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KR20040108081A - Antioxidant and anti-aging effects of dimethyl lithospermate derived from a Salvia miltiorrhiza - Google Patents

Antioxidant and anti-aging effects of dimethyl lithospermate derived from a Salvia miltiorrhiza Download PDF

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Publication number
KR20040108081A
KR20040108081A KR1020030038823A KR20030038823A KR20040108081A KR 20040108081 A KR20040108081 A KR 20040108081A KR 1020030038823 A KR1020030038823 A KR 1020030038823A KR 20030038823 A KR20030038823 A KR 20030038823A KR 20040108081 A KR20040108081 A KR 20040108081A
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KR
South Korea
Prior art keywords
dimethyl
resource
permate
peroxynitrite
antioxidant
Prior art date
Application number
KR1020030038823A
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Korean (ko)
Inventor
정해영
최재수
김형석
이지영
Original Assignee
부산대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

PURPOSE: Provided are an antioxidant and an anti-aging agent which contain, as an active ingredient, dimethyllithospermate derived from Salvia miltiorrhiza. Therefore, the antioxidant and an anti-aging agent effectively inhibit aging caused by oxidative damage of the cell. CONSTITUTION: The antioxidant and anti-aging agent are characterized by containing dimethyllithospermate of the formula(1) as an active ingredient. The dimethyllithospermate displays antioxidation activity in the cell, inhibits by antioxidation activity and protects proteins which participate in maintaining homeostasis inn the cell.

Description

단삼유래 천연물 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 하는 항산화제 및 항노화제 {Antioxidant and anti-aging effects of dimethyl lithospermate derived from a Salvia miltiorrhiza}Antioxidants and Anti-aging Agents Using Natural Saliva Dimethyl Resources Permate as an Active Ingredient {Antioxidant and anti-aging effects of dimethyl lithospermate derived from a Salvia miltiorrhiza}

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 단삼 유래의 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 함유하는 항산화용 및 항노화용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for anti-oxidation and anti-aging containing dimethyl resources permate derived from Salvia soybean represented by the following formula (1) as an active ingredient.

dimethyl lithospermate (DML)dimethyl lithospermate (DML)

노화란 생명체가 겪는 불가피한 현상으로, 시간에 따른 생체의 기능적 손실을 의미하며 노화에 따른 세포의 기능적 손실은 곧 조직의 손상과 생체 내 저항력의 소실을 초래하게 되고, 궁극적으로는 세포와 신체 전체의 사망에 이르게 되는 현상이다. 또한, 인간에서의 노화과정이란 수십년에 걸쳐 일어나는 오랜 시간 동안의 퇴행적 변화이므로 이 변화들이 적절히 조절되지 않을 경우 병적 노화, 즉 동맥경화를 비롯한 암, 당뇨병, 치매등과 같은 여러 노인성 질환의 유발요인이 된다.Aging is an inevitable phenomenon of living organisms, which means the functional loss of living organisms over time, and functional loss of cells with aging leads to tissue damage and loss of resistance in vivo. It is a phenomenon that leads to death. In addition, the aging process in humans is a long-term degenerative change that occurs over several decades, so if these changes are not properly controlled, pathological aging, including atherosclerosis and other senile diseases such as cancer, diabetes, and dementia, is caused. It becomes a factor.

호기성 생물체는 생명현상을 유지하기 위해 일어나는 여러 대사과정에서 끊임없이 생성되는 활성산소에 노출되어 있다. 노화란 이러한 활성산소가 체내에 지속적으로 생성 축적됨으로써 이들을 제거하는 체내 항산화능과의 불균형으로 과도한 산화적 스트레스의 환경에 놓이게 되어 세포내 항상성이 깨어지면서 생명분자들의 기능저하를 비롯한 세포사의 유발 현상이다. 활성산소란 짝을 이루지 못한 독신전자를 가진 불안정한 산소 화합물 (free radical: ·O2 -, OH, LOO, LO 등) 혹은 반응성이 큰 산소화합물 (H2O2,1O2등)로써, 질소 유래 라디칼(NO, NO2, HNO2, NO3, ONOO-)과 함께 세포막, 지질, 단백질, 핵산에 작용하여 세포기능을 유지하기 위한 세포소기관인 미토콘드리아, 마이크로좀의 장해, 세포막의 파괴, 세포에너지 생성의 감소, 물리적 압박등을 초래함으로써 세포손상을 야기시켜 결국 세포사를 일으키게 된다. 특히, 생체 내에서는 ·NO와 ·O2 -가 동시에 발생하는 조건에서 라디칼-라디칼 반응으로 비라디칼 페록시나이트라이트 (ONOO-)가 쉽게 생성된다. ONOO-의 독성 작용은 알쯔하이머, 암, 관절염, 동맥경화, 피부 염증 및 여러 가지 노인성 질환이 관련되는 것으로 보고되고 있다. 특히, 생체에는 이를 제거하는 특이적 효소가 없으므로 이로 인한 세포손상으로부터 세포를 보호할 수 있는 효과적인 항산화, 항노화제 개발을 위한 연구가 절실히 요구된다.Aerobic organisms are exposed to free radicals that are constantly produced by various metabolic processes that occur to sustain life. Aging is a phenomenon in which cell death, including deterioration of biomolecules, is caused by the formation of free radicals in the body and imbalanced with the antioxidant capacity of the body to remove them. . Active oxygen is an unstable oxygen compounds having not paired single E: - by (free radical · O 2, OH, LOO, LO, and so on) or a larger oxygen compound reactive (H 2 O 2, 1 O 2 , etc.), a nitrogen derived radicals (NO, NO 2, HNO 2 , NO 3, ONOO -) and membranes, lipids, proteins, acts on the nucleic acid to the cell organelle is the mitochondria, microsomal the disturbance or destruction of the cell membrane to keep in function, cells with Reduction of energy production, physical pressure, etc. causes cell damage and eventually cell death. In particular, non-radical peroxynitrite (ONOO ) is easily generated by radical-radical reaction under conditions in which · NO and · O 2 occur simultaneously in vivo. The toxic effects of ONOO - are reported to involve Alzheimer's, cancer, arthritis, arteriosclerosis, skin inflammation and various senile diseases. In particular, since there is no specific enzyme that removes it from the living body, research for the development of effective antioxidants and anti-aging agents that can protect the cells from cell damage caused by this is urgently required.

노화에 따른 생체 내 각 조직의 활성산소 생성 증가 및 축적과 이들을 제거하는 항산화능과의 균형이 노화과정을 결정하는 중요한 요소인데, 항산화능의 노화에 따른 변화를 살펴보면 비타민C는 노령자의 혈구, 뇌하수체, 대뇌피질, 심근, 흉근 등에서 감소하며 글루타치온도 여러조직에서 노화에 따라 그 함유량의 저하가 나타난다. 활성산소 제거 효소는 종이나 장기에 따라 다소 차이가 있지만 대체로 고령으로 갈수록 카탈라제, 글루타치온 과산화효소, 글루타치온 환원효소의 활성이 감소한다. 따라서 활성산소 생성량에 대한 그 제거능력의 비가 노화 과정에서 중요한데, 어떤 원인으로 활성산소 발생량이 증가했을 경우 얼마만큼 원활히 항산화 능력의 상승을 유도할 수 있는지가 포인트이다. 그러므로 이러한 것을 포함하는 예비력을 서서히 잃어가는 과정이 보편적인 노화현상이다. 즉 항산화력의 예비력 소실을 잘 보완한다면 노화과정은 조절이 가능할 것이다.The balance between the increase and accumulation of free radicals in each tissue in vivo and the antioxidant ability to remove them is an important factor in determining the aging process. Vitamin C is the blood cell and pituitary gland of the elderly. It decreases in the cerebral cortex, myocardium and pectoral muscle, and the glutathione temperature decreases with age in various tissues. Free radical scavenging enzymes vary slightly depending on species and organs, but generally the activity of catalase, glutathione peroxidase and glutathione reductase decreases with age. Therefore, the ratio of the removal capacity to the amount of free radicals is important in the aging process, and how can the smooth increase in antioxidant capacity is caused when the amount of free radicals is increased due to some cause. Therefore, the process of slowly losing the reserve power including this is a common aging phenomenon. In other words, if the supplementary loss of antioxidant power is well compensated, the aging process will be controllable.

상기에서 언급했듯이 ONOO-는 독성이 매우 강하여 노화는 물론, 여러 가지 질병과 관련되어 있다는 것을 알 수 있다. 따라서 ONOO-의 특성을 검토하고 연구하여 이것을 무독화시키는 방법은 노화과정뿐만이 아니라 노인성 질환을 조절하는데 대단히 중요한 의미를 가진다. 인체 내에서 특이하게 ONOO-를 소거하는 효소가 존재하지 않으므로 내인성 물질과 천연물을 이용하여 ONOO-에 대한 독성을 방지하는 것이 중요하다.As mentioned above, ONOO - is very toxic and can be found to be associated with various diseases as well as aging. Therefore, the method of examining and studying the characteristics of ONOO - and detoxifying it is very important in controlling senile diseases as well as the aging process. Since there is no enzyme that specifically eliminates ONOO - in the human body, it is important to prevent toxicity to ONOO - by using endogenous substances and natural products.

이에 본 발명자들은 천연물 유래 항산화물을 탐색하여 더욱 활성이 강한 물질을 개발하고 그 기전을 규명하고자 단삼으로부터 유효한 항산화, 항노화 성분을 분리하여 발명하였다.Accordingly, the present inventors invented by separating the effective antioxidant and anti-aging components from salvia soybeans to search for a natural-derived antioxidant to develop a more active substance and to elucidate its mechanism.

단삼(Salvia miltiorrhizaBUNGE)은 혈관확장, 혈압강하, 항균작용을 갖는 것으로 알려져 있으며, 또한 임상적으로는 관(冠)부전, 심근경색, 간질환의 만성기, 혈전성 정맥염, 고혈압, 월경곤란증, 월경통, 항균 항암 등에 이용되고 있는 대표적인 양혈활혈약(養血活血藥)이지만, 그 유효성분은 불분명하다. 본 발명자들은 단삼의 강한 페록시나이트라이드 소거작용을 확인하였고, 그 유효성분으로 리소스퍼메이트 및 그 유도체인 디메틸리소스퍼메이트를 분리하였다. 이에 본 발명자들은 퍼옥시나이트라이트에 의한 세포의 산화적 손상과 이에 의한 노화를 억제할 수 있는 물질을 찾고자 연구한 결과, 단삼 성분의 퍼옥시나이트라이트 소거 및 발생 억제 효과를 확인하고, 이는 단삼의 성분 중 디메틸리소스퍼메이트에 의해 특이적으로 억제됨을 밝히고 그 작용기전의 규명을 통해 항산화제 및 항노화제로 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Danshen (Salvia miltiorrhiza BUNGE) is vasodilator, and known to have antihypertensive, antibacterial, and also clinically tube (冠) failure, myocardial infarction, chronic liver disease, thrombophlebitis, hypertension, dysmenorrhea, menstrual cramps Although it is the typical sheep blood sclerosing medicine used for antibacterial anticancer etc., the effective ingredient is unclear. The present inventors confirmed the strong peroxynitride scavenging effect of Salvia soybean, and separated the lysopermate and its derivative dimethyl resource permate as its active ingredient. Therefore, the present inventors have studied to find a substance that can inhibit the oxidative damage of the cells and the aging caused by the peroxy nitrite, and confirmed the peroxy nitrite scavenging effect and inhibiting the development of the Dansam component, The present invention was completed by revealing that it is specifically inhibited by dimethyl resource permate and confirming that the mechanism of action can be used as an antioxidant and an anti-aging agent.

본 발명은 단삼 성분들 중 하나인 디메틸리소스퍼메이트의 항산화 활성을 조사하고, 페록시나이트라이트에 대한 제거 활성과 페록시나이트라이트로부터 야기되는 단백질 니트로화(nitration)의 저해작용에 대한 기전을 밝힘으로써 항산화제 및 항노화제로 유용한 화합물 및 이를 유효 성분으로 하는 약학조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention investigates the antioxidant activity of dimethyl resources permate, one of the components of Salvia Militiorrhiza, and reveals a mechanism for the removal activity against peroxynitrite and the inhibition of protein nitration resulting from peroxynitrite. It is an object of the present invention to provide a compound useful as an antioxidant and an anti-aging agent and a pharmaceutical composition comprising the same as an active ingredient.

본 발명의 기술적 과제는 단삼 유래의 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 소거능 및 생성억제능을 검증하고 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 제거 기전을 밝히고 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 함유하는 항산화제 및 항노화제를 제공함으로써 달성하였다.The technical problem of the present invention is to verify the peroxynitrite scavenging and production inhibitory ability of dimethyl resource permate derived from Salvia Militiorrhiza, revealing the mechanism of removing peroxy nitrite by dimethyl resource permate, and an antioxidant containing dimethyl resource permate as an active ingredient. And anti-aging agents.

도 1은 혈관내피세포에서 SIN-1에 의해 생성촉진된 페록시나이트라이트에 의해 유발된 혈관내피세포의 세포사에 대한 디메틸리소스퍼메이트의 세포사 방어작용을 나타내는 그래프이다.1 is a graph showing the cell death defense action of dimethyl resource permate against cell death of vascular endothelial cells induced by peroxitrite produced by SIN-1 in vascular endothelial cells.

도 2는 AAPH에 의해 유도 생성된 인간피부의 섬유아세포 내 총활성산소종에 대한 디메틸리소스퍼메이트의 생성억제효과에 대한 현미경 사진이다.Figure 2 is a micrograph of the inhibitory effect of dimethyl resource permate on total reactive oxygen species in fibroblasts of human skin induced by AAPH.

도 3은 디메틸리소스퍼메이트의 LPS 주사한 마우스신장에서 촉진된 총활성산소종의 발생에 대한 억제 효과 그래프이다.Figure 3 is a graph of the inhibitory effect on the generation of promoted total reactive oxygen species in the mouse kidneys injected with dimethyl resource permate.

도 4는 디메틸리소스퍼메이트의 LPS 주사한 마우스 혈청에서 발생하는 나이트라이트(NO2)와 나이트레이트(NO3) 생성억제 효과에 대한 그래프이다.4 is a graph showing the effect of inhibiting the production of nitrite (NO 2 ) and nitrate (NO 3 ) generated in LPS-injected mouse serum of dimethyl resource permate.

도 5는 디메틸리소스퍼메이트의 노화 흰쥐의 신장에서 발생하는 페록시나이트라이트 발생억제효과에 대한 그래프이다.5 is a graph showing the effect of inhibiting the generation of peroxynitrite in the kidney of aging rats of dimethyl resource permate.

도 6은 디메틸리소스퍼메이트의 노화 흰쥐의 혈청에서 발생하는 나이트라이트 생성억제효과에 대한 그래프이다.Figure 6 is a graph of the nitrite production inhibitory effect of dimethyl resource permate in the serum of aging rats.

도 7은 디메틸리소스퍼메이트의 노화 흰쥐의 신장에서 발생하는 총활성산소종 발생억제효과에 대한 그래프이다.Figure 7 is a graph of the total inhibitory effect of the generation of free radicals occurring in the kidney of dimethyl resource permate aging rats.

도 8은 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 제거 기전을 나타내는 그래프이다.8 is a graph showing the mechanism for removing peroxynitrite of dimethyl resource permate.

도 9는 디메틸스퍼메이트의 단백질 니트로화(nitration)에 대한 방어작용을 나타내는 그림이다.9 is a figure showing the protective action against nitration of protein of dimethyl spermate.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 단삼 유래의 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 포함하는 항산화용 및 항노화용 조성물에 관한 것이다The present invention relates to a composition for antioxidant and anti-aging comprising dimethyl resources permate derived from Salvia ginseng represented by the following formula (1) as an active ingredient

[ 화학식 1 ][Formula 1]

본 발명은 단삼 유래의 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 소거능을 검증하는 단계; 디메틸리소스퍼메이트의 생체내 페록시나이트라이트 생성억제능을 검증하는 단계; 및 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 제거 기전을 검증하는 단계로 구성된다.The present invention comprises the steps of verifying the peroxynitrite scavenging ability of dimethyl resources permate derived from Salvia Miltiorrhiza; Verifying the in vivo peroxynitrite production inhibitory ability of dimethyl resource permate; And verifying the peroxynitrite removal mechanism of dimethyl resource permate.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 효과를 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the specific configurations and effects of the present invention will be described with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited only to these Examples.

실시예 1 : 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 제거능 및 항산화능 측정Example 1 Determination of Peroxynitrite Removal and Antioxidant Capacity of Dimethyl Resources Permate

(시약)(reagent)

몰포리노신논(SIN-1), 페니실라민, 리포폴리사카라이드는 시그마 화학 주식회사에서, 디하이드로로다민123과 디클로로디하이드로플루오레신 디아세테이트는 몰레큘라 프로브사로부터 구입하였으며, 다이아미노플루오레신은 다이치화학회사에서 페록시니이트라이트는 케이맨사로부터 구입하였다. 케모루미노센스 측정시약은 아머샴 라이프 사이언스사에서 구입하여 사용하였고, 나이트로타이로신 항체는 업스테이트 바이오테크놀러지사에서 구입하였다.Morpholininosinone (SIN-1), penicillamine and lipopolysaccharides were purchased from Sigma Chemical Co., Ltd., dihydrodamine123 and dichlorodihydrofluorescein diacetate from Molecular Probe. Oresin was purchased from Daichi Chemical Co., and peroxynitrite from Cayman. Chemoluminosense measurement reagent was purchased from Amersham Life Science, Inc., and nitrotyrosine antibody was purchased from Upstate Biotechnology.

(실험기기)(Experimental equipment)

바이오테크 인스트루먼트사의 미세판형광 판독기 (FL 500, Bio-Tek Instrument)와 다중촛점 레이져 현미경 (LSM 510, Zeiss Co., Japan)을 이용하였다.A bioplate instrument microplate fluorescence reader (FL 500, Bio-Tek Instrument) and a multifocal laser microscope (LSM 510, Zeiss Co., Japan) were used.

(페록시나이트라이트에 대한 소거효과 측정)(Measurement of scavenging effect on peroxynitrite)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트가 페록시나이트라이트에 대하여 소거작용을 갖는지를 확인하기 위하여 Kooy 등의 방법을 변형하여 디하이드로로다민123의 산화정도를 측정함으로써 수행하였다. 마우스 신장파쇄액에 리포폴리사카라이드의 처리에 의해 유도되는 ·O2와 ·NO에 의해 생성되는 ONOO-소거능을 검토하였다. 90 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘 (pH 7.4) 및 100 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산으로 구성된 완충액에 시료와 페록시나이트라이트 용액을 넣어 산화된 디하이드로로다민 123의 형광강도를 여기파장 480 nm, 방출파장 530 nm인 미세판형광 판독기에서 측정하였다. 이때 IC50은 신장파쇄액에 리포폴리사카라이만 첨가한 형광도 값을 50% 감소시키는데 필요한 리소스퍼메이트의 양 (μM)으로 표 1에 정리하였다.In order to confirm that the dimethyl resource permate of the present invention has an scavenging action with respect to peroxynitrite, the method of Kooy et al. Was modified to measure the degree of oxidation of dihydrodamine 123. The ONOO scavenging ability generated by · O 2 and · NO induced by treatment of lipopolysaccharide in mouse kidney crushed solution was examined. In a buffer consisting of 90 mM sodium chloride, 5 mM calcium chloride (pH 7.4) and 100 mM diethylenetriaminepentaacetic acid, a sample and a peroxynitrite solution were added to emit fluorescence intensity of oxidized dihydrodamine 123 with an excitation wavelength of 480 nm. Measurements were made in a microplate fluorescence reader with a wavelength of 530 nm. At this time, IC 50 is summarized in Table 1 by the amount of resource permate (μM) required to reduce the fluorescence value added only lipopolysaccharase to the kidney crushing liquid by 50%.

단삼으로부터 분리된 리소스메이트들의 페록시나이트라이트 제거효과Peroxynitrite Removal Effect of Resource Mates Isolated from Salvia Miltiorrhiza 화합물compound ONOO-소거 (IC50, μM)ONOO - Clear (IC 50 , μM) 리소스퍼메이트디메틸리소스퍼메이트리소스퍼메이트 B마그네슘 리소스퍼메이트 BNH2/K 리소스퍼메이트 BResource Perm Dimethyl Resource Perm Resource Perm B Magnesium Resource Perm BNH 2 / K Resource Perm B 19.22±0.629.22±0.5717.39±0.2314.67±0.6813.45±0.3019.22 ± 0.629.22 ± 0.5717.39 ± 0.2314.67 ± 0.6813.45 ± 0.30 페니실라민 (penicillamine)Penicillamine 9.29±0.139.29 ± 0.13

(활성산소에 대한 소거효과 측정)(Measurement of scavenging effect on active oxygen)

리포폴리사카라이드에 의해 수퍼옥사이드와 나이트릭옥사이드의 생성을 유도한 신장 파쇄액에 비형광성 2',7'-DCFDA (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 첨가한 후, 디메틸리소스퍼메이트의 첨가에 따른 형광도의 변화를 여기 파장 485 nm 및 방출 파장 530 nm에서 60분 간 10분 간격으로 미세판형광 판독기로 측정하였다. 이때 IC50은 신장 파쇄액에 리포폴리사카라이드만 첨가한 형광도 값을 50% 감소시키는데 필요한 리소스퍼메이트의 양(μM)으로 표 2에 정리하였다.Non-fluorescent 2 ', 7'-DCFDA (2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate) was added to the kidney crushed solution which induced the formation of superoxide and nitric oxide by lipopolysaccharide, followed by dimethyl resource fermate. The change in fluorescence with addition was measured with a microplate fluorescence reader at an interval of 60 minutes at excitation wavelength 485 nm and emission wavelength 530 nm for 60 minutes. At this time, IC 50 is summarized in Table 2 by the amount (μM) of the resource permate required to reduce the fluorescence value added only lipopolysaccharide to kidney crushing liquid by 50%.

단삼으로부터 분리된 리소스퍼메이트들의 총활성산소종 제거효과Removal of Total Reactive Oxygen Species from Resource Permates Isolated from Salvia Miltiorrhiza 화합물compound ROS 소거 (IC50, μM)ROS clearance (IC 50 , μM) 리소스퍼메이트디메틸리소스퍼메이트리소스퍼메이트 B마그네슘 리소스퍼메이트 BNH2/K 리소스퍼메이트 BResource Perm Dimethyl Resource Perm Resource Perm B Magnesium Resource Perm BNH 2 / K Resource Perm B 4.10±0.470.56±0.113.75±0.403.60±0.275.41±0.704.10 ± 0.470.56 ± 0.113.75 ± 0.403.60 ± 0.275.41 ± 0.70 TroloxTrolox 2.49±0.212.49 ± 0.21

(나이트릭옥사이드에 대한 소거효과 측정)(Measurement of scavenging effect on nitric oxide)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트가 나이트릭옥사이드에 대한 소거효과를 검토하기 위해 다이아미노플루오레신 (DAF-2)을 이용하여 폴리사카라이드 처리한 신장 파쇄액으로 형광의 변화를 측정하였다. 이는 나이트릭 옥사이드에 의해 비형광성인 DAF-2가 형광성인 DAF-2T로 산화되기 때문이다. 시료에 니트로플루시드 나트륨, 50 mM 포타슘포스페이트 완충액 (pH 7.4)에 DAF-2 용액을 넣어 37℃에서 5분 간 혼합하였다. 형광의 변화를 여기 파장 495 nm 및 방출 파장 515 nm에서 60분 간10분 간격으로 미세판영광 판독기로 측정하였다. 이때 IC50은 리포폴리사카라이드만 첨가한 형광도 값을 감소시키는데 필요한 디메틸리소스퍼메이트의 양 (μM)으로 표 3에 정리하였다.In order to examine the scavenging effect of the dimethyl resource permate of the present invention, the change in fluorescence was measured with a polysaccharide-treated kidney lysate using diaminofluorescein (DAF-2). This is because non-fluorescent DAF-2 is oxidized to fluorescent DAF-2T by nitric oxide. To the sample was added DAF-2 solution in nitrofluside sodium, 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) and mixed for 5 minutes at 37 ℃. The change in fluorescence was measured with a microplate reader at 10 minute intervals for 60 minutes at an excitation wavelength of 495 nm and an emission wavelength of 515 nm. The IC 50 is summarized in Table 3 by the amount of dimethyl resource permate (μM) required to reduce the fluorescence value added only lipopolysaccharide.

단삼으로부터 분리된 리소스퍼메이트들의 나이트릭옥사이드 제거효과Removal of Nitric Oxides from Resource Permates Isolated from Salvia Miltiorrhiza 화합물compound ·NO 소거 (IC50, μM)NO clearance (IC 50 , μM) 리소스퍼메이트디메틸리소스퍼메이트리소스퍼메이트 B마그네슘 리소스퍼메이트 BNH2/K 리소스퍼메이트 BResource Perm Dimethyl Resource Perm Resource Perm B Magnesium Resource Perm BNH 2 / K Resource Perm B 6.92±0.243.99±0.366.92±0.246.33±0.145.69±0.396.92 ± 0.243.99 ± 0.366.92 ± 0.246.33 ± 0.145.69 ± 0.39 카르복시-PTIO (Carboxy-PTIO)Carboxy-PTIO 6.74±0.076.74 ± 0.07

실시예 2 : 디메틸리소스퍼메이트의 생체내에 페록시나이트라이드 생성억제능Example 2 Inhibition of Peroxynitride Production in Vivo of Dimethyl Resource Fermate

(혈관내피세포의 페록시나이트라이트로 인한 세포사 억제능)(Inhibition of cell death due to peroxynitrite of vascular endothelial cells)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트가 SIN-1처리에 의해 유도된 페록시나이트라이트로 인한 세포사에 대한 억제작용을 측정하기 위하여, 혈관내피세포 (YPEN)에 SIN-1을 처리하여 세포내 페록시나이트라이트의 생성을 유도한 후 세포 생존율을 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT)In order to measure the inhibitory effect on the cell death due to peroxynitrite induced by SIN-1 treatment, the dimethyl resource permate of the present invention was treated with SIN-1 in vascular endothelial cells (YPEN) to treat intracellular peroxynitite. After inducing the production of light, cell viability was reduced to 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium (MTT).

측정법으로 측정하였다. 96 웰 플레이트(well-plate)에 키운 세포에 디메틸스퍼메이트와 SIN-1을 처리하여 24시간 배양한 다음 MTT 50㎕를 가하고 CO2배양기It measured by the measuring method. Treat the dimethyl spur mate with SIN-1 in a 96-well plate cell grown in (well-plate) were incubated 24 hours and then added to CO 2 incubator MTT 50㎕

(5% CO2, 37℃)에서 3시간 배양하여 살아있는 세포의 마이토콘드리아 탈수효소(dehydrogenases)의 환원반응에 의하여 MTT를 포마즌(formazan)으로 변화시킨 후, 생성된 보라색의 결정물질을 완전히 용해시켜 용출되도록 하여 560nm에서 흡광도를 측정하여 비처리 대조군의 % 값으로 도 1에 나타내었다.After incubating for 3 hours at (5% CO 2 , 37 ° C), MTT was changed to formazan by reduction of mitochondrial dehydrogenases of living cells, and then the resulting purple crystalline material was obtained. Completely dissolved and eluted, the absorbance at 560 nm was measured and shown in FIG. 1 as the% value of the untreated control.

실험결과 디메틸리소스퍼메이트는 SIN-1에 의한 페록시나이트라이트로 초래된 세포사의 억제기능이 있는 것으로 나타났다.Experimental results showed that dimethyl resource permate has an inhibitory function on cell death caused by SIN-1 peroxynitrite.

(AAPH 의한 세포내 활성산소종 생성억제 효과 측정)(Measurement of inhibitory effect on the generation of free radical species in cells by AAPH)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트가 2,2 azobis (2-amidino propane) dihydrochloride (AAPH) 처리에 의해 혈관내피세포내 유도된 활성산소종의 생성 억제능을 검토하기 위해, 혈관내피세포를 6-웰 플레이트(well plates)에 2x104/ml로 심은 후 하루 동안 배양한 다음 1, 2, 4 μM의 디메틸리소스퍼메이트와 AAPH를 처리하여 8시간 배양하였다. 배양된 세포는 커버 글래스(cover glass)에서 10 μM의 DCFDA을 가하여 세포내 생성된 활성산소종에 대한 디메틸리소스퍼메이트의 억제를 다중 초점 현미경 (confocal laser scanning microscope) (LSM 510, Zeiss Co., Japan)을 통해 분석하였다. 도 2의 a와 같이 AAPH 처리하지 않은 세포에 비해 AAPH를 도 2의 b, c 각각 500 μM, 1 mM 처리한 세포의 활성산소의 생성이 촉진되었으며, 도 2의 d, e, f 와 같이 디메틸리소스퍼메이트를 함께 처리함으로써 세포내 활성산소 생성이 억제되었다.In order to examine the ability of the dimethyl resource permate of the present invention to inhibit the production of reactive oxygen species induced in vascular endothelial cells by 2,2 azobis (2-amidino propane) dihydrochloride (AAPH) treatment, 6-well plate After planting at 2x10 4 / ml in well plates, the cells were incubated for one day, and then incubated with 1, 2, and 4 μM of dimethyl resource permate and AAPH for 8 hours. The cultured cells were subjected to 10 μM of DCFDA in cover glass to suppress the inhibition of dimethyl resource permate on the free radicals produced in cells by confocal laser scanning microscope (LSM 510, Zeiss Co., Japan). Compared with cells not treated with AAPH as shown in FIG. 2A, the generation of free radicals of cells treated with 500 μM and 1 mM of AAPH in FIG. 2 was increased, and dimethyl as shown in d, e, and f of FIG. 2. Treatment of rhyperperate together inhibited the production of free radicals in cells.

(LPS에 의한 생체내 활성산소종 생성억제 효과 측정)(Measurement of the inhibitory effect of free radical generation in vivo by LPS)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 생체내 활성산소종에 생성억제능을 확인하기 위하여, 리포폴리사카라이드(LPS)를 복강주사하여 총활성산소종 생성을 유도하였으며, 디메틸리소스퍼메이트를 20일 간 먹이와 섞어 투여한 후 그 신장 파쇄액에 DCFDA (2`,7`-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 첨가한 후, 형광도의 변화를 여기 파장 485 nm 및 방출 파장 530 nm에서 60분 간 10분 간격으로 미세판형광 판독기로 측정하였다. 그 결과 리포폴리사카라이드(LPS)를 먹인 흰쥐 대조군에 비해 리소스퍼메이트를 함께 먹인 쥐의 활성산소 생성은 유의성 있는 감소를 나타냈으며 이를 도 3에 나타내었다.In order to confirm the production inhibitory ability of the dimethyl resource permate of the present invention in the active oxygen species, intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS) induced the generation of total reactive oxygen species, and fed dimethyl resource permate for 20 days Mixed with and added with DCFDA (2`, 7`-dichlorodihydrofluorescein diacetate) to the kidney lysate, and then change the fluorescence at 10 min intervals for 60 min at excitation wavelength 485 nm and emission wavelength 530 nm. Measured with a fluorescence reader. As a result, compared to the rat control group fed with lipopolysaccharide (LPS), the active oxygen production of rats fed with lysopermate showed a significant decrease, which is shown in FIG. 3.

(LPS에 의한 혈청 나이트라이트와 나이트레이트에 대한 생성억제 효과)(Production inhibitory effect on serum nitrite and nitrate by LPS)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 생체 내 활성산소종에 생성억제능을 확인하기 위하여 리포폴리사카라이드를 복강주사하여 총활성산소종 생성을 유도하였으며, 리소스퍼메이트를 20일 간 먹이와 섞어 투여한 후 그 신장 파쇄액을 사용하였다. 나이트라이트는 그리스(Griess) 시약과 결합하여 보라색을 띄게되므로 540nm에서 흡광도를 측정하여 확인할 수 있다. 그러나 그리스(Griess) 시약은 나이트레이트와는 결합하지 않으므로 나이트레이트는 나이트레이트 환원효소와 NADPH를 이용하여 나이트라이트로 환원 후 측정하였다. 그 결과 리포폴리사카라이드를 먹인 흰쥐 대조군에 비해 디메틸리소스퍼메이트를 함께 먹인 쥐의 혈청내의 나이트라이트와 나이트레이트의 생성은 유의성 있는 감소효과를 나타내었다 (도 4 참조).In order to confirm the production inhibitory ability of the dimethyl resource permate of the present invention to the active oxygen species in vivo, intraperitoneal injection of lipopolysaccharide was induced to generate total reactive oxygen species, and after the administration of the resource permeate mixed with food for 20 days The kidney crushing liquid was used. The nitrite is purple in combination with the grease reagent, which can be confirmed by measuring the absorbance at 540 nm. However, since the grease reagent does not bind to nitrate, nitrate was measured after reduction to nitrite using nitrate reductase and NADPH. As a result, the production of nitrite and nitrate in the serum of rats fed with dimethyl resource permate showed a significant reduction effect compared to the rat control fed lipopolysaccharide (see FIG. 4).

(노화 흰쥐에서 페록시나이트라이트에 대한 소거효과)Scavenging Effect on Peroxynitrite in Aged Rats

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 노화 흰쥐의 생체내 나이트라이트 생성억제능을 확인하기 위하여 디메틸리소스퍼메이트를 20일 간 5 또는 10 mg/kg을 먹이와 섞어 투여한 후 그 신장 파쇄액을 사용하였다. 90 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘 (pH 7.4) 및 100 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산으로 구성된 완충액에 시료와 페록시나이트라이트 용액을 넣어 산화된 디하이드로로다민123의 형광강도를 여기파장 480 nm, 방출파장 530 nm인 미세판형광 판독기에서 측정하였다. 그 결과 노화 흰쥐 대조군에 비해 리소스퍼메이트를 먹인 쥐의 페록시나이트라이트 생성이 유의성 있는 감소를 나타내었다 (도 5 참조).In order to confirm the nitrite production inhibitory ability of the dimethyl resource permate of the present invention in vivo in vivo, dimethyl resource permate was mixed with 5 or 10 mg / kg of food for 20 days, and then the kidney crushed solution was used. In a buffer consisting of 90 mM sodium chloride, 5 mM calcium chloride (pH 7.4) and 100 mM diethylenetriaminepentaacetic acid, a sample and a peroxynitrite solution were added to emit fluorescence intensity of oxidized dihydrodamine123 with an excitation wavelength of 480 nm. Measurements were made in a microplate fluorescence reader with a wavelength of 530 nm. As a result, the production of peroxynitrite in rats fed Rhyperpermate showed a significant reduction compared to the aging rat control group (see FIG. 5).

(노화 흰쥐에서의 혈청 나이트라이트와 나이트레이트에 대한 생성억제 효과)(Production inhibitory effect on serum nitrite and nitrate in aged rats)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 생체내 나이트라이트와 나이트레이트의 생성억제능을 확인하기 위하여 리소스퍼메이트를 20일 간 먹이와 섞어 투여한 후 그 신장 파쇄액을 사용하였다. 나이트라이트는 그리스(Griess) 시약과 결합하여 보라색을 띄게되므로 540nm에서 흡광도를 측정하여 확인할 수 있다. 그러나 그리스(Griess) 시약은 나이트레이트와는 결합하지 않으므로 나이트레이트는 나이트레이트 환원효소와 NADPH를 이용하여 나이트라이트로 환원 후 측정하였다. 그 결과 노화 흰쥐 대조군에 비해 디메틸리소스퍼메이트를 함께 먹인 쥐의 혈청내의 나이트라이트와 나이트레이트의 생성은 유의성 있는 감소를 나타내었다 (도 6 참조).In order to confirm the ability of the dimethyl resource permate of the present invention to inhibit the production of nitrite and nitrate in vivo, renal permeate was mixed with food for 20 days and then the kidney crushed solution was used. The nitrite is purple in combination with the grease reagent, which can be confirmed by measuring the absorbance at 540 nm. However, since the grease reagent does not bind to nitrate, nitrate was measured after reduction to nitrite using nitrate reductase and NADPH. As a result, the production of nitrite and nitrate in the serum of rats fed with dimethyl resource permate showed a significant decrease compared to the aging rat control group (see FIG. 6).

(노화 흰쥐에서 활성산소종에 대한 생성억제 효과)(Production Inhibitory Effect on Reactive Oxygen Species in Aged Rats)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 노화 흰쥐의 생체내 활성산소종 생성억제능을 확인하기 위하여 디메틸리소스퍼메이트를 20일간 5 또는 10 mg/kg을 먹이와 섞어 투여한 후 그 신장 파쇄액을 사용하였다. 파쇄액에 비형광성 2',7'-DCFDA (2`,7`-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 첨가한 후, 디메틸리소스퍼메이트의 첨가에 따른 형광도의 변화를 여기 파장 485 nm 및 방출 파장 530 nm에서 60분 간 10분 간격으로 미세판형광 판독기로 측정하였다. 이때 노화 흰쥐에서 증가한 총활성산소종의 생이 디메틸리소스퍼메이트를 먹인 쥐에서 감소되었으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다.In order to confirm the oxidative oxygen production inhibitory ability of the dimethyl resource permate of the present invention in vivo in oxidized rats, dimethyl resource permate was mixed with food or 5 mg or 10 mg / kg for 20 days, and the kidney lysate was used. After adding non-fluorescent 2 ', 7'-DCFDA (2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate) to the lysate, the change in fluorescence with the addition of dimethyl resource was measured at excitation wavelength 485 nm and emission wavelength 530 nm. Measurements were made with a microplate fluorescence reader at 60 minute intervals for 60 minutes. At this time, the life of the total reactive oxygen species increased in the aging rats was reduced in the rats fed with dimethyl resource, and the results are shown in FIG.

실시예 3 : 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 제거 기전 측정Example 3 Measurement of Peroxynitrite Removal Mechanism of Dimethyl Resource Fermate

(3-나이트로타이로신 생성 억제 기전 확인)(Check the mechanism of inhibition of 3-nitrotyrosine production)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트에 의해 발생되는 단백질 니트로화(nitration) 저해효과를 확인하기 위하여 Pannala 등의 방법을 변형하여 분광측정법으로 분석하였다. 50 mM 인산칼륨(potassium phosphate) (pH 7.4)에 농도별로 페록시나이트라이트와 디메틸리소스퍼메이트을 가한 용액을 190 nm에서 600 nm까지 파장을 이동하여 측정하였다. 타이로신은 페록시나이트라이트와 반응하며 430 nm에서 최대 흡광을 가지는 3-나이트로타이로신을 생성한다. 430 nm 근처에서 피크(peak)가 관찰되면 질화과정으로 페록시나이트라이트를 소거하며,피크(peak)가 관찰되지 않으면 전자 공여과정으로 소거함을 알 수 있다. 실험결과, 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트와의 반응에서는 피크(peak)가 관찰되지 않았으므로 이는 전자공여과정으로 페록시나이트라이트를 제거함을 알 수 있다 (도 8 참조).In order to confirm the protein nitration inhibitory effect caused by the peroxynitrite of the dimethyl resource permate of the present invention was modified by Pannala et al. And analyzed by spectroscopic method. Peroxynitrite and dimethyl resources permate were added to 50 mM potassium phosphate (pH 7.4) at different concentrations and measured at 190 nm to 600 nm. Tyrosine reacts with peroxynitrite and produces 3-nitrotyrosine with maximum absorption at 430 nm. When peaks are observed near 430 nm, peroxynitrite is quenched by nitriding. If peaks are not observed, it is cleared by electron donating. As a result, since no peak was observed in the reaction of dimethyl resource permate with peroxynitrite, it can be seen that it removes peroxynitrite by an electron donating process (see FIG. 8).

(단백질 니트로화의 저해효과)(Inhibitory effect of protein nitration)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트에 의한 단백질 니트로화 억제효과를 확인하기 위하여 본 실시예에서는 알부민의 타이로신이 페록시나이트라이트에 의해 니트로화되는 정도에 디메틸리소스퍼메이트가 미치는 영향을 나이트로타이로신 항체로 검토하였다. 단백질 양의 확인은 웨스턴 블랏(Western blot) 분석법을 실시하였다. 알부민 단백질(BSA, 0.5mg/㎖) 95㎕에 농도별 시료나 혹은 용매 2.5㎕를 첨가하여 상온에서 10분 간 배양한 후, 페록시나이트라이트(4mM in 0.3N NaOH) 2.5㎕를 첨가하고 20분 간 상온에서 재배양하였다. 니트로화 반응이 끝난 후, SDS-PAGE 에 전기영동한 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막에 단백질을 전이시키고 나이트로타이로신 항체로 반응시킨 다음 ECL법으로 확인하였다. 그 결과 디메틸리소스퍼메이트가 페록시나이트라이트를 전자공여에 의해 효과적으로 소거함으로써 알부민의 니트로화를 억제하였다 (도 9 참조).In order to confirm the inhibition of protein nitration by the peroxynitrite of the dimethyl resource permeate of the present invention, in this example, the effect of dimethyl resource permate on the degree to which the tyrosine of albumin is nitrated by peroxynitrite It examined with nitrotyrosine antibody. Confirmation of protein amount was performed by Western blot analysis. 95 μl of albumin protein (BSA, 0.5mg / mL) was added to 2.5 μl of sample or solvent for each concentration, followed by incubation for 10 minutes at room temperature, and then 2.5 μl of peroxynitrite (4 mM in 0.3N NaOH) was added thereto. Cultured at room temperature for minutes. After the nitration reaction, electrophoresis on SDS-PAGE, the protein was transferred to polyvinyridine fluoride membrane, reacted with nitrotyrosine antibody, and confirmed by ECL method. As a result, dimethyl resource permate effectively eliminated peroxynitrite by electron donation, thereby inhibiting nitration of albumin (see FIG. 9).

본 발명은 단삼 유래의 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 함유하는 항산화용 및 항노화용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for anti-oxidation and anti-aging containing dimethyl resources permate derived from Salvia soybean as an active ingredient.

디메틸리소스퍼메이트는 페록시나이트라이트의 생성 및 반응성을 억제시키며, 생체 내 페록시나이트라이트뿐만 아니라 수퍼옥사이드와 나이트릭옥사이드의 생성을 억제하고, 페록시나이트라이트로 인한 세포사를 억제하므로 세포내 항산화능을 나타냄과 동시에 그에 따른 항산화능으로 세포사를 방지한다. 또한 전자공여 기전을 통해 페록시나이트라이트를 제거함으로써 단백질의 니트로화 (nitration)를 저해하여 세포내 항상성을 유지시키는데 주요한 역할을 담당하는 단백질들의 기능을 효과적으로 보호한다.Dimethyl resource permate inhibits the production and reactivity of peroxynitrite, inhibits the production of superoxide and nitric oxide as well as peroxynitrite in vivo, and inhibits cell death due to peroxynitrite. At the same time it prevents cell death with its antioxidant capacity. In addition, by removing the peroxynitrite through the electron donor mechanism to inhibit the protein nitration (nitration) effectively protects the function of proteins that play a major role in maintaining intracellular homeostasis.

따라서 본 발명의 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 함유하는 항산화제 및 항노화제는 세포내 산화적 손상에 의해 진행되는 노화를 효과적으로 방지하므로 이는 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.Therefore, antioxidants and anti-aging agents containing dimethyl resource permate of the present invention effectively prevent aging caused by oxidative damage to cells, which is a very useful invention for the pharmaceutical industry.

Claims (7)

하기 화학식 1로 표시되는 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물.The composition for antioxidant containing dimethyl resource permate represented by the following formula (1) as an active ingredient. [ 화학식 1 ][Formula 1] 하기 화학식 1로 표시되는 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 함유하는 항노화용 조성물.An anti-aging composition containing a dimethyl resource permate represented by the following formula (1) as an active ingredient. [ 화학식 1 ][Formula 1] 제 1항 또는 제 2항에 있어서 디메틸리소스퍼메이트는 단삼으로부터 회수된 것임을 특징으로 하는 조성물.The composition according to claim 1 or 2, wherein the dimethyl resources permate is recovered from salvia. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 디메틸리소스퍼메이트가 페록시나이트라이트에 의한 세포사를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.The composition according to claim 1 or 2, wherein the dimethyl resource permate inhibits cell death by peroxynitrite. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 디메틸리소스퍼메이트가 LPS에 의한 생체내 페록시나이트라이트 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.The composition according to claim 1 or 2, wherein the dimethyl resource permate inhibits the production of peroxynitrite in vivo by LPS. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 디메틸리소스퍼메이트가 페록시나이트라이트에 의한 3-나이트레이션을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.The composition according to claim 1 or 2, wherein the dimethyl resource permate inhibits 3-nitration by peroxynitrite. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 디메틸리소스퍼메이트가 전자공여에 의한 단백질 니트로화를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.The composition according to claim 1 or 2, wherein the dimethyl resource permate inhibits protein nitration by electron donation.
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