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KR20050072814A - 종양 괴사 인자-알파에 대한 단일 도메인 항체 및 그 용도 - Google Patents

종양 괴사 인자-알파에 대한 단일 도메인 항체 및 그 용도 Download PDF

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KR20050072814A
KR20050072814A KR1020057008180A KR20057008180A KR20050072814A KR 20050072814 A KR20050072814 A KR 20050072814A KR 1020057008180 A KR1020057008180 A KR 1020057008180A KR 20057008180 A KR20057008180 A KR 20057008180A KR 20050072814 A KR20050072814 A KR 20050072814A
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KR
South Korea
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tnf
alpha
polypeptide
alpha polypeptide
disease
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KR1020057008180A
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KR101103218B1 (ko
Inventor
카렌 사일런스
마르크 라우웨레이스
한스 데 하아르드
Original Assignee
아블린쓰 엔.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32830281&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20050072814(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 아블린쓰 엔.브이. filed Critical 아블린쓰 엔.브이.
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Abstract

본 발명은 종양 괴사 인자 알파에 대한 단일 도메인 중쇄 항체에서 유래한 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 카멜리대 VHH인 단일 도메인 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 투여하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 TNF-알파 수용체를 조절하는 제제를 위한 스크리닝 방법 및 상기 스크리닝으로부터 얻어진 제제에 관한 것이다.

Description

종양 괴사 인자-알파에 대한 단일 도메인 항체 및 그 용도 {SINGLE DOMAIN ANTIBODIES DIRECTED AGAINST TUMOUR NECROSIS FACTOR-ALPHA AND USES THEREFOR}
본 발명은 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)에 대한 단일 도메인 항체 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 추가로 진단 및 치료에서 그들의 용도에 관한 것이다. 그러한 항체는 사람 골격 서열에 높은 상동성을 갖는 골격 서열을 가질 수도 있다. 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)에 대한 항체를 단독으로 또는 다른 약물과 함께 포함하는 조성물이 개시된다.
종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)는 예를 들어 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염 및 다발성 경화증과 같은 염증성 질환과 같은 다양한 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. TNF-알파와 그 수용체(CD120a, CD120b) 둘다 상당히 상세히 연구되어졌다. 생물활성 형태의 TNF-알파는 삼량체이며 이웃한 서브유닛들에 의해 형성된 그루브는 사이토카인-수용체 상호작용을 위해 중요하다. 사이토카인의 작용에 대항하기 위한 몇 가지 전략이 개발되었으며 현재 다양한 질병 상태를 치료하기 위해 이용되고 있다.
TNF-알파에 대해 충분한 특이성 및 선택성을 갖는 TNF-알파 억제제는 TNF-알파가 원인 제제로 생각되는 질환을 방지하거나 치료하기 위한 효과적인 예방적 또는 치료적 약학 화합물일 수 있다. TNF-알파에 대한 항체를 이용한, 독성 쇼크(EP 486526호), 종양 퇴화, 세포독성의 억제(미국 특허 6448380호, 미국 특허 6451983호, 미국 특허 6498237호), RA 및 크론 질병과 같은 자가면역 질병(EP 663836호, 미국 특허 5672347호, 미국 특허 5656272호), 이식편 대 숙주 반응(미국 특허 5672347호), 박테리아성 뇌막염(EP 585705호)의 치료 방법들이 개시되어 왔다.
그러나 현재 이용되고 있는 약물 중 어느 것도 자가 면역 질병의 치료에 완전히 효과적이지 못하며, 대부분은 심각한 독성에 의해 제한된다. 또한, 그러한 표적 서열에 대해 충분한 강력함과 선택성을 갖는 새로운 화학적 물질(entity)(NCE)을 개발하는 것은 극히 어렵고 긴 과정이다. 한편, 항체계 치료제는 그들의 표적에 대한 뛰어난 특이성 및 낮은 고유 독성을 가지므로 약물로서 상당한 잠재성을 갖는다. 또한, 새로운 화학 물질(NCE)의 개발과 비교할 때, 개발 시간이 상당히 감소될 수 있다. 하지만, 종래의 항체는 TNF-알파의 경우처럼, 리간드의 수용체-결합 도메인이 그루브내에 묻혀있는 다가 단백질에 대해서는 생성되기 어렵다. 카멜리대(Camelidae)에서 유래한 본 발명에서 개시된 중쇄 항체는 공동-결합 경향을 갖는 것으로 알려져 있다(WO97/49805호; Lauwereys et al., EMBO J. 17, 5312, 1998). 따라서, 그러한 중쇄 항체는 TNF와 같은 리간드의 수용체 결합 도메인에 결합하기에 원래 적합하다. 또한, 그러한 항체는 오랜 기간동안 안정하여 그들의 반감기를 증가시키는 것으로 알려져 있다(Perez et al., Biochemistry, 40, 74, 2001). 더욱이, 그러한 중쇄 항체 단편은 효모 또는 다른 미생물과 같은 포유류 세포 배양 발효(EP 0 698 097호)와 비교할 때 저렴한 발현 시스템을 이용하여 발효기에서 '한번에(en-masse)' 생산될 수 있다.
마우스, 양, 염소, 토끼 등과 같은 공급원으로부터 유래된 항체 및 그들의 인간화된 유도체를 염증의 조절을 필요로 하는 상태를 위한 치료로서 이용하는 것은 몇 가지 이유로 문제가 있다. 종래의 항체는 실온에서 안정하지 않으며, 제조 및 저장을 위해 냉장되어야 하므로 냉장 실험 장비, 냉장 저장 및 수송을 필요로 하여 시간과 비용을 소모하게 한다. 냉장은 때때로 개발도상국에서는 이용가능하지 않다. 더욱이, 상기 항체의 제조 또는 소규모 생산은, 본래의 활성 항체의 발현을 위해 필요한 포유류 세포 시스템이 시간과 설비면에서 높은 지지 수준을 요하며 수율이 매우 낮기 때문에 비용이 많이 든다. 더욱이 종래의 항체의 큰 크기는 예를 들어 염증 조직에서의 조직 침투를 제한할 것이다. 더욱이, 종래의 항체는 pH에 의존하는 결합 활성을 가져, 예를 들어 위 출혈, 위 수술을 치료하는 것과 같은 일반적인 생리학적 pH 범위외의 환경에서 사용하기에 적합하지 않다. 더욱이, 종래의 항체는 낮거나 높은 pH에서 불안정하여 경구 투여에 적합하지 않다. 하지만, 카멜리대 항체는 극한 pH, 변성 시약 및 고온과 같은 거친 조건에 저항하여 경구 투여에 의한 전달에 적합한 것으로 입증되었다. 더욱이, 종래의 항체는 온도에 의존하는 결합 활성을 가져, 생물학적으로 활성인 온도 범위(예, 37 ± 20 ℃)외의 온도에서 실시되는 분석 또는 키트에 사용하기에 부적합하다
폴리펩티드 치료제 및 특히 항체계 치료제는 그들의 표적에 대한 우수한 특이성 및 낮은 내재적인 독성을 가지므로 약물로서 상당한 잠재력을 갖는다. 하지만, 치료적으로 유용한 표적에 대해 얻어진 항체는, 사람에게 투여시 사람 개인에서 원치않는 면역학적 반응을 피하기 위하여, 사람 치료를 위해 항체를 제조하기 위해서는 추가적인 변형을 필요로 함을 당업자는 알고 있다. 변형 과정은 일반적으로 "인간화"로 불린다. 사람이 아닌 종에서 생성된 항체는 사람에서 치료적으로 유용하기 위해서는 인간화를 필요로 함이 알려져 있다( (1) CDR grafting: Protein Design Labs: 미국특허 6,180,370호, 미국특허 5,693,761호; Genentech 미국특허 6,054,297호;Celltech : 460167, EP 626390호, 미국특허 5,859,205호; (2) Veneering: Xoma: 미국특허 5,869,619호, 미국특허 5,766,886호, 미국특허 5,821,123호). 실질적인 인간화를 필요로 하지 않는, 또는 인간화의 필요를 완전히 제거한 항체를 생산하는 방법이 필요하다. 한정된 골격 영역 또는 아미노산 잔기를 가지며 실질적인 인간화가 필요없이 또는 인간화가 전혀 필요없이 사람 대상에게 투여될 수 있는 새로운 부류의 항체가 필요하다.
종래의 항체의 다른 중요한 단점은 그들이 복잡하고 큰 분자이며 따라서 상대적으로 불안정하며, 그리고 그들이 프로테아제에 의한 분해에 민감하다는 것이다. 이것은 종래의 항체 약물이 경구로, 혀밑으로, 국소로, 비강으로, 질내로, 직장으로, 또는 흡입에 의해 투여될 수 없음을 의미하며, 이는 그들이 이들 부위에서의 낮은 pH, 이들 부위 및 혈액에서의 프로테아제의 작용에 대해 저항성이 없으며 및/또는 그들의 큰 크기때문이다. 이들은 이들 문제점의 일부를 극복하기 위하여 주사에 의해(정맥내, 피하, 등) 투여되어야 한다. 주사에 의한 투여는 정확하고 안전하게 피하주사용 시린지 또는 주사바늘을 사용하기 위해 훈련받은 전문가를 필요로 한다. 추가로 멸균 설비, 치료 폴리펩티드의 액체 제제, 멸균되고 안정한 형태의 상기 폴리펩티드의 바이알 팩킹 및 주사 바늘의 주입을 위한 적절한 부위를 필요로 한다. 더욱이, 대상은 일반적으로 주사 맞기 전 및 주사시에 물리적 및 심리적 스트레스를 경험한다. 따라서, 비용/시간을 절약할 뿐만 아니라 또한 대상에게 보다 편리하고 편안한, 주사의 필요성을 제거한 치료 폴리펩티드의 전달 방법이 필요하다.
단일 도메인 항체계 치료제는 그들의 표적에 대한 우수한 특이성 및 낮은 내재적 독성을 가지므로 약물로서 상당한 잠재성을 갖는다. 하지만, 그들의 고유한 및 기능적 친화성을 더 개선하는 것은 치료제의 투여량 감소, 더 빠른 치료 및 부작용 감소와 같이 환자를 위한 많은 잇점을 야기할 수 있다.
본 발명의 목적은 TNF-알파, 상기 폴리펩티드의 상동체, 상기 폴리펩티드의 상동체의 기능성 부분에 결합하는 단일 도메인 항체 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 상기 폴리펩티드는 결합시에 TNF-알파의 생물학적 활성을 변형시킨다. 그러한 폴리펩티드는 TNF-알파의 수용체-결합그루브내로 결합하거나, 또는 수용체 결합 그루브에 결합하지 않을 수도 있다. 그러한 폴리펩티드는 단일 도메인 항체이다.
본 발명의 추가의 목적은 당업계의 임의의 것 또는 임의의 미래의 단일 도메인 항체일 수 있는 단일 도메인 항체를 제공하는 것이다. 예로는 중쇄 항체, 경쇄가 자연적으로 없는 항체, 종래의 4-쇄 항체에서 유래한 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체에서 유래된 것외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 한 태양에 따라, 여기서 이용되는 단일 도메인 항체는 경쇄가 없는 중쇄 항체로 알려진 자연 발생 단일 도메인 항체이다(WO 9404678호). 명확히 하기 위하여, 경쇄가 없는 중쇄 항체에서 유래된 이 가변성 도메인은 종래의 4-쇄 면역글로불린의 VH와 구별하기 위하여 VHH 또는 나노바디(nanobody)로 불릴 것이다. 그러한 VHH 분자는 예를 들어 낙타, 라마, 단봉낙타, 알파카, 및 야생라마와 같은 카멜리대 종에서 생성된 항체에서 유래될 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 항-TNF-알파 폴리펩티드를 정맥내로, 피하로, 경구로, 혀밑으로, 국소로, 비강으로, 질내로, 직장으로 또는 흡입에 의해 투여하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 1가 단일 도메인 항체의 결합 친화성을 증강시키는 것이다.
도 1은 실시예 1에서 설명된 항-인간 TNF VHH의 배열이다.
도 2는 실시예 1에 따라 ELISA에서 시험된 항-인간 TNF-알파 VHH의 희석 시리즈이다.
도 3은 실시예 1에 따라 사람 세포주 KYM을 이용한 세포독성 분석에서 결정된 VHH의 안타고니스트 효과이다.
도 4는 야생형 VHH#12B와 돌연변이 A74S+Y76N+K83R+P84A의 생체외 수용체 결합 분석이다.
도 5는 야생형 VHH#12B와 돌연변이 1E + Q5LA74S + Y76N + K83R + P84A의 생체외 수용체 결합 분석이다.
도 6은 야생형 VHH#3E 및 돌연변이 VHH의 ELISA에서의 결합이다.
도 7은 야생형 VHH#3E 및 돌연변이 VHH의 생체외 수용체 결합 분석이다.
도 8은 실시예 3에서 설명된 안타고니스트 항-마우스 TNF의 배열이다.
도 9는 실시예 3에 따라 쥐과 세포주 L929를 이용한 세포독성 분석에서 결정된 항-마우스 TNF VHH의 안타고니스트 효과이다.
도 10은 2가 또는 이특이적 VHH의 생산을 위한 벡터 pAX11 (pUC119 백본)의 EcoRl-HindIII 삽입체이다.
도 11은 IMAC-정제된 일- (레인 8), 이-(레인 1), 삼- (레인 2,3, 및 5) 및 4가 (레인 4,6, 및 7) 항-TNF알파 VHH의 쿠마시-염색된 PAGE (15%)이다.
도 12는 일-, 이-, 삼- 및 4가 VHH의 수퍼덱스 75HR에서의 젤 여과에 의한 분석의 크로마토그램이다.
도 13은 임상적으로 이용된 제품 레미케이드(Remicade)와 엔브렐(Enbrel)과 항-인간 TNF VHH의 일-, 이-, 삼- 및 4가 형태의 안타고니스트 특징을 비교한 것이다.
도 14는 마우스 TNF 알파에 대한 1가 및 2가 VHH의 안타고니스트 행동이다.
도 15는 실시예 4에서 설명된 사람 IgG1에서 유래한 VHH-Fc-융합체의 쿠마시 염색된 PAGE이다.
도 16은 생물분석에서 결정된, VHH#3E의 2가 형태와 비교한 VHH#3E에서 유래한 VHH-Fc 융합체의 안타고니스트 효능이다.
도 17은 pH 2.2, pH 3.2 및 pH 4.2에서 표준 및 펩신-처리된 TNF3E의 ELISA이다(100%는 1/100 희석에서 측정된 시그널이다).
도 18은 실험적 세팅이다.
표 1은 TNF-알파에 대한 본 발명의 태양들의 펩티드의 아미노산 서열 리스트이다.
표 2는 VHH#12B의 돌연변이유발을 위해 이용된 돌연변이 유발 반응, 돌연변이유발성 프라이머 및 주형의 리스트이다.
표 3은 VHH#3E의 돌연변이유발을 위해 이용된 돌연변이 유발 반응, 돌연변이유발성 프라이머 및 주형의 리스트이다.
표 4는 야생형 VHH와 인간화된 VHH의 개요이다.
표 5는 항-마우스 혈청 알부민/항 TNF-알파이다.
표 6은 사람 IFN-감마에 대한 VHH의 아미노산 서열 리스트이다.
표 7은 TNF-알파에 대한 2가(BIV 3E, BIV#m3F), 3가 (TRI3E) 또는 4가 (TETRA 3E) VHH의 서열이다.
표 8은 본 발명의 항-마우스 혈청 알부민 VHH의 아미노산 서열간의 분획 상동성이다.
표 9는 본 발명의 항-TNF-알파 VHH간의 분획 상동성이다.
표 10은 본 발명의 항-IFN-감마 VHH간의 퍼센티지 상동성이다.
표 11은 치료 스케쥴이다.
본 발명의 한 구체예는 항-TNF-알파 단일 도메인 항체 적어도 하나를 포함하는 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 구체예는 단일 도메인 항체가 서열 번호 1 내지 16 및 79 내지 84 중 어느 하나에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 구체예는 혈청 단백질에 대한 단일 도메인 항체 적어도 하나를 추가로 포함하는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 혈청 단백질이 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 티록신-결합 단백질, 트랜스페린, 또는 피브리노겐 중 어느 하나인 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 구체예는 단일 도메인 항-혈청 단백질 단일 도메인 항체가 서열 번호 26 내지 29 및 85 내지 97중 어느 하나에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 구체예는 서열 번호 30 내지 43 중 어느 하나에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 구체예는 항-IFN-감마 단일 도메인 항체, 항-TNF-알파 수용체 단일 도메인 항체 및 항-IFN-감마 수용체 단일 도메인 항체로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단일 도메인 항체를 추가로 포함하는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 구체예는 TNF-알파에 대한 단일 도메인 항체의 수가 적어도 두개인 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 구체예는 서열 번호 73 내지 76 중 어느 하나에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 구체예는 적어도 하나의 단일 도메인 항체가 인간화된 카멜리대 VHH인 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 구체예는 인간화된 카멜리대 VHH가 서열 번호 17 내지 19 및 21 내지 24 중 어느 하나에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 구체예는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드, 및 항-IFN-감마 단일 도메인 항체, 항-TNF-알파 수용체 단일 도메인 항체 및 항-IFN-감마 수용체 단일 도메인 항체로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단일 도메인 항체를 포함하는, 대상에의 동시, 분리 또는 순차적 투여를 위한 조성물이다.
본 발명의 다른 구체예는 적어도 하나의 항-IFN-감마 단일 도메인 항체가 서열 번호 44 내지 72 중 어느 하나에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물이다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단일 도메인 항체가 전길이 단일 도메인 항체의 상동성 서열, 기능적 부분, 또는 상동성 서열의 기능적 부분인 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물이다.
본 발명의 다른 구체예는 항-TNF-알파 폴리펩티드가 전길이 항-TNF-알파 폴리펩티드의 상동성 서열, 기능적 부분, 또는 상동성 서열의 기능적 부분인 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물이다.
본 발명의 다른 구체예는 적어도 하나의 단일 도메인 항체가 카멜리대 VHH인 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물이다.
본 발명의 다른 구체예는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드를 암호하는 핵산이다.
본 발명의 다른 구체예는 하기의 단계를 포함하는, 종양 괴사 인자-알파에의 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드의 결합을 조절하는 제제를 확인하는 방법이다:
(a) 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드를, 상기 폴리펩티드와 표적간의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절자의 존재 및 부재하에서 종양 괴사 인자 알파인 표적과 접촉시키는 단계, 및
(b) 단계 (a)의 상기 폴리펩티드와 표적간의 결합을 측정하며, 이때 상기 후보 조절자의 부재하에서의 결합에 비하여 후보 조절자의 존재하에서의 결합의 감소는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드와 종양 괴사 인자-알파의 결합을 조절하는 제제로서 상기 후보 조절자를 확인하는 단계.
본 발명의 다른 구체예는 하기를 포함하는, 종양 괴사 인자-알파에의 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드의 결합을 통해 종양 괴사 인자-알파-매개된 질환을 조절하는 제제를 확인하는 방법이다:
(a) 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드를, 상기 폴리펩티드와 표적간의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절자의 존재 및 부재하에서 종양 괴사 인자 알파인 표적과 접촉시키는 단계, 및
(b) 단계 (a)의 상기 폴리펩티드와 표적간의 결합을 측정하며, 이때 상기 후보 조절자의 부재하에서의 결합에 비하여 후보 조절자의 존재하에서의 결합의 감소는 종양 괴사 인자-알파-매개 질환을 조절하는 제제로서 상기 후보 조절자를 확인하는 단계.
본 발명의 다른 구체예는 하기를 포함하는, 종양 괴사 인자-알파에의 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드의 결합을 통해 종양 괴사 인자-알파의 그 수용체에의 결합을 조절하는 제제를 확인하는 방법이다:
(a) 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드를, 상기 폴리펩티드와 표적간의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절자의 존재 및 부재하에서 종양 괴사 인자 알파인 표적과 접촉시키는 단계, 및
(b) 단계 (a)의 상기 폴리펩티드와 표적간의 결합을 측정하며, 이때 상기 후보 조절자의 부재하에서의 결합에 비하여 후보 조절자의 존재하에서의 결합의 감소는 종양 괴사 인자-알파의 그 수용체에의 결합을 조절하는 제제로서 상기 후보 조절자를 확인하는 단계.
본 발명의 다른 구체예는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 및 종양 괴사 인자-알파를 포함하는 종양 괴사 인자-알파-매개된 질환을 조절하는 제제를 위한 스크리닝을 위한 키트이다.
본 발명의 다른 구체예는 전술한 본 발명의 방법에 따라 확인된, 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드의 종양 괴사 인자-알파에의 결합을 조절하는 미지의 제제이다.
본 발명의 다른 구체예는 전술한 본 발명의 방법에 따라 확인된, 종양 괴사 인자-알파-매개 질환을 조절하는 미지의 제제이다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 질환이 염증, 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군 및 다발성 경화증 중 하나 이상인 전술한 미지의 제제이다.
본 발명의 다른 구체예는 염증성 과정에 관련된 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 전술한 핵산, 또는 전술한 조성물 또는 전술한 제제이다.
본 발명의 다른 구체예는 염증성 과정에 관련된 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 전술한 핵산, 또는 전술한 조성물 또는 전술한 제제이다.
본 발명의 다른 구체예는 불활성화되지 않고 위장 환경을 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물이다.
본 발명의 다른 구체예는 불활성화되지 않고 위장 환경을 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한, 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물의 용도이다.
본 발명의 다른 구체예는 질 및/또는 직장관에 전달되는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물이다.
본 발명의 다른 구체예는 질 및/또는 직장관에 전달되는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물의 용도이다.
본 발명의 다른 구체예는 코, 상부 호흡기 및/또는 폐에 전달되는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물이다.
본 발명의 다른 구체예는 코, 상부 호흡기 및/또는 폐에 전달되는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물의 용도이다.
본 발명의 다른 구체예는 장 점막에 전달되는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이며 장 점막의 투과성을 증가시키는 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물이다.
본 발명의 다른 구체예는 장 점막에 전달되는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이며 장 점막의 투과성을 증가시키는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물의 용도이다.
본 발명의 다른 구체예는 혀 밑의 조직을 효과적으로 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물이다.
본 발명의 다른 구체예는 혀 밑의 조직을 효과적으로 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물의 용도이다.
본 발명의 다른 구체예는 피부를 효과적으로 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물이다.
본 발명의 다른 구체예는 피부를 효과적으로 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 전술한 조성물의 용도이다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 질환이 염증, 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군, 다발성 경화증, 애디슨 질병, 자가면역 간염, 자가면역 이하선염, 타입 I 당뇨병, 부고환염, 사구체신염, 그레이브 질병, 길리안-바레 증후군, 하시모토 질병, 용혈성 빈혈, 전신성 루푸스 홍반, 남성 불임, 다발성 경화증, 중증근육무력증, 천포창, 건선, 류마티스성 열, 류마티스 관절염, 사르코이드종, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 척추관절병증, 갑상샘염, 및 혈관염 중 어느 것인 전술한 방법, 전술한 키트, 전술한 핵산 또는 제제, 전술한 핵산 또는 제제의 용도, 전술한 조성물, 전술한 조성물의 용도, 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드, 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드의 용도이다.
본 발명의 다른 구체예는 전술한 핵산 또는 제제, 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 전술한 조성물, 및 적합한 약학적 비히클을 포함하는 조성물이다.
본 발명의 다른 구체예는 하기를 포함하는 종양 괴사 인자-알파의 기능장애를 특징으로 하는 질환을 진단하는 방법이다:
(a) 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드와 샘플을 접촉시키는 단계,
(b) 상기 폴리펩티드의 상기 샘플에의 결합을 검출하는 단계, 및
(c) 단계 (b)에서 검출된 결합을 표준과 비교하며, 이때 상기 샘플에 비하여 결합의 차이는 종양 괴사 인자-알파의 기능장애를 특징으로 하는 질병의 진단인 단계.
본 발명의 다른 구체예는 전술한 방법을 이용한, 전술한 질환을 스크리닝하기 위한 키트이다.
본 발명의 다른 구체예는 전술한 분리된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 포함하는 전술한 질환을 스크리닝하기 위한 키트이다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 종양 괴사 인자-알파의 정제를 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드의 용도이다.
본 발명의 다른 구체예는 종양 괴사 인자-알파와 하나 이상의 종양 괴사 인자-알파 수용체간의 상호작용을 억제하기 위한 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드의 용도이다.
본 발명의 다른 구체예는 하기의 단계를 포함하는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드를 생산하는 방법이다:
(a) 종양 괴사 인자 알파에 대한 카멜리대 VHH를 암호하는 이중쇄 DNA를 얻는 단계, 및
(b) 단계 (a)에서 선택된 DNA를 클로닝하고 발현시키는 단계.
본 발명의 다른 구체예는 하기를 포함하는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드를 생산하는 방법이다:
(a) 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서, 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드를 암호할 수 있는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
(b) 상기 배양으로부터 생산된 폴리펩티드를 회수하는 단계.
본 발명의 다른 구체예는 상기 숙주 세포가 박테리아 또는 효모인 전술한 방법이다.
본 발명의 다른 구체예는 전술한 항-TNF-알파 폴리펩티드를 포함하는, 염증, 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군 또는 다발성 경화증 중 어느 것을 스크리닝하기 위한 키트이다.
본 발명은 TNF-알파에 대한 단일 도메인 항체 하나 이상을 포함하는 항-종양 괴사 인자-알파(TNF-알파) 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 암호할 수 있는 핵산에 관한 것이다.
단일 도메인 항체는 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 항체이다. 예로는 중쇄 항체, 경쇄가 자연적으로 없는 항체, 종래의 4-쇄 항체에서 유래한 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체에서 유래된 것외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 단일 도메인 항체는 당업계의 임의의 것 또는 임의의 미래의 단일 도메인 항체일 수 있다. 단일 도메인 항체는 마우스, 사람, 낙타, 라마, 염소, 토끼, 소를 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 한 태양에 따라, 여기서 이용되는 단일 도메인 항체는 경쇄가 없는 중쇄 항체로 알려진 자연 발생 단일 도메인 항체이다. 그러한 단일 도메인 항체는 예를 들어 WO 94/04678호에 개시된다. 명확히 하기 위하여, 경쇄가 자연적으로 없는 중쇄 항체에서 유래된 이 가변성 도메인은 종래의 4-쇄 면역글로불린의 VH와 구별하기 위하여 VHH 또는 나노바디(nanobody)로 불릴 것이다. 그러한 VHH 분자는 예를 들어 낙타, 단봉낙타, 라마, 알파카, 및 야생라마와 같은 카멜리대 종에서 생성된 항체에서 유래될 수 있다. 카멜리대 외의 다른 종이 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생산할 수도 있으며, 그러한 VHH는 본 발명의 범위내이다.
본 발명에 따른, 그리고 당업자에게 알려진 VHH는 WO 94/04678호에 개시된 카멜리대에서 유래한 것과 같은 경쇄가 자연적으로 없는 면역글로불린에서 유래한 중쇄 가변 도메인이다(그리고 이후에는 VHH 도메인 또는 나노바디로 불림). VHH 분자는 IgG 분자보다 약 10배 더 작다. 이들은 단일 폴리펩티드이며 매우 안정하여 극한 pH와 온도 조건을 견딘다. 더욱이, 이들은 종래의 항체와는 달리 프로테아제의 작용에 대해 내성을 갖는다. 더욱이, VHH의 생체외 발현은 높은 수율로, 적절하게 접힌 기능성 VHH를 생산한다. 또한, 카멜리대에서 생성된 항체는 항체 라이브러리의 사용을 통하여 또는 카멜리대외의 포유류의 면역화를 통하여 생체외에서 생성된 항체에 의해 인식되는 것들외의 에피토프를 인식할 것이다(WO 9749805호). 따라서, 항-TNF-알파 VHH는 종래의 항체보다 더 효과적으로 TNF-알파와 상호작용하여 TNF-알파 수용체와 TNF-알파의 상호작용을 더 효과적으로 차단할 수 있다.
본 발명에 따라, TNF-알파는 임의의 종으로부터 유래된다. 본 발명에 관련된 종의 예는 토끼, 염소, 쥐, 소, 송아지, 낙타, 라마, 원숭이, 당나귀, 기니아피그, 닭, 양, 개, 고양이, 말 및 바람직하게는 사람을 포함한다.
TNF-알파는 또한 면역 반응을 유도할 수 있는 TNF-알파의 단편이다. TNF-알파는 또한 전길이 TNF-알파에 대한 단일 도메인 항체에 결합할 수 있는 TNF-알파의 단편이다.
TNF-알파에 대한 단일 도메인 항체는 10-6 M 보다 우수한 친화성으로 TNF-알파에 결합할 수 있는 단일 도메인 항체를 의미한다.
본 발명의 한 구체예는 단일 도메인 항체가 TNF-알파에 대한 카멜리대 VHH를 포함하는 항-TNF 폴리펩티드이다.
TNF-알파에 대한 항-TNF 폴리펩티드의 단일 도메인 항체 하나 이상은 동일한 서열일 수 있다. 다르게는 그들은 모두 동일한 서열을 갖지 않을 수도 있다. 항-TNF 폴리펩티드가 모두 동일한 서열을 공유하지는 않지만 동일한 표적, 하나 이상의 그 항원에 대한 항-TNF-알파 단일 도메인 항체를 포함하는 것은 본 발명의 범위내이다.
본 발명의 다른 구체예는 단일 도메인 항체가 표 1에 나타난 서열 번호 1 내지 16 및 79 내지 84 중 어느 것에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 항-TNF-알파 폴리펩티드이다. 상기 서열은 TNF-알파에 대한 카멜리대 중쇄 항체(VHH)에서 유래된다.
본 발명은 추가로 상기 단일 도메인 항체가 TNF-알파에 대한 VHH이며, 이때 상기 VHH가 인간-유사 서열을 갖는 부류에 속하는, 항-TNF-알파 폴리펩티드에 관한 것이다. 이 부류는 카바트(Kabat) 넘버링에 따를 때, VHH가 예를 들어 L45처럼 위치 45에서 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 또는 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 및 위치 103에서 트립토판을 보유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 개시된 카멜리대 단일-도메인 항체의 상기 새로운 부류(표 1, 실시예 1)는 위치 103에서의 소수성 잔기 트립토판과 함께 FR2에서 소수성 잔기를 함유하는 VHH#2B(서열 번호 3)와 VHH#12B(서열 번호 14)에 의해 나타내진다.
서열 VHH#1A (서열 번호 1), VHH#4B (서열 번호 12), VHH#8-29 (서열 번호 81), VHH#8-41 (서열 번호 82), VHH#8-42 (서열 번호 83) 및 VHH#8-44 (서열 번호 84) (표 1, 실시예 1)에 의해 나타내지는 카멜리대 단일 도메인 항체의 다른 사람-유사 부류는 WO03035694호에 개시되었으며 사람 기원 또는 다른 종의 종래의 항체에서 일반적으로 발견되는 소수성 FR2 잔기를 함유하지만, 이중쇄 항체로부터의 VH에 존재하는 보존된 트립토판 잔기를 대신하는 위치 103에서의 하전된 아르기닌 잔기에 의해 친수성의 손실을 보상한다. 따라서, 이들 두 부류에 속하는 펩티드는 사람 VH 골격 영역에 높은 아미노산 서열 상동성을 나타내며 상기 펩티드는 원치않는 면역 반응의 예상없이 그리고 추가 인간화의 부담없이 사람에 직접 투여될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 암호할 수 있는 핵산에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 한 태양은 단일 도메인 항체가 VHH의 인간화된 부류에 속하며 서열 번호 1, 3, 12, 14, 81, 82, 83, 및 84 중 어느 것에 의해 나타내지는 서열을 포함하는 항-TNF-알파 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 환자에게 직접 투여하는 것을 허용한다.
본 발명에 의해 이용되는 임의의 VHH는 사람-유사 카멜리대 항체의 부류 또는 종래의 부류일 수 있다. 상기 항체는 전체 TNF-알파, 또는 그 단편, 또는 그 상동성 서열의 단편에 대해 형성될 수 있다. 이들 폴리펩티드는 전길이 카멜리대 항체, 즉 Fc 및 VHH 도메인, 사람 Fc 도메인 또는 VHH를 갖는 중쇄 카멜리대 항체의 그 자신 또는 그 유래 단편에 의한 키메라 버젼을 포함한다.
항-혈청 알부민 VHH는 종래의 항체보다 담체 단백질로 알려진 혈청 알부민과 더 효과적인 방식으로 상호작용할 수도 있다. 담체 단백질로서 혈청 알부민의 에피토프의 일부는 결합된 단백질, 펩티드 및 작은 화학적 화합물에 의해 접근이 불가능할 수도 있다. VHH는 공동과 같은 '특이한' 또는 비통상적인 에피토프내로 결합하는 것으로 알려져 있으므로(WO 97/49805호), 순환하는 알부민에 대한 그러한 VHH의 친화성이 증가될 수 있다.
본 발명은 또한 대상의 혈청 단백질 하나 이상에 대한 단일 도메인 항체 하나 이상을 추가로 포함하는 여기서 개시된 항-TNF 폴리펩티드가 놀랍게도 상기 구조체의 일부가 아닐 때의 항-TNF-알파 단일 도메인 항체의 반감기에 비하여 상기 대상의 순환에서 상당히 지연된 반감기를 갖는다는 발견에 관한 것이다. 그러한 폴리펩티드의 예는 서열 번호 30 내지 43에 의해 표 5에서 나타내진다. 더욱이, 상기 폴리펩티드는 마우스에서 그대로 남아있는 높은 안정성, 극한 pH 내성, 고온 안정성 및 높은 표적 친화성과 같은 단일 도메인 항체의 동일한 바람직한 특성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 다른 구체예는 서열 번호 30 내지 43(표 5)에 의해 나타내지는 임의의 것에 해당하는 서열을 포함하며, 하나 이상의 혈청 단백질에 대한 단일 도메인 항체 하나 이상을 추가로 포함하는 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 구체예는 항-혈청 단백질 단일 도메인 항체가 표 5에 나타난 서열 번호 26 내지 29 및 85 내지 97 중 임의의 것에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
혈청 단백질은 대상의 혈청에서 발견되는 임의의 적합한 단백질일 수 있다. 본 발명의 한 태양에서, 혈청 단백질은 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 티록신-결합 단백질, 트랜스페린, 또는 피브리노겐이다. 효과적인 치료를 위해 필요한 반감기 및/또는 표적 항원의 구획화와 같은 의도하는 용도에 따라, VHH-파트너는 상기 혈청 단백질 중 하나로 지시될 수 있다.
본 발명의 다른 태양은 항-IFN-감마 폴리펩티드, 항-TNF-알파 수용체 폴리펩티드 및 항-IFN-감마 수용체 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 적어도 하나를 추가로 포함하는 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
IFN-감마에 대한 단일 도메인 항체가 표 6에 나타난 서열 번호 44 내지 72 중 어느 것에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 것은 본 발명의 구체예이다.
본 발명의 한 태양에 따라, 단일 도메인 항체는 TNF-알파 수용체에 대해 형성된다. 상기 단일 도메인 항체는 카멜리대 VHH일 수 있다.
본 발명의 한 태양에 따라, 단일 도메인 항체는 IFN-감마 수용체에 대해 형성된다. 상기 단일 도메인 항체는 카멜리대 VHH일 수 있다.
본 발명의 다른 태양은 후술하는 바와 같이 서로 연결된 폴리펩티드와 같은,항-IFN-감마 폴리펩티드, 항-TNF-알파 수용체 폴리펩티드 및 항-IFN-감마 수용체 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 적어도 하나를 추가로 포함하는 항-TNF-알파 폴리펩티드의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 여기서 인용된 자가면역 질병 또는 상태를 치료하는 방법이다.
그러한 다중-특이적 구조체는 단일-특이적 구조체에 비하여 염증성 치료 화합물로서 개선된 성능을 가질 수 있다.
본 발명의 한 태양은 동시, 별도 또는 순차적으로 대상에 투여하기 위한, 항-IFN-감마 폴리펩티드, 항-TNF-알파 수용체 폴리펩티드 및 항-IFN-감마 수용체 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 적어도 하나 및 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 포함하는 조성물이다.
본 발명의 한 태양은 항-IFN-감마 폴리펩티드, 항-TNF-알파 수용체 폴리펩티드 및 항-IFN-감마 수용체 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 적어도 하나 및 항-TNF-알파 폴리펩티드의 유효량을 동시에, 별도로 또는 순차적으로 개인에게 투여하는 것을 포함하는 자가면역 질병 치료 방법이다.
본 발명의 다른 태양은 대상에게 동시, 별도 또는 순차적으로 투여하기 위한 항-IFN-감마 폴리펩티드, 항-TNF-알파 수용체 폴리펩티드 및 항-IFN-감마 수용체 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 적어도 하나 및 항-TNF-알파 폴리펩티드를 함유하는 키트이다. 상기 키트가 본 발명에 따라 이용되는 것은 본 발명의 태양이다. 상기 키트를 여기서 인용된 질병을 치료하기 위해 이용하는 것은 본 발명의 태양이다.
동시 투여란 폴리펩티드들이 동시에 대상에게 투여되는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 혼합물로서 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서이다. 그 예로는 정맥내로 투여되는 용액, 정제, 액체, 국소 크림 등을 포함하며 이에 한정되지 않으며, 이때 각 제제는 대상 폴리펩티드를 포함한다.
별도 투여란 폴리펩티드가 동시에 또는 실질적으로 동시에 대상에게 투여되는 것을 의미한다. 폴리펩티드는 별도의, 혼합되지 않은 제제로 키트내에 존재한다. 예를 들어, 상이한 폴리펩티드는 별도의 정제로서 키트내에 존재할 수 있다. 상기 정제들은 두 정제를 동시에, 또는 한 정제에 이어 다른 정제를 삼킴으로써 대상에게 투여될 수 있다.
순차적인 투여란 폴리펩티드가 대상에게 순차적으로 투여됨을 의미한다. 폴리펩티드는 별도의 혼합되지 않은 제제로서 키트내에 존재한다. 투여간에는 시간적 간격이 있다. 예를 들어, 한 폴리펩티드는 다른 성분 후에 최대 336, 312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, 144, 120, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2,1 또는 0.5 시간까지 투여될 수 있다.
순차적 투여에서는, 한 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드의 투여 전 및/또는 후에 한번, 또는 여러번 그리고 다양한 투여량으로 투여될 수 있다. 순차적 투여는 동시 또는 순차적 투여와 조합될 수 있다.
후술되는 항-TNF-알파 폴리펩티드의 의학적 용도는 또한 전술한 대로 대상에게 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여하기 위한, 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드 및 항-IFN-감마 폴리펩티드, 항-TNF-알파 수용체 폴리펩티드 및 항-IFN-감마 수용체 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 적어도 하나를 포함하는 조성물에 적용된다.
본 발명의 한 태양에 따라, 항-IFN-감마 폴리펩티드는 IFN-감마에 대한 항-TNF-알파 단일 도메인 항체이다. 상기 단일 도메인 항체는 카멜리대 VHH일 수 있다.
본 발명의 한 구체예는 IFN-감마에 대한 단일 도메인 항체가 표 6에 나타난 서열 번호 44 내지 72 중 어느 것에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 것이다.
본 발명의 한 태양에 따라, 항-TNF-알파는 TNF-알파 수용체에 대한 단일 도메인 항체이다. 상기 단일 도메인 항체는 카멜리대 VHH일 수 있다.
본 발명의 한 태양에 따라, 항-IFN-감마 수용체 폴리펩티드는 IFN-감마 수용체에 대한 항-TNF-알파 단일 도메인 항체이다. 상기 단일 도메인 항체는 카멜리대 VHH일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드이며, 이때 TNF-알파에 대한 단일 도메인 항체의 수는 둘이상이다. 그러한 다가 항-TNF-알파 폴리펩티드는 표적에 대해 특이하게 높은 기능적 친화성의 잇점을 가져 그들의 1가 대응물에 비교할 때 예상보다 훨씬 높은 억제 특성을 나타낸다.
다가 항-TNF-알파 폴리펩티드는 1가 모 항-TNF-알파 폴리펩티드보다 훨씬 높은 기능적 친화성을 갖는다. 본 발명자들은 이들 다가 폴리펩티드의 기능적 친화성이 2가 및 다가 항체에 대해 이전에 보고된 것들보다 훨씬 높음을 발견했다. 놀랍게도, 서로 직접 연결되거나(서열 번호 77과 78) 또는 짧은 링커 서열을 통해 연결된 본 발명의 항-TNF-알파 폴리펩티드는 종래의 다가 4쇄 항체에서 이론적으로 예상된 것보다 높은 기능적 친화성을 갖는다.
본 발명자들은 그러한 크게 증가된 기능적 친화성이 바람직하게는 직접적인 결합 분석 또는 기능 분석, 예, 세포독성 분석에서, 다도메인 및 다가 단백질로 구성된 항원으로 검출될 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 다른 구체예는 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드이며, 이때 TNF-알파에 대한 단일 도메인 항체의 수는 둘 이상이며, 상기 항-TNF-알파 폴리펩티드는 서열 번호 73 내지 76에 의해 나타내지는 임의의 것에 해당하는 서열을 포함한다.
단일 도메인 항체는 당업계에 공지된 방법 또는 임의의 미래의 방법을 이용하여 둘 이상의 단일 도메인 항체를 포함하는 여기서 개시된 임의의 폴리펩티드를 형성하기 위하여 연결될 수 있다. 예를 들어, 이들은 아미노산 잔기를 Blattler et al, Biochemistry 24,1517-1524 ; EP294703호에 의해 개시된 것과 같은 유기 유도화 제제와 반응시켜 화학적 가교에 의해 융합될 수 있다. 다르게는, 단일 도메인 항체는 DNA 레벨에서 유전학적으로 융합될 수 있어, 즉, 하나 이상의 항-표적 단일 도메인 항체와 하나 이상의 항-혈청 단백질 단일 도메인 항체를 포함하는 완전한 폴리펩티드 구조체를 암호하는 폴리뉴클레오티드 구조체를 형성시킬 수 있다. 2가 또는 다가 VHH 폴리펩티드 구조체를 생산하는 방법이 PCT 출원 WO 96/34103호에 개시된다. 다수의 단일 도메인 항체를 연결하는 한 가지 방법은 단일 도메인 항체 암호 서열을 직접 연결하는 유전적 경로를 통해서 또는 펩티드 링커를 통하여서이다. 예를 들어, 첫번째 단일 도메인 항체의 C-말단은 다음 단일 도메인 항체의 N-말단에 연결될 수 있다. 이 연결 모드는 3가, 4가 등의 기능적 구조체의 구성 및 생산을 위해 추가의 단일 도메인 항체를 연결시키기 위해 확장될 수 있다.
본 발명의 한 태양에 따라, 단일 도메인 항체는 링커 사용없이 직접 서로 연결된다. 두 서브유닛에서 결합 활성을 보유하기 위해 링커 서열이 필요한, 부피 큰 종래의 항체를 연결하는 것과는 대조적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 직접 연결될 수 있어(서열 번호 77과 78) 사람 대상에 투여될 때의 항원성, 서브유닛의 분리를 야기하는 링커 서열의 불안정성과 같은 링커 서열의 잠재적인 문제점을 피할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 단일 도메인 항체는 펩티드 링커 서열을 통하여 서로 연결된다. 그러한 링커 서열은 자연 발생 서열 또는 비자연 발생 서열일 수 있다. 링커 서열은 항-TNF-알파 폴리펩티드가 투여되는 대상에서 비면역원성으로 예상된다. 링커 서열은 단백질 분해에 내성인 것과 동시에, 다가의 항-TNF-알파 폴리펩티드에 충분한 유연성을 제공할 수 있다. 링커 서열의 비제한적인 예는 WO 96/34103호에서 개시된 VHH의 힌지 영역에서 유래할 수 있는 것이다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 둘보다 많은 단일 도메인 항체를 포함하는 다가 단일 도메인 항체가 직접 또는 링커 서열을 통하여 서로 연결될 수 있다. 그러한 구조체는 부피가 큰 서브유닛의 입체 장애로 인해 종래 항체를 이용하여 생산되기 어려우며, 기능성은 1가 구조체와 비교하여 본 발명의 VHH에서 나타난 것처럼 상당히 증가되기 보다는 손실되거나 크게 감소될 것이다(그러한 다가 VHH 구조체의 젤 여과 분석을 위해서는 도 12를 참고한다).
여기서 개시된 폴리펩티드 구조체는 당업계에 공지된 방법 또는 임의의 미래의 방법에 따라 당업자에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들어, VHH는 낙타를 면역화하고 그로부터 하이브리도마를 얻거나, 또는 당업계에 공지된 분자 생물학 기법을 이용하여 단일 도메인 항체 라이브러리를 클로닝하고 파아지 디스플레이를 이용하여 후속 선별하는 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 얻을 수 있다.
본 발명의 태양에 따라, 항-TNF-알파 폴리펩티드는 전길이 항-TNF-알파 폴리펩티드의 상동성 서열일 수 있다. 본 발명의 다른 태양에 따라, 항-TNF-알파 폴리펩티드는 전길이 항-TNF-알파 폴리펩티드의 기능성 부분일 수 있다. 본 발명의 다른 태양에 따라, 항-TNF-알파 폴리펩티드는 전길이 항-TNF-알파 폴리펩티드의 상동성 서열일 수 있다. 본 발명의 다른 태양에 따라, 항-TNF-알파 폴리펩티드는 전길이 항-TNF-알파 폴리펩티드의 상동성 서열의 기능성 부분일 수 있다. 본 발명의 태양에 따라 항-TNF-알파 폴리펩티드는 항-TNF-알파 폴리펩티드의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 태양에 따라 항-TNF-알파 폴리펩티드를 형성하기 위해 이용된 단일 도메인 항체는 완전한 단일 도메인 항체(예, VHH) 또는 그 상동성 서열일 수 있다. 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리펩티드 구조체를 형성하기 위해 이용된 단일 도메인 항체는 완전한 단일 도메인 항체의 기능성 부분일 수 있다. 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리펩티드 구조체를 형성하기 위해 이용된 단일 도메인 항체는 완전한 단일 도메인 항체의 상동성 서열일 수 있다. 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리펩티드 구조체를 형성하기 위해 이용된 단일 도메인 항체는 완전한 단일 도메인 항체의 상동성 서열의 기능성 부분일 수 있다.
여기서 이용될 때, 본 발명의 상동성 서열은 본 발명의 폴리펩티드의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 추가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 아미노산 결실 또는 치환의 수는 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70 아미노산이다.
본 발명에 따른 상동성 서열은 아미노산의 추가, 결실 또는 치환에 의해 변형된 폴리펩티드일 수 있으며, 상기 변형은 비변형 폴리펩티드와 비교할 때 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는다.
본 발명에 따른 상동성 서열은 아미노산의 추가, 결실 또는 치환에 의해 변형된 폴리펩티드일 수 있으며, 상기 변형은 비변형 폴리펩티드와 비교할 때 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는다.
본 발명에 따른 상동성 서열은 예를 들어, 낙타, 단봉낙타, 라마, 알파카, 야생라마 등과 같은 다른 카멜리대 종에 존재하는 서열 일 수 있다.
상동성 서열이 서열 동일성을 나타내는 경우, 이것은 모 서열과 높은 서열 동일성(70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 보다 높은 서열 동일성)을 제시하며 바람직하게는 모 서열의 유사한 특성, 즉, 친화성을 특징으로 하는 서열을 의미하며, 상기 동일성은 공지의 방법을 이용하여 계산된다.
다르게는, 상동성 서열은 또한 하기 식에 따라 모 서열의 임의의 수의 위치에서 허용된 치환으로부터 생성된 임의의 아미노산 서열일 수 있다:
Ser, Thr, Gly, 및 Asn에 의해 치환된 Ser;
Arg, His, Gln, Lys, 및 Glu 중 하나에 의해 치환된 Arg;
Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, 및 Val 중 하나에 의해 치환된 Leu;
Pro, Gly, Ala, 및 Thr 중 하나에 의해 치환된 Pro;
Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His, 및 Gln 중 하나에 의해 치환된 Thr;
Ala, Gly, Thr, 및 Pro 중 하나에 의해 치환된 Ala;
Val, Met, Tyr, Phe, Ile, 및 Leu 중 하나에 의해 치환된 Val;
Gly, Ala, Thr, Pro, 및 Ser 중 하나에 의해 치환된 Gly;
Ile, Met, Tyr, Phe, Val, 및 Leu 중 하나에 의해 치환된 Ile;
Phe, Trp, Met, Tyr, Ile, Val, 및 Leu 중 하나에 의해 치환된 Phe;
Tyr, Trp, Met, Phe, Ile, Val, 및 Leu 중 하나에 의해 치환된 Tyr;
His, Glu, Lys, Gln, Thr, 및 Arg 중 하나에 의해 치환된 His;
Gln, Glu, Lys, Asn, His, Thr, 및 Arg 중 하나에 의해 치환된 Gln;
Asn, Glu, Asp, Gln, 및 Ser 중 하나에 의해 치환된 Asn;
Lys, Glu, Gln, His, 및 Arg 중 하나에 의해 치환된 Lys;
Asp, Glu, 및 Asn 중 하나에 의해 치환된 Asp;
Glu, Asp, Lys, Asn, Gln, His, 및 Arg 중 하나에 의해 치환된 Glu;
Met, Phe, Ile, Val, Leu, 및 Tyr 중 하나에 의해 치환된 Met.
본 발명에 따른 상동성 뉴클레오티드 서열은 엄격한 하이브리드화 조건하에서(예, Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New York에 의해 개시된 것), 모 서열을 암호할 수 있는 뉴클레오티드 서열의 역-보체에 하이브리드할 수 잇는 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 또는 1000 뉴클레오티드보다 많은 뉴클레오티드 서열을 말할 수 있다.
여기서 이용될 때, 기능적 부분은 대상 상호작용이 1 x 10-6 M 또는 그 이상의 친화성으로 유지될 수 있는 충분한 크기인 단일 도메인 항체의 서열을 말한다.
다르게는, 기능적 부분은 완전한 아미노산 서열의 부분적인 결실을 포함하며 표적과의 결합 및 상호작용에 필요한 결합 부위 및 단백질 도메인을 여전히 유지한다.
여기서 이용될 때, 기능적 부분은 완전한 서열의 100% 미만(예, 99%, 90%, 80%, 70%, 60% 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1 % 등)을 말하지만, 5 이상의 아미노산 또는 15 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
TNF-알파, TNF-알파 수용체, 혈청 단백질(예, 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 티록신-결합 단백질, 트랜스페린, 피브리노겐) 및 IFN-감마, IFN-감마 수용체와 같은 여기서 언급된 표적은 상기 표적의 단편일 수 있다. 따라서, 표적은 또한 면역 반응을 유도할 수 있는 상기 표적의 단편이다. 표적은 또한 전길이 표적에 대해 생성된 단일 도메인 항체에 결합할 수 있는 상기 표적의 단편이다.
여기서 이용될 때 단편은 서열의 100% 미만(예, 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 등)을 말하지만, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 이상의 아미노산을 포함한다. 단편은 대상 상호작용이 1 x 10-6 M 또는 그 이상의 친화성으로 유지될 수 있는 충분한 길이이다.
여기서 사용될 때 단편은 또한 야생형 표적에 대해 생성된 단일 도메인 항체에 표적이 결합하는 능력을 실질적으로 변화시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 선택적인 삽입, 결실 및 치환을 말한다. 아미노산 삽입, 결실 또는 치환의 수는 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 또는 70 아미노산이다.
본 발명의 상동성 서열은 인간화된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 새로운 부류의 VHH의 항체의 인간화는 투여시 사람 개인에서 원치않는 면역 반응의 가능성을 추가로 감소시킬 것이다.
본 발명의 한 구체예는 항원에 대한 도메인의 천연 친화성을 감소시키지 않는 한편 이종성 종에 대한 그 면역원성을 감소시키도록 변형될 수 있는 항체 가변 도메인(VHH)의 아미노산 잔기를 결정함으로써 라마 항체에 기초한 변형된 폴리펩티드를 제조하는 방법; 이종성 종에 투여하기에 유용한 것으로 확인된 잔기에서 변형을 갖는 VHH의 용도; 및 그렇게 변형된 VHH에 관한 것이다.
더욱 구체적으로는, 본 발명은 사람에게 투여하기 위해 변형된 변형 VHH의 제조, 생성된 VHH 자체, 및 사람에서 질병의 치료에서 그러한 "인간화된" VHH의 용도에 관한 것이다. 인간화된이란 사람 환자에 투여시 면역원성이 적거나 존재하지 않도록 돌연변이됨을 의미한다. 본 발명에 따라 폴리펩티드를 인간화하는 것은 카멜리대 아미노산 중 하나 이상을 사람 컨센서스 서열에서 발견되는 그들의 사람 대응부로 치환시키되 그 폴리펩티드가 그것의 일반적인 특징을 잃지 않도록 하는 단계를 포함하며, 즉, 인간화는 생성된 폴리펩티드의 항원 결합 능력에 크게 영향을 주지 않는다. 그러한 방법은 당업자에게 알려져 있다.
카멜리대 단일 도메인 항체의 인간화는 단일 폴리펩티드 쇄에서 한정된 양의 아미노산의 도입과 돌연변이유발을 필요로 한다. 이것은 두 쇄, 경쇄 및 중쇄에서의 아미노산 변화의 도입 및 두 쇄의 조립체의 보존을 필요로 하는 scFv, Fab, (Fab)2 및 IgG의 인간화와 대조적이다.
비제한적인 예로서, FR2에서 사람-유사 잔기를 함유한 VHH#12B의 폴리펩티드를 인간화시켰다. 인간화는 레퍼토리 클로닝을 위해 사용된 프라이머에 의해 도입되었으며 라마 서열에서 자연적으로는 발생하지 않는, 위치 1과 5에서 FR1내의 잔기의 돌연변이유발을 필요로 하였다. 이들 잔기의 돌연변이유발은 결합 및/또는 억제 활성의 손실을 야기하지 않았다. 인간화는 또한 위치 74, 76, 83, 84, 93에서 FR3내의 잔기의 돌연변이 유발을 필요로 하였다. 이들 잔기의 돌연변이유발은 결합 및/또는 억제 활성의 심한 손실을 야기하지 않았다(도 4 참고). 따라서 FR1과 FR3의 돌연변이를 조합하는 것은 결합 및/또는 억제 활성에 영향을 주지 않았다(도 5). 인간화는 또한 위치 108에서 FR4의 잔기의 돌연변이 유발을 필요로 하였다. Q108L의 돌연변이유발은 에스케리챠 콜리에서 생산 수준의 감소를 야기하였다. 위치 108은 카멜리대 VHH에서 용매에 노출되며, 사람 항체에서는 이 위치는 VH-VL 계면에 묻힌다(Spinelli, 1996; Nieba, 1997). 분리된 VH에서 위치 108은 용매에 노출된다. 극성 비전하 Gln 대신 비극성 소수성 Leu의 도입은 분자의 고유의 접힘/안정성에 극적인 효과를 가질 수 있다.
비제한적인 예로서, 친수성 특징을 갖는 위치 37, 44, 45, 및 47에서 카멜리대 특징 잔기를 함유한 VHH#3E로 나타내진 폴리펩티드를 인간화시켰다. 위치 44와 45에서 사람 소수성 잔기에 의한 친수성 잔기의 치환(E44G와 R45L)은 결합 및/또는 억제에 영향을 주지 않았다. 하지만, 결합 및/또는 억제 활성의 손실은 F37V와 F47W가 도입되었을 때 관찰되었다. 모델링 데이터는 CDR3 루프 형태의 통합성 및 따라서 활성을 보존하기 위해 중요한 잔기가 37임을 확인하였다(도 6 참고)(모든 넘버링은 카바트에 따름).
서열 번호 3과 14는 사람 VH 골격 영역에 90%를 넘는 아미노산 서열 상동성을 나타내며 따라서 상기 VHH는 면역 반응없이 그리고 추가의 인간화 부담없이 직접 환자에 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 태양은 서열 번호 3과 14를 포함하는 폴리펩티드, 그 상동성 서열, 또는 그 상동성 서열의 기능성 부분을 이를 필요로 하는 환자에게 직접 투여하는 것을 허용한다.
본 발명의 한 구체예는 단독으로 또는 조합으로 하기 잔기 중 어느 것을 치환하는 단계를 포함하는 VHH를 인간화시키는 방법이다:
FR1 위치 1,5, 28 및 30,
FR2에서 위치 44와 45에서의 특징 아미노산,
FR3 잔기 74, 75, 76, 83, 84, 93 및 94,
및 FR4에서 위치 103, 104, 108 및 111.(넘버링은 카바트 넘버링에 따름)
본 발명의 한 구체예는 면역 과정에 관련된 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키는 데 사용하기 위한 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 암호할 수 있는 핵산이다. TNF-알파는 염증 과정에 관여하며, TNF-알파 작용의 차단은 항 염증 효과를 가질 수 있으며, 이것은 예를 들어 크론 질병과 같은 일부 질병 상태에서 매우 바람직하다. 본 발명의 실시예는 본 발명의 VHH가 TNF-알파에 결합하며 또한 TNF-알파가 TNF-알파 수용체에 결합하는 것을 차단함을 증명한다.
본 발명의 항-TNF-알파 폴리펩티드는 애디슨 질병(부신), 귀의 자가변역 질병(귀), 눈의 자가면역 질병(눈), 자가면역 간염(간), 자가면역 이하선염(이하선), 크론 질병(장), 타입 I 당뇨병(췌장), 부고환염(부고환), 사구체신염(신장), 그레이브 질병(갑상선), 길리안-바레 증후군(신경 세포), 하시모토 질병(갑상선), 용혈 빈혈(적혈구 세포), 전신성 루푸스 홍반(다수 조직), 남성 불임(정자), 다발성 경화증(신경 세포), 중증근육무력증(신경근육 이음부), 천포창(주로 피부), 건선(피부), 류마티스 열(심장 및 관절), 류마티스 관절염(관절 내층), 사르코이드증(다수 조직 및 기관), 피부경화증(피부 및 연결 조직), 쇼그렌 증후군(외분비선, 및 다른 조직), 척추관절병증(몸통 뼈대, 및 다른 조직), 갑상샘염(갑상선), 혈관염(혈관)과 같은 자가면역 질병에 적용가능하다. 괄호내에 기재된 것은 질병에 의해 영향을 받는 조직이다. 자가면역 질병의 리스트는 예시적인 것이다.
본 발명의 항-TNF-알파 폴리펩티드가 적용가능한 자가면역 상태는 예를 들어, AIDS, 아토피성 알러지, 기관지 천식, 습진, 나병, 정신분열병, 선천성 우울증, 조직 및 기관의 이식, 만성 피로 증후군, 알츠하이머 질병, 파킨슨 병, 심근경색, 발작, 자폐증, 간질, 아르터스 현상, 아나필락시스, 및 알콜 및 약물 중독을 포함한다. 전술한 자가면역 상태에서, 영향받는 조직은 주요 표적이며, 다른 경우에는 이차 표적이다. 이들 상태는 부분적으로 또는 거의 자가면역 증후군이다. 따라서, 이들을 치료할 때, 여기서 개시된 것과 동일한 방법 또는 동일한 방법의 태양들을 이용하는 것이 가능하며, 때때로 다른 방법과 함께 이용하는 것도 가능하다.
본 발명의 다른 구체예는 본 발명에 따른 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 암호할 수 있는 핵산을, 염증성 과정에 관련된 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 이용하는 것이다. 질환의 예는 류마티스 관절염, 크론 질명, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군 및 다발성 경화증을 포함한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드와 핵산은 정맥내와 같은 종래의 경로에 의해 대상에 투여될 수 있다. 하지만, 본 발명의 항-TNF-알파 폴리펩티드의 특별한 특성은 그들이 조직 막 및/또는 종양과 같은 장애물을 침투하며 국소적으로 그곳에서 작용하며, 이들이 위와 같은 극한 환경을 견디기에 충분히 안정하다는 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 태양은 항-TNF-알파 폴리펩티드의 전달에 관한 것이다.
본 발명에 따른 대상은 치료적 폴리펩티드에 의한 치료를 받아들이는 임의의 포유류일 수 있다.
본 발명의 항-TNF-알파 폴리펩티드의 경구 전달은 질환에 의해 영향을 받는 국소적 부위에서 결장에서 활성 형태인 그러한 분자를 제공한다. 이들 부위는 염증이 심하고 TNF-알파-생성 세포를 함유할 수 있다. TNF-알파에 결합하는 본 발명의 항-TNF-알파 폴리펩티드는 TNF-알파를 국소적으로 중화시켜 신체 전체를 통한 분포를 피하고 따라서 부정적인 부작용을 억제할 수 있다. 마이크로코커스 락티스와 같은 유전학적으로 변형된 미생물은 항체 또는 그 기능적 부분을 분비할 수 있다. 그러한 변형된 미생물은 장에서 항체 또는 그 기능적 부분의 국소 생산 및 전달을 위한 비히클로서 이용될 수 있다. 항-TNF-알파 폴리펩티드를 생산하는 균주를 이용함으로써, 염증성 장 증후군을 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 태양은 WO00/23471호에 개시된 것과 같은 벡터를 이용하여 락토코커스 종와 같은 그램-양성 숙주 유기체와 같은 비침입성 박테리아에서의 표면 발현 또는 그로부터의 분비를 이용하여 항-TNF 폴리펩티드를 전달하는 것에 관련된다.
본 발명의 한 구체예는 불활성화되지 않고 위 환경을 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키는데 사용하기 위한 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
질환의 예는 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군, 및 다발성 경화증을 포함하며 이에 한정되지 않는, 염증을 야기하는 임의의 것이다. 당업자에게 알려진 바대로, 일단 상기 폴리펩티드 구조체를 보유하면, 정확한 위치(위, 결장 등)에서 최대량의 폴리펩티드를 방출시키기 위한 제제화 기술이 적용될 수 있다. 이 전달 방법은 표적이 창자 시스템에 위치한 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화하는 데 중요하다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에게 경구 투여함으로써, 불활성화되지 않고 위 환경을 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키는 방법이다.
본 발명의 다른 구체예는 불활성화되지 않고 위 환경을 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약에 제조를 위한 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드의 용도이다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에 경구 투여함으로써, TNF-알파 조절 물질을 불활성화시키지 않고 창자 시스템에 전달하기 위한 방법이다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에 경구 투여함으로써, TNF-알파 조절 물질을 불활성화시키지 않고 대상의 혈류에 전달하기 위한 방법이다.
본 발명의 다른 구체예는 질 및/또는 직장관에 전달된 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환 또는 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키는데 사용하기 위한 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
질환의 예는 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군, 및 다발성 경화증을 포함하며 이에 한정되지 않는, 염증을 야기하는 임의의 것이다. 비제한적인 예에서, 본 발명에 따른 제제는 젤, 크림, 좌약, 필름의 형태로, 또는 시간에 걸쳐 활성 성분을 서서히 방출하는 스폰지 형태 또는 질 고리로서, 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 포함한다(그러한 제제는 EP 707473호, EP 684814호, 미국특허 5,629,001호에 개시됨).
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에 질내로 및/또는 직장으로 투여함으로써, 질 및/또는 직장관에 전달된 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키는 방법이다.
본 발명의 다른 구체예는 질 및/또는 직장관에 전달된 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드의 용도이다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상의 질내로 및/또는 직장으로 투여함으로써, TNF-알파 조절 물질을 불활성화시키지 않고 질 및/또는 직장관으로 전달하는 방법이다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상의 질내로 및/또는 직장으로 투여함으로써, TNF-알파 조절 물질을 불활성화시키지 않고 대상의 혈류로 전달하는 방법이다.
본 발명의 다른 구체예는 코, 상부 호흡기 및/또는 폐로 전달된 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키는 데 사용하기 위한 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
질환의 예는 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군, 및 다발성 경화증을 포함하며 이에 한정되지 않는, 염증을 야기하는 임의의 것이다. 비제한적인 예에서, 본 발명에 따른 제제는 비강 분무기(예, 에어로졸) 또는 흡입기 형태에 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 포함한다. 상기 폴리펩티드 구조체는 작기 때문에, 이것은 치료적 IgG 분자보다 훨씬 더 효과적으로 표적에 도달할 수 있다.
본 발명의 태양은 입 또는 코를 통한 흡입에 의하여 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에 투여함으로써, 상부 호흡기 및 폐로 전달된 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키는 방법이다.
본 발명의 다른 구체예는 불활성화되지 않고 코, 상부 호흡기 및/또는 폐로 전달된 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드의 용도이다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상의 코, 상부 호흡기 및/또는 폐로 투여함으로써, TNF-알파 조절 물질을 불활성화시키지 않고 코, 상부 호흡기 및 폐로 전달하는 방법이다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상의 코, 상부 호흡기 및/또는 폐로 투여함으로써, TNF-알파 조절 물질을 불활성화시키지 않고 대상의 혈류로 전달하는 방법이다.
본 발명의 한 구체예는 장 점막에 전달된 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키는 데 사용하기 위한 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드이며, 이때 상기 질환은 장 점막의 투과성을 증가시킨다. 그들의 작은 크기때문에, 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드는 크론 질병과 같은 장 점막의 투과성 증가를 야기하는 질환으로 고통받는 대상에서 장 점막을 통과하여 더욱 효과적으로 혈류에 도달할 수 있다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에 경구 투여함으로써, 장 점막의 투과성을 증가시키며 장 점막에 전달된 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키는 방법이다.
이 과정은 능동 수송 담체의 이용과 같은 본 발명의 추가 태양에 의해 추가로 증강될 수 있다. 본 발명의 이 태양에서, VHH는 장벽을 통과하여 혈류내로의 전달을 증가시키는 담체에 융합된다. 비제한적인 예에서, 이 "담체"는 치료적 VHH에 융합된 두번째 VHH이다. 그러한 융합 구조체는 공지의 방법을 이용하여 만들어진다. "담체" VHH는 장벽에 있는 수용체에 특이적으로 결합하여 벽을 통한 능동 수송을 유도한다.
본 발명의 다른 구체예는 장 점막에 전달된 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드의 용도이며, 이때 상기 질환은 장 점막의 투과성을 증가시킨다.
본 발명의 태양은 본 발명의 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에 경구 투여함으로써, TNF-알파 조절 물질을 불활성화시키지 않고 장 점막에 전달하는 방법이다.
본 발명의 태앙은 본 발명의 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에 경구 투여함으로써, TNF-알파 조절 물질을 불활성화시키지 않고 대상의 혈류에 전달하는 방법이다.
이 과정은 능동 수송 담체의 이용과 같은 본 발명의 추가 태양에 의해 추가로 증강될 수 있다. 본 발명의 이 태양에서, 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드는 장벽을 통과하여 혈류내로의 전달을 증가시키는 담체에 융합된다. 비제한적인 예에서, 이 "담체"는 상기 폴리펩티드에 융합된 VHH이다. 그러한 융합 구조체는 공지의 방법을 이용하여 만들어진다. "담체" VHH는 장벽에 있는 수용체에 특이적으로 결합하여 벽을 통한 능동 수송을 유도한다.
본 발명의 한 구체예는 혀 밑 조직을 효과적으로 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키는 데 사용하기 위한 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
질환의 예는 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군, 및 다발성 경화증을 포함하며 이에 한정되지 않는, 염증을 야기하는 임의의 것이다. 여기서 개시된 상기 폴리펩티드 구조체의 제제, 예를 들어, 정제, 스프레이, 드롭은 혀 밑에 놓여져 점막을 통하여 혀 아래의 모세관 네트워크내로 흡수된다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에 혀밑으로 투여함으로써, 혀밑 조직을 효과적으로 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키는 방법이다.
본 발명의 다른 구체예는 혀밑 조직을 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드의 용도이다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에 혀밑으로 투여함으로써, TNF-알파 조절 물질을 불활성화시키지 않고 혀 밑 조직으로 전달하는 방법이다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에 경구 투여함으로써, TNF-알파 조절 물질을 불활성화시키지 않고 대상의 혈류로 전달하는 방법이다.
본 발명의 한 구체예는 피부를 효과적으로 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키는데 사용하기 위한 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드이다.
질환의 예는 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군, 및 다발성 경화증을 포함하며 이에 한정되지 않는, 염증을 야기하는 임의의 것이다. 상기 폴리펩티드 구조체의 제제, 예를 들어, 크림, 필름, 스프레이, 드롭, 패치는 피부에 놓여 피부를 통과한다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에 국소 투여함으로써, 피부를 효과적으로 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키는 방법이다.
본 발명의 다른 구체예는 피부를 효과적으로 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드의 용도이다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에 국소 투여함으로써, TNF-알파 조절 물질을 불활성화시키지 않고 피부에 전달하는 방법이다.
본 발명의 태양은 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 대상에 국소 투여함으로써, TNF-알파 조절 물질을 불활성화시키지 않고 대상의 혈류에 전달하는 방법이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 항-TNF-알파 폴리펩티드는 추가로 폐강으로부터 혈액으로 상기 항-TNF-알파 폴리펩티드를 수송하기 위한 능동 수송 담체로 작용하는 담체 단일 도메인 항체(예, VHH)를 추가로 포함한다.
추가로 담체를 포함하는 항-TNF-알파 폴리펩티드는 점막 표면(기관지 상피 세포)에 존재하는 수용체에 특이적으로 결합하여 폴리펩티드가 폐강으로부터 혈액으로 능동 수송된다. 담체 단일 도메인 항체는 폴리펩티드 구조체에 융합될 수도 있다. 그러한 융합 구조체는 공지의 방법을 이용하여 만들 수 있으며 여기서 개시된다. "담체" 단일 도메인 항체는 점막 표면상의 수용체에 특이적으로 결합하여 표면을 통한 능동 전달을 유도한다.
본 발명의 다른 태양은 비강 투여시에 단일 도메인 항체(예, VHH)가 혈류내로 능동적으로 수송되는 지를 결정하는 방법이다. 유사하게, 천연 또는 면역 VHH 파아지 라이브러리를 비강으로 투여하고, 투여 후 다른 시점에서, 혈액 또는 기관을 분리하여 혈류로 능동적으로 수송된 파아지를 구할 수 있다. 폐강으로부터 혈류로의 능동 수송을 위한 수용체의 비제한적인 예는 Fc 수용체 N(FcRn)이다. 본 발명의 한 태양은 상기 방법에 의해 확인된 VHH 분자를 포함한다. 그러한 VHH는 이어서 비강 투여시 치료적 VHH를 혈류내의 상응하는 표적으로 전달하기 위한 담체 VHH로 이용될 수 있다.
본 발명의 한 태양에서, TNF-알파에 대한 상기 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드의 결합을 조절하는 제제를 스크린하기 위해, 여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 이용할 수 있다. 결합 또는 상기 폴리펩티드 치환만을 측정하는 분석에서 확인될 경우, 제제는 그들이 생체내에서 항원의 작용을 조절하는 지 여부를 결정하기 위하여 기능 테스트가 이루어져야 할 것이다. 여기서 개시된 임의의 항-TNF-알파 폴리펩티드가 적절할 수 있지만, 스크리닝 분석의 예는 서열 번호 3에 대하여 주로 하기에서 주어진다.
치환 실험의 예에서, TNF-알파 또는 그 단편을 발현하는 파아지 또는 세포를 증가하는 농도의 후보 조절자의 존재 또는 부재하에서, 예를 들어 표지된 서열 번호 3으로 나타내진 폴리펩티드와 함께 결합 완충액에서 항온처리시킨다. 분석을 확실히하고 보정하기 위하여, 증가하는 농도의 표지되지 않은 상기 폴리펩티드를 이용하는 대조 경쟁 반응을 실시할 수 있다. 항온처리 후, 세포를 완전히 세척하고, 주어진 표지에 대해 적절한 대로(예, 신틸레이션 카운팅, 형광 등), 결합된, 표지된 폴리펩티드를 측정한다. 후보 조절자의 존재하에서 결합된 표지 폴리펩티드 양의 적어도 10% 감소는 후보 조절자에 의한 결합의 치환을 나타낸다. 후보 조절자는 그들이 1 μM 또는 그 이하의 농도에서 표지 폴리펩티드의 50%를 대체하면 여기서 개시된 분석에서 특이적으로 결합하는 것으로 간주된다.
다르게는, 결합 또는 결합의 치환은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 모니터될 수 있다. 표면 플라스몬 공명 분석은 예를 들어, 수성 상으로부터의 서열 번호 3으로 나타내지는 폴리펩티드의, 센서상의 막에 고정된 TNF-알파에의 결합 또는 결합의 손실에 의해 야기된, 고정 센서 근처의 질량의 변화에 의해 두 분자간의 결합을 측정하기 위한 정량적 방법으로 이용될 수 있다. 이러한 질량의 변화는 공명 단위 대 상기 폴리펩티드 또는 후보 조절자의 주입 또는 제거 후 시간으로 측정되며, 비아코어 바이오센서(Biacore AB)를 이용하여 측정한다. TNF-알파는 예를 들어 Salamon et al.(Salamon et al., 1996, Biophys J. 71:283-294; Salamon et al., 2001, Biophys J. 80:1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem.Sci. 24:213-219, 각각은 참고로 본원에 통합됨)에 의해 개시된 방법에 따라 박막 지질 막내의 센서 칩(예, 연구 등급 CM5 칩; Biacore AB)상에 고정될 수 있다. Sarrio et al.은 SPR이 칩상의 지질층내에 고정된 GPCR A(1) 아데노신 수용체에의 리간드 결합을 검출하기 위해 이용될 수 있음을 입증하였다(Sarrio et al. 2000, Mol.Cell.Biol. 20:5164-5174, 참고로 본원에 통합됨). SPR 분석에서 TNF-알파에의 서열 번호 3의 결합을 위한 조건은 출발점으로 Sarrio et al.에 의해 보고된 조건을 이용하여 당업자에 의해 미세 조절될 수 있다.
SPR은 적어도 두 방식으로 결합의 조절자를 분석할 수 있다. 먼저, 서열 번호 3으로 나타내지는 폴리펩티드는 예를 들어 고정된 TNF-알파에 예비결합되고 이어서 0.1 nM 내지 1 μM 범위의 농도의 후보 조절자가 주입된다. 결합된 폴리펩티드의 치환을 정량하여 조절자 결합을 검출할 수 있다. 다르게는, 막에 결합된 TNF-알파를 후보 조절자와 예비 항온처리하고, 예를 들어, 서열 번호 3의 폴리펩티드로 챌린지시킨다. 조절자의 부재하에서 상기 폴리펩티드와 TNF-알파 사이의 결합 친화성과 비교할 때, 상기 폴리펩티드와 조절자로 예비항온처리된 TNF-알파 사이의 결합 친화성의 차이는 조절자의 존재하에서 상기 폴리펩티드의 결합 또는 치환을 입증할 것이다. 어느 한 분석에서, 후보 조절자의 부재하에서 결합된 상기 폴리펩티드의 양에 비하여, 후보 조절자의 존재하에서 결합된 상기 폴리펩티드의 양에서 10% 이상의 감소는, 후보 조절자가 TNF-알파와 상기 폴리펩티드의 상호작용을 억제함을 나타낸다.
예를 들어 서열 번호 3의 폴리펩티드의 TNF-알파에의 결합의 억제를 검출하는 다른 방법은 형광 공명 에너지 전이(FRET)를 이용한다. FRET은 형광 공여체(D)의 방출 스펙트럼이 형광 수용체(A)의 여기 스펙트럼과 중복되면 서로 아주 가까운 (대개 100Å 미만의 분리) 형광 공여체와 형광 수용체 사이에서 발생하는 양자 기계적 현상이다. 시험될 분자, 예를 들어 서열 번호 3의 폴리펩티드 및 TNF-알파를 공여체 및 수용체 형광단의 상보성 쌍으로 표지한다. TNF-알파:폴리펩티드 상호작용에 의해 서로 가까이 결합되어 있는 동안, 공여체 형광단의 여기시에 방출된 형광은 상기 폴리펩티드와 TNF-알파가 결합되지 않을 때 여기 파장에 대한 반응으로 방출되는 것과는 다른 파장을 가져, 각 파장에서 방출 강도를 측정함으로써 결합 분자 대 미결합 분자의 정량을 제공한다. TNF-알파를 표지하는 공여체 형광단은 공지되어 있다. 특히 관심의 대상은 Cyan FP(CFP, 공여체(D)) 및 Yellow FP(YFP, 수용체(A))로 알려진 A.Victoria GFP의 변종이다. 예로서, YFP 변종은 TNF-알파와 융합 단백질로 만들어질 수 있다. 형광단-표지된 시약(Molecular Probes)뿐만 아니라 융합체(Clontech)로서 GFP 변종의 발현을 위한 벡터는 공지되어 있다. 형광 표지된 폴리펩티드와 YFP-TNF-알파의 혼합물에 후보 조절자를 첨가하면, 예를 들어 후보 조절자가 없는 샘플에 비하여 YFP 형광의 감소에 의해 입증되는 에너지 전달의 억제를 야기할 것이다. TNF-알파:폴리펩티드 상호작용의 검출을 위해 FRET을 이용하는 분석에서, 후보 조절자가 없는 샘플에 비하여, 후보 조절자를 함유한 샘플에서 수용체 파장에서 형광 방출의 강도의 10% 초과 감소는 후보 조절자가 TNF-알파:폴리펩티드 상호작용을 억제함을 나타낸다.
여기서 이용될 때 샘플은 임상적, 농업적, 법의학, 연구, 또는 다른 가능한 샘플에서 유래한, 임상 샘플(예, 세포 분획, 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포 등)과 같은 TNF-알파를 함유한 임의의 생물학적 샘플일 수 있다. 임상적 샘플은 사람 또는 동물 기원일 수 있다. 분석된 샘플은 특성상 고체 또는 액체일 수 있다. 고체 물질이 이용될 경우, 이들은 먼저 적절한 용액에 용해된다.
FRET에서의 변화는 분자 상호작용을 모니터하기 위해 형광 소멸을 이용한다. 상호작용 쌍에서 한 분자는 형광단으로 표지되고, 다른 분자는 첫번째 분자와 가까워지면 형광단의 형광을 소멸시키는 분자로 표지될 수 있다. 여기시의 형광의 변화는 형광단:켄처 쌍으로 태그(tag)된 분자들의 연합에서의 변화를 나타낸다. 일반적으로, 표지된 TNF-알파의 형광의 증가는 켄처를 함유한 항-TNF-알파 폴리펩티드가 치환되었음을 나타낸다. 소멸 분석의 경우, 후보 조절자가 없는 샘플에 비하여, 후보 조절자를 함유한 샘플에서 형광 여기의 강도에서 10% 이상의 증가는 후보 조절자가 TNF-알파:항-TNF-알파 폴리펩티드 상호작용을 억제함을 나타낸다.
표면 플라스몬 공명 및 FRET 방법에 더하여, 형광 분극화 측정은 결합을 정량화하는 데 유용하다. 형광적으로 태그된 분자를 위한 형광 분극화 값은 회전 상관 시간 또는 텀블링 속도에 의존한다. 형광 표지된 항-TNF-알파 폴리펩티드와 연합하는 TNF-알파에 의해 형성된 것들과 같은 복합체는 복합체를 형성하지 않은 표지된 폴리펩티드보다 더 높은 분극화 값을 갖는다. TNF-알파:항-TNF-알파 폴리펩티드 상호작용의 후보 억제자의 포함은, 후보 억제자가 TNF-알파와 상기 폴리펩티드의 상호작용을 파괴하거나 억제하면, 후보 억제자없는 혼합물에 비하여 형광 분극화의 감소를 야기한다. 형광 분극화는 TNF-알파:항-TNF-알파 폴리펩티드 복합체의 형성을 파괴하는 작은 분자의 확인에 매우 적합하다. 후보 조절자가 없는 샘플에서의 형광 분극화에 비하여, 후보 조절자를 함유한 샘플에서 형광 분극화의 10% 이상의 감소는 후보 조절자가 TNF-알파:항-TNF-알파 폴리펩티드 상호작용을 억제함을 나타낸다.
TNF-알파:항-TNF-알파 폴리펩티드 상호작용을 모니터하기 위한 다른 대안은 바이오센서 분석을 이용한다. ICS 바이오센서가 당업계에서 개시되었다(Australian Membrane Biotechnology Research Institute; Cornell B, Braach-Maksvytis V, King L, Osman P, Raguse B, Wiecxorek L, and Pace R. "A biosensor that uses ion-channel switches" Nature 1997, 387, 580). 이 기술에서, TNF-알파와 항-TNF-알파 폴리펩티드의 연합은 서스펜드된 막 이중층내의 그라마시딘-촉진된 이온 채널의 폐쇄 및 따라서 바이오센서의 어드미턴스(임피던스와 유사)의 측정가능한 변화에 연결된다. 이 접근법은 어드미턴스 변화의 양의 6차수에 걸쳐 선형이며, 대규모의, 작은 분자 조합 라이브러리의 고처리 스크리닝에 이상적이다. 후보 조절자가 없는 샘플의 어드미턴스에 비하여, 후보 조절자를 함유한 샘플에서 어드미턴스의 10% 이상의 변화(증가 또는 감소)는 후보 조절자가 TNF-알파와 상기 폴리펩티드의 상호작용을 억제함을 나타낸다. TNF-알파와 항-TNF-알파 폴리펩티드의 상호작용을 시험하는 분석에서, 상호작용의 조절자가 상기 폴리펩티드와 물리적으로 상호작용하는 단백질의 도메인과 반드시 직접 상호작용할 필요가 없는 것이 가능함을 주목하는 것이 중요하다. 조절자는 상호작용 부위로부터 제거된 위치에서 상호작용하여 예를 들어 TNF-알파의 형태 변화를 야기하는 것 또한 가능하다. 이러한 방식으로 작용하는 조절자(억제자 또는 아고니스트)는 그 수용체에의 TNF-알파의 결합을 조절하기 위한 제제로서 관심의 대상이다.
여기서 개시된 결합 분석의 임의의 것을 이용하여 샘플, 예를 들어 조직 샘플내의, TNF-알파에 결합하거나 예를 들어 서열 번호 3의 폴리펩티드의 TNF-알파에의 결합에 영향을 주는 제제의 존재를 결정할 수 있다. 그렇게 하기 위해 TNF-알파는 샘플의 존재 또는 부재하에서 상기 폴리펩티드와 반응되며, 폴리펩티드 결합은 이용되는 결합 분석에 적절한 대로 측정된다. 상기 폴리펩티드의 결합에서 10% 이상의 감소는 샘플이 상기 폴리펩티드의 TNF-알파에의 결합을 조절하는 제제를 함유함을 나타낸다. 물론, 상기 일반화된 방법은 본 발명의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 그 상동성 서열, 그 기능성 부분 또는 그 상동성 서열의 기능성 부분과 TNF-알파 또는 그 단편 사이의 결합을 변화시키는 후보 조절자를 위한 스크리닝에 쉽게 적용될 수 있다.
본 발명의 한 구체예는 여기서 개시된 방법에 의해 확인된 미지의 제제이다.
본 발명의 한 구체예는 염증성 과정에 관련된 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화하는 데 사용하기 위한 여기서 개시된 방법에 의해 확인된 미지의 제제이다.
본 발명의 다른 구체예는 염증성 과정에 관련된 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화하는 데 사용하기 위한 여기서 개시된 방법에 의해 확인된 미지의 제제의 용도이다.
질환의 예는 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군 및 다발성 경화증을 포함한다.
본 발명에 따라 유용한 세포는 바람직하게는 예를 들어 이.콜리와 같은 박테리아 세포, 예를 들어 에스.세레비제, 피.파스토리스와 같은 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따라 유용한 세포는 본 발명의 항-TNF-알파를 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 핵산 서열, 그 상동성 서열, 그 기능성 부분 또는 본 발명에 따른 그 상동성 서열의 기능성 부분이 도입되어 폴리펩티드가 여기서 정의된 대로 자연 수준으로 또는 자연 수준 이상으로 발현되는 임의의 세포일 수 있다. 바람직하게는 세포에서 발현되는 본 발명의 폴리펩티드는 여기서 정의된 대로 정상의 또는 거의 정상의 약리학적 특성을 나타낸다. 가장 바람직하게는 세포에서 발현되는 본 발명의 폴리펩티드는 표 1에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나를 암호할 수 있거나 또는 표 1에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 암호할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 세포는 COS7 세포, CHO 세포, LM(TK) 세포, NIH-3T3 세포, HEK-293 세포, K-562 세포 또는 1321N1 별아교세포종 세포 및 다른 형질감염가능한 세포주로 구성된 군으로부터 선택된다.
일반적으로, "치료적 유효량", "치료적 유효 투여량" 및 "유효량"은 원하는 결과 또는 결과들(TNF-알파 결합의 조절; 염증의 치료 또는 방지)을 얻기 위해 필요한 양을 의미한다. 당업자는 성능 및 따라서 "유효량"이 본 발명에서 이용되는 TNF-알파 결합을 조절하는 다양한 화합물에 따라 다양할 수 있음을 인식할 것이다. 당업자는 화합물의 성능을 쉽게 평가할 수 있다.
여기서 이용될 때, 용어 "화합물"은 본 발명의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 조성물, 또는 상기 폴리펩티드를 암호할 수 있는 핵산, 또는 여기서 개시된 스크리닝 방법에 따라 확인된 제제 또는 하나 이상의 유도체화된 아미노산을 포함하는 상기 폴리펩티드를 말한다.
"약학적으로 허용가능한"은 생물학적이지 않거나 또는 다르게는 비바람직하지 않은 물질을 의미하며, 즉 상기 물질은 원치않는 생물학적 효과를 야기하거나 그것이 함유된 약학 조성물의 다른 성분 중 임의의 것과 해로운 방식으로 상호작용하지 않고 상기 화합물과 함께 개인에게 투여될 수 있다.
여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드는 대상에서 질환을 치료하거나 방지하는데 유용하며 약학적 유효량의 화합물 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 항-TNF-알파 폴리펩티드는 대상에서 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군 및 다발성 경화증에 관련된 상태를 치료하거나 방지하는 데 유용하며 그리고 TNF-알파에 결합하는 화합물 또는 조성물의 약학적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
여기서 개시된 항-TNF-알파 폴리펩티드는 대상에서 질환을 치료하거나 방지하는데 유용하며 약학적 유효량의 화합물을 예를 들어 아스피린과 같은 다른 것과 함께 투여하는 것을 포함한다.
여기서 개시된 항-TNF 폴리펩티드는 대상에서 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군 및 다발성 경화증에 관련된 상태를 치료하거나 방지하는 데 유용하며 약학적 유효량의 화합물을 예를 들어 아스피린과 같은 다른 것과 함께 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 단일 화합물을 포함하는 제제의 투여에 제한되지 않는다. 본 발명의 화합물 둘 이상을 포함하는 제제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 조합 치료를 제공하는 것은 본 발명의 범위내이다.
TNF-알파에 의해 매개된 상태는 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군 및 다발성 경화증을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 유용한 화합물은 약학 조성물로 조제되고, 선택된 투여 경로, 즉 경구 또는 비경구로, 흡입에 의해 비강내로, 정맥내로, 근육내로, 국소로 또는 피하 경로에 적합한 다양한 형태로 사람 환자 또는 가축 동물과 같은 포유류 숙주에게 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 유전자 치료 전달법을 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 전체가 본원에 참고로 통합되는 미국 특허 5,399,346호를 참고한다. 유전자 치료 전달법을 이용하여, 본 발명의 화합물을 위한 유전자로 형질감염된 일차 세포는 부가적으로 특정 기관, 조직, 이식편, 종양 또는 세포를 표적화하기 위한 조직 특이적 프로모터로 형질감염될 수 있다.
따라서, 본 화합물은 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 같은 약학적 허용 비히클과 함께 전신성으로, 예를 들어 경구로 투여될 수 있다. 이들은 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐내로 포장되거나, 정제로 압착되거나, 또는 환자의 식사의 음식에 직접 통합될 수도 있다. 경구 치료 투여의 경우, 활성 화합물은 하나 이상의 부형제와 배합되고 소화가능한 정제, 볼내 정제, 트로치, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 이용될 수 있다. 그러한 조성물 및 제제는 활성 화합물 적어도 0.1%를 함유한다. 조성물과 제제의 퍼센티지는 물론 변화될 수 있으며 편리하게는 주어진 단위 투여 형태의 중량의 약 2 내지 약 60% 사이일 수 있다. 그러한 치료적으로 유용한 조성물에서 활성 화합물의 양은 효과적인 투여량 수준이 얻어지도록 하는 것이다.
정제, 트로치, 알약, 캡슐 등은 또한 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제; 및 수크로스, 프럭토스, 락토스 또는 아스파탐과 같은 감미제를 함유할 수 있으며 또는 페퍼민트, 노루발풀의 오일 또는 체리향과 같은 향미제가 첨가될 수 있다. 단위 투여 형태가 캡슐일 때, 이것은 상기 타입의 물질에 더하여, 식물성 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅으로 존재하거나 또는 다르게는 고체 단위 투여 형태의 물리적 형태를 변화시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약, 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 쉘락 또는 당 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성 화합물, 감미제로서의 수크로스 또는 프럭토스, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지 향과 같은 향료를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여 형태를 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 약학적으로 허용가능하고 이용되는 양에서 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방성 제제 및 장치내로 통합될 수 있다.
활성 화합물은 또한 주입 또는 주사에 의해 정맥내로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 활성 화합물 또는 그 염의 용액은 선택적으로 비독성 계면활성제와 혼합되어 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴, 및 그 혼합물에서 그리고 오일에서 제조될 수 있다. 일상적인 저장 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 함유한다.
주사 또는 주입에 적합한 약학적 투여 형태는 멸균 주사용 또는 주입용 용액 또는 분산액의 즉석 제조에 적합한, 활성 성분을 포함하는 멸균 수성 용액 또는 분산액 또는 멸균 분말을 포함할 수 있으며 선택적으로 리포좀에 캡슐화된다. 모든 경우에, 궁극적인 투여 형태는 멸균된 유체이고 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 한다.
액체 담체 또는 비히클은 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 비독성 글리세릴 에스테르 및 적합한 그 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산액 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 리포좀의 형성에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 솔브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어 당, 완충액 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 흡수 지연은 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 조성물내에 사용함으로써 이루어질 수 있다.
멸균 주사용 용액은 원하는 양의 활성 화합물을 필요에 따라 전술한 다른 다양한 성분들과 함께 적절한 용매에 포함시키고, 이어서 필터 멸균함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기법이고, 이들은 활성 성분 및 이전에 멸균-여과된 용액에 존재하는 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성한다.
국소 투여의 경우, 본 화합물은 순수한 형태로, 즉 그들이 액체일 때 적용될 수 있다. 하지만, 일반적으로 그들을 고체 또는 액체일 수 있는 피부학적으로 허용가능한 담체와 함께 조성물 또는 제제로서 피부에 투여하는 것이 바람직할 것이다.
유용한 고체 담체는 탈크, 점토, 미세결정질 셀룰로스, 실리카, 알루미나 등과 같은 미분 고체를 포함한다. 유용한 액체 담체는 물, 하이드록시알킬 또는 글리콜 또는 물-알콜/글리콜 혼합물을 포함하며, 여기서 본 화합물은 선택적으로 비독성 계면활성제의 도움으로 효과적인 수준으로 용해되거나 분산될 수 있다. 방향제 및 추가의 항균 제제와 같은 아쥬반트는 주어진 용도를 위해 특성을 최적화시키기 위해 첨가될 수 있다. 생성된 액체 조성물은 흡수 패드로부터 적용되거나, 붕대 및 다른 드레싱을 함침시키기 위해 이용되거나, 또는 펌프-타입 또는 에어로졸 분무기를 이용하여 질환 영역상에 분무될 수 있다.
합성 중합체, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방 알콜, 변형된 셀룰로스 또는 변형된 미네럴 물질과 같은 농후제는 또한 액체 담체와 함께 이용되어 사용자의 피부에 직접 적용하기 위한, 스프레드가능한 페이스트, 젤, 연고, 비누 등을 형성할 수 있다.
상기 화합물을 피부에 전달하기 위해 이용될 수 있는 유용한 피부학적 조성물의 예는 공지되어 있으며, 예를 들어 Jacquet et al.(미국 특허 4,608392호), Geria(미국 특허 4,992,478호), Smith et al.(미국 특허 4,559,157호) 및 Wortzman(미국 특허 4,820,508호)를 참고한다.
화합물의 유용한 투여량은 동물 모델에서 그들의 생체외 활성 및 생체내 활성을 비교하여 결정할 수 있다. 마우스 및 다른 동물에서의 유효 투여량의 사람에의 외삽 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 4,938,949호를 참고한다.
일반적으로, 로션과 같은 액체 조성물내의 상기 화합물의 농도는 약 0.1-25 wt%, 바람직하게는 약 0.5-10wt%일 것이다. 젤 또는 분말과 같은 반고체 또는 고체 조성물에서의 농도는 약 0.1-5wt%, 바람직하게는 약 0.5-2.5wt%일 것이다.
치료에 사용하기 위해 필요한 상기 화합물 또는 그 활성 염 또는 유도체의 양은 선택된 구체적인 염뿐만 아니라 투여 경로, 치료될 상태의 특성 및 환자의 연령과 상태에 따라 변할 것이며, 궁극적으로는 진료 의사 또는 임상의의 판단에 따를 것이다. 또한 화합물의 투여량은 표적 세포, 종양, 조직, 이식편 또는 기관에 따라 변한다.
원하는 투여량은 편리하게 단일 투여량으로 또는 적절한 간격으로, 예를 들어 하루에 2, 3, 4 또는 그 이상의 하위 투여량으로 투여되는 분할 투여량으로 제공될 수 있다. 하위-투여량 자체는 예를 들어, 많은 별도의 느슨하게 간격을 갖는 투여로 추가 분할될 수 있으며, 예를 들어 취입기로부터 다수 흡입 또는 여러 방울을 눈내로 적용하는 것과 같다.
투여 요법은 장기, 매일 치료를 포함할 수 있다. "장기"란 적어도 2주, 그리고 바람직하게는 수주, 수개월, 또는 수년의 지속을 의미한다. 이 투여량 범위의 필요한 변형은 여기서 주어진 설명을 가지고 일상적인 실험만에 의해 당업자가 결정할 수 있다. Reminton's Pharmaceutical Sciences(Martin, E.W., ed.4), Mack Publishing Co.,Easton, PA를 참고한다. 투여량은 또한 합병증이 나타날 경우 개별 의사에 의해 조절될 수 있다.
본 발명은 TNF-알파/TNF-알파-수용체 상호작용의 조절자인 제제를 제공한다.
후보 제제는 합성 제제 또는 제제의 혼합물이거나, 또는 자연 생성물(예, 식물 추출물 또는 배양물 상등액)일 수 있다. 본 발명에 따른 후보 제제는 합성될 수 있는 작은 분자, 천연 추출물, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질 등을 포함한다.
합성 또는 천연 제제의 큰 라이브러리로부터의 후보 조절자 제제를 스크린할 수 있다. 당류, 펩티드, 및 핵산계 제제의 임의 및 지시된 합성을 위해 많은 수단이 현재 이용되고 있다. 합성 제제 라이브러리는 메이브릿지 케미컬 컴퍼니(Trevillet, Cornwall, UK), 콤제넥스(Princeton, NJ), 브랜던 어소시에이트(Merrimack, NH), 및 마이크로소스(New Milford, CT)를 비롯한 많은 회사에서 시판하고 있다. 드문 화학 라이브러리는 알드리치(Milwaukee, WI)에서 판매한다. 조합 라이브러리가 이용가능하며 제조될 수 있다. 다르게는, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 제제의 라이브러리를 예를 들어 팬 래버러토리즈(Bothell, WA) 또는 미코서치(NC)로부터 구입가능하며, 또는 공지 방법에 의해 쉽게 생산가능하다. 부가적으로, 천연 및 합성적으로 생산된 라이브러리와 제제는 종래의 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 쉽게 변형된다.
유용한 제제는 많은 화학적 부류내에서 발견될 수 있다. 유용한 제제는 유기 제제, 또는 작은 유기 제제일 수 있다. 작은 유기 제제는 50 달톤 초과 내지 약 2500 달톤 미만, 바람직하게는 약 750 미만의 분자량, 더욱 바람직하게는 약 350 달톤 미만의 분자량을 갖는다. 예시적인 부류는 헤테로사이클, 펩티드, 당류, 스테로이드 등을 포함한다. 상기 제제는 효능, 안정성, 약학적 융화성 등을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 제제의 구조적 확인은 추가 제제를 확인, 생성 또는 스크린하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 제제가 확인되는 경우, 이들은, D-아미노산, 특히 D-알라닌과 같은 비천연 아미노산을 이용하거나, 예를 들어 아미노기의 경우 아실화 또는 알킬화 그리고 카르복실기의 경우 에스테르화 또는 아미드화 등과 같이 아미노 말단 또는 카르복시 말단을 관능화시키는 것과 같은, 다양한 방식으로 그들의 안정성을 증가시키기 위해 변형될 수 있다.
일차 스크리닝의 경우, 본 발명에 따른 후보 제제의 유용한 농도는 약 10 mM 내지 약 100 μM 또는 그 이상이다(즉, 1 mM, 10 mM, 100 mM, 1M 등). 일차 스크리닝 농도는 아홉개의 추가 농도와 함께 상한선으로 이용될 것이며, 이때 추가 농도는 이차 스크린을 위해 또는 농도 곡선의 생성을 위해 1/2 로그 간격으로 일차 스크리닝 농도를 감소시킴으로써 결정된다(예, 9개의 추가 농도).
고처리 스크리닝 키트
본 발명에 따른 고처리 스크리닝 키트는 바람직하게는 1 μM 내지 1 mM 범위의 농도의 폴리펩티드의 존재하에서 TNF-알파와 상호작용함으로써 TNF-알파/TNF-알파 수용체 상호작용을 조절하는 제제의 검출을 실시하기 위한 모든 필요한 수단과 매질을 포함한다.
상기 키트는 하기를 포함한다. TNF-알파를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 발현하며, WO 00/020045호에 개시된 대로 당업계에 공지된 방법에 따라, 미세적정 플레이트, 더욱 바람직하게는 96웰 미세적정 플레이트와 같은 고체 지지체상에서 키트에 따라 성장되는 본 발명의 재조합 세포. 다르게는 TNF-알파는 예를 들어 당업자에 의해 96 웰 미세적정 플레이트상에 고정될 정제된 형태로 공급된다. 다르게는 TNF-알파는 예를 들어 96 웰 미세적정 플레이트상에 예비 고정되어 키트에 공급된다. TNF-알파는 전체 TNF-알파 또는 그 단편일 수 있다.
본 발명의 따른 조절자 제제는 약 1 μM 내지 1 mM 또는 그 이상의 농도로, 적절한 농도의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 그 상동성 서열, 그 기능성 부분 또는 그 상동성 서열의 기능성 부분의 존재하에서 한정된 웰에 첨가되며, 상기 폴리펩티드의 농도는 바람직하게는 1 μM 내지 1 mM 범위이다. 키트는 하나 이상의 항-TNF-알파 폴리펩티드를 함유할 수 있다(예, 서열 번호 1 내지 15 중 하나에 의해 나타내지는 폴리펩티드 중 하나 이상 또는 항-TNF-알파 폴리펩티드, 그 상동성 서열, 그 기능성 부분 또는 그 상동성 서열의 기능성 부분).
결합 분석은 여기서 이미 개시된 방법에 따라 실시되며 그 결과는 예를 들어첨가된 조절자 제제의 부재하에서 항-TNF-알파 폴리펩티드, 그 상동성 서열, 그 기능성 부분 또는 그 상동성 서열의 기능성 부분에의 TNF-알파 결합의 기준 수준에 비교된다. 조절자 부재하에서의 활성의 수준과 비교할 때 TNF-알파-폴리펩티드 결합(예)의 적어도 2배, 바람직하게는 5배, 더욱 바람직하게는 10배 그리고 가장 바람직하게는 100배 또는 그 이상 감소 또는 증가를 나타내는 웰은 추가 분석을 위해 선택된다.
본 발명에 따라 유용한 다른 키트
본 발명은 TNF-알파/TNF-알파 수용체 결합의 조절자를 스크리닝하는데 유용한 키트, 및 TNF-알파의 기능장애를 특징으로 하는 질환의 진단에 유용한 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 TNF-알파에 관련된 하나 이상의 과정을 특징으로 하는 질환의 조절자를 스크리닝하는 데 유용한 키트 및 그 진단을 위한 키트를 제공한다. 본 발명에 따라 유용한 키트는 분리된 TNF-알파를 포함할 수 있다. 다르게는, 또는 추가로, 키트는 TNF-알파를 발현시키기 위해 형질전환된 세포를 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본 발명에 따른 키트는 TNF-알파를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본 발명에 따른 키트는 TNF-알파의 증폭에 유용한 특이적 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 유용한 키트는 분리된 TNF-알파 폴리펩티드, 그 상동체, 또는 그 기능성 부분을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 상기 폴리펩티드를 발현시키기 위해 형질전환된 세포를 포함할 수 있다. 키트는 하나보다 많은 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 추가 구체예에서, 본 발명에 따른 키트는 TNF-알파를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본 발명에 따른 키트는 예를 들어 TNF-알파와 같은 거대분자의 증폭에 유용한 특이적 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 언급된 아이템 또는 아이템의 조합 및 그를 위한 포장 재료를 포함할 것이다. 키트는 또한 사용 안내서를 포함할 것이다.
실시예
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예에 의해 예시된다.
실시예 1 : 인간 종양 괴사 인자 알파에 대한 카멜리대 항체의 예
1) 면역화 및 라이브러리 구성
라마(Llama glama)를 사람 TNF-알파로 면역화시켰다. 면역화를 위해, 사이토카인을 적절한 동물 친화성 아쥬반트(Specoll, CEDI Diagnostic B.V.)와 함께 에멀젼으로 조제하였다. 항원 칵테일을 이중-점 주입에 의해 목에 근육내로 투여하였다. 1주일 간격으로 TNF-알파 100 ㎍을 함유하는 에멀젼을 동물에게 6회 주사하였다. 면역화동안 상이한 시점들에서, 10 ml 혈액 샘플을 동물로부터 수집하고 혈청을 제조하였다. 항원 특이적인 체액성 면역 반응의 유도를 TNF를 이용한 ELISA 실험에서 혈청 샘플을 이용하여 확인하였다(데이터 나타나지 않음). 마지막 면역 후 5일째에, 150 ml의 혈액 샘플을 수집하였다. 이 샘플로부터, 종래의 중쇄 항체(HcAb)를 분획화시키고(Lauwereys et al. 1998) ELISA에서 사용한 결과, HcAb가 항원 특이적 체액성 면역 반응에 책임이 있음이 밝혀졌다(데이터 안 나타남). 라마 중쇄 면역글로불린(HcAb)의 유전적 공급원으로서 말초 혈액 림프구(PBL)를 피콜-플라크 구배(Amersham Biosciences)를 이용하여 150 ml 혈액 샘플로부터 분리하여 5 x 108 PBL을 얻었다. 항체의 최대 다양성은 샘플된 B-림프구의 수와 동일할 것으로 예상되며, 이것은 PBL의 수의 약 10%(5 X 107)이다. 라마에서 중쇄 항체의 분율은 B-림프구 수의 최대 20%이다. 따라서, 150 ml 혈액 샘플중의 HcAb의 최대 다양성은 107 개의 상이한 분자로 계산된다. 총 RNA(약 400 ㎍)를 산 구아니디늄 티오시아네이트 추출법을 이용하여 이들 세포로부터 분리하였다(Chomczynski and Sacci, 1987).
cDNA를 이전에 개시된 대로(de Haard et al.,1999) M-MLV 역전사효소(Gibco BRL) 및 올리고-dT-프라이머 또는 헥사뉴클레오티드 임의 프라이머(Amersham Biosciences)를 이용하여 100 ㎍의 총 RNA에서 제조하였다. 상기 cDNA를 페놀/클로로포름 추출과 함께 에탄올 침전을 이용하여 정제하고 이어서 VHH 레퍼토리를 특이적으로 증폭시키기 위해 주형으로 이용하였다.
EP 01205100.9호에 개시된 대로, 올리고-dT 프라이머와 함께, PstI 제한 부위(진함)를 도입하는 단일 축퇴 골격1(FR1) 프라이머 ABL013(5'-GAGGTBCARCTGCAGGASTCYGG-3')와 함께 주형으로서 올리고-dT 프라임된 cDNA를 이용하여 VHH 레퍼토리를 증폭시켰다. 이 증폭은 1650 bp와 1300 bp의 두 단편을 생성하며, 후자는 CH1-결실된 HcAb 유전자로부터 유래된 생성물이다. 더 작은 PCR-생성물을 젤 정제하고 이어서 PstI과 BstEII로 분해하였다. BstEII-부위는 중쇄 유래된 VHH 암호 DNA 단편의 FR4내에 자주 발생한다.
다르게는, VHH 레퍼토리를 두 개의 IgG 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 힌지-의존성 접근법으로 증폭시켰다. 단일 PCR 반응에서 HcAb에 대해 특이적인 것으로 알려진 짧은(5'-AACAGTTAAGCTTCCGCTT GCGGCCGC GGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3') 또는 긴(5'-AACAGTTAAGCTTCCGCTT GCGGCCGC TGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT-3') 힌지 프라이머를 FR1-프라이머 ABL013과 배합하였다(상기 참고). PstI 및 NotI(진하며 밑줄) 제한 부위를 각각 FR1과 힌지 프라이머내로 도입하여 클로닝을 허용하였다. 이어서, DNA 단편을 PstI-BstEII 또는 PstI-NotI 분해된 파지미드 벡터 pAX004내로 결찰시켰으며, 상기 벡터는 pHEN1(Hoogenboom et al., 1991)과 동일하지만, 각각 정제 및 검출을 위한 카르복시말단 (His)6- 및 c-myc-태그를 암호한다. 결찰 혼합물을 마이크로콘 필터(YM-50, Millipore)에서 탈염시키고 이.콜리 TG1 세포내로 전기천공시켜 1.8 X 107 클론을 함유한 라이브러리를 얻었다. 형질전환된 세포를 100 ㎍/ml 암피실린 및 2% 글루코스를 함유한 LB를 가진 하나의 20 X 20 cm 플레이트에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 2xTY 배지를 이용하여 플레이트로부터 콜로니를 긁어내고 20% 글리세롤에서 -80℃에서 저장하였다.
품질 관리로서, 벡터계 프라이머의 조합을 이용하는 PCR에 의해 삽입체 함유 클론의 퍼센티지를 각 라이브러리를 위해 24 클론에서 확인하였다. 이 분석은 클론의 95%가 VHH 암호 삽입체를 함유함을 밝혔다. 변이성은 이들 24 클론의 증폭된 VHH 단편의 HinfI 핑거프린트 분석에 의해 검사하였으며, 모든 클론이 사실상 상이한 것으로 나타났다(데이터 안 나타남).
2) 안타고니스트성 항-TNF VHH의 선별
두 라이브러리로부터 파아지를 제조하였다. 폴리클로날 파아지 레퍼토리를 얻기 위하여, 라이브러리를 100 ㎍/ml 암피실린과 2% 글루코스를 함유한 2xTY에서 37℃에서 로그상까지(OD600 = 0.5) 성장시키고 이어서 37℃에서 30분동안 M13K07 헬퍼 파아지로 수퍼감염시켰다. 감염된 세포를 4000 rpm에서 5분동안 침전시키고 100 ㎍/ml 암피실린과 25 ㎍/ml 카나마이신을 함유한 2xTY에 재현탁시켰다. 박테리오파아지를 37℃와 250 rpm에서 밤새 성장시켜 증식시켰다. 밤샘 배양물을 4500 rpm에서 15분간 원심분리하고 얼음에서 30분동안 항온처리하여 [20% 폴리에틸렌글리콜 6000, 1.5M NaCl]-용액의 1/5 부피로 침전시켰다. 4000xg와 4℃에서 15분간 원심분리하여 파아지를 침전시켰다. PBS에서 파아지의 재현탁 후, 세포 찌꺼기를 마이크로원심분리기 튜브에서 최대 속도(15000 x g)에서 1분간 원심분리하여 침전시켰다. 파아지 입자를 함유한 상등액을 새로운 튜브로 옮기고 다시 파아지를 전술한 대로 침전시켰다. 파아지를 PBS에 용해시키고 나머지 세포 찌꺼기로부터 전술한 대로 분리하였다. 파아지의 역가를 로그상의 TG1 세포의 감염 및 이어서 선별 배지에의 도말에 의해 결정하였다.
생체외 비오틴화된 TNF-알파를 이용하여 라이브러리를 선별하였다. 비오틴화를 Magni et al(Anal Biochem 2001, 298, 181-188)에 의해 개시된 대로 실시하였다. TNF로의 비오틴의 통합은 SDS-PAGE 분석 및 엑스트라비딘-알카리 포스파타제 접합체(Sigma)를 이용한 검출에 의해 평가되었다. 변형된 단백질의 기능성은 그것이 재조합 p75 수용체로 코팅된 고체상에 결합하는 능력에 대해 평가하였다.
스트렙타비딘 코팅된 미세적정 플레이트(4℃에서 16시간동안 10㎍/ml 스트렙타비딘 100 ㎕로 코팅됨)상에 비오틴화된 TNF-알파(실온에서 2시간동안 웰 당 10 내지 400 ng)를 포획함으로써 VHH를 선별하였다. 안타고니스트성 VHH를 과량의 수용체, 세포외 리간드 결합 도메인 또는 수용체를 발현하는 세포로 용출시켜 얻었다. 포획된 사이토카인으로 파아지를 2시간 항온처리한 후, 비특이적인 파아지를 세척하여 제거하고, 안타고니스트성 VHH를 나타내는 특이적인 파아지를 수용체(CD120b 또는 p75의 세포외 도메인; 10 μM) 또는 수용체 제시 세포(웰 당 105 초과 KYM 세포)로 30분동안 용출시켰다. 20의 인자를 초과하는 고 농축물, 즉, 수용체로 용출된 파아지의 수와 혈청 알부민(50 ㎍/웰)에 의해 용출된 것의 비율은 TNF-알파 특이적인 클론의 성공적인 선별을 제안하였다. 다르게는, 수용체로 용출하는 대신, 낮은 pH가 VHH 및/또는 항원의 변성을 야기하는 표준 과정을 적용하였다(0.1 M 글리신 완충액 pH 2.5). 로그 상 성장중인 이.콜리 세포를 용출되고 중화된 파아지로 감염시키고 선별 배지에 도말하였다.
개별 클론을 뽑아서 배양 상등액에서 VHH를 생산하기 위해 미세적정 플레이트에서 성장시켰다. 엑스트라비딘 코팅된 플레이트에서 포획된 TNF-알파를 이용한 ELISA 스크리닝은 약 50%의 양성 클론을 밝혔다. HinfI-핑거프린트 분석은 13개의 상이한 클론이 선별되었음을 나타내었으며, 이들은 50 ml 규모로 성장되고 유도되었다. 상기 클론의 서열은 표 1에 나타난다.
VHH#1A, #2B, #3E, #3G, #7B 및 #12B로 불리며 상이한 서열을 갖는 다섯 클론(도 1)을 상세히 특징을 밝혔다. VHH#3E, #3G, 및 #7B는 위치 45(아르기닌)에서 전형적인 친수성 잔기를 보유하며 FR2의 위치 47에서 페닐알라닌에서 트립토판으로의 치환을 보유하여 가용성 면에서 유익한 특성을 부여하는 단일 도메인 항체 단편이다. VHH#1A는 사람 기원 또는 다른 종으로부터의 이중쇄 항체에서 일반적으로 발견되는 소수성 FR2 잔기를 함유하지만, 이중쇄 항체로부터의 VH에서 존재하는 보존된 트립토판 잔기를 대신하는 위치 103에서의 하전된 아르기닌 잔기에 의해 친수성에서의 상기 손실을 보상한다(PCT/EP02/07804). 본 발명에서 개시된 인간화된 카멜리대 단일-도메인 항체의 새로운 부류는 VHH#2B와 VHH#12B에 의해 나타내지며, 이것은 위치 103에서 소수성 잔기 트립토판과 함께 FR2에서 소수성 잔기를 함유한다. 50 ml 규모로 배양하여 보다 많은 양의 항체 단편을 발현시키고 TALON 수지(Clontech)를 이용하여 IMAC에 의해 정제하였다. 용출제 이미다졸을 제거하기 위하여 PBS에 대하여 투석한 후, VHH의 양을 OD280에 의해 결정하였으며, 각 클론으로부터 약 300 ㎍의 VHH를 얻었다.
이 물질을 ELISA에서 (비오틴화된) TNF의 검출의 민감도를 결정하는 데 이용하였다. 이 목적을 위하여, 비오틴화된 TNF(1 ㎍/ml)의 포획을 위해 스트렙타비딘(10 ㎍/ml) 코팅된 미세적정 플레이트를 이용하였으며, VHH를 0.2% 카세인/PBS에 희석시키고 실온에서 2시간동안 항온처리하였다. 결합된 VHH를 항-MYC mAB9E10(0.5 ㎍/ml) 및 항-마우스 AP 접합체(1000 배 희석됨, Sigma)로 검출하였다. 결과는 도 2에 나타난다.
3) KYM 세포주를 이용한 세포독성 분석에서 안타고니스트적 효과의 결정
TNF-알파-유도된 세포정지/세포독성을, Vandenabeele 및 동료들(Vandenabeele, P., Declercq, W., Vercammen, D., Van de Craen, M.,Grooten, J.,Loetscher, H.,Brockhaus, M.,Lesslauer, W.,Fiers, W.(1992) Functional characterization of the human tumore necrosis factor receptor p75 in a transfected rat/mouse T cell hybridoma, J.Exp.Med.176, 1015-1024)에 의해 개시된 색채계 MTT 분석에 의해 결정하였다. MTT(3-(4,5-시메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드)는 살아있는 세포에 의해 절단되어 진한 청색의 포르마잔 생성물을 생성하는 연노란색 기질이다. 이 과정은 활성 미토콘드리아를 필요로 하며, 금방 죽은 세포도 많은 양의 MTT를 절단하지 못한다. KYM 세포(Sekiguchi M, Shiroko Y, Suzuki T, Imada M, Miyahara M, Fujii G.(1985) Characterization of a human rhabdomyosarcoma cell strain in tissue culture. Biomed.Pharmacother. 39,372-380)를 96 웰 미세적정 플레이트에 심고 TNF-알파(0.216 ng/ml 또는 약 5 pM의 삼량체)의 존재 또는 부재하에서 배양시켰다. TNF에 더하여, 다양한 농도의 항체(VHH 또는 레미케이드)를 배양동안 포함시켰다. 분석을 위하여 MTT를 500 ㎍/ml의 최종 농도로 배양 배지에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 항온처리하여 미토콘드리아 효소에 의해 MTT를 절단시켰다. 웰의 바닥에서 검은색의 보풀같은 결정으로 나타나는 형성된 포르마존 생성물을 산 이소프로판올(이소프로판올중의 40 nM HCl) 또는 DMSO의 첨가에 의해 용해시켰다. 흡광도를 570 nm에서 측정한다.
MTT 분석(도 3)은 FR2에서의 사람-유사 소수성 잔기와 함께 위치 103에서의 아르기닌을 갖는 VHH#1A가 적당한 안타고니스트 효과(IC50 ~ 100 nM)를 가짐을 나타낸다. FR2에서 특징적인 친수성 잔기를 갖는 VHH#7B는 ELISA에서 사이토카인의 민감한 검출에도 불구하고 TNF-알파가 그 리간드에 결합하는 것을 막지 않는다. 대조적으로, 친수성 FR2 특징 잔기를 갖는 VHH#3E 및 #3G는 매우 강력한 안타고니스트적 VHH(20 nM의 IC50)이다. VHH#3E와 #3G는 높은 상동성을 가지며 클론에서 관련되나(Harmsen et al., Mol. Immunol. 37, 579-590), VHH#3E는 아마도 그것이 VHH#3G보다 더 높은 친화성을 가지는 사실로 인해 더욱 강력하다(도 2). (키메릭) 모노클로날 항체 레미케이드는 매우 강력하며(80 pM의 IC50), 그것의 유도된 Fab 단편은 이 효능의 대부분을 잃어버렸다(IC50은 3 nM이며, 그대로의 mAB보다 30배 적음). 이것은 항체와 사이토카인 사이의 상호작용의 친화성 효과를 명확히 나타내며; 두 개의 결합 부위를 갖는 mAB는 협조적 결합을 통하여 삼량체 TNF 분자와 더욱 효과적으로 상호작용한다. VHH 단편은 엄격하게 1가이며 따라서 VHH 유전자를 유전적으로 융합시켜 친화성을 증가시키는 것이 그들의 안타고니스트 효능을 증가시킬 수 있는 것으로 생각되었다(실시예 4 참고).
이들 실험은 새로운 부류의 사람-유사 VHH가 진실한 결합 및 기능적 특성을 가지며 따라서 치료 목적을 위해 그들의 적용이 가능함을 보여준다.
실시예 2 : 부위 지시된 돌연변이유발에 의한 VHH#12B와 VHH#3E의 인간화
1) VHH#3E/VHH#12B와 인간 생식세포 중쇄 V-영역 DP-47 사이의 상동성
VHH#12B와 인간 VH3 생식세포 서열(DP-47)의 배열 결과 하기 서열 배열에 나타난 대로 높은 상동성을 확인하였다:
위치 1,5,28 및 30에서 FR1에서 4 아미노산 변화
위치 74, 76, 83, 84 및 93에서 FR3에서 5 아미노산 변화
위치 108에서 FR4에서 1 아미노산 변화:
따라서, 사람 생식세포 유전자 DP-47에 대해 높은 상동성을 갖는, TNF-알파 사이토카인을 위한 특이적 억제제는 추가로 인간화하고 ELISA에서 억제 능력에 대한 돌연변이유발의 영향을 평가하기 위한 이상적인 후보였다.
VHH#3E와 인간 VH3 생식세포(DP-47)의 배열 결과 DP-47의 소수성 잔기에 비하여 VHH#3E의 FR2에서는 친수성 아미노산 잔기가 존재함을 확인하였다.
인간 VH에 존재하는 소수성 잔기에 의해 친수성을 치환하는 효과의 평가는, 카멜리대 VHH 서열의 대부분이 친수성 잔기를 함유하므로 중요하다.
2) VHH#12B의 돌연변이유발
VHH#12B를 Chen 및 Ruffner에 의해 개시되고 스트라타진(신속변화 부위지시된 돌연변이유발)에 의해 상업화된 비-PCR계 부위 지시된 돌연변이유발 방법을 이용하여 돌연변이시켰다. 플라스미드 DNA를 원하는 돌연변이를 도입하는 2개의 돌연변이유발성 프라이머와 함께 주형으로 이용하였다. 상기 두 프라이머는 각각 주형 플라스미드 DNA의 반대 쇄에 상보적이다. Pfu DNA 폴리머라제를 이용하는 폴리머라제 반응에서 각 쇄는 한정된 수의 사이클을 이용하는 사이클링 프로그램동안 프라이머 서열로부터 연장된다. 이 결과 야생형과 돌연변이된 쇄의 혼합물이 형성된다. DpnI로 분해한 결과 돌연변이된 생체외 합성된 DNA 쇄의 선별이 이루어졌으며, 이는 단지 주형 쇄만이 분해에 민감하기 때문이다. DNA를 침전시키고 이.콜리로 형질전환시키고 서열 분석에 의해 원하는 돌연변이를 위해 분석하였다. 생성된 돌연변이 VHH와 돌연변이유발성 프라이머는 표 2에 열거된다. 돌연변이 클론으로부터 플라스미드를 제조하고 WK6 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포내로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 이용하여 2% 글루코스와 100 ㎍/ml 암피실린을 함유한 LB에서 밤새 배양을 시작하였다. 이 밤샘 배양물을 100 ㎍/ml 암피실린을 함유한 300 ml TB 배지에 100배 희석하고, OD600nm = 2일때까지 37℃에서 항온처리하고, 이때 1 mM IPTG와 5 mM MgSO4(최종 농도)를 첨가하고 배양물을 37℃에서 3시간동안 더 항온처리하였다.
배양물을 4℃에서 4,500 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 침전물을 -20℃에서 1시간동안 또는 밤새 동결시켰다. 이어서, 침전물을 실온에서 40분간 해동시키고, 20 ml PBS/1 mM EDTA/1M NaCl에 재현탁시키고 얼음에서 1시간동안 흔들었다. 4℃에서 4,500 rpm에서 20분간 원심분리하여 페리플라즘 분획을 분리하였다. VHH를 함유한 상등액을 TALON(ClonTech)상에 로드하고 균질하게 정제하였다. VHH의 수율은 계산된 소멸 계수를 이용하여 결정하였다. 모든 돌연변이 VHH는 야생형에 비교할만하게 발현되었다. 돌연변이를 생체외 수용체 결합 분석에서 그들의 억제 능력에 대해 분석하였다.
미세적정 플레이트를 PBS중의 2 ㎍/ml의 엔브렐(Wyeth)을 이용하여 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 PBS-Tween으로 5회 세척하고 실온에서 1% 카세인을 함유한 PBS로 1시간동안 차단시켰다. 플레이트를 PBS-Tween으로 5회 세척하였다. 비오틴화된 인간 TNF-알파(80 ㎍/ml)를 돌연변이 또는 야생형 VHH#12B의 희석 시리즈로 실온에서 1시간동안 예비항온처리하고 혼합물을 미세적정 플레이트의 웰에서 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 플레이트를 PBS-Tween으로 5회 세척하였다. 결합된 인간 TNF-알파는 엑스트라비딘-AP(1/1000 희석) 및 파라니트로페닐포스페이트(pNPP)를 이용하여 검출하였다. 405 nm에서 30분후에 시그널을 측정하였다. 결과가 도 4 및 5에 나타난다. IC50은 66 nM(야생형)에서 200 nM(돌연변이 Q1E+Q5L+A74S+Y76N+K83R+P84A)로 3배 증가하였다. 위치 T93A의 돌연변이는 억제를 손실시켰다(데이터 안 나타남). 인간화되는 데 여전히 필요한 위치는 E28, E30 및 Q108이다. 하지만, E28과 E30은 H1 기준 구조의 일부이며 따라서 초티아 넘버링 시스템에 따라 CDR1의 일부이다.
돌연변이 VHH의 아미노산 서열이 표4의 서열 번호 17 내지 19에 나타난다.
3) VHH#3E의 돌연변이유발
전술한 비-PCR계 부위 지시된 돌연변이 방법을 이용하여 VHH#3E를 돌연변이시켰다. 얻어진 돌연변이 VHH와 돌연변이유발성 프라이머는 표 3에 열거된다.
모든 돌연변이 VHH는 야생형과 비교할만하게 발현되었다. 정제된 돌연변이 VHH를 ELISA에서 결합에 대해 분석하고 전술한 방법과 동일한 수용체 결합 분석에서 억제 능력에 대해 분석하였다.
ELISA의 결과는 도 6에 나타나고, 수용체 결합 분석의 결과는 도 7에 나타난다.
돌연변이 VHH의 아미노산 서열은 표 4의 서열 번호 21 내지 24에 나타난다.
실시예 3: 마우스 TNF-알파에 대한 안타고니스트 VHH의 분리
1) 항-마우스 TNF-알파 VHH의 선별
IBD 또는 크론 질병을 위한 마우스 모델에서 효능 연구를 실시하기 위해 마우스 TNF 특이적 VHH를 선별하였다. 따라서, 라마를 실시예 1에서 개시된 마우스 TNF-알파로 면역시켰다. 마지막 면역화 후 4일 및 10일에 샘플된 PBL 및 4일 후 림프절로부터 채취한 생검으로부터 RNA를 추출하였다. 전체 RNA를 임의 프라임되거나 올리고-dT 프라임된 cDNA로 전환시키고, Ig 유래 프라이머 또는 올리고 dT 프라이머와 단일 Ig 프라이머(실시예 1 참고)의 배합물을 이용하여 VHH 암호 유전자 분절의 증폭을 위한 주형으로 이용하였다. Ig 프라이머를 이용하여, 8.5 x 107 클론을 함유한 라이브러리를 첫번째 PBL로부터 생성시켰으며, 두번째 PBL 샘플로부터는 7 X 106 클론을 갖는 라이브러리, 그리고 림프절로부터는 5.8 X 108 클론을 갖는 라이브러리를 생성시켰다. 올리고-dT 프라이머와 Ig 프라이머의 조합을 이용하여, 첫번째 PBL 샘플로부터 1.2 X 108 클론을 함유하는 라이브러리를 만들고, PBL의 두번째 샘플로부터는 5.7 X 107 클론의 라이브러리를 만들었으며, 림프절 유래 라이브러리는 2 X 108 클론을 함유하였다. 사용된 프라이머의 조합에 따라 라이브러리를 모으고 생성된 두 라이브러리를 전술한 대로 파아지의 증식을 위하여 성장시켰다. 코팅된 스트렙타비딘상에 포획된 비오틴화된 마우스 TNF-알파에서 선별을 실시하고, 결합된 파아지를 마우스 TNF-알파와 교차반응하는 것으로 알려진 사람 수용체 p75와의 경쟁에 의해 용출시켰다. Ig 유래 프라이머를 이용한 증폭에 의해 얻어진 라이브러리로부터 두 가지 다른 마우스 TNF-알파 특이적 VHH(VHH#3F 및 VHH#m9E)를 선별하고, 두개의 밀접하게 관련된 VHH를 올리고-dT 프라이머와 Ig-프라이머를 이용한 PCR에 의해 구성된 라이브러리로부터 얻었다(도 8).
2) L929 세포주를 이용한 세포독성 분석에서 안타고니스트 효능의 결정(도 9)
쥐과 세포주 L929를 이용하여 실시예 1에서 개시된 것과 동일한 타입의 분석을 실시하였다. VHH#m3F와 VHH#m4B(도 9)는 다른 두 VHH보다 10배 더 강력한 것으로 판명되었다.
실시예 4: 다가 카멜리대 항체를 이용하여 친화성을 증가시킴으로써 안타고니스트 효능을 증가시키기
1) 사람 및 마우스 TNF-알파에 대한 2가, 3가 및 4가 VHH의 안타고니스트 효능
이.콜리 생산 벡터 pAX11(도 10)을 고안하였으며, 이 벡터는 2가 또는 이특이적 VHH의 2단계 클로닝을 가능하도록 한다. 카르복시 말단 VHH를 먼저 PstI과 BstEII를 이용하여 클로닝하고, 두번째 단계에서는 다른 VHH를 첫번째 유전자 단편내에서는 절단하지 않는 SfiI 및 NotI에 의해 삽입한다. 상기 과정은 증폭에 의한 새로운 부위를 강요하지 않으며 따라서 PCR 에러가 도입될 위험을 피한다.
이 벡터를 이용하여 안타고니스트 항-인간 TNF-알파 VHH#3E의 2가 유도체를 생성하였다. 2가 VHH를 암호하는 플라스미드 벡터를 이용하여 3가 및 4가 유도체를 생성시켰으며, 이것은 두 VHH 유전자 절편에서 발생하는 BstEII를 이용하여 플라스미드를 부분 분해하여 이루어졌다. 선형화된 벡터를 젤로부터 정제하고, 이어서 탈인산화시켜, 동일한 플라스미드의 완전한 분해에 의해 얻어진 약 350 bp의 BstEII 단편의 클로닝을 위한 수용체로 이용하였다. 벡터에 첨가하기에 앞서 BstEII 단편만의 결찰은 다가 VHH 암호 유전자 절편의 삽입을 증가시킨다. 이.콜리 TG1에서의 형질전환 후, 생성된 클론을 M13Rev 및 M13Fwd 프라이머를 이용한 PCR에 의해 스크리닝하였으며; BstEII는 비대칭 절단자이므로(5 nt 오버행), 단지 정확하게 배향된 삽입체만이 얻어졌으며, 이는 플라스미드를 PstI 단독(350 bp)으로 분해하거나 또는 EcoRI과 HindIII로 이중 분해하여 확인하였다(2가를 위해서는 1000 bp(BIV 3E, 서열 번호 73), 3가를 위해서는 1350 bp(TRI 3E, 서열 번호 74) 및 4가를 위해서는 1700 bp(TETRA 3E, 서열 번호 75), 데이터는 안 나타남). 서열들은 표 7에 열거된다.
클론을 성장시키고 50 ml 규모로 유도시키고, 페리플라즘 분획을 준비하고 TALON 수지를 이용한 IMAC 정제를 위해 이용하였다. 정제된 생성물을 쿠마시 염색된 PAGE에서 분석한 결과, 본래의 다가 VHH의 우수한 생성 수준(세포 배양물 1리터 당 2 내지 10 mg 사이)이 확인되었다(도 11 참고). IMAC 정제된 VHH의 분자 외관을 수퍼덱스 75HR 컬럼에서 젤 여과에 의해 결정하였으며 예상대로 더 높은 친화성을 갖는 분자가 컬럼으로부터 더 빨리 나왔다(도 12 참고).
안타고니스트 효능을 KYM 세포를 이용하여 세포계 분석으로 분석하였다. 세포를 미세적정 플레이트에 심고 TNF-알파(1.29 ng/ml 또는 약 25 pM의 삼량체)의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. 분석 결과(도 13) 이 연구에서 사용된 1가 분자가 가장 약한 안타고니스트 특징을 가짐을 밝혔으며, 이는 그들의 IC50 값에 의해 반영되며: 키메릭 항체 레미케이드에서 유래한 Fab는 2 nM의 IC50을 가지며 VHH#3E의 IC50은 12 nM이다(도 3 참고). 이용된 분자의 친화성은, Fab보다 40배 더 효과적인(IC50 50 pM) 2가 IgG 분자 레미케이드에서 관찰된 대로 안타고니스트 효능에 대해 극적인 영향을 갖는 것으로 드러났다. TNF-알파는 이량체 수용체와 상호작용하는 삼량체 분자이며, 따라서 IgG의 친화성이 사이토카인상의 두 에피토프에의 상호 결합을 허용하고 이전에 개시된 것과 같은(Santora et al, Anal. Biochem. 299,119-129) 큰 복합체의 형성을 지지함이 예상된다. 놀랍게도, 단량체에서 이량체로 될때 VHH의 친화성의 증가는 레미케이드에서 관찰되는 것보다 훨씬 더 우수한 효과를 가지며, 이는 이량체의 IC50(30 pM)이 단량체보다 400배 더 낮기 때문이다. 친화성을 더 증가시키면 더 우수한 안타고니스트 행동을 야기하며, 삼량체 VHH는 20 pM의 IC50을 가지며 4가 형태는 6 pM의 IC50을 갖는다. VHH의 모든 더 높은 친화성 형태는 레미케이드보다 더 효과적인 한편, 4가 형태는 IgG의 Fc에 융합된 수용체 p75의 세포외 도메인으로 구성되어 2가 결합 모드를 갖는 엔브렐보다 훨씬 더 우수하다.
안타고니스트 행동에 대한 친화성의 동일한 예상치못한 효과는 마우스 TNF에 대해 생성된 VHH에서 관찰되었다(도 14). 동일한 타입의 세포독성 분석을, 기질로서 MTT를 이용하고 마우스 TNF-알파(65 pg/ml 또는 1.3 pM)를 이용하되, 마우스 특이적 수용체를 발현하는 쥐과 세포주 L929를 이용하여 실시하였다. 세 가지 다른 안타고니스트(1가) VHH를 확인하여 9E와 3F로 명명하였으며, 이중 처음 두 가지는 25 nM의 IC50을 그리고 후자는 2 nM을 가졌다(실시예 3 참고). 3F의 2가 형태(BIV#m3F, 서열 번호 76)로의 전환은 IC50에서 1000배 증가를 낳았으며(2 pM), 따라서 항체의 친화성의 증가가 안타고니스트 특성의 예상치 못한 개선을 야기함을 다시 한번 입증하였다.
2) VHH-Fc 융합체와의 비교
사람 TNF에 대한 VHH#3E를 pCDNA3에서 유래한 적응된 벡터에서 PstI과 BstEII를 통해 클로닝하여, 사람 IgG1의 CH1 결실된 Fc 부분에의 유전적 융합체를 생성하였다. 서열결정에 의해 확인한 후, 플라스미드 구조체를 골수종 세포주 NS0로 형질감염시켰다. 얻어진 세포주를 성장시키고 VHH-Fc 융합체를 배양 상등액내로 분비시켰다. 생성물을 항-인간 Fc VHH 수지를 이용하여 정제하고 쿠마시 염색된 젤에서 분석하였다(도 15). DTT의 존재하에서 상기 융합체는 45 kDa 단백질로서 나타났으며, DTT의 부재하에서는 90 kDa의 분자량을 갖는 이량체 분자를 관찰할 수 있었다. 이 이량체 생성물은 힌지 영역내에 위치한 시스테인 잔기로부터 기원하는 두 개의 이황화 결합에 의한 두 쇄의 연결에 의해 생성된다.
VHH-융합체를 사람 세포주 KYM을 이용하는 생물분석에서 시험하였으며, VHH-융합체와 2가 VHH 두 분자 모두 동일한 친화성을 가지며 그들 모두 VHH#3E로부터 기원함에도 불구하고 2가 VHH보다 VHH-융합체가 5배 덜 효과적인 것으로 나타났다(도 16). 아마도 부피가 큰 Fc 꼬리에 의한 입체 장애가 이러한 차이를 야기하였을 것이다.
실시예 5 : 본 발명의 항-표적-단일 도메인 항체 사이의 상동성의 계산
본 발명의 항-표적 단일 도메인 항체 사이의 아미노산 서열 상동성의 정도를 바이오에디트 시퀀스 얼라인먼트 에디터를 이용하여 계산하였다. 상기 계산은 서열을 ClustalW(Thompson, J. D. , Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, submitted, June 1994)에 의해 배열할 때 모든 서열간에 동일한 잔기의 비율을 나타낸다. 표 8은 본 발명의 항-혈청 알부민 VHH 사이의 분획 상동성을 나타낸다. 표 9는 본 발명의 항-TNF-알파 VHH 사이의 분획 상동성을 나타낸다. 표 10은 본 발명의 항-IFN-감마 VHH 사이의 퍼센티지 상동성을 나타낸다.
실시예 6: VHH#3E의 VHH-CDR3 단편의 발현
VHH#3E의 CDR3 영역을 골격 4 영역에 위치한 센스 프라이머(전방: CCCCTGGCCCCAGTAGTTATACG) 및 골격 3 영역에 위치한 안티-센스 프라이머(역방: TGTGCAGCAAGAGACGG)를 이용하여 증폭시켰다.
pAX10에 CDR-3 단편을 클로닝하기 위해, 두번째 라운드의 PCR 증폭을 원하는 제한 부위를 도입하는 하기 프라이머를 이용하여 실시하였다:
역방 프라이머 Sfi1:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCTGTGCAGCAAGAGACGG
전방 프라이머 Not1:
GTCCTCGCAACTGCGCGGCCGCCCCCTGGCCCCAGTAGTTATACG
각 프라이머 50 pmol을 이용하여 50 ml 반응 부피로 PCR 반응을 실시하였다. 일차 PCR을 위한 반응 조건은 94℃에서 11분, 이어서 30사이클동안 94/55/72℃에서 30/60/120초, 및 72℃에서 5분이었다. 모든 반응은 2.5 mM MgCl2, 200 mM dNTP 및 1.25U AmpliTaq God DNA 폴리머라제 (Roche Diagnostics, Brussels, Belgium)를 이용하여 실시되었다. Sfi1 및 Not1을 이용한 절단 후 PCR 생성물을 pAX10에 클로닝하였다.
실시예 7: 사람 TNF알파에 특이적인 항체 단편의 안정성 시험
경구 투여되는 단백질은 위의 산성 pH에서의 변성 및 펩신에 의한 분해에 노출된다. 본 발명자들은 위장 환경을 모방하는 것으로 가정되는 펩신에 대한 VHH#3E의 저항성을 연구하기 위한 조건을 선택하였다. 사람 TNF 알파에 대해 특이적인 VHH#3E를 이.콜리에서 재조합 단백질로서 생산하였으며 IMAC 및 젤 여과 크로마토그래피에 의해 균질하게 정제하였다. 정제 후 단백질 농도를 280nm에서 계산된 몰 소멸 계수를 이용하여 분광학적으로 결정하였다. 100 ㎍/ml의 희석된 용액을 각각 pH 2, pH 3 및 4의 맥일바인(McIlvaine) 완충액 (J. Biol. Chem. 49,1921, 183) 에서 제조하였다. 이들 용액을 후속하여 1/30 w/w 비율로 돼지 위 점막 펩신을 첨가하기에 앞서, 37℃에서 15분동안 항온처리하였다. 프로테아제 첨가 후 60분에, 샘플을 모으고 0.1% 카세인을 함유한 PBS(pH7.4)에 즉시 100배 희석시켜 펩신을 불활성화시켰다. 7개의 추가의 3배 희석액을 이 샘플로부터 제조하여 ELISA에 의해 기능성 항체 단편의 존재를 평가하였다. 프로테아제의 첨가에 앞서 모아진 분액으로부터 제조된 동일한 희석액을 기준으로 사용하였다. ELISA 분석에서 비오틴화된 TNF 알파는 뉴트라비딘으로 코팅된 미세적정 플레이트의 웰에 포획되었다. 펩신-처리된 샘플 및 기준 샘플 둘다를 위하여, 샘플의 유사한 연속 희석액을 제조하고 이들 희석액 100 ㎕를 웰에 첨가하였다. 1시간동안 항온처리한 후, 플레이트를 세척하였다. 포획된 TNF 알파에의 VHH 결합의 검출을 위하여, 폴리클로날 토끼 항-VHH 항혈청(R42) 및 항-토끼 IgG 알카리 포스파타제 접합체를 이용하였다. 세척 후, 파라니트로페닐 포스페이트로 플레이트를 현상하였다. 도 17에 그려진 데이터는 분해 조건에 노출된 모든 샘플 및 기준 샘플에 대해 유사한 곡선을 보여준다. 이것은 VHH#3E가 본질적으로 선택된 모든 조건하에서 그 기능적 활성을 보유함을 나타낸다.
실시예 8: 항-사람 TNF알파 특이적 VHH의 마우스에서의 경구 투여
항-사람 TNF알파 특이적 VHH#3E를 함유하는 항체 용액(100배 희석된 PBS에서 ml 당 100 ㎍)을 제조하였다. 마우스 3마리를 먼저 12시간동안 마실 물을 제공하지 않고 이어서 다음 2시간동안 항체 용액에 자유롭게 접근하도록 하였다. 마우스를 죽이고 그들의 위를 절개하였다. 즉시 위를 1% BSA를 함유한 500 ㎕ PBS로 세척하여 위의 내용물을 수집하였다. 이 세척된 물질을 이어서 미희석 물질로부터 1/5 희석에서 시작하여, 연속적인 3배 희석액을 제조하는 데 이용하였다. 이들 샘플 100 ㎕를 사람 TNF 알파로 코팅된 미세적정 플레이트의 개별 웰에 옮겼다. 1시간동안 항온처리하고 이어서 여러번 세척한 후, 면역반응성 물질의 존재를 폴리클로날 토끼 항-VHH 항혈청(R42) 및 이어서 항-토끼 알카리-포스파타제 접합체로 항온처리하여 평가하였다. ELISA를 파라니트로페닐 아세테이트로 현상시켰다. 10분후 얻어진 ELISA 시그널은 이들 마우스의 위 세척물에서 기능적 VHH#3E의 존재를 명확히 입증하였다. 표준 곡선에 비교하여, 위 세척물내의 기능적 항체 단편의 농도는 시험된 마우스 세마리에 대하여 1.5, 12.6 및 8.6 ㎍/ml로 측정되었다.
실시예 9: IBD를 위한 동물 모델에서의 효능
1) 만성 대장염의 동물 모델
다양한 투여 경로를 통해 적용된 2가 VHH 구조체의 효능을 BALB/c 마우스에서 만성 대장염의 DSS(덱스트란 소듐 설페이트) 유도 모델에서 평가하였다. 이 모델은 원래 Okayasu et al. [Okayasu etal. Gastroenterology 1990; 98: 694-702]에 의해 개시되었으며 Kojouharoff et. al. [G. Kojouharoff et al. Clin. Exp. Immunol. 1997; 107: 353-8]에 의해 변형되었다. 동물은 11주 연령에 찰스 리버 래보래토리즈(독일)로부터 얻었으며 21 내지 22 g 사이의 체중에 도달할 때까지 동물 설비에 보관하였다. 만성 대장염은 4 번의 DSS 처리 사이클에 의해 동물에서 유도되었다. 각 사이클은, DSS가 5%(w/v)의 농도로 식용수와 함께 제공되는 DSS 처리 간격(7일) 및 식용수에 DSS가 없는 회복 간격(12일)로 구성되었다. 마지막 회복기간은 12일에서 21일로 연장하여, 치료시에 급성 염증보다는 만성인 염증 상태를 제공하였다. 마지막 회복 간격에 이어 마우스를 임의로 8마리 마우스의 그룹들로 할당하고 VHH-구조체를 이용한 치료를 시작하였다. 치료 간격은 2주였다. 치료 간격이 끝난 후 1주일째에 동물을 죽이고, 장을 잘라서 조직 검사를 실시하였다. 실험 세팅은 도 18에 나타난다.
2) VHH 치료 스케쥴
VHH 치료 기간동안, 마우스(그룹 당 8마리)를 연속 14일동안 2가 VHH 3F 100㎍을 위내 또는 정맥내 적용하여 2가 VHH#3F (VHH#m3F-VHH#m3F, 서열 번호 76)로 매일 치료하였다. 동물의 추가 그룹을 14일동안 2일에 한번씩 2가 VHH#3F로 직장으로 치료하였다. 모든 치료 그룹에서 2가 VHH#3F 100㎍의 투여량을 완충된 용액에서 1 mg/ml의 농도로 적용하였다. 음성 대조 그룹은 동일한 조건하에서 100 ㎕의 PBS가 주어졌다. 치료 스케쥴이 표 11에 나타난다.
3) 결과
마우스를 죽인 후, 체중을 결정하고 결장을 잘랐다. 잘라진 결장의 길이를 결정하고 결장의 조직을 헤마톡실린-에오신(HE) 염색(표준 조건)에 의해 평가하였다. 음성 대조(PBS 처리)와 비교할 때, 2가 나노바디 3F로 처리한 그룹은 길어진 결장 길이 및 개선된 조직학적 점수 [G.Kojouharoff et al. Clin. Exp. Immunol. 1997; 107: 353-8]를 나타내어 처리의 효능을 입증하였다.
[표 1]: TNF-알파에 대한 본 발명의 태양의 펩티드의 아미노산 서열 리스트
[표 2]: VHH#12B의 돌연변이유발을 위해 이용된 돌연변이유발 반응, 돌연변이유발성 프라이머 및 주형의 리스트
[표 3]: VHH#3E의 돌연변이유발을 위해 이용된 돌연변이유발 반응, 돌연변이유발성 프라이머 및 주형의 리스트
[표 4]: 인간화 및 야생형 항-TNF-알파 VHH의 개요
[표 5]: 항-마우스 혈청 알부민, 및 항-마우스 혈청 알부민 + 항 TNF-알파 VHH
[표 6]: 인간 IFN-감마에 대한 VHH의 아미노산 서열 리스트
[표 7]: TNF-알파에 대한 2가(BIV 3E, BIV#m3F), 3가(TRI3E) 또는 4가(TETRA 3E) VHH의 서열
[표 8]: 본 발명의 항-마우스 혈청 알부민 VHH의 아미노산 서열간의 분획 상동성
[표 9]: 본 발명의 항-TNF-알파 VHH 간의 분획 상동성
[표 10]: 본 발명의 항-IFN-감마 VHH 간의 % 상동성
[표 11]: 치료 스케쥴
그룹 동물 설명 스케쥴
1 8 음성 대조 1, 복강내 매일 100㎕ PBS 복강내 투여
2 8 음성 대조 2, 직장 2주동안 2일마다 100㎕ PBS 직장 투여
3 8 음성 대조 3, 위내 연속 14일동안 매일 100㎕ PBS를 위내 투여
4 8 양성 대조 1, 덱사메타손 7일 연속동안 5㎍ 복강내 투여
5 8 양성 대조 2, IL10을 발현하는 아이.락티스 연속 14일동안 하루에 한번씩 경구 적용
6 8 2가 VHH 3F, 위내 연속 14일동안 2가 VHH 3F2 100㎍을 매일 위내 투여
7 8 2가 VHH3F, 복강내 연속 14일동안 2가 VHH 3F 100㎍을 매일 위내 투여
8 8 2가 VHH3F, 직장 2주동안 2일마다 100 ㎕ PBS중의 100 ㎍ 2가 VHH 3F 직장 투여

Claims (49)

  1. 적어도 하나의 항-TNF-알파 단일 도메인 항체를 포함하는 항-TNF-알파 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 단일 도메인 항체가 서열 번호 1 내지 16 및 79 내지 84 중 어느 하나에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 것인 항-TNF-알파 폴리펩티드.
  3. 제1항 및 제2항에 있어서, 혈청 단백질에 대한 적어도 하나의 단일 도메인 항체를 추가로 포함하는 것인 항-TNF-알파 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혈청 단백질이 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 티록신-결합 단백질, 트랜스페린, 또는 피브리노겐 중 어느 하나인 것인 항-TNF-알파 폴리펩티드.
  5. 제3항 및 제4항에 있어서, 단일 도메인 항-혈청 단백질 단일 도메인 항체가 서열 번호 26 내지 29 및 85 내지 97 중 어느 하나에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 것인 항-TNF-알파 폴리펩티드.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 30 내지 43 중 어느 하나에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 것인 항-TNF-알파 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항-IFN-감마 단일 도메인 항체, 항-TNF-알파 수용체 단일 도메인 항체 및 항-IFN-감마 수용체 단일 도메인 항체로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단일 도메인 항체를 추가로 포함하는 것인 항-TNF-알파 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, TNF-알파에 대한 단일 도메인 항체의 수가 적어도 2개인 것인 항-TNF-알파 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 서열 번호 73 내지 76 중 어느 하나에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 것인 항-TNF-알파 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 단일 도메인 항체가 인간화된 카멜리대(Camelidae) VHH인 것인 항-TNF-알파 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 인간화된 카멜리대 VHH가 서열 번호 17 내지 19 및 21 내지 24 중 어느 하나에 의해 나타내지는 서열에 해당하는 것인 항-TNF-알파 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 및 항-IFN-감마 단일 도메인 항체, 항-TNF-알파 수용체 단일 도메인 항체 및 항-IFN-감마 수용체 단일 도메인 항체로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단일 도메인 항체를 포함하는, 대상에의 동시, 분리 또는 순차적 투여를 위한 조성물.
  13. 적어도 하나의 항-IFN-감마 단일 도메인 항체가 서열 번호 44 내지 72 중 어느 하나에 의해 나타내지는 서열에 해당하는, 제7항 내지 제11항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 제12항의 조성물.
  14. 상기 단일 도메인 항체가 전길이 단일 도메인 항체의 상동성 서열, 기능적 부분, 또는 상동성 서열의 기능적 부분인, 제1항 내지 제11항 및 제13항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 제12항 및 제13항의 조성물.
  15. 항-TNF-알파 폴리펩티드가 전길이 항-TNF-알파 폴리펩티드의 상동성 서열, 기능적 부분, 또는 상동성 서열의 기능적 부분인, 제1항 내지 제11항 및 제13항 및 제14항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 제12항 내지 제14항의 조성물.
  16. 적어도 하나의 단일 도메인 항체가 카멜리대 VHH인, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제15항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드 또는 제12항 내지 제15항의 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드를 암호하는 핵산.
  18. 하기의 단계를 포함하는, 제1항 내지 제11항, 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드의 종양 괴사 인자-알파에의 결합을 조절하는 제제를 확인하는 방법:
    (a) 제1항 내지 제11항, 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드를, 상기 폴리펩티드와 표적간의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절자의 존재 및 부재하에서 종양 괴사 인자 알파인 표적과 접촉시키는 단계, 및
    (b) 단계 (a)의 폴리펩티드와 표적간의 결합을 측정하며, 이때 상기 후보 조절자의 부재하에서의 결합에 비하여 상기 후보 조절자의 존재하에서의 결합의 감소는 제1항 내지 제11항, 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드와 종양 괴사 인자-알파의 결합을 조절하는 제제로서 상기 후보 조절자를 확인하는 단계.
  19. 하기 단계를 포함하는, 종양 괴사 인자-알파에의 제1항 내지 제11항, 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드의 결합을 통해 종양 괴사 인자-알파-매개된 질환을 조절하는 제제를 확인하는 방법:
    (a) 제1항 내지 제11항, 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드를, 상기 폴리펩티드와 표적간의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절자의 존재 및 부재하에서 종양 괴사 인자 알파인 표적과 접촉시키는 단계, 및
    (b) 단계 (a)의 폴리펩티드와 표적간의 결합을 측정하며, 이때 상기 후보 조절자의 부재하에서의 결합에 비하여 후보 조절자의 존재하에서의 결합의 감소는 종양 괴사 인자-알파-매개 질환을 조절하는 제제로서 상기 후보 조절자를 확인하는 단계.
  20. 하기 단계를 포함하는, 종양 괴사 인자-알파에의 제1항 내지 제11항, 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드의 결합을 통해 종양 괴사 인자-알파의 그 수용체에의 결합을 조절하는 제제를 확인하는 방법:
    (a) 제1항 내지 제11항, 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드를, 상기 폴리펩티드와 표적간의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절자의 존재 및 부재하에서 종양 괴사 인자 알파인 표적과 접촉시키는 단계, 및
    (b) 단계 (a)의 폴리펩티드와 표적간의 결합을 측정하며, 이때 상기 후보 조절자의 부재하에서의 결합에 비하여 후보 조절자의 존재하에서의 결합의 감소는 종양 괴사 인자-알파의 그 수용체에의 결합을 조절하는 제제로서 상기 후보 조절자를 확인하는 단계.
  21. 제1항 내지 제11항, 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드 및 종양 괴사 인자-알파를 포함하는 종양 괴사 인자-알파-매개된 질환을 조절하는 제제에 대한 스크리닝용 키트.
  22. 제18항의 방법에 따라 확인된, 제1항 내지 제11항, 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드의 종양 괴사 인자-알파에의 결합을 조절하는 미지의 제제.
  23. 제19항 및 제20항의 방법에 따라 확인된, 종양 괴사 인자-알파-매개 질환을 조절하는 미지의 제제.
  24. 제23항에 있어서, 상기 질환이 염증, 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군 및 다발성 경화증 중 하나 이상인 것인 미지의 제제.
  25. 염증성 과정에 관련된 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제17항의 핵산, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물, 또는 제22항 내지 제24항 중 어느 하나의 항의 제제.
  26. 염증성 과정에 관련된 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제17항의 핵산, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물, 또는 제20항 또는 제21항의 항의 제제의 용도.
  27. 불활성화되지 않고 위장 환경을 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물.
  28. 불활성화되지 않고 위장 환경을 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물의 용도.
  29. 질 및/또는 직장관에 전달되는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물.
  30. 질 및/또는 직장관에 전달되는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물의 용도.
  31. 코, 상부 호흡기 및/또는 폐에 전달되는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물.
  32. 코, 상부 호흡기 및/또는 폐에 전달되는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물의 용도.
  33. 장 점막에 전달되는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이며 장 점막의 투과성을 증가시키는 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물.
  34. 장 점막에 전달되는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이며 장 점막의 투과성을 증가시키는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물의 용도.
  35. 혀 밑의 조직을 효과적으로 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물.
  36. 혀 밑의 조직을 효과적으로 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물의 용도.
  37. 피부를 효과적으로 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환을 치료 및/또는 방지 및/또는 완화시키기 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물.
  38. 피부를 효과적으로 통과할 수 있는 TNF-알파 조절 물질에 의한 조절을 받아들이는 질환의 증상을 치료, 방지 및/또는 완화시키기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물의 용도.
  39. 상기 질환이 염증, 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군, 다발성 경화증, 애디슨 질병, 자가면역 간염, 자가면역 이하선염, 타입 I 당뇨병, 부고환염, 사구체신염, 그레이브 질병, 길리안-바레 증후군, 하시모토 질병, 용혈성 빈혈, 전신성 루푸스 홍반, 남성 불임, 다발성 경화증, 중증근육무력증, 천포창, 건선, 류마티스성 열, 류마티스 관절염, 사르코이드종, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 척추관절병증, 갑상샘염, 및 혈관염 중 어느 것인 제19항의 방법, 제21항의 키트, 제25항의 핵산 또는 제제, 제26항의 핵산 또는 제제의 용도, 제25항, 제27항, 제29항, 제31항, 제33항, 제35항, 제37항 및 제39항 중 어느 하나의 항의 조성물, 제26항, 제28항, 제30항, 제32항, 제34항, 제36항 및 제38항 중 어느 하나의 항의 조성물의 용도, 제25항, 제27항, 제29항, 제31항, 제33항, 제35항, 제37항 및 제39항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 제26항, 제28항, 제30항, 제32항, 제34항, 제36항 및 제38항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드의 용도.
  40. 제25항의 핵산 또는 제제, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드, 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 조성물, 및 적합한 약학적 비히클을 포함하는 조성물.
  41. 하기 단계를 포함하는 종양 괴사 인자-알파의 기능장애를 특징으로 하는 질환을 진단하는 방법:
    (a) 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드와 샘플을 접촉시키는 단계,
    (b) 상기 폴리펩티드의 상기 샘플에의 결합을 검출하는 단계, 및
    (c) 단계 (b)에서 검출된 결합을 표준과 비교하며, 이때 상기 샘플에 비하여 결합의 차이는 종양 괴사 인자-알파의 기능장애를 특징으로 하는 질환의 진단인 단계.
  42. 제38항의 방법을 이용하여 제39항에 개시된 질환을 스크리닝하기 위한 키트.
  43. 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 분리된 항-TNF-알파 폴리펩티드를 포함하는 제39항에 개시된 질환을 스크리닝하기 위한 키트.
  44. 종양 괴사 인자-알파의 정제를 위한 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드의 용도.
  45. 종양 괴사 인자-알파와 하나 이상의 종양 괴사 인자-알파 수용체간의 상호작용을 억제하기 위한 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드의 용도.
  46. 하기 단계를 포함하는 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드를 생산하는 방법:
    (a) 종양 괴사 인자 알파에 대한 카멜리대 VHH를 암호하는 이중쇄 DNA를 얻는 단계, 및
    (b) 단계 (a)에서 선택된 DNA를 클로닝하고 발현시키는 단계.
  47. 하기 단계를 포함하는 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드를 생산하는 방법:
    (a) 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서, 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드를 암호할 수 있는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    (b) 상기 배양으로부터 생산된 폴리펩티드를 회수하는 단계.
  48. 제47항에 있어서, 상기 숙주 세포가 박테리아 또는 효모인 방법.
  49. 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항-TNF-알파 폴리펩티드를 포함하는, 염증, 류마티스 관절염, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군 또는 다발성 경화증 중 어느 것을 스크리닝하기 위한 키트.
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