KR20050112127A - 중증급성호흡기증후군(ｓａｒｓ)에 인터페론 베타 - Google Patents

Abstract

중증급성호흡기증후군(SARS) 치료 또는 예방에 유용한 약물 제조에 인터페론을 이용하는 것을 설명한다.

Description

중증급성호흡기증후군(ＳＡＲＳ)에 인터페론 베타{INTERFERON BETA IN SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME (SARS)}

본 발명은 중증급성호흡기증후군(SARS) 치료 또는 예방용 약물 제조에 인터페론(IFN)을 이용하는 것과 관계한다.

발명의 배경

간질성 폐렴(pneumonitis)은 폐포 공간 및 세포간 조직(interstitial tissue)을 포함하는 폐 실질조직의 급성 감염으로 인한 질환이다. 이 폐렴은 전체 대엽(대엽성 폐렴), 대엽의 부분(부분성 또는 대엽성 폐렴), 기관지에 인접한 폐포(기관지 폐렴)에 영향을 줄 수 있다. 이들의 특징은 일반적으로 X-선 관찰에 근거한다.

30세 이상의 성인의 경우 폐렴의 가장 흔한 원인은 세균이다. 이들 세균중에 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonias)가 가장 흔하다. 다른 병인균에는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 헤보필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzas), 글라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumonias), C. 사티파치(C. psittaci), C. 프라코마티스(C. trachomatis), 모렉셀라(부란헤멜라) 카타르할리스(Moraxella ( Branhamella ) catarrhalis), 레지오넬라 뉴모니아(Legionella pneumophila), 클렙스엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonias)와 같은 혐기성 세균 및 다른 그램 음성 바실러스가 포함된다. 세균형 유기체인 미코플라즈마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonias)는 청소년기 및 젊은이들에 특히 흔하며, 봄에 빈번하다. 신생아 및 어린이에게서 주요 폐 병인균은 바이러스이다; 호흡기 합체 바이러스(respiratory syncytial viruses), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 인플루엔자 A 및 B 바이러스. 이들 바이러스들은 성인에서 폐렴의 원인이 될 수도 있지만, 건강한 성인에서 유일하게 흔한 바이러스가 인플루엔자 A이며, 가끔 인플루엔자 B에 감염되며, varicella zoster에 감염되는 경우는 극히 드물다. 이들 바이러스원인균중에 노카르디아(Nocardia), 악티로미세스(Actinomyces) sp; 미코박테리아 튜베르클로시스(Mycobacterium tuberculosis), 비전형 균주[주로 M. 칸사스리(M. kansasli), M. 아비움-인터라셀룰라(M. avium-intracellulare)을 포함하는 미코박테리아(mycobacteria); 히스토플라즈마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 코카이도이드 이미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neofommans), 아스퍼질러스 퓨미게이츠(Aspergillus fumigates), 뉴모시스티스 카르니(Pneumocystis carinii)를 포함하는 곰팡이; 리켓치아, 주로 코시에라 부메틀리(Coxiella bumetli)(Q 열병)등을 포함하는 고등 박테이라도 있다. 일반적인 증상은 기침, 발열, 수일후에는 가래가 발생하며, 가끔 늑막염이 수반되는 경우도 있다. 신체 검사를 통하여 빈호흡(tachypnea)을 감지하거나 기관지 호흡 소리에서 딱딱거리는 폐기관 경화 징후를 감지할 수도 있다. 이와 같은 증후는 일반적으로 S. 뉴모니아(S. pneumonias)와 H. 인플루엔자(H. influenzas)가 원인이 된다.

흉부 X-선 활영 사진에서 침윤과 복합된 특징적 징후에 근거하여 진단을 한다. 환자의 약 30 내지 50%는 세균성 폐렴의 임상적 결과가 있음에도 불구하고 확인되는 병인균이 없다. 세균성 병인균을 동정하는 시간 한정방법(the time-honored method)으로 객담을 배양하기는 하지만, 이들 견본은 상측 기도를 통하여 통과하는 동안에 정상적인 인두 플로라(flora)가 이들 객담 미생물을 오염시킬 수 있기 때문에 그룻된 결과를 초해할 수 있다. 가장 신뢰성있는 견본은 세균성 폐렴 환자의 혈액, 농흉이 있는 환자의 늑막 액과 같은 통상 멸균 부위에서 취한 견본이 된다. 일부 병인균; 미코박테리아, 미코플라즈마, 혐기성 세균, 클라미디아(chlamydiae), 바이러스, 곰팡이, 레지오넬라, 리켓치아, 기생충등을 동정하기 위해서는 특이적 배양 기술, 특이적 착색, 혈액 검사 등이 요구된다.

치료는 그램 착색(Gram stain) 결과에 근거하여 선택된 항생제와 O₂를 포함하는 호흡기 서포트로 구성된다. 그램 착색이 실행되지 않았거나 진단을 하지 못한 경우에는 환자의 나이, 전염병학, 숙주 위험인자, 질병의 중증도에 근거하여 항생제를 선택한다.

중증 비전형 폐렴인 중증급성호흡기증후군(SARS)은 아시아, 북미, 유럽에서 아주 최근에 알려진 미확인 병인성 질환이다.

SARS를 가지는 것으로 확인인 환자들의 대부분은 건강하였던 25 내지 70세 성인이다. SARS로 의심된 경우에 15세 미만의 어린이는 거의 없었다.

SARS의 배양 기간은 일반적으로 2-7일이 소요되나, 별도 보고서에 따르면 최장 10일까지 배양기간을 제안하기도 하였다. 질환은 발열 전징(100.4℉이상, 38.0℃이상)으로 시작되는 것이 일반적이다. 열은 종종 아주 높아서, 심한 오한이 동반되며, 두통, 불쾌감을 포함하는 다른 증상이 수반될 수도 있다. 질병이 개시되면, 일부 환자에게는 약한 호흡기 증상이 나타날 수 있다. 일반적으로, 발진, 신경성 또는 위장 관련 징후는 없지만, 일부 환자에게서 열이 나는 동안에 설사를 경험한다는 보고는 있다.

3-7일 후에, 하부 호흡기 상이 건조되기 시작하고, 마른기침, 호흡곤란으로 질환이 시작되어, 저산소혈증으로 진행되거나 이를 수반할 수도 있다. 호흡기 질환의 10%-20%는 삽관법 및 기계적 호흡 장치를 요구할 정도로 심각하다. 치사율은 -현재 WHO에서 정하는-SARS로 정의되는 경우에 약 3%가 된다. 열병 전징이 있는 동안에 그리고 질병이 진행되는 동안에도 흉부 방사선 사진은 정상일 수도 있다. 그러나, 환자의 실질적인 비율에서, 호흡기는 초기 형식적인 간질 침윤에서 좀더 일반화된 침윤, 패치 침윤, 간질 침윤으로 진행되는 특징이 있다. SARS의 말기 환자의 흉부 방사선 사진에서는 경화 부분이 나타난다.

질병의 초기에, 절대적인 임파세포 수치가 종종 감소되기도 한다. 전반적인 백혈구 세포 수는 일반적으로 정상이거나 감소되는 경우도 있다. 호흡기 질환 절정에서, 환자의 약 50%는 백혈구감소증 및 혈소판감소증 또는 정상보다 적은 혈소판 수치(50,000-150,000/pL)를 가진다. 호흡기 질환의 초기에 크리아틴 포스포카이나제 수준이 상승(최고 3,000 IU/L)과 간 트란스아미나제(정상 상한의 2 내지 6배이상 높은)의 상승이 기록된 바 있다. 환자의 대부분에서 신장 기능은 정상이다.

질병의 중증도는 매우 다양하여 약간의 아픔부터 사망에 이르기까지 다양하다. SARS 환자와 접촉하여 유사 질환이 발병되기도 하지만, 대부분은 무관하다. 일부 밀접 접촉으로 호흡기 증상없이 약한, 발열이 발생되는 경우도 있어, 이 질환이 반드시 대인 접촉에 의해 진행된다는 것이 아님을 나타낸다.

SARS가 전파되는 주요 경로는 긴밀한 대인 접촉에 의해 일어난다. SARS의 대부분 경우에 SARS 환자를 돌보거나 같이 거주한 사람에서 발명하며, 또는 감염성 물질(예를 들면 SARS 환자에서 나온 호흡기 분비물)과 직접적으로 접촉한 사람에서 발명하였다. SARS가 전차되는 가망 경로는 감염성 액체로 오염된 사람의 피부 또는 물체를 만지거나 눈, 코 또는 입에 닿는 경우가 포함된다. SARS를 앓고 있는 환자의 기침, 콧물이 다른 사람 또는 주변 표면에 떨어져 발생할 수도 있다. SARS는 또한 공기를 통하여 광범위하게 전파되거나 현재까지 밝혀지지 않은 방식으로 전파될 가능성도 있다.

현재까지 정보로는 사람은 열이나 기침을 할 때 감염되기 쉽다는 것이다. 그러나, 환자에서 이들 정상이 개시되기 전 또는 개시후에 얼마나 지나야 다른 사람에게 전파되는지에 대해서는 밝혀지지 않았다.

질병 방재 및 예방 센터(CDC)의 과학자들 및 기타 실험실 연구자들은 SARS 환자에서 미인지의 코로나바이러스(coronavirus)를 감지하였다.

현재, 예비 데이터를 이 물질이 원인성 물질인지에 대해 이용할 수 있다. 신규한 코로나바이러스가 SARS의 원인이라는 가설이 지배적이다(Ksiazek et al., A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. The New England Journal of Medicine. www.neim.org 16 April 2003). 그러나, 잠재적인 원인물질로 다른 바이러스들도 연구되고 있다.

코로나바이러스는 현미경하에서 관찰하였을 때 원광(halo) 또는 크라운모양(코로나)을 가지는 바이러스 군이다. 이들 바이러스들은 사람에서 약한 호흡기 질환에서부터 중증도의 호흡기 질환의 통상원인물질이며, 동물에서는 호흡기, 위장관, 간, 신경 질환과 연관이 있다. 코로나바이러스는 최장 3시간까지 이들 환경에서 생존할 수 있다.

CDC 과학자들은 두명의 SARS 환자로부터 바이러스를 분리하였고, 몇 가지 실험실 방법을 이용하여 이를 특징화시켰다. 전자 현미경을 통한 검사에서 바이러스는 코로나바이러스의 독특한 모양 및 외양을 가지고 있었고, 이의 유전자 코드 분석에서, 이 신규한 바이러스가 코로나바이러스 족에 속하나 기존에 확인된 족과는 상이하다는 것으로 밝혀졌다. SARS 환자의 혈청 샘플 테스트에서 이 환자들은 이 바이러스에 최근에 감염된 것으로 나타났다. 다른 테스트에 따르면, 이와 같은 기존의 미확인된 코로나바이러스가 직간접적으로 발병된 다른 SARS 환자에서 얻은 임상 견본(코 및 목의 스웹에서 얻는 견본 포함)에 존재하였다는 것을 설명한다. 이들 결과 및 다른 WHO 네트워크에 참여한 실험실들의 보고서에 따르면, 이 신규한 코로나바이러스가 SARS의 원인 물질이라는 가설을 뒷받침하는 증거가 된다. 코로나바이러스와 SARS의 연관성에 대한 추가 연구가 진행중이다.

코로나바이러스는 사람, 특히 면역계가 약화된 사람에서 폐렴과 종종 연관이 있다. 이들 바이러스는 고양이, 개, 돼지, 쥐, 새들을 포함하는 동물에서 심각한 질병의 원인이 될 수 있다.

WHO 네트워크에 참여한 몇 개 실험실들의 연구자들은 SARS 환자의 임상 견본에서 파라믹소바이러스를 확인하였다고 보고한 바 있다. 이들 실험실들은 현재 파라믹소바이러스가 SARS의 원인균인지에 대해 연구중이다.

현재까지, 가장 효과적인 치료 방법에 대해서는 알려진 바 없다. 일부 지역에서는 오셀라미비르(oseltamivir) 또는 리바비린(ribavirin)과 같은 항-바이러스제를 포함시키는 요법을 사용한다. 리바비린 또는 다른 항균제와 함께 환자에게 스테로이드를 구강으로 또는 정맥으로 제공하기도 하였다. 제어된 임상 실험없이 이들 방법이 효과가 있는지에 대해서는 아직 미지수이다. 실험실 실험에서 얻은 정보에 따르면, 리바비린은 테스트된 신규한 코로나바이러스의 한개 분리체의 바이러스 생장 또는 세포간 전파를 저해하지 못하였다. 리바비린 및 다른 항바이러스 약물의 추가적인 실험실 테스트는 이것이 효과적인 방법인지를 보기위한 것이다.

인터페론은 감염원인이 되는 미생물을 파괴하는 것을 돕거나 임의 생성된 손상을 복구함으로써 면역계에 필수적인 역할을 하고, 세포간 메시지를 전달하는 가용성 단백질인 사이토킨이다. 인터페론은 감염된 세포에서 자연적으로 분비되며, 1957년에 최초로 확인되었다. 인터페론 이름도 바이러스 복제 및 생산을 “간섭(interfere)”한다고 하여 유래된 것이다. 인터페론은 항-바이러스 및 항-증식 활성을 모두 나타낸다. 생화학적, 면역학적 성질에 근거하면, 자연 발생되는 인간 인터페온은 세 가지 종류로 나눌 수 있다; 인터페론-알파(백혈구세포), 인터페론-베타(섬유아세포), 인터페론-감마(면역). 알파-인터페론은 현재 미국 및 여러 국가에서 모상세포백혈병(hairy cell leukemia), 성기 사마귀(venereal warts), 카푸시 육종(ADIS 환자에서 흔히 있는 암), 만성 non-A, non-B 감염 치료로 승인을 받았다.

추가로, 인터페론(IFNs)은 바이러스 감염에 반응하여 신체에서 생성되는 당단백질이다. 이들은 보호 세포에서 바이러스가 다중복제하는 것을 저해한다. 낮은 분자량 단백질을 고려하면, IFNs는 이들 작용에 상당히 비-특이적이다; 한개 바이러스에서 유도되는 IFN이 다른 광역의 바이러스에 대해 효과적이다. 그러나, 종-특이적이기도 하다, 즉, 한 종에서 생성되는 IFN은 동일한 세포 또는 매우 근접한 종의 세포에서만 항바이러스 활성을 자극한다. IFNs은 이들의 잠재적인 항-종양 및 항-바이러스 활성에 이용되는 제 1 군이다.

세가지 주요 IFN을 IFN-α, IFN-β,IFN-γ로 칭한다. 이들 종류의 IFN은 세포 기원에 따라(백혈구, 섬유아세포, T 세포) 초기에는 분류하였다. 그러나, 한개 세포에서 몇 가지 타입이 생산될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 백혈구 IFN은 현재 IFN-α라 부르고, 섬유아세포 IFN을 IFN-β라고 부르며, T 세포 IFN은 IFN-γ라고 부른다. 백혈구 IFN 및 섬유아세포 IFN 혼합물로 생산하는 것으로 보이는 “Namalwa" 세포주(Burkitt's 임파종에서 유도된)에서 생산되는 제 4의 IFN, 임파아구종 IFN이다.

인터페론의 단위 또는 국제 단위(U. 또는 IU)는 바이러스 손상에 대해 세포의 60%를 보호하는데 필요한 양으로 정의되는 IFN 활성으로 보고 되어 있다. 생활성을 측정하는데 이용할 수 있는 검사는 설명된 바와 같이(Rubinstein, et al. 1981; Famillefli, P. C., et al., 1981), 세포병인 효과 저해 검사이다. 인터페론의 항바이러스 검사에서 ㎖당 1 단위는 50%의 세포병인 효과를 만드는데 필요한 양이다. 단위는 국립보건국에서 제공하는 Hu- IFN-베타의 국제 기준 표준에 근거하여 결정된다(Pestka, S. 1986).

모든 종류의 IFN에는 몇 가지 특이한 타입이 포함된다. IFN-β 및 IFN-γ는 각각 단일 유전자의 생성물이다.

IFN-α로 분류된 단백질은 약 15가지 타입을 포함하는 가장 다양한 군이다. 염색체 9에있는 IFN-α 유전자 클러스터(cluster)는 적어도 23개 구성으로 되어 있고, 이중 15개는 활성이 있으며, 전사된다. 완숙 IFNs-α는 글리코실화되지 않는다.

IFNs-α 및 IFN-β는 유사한 생물학적 활성을 가지며 동일한 길이로 이루어졌다(165 또는 166개 아미노산). lFNs-γ는 길이가 146개 아미노산으로 α와는 많이 유사하나, β와는 덜 유사하다. IFNs-γ는 유일하게 킬러 T 세포의 성숙을 유도하거나 마크로파지(macrophages)를 활성화시킬 수 있다. 이와 같은 새로운 타입의 치료제를 생물학적 반응 조절제(BRMs)라고 부르는데, 그 이유는 종양에 대한 유기체의 반응에 영향을 가지고 있어, 면역조절을 통하여 인지에 영향을 주기 때문이다.

사람 섬유아세포 인터페론(IFN-β)은 항-바이러스 활성을 가지며, 신조직 세포에 대해 자연 킬러 세포를 자극할 수도 있다. 바이러스와 이중 가닥 RNA에 의해 유도되는 약 20,000Da의 폴리펩티드이다. 재조합 DNA기술에 의해 클론된(Derynk et al. 1980) 섬유아세포 인터페론 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 단백질의 완전한 아미노산 서열을 유추하였다. 약 166개 아미노산 길이를 가진다.

Shepard et al.,(1981)는 염기 842에서 돌연변이(141위치에 Cys→Tyr)로 인하여 항바이러스 활성이 사라진다고 설명하였으며, 뉴클레오티드 1119-1121이 결손된 변이체 클론에 대해서도 보고하였다. Mark et al.,(1984)은 염기 469(T)를 (A)로 대체시켜, 위치 17에 Cys이 Ser로 전환되는 인위적인 돌연변이를 만들었다. 생성된 IFN-β는 “고유” IFN-β와 같이 “활성”인 것으로 보고 되었으며, 장기간 저장(-70℃)에도 안정적인 것으로 보고된 바 있다.

다발성 경색(MS)의 인터페론 요법에서 가장 최근에 개발된 Refit^R(재조합 사람 인터페론-β)은 인터페론 베타-1a로 포유류 세포주에서 생산된 것이다.

인터페론 단독으로 또는 다른 항바이러스 물질과 복합하여 SARS를 치료하는 방법에 대해서는 문헌에 아직 보고된 바가 없다.

본 발명의 주요 목적은 인터페론 단독 또는 다른 유용한 항바이러스 물질과 복합하여 중증급성호흡기증후군(SARS)의 치료 또는 예방에 유용한 약물을 제조하는데 인터페론(IFN)을 이용하는 것에 관계한다.

SARS-CoV(중증급성호흡기증후군 연관된 코로나바이러스)의 두 가지 임상 분리체에 대해 인터페론의 항바이러스 효과는 the University of Frankfurt (see J. Cintal et al., The Lancet, 362, 293 - 294, 2003)의 일부 과학자들에 의해 제기된바 있다. 이 문헌에서 과학자들은 인터페론이 in vitro에서 SARS-CoV 복제를 저해하는 것을 설명하였다. 특히, 이들은 재조합 인터페론(IFN-alpha, IFN-beta and IFN-gamma)이 SARS-CoV-FFM-1의 두 가지 임상 분리체(하나는 Frankfurt 환자에서, 하나는 Vero 및 Caco2 세포에서 복제된 Hong Kong)에 대해 항바이러스 활성을 가진다고 평가하였다.

인터페론-베타는 가장 강력한 것으로, 두개 분리체에 주사 후에 예방적 차원의 보호 및 항바이러스 능력을 가졌다. 또한, 과학자들은 바이러스 감염전 24시간에 그리고 바이러스 감염후에 즉시 인터페론-베타로 처리된 배양물에서 바이러스에 의해 유도된 세포병인 효과를 억제하기 위한 바이러스 복제 저해 관련성을 테스트하였다. 인터페론-베타는 배양물에서 감염 바이러스 생산의 저해가 약량에 따라 달라졌다.

본 명세서에서 “치료”는 질병의 진행시에 임의 유익한 효과 예를 들면, 질병 개시후에 병인성의 감쇠, 감소, 차감등을 포함하는 것을 말한다.

여기에서 사용된 바와 같이, "인터페론" 또는 "IFN"는 문헌에서 정의하는 임의 분자가 포함되는데, 예를 들면, “발명의 배경”에서 설명하는 것과 같이 임의 IFNs으로 구성된다. 특히, IFN-α, IFN-β, IFN-γ는 상기 정의에 포함된다. IFN-β가 본 발명에 따르면 가장 적절한 IFN이다. 본 발명에 따라 적절한 IFN-β는 시판되는 것을 이용할 수 있다; Rebif(Serono), Avonex(Biogen), Betaferon (Schering). 사람에서 기원된 인터페론을 본 발명에 이용할 수도 있다. 여기에서 사용된 인터페론 용어는 염, 기능적 유도체, 변이체, 돌연변이체, 융합된 단백질, 유사체, 이의 활성 단편이 포함되는 것을 말한다.

여기에서 설명된 바와 같이, “인터페론-베타(IFN-β)"는 생물학적 유체로부터 분리하여 또는 진핵 또는 원핵 세포로부터 DNA 재조합 기술에 의해 수득되는 것과 같이 사람 기원의 섬유아세포 인터페론 및 이의 염, 기능적 유도체, 변이체, 유사체 및 활성 단편을 포함한다.

여기에서 사용된 바와 같이, “뮤테인”은 IFN의 유사체를 말하는 것으로, 자연 IFN의 아미노산 잔기들중 하나 또는 그 이상이 상이한 잔기로 치환되거나, 결손되거나 하나이상의 아미노산 잔기가 자연 IFN의 서열에 삽입되는 것을 말하고, 이와 같은 변형으로 인하여 야생형 IFN의 활성과 비교하였을 때 최종 산물의 활성에 큰 변화가 없는 것을 말한다. 이와 같은 뮤테인은 부위-직접 돌연변이 형성 기술 또는 임의 다른 공지 기술을 이용하여 당업자가 만들 수 있다. 적절한 뮤테인은 Shepard et al. (1981) 또는 Mark et al. (1984)에 의해 설명된 것들이다.

이와 같은 뮤테인중 임의의 것은 IFN의 서열과 중복되는 아미노산 서열을 가져 IFN과 실질적으로 유사한 활성을 가지거나 더 나은 활성을 가질 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 인터페론의 생물학적 기능은 당분야의 평균적 지식을 가진 자에게 공지된 것으로, 생물학적 기준도 정립되어 있고, 이용할 수도 있다(the National institute for Biological Standards and Control (http://immunology.org/links/NIBS C).

IFN 활성을 결정하는 생검에 대해서는 설명된 바가 있다. IFN 검사는 Rubinstein et aL, 1981에서 설명하는 방법에 의해 실행할 수 있다. 따라서, 임의 주어진 뮤테인이 IFN과 실질적으로 유사한 또는 더 나은 활성을 가지는 지를 통상적인 실험을 통하여 결정할 수 있다.

본 발명에 따라 이용될 수 있는 IFN의 뮤테인 또는 이의 핵산에는 당업자과 과도한 실험없이도 수득할 수 있는 펩티드 치환 또는 폴리펩티드 치환에 상응하는 서열이 포함된다.

본 발명에 따른 뮤테인을 위한 적절한 변화는 보존 치환으로 공지된 것이다. 발명의 폴리펩티드 또는 단백질의 보존적 아미노산 치환에는 치환에 의해 군내에 분자의 생물학적 기능을 보존할 수 있는 충분히 유사한 물리생화학적 성질을 가지는 유사 아미노산이 포함된다. 아미노산 삽입 또는 결손은 이들의 기능에 변화없이 상기 정의된 서열에서 일어날 수 있으며, 특히, 삽입 또는 결손이 소수 아미노산 가령, 30개 미만, 적절하게는 10개 미만이 관여할 때 적절하며, 시스테인 잔기와 같은 기능적 모양을 유지하는데 중요한 아미노산을 제거하거나 대체하지는 않는다.

이와 같은 결손 또는 삽입에 의해 만들어진 단백질 및 뮤테인은 본 발명의 범위내에 있다.

좀더 적절하게는 유사 아미노산을 표 2에 정의하였고, 가장 적절한 아미노산 은 표 3에 정리하였다.

본 발명에서 이용하기 위한 IFN의 뮤테인을 수득하는데 이용할 수 있는 단백질에서 아미노산 치환을 만드는 방법은 임의 공지의 방법이 포함되는데, 예를 들면, 미국 특허 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,); 4,965,195(Namen et al); 4,879,111(Chong et al); 5,017,691(Lee et al)이 포함되며; 리신 치롼된 단백질은 미국 특허 4,904,584(Straw et al)에 설명되어 있다. IFN-베타의 특정 뮤테인 이름은 Mark et al., 1984에서 설명하고 있다.

“융합된 단백질"은 다른 단백질 예를 들면 생체 유체에 잔류 시간이 연장되는 단백질에 융합된 IFN 또는 이의 뮤테인으로 구성된 폴리펩티드를 말한다. IFN은 이뮤노글로블린 또는 이의 단편과 같은 또 다른 단백질, 폴리펩티드 또는 유사 물질에 융합될 수도 있다.

여기에서 사용된 것과 같은 "기능적 유사체"는 IFN의 유도체, 이의 뮤테인, 융합 단백질을 포함하는데, 이들은 당분야에 공지의 방법을 이용하여 잔기 또는 N-단부 또는 C-단부에 측쇄에서 발생될 수 있고, 이들은 IFN의 활성과 실질적으로 유사하여 단백질의 활성을 파괴하지 않으면서, 독성이 없는 것이 본 발명의 범위에 포함된다. 이들 유도체들은 예를 들면, 생체 유체에서 IFN 잔기를 연장시키고, 항원 부위를 차단할 수 있는 폴리에틸렌 글리콜 측쇄가 포함된다. 다른 유도체에는 카르복시기의 지방족 에스테르, 1차 또는 2차 아민과 반응에 의한 카르복실기의 아미드, 아실 부분과 형성된 아미노산 잔기의 자유 아미노기 N-아실 유도체(예를 들면, 알카노일 또는 카르보사이클 아로일 기) 또는 아실 부분과 형성된 자유 하이드록실기의 O-아실 유도체(예를 들면, 세릴 또는 트레오닐 잔기)가 포함된다.

IFN 또는 뮤테인 및 융합 단백질의 "활성 분취물" 으로써, 본 발명은 단백질 분자 단독의 폴리펩티드 쇄의 임의 단편 또는 그 전구물질 또는 이와 연합된 분자 또는 잔기에 연결된 당, 인산염기 또는 단백질 분자 응집체 또는 당분자 자체의 응집체도 포함하는데, 단 조건은 이와 같은 분취물이 이에 상응하는 IFN과 비교하였을 때 심각한 활성 감소가 없어야 한다.

"염"이란 상기에서 설명하는 단백질의 아미노산에 산추가 염 또는 카르복실기의 염, 또는 이의 유사체를 모두 말하는 것이다. 카르복실기의 염은 당분야에 공지 방법에 의해 만들 수 있는데, 무기염, 예를 들면, 나트륨, 칼슘, 암모니움, 철 아연 등이 있고, 유기 염기 예를 들면, 트리에탄올아민과 같은 아민, 아르기닌 또는 리신, 피페리딘, 프로카인 등으로 만들어진 유기 염기등이 포함된다. 산 첨가 염에는 예를 들면, 염산 또는 황산과 같은 미네랄 산염과 아세트산, 옥살산과 같은 유기산으로 만들어진 염이 포함된다. 물론 이와 같은 염은 본 발명에 연관된 단백질(IFN)의 생물학적 활성을 보유해야만 하는데, 예를 들면, 이에 상응하는 수용체에 결합하여 수용체 시그날 생성을 개시할 수 있는 능력을 보유해야만 한다.

본 발명에 따르면, 인터페론과 복합하여 이의 유익한 효과를 강화시키는데 이용할 수 있는 항바이러스 물질로 리바비린(Ribavirin),(1-β- 리보퓨라노실-1H-1,2,4-트리아졸-3-카르복사미드)가 적절하다.

본 발명에 따르면, 재조합 사람 IFN-베타와 본 발명의 화합물을 이용하는 것이 특별히 적절하다.

특별한 종류의 인터페론 변이체가 최근에 설명된 적이 있다. 소위 “콘센선스 인터페론”은 IFN의 비-자연 생성되는 변이체(US특허 6,013,253)이다. 본 발명의 적절한 구체예에 따르면, 본 발명의 화합물은 콘센선스 인터페론과 복합하여 사용할 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, 사람 인터페론 콘센선스(IFN-con)는 비-자연 발생적 폴리펩티드를 의미하는 것으로, 주로 자연 발생 사람 백혈구 세포 인터페론 서브타입의 대부분을 대표하는 IFN-알파의 서브세트에 공통적인 아미노산 잔기를 포함하고, 이들 위치중에 하나이상에서 모든 서브타입에는 공통적이지 않는 임의 아미노산을 포함하는데, 이들은 자연 발생 서브타입에 존재하는 아미노산 잔기가 아니다. IFN-con에는 미국 특허 4,695,623; 4,897,471; 5,541,293에서 설명하는 IFN-con1, IFN-con2, IFN-con3으로 지정된 아미노산 서열을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. IFN-con을 인코드하는 DNA 서열은 상기 특허에 설명된 방법을 이용하여 만들거나 다른 표준 방법을 이용하여 만들 수도 있다.

적절한 구체예에서, 융합 단백질은 Ig 융합으로 구성된다. 융합은 직접적으로 또는 길이가 1 내지 3개 아미노산 잔기와 같은 짧은 링커 펩티드를 이용하여 또는 길이가 13개 아미노산 잔기 정도의 링커에 의해 간접적으로 융합될 수 있다. 이와 같은 링커는 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met) 또는 13개 아미노산 잔기 링커 예를 들면, Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met가 IFN 및 면역글로블린 서열 사이에 도입된다. 생성된 융합 단백질은 신체 유체에 잔류 시간(반감기)이 연장, 증가된 특이활성, 발현 수준의 증가 등 개선된 성질을 가질 수 있고, 융합 단 정제가 가능하다.

적절한 구체예에서, IFN은 Ig 분자의 항상부에 융합된다. 적절하게는 사람 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인과 같은 중쇄 부분에 융합된다. Ig 분자의 다른 동소체도 본 발명의 따른 융합 단백질 생성에 적절할 수 있는데, 예를 들면, 동소체 IgG₂, IgG₃,IgG₄, 또는 다른 Ig 종류 예를 들면, IgM 또는 IgA가 될 수도 있다. 융합 단백질은 단량체 또는 다량체, 동질체 또는 이질체가 될 수도 있다.

적절한 구체예에서, 기능적 유도체는 한개 또는 그이상의 기능기에 적어도 한개의 모이어티(moiety)가 결합된 것으로 아미노산 잔기에 한개 또는 그 이상의 측쇄가 형성된다. 적절하게는 모이어티 부분은 폴리에틸렌(PEG) 모이어티가 된다. 페길레이션(PEGylation)을 공지의 방법 예를 들면, W099/55377에서 설명하는 것에 따라 실행할 수 있다.

개인에 따라 1회약량 또는 다중 약량으로 투여되는 약량은 약리역학적 성질, 투여 경로, 환자의 상태, 특징(성별, 나이, 체중, 건강, 신체), 중증도, 동시 치료, 치료 반도, 원하는 효과 등을 포함하는 다양한 요인들에 따라 달라질 수 있다. 사람 IFN-베타의 표준 약량은 하루에 80,000IU/kg 내지 200,000IU/kg 또는 1인당, 1일 6MIU (million international units) 및 12MIU 또는 1인당 44㎍(microgram) 이 된다. 본 발명에 따르면, IFN은 적절하게는 1인당 1일에 약 1 내지 50㎍, 좀더 적절하게는 약 10 내지 30㎍ 또는 약 10 내지 20㎍ 범위가 된다.

본 발명에 따른 활성 성분의 투여는 정맥, 근육내 또는 피하 경로가 될 수 있다. IFN의 투여 경우에 가장 적절한 경로는 피하 경로이다.

IFN은 매일 또는 하루걸러(가장 빈도가 적은 경우) 투여할 수도 있다. IFN은 적절하게는 1주일에 1, 2, 3회 투여하는 것이다.

적절한 투여 경로는 피하 투여로써 1주일에 3회 투여이다. 또 다른 적절한 투여 경로는 근육을 통한 투여인데, 1주일에 1회 투여할 수 있다.

IFN-베타 6MIU 내지 12 MIU 또는 22 내지 44㎍을 피하로 1주일에 3회 투여하는 것이다.

30㎍ 또는 9.6MIU IFN-베타를 1주일후에 근육으로 다시 투여할 수도 있다.

적절한 구체예에서, 리바비린을 IFN 베타와 복합하여 투여할 수 있는데, 1인당 1일 약량은 약 100 내지 2000mg, 적절하게는 약 400 내지 1200mg, 좀더 적절하게는 약800 내지 1000mg 또는 약 1000 내지 1200mg이 된다. 환자의 체중이 65kg 미만인 경우에 통상 약량은 1일 800mg이고, 환자의 체중이 65 내지 85kg 범위이면, 1일 통상 약량은 1000mg이고, 환자의 체중이 약 85kg이상인 경우에, 1일 통상 약량은 1200mg이다. 이용되는 정확한 약량은 환자의 필요, 치료 질환의 중증도에 따라 달라진다. 특정 상황에 대해 적절한 약량 결정은 당업자가 인지하는 범위내에 있다. 편의를 위하여 전체 1일 약량을 분할하여, 필요한 경우에 그날에 분량으로 나누어 투여할 수 있다.

적절한 구체예에서, 리바비린을 경구로 투여할 수도 있다. 리바비린은 주사 또는 경구로 투여하는 것이 적절하다. 투여 방식에 따라, 화합물을 적절한 희석제 및 캐리어를 이용하여 연고, 크림, 포말, 로션, 용액등의 형태로 하여 화합물 중량의 약 1% 내지 약 10중량%를 포함하도록 만들 수 있다. 주사의 경우에, 리바비린은 현탁액, 용액으로 만드는데, 약 10㎎/㎖ 내지 1500㎎/㎖을 생리학적 용액에 용해 또는 현탁시켜 만들 수 있다. 주사는 정맥, 근육, 뇌, 피하, 복막을 통하여 주사한다.

경구 투여의 경우에, 리바비린은 캡슐, 정제, 경구 현탁액 또는 시럽 형으로 만들 수 있다. 정제 또는 캡슐에는 약 10 내지 500mg 리바비린을 포함한다. 적절하게는 약 300㎎ 리바비린을 포함한다. 캡슐은 통상 젤라틴 캡슐로써 상기 정해진 양의 리바비린에 추가적으로 소량 예를 들면, 5중량%미만의 마그네슘 스테아레이트 또는 다른 부형제가 포함될 수 있다. 정제에는 상기 언급된 화합물과 결합제, 가령, 젤라틴 용액, 전분/물, 폴리비닐 피리리돈, 폴리비닐 알코올/물이 포함되고 전형적인 당 코팅형태로 만들어진다.

본 발명의 화합물과 IFN은 제약학적 조성물로 만들어질 수 있다.

"제약학적으로 수용가능한"이란 의미는 활성 성분의 생물학적 활성의 효과를 간섭하지 않으면서, 투여하였을 때 숙주에 독성을 주지 않는 임의 캐리어를 말한다. 예를 들면, 장과뇌 투여의 경우에, 활성 단백질은 염, 덱스트로즈 용액, 혈청 알부민 또는 링거용액과 같은 주사용 비이클에 단위 약량으로 조제될 수 있다. 본 발명에 따른 활성 성분을 다양한 방식으로 개체에 투여할 수 있다. 투여 경로에는 피내, 경피(예를 들면 서방형 제제), 근육, 복막, 정맥, 피하, 경구, 경막, 국소, 비강 등이 포함된다. 임의 다른 치료요법적 효과적인 투여 경로를 이용할 수 있는데, 상피 또는 진피 조직을 통한 흡수 또는 유전자 요법(활성 물질을 인코드하는 DNA 분자를 활자에 벡터 등을 이용하여 투여함으로써 생체내에서 활성 물질이 발현되어 분비되는 방법)을 이용할 수 있다. 추가적으로 본 발명에 따른 단백질을 생물학적으로 활성이 있는 다른 물질, 예를 들면, 약리학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 희석제 및 비이클과 복합하여 투여할 수 있다. 피하 경로가 본 발명의 경우에 적절하다.

본 발명을 실시할 수 있는 또 다른 가능성은 IFN의 유전자를 내생적으로 활성화시키는 것이다. 이와 같은 경우에, IFN 발현에 대해 통상적으로는 사일런트(silent)한 세포내에서 또는 충분한 양의 IFN을 발현하지 못하는 세포내에서 IFN의 내생 생산을 강화시키는 또는 유도하는 벡터를 이용하여 SARS를 치료할 수 있다. 벡터는 IFN을 발현시키기를 원하는 세포에 기능을 하는 조절 서열로 구성된다. 이와 같은 조절 서열은 프로모터 또는 인헨서가 될 수 있다. 조절 서열을 상동성 재조합에 의해 게놈의 정확한 위치로 도입시키고, 유전자에 조절 서열을 기능을 할 수 있도록 연결하여, 원하는 발현을 유도하거나 강화시킨다. 이와 같은 기술을 “내생 유전자 활성화(EGA)"라고 한다(WO91/09955에서 설명하고 있다).

본 발명은 SARS의 치료 또는 예방용 약물 제조에 IFN을 생산할 수 있도록 유전적으로 조적된 세포를 이용하는 것과 연관이 있다.

장관외(가령, 정맥, 피하, 근육) 투여의 경우에, IFN은 용액, 현탁액, 에멸전 또는 동결건조된 분말과 이와 연합되는 약리학적으로 수용가능한 비이클(가령, 물, 염), 등장성을 유지시키는 첨가제(예를 들면, 만니톨) 또는 화학적 안정제(보존제 및 완충액)을 연합하여 만들 수 있다. 조제물은 통상적인 기술을 이용하여 멸균한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 화합물 및 IFN은 치료목적 또는 예방 목적으로 치료용 목적으로 치료요법적 효과량의 다른 물질(예를 들면 다중 약물 섭생)과 동시에 또는 연속하여 투여할 수도 있다.

다른 요법제와 동시에 투여하는 활성 물질은 동일한 또는 사이한 조성으로 투여할 수 있다.

여기에 언급된 저널, 논문, 요약서 또는 공개 및 미공개된 미국 및 타국 특허 출원, 공고된 미국 및 타국 특허를 포함하는 모든 참고 문헌은 참고문헌으로 한다. 또한, 전제 내용을 참고문헌으로 첨부한다.

공지의 방법, 통상적인 방법, 공지의 또는 통상적 방법의 참고는 본 발명의 임의 특징, 설명 또는 구체예를 관련 문헌에서 공개, 지시 또는 제시하는 것으로 허용한다는 의미는 아니다.

특정 구체예의 상기 설명은 본 발명의 일반적인 특징을 설명하기에 충분하여, 당업자의 통상적 지식 범위내에(언급한 참고문헌 포함) 과도한 실험없이 본 발명의 일반적 개념을 벗어나지 않으면서 특이적 구체예를 다양하게 변형 수정하여 얻을 수 있는 다른 것들도 포함된다.

따라서, 이와 같은 변형 또한 본 발명에서 설명하는 기술 및 아이디어에 근거하여 등가의 범위내에 있다는 것을 의미한다. 여기에서 정의된 용어는 당업자가 당분야에 이용할 수 있는 지식과 복합하여 본발명에서 제공하는 기술에 근거하여 용이하게 해석하거나 이해 할 수 있는 정도의 것이므로, 정의된 의미에만 국한시키지 않는다는 것을 인지할 수 있을 것이다.

임상 시험

2가지 상이한 약량의 IFN-베타를 이용하여 임상 실험을 실시하였다. 이 시험의 목적은 SARS CoV-감염된 환자의 임상 결과를 측정하는 것이다. 임상 결과는 비인두 흡입물에서 SARS-CoV 바이러스 역가를 정량화하고, 환자의 PBMC를 정량화하여, 결과를 나타내는 면역학적 변수를 검사하는 것이다.

임상 시험 방법

제 1 임상 시험은 어린이에 적용하기 위한 것이다. 이 시험을 어린이에 실시하는 이유는 다음과 같다; 우선 질병이 어린이에게는 심각하지 않다. 현재까지 사망한 경우도 없었다. 이는 매우 아픈 환자 또는 약물에 대한 내성이 없는 환자를 치료하는 위험을 최소화시킬 수 있을 것이다. 또한, 소아과 시험에서 얻은 경험을 성인 환자에 적용할 수 있을 것이다.

무작위 기준 시럼을 18세 미만의 환자에서 실행하였다. 환자들은 임상 상태 및 WHO에서 정의하는 기준에 따라 폐 방사선 사진에 근거하여 선별하였다. 환자는 3개 군으로 분류하고, 각 군은 10명의 환자로 구성된다; 1) IFN-베타 없는 대조군; 2) 낮은 약량(1 million units/㎡/day)의 IFN-베타, 3) 중간 정도 약량(3 million units/㎡/day)의 IFN-베타. 환자는 이들의 임상 과정에 따라 1 내지 4주간 치료를 받았다. 치료 종료시에 이들의 임상적 결과, 바이러스 로드, 면역 반응을 측정하였다.

CoV -SARS-감염 환자의 임상 결과 특정

다음의 환자 데이터를 시험 과정에서 분석을 위해 수득하였다.;

열*, 오한, 한기, 기침*, 호흡곤란, 호흡기 스트레스*, 근육통, 말라리아, 기면 또는 과민성, 음식 섭취 곤란, 비루(rhinorrhea), 인후염, 식욕감퇴 또는 구토, 어지러움 또는 신경성 불평, 발진(*는 SARS 환자에서 주요 증상을 말한다). 임상적 결과 측정은 병원 과정, 환자의 호흡기 상태(호흡곤란 또는 치노아제), 동맥 혈액 가스, 기도 통기 서포트 필요, 폐 방사선 사진에 변화 등에 근거한다.

인두 흡입물 및 대변에서 SARS- CoV 바이러스 역가의 결정

3주간(치료전과 치료 3, 6, 9, 12, 15, 21일 전.) 감염된 환자로부터 연속하여 비강 흡입물 및 환자의 대변 샘플을 수집하였다. FRISKS 세포를 이용하여 SARS-CoV에 대해 샘플을 배양하였다. 간접 면역형광 검사를 실시하여 감염된 세포를 특징화시켰다. 세포는 광현미경을 이용하여 세포병인 효과 및 바이러스 역가(㎖당)를 결정하였다. 추가적으로, 총 RNA를 샘플로부터 역 전사에 의해 추출하고, 연속하여, 정량적-PCR 검사를 하여 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 SARS- CoV를 확인하였다.

혈청 샘플을 수집하여 SARS-CoV 항체 검사를 하였다.

치료 결과의 면역학적 변수 예측

in vivo에서 외생 IFN의 효과를 나타낼 수 있는 IFN-자극된 유전자 발현을 측정하였다. 측정된는 IFN-자극된 유전자에는 2-5 합성효소, PKR 및 Mx를 포함한다. 이들은 세포에서 IFN 활성의 정립된 마커들이다. 또한, 전형적 반응자(치료후 더 나은 임상적 결과 및 바이러스 양의 감소) 및 비-반응자(IFN-베타 치료후 임상적 결과가 나쁘거나 바이러스 양의 변화가 없는 경우)를 선별한다.

나타난 바와 같이, 환자 말초 혈액 단핵 세포의 유전자 발현 프로파일을 마이크로오레이 시스템(가령 Affflmetrix)을 이용하여 조사하고, 이의 프로테오믹스를 연구하였다. 이들 결과들은 치료 반응의 마커를 확인하는데 유용하다.

참고문헌

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Claims (13)

1. 중증급성호흡기증후군(SARS) 치료 또는 예방에 유용한 약물 제조에 이용되는 인터페론(IFN).
2. 중증급성호흡기증후군(SARS) 치료 또는 예방에 유용한 약물 제조에 항바이러스 물질과 복합하여 사용되는 인터페론(IFN), 이때 두 물질은 동시에 또는 연속하여 또는 별도로 이용되는 인터페론.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항바이러스 물질은 비라비린(Ribavirin)인 인터페론.
4. 전술한 어느 한 항에 있어서, IFN은 재조합 사람 IFN-베타.
5. 제 1 항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, IFN은 콘센선스 인터페론.
6. 전술한 어느 한 항에 있어서, IFN은 적어도 이뮤노글로블린 도메인으로 구성된 융합 단백질.
7. 전술한 어느 한 항에 있어서, 1인당 1일에 약 1 내지 50㎍, 또는 약 10 내지 30㎍, 또는 약 10 내지 20㎍ 약량으로 투여되는 인터페론.
8. 전술한 어느 한 항에 있어서, 매일 또는 2일에 1번 투여되는 인터페론.
9. 전술한 어느 한 항에 있어서, 1주일에 2회 또는 3회 투여되는 인터페론.
10. 전술한 어느 한 항에 있어서, 피하로 투여되는 인터페론
11. 전술한 어느 한 항에 있어서, 근육으로 투여되는 인터페론.
12. 전술한 어느 한 항에 있어서, 항바이러스 물질은 1일 1인당 약100 내지 2000 mg 또는 400 내지 1200mg 또는 약 800 내지 1000mg으로 또는 약 1000 내지 1200mg 약량으로 투여되는 인터페론.
13. 전술한 어느 한 항에 있어서, 리바비린은 구강으로 투여되는 인터페론.