpts/530에 비해 cpts530/1009가 보다 큰 수준으로 온도 감응성을 나타내는 변이로서 위치 1169에서 메티오닌에서 발린으로의 변경을 확인해준다. 530, 530/1009 및 530/1030 재조합 바이러스에서의 온도 민감성 정도를 효소 분석 또는 노던 블롯 분석에 의해 모니터링되는 RSV-CAT 또는 RSV-루시페라제 미니게놈 (상기설명 참조)을 이용하여 확인하였다.
예컨대, 37℃의 높은 온도에서, 야생형 L 단백질에 대해 선택된 변이주에 의해 생산된 루시페라제 활성은 1009, 530, 및 이중 변이주 pTM1-L 지지된 플라스미드에 대해 각각 18.4%, 1.5%, 및 0.4%였다. 이러한 예시적인 변이는 또한 32℃에서 야생형 L 단백질에 비해 L 기능을 1009의 경우 70% 감소시켰고, 530에 대해 40% 활성, 530/1009 L 단백질에 대해 12.5% 활성을 감소시켰다. 전사 및 복제에 대한 이러한 변이 효과는 또한 미니게놈 시스템을 이용, 본문에 설명된 재조합 바이러스 방법과 함께 또는 단독으로 측정될 수 있다.
정의된, 약독화 재조합 RSV 백신 바이러스에 cpts530 및 cpts1009 특이적 변이를 인코포레이션시키기 위해, 본문에 설명된 cDNA-기초 회수 시스템을 다음과 같이 사용하였다. 전술한 RSV A2 야생형의 완전한 길이의 cDNA 클론 (Collins 외, 상기문헌 (1995))을 본래의 구축물에서 고안하여 뉴클레오타이드 위치 1099에서 cDNA 클론 중 단일 뉴클레오타이드 C를 삽입하고 (이로 인해 AflII 부위 생성됨), 4개의 위치에서 총 6개의 부가적인 뉴클레오타이드 치환을 함유시켰다. 따라서, 자연발생적인 바이러스에 대한 뉴클레오타이드 넘버링 시스템 및 cDNA로부터 유도된 재조합 바이러스에 대한 뉴클레오타이드 넘버링 시스템은 위치 1099 이후 1 뉴클레오타이드만큼 기록이 차이가 난다. 상기 표 36 및 37에서의 뉴클레오타이드 넘버링은 자연발생적인 바이러스에 대한 위치를 나타내는 반면, cDNA 클론에 대한 것들 (표 39)과 cDNA 클론으로부터 유도된 재조합 바이러스에 대한 것들은 하나의 뉴클레오타이드가 더 많다. 6개 뉴클레오타이드 치환 중 하나는 리더 서열 중 뉴클레오타이드 위치 4에서 게놈 센스에서 G를 C로 변경시킨 것이다. 이 뉴클레오타이드 변화는 비-재조합 RSV에서 감지되었으며 조직 배양체나 또는 마우스에 있어서 바이러스 복제의 온도 민감성에는 아무런 영향을 주지 않는 것으로 밝혀졌다 (Firestone 외, Virology, 225:419-522 (1996), 본문에 참조됨). 표 39는 이 실시예 및 다음의 실시예에서 RSV cDNA내로 삽입된 여러 가지 변이 목록을 나타낸다.
중간체 클론 (D50 및 D39)을 이용하여 양성-센스의 RSV 안티게놈을 코딩하는 완전한 길이의 RSV cDNA 클론 D53을 조립하였다 (도 4). D50 플라스미드는 리더로부터 T7 프로모터의 M2-L 오버랩 다운스트림까지의 RSV 게놈을 함유하는 반면, D39 플라스미드는 완전한 길이의 L 유전자 및 BamHI과 MluI 제한효소 부위에 의해 경계가 지워진, 해머헤드 리보자임과 2개의 T7 터미네이터 (약 7kb 길이)를 수반하는 트레일러를 코딩한다. 감염성 바이러스를 구제하기 위해 형질도입에 사용된 완전한 길이의 RSV cDNA 클론 (D53)은 D50 플라스미드 내로 D39 플라스미드의 BamHI-MluI 단편을 삽입함으로써 조립하였다 (미국특허출원 제 98/720,132 및 국제특허공개 제 PCT/US96/15524, 각각 본문에 참조됨). D50은 돌연변이를 용이하게 할 목적에서 파게미드(phagemid) 플라스미드에 각각 위치한 몇몇 단편으로 추가로 분리시켰다; 한 단편은 N 유전자 (cDNA pUC118.D50N)를 함유하는 Xbal-EcoRI 단편이었고, 하나는 F 및 M2 유전자 (pUC118.F-M2)를 함유하는 StuI-BamHI 단편이었음. D39는 별도의 파게미드 플라스미드에 각각 위치하는 2개의 단편으로 추가로 분리되었다; 한 단편 (왼쪽 절반, cDNA pUC119.L1)은 뉴클레오타이드 12255에서 BamHl 부위부터 PamlI 부위까지 (본문에서 제한 부위 위치에 할당된 서열 위치는 설명을 위한 안내지침으로 의도되는 것이지 그 단독으로 모든 뉴클레오타이드를 정확히 정의하는 것은 아님), 다른 단편 (오른쪽 절반, cDNA pUC119.L2)은 Pm/I 부위에서 T7 터미네이터의 말단까지이다.
표준 공정 (예컨대, Kunkel 외, Methods Enzymol, 54:367-382 (1987), 본문에 참조됨)에 따라 도 4의 아랫쪽에 설명된 pUC118- 및 pUC119-기초 구축물로 변이를 일으켰다. E. coli.의 dut ung 균주, 이 경우 CJ236에서 플라스미드를 증식시키고, 단일 사슬 DNA를 헬퍼 파지, 이 경우 M13KO7로 감염시킴으로써 제조하였다. 하나 이상의 뉴클레오타이드 변경을 함유하는 각각의 포스포릴화 합성 올리고뉴클레오타이드들을 제조하여 단일 사슬 주형으로 단독으로 또는 조합하여 어닐링하여 T4DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성을 지향하는데 이용하였다. 생성물을 접합시켜 E. coli의 비-dut ung균주, 이 경우 DH5알파 또는 DH10B로 형질전환시켰다. 형질전환주 집락의 미니프렙 DNA를 제한효소 절단 또는 변이 영역의 뉴클레오타이드 서열 분석에 의한 변이의 존재 여부에 대해 스크리닝하였다. 적절한 변이를 함유하는 단편을 pUC 구축물로부터 다시 D50 또는 D39 플라스미드로 이전시키고 이를 완전한 길이의 D53 클론내에 조립하였다. D53플라스미드를 N, P, L 및 M2 (ORF1) 단백질을 코딩하는 4개의 서포트 플라스미드 혼합물로 상보시킴으로써 HEp-2 세포에서 회수하였다.
생물학적으로 유도된 변이가 인코포레이션된 특정 재조합 RSV를 설명하는 이 실시예 및 다음의 실시예들에서는 4가지 유형의 변이가 관련되어 있다 (표 36, 37, 39 참조):
(1) 첫 번째 변이 그룹은 L 유전자내로 도입된 번역수준에서 무성적인 (silent) 6개의 새로운 제한효소 부위 표시자를 포함하며, 집합적으로 "부위 (sites)" 변이라 칭한다. 6개의 부위는 Bsu36I, SnaBi, PmeI, RsrII, BstEII 및 두 번째, 다운스트림의 SnaBI 부위로서, 도 4에서 D53 다이아그램 위에 밑줄그어져 있다. 이들 6가지 변경은 "부위" 변이라 집합적으로 칭해지며, cDNA 구축을 쉽게할 목적으로 합입되었다. 또한, D53 플라스미드와 서포트 플라스미드, 즉, N, P, M2(ORF1) 및 L 플라스미드 사이에서 형질도입 동안 재조합이 일어날 수 있는 것으로 알려져있다 (Garcin 외, EMBO, J. 14:6087-6094 (1995), 본문에 참조됨). L에 있어서 이들 제한효소 부위는 D53 구축물에는 존재하지만 L 서포트 플라스미드에는 부재하므로, L에서의 재조합이 일어나지 않았음을 확인해주는 표시자가 된다. 이것은 많은 약독화 변이가 L에서 일어나기 때문에 특히 중요하다.
(2) 두 번째 변이 그룹은 F 유전자에서의 2개의 아미노산 변경을 포함한다 (도 4, 표 39). cpRSV와 그의 모든 유도체는 HEK-7로 칭해지는 야생형 바이러스로부터 유도된다. 오리지날 D53 cDNA의 서열은 7개 부위에서의 단일 뉴클레오타이드 치환에 의해 HEK-7의 것과 구별된다. 하나는 뉴클레오타이드 4에서 일어나는데, 즉, 오리지날 D53에서는 C ((-) 센스에서)인 반면, HEK 바이러스에서는 G이다. 그러나, 생물학적으로 유도된 바이러스는 어느 한쪽을 함유하는 것으로 나타났으며 두가지 사이에서 유동적일 수 있고, 따라서 이러한 차이는 부수적인 것으로 취급되며 더 이상의 의미가 부여되지는 않는다. 다른 4개의 뉴클레오타이드 치환은 아미노산 수준에서는 무성적이었으며; 이들은 F에서 2개의 변경, 즉 6222 및 6387, 위치 7560에서의 F-M2 유전자간 영역에서 1개, L 위치 10515에서 1개였다. 이들은 또한 d의적인 것으로 여겨지지 않으므로 더 이상 고려대상은 아니다. 마지막으로, F 유전자에 각각 2개의 뉴클레오타이드 치환이 있었는데, 이들은 각각 아미노산 치환을 초래항T다 9표 39). 이들 두가지 변경은, 집합적으로 "HEK" 지정으로 칭하며, 코딩된 재조합 야생형 바이러스가 생물학적으로 유도된 cpts 변이주의 HEK 야생형 모 균주와 아미노산 수준에서 동일하도록 D53내로 도입된다. 이들 변경은 각각 회수된 바이러스에서뿐 아니라 cDNA에 도입된 변이의 존재여부를 모니터링할 목적에서 새로운 제한효소 인식 부위를 도입하도록 고안된 것이다.
(3) 세 번째 변이 그룹은 cpRSV 바이러스에서 발견된 5가지 아미노산 치환과관련된 것으로 집합적으로 "cp" 변이라 칭한다. 이들은 생물학적으로 유도된 모든 cpts 바이러스에 존재하며 약독화 표현형에 기여한다. 생물학적으로 유도된 cpRSV에 있어서, 이들 아미노산의 변경은 단일 뉴클레오타이드 변경이 게인하는 것이다. 표 39에 나타난 바와 같이, 아미노산 코딩 변경이 cDNA에 도입되어 5가지 경우 중 4가지 경우에서 재조합 바이러스가 제조되었을 때, 각각의 코딩 변경은 2가지 뉴클레오타이드 치환에 연관된 것으로 만들어졌으며, 이는 재조합 RSV로 하여금 야생형으로의 환원에 강력한 내성을 부여하였다. 이들 변경 4가지는 새로운 제한효소 부위를 도입하기 위해 고안된 것인 반면, 5번째 변경은 기존의 부위를 제거하기 위해 고안된 것이므로, 재조합 바이러스로부터 생산된 cDNA 또는 RT-PCR 생성물에서의 제한효소 부위의 존재여부에 의한 변이의 존재를 모니터링하는 방법을 제공한다.
(4) 네 번째 변이 그룹은 개별적인, 생물학적으로 유도된 cpts 바이러스에 특이적인 포인트 변이와 관련된 것으로 (표 39, 도 4), 이들이 획득된 생물학적 단계에 따라 명명한다. 예컨대, 다음 실시예에서 cpRSV로부터의 cpts248/404 바이러스의 유도는 2가지 돌연변이 단계와 관련되어 있다. 첫 번째는 cpts248 바이러스를 생산하는데, 이것은 단일의 아미노산 변경을 유지하므로 248 변이라 칭해진다. cpts248에 적용되는 두 번째 돌연변이 단계는 cpts248/404를 생산하는데, 404(L) 변이라 불리우는, L에서의 아미노산 변경과 404 (M2) 변이라 칭해지는, M2의 유전자 개시(GS: gene start) 신호에서의 뉴클레오타이드 변경을 함유한다. 나머지 변이들, 즉, 530, 1009 및 1030은 각각 단일의 (상이한) 아미노산 변경과 관련이 있다. 404(M2) 변이는 GS 전사 신호과 연관있고 (단백질-코딩 서열과는 관련이 없으며), 이 변이가 미니게놈 시스템에서 mRNA 합성에 중요한 것으로 나타났기 때문에 특히 주목된다 (Kuo 외, J. Virol . 71:4944-4953 (1977), 본문에 참조됨). 표 36, 37 및 39에 개략된 바와 같이, 유전 안정성 개선을 위한 목적에서 2개의 뉴클레오타이드 치환을 이용하여 248, 404 (L) 및 1009 변이의 아미노산 코딩 변경들이 재조합 바이러스에 삽입되었다. 또한, 재조합 바이러스에 대한 248, 404(M2), 404(L), 및 1009 변이들은 각각 모니터링 목적을 위해 새로운 제한효소 부위를 도입하도록 고안된 것인 반면, 1030 변이는 기존의 부위를 제고하기 위해 고안되었다.
본 실시예에서는, D50 및 D39 플라스미드로부터 몇가지 pUC118- 및 pUC119-기초 구축물을 유도하였으며 소망되는 변이를 이들 구축물에 도입하였다 (도 4, 5). 적절한 변이를 함유하는 단편들을 pUC 구축물로부터 D50 또는 D39 플라스미드내로 지정된 바에 따라 이전시키고, 이를 완전한 길이의 클론으로 조립하였다. 이러한 방식으로, 6가지 상이한 종류의 D53 완전-길이 유도체 클론을 생산하였다 (도 4, 5). 도 5에서, D53 구축물은 F에서 2개의 HEK 변이가 없다 (도 4 참조).
제조업자의 추천에 따라 Muta-GeneR 생체외 돌연변이 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 돌연변이를 수행하였다. 변이된 구축물을 경쟁적인 E.coliDH10B (Life Technologies) 내로 형질전환시켰다. 형질전환주 콜로니의 미니프렙 DNA를 제한효소 절단 (다음 설명 참조) 또는 변이된 영역의 뉴클레오타이드 서열 분석에 의해 변이의 존재여부에 대해 스크리닝하였다.
번역수준에서 무성적인 6개의 제한효소 부위 표시자, 530 변이 (521phe→leu), 및 5cp 변이 (표 39)를 pUC-기초 구축물에 도입하고 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이 D50 및 D39 플라스미드 내로 서브클로닝시켰다. 상술한 변이를 여러 가지 상이한 조합으로 함유하는 D50 및 D39 구축물을 이용하여 여러 가지의 완전-길이 cDNA 구축물을 조립하였다.
마지막 cDNA 구축물에서, 530 및 cp 변이의 존재여부를 서열 분석에 의해 확인하고, 무성적인 제한효소 부위의 존재는 제한효소 엔도뉴클리아제 분석에 의해 결정하였다. 여러 가지 제한효소 (예컨대, HpaI, AccI, HindIII, PstI)를 이용하여 각각의 D53-기초 구축물을 분석하고, 새롭게 생성된 완전한 길이의 cDNA 클론의 제한효소 패턴을 앞서 확인된 야생형의 완전-길이 cDNA 클론의 것과 비교하였다. 이와같은 제한효소 분석을 이용하여 완전-길이 플라스미드의 세균 증폭시 100 뉴클레오타이드 이상의 삽입 또는 결실이 일어났는지를 검사하였다.
앞서 설명된 바와 같이 (Collins 외, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 92:11563-11567 (1995), 본문에 참조됨) 형질도입을 수행하였다. 요약하면, T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 MVA (MVA-T7)을 이용하여 1 MOI로 HEp-2 세포 단층을 감염시키고 LipofectACE (Life Technologies)와 D53 안티게놈 구축물 플러스 N, P, L 및 M2 (ORF1) pTM1 서포트 플라스미드를 이용하여 형질도입시켰다. 제 3일에, 구제된 바이러스를 증폭하기 위해 상등액 (청정화된 배지)을 신선한 HEp-2 세포 상에 계대시켰다. 이 첫 번째 증폭으로부터의 바이러스 현탁액을 감염 5일 후 수확한 다음, HEp-2 세포 단층 상에서 여러농도로 희석 접종 후, 플락 계수를 위해 메틸셀룰로스를 오버레이하거나 또는 플락 수확 및 생물학적 클로닝을 위해 아가로스를 오버레이하였다. 플락 계수는 전술한 바와 같이 (Murphy 외, Vaccine, 8:497-502 (1990), 본문에 참조됨) 모노클로날 항체-호스래디쉬 퍼옥시다제 염색공정을 이용하여 수행하였다. 회수된 재조합 바이러스들을 3차례 계대 플락 정제에 의해 생물학적으로 클로닝시킨 다음 HEp-2 세포상에서 2회 계대에 이어 바이러스 현탁액을 생산하는데 이용하였다. RSV의 완전한 길이의 cDNA를 나타내는 플라스미드와 RSV 유전자를 함유하는 서포트 플라스미드 사이에 첫 번째 구제 단계 동안 재조합이 일어날 수 있기 때문에, 회수된 바이러스의 동종 집단을 확실히 하는데 있어서, 생물학적 클로닝이 중요했다 (Garcin 외, EMBO J. 14: 6087-6094 (1995), 본문에 참조됨). 이 생물학적으로 클로닝 및 증폭된 바이러스 현탁액들은 재조합 바이러스의 추가적인 분자 유전학적 또는 표현형적 특징화에 이용되었다. 각각의 cDNA 구축물에 대해 2개의 생물학적 클로닝된 재조합 바이러스를 생산하였는데 (도 5), 단 cp L530-부위와 cp530 부위의 경우에는, 하나의 생물학적 클론만을 생산하였다. 각각의 경우, 시스터 클론이 있을 때는, 후술하는 바와 같이 유전적 및 생물학적 분석에 기초할 때 구별이 불가능했다. D53-D530-부위 (또는 A2 ts530-s cl1cp 또는 ts530-부위로 표시)에 해당하는 전술한 구축물의 대표적인 예를 부다페스트 조약에 의거하여 ATCC에 기탁하고 수탁번호 VR-2545를 부여받았다.
상술한 바와 같이 생산된 재조합 RSV가 실제로 각각의 도입된 변이를 함유하는지를 측정하기 위해 이들을 유전학적으로 특징지었다. HEP-2 세포의 단층을 생물학적으로 클로닝된 재조합 바이러스로 감염시키고 총 RNA를 상술한 바와 같이 감염 4-5일 경과 후 수확하였다. 무작위 헥사머 프라이머를 이용하여 RT를 수행하고 생산된 cDNA를 AdvantageTM cDNA PCR 키트 (Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA)를 이용하여 PCR에서 주형으로서 이용하여 거의 완전한 길이의 재조합 RSV 게놈을 나타내는 세 개의 단편을 생산하였다. PCR 단편은 뉴클레오타이드 위치 1-5131, 5949, -10751 및 8501-15179 사이의 RSV 게놈에 해당하였다. 또한, 뉴클레오타이드 위치 9665와 10209 사이의 530 변이 영역 중 L 유전자 부분을 나타내는 544 bp 단편도 생산되었다. 사이클 시퀀싱에 이 짧은 PCR 단편을 이용하여 (71001 델타 TAQTM Cycle Sequencing Kit, USB, Cleveland, OH)회수된 재조합 바이러스에서 530 변이의 존부 여부를 확인한 반면, 큰 PCR 생성물은 특정 제한효소 부위로 표시된 cp 변이와 무성의 제한효소 부위 표시자의 존재 여부를 확인하기 위항 제한효소 절단에 이용하였다.
상기 방법에 따라 생산된 재조합 RSV가 소망되는 표현형, 즉, 인코포레이션된 서열 변경(들)에 의해 특정된 표현형을 인코포레이션하였는지를 확인하기 위해, 재조합 RSVs 및 비재조합 대조군 바이러스의 플락 형성 효율 (EOP: efficiency of plaque formation)을 측정하였다. 특히, 앞서 설명된 바와 같이 온도 조절 수조 중 HEp-2 단층 배양체를 이용하여 32, 37, 38, 39 및 40℃에서 플락 적정을 수행하였다 (Crowe 외, Vaccine, 11:1395-1404 (1993); Firestone외, Virology 225:419-522 (1996), 각각 본문에 참조됨). 플락 동정 및 계수는 상기한 바와 같이 항체 염색을 이용하여 수행하였다.
재조합 바이러스 및 야생형 및 생물학적으로 유도된 변이주 cpts530 바이러스의 온도-민감성 수준을 표 40에 나타내었다. 이 데이터는 무성 제한효소 부위나 또는 cp 변이의 도입이 ts 표현형에 기여하지 않음을 보여준다. 이 후자의 관찰은 본 발명자들의 이전의 관찰, 즉 cpRSV가 ts+ 바이러스라는 관찰과 일치한다 (Crowe 외, Vaccine, 12:691-699 (1994)).
상기의 발견은 생물학적으로 유도된 cpts530 바이러스의 ts 표현형이 이 약독화된 RSV 균주에 독특한 것으로 동정된 단일 변이에 의해 특징화됨을 확인해준다. A2 야생형 ts+ 모 바이러스의 완전한 길이의 cDNA 클론내로의 530 변이 도입, 그에 이은 530 변이를 산생하는 ts 재조합 바이러스의 회수에 의해 이러한 관점에서 cpts530 균주의 유전학적 분석이 확인되었다. 530 변이 및 cp 변이를 함유하는 이것 및 부가적인 재조합 바이러스의 온도 민감성 수준은 530 변이에 의해 특정된 온도 민감성 수준이 5개의 cp 변이에 의해 영향받지 않았음을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 방법과 조성물은 그의 cpRSV 모 바이러스에서보다 모델 숙주에서의 cpts530 바이러스의 약독화에 더 기여하는 ts 표현형 특이적 변이로서 530 변이를 동정해주었다 (Crowe외, Vaccine, 12:783-90 (1994), Crowe 외, Vaccine, 13:847-855 (1995) 본문에 참조됨).
상술한 발견에 더해, cpts530 변이와 함께 1009 변이 또는 1030 변이의 재조합 RSV로의 도입에 의해 재조합체가 생산되었는데 이것의 온도 민감성 수준은 각각 생물학적으로 유도된 cpts530/1009 및 cpts530/1030 RSV 변이주의 것과 동일하였다.
상기한 발견은 살아있는 약독화 RSV 백신을 개발하는데 있어서 본 발명의 재조합법과 RSV 클론의 중요한 몇가지 장점을 설명해 주는 것이다. RSV A2 cDNA 클론으로부터 변이주의 회수뿐만 아니라 재조합 RSV내로 선별된 변이를 삽입하는 것 역시 비교적 효과적이다. 이 실시예에 사용된 cDNA 클론의 안티게놈은 5개의 서로 다른 위치에서, 6개 뉴클레오타이드 치환 및 1개 뉴클레오타이드 삽입을 포함한 변경을 함유하도록 오리지날 구축물에서 변형되었다. 24개의 부가적인 뉴클레오타이드 치환과 관련하여 부가적인 12개 위치에서의 변이를 포함하는 변이처리된 바이러스 또한 설명된다. 530개만의 변이가 조직 배양에서 검색가능한 표현형을 일으킨다는 사실은 이렇게 큰 RNA 게놈을 조작하는 것이 비교적 쉽다는 것을 가리키는 것이다. 서포트 플라스미드와 백시니아 바이러스 효소에 의해 매개된 완전한 길이의 클론 사이에서 재조합이 일어날 수 있지만 (Garcin외, EMBO J., 14:6087-6094 (1995)), 그의 빈도는 본문에 분석된 10개 바이러스 각각이 그가 유래된 cDNA 클론에 존재하는 변이들을 소유하기에 충분할 정도로 낮다. 따라서, 소망되는 약독화 수준을 달성하기 위해, RSV 내로 일련의 방식으로 약독화 변이를 추가로 도입하는 것은 매우 그럴 듯한 일이다.
약독화 변이의 직접 동정에 있어서의 기존의 RSV 회수 시스템의 입증된 용도와 재조합 RSV의 조작 성공으로 인해 살아있는 감염성 RSV 클론 내로 다른 소망되는 변이를 인코포레이션하고 동정하는 것이 가능하다. 임상 연구와 cpRSV 바이러스의 서열분석에 의한 앞서의 발견은 cpRSV에 존재하는 5개의 비-ts 변이 세트가 혈청양성 사람에 있어 약독화 변이임을 시사하는 것이다 (Connors 외, Virology, 208:478-84 (1995), Firestone 외, Virology 225:419-522 (1996), Friedewald외, JAMA, 203:690-694 (1968), Kim 외 Pediatrics, 48:745-755 (1971), 각각 본문에 참조됨). 이 변이 및 기타 변이는 본문에 설명된 방법을 이용하여 약독화 및/또는 ts 표현형에 대해 인정된 그의 특이성에 따라 선정되며, 약독화 변이 메뉴로 조립될 수 있다. 이들 약독화 변이와 기타 약독화 변이는는 ts 및 비-ts 두가지 모두, 약독화와 면역성 사이의 적절한 균형을 위해 선택된 살아있는 약독화 바이러스를 생산하기 위해, RSV A2 야생형 바이러스 내로 도입될 수 있다. 이와 관련하여, 인체에서 RSV에 대한 보호적 면역반응을 유도하는 G 및 F 당단백질 내에서는 530 및 기타 동정된 ts 변이가 없는 것이 유리하다. 이로 인해 RSV 서브그룹 B 또는 전염병학적으로 다양한 서브그룹 A의 F 및 G 당단백질이 A2F 및 G 당단백질을 대체할 수 있는 cDNA 기질로서 작용할 수 있는 F 및 G 외부의 변이를 갖는 약독화 RSV cDNA 골격을 개발시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 서브그룹 A 균주 내에서 항원 드리프트를 축적하기 위해 살아있는 약독화 RSV 백신을 신속하게 갱신시킬 수 있으며, 서브그룹 B 백신 성분 역시 신속히 생산할 수 있다.
실시예 X
RSV 균주 cpts 248 /404의 표현형-특이 변이를 인코포레이션시키기 위한 변형된 감염성 재조합 RSV의 구축
이 실시예는 본문에 설명된 재조합 공정과 그에 필요한 물질들을 사용하여 소정의 약독화 변이를 감염성 RSV 내로 도입하기 위한 부가적인 방식을 설명해준다.
RSV A2 cpts248 변이주의 앞서의 서열 분석 역시 L 유전자에서의 단일 변이, 아미노산 위치 831에서의 글루타민에서 류신으로의 치환을 동정하였다 (표 39; Crowe 외, Virus Genes, 13:269-273 (1996), 본문에 참조됨). 이 변이는 본 발명 방법에 의해 약독화 및 ts인 것으로 확인되었다. 추가로 약독화된 RSV 변이주 cpts248/404의 서열 분석 결과, 2개의 추가적인 변이, 즉, M2 유전자 개시 서열에서의 뉴클레오타이드 변경과 L 단백질 중 아미노산 위치 1183에서의 아미노산 변경, 즉, 아스파르트산에서 글루탐산으로의 변경이 있는 것으로 나타났다 (표 39; Firestone 외, Virology, 225:419-522 (1996), 본문에 참조됨).
생물학적으로 유도된 약독화 RSV 균주 cpts248/404를 본 발명의 상기 방법에 따라 재조합 바이러스 (rA2cp/248/404)로서 재구축하였다. rA2cp/248/404 바이러스를 코딩하는 cDNA D53은 HEK, cp, 248 및 404 변경을 삽입함으로써 구축하였다 ( 표 39). 재조합 바이러스 (rA2cp/248/404)를 회수하고, 플락를 정제 및 증폭시켰다. 재조합 바이러스에서의 변이의 존재 여부를 바이러스 RNA의 RT-PCR 및 이어서 제한효소 절단 또는 뉴클레오타이드 서열 분석 또는 두가지 모두에 의해 분석하였다. rA2cp/248/404 재조합 균주를 pTMLwt 또는 pTML248/404 서포트 플라스미드를 이용하여 회수하고, 이때 후자는 생물학적으로 유도된 cpts248/404 변이주에 존재하는 L 중의 모든 변이를 함유한다 (표 39, 530, 1009, 또는 1030 바이러스에 특이적인 변이는 포함하지 않음). 서포트 플라스미드로서 pTML248/404를 사용하면 서포트 플라스미드를 이용한 동종 재조합에 의해 완전한 길이의 클론에 존재하는 248/404 변이의 손실이 방지된다.
재조합 바이러스를 위치 변이와 HEK 변이만이 존재하는 (표 41에서 rA2) D53 DNA로부터 회수하자 예측했던 바와 같이 이러한 변경이 실제로 표현형적으로 무성적임이 입증되었다. 위치 변이, HEK 변이 및 cp 변이를 함유하는 재조합 바이러스를 회수하여 (표 41에서 rA2cp라 칭함), cp 변이로 특정된 표현형을 평가하였다. 또한, 표 41에 나타난 바와 같이, (i) 248 변이 (rA2cp/248), (ii) 2개의 404 변이 (rA2cp/404); 및 404 (M2) 변이 (rA2cp/404(M2) 및 404(L) 변이 (rA2cp/404(L))와 함께, 부위, HEK 및 cp 배경을 함유하는 별도의 바이러스를 구축하였다.
32, 36, 37, 38 및 39℃에서 HEp-2 세포 중 플락를 형성하는 능력에 대해서도 이들 바이러스를 평가하였다. 이러한 비교 결과 모든 바이러스가 32℃에서 플락를 형성하고, 여러 가지 바이러스 제제의 농도는 RSV의 독립적인 제제에서 일반적으로 관찰되는 실험 편차 범위 내인 대략 서로 3 log10단위 이내인 것으로 나타났다. 야생형 재조합 바이러스 내로 "위치" 및 HEK 변이를 도입(바이러스 rA2를 생산하기 위한)해도 생물학적으로 유도된 야생형 바이러스 (바이러스 A2 wt)에 비교할 때, 높은 온도에서의 생장 능력에는 변함이 없었다. cp 변이의 부가적인 도입 (바이러스 rA2cp를 생산하기 위함) 역시 고온에서의 그의 생장능력을 변화시키지 않았다. 변이가 유도된, 생물학적으로 유도된 cpRSV가 ts 표현형을 갖지 않고; 그의 변이가 숙주 범위내이기 때문에, 이러한 결과는 예상했던 바이다. rA2cp/404(L)은 ts가 아니었으므로, L 중 404 변이는 ts 변이인 것으로 나타나지 않는다. 그러나, 본문의 방법에 따른 추가의 번석에 의해 결정되게 될 바와 같이, 이 변이는 약독화일 것으로 증명될 수 있다. 따라서, cpts2488/404 바이러스의 2가지 특이적인 변이 중, 404M2 변이만이 ts이다. 248 및 404 변이(rA2cp/248/404 바이러스를 생산하기 위함)의 추가는 그의 생물학적으로 유도된 등가 바이러스과 실질적으로 동등한 ts 표현형을 초래하는데, 이것은 이전 온도에서 핀포인트 플락가 형성된 36-37℃에서의 플락 형성능력이 크게 손상된 것에 의해 입증되었다. 이러한 여러 가지 변이가 인코포레이션된 재조합 바이러스들은 조직 배양의 성장에서는 아무런 효과를 갖지 않을 것으로 예상되었고 부가적인 변이는 ts 표현형에 기여할 것으로 예측되었다. 생산된 각각의 변이 유형은 이러한 예상과 일치하였으며, 이는 RSV 게놈이 합리적으로, 그리고 예측가능한 방식으로 조작될 수 있음을 입증하는 것이다.
표 41은 248 및 404 돌연변이 단계에 특이적인 변이의 부가적인 특징화를 보여준다.특히, (i) 248 변이 (바이러스 rA2cp/248를 생산하기 위함); (ii) 2개의 404 변이 (바이러스 rA2cp/404); 또는 404(M2) 변이 (바이러스 rA2cp/404(M2))에 더해, 위치, HEK 및 체 배경을 이용하여 바이러스를 구축하였다 (표 39). 이들 바이러스들은 각기 ts 표현형을 나타내었는데, 이는 이 변이들이 ts임을 직접적으로 나타내는 것이다. 248 변이는 낮은 수준의 온도 민감성을 제공한 반면, 404(M2) 변이는 높은 ts였고 404(L) 변이 첨가에 의해 증가되지는 않았다. 404(M2) 변이가 ts라는 것은 특히 주목할만 것으로서, 이는 이것이 전사 개시에 있어서 포인트 변이이거나 또는 유전자 개시 (GS), 신호이고, 이러한 유형의 변이는 ts인 것으로 나타난 적이 없었기 때문이다.
실시예 XI
다중
약독화
모 바이러스로부터 소정의
약독화
변이가
결합되니
재조합 RSV의 구축
이 실시예는 생물학적으로 유도된 하나의 RSV 균주 (특히 cpts248/404)로부터의 세가지 약독화 변이와 또 다른 RSV 균주 (cpts530)으로부터의 부가적인 약독화 변이를 인코포레이션한 다중 약독화 재조합 RSV (rA2cp/248/404/530)를 생한하기 위한 조합 디자인을 설명해준다. 이 재조합 RSV는 다중 변이가 백신 균주의 추가적인 약독화 표현형에 기여하여 유전 안정성을 증가시켜주는 RSV 백신에 있어서 약독화 수준을 미세하게 조정하기 위한 단계적인 약독화 변이를 조작하기 위한 본 발명의 방법을 예시해준다.
상술한 실시예 IX와 X의 cDNA 및 방법을 이용하여 위치, HEK, cp, 248, 404 및 530 변경을 함유하는 D53 cDNA를 구축하였다 (표 39). 이것은 4개의 별도로 생물학적으로 유도된 바이러스, 즉, cpRSV, cpts248, cpts248/404 및 cpts530의 바이러스로부터의 약독화 변이의 조합을 포함한다. 재조합 바이러스 (rA2cp/248/404/530)을 회수하여, 플락 정제시켜 증폭하였다. 변이의 존재여부를 바이러스 RNA의 RT-PCR에 의해 분석한 다음 제한 효소 절단 또는 뉴클레오타이드 서열결정 또는 두가지 모두에 의해 분석하였다. rA2cp/248/404/530은 L 중 248 변이가 결실되어 있지만 530 변이와 기타 248/404 변이는 포함하였다.
상기한 바와 같이 rA2cp/248/404 바이러스를 32, 36, 37, 38 및 39℃에서 HEp-2 세포 중 플락를 형성할 수 있는 그의 능력에 대해 평가하였다 (표 41). 모든 바이러스는 32℃에서 플락를 형성하였고 이 온도에서의 성장 효율은 야생형의 것과유사하였다. rA2cp/248/404/530 바이러스는 생물학적으로 유도된 cpts248/404 바이러스와 ts 표현형 관점에서 기본적으로 동등하였는데, 이는 37℃에서 플락를 형성할 수 있는 능력이 크게 훼손된 점으로부터 입증된다. 따라서, rA2cp/248/404 배경에 530 변이의 부가는 그의 ts 표현형을 증가시키지 않았지만, 재조합은 L 중 248 변이를 결여하였다.
이것과 전술한 실시예에 기초해서, 예컨대 248, 404, 530, 1009, 또는 1030 생물학적 변이와 같이 생물학적으로 유도된 RSV 변이주로부터 동정 및 확인된 일련의 변이로부터의 2개 이상의 ts 변이를 함유하는 광범위한 재조합 바이러스를 회수할 수 있다. 이러한 재조합 바이러스의 예로는 248/404/530 변이, 248/404/1009 변이, 248/404/530/1030 변이, 248/404/530/1009 변이, 248/404/530/1030 변이, 248/404/530/1030 변이, 248/404/1009/1030 변이의 조합 또는 기타 다른 약독화 변이의 조합을 갖는 RSV가 포함된다. 이에 더해, 생물학적으로 유도돈 RSV 변이로부터 동정되니 한가지 이상의 ts 변이를 인코포레이션한 재조합 RSV는 RSV 유전자 발현을 조절하는 약독화 유전자 결실 또는 변이와 같이 본 발명에 기재된 기타 변이와 결합되리 수 있다. 이러한 예의 한가지는 재조합 클론에서 248/404 변이를 SH 유전자 결실과 결합시켜 살아있는 백신 후보를 생산하는 것이다. 다른 조합 변이주의 숙주도 제공되며, 이것은 생물학적으로 유도된 RSV로부터의 한가지 이상의 ts 변이와 예컨대 유전자 또는 유전자 단편의 결실, 치환, 부가 및/또는 재배열과 같은 본 발명에 개시된 다른 변이 한가지 이상을 인코포레이션한 것일 수 있다. 약독화 ts 변이라기 보다 약독화 숙주범위인 cp 변이 역시 본 발명의 한가지 이상의 변이와 함께 포함될 수 있다. 이것으로부터 약독화, 면역성 및 유전적 안정성의 개별적인 수준과 결합 수준 관점에서 광범위한 스펙트럼을 나타내는 바이러스 패널이 얻어진다. 생물학적으로 유도된 RSV 변이로부터의 이러한 약독화 변이는 또한 재조합 RSV에서 소망되는 표현형 변경을 특정하는, 본문에 설명된 다른 여러 가지 구조적 변화와 결합됨으로써, 더 우수한 백신 특징을 갖는 부가적인 RSV를 생산할 수 있다.
실시예XII
부가적인, 외래 유전자를 발현하는 감염성 호흡기 세포 융합 바이러스의
회
수
상기 방법을 이용하여 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제 (CAT)를 코딩하는 부가적인 유전자를 함유하는 재조합 RSV를 구축하였다. CAT 코딩 서열을 RSV-특이 유전자 개시 및 유전자-변이 모티프, 바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제의 전사 신호에 의해 플랭킹시켰다. Kuo외, J. Virol . 70:6892-6901 (1996) (본문에 참조됨). RSV/CAT 키메릭 전사 카세트를 완전한 cDNA-코딩된 양성-센스 RSV 안티게놈의 G 유전자와 F 유전자 사이에 삽입하여, 감염성 CAT-발현 재조합 RSV를 회수하였다. CAT mRNA이 효과적으로 발현되어 G 및 F mRNA의 수준은 야생형 재조합 RSV에 의해 발현되는 것과 필적할만 하였다. CAT-함유 및 야생형 바이러스는 주요 바이러스 단백질 합성 수준에서는 유사하였다.
CAT 유전자를 함유하는 cDNA 코딩 RSV 안티게놈 RNA를 구축하기 위해 플라스미드 D46을 이용하였다 (플라스미드 D46과 D53 (후자는 상술하였음)은 동일한 안티게놈 cDNA의 상이한 프레퍼레이션이다). 완전한 15,223-뉴클레오타이드 (야생형 RSV보다 뉴클레오타이드가 하나 더 많다) SV 안티게놈을 코딩하는 D46을 이용하여 상기한 바와 같이 재조합 감염성 RSV를 생산하였다. 이 구축 동안, 안티게놈 cDNA를 조정하여 표시자로서 4개의 새로운 제한효소 부위를 함유시켰다. G와 F 유전자 사이의 유전자간 영역 (야생형 게놈의 3'-5' 서열 중 위치 5611-5616)에 위치하는 StuI 부위를 외래 CAT 유전자의 삽입 위치로서 선택하였다. RSV GS 신호에 의해 업스트림 말단과 RS GE 신호에 의해 다운스트림 말단 상에 플랭크된 CAT ORF의 복제물이 앞서 설명된 RSV-CAT 미니게놈으로부터 유도되었다 (Collins 외, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 88:9663-9667 (1991) 및 Kuo 외 J. Virol . 70: 6892-6901 (1996), 본문에 참조됨). StuI 부위로의 이 RSV/CAT 전사 카세트의 삽입에 의해 D46/1024CAT cDNA가 생산되었으며 (부다페스트 조약에 따라 ATC에 VR-2544로 기탁됨), 이것은 코딩된 안티게놈의 길이를 총 15,984개의 뉴클레오타이드로 증가시켰다. 또한, 야생형 RSV는 10개의 주요한 서브게놈 mRNA를 코딩하는 반면, D46/1024 CAT 안티게놈으로부터 예상된 재조합 바이러스는 11번째 mRNA로서 CAT 유전자를 코딩할 것이다. 구축 전략을 도 6에 도시하였다.
상기한 바와 같이, cDNA-코딩된 안티게놈 RNA로부터 감염성 RSV의 생산은 바이러스의 RNA 복제 및 전사에 필요 및 충분한, 안티게놈 RNA 또는 N, P, L 또는 M2 (ORF1) 단백질을 별도로 코딩하는 5개의 cDNA의 HEp-2 세포 중에서의 공동발현과 관련되어 있다. MVA 균주에 기초하여 백시니아-T7 재조합 바이러스에 의해 공급된 T7 RNA 폴리머라제에 의해 cDNA 발현이 추진되었다. MVA-T7 재조합 바이러스는 계대시 강력한 세포변성을 일으키는데 충분한 감염성 자선을 생산하였으므로, 백시니아 바이러스 복제의 억제제인 시토신 아라비노사이드를 형질도입 후 24시간 후에 첨가하고 최초 6회 계대시 유지시켰다. 시토신 아라비노사이드의 사용이 반드시 요구되지는 않았으며, 본 실시예 후반부에는 사용되지 않았다.
RSV 회수를 위해 2가지 안티게놈 cDNA: 즉 D46 cDNA와 D46/1024CAT cDNA가 시험되었다. 각각은 감염성 재조합 RSV를 생산하였다. D46/1024CAT 재조합 바이러스로 감염된 세포들은 CAT 효소를 풍부한 수준으로 발현하였다. 각각의 바이러스에 있어서, 형질도입 상등액을 신선한 세포로 계대시키고 총 8개의 계대를 6 내지 6일 간격으로, 그리고 세포 당 0.1 PFU 미만의 다중 감영도로 수행하였다.
C46/1024 CAT 게놈의 CAT 서열을 RSV GS 및 GE 신호에 의해 플랭크시켰으므로 부가적인 별도의 폴리아데닐화된 mRNA로서 발현될 것이다. 예측된 이러한 mRNA의 존재를 제 8회 계대시 D46/1024 CAT 바이러스 또는 D46 바이러스로 감염된 세포로부터의 RNA의 노던 블롯 하이브리다이제이션에 의해 시험하였다. 음성-센스 CAT-특이 리보프로브의 하이브리다이제이션에 의해 주요 밴드가 검색되었으며 이것은 예측된 CAT mRNAdp 적합한 크기였고, 폴리(A)를 제외한 735 뉴클레오타이드를 함유할 것이다. 올리고(dT) 라텍스 입자에 의해 이 종이 효과적으로 유지되었으며, 폴리아데닐화되었다. 몇가지 경우에서, 소수의 보다 큰 CAT-특이 종이 검색되었고 이것은 G-CAT 리드쓰루 (readthrough) mRNA에 적합한 크기였다. 세포내 RNA 제조에 사용되는 감염에 앞서 낮은 감염 다중도에서 D46/1024 CAT 바이러스를 8회 계대시켰다. CAT 유전자를 결실시킬 경우 일어날 수 있는 것처럼 CAT mRNA의 보다 짧은 형태의 증거는 없었다.
모사 블롯을 CAT, SH, G 또는 F 유전자 (후자의 2가지 유전자는 삽입된 CAT 유전자를 플랭킹함)에 특이적인 음성-센스 리보프로브와 함께 하이브리다이즈시켰다. 블롯은 서브게놈 SH, G 및 F mRNA의 발현이 2가지 바이러스에 있어서 유사함을 보여주었다. D46/1024CAT 및 D46에 대해 3가지 RSV mRNA 밴드 각각에서의 하이브리다이즈된 방사능량을 비교하기 위해 포스포이매저리 (phosphoimagery)를 이용하였다. D46/1024 AT와 D46 사이의 방사능 비율을 각각의 mRNA에 대해 측정하였다: SH, 0.77; G, 0.87; 및 F, 0.78. 1로부터의 편차는 전체적인 mRNA 축적 수준이 D46/1024 CAT RSV에 대해 약간 낮은 것일 수도 있지만, D46/1024CAT 대 D46에 있어서 아마도 약간 적은 RNA가 로딩되었음을 가리킨다. 세가지 비율이 유사하다는 증입증은 이들 mRNA 각각의 발현 수준이 D46/1024 CAT 대 D46에 대해 거의 동일하다는 것을 확인해준다. 따라서, G 및 F 유전자 사이의 CAT 유전자의 삽입은 djEJ한 유전자의 전사 수준에도 큰 영향을 미치는 것은 아니었다.
바이러스 단백질 합성을 특징화시키기 위해, 감염된 HEp-2 세포를 [35S] 메티오닌으로 표지시키고, 세포 용해물을 PAGE에 의해 직접 분석하거나 또는 표지된 항원 회수가 기본적으로 완료된 조건 하에서 면역침전시켰다. 정제된 RSV에 대해 발생한 토끼의 항혈청 조제는 D46/1024 CAT와 D46 바이러스가 두가지 모두 조요 바이러스 단백질인 F1, N, P, M 및 M2를 유사한 양으로 발현하였음을 나타내었다. 각 바이러스에 대해 유사한 수준으로 M2 단백질이 회수되었다는 것은 주목할만한데, 이는 그 유전자가 삽입되니 CAT 유전자의 다운스트림이기 때문이다. 삽입의 바로 다운스트림에 위치하는 유전자에 의해 코딩되는 F 단백질의 축적 역시 세가지 항-F 모노클로날 항체 혼합물을 이용한 면역침전에 의해 시험하였다. F1 서브유닛의 유사한 수준을 각각의 바이러스에 대해 회수하였다. 상술한 주요 바이러스 단백질의 포스포이매저리 분석을 몇가지 독립적인 실험에 대해 수행하자 시료와 시료 사이에 어떤 다양성이 관찰되었지만, 전체적으로는 두가지 바이러스들이 회수된 단백질 수준 측면에서는 구별될만하지 않았다. 항-CAT 항체를 이용한 침전에 의해 C46/1024 CAT에 대한 단일 종이 회수되었지만 D46 바이러스에 대해서는 아니었다. 표지된 총 단백질 분석결과, N, P 및 M 단백질은 면역침전 없이도 검색되었으며 (비록 후자는 세포종과의 공동이동에 의해 복잡화되었지만) 2개의 바이러스가 유사한 패턴을 생산함이 확인되었다. CAT 단백질에 상응하는 위치는 독립적인 실험의 포스포이매저리에 의해 확인되는 바와 같이, D46에 비해 D46/1024 CAT 패턴에서 더 많은 방사능을 함유하였다. 비록 이러한 입증은 비감염 및 D46-감염 패턴 중 공동이동 배경 밴드의 존재로 말미암아 복잡화되었지만, 이것은 CAT 단백질이 침전을 거치지 않고 표지된 총 단백질 중에서 검색될 수 있음을 시사하는 것이다.
재조합 RSV의 게놈의 예상된 위치에 있어서 CAT 유전자의 존재여부를 확인하기 위해 RT-PCR을 이용하였다. 세포내 총 RNA를 D46/1024 CAT 및 D46 RSV 두가지 모두의 8회계대 세포 펠렛으로부터 분리하였다. 삽입 위치, RSV 위치 5611-5616에서의 StuI 제한 엔도뉴클리아제를 플랭크하는 2개의 프라이머를 선택하였다: 업스트림 양성-센스 프라이머는 위치 5412-5429에 해당하였고, 다운스트림 음성-센스는 1 내지 5730-5711 위치에 상응하였다. 양성-센스 프라이머를 RT 단계에 사용하고, 두가지 프라이머를 모두 PCR에 포함시켰다.
D46 바이러스의 RT-PCR은 부가적인 외래 서열없이 G/F 유전자 접합부을 나타내는 318 뉴클레오타이드의 예정된 단편에 상응하였다. D46/1024 CAT 바이러스의 RNA 분석에 의해 전기영동 이동성이 예측된 1079 뉴클레오타이드 단편의 것과 상응하는 단일 생성물이 생산되었는데, 이것은 삽입된 CAT 전사 카세트를 함유하는 G/F 접합부을 나타낸다. 후자의 PCR은 단일의 주요 밴드를 생산하였고; 검색가능한 소형 생성물이 없다는 것은 재조합 게놈의 집단이 이 관점에서 결실된 다수의 분자를 함유하지 않았음을 가리킨다. RT 단계 없이 PCR 분석을 D46/1024 CAT 바이러스 RNA 상에서 수행하자, 밴드가 관찰되지 않았고,이는 이 분석이 RNA에 특이적인 것임을 확인해주는 것이다. 따라서, RT-PCR 분석은 D46/1024 CAST 재조합 바이러스의 게놈 RNA에 있어서 예측된 위치에서의 예상된 길이의 삽입의 존재 여부를 확인해준다.
CAT 유전자의 안정성을 측정하기 위해 효소 발현을 이용하였다. 3회로부터 시작한 모든 계대로부터의 세포 펠릿을 CAT 발현에 대해 시험하였다. D46/1024 CAT 바이러스에 있어서, 이러한 모든 분석은 [14C] 표지된 클로람페니콜이 아세틸화된 형태로 전환되었음을 나타내주었다. 발현 안정성을 조사하기 위해, 3회 내지 8회 계대 각각으로부터의 개별적인 20 내지 25개 플락로부터의 바이러스를 CAT 발현에 대해 분석하였다. 모든 샘플들이 양성이었고, CAT 발현 수준은 세포 용균물의 동등한 분취액 분석에 의해 판정되는 바와 같이, 8회 계대로부터의 25 분리물 각각에 대해 유사하였다. 이것은 각 분리물에 의해 코딩된 CAT 단백질의 활성이 변이에 의해 손상되지 않고 유지되었음을 입증해 주었다.
플락 형태학과 크기를 결정하기 위해, 2회 계대로부터 시작하여, 각 계대 단계로부터 수확된 배지 상등액의 팔분의 일을 이용하여 5일 내지 7일간 메틸셀룰로스 오버레이 하에서 배양시킨 6-웰 플레이트 중 신선한 HEp-2 세포를 감염시켰다. 이어서 세포를 고정시키고 RSV F 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이어서 호스래디쉬 퍼옥시다제에 결합된 제 2 항체와 함께 배양시킴으로써 염색하였다. 먼저, cDNA D46으로부터 생산된 재조합 RSV는 생체외에서 온도 변화시 플락 형성 효율 및 앞서 감염되지 않은 침팬지의 기도내로 접종된 질환의 복제 및 발병능력 측면에서 자연발생적인 야생형 RSV 분리물과 구별될 수 없다는 것이 관찰되었다. 따라서, D46 재조합 RSV는 악성의 야생형 균주인 것으로 여겨졌다. D46 및 D46/1024 CAT 재조합 바이러스에 의해 생산된 플락들을 항체 염색에 의해 비교하였다. 각 바이러스에 대해 무작위적으로 선택한 30개 플락를 측정한 결과, 비록 CAT-함유 재조합 플락의 평균 직경은 D46 바이러스의 그것의 90퍼센트였지만, 플락 형태는 2가지 바이러스에 있어서 매우 유사하였다.
D46 및 D46/1024 CAT 바이러스의 조직 배양에서의 복제 효과를 단일 단계 성장 사이클에서 비교하였다. 세포들의 삼중 단층을 이들 바이러스 중 어느 하나로 감염시키고 샘플을 12시간 간격으로 취하여 플락 분석에 의해 정량하였다. 그 결과 D46/1024 CAT 바이러스의 생산은 D46에 비해 지연되었고 최대 농도는 20배 더 낮은 것으로 나타났다.
이러한 결과는 외래 유전자, 이 경우 CAT 유전자를 발현하는 재조합, 헬퍼-독립성 RSV를 구축하는 것이 가능함을 보여주는 것이다. 재조합 RSV는 효소 분석과 방사능면역침전의 두가지 모두에 의해 검색되는 단백질인 CAT 단백질을 코딩하는 예측된 폴리아데닐화 서브게놈 mRNA의 발현을 지향하였다. 다른 예에서는 동일한 CAT 위치에 삽입된 루시페라제 유전자, 또는 SH와 G 유전자 사이에 삽입된 CAT 또는 루시페라제 유전자를 갖는 RSV 재조합체가 생산되었다. 이러한 바이러스들은 감소된 생장을 나타내는 반면, 회수된 수많은 야생형 재조합 바이러스들은 성장이 감소되지 않은 것으로 나타났다. 이것은 실제로 감소된 성장이 게놈 어디에선가의 기쇠적 변이에 기인한다기 보다 삽입된 유전자와 관련되어 있음을 가리키는 것이다. 약독화 수준은 삽입된 유전자 길이가 증가할수록 증가하는 것으로 보인다. 재조합 RSV 내로의 외래 유전자의 발견이 그의 복제 수준을 감소시키고 생체외 계대시 안정하였다는 관찰은 이것이 백신 사용에 있어 또 다른 약독화를 발현시키는 수단을 제공함을 시사하는 것이다. 또한, 감마 인터페론 및 IL-2와 같이 항바이러스 활성을 갖는 단백질 발현 유전자의 재조합 바이러스 내로의 삽입에 의해, 발현된 항바이러스 단백질의 활성에 기인한 바이러스의 약독화가 초래될 것이다.
변형된 성장 특징을 갖는 RSV의 회수를 입증하는데 더해, 본 발명의 실시예들은 다른 중요한 방법과 재조합 RSV의 유전자 발현 및 기타 비단편화된, 음성 사슬 바이러스의 유전자 발현의 장점을 설명해준다. 예컨대, 본 실시예에 제시된 데??타는 별도 mRNA로서 발현된 별도 전사 카세트로서 외래 코딩 서열이 도입될 수 있음을 보여준다. 이 결과는 RSV가 예컨대 CAT 유전자의 경우 762 뉴클레오타이드를 또한 총 15,984개의 뉴클레오타이드로 (야생형 RSV의 1.05배) 게놈 길이의 실질적 증가를 관용함을 보여주는 것이다. 성공적으로 회수된 루시페라제 유전자는 거의 3배 더 길다.
바이러스의 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 교정 메카니즘 및 손상 메카니즘의 부재로 인해 오차가 발생하기 쉬은 속성을 갖는 것으로 알려져 있다. RNA 바이러스 게놈에 있어서, 변이의 빈도는 평균 1 위치 당 10-4 - 10-5 만큼 높은 것으로 평가되었다 (Holland 외, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 176:1-20 (1992) 및 본문 참조). 본문에서 생산된 재조합 D46/1024CAT RSV의 경우, 외래 유전자의 정확한 발현은 바이러스 복제와 무관하고 변이 축적이 없을 것이다. 본 발명에 설명된 계대는 세포 당 0.1 PFU 미만의 감염 다중도를 가지며, 각 계대 수준의 기간은 감염의 다중도가 관여함을 가리켰다. RSV-감염 조직 배양체 세포로부터의 감염성 바이러스의 생산량이 낮은 반면, 세포내 고분자 합성은 왕성하고, 감염섬 바이러스의 생산량이 낮은 것은 RNA복제 수준이 낮다기 보다는 패키징 단계가 비효율적임을 나타내느 것으로 보인다. 따라서 8회 연속 계대를 통한 CAT의 유지는 많은 횟수의 RNA 복제와 관련이 있었다. 비필수 CAT 유전자가 고유하게 남아있고 제 8해 계대시 시험된 25개의 분리물 각각에서 완전히 기능적인 단백질을 코딩할 수 있다는 것은 놀라운 일이다. 또한, 제 8회 계대로부터 분리된 RNA의 RT-PCR 분석 결과 CAT 유전자 내에서느 결실이 검색되지 않았다.
SH-G 유전자간 영역 (상기에서 사용된 F-G 유전자간보다 프로모터에 한 위치 더 가까움) 내로 엔지니어링된 XmaI 위치 내로 CAT 전사 카세트가 삽입되어 있는 제 2의 감염성 RSV-CAT 재조합체를 구축하였다. 이 재조합체의 성장 특성은 D46/1024 CAT 재조합체의 그것과 유사한 반면, CAT 발현 수준은 약 2 - 3배 더 높았는데,이는 이것이 프로모터에 보다 가깝게 위치한다는 것과 일치하는 것이다. 이것은 외래 유전자가 게놈 내 2번째의 상이한 위치내에 삽입될 수 있음과 따라서, 그의 발현 수준이 변경될 수 있음을 보여준다. 이론상으로는, 삽입이 mRNA-코딩 단위를 파괴하지 않고 게놈의 양 말단에서 발견된 시스-작용 서열 요소를 간섭하지 않는 한, 게놈의 어떠한 위치든지 외래 유전자를 코딩하는 전사 단위의 삽입이 가능하다.
CAT 유전자가 루시페라제 (LUC) 표시자 유전자의 그것으로 대체되어 있는 감염성 재조합 RSV도 회수되었다. LUC 코딩 서열은 약 1,750 bp (CAT 크기의 3배)이고, F와 L을 제외한 어떠한 RSV 유전자보다도 크다. 이것을 SH-G 또는 G-F 유전자간 영역 중 어느 하나에 삽입하고 감염성 재조합 바이러스를 회수하였다. 조직 배양체에서 성장과 관련하여 CAT 바이러스에 비해 LUC바이러스는 보다 더 약독화되어Tsmsepk, 이는 게놈 크기의 증가가 성장 효율을 감소시킴을 가리키는 것이다. 이러한 CAT 및 LUC 바이러스의 특징화는 바이러스 유전자 발현 및 성장에 미치는 외래 유전자 크기의 효과를 결정할 것인데, 예컨대, 얼마만큼이 전사 신호의 부가적인 세트의 도입에 기인할 것인지, 그리고 얼마만큼이, 증가된 게놈 길이에 기인할 것인지를 결정해 줄 것이다.
미니레플리콘 시스템에 있어서, 전사 단위가 미니게놈보다 (+)-센스 안티게놈의 "센스" 배향에 있도록, RSV-CAT 미니게놈을 변형시켰다. 따라서, 서브게놈 mRNA는 폴리머라제가 안티게놈 복제 중간물을 전사할 수 있는 경우에만 만들어질 수 있다. 흥미롭게도, 플라스미드-발현된 N, P, L 및 M2 ORF1 단백질에 의해 상보될 경우, 이러한 역상-RSV-CAT 미니게놈은 서브게놈, 폴리아데닐화, 번역가능한 mRNA를 합성할 수 있다. 효과적인 미니게놈 전사의 경우에서와 같이, mRNA 합성은 M2 ORF1 단백질에 의존적이었다. 그의 안티게놈 주형에 상대적인 mRNA의 수준은 mRNA 대 표준 미니레플리콘에 의해 만들어진 미니게놈 주형의 비율과 거의 동일하였다. 이것은 게놈뿐만 아니라, 안티게놈도 외래 전자 단위를 받아들이는데 사용가능함을 가리키는 것이다. 따라서, 외래 유전자의 발현은 게놈 전사 순사로 할 필요 없이 달성될 수 있다. 이것은 외래 유전자가 게놈의 전사 프로그램가 아니기 때문에 이 유전자들의 상대적인 발현 수준을 교란하지 않는다는 장점을 가졌다.
두 개의 RSV 항원 서브그룹 사이의 대부분의 항원 차이가 G 당단백질에 존재하기 때문에, 2가 백신을 생산하기 위한 부가적인 유전자로서 이종의 서브그룹의 G 단백질을 발현하기 위해 재조합 RSV를 구축할 수 있다. 사람의 파라인플루엔자 3 바이러스와 같은 기타의 호흡기 바이러스의 외피 단백질 유전자 역시 재조합 RSV에 의한 발현을 위해 삽입될 수 있다. 기타 용도에는 인터루킨 6과 같은 면역 조절제의 공동 발현이 포함되어 감염성 RSV의 면역성을 증진시킬 수 있다. 본문에 설명된 바와 같이 변형된 RSV를 사용하는 것과 같은 기타 용도 역시 제공된다.
실시예 XIII
SH
유전자 결실을 갖는 재조합
RSV
이 실시예는 SH 유전자의 발현이 SH mRNA 및 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 제거에 의해 제거된 재조합 RSV의 생산을 설명해준다. SH 단백질은 작은 (균주 A2의 경우 64 아미노산) 단백질로서 아미노산 위치 14-41에서 추정적인 트랜스막 영역을 함유한다. 이것은 노출된 C-말단을 갖는 막에 지향되어 있고 C-말단 및 N-말단 영역의 두가지 모두에서 잠재적인 글리코실화 부위가 존재한다 (Collins 외, J. Gen. Virol . 71:3015-3020 (1990), 본문에 참조됨). 감염된 세포에 있어서, A2 균주의 SH 단백질은 4가지 주요 형태; 즉, (i)SH0 (Mr 7500), 가장 풍부한, 완전한 길이의 비글리코실화된 형태 (Olmsted 외, J. Virol . 63:2019-2029 (1989), 본문에 참조됨); (ii) SHg (Mr 13,000-15,000), 단일의 N-연결 탄수화물 사슬을 함유하는 완전 길이 형태; (iii) SHp (Mr 21,000-40,000), 폴리락토스아미노글리칸의 첨가에 의해 변형된 단일의 N-연결 탄수화물 사슬 (Anderson 외, Virology 191:417-430 (1992), 본문에 참조됨); (iv) SHt (MRr 4800), 두 번째 메티오닐 코돈 (위치 23)으로부터 개시되고 여러 가지 형태 중에서 단독으로는 세포 표면으로 전달되는 것으로 보이지 않는 절단된 비글리코실화 형태로 축적된다. SH0 및 SHp 형태가 순수한 바이러스에서 검색된 바 있으며, 이는 바이러스 형태발생 수준에서 선택성이 있음을 시사하는 것이다 (Collins 외, 상기문헌 (1993)).
파라믹소바이러스 중에서, 표면적으로 유사한 SH 단백질이 원숭이 바이러스 5 (Hiebert 외, J. Virol . 55:744-751 (1985), 본문에 참조됨), 소의 RSV (Samal 외, J. Gen. Virol . 72:1715-1720 (1991), 본문에 참조됨), 유행성 이하선염 바이러스 (Elango 외, J. Virol . 63:1413-1415 (1989), 본문에 참조됨), 및 칠면조 라이노트라키티스 바이러스 (Ling 외, J. Gen. Virol . 73:1709-1715 (1992), 본문에 참조됨)에서 발견되었다. 필로바이러스의 작은 소수성 VP24 단백질은 표면 단백질 (Bukreyev 외, Biochem. Mol. Biol. Int. 35:605-613 (1995), 본문에 참조됨)인 것으로 생각되고, 파라믹소바이러스 SH 단백질의 대응부인 것으로 추정된다.
SH 단백질의 기능은 이제까지 정의되지 않았다. 플라스미드-코딩 단백질을 발현하는 세포의 융합 분석에 있어서, RSV 단백질에 의한 CV-1 세포의 효과적인 융합은 F, G 및 SH 단백질을 공동발현을 요구하였다 (Heminway외, Virology 200:801-805 (1994), 본문에 참조됨). 특정 이론에 구애됨이 없이 RSV SH 단백질의 몇가지 기능이 존재할 수 있다 :(i)이것은 바이러스의 부착 또는 침투를 촉진할 수 있다 (Heminway외, 상기문헌); (ii) 이것은 바이러스의 형태발생학에 관여할 수 있다; 또는 (iii) 이것은 Sendai 바이러스의 V 단백질에 대해 최근 설명된 바와 같이 숙주 면역 시스템의 성분과의 상호작용과 같이, 바이러스 성장에 있어서 직접적인 역할과 구별되는 "럭셔리 (luxury)" 기능을 가질 수 있다 (Kato 외, EMBO J. 16;178-587 (1997), 본문에 참조됨). 상술한 기능 (i) 또는 (ii)는 여러 가지 바이러스의 몇몇 소수성 단백질에 있어서 제안된 바와 같이, 막 투과성을 변형시키는 활성과 관련되어 있다 (Maramorosh 외, (편), Advances in Virus Research 45:61-112 (1995); Schubert 외, FEBS Lett. (1996); Lamb 외, Virology 229:1-11 (1997), 각각 본문에 참조됨). SH 단백질의 이들 모든 잠재적인 활성은 본 발명에 설명되니 방법과 전략에 따르면 RSV 재조합 백신에 있어서 부가적인 장점을 제공한다.
SH 유전자 기능의 선택적인 파괴를 갖는 재조합 RSV를 생산하기 위해, SH 유전자를 모 RSV 클론으로부터 완전히 삭제하였다. 상술한 플라스미드 D46 플라스미드는 RSV의 A2 균주의 완전한 안티게놈 RNA를 코딩하는 클론의 하나로서, 재조합 RSV를 성공적으로 회수하는데 이용되었다 (미국특허출원 제 08/720,132; 미국 잠적 특허출원 No. 60/007,083, 각각 본문에 참조됨). 이 안티게놈은 자연발생적인 게놈에 비해 1 nt만큼 더 길며 몇몇 임의적인 제한효소 부위 표시자를 함유한다. D46 플라스미드는 완전한 SH 유전자가 결실되어 플라스미드 D46/6368을 생산하도록 변형시켰다 (도 7).
플라스미드 D46/6368의 구축은 2가지 모 서브클론을 포함하며, 그 하나는, L 유전자 개시부의 리더 영역을 에워싸는 게놈의 좌측말단에 부착된 T7 프로모터를 함유하는 D50이고, 다른 하나는, 나란한 쌍 T7 전사 터미네이터와 해머헤드 리보자임의 하류 말단에서 부착된 L 유전자와 M2 유전자의 말단을 함유하는 D39이다. D50 플라스미드는 ScaI (완전한 15,223-뉴클레오타이드 안티게놈 서열에서 4189 위치)와 PacI (위치 4623)으로 절단되었고 결과된 435 bp 단편은 2개의 상보적인 올리고뉴클레오타이드로부터 구축된 짧은 DNA 단편으로 대체되었다. 이 실시예에서 결실, ScaI과 PacI 부위에 위치하는 435-bp 단편은 M 유전자의 바로 하류 말단, 그의 GE 신호, 및 그의 GE 서열의 마지막 6개 뉴클레오타이드를 제외한 완전한 SH 유전자에 해당한다 (도 7). 이것을 2개의 부분 합성 상보 올리고뉴클레오타이드인 5'- ACT CAATAAGTTAATAAAAAATATCCCGGG AT -3' [서열 3] ((+)-센스 사슬, M GE 서열은 밑줄긋고 Xmal 부위는 이탤릭체로 표시하였으며, 왼쪽과 오른쪽의 ScaI 절반-부와 PacI 접착성 말단은 굵은 이탤릭체로 나타내었음) 및 5'-CCCGGGATATTTTTTATTAACTTATTTG AGT -3' [서열 4] ((-)-센스 사슬)로 대체하였다. D50/6368이라 불리우는 이 cDNA를 이용하여 안티게놈의 나머지를 함유하는 D39의 BamHI-Mlul 단편을 받아들였다. 그 결과 결실된 서열을 제외한 완전한 안티게놈을 코딩하는 플라스미드 D46/6368, 야생형 플라스미드 D46에 의해 코딩되는 안티게놈보다 398 nt가 짧은, 즉 14,825 nt 길이의 안티게놈이 결과되었다. 삽입물의 서열을 디데옥시뉴클레오타이드 서열 분석에 의해 확인하였다. XmaI 부위를 임의로 도입하여 이 위치에서 삽입이 쉽게 일어날 수 있도록 하였다.
바이러스의 형질도입, 성장 및 계대, 플락 정제 및 바이러스 플락의 항체 형색을 다음의 2가지 변형을 제외하고 전술한 공정에 따라 일반적으로 수행하였다: (i)백시니아 바이러스의 저해제인 시토신 아라비노사이드를 사용하지 않고; (ii)형질도입에 사용된 HEp-2 세포를 32℃ 또는 37℃에서 배양시키고, 회수된 모든 바이러스를 37℃에서 증식시켰다.
총 RNA 및 폴리(A)+RNA를 평가하기 위해, 세포들을 스크랩하여 물 100μldp 재현탁시키고, 총 세포내 RNA를 제조업자의 추천에 따라 TrizolTM 시약을 이용하여 분리하였다 (이소프로판올 침전에 이어 RNA를 페놀-클로로포름, 및 이어서 에탄올 침전으로 2회 추출한 것을 제외). Oligotex mRNA 키트 (Quigen, Chatsworth, CA)를 이용하여 폴리(A) + RNA를 분리하였다.
역전사 및 폴리머라제 연쇄반응 (RT-PCR)을 수행하기 위해, SH 유전자 영역을 cDNA로 복사하여 증폭시켰다. 프라이머로서 (-) 센스 합성 올리고뉴클레오타이드 5'-GAAAGTATATATTATGTT-3' (서열 5)를 이용하여 Superscript II (Life Technologies)로 총 세포내 RNA를 역전사시켰다. 이 프라이머는 SH 유전자의 업프트림인 뉴클레오타이드 3958-3975에 상보적이다. 음성-센스 올리고뉴클레오타이드 5'-TATATAAGCACGATGATATG-3' [서열 6]과 함께 상술한 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하는 pcrDPTJ cDNA 생성물의 분주액을 주형로서 사용하였다. 후자의 이 프라이머는 SH 유전자의 하류인 게놈의 뉴클레오타이드 4763-4782에 해당한다. 처음 2분간 변성 단계를 수행하고 이동안 Taq DNA 폴리머라제를 첨가한 다음, 33 회를 수행하였다 (변성, 1분, 94℃에서; 어닐링, 1분, 39℃에서; 연장, 2분, 72℃에서). 이어서 생성물을 2.5% 한천 겔 상에서 분석하였다.
노던 블롯 혼성화를 위해, 포름알데히드 존재 하에 RNA를 한천겔 상에서 전기영동에 의해 분리하고 니트로셀룰로스에 블로팅하였다. 합성 헥사머를 이용한 무작위적 프라이머와 Klenow 폴리머라제에 의해 cDNA로부터 생체외에서 개별적으로 합성된 M, SH, G, F, M2 및 L 유전자의 [32P]-CTP-표지된 DNA 탐지자를 혼성화시켰다(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Molecular Dynamics (Synnyvaly, CA) Phosphorlmager 445 SI를 이용하여 혼성화된 방사능을 정량하였다.
35S 메티오닌 표지, 면역침전, 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 과정을 전술한 바와 같이 수행하였다 (Bukreyev 외, 상기문헌). 프리-캐스트 4%-20% Tris-글리신 겔 (Novex)를 이용하여 전기영동을 수행하였다.
생체외 성장 분석을 위해, HEp-2, 293, CV-1, Vero, MRC-5, 아프리카 녹색 원숭이 신장 (AGMK), 소의 갑개골 (BT), 및 MDBK 세포 단층을 단일-단계 성장 사이클 분석에 이용하였다. 각각의 세포 종류에 대해, 3가지 25-cm2 배양 플라스크를 D46/6368 (SH-마이너스) 또는 D46 (야생형 재조합) 바이러스 107 PFU로 감염시켰다. HEp-2, Vero, 293, BT, MRC-5, 및 AGMK 세포에 대해 2% 송아지 태아 혈청 (FBS) (Summit)과 함께 Opti-MEM (Life Technologies)을; MDBK 또는 BT 세포에 대해 1% /또는 2% FBS와 함께 E-MEM (Life Technologies)을 사용하였다. 37℃에서 3시간 흡수 후, 세포를 4 ml 배지로 각각 3회 세정하고, 4 ml 배지를 첨가하였으며, 세포를 37℃에서 5% CO와 함께 배양시켰다. 이어서, 접종 (하기 참조)후, 여러 가지 시간대에서, 배지 상등액의 200μl 분주액을 제거하고, 100 mM 마그네슘 설페이트와 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 것으로 조정하고, 플래쉬-냉각하여 -70 ℃에서 적정할 때까지 저장하였다; 각각의 분주액을 동량의 새로운 배지로 대체하였다. 적정을 위해, HEp-2 세포 (24-웰 플레이트)를 10-배 분주액 희석물로 감염시키고, 2% FBS와 0.9% 메틸셀룰로스 (MCB Reagents)를 함유하는 Opti-MEM으로 중층하였다. 7일간 배양한 후, 배지를 제거하고, 세포 단층을 4℃에서 80% 메탄올로 고정시켰다. 플락를 RSV F 단백질에 특이적인 세가지 단클론 항체 혼합물과 함께 배양시킨 다음, 호스래디쉬 퍼옥시다제와 함께 염소 항-마우스 IgG 접합시켰다 (Murphy외, Vaccine, 8:497-502 (1990) 본문에 참조됨).
D46/6368 플라스미드를 N, P, L 및 M2 ORF1 단백질을 코딩하는 플라스미드와 함께 SH 유전자 기능을 결여하는 감염성의 재조합 RSV의 회수에 이어 HEp-2 세포내로 공동형질도입시킨 상술한 공정을 수행하고, 세포를 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 백시니아 바이러스의 MVA 균주의 재조합체로 동시에 감염시켰다. 동일한 조건 하에서 D46 야생형 cDNA에 의해 병용 (parallel) 배양체를 형질도입시켰다. 배지 상등액을 형질도입 3일 후에 수확하고 1회 계대시켰다. 37℃에서 6일간 배양시킨 후, 각각의 오리지날 형질도입을 나타내는 배지 상등액의 분취액을 신선한 HEp-2 세포상에 깔고 메틸셀룰로스 중층하에서 6일간 배양시킨 다음, RSV F 단백질에 특이적인 3가지 단클론 항체 혼합물에 이어 호스래디쉬 퍼옥시다제로 콘쥬게이션시킨 2차 항체와 반응시킴으로써 염색시켰다. 야생형 재조합 바이러스의 플락 대 SH-마이너스 바이러스의 형태학은 후자의 플락가 좀 더 큰 것을 제외하고 서로 매우 유사하였다. 주목할 것은, 대조군과 SH 마이너스 바이러스에 의해 형성된 플락이 합포체를 함유했다는 것이다.
회수된 D46/6368 바이러스의 게놈에서 SH 유전자가 부재하는 것을 확인하기 위해, 세포들을 야생형 또는 SH-마이너스 재조합 바이러스의 제 1회 계대물로 감염시키고 총 세포내 RNA를 회수한 다음 RT-PCR로 분석하였다. 게놈 위치 3958-3975에서, SH 유전자의 상류을 어닐링시킨 RT를 (+)-센스 프라이머로 수행하였다. SH 유전자의 하류 뉴클레오타이드 4763-3782를 나타내는 (-)-센스 프라이머를 함께 동일한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 야생형 D46 바이러스는 3958과 4782 (레인 3) 위치 사이의 예측된 824 bp 단편에 상응하는 단일의 PCR 생성물을 생산하였다. D46/6368 바이러스의 경우, PCR 생성물은 더 짧았고 결실 (레인 2)를 함유하는 예측된 426 bp 단편에 해당하였다. PCR 생성물의 생산은 RT 단계에 의존적이었는데, 이는 예상된 바와 같이, 이들이 DNA보다 RNA로부터 유도되었음을 나타낸다. 따라서, RT-PCR 분석은 D46/6368 바이러스의 게놈이 SH 위치에서 예상된 398-뉴클레오타이드 결실을 함유함을 입증해준다.
SH 유전자의 상류와 하류에 위치하는 유전자의 전사를 시험하기 위해, D46 또는 D46/6368 바이러스로 감염된 세포로부터 폴리(A)+mRNA를 분리하여 노던 블롯 하이혼성화에 의해 분석하였다 (도 9). 폴리(A)+선별 전에 세포내 RNA는 의도적으로 변성시키지 않았으므로; 하기한 바와 같이, 선별된 mRNA 역시 mRNA로의 샌드위치 혼성화에 의한 게놈 RNA를 함유하였다. 이로 인해, mRNA와 게놈의 동시 분석이 가능하고, 각 mRNA의 풍부함을 동일한 겔 레인에 함유된 게놈 RNA에 대해 관계시킬 수 있으므로 레인들 간의 mRNA 풍요도를 비교할 수 있다. 무작위적인 프라이밍에 의해 cDNA 클론으로부터 합성된 [32P]-표지된 DNA 프로브로 블롯을 혼성화시켰으므로 두가지 극성의 탐지자가 모두 함유되었다. 이에 더해, 앞서 설명된 몇몇 두 시스트론의 통독 (dicistronic readthrough) mRNA 역시 예컨대 F-M2, G-F 및 P-M mRNA와 같이 두가지 바이러스에 대해 모두 검색되었다.
G-특이 탐지자를 M 및 G유전자의 통독인 것으로 나타난 D46/6368 바이러스에 특이적인 신규한 종과 혼성화시켰다. 이러한 조합은 개재 SH 유전자의 결실로 인해 가능하였다. D46/6468에 특이적인 (그러나 D46에는 특이적이지 않은) 동일한 종은 M-특이적인 탐지자에 부가적으로만 혼성화하는 것으로 나타났다.
상대적인 합성 수준을 D46 대 D46/6368의 각 mRNAdp 대해 후속적으로 정량하였다. 각 쌍에 대해 비교하여, 주어진 겔 레인에서의 mRNA의 양을 게놈의 양에 대해 상대적으로 정상화시켰다. 이 비교는 표시된 비율에서 다음의 mRNA 발현하는 D46/6368 대 D46을 나타내었다 (D46/6368 대 D46)L M(1.1), G(1.3), F(0.61), M2(0.32), 및 L(0.17).
D46 대 D46/6268 RSV 클론에 의해 합성된 바이러스 단백질을 비교하기 위해, HEp-2 세포를 세포 당 2 PFU의 인풋 감염 다중도로 감염시키고 감염 후 16 내지 20시간 으로부터 [35S]메티오닌과 함께 배양시켰다. 세포 용해물을 제조하고 직접 분석하거나 또는 정제된 RSV 바이러스에 대해 발생된 토끼의 항혈청을 이용하여 면역침전하였다. 총 단백질과 면역침전된 단백질을 4-20% 구배 겔 상에서 PAGE시켰다 (도 10).
D46 바이러스의 경우, 면역침전된 단백질의 패턴은 SH 단백질의 비글리코실화 형태, SH0 및 N-글리코실화 형태, Shg를 포함하는 반면, 어떠한 종도 D46/6368 바이러스에 대해 명확하지 않았다 (도10). SH0 단백질 역시 D46의 경우에는 총 감염-세포 단백질의 유형으로 검색되었지만 D46/6368의 경우에는 그렇지 않았다. 다른 한편, D46 대 D46/6368에 의해 합성된 단백질의 유형은 기본적으로 구별할 수 없었다. 면역침전된 단백질의 유형에서 N, P, M, F1 및 M2 단백질의 포스포이매져 분석 결과 동량이 두가지 모두의 바이러스에 의해 만들어진 것으로 나타났다 (도10).
상기한 바와 같이, 플락 분석에 의한 D46과 D46/6368 바이러스의 예비적인 비교는 생체외에서의 성장의 차이를 나타내었다. EK라서, 본 발명자들은 HEp-2 세포에서 플락 크기와 관련하여 두가지 바이러스를 추가로 비교하였다. 단층이 아직 어리고 너무 자라지 않도록 특별한 주의를 기울였는데, 이는, 이러한 변수가 플락 크기에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 메틸셀룰로스 하, 37℃에서 7일간 배양한 후, 단층을 메탄올로 고정시키고 사진을 찍었다. 그 결과 플락 크기가 크게 다른 것으로 나타났다. 각 바이러스에 대해 30개의 플락를 측정한 결과 D46/6368 바이러스의 플락들은 D46 바이러스의 그것에 비해 평균 70% 더 큰 것으로 나타났다.
D46과 D46/6368 바이러스의 복제 효과를 비교하기 위해, 상이한 종과 상이한 조직 기원을 나타내는 8개의 상이한 세포주에 대한 성장 곡선 분석을 얻기 위해 추가로 실험을 수행하였다 (표 42). 각각의 세포 종류의 삼중 단층으로 어느 한 바이러스를 감염시키고, 샘플을 12시간 또는 24시간 간격으로 취하여, 플락 분석 및 항체 염색에 의해 정량하였다. 놀랍게도, D46/6368 바이러스는 세가지 세포주, 즉 HEp-2, 293 및 AGMK-21 세포에 있어서 D46 야생형에 비해 더 높은 농도로 자랐다. HEp-2 세포에 있어서 (도 11), 감염 36시간 경과 후의 자손 D46/6368 바이러스의 농도는 D 46 바이러스에 비해 2.6배 더 높았다. 293 세포 (도 12)에 있어서, D46/6368 바이러스의 수율은 감염 36시간 경과 후 D46 바이러스의 그것보다 2배 더 컸으며, 이러한 차이는 감염 60시간 및 84시간 경과 후 각각 4.8배 및 12.6배로 증가하였다. AGMK-21 세포 (도 13)에 있어서, D46/6368 바이러스의 수율은 감염 36시간 후 3.2배였다. MRC-5, Vero, CV-1, MDBK 및 BT 세포에 있어서, 변이주와 야생형 바이러스에 있어서의 복제상의 유의적인 차이는 관찰되지 않았는데, 이는, SH-마이너스 RSV의 성장이 숙주 범위 효과에 의해 실질적으로 영향을 받지 않았음을 가리키는 것이다.
| 세포 종류 | 숙주 | 조직 종류 | D46과 비교한 D46/6368 바이러스 복제 |
| HEp-2 | 인간 | 후두 | 증가됨 |
| 293 | 인간 | 신장 | 증가됨 |
| MRC-5 | 인간 | 폐 | 유사함 |
| Vero | 원숭이 | 신장 | 유사함 |
| AGMK-21 | 원숭이 | 신장 | 증가됨 |
| CV-1 | 원숭이 | 신장 | 유사함 |
| BT | 소 | 갑개골 | 유사함 |
| MDBK | 소 | 신장 | 유사함 |
이러한 발견 및 기타의 발견은 SH 유전자의 결실에 의해 회수가능한, 감염성 RSV이 생산될 뿐 아니라, 감염성 바이러스와 플락 크기의 수율 두가지 모두에 기초할 때, 조직 배양에서 실질적으로 성장이 증가된 재조합 RSV도 생산가능함을 입증해준다. SH 결실에 의해 특징된 조직 배양에서의 이러한 성장 증가는 예컨대, 배양시 저조한 RSV 수율 문제를 극복하는 등, RSV 백신 개발에 유용한 도구가 된다. 뿐만 아니라, 이러한 결실은 유전적 전환에 대해 고도로 안정하므로, 백신 제제로서 특히 유용한 RSV 클론을 만들 수 있다.
마우스에서 예시적인 SH-결실 클론의 복제, 면역성 및 보호적 효과를 평가하기 위해, 가벼운 메톡시플루란 마취하에, 24마리의 호흡계-병원균이 없는 13주령의 BALB/c 마우스에게 제 0일 야생형 재조합 D46 바이러스, SH-마이너스 재조합 D46/6368 바이러스 또는 생물학적으로 유도된 냉각-계대 (체) 온도-민감성 (ts) 바이러스 ctps248/404 접종물 0.1 ml 중, 동물 당 106PFU로 접종하였다 (Firestone외, 상기문헌, (1996), 본문에 참조됨). 이 후자의 바이러스들은 설치류, 침팬지 및 사람에서 집중적으로 특징화되었으며, 마우스의 상부 및 하부 기도에서 복제가 극히 제한된다. 접종 후 제 4일, 5일, 6일 및 8일 경과시, 각 그룹으로부터 6마리의 마우스를 CO2 질식사시키고, 비개골과 폐 조직을 별도로 채취하고, 균질화시켜 상술한 항체 염색 공정을 이용하여 바이러스의 정량화를 위한 플락 분석에 이용하였다.
상부 기도에 있어서, SH 마이너스 D46/6368 바이러스는 약독화 표현형을 나타내었다 (도 14). 본 실시예에서, 그의 복제 수준은 야생형에 비해 10배 더 낮았으며 cpts248/404 바이러스와는 필적할만하였다. 이와 대조적으로, 하부 기도에 있어서는 9도 15), D46/6368 바이러스의 복제 수준은 야생형의 것과 유사한 반면, cpts248/404바이러스는 매우 제한적이었다. 부가적인 연구에서, 모 D46 cDNA에 의해 코딩된 재조합 바이러스는 전적으로 허용가능한 실험 도물인 나이브한 침팬지의 복제 및 병독성 측면에서 야생형 표현형을 갖는 것으로 결정되었다. 이는, 실험실 균주로부터 조립된 바와 같이, 모 재조합 바이러스가 허용가능한 숙주에 있어서 복제 및 병독성에 필요한 완전한 고유 유전자의 상보성을 함유함을 가리킨다. 예시적인 유전자 결실 RSV 균주의 이러한 특성 및 기타 특성으로 인해 이 방법과 숙주 균주를 백신 용도로 이용할 수 있다.
재조합 RSV의 면역성과 보호적 효과를 추가로 평가하기 위해, 4가지 부가적인 마우스 그룹에게 상기한 바와 같이 야생형 재조합체, 그의 SH-마이너스 유도체 또는 cpts248/404 바이러스를 접종하거나 또는 모조(mock) 감염시켰다. 4주 후, 마우스를 마취시키고, 혈청 샘플을 취하여 동물 당 생물학적으로 유도된 RSV 균주 106 PFU의 공격 접종을 비강내로 투여하였다. 4일 후 동물을 죽여서 비개골과 폐 조직을 채취하여 상술한 바와 같이 감염성 RSV에 대해 분석하였다. RSV F 단백질에 결합하는 혈청 IgG 항체들을 RSV 폐 균주 감염 세포로부터 면역친화-정제시킨 F 당단백질을 이용하여 ELISA로 정량시켰다 (Murphy외, 상기문헌, 1990).
D46 야생형, D46/6368 SH-마이너스 및 cpts248/404 바이러스에 대한 면역성 분석 결과 3가지 바이러스 중 어느 하나로 제 0일 감염된 마우스들은 F-특이적인 혈청 항체를 높은 수준으로 발달시킨 것으로 나타났다 (표 43). 이러한 모든 테스트 숙주들은 RSV 공격 바이러스의 복제에 대해 상부 및 하부 호흠기관 모두에서 고도로 내성을 나타냈다. 따라서, 마우스에 있어서 RSV-특이 혈청 항체와 보호를 유도하는 능력에 기초할 때, SH-마이너스 변이주는 그의 야생형 모균주와 구별할 수 없었다.
상이한 RSV와 상이한 뉴모바이러스의 SH 유전자를 비교함으로써 유용한 RSV 재조합 백신을 생산하기 위한 부가적인 도구와 방법이 제공된다. 예컨대, 2가지 항원 서브그룹인 A와 B는 어떤 SH 영역에서 비교적 높은 보존도를 나타낸다. 이러한 두가지 영역에서, RSV A 및 B의 N-말단 영역과 잠정적인 막-스패닝 영역은 아미노산 수준에서 84%의 상동성을 나타내는 반면, C-말단의 잠정적인 엑토도메인은 보다 다양하다 (약 50% 상동성) (Collins 외, 상기문헌, 1990). 2가지 사람의 RSV 서브그룹 B 균주인 8/60과 18537의 SH 유전자의 비교 결과 단일의 아미노산 차이만이 확인되었다 (Anderson 외, 상기문헌). 사람 대 소의 RSV의 SH 단백질은 대략 40% 동일하고, (i) 상기한 것과 유사한 보존 잔기의 비대칭 분포; (ii) 매우 유사한 소수성 프로필; (iii) 2개의 N-결합 글리코실화 부위 존재. 이때, 각 부위는 소수성 영역의 각 면에 존재함; 및 (iv) 각각의 SH 단백질의 중앙 소수성 영역의 카르복시터미날 면 상의 단일 시스테인 잔기 (Anderson 외 상기문헌)를 비롯한 구조적으로 중요한 특징들을 공유한다. 이들 및 기타의 서열 유사성과 차이점을 평가함으로써 예컨대 다중 특이적 면역 효과를 갖는 백신을 생산하기 위해, 감염성 RSV 클론 내에서 치환 또는 삽입될 수 있는 이질성 서열(들)로 선택할 수 있다.
D46 및 D46/6368에 대한 전사 번역 결과 본 실시예에서 다른 중요한 점이 발견되었다. 전체적인 전사 수준은 양 바이러스에서 실질적으로 동일한 반면, 노던 블롯 분석결과 개별적인 mRNA 종의 축적에는 어떤 차이가 있는 것으로 나타났다. 주목할 만한 것은, SH 유전자의 상류에 위치하는 M 유전자의 전사가 2 바이러스에 있어서 실질적으로 동일하였다는 것이다. 그러나, SH 유전자의 결실은 그의 하류에 인접한 G 유전자에 대한 전사를 증가시켰다 (도 16). 이러한 결과에 기초해서, 선택된 RSV 유전자의 전사 수준은 RSV 맵 상의 유전자의 각각의 극성 또는 인접성을 변경시킴으로써 쉽게 변형시킬 수 있다. 예컨대, D46 바이러스 G 유전자는 유전자 순서로 7번째인 반면, SH 유전자가 결실되면 6번째 위치가 되어, 전사 수준의 증가가 초래되는 것이다. 이러한 유전자 순서의 변경과 관련한 전사의 증가는 다른 재조합 바이러스 시스템에서 보고된 2.5배 내지 3배 증가보다는 적었다 (예컨대 Kuo 외, 상기문헌 (1996)).
전술한 연구에서 밝혀진 또 다른 중요한 발견은 G 유전자의 하류의 각 유전자 (M, M2 및 L)가 SH-마이너스 유전자에서 덜 효과적으로 발현되었고, D46/6368 대 이러한 하류의 유전자에 의해 발휘되는 야생형 D46 바이러스에 있어서 보다 가파른 극성 구배가 있었다는 것이다 (도 16). SH 결실 좌측의 D46/6368의 조작된 M-G 유전자간 영역의 길이가 65 nt임은 주목할만하다. 이와 대조적으로, 균주 A2에서 가장 긴 자연발생적인 유전자간 영역은 44-nt M-SH, 46-nt F-M2, 및 52-nt G-F 유전자간 영역이고, 균주 18537은 56 nt의 F-M2 유전자간 영역을 갖는다 (Johnson 외, J. Gen. Virol. 69:2901-2906 (1988), 본문에 참조됨). 크기가 1 내지 52 nt에 달하는, 균주 A2의 자연발생적인 유전자간 영역은 전사 통독에 미치는 그의 효과와 2 시트트론의 미니게놈의 극성 측면에서 실질적으로 다르지 않았다 (Kuo 외, 상기문헌 (1996)). 그러나, 본 발명의 방법에 따른 52-nt G-F 영역보다 긴 영역을 테스트함으로써 상한선을 수립할 수 있고, 그 후 폴리머라제가 보다 심하게 영향받는다. 따라서, SH-마이너스 결실 클론에서 관찰되는 유전자 순서의 변경에 기인한 G 유전자 전사의 예상보다 낮은 증가와, 하류 유전자의 감소된 전사는 M과 G 사이에서 엔지니어링된 유전자간 영역의 길이가 더 길다는데 기인한 것일 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서 RSV 클론의 유전자간 영역의 선택된 길이를 조절하면 유용한 RSV 백신을 생산할 수 있는 부가적인 도구와 방법이 제공될 수 있을 것으로 기대된다.
상술한 발견은 RSV 유전자 발현 수준을 변경시키기 위한 2가지 부가적인 방법을 제공한다. 먼저, 비필수 유전자의 결실은 하류 유전자의 발현을 상향-조절할 수 있다. 둘째, 야생형 유전자간 영역보다 긴 영역을 삽입하면 하류 유전자의 전사를 감소시킬 수 있는 방법이 제공된다. 하류 유전자의 발현 수준의 감소는 예컨대 침팬지와 사람과 같이 허용된 숙주에서 재조합 RSV의 약독화 표현형을 특정할 수 있을 것으로 기대된다.
SH-마이너스 바이러스가 조직 배양에서 잘 성장하고 상부 기도에서 위치-특이적 약독화를 발휘한다는 발견은 백신 개발에 있어서 새로운 장점을 제공한다. 살아있는 바이러스 백신과 같이 현재 평가중인 RSV 균주는 예컨대 cp 변이를 함유한다 (점차 저온에서 집중적으로 계대시 획득됨; cpRSV 균주를 생산하기 위함). 예시적인 cp 변이에는 N, F 및 L에서의 5개 아미노산의 치환이 포함되며, 온도-민감성 또는 냉-적응에 기여하지 않는다. 이러한 변이는 또한 조직 배양시의 성장에 유의적인 영향을 미치지 않는다. 이들은 숙주 범위의 변이인데, 이는 이들이 침팬지와 사람의 기도의 복제를 하부 기도의 경우에 비해 약 100배 정도 제한시키기 때문이다. 또 다른 예시적인 변이 유형은 ts 변이로서, 이것은 cpRSV의 화학적 변이에 의해 획득되었다. 이러한 변이 유형은 상부 기도으로부터 하부 기도으로 갈수록 증가하는 체온 구배로 인해, 하부 기도에서 바이러스 복제를 우선적으로 제한시키는 경향이 있다. 이들 cp 및 ts 변이와 대조적으로, 본문에서 설명된 SH-마이너스 변이는 상부 기도에서 보다 큰 제한 표현형을 갖는다. 주로 코를 통해 호흡하는 매우 어린 유아 그룹에 있어서, 안전한 백신 투여를 보장하기 위해서는 상부 호흡 기관의 복제 제한이 요구되기 때문에, 유아용으로 사용될 백신 바이러스에 있어서는 이러한 점이 특히 요구된다. 또한, 모든 연령층에서, 상부 기도의 복제가 감소되면 이염 중막으로부터의 질병률이 감소될 것이다. 이러한 장점에 더해, 예컨대 약 400 nt 및 전체 mRNA의 제거를 비롯한 SH 결실 변이의 특성은 복귀하기가 매우 어려운 변이 유형을 나타낸다.
실시예 XIV
이종 서열의 도입 없이
SH
유전자의 결실을 갖는 재조합
RSV
이 실시예는 전술한 실시예 XIII에서 수행한 바와 같은 이종 서열의 도입 없이, 노 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제거함으로써, SH 단백질 발현이 제거된 재조합 RSV의 생산을 설명해준다. 상기 실시예에서는, SH 코딩 서열이 제거된 RSV 클론 D46/6368은 최장의 자연발생적인 균주 A2 유전자간 영역의 경우 52 뉴클레오타이드에 비해 65 뉴클레오타이드만큼 연장된 M-G 유전자간 영역도 특색을 이룬다. 또한, 이렇게 재조합된 유전자간 영역은 SmaI 부위를 비롯하여 이종의 서열을 함유하였다. 이러한 변경은 다운스트림 유전자의 전사 효율 감소와 같은, 특정의 이로운 결과를 나타내었다. 그러나, 다른 응용에 있어서는, 본 실시예에서 설명되는 것과 같이, 이종 서열의 도입이 수반되지 않는 결실 또는 변경을 만드는 것이 바람직하다 (도 17).
본문에 설명된 (실시예 VII 참조) D13 플라스미드는 리더 영역을 둘러싼 게놈의 왼쪽 말단에 부착된 T7 프로모터와 NS1, NS2, N, P, M 및 SH 유전자를 함유한다 (완전한 15,223 안티게놈 서열에서 서열 위치 1 내지 4623). ScaI (위치 4189) 내지 PacI (위치 4623) 단편을 부분적으로-상보적인 2개의 합성 뉴클레오타이드인 ACTCAAATAAGTTA AT [서열 7] ((+)-센스 사슬, ScaI 절반 위치는 왼쪽으로 이탤릭체로 표시되고 PacI 접착성 말단는 오른쪽으로 이탤릭체로 표시되었으며, GE 시그날 부분은 밑줄그었음)과 TAACTTATTTGAGT [서열 8] ((-) 센스, ScaI 절반 위치는 오른쪽을 이탤릭체로 표시하고, GE 시그날 부분은 밑줄침)로 치환시켰다. 이 변이에 의해, M GE 신호, M-SH 유전자간 영역과 완전한 SH 유전자가 결실되었고 M 유전자의 그것을 대체하기 위한 SH GE 시그날의 이동 효과가 나타낫다. 이종의 뉴클레오타이드는 도입되지 않았다. D13/6340이라 칭해지는 결과적인 cDNA를 G-F-M2 cDNA편과 접합시켜 (실시예 VII) 리더 영역으로부터 L 유전자의 개시부까지 뻗어있는 D50/6340을 생산하였다.
D50/6340의 StuI-BamHI 단편 (위치 5613 내지 8501에 걸침, F 및 M2 유전자를 포함함)을 절단하여 상술한 F 유전자에 대해 2개의 "HEK" 변경을 함유하는 것을 제외하고 이소제닉(isogenic)한 D50-COR#1의 동등한 단편으로 대체하였다. 얻어진 D50/6340HEK를 플랭킹 리보자임과 T7 전사 종료인자를 둘러싼 안티게놈 cDNA의 나머지를 함유하는 D39sites#12의 BamHI-MluI 단편을 받아들이는데 사용하였다 (실시예 IX 참조). D39 sites#12는 "위치" 변이를 함유하는 D39의 한 버전이다 (표 39 참조). 이로부터 SH 유전자를 결여하는 안티게놈을 코딩하고 "HEK" 및 "위치" 변경을 함유하는 플라스미드 D46/6340HEK가 얻어졌다. D46/6340 안티게놈 cDNA는 그의 모 D46 cDNA보다 417 bp만큼 더 짧았다. 디데옥시뉴클레오타이드 서열결정에 의해 ScaI PacI 합성 삽입물의 서열을 확인하였다. 이어서 cDNA를 이용하여 상기한 공정에 의한 재조합 바이러스를 성공정으로 회수하였다. 회수된 D46/6340 SH 결실 바이러스는 그의 플라크 표현형과 성장 특성 측면에서, 실시예 XIII에 설명된 D46/6368 SH 결실 바이러스와 유사하였다.
실시예 XV
NS2
단백질 발현의 녹아웃
이 실시예은 RSV 단백질, NS2의 합성을 제거하는 것을 설명하는 것이다. 이 예에서 제거를 위해서 선택된 방법은 종료 코돈은 번역 ORF에 도입하는 것이다.
D13은 완전한 안티게놈 cDNA의 왼쪽말단을 나타내는 cDNA이며, 이는 T7 프로모터, 리더영역 및 NS1, NS2, N, P, M 및 SH유전자(서열 위치 1내지 4623)을 포함한다(도 18). 이 cDNA의 AatII-aflII단편은 T7 프로모터 및 NS1 및 NS2 유전자를 포함하는 것으로서 pGem 벡터에 서브클로닝하고 올리고-뉴클레오타이드-특이적 돌연변이를 야기하여, 표시자로서 작용하며 번역단계에서 번역되지 않는 XhoI부위와 함께 두 번역 종료코돈을 NS2 ORF에 도입한다(도 18). 돌연변이의 서열을 확인하였고, AatII-AflII 단편을 D13에 도입시킨후, G, F, 및 M2유전자를 포함하는 PacI-BamHI단편으로 접합함으로써, 삽입된 돌연변이를 포함하는 cDNA D50을 제조한다. 그 다음 이것을 D39 삽입체와 접합하여 재조합 바이러스를 회수하는데 사용되는 완전한 안티게놈 cDNA을 제조한다. RT-PCR 산물의 서열동정 및 XhoI분해에 의해서 재조합 RSV에서 돌연변이의 존재를 확인하였다. 추가로, NS2의 C말단을 나타내는 합성 펩타이드에 대한 토끼 항혈청을 사용하여 웨스턴 블랏 분석법을 사용함으로써 NS2단백질이 합성되지 않음을 학인하였다.
도 19는 상기에서 SH-(-) 바이러스에 대해 설명한 방법으로 재조합 야생형과 NS2 -녹아웃 바이러스를 비교한 성장곡선을 나타낸다. 이들 결과에 의하면, 감염성 바이러스 방출 속도는 야생형에 비해 NS2 -녹아웃 바이러스에 대해서 감소하였다. 추가로, 돌연변이와 야생형 바이러스의 플락을 비교해 보면 NS2 -녹아웃 바이러스의 플락은 크기가 크게 감소하였음을 알 수 있다. 따라서, 이런 유형의 돌연변이를 살아있는 재조합 RSV내에 포함시켜 변형된 표현형을 제조할수 있으며, 이런 경우에 생체외에서 바이러스 성장율과 플락 크기가 감소했다. 따라서, 생체외 플락크기의 감소와 생체내 약독화사이에 알려진 상호관계에 근거하여, 이들 및 다른 녹아웃 방법 및 돌연변이는 추가적인 재조합 RSV 백신제를 제공할 것이다.
실시예 XVI
Cis
-작용
조절서열인자의
변화에 의한
RSV
표현형의
변화야기
이 실시예는 통상적인 유전자, NS1 및 NS2의 cis-작용 전사 신호를 변화시킴으로써 재조합 RSV 바이러스의 성장 특성을 변화시키는 것을 예시한다.
D13의 서브클론닝된 AatII-AflII 단편은 게놈의 왼쪽 말단을 나타내며, 올리고뉴크레오타이드-특이적 돌연변이를 야기시켜 NS1 및 NS2 유전자의 GE신호에서 변화를 도입하였다(도 20). NS1 GE신호는 하나의 뉴클레오타이드 치환을 보유하고 있으며, NS2 GE신호는 3개의 치환과 1개 삽입을 보유하고 있다. 이러한 변화는 각 신호를 자연발생적 N유전자의 GE신호와 동일하게 변화시키는 효과를 가졌다.
디데옥시뉴클레오타이드 서열 분석법에 의해서 이들 돌연변이를 확인하였고, AatII-AflII 단편을 D13으로 치환하였으며, 여기서 순서대로 상기한 단계를 거쳐 상기 돌연변이를 포함하는 완전한 D53 DNA을 제조했다. 재조합 바이러스를 회수한는데 이 클론을 사용하였다.
HEp-2세포에서 GE-돌연변이 바이러스를 분석하였고, 플락크기와 성장곡선면에서 야생형과 비교하였다. 이러한 결과로 플락은 야생형보다 더 컸으며(평균 30%이상), 성장속도 및 바이러스 수율도 증가하였다. 이러한 결과는 cis-조절인자의 변형에 의한 유전자 발현의 변화와도 일치했으며, 예를 들면, mRNA의 통독수준이 감소하여 하류에 존재하는 유전자의 단백질 발현이 증가함 등이다. 결과적인 재조합 바이러스는 바람직하게도 성장속도가 증가하고 플락 크기가 증가하며, 단지 cis-작용 조절인자을 변화시킴으로써 RSV 표현형이 변화된 일례을 제공했다. 이러한 실시예와 본명세서의 다른 실시예는 효과적인 백신제를 제공하기에 유리한 표현형적 변화에 특이적인 광범위한 RSV 돌연변이를 설명하고 있다.
실시예 XVII
NS1
유전자가 결실된 재조합
RSV
이 실시예는 NS1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제거함으로써 NS1 단백질의 발현이 제거된 재조합 RSV를 제공하는 것에 관한 것을 설명한다. 상기 NS1 단백질은 작은 139 아미노산으로 이루어지며 3' 에서 5' RSV 유전자 지도에서 첫 번째 유전자에 의해서 코딩된다(Collins and Wertz, Proc. Natl. Sci. USA 80:3208-3212 (1983) ; Collins and Wertz, Virol. 243:442-451 (1985)). 그의 mRNA는 RSV mRNA중 가장 풍부하며, 이는 유전자 발현효율이 3'말단의 프로모터로부터 거리가 증가함에 따라 감소한다는 일반적인 발견과 일치한다. 비록 주의 깊은 양적 비교가 남아 있을 지라도, NS1 단백질은 가장 많이 발현되는 RSV 단백질중 하나라고 여겨진다. 그의 풍부함에도 불구하고, NS1 단백질의 기능은 명백히 밝혀지지 않았다. 재구성된 RSV 미니게놈 시스템에서(Grosfeld et al., J. Viro. 69:5677-5686 (1995)), 미니게놈의 전사 및 RNA 복제는 플라스미드가 공급하는 바이러스 단백질에 의해 공급되며, 상기 NS1단백질은 전사 및 RNA 복제에 있어서 음성적 조절인자인 것같다. 따라서, 그것은 조절 단백질일 것이다. 확인되지 않은 다른 기능도 있을 가능성이 높다. 상기 NS1단백질은 다른 파라믹소바이러스에서 알려진 대응부를 갖지 않는다. 이론에 얽매이지 않고서, NS1단백질의 몇몇 기능은 다음과 같을 수 있다: (1) 상기에서 언급한 바와 같이 바이러스 조절인자, (2) 바이러스 성장 주기에서의 몇몇 다른 측면, (3) 숙주세포와 상호작용, 및 (4) 숙주 면역시스템과 상호작용, 예를 들면 인터페론 생산, 항원가공, 또는 B나 T세퐁의 기능과 같은 숙주 방어 시스템의 저해. NS1의 이러한 모든 잠재적인 활성은 RSV 재조합 백신에서 추가적인 장점을 만들 수 있다.
NS1 유전자 기능이 선택적으로 파괴된 재조합 RSV를 제조하기 위해서, NS1을 코딩하는 서열을 모 RSV cDNA에서 완전한 형태로 제거하였다. 이러한 일반적인 결실에서, 돌연변이반응의 대상은 이하에서 설명할 플라스미드 D13이며, 이 플라스미드는 완전한 안티게놈 cDNA의 왼쪽 말단으로서 T7 RNA 폴리머라제, 리더영역, 및 NS1, NS2, N, P, M 및 SH유전자(서열 위치 1에서 4623)를 포함한다. 원하는 변형을 지닌 합성 프라이머를 플라스미드상에서 반대방향으로 맞춘 후에 PCR로 증폭하고 접합하여 박테리아에 형질전환시키는 방법인 Byrappa et al.(Byrappa et al., Genome Res. 5:404-407 (1995))방법에 의해 돌연변이를 야기했다. 제공된 PCR 프라이머는 GACACAACCCACAATGATAATACACCAC[서열 ID NO:9](NS2 ORF의 두 번째 코돈이 이탤리체로 기재됨) 이었고, 역PCR 프라이머는 CATCTCTAACCAAGGGAGTTAAATTTAAGTGG[서열 ID NO:10](NS2의 첫 번째 코돈에 상보적인 서열이 이탤릭체로 기재됨)이었다. 고-충실성 폴리머라제을 사용한 PCR방법의 주형으로서 D13을 사용하였다. NS1 ORF의 AUG개시부위의 바로 상류에서 부터 NS1 ORF의 AUG개시부위의 바로 상류까지 결실시켰다(도 21). 이 결과로 NS1 코딩서열 및 NS2 GE신호, NS1-NS2유전자간 영역, 및 NS2 GS신호을 포함하는 529 bp이 결실되었다. NS1 유전자의 상류 말단, 즉 NS1의 GS과 비단백질 코딩영역에서 NS2 ORF이 융합된 효과를 가진다. NS1유전자의 이 부분은 리더영역 바로 옆에 위치하기에 이 부분의 서열은 명백히 유지되며, 따라서 RNA 복제와 전사에 중요한 서열을 포함하였다. 돌연변이를 포함하는 영역을 서열분석법으로 확인하였다. 그런 후에, Aat2와 avr2부위사이의 ~2230bp 단편(도 21)을 잘라내어 새로운 D13 사본에 삽입하였으며, 이는 RSV cDNA상의 다른 부위에서 PCR 실수의 가능성을 전조가 되는 한단계이다. NS1 (D13△NS1)이 결실된 D13 플라스미드를 사용하여 "HEK" 및 "부위들"변화를 포함하는 완전한 안티게놈(D53△NS1)을 제조하였다.
그 다음, D53△NS1 플라스미드를 사용하여 바이러스를 회수하였다. 흥미롭게도, 회수된 RSV△NS1 바이러스는 조직배양에서 작은 플락을 형성하였다. RT-PCR로 결실의 존재를 확인하였다. RSV△NS1 바이러스는 감소된 효율이기는 하나 성장할 수 있다는 사실로 인해 NS1 단백질을 바이러스 성장에 필수적이지 않는 보조단백질로 확인하였다.RSV△NS1 바이러스의 플락 크기는 번역 종료 코돈을 그 코딩서열내로 도입함으로써 NS2 단백질의 발현이 제거된 상기의 NS2-녹아웃 바이러스의 것(실시예 15)과 비슷하다. 작은 플락 표현형은 통상적으로 약독화 돌연변이와 관련된다. 따라서, 이런 유형의 돌연변이를 살아있는 재조합 RSV로 도입함으로써 변형된 표현형을 제조할 수 있다. 따라서, 생체외 플락크기와 생체내 약독화간의 알려진 관계에 근거하여, 이들 및 다른 녹아웃 방법 및 돌연변이는 여전히 추가의 재조합 RSV 백신제을 제공할 것이다.
실시예 XVIII
NS2
유전자가 결실된 재조합
RSV
이 실시예는 NS2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제거함으로써 NS2 단백질의 발현이 제거된 재조합 RSV의 제조을 설명한다. 실시예15에서, 코딩서열을 결실시키기보다는 두 번역종료코돈을 그의 코딩서열에 도입시킴으로써 NS2의발현을 게거함으로써 재조합 RSV(NS2 녹아웃 또는 NS2-KO라고 불리움)을 생산했다. 표현형 NS2-KO에서 NS2 단백질의 발현 제거는 생체외에서 작은 플락 표현형 및 감소된 바이러스 성장속도와 관련된다. 후속적인 분석에 의하면, NS2-KO를 처리하자마자, 야생형 성장특성으로 바이러스가 낮은 수준으로 복귀할 수 있다는 것을 나타낸다. 후속적인 분석에 의하면, 비록 모 야생형 바이러스와 코돈할당이 다를지라도 도입된 두 번역 종료코돈을 돌연변이시켜 센스코돈으로 만들었음을 나타낸다. 이것은 웨스턴 블랏 분석에 의해서 확인된 바와 같이 NS2 단백질의 합성을 회복시키는데 중요하며, 이는 야생형 표현형에 의해서 설명된다. 완전한 NS2 유전자를 제거하기에 같은 부위 복귀가 일어날 수 없으므로 현재의 방법은 장점을 제공한다.
NS2 단백질은 작은 124 아미노산 단백질이며, 이는 유전자 순서에서 두 번째 유전자에 의해서 코딩된다(Collins and Wertz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3208-3212 (1983); Collins and Wertz, Virol. 243:442-451 (1985)). NS2 mRNA는 RSV mRNA중 두 번째로 많으며, NS2단백질은 주의 깊은 양비교가 남아있을 지라도 가장 풍부하게 발현되는 RSV 단백질중 하나라고 여겨진다. 그의 풍부한 양에도 불구하고, NS2 단백질의 기능은 여전히 밝혀지지 않았다. RNA 복제와 전사가 플라스미드에 의해서 공급되는 바이러스 단백질로 유도되는 재구성된 RSV 미니게놈 시스템()에서 NS2 단백질은 RNA 복제와 전사 모두에서 적당한 부정적인 조절효과를 가졌다. 상대적으로 높은 수준의 NS2 단백질의 발현이 이러한 효과를 유지하기에 필요하며, 그래서 그의 중요성을 명백하지 않다. 따라서, NS1 단백질에서 제안된 바와 같이, NS2는 다음 기능을 할 것이다:(1) 상기에서 언급한 바와 같이 바이러스 조절인자, (2) 바이러스 성장 주기에서의 몇몇 다른 측면, (3) 숙주세포와 상호작용, 및 (4) 숙주 면역시스템과 상화작용, 예를 들면 인터페론 생산, 항원가공, 또는 B나 T세포의 기능과 같은 숙주 방어 시스템의 저해. NS2의 이러한 모든 잠재적인 활성은 명세서에 기재된 방법 및 기술에 따라 본 발명에 포함되어 RSV 재조합 백신에서 추가적인 장점을 만들 수 있다.
NS2 유전자 기능이 선택적으로 파괴된 재조합 RSV를 제조하기 위해서, mRNA를 코딩하는 서열을 모 RSV cDNA에서 제거하였다. 이러한 일반적인 결실에서, 돌연변이반응의 대상은 이하에서 설명할 플라스미드 D13이며, 이 플라스미드는 완전한 안티게놈 cDNA의 왼쪽 말단으로서 T7 RNA 폴리머라제, 리더영역, 및 NS1, NS2, N, P, M 및 SH유전자(서열 위치 1에서 4623)를 포함한다. 원하는 변형을 지닌 합성 프라이머를 플라스미드상에서 반대방향으로 맞춘 후에 PCR로 증폭하고 접합하여 박테리아에 형질전환시키는 방법인 Byrappa et al.(Byrappa et al., Genome Res. 5:404-407 (1995))방법에 의해 돌연변이를 야기했다. 제공된 PCR프라이머는 TTAAGGAGAGATATAAGATAGAAGATG[서열 ID NO:10](NS2 N 유전자간 영역에서 부터 밑줄이 그어져 있고, N GS신호의 첫 번째 뉴클레오타이드는 이탤릭체로 표시하였다) 이었고, 역PCR 프라이머는 GTTTTATATTAACTAATGGTGTTAGTG[서열 ID NO:11](NS1 GE 신호의 첫 번째 코돈에 상보적인 서열에 밑줄이 그어짐)이었다. 고-충실성 폴리머라제을 사용한 PCR방법의 주형으로서 D13을 사용하였다. NS1 GE의 바로 상류에서 부터 NS1 GS 신호위의 바로 상류까지 결실시켰다(도 22). 이 결과로 NS1-NS2유전자간 영역, 및 완전한 NS2유전자를 포함하는 522 bp이 결실되었다(도 22).
결실을 포함하는 D13플라스미드에서, 돌연변이 영역을 서열분석법으로 확인하였다. 그런후에, Aat2와 avr2부위사이의 ~2230bp 단편(도 22)을 잘라내어 새로운 D13 사본에 삽입하였으며, 이는 RSV cDNA상의 다른 부위에서 PCR 실수의 가능성을 전조가되는 한 단계이다. NS2 (D13△NS2)이 결실된 D13 플라스미드를 사용하여 "HEK" 및 "부위들"변화를 포함하는 완전한 안티게놈(D53△NS2)을 제조하였다.
그 다음, D53△NS2 플라스미드를 사용하여 바이러스를 회수하였다. NS2-KO 바이러스에 대해 상기에서 설명한 바와 같이(실시예 15 참조), RSV△NS2는 작은 플락을 형성하였다. RT-PCR로 결실의 존재를 확인하였다. RSV△NS2 바이러스는 감소된 효율이기는 하나 성장할 수 있다는 사실로 인해 NS2 단백질을 바이러스 성장에 필수적이지 않는 보조단백질로 확인하였다. RSV△NS2 바이러스의 플락 크기는 번역 종료 코돈을 그 코딩서열내로 도입함으로써 NS2 단백질의 발현이 제거된 상기의 NS2-녹아웃 바이러스의 것(실시예 15)과 비슷하다. 작은 플락 표현형은 통상적으로 약독화 돌연변이와 관련된다. 따라서, 이런 유형의 돌연변이를 살아있는 재조합 RSV로 도입함으로써 변형된 표현형을 제조할 수 있다. 따라서, 생체외 플락크기와 생체내 약독화간의 알려진 관계에 근거하여, 이들 및 다른 녹아웃 방법 및 돌연변이는 여전히 추가의 재조합 RSV 백신제을 제공할 것이다.
실시예 XIX
분비형 G 당단백질에 대한 번역 개시부위의 제거
이 실시예는 분비형 G 단백질의 번역 개시 부위가 제거된 재조합 RSV의 제조를 설명한다. RSV G단백질은 두가지 형태로 합성된다: 고정된 유형II 완전한 막단백질로서 및 막고정에 필수적인 부분이 없는 N말단이 결실된 형태이다(Hendricks et al., J. Virol. 62:2228-2233 (1988)). 상기 두가지 형태는 두가지 다은 개시부위에서 버녁 개시을 함으로써 유도됨을 나타낸다: 더 긴 형태는 G ORF의 첫 번째 AUG에서 개시되고, 두 번째 것은 48 코돈에 위치한 AUG에서 개시하여 추가로 단백질 분해에 의해서 가공된다(Roberts et al., J. Virol. 68: 4538-4546 (1994)). 이러한 두 번째 개시부위의 존재를 매우 보존적이며, 사람, 소 및 양 RSV등 모든 균주에 존재하며, 오늘날까지 이어지고 있다. 분비형 G단백질은 무력화 항체를 잡는 유인물로 작용하여 숙주 면역을 완화시킬수 있다. 또한 분비형 G단백질은 순서로 후속적인 RSV의 노출에 대한 면역성인 Th-2에 치우친 반응의 우선적인 자극에 관련된다. RSV 백신바이러스에 관하여, 항체포획과 면역시스템의 불균형적인 자극을 최소하에 매우 바람직기에, 분비형 G단백질을 제거하는 것이 매우 바람직하다. 이것은 일유형의 돌연변이의 작용이 직접적으로 바이러스를 약독화시키기 보다는 질적으로 및/또는 양적으로 숙주 면역 반응을 변화시킬 것이라는 것을 나타낸다.
G, F 및 M2 유전자을 포함하는 플라스미드 pUC19를 (실시예 12 참조) Byrappa et al의 방법에 의한 PCR돌연변이(Byrappa et al., Genome Res. 5:404-407 (1995))에서 주형으로 사용하였다. 사용된 PCR 프라이머는 다음과 같다: TTATAATTGCAGCCATCATATTCATAGCCTCGG[서열 ID NO: 13]과, 역 프라이머는 다음과 같다: GTGAAGTTGAGATTACAATTGCCAGAATGG[서열 ID NO: 14](두 뉴클레오타이드 변화의 상보적인 서열은 밑줄을 그음). 이 결과로 코딩 서열에서 두 아미노산이 변화하였으며(도 24), 즉 AUG-48에서 AUU-48로 변화되어 번역개시부위가 제거되었고, AUA-49에서 GUA-49로 변화되어 돌연변이의 모니터링을 위한 MfeI 부위의 삽입에 기여하였다.
디데옥시뉴클레오타이드 서열동정으로 돌연변이 부위를 둘러싼 서열을 확인하였다. 그런 후에, G 유전자를 포함하는 PacI-StuI 단편을 플라스미드 50으로 치환시켰으며, 이는 사기 명세서에서 설명되어 있으며 리더에서부터 L유전자의 개시까지 처음 9개 유전자를 함유한다. 그런 후에 바이러스를 회수하기 위해서 이것을 사용하였다. 이러한 돌연변이가 재조합 백신 바이러스에 의해서 G cDNA가 다른 RSV 유전자로부터 독립적으로 발현되는 조건하에서 분비형 G의 발현을 제거한다는 것이 이전에 제시하였다(Roberts et al., J. Virol. 68:4538-4546 (1994)).
최수된 D53/M48I의 두 분리체를 야생형 재조합 RSV에 비교하여 생체외에서 성장속도에 관하여 평가하였다(도 24). 이것에 의하면, 두 바이러스 모두 약간 천천히 자라며, 야생형보다 약간 농도가 감소하였다. 성장면에서의 이러한 차이는 이 실시예에서 막결합형의 AUG-1은 그 발현증가를 위해서 변화시키지 않은 반면에 분비형 G단백질의 AUG-48의 제거로 예상되는 발현감소 때문이다. 사실상, G ORF의 AUG-1와 중복되는 또다른 짧은 ORF상세서 다른 AUG가 G서열에 앞에 위치하여 G단백질의 발현을 감소시키기 될 것이기 때문에 G ORF의 AUG-1의 발현은 최적이하(suboptimal)이다. 이 ORF를 제거하는 안티게놈 cDNA의 추가적인 변형이 완전한 성장특성을 회복시킬 것으로 예상될 수도 있다. 혹은, 48 및 49위치에서 돌연변이는 단독으로나 함께 작용하여 G단백질이 기능에 유해할 것이다. 49위치에서의 아미노산은 그의 천연의 코딩 배열을 회복할 것이고, 다른 아마노산 치환이 48위치에서 선택되어 완전한 성장 특성을 회복할 것이다. 본 명세서에서 설명하고 있는 방법 및 물질로서 이러한 가능성을 용이하게 평가할 수 있다. 그럼에도 불구하고, D53/GM48I바이러스의 회수에 의하면 분비형에 대한 번역개시부위을 제거할 수 있으며, 이 바이러스는 현재 실험동물 및 사람에서 평가하는 데 이용할 수 있을 것이다.
비록 앞에 기술한 발명을 명확한 이해를 위해서 예 및 실시예로서 상세히 설명했을 지라도, 다음의 청구범위내에서 어떤 변화나 변형을 가할 수 있음은 명백할 것이다.
서열 목록
(1) 일반적 정보:
(i) 출원인:
(A) 명칭: 더 가번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠
(B) 가: 박스 오티티
(C) 시: 베데스타
(D) 주: 매릴랜드
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호 (ZIP): 20892
(G) 전화:
(H) 팩스:
(I) 텔렉스:
(ii) 발명의 명칭: 클로닝된 뉴클레오타이드 서열로부터의 약독화된 호흡기 세포 융합 바이러스의 생산
(iii) 서열 수: 14
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 종류: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 구동 시스템:PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(v) 현재 출원 데이터:
(A) 출원번호: US
(B) 출원일: 1997. 7. 15.
(C) 분류:
(vi) 우선권 출원 데이터:
(A) 출원번호: US 60/021,773
(B) 출원일: 1996. 7. 15.
(vii) 대리인 정보:
(A) 성명: 파밀리, 스티븐 더블유.
(B) 등록번호: 31,900
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(viii) 원격통신 정보:
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(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 15223 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 사슬 종류: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 종류: cDNA
(xi) 서열 설명: 서열 1:
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 15225 염기쌍
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(C) 사슬 종류: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 종류: cDNA
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(i) 서열 특징:
(A) 길이: 33 염기쌍
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(ii) 분자 종류: cDNA
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(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
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(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
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(2) 서열 8에 대한 정보:
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(i) 서열 특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
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(ii) 분자 종류: cDNA
(xi) 서열 설명: 서열 11:
(2) 서열 12에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 종류: 핵산
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(D) 형태: 선형
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(2) 서열 13에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 사슬 종류: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 종류: cDNA
(xi) 서열 설명: 서열 13:
(2) 서열 14에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 사슬 종류: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 종류: cDNA
(xi) 서열 설명: 서열 14:
상기 참조.
Claims (9)
- 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈, 주요 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰 폴리머라제 단백질 (L) 및 RNA 폴리머라제 연장 인자를 함유하고, 한 RSV 서브그룹의 면역원성 에피토프 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자 단편이 상기 RSV 서브그룹과 상이한 RSV 서브그룹의 재조합 게놈 또는 안티게놈에 병합되어 있는 것을 특징으로 하는, 분리된 감염성 재조합 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV).
- 제1항에 있어서, 성장 특성의 변화, 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성, 작은 플락 크기, 숙주 범위 제한 또는 면역성의 변화 중에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 뉴클레오타이드 변형을 추가로 포함하는 것이 특징인 감염성 재조합 RSV.
- 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈, 주요 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰(L) 폴리머라제 단백질, 및 RNA 폴리머라제 연장 인자를 포함하고, 한 RSV 서브그룹의 면역원성 에피토프 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자 단편이 상기 RSV 서브그룹과 상이한 RSV 서브그룹의 재조합 게놈 또는 안티게놈 내에 병합되어 있고, 상기 게놈 또는 안티게놈은 SH[small hydrophobic(작은 소수성)] 유전자, NS1[nonstructural protein(비구조성 단백질) 1] 유전자, NS2[nonstructural protein(비구조성 단백질) 2] 유전자 또는 G 단백질(부착 단백 질) 코딩 유전자나 cis-작용 조절 서열의 발현을 제거 또는 조절하도록 변형된 것이 특징인 분리된 감염성 RSV.
- 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈, 주요 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰(L) 폴리머라제 단백질, 및 RNA 폴리머라제 연장인자를 함유하고, 한 RSV 서브그룹의 면역원성 에피토프 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자 단편이 상기 RSV 서브그룹과 상이한 RSV 서브그룹의 재조합 게놈 또는 안티게놈 내에 병합되어 있고, 상기 RSV 게놈 또는 안티게놈은 선택된 유전자 내로 도입된 종결 코돈 또는 선택된 유전자와 관련된 GS [gene-start(유전자 개시)] 또는 GE [gene-end(유전자 종료)] 전사 신호의 서열, 위치 또는 존재 여부의 변화에 의해서 변형된 것인, 분리된 감염성 RSV.
- 생리적으로 허용되는 담체 내에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 분리된 약독화 재조합 RSV를 면역학적으로 충분한 양으로 함유하는, RSV에 대한 보호 반응을 유도하는 백신.
- 한 RSV 서브그룹의 면역원성 에피토프 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자 단편이 상기 RSV 서브그룹과 상이한 RSV 서브그룹의 재조합 게놈 또는 안티게놈 내에 병합되어 있는 감염성 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현 벡터, 및RSV의 주요 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰(L) 폴리머라제 단백질, 및 RNA 폴리머라제 연장인자 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하고,발현시 감염성 RSV 입자를 생산하는 것이 특징인 조성물.
- 제6항의 발현 벡터를 세포 또는 무세포 용균물 중에서 공동 발현시킴으로써 상기 감염성 RSV 입자를 생산하는 것을 포함하는, 상기 RSV를 코딩하는 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 감염성 약독화 RSV 입자를 생산하는 방법.
- cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts 248/404 (ATCC VR 2454), cpts 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts 530/1009 (ATCC VR 2451) 및 cpts 530/1030 (ATCC VR 2455)로 이루어진 군 중에서 선택된 RSV 균주.
- B-1 cp52/2B5 (ATCC CR 2542) 및 B-1 cp-23 (ATCC VR)로 이루어진 군 중에서 선택된 RSV 균주.
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