KR20050042791A - 포도상구균 장독소 ｂ의 ｔ-세포 에피토프 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 면역 반응을 불러일으킬 수 있는 포도상구균 장독소 B (SEB)의 결정 인자를 동종한다. 특히, 본 발명은 SEB 내의 T-세포 에피토프를 동종하는 것과 관계있다. 본 발명은 또한 감소된 면역원성을 지닌 개질된 SEB 변이체를 제조할 수 있는 방법에 의한, SEB 로부터 유래된 T-세포 에피토프 펩티드에 관한 것이다.

Description

포도상구균 장독소 Ｂ의 Ｔ-세포 에피토프{Ｔ-CELL EPITOPES IN STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN Ｂ}

본 발명은 면역학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 면역 반응을 일으킬 수 있는 포도상구균 장독소 B (SEB) 의 결정인자를 동정(identify)한다. 특히 본 발명은 SEB 의 T-세포에 대한 에피토프를 동정하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역원성이 감소된 변형된 SEB 변이체를 만들어내는 것이 가능한 방법으로 SEB 에서 유래된 T-세포 에피토프 펩티드에 관한 것이다.

치료용 단백질에 대한 원치 않은 면역 반응으로 인해 치료용 단백질의 효능이 제한되는 경우가 많이 있다. 몇몇 마우스 단일클론 항체는 여러 가지 인간 질병에 대한 치료법으로서 가능성을 보여주었으나, 몇 가지 경우에서 심각한 정도의 인간 항-생쥐 항체 (HAMA) 반응을 유발함으로 인해 실패하였다 [Schroff, R. W. 등 (1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D. L. 등 (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535]. 단일클론 항체에 대하여, HAMA 반응을 감소시키기 위해 여러 가지 기술이 개발되었다 [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. 이러한 재조합 DNA 연구는 통상적으로 최종 구성체 (construct) 에 인간 유전 정보는 증가시키면서 최종 항체 구성체에 마우스 유전 정보는 감소시켜 왔다. 그럼에도 불구하고, 생성된 "인간화된" 항체는, 몇 가지 경우에서, 여전히 환자에게서 면역 반응을 유도하였다 [Issacs J. D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449,456 ; Rebello, P.R. 등 (1999) Transplantation 68: 1417-1420].

항체만이 치료제로서 투입되어, 면역 반응을 개시시킬 수 있는 유일한 폴리펩티드 분자 군은 아니다. 인간 유래의 단백질 및 인간에게서 발생하는 것과 동일한 아미노산 서열 조차도 인간에게서 면역 반응을 일으킨다. 다른 것 중에서 주목할 만한 예로는, 과립구-대식세포 콜로니 자극인자 [Wadhwa, M. 등 (1999) Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361] 및 인터페론 알파 2 [Russo, D. 등 (1996) Bri. J. Haem. 94: 300-305; Stein, R. 등 (1988) New Engl. J. Med. 318: 1409-1413] 의 치료적 사용이 포함된다. 이러한 인간 단백질이 면역 발생원인 상황하에서, 그렇지 않았다면 대상자에 작용하였을, 상기 단백질에 대한 면역학적 내성이 파괴된다고 추정된다.

치료용 단백질에 대한 지속적인 항체 반응에는 T-보조 세포(T-helper cell)의 증식 및 활성화에 대한 자극이 필요하다. T-세포 자극에는 T-세포와 항원제시 세포 (APC) 간의 T-세포 시냅스의 형성이 필요하다. 시냅스의 핵심에서 T-세포 상의 T-세포 수용체 (TCR) 가 APC 표면 위의 펩티드 MHC 클래스 Ⅱ 복합체와 결합한다. 상기 펩티드는 항원성 단백질의 세포내 가공에서 유래된다. MHC class Ⅱ 분자상에 제시함으로써 T-세포의 활성을 자극할 수 있는 단백질 항원의 펩티드 서열을 "T-세포 에피토프" 라고 부른다. 이러한 T-세포 에피토프는 통상 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 임의의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. 암묵적으로는, "T-세포 에피토프" 는 MHC 분자에 결합시 TCR 에 의하여 인식될 수 있고, 적어도 원칙적으로는 TCR 을 이용하여 이들 T-세포의 활성화를 유발하여 T-세포 반응을 촉진할 수 있는 에피토프를 의미한다. 많은 단백질에 있어서, 소수의 T-보조 세포 에피토프가 T-보조 신호를 작동시켜서 치료용 단백질 상의 노출된 표면 결정 인자의 매우 거대한 레파토리 (repertoire) 일 수 있는 부분에 대하여 지속적이고, 친화력이 강하며, 클래스-전환된 항체 반응을 일으키게 할 수 있다고 이해되고 있다.

T-세포 에피토프 동정 작업은 에피토프 제거의 첫 번째 단계로 인식되며, 치료용 단백질의 T-세포 에피토프를 동정해내는 것이 매우 필요하다. 특허 출원 W0 98/52976 및 WO 00/34317 은 인간 MHC 클래스 II DR 동종이형의 하위 집합(sub-sets)에 결합할 가능성을 가진 폴리펩티드 서열을 동정하는 전산 쓰레딩 접근법 (computational threading approach) 을 제시한다. 그 내용에서, 관심 단백질 내에서 적절한 아미노산 치환을 사용하여 예상되는 T-세포 에피토프를 제거한다. 그러나, 이 방법 및 기타의 전산 기초의 에피토프 동정 실험 절차[Godkin, A. J. 등 (1998) J. Immunol. 161: 850-858; Sturniolo, T. 등 (1999) Nat. Biotechnol. 17:555-561] 를 이용하여 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있을 것으로 예측된 펩티드들은, 모든 상황에서 T-세포 에피토프로 기능하는 것은 아닐 수 있는데, 특히, 생체 내에서는 가공 경로 또는 기타 현상으로 인해 그러할 수 있다. 덧붙여, T-세포 에피토프 예측에 대한 전산적 접근법은 일반적으로 DP 또는 DQ 제한을 가진 에피토프를 예측할 수 없었다.

마찬가지로, 예를 들어 MHC 클래스 II 결합 표면의 원천으로서 B-세포주(cell line)의 정의된 MHC 동종이형을 사용하여 합성 펩티드의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 능력을 측정하는 시험관내 (in vitro) 방법을 [Marshall K. W. 등 (1994) J. Immunol. 152:4946-4956; O'Sullivan 등 (1990) J. Immunol. 145:1799-1808; Robadey C. 등 (1997) J. Immunol 159:3238-3246], MHC 클래스 II 리간드 동정에 적용할 수 있다. 그러나, 이러한 기법은 매우 다양한 MHC 동종이형에 대한 잠재적 다수의 에피토프를 스크리닝하는 데에는 적합화되지 않거나, 또는 이들은 결합 펩티드들이 T-세포 에피토프로 기능하는 능력을 확인할 수 없다.

최근, 재조합 MHC 분자를 합성 펩티드와 결합시킨 가용성 복합체를 이용하는 기법이 사용화 되었다[Kern, F. 등 (1998) Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W. W. 등 (2001) TRENDS in Immunol. 22:583-588]. 이들 시약 및 실험절차는 인간 또는 실험 동물 피험체의 말초혈액 시료에서 특정 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 T-세포 클론의 존재 여부를 밝히는데 이용되나, 매우 다양한 MHC 동종이형에 대한 다수의 잠재적 에피토프를 스크리닝하는 데에는 적합화되어 있지 않다.

T-세포 활성화에 대한 생물학적 검정은 시험 펩티드/단백질 서열이 면역반응을 일으킬 수 있는 능력에 대한 판단을 제공하는 가장 실용적인 선택 사항으로 남아있다. 이러한 종류의 접근법의 예로서, 세균 단백질 스타필로키나제(staphylokinase) 에 대한 T-세포 증식 검정 및 그 후 T-세포주를 자극하는 합성 펩티드를 사용한 에피토프 매핑을 사용하는 Petra 등의 연구가 있다[Petra, A. M. 등 (2002) J. Immunol. 168:155-161]. 유사하게, 테타누스 (tetanus) 독소 단백질의 합성 펩티드를 사용하는 T-세포 증식 검정의 결과로서 상기 독소의 면역지배적 (immunodominant) 에피토프가 밝혀졌다 [Reece J. C. 등 (1993) J. linmunol. 151:6175-6184]. W0 99/53038 에는, 분리된 인간 면역 세포의 하위 집합을 이용하여 이들의 시험관내 분화를 촉진시키고, 관심 합성 펩티드의 존재하에서 상기 세포를 배양하고, 상기 배양된 T-세포 내에서 유도된 증식을 측정하여, 시험 단백질 내의 T-세포 에피토프를 결정하는 접근법이 개시되어 있다. 동일한 기법이 또한 Stickler 등에 의해 기술되었는데 [Stickler, M. M. 등 (2000) J. Immunotherapy 23:654-660], 여기서는, 두 경우 모두에 있어서, 상기 방법이 세균 서브틸리신 (subtilisin) 내의 T-세포 에피토프 검출에 적용된다. 상기와 같은 기법은, 원하는 면역 세포 하위 집합 (수상세포, CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포) 을 수득하기 위하여 세포 분리 기법 및 복합적인 시토카인 보충물에 의한 세포 배양에 있어서 조심스런 적용을 필요로 한다.

상기한 바와 같이, 그리고 그의 결과로서, 원칙적으로는 치료적으로 유용하나, 본래적으로 면역원성인, 주어진 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 T-세포 에피토프를 동정 및 제거하거나 최소한 감소시키는 것이 바람직하다. 상기 잠재적으로 치료적으로 유용한 분자 중 하나가 포도상구균 장독소 B (SEB) 이다.

SEB 는 황색 포도상구균에 의해 생성된 장독소들 중 하나이다. 다른 장독소에는, 혈청학적으로 상이한 단백질로서, A, C₁, C₂, C₃, D, E 및 F 로 명시된 것들이 포함된다. 이들 단백질은 포도상구균 식중독의 원인균으로서 인식되고 있다. 상기 단백질 종류에 대한 치료적 관심들 중 하나는 "초항원", 즉 인간 T-세포의 활성을 자극할 수 있는 분자로서 기능하는 능력에서 유래한다. 이의 치료적 잠재력은 몇 번의 암에 대한 임상 시험에서 테스트되었는 바, 그 목적은 T-세포 활성을 강화하여 종양 세포의 성장을 면역 매개 방식으로 억제하는 것이었다. 몇 가지 경우에서, 상기 독소 분자는 항체와 결합하여 세포 특이성 표적화 (cell specific targeting) 를 제공하였다 [Dohlstein, M 등 (1994) PNAS USA 91: 8945-8949; Giantonio, B. J. 등 (1997) J. Clin. Oncol. 15: 1994-2007; Hansson, J. 등 (1997) PNAS USA 94: 2489-2494; Alpaugh, K. R. 등 (1998) Clin. Cancer Res. 4: 1903-1914].

본 발명은 주로 장독소 B 에 관한 것이다. SEB 의 성숙한 아미노산 서열은 237 개의 아미노산 잔기를 함유하고, 하기의 서열을 포함하는 단일 문자 코드로 나타낸다:

"초항원"으로서 포도상구균의 장독소는, 식물 적혈구 응집소와 같은 종래의 T 세포 미토겐 (mitogen) 보다 10³ 낮은 농도에서 강한 다클론 (polyclonal) 증식을 유도한다고 알려진 가장 강력한 T 세포 미토겐이다. 모두 대부분의 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 자극한다. 이들의 T-세포 자극 능력은 MHC 클래스 Ⅱ 항원에 의해 엄격하게 제한된다. 포도상구균 장독소 및 기타 초항원 독소는 T 세포 수용체 및 MHC 클래스 Ⅱ 에 직접 결합하는 것으로 이해된다. 상기 두 구조체는 서로 접촉하여, T 세포 수용체의 Va 부위를 통해 강한 동종반응(alloreactive response)을 모방함으로써 T 세포의 활성을 자극한다. MHC 단백질에 결합하는 가장 통상적인 항원성 펩티드의 인식에는 T 세포 수용체의 모든 가변 성분이 기여한다. 반대로, 상기 독소는 거의 독점적으로 T 세포 수용체의 Va 부위를 통해 T 세포를 자극한다. 상기 독소를, MHC 클래스 Ⅱ 와 Va 의 측면을 끌어당겨, 대개는 T 세포/APC 시냅스의 형성중에 서로 접촉하는 T 세포 수용체와 MHC 의 표면을 가깝게 접근시키는 일종의 집게로서 생각할 수 있다.

초항원 분자의 상기 및 기타 특유한 특성이, 암 치료를 포함한 몇가지 서로 다른 실험적 치료 기법에 있어서 이들의 사용을 고무시켰다. SEB 독소의 경우, 일련의 미국 특허; US,6,180,097; US,5,728,388; US,6,338,845; US,6,221,351; US,6,126,945 및 이의 대응 특허 W093/24136; W098/26747; EP1103268 및 EP0511306 (모두 Terman 과 동료의 발명) 은 SEB 유전자, 카르복시메틸화 SEB 단백질 및 SEB-항원 접합체를 포함하는 SEB 단백질 및 융합 (fusion) 단백질의 용도에 관한 기술을 총망라하여 상세히 기재하고 있다. 모두 암세포 파괴 효과의 유도 및 암 치료를 목적으로 하는 방법 및 또는 조성물에 관한 것이다.

따라서, 예컨대 EP0511306 은 본질적으로 초항원과 동일한 생물학적 활성을 지닌 SEB, SEB 유사체 (homologue) 및 SEB 단편을 포함하는 장독소 분자 및 단일클론 항체와의 SEB 접합체의 용도를 청구한다.

상기 분자와 접합체는 암 치료용으로 제공되며, 상기한 바와 같이 효과적일 수 있다. 그러나 인간 면역계에 대한 SEB (및 가능한 임의의 연합된 항체 성분) 의 외래성으로 인해, 임의의 첫 번째 투여량의 효과를 제한하지 못하거나, 그 효과를 제한하긴 하나 이후의 투여량에 대하여 심각한 해로운 부작용을 일으킬 수 있는 면역 반응을 불러일으킬 상당한 가능성이 있다. 상기 청구된 약제는 오직 암환자를 대상으로 한다. 그러한 환자의 대다수가 이전의 치료법의 결과로서 또는 질병으로 인한 직접적인 결과로서 면역계가 억제될 수 있고, 따라서 SEB 를 기초로 한 치료에 따른 면역원성 결과는 줄어들 수 있다. 그러나, 그러한 제한이 SEB 를 기초로 한 치료가 도움이 될 수 있는 다른 환자에게는 나타나지 않을 수도 있다. 본 발명의 목적은 우선 SEB 분자의 면역원성 부위를 규명하여, 해로운 면역원성 반응을 유발할 가능성이 감소된 SEB 기재 조성물을 제공하는 것이다. 상기 조성물은 지금보다 더욱 다양한, 암이 아닌 질환을 포함한 임상 증세에 적용할 수 있을 것이다.

반대로, US,6,528,051 은 SEB 를 항원으로 이용하여 특정하고 방어적인 면역반응을 개시하도록 하는 방법을 시도한다. SEB 를 콜로이드성 금 복합체로 투여한다.

유사하게, 미국 특허출원 20010046501A1 은 감염성 질병 증세에 대한 치료적 또는 예방적 치료 방법에 있어서 혼합 SEA/SEB 조성물의 용도를 제시한다. 상기 접근법은 나이브 (naive: 비-활성화된) T-세포 집단을 소모함으로써 항원에 대한 특정 면역 반응을 강화시킬 수 있는 조성물 및 치료 계획을 제공한다.

더욱 최근에, 미국 특허출원 20030009015A1 은 초항원의 특질은 사라졌으나 그 구조는 충분히 남아 있어서 면역계에 의해 인지되어 방어적 예방 접종 효과를 나타내는 초항원 백신 제조물을 제공한다. MHC 클래스 Ⅱ 결합 부위 또는 TCR 결합 부위에 치환체를 함유한 SEB 분자를 기재하고 있으며, 소기의 성과를 내기에 충분한 것으로 생각된다. 상기 치환체로 고려된 것에는, 단일 문자 코드를 이용하여, 61A, 67Q, 89A, 94A 및 115A 가 포함된다.

일반적으로, SEA 를 이용한 병행 요법이 채택되었으나, 예컨대 미국 특허출원 20030039655A1 은 SEA 일부가, 표면에 노출되는 잔기에 아미노산 치환체를 함유하여 혈청-반응성을 감소시키는 효과를 지닌 SEA-항원 접합체를 시도한다. 본 경우와는 다르게, 상기 출원은 숙주 항체와 결합할 수 있는 SEA 분자의 표면 결정인자에 관한 것이며, SEB 의 T-세포 에피토프에 관한 것이 아니다.

상기한 것으로부터, 다른 기술들이 개질된 SEB 분자를 포함한 SEB 분자를 제공하였으나, 상기 기술은 상기 단백질의 면역원성 특성에 대한 T 세포 에피토프의 중요성을 다루고 있지 않으며, 본 발명의 방법에 따른 구체적이고 제어된 방식으로 상기 특성의 직접적인 영향을 제시하지도 않았다는 점을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 특정한 목적은 잠재적인 T-세포 에피토프의 수가 감소됨으로써 면역 특성이 변형된, 개질된 SEB 단백질을 제공하는 것이다. 상기 면역 특성은 MHC-TCR 교차결합에 의해 T-세포의 활성을 유도하는 작용을 하는 전체 단백질 분자의 기능적 능력과는 별개이다. 오히려 본 발명의 목적은 초항원 활성을 보유하되, 치료적으로 투여된 SEB 에 대한 중화 (neutralizing) 면역 반응, 특히 T-세포 매개의 중화 항체 반응을 유발하는 능력이 감소된 SEB 분자를 제공하는 것이다.

선형 단백질 서열 내의 T-세포 에피토프의 출처 또는 위치는 본 명세서에서 "에피토프 지도" 로 불린다. 본 발명의 목적은 SEB 의 에피토프 지도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 이전에 매핑된 T-세포 에피토프가 MHC 클래스 Ⅱ 리간드로서 기능하는 능력 또는 MHC 클래스 Ⅱ 분자와 결합하여 T-세포를 활성화시키는 능력이 손상된 SEB 유사체를 제공하는 것이다. 인간 대상체에서 면역 반응을 유도하는 잠재력이 축소되거나 사라진 SEB 를 제공하는 것이 매우 바람직하고, 따라서 잠재적인 T-세포 에피토프의 수를 감소시킴으로써 면역 특성이 변형된 개질된 SEB 단백질을 제공하는 것이 특히 본 발명의 목적이다.

요약하면, 본 발명은 하기의 주제에 관한 것이다:

ㆍ나이브 T-세포 검정에서 합성 펩티드 패널 (panel) 을 이용하여, SEB 의 면역원성 부위(들)를 매핑하는 것;

ㆍ20 명 이상의 건강한 공여자에게서 분리한 PBMC 및 하기의 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 이용하여 SEB 단백질의 T-세포 에피토프 지도를 구성하는 것:

i) 2 가지 이상의 농도의 펩티드에서 합성 펩티드 면역원을 이용하여 7 일까지의 기간 동안 배양하여 시험관 내에서 항원 자극시키기; 이 때 생리학적 비율의 T-세포 대 항원 제시 세포를 함유한 PBMC 표본을 사용하는 단계 및 ii) 유도된 증식 지수를 적절한 방법으로 측정하는 단계;

ㆍ나이브 T-세포 검정에서 1.8 초과, 바람직하게는 2.0 초과의 자극 지수를 불러일으킬 수 있는 SEB 유래의 펩티드 서열;

ㆍ나이브 T-세포 검정에서 1.8 초과, 바람직하게는 2.0 초과의 자극 지수를 가진 SEB 유래의 펩티드 서열로서, 상기 펩티드가 최소한의 정도로 개질되고, 나이브 T-세포 검정에서 시험되며, 자극 지수가 2.0 미만인 펩티드;

ㆍ야생형 (wild-type) 단백질 서열과 아미노산이 100 % 상동이며, T-세포 검정에서 1.8 이상, 바람직하게는 2.0 초과의 자극 지수를 불러일으킬 수 있는 SEB 유래의 펩티드 서열;

ㆍ야생형 단백질 서열과 100 % 미만의 동일성을 갖도록 개질되고, T-세포 검정에서 2.0 미만의 자극 지수를 불러일으키는, 그에 상응하게 조건화된 SEB 펩티드 서열;

ㆍ면역원성 부위를 T-세포 검정을 이용하여 매핑한 후, T-세포 검정에서 재시험했을 때, 개질된 단백질이 부모 (비-개질된) 분자에 비해 작은 자극 지수, 가장 바람직하게는 2.0 미만의 자극 지수를 불러일으키도록 개질된 SEB 분자;

ㆍSEB 의 생물학적 활성을 지니며, 생체 내에서 사용될 경우, 실질적으로 비-면역원성이거나 동일한 생물학적 활성을 지닌 임의의 비-개질된 분자에 비해 면역원성이 더 낮은 개질된 분자;

ㆍ본 명세서에 하기의 에피토프 부위 R1, R2 및 R3 으로 정의된 연속된 잔기의 스트링 (string) 에서 하나 이상의 잔기의 변형이 행해지도록 조건화된 분자;

ㆍ본 명세서에 바람직한 에피토프 부위 R1a, R1b, R1c 로 정의된 하기의 서열을 포함하는 연속된 잔기의 스트링에서 하나 이상의 잔기의 변형이 행해지도록 조건화된 분자;

ㆍ본 명세서에 바람직한 에피토프 부위 R2a 로 정의되고 SIKDTKLGNYDNVRV 서열을 포함하는 연속된 잔기의 스트링에서 하나 이상의 잔기의 변형이 행해지도록 조건화된 분자;

ㆍ본 명세서에 바람직한 에피토프 부위 R3a 로 정의되고 DKYVDVFGANYYYQC 서열을 포함하는 연속된 잔기의 스트링에서 하나 이상의 잔기의 변형이 행해지도록 조건화된 분자;

ㆍ임의의 R1a,b,c - R3a 또는 R1 - R3 서열 중에서 13 내지 15 개의 연속된 잔기를 포함하는 펩티드 분자;

ㆍ하기의 표 1 에 나타낸 임의의 서열 중에서 13 내지 15 개의 연속된 잔기를 포함하는 펩티드 분자;

ㆍ하기 식 Ⅰ의 아미노산 서열을 포함하는 개질된 SEB 분자:

식에서,

X⁰ 는 수소 또는 표적화 일부분 (targeting moiety), 예컨대 항원, 항체 도메인 [Fab', F(ab)2', scFv, Fc-도메인], 또는 다른 단백질 또는 폴리펩티드이고;

X¹ = A, G, P 또는 M;

X² = A, G, P, 또는 M;

X³ = T, A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, 또는 Y;

X⁴ = A, 또는 I;

X⁵ = H, 또는 L;

X⁶ = T, A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, 또는 Y;

X⁷ = H, 또는 V;

X⁸ = A, P, G, 또는 V;

X⁹ = T, H, 또는 F;

여기서 동시에 X¹ = M, X² = M, X³ = Y, X⁴ = Y, X⁵ = L, X⁶ = Y, X⁷ = V, X⁸ = V 및 X⁹ = F 인 경우는 제외된다.

ㆍ에피토프 부위 R1 - R3 또는 R1a - R3a 에서 유래된 임의의 펩티드 서열과 80 % 초과의 동일한 아미노산을 공유한 상기 펩티드 분자;

ㆍ본 명세서의 표 1 에 나타낸 펩티드 서열에서 유래된 임의의 펩티드 서열과 80 % 초과의 동일한 아미노산을 공유한 상기 펩티드 분자;

ㆍMHC 클래스 Ⅱ 와 결합할 수 있는 상기한 펩티드 서열;

ㆍMHC 클래스 Ⅱ 와 결합하는 활성을 지닌 임의의 상기 펩티드 또는 개질된 펩티드를 포함하는 약학적 조성물;

ㆍ상기 및 하기에 정의한 바와 같은, 임의의 상기한 개질된 분자를 코딩하는 DNA 서열 또는 분자;

ㆍSEB 의 생물학적 활성을 지닌 개질된 분자를 포함하는 약학적 조성물;

ㆍ상기 및/또는 청구항에 정의한 바와 같은 약학적 조성물로서, 임의로는 약학적으로 허용되는 담체, 희석액 또는 부형제를 포함하는 조성물;

ㆍSEB 의 생물학적 활성을 지닌 개질된 분자를 제조하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 방법:

(i) 폴리펩티드 또는 이의 부분의 아미노산 서열을 결정하는 단계;

(ii) 시험관내 또는 컴퓨터 (in silico) 기법 또는 생물학적 검정법을 이용하여 MHC 분자와 결합하는 펩티드의 결정법을 포함하는 임의의 방법에 의해, 상기 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프를 동정하는 단계;

(iii) 동정한 잠재적인 T-세포 에피토프 내 하나 이상의 아미노산이 변형된 새로운 서열을 설계하는 단계로서, 시험관내 또는 컴퓨터 기술 또는 생물학적 검정법을 이용하여 상기 펩티드를 MHC 분자와 결합시킴으로써 결정된 T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 개질되도록 설계하는 단계;

(iv) 재조합 DNA 기술로 상기 서열 변이체를 구성하고, 목적하는 특성을 지닌 하나 이상의 변이체를 동정하기 위해 상기 변이체를 시험하는 단계; 및

(v) 임의로 (ii) 내지 (iv) 단계를 반복하는 단계;

ㆍ원래 존재하는 T-세포 에피토프 중 임의의 것에서 1 내지 9 개의 아미노산 잔기를 치환, 부가 또는 제거함으로써 (iii) 단계를 수행하도록 조건화된 방법;

ㆍ변형이, 동종성 (homologous) 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 모델링 기법에 관하여 행해지도록 조건화된 방법;

ㆍ상기 T-세포 에피토프 펩티드 중에서 9 개 이상의 연속된 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 서열 및 비-개질된 분자에 비해 면역원성이 실질적으로 없거나 적으며, 생체내에서 사용될 경우 SEB 의 생물학적 활성을 지닌 SEB 의 제조를 위한 그의 용도;

ㆍ나이브 T-세포 활성 검정법 및 펩티드 리간드와 하나 이상의 MHC 동종이형의 결합을 자극하는 전산 계획을 이용하여 SEB 내의 T-세포 에피토프의 위치를 매핑하는 방법;

ㆍ하기의 단계를 포함하는, SEB 내에서 T-세포 에피토프의 위치를 정하는 방법:

i) 나이브 T-세포 활성화 검정 및 집단적으로 관심 단백질 서열을 모두 포함하는 합성 펩티드들을 이용하여 T-세포를 활성화할 수 있는 에피토프 부위를 동정하는 단계;

ii) 상기 펩티드 리간드와 하나 이상의 MHC 동종이형의 결합을 모의 실험하는 전산적 계획을 이용하여 i) 단계에서 동정된 에피토프 부위를 분석하고, 이로써 상기 에피토프 부위 내의 MHC 클래스 II 리간드를 동정하는 단계;

iii) 상기 펩티드 리간드와 하나 이상의 MHC 동종이형의 결합을 모의 실험하는 전산적 계획을 이용하여 더 이상 MHC 클래스 II 에 결합하지 않거나 또는 더 적은 수의 MHC 동종이형에 대하여 더 낮은 친화성을 가지고 결합하는, 상기 에피토프 부위(들) 내에 포함된 MHC 리간드의 서열 유사체들을 동정하는 단계;

iv) 나이브 T-세포 활성화 검정 및 관심 단백질 내에서 동정된 에피토프 부위를 하나로서 또는 집합적으로서 모두 포함하는 합성 펩티드들을 이용하여 나이브 T-세포 활성화 검정으로 상기 야생형 (부모) 서열과 병행하여 서열 유사체들을 검사하는 단계;

ㆍ상기 방법에 있어서, (ii) 및 (iii) 단계를 WO 02/069232 에서 개시한 전산적 접근법을 사용하여 수행하는 방법;

ㆍ상기 방법에 있어서, (iv) 단계를 임의적으로 수행하는 방법;

ㆍ상기 방법에 있어서, 나이브 T-세포 활성화 검정을, 20 명 이상의 서로 연관되지 않은 공여자로부터 유래된 PBMC 세포를 이용하여 수행하는 방법;

ㆍ상기 방법에 있어서, 둘 이상의 독립된 공여자 샘플에서 약 2.0 의 자극 지수가 관찰된 경우에 T-세포 에피토프의 위치를 동정하는 방법;

ㆍ상기 방법에 있어서, 둘 이상의 독립된 공여자 샘플에서 약 2.0 의 자극 지수가 관찰된 경우에 T-세포 에피토프의 위치를 동정하는 방법;

ㆍ상기 방법에 있어서, 둘 이상의 독립된 공여자 샘플에서 약 2.0 의 자극 지수가 관찰된 경우에 T-세포 에피토프의 위치를 동정하며, 전산 시스템을 이용하여 상기 동일한 서열 위치에서 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅱ 리간드를 동정할 수 있는 방법;

ㆍ상기 방법에 있어서, 상기 전산 시스템이 WO 02/069232 에 의하여 개시된 방법에 따르는 방법;

도 1 은 에피토프 부위 R1a 내에서 동정된 MHC 클래스 Ⅱ 리간드를 나타낸다. 리간드는 실시예 2 의 컴퓨터 시스템을 이용하여 동정하였다. 여기서, 18 개의 인간 DR 동종이형의 결합 프로필을 막대로서 나타낸다. 검출된 리간드는 13-머이고, 각 13-머의 1 번 잔기는 채색된 블록으로 표시한다. 각각의 18 개의 동종이형에 대한 각 펩티드의 결합의 강도 (고, 중 또는 저) 는 표시된 범례에 따라 표시된다.

도 2 는 에피토프 부위 R2 내에서 동정된 MHC 클래스 Ⅱ 리간드를 나타낸다.

리간드는 실시예 2 의 컴퓨터 시스템을 이용하여 동정하였다. 여기서, 18 개의 인간 DR 동종이형의 결합 프로필을 막대로서 나타낸다. 검출된 리간드는 13-머이고, 각 13-머의 1 번 잔기는 채색된 블록으로 표시한다. 각각의 18 개의 동종이형에 대한 각 펩티드의 결합의 강도 (고, 중 또는 저) 는 표시된 범례에 따라 표시된다.

도 3 은 에피토프 부위 R3 내에서 동정된 MHC 클래스 Ⅱ 리간드를 나타낸다.

리간드는 실시예 2 의 컴퓨터 시스템을 이용하여 동정하였다. 여기서, 18 개의 인간 DR 동종이형의 결합 프로필을 막대로서 나타낸다. 검출된 리간드는 13-머이고, 각 13-머의 1 번 잔기는 채색된 블록으로 표시한다. 각각의 18 개의 동종이형에 대한 각 펩티드의 결합의 강도 (고, 중 또는 저) 는 표시된 범례에 따라 표시된다.

식 Ⅰ(상기 참조)은, MHC 클래스 Ⅱ 리간드가 각각 에피토프 부위 R1a, R2a 및 R3a, 및 R1a, R1b, R1c, R2a 및 R3a 내에서 치환에 의해 제거된 가장 바람직한 SEB 구조를 나타낸다.

본 발명의 첫 번째 구현예에 따라, SEB 의 T-세포 에피토프 지도가 제공된다. SEB 의 에피토프 지도는, 아미노산 치환이 특정 위치에서 특정한 잔기에 대해 수행됨으로써 상기 단백질로부터 하나 이상의 잠재적 T-세포 에피토프를 제거하거나 그 활성을 실질적으로 감소시키도록 SEB 유사체를 설계할 수 있게 하는데 사용된다. 본 발명은 부모 분자의 가장 면역원성인 부위 내에 적절한 치환의 예를 제공하며, 그러한 치환은 본 발명의 구현예로 간주된다.

공동 출원 WO 02/069232 은 치료적 관심의 대상이 되는 다수의 단백질의 MHC 클래스 Ⅱ 리간드를 정의하기 위해 컴퓨터 기술을 사용하였다. 그러나, 생체내에서 면역원성 펩티드가 제시되게 하는 단백질 가수분해 처리과정 및 다른 생리학적 단계가 요구된다는 것과 같은 이유로 인해, 전산을 기초로 한 방법에 의해 규명할 수 있는 전체 펩티드 레파토리 중 비교적 소수의 하위 집합이 궁극적인 생물학적 관련성을 가진다는 것이 명백하다. 본 발명자들은, 생체 외 (ex vivo) 인간 T-세포 활성화 검정을 사용하여, T-세포 활성을 지원할 수 있고, 그로써 상기 단백질의 면역원성 문제에 가장 생물학적으로 연관된 SEB 의 단백질 서열 내의 부위를 동정할 수 있다는 사실을 입증하였다. 여기에 개시된 SEB 의 에피토프 지도는 상기 접근법의 적용에 의해 유도되었고, 개시한 바와 같은 방법 또한 본 발명의 구현예의 하나이다.

상기 방법에 따라, 합성 펩티드의, 시험관 내에서 배양된 인간 T-세포에서 증식적 반응을 일으키는 능력을 시험한다. T-세포는, 공지된 방법에 의해 전체 혈액 샘플에서 쉽게 수득할 수 있는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 내에 존재한다. 또한, PBMC 표본은 T-세포와 항원 제시 세포를 생리학적 비로 함유하므로, 시험관 내에서 면역 반응을 대신 수행하기에 우수한 재료 공급원이다. 본 발명자들은 상기 검정법을 수행하는 데 있어서, 2.0 에 근접하거나 이를 초과하는 자극 지수가 유도된 증식성을 측정하기에 유용한 지표라는 점을 확인하였다. 자극 지수 (SI) 는 통상적으로 시험 펩티드에 대해 측정된 증식 수치 (예컨대 ³H-티미딘 혼입을 이용하는 경우, 예를 들어 1 분당 방사능 계수) 를 시험 펩티드와 접촉하지 않은 세포에서 측정된 수치로 나눔으로써 유도된다. 반응을 전혀 일으키지 않는 펩티드는 SI = 1.0 이나, 실제로 0.8 내지 1.2 범위의 SI 지수는 놀랄만한 수치가 아니다. 기록된 수치에 대한 신뢰를 보장하기 위해, 몇 가지 기술적 절차를 상기 검정법에 포함시킬 수 있다. 전형적으로는 모든 측정을 적어도 삼중으로 하며, 평균 수치를 계산할 수 있다. 계산된 SI => 2.0 인 경우, 중심에서 벗어난 데이타가 있는지 확인하기 위하여 상기 세 번의 개별 수치를 조사할 수 있다. 시험 펩티드는 두 가지 이상의 상이한 농도의 세포와 접촉하며, 상기 농도는 보통 최소한 두 배의 농도차에 걸쳐진다. 그러한 농도 범위는 상기 검정의 키네틱 차원 (kinetic dimension) 에 대한 상쇄 (off-set) 를 제공하며, 단일 시점의 측정, 예를 들어 실험 개시후 7 일째의 측정을 수행할 경우 특히 중요하다. 일부 검정에서 다중 시간 경로 측정을 수행할 수 있으나, 이 경우에도 최소한 두 가지 상이한 농도로 제공된 펩티드 면역원을 이용하여 행해진다.

유사하게, PBMC 공여자 샘플의 대다수가 반응을 보일 것으로 예상되는 대조군 펩티드 함유물을 각 검정 플레이트에 포함시킬 수 있다. 다수의 다른 예를 이용할 수 있으나, 서열이 PKYVKQNTLKLA 인 인플루엔자 적혈구응집소 펩티드 307-309; 및 서열이 KVVDQIKKISKPVQH 인 클라미디아 (Chlamydia) HSP 60 펩티드가 특히 적당한 대조군 펩티드이다. 또한 검정에는 바람직하게는, 그에 대하여 모든 PBMC 샘플이 2.0 을 현저히 초과하는 SI 를 나타낼 것으로 예상되는 키홀 림펫 (Keyhole Limpet) 으로부터의 헤모시아닌 (hemocyanin) 등의 유력한 완전한 단백질을 사용한다.

광범위한 범위의 가능한 MHC 동종이형과 관계된 SEB 에피토프의 지도를 제공하는 것이 특히 요구된다. 상기 단백질을 투여받을 가능성이 있는 대다수의 환자를 위해 T-세포에 의해 가동되는 면역 반응을 일으키는 상기 단백질의 기능이 제거되거나 또는 최소한 개선된, 개질된 단백질을 설계 또는 선택하기 위해, 상기 지도가 충분히 대표적일 것이 요구된다. 따라서, 스크리닝 방법의 실행에 있어서, 나이브 공여자로부터의 PBMC 유도 T-세포를, 인간 집단내에 남아있는 MHC 클래스 II 레파토리 (HLA-DR) 가 90 % 를 초과하는 샘플을 제공하기에 충분이 면역학적 다양성을 가진 공여자 풀로부터 수집한다. 주어진 합성 펩티드에 대하여 나이브 T-세포 반응이 검출되는 곳에서, 상기 펩티드는 실제로는 분리된 다수의 공여자로부터 유래한 PBMC 표본과 접촉할 것이고, 상기 공여자 수 (또는 "공여자 풀" 의 크기) 는 실제적인 목적상 서로 관련되지 않은 20 명 이상의 개인일 것이고, 공여자 풀의 모든 샘플은 MHC 클래스 II 하플로타입 (haplotype) 에 따라 미리 선택될 것이다.

본 발명의 맥락에서 상기 "나이브 공여자" 라는 용어는, 치료적 원천으로서 어떠한 SEB 도 받은 적이 없는 개인으로부터 수득한 T-세포를 의미하나, 상기 집단 내의 다수의 개인들이 이전에 환경적 원천으로서 외래성 SEB 및 SEB 유사 단백질에 노출된 경험이 있을 것이라는 점이 인정된다. 그러한 개인들의 경우, 본 발명의 검정에서 특히 높은 SI 수치를 특징으로 하는 기억형 반응 (recall type response) 의 가능성이 있다. 이는 일부 개인에게서 실제로 발견되었으며, 특정한 펩티드가 SI 수치 8.1 을 기록한 한 케이스도 있었다.

여기에서 본 발명은 면역학적 나이브 T-세포를 이용한 T-세포 에피토프 매핑 방법을 개시한다. 상기 T-세포는, 치료적 단백질을 받은 적은 없는 다수의 서로 다른 건강한 공여자들로부터의 말초혈액 샘플로부터 제공된다. 상기 검정은, 당업계에서 통상적인 실험 절차를 사용하여 시험관 내에서 배양된 PBMC 를 사용하여 수행하며, 상기 PBMC 를 관심 단백질을 대표하는 합성 펩티드 종류 (species) 에 접촉시키고, 그 후 적당히 배양한 후 세포 증식 등의 펩티드 유도 T 세포 활성화를 측정하는 단계를 포함한다. 측정은 임의의 적당한 수단으로 하며, 예를 들어, ³H-티미딘 혼입법을 이용하여 수행할 수 있는데, 실험 도구를 사용하여 세포 물질 내로의 ³H의 축적이 용이하게 측정된다. PBMC 샘플 및 합성 펩티드의 각 조합에 있어서 세포 증식의 정도는 펩티드 처리되지 않은 PBMC 샘플에서 관찰되는 것과 비교하여 측정된다. 또한 증식 효과가 예측되는 하나의 펩티드 또는 다수의 펩티드로 처리한 후 관찰되는 증식 반응을 언급할 수 있다. 이 점에 있어서, 공지의 넓은 MHC 제한을 가지는 펩티드 및 특히 DP 또는 DQ 동형에 대한 MHC 제한을 가지는 펩티드 에피토프를 사용하는 것이 특히 유리하다고 생각된다.

SEB 에 대한 에피토프 지도의 조립을 용이하게 하기 위하여, 합성 펩티드 집합을 제조하였다. 각 펩티드는 길이가 아미노산 잔기 15 개였고, 각각 이웃하는 펩티드와 연속물 (series) 내에서 12 개 아미노산 잔기가 겹쳐졌다; 즉, 연속물 내의 각각의 연속된 펩티드는 상기 분석에서 추가적인 3 개의 아미노산이 증분 추가되었다. 이러한 방식으로, 임의의 주어진 인접 펩티드 쌍은 연속된 서열의 18 개 아미노산으로 매핑되었다. SEB 의 경우, 전체 성숙 단백질에 대한 스캐닝을 가능케하기 위해 총 77 개의 펩티드가 필요하였다. 그러나 전체 단백질의 서열 길이로 인해, C-말단에 대한 유용한 스캐닝을 보장하기 위하여, 사용된 최종 2 개의 펩티드는 14 머 와 11 머였다. 나이브 T-세포 검정법을 이용한 SEB 용 T-세포 지도를 규명하는 특히 효과적인 방법을 실시예 1 에 제공한다.

본 연구로 2 이상의 개별 공여자 샘플에서 중요한 증식 반응을 일으킬 수 있는 5 개의 펩티드 서열을 발견하였다. 상기 펩티드를 표 1 에 나열하고 있으며, 이는 본 발명의 구현예이다.

표 1 에 기재된 각각의 펩티드는 MHC 클래스 Ⅱ 와 결합하고 하나 이상의 동일 기원의 TCR 과 충분한 친화력으로 결합하여, 검정 시스템에서 검출할 수 있는 증식 급증을 일으킬 수 있는 것으로 추측된다. 2 또는 일부의 경우 3 개의 관련성 없는 PBMC 샘플로부터 유래된 PBMC 를 이용하여 이러한 기준(criteria)을 얻었다. 상기 펩티드는 상기 분자의 주요한 에피토프 부위 및 본 명세서에서 에피토프 부위 R1, R2 및 R3, 또는 각각 R1, R2 및 R3 스트링의 하위 스트링인 R1a,b,c, R2a 및 R3a 로 지칭하는 SEB 서열 내의 세 개 구역의 클러스터를 포함하는 것으로 생각된다.

둘 이상의 공여자 샘플에서 생체 외 인간 T-세포를 자극할 수 있는 SEB 펩티드 서열

에피토프 부위 R1a 는 KFTGLMENMKVLYDDNHVSAI 서열을 포함하는 P6, P7 및 P8 펩티드에 의해 둘러싸여 있다. R1a 에피토프에 있어서, 펩티드 P6 및 P8 은 각각 두 개의 공여자 샘플과 반응성이 있는 반면, 간섭 펩티드 P7 은 공여자 중 한 명에 대하여서만 반응성이 있다. 이 경우 P7 반응은 특히 높은 SI 수치 (8.1) 를 나타내며, 반응 샘플 또한 P6 및 P8 에 대하여 반응성이 있다. 서열 내의 각 연속되는 펩티드의 위상이 일치 (phasing) 되므로, 2 또는 3 개의 인접 펩티드 사이에 동일한 핵심 노나머 (nonamer) 를 공유하는 것 (즉, 공통됨) 이 가능하다. 정확한 일치성은 N-말단에의 근접성 및 펩티드의 길이 및 각 서열의 연속적인 증가에 의해 식별된 "새로운" 잔기 수에 따라 다르다. R1a 에피토프의 경우, 몇 가지 오버래핑된 MHC 클래스 Ⅱ 리간드를 동종할 수 있다 (도 1 참조).

에피토프 부위 R2 는 SIKDTKLGNYDNVRV 서열을 포함하는 펩티드 P18 에 의해 둘러싸여 있다.

에피토프 부위 R3 은 DKYVDVFGANYYYQC 서열을 포함하는 펩티드 P27 에 의해 둘러싸여 있다.

SEB 서열 내의 추가적인 펩티드 서열이 T-세포 에피토프로서 기능할 수도 있으며, 그러한 서열을 시험관 내의 물리적 결합 분석 또는 가상의 수단, 예컨대 컴퓨터 기술을 이용하여 MHC 리간드로서 검출할 수 있다고 알려졌다. 덧붙여, 본 명세서에 제시된 생물학적 검정으로 특히 공여자 샘플에서 추가적인 반응성 펩티드를 검출할 수 있으며, 그러한 샘플은, 예컨대 주위 환경에서 SEB 에 또는 SEB 의 서열과 동일한 또는 최소한 매우 유사한 펩티드 서열을 함유한 임의의 독소 또는 비독소 단백질에 최근에 노출된 개인에게서 유래된 것일 수 있다. 그럼에도, 본 명세서에 개시된 R1a, R2a, R3a 서열은, 하나 이상의 상기 에피토프가 손상된 개질된 SEB 분자의 설계를 위해 요구되는 중요한 정보를 나타내는 것으로 간주된다.

본 방법 하에서, 상기 에피토프를 돌연변이에 의해 손상시켜서 더이상 T-세포 에피토프로 기능하지 못하는 서열이 되게 한다. 목표 서열의 직접적인 돌연변이 유발을 달성하기 위해 재조합 DNA 기법을 사용하는 것이 가능하며, 많은 그러한 기법을 사용할 수 있고 당업계에 공지되어 있다.

표 1 에 나열된 하나 이상의 상기 펩티드의 아미노산 서열을 변형시키는 것이 본 발명의 목적이다. 본 명세서에 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅱ 동종이형에 대한 리간드인 수준에서, T-세포 에피토프로서 기능하는 대상 펩티드 서열의 능력을 감소시키거나 제거하는 목적을 달성하기 위한 적절한 변이체를 개시하고 있다. 그러한 한 가지 적절한 변이체 집합을 식 Ⅰ에 제공한다.

상기 두번째 구현예에 따르면, 상기 단백질에 대한 적절한 개질 방법으로서 특정 잔기들 또는 잔기들의 조합에 대한 아미노산 치환이 포함될 수 있다. T-세포 에피토프의 제거를 위하여, 바람직하게는, 상기 T-세포 에피토프의 활성의 실질적인 감소 또는 제거를 이룰 것으로 예측되는 상기 펩티드 서열 내의 적절한 지점에서 아미노산 치환을 한다. 실제에 있어서, 적절한 지점은 바람직하게는 상기 MHC 클래스 II 결합 홈(groove) 내에 제공된 포켓 중 하나 내에서 결합하는 한 아미노산 잔기일 것이다. 상기 홈의 첫번째 포켓 내의 상기 펩티드의 소위 "P1" 또는 "P1 앵커 (anchor)" 위치에서의 결합을 변경시키는 것이 가장 바람직하다. 상기 펩티드의 P1 앵커 잔기와 상기 MHC 클래스 II 결합 홈의 첫번째 포켓 사이의 결합 상호작용의 질은 상기 전체 펩티드에 대한 총체적인 결합 친화력에 대한 주요 결정 인자로 인식된다. 상기 펩티드의 이 위치에서의 적절한 치환은 상기 포켓 내에 용이하게 순응되기 어려운 잔기에 대한 것일 것인데, 예를 들어 좀 더 친수성인 잔기로의 치환일 것이다. 상기 펩티드 내의 상기 MHC 결합 홈 내의 다른 포켓 부위 내에서의 결합에 해당하는 위치에서의 아미노산 잔기 또한 고려되며 본 발명의 영역에 속한다.

주어진 잠재적 T-세포 에피토프 내의 단일 아미노산 치환이 상기 에피토프를 제거할 수 있는 가장 바람직한 경로임이 알려졌다. 단일 에피토프 내의 치환 조합을 고려할 수 있으며, 예를 들어 개별적으로 정의된 에피토프들이 서로 오버랩되어 있는 곳이 특히 적절할 수 있다. 나아가, 주어진 에피토프 내에서 단독인 또는 단일 에피토프 내에서 조합적인 아미노산 치환은, 상기 MHC 클래스 II 결합 홈에 대하여 "포켓 잔기들"에 해당하는 위치에서가 아닌 상기 펩티드 서열 내의 임의의 지점에서 이루어질 수 있다. 치환은 당업계에 공지된 컴퓨터 기술을 이용하여 만들어지는 상동 구조 또는 구조적 방법과 관련하여 이루어질 수 있으며, 상기 분자의 공지된 구조적 특징에 기초하여 이루어질 수 있다. Protein Data Bank 내에 포함된 SEB 결정 구조 모델은 특히 이와 관련하여 유용하다 [PDB ID : 3SEB Papageoriou, A. C. 등 (1998) J. Mol. Biol. 277: 61-79]. 변형 분자의 구조 또는 생물학적 활성을 회복시키기 위한 변화를 모색할 수 있다. 그러한 보충적 변화도 또한 상기 폴리펩티드의 특정 아미노산 잔기의 제거 또는 추가를 포함할 수 있다.

단백질 분자로부터 에피토프를 제거하는 특히 효과적인 방법은 본 명세서에서 약술한 상기 나이브 T-세포 활성화 검정 방법과 공동 출원된 WO 02/069232 (이의 전문이 참조로서 본 명세서에 포함된다) 에 기술된 방법에 따라 개발된 컴퓨터 툴 (tool) 을 함께 이용하는 것이다.

상기 소프트웨어는 상기 펩티드 MHC 클래스 II 결합 상호작용의 수준에서의 항원 제시 과정을 시뮬레이션하여 주어진 임의의 펩티드 서열에 대한 결합 수치를 제공한다. 이러한 수치는 인간 개체군에 잔존하는 많은 주된 MHC 클래스 II 동종이형들에 대하여 측정된다. 이 방법이 임의의 펩티드 서열을 검사할 수 있기 때문에, 펩티드가 MHC 클래스 II 결합 홈과 상호작용하는 능력과 관련한, 추가 또는 결손 아미노산 치환의 결과를 예측할 수 있다. 따라서, 상기 MHC 클래스 II 와 상호작용할 수 있어서 면역원성 T-세포 에피토프로서 기능할 수 있는 펩티드의 수가 줄어든 신규의 서열 조성물을 설계할 수 있다. 임의의 한 주어진 공여자 샘플을 사용하는 생물학적 검정법으로 최대 4 개의 DR 동종이형에 대한 결합을 측정할 수 있는 반면, 상기 컴퓨터 방법으로는 40 개 초과의 동종이형을 사용하여 동일 펩티드 서열을 동시에 검사할 수 있다. 실제로, 이 접근법으로 다양한 MHC 동종이형과 상호작용하는 능력이 손상된 신규한 서열 변이체를 설계하는데 도움을 받을 수 있다.

T-세포 검정으로 상기 분자 내에서 세 개의 면역원성 부위 R1a - R3a 를 밝혀낼 수 있었고, WO 02/069232 의 방법에 따르는 소프트웨어 시스템으로는 상기 에피토프 각각에 있는 예상 MHC 클래스 II 리간드를 밝힐 수 있었다. 나아가, 상기 시스템으로, 상기 에피토프들 내에서, 상기 펩티드 서열 및 본질적으로 상기 시스템에서 나타난 MHC 클래스 II 동종이형 모두 사이의 결합 친화력을 현저히 감소시킨 아미노산 치환을 추가적으로 밝힐 수 있었다.

그러한 변이체 집합의 한 가지 예가 R1a 에피토프 부위의 파괴에 의해 제공된다. 치환 집합 M21A, M24A 및 Y28T 는 에피토프 R1a 내의 주요한 MHC 클래스 Ⅱ 리간드를 손상시키는 결과를 가져온다.

유사하게, 에피토프 부위 R2 내에서 동정된 MHC 클래스 Ⅱ 리간드에 대하여, I53A 및 L58H 치환들은 실현가능한 변형의 예이다.

에피토프 부위 R3 에서, 적절한 일련의 치환에는 하나 이상의 Y81T, V82H, V84A 및 F85T 변이가 포함된다.

상기 모든 경우에 있어서, 주어진 펩티드가 MHC 클래스 Ⅱ 내의 결합 홈과 결합하는 능력 및 SEB 결정 구조 모델 PDB ID 번호 3SEB 및 1GOZ [3SEB 에 대하여 Papageoriou, A. C. 등 (1998) J. Mol. Biol. 277: 61-79 를 참조. 1GOZ 에 대하여 Baker M. D. 등 (2002) J. Biol.Chem. 277: 2756-2762 를 참조] 에 대한 조사를 바탕으로 한 구조에 관한 검토를 기초로, 대체 (alternative) 돌연변이 집합을 구별할 수 있다.

상기 치환은 각각 상기 방법의 예이며, 본 발명의 방법 하에서 모두 바람직한 조성물이다. 당업자에게 명백할 것인 바, 원치 않는 에피토프를 제거하는 목적을 달성하게 하는 다수의 대체 치환 집합을 고안할 수 있다. 그러나, 그 결과 생성된 서열은 본 명세서에 개시된 특정한 조성물과 매우 유사하다고 인식될 것이므로, 이는 본 발명의 범위 내에 해당하게 된다.

MHC 클래스 II 리간드 동정 및 MHC 클래스 II 리간드가 없는 서열 유사체의 설계를 위한 컴퓨터 툴 사용을, 임의로 생물학적 기초의 T-세포 활성화 검정을 이용한 에피토프 매핑 및 재검사와 함께 조합적으로 이용하는 것이 특히 효과적인 방법이며 본 발명의 가장 바람직한 구현예이다. 상기 구현예에 따르는 일반적인 방법은 하기 단계를 포함한다:

i) 나이브 T-세포 활성화 검정 및 집단적으로 관심 단백질 서열을 포함하는 합성 펩티드들을 이용하여 T-세포를 활성화할 수 있는 에피토프 부위를 동정하는 단계;

ii) 상기 펩티드 리간드와 하나 이상의 MHC 동종이형의 결합을 모의 실험하는 전산적 방법을 이용하여 단계 i) 에서 동정된 에피토프 부위를 분석하고, 이로써 상기 에피토프 부위 내의 MHC 클래스 II 리간드를 동정하는 단계;

iii) 상기 펩티드 리간드와 하나 이상의 MHC 동종이형의 결합을 모의 실험하는 전산적 방법을 이용하여 더 이상 MHC 클래스 II 에 결합하지 않거나 또는 더 적은 수의 MHC 동종이형에 대하여 더 낮은 친화성을 가지고 결합하는, 상기 에피토프 부위(들) 내에 포함된 MHC 리간드의 서열 유사체들을 동정하는 단계; 및 임의로는

iv) 나이브 T-세포 활성화 검정 및 관심 단백질 내에서 동정된 에피토프 부위를 전체로서 또는 집합으로서 포함하는 합성 펩티드들을 이용하여 나이브 T-세포 활성화 검정으로 상기 야생형 (부모) 서열과 병행하여 서열 유사체들을 검사하는 단계.

"T-세포 에피토프" 라는 용어는 본 발명의 이해에 따르면 MHC 클래스 II 에 결합하며, T-세포를 자극할 수 있고/있거나, MHC 클래스 II 와의 복합체로서 T-세포에 결합할 수 있는 (반드시 측정가능하게 T-세포를 활성화시킬 필요는 없음) 아미노산 서열을 의미한다.

본 명세서의 상세한 설명 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 바 "펩티드" 라는 용어는 두 개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 아미노산들은 펩티드 결합 (본 명세서 하기에 정의됨) 에 의하여 서로 연결된다. 펩티드의 생물학적 생산에 포함되는 20 개의 상이한 자연발생적인 아미노산이 존재하며, 이들의 임의 갯수가 임의 순서로 연결되어 펩티드 사슬 또는 고리를 형성할 수 있다. 펩티드의 생물학적인 생산에 이용되는 자연발생적인 아미노산은 모두 L-형태를 가진다. 통상의 합성 방법을 이용하고, L-아미노산, D-아미노산 또는 두 상이한 형태의 아미노산의 다양한 조합을 이용하여 합성 펩티드를 제조할 수 있다. 일부 펩티드는 단지 수 개의 아미노산 단위들로 되어 있다. 짧은 펩티드, 예컨대, 10 개 미만의 아미노산 단위를 가지는 펩티드들을 간혹 "올리고펩티드"로 부른다. 다른 펩티드들은 많은 수의 아미노산 잔기들, 예컨대 100 개 까지 또는 그 이상의 잔기들을 포함하며, "폴리펩티드"로 불린다. 통상, "폴리펩티드"가 세 개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 사슬로 간주될 수 있는 반면, "올리고펩티드"는 보통 특정 유형의 "짧은" 폴리펩티드로 간주된다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바, "폴리펩티드"에 대한 임의의 언급은 또한 올리고펩티드를 포함함은 물론이다. 나아가, "펩티드"에 대한 임의의 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 단백질을 포함한다. 아미노산의 각 상이한 배열은 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 수-및 따라서 상이한 단백질의 수-는 실제로 무한하다.

본 발명의 SEB 분자는 임의의 여러 가지 방법으로 준비할 수 있으나, 일상적인 재조합 방법을 이용하여 수행하는 것이 가장 바람직하다. 본 명세서에 제시된 단백질 서열 및 정보를 이용하여 임의의 바람직한 단백질 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (DNA) 를 추론하는 방법이 비교적 간편한 방법이다. 예컨대, DNSstar 소프트웨어 [DNAstar Inc, Madison, WI, USA] 등과 같은 컴퓨터 소프트웨어 툴을 이용하여 이를 수행할 수 있다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드 또는 이의 중요한 유사체를 암호화할 수 있는 임의의 DNA 서열은 본 발명의 구현예로서 간주되어야 한다.

일반적인 방법으로서, 임의의 SEB 단백질 서열을 암호화하는 유전자를 유전자 합성법을 이용하여 만들고, 적절한 발현 벡터에 클로닝할 수 있다. 차례로 상기 발현 벡터가 숙주 세포로 도입되고, 세포를 선택하여 배양한다. 바람직한 분자를 배지로부터 정제하여, 치료적으로 투여하기 위한 제조물로 만든다. 다르게는, 예컨대 S.aureaus 의 DNA 및 PCR 프라이머 및 Horgan 과 Fraser 가 구상해낸 프로토콜 [Horgan C & Fraser J..D, In Chapter 8 of MHC Volume 1 A Practical Approach, pp 107-121, Eds: Fernandez, N. & Butcher, G. IRL Press, Oxford 1997] 을 이용한 PCR 클로닝 기법에 따라서 야생형 SEB 유전자 서열을 수득할 수 있다. 상기 야생형 독소 유전자는 돌연변이 유발 및 바람직한 변형 서열의 구성을 위한 원형(template)으로 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 다른 방법론 및 시스템을 간편하게 적용할 수 있지만, Higuchi 등이 기술한 "오버랩 연장 PCR" 기법 [Higuchi 등 (1988) Nucleic Acids Res. 16:7351] 을 이용하는 것이 특히 편리하다. 이어서, 변형된 코딩 DNA 를 목적하는 SEB 를 회수하여 정제한, 선택된 숙주 세포 시스템, 예컨대 E.coli 에서 종래의 방법에 의해 발현시킨다. 적절한 숙주 세포, 정제 및 검정 방법은 당업계에 공지되어 있다.

재조합 DNA 기술에 의해 SEB 분자의 구성을 수행할 수 있는 경우, 이에는 다른 단백질, 예컨대 항체 가변부 도메인과 융합된 SEB 분자가 포함될 수 있다. 융합 단백질을 포함한 재조합 단백질의 정제 및 조작 방법은 당업계에 공지되어 있다. 필요한 기술은 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2 판 (Sambrook 등 , 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel 등, eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis 등, eds., 1994); "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan 등, eds., 1991) 과 같은 문헌에 완전히 기재되어 있다.

본 발명은 본 명세서에 개시된 것과 실질적으로 동일한 1차 아미노산 서열을 갖는 임의의 SEB 분자 종류에 적용할 수 있고, 따라서 유전 공학적 방법 또는 기타 공정에 의해 유도된 SEB 단백질을 포함하며, 약 239 개의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.

포도상구균 장독소 A, C, C₁, C₂, D, E 및 F 와 다른 미생물에서 유래된 기타 연관된 독소는 본 발명에 개시된 많은 펩티드 서열을 공통적으로 가지고 있고, 개시된 목록의 것과 실질적으로 동일한 서열의 펩티드 서열 다수를 공통으로 가진다. 따라서 그러한 단백질 서열도 마찬가지로 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명은 개질된 SEB 에 관한 것인 바, 상기 개질된 SEB 단백질 또는 개질된 SEB 단백질의 단편 및 관련된 조성물은 본 발명의 범위 내로 간주되어야 한다. 이와 관련된 적절한 실시예는, 하나 이상의 개시된 펩티드를 면역치료적 정도의 양으로 환자에게 투여하는, 펩티드를 매개로 한 내성 유도 기법의 개발일 수 있다. 따라서, 합성 펩티드 분자, 예컨대 표 1 에 나열된 하나 이상의 서열을 포함하거나 또는 더욱 바람직하게는 임의의 에피토프 부위 R1a, R2a 및 R3a 의 전부 또는 일부를 포함하는 서열이 본 발명의 구현예로 간주된다.

다른 측면에서, 본 발명은 개질된 SEB 통일체 (entity) 를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 추가적 측면에서, 본 발명은 상기 개질된 SEB 단백질을 이용하여 인간을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 측면에서 상기 개질된 SEB 를 재조합 융합 단백질로서 제조할 수 있다. 이 측면에서 개질된 SEB 단백질은 항체 분자 또는 항체 분자의 단편과 결합될 수 있다. 이 결합은 화학적 가교제(cross-linker)에 의한 것이거나, 더욱 바람직하게 SEB-항체는 재조합 융합 단백질로서 제조될 수 있다. 상기 융합 분자는 항체 도메인이 융합 분자의 N-말단 쪽으로 향한 개질된 SEB 도메인을 함유할 수 있으며, 그 반대 방향으로 향한 것도 고려할 수 있다.

본 발명의 개질된 SEB 분자의 결합을 위한 목적하는 항체 특이성에는 암 특이적 항원에 대한 것이 포함되며, 그 예로는 A33 항원 [Heath, J. K. 등 (1997) Proc. Natl, Acad. Sci U.S.A. 94 : 469-474] 및 GA733-1 항원 [US,5,840,854] 이 포함된다. 암배아 (carcinoembryonic) 항원을 사용하는 것도 고려할 수 있는데, 이는 임의의 다수 항체에 의해 표적화될 수 있으나, 이에는 MFE23 [Chester, K. A. 등 (1994) Lancet 343 : 455], A5B7 [W092/010159], T84.66 [US,5,081,235], MN-14 [Hansen, H. J. 등 (1993) Cancer 71: 3478-3485], COL-1 [US,5,472,693], 항원 KS1/4 에 의해 인지되는 40kDa 글리코단백질 항원 [Spearman 등 (1987) J. Pharmacol. Exp. Therapeutics 241: 695-703], 표피 성장인자 수용체 (HER1) 또는 HER2 와 같은 관련된 수용체, 항체 14.18 [US,4,675,287; EP0192657] 과 같은 항-GD2 항체, 또는 전립선 특이적 막 항원에 대한 항체 [US,6,107,090], IL-2 수용체 [US,6,013,256], 루이스 Y 결정인자, 점액소 (mucin) 글리코단백질이 포함되며, 다른 것도 고려할 수 있다.

개질된 SEB 분자를 항체 서열과 융합하여 제조하는 모든 경우에서, MHC 클래스 Ⅱ 분자와 결합하거나 T 세포를 자극하거나 MHC 클래스 Ⅱ 분자와 연합하여 T 세포와 결합할 수 있는 T 세포 에피토프 또는 서열이 제거된 항체 서열을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

이제 본 발명의 하기의 실험적 실시예에 의해 상술하겠다. 실시예는 하기의 도면을 참조한다:

실시예 1

MHC, 펩티드 및 T-세포 수용체 (TCR) 사이의 상호작용은 T-세포 인식에 대한 항원 특이성에 대한 구조적 기초를 제공한다. T-세포 증식 검정은 펩티드의 MHC 에의 결합 및 TCR 에 의한 MHC/펩티드 복합체 인식을 검사한다. 본 실시예의 시험관내 T-세포 증식 검정은, 항원 제시 세포 (APC) 및 T-세포를 포함하는 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한 자극을 수반한다. 항원으로서 합성 펩티드를 사용하여 시험관 내에서 자극을 수행한다. ³H-티미딘 (³H-Thy) 을 사용하여 자극받은 T-세포 증식을 측정하고, 세정된 고정 세포들에 대한 섬광 계측 (scintillation counting) 을 이용하여 혼입된 ³H-Thy 의 존재를 측정한다.

12 시간 미만 동안 저장된 인간 혈액으로부터의 연층 (buffy coat) 은 영국국립혈액원 (Addenbrooks Hospital, 캠프리지, 영국) 로부터 획득하였다. ficoll-paque 는 Amersham Pharmacia Biotech (Amersham, 영국) 으로부터 획득하였다. L-글루타민, 50 ㎍/㎖ 의 스트렙토마이신, 10 ㎍/㎖ 의 젠토마이신 및 0.1 % 인간 혈청 알부민을 포함하는, 일차 인간 림프구 배양을 위한 무(無)혈청 AIM V 배지를 Gibco-BRL (Paisley, 영국) 로부터 획득하였다. 합성 펩티드는 Pepscan (네덜란드) 및 Babraham Technix (캠프리지, 영국) 로부터 획득하였다.

연층을 온화하게 원심분리하여 적혈구 및 백혈구를 혈장 및 혈소판으로부터 분리하였다. 최상층 (혈장 및 혈소판 함유) 을 제거하여 폐기하였다. 적혈구 및 백혈구를 인산완충 생리식염수 (PBS) 로 1:1로 희석하고, 15 ㎖ ficoll-paque (Amersham Pharmacia, Amersham UK) 상에 적층시켰다. 제조자의 추천 조건에 따라 원심분리를 수행하고 혈청+PBS/ficoll paque 경계면으로부터 PBMC 를 수확하였다. PBMC 를 PBS 와 혼합(1:1)하고 원심분리로 수집하였다. 상층액을 제거하여 버리고 PBMC 펠렛을 PBS 50 ㎖ 로 재현탁하였다. 세포를 원심분리로 다시 펠렛화하고 PBS 상층액을 버렸다. 세포를 AIM V 배지 50 ㎖ 을 이용하여 재현탁하고 이 시점에서 세포 수를 카운팅하여 트리판 블루 염색 배제법 (trypan blue dye exclusion) 를 이용하여 생존율을 평가하였다. 원심분리로 세포를 다시 수집하고 상층액을 버렸다. 세포를 냉동보관을 위하여 ㎖ 당 3x10⁷ 개의 밀도로 재현탁하였다. 저장 배지는 90 % (v/v) 열 불활성화 AB 인간 혈청 (Sigma, Poole, 영국) 및 10 % (v/v) DMSO (Sigma, Poole, 영국) 이었다. 세포를 온도조절된 동결 용기 (Sigma) 로 옮기고 -70 ℃ 에서 하룻밤 방치한 후, 장기간의 보관을 위하여 액체 N₂ 로 옮겼다. 사용해야 할 때, 세포를 37 ℃ 수조에서 급속히 해동시킨 후 예열된 AIM V 배지 10 ㎖ 로 옮겼다.

웰 당 2x10⁵ PBMC 의 농도의 96 웰 평면 바닥 플레이트에서 PBMC 를 단백질 및 펩티드 항원으로 자극하였다. PBMC 를 37 ℃ 에서 7 일간 배양하고 ³H-Thy 로 (Amersham-Phamacia, Amersham, 영국) 펄싱 (pulsing) 하였다. 본 연구에 있어서, 서로 연속되는 펩티드가 12 개의 아미노산씩 오버래핑되는 합성 펩티드 (15머) 를 EPO 의 전체 서열에 걸치도록 생성하였다. 펩티드 식별 번호 (ID#) 및 서열은 하기 표 2a, 2b, 2c 및 2d 에 주어진다.

각 펩티드를 20 명의 나이브 공여자로부터 분리된 PBMC 에 대하여 개별적으로 스크리닝하였다. 이전에 면역원성으로 나타난 두 개의 대조군 펩티드 및 유력한 비-기억 항원인 KLH 를 각각의 공여자 검정에 사용하였다. 본 연구에서 사용된 대조군 항원은 Flu 적혈구 응집소 307-319 (서열: PKYVKQNTLKLAT); Chlamydia HSP 60 펩티드 (서열: KVVDQIKKISKPVQH) 및 Keyhole Limpet 혈색소이었다. 모든 PBMC 샘플에 대한 조직 유형을 시판되는 시약 시스템 (Dynal, Wirral, UK) 을 이용하여 검정하였다. 제조자 추천 방식 및 표준 보조 시약 및 아가로스 전기영동 시스템에 따라 검정을 수행하였다.

펩티드들을 최종 농도가 10 mM 이 되도록 DMSO 에 용해시키고, 이 저장 용액 (stock solution) 들을 그 후 AIM V 배지에서 1/500 으로 희석하였다(최종 농도 20μM). 펩티드들을 평면 바닥 96 웰 플레이트에 첨가하여 최종 농도가 100 ㎕ 중 2 및 20 μM 이 되게 한다. 해동시킨 PBMC 의 생존율을 트리판 블루 염색 배제법으로 평가하고, 세포들을 ㎖ 당 2x10⁶ 개의 밀도로 재현탁한 후, 100 ㎕ (웰당 2x10⁵ PBMC) 를 펩티드를 함유한 각 웰로 옮겼다. 각 펩티드 농도에서 3 개의 웰 배양액을 분석하였다. 플레이트들을 37 ℃, 5 % CO₂ 의 습한 대기에서 7 일간 배양하였다. 세포들을 18 내지 21 시간 동안 웰당 1 μCi ³H-Thy 로 펄싱한 후 필터 받침으로 수집하였다. Wallac 마이크로플레이트 베타 탑 플레이트 계수기 (Wallac microplate beta top plate counter) (Perkin Elmer 사) 를 사용하여 CPM 값을 측정하였다. 자극 지수로 결과를 나타내었는데, 이때 자극 지수 (SI) 는 상기 검사 펩티드에 대하여 측정된 증식 수치 (예컨대, 1 분 당 방사능 계수) 를 시험 펩티드에 접촉되지 않은 세포에서 측정된 수치로 나누어 유도한다.

T-세포 에피토프 매핑에 사용된 SEB 합성 펩티드의 목록

T 세포 증식 검정법을 이용하여 SEB 서열 내의 T 세포 에피토프를 매핑한 결과 세 개의 면역원성 부위인 R1a, R2a 및 R3a 을 동정하였다. 상당한 반응을 자극할 수 있는 펩티드는 표 1 에 나열되어 있다. 반응성 공여자의 동종이형 제한 및 SEB 펩티드에 대한 SI 기록을 하기 표 3 에 나타낸다.

*SI = 자극 지수. 주어진 수는 각 반응성 공여자 샘플에 대한 세 번의 측정치의 평균값이다. 모든 펩티드는 1 μM 및 5 μM 에서 측정하였다. 주어진 SI 는 두 개의 측정값 중 높은 쪽과 관계있다.

실시예 2

향상된 면역원성 프로필을 지닌 개질된 SEB 서열의 설계:

에피토프 부위 R1a, R2a 및 R3a 을 분석함에 있어서 공동 출원 WO 02/069232 의 방법을 사용하였다. 상기 시스템은 생물학적으로 검출된 에피토프 부위 내에 둘러싸인 특정한 MHC 리간드의 예측을 가능케 하고, 주어진 MHC 클래스 Ⅱ 리간드가 특정한 MHC 동종이형과 결합하는 능력에 관한 "수치" 를 제공한다.

MHC 리간드에 대한 동종이형 제한 패턴을 동종이형 제한 차트를 이용하여 나타낼 수 있는 바, 하기 도 1 내지 도 3 에서 각각의 에피토프 부위 R1a 내지 R3a 에 대한 동종이형 제한을 도시한다.

상기 분석을 각 에피토프 R1a 내지 R3a 내의 서열의 변형에 대한 검토로 확장하였다. 서열 변이체를, MHC 클래스 Ⅱ 와의 지속적 결합 능력 및 그것이 남아있는 곳에서의 결합 수치로 시험하였다. 시험된 MHC 동종이형의 대다수와 MHC 클래스 Ⅱ의 결합의 제거를 달성한 다수의 아미노산 치환을 규명하였다. 확인된 특정한 치환체에 대한 SEB 결정 구조 모델 PDB ID 번호 3SEB 및 1GOZ 내에서의 적응 능력을 추가로 시험하였다 [3SEB 의 경우, Papageoriou, A. C. 등 (1998) J.Mol. Biol. 277: 61-79 참조. 1GOZ 의 경우, Baker M. D. 등 (2002) J. Biol. Chem. 277: 2756-2762 참조]. 야생형 서열의 선택된 잔기 상에 설계된 돌연변이에 대하여, 입체적 충돌(clash), 수소 결합 형성, 소수성 결합 및 구조내에서 이의 일반적인 적응을 검토하였다. 입체적 충돌을 일으키는 치환을 제거하였다. 측쇄에 원래 잔기와 유사한 배열 (회전 이성질체) 이 채택되었을 때 적응되는 치환은 허용가능한 것으로 간주하였다. 하나 이상의 치환이 상기 기준을 충족한 경우, 이웃하는 측쇄 또는 백본 (backbone) 원자와 잠재적으로 수소 결합을 형성하고/거나 유리한 소수성 접촉 또는 기타 결합을 형성하는 잔기가 바람직하였다. 상기 절차는 Swiss Prot Deep View v3.7 [Guex, N. and Peitsch, M. C. (1997) Electrophoresis 18:2714-2723] 를 이용하여 서로 교류하며 수행하였다. 상기 방법으로 각 에피토프 부위 R1-R3, 바람직하게는 R1a-R3a 에 대한 바람직한 치환 집합이 생성되었다. 상기 치환 집합을 편집하여 식 Ⅰ에 도시한 구조를 제작하였다. 모든 치환들은 각각의 에피토프 부위 R1-R3, 바람직하게는 R1a-R3a 내의 MHC 클래스 Ⅱ 리간드를 제거하는 것으로 확인되었다. 상기 방법에 따라 가장 바람직한 치환 세트를 함유한 SEB 구조를 상기 식 Ⅰ과 같이 도시한다.

Claims (16)

1. 포도상구균 장독소 B (SEB) 의 생물학적 활성을 지니며, 생체 내에서 사용될 경우, 실질적으로 비-면역원성이거나 개체 내에서 동일한 생물학적 활성을 지닌 임의의 비-개질된 분자에 비해 면역원성이 더 낮은 개질된 분자로서 하기의 특징을 지닌 분자:

   (ⅰ) 원래의 비개질된 분자로부터 유래된 하나 이상의 T-세포 에피토프를 제거함으로써 상기 면역원성의 소실을 달성하고, 상기 T-세포 에피토프는, 클래스 Ⅱ 에 제시됨으로써 T-세포를 자극하거나 이와 결합하는 능력을 보이는 MHC 클래스 Ⅱ 리간드 또는 펩티드 서열이고,

   (ⅱ) 상기 개질된 분자는, 생물학적인 인간 T-세포 증식 검정에서 전체 단백질로서 시험할 경우, 부모 비-개질된 분자에 비해 더 낮은 자극 지수 (SI) 및 2.0 미만의 자극 지수를 나타내고,

   (ⅲ) 제거되는 상기 T-세포 에피토프는 원래의 비-개질된 SEB 분자의 연속된 잔기의 R1 내지 R3 으로 명명된 하나 이상의 스트링 상에 위치하며, 상기 스트링은 하기로부터 선택된다:
2. 제 1 항에 있어서, 상기 제거되는 T-세포 에피토프가 원래의 비-개질된 SEB 분자의 연속된 잔기의 R1a,b,c, R2a 및 R3a 로 명명된 하나 이상의 스트링 상에 위치하며, 상기 스트링은 하기로부터 선택되는 개질된 SEB 분자:

   R1a: KFTGLMENMKVLYDD,

   R1b: GLMENMKVLYDDNHV, 또는

   R1c: ENMKVLYDDNHVSAI

   R2a: SIKDTKLGNYDNVRV,

   R3a: DKYVDVFGANYYYQC.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 스트링 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 상기 T-세포 에피토프를 제거한 개질된 SEB 분자.
4. 포도상구균 장독소 B (SEB)의 생물학적 활성을 지니며, 생체 내에서 사용될 경우, 실질적으로 비-면역원성이거나 개체 내에서 동일한 생물학적 활성을 지닌 임의의 비-개질된 분자에 비해 면역원성이 더 낮은 개질된 분자로서, 최초의 비개질된 분자로부터 유래된 하나 이상의 T-세포 에피토프를 제거함으로써 상기 면역원성의 소실을 달성하고, 상기 T-세포 에피토프는, 클래스 Ⅱ 에 제시됨으로써 T-세포를 자극하거나 이와 결합하는 능력을 보이는 MHC 클래스 Ⅱ 리간드 또는 펩티드 서열이며, 상기 개질된 분자는 하기의 아미노산 서열을 가지는 개질된 분자:

   [여기서,

   X¹ = A, G, P 또는 M;

   X² = A, G, P, 또는 M;

   X³ = T, A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, 또는 Y;

   X⁴ = A, 또는 I;

   X⁵ = H, 또는 L;

   X⁶ = T, A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, 또는 Y;

   X⁷= H, 또는 V;

   X⁸= A, P, G, 또는 V;

   X⁹ = T, H, 또는 F;

   단, 동시에 X¹= M, X² = M, X³ = Y, X⁴ = Y, X⁵ = L, X⁶ = Y, X⁷ = V, X⁸ = V 및 X⁹ = F 인 경우는 제외된다].
5. 제 4 항에 있어서, X¹ = A, X² = A, X³= T, X⁴ = A, X⁵ = H, X⁶ = T, X⁷ = H, X⁸ = A, 및 X⁹ = T 인 개질된 SEB 분자.
6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 분자를 생물학적인 인간 T-세포 증식 검정에서 전체 단백질로서 시험할 경우, 부모 비-개질된 SEB 분자에 비해 낮은 자극 지수 (SI) 및 2.0 미만의 자극 지수를 나타내는, 개질된 SEB 분자.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 개질된 SEB 분자를 코딩하는 DNA 분자.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 개질된 SEB 분자와 함께 약학적으로 허용할 수 있는 담체, 희석액 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
9. 포도상구균 장독소 B (SEB) 의 생물학적 활성을 지니고, 클래스 Ⅱ 에 제시됨으로써 T-세포를 자극하거나 그와 결합하는 능력을 보이는 MHC 클래스 Ⅱ 리간드 또는 서열 트랙 (track) 인, 하나 이상의 T-세포 에피토프를 포함하는 분자의 일부인 펩티드 서열로서, 표 1 또는 표 2a, 2b, 2c 및 2d 로부터 선택되는 펩티드 서열.
10. 제 9 항에 있어서, 임의의 상기 스트링에서의 13 내지 15 개의 연속된 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 서열.
11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 생물학적 인간 T-세포 증식 검정에서 시험하는 경우, 2.0 을 초과하는 자극 지수 (SI) 를 나타내는 펩티드 서열.
12. 제 11 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 개질되어, MHC 클래스 Ⅱ 리간드인 잠재적인 T-세포 에피토프가 제거되고, 상기 펩티드는, 생물학적 인간 T-세포 증식 검정에서 시험할 경우, 2.0 미만, 바람직하게는 1.8 미만의 자극 지수 (SI) 를 나타내는 개질된 펩티드 서열.
13. 제 1 항에 정의한 바와 같은 개질된 인간 SEB 분자의 제조를 위한 제 12 항에 따른 펩티드의 용도.
14. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 펩티드 서열을 코딩하는 DNA 분자.
15. 비개질된 SEB 내의 T-세포 에피토프의 위치를 확인함으로써 포도상구균 장독소 B (SEB)의 T-세포 에피토프 지도를 구성하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 방법:

    (i) 생리학적 비율의 T-세포 대 항원 제시 세포를 함유한 서로 연관되지 않은 공여자 샘플로부터의 PBMC 표본을 이용한 합성 펩티드 면역원을 사용하여 시험관 내에서 항원 자극시키는 단계;

    (ii) 상기 펩티드 리간드와 하나 이상의 MHC 동종이형의 결합을 자극하는 전산적 방법을 이용하여 (i) 단계에서 동정된 에피토프 부위를 분석하고, 이로써 상기 에피토프 부위 내의 MHC 클래스 II 리간드를 동정하는 단계;

    (iii) 상기 펩티드 리간드와 하나 이상의 MHC 동종이형의 결합을 자극하는 전산적 방법을 이용하여, 더 이상 MHC 클래스 II 에 결합하지 않거나 또는 더 적은 수의 MHC 동종이형에 대하여 더 낮은 친화력을 가지고 결합하는, 상기 에피토프 부위(들) 내에 포함된 MHC 리간드의 서열 유사체들을 동정하는 단계; 및 임의로는

    (iv) 나이브 T-세포 활성화 검정 및 SEB 분자 내에서 동정된 에피토프 부위를 전체로서 또는 집합으로서 포함하는 합성 펩티드들을 이용하여, 나이브 T-세포 활성화 검정으로 상기 부모 SEB 서열과 병행하여 서열 유사체들을 검사하는 단계.
16. 제 15 항에 있어서, 두 개 이상의 독립된 공여자 샘플에서 2.0 이상의 자극 지수 (SI) 를 관찰한 경우에 있어서 특정한 T-세포 에피토프의 위치를 발견하는 방법.