KR20050028063A - 식물체에서 발현된 말라리아의 ｃｓ 단백질을 포함하는말라리아 진단키트 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 말라리아의 CS (Circumsporozoite) 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 식물체, 상기 식물체를 이용한 CS 단백질의 제조방법 및 CS 단백질을 이용한 말라리아의 진단에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, CS 단백질을 대량으로 저비용으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 생산된 CS 단백질은 천연 CS 단백질과 동일한 항원-항체 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 CS 단백질은 우수한 민감도 및 특이성으로 말라리아의 진단에 이용될 수 있다.

Description

식물체에서 발현된 말라리아의 ＣＳ 단백질을 포함하는 말라리아 진단키트 및 이의 제조방법{Circumsporozoite Protein of Malaria Expressed in Plants and Diagnostic Kit Comprising the Same}

본 발명은 식물체에서 발현된 말라리아의 CS (Circumsporozoite) 단백질 항원을 포함하는 말라리아 진단 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 CS 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 식물체, 상기 식물체를 이용한 CS 단백질의 제조방법 및 CS 단백질을 이용한 말라리아의 진단에 관한 것이다.

말라리아는 플라스모디아 (Plasmodia)라 불리는 혈액 기생충 질환으로서, 암모기에 의해서 흡혈을 통해 전염되는 질환이다. 사람에서는 주로 4종류의 말라리아가 존재하는 데, 우리나라에서는 현재 유행중인 삼일열 말라리아가 주로 나타나며, 이외에 사일열, 열대열 및 난원형 말라리아가 있으며, 각각 플라스모디움 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모디움 말라리애 (P. malariae), 플라스모디움 팔시파룸 (P. falciparum) 및 플라스모디움 오발레 (P. ovale)에 의해 발병된다.

말라리아는 1640년 처음으로 Huan del Vego가 페루와 에쿠아도르에서 기나피 액으로 치료했다는 기록이 있으며, 1880년 프랑스의 의사 Laveran이 알제리의 한 환자에서 처음으로 원인 원충을 규명하였다. 1897년 영국의사 Ronald Ross경이 인디아에서 말라리아를 매개하는 것은 모기라는 사실을 밝혔으며, 이후 말라리아 연구가 진척되기 시작했다.

세계 제 2 차 세계대전에서는 독일인 의사 Resochin에 의해 클로로퀸 (Chloroquine)의 효능이 발견되어 사용되었고, 1950년도에 미국인 의사인 Elderfield에 의해 프리마퀸 (Primaquine)이 발견되고 월남전에는 내성 말라리아의 등장으로 메플로퀸 (Mefloquine)이 사용되어 현재에 이르고 있다.

말라리아는 얼룩날개모기 (Anopheles spp.)에 속하는 암컷 모기의 흡혈에 의해서 전파되는데 우리나라에서는 중국얼룩날개모기 (An. sinensis) 암컷이 전파시킨다. 말라리아는 사람에서의 생활사인 무성생식 (분열생식기, Schizogony)과 모기에서의 생활사인 유성생식 (포자생식기, Sporogony)으로 나뉘는데, 처음 모기가 사람을 물면 말라리아 포자 (sporozoite)가 혈관을 따라 간으로 이동한다. 간세포에서 증식을 실시하거나 휴면상태로 존재하다가 일정한 기간이 지나면 (8-9일), 혈중으로 나오게 되고 본격적인 증식을 하게된다. 혈중에서는 적혈구로 들어가 영양체인 고리형에서 증식형, 분열체 과정을 거치며 분열체 (schizont)가 수십 개의 분열소체 (merozoite)를 방출하게 되면 각각의 적혈구에 들어가 같은 사이클을 반복한다. 이중 일부가 생식모세포형태로 존재하며 모기가 이런 상태의 사람을 흡혈하였을 때 이로 인해 모기로 넘어가 증식하고 다시 모기의 증식과정을 통해 위와 침샘에 존재하다가 사람에게 넘어오는 과정을 반복하게된다.

말라리아는 전세계적인 분포를 보이고 있으나 일부지역에서는 효과적인 방제로 인하여 1960 년대 이후 발생이 중지되거나 감소되었다. 그러나 최근의 엘니뇨 현상과 같은 이상 기온 및 약제내성균주의 증가, 살충제에 대한 저항성 증가 등으로 인해 전세계적으로 다시 확산되고 있는 추세이다. 말라리아는 크게 중남미를 중심으로 하여 아메리카형, 아프리카형, 그리고 인도와 동남아시아를 중심으로 하는 아시아형으로 나뉘는 데 각 형은 지리적 분포의 차이를 보일 뿐만 아니라 원충의 종적 특성과 유전적 성향도 크게 다르다.

우리나라는 6.25 사변 이후 많이 유행되었으나 1970년대 후반 이후에는 거의 소멸되었으나 1993년부터 경기북부 휴전선 근처에서 다시 발생하기 시작하여 1997년에는 1,724예가 발생하였다. 현재의 재유행은 과거에 유행하던 말라리아가 장기간 잠복해 있다가 유행하는 것보다는 외부에서 원충이 새로이 도입되어 일어나는 것으로 추정된다. 외부 원충의 유입원으로 해외유입 말라리아 환자나 외국인 근로자의 가능성은 거의 없고 북한에서 넘어온 것으로 추정되고있다. 이는 북한이 경제난과 식량기근으로 말라리아환자가 대량으로 발생하고, 기상이변으로 인한 모기의 증가로 원충을 보유한 모기의 수가 급증하였고, 이들 모기의 일부가 기류를 타고 휴전선을 넘어 남하하여 경기도 북부에 정착한 것으로 생각되며, 1998년까지 6142명의 내국인 환자가 발생하였다.

말라리아는 현재 지구상에서 가장 인류를 위협하는 질환으로 이로 인해 매년 2 억에서 3 억 명이 감염되고 250 만에서 300 만 명이 사망하며, 전세계의 40%인 100 여 개국 이상이 이 질환으로 고생하고 있다. 우리나라에서는 삼일열 말라리아가 최근 기하급수적 증가세를 기록하고 있으며 말라리아 감염지역은 3년간 헌혈이 금지되고 헌혈된 혈액도 폐기되기 때문에 전체 헌혈의 70% 이상을 군인이나 학생 등의 단체헌혈에 의존하고 있는 국내 현실상 혈액수급에도 큰 차질을 빚고 있다.

말라리아의 진단은 현미경으로 염색된 말라리아 감염 혈구를 관찰하는 혈액 도말법이 가장 많이 사용되나, 시간이 많이 소요되고, 감염 혈구를 판별할 수 있는 전문적인 검사자가 요구되는 문제점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 말라리아의 항원을 검출하는 시약이 사용되고 있으나 이들 시약 역시 민감도가 낮아 상기 혈액 도말법과 함께 사용하고 있다. 또 다른 진단법인 PCR 법은 민감도는 높지만 아직 실용화되지 못하고 있다. 또한 이러한 진단법은 특히 삼일열 말라리아 원충에 의해 감염되어 잠복기가 길고 혈액 내 원충수가 적은 한국형 말라리아를 진단하는데는 더욱 어려움이 있다.

따라서 말라리아 감염증에 대해 민감도와 특이성이 높으면서 신속하게 진단할 수 있는 진단법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

WO 0161032는 말라리아 프로토조아의 항원을 이용한 혈액 내 말라리아-특이 항체를 검출하여 말라리아를 면역적으로 진단하는 방법을 개시하고 있고, WO 9724141는 플라스모디움-특이 젖산 탈수소효소 (LDH)에 대한 단세포군 항체를 이용하여 플라스모디움의 존부를 검출하는 방법을 개시하고 있다. 한편, 대한민국 특허출원 제 2000-14123 호는 MSP (merozite surface protein)를 포함하는 말라리아 항체진단 시약 조성물을 개시하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 상술한 당업계의 요구를 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, 삼일열 말라리아의 전체 유전자 중에서 항원성이 가장 우수한 CS (Circumsporozoite) 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드를 식물체에 성공적으로 도입하고, 이로부터 분리·정제된 CS 단백질이 말라리아 원충과 동일한 면역학적 항원성을 나타내는 것을 확인하고, 이를 말라리아 진단에 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 CS (Circumsporozoite) 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 CS 단백질의 식물발현용 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 CS 단백질을 일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 CS 단백질을 일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 CS 단백질의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 CS 단백질을 안정되게 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 CS 단백질을 안정되게 발현하는 형질전환 식물체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 제조된 재조합 CS 단백질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 CS (Circumsporozoite) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

CS (Circumsporozoite) 단백질은 말라리아 원충의 포자소체 (sporozoite)의 체표면을 덮고 있는 단백질로서 주된 표면 항원으로 작용한다. 따라서 감염된 모기에 노출된 경험이 있는 사람에게서 이 CS 단백질에 대한 항체를 검출할 수 있고, 환자로 발병하기 전에 항체반응 강도에 따라서 사전에 말라리아 원충에 대한 노출여부를 판별하여 혈액검사가 가능하다.

본 발명의 신규한 폴리뉴클레오타이드는 CS 단백질을 코딩하는 것으로서, 아미노산 치환 없이 식물체내에서의 발현을 최적화하기 위하여 변형된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 디자인은 다음과 같은 기준에 의해 실시된다: (ⅰ) GC 함량을 50% 이상으로 하고, (ⅱ) 식물이 선호하는 코돈을 갖도록 하며, (ⅲ) 인트론 유사 서열을 제거하는 것이다. 이러한 식물-적합 서열은 유전자의 해독율 (translation rate)을 증가시킬 수 있다 (Kusnadi et al., Biotechnol. Prog. 14:149-155(1998)). 또한, 도입 유전자의 배열이 숙주 식물체에서 인트론으로 인식됨으로 인해 식물체 핵 내에서 절단되어 원하는 단백질의 생산에 실패할 가능성을 배제하기 위하여, 도입되는 외래 유전자 내의 인트론 유사 서열이 제거된다.

본 발명의 신규한 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 그의 일부 서열도 포함한다. 즉, 상기 일부 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 항원성을 나타내는 경우에는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 포함된다. 보다 상세하게는, 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체에 대하여, 상기 일부 서열에 의해 코딩되는 단백질이 반응 (항원-항체 반응) 하는 경우에는 일부 서열로 이루어진 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

또한, 본 발명의 신규한 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 배열된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 보다 바람직하게는 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 상기 제 1 항의 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질의 식물발현용 벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 쌀 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위는 아그로박테리움 튜머페이션스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분 및 CaMV 35S 터미네이터를 포함한다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptⅡ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함한다.

본 발명에 따르면, CS 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 식물체의 제조는 크게 두 방식에 의해 달성된다: 일시적 형질감염 식물체 (transient transfected plant) 및 형질전환 식물체 (transgenic plant).

본 명세서에서 용어 "일시적 형질감염 식물체"는 외래 유전자가 도입된 식물체로서 도입된 외래 유전자가 다음 세대로 전달되지 않는 것을 의미한다. 일시적 형질감염 식물체에서 외래 유전자는 일반적으로 숙주 세포의 염색체와 별개로 존재하게 된다. 반대로, 용어 "형질전환 식물체"는 다음 세대로 전달되는 외래 유전자를 갖는 식물체를 의미한다. 형질전환 식물체에서 외래 유전자는 일반적으로 숙주 세포의 염색체에 통합 (integration)되어 숙주 세포의 유전 내용물 (genetic repertoire)가 되며, 다음 세대에 안정적으로 전달된다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명의 식물발현용 벡터를 식물체의 식물세포로 도입되는 단계; 및 (b) 상기 식물세포에 유전자 도입이 되었는 지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질을 일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 방법에 의해 제조된 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질을 일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 본 발명의 식물발현용 벡터를 식물세포로 도입되는 단계; (b) 상기 식물세포에 유전자 도입이 되었는 지 여부를 확인하는 단계; 및 (c) 유전자가 도입된 식물세포를 포함하는 식물체로부터 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질을 포함하는 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질을의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 일시적 형질감염은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다 (Rainer Fisher et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 30:113-116(1999)). 식물에서의 일시적 유전자 발현은 안정된 발현을 하는 형질전환체에 비하여 신속하고 단백질 발현 결과를 빠른 시일 내에 확인할 수 있기 때문에, 안정된 형질전환 식물체를 사용한 대규모 생산에 앞서 식물체에서 수득한 목적 단백질의 정상적 기능 여부를 확인하는데 적합하다.

이에 본 발명자들은 생물학적 활성을 가지는 CS 단백질의 효율적인 대량 생산을 위하여, 식물체에서 일시적 유전자 발현 방법을 사용하여 CS (Circumsporozoite) 단백질을 발현하고 분리 및 정제하였다.

일시적 유전자 발현 방법은 대량 생산을 위해 식물 형질전환체를 제조하기 전에 목적 유전자의 기능성과 안정적 발현성을 검사하는데 적합한 접근방법으로서, 시간과 비용을 절약할 수 있는 이점이 있다. 특히, 안정적 형질전환에 의해 제조된 식물 형질전환체의 경우, 외래 유전자가 삽입된 위치에 따라 영향을 받는 염색체 위치효과 (chromosomal positional effect)를 나타내는 데, 일시적 형질감염은 이러한 효과를 배제할 수 있어 외래 유전자의 효과적 발현과 분리에 매우 적합하다.

일시적 형질감염에서 외래 유전자를 식물세포로 전달하는 방법은 대표적으로 세 종류가 있다: 내이키드 (naked) DNA를 입자에 코팅하여 도입하는 입자총 (particle bombardment) 방법 (Christou, P., Trends Plant Sci. 1:423-431(1996)), 진공 침투 (vacuum infiltration) 등에 의하여 발현 벡터를 포함하고 있는 아그로박테리움을 식물조직으로 도입하는 아그로인필트래이션법 (agroinfiltration) (Kapila et al., Plant Sci., 122:101-108(1996)), 및 변형된 식물 바이러스 벡터를 이용하는 바이러스벡터법 (viral vectors) (Scholthof, H. et al., Annu. Rev. Phytopathol. 34:299-323(1996)).

이들 세 가지 방법의 형질전환 효율은 각각 다양하여, 입자총에 의한 DNA 도입의 경우에는 일반적으로 소수의 세포들에만 유전자가 도입되며 전사를 위하여 DNA가 세포의 핵 내에 도달해야만 기능을 하게 된다. 이 방법은 안정적 형질전환에 앞서서 재조합 단백질의 안정성 검사에 사용할 수 있지만 재조합 단백질의 대량 발현을 위해서는 부적당하다.

아그로인필트래이션법은 입자총 보다 많은 세포들에 유전자가 도입될 수 있는데, 목적 유전자를 포함하는 T-DNA가 몇 가지 세균 단백질들의 도움으로 능동적으로 핵 내에 도입된다. 이 방법 또한 도입된 T-DNA가 숙주세포의 염색체로 통합되어 지속적으로 발현되는 것이 아니고, 핵 내에 독립적으로 존재하여 목적 유전자의 일시적 발현을 나타내는 것으로 단백질 안정성과 기능의 특성을 조사하기에 충분한 양의 단백질을 신속하게 확보하기에 적당하다.

그리고 바이러스벡터를 이용한 방법은 바이러스 식물 병원성 유전자 (viral plant pathogene)의 지놈에 외래 유전자를 도입하여 강한 프로모터의 조절을 받도록 하는 것으로서, 외래 유전자를 포함한 재조합 바이러스 벡터를 식물에 감염시키면 도입된 외래 유전자는 식물 바이러스 복제 과정 중에 고효율로 함께 증폭된 후 발현이 이루어져 외래 단백질을 생산하게 된다. 그러나 바이러스 벡터를 사용할 경우에는 생산할 단백질의 크기가 30 kDa 이하로 제한되어 있어 도입할 유전자의 크기가 커서는 사용하기가 어렵다는 단점이 있다.

따라서, 본 발명에서는 아그로인필트래이션법이 가장 바람직하다. 아그로인필트래이션법은 일반적으로 잎을 가지고 실시된다.

아그로필트레이션에 본 발명이 실시되는 경우, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템을 이용한다.

아그로박테리움 시스템을 이용하는 방법에 있어서, 구체적인 일 실시예는 다음의 단계를 포함한다: (a') 다음의 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)를 식물체의 잎의 조직에 침투시키는 단계: 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b') 상기 침투된 잎에서 단백질의 발현을 확인하는 단계.

상기한 구체적인 일 실시예에서, 적합한 잎은 발아된 종자로부터 유래된 어떠한 조직도 포함하며, 바람직하게는 꽃대가 오르기 전에 생성된 잎이고, 가장 바람직하게는 너무 어리거나 성숙하지 않은 잎이다. 잎이 어릴수록 발현량이 많으나 조직이 황화되거나 죽기 쉬우며, 성숙한 잎은 조직이 팽창되어 있어 균의 주입은 쉬우나 발현량이 감소된다. 종자의 발아는 적합한 배지를 이용하여 적합한 암/광조건 하에서 실시된다.

식물 세포로의 유전자 도입은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스를 가지고 실시된다 (Depicker, A. et al., In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)). 보다 바람직하게는, pBin19, pRD400, pRD320 및 pHS737과 같은 바이너리 벡터 시스템이 이용된다 (An, G. et al., "Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986); R. K. Jain, et al., Biochem. Soc. Trans. 28:958-961(2000)).

아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 잎에 있는 식물세포로의 유전자 도입은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 유전자 도입 과정은 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물을 잎의 조직에 침투 (infiltration)시키는 과정을 포함한다.

상기 침투 과정은 진공을 이용한 방법 또는 주사기를 이용한 방법으로 실시될 수 있다. 진공을 이용하는 경우의 구체적인 일 실시예는 다음과 같다. 식물체 잎을 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물에 놓고, 짧은 시간 동안 진공을 적용한다. 이어 진공을 빠르게 해제하고, 잎을 멸균수로 소독한 다음, 습한 종이 위에 잎의 윗 부분이 아래로 향하도록 놓는다. 그런 다음, 상기 잎을 약 22℃에서 약 16 시간의 광조건 하에서 보관한다. 그리고 나서, 약 2-3 시간 후, 발현된 목적 단백질의 확인한다.

한편, 주사기를 이용하는 경우에의 구체적인 일 실시예는 다음과 같다. 식물체 잎의 뒷면에 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물을 주사기를 이용하여 주입하고, 이 식물체를 약 3-5일 동안 배양한 다음, 발현된 목적 단백질을 확인한다.

아그로박테리움 튜머페이션스 배양액에는 바람직하게는 아세토시링곤이 포함되는데, 이는 아그로박테리움의 식물로의 침투를 돕기 위한 것이다.

본 발명에 따라 유전자 도입된 식물체는 당업계에 공지된 방법에 의해 목적 단백질의 발현을 확인된다. 예를 들어, 유전자 도입된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 식물 세포에 존재하는 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 유전자 도입 여부를 확인할 수 있다 (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)). 한편, 유전자 도입 시 이용되는 벡터에 β-글루쿠로니다아제 유전자가 있는 경우에는 유전자가 도입된 잎 조직의 일부를 X-gluc (5-Bromo-4-Chloro-3-Indole-β-D-Glucuronic Acid) 등의 기질 용액에 침지시켜 발색되는 양상을 육안으로 관찰함으로써 유전자 도입 여부를 용이하게 확인할 수 있다 (Jefferson, R.A., Plant Mol. Biol. Rep., 5:387(1987)).

본 발명의 방법은 다양한 식물체에 적용되지만, 바람직하게는 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채에 적용된다.

본 발명의 유전자 도입 식물체, 즉 일시적 형질감염 식물체의 조직 (예: 잎)으로부터 CS 단백질을 얻을 수 있으며, 상기 조직으로부터 얻은 추출액을 통상적인 정제과정을 거쳐 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 정제 단계는 당업계에서 통상적으로 이용되는 정제방법을 채용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리 (solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 정제하게 된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 재조합 CS 단백질의 N-말단에 6 x His이 있는 경우에는, Ni-NTA His-결합 레진 컬럼을 이용하여 소망하는 재조합 GM-CSF 단백질을 신속하고 용이하게 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 일시적 형질감염 식물체를 이용함으로써 단기간에 저렴한 비용으로 재조합 CS 단백질을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 생산된 CS 단백질은 천연 (natural-occurring) CS 단백질과 동일한 항원-항체 반응을 유도할 수 있다.

CS 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 식물체를 제조하기 위한 다른 접근 방법은 CS 단백질을 안정적으로 발현하는 형질전환 식물체를 이용하는 것이다.

따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명의 식물발현용 벡터를 식물세포에 도입하는 단계; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계를 포함하는 재조합 CS 단백질을 안정되게 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 본 발명의 방법에 의해 제조된 재조합 CS 단백질을 안정되게 발현하는 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명의 식물발현용 벡터를 식물세포에 도입하는 단계; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 형질전환 식물체로부터 재조합 CS 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 재조합 CS 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 방법에 의해 제조된 재조합 CS 단백질을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982) 및 Saul, M. et al., Plant Molecular Biology Manual, Vol. A1, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988)), 입자총 방법 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990) 및 Christou, P., Trends Plant Sci. 1:423-431(1996)) 및 아그로박테리움-매개 형질전환 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호)을 포함한다. 이 중에서, 아그로박테리움-매개 형질전환이 가장 바람직하다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 일반적으로 잎 디스크, 그리고 다른 조직 (자엽 및 배축)을 가지고 실시된다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 쌍자엽 식물에서 가장 효율적이다.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제 (예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (Bhojwani, S.S. et al., Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Elsevier Science, New York, (1983); 및 Lindsey, K., Ed., Plant Tissue Culture Manual, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, (1991)). 형성된 형질전환 발근 신초는 적합한 식물 성장 배지에 치상된다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).

한편, 본 발명자들은 신규한 형질전환 식물체 (예: 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채)를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 특정 식물체의 형질전환을 위한 가장 효율적인 방법을 구축하였다. 이러한 방법은 PCT/KR02/01461, PCT/KR02/01462 및 PCT/KR02/01463에 개시되어 있으며, 상기 특허문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 방법은 다양한 식물체에 적용되지만, 바람직하게는 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채에 적용된다.

본 발명에 있어서, 바람직한 형질전환 방법은 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템을 이용하여 실시된다.

아그로박테리움 시스템을 이용하는 방법에 있어서, 구체적인 일 실시예는 다음의 단계를 포함한다: (a') 식물 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음의 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)로 식물체의 익스플랜트를 감염시키는 단계: (ⅰ) 서열목록 제 1 서열에 기재된 CS 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b') 상기 감염된 익스플랜트를 재분화 배지에서 재분화하여 재분화 신초를 얻는 단계; 및 (c') 상기 재분화 신초를 발근 배지에서 배양하여 형질전환 식물체를 얻는 단계.

상기한 구체적인 일 실시예에서, 형질전환에 적합한 익스플랜트는 발아된 종자로부터 유래된 어떠한 조직도 포함하며, 바람직하게는 자엽 및 배축이고, 가장 바람직하게는 자엽이다. 종자의 발아는 적합한 배지를 이용하여 적합한 암/광조건 하에서 실시된다. 식물 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스를 가지고 실시된다 (Depicker, A. et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)).

보다 바람직하게는, pBin19, pRD400 및 pRD320과 같은 바이너리 벡터 시스템 이 이용된다 (An, G. et al., Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986)). 본 발명에 적합한 바이너리 벡터는 (i) 식물에서 작동하는 프로모터; (ii) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 구조 유전자; 및 (iii) 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 바이너리 벡터에 이용되는 프로모터의 예는 CaMV 35S 프로모터, 1 프로모터, 2 프로모터 및 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 익스플랜트의 감염은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 감염 과정은 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물에 자엽을 함침시켜 공동배양하는 과정을 포함한다. 이에 의해 아그로박테리움 튜머페이션스는 식물내로 감염된다.

아그로박테리움 튜머페이션스에 의해 형질전환된 익스플랜트는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 신초의 재분화를 성공적으로 야기한다. 최종적으로, 발근 배지에서 재분화된 신초의 발근에 의해 형질전환 식물이 생산된다.

본 발명에 따라 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인된다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다 (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)).

형질전환체에서 발현된 CS 단백질은 형질전환 식물체의 다양한 기관 (예: 줄기, 잎, 뿌리, 열매, 종자 등)으로부터 유래된 조직으로부터 얻을 수 있으며, 상기 조직으로부터 얻는 추출액을 통상적인 정제과정을 거쳐 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 정제 단계는 당업계에서 통상적으로 이용되는 정제방법을 채용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리 (solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 정제하게 된다.

본 발명의 방법에 따르면, CS 단백질을 대량으로 저비용으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 생산된 CS 단백질은 천연 (natural-occurring) CS 단백질과 동일하게 항원-항체 반응을 유도한다. 따라서, 본 발명의 CS 단백질은 말라리아의 진단에 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 시험 대상의 개체로부터 시험액 (testing fluid)을 수득하는 단계; (b) 상기 본 발명의 CS (Circumsporozoite) 단백질을 항원으로 이용하여 상기 시험액과 항원-항체 반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 항원-항체 반응의 발생 (occurrence) 여부를 측정하는 단계를 포함하는 말라리아의 항체 측정 방법을 제공한다.

본 발명에서는 다양한 생체액 (예: 혈액, 혈청, 오줌, 땀 등)에 적용될 수 있지만, 바람직하게는 혈액이고, 보다 바람직하게는 혈청이다.

본 발명의 방법은 항원-항체 결합을 원리로 하는 모든 면역분석방법 (immunoassay)이 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assy) 방법에 따라 실시하는 것이다. 보다 구체적으로는, (ⅰ) 웰 플레이트에 항-인간 항체를 흡착시키는 단계; (ⅱ) 상기 웰 플레이트에 검체의 혈청을 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계; (ⅲ) CS 단백질을 첨가하여 반응시키는 단계; (ⅳ) CS 단백질에 대한 단일클론 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; (ⅴ) 상기 웰 플레이트를 세척한 후 발색효소 또는 형광물질이 결합된 2차 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (ⅵ) 2차 항체의 결합여부를 측정하는 단계를 포함하는 방법으로 실시된다.

상기 발색 효소는 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 페록시다아제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알칼린 포스파타아제를 이용하는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), ECF 기질 등이 이용되고, 호스 래디쉬 페록시다아제를 이용하는 경우에는 기질로서 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, 루미놀, ABTS (2,2´-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 등이 이용된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 CS 단백질을 항원으로 포함하는 말라리아의 항체 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트가 포함하는 CS 단백질은 식물체에서 발현된 재조합 단백질로서, 인간 및 동물에는 감염성이 없으면서, 삼일열 말라리아 항체에 대한 특이성 및 민감성이 매우 우수하며, 이러한 사실은 하기의 실시예에 증명되어 있다.

본 발명의 키트가 기본적으로 ELISA 용으로 개발되는 경우에는, 플레이트 (또는 CS 항원 단백질로 표면 코팅된 플레이트), 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: CS 단백질의 신규 유전자의 합성

천연의 CS 단백질의 유전자와 동일하게 37개의 아미노산 (참조: 서열목록 제 2 서열)을 암호화하면서도, 기존의 CS 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과는 다르게, 식물체가 선호하는 최적의 뉴클레오타이드 서열을 디자인하였다. 신규 유전자의 디자인 기준은, 첫째, GC 함량을 50% 이상으로 하고, 식물이 선호하는 코돈을 갖도록 하였으며, 그리고 인트론 유사 서열을 제거하는 것이다. 이렇게 디자인된 뉴클레오타이드 서열은 Plant Biotechnology Institute (이하 "PBI"로 표시), National Research Centre (SK, 캐나다)에서 화학적으로 합성하였다. 합성된 CS 단백질을 코딩하는 DNA는 서열목록 제 1 서열에 기재되어 있다.

실시예 2: CS 단백질 유전자의 식물 발현용 벡터의 제작

CS 단백질을 코딩하는 합성 유전자는 111 bp로 구성되어 있으며, 5'-말단에 XbaI과 3'-말단에 BamHI의 인식부위를 가질 수 있도록 합성되어 있다.

식물 발현용 바이너리 벡터인 pHS737 (PBI, National Research Centre, 캐나다)을 제한효소 XbaI과 BamHI 효소로 함께 처리하여 절단한 후 분리·정제하였다. 상기 111 bp 합성 유전자와 절단된 pHS737 벡터를 혼합하고, 이 혼합물에 라이게이션 완충액 (KOSCO, 한국) 및 T4 리가아제 (KOSCO, 한국)를 첨가한 후 1시간 이상 16℃에서 반응 시켰다. 그런 다음, 반응물을 CaCl₂로 처리된 컴피턴트 세포 E. coli strain DH5α(Promega, 미국)에 형질전환시킨 후 항생제 카나마이신 (100 mg/㎖)이 포함된 LB 배지에서 항생제 저항성 균주를 선별하였다.

선발된 클론으로부터 알칼리 방법을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였고, 정방향 프라이머 5'-AAT CTA GAA TCT AGA AAT GAG-3'과 역방향 프라이머 5'-AAG GAT CCC GGA TCC CCT TAA-3'를 사용해서 중합효소연쇄반응 (PCR)을 실시하였다. PCR 증폭에서 이용된 효소는 Taq 중합효소 (솔젠트, 한국)이고, 온도 조건은 다음과 같이 세팅하였다: 96℃에서 2분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 연결반응, 72℃에서 2분간의 중합반응을 35회 반복하였고, 추가로 72℃에서 10분간 연장 반응을 하였다.

이어, 증폭 생성물을 1.0% 아가로스 겔에서 분석하여 목적하는 인서트 서열이 플라스미드에 있음을 확인하였다.

실시예 3: 식물체로의 CS 단백질 유전자 도입

실시예 3-1: 아그로박테리움 튜머페이션스 ( Agrobacterium tumefaciens ) GV3101 감염 배양액의 제조

실시예 2에서 제작한 재조합 pHS737/CSP 벡터를 접합 (conjugation)에 의하여 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101 (Mp90)에 도입하였다 (Plant-cell-rep., 15(11):799-803(1996)). 재조합 pHS737/CSP 벡터를 가진 대장균 S17-1과 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101 (Mp90)를 각각 액체 LB배지에서 대수기까지 배양하였다. 이들 각각의 세포들을 에펜도르프 튜브에 1:1로 함께 혼합한 다음 30초간 원심분리하여 세포들을 농축시킨 후 28℃에서 1-2일 동안 정치배양을 하였다. 시간이 경과한 세포들이 든 에펜도르프 튜브는 살살 흔들어 주어 농축된 세포를 부유화시킨 다음, 50 mg/L 카나마이신 및 30 mg/L 겐타마이신이 첨가된 LB 고체배지에 도말한 다음, 28℃에서 2일 동안 배양한 후 콜로니를 선별하였다. 상기 벡터가 도입된 균주를 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101-pHS737/CSP로 명명하였다 (Alt-Morbe et al., J. Bacteriol. 178:4248-4257(1996)).

pHS737/CSP를 갖는 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101-pHS737/CSP 를 액체 LB 배지에 접종한 후 28℃에서 2일간 배양하여 종균 (seed culture)으로 사용하였다. 충분히 배양된 종균을 액체 LB 배지에 최종 배양 볼륨의 1/50과 항생제 (50 mg/L Kanamycin)를 넣고 600 nm에서 흡광도 1.5 에 도달할 때까지 약 18시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 상온에서 3500 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음, 균체를 10 mM MgCl₂ 용액 (BA 0.2 ppm, 아세토시링곤 150 μM 함유)에 현탁한 후 3시간 이상 상온에서 적응시킨 후 식물체의 감염에 사용하였다.

실시예 3-2: 식물세포의 준비 및 아그로인필트래이션

먼저 소독한 담배 (Nicotina bentamiana)의 종자를 파종하여 3 주 이상 배양한 후 온실에서 순화시켰다. 순화된 식물체의 잎사귀에 CS 단백질 유전자를 가진 pHS737 벡터(pHS737/CSP)를 갖는 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101(Mp90)를 실시예 3-1에서 제시된 방법으로 감염용 배양액을 제조한 후 액을 바늘을 제거한 1 ㎖ 주사기 ((주) 녹십자)에 삽입 후 이를 잎의 뒷면에 고르게 퍼질때까지 주입하였다. 잎 전체에 균을 주입하면 잎이 무거워 식물체 자체가 쓰러지거나 엽병이 부러지는 경우가 발생할 수 있어 주의하여 주입하였다. 아그로박테리움이 주입된 식물체는 10분에서 1시간이 경과하면 원래의 상태를 회복하게 된다. 아그로박테리움이 주입된 식물체는 배양 3일이 경과한 후 5일 이내에 수확하여 실시예 4의 방법을 이용하여 분석하였다.

실시예 4: 유전자 도입 식물체에서 도입 유전자 발현 확인을 위한 표지인자 분석

상기 실시예 3에서 확보한 식물체의 유전자 발현 확인은 다음과 같이 실시하였다: 베타-글루쿠로니다아제 (β-glucuronidase, GUS) 리포터 유전자 (reporter gene)의 발현을 확인하기 위해 잎을 채취한 다음, GUS 분석 용액 (X-gluc (5-Bromo-4-Chloro-3-Indole-β-D-Glucuronic Acid), 1 mg/㎖) 200 ㎕를 잎이 들어있는 용기에 넣고 진공기 (vacuum)를 이용하여 완전히 젖을 때까지 진공을 유지한다. 그 후 발색되는 양상을 육안으로 관찰하여 유전자의 도입 및 발현을 확인하였다. 유전자가 도입된 잎의 세포들은 리포터 유전자인 베타-글루쿠로니다아제 가 발현되면 효소인 베타-글루쿠로니다아제가 생성되며 여기에 X-gluc용액을 첨가하면 베타-글루쿠로니다아제가 X-gluc를 분해하면서 색소가 생성되어 세포들이 파란색을 나타낸다. 본 발명에서 유전자가 도입된 잎은 리포터 유전자인 베타-글루쿠로니다아제가 발현되어 파란색을 나타내어 유전자의 도입되어 발현되었음을 확인하였다.

실시예 5: 유전자 도입 식물체에서 CS 단백질의 분리 및 정제

적당량의 액체질소가 들어있는 막자사발에 형질전환 식물체의 잎 1 g을 잘라서 넣고 식물조직을 분쇄하였다. 식물 생중량 0.5 g 당 단백질 분해효소 억제제-함유 추출완충액 (250 mM 수크로스, 1 M Hepes, 1 mM MgCl₂, 1 mM DTT) 2 ㎖를 첨가하여 미세하게 갈았다. 추출액을 12,000 rpm, 4℃에서 30분 이상 원심분리한 후 상등액을 취하여 새 튜브로 옮겼다. 이 용해된 세포용액을 니켈 수지가 함유된 프로본드 (Probond) 컬럼 (Quiagen GmbH, 독일)에 첨가하여 실온에서 10분간 약하게 흔들어주면서 세포용액내의 CS 단백질이 니켈 수지에 잘 흡착되도록 하였다.

CS 단백질이 흡착된 수지를 동량의 pH 7.8 흡착 완충용액 (20 mM 소듐 포스페이트, 500 mM 소듐 클로라이드)으로 2회 세척하여 수지에 흡착된 식물세포 유래 단백질을 제거하였다. 이와 같이 세척된 수지에 동량의 pH 6.0 세척 완충용액 (20 mM 소듐 포스페이트, 500 mM 소듐 클로라이드)을 첨가하여 실온에서 약하게 흔들어주어 수지를 재차 세척하고, 다시 동량의 pH 4.0 용출 완충용액 (20 mM 소듐 포스페이트, 500 mM 소듐 클로라이드)을 첨가하여 CS 단백질을 용출시켰다.

유전자 도입 식물체에서 발현된 CS 단백질은 아미노 말단에 6개의 히스티딘 잔기를 가지고 있어 양이온을 띠는 니켈 수지에 결합되어 쉽게 분리된다. 이러한 과정을 거쳐 식물세포 단백질들이 모두 제거된 CS 단백질만을 순수하게 정제하였다. 이와 같이 용출된 단백질을 센트리콘 (Amicon Co., U.S.A.)을 사용하여 농축하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, CS 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동한 후 쿠마시블루로 염색한 결과 야생형 담배에서는 검출되지 않는 10.1 kD의 CS 단백질이 세포 용출액에서 검출되었고, 특히 니켈 수지 칼럼으로 용출한 경우는 식물세포 단백질이 모두 제거된 순수한 CS 단백질이 검출됨을 확인하였다.

상기의 방법으로 정제된 CS 단백질에 브래드포드 (Bradford) 방법에 의해 염색제 (Protein assay kit, Bio-Rad)를 넣고 UV-분광광도계로 595 nm에서 흡광도를 측정하고 BSA (Bovine Serum Albumin) 표준물질과 비교해서 단백질 정량을 실시하였다. 추출된 단백질은 양이 동일하도록 조정하여 각 시료를 8% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 하였고, 이에 대해 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다 (참조: Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press). 웨스턴 블럿 분석은 아래와 같은 방법으로 시행되었다. 상기 SDS-PAGE 겔에 있는 단백질을 Semi-Dry Transfer Units (Hoefer, 미국)를 이용하여 PVDF 막으로 이동시켰다. 겔에 있는 단백질 전부가 PVDF 막에 이동한 것을 확인한 다음 PVDF막을 건조시켰다. 이 PVDF막을 CS 단백질 항원에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체 (Centers of disease control, Georgia, USA)가 첨가된 0.5% BSA/TBS (Tris-Buffered Saline) 용액에 1시간 동안 반응시킨 다음 TBS 용액으로 PVDF 막을 5분씩 세 번 세척하였다. 그런 다음 퍼옥시다아제 표지 2차 항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)와 1시간 동안 반응시킨 후 다시 TBS 용액으로 PVDF 막을 10분씩 세 번 세척하였다. 마지막으로 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)을 첨가된 왼충액에 PVDF 막을 넣고 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 그 결과를 판독하였다 (참조: 도 2). 도 2 에서 확인할 수 있듯이, 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과 상기 결과와 동일하게 10.1 kD의 CS 단백질이 확인되었다.

실시예 6: CS 단백질이 흡착된 96-웰 플레이트를 이용한 말라리아의 진단

실시예 6-1 : CS 단백질에 대한 항체 역가 측정

유전자 도입 식물체에서 분리·정제된 CS 단백질을 말라리아의 진단에 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, CS 단백질의 항원-항체 반응을 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 측정하였다.

정제된 CS 단백질을 인산염 완충용액에 연속적으로 희석하여, 웰당 100 ㎕ 씩 분주한 후, 4℃에서 8시간 이상 방치하여 항원을 웰에 고정시켰다. 단백질 항원이 흡착된 플레이트를 세척 완충용액 (0.05 % Tween 20, 0.01 M 인산염, pH 7.6)으로 3회 세척하여 플레이트에 흡착되지 못한 항원을 제거하고, CS 단백질 항원에 대한 단일클론항체 (Centers of disease control, Georgia, USA)를 희석액 (0.1% BSA, 0.05% Tween 20, 20 mM Trisma base, 150 mM NaCl)에 일정 희석배수로 희석하여 웰 당 100 ㎕ 씩 분주한 후 실온에서 1시간 이상 반응시켜 항원-항체반응을 유도하였다. 그런 다음 세척 완충용액으로 각각의 웰을 3회 세척한 후에 블롯킹 완충액을 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 상기와 동일하게 세척하였다.

퍼옥시다아제 표지 2차 항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)를 분주하고 상기와 동일하게 반응 및 세척하였다. 마지막으로 각 웰에 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 ELISA 판독기 (ELISA Reader, Titertek, USA) 로 405 nm 파장에서 그 결과를 판독하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 표의 가로축은 정제된 삼일열 말라리아의 CS 단백질의 희석 배수를 나타내며 (희석 전 양: 62.5 ng, 20480 배 희석: 30 pg), 세로축은 상기 단백질에 대한 항체의 초기 역가를 1로 보았을 때 희석한 배수를 나타낸 것이다. 표 1에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 CS 단백질은 우수한 항원성을 나타낸다.

도 3은 정제된 삼일열 말라리아의 CS 단백질 36 pg과 반응하는 항체 역가군을 야생형 식물체에서 분리한 단백질과 비교하여 도식화 한 것이다. 그림에서와 같이 재조합 식물체에서 분리 정제한 CS 단백질의 항원성은 탁월하게 나타났으며, 이와 비교하여 야생형 식물체에서 분리한 단백질은 전혀 항원성을 나타내지 않았다.

	CS 단백질의 희석 배수
항체 희석배수	10	20	40	80	160	320	640	1280	2560	5120	10240	20480
100	< 3.0	< 3.0	< 3.0	< 3.0	2.73	2.31	2.21	2.18	2.11	1.92	1.71	1.51
200	< 3.0	< 3.0	< 3.0	2.91	2.46	2.22	2.09	2.03	2.03	1.83	1.60	1.40
400	< 3.0	< 3.0	2.94	2.79	2.30	2.19	2.00	2.01	1.98	1.67	1.55	1.37
800	2.98	2.95	2.75	2.61	2.11	2.05	1.99	1.95	1.93	1.54	1.50	1.20
1600	2.79	2.63	2.51	2.35	1.98	1.83	1.80	1.78	1.81	1.48	1.32	1.13
3200	2.65	2.40	2.31	2.26	1.89	1.77	1.70	1.45	1.77	1.24	1.13	0.89
6400	2.37	2.32	2.19	2.15	1.73	1.61	1.45	1.19	1.64	1.15	0.89	0.67
12800	2.16	1.94	1.75	1.67	1.31	1.27	0.94	0.9	0.65	0.66	0.65	0.61

실시예 6-2 : 말라리아의 진단

유전자 도입 식물체에서 분리·정제된 CS 단백질을 실질적으로 말라리아의 진단에 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 말라리아 환자의 혈청 내의 항체 역가를 측정하였다.

96-웰 마이크로타이터 플레이트에 인산염 완충용액으로 일정량 희석된 항-인간 IgM 항체 (goat anti-human IgM, KPL, U.S.A.) 를 웰당 100 ㎕ 씩 분주한 후, 4℃에서 8시간 이상 방치하여 항체를 웰에 고정시켰다. 항체가 흡착된 플레이트를 세척 완충용액 (0.05 % Tween 20, 0.01 M Phosphate, pH 7.6)으로 3회 세척하여 플레이트에 흡착되지 못한 항체를 제거하고, 환자 혈청을 희석액 (0.1% BSA, 0.05% Tween 20, 20 mM Trisma base, 150 mM NaCl)에 일정 희석배수로 희석하여 웰 당 100 ㎕ 씩 분주한 후 실온에서 1시간 이상 반응시키고 상기와 동일한 세척액으로 3회 세척하였다.

농도별로 희석액에 용해된 CS 단백질 항원을 각 웰에 100 ㎕ 씩 분주한 후 실온에서 1시간 이상 방치하여 2차 항원-항체반응을 유도하였다. 다시 세척 완충용액으로 각각의 웰을 세척한 후에 희석액에 10 ug/㎖ 농도로 용해된 CS 항원 단백질에 대한 단일클론항체 (Centers of disease control, Georgia, USA)를 각 웰당 100 ㎕씩 분주하여 실온에서 1 시간 동안 반응시킨 후 세척액으로 3회 세척하였다.

그런 다음, 퍼옥시다아제 표지 2차 항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)를 분주하고 상기와 동일하게 반응 및 세척하였다. 마지막으로 각 웰에 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 ELISA 판독기 (ELISA Reader, Titertek, USA) 로 405 nm 파장에서 그 결과를 판독하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 결과는 흡광도 값이 1.5 이상인 희석배수를 양성으로 판독하였다.

번호	혈청	항체 역가
1	환자 1	800
2	환자 2	400
3	환자 3	6400
4	환자 4	6400
5	환자 5	1600
6	환자 6	6400
7	환자 7	200
8	환자 8	400
9	환자 9	25600
10	환자 10	6400
11	정상인 1	< 100
12	정상인 2	< 100
13	정상인 3	< 100
14	정상인 4	< 100
15	정상인 5	< 100
16	정상인 6	< 100
17	정상인 7	< 100
18	정상인 8	< 100
19	정상인 9	< 100
20	정상인 10	< 100

표 2에 나타낸 바와 같이, 정상인의 혈청은 항체 역가가 모두 100 이하를 나타낸 반면, 말라리아 환자의 혈청에서는 항체 역가가 200-25600을 나타내어 말라리아 환자와 정상인의 감별이 뚜렷하게 나타났다. 이는 유전자 도입 식물체에서 분리한 삼일열 말라리아의 CS 단백질 항원을 이용한 항원-항체 반응이 높은 특이성으로 발생함을 보여주는 것으로서, 이를 통해 말라리아 환자를 감별할 수 있음을 확인할 수 있다.

또한, ELISA 결과를 보여주는 도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의해 생상된 재조합 CS 단백질은 말라리아 질병이 있는 사람의 혈청 내에 있는 항체와 반응하여 양성의 항원-항체 반응을 나타냄을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 CS (Circumsporozoite) 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 CS 단백질의 식물발현용 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 재조합 CS 단백질을 일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체 및 재조합 CS 단백질을 안정되게 발현하는 형질전환 식물체를 제공한다. 한편, 본 발명은 재조합 CS 단백질의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, CS 단백질을 대량으로 저비용으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 생산된 CS 단백질은 천연 CS 단백질과 동일한 항원-항체 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 CS 단백질은 우수한 민감도 및 특이성으로 말라리아의 진단에 이용될 수 있다.

도 1은 유전자 도입 식물체에서 발현된 CS 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 결과 사진. M, 분자량 마커; 레인 W, 야생종 담배의 단백질; 및 레인 T, 유전자 도입 식물체 내 발현된 CS 단백질.

도 2는 유전자 도입 식물체에서 발현된 CS 단백질의 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여주는 사진. 레인 W, 야생형 담배; 레인 T, 유전자 도입 식물체.

도 3은 유전자 도입 식물체에서 발현된 CS 단백질의 항원성을 보여주는 그래프. 사용된 CS 단백질량 36 pg; Y 축, 405 nm에서의 흡광도 값; X 축, CS 단백질 항원에 대한 단일클론항체의 희석배수.

도 4는 유전자 도입 식물체에서 발현된 재조합 CS 단백질의 항원성을 ELISA 플레이트 사진. 가로: (+), E. coli에서 발현된 양성 대조군; (-), 야생형 담배; 1-2, 유전자 도입 담배에서 발현된 MSP (malaria merozoitic suface protein); 3-4 유전자 도입 담배에서 발현된 CS 단백질. 세로: 1-6, 말라리아 감염된 사람의 혈청; 7, 정상 혈청; (-) PBS 완충액.

<110> NEXGEN BIOTECHNOLOGIES, INC. <120> Circumsporozoite Protein of Malaria Expressed in Plants and Diagnostic Kit Comprising the Same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the nucleotide sequence coding for circumsporozoite protein <220> <221> CDS <222> (1)..(111) <400> 1 atg ggt gat gga gct gca gga caa gct gct ggt gat gga gct gca ggt 48 Met Gly Asp Gly Ala Ala Gly Gln Ala Ala Gly Asp Gly Ala Ala Gly 1 5 10 15 caa gca gct ggt gat aga gct gca gga caa cct gca gga gat aga gct 96 Gln Ala Ala Gly Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala 20 25 30 gca ggt caa cca gct 111 Ala Gly Gln Pro Ala 35 <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Met Gly Asp Gly Ala Ala Gly Gln Ala Ala Gly Asp Gly Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Gly Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala 20 25 30 Ala Gly Gln Pro Ala 35

Claims (11)

1. 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 말라리아의 CS (Circumsporozoite) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
2. (ⅰ) 상기 제 1 항의 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질의 식물발현용 벡터.
3. 다음의 단계를 포함하는 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질을 일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체의 제조방법:

   (a) 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터를 식물체의 식물세포로 도입되는 단계; 및

   (b) 상기 식물세포에 유전자 도입이 되었는 지 여부를 확인하는 단계.
4. 상기 제 3 항의 방법에 의해 제조된 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질을일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체.
5. 다음의 단계를 포함하는 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질의 제조방법:

   (a) 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터를 식물세포로 도입되는 단계;

   (b) 상기 식물세포에 유전자 도입이 되었는 지 여부를 확인하는 단계; 및

   (c) 유전자가 도입된 식물세포를 포함하는 식물체로부터 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질을 수득하는 단계.
6. 다음의 단계를 포함하는 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질을 안정되게 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법:

   (a) 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터를 식물세포에 도입하는 단계;

   (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; 및

   (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
7. 상기 제 6 항의 방법에 의해 제조된 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질을안정되게 발현하는 형질전환 식물체.
8. 다음의 단계를 포함하는 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질의 제조방법:

   (a) 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터를 식물세포에 도입하는 단계;

   (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계;

   (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계; 및

   (d) 상기 형질전환 식물체로부터 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질을 수득하는 단계.
9. 상기 제 5 항 또는 제 8 항의 방법에 의해 제조된 재조합 CS (Circumsporozoite) 단백질.
10. 상기 제 9 항의 CS (Circumsporozoite) 단백질을 항원으로 포함하는 말라리아의 항체 검출용 키트.
11. 다음의 단계를 포함하는 말라리아의 항체 측정 방법:

    (a) 시험 대상의 개체로부터 시험액 (testing fluid)을 수득하는 단계;

    (b) 상기 제 9 항의 CS (Circumsporozoite) 단백질을 항원으로 이용하여 상기 시험액과 항원-항체 반응을 유도하는 단계; 및

    (c) 상기 단계 (b)에서 항원-항체 반응의 발생 (occurrence) 여부를 측정하는 단계.