KR20040108671A - 한타 바이러스 감염에 대한 ｄｎａ 백신 - Google Patents

Abstract

본 출원은 HFRS- 및 HPS-관련 한타바이러스 감염에 대한 보호성 DNA 백신에 관한 것이다. 상기 백신은 메디엄(medium:M)(G1 및 G2 당단백질을 인코드) 유전자를 나타내는 cDNA를 DNA 발현벡터인 pWRG7077내로 서브클로닝하므로써 제조되었다. M 구조체로 면역접종된 동물들은 중화항체 반응을 발생시켰다. 수동 전달 실험은 챌린지 후 4일째 또는 5일째에 주사될 때, 면역접종된 동물들 유래의 혈청이 치명적인 질병으로부터 동물들을 보호한다는 사실을 보여준다.

Description

한타 바이러스 감염에 대한 ＤＮＡ 백신{DNA VACCINES AGAINST HANTAVIRUS INFECTIONS}

현재, 신증후군출혈열(hemorrhagic fever with renal syndrome: HFRS)과 관련하여 4 종류의 한타바이러스가 알려져 있다: 한탄 바이러스(Hantaan virus: HTNV), 도브라바-벨그라데 바이러스(Dobrava-Belgrade virus: DOBV), 푸우말라 바이러스(Puumala virus : PUUV) 및 서울 바이러스(Seoul virus: SEOV). 각기 다른 한타바이러스들이 단 하나의 주요 설치류 숙주종에 의하여 일반적으로 전염되기 때문에, 그들의 분포는 그 숙주의 범위에 일반적으로 한정된다(Schmaljohn 및 Hjelle, 1997,Emerg. Infect. Dis.3, 95∼104로부터 요약함). 아포데무스 아그라리우스(Apodemus agrarius)에 의하여 전염되는 HTNV는 아시아에서 발견된다; 아포데무스 플라비콜리스(Apodemus flavicollis)에 의하여 전염되는 DOBV 및 클레스리오노미스 글라레올러스(Clethrionomys glareolus)에 의하여 전염되는 PUUV는 유럽에서 발견된다. SEOV는 다른 알려진 한타바이러스 보다 광범위하게 퍼져있는데, 이는 숙주인 통상의 집쥐(Rattus norvegicus)가 전세계적으로 발견되고 있기 때문이다.

신세계 한타바이러스가 미국에서 매우 치명적인 질병인 한타바이러스 폐증후군(Hantavirus pulmonary syndrome:HPS)의 발생과 관련되어 왔다(Schmaljohn 및 Hjelle, 1997, Emerg. Infect Dis. 3, 95~104). 상기 질병은 열과 혈관출혈(vascular leakage)로 인한 심장외인성 폐부종(non-cardiogenic pulmonary edema)과, 그 결과로 인해 쇼크가 발생하는 특징이 있다. 가장 널리 퍼져 있는 북미와 남미의 한타바이러스인, 신놈버 바이러스(Sin Nombre virus:SNV)와 안데스 바이러스(Andes virus:ANDV)에 의해 야기되는 HPS에 대한 치명율(case-fatality)은 각각 30~50%이다.

한타바이러스 속(Bunyaviridae과)에 속하는 바이러스들은 엔벨로프(envelope)를 가지고, 크기에 따라 대형(L), 중간형(M) 및 소형(S)으로 명명된 3개의 단일가닥 RNA 절편을 포함하는 게놈을 포함하고 있다(Schmaljohn, 1996, InThe BunyaviridaeEd. R.M.Elliott. New York, Plenum press p.63∼90을 요약함). 상기 한타바이러스 L 절편은 RNA 의존성 RNA 폴리머라제를 코드하고, M은 2개의 엔벨로프 당단백질(G1 및 G2)을 코드하고, S는 뉴클레오캡시드 단백질(N)을 코드한다.

세포배양 또는 설치류 뇌로부터 파생된 많은 불활성화 HFRS 백신이 아시아에서 개발되었고 검사되었다(Lee 등, 1990, Arch. Virol., Suppl. 1, 35∼47; Song 등, 1992, Vaccine 10, 214∼216; Lu 등, 1996, J. Med. Virol. 49, 333∼335). 이들 전통적인 사멸-바이러스 백신의 단점은 바이러스의 증식과 취급을 위해 적당한 봉쇄의 필요성을 포함하는 것이다. 이들 단점을 극복하기 위하여, 재조합 DNA 기술을 포함하는 다음과 같은 백신 접근법이 개발되었다: 백시니아-벡터 백신(Schmaljohn 등, 1990, J. Virol. 64, 3162∼3170; Schmaljohn 등, 1992, Vaccine 10, 10∼13; Xu 등, 1992, Am. J. Trop. Med. Hyg. 47, 397∼404); 박테리아 또는 곤충세포에서 발현된 단백질 서브유니트 백신(Schmaljohn 등, 1990 상게서; Yoshimatsu 등, 1993, Arch. Virol. 130, 365∼376; Lundkvist 등, 1996, Virology 216, 397∼406) 및 간염 바이러스 코아 항원에 기초한 재조합 백신(Ulrich 등, 1998, Vaccine 16, 272∼280).

HTNV나 SEOV의 M 절편을 발현하는 백시니아 재조합체로 면역접종하는 경우에는 중화항체를 유도하였고, HTNV 및 SEOV 모두에 대한 감염에 대하여 설치류를 보호하였으며, 이는 G1-G2에 대한 면역 반응만으로도 보호를 제공할 수 있다는 것을 암시한다(Schmaljohn 등, 1990 상게서; Xu 등, 1992 상게서; Chu 등, 1995, J. Virol. 69, 6417∼6423). 유사하게, 곤충세포(바큘로바이러스 재조합 바이러스 시스템)에서 발현된 G1-G2 단백질로 면역접종하는 경우 중화항체를 유도하였고, HTNV 감염으로부터 햄스터를 보호하였다(Schmaljohn 등, 1990 상게서). 백시니아 및 바큘로바이러스 시스템 모두에서, G1-G2의 면역접종은 G1 또는 G2 단독 접종보다 더완벽한 보호를 제공하였다(Schmaljohn 등, 1990 상게서). 상기한 백신 연구에서 G1-G2에 대한 중화항체 반응은 보호와 상관관계가 있었고, 이는 중화항체가 한타바이러스 감염을 예방하는 데 중요한 역할을 하는 것을 암시한다. G1 또는 G2에 특이적인 중화 단일클론 항체(MAbs)를 수동 면역(passive transfer)한 경우에도 HTNV 감염에 대하여 햄스터를 보호하였으며(Schmaljohn 등, 1990 상게서; Arikawa 등, 1992, J. Gen. Virol. 70, 615∼624), 이는 중화항체 단독으로도 보호를 제공할 수 있다는 상기 아이디어를 지지하는 것이다.

N 단백질 역시 한타바이러스 감염으로부터 보호하는 역할을 한다. 박테리아나, 곤충세포에서 또는 키메라성 B형 간염 바이러스(HBV) 코아 입자로 발현된 N으로 면역접종하는 경우 한타바이러스 감염으로부터 설치류를 보호하였다(Schmaljohn 등, 1990 상게서; Yoshimatsu 등, 1993 상게서; Lundkvist 등, 1996 상게서; Ulrich 등, 1998 상게서). S 절편을 발현하는 백시니아 재조합체로 면역접종하는 경우에는 명확하지 않다. HTNV S 절편을 발현하는 구조체는 HTNV 감염으로부터 햄스터를 보호하지 않았으며, 이는 아마도 낮은 N 발현 수준 때문인 것으로 여겨지고(Schmaljohn 등, 1990 상게서); SEOV의 S 절편을 발현하는 구조체는 SEOV 감염으로부터 4 마리의 모래쥐(gerbil) 중 3마리를 보호하였다(Xu 등, 1992 상게서).

유사하게, 1990년대 중반에 최초의 HPS-관련 한타바이러스가 분리된 이후로,유전자에 기초한 항 HPS 백신에 대한 기초연구가 진행되고 있다. 약 500뉴클레오티드 길이의 SNV M 유전자, 또는 전장 S 유전자를 포함하는 후보 DNA 백신이 생쥐에서 면역원성이 있고(Bharadwaj 등, 1999, Vaccine 17, 2836,43), 디어 생쥐(deermouse) 감염모델에서 SNV 감염에 대해 일부의 보호를 제공한다(Bharadwaj 등, 2002, J.Gen.Virol. 83, 1745~1751)는 보고가 있다. 상기 보호는, 이들 구조체가 중화성 또는 보호성 항체반응을 유도한다는 확증이 없기 때문에, 세포-매개성인 것으로 추측된다.

따라서, G1 단독, G2 단독 또는 상기 당단백질 절편이 중화항체를 유도하고, 감염에 대해 보호할 수 있는지 여부는 불분명한 상태이다. G1 또는 G2를 단독으로 포함하는 재조합 바큘로바이러스-감염 세포 용해액, 및 G1 또는 G2를 단독으로 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 이용한 면역접종은 중화항체를 유도하는 데 실패하였고, 햄스터 감염 모델에서 불완전한 보호를 나타내었다(Schmaljohn 등, 1990). 비록 이들 백시니아 백신이 일부 가능성을 제시하였지만, 재조합 백시니아 바이러스 백신 및 백시니아에 기초한 백신은 살아있는 바이러스로 구성되기 때문에, 특히 면역력이 약화된 개체에서 감염이 전파될 가능성을 포함한 단점들이 있다. 또한, 이들 바이러스로 면역접종하는 것은 감염력 있는 바이러스를 포함하는 상처(두진(痘疹))를 생기게 할 수 있다. 이들 상처의 바이러스는 부주의하게 다른 신체부위(예컨대, 눈) 또는 다른 개체로 전염될 수 있다. 뿐만 아니라, 백시니아-벡터 백신은 이전에 천연두 백신으로 면역접종된 사람에게는 면역원성이 약하다(McClain 등, 2000, J. Med. Virol. 60, 77~85). 백시니아에 기초한 백신의 다른 단점들에는 림프절이 부푸는 것으로 인한 불쾌함 및 접종 부위에 상처가 나는 것이 포함된다.

본 출원은 1999년 1월 29일 미국 출원된 가출원 일련번호 제60/117,680호에 기초하여 우선권을 주장하는, 2000년 1월 27일 미국 출원된 일련번호 제09/941,974호의 일부계속출원(Continuation-In-Part Application)이다. 본 출원은 또한 2002년 3월 22일 선출원된 가출원 일련번호 제60/367,128호 및 2002년 7월 26일 선출원된 가출원 일련번호 제60/398,985호의 이익을 주장한다.

본 발명은, 각 한타바이러스 게놈 절편 cDNA를 발현하는 나 DNA(naked DNA)로 면역접종하는 것과 관련되는 새로운 재조합 DNA 백신 접근법에 관한 것이다.

도 1은 SEOV 나(naked) DNA 발현 구조체에 관한 것이다. SEOV M 또는 S 게놈 절편은 RT-PCR에 의하여 증폭되었고, pWRG7077의NotI 및BamHI 부위에 클로닝되었다(PowderJect Vaccines, Inc., Madison, Wisconsin; Schmaljohn 등, 1997, 상게서에 기술되어 있다). pWRG7077의 특징은 이전에 기술된 pWRG1602의 특징과 유사하며(Dimmock, N. J., 1995, Med. Virol. 5: 165), 인간 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터(CMV IE 프로모터) 및 인트론 A, 소 성장호르몬 전사 터미네이터(terminator) 및 폴리아데닌 첨가 신호(BGH pA), 그리고 카나마이신 저항성 유전자를 포함한다. CMV IE 프로모터: cytomegalovirus immediate early promoter 및 인트론 A, BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal, KAN : kanamycin antibiotic resistance gene.

도 2A 및 2B는 pWRG/SEO-M(서열번호3) 및 pWRG/SEO-S(서열번호4)로부터의 임시 발현(transient expression)에 관한 것이다.

A) IFAT는 SEOV M 또는 S 구조체로 형질도입된 COS 세포 단층에서 행하여졌다. pWRG/7077-형질도입 단층이 음성 대조군 역할을 하였다. 항-SEOV 폴리클론 토끼 항혈청이 일차 항체로서 사용되었다.

B) COS 세포는 표시된 플라스미드로 형질도입되었고, 방사선 표지된 발현 산물은 항-SEOV 폴리클론 토끼 혈청으로 면역침전되었다. kDa으로 나타낸 분자량 크기 마커(MW)를 왼쪽에 나타내었고, SEOV G1, G2 및 N 단백질의 위치는 오른쪽에 나타내었다.

도 3A 및 3B는 유전자 총 또는 근육내 주사 접종에 의하여 SEOV 나 DNA로 면역접종된 생쥐의 항체 반응(ELISA)에 관한 것이다. 유전자 총 또는 근육내 주사 접종으로 pWRG/SEO-M(패널 A) 또는 pWRG/SEO-S(패널 B)를 면역접종한 경우에 대한 항체 반응은 ELISA로 평가하였다. 음성 대조군 플라스미드 pWRG7077로 면역접종된 생쥐는 두가지의 ELISA로 평가되었다. 전채혈(prebleed) 혈청 및 제1차 면역접종(1차 접종) 후 4주째, 제2차 면역접종(2차 접종) 후 4주째, 최종 면역접종(3차 접종) 후 3주째에 수집된 혈청은 단일 검정(assay)에서 모두 시험되었다. 기호는 2배수로 검정된 각 생쥐 혈청 시료의 평균값을 나타낸다.

도 4는 SEOV 나 DNA로 면역접종된 생쥐의 중화 항체 반응에 관한 것이다. PRNT는 유전자 총 또는 근육내 주사 접종(주사 접종)에 의한 제3차 면역접종 후 3주째에 수집된 생쥐 혈청에 대해 행하여졌다. 막대 표시는 표시된 면역원으로 면역접종된 각 생쥐로부터 유래한 혈청을 나타낸다. 혈청은 열 불활성화(56℃, 30분)되었고, 상기 검정은 5% 기니 피그 보조체(complement) 존재하에서 행하여졌다. PRNT50% 역가는 플라크 수를 50% 감소시키는 최고 혈청 희석 배수의 역수로 나타낸다.

도 5는 pWRG/SEO-M으로 면역접종한 경우 한탄 바이러스 감염에 대하여 교차보호하는 것에 관한 것이다. 4∼5마리의 햄스터의 그룹이 하기의 방법들에 설명된 바와 같이 pWRG/SEO-M 또는 음성 대조군 플라스미드(pWRG7077)로 면역접종되었다. 최종 면역접종 후 3주째에 챌린지 전(prechallenge: 면역성 검사를 위한 접종 전)의 혈청 시료을 얻고, 햄스터는 한탄 바이러스 1,000PFU로 챌린지(면역성 검사를 위한 접종)를 하였다. 챌린지 전후(prechallenge 및 postchallenge)의 혈청 시료는, 뉴클레오캡시드에 대한 항체를 검출하기 위하여는 항-N ELISA로, 한탄 중화 항체를 검출하기 위하여는 한탄 플라크 감소 중화 시험(Hantaan plaque reduction neutralization test: PRNT)으로 평가되었다. ELISA 역가는 배경 O.D.에 3 표준편차를 더한 것보다 큰 O.D.값을 야기시키는 가장 낮은 희석배수의 역수를 나타낸다. PRNT50% 역가는 혈청 부재하에서 플라크 수를 50% 감소시키는 최저 희석 배수의 역수를 나타낸다.

도 6은, pWRG/SEO-M으로 면역접종하는 경우 도브라바 바이러스 감염에 대하여 교차보호하는 것에 관한 것이다. 방법에서 설명한 바와 같이 5마리의 햄스터 그룹은 pWRG/SEO-M 또는 음성 대조군 플라스미드(pWRG7077)로 면역접종되었다. 최종 면역접종 3주 후에, 챌린지 전(prechallenge)의 혈청 시료을 얻고, 상기 햄스터를 도브라바 바이러스 1,000PFU로 챌린지하였다. 챌린지 28일 후, 챌린지 후 혈청 시료를 얻었다. 챌린지 전과 후의 혈청 시료는 뉴클레오캡시드에 대한 항체를 검출하기 위하여는 항-N ELISA로 평가하고, 도브라바 중화 항체를 검출하기 위하여는 도브라바 플라크 감소 중화 시험(PRNT)으로 평가하였다. ELISA 역가는 배경 O.D.에 3 표준편차를 더한 것보다 큰 O.D. 값을 야기시키는 최저 희석 배수의 역수를 나타낸다. PRNT50% 역가는 혈청 부재하에서 플라크 수를 50% 감소시키는 최저 희석배수의 역수를 나타낸다. 서울 바이러스를 중화시키는 챌린지 전 항체 역가(백신에 의하여 유도된다)도 또한 측정되었다. 상기 서울 바이러스 PRNT50% 값은 속이 빈 원으로 나타내었다.

도 7은, pWRG/SEO-M으로 면역접종하는 경우 푸우말라 바이러스(Puumala virus) 감염에 대하여 교차보호하지 못한다는 것에 관한 것이다. 방법에서 설명한 바와 같이 5마리의 햄스터 그룹은 pWRG/SEO-M 또는 음성 대조군 플라스미드(pWRG7077)로 면역접종되었다. 최종 면역접종 3주 후에, 챌린지 전(prechallenge)의 혈청 시료을 얻고, 상기 햄스터를 푸우말라 바이러스 1,000PFU로 챌린지하였다. 챌린지 28일 후, 챌린지 후 혈청 시료를 얻었다. 챌린지 전과 후의 혈청 시료는 뉴클레오캡시드에 대한 항체를 검출하기 위하여는 항-N ELISA로 평가하고, 푸우말라 중화 항체를 검출하기 위하여는 푸우말라 플라크 감소 중화 시험(PRNT)으로 평가하였다. ELISA 역가는 배경 O.D.에 3 표준편차를 더한 것보다 큰 O.D. 값을 야기시키는 최저 희석 배수의 역수를 나타낸다. PRNT50% 역가는 혈청 부재하에서 플라크 수를 50% 감소시키는 최저 희석배수의 역수를 나타낸다. 서울 바이러스를 중화시키는 챌린지 전 항체 역가(백신에 의하여 유도된다)도 또한 측정되었다. 상기 서울 바이러스 PRNT50% 값은 속이 빈 원으로 나타내었다.

도 8은, HTNV G1 및 G2의 일시적인 발현에 관한 것이다. Cos 세포를 pWRG/HTN-M 또는 음성 대조군 플라스미드(pWRG7077)로 형질도입하고, 24시간 후, RIPA 분석을 위해 방사선 표지된 세포 용해액을 제조하였다. 발현산물은 항 HTNV (HTN HMAF) 폴리클론 생쥐 과면역 복수액(hyperimmune ascitic fluid), G1-특이적 MAb(MAb 6D4) 또는 G2-특이적 MAb(MAb-23G10)로 면역침전되었다. kDa으로 나타낸 분자량 크기 마커(M)를 왼쪽에 나타내었고, G1과 G2의 위치는 오른쪽에 나타내었다.

도 9A, 9B, 9C 및 9D는, G1의 효과적인 발현에는 상류의 외래 서열(upstream extraneous sequence)이 필요하다는 것을 나타낸다. 도 9A는 상기 벡터의 NotI 부위와 SEOV G1 개시코돈 사이의 뉴클레오티드 서열(서열번호5)을 나타내는 SEOV M 유전자 DNA 백신 플라스미드인 pWRG/SEO-M의 개략도이다. NotI 부위 뒤에는 상기한클로닝 과정에서 유래하는 24 외래 뉴클레오티드(서열번호6)가 이웃하고, 이어서 2번째 염기 위치에서 시작하는 SEOV M 안티게놈 5' 비코딩 영역이 이웃한다. 한타바이러스 M 유전자는 pWRG7077의 NotI-BamHI 부위 또는 NotI-BglII 부위로 클로닝되었다. G1 및 G2 당단백질을 인코드하는 ORF(open reading frame)인 G1/G2; 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터와 뒤이어 연결된 인트론 A인 CMV IE 인트론 A; 카나마이신 저항성 유전자인 KANr; 소 성장호르몬 폴리아데닌 첨가 신호인 BGH 폴리 A. 도 9B는 외래 서열의 변이가 SEOV G1 발현에 영향을 미침을 나타낸다. COS 세포는 pWRG/SEO-M(SEO-M)(해당 칼럼에 있는 서열은 서열번호6에 대응) 또는 다음과 같이 변형된 플라스미드로 형질도입되었다: 외래 서열의 결실(0); 외래 서열의 회복(1~24)(해당 칼럼에 있는 서열은 서열번호6에 대응); 외래 서열의 역위(24~1)(해당 칼럼에 있는 서열은 서열번호7에 대응); 외래 서열의 3'말단쪽 절반이 결실(1~12)(해당 칼럼에 있는 서열은 서열번호6의 뉴클레오티드 1~12에 대응); 외래 서열의 5'말단쪽 절반이 결실(13~24)(해당 칼럼에 있는 서열은 서열번호6의 뉴클레오티드 13~24에 대응); 외래 유전자의 9, 10번째 염기 위치에서 AG가 CC로 치환(1~24^*)(해당 칼럼에 있는 서열은 서열번호6의 9, 10번째 염기 위치에서 AG가 CC로 치환된 것에 대응). G1- 및 G2-특이적인 항체를 포함하는 폴리클론 토끼 항-SEOV 항체(1), 또는 G2-특이적인 단일클론 항체 풀(3)을 사용하여, 면역침전을 수행하였다. 벡터의 NotI 부위와 SEOV M 유전자 비번역 부위의 2번째 위치 사이의 서열을 나타내었다. Δ는 외래 서열이 결실되었음을 나타낸다.GGATCTGC(서열번호6의 뉴클레오티드1~8)는 G1의 효율적인 발현과 관련하여 최소한도로 보존된 서열이다. 도 9C는 만약 외래 서열의 뉴클레오티드 1~8인 GGATCTGC(서열번호6의 뉴클레오티드 1~8)가 NotI 부위와 SEOV M 비코딩 영역 사이에 위치하면, 효율적인 G1의 발현이 회복됨을 나타낸다. COS 세포는 pWRG/SEO-M(SEO-M), 또는 외래 서열이 결실된 플라스미드(0); 외래 서열이 회복된 플라스미드(1~24)(서열번호6); 외래 서열이 짧아진 플라스미드(1~8)(서열번호6의 뉴클레오티드 1~8)로 형질도입되었다. G1- 및 G2-특이적인 항체를 포함하는 폴리클론 토끼 항-SEOV 항체(1), G1-특이적인 MAb 풀(2) 또는 G2-특이적인 MAb-11E10(3)을 사용하여, 면역침전을 수행하였다. 도 9D는 외래 서열의 결실이 HTNV G1 발현에 영향을 미침을 나타낸다. COS 세포는 HTNV M 유전자 DNA 백신 플라스미드인 pWRG/HTN-M(x)(HTN-M)(해당 칼럼의 서열은 서열번호6에 대응), 또는 다음과 같은 변형된 플라스미드로 형질도입되었다: 외래 서열의 결실(0); 외래 서열의 회복(1~24)(해당 칼럼에 있는 서열은 서열번호6에 대응). G1- 및 G2-특이적인 항체를 포함하는 항-HTNV 생쥐 과면역 복수액(1), G1-특이적인 MAb 풀(2) 또는 G2- 특이적인 MAb-11E10(3)을 사용하여, 면역침전을 수행하였다. kDa으로 나타낸 분자량 크기 마커(M)를 왼쪽에 나타내었고, G1과 G2의 위치는 오른쪽에 나타내었다.

도 10은, G1 및 G2를 발현하는 pWRG/HTNV-M(x) 플라스미드의 개략도이다. pWRG/HTN-M(x)은 hCMV 초기 프로모터, 및 인트론 A가 개재된 엑손 1과 엑손 2, 및 5' 비코딩 서열을 포함한다. 한탄 바이러스 M 유전자 ORF에 대하여, 한탄 바이러스 M 비번역 영역(untranslated region:UTR)이 선행하고, 한탄 바이러스 M 유전자 3'-UTR이 후행한다. 본 발명자들이 발견한, 효율적인 G1 발현에 필요한 외래 유전자는인트론 A와 한탄 바이러스 5'-UTR 사이에 있다. 전사 종결은 소 성장호르몬 폴리아데닌 첨가 신호(BGH 폴리A)에 의하여 촉진되었다. 플라스미드 골격(backbone)은 pUC19이고, 카나마이신 저항성 유전자(KanR)가 항생제 저항성을 부여하였다.

도 11은, HTNV G1 및 G2를 발현하는 플라스미드로 DNA 면역접종하면 HTNV 감염을 보호할 수 있다는 것을 나타낸다. 2개의 독립한 실험 결과를 본 도면에 함께 나타내었다. 첫번째 실험에서, 햄스터 제1의 군(659~666)은 pWRG/HTN-M으로 면역접종되었고, 제2의 음성 대조군(667~674)은 벡터 플라스미드 pWRG7077로 면역접종되었다. 두번째 실험에서, 햄스터 제1의 군(2101~2108)은 pWRG/HTN-M(x)로 면역접종되었고, 제2의 음성 대조군(2109~2116)은 면역접종되지 않았다. 최종 면역접종한지 3주후에, 챌린지 전 혈청 샘플을 얻었고, 햄스터는 HTNV로 챌린지되었다. 챌린지 후 혈청 샘플은 챌린지한지 28일 후에 얻었다. 챌린지 전후의 혈청 샘플은, 항-N ELISA로 N-특이적 항체가 검정되었고, PRNT로 중화항체가 검정되었다. 각 햄스터에 대하여, 챌린지 전후의 종점(end point) 항체 역가를 나타내었다. 각 실험에서, 챌린지 전의 동형 PRNT_80%역가를 왼쪽에서 오른쪽으로, 최고부터 최저까지 분류하였다.

도 12A, 12B, 12C, 12D 및 12E는, 교차-보호에 관한 것이다. 햄스터를 다음의 플라스미드(pWRG/SEO-M, 외래 서열을 포함하는 pWRG/HTN-M(x) 또는 음성 대조군)로 면역접종한 후, 표시된 바이러스로 챌린지하였다. 패널 A, B 및 C에서, 음성 대조군 햄스터는 면역접종되지 않은 상태이다. 챌린지 전후의 혈청 샘플은, 항-NELISA로 N-특이적 항체가 검정되었고, PRNT로 중화항체가 검정되었다. 동형 바이러스에 대한 PRNT_80%역가 및 이형 바이러스에 대한 PRNT_50%역가를 결정하였다. 각 햄스터에 대하여, 챌린지 전후의 종점 항체 역가를 나타내었다. 챌린지 전의 동형 PRNT_80%역가(왼쪽에서 오른쪽으로, 최고부터 최저까지 분류)를 기호선으로 나타내었다. 각 햄스터에 대한 확인 코드는 X축에 나타내었다. 햄스터 943, 944, 945 및 948에 대한 HTNV PRNT와 항-N ELISA 데이터는 이전에 발표되었다(Kamrud 등, 1999, Virology, 263, 209~219).

도 13은, 레서스 원숭이에서 SEOV 또는 HTNV G1 및 G2를 발현하는 플라스미드로 DNA 면역접종하면, 고역가 중화항체 반응이 유도된다는 것을 나타낸다. 레서스 원숭이는, 실시방법에서 설명한 대로, 표시한 루트에 의해 pWRG/SEO-M(x), pWRG/HTN-M(x) 또는 rVV/HTN-M+S로 면역접종되었다. 혈청 샘플을 면역접종(P) 전에 얻고, 이어서 1차(1), 2차(2) 및 3차(3) 면역접종 3주후에 얻었다. 또한, 혈청을 최종 면역접종한지 2개월(a), 4개월(b) 및 6개월 후에 수집하였다. PRNT 역가는, 중화된 바이러스 플라크수가 80% 또는 50%가 되는 혈청 희석 배수의 역수를 나타낸다. 각 원숭이에 대한 확인코드는 각 플롯 아래쪽에 나타내었다.

도 14는, 원숭이에서 중화항체 반응의 지속시간을 나타낸다. 레서스 원숭이에서, DNA 면역접종에 의해 유도된 중화항체는 최종 면역접종한지 8개월 후에 검출되었다. 표시된 백신으로 면역접종된 레서스 원숭이는 각 면역접종을 한지 3주후, 최종 면역접종한지 2, 4, 6 및 8개월 후(각각 14, 22, 30 및 38주)에 채혈되었다.1차 면역접종(0주)후 표시된 주에 대하여, 동일한 중화항체 반응을 PRNT로 평가하였다. 각 라인은 각 원숭이를 나타낸다. 9주에 대한 데이터는 또한 도 13에 나타내었다.

도 15는, 햄스터/ANDV 치명적인 질병 모델에서의 HFRS DNA 백신에 대한 평가에 관한 것이다. 햄스터를 pWRG/HTN-M(x) 또는 음성 대조군 플라스미드 pWRG7077로 면역접종한 다음, ANDV로 챌린지시켰다. 사망한 동물에 대하여, 사망일은 괄호안에 나타내었다. 1차 챌린지에 생존한 동물을 ANDV로 재챌린지시켰다. 챌린지한 날(챌린지 전), 챌린지한지 4~6주 후(챌린지 후) 및 2차 챌린지한지 28~48일 후(재챌린지 후)에 추출된 혈청을, PRNT로 HTNV- 및 ANDV-특이 NAbs에 대해 검정하였다. 막대는 PRNT 역가를 나타낸다. 햄스터 확인 번호(ID＃) 68~91 및 501~523은 두개의 독립된 실험을 나타낸다; N에 대하여는 수행하지 않았다.

도 16은, pWRG/AND-M 플라스미드의 개략도이다. pWRG/AND-M은 hCMV 초기 프로모터, 및 인트론 A가 개재된 엑손 1과 엑손 2, 및 5' 비코딩 서열을 포함한다. 안데스 바이러스 M 유전자 ORF에 대하여, 안데스 바이러스 M 비번역 영역(untranslated region:UTR)이 선행하고, 안데스 바이러스 M 유전자 3'-UTR이 후행한다. 본 발명자들이 발견한, 효율적인 G1 발현에 필요한 외래 유전자는 인트론 A와 안데스 바이러스 5'-UTR 사이에 있다. 전사 종결은 소 성장호르몬 폴리아데닌 첨가 신호(BGH 폴리A)에 의하여 촉진되었다. 플라스미드 골격은 pUC19이고, 카나마이신 저항성 유전자(KanR)가 항생제 저항성을 부여하였다.

도 17A, 17B 및 17C는 pWRG/AND-M의 발현에 관한 것이다. 도 17A에서, 아르헨티나인 또는 미국인의 HPS 회복기 혈청을, pWRG/AND-M(+) 또는 공벡터 플라스미드 pWRG7077(-)로 형질도입된 COS 세포 유래의 방사성-표지 단백질을 면역침전시키는데에 사용하였다. 도 17B에서, 아르헨티나인(항-ANDV 인간)의 HPS 회복기 혈청을, pWRG/AND-M, pWRG7077로 형질도입된 COS 세포, 또는 ANDV로 감염된 Vero E6 세포 유래의 단백질을 면역침전시키는 데에 사용하였다. 도 17C에서, 표시된 HTNV 특이적 MAbs, HTNV-특이 생쥐 과면역 복수액(HTN-폴리) 또는 아르헨티나인의 HPS 회복기 혈청 형태(AND-폴리)가, pWRG/HTN-M(x) (H) 또는 pWRG/AND-M (A)로 형질도입된 COS 세포 유래의 단백질을 면역침전시키는데에 사용되었다. + 표시는 G1 또는 G2가 면역침전되었음을 의미하고, - 표시는 어떠한 단백질도 면역침전되지 않았음을 의미하고, * 표시는 G1 및 G2 모두가 면역침전되었음을 의미한다. kDa으로 나타낸 분자량 크기 마커(M)를 왼쪽에 나타내었고, G1, G2 및 N의 위치는 오른쪽에 나타내었다.

도 18A, 18B 및 18C는, 비인간 영장류에서, 한타바이러스 DNA 백신의 면역원성에 관한 것이다. 도 18A에서, 레서스 마카크(rhesus macaque) 원숭이를 pWRG/HTN-M(x), pWRG/AND-M 또는 음성 대조군 플라스미드로 면역접종시켰다. 1차 면역접종(P) 후, 및 1차, 2차, 3차 및 4차 면역접종(각각 1, 2, 3, 4)을 한지 3주 후, 혈청을 수집하였다. HTNV-, ANDV-, BCCV- 및 SNV-특이 PRNT를 수행하여, 종점 50% 및 80% 역가를 결정하였다. 도 18B에서, pWRG/AND-M으로 4회의 면역접종을 하기 전(채혈전) 및 후(면역접종후)에 수집된 원숭이 CH69 유래의 혈청을, pWRG/AND-M으로 형질도입된 세포 유래의 방사성-표지 용해액을 사용하여, RIPA로 G1- 및 G2-특이적 항체를 검정하였다. 항-ANDV 항체에 대한 양성 대조군으로서, 인간 HPS-환자 회복기 혈청(항-ANDV 인간)을 사용하였다. kDa으로 나타낸 분자량 크기 마커(M)를 왼쪽에 나타내었고, G1, G2 및 ~70kDa의 단백질(확인 안됨)의 위치는 오른쪽에 나타내었다. 도 18C에서, pWRG/HTN-M(x) 또는 pWRG/AND-M으로 면역접종된 원숭이에서의 NAb 반응은 각 면역접종 후에, 그리고 나서 1차 면역접종(0주)된지 표시된 주 후에, 결정되었다. CH64, CH85 및 CH69를 0, 3, 6 및 12주째에 면역접종하였다; 그리고 원숭이 90BD25를 0, 3, 6 및 9주째에 면역접종하였다. HTNV에 대한 NAb 역가(실선) 또는 ANDV에 대한 NAb 역가(점선)는 PRNT로 결정하였다.

도 19는, pWRG/HA-M 플라스미드의 개략도이다. pWRG/HA-M은, pWRG/AND-M의 어떠한 부위를 PCR 증폭하고, 이것을 pWRG/HTN-M(x)의 XbaI 부위에 삽입하므로써 제조되었다. 상기 증폭된 부위(XbaI 부위를 가진 프라이머 사용)는 CMV 프로모터, 인트론 A, 엑손 2, 외래 서열, 안데스 M 5'-UTR, 안데스 바이러스 M ORF, 안데스 3'-UTR 및 BGH 폴리 A를 포함한다. 다른 약칭은 상기 도면 참조.

발명의 요약

본 명세서에서는, 각 한타바이러스 게놈 절편 cDNA를 발현하는 나 DNA(naked DNA)로 면역접종하는 것과 관련되는 새로운 재조합 DNA 백신 접근법을 설명한다.

나 DNA 면역접종은 소망의 유전자(들)를 포함하는 플라스미드 DNA 구조체를 피접종자(vaccinee)의 조직에 전달하는 것과 관련된다(Robinson 및 Torres, 1997,Semin. Immunol. 9, 271∼283; 및 Gregoriadis, 1998,Pharm. Res.15, 661∼670을 요약).

이 백신 접근법은, 감염 또는 질병의 발생을 예방하기 위하여 필요한 세포독성 반응(cytotoxic response)을 유도하지 않는 소단위체 백신보다 유리하다. DNA 백신은 병원균 감염의 위험 없이, 생백신으로 얻을 수 있는 새로운 항원 생성과 MHC I족-제한 항원(MHC class I-restricted antigen) 제시와 유사하다. 또한, 이 DNA 백신 접근법은, 바이러스가 점액조직을 통해 침입할 수 있기 때문에, 바이러스 침입에 대한 저항성을 주는데 도움이 될 수 있는 점액조직 전달을 허용한다.

상기 소망의 유전자(들)(본 발명에서는 한타바이러스 게놈 절편)는 피접종자의 세포 속에서 나 DNA 유전자 산물(들)의 발현을 촉진하는 포유동물 또는 바이러스 프로모터(예컨대, 사이토메갈로바이러스의 아주(immediate) 초기 프로모터)에 의하여 제어된다. 이 세포내 발현에 의하여 체액성 및 세포성 면역반응 모두가 유도될 수 있다(Robinson 및 Torres, 1997, 상게서; 및 Gregoriadis, 1998, 상게서). DNA 전달 방법에는 주사 접종, 경구 또는 폐를 통한 전달 및 입자 충돌에 의한 접종(예컨대, 유전자 총)을 들 수 있다. 이들 각 방법에 의한 DNA 면역접종에 의하여많은 바이러스를 포함한 여러 다른 병원균에 대하여 보호 면역성이 유도된다(Robinson 및 Torres, 1997, 상게서; 및 Gregoriadis, 1998, 상게서). 그러나, 한타바이러스에 대한 면역반응이나 한타바이러스 감염에 대한 보호에 관하여는 나 DNA 백신을 사용하여 입증된 바는 없다.

본 명세서에서는, SEOV M 또는 S 게놈 절편으로 나 DNA 면역접종하는 경우, 설치류에서 SEOV-특이적 항체반응이 유도된다는 것을 입증한다. 더욱 중요하게는, SEOV M 게놈 절편으로 나 DNA 면역접종하는 경우 중화항체를 유도하여 SEOV 감염에 대하여 햄스터를 보호한다는 것을 입증한다.

또한, 본 출원에서는, HTNV M DNA 백신의 개발에 대해 설명한다. 이 백신은 햄스터에서 HTNV의 G1 및 G2 단백질을 발현하여, 중화항체를 유도하고, HTNV, SEOV 및 DOBV의 감염에 대하여 햄스터를 보호한다. 더욱이, SEOV M과 HTNV M DNA 백신은 인간 이외의 영장류에서 고농도의 중화항체반응을 유도한다.

또한, 본 발명자들은, 중화성 또는 보호성 항체반응을 유도하는, ANDV M 유전자에 기초한 DNA 백신을 최초로 개발 및 시험하였다. 상기 백신은 햄스터에서는 면역원성이 없고 햄스터를 보호하지 못하지만, 레서스 원숭이(rhesus monkeys)에서는 면역원성 및 보호성이 있기 때문에, 이것은 예상치 못한 결과였다. 또한, 2종의 다른 HPS-관련 한타바이러스:신놈버 바이러스(Sin Nombre virus)와 블랙크릭카날 바이러스(Black Creek Canal virus)에 대한 교차보호가 입증되었다.

또한, 본 출원에서는, HTNV M 유전자와 ANDV M 유전자 모두를 포함하는 한탄/안데스 이중-M 유전자 한타바이러스 DNA 백신에 대해 설명한다. 상기 백신은 인간이외의 영장류에서 면역원성과 보호성을 나타내었다. 이것은 심각한 질병을 일으키는 HPRS-관련 및 HPS-관련 모든 한타바이러스에 대하여 보호하도록 디자인된 최초의 DNA 백신이다. 레서스 마카크 원숭이(rhesus macaques)에서, 한탄/안데스 이중-M 유전자 한타바이러스 DNA 백신인 pWRG/HA-M의 면역원성을 시험하였다. 상기 백신은 한탄 바이러스와 안데스 바이러스를 중화하는 항체반응을 유도하였다(표 8 참조). 하나의 햄스터 실험에서, 본 발명자들은, 상기 백신이 햄스터에서는 항체반응을 유도하지 않았다는 점에서, 상기 플라스미드가 안데스 바이러스 플라스미드와 유사하다는 것을 발견하였다. 그러나, 이것이 원숭이에서 중화항체를 유도한다는 사실은, 이것이 인간에서 중화항체를 유도할 수 있다는 것을 암시한다.

더욱이, 본 출원은 또한 한타바이러스에 노출된 후, 한타바이러스 감염의 발병을 예방하는 데에 효과적인, 예방적 또는 치료적으로 사용될 수 있는 한타바이러스 면역글로블린 조성물에 대해 설명한다. 현재, HPS 또는 HFRS 질병을 치료하거나, 또는 한타바이러스에 노출되거나 또는 한타바이러스 질병을 가질 가능성이 있는 사람에게 투약하기 위한 특이적인 의약 또는 면역치료제는 없다. 본 발명의 한타바이러스 면역글로블린 조성물은, 안데스 바이러스 M 유전자 및/또는 한탄 바이러스 M 유전자를 발현하는 플라스미드가 포함된 DNA 백신으로 면역접종된 동물/인간 집단 유래의 폴리클론 혈청으로 조성되어 있다. 상기 폴리클론 혈청은 안데스 바이러스 및/또는 한탄 바이러스에 대한 중화항체를 포함할 것이다. 전형적인 폴리클론 면역 혈청 제품과 달리, 본 발명의 방법(영장류 항체를 생성하는 피접종자에 대한 DNA 면역접종)은 생바이러스와 관련이 없고, 생존 한타바이러스 질병을 갖는환자들의 확인을 필요로 하지 않는다.

그러므로, 본 발명의 목적은 한타바이러스 게놈 절편을 포함하는 한타바이러스 DNA 백신을 제공하는 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 서열번호1로 특정된 SEOV M 게놈 절편 또는 서열번호2로 특정된 SEOV S 게놈 절편을 포함하는 SEOV 한타바이러스 DNA 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 Genbank 서열 기탁 번호(genbank sequence accession number) M14627의 2~3565번째 염기로 특정된 HTNV M 게놈 절편을 포함하는 HTNV 한타바이러스 DNA 백신과 관련된다. 더욱이, 본 발명은 GenBank 서열 기탁번호 AF291703의 2~3671번째 염기의 ANDV M 게놈을 포함하는 ANDV DNA 백신과 관련된다. 본 발명은 또한 서열번호3의 HTNV M 게놈 절편과 서열번호4의 ANDV M 게놈 절편을 포함하는 HTNV/ANDV DNA 백신과 관련된다. 상기한 한타바이러스 DNA 절편은 DNA 백신을 단독으로, 또는 같은 구조체 또는 다른 구조체상에 존재하는 형태로 다른 한타바이러스 DNA 절편과 조합하여 대상에게 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 대상 내에서 한타바이러스에 대한 면역반응 유도방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 대상에게 한타바이러스의 게놈 절편을 포함하는 DNA 단편을 주입하는 것을 포함한다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 SEOV의 M 또는 S 게놈 절편을 제공하므로써 SEOV 한타바이러스에 대한 면역반응 유도 방법, HTNV의 M 게놈 절편을 제공하므로써 HTNV 한타바이러스에 대한 면역반응 유도방법, ANDV의 M 게놈 절편을 제공하므로써 ANDV 한타바이러스에 대한 면역반응 유도방법에 관한 것이다. 한탄 바이러스 및 도브라바 또는 신놈버 및 블랙크릭카날 바이러스와 같은 다른 한타바이러스에 대한 교차보호도 역시 본 발명의 목적 중의 하나이다.

각 M 유전자가 대상에서 발현되도록 안데스 M 유전자 DNA 백신과 조합된 한탄 M 유전자 DNA 백신을 포함하는 DNA 백신을 대상에게 제공하므로써, HFRS와 HFS 한타바이러스 모두에 대한 면역반응을 유도하고, 심각한 질환을 야기하는 모든 한타바이러스에 대해 보호하는 DNA 백신을 제공하는 것도 역시 본 발명의 목적 중의 하나이다. 본 발명의 하나의 측면에 의하면, 상기한 바와 같이 한탄 M 유전자 또는 안데스 M 유전자는 별도로 즉, 별도의 벡터로 투여되거나, 같은 벡터에 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 한타바이러스 감염에 대한 추가적인 보호를 제공할 수 있는 다가(multivalent)의 백신을 제조하기 위하여, 푸우말라와 같은 다른 한타바이러스 유래의 다른 M 유전자 절편이 한탄 DNA 백신 및 안데스 DNA 백신과 조합될 수 있다.

본 발명의 하나의 측면에 의하면, 상기 DNA 백신의 전달은 작은 담지체 입자를 DNA 백신으로 도포하고, 상기 DNA-도포 담지체 입자를 입자 충돌을 통하여 동물의 표피 조직으로 전달하므로써 이루어진다. 이 방법은 표피 또는 점액 조직 중의 하나로의 전달, 또는 말단 혈액 세포로의 전달용으로 변경될 수 있으며, 그렇게 하므로써 면역접종된 개체 내에서의 체액성, 세포 매개성 및 분비성 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 DNA 백신은 면역접종되는 개체에게 내재적으로 안전하며, 투여하기에 고통스럽지 않으며, 심각한 부작용을 일으키지 않는다. 더욱이, 본발명은 에어로졸 전달(aerosol transmission)에 의하여 전파될 수 있는 한타바이러스의 성장 또는 사용을 필요로 하지 않는다.

본 발명의 다른 목적은, 적어도 하나, 바람직하게는 2개 이상의 한타바이러스, 예로써 안데스 바이러스 및/또는 한탄 바이러스 M 절편에 대한 중화항체를 포함하는 영장류 폴리클론 혈청 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기한 항체와 기능적으로 균등한 항체를 제공하는 것이다. 이러한 기능적으로 균등한 항체는 상기한 항체와 적어도 하나의 주요한 기능적 특성을 실질적으로 공유하며, 여기서는 다음을 포함하는 의미이다: 생체외(in vitro) 면역반응성, 예방적으로 또는 치료적으로 투여되었을 때 한타바이러스에 대한 보호, 및 G1 및/또는 G2상의 같은 결합부위에 대한 경쟁. 상기 항체들은 IgG, IgM 또는 IgA와 같은 어떠한 족(class), 또는 IgG1, IgG2a와 같은 어떠한 하위족, 및 당해 기술분야에서 공지인 다른 하위족일 수 있다. 더욱이, 상기 항체들은 파아지 발현(phage display)과 같은 어떠한 방법에 의해서 제조될 수 있고, 인간 항체성과 같은 원하는 특성을 가지는 항체를 생산하는, 박테리아, 곤충, 포유류 또는 다른 타입의 세포 또는 세포주(cell line)를 포함하는, 어떠한 유기체 또는 세포주에서 제조될 수 있다. 상기 항체들은 또한 다른 종 유래의 Fab 부위 및 Fc 부위를 결합하므로써 형성될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은, 치료적으로 또는 예방적으로 유효량의 본 발명의 혈청 또는 본 발명의 항체 혼합물을, 이러한 치료가 필요한 대상에게 투여하므로써 한타바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 조합된, 한타바이러스 질병에 대해 보호하는 치료적으로 또는 예방적으로 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는, 한타바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 수동면역 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 본 발명의 항체를 사용하여 샘플에서 한타바이러스의 존재를 분석하므로써, 한타바이러스 감염에 대한 진단방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 한타바이러스 감염의 검출을 위한 새로운 면역프로브와 시험키트를 제공하는 것이다. 면역프로브를 위한 항체는, 예로써 효소 또는 방사성 핵체(radionuclide)와 같은 적당한 리포터 분자에 직접 또는 간접적으로 부착된다. 상기 시험키트는 본 발명에 따른 하나 이상의 항체를 수용하는 용기, 및 한타바이러스에 결합되어 면역 복합체를 형성하기 위한 항체의 사용 및, 상기 면역 복합체의 형성을 검출하기 위한 항체의 사용 설명서를 포함하며. 면역 복합체의 존재 여부는 한타바이러스의 존재 여부와 상관관계가 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 상기 특징들 및 다른 특징들, 양상 및 이점들은 하기의 설명, 첨부된 청구범위 및 첨부 도면을 참조하면 보다 잘 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에서는, 한타바이러스에 대한 개체의 면역접종용 조성물 및 그 방법을 설명한다. 상기 방법은 항원이 세포 속에서 발현되어, 면역반응이 개체 내에서 유도되도록 개체의 세포로 한타바이러스 항원을 코드하는 DNA를 전달하는 것을 포함한다.

DNA 면역접종은 표적 세포내에서 올바르게 접혀진(folded) 항원의 생산을 유도하기 위하여 생체내(in vivo)로 항원-코드 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것과 관련된다. 상기 DNA 백신의 도입에 의하여, 병원성 단백질 또는 단백질들과 관련되어 있는 구조적 단백질 결정기(determinant)를 그러한 세포 내에서 발현되도록 한다. 가공된 구조적 단백질들은 정상세포의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 항원과 결합하여 형질도입된 세포의 세포표면에 표시될 것이다. 그것은 세포-매개성 면역이 일차적 감염예방 수단이 아닐 때 조차도, 확립된 감염을 해소하는 데에도 또한 중요하다. 더욱이, 발현하는 형질도입된 세포에 의하여 배출된 구조 단백질은 또한 항원-제시 세포에 의하여 섭취되어 전신적 체액성 항체 반응을 야기시킬 수 있다.

소망의 면역 반응을 일어나게 하기 위하여, 면역접종된 개체의 형질도입된 세포가 하나 이상의 주요 바이러스 항원 결정기를 발현시키도록 할 수 있는 DNA 백신 구조체가 필요하다. 이는 바이러스 당단백질 또는 캡시드 성분을 코드하는 바이러스 게놈 영역을 확인하고, 그러한 코드 서열을 피접종자의 세포 내에서 그 서열들을 발현시킬 수 있는 프로모터에 연결하므로써 이루어질 수 있다. 다른 방법으로는, 바이러스 게놈 그 자체, 또는 게놈의 일부가 사용될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명은 한타바이러스로부터 유래한 항원을 코드하는 DNA 또는 cDNA 절편에 관한 것이다. 한타바이러스라는 것은, 신 놈브레 바이러스(SNV), 블랙크릭 카날 바이러스(BCCV), 바유 바이러스(BAYV), 뉴욕 바이러스(NYV), 안데스 바이러스(ANDV) 및 라구나 네그라 바이러스(LNV)와 같은 한타바이러스 폐증후군(HPS) 한타바이러스뿐만 아니라 한탄 바이러스(HTNV), 도브라바-벨그라데 바이러스(DOBV), 푸우말라 바이러스(PUUV) 및 서울 바이러스(SEOV)와 같은 어떤 신증후군출혈열(HFRS) 한타바이러스 및 인간에게 질병을 야기시키는 것으로 알려진 다른 어떤 한타바이러스를 의미한다.

더욱 구체적으로는, 2개의 엔벨로프 당단백질(G1 및 G2)(서열번호1)을 코드하는 한타바이러스 게놈 M 절편, 및 뉴클레오캡시드 단백질(서열번호2)을 코드하는 한타바이러스 게놈 S 절편이 SEOV, SR-11 균주(Kitamura, T. 등, 1983, Jpn. J. Med. Sci. Biol. 36, 17∼25) 바이러스 게놈(Arikawa, J 등, 1990, Virology 176, 114∼125)으로부터 추론되었다. M 절편(서열번호1로 특정된다)은 GenBank 기탁번호 M34882로 기탁되어 있고, 서울(SR-11) M 유전자의 2 내지 3602번째 뉴클레오티드에 해당한다. S 절편(서열번호2로 특정된다)은 GenBank 기탁번호 M34881로 기탁되어 있고, 서울(SR-11) S 유전자의 2 내지 1699번째 뉴클레오티드에 해당한다.

G1/G2를 인코드하는 한탄 한타바이러스(HTNV) M 절편은 한탄 M 서열 기탁번호 M14627로 공표되어 있고, 한탄 바이러스(종 76~118)의 2 내지 3565번째 뉴클레오티드에 해당한다. G1/G2를 인코드하는 안데스 바이러스 M 절편은 GenBank 기탁번호 AF291703으로 기탁되어 있고, 안데스종 칠레-9717869의 2 내지 3671번째 뉴클레오티드에 해당한다.

본 발명에 또한 관련되는 DNA 또는 폴리뉴클레오티드 서열에는 보호성 에피토프 또는 항원 결정기를 포함하고 있는 다른 한타바이러스 유래의 M 또는 S 유전자 절편 유래의 단편들이 포함된다. 3차원 구조(confomational)에 의하여 형성될수도 있는 그러한 에피토프에는, G1 및 G2 모두에 대한 단일클론 항체가 수동보호(passive protection) 실험에서 바이러스를 중화하고, 설치류를 보호하는 것으로 나타났기 때문에, G1 및/또는 G2 유래의 서열들이 포함될 수 있다. 더욱이, N의 아미노 말단은 아주 면역원성이 높으며, 다른 연구자들이 상기 아미노 말단 영역으로 면역접종하는 다른 방법들에 의하여 보호 면역을 제공할 수 있다는 것을 증명하였다(Lundkvist, 1996, 상게서; Ulrich, 1998, 상게서).

상기 파생된 서열은 뉴클레오티드 서열 자체로부터 반드시 물리적으로 파생될 필요는 없고, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드가 파생될 영역(들)의 염기서열에 의하여 제공되는 정보에 근거하여 화학 합성, DNA 복제, 역전사 또는 전사를 포함하는 어떠한 방법에 의하여 만들어 질 수 있다. 더욱이, 지정된 서열의 영역에 해당하는 영역들의 조합은 의도하는 용도에 일치되도록 당업계에 알려진 방법으로 변형될 수 있다. 본 발명의 서열은 한타바이러스 검출용의 혼성화 검정 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 진단 검정(diagnostic assay)에 사용될 수 있다.

SEOV종 SR-11의 M 및 S 게놈 절편의 RT-PCR 클로닝은 이전에 기술되었다(Arikawa 등, 1990, Virology 176, 114∼125). 서울(SR-11) M 유전자 뉴클레오티드 2번째에서 3602번째를 포함하는 DNA 단편을 BglII 및 BamHI을 사용하여 YMIS/SR 11-M(Arikawa, 1990, 상게서)으로부터 잘라내었다. 이 단편을 pWRG7077의 BamHI 부위에 연결하여 pWRG/SEO-M(서열번호3)을 만들었다. pWRG/SEO-M은 클로닝 벡터 바큘로바이러스 전이 벡터 YMIS로부터 파생된 추가의 뉴클레오티드를 포함하고 있다.

서울(SR-11) S 유전자의 2번째 내지 1699번째 뉴클레오티드로부터 유래한DNA 단편을 EcoRI을 사용하여 pBSKS+/SR11-S(Arikawa, 1990, 상게서)로부터 잘라내었다. 이 단편을 클리나우(Klenow)로 처리하여 제한 부위를 평활화하였고, 그 후 pWRG7077(Madison, Wisconsin 소재의 PowderJect, Inc. 제품)의 클리나우-평활화 NotI 부위에 연결하여 pWRG/SEO-S(서열번호4)을 만들었다. pWRG/SEO-S는 클로닝 벡터 pBSKS+로부터 파생된 추가의 뉴클레오티드를 포함하고 있다.

HTNV M DNA 백신 플라스미드인 pWRG/HTN-M(x)(서열번호7)는 본질적으로 다음과 같이 제조되었다. 우선, HTNV G1/G2를 인코드하는 DNA는 pTZ19RHTNMm(Schmaljohn 등, 1989, In: Genetics and pathogenicity of negative strand viruses, D. Kolokofsky 및 B. Mahy, Eds., pp. 58~66. Elsevier Press, Amsterdam)으로부터BglII단편으로 절단되어,BamHI-절단 pWRG7077 벡터내로 연결되었다. 상기 플라스미드는 G2를 발현하나, G1은 발현하지 않는다. 벡터의 NotI 클로닝 부위와 SEOV M 비코딩 영역 사이에서 발견되는 24염기쌍(bp)의 외래 DNA(서열번호6)(도 9A)가 결실되면 SEOV M 플라스미드 pWRG/SEO-M가 효과적으로 G1을 발현할 수 없다는 사실을 발견한 후에, 본 발명자들은 상기 문제를 해결하였다. 상기 외래 DNA는 SEOV 유전자의 초기 클로닝과 서브클로닝동안 사용된 방법으로부터 유래된다. 24bp 서열이 결실된 이 SEOV M 구조체는 G1를 발현하지 못했지만, G2는 발현하였다(도 9B). 만약 24bp 서열이 상기 구조체내에 역방향이 아닌 정방향으로 삽입되면, G1의 발현은 회복되었다(도 9B). 이러한 결과는 뉴클레오티드수가 아닌 뉴클레오티드 서열이 G1 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다. 효율적인 G1 발현을 위한 서열 지도 제작을 위해, 1~12번째 또는 13~24번째의 뉴클레오티드로 된 외래서열이 포함된 구조체를 제작하였다. 플라스미드에 13~24번째의 뉴클레오티드가 아닌 1~12번째의 뉴클레오티드가 존재할 때, G1이 발현되었다(도 9B). 4~10번째의 뉴클레오티드로 된 DNA(TCTGCAG)는 인트론 A(즉, 스플라이스 수용체 부위:splice acceptor site)(Stenberg 등, 1984, J. Virol. 49, 190~199)의 마지막 7개의 뉴클레오티드와 동일하였다. 추정되는 스플라이스 수용체 부위의 2개의 뉴클레오티드 AG를 CC로 변이시키는 것은 G1의 발현에 영향을 미치지 않으며, 이는 이 영역이 스플라이싱(splicing)에 관여할 경우, 인트론 A 스플라이스 부위에서 정확한 서열을 유지할 필요가 없음을 의미한다(도 9B). 1~8번째 뉴클레오티드로 된 외래 DNA를 포함하는 구조체를 제조하였으며, 이는 G1의 효율적인 발현을 회복시키기에 충분하였다(도 9C). 따라서, NotI 클로닝 부위와 SEOV M 유전자의 5' 비코딩 영역 사이에 위치하는 GGATCTGC 서열이, pWRG7077-기초 DNA 백신으로부터 G1의 효율적인 발현을 위해 필요하다는 결론을 내렸다.

상기 SEOV M의 발견을 기초로, HTNV M 유전자의 상류에 외래 서열을 포함하는 것이 DNA 백신 플라스미드로부터 HTNV G1 및 G2 모두를 발현할 수 없는 문제를 해결할 수 있다는 가정을 하였다. HTNV M 유전자의 상류에 외래 서열이 포함된 플라스미드를 제작하였고, 이로써 G1 및 G2 모두를 발현하는 클론인 pWRG/HTN-M(x)를 획득하였다(도 9D 및 10). 외래 서열이 결실되면 G1은 발현되지 않았고, 외래 서열이 회복되면 G1이 효과적으로 발현되었다(도 9D). 이러한 데이터는 외래 서열이 SEOV G1의 성공적인 발현뿐만 아니라, HTNV G1의 성공적인 발현을 위하여도 필요하다는 것을 확실히 하였다. 상기 서열은 SEOV 또는 HTNV로부터 G2 발현에는 영향을 미치지 않았다(도 9). 외래 서열이 G1 발현에는 영향을 미치나, G2 발현에는 영향을 미치지 않는 메커니즘은 알려져 있지 않다.

ANDV M 유전자-기초 DNA 백신 플라스미드인 pWRG/AND-M(서열번호8)을 제작하기 위하여, ANDV-감염 Vero E6으로부터 바이러스 RNA를 분리하여, 역전사시켰다. 공지의 SNV 및 PUUV 서열에 기초하여 제작된 정프라이머(forward primer) 및 역프라이머(reverse primer)를 각각 역전사 반응에 사용하였다. NotI 제한부위(하선표시)와 앞서 발견한 M 유전자 비코딩 영역의 상류(upstream)에 있는 24개의 뉴클레오티드를 포함하는 정프라이머는, 상기한 바와 같이, pWRG/HTN-M에서의 G1 발현에 중요하였다. cDNA를 정제하여 PCR 반응의 주형(template)으로 사용하였다. 상기 PCR 산물을NotI와BamHI로 절단한 다음,NotI-BglII-절단 pWRG7077 벡터에 연결하여 pWRG/AND-M을 제작하였다. ANDV M 유전자 서열은 밝혀져 있지 않았으며, 따라서 M 유전자와 벡터/삽입체 연결부의 염기서열을 밝혔다. ANDV종 칠레-9717869의 전장 M 유전자를 pWRG7077내로 RT-PCR 클로닝하여 pWRG/AND-M을 제조하였다. 전체 M 유전자 오픈 리딩 프레임(open reading frame:ORF)을 서열 분석하였다. 상기 클로닝된 M 유전자의 서열은, GenBank 기탁번호 AF291703의 공지의 M 유전자 서열과 거의 동일하였고, 이는 바이러스 분리체가 같은 설치류에서 유래된 것(Meisner 등, 2002, Virus Res. 89, 131~143)이므로 당연한 것이다. 2개의 아데닌이 구아닌으로 뉴클레오티드 변이되었다. 1504번째 염기위치에서의 변이는 침묵 돌연변이(silent)였고, 1840번째 염기위치에서의 변이 결과, 597번째 아미노산이 트레오닌에서 알라닌으로 치환되었다.

한탄 M 유전자와 안데스 M 유전자 모두를 포함하는 구조체를 제조하였다. 한탄 M 유전자와 안데스 M 유전자를 pWRG7077에 클로닝하여, pWRG/HA-M(서열번호9, 도 19)을 제조하였다. 각 M 유전자의 양쪽에는 각각 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 인트론 A(CMV 인트론 A), 및 소 성장호르몬 폴리아데닌 첨가 부위가 존재한다. 대부분의 5' 및 3' 비코딩 서열뿐 아니라, 한탄 바이러스 및 안데스 바이러스 M 유전자 ORF 전체가 상기 구조체에 포함되어 있다. 또한, 24bp 서열이 각 한타바이러스 M 유전자와 그것의 각 CMV 인트론 A 서열 사이에 위치한다. 상기한 바와 같이, 알려지지 않은 이유로, 상기 24bp 서열(또는 그것의 일부분)이 G1 당단백질의 발현을 위하여 필요하다는 것을 밝혀냈다. pWRG/HA-M이 포유류 세포에 도입되면, 한탄 바이러스 및 안데스 바이러스 M 유전자가 발현된다. 그 발현 산물은 한탄 바이러스 G1과 G2 당단백질, 및 안데스 바이러스 G1과 G2 당단백질로 구성된다.

유전적 구조체에 가해지는 어떤 뉴클레오티드 서열 변화는, 예를 들면 유전자 코드의 다의성(degeneracy)으로 인하여 구조체에 의하여 코드되는 단백질에 거의 영향을 미치지 않거나 전혀 영향을 미치지 않을 수 있다는 것은 당업계에서 잘 알려져 있다. 그러한 변화는 다른 아미노산을 코드하나, 코드된 단백질의 거동은 크게 변화시키지 않는 침묵 점 돌연변이(silent point mutation) 또는 점돌연변이에 기인하는 것이다. 소망의 효과, 즉 한타바이러스에 대한 보호 면역반응의 유도가 일어나도록 하는 상기 구조체의 능력에 영향을 미치지 않고 코드영역의 일부분이 제거될 수도 있다는 사실도 잘 알려져 있다. 아미노산 조성을 변화시키므로써 코드된 단백질의 항원성(antigenicity)을 증가시키기 위하여 어떤 이로운 공정을밟을 수 있다는 사실도 당업계에서 잘 알려져 있다. 아미노산 조성에 있어서의 그러한 변화는 단백질을 코드하는 유전적 서열을 변화시키므로써 도입될 수 있다. 한타바이러스의 M 및 S 절편의 그러한 모든 변화 및 변조는 본 발명의 범위 내에 있는 등가물이라고 여겨진다.

소망의 항원을 코드하는 DNA는 선형화된 플라스미드, 원형 플라스미드, 복제할 수 있는 플라스미드, 에피좀(episome), RNA 등을 포함한 어떠한 적절한 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직하기로는, 상기 유전자는 플라스미드 내에 포함되는 것이다. 구체적으로 바람직한 구체예에서, 상기 플라스미드는 발현 벡터이다. 유전물질을 발현할 수 있는 각 발현벡터는 일반적인 재조합 기술을 사용하여 만들어질 수 있다. 일반적인 클로닝 방법을 위하여는 Maniatis 등, 1985Molecular Cloning: A Laboratory Manual또는DNA Cloning, Vol. I 및 II(D.N. Glover, ed., 1985) 참조.

그러므로, 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 상기한 벡터 및 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. 상기 벡터는 pCRII(Invitrogen) 또는 pJW4303(Konishi, E 등, 1992, Virology 188: 714)과 같은 플라스미드의 형태, 또는 바이러스성 벡터, 예컨대 아데노바이러스 또는 베네주엘라 말 뇌염 바이러스 및 당업계에서 알려진 다른 바이러스와 같은 어떤 발현벡터의 형태를 가질 수 있다. 바람직하기로는, 표적세포에서 작동할 수 있는 프로모터 서열이 상기 DNA 서열에 작동할 수 있도록 연결될 수 있다. 발현될 코드된 단백질의 코드 서열의 5′, 또는 상류에 연결될 수 있는 그러한 몇개의 프로모터가 포유동물 시스템용으로 알려져있다. 바람직한 프로모터는 인간 사이토메칼로바이러스 아주(immediate) 초기 프로모터이다. 하류 전사 터미네이터, 또는 소 성장호르몬 유전자의 폴리A 부가 서열과 같은 폴리아데닌첨가 서열이 상기 단백질 코드 영역의 3′에 또한 부가될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용될 적절한 구조체는 도1의 pWRG7077(4326bp)(PowderJect Vaccines, Inc., Madison, WI)이다. pWRG7077은 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 아주 초기 프로모터(IE) 및 소 성장호르몬 폴리A 첨가 부위를 포함하고 있다. 프로모터와 폴리A 첨가 부위 사이에, 발현 플라스미드에 존재하는 경우 전사를 증가시키는 것으로 입증되어 있는 hCMV IE 프로모터와 연결되어 있는 천연유래의 서열인, 인트론A가 있다. 인트론A의 하류이고, 인트론A와 폴리A 첨가 서열 사이에는 한타바이러스 M 및 S DNA가 클로닝될 수 있는 특유의 클로닝 부위들이 있다. 또한, pWRG7077 상에는 카나마이신에 대하여 박테리아 숙주-세포에 저항성을 줄 수 있는 유전자가 있다. 한타바이러스 G1 및/또는 G2 또는 뉴클레오캡시드 펩티드를 코드하는 어떠한 단편이라도 당업계에 알려진 방법을 사용하여, pWRG7077 내의 클로닝 부위 중의 하나에 클로닝할 수 있다.

또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 상기한 재조합 DNA 구조체로 안정되게 형질전환 또는 형질도입된 숙주세포와 관련된다. 상기 숙주세포는 바실러스(Bacillus) 또는 대장균(E.coli)과 같은 원핵생물 또는 사카로마이세스(Saccharomyces)나 피치아(Pichia), 또는 포유동물 또는 곤충세포와 같은 진핵생물일 수 있다. 한타바이러스 서열을 포함하고 있는 벡터는 박테리아에서 발현되고, 발현된 산물은 진단 절차용 또는 백신으로 사용될 수 있다. 일반적인 클로닝 방법에 대하여는 Maniatis 등, 1985Molecular Cloning: A Laboratory Manual또는DNA Cloning, Vol. I 및 II(D.N. Glover, ed., 1985) 참조. 상기 DNA 서열은 벡터내에서 한타바이러스 단백질 또는 펩티드의 정제를 위하여 고도로 정제된 IgG 분자, 면역증강제(adjuvant), 담지체(carrier), 또는 어떤 약제(agent)와 작동할 수 있는 상태로 연결되어 있을 수 있다. 상기 형질전환 또는 형질도입된 숙주세포는 상기한 DNA 서열의 생성원(source)으로서 사용될 수 있다. 재조합 분자가 발현시스템의 형태를 취할 때에는, 상기 형질전환 또는 형질도입된 세포는 상기 DNA에 의하여 코드된 단백질 또는 펩티드의 생성원으로서 사용될 수 있다. 상기 DNA는 한타바이러스 서열이 형질도입된 세포 내에서 발현될 수 있는 프로모터에 작동할 수 있도록 연결되어 있는 한, 원형 또는 선형, 또는 선형화된 플라스미드로서 사용될 수 있다.

본 출원에서는 DNA 백신에 의한 한타바이러스에 대한 보호 면역의 유도에 관하여 설명한다. 상기 DNA는 구강 또는 폐를 통한 전달에 의하여 피접종자의 조직으로 주입하거나, 입자 충돌(예컨대, 유전자 총)에 의한 접종에 의하여 전달될 수 있다. 세포 내에서 상기 DNA가 발현되고 소망의 항원이 만들어지는 한, 이들 중 어떠한 방법이라도 DNA를 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 본 출원에서는 두 가지 방법을 예시하였으며, 모두 백신으로 보호 면역 반응을 유도하는 데 성공적인 것으로 나타났다.

입자 충돌에 의하여 DNA 백신을 전달하기 위하여, 1995년 7월 27일 공개된 WO 95/19799에 기재된PowderJect-XR ^TM유전자 총 장치를 사용하기 위하여 선택하였다. 다른 기계들도 사용할 수 있으며, 이는 당업계의 종사자들에게 알려져 있는 것이다. DNA-도포된 금 구슬을 고속도 입자 충돌에 의하여 표피세포로 직접적으로 전달하는 이 기계는 동일한 DNA를 다른 비경구적 경로를 통한 접종에 비하여 보다 적은 양의 DNA로 체액성 및 세포-매개성 면역 반응 모두를 더 효과적으로 유도하는 것으로 나타났다(Eisenbraun, M 등, 1993, DNA Cell. Biol. 12: 791; Fynan, E.F. 등, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11478; Haynes, J.R. 등, 1994, AIDS Res. Hum. Retroviruses 10: Suppl. 2: S43; Pertmer, T.M. 등, 1995, Vaccine 13: 1427). 또한, DNA 후보 백신을 표피에 접종하는 것은, 진드기에 물린 후 바이러스 복제의 중요한 자연적 병소로서, 일반적으로 15 내지 30일 내에 벗겨져 나가는 면역학적으로 활성있는 조직 내에서 유전자를 발현시키는 이점도 제공한다(Bos, J. D. 등, 1997, Clin. Exp. Immunol. 107 Suppl. 1:3; Labuda, M 등, 1996, Virology 219: 357; Rambukkana, A 등, 1995, Lab. Invest. 73: 521; Stingl, G 등, 1993, Recent Results Cancer Res. 128: 45). 후보 백신에는 신 놈브레 바이러스, 블랙크릭 카날 바이러스, 바유 바이러스, 뉴욕 바이러스, 안데스 바이러스 및 라구나 네그라 바이러스와 같은 한타바이러스 폐증후군(HPS) 한타바이러스뿐만 아니라, 서울 바이러스, 한탄 바이러스, 푸우말라 바이러스 및 도브라바 바이러스와 같은 다른 HFRS 바이러스 유래의 G1 및/또는 G2를 포함하는, M 게놈 절편을 가지는 입자들이 포함된다. 다른 바이러스 유래의 DNA 절편은 소망의 면역 반응을 가져오는 한, 다른 입자 상 또는 동일 입자 상에 있을 수 있다. 더욱이, 본 발명은 다른 한타바이러스 유래의 하나이상의 DNA를 포함하는 백신에 관한 것이기도 하다. 그러한 백신은 다가 백신(multivalent vaccine)으로 표시한다. 상기 백신은 하나 또는 여러 한타바이러스에의 노출로부터 유래하는 병리에 대하여 보호하고자 하는 것이다. 상기 백신은 또한 백신의 항원성을 증가시키거나, 부작용을 감소시키는 시약과 조합되어질 수 있다.

가속화된 입자 유전자 전달 또는 입자 충돌 기술은 세포내로 전달되어질 DNA를 전달 과정에 의하여 형질전환될 소망의 세포에 비하여 상대적으로 작도록 고안된, 극히 작은 담지체 입자(carrier particle) 상에 도포하는 것에 근거한 것이다. 소망의 유전자를 포함하는 상기 DNA 서열은 작은 불활성 입자상에서 단순히 건조될 수 있다. 상기 입자는 불활성 금속(예컨대, 금, 은, 플라티늄, 텅스텐 등) 또는 불활성 플라스틱(예컨대, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 등)과 같은 어떠한 불활성 물질로 만들어질 수 있다. 바람직하기로는, 상기 입자는 금, 플라티늄 또는 텅스텐으로 만들어진 것이다. 가장 바람직하기로는, 상기 입자는 금으로 만들어진 것이다. 적절하기로는, 상기 입자는 구형이며, 0.5 내지 5μ, 바람직하기로는 1 내지 3μ의 직경을 가진다.

유전자 도입에 적절한 형태로 준비된 소망의 유전자를 포함하는 DNA 서열은 나(裸) 금 또는 텅스텐 펠렛 상에 단순히 건조되어질 수 있다. 그러나, 그러한 형태의 DNA 분자는 상대적으로 단기간의 안정성을 가질 수 있고, 입자 그 자체의 금속성 또는 옥사이드 기재와의 화학반응으로 인하여 다소 빨리 분해되어 버릴 수 있다. 그러므로, 만약 담지체 입자들이 먼저 캡슐화제(encapsulating agent)로 도포되면, DNA 가닥은 안정성이 상당히 개선되어, 심지어는 수주 동안에 걸쳐서도 유의하게 분해하지 않는다. 적절한 캡슐화제는 DNA가 적용되기 전에 담지체 입자들에 적용될 수 있는 폴리라이신(분자량 200,000)이다. 스퍼미딘을 포함한, 폴리머성 또는 그외의 다른 캡슐화제가 비슷한 캡슐화제로 유용할 수 있다. 상기 폴리라이신은 0.02% 폴리라이신 용액으로 금 입자를 세척하는 단계, 그렇게 도포된 입자를 공기 건조하거나 열 건조하는 단계에 의하여 입자에 적용된다. 일단 폴리라이신으로 도포된 금속 입자가 적절하게 건조되면, 그 후 DNA 가닥을 상기 입자 상에 로드한다.

상기 DNA는 0.5 내지 30㎍ DNA/mg 금구슬 구의 속도로 입자상에 로드된다. 금에 대한 DNA의 바람직한 비율(DNA/금)은 0.5∼5.0㎍ DNA/mg 금이다. 시료 과정(sample procedure)은 감마선 조사된(바람직하기로는 약 30kGy) 테프젤(tefzel) 튜빙으로 시작한다. 금을 칭량하여 마이크로퓨지 튜브에 넣고, 약 0.05M인 스퍼미딘(자유 염기)을 첨가하고 혼합한 후, DNA를 첨가한다. 미세한 칼슘 침전물을 제공하기 위하여 10% CaCl 용액을 DNA와 함께 약 10분 동안 배양한다. 침전물은 구슬 상에 DNA를 함께 포함하고 있다. 튜브는 마이크로퓨지하고, 펠렛을 재현탁시키고 100% 에탄올로 세척한 후, 최종 산물을 0.0025mg/ml PVP로 100% 에탄올에 재현탁시킨다. 그 후 DNA를 함유한 금을 튜빙에 적용하고 건조시킨다.

가속화된 입자 유전자 형질도입 기술에 관한 일반적인 접근법은 미국 특허 제4,945,050호에 기재되어 있다. 그 접근법의 개선된 변형에 근거한 장치를 Madison Wisconsin 소재의 PowderJect Vaccines, Inc.사로부터 상업적으로 구입할 수 있고, 이는 WO 95/19799에 기재되어 있다. 본 명세서에서 인용된 상게서 및 하게서의 모든 문헌은 그 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함되어진다. 요약하면, DNA-도포된 입자는 시료 카트리지를 형성하기에 적당한 길이로 잘려진 플라스틱 튜빙의 내부 표면상에 침착된다. 시료 카트리지를 압축 기체(예컨대, 카트리지로부터 입자를 떼어내기에 충분한 압력, 예컨대, 350∼400psi의 헬륨)의 경로에 위치시킨다. 상기 입자는 기체 흐름 속으로 흘러들어가서, 표적 세포를 향한 충분한 힘으로 전달되어 조직의 세포로 들어간다. 추가의 상세한 내용은 공개된 장치 출원에서 얻을 수 있다.

도포된 담지체 입자는 표적 세포의 내부에 담지체 입자가 자리잡도록 형질전환될 세포를 향하여 물리적으로 가속된다. 이 기술은 in vitro 또는 in vivo 세포 어느 것에나 사용될 수 있다. 얼마간의 빈도로, 미리 담지체 입자상에 도포된 DNA는 표적 세포내에서 발현된다. 이 유전자 발현 기술은 박테리아 및 효모로부터 고등 식물 및 동물에 이르는, 원핵생물 및 진핵생물에서 적용되는 것이 입증되었다. 따라서, 가속화된 입자법에 의하면 아주 다양한 조직형의 세포내로 유전자를 전달하기 위한 편리한 방법론이 제공되고, 처리되는 개체에 어떤 나쁜 충격이나 효과를 주지않고 in situ 및 in vivo 세포에 그러한 유전자를 전달할 수 있는 능력이 제공된다. 그러므로, 가속화된 입자법에 의하면, 각각 담지체가 가속화되는 위치 및 힘을 변화시키므로써, 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA 백신이 특정한 조직 및 조직내의 특정한 세포층으로 향하도록 할 수 있다는 점에서 또한 바람직하다. 따라서, 이 기술은 항원 단백질용 유전자를 표피(epidermis) 내로 전달하는데 특히 적당하다.

DNA 백신은 개체내에서 소망의 항원 반응을 일으키기 위하여 다양한 민감성조직형에 비침투적 방법으로 전달될 수 있다. 가장 바람직하게는, 유전적 백신이 표피내로 도입될 수 있다. 그러한, 전달에 의하면 전신성 체액성 면역반응을 일으킬 것이고, 실제로 그렇게 밝혀졌다.

이 기술로부터 추가의 유효성을 얻기 위하여, 면역접종된 개체 내에서 점액성, 체액성 및 세포성 면역 반응이 일어나도록 하기 위하여, 상기 유전자를 점액조직 표면으로 전달하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 표피, 말단 혈액 세포, 예를 들면, in vitro에서 처리되어 개체내로 되돌려 보낼 수 있는 림프구 및 다양한 구강, 상기도(upper respiratory) 및 생식기의 점액 표면 상의 어떤 갯수의 부위들을 포함하여, 다양하고 적당한 전달 부위를 이용할 수 있다.

유전자 총-기초 DNA 면역에 의하면, DNA의 직접적인 세포내 전달이 이루어지고, 고수준의 보호 면역을 유도하고, 기존 접종에 사용되는 방법 보다 약 1,000배 적은 DNA를 필요로 한다.

더욱이, 유전자 총 전달에 의하면, 전달되는 입자의 수와 입자당 DNA의 양을 체계적으로 변화시키므로써 세포내 DNA 전달을 제어할 수 있기 때문에, 주어진 표피 부위 내에서의 항원 생산의 수준 및 형태를 정확하게 제어할 수 있게 된다. 이 항원 생산의 수준 및 형태에 대한 정확한 제어에 의하여, 최종 면역 반응의 성질에 대하여 제어할 수 있게 된다.

″형질도입된(transfected)″이라는 용어는 어떠한 전달 기술이 사용되든, 전달된 외래 DNA 백신을 체화시킨 세포를 의미하는 것으로 본 명세서에서는 사용된다.

DNA 면역 접종 후에 세포성, 체액성 및 보호 면역 반응을 유도하는 때에, 표적 세포는 진피(dermis)와 같은 깊은 위치에 있는 피부층의 세포보다는 표피세포가 바람직하다는 것이 본 명세서에 개시된다. 표피세포는 신체에서 가장 접근하기 쉬운 세포이고 따라서 비침투적으로 면역화시킬 수 있기 때문에, 표피세포는 DNA 백신의 바람직한 수용체이다. 두 번째로, 체액성 면역 반응을 유도하는 것 외에, DNA로 면역된 표피세포는 또한 피하(sub-epidermal) 세포에서 일어나는 것보다 더 강한 세포독성 면역 반응을 유도한다. 표피로의 전달은 또한 덜 침투적이며, 신체에 의하여 최종적으로 제거되어질 세포에 전달한다는 이점이 있다.

표적 동물에 유전 물질을 전달하므로써 면역 반응을 유도하는 것이 바람직하나, 단순히 면역 반응을 입증하는 것만으로는 그 동물에 보호의 이점을 제공하기에 반드시 충분한 것은 아니다. 중요한 것은 임상적 차이에 있어서 분명하게 드러나는 보호면역반응을 일으키는 것이다. 즉, 질병의 증후의 강도를 감소시키는 방법만이효과적인 것이다. 바람직하기로는, 상기 면역 방법은 한타바이러스로 챌린지 한 후 면역된 집단의 치사를 예방하는데 있어서 적어도 20%는 효과적인 것이다. 더욱 바람직하기로는, 상기 면역접종 방법이 면역된 집단의 치사를 예방하는데 있어서 50% 이상, 가장 바람직하기로는, 70∼100% 효과적인 것이다. 본 명세서에 기술한 면역접종 방법에 의하면 한타바이러스에 대한 햄스터 모델에서 100% 효과적이다. 햄스터는 한타바이러스에 대한 보호 면역 반응의 검사용으로 사용되는 실험 모델의 하나로서 광범위하게 사용되어 왔다. 대조적으로, 면역되지 않은 동물은 챌린지에 의하여 한타바이러스로 균일하게 감염되었다. 본 발명의 결과에 의하면, SEOV M 게놈절편으로 면역접종하는 경우 한탄바이러스(HTNV)에 대하여 보호되고, 그리고 도브라바 바이러스(DBOV)에 대하여도 보호된다.

일반적으로, 투여되는 DNA 백신은 1회 투여당 약 1∼8㎍의 양일 수 있으며, 이는 처리되는 피접종체, 소망의 면역반응을 일으키려고 하는 피접종체의 면역 체계의 능력 및 소망의 보호의 정도에 의존할 수 있다. 투여되어야 할 정확한 양은 투여자(practitioner)의 판단에 의존할 수도 있으며, 각 피접종자 및 항원에 따라 독특한 값이 될 수도 있다.

하나 이상의 바이러스에 대한 면역반응을 유도하기 위한 백신은, 단일 투여(dose) 계획으로 주어질 수도 있고, 또는 바람직한 것으로, 제1차 면역접종 과정이 1∼8개의 별개의 투여로 이루어지고, 상기 면역반응을 유지 및/또는 강화시키기 위하여 필요한 연속적인 시간 간격, 예를 들면, 2차 투여를 1∼4개월의 시간 간격으로, 다른 투여들을 할 수 있고 필요하다면, 수개월 후에 또 다른 연속적인 투여(들)이 실시될 수도 있는 복수 투여 계획(multiple dose schedule)으로 투여될 수도 있다. 적당한 면역화 계획의 예들에는 (i) 0, 1개월 및 6개월, (ii) 0, 7일 및 1개월, (iii) 0 및 1개월, (iv) 0 및 6개월, 또는 보호 면역을 제공할 것으로 기대되는 소망의 면역 반응을 유도하거나, 또는 질병 증후를 감소시키거나, 또는 질병의 강도를 감소시키기에 충분한 다른 계획이 포함된다.

또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 본 과정을 실시하는 데 유용한 시약을 제공한다. 그러한 시약에는 한타바이러스 유래의 M 또는 S 또는 두 유전자 절편을 포함하는 DNA 단편 및 작고, 불활성이며, 밀도가 높은 입자가 포함된다. 상기 DNA단편 및 밀도가 높은 입자는 상기한 것들이다.

바람직하기로는, 상기 DNA는 냉동되거나 냉동건조된 것이고, 작고, 불활성이며, 고밀도의 입자는 건조 분말이다. 만약 도포액(coating solution)이 사용된다면, 도포액용 건조 성분은 미리 혼합되고, 미리 측량되어 바이알이나 봉인된 엔벨로프(envelop)와 같은 용기내에 담겨진다.

본 발명은 또한 본 발명을 실시하는 유용한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 상기한 냉동되거나 냉동건조된 DNA를 포함하는 제1 용기수단을 포함하여 이루어진다. 또한, 상기 키트는 도포액 또는 미리 혼합되고, 미리 측량된 도포액의 건조 성분을 포함하는 두 번째 용기 수단을 포함하여 이루어진다. 또한, 상기 키트는 건조 분말 형태의 또는 100% 에탄올에 현탁된 작고, 불활성이며, 고밀도의 입자를 포함하는 제3 용기 수단을 포함하여 이루어진다. 이들 용기 수단은 유리, 플라스틱 또는 포일로 만들어질 수 있고, 바이알, 병, 파우치, 튜브, 가방 등의 형태일 수 있다. 또한, 상기 키트는 본 발명을 실시하기 위한 실험 과정과 같은 문서(written) 정보 또는 제1 용기 수단에 포함된 시약의 양(예컨대, DNA의 몰 또는 질량)과 같은 분석 정보를 포함할 수 있다. 상기 문서 정보는 제1, 제2 및/또는 제3 용기 수단, 및/또는 상기 제1, 제2 및/또는 제3 용기 수단과 함께, 제4 용기 수단에 포함된 별도의 용지(sheet)중의 어느 것에 기재되어 있을 수 있다. 상기 제4 용기 수단은 예컨대, 상자 또는 가방일 수 있고, 상기 제1, 제2 및/또는 제3 용기 수단을 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 상기한 DNA 백신을 투여받은 피접종자유래의 폴리클론 항체와 관련된다. "항체"란, 당해 기술분야에서 공지의 용어이고, 어떠한 항원에 결합하는 분자 또는 분자의 활성 단편을 포함하는 의미이다. 이들 활성 단편은 많은 기술에 의해 본 발명의 항체로부터 파생될 수 있다. 항체의 활성 단편의 분리를 위한 일반적인 기술을 더욱 설명하기 위하여, 예로써 Khaw, B. A. 등 J. Nucl. Med. 23: 1011~1019(1982)를 참조할 수 있다. 또한, "항체"란 이중특이성 및 키메라성 항체를 포함하는 의미이다.

하기의 실시예에서 설명되는 폴리클론 항체는, 항체가 적당한 항원, 예로써 G1 및 G2에 결합하는 특징이 있으며, 이는 ELISA, 면역침전법 또는 면역형광법과 같은 분석법으로 측정될 수 있다. 또한, 상기 항체는 플라크 감소 중화 시험(PRNT)으로 측정되는 바와 같이, 한타바이러스를 중화시킬 수 있어야 한다. 이러한 특징을 갖는 어떠한 항체가 본 발명과 관련된다. 폴리클론 항체를 농축, 방사성 표지시키고, 원하는 다른 한타바이러스중에서 안데스 바이러스와 한탄 바이러스를 중화시키는 능력을 시험할 수 있다. 충분히 높은, 예로써 투여한 후에 수혜자에서 탐지가능한 반응을 나타내기에 충분히 높은 중화항체 역가를 가진 혈청량(serum lots)을 모을 수 있다. 다음으로, 상기 산물을 저장을 위해 냉동건조시키고, 사용을 위해 원래 상태로 할 수 있다.

실시예에서 좀 더 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명자는 예로써, 한탄 또는 안데스와 같은 한탄 바이러스의 M 절편을 포함하는 DNA 백신으로 면역화시킨 피접종자로부터 채취한 혈청이, 한타바이러스를 중화할 수 있고, 생체외 또는 생체내에서의 한타바이러스 중화 특성을 나타낼 수 있는 항체를 포함한다는 사실을 발견하였다. 중요하게도, 상기 항체의 반응성은 HFRS 한타바이러스 및 HPS 한타바이러 와 같은 다양한 다른 한타바이러스에 대하여도 적용할 수 있다.

그 결과, 본 발명에 따른 폴리클론 항체는, 한타바이러스에 노출된 민감한 대상에서 한타바이러스 감염 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 치료제 또는 예방제로서 모두 적합하다. 대상은 생쥐 또는 기니피그(guinea pigs)와 같은 설치류, 조류 또는 가금류(avian), 및 인간을 포함하는 포유류를 포함한다.

일반적으로, 이것은 치료적 또는 예방적으로 유효량의 본 발명의 폴리클론 항체를, 한타바이러스 노출 가능성이 있는, 또는 한타바이러스 증후를 나타내는 대상에게 투여하는 것을 포함할 것이다. 상기 항체는 어떠한 활성형태로 투여 가능하다. 본 발명의 항체는 곤충세포, 바큘로바이러스 발현 시스템, 닭, 토끼, 염소, 소, 또는 토마토, 감자, 바나나 또는 딸기와 같은 식물을 포함하는, 어떠한 시스템에서 제조될 수 있다. 이들 시스템에서 항체의 생산방법은 당업자에게 알려져 있다. 바람직하게는, 사용되는 항체는 항체에 대한 면역반응 결과, 바이러스가 제어될 수 있기 전에 항체가 제거되지 않고, 대상에서 항체에 대해 유도된 면역반응이 대상에서 "혈청 질병"을 유도하지 않도록, 수혜자에게 적합하여야 한다.

한타바이러스에 감염된 대상의 치료는, 치료적으로 유효량의 본 발명의 항-한타바이러스 항체를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 항체는 하기의 키트로 제공될 수 있다. 피접종 환자에서 한타바이러스와 결합할 수 있고 또는 한타바이러스에 대해 보호할 수 있는 항체, 또는 그것의 단편을 환자에게 제공할 경우, 상기 투여제의 투여량은 환자의 나이, 체중, 신장, 성, 일반적인 의학적 상태, 이전의의학적 경험 등과 같은 요인에 따라 다양할 것이다.

일반적으로, 항체는 다음의 양보다 더 낮거나 또는 높은 투여량으로 투여될 수 있지만, 1pg/kg(수혜자의 체중)~100pg/kg(수혜자의 체중), 100pg/kg~500pg/kg, 500pg/kg~1ng/kg, 1ng/kg~100ng/kg, 100ng/kg~500ng/kg, 500ng/kg~1ug/kg, 1ug/kg~100ug/kg, 100ug/kg~500ug/kg, 500ng/kg~1mg/kg, 1mg/kg~50mg/kg, 50mg/kg~100mg/kg, 100mg/kg~500mg/kg, 500mg/kg~1g/kg, 1g/kg~5g/kg, 5g/kg~10g/kg의 범위의 투여량으로 수혜자에게 제공하는 것이 바람직하다.

한타바이러스에 대해 보호할 수 있는 항체는 한타바이러스 감염 징후의 감소에 영향을 미치기에 충분한 양으로 수혜 대상에게 제공되어야 한다. 만약 치료제의 투여량 또는 투여경로 등이 이러한 반응에 영향을 미치기에 충분하다면, 상기의 양은 감염 징후의 감소에 "영향을 미치기에" 충분하다고 할 수 있다. 항체 투여에 대한 반응은 대상의 중요한 징후의 분석에 의해 측정될 수 있다.

만약, 그 투여가 수혜 환자에 의해 견딜 수 있다면, 조성물이 "약리적으로 허용가능한"이라고 할 수 있다. 만약, 투여량이 생리적으로 중요하다면, 이러한 치료제는 "치료적으로 유효량"으로 투여된 것이라 할 수 있다. 만약, 그 존재 결과 수혜 환자의 생리에 감지가능한 변화가 생긴다면, 치료제는 생리적으로 중요한 것이다.

본 발명의 화합물은 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위해 알려진 방법에 따라 처방될 수 있고, 이에 의하여 이들 물질 또는 이들의 기능적 유도체는 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 조합될 수 있다. 다른 인간 단백질, 예로써 인간 혈청 알부민을 포함하는 적당한 담체와 이들의 처방은, 예를 들면Remington's Pharmaceutical Science(제16판, Osol, A. ed., Mack Easton Pa.(1980))에 설명되어 있다. 효과적인 투여에 적합한 약제학적으로 허용가능한 조성물을 형성하기 위하여, 상기 조성물은 적당한 양의 담체와 함께 유효량의 상기 화합물을 함유할 것이다.

작용의 지속을 조절하기 위해, 부가적인 약제학적 방법을 적용할 수 있다. 방출 조절 제제는, 화합물과 복합체를 형성하거나 화합물을 흡수하기 위한 중합체를 사용하므로써 획득될 수 있다. 전달 조절은 방출 조절을 위해, 혼입(incorporation)방법 뿐 아니라, 적당한 고분자 물질(예를 들면, 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리비닐, 피롤리돈, 에틸렌비닐아세테이트, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스 또는 프로타민 설파이트)과 고분자 물질의 농도를 선택하므로써 수행될 수 있다. 방출 조절 제제에 의해 작용의 지속을 조절하기 위한 다른 가능한 방법은, 본 발명의 화합물을 폴리에스테르, 폴리아미노산, 하이드로겔, 폴리(젖산) 또는 에틸렌비닐아세테이트 공중합체와 같은 중합체 물질 입자내로 혼입시키는 것이다. 또는, 이들 물질을 중합체 입자내로 혼입시키는 대신, 이들 물질을 각각, 예를 들면 계면중합 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타실레이트)-마이크로캡슐, 또는 콜로이드 약물 전달 시스템, 예를 들면 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐 또는 마크로에멀젼에 트랩시키는(entrap) 것이 가능하다. 상기 기술은Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)에 개시되어 있다.

여기에 개시된 항체의 투여는, (복막내, 피하 또는 근육내 주사와 같은) 비경구 주사와 조류의 인오보(in ovo) 주사를 포함하는 어떠한 적당한 방법, 경구 투여 또는 항체의 기도 표면 국부 적용(전형적으로 약제학적 제제로 운반됨)에 의해 수행될 수 있다. 항체의 기도 표면 국부 적용은 (약제학적 제제를 비강내로 주입하는 점적기, 면봉 또는 흡입기의 사용에 의한) 비강내 투여에 의해 수행될 수 있다. 또한, 항체의 기도 표면 국부 적용은, 항체를 포함하는 약제학적 제제의 호흡가능 입자(고체입자 및 액체입자 모두 포함)를 에어로졸 현탁액으로 제조한 다음, 대상에게 상기 호흡가능 입자를 흡입하도록 하는 것과 같은, 흡입투여에 의해 수행될 수 있다. 약제학적 제제의 호흡가능 입자 투여방법 및 기구는 잘 알려져 있고, 어떠한 전형적인 방법을 사용할 수 있다. 경구 투여는 소화가능한 액체 또는 고체 제제의 형태로 할 수 있다.

치료는 단일 투여 스케쥴, 또는 바람직하게는 치료의 1차 코스가 1~10회의 개별 투여이고, 이어서 상기 반응을 유지하거나 또는 강화하는 데 필요한 연속되는 시간 간격, 예를 들면 1~4개월 후에 2차 투여, 원한다면 몇개월 후에 연속되는 투여(들)를, 정해진 다른 투여량에 의해 행하는 다중 투여 스케쥴로 행할 수 있다. 적당한 치료 스케쥴의 예들은 다음을 포함한다: (ⅰ) 0, 1개월 및 6개월, (ⅱ) 0, 7일 및 1개월, (ⅲ) 0개월과 1개월, (ⅳ) 0개월과 6개월, 또는 질병의 징후를 감소시키거나 또는 질병의 심각성을 감소시키리라 예상되는 원하는 반응을 유도하기에 충분한 다른 스케쥴.

또한, 본 발명은 한타바이러스를 포함하는 것으로 의심되는 샘플에서의 한타바이러스 검출방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 샘플을 한타바이러스 항원에 결합하는 본 발명의 폴리클론 항체와 접촉시켜, 항체가 한타바이러스 항원(들)에 결합하여 면역 복합체를 형성하도록 하고, 상기 면역 복합체의 형성을 검출하고, 샘플에서 한타바이러스 항원의 존재 또는 부존재와 면역 복합체의 존부와의 상관관계를 밝히는 것을 포함한다. 샘플은 생물 샘플, 환경 샘플 또는 음식 샘플이다.

"면역 복합체의 형성 검출"이란, 샘플에서 한타바이러스 항원의 존재 또는 부존재를 밝히는 것을 포함하는 의미이다. 한타바이러스 항원의 존재 또는 부존재는 면역분석법을 사용하여 알 수 있다. 항원을 검출 및/또는 정량화하는 데에 사용되는 많은 면역분석법은 당업자에게 잘 알려져 있다. Harlow 및 Lane,Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, 555~612) 참조. 이러한 면역분석법은 항체 포착 분석법(antibody capture assays), 항원 포착 분석법, 2-항체 샌드위치 분석법을 포함한다. 이들 분석법은 당업자에 의해 일반적으로 사용된다. 항체 포착 분석법에서, 항원은 고체 지지체에 부착되어 있고, 표지된 항체가 결합하도록 한다. 세정 후, 상기 분석법은 고체 지지체에 부착되어 있는 항체의 양을 측정하므로써 정량할 수 있다. 이 분석법의 변형된 방법에는, 항원이 고체 지지체에 결합되어 있고, 항원에 결합하는 항체를 포함하는 2가지 용액, 예를 들면 한타바이러스 피접종자 유래의 혈청 및 본 발명의 폴리클론 항체가 항원의 결합에 경쟁하도록 할 수 있는 경쟁 ELISA법이 있다. 그 다음, 결합된 폴리클론 항체의 양을 측정하고, 혈청이 항 한타바이러스 항원 항체를 함유하는지 여부에 관하여 결정한다. 상기 경쟁 ELISA법은, 면역접종 후에 피접종자에서 알려진 보호 에피토프(epitopes)에 대한 면역성을 나타내는 데에 사용될 수 있다.

항원 포착 분석법에서, 항체가 고체 지지체에 부착되어 있고, 표지된 항원이 결합하도록 한다. 결합되지 않은 단백질은 세정에 의해 제거되고, 상기 분석법은 결합된 항원의 양을 측정하므로써 정량할 수 있다. 2-항체 샌드위치 분석법에서, 하나의 항체가 고체 지지체에 결합되어 있고, 항원이 이 제1의 항체에 결합하도록 한다. 상기 분석법은 항원에 결합할 수 있는 표지된 제2의 항체의 양을 측정하므로써 정량할 수 있다.

이들 면역분석법은 전형적으로 표지 항원, 항체 또는 검출용 2차 시약을 이용한다. 이들 단백질은 방사성 화합물, 효소, 비오틴(biotin) 또는 형광염료(fluorochromes)로 표지될 수 있다. 이것들 중, 방사성 표지는 거의 모든 타입의 분석법에 다양하게 변형하여 사용될 수 있다. 효소-결합 표지는 방사성 활성을 피하여야 할 때, 또는 신속한 결과가 필요할 때 특히 유용하다. 보통, 비오틴-결합 시약은 표지된 스트렙타비딘(streptavidin)으로 검출된다. 스트렙타비딘은 비오틴에 강하게 그리고 빠르게 결합하며, 방사성 동위원소 또는 효소로 표지될 수 있다. 형광염료는 비록 그 사용을 위해서 고가의 장비가 필요하지만, 매우 정밀한 검출방법을 제공한다. 이들 분석법에 유용한 항체는 단일클론 항체, 폴리클론 항체 및 친화 칼럼으로 정제된 폴리클론 항체를 포함한다. 본 발명에 따라 적용할 수 있는 다른 적당한 표지는 당업자에게는 잘 알려져 있다. 항체 또는 이것의 단편에 대한 이들 표지물질의 결합은 당업자에게 일반적으로 알려진 표준 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 전형적인 기술은 Kennedy, J. H. 등, 1976(Clin. Chim. Acta 70: 1~31),및 Schurs, A. H. W. M. 등, 1977(Clin. Chim Acta 81: 1~40)에 설명되어 있다. 후자의 커플링 기술은 여기에 참조문헌으로 포함된 글루타르알데하이드법, 과요오드산법(periodate method), 디말레이미드법(dimaleimide method) 등이 있다.

"생물 샘플"이란, 생물 물질, 예로써 세포, 조직 또는 생물액을 포함하는 의미이다. "환경 샘플"이란, 토양 및 물과 같은 샘플을 의미한다. "음식 샘플"이란, 캔음식, 고기 등을 포함하는 의미이다.

본 발명의 또 다른 측면은, 생물 샘플내의 한타바이러스 검출용 키트이다. 상기 키트는, 한타바이러스 항원에 결합하는 하나 이상의 본 발명의 폴리클론 항체를 수용하는 용기, 및 한타바이러스 항원과 결합하여 면역복합체를 형성하기 위한 항체 사용법과 면역 복합체의 형성 검출법에 관한 설명서를 포함하며, 상기 면역 복합체의 존부는 샘플내의 한타바이러스의 존부와 상관관계가 있다. 용기의 예에는 여러가지 샘플내의 한타바이러스를 동시에 검출하도록 하는 멀티웰 플레이트(multiwell plate)를 포함한다.

본 출원에서 인용하고 있는 모든 인용 참조문헌(도서, 등록특허, 공개된 특허출원 및 출원계속중인 특허출원을 포함)의 내용은 명백히 여기에 참조문헌으로 포함된다.

본 발명의 다른 특징들은 하기의 예시적인 구체예를 설명하는 과정에서 분명해질 것이며, 이들 구체예는 단지 본 발명의 설명을 위하여 주어진 것일 뿐, 본 발명을 한정하고자 하는 의도는 아니다.

다음의 재료 및 방법이 하기 실시예에 사용되었다.

재료 및 방법

바이러스, 세포 및 배지

HTNV종 76-118(Lee 등, 1978, J. Infect. Dis. 137, 298~308), ANDV종 칠레-9717869(Hooper 등, 2001, Virology 289, 6~14), BCCV(Rollin 등, 1995, J. Med. Virol. 46, 35~39) 및 SNV종 CC107(Schmaljohn 등, 1995, Virology 206, 963~972)을 Vero E6 세포(Vero C1008; ATCC CRL 1586)에서 배양시켰다. 임시 발현 실험은 COS 세포(COS-7; ATTC CRL 1651)로 수행되었다. 두 세포형 모두 37℃의 5% CO₂세포 배양기내에서, 10% 우태아혈청(FBS), 10mM HEPES pH 7.4 및 항생제[페니실린(100U/ml), 스트렙토마이신(100㎍/ml), 및 겐타마이신 설페이트(50㎍/ml)]를 포함하는, Earle의 염을 가진 이글최소필수배지(Eagle's minimal essential medium with Earle's salts: EMEM)에서 유지되었다.

HTNV G2-특이 단일클론 항체(MAbs): MAb-23G10, MAb-11E10, MAb-3D7, MAb-16E6 및 MAb-HC02; 및 HTNV G1-특이 MAbs: MAb-2D5, MAb-6D4, MAb-8B6, MAb-3D5 및 MAb-10F11은 이전에 개시되었다(Arikawa 등, 1989, J. Gen. Virol. 70, 615~24, 24). MAb-HC02 및 MAbE606은 Dr. J. McCormick(Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia, Ruo 등, 1991, Arch. Virol. 119, 1~11)로부터 제공받았다.

SEOV M 및 S 나 DNA 플라스미드의 제조

SEOV, SR-11균주의 M 및 S 게놈 절편의 RT-PCR 클로닝은 이전에 개시되었다(Arikawa 등, 1990, Virology 176, 114∼125). 각 게놈 절편을 나타내는 cDNA는 이전에 개시된 나 DNA 벡터 pWRG7077(Schmaljohn 등, 1997, J. Virol. 64, 3162∼3170)의NotI 또는BamHI 부위에 서브클로닝되었다. 플라스미드 DNA는 제조사의 설명서에 따라서, Qiagen maxiprep DNA 정제 키트(Cat. no. 12163, Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 근육내 주사 접종 및 표피 유전자 총 접종 모두에 대하여 사용한 DNA는 무-내독소(endotoxin-free) qiagen DNA 정제 키트를 사용하여 준비하지 않았으며, 따라서 상기 DNA는 무-내독소 상태가 아니다[Qiagen 플라스미드 키트는 ㎍ DNA당 ∼9.3 내독소 단위를 발생시킨다(Qiagen 플라스미드 정제 핸드북 01.97)]. 내독소의 잠재적 면역자극 효과에 대한 대조군을 위하여, 본 발명의 음성 대조군 플라스미드 DNA는 백신 후보와 정확하게 동일하게 준비되었다.

한타바이러스 M 유전자 DNA 백신 플라스미드의 제조

변형된 버젼의 pWRG/SEO-M이 다음과 같이 제조되었다.

SEOV M DNA를 정방향 프라이머[프라이머O, 5'-GCGCGCGGCCGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAAC(서열번호10)] 및 역방향 프라이머[역, 5'- GCGCGGATCCCGGGTACCGGGCCCCCCCTCG(서열번호11)]를 사용하여, pWRG/SEO-M으로부터 폴리머라제 사슬반응(PCR)으로 증폭시켰다. PCR 산물을NotI및BamHI으로 절단한 다음, NotI-BamHI-절단 pWRG7077 벡터에 연결시켜 pWRG/SEO-M(0)을 제조하였다.

SEOV M DNA를 정방향 프라이머[프라이머1~24, 5'-GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(서열번호12)], 또는 [프라이머24~1, 5'-GGCCGCGGCCGCGAGCACGGCTTAAGGACGTCTAGGAGTAGTAGTCTCCGCAAGAAACAGCA(서열번호13)], 또는 [프라이머1~12, 5'-GGCCGCGGCCGCATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(서열번호14)], 또는 [프라이머13~24, 5'-GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(서열번호15)], 또는 [프라이머1~24^*, 5'-GGCCGCGGCCGCGGATCTGCCCGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(서열번호16)], 또는 [프라이머l~8, 5'-GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(서열번호17)] 및 역방향 프라이머를 사용하여, pWRG/SEO-M(0)으로부터 PCR로 증폭시켰다. PCR 산물을NotI및BamHI으로 절단한 다음, NotI-BamHI-절단 pWRG7077 벡터에 연결시켜 각각 pWRG/SEO-M(1~24), pWRG/SEO-M(24~1), pWRG/SEO-M(1~12), pWRG/SEO-M(13~24), pWRG/SEO-M(1~24^*) 및 pWRG/SEO-M(1~8)을 제조하였다.

pWRG/SEO-M(x)를 제조하기 위하여, SEOV G1/G2 단백질을 인코드하는 DNA를 프라이머l~24 및 역방향 프라이머[SEOMX, 5'-GCGCGGATCCAGATTGGGAGATAGAAGAGAG(서열번호18)]를 사용하여, pWRG/SEO-M으로부터 PCR로 증폭시켰다. PCR 산물을NotI및BamHI으로 절단한 다음, NotI-BglII-절단 pWRG7077 벡터에 연결시켰다. 이 클론은 pWRG7077의BamHI과BglII사이에서 발견되는, 원하지 않는 클로닝 인위 DNA(원숭이 면역결핍 바이러스 nef 유전자의 ~100 뉴클레오티드)가 제거되었다. 상기 서열의 제거는 클론 유전자의 발현에 영향을 미치지 않았다(데이터 생략).

HTNV M DNA 백신 플라스미드인 pWRG/HTN-M은 본질적으로 다음과 같이 제작되었다. 첫째, HTNV G1/G2를 인코드하는 DNA가 pTZ19RHTNMm(Schmaljohn 등, 1989, 상게서)로부터BglII절편으로 절단되어, BamHI-절단 pWRG7077 벡터에 연결되었다. 상기 플라스미드는 G2를 발현하지만 G1을 발현하지는 않았다(데이터 생략). 다음으로, M 유전자의 5' 말단을 포함하는 상기 플라스미드의Notl-PshAI절편을 절단하고, 프라이머-24(상기 참조) 및 역프라이머[M5B, 5'-TCAGGACTCCTGTCATGCAATAAGATCTC(서열번호19)]를 사용하여, (바이러스 RNA로부터 역전사제-PCR 클로닝에 의해 클로닝된 전장 HTNV M 유전자를 포함하는 pUC18 플라스미드로부터) PCR에 의해 증폭된 DNA로 대체하였다.BglII부위를 만든 HTNV M 유전자내의 침묵 뉴클레오티드 변이가 포함된 상기 역프라이머는 진단목적으로 사용되었다. 상기 PCR 산물을NotI및PshAI로 절단하고,NotI-PshAI-절단 플라스미드에 연결하여 pWRG/HTN-M를 제조하였다.

pWRG/HTN-M으로부터 HTNV M 유전자를 PCR 증폭하기 위하여, 프라이머1~24와 역프라이머[HTNMX, 5'- GCGCGGATCCGTTTGTGGTTAGAAAGCTAC(서열번호20)]를 사용하여 pWRG/HTN-M(x)가 제조되었다. PCR 산물은 NotI 및 BamHI로 절단되어 NotI-BglII-절단 pWRG7077 벡터에 연결되었다. 이 클론은 pWRG/HTN-M과 동일하였다: 그러나, 유전자의 3'-비번역 부위의 일부분과, NotI과 BglII 사이의 벡터 서열이 제거되었다.

pWRG/HTN-M(0)은 pWRG/HTN-M(x)로부터 HTNV M 유전자를 PCR 증폭하기 위하여, 프라이머0과 역프라이머 HTNMX를 사용하여 제작되었다. PCR 산물은 NotI 및 BamHI로 절단되어 pWRG7077 벡터의 NotI-BamHI 부위에 연결되었다.

pWRG/HTN-M(1~24)은 pWRG/HTN-M(0)으로부터 HTNV M 유전자를 PCR 증폭하기 위하여, 프라이머1~24와 역프라이머 HTNMX를 사용하여 제작되었다. PCR 산물은 NotI 및 BamHI로 절단되어 pWRG7077의 NotI-BamHI 부위에 연결되었다.

플라스미드 DNA는 제조사의 설명서에 따라서, Qiagen maxiprep DNA 정제 키트를 사용하여 정제되었다.

ANDV M 유전자-기초 DNA 백신 플라스미드인 pWRG/AND-M을 제작하기 위하여, 표준방법에 따라 TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)을 사용하여 ANDV-감염 Vero E6 세포로부터 바이러스 RNA를 정제하였다. 상기 RNA는 Superscript II 역전사효소(Invitrogen)를 사용하여 50℃에서 50분 동안 역전사되었고, 다음으로 70℃에서 15분 동안 정치하여 불활성화되었다. 상기 RNA는 37℃에서 20분 동안 RNaseH로 절단하므로써 제거되었다.

공지의 SNV와 PUUV 서열에 기초한 정프라이머와 역프라이머가 각각 역전사 반응물에 포함되었다: 정프라이머[SN-Fj, 5'- GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCACGAAGAAGC(서열번호21)] 및 역프라이머[PUUM-R, 5'-GCGCGGATCCTAGTAGTATGCTCCGCAGGAAC(서열번호22)]. Not I 제한부위(하선표시) 및 본 발명자가 이전에 발견한 M 유전자 비코딩 영역의 상류 24 뉴클레오티드가 포함된 정프라이머는 pWRG/HTN-M(x)에서 G1을 발현하는 데에 중요하였다. 역프라이머는 BamHⅠ 제한부위(하선표시)를 포함하였다. cDNA는 PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제되었고, PCR 반응에서 주형으로 사용되었다. 프라이머 SN-Fj 및 PUUM-R이 플래티넘 택 고정확도 DNA 폴리머라제(Platinum Taq High Fidelity DNA polymerase(Invitrogen))가 포함된 PCR 반응액에 포함되었다: 94℃에서 3분 1사이클, 및 94℃에서 30초, 68℃에서 8분 30사이클. PCR 산물을 NotI 및 BamHI으로 절단한 후, NotI-BglII-절단 pWRG7077 벡터내로 연결하여 pWRG/AND-M(1.1)를 제조하였으며, 여기서, pWRG/AND-M(서열번호8)로 명명된다. 플라스미드 DNA는 제조사의설명서에 따라서, Qiagen maxiprep DNA 정제 키트를 사용하여 정제되었다. 이 플라스미드가 제작되었을 때, ANDV M 유전자 서열이 알려져 있지 않았으므로, 본 발명자들은 프라이머 워킹 기술(primer walking technique)과 ABI 3100 유전자 분석기를 사용하여, M 유전자와 벡터/삽입체 연결체 서열을 밝혔다.

간접 형광 항체 시험(Indirect fluorescent antibody test: IFAT)

IFAT는 이전에 개시된 시험절차(Kamrud 등, 1995,Exp. Parasitol.81, 394∼403)의 변형이다. 12웰 세포 배양 플레이트 내의 15mm 유리커버 슬립 상에서 자란 COS 세포를 제조사가 설명한 대로 Fugene6(Boehringer Mannheim)를 사용하여 1㎍의 플라스미드 DNA로 형질도입시켰다. 형질도입 24시간 후, 커브 슬립을 PBS(pH 7.4)로 한번 세척하고, 실온에서 10분 동안 아세톤으로 고정한 후, 항-SEOV 폴리클론 항혈청(토끼) 또는 면역접종된 동물로부터 유래한 혈청과 반응시켰다. 항체는 3% 우태아혈청(FBS)을 포함하는 PBS로 희석한 후, 37℃에서 30분 동안 형질도입된 세포 상에서 배양되었다. 커버 슬립을 PBS로 3번 세척하였고, 비오틴이 첨가된 당나귀 항-토끼 항체로 37℃에서 30분 동안 배양하고, 그 후 스트렙트아비딘이 연결된 플루오레신(fluorescein)(Amersham) 또는 PBS, 3% FBS로 희석된 플루오레신-표지 염소(goat) 항-햄스터 항체(Kirkegaard & Perry Laboratories)로 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 반대 염색으로서 제2차 항체 용액에는 에반스 블루(Evans blue)(Fisher)가 포함되었다. 커버 슬립은 PBS로 세번 그리고 물로 한번 세척한 후, 유리 슬라이드 상의 한 방울의 형광 돋움(mounting) 배지(DAKO) 상에 위치시켰다. 세포는 Zeiss Axioplan 형광 현미경으로 관찰되었다.

HTNV에 대하여, 햄스터 혈청을 3% FBS를 포함하는 PBS로 1:200 희석시킨 후, 다음으로 37℃에서 1시간 동안 형질도입된 세포에 배양시켰다. 커버 슬립을 PBS로 3번 세척하였고, 플루오레신-표지 염소 항-햄스터 IgG 항체(Kirkegaard & Perry Laboratories)로 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 2차 항체 용액에는 반대 염색제로서 Hoechst 염색제(1㎍/㎖)가 포함되었다. 커버 슬립은 PBS로 세번 그리고 탈이온수로 한번 세척한 후, 유리 슬라이드 상의 한 방울의 형광 돋움 배지(DAKO) 상에 위치시켰다. 세포는 Nikon E600 형광 현미경으로 관찰되었다.

면역 침전

T-25 세포 배양 플라스크에서 자란 COS 세포는 Fugene6(Boehringer Mannheim)를 사용하여 5~8㎍의 플라스미드 DNA로 형질도입시켰다. 24시간 후, 발현 산물은 Promix([³⁵S]-메티오닌 및 [³⁵S]-시스테인, Amersham)로 방사선 표지되고, 이전에 개시된 바(Schmaljohn 등, 1997, Emerg. Infect. Dis. 3,95~104) 대로 면역침전되었다. 환원된 샘플을 200V 일정전압에서, 3-(N-몰포리노)프로판 술폰산(MOPS) 러닝 버퍼(NuPage)로, 4~12% Bis-Tris SDS PAGE 그래디언트 겔(gradient gel)에 전기영동시켰다.

유전자 총으로 면역 접종

유전자 총을 위한 카트리지는 이전에 개시된 바(Eisenbraun 등, 1993, DNA Cell. Biol. 12, 791∼797; Schmaljohn 등, 1997, 상게서) 대로 준비하였다. 요약하면, 약 1.5㎍의 DNA를 0.5mg의 약 2㎛ 직경의 금 구슬(Degussa) 상에 침전시켰다. DNA-도포된 금 구슬은 테프젤(Tefzel) 튜빙(McMaster-Carr)의 내부 표면을 도포하는데 사용되었다. 카트리지는 DNA-금-도포 테프젤 튜빙을 각각 약 0.5mg의 금을 포함하고, 약 0.75㎍의 DNA(침전된 DNA의 약 50%는 금에 결합한 것으로 용출 및 형광 측정 검사(fluorometric assay)에 의하여 결정되었다)로 도포된 약 0.5인치 절편(section)으로 자르므로써 제조되었다. 동물을 면역접종하기 위하여, 복부의 털을 가위로 제거하고, DNA-도포된 금을 이전에 개시된 바(Pertmer 등, 1995, Vaccine 13, 1427∼1430) 대로 유전자 총(PowderJect-XR 전달 장치, PowderJect Vaccines, Inc.)을 사용하여 복부 상의 중복되지 않는 부위에 투여하였다. BALB/c 생쥐(National Cancer Institute) 및 잡종(outbred) 시리아 햄스터(Charles River)를 400p.s.i. 헬륨 압력하에서 각각 2 또는 4 카트리지로 면역접종하였다. 이 연구는 실험실 동물의 보호 및 사용에 관한 지침(National Institute of Health, 1996)에 기술된 절차에 따라서 행하여졌다. 시설은 실험 동물 보호의 인가를 위한 미국 협회에 의하여 완전히 인가된 것이다.

HTNV에 대하여, 유전자 총 카트리지(0.5mg의 금상에 도포된 ~0.5㎍의 플라스미드 DNA)를 준비하여, 잡종 골든 시리아 햄스터를 상기한 바와 같이 유전자 총-면역접종하였다. 햄스터를 3주 간격으로 3회 면역접종하였다. 레서스 마카크 원숭이(Rhesus macaques)를 동일한 카트리지로 면역접종하였으며, 햄스터를 면역접종시키기 위하여 사용된 것과 동일한 유전자 총 조건이 사용되었다; 그러나, 원숭이는 면역접종당 4회가 아닌 8회의 투여를 받았다.

단계 II 임상시험(McClain 등, 2000, 상게서)에서 인간을 면역접종시키는 데에 사용되는 방법에 의해, 레서스 마카크 원숭이를 재조합 백시니아 바이러스인 rVV/HTN-M+S로 면역접종하였다. 상기 백신(0.5ml의 PBS내에 3.4×10⁷PFU)을 26G 3/8인치 바늘로 팔의 우측면 상부 피하지방층에 주입하였다. 42일 후에, 원숭이를 왼팔에 동일하게 2차(boost) 면역접종하였다.

ANDV에 대하여, 플라스미드 DNA를 금 구슬상에 침전(금 mg당 3㎍의 DNA)시킨 후, DNA-도포 금 구슬을 튜빙상에 도포시켰다. 0.5mg의 금상에 도포된 ~0.75㎍의 플라스미드 DNA로 이루어지는 유전자 총 카트리지를 준비하여, 사용할 때까지 4℃, 건조상태로 저장하였다. 시리아 햄스터를 Powderject XR1 입자-매개 상피 전달 장치(유전자 총)(Powderject Vaccines, Inc., Madison, Wis.)로 400 p.s.i.의 헬륨압을 사용하여 제모 복부 상피상의 겹치지 않는 부분에, 면역접종당 4회 투여하는 식으로 면역접종하였다. 레서스 마카크 원숭이를 동일한 카트리지로 면역접종하였으며, 햄스터를 면역접종시키기 위하여 사용된 것과 동일한 유전자 총 조건이 사용되었다; 그러나, 원숭이는 면역접종당 8회의 투여(복부에 4회 및 서혜부 림프절상에 4회)를 받았다. 햄스터와 원숭이는 무고통 유전자 총 과정 동안 마취되었다. 면역접종 부위에 미세한 홍반만이 유일하게 보였다.

근육내 주사 접종에 의한 면역접종

50㎕의 PBS(pH 7.4)내에 현탁된 플라스미드 DNA 25㎍을 마취된 생쥐의 비복근(gastrocnemius) 근육에 28.5-게이지 바늘로 주입하였다.

ELISA

SEOV G1 및 G2 검출을 위하여, ELISA 플레이트(Costar)를 카보네이트 버퍼(pH 9.6)로 4℃에서 밤새 희석된 SEOV-감염된 Vero E6 세포 파쇄물[바이러스를 불활성화 시키기 위하여 Co-조사(3백만 라드)된 것임]로 도포하였다. 플레이트를 PBS, 3% 탈지 우유, 0.05% Tween-20[방해 용액(blocking solution)]으로 4℃에서 1시간 동안 방해시킨 후, PBS, 0.05% Tween-20[세척 용액(washing solution)]으로 한번 세척하였다. 방해 용액으로 희석된 생쥐 또는 햄스터 혈청을 상기 웰에 첨가하고, 플레이트를 이전과 같이 배양하였다. 플레이트를 세척 용액으로 4번 세척하고, 방해 용액으로 1/1,000로 희석된 양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제(HRP)-연결 염소 항-생쥐 IgG(Cat. no. A-4416, Sigma) 또는 방해 용액으로 1/2,000로 희석된 퍼옥시다제-표지 염소 항-햄스터 항체(Cat. no. 14-22-06, Kirkegaard & Perry Laboratories)로 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 이전과 같이 세척한 후, 테트라-메틸벤지딘 기질(TMB, Cat. no. 50-76-04, Kirkegaard & Perry Laboratories)과 함께 실온에서 10분 동안 배양하였다. 이 발색반응은 중지 용액을 첨가하여 중지시키고(Cat. no. 50-85-04, Kirkegaard & Perry Laboratories), 450nm에서의 광밀도(O.D.)를 결정하였다. SEOV N-특이적 항체를 검출하기 위한 방법은 이전에 개시된 기술을 개작한 것이다(Elgh 등, 1997, J. Clin. Microbiol. 35, 1122∼1130). SEOV(SR-11 균주)의 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 1∼117은Escherichia coliBL21(DE3)(Novagen, Inc.) 내에서 pRSET 플라스미드(Invitrogen)를 사용하여 히스티딘-태그 융합 단백질로서 발현되었고, Ni-NTA 칼럼(Qiagen) 상에서 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제되었다. 항원은 카보네이트 버퍼(pH 9.6)로 희석하여,96-웰 마이크로역가 플레이트(Maxisorp; NUNC)(웰당 100㎕내에 0.2㎍)에 첨가한 후, 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 탈이온수(deionized water)로 세척하고 실온에서 30분 동안 방해 용액으로 배양하였다. 플레이트를 탈이온수로 세척한 후, 100㎕의 혈청(E.coli 항원 추출액[0.6mg/ml]을 포함하는 방해 용액으로 희석됨)을 동일한 두개의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 다시 이전과 같이 세척하였다. HRP 2차 항체의 첨가와 발색 검출은 SEOV G1-G2 ELISA에 대하여 상기한 바 대로 첨가되었다. 종말점(end-point) 역가는 음성 대조군 플라스미드(pWRG7077)-면역접종된 동물로부터 유래한 혈청 시료의 평균 O.D. 값에 3 표준편차를 더한 값보다 큰 O.D.를 가진 가장 높은 희석으로서 결정하였다. HTNV N-특이적 항체를 검출하기 위하여 SEOV N 항원이 사용되었고, ANDV N-특이적 항체를 검출하기 위하여 PUUV N이 사용되었다.

플라크 감소 중화 시험(PRNT)

중화 검사(neutralization assay)는 본질적으로 이전에 개시된 바(Chu 등, 1995, J. Virol. 69, 6417∼6423) 대로 행하였다. 혈청 시료는 cEMEM으로 희석한 후, 약 75PFU의 SEOV를 포함하는 동부피(111㎕)의 cEMEM과 조합하였다. 이 혈청-바이러스 혼합물은 4℃에서 밤새 배양한 후, 웰당 200㎕로 3∼7일된 Vero E6 단층을 포함하는 6웰 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 흡착 후, 10% FBS와 1x 비필수 아미노산 혼합물(GIBCO BRL)을 포함하는 오버레이 배지[Earle's basal minimal essential medium(EBME), 10 mM HEPEs, 0.6% 아가로즈(Sea Kem ME 아가로즈), 8 mM L-글루타민, 항생제] 3ml를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트는 37℃에서 7일 동안 배양한 후, 5% FBS와 5% 중성 레드(neutral red) 용액(GIBCO BRL)을 포함하는 오버레이 배지를 웰당 2ml를 첨가하여 염색하였다. 37℃에서 2일 경과 후, 플라크를 세었다. 혈청 시료는 검사하기 전에 열 불활성화(56℃, 30분)되었다. 보조체(complement)가 사용되는 실험에서는, 혈청 및 바이러스는 5% 기니 피그 보조체(Cat. no. ACL-4051, Accurate Chemical and Scientific Corporation) 존재하에서 밤새 배양되었다. 1주일 후에, HTNV, SEOV, ANDV 및 BCCV PRNT를 중성 레드(neutral red)로 염색하였고, 9일 후에, PUUV, DOBV 및 SNV PRNT를 염색하였다. 염색 2~3일(37℃) 후, 플라크수를 세었다.

SEOV에 의한 챌린지

시리아 햄스터의 근육[뒤쪽 넓적다리(caudal thigh)]에 25 게이지 주사바늘로 0.2ml 멸균 PBS(pH 7.4)로 희석된 10³PFU의 SEOV를 주사하였다. 10³PFU 도우즈(dose)는 이 챌린지 도우즈 및 경로가 있은 후 햄스터가 100% 감염되었다고 보고한 이전에 공개된 문헌(Schmaljohn 등, 1990, 상게서; Chu 등, 1995, 상게서)에 근거한 것이다. 챌린지 28일 후, 햄스터를 마취시키고 심장 구멍을 통하여 채혈하였다. 챌린지 후 혈청은 IFAT, ELISA 및 PRNT에 의하여 항-SEOV 항체의 존재가 평가되었다. 면역원 이외의 바이러스 단백질에 대한 챌린지 후 항체 역가의 갑작스런 상승은 햄스터가 SEOV에 감염되었다는 것을 나타내고 있다.

HTNV 및 ANDV에 대하여, 챌린지 전후 혈청을 ELISA에 의해 N-특이적 항체의 존재 여부를, PRNT에 의해 중화항체의 존재 여부를 평가하였다. 챌린지 후 N-특이적 항체의 검출은 햄스터가 챌린지 바이러스에 감염되었음을 나타내는 것이다.

HTNV에 대한 챌린지 투여량은 2,000 PFU이었고, 이것은 ~1000 LD₅₀(데이터 생략)에 해당한다. ANDV에 대한 챌린지 투여량은 2,000 PFU이었고, 이것은 250 LD₅₀에 해당한다. ANDV-감염 햄스터에 관한 작업은 생물학적 안전레벨 4(BSL-4) 실험실에서 수행되었다. HTNV-감염 햄스터에 관한 작업은 생물학적 안전레벨 3(BSL-3) 실험실에서 3M-RACAL 후드와 TYVEK 슈트를 착용하고 수행되었다. 생존 결과에 미치는 백신의 영향은 병참학 퇴화모델(logistic regression model)을 사용하여 평가되었다. 분석은 SAS Version 8.2(SAS Institute Inc., SAS OnlineDoc, Version 8, Cary, NC 2000)를 사용하여 수행되었다.

모든 동물 연구는 실험동물의 보호 및 사용에 관한 지침(National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1996)에 설명되어 있는 방법에 따라 수행되었다. 시설은 실험동물 보호 인가 미국협회(the American Association of Acccreditation of Laboratory Animal Care)에 의해 전부 인가 받았다.

교차 보호 분석

4∼5마리의 햄스터 그룹을 pWRG/SEO M 또는 음성 대조군 플라스미드(pWRG7077)로 면역접종하였다. 면역접종은 3주 간격으로 3번을 포함하여 4번의 유전자 총 투여(투여당 약 1.5㎍ DNA)로 구성되었다. 최종 면역 접종 3주 후, 챌린지 전 혈청 시료를 얻었고, 햄스터를 한탄 바이러스 1,000PFU, 도브라바 바이러스 1,000PFU 또는 푸우말라 바이러스 1,000∼2,000PFU로 챌린지하였다. 챌린지 28일후, 챌린지 후 혈청 시료를 얻었다. 챌린지 전 및 후의 혈청 시료는 뉴클레오캡시드에 대한 항체를 검출하기 위하여 항-N ELISA에 의하여 평가되거나, 챌린지 바이러스에 따른 반응성 중화 항체를 검출하기 위하여 한탄, 도브라바 또는 푸우말라 플라크 감소 중화 시험(PRNT)에 의하여 평가되었다.

항체 주사

인간 HPS 환자 유래의 냉동건조된 인간 응고 혈장을 물에 재현탁시키고, 사용하기 전에 CaCl₂를 0.1M농도가 될 때까지 첨가하므로써 재석회화시키고, 37℃에서 4시간, 4℃에서 밤새, -20℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 처리된 혈장을 녹여서 10,000×G에서 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 모았다. DNA-면역접종된 원숭이 유래의 원숭이 혈청과 인간 혈청(PEL-FREEZ Biologics, Rogers, Ariz.)을 열처리(56℃에서 30분)하여 불활성화시켰다. 1ml의 혈청 또는 혈장을 25-ga, 5/8-인치 바늘이 장착된 1ml 실린지를 사용하여 햄스터 복막내로 주사하였다.

실시예1

한타바이러스 유전자의 임시 발현

SEOV의 SR-11 균주의 M(서열번호1) 또는 S(서열번호2) 유전자 절편을 나타내는 cDNA를 나 DNA 발현 벡터 pWRG7077의 사이토메갈로바이러스 아주 초기 프로모터의 하류에 서브클로닝하여 각각 pWRG/SEO-M(서열번호3) 및 pWRG/SEO-S(서열번호4)를 만들었다(도1). M 및 S 구조체에 의한 발현을 검사하기 위하여, 이 플라스미드들을 COS 세포에 형질도입하고, 발현된 단백질은 면역염색하거나 면역침전시켰다.항-SEOV 폴리클론 혈청과 함께 배양된 형질도입된 단층 내에 염색된 세포가 존재하는 것은 SEOV 반응성 단백질이 pWRG/SEO-M 및 pWRG/SEO-S(도2A)로부터 발현되었다는 것을 나타낸다. 방사선 표지된 발현 산물은 항-SEOV 폴리클론 항혈청으로 면역침전되었고, SDS-PAGE로 분석되었다(도2B). 면역침전된 단백질은 G1, G2 및 N(80kDa, 56kDa 및 48kDa)(Elliot 등, 1984, J. Gen. Virol. 65, 1285∼1293; Schmaljohn 등, 1986, Virology 155, 633∼643)으로 예상되는 외견상 분자 크기를 가졌다. 약 37kDa 및 약 28kDa의 외견상 분자량을 가진 추가의 단백질 밴드가 N과 함께 면역침전되었다. 이들 폴리펩티드는 N 아미노-말단-특이적 단일클론 항체에 의하여 면역침전되었고, 웨스턴 블롯에 의하여 검출할 수 있었으며, 이는 N의 잘려진 형태(데이터는 나타내지 않음)라는 것을 나타낸다.

실시예2

pWRG/SEO-M 또는 pWRG/SEO-S에 의한 생쥐의 면역 접종

M 또는 S 구조체가 생쥐에서 항체 반응을 유도할 수 있는지를 결정하기 위하여, 10마리의 6 내지 8 주된 암컷 BALB/c 생쥐의 그룹에 대해, pWRG/SEO-M, pWRG/SEO-S 또는 음성 대조군 DNA(pWRG7077)을, 유전자 총에 의한 표피 접종 또는 주사주입에 의한 비복근 근육 주입의 두 가지 경로로 면역접종하였다. 제1차 면역접종을 받은 생쥐는 4주 간격으로 두번의 부스터 접종을 받았다. 각 면역접종 전 및 최종 부스터 접종 3주 후에 수집된 혈액 시료에 대하여 ELISA에 의하여 SEOV-특이적 항체 반응을 탐색하였다. M 또는 S 구조체 모두는 두 가지 DNA 투여 경로에 의하여 SEOV-특이적 항체 반응을 유도하였다(도3). 유전자 총에 의하여 SEOV S로면역접종된 대부분의 생쥐는 단 한번의 면역접종 후에 특이적 항체를 보였으며, 항체 반응은 뒤 이은 면역접종 후에 증가되었다(도3B). 상대적 항체 반응을 비교하기 위하여, 종말점 ELISA 역가를 최종 혈액 시료에 대하여 결정하였다(표1). 유전자 총 면역접종에 의하여 둘 중의 어느 구조체로 근육 면역접종하는 것보다 더 높은 혈청전환(seroconversion) 빈도 및 기하학적 평균 역가(GMT)가 생겼다.

표1: SEOV 나 DNA 백신으로 면역접종된 생쥐에서의 ELISA 역가

접종된 DNA	백신 경로a	양성/총(total)	종말점 역가 범위	GMTb
pWRG/SEO-M	g.g.	9/10	200∼1600	303
pWRG/SEO-M	i.m.	7/10	100∼400	132
pWRG/SEO-S	g.g.	10/10	6400∼12800	7352
pWRG/SEO-S	i.m.	9/10	800∼6400	1213

주: 생쥐는 4주 간격으로 3번 면역접종되었다. 역가는 최종 부스터 접종 3주 후 수집된 혈청에 대하여 결정하였다.

^ag.g.는 유전자 총(gene gun)을 나타내고; i.m.은 근육내 주사 접종(intramuscular needle inoculation)을 나타낸다.

^b그룹내의 모든 동물의 기하학적 평균 역가(Geometric mean titer).

나 DNA 면역접종이 중화항체를 유도하는지를 결정하기 위하여, 최종 부스터 접종 3주 후에 수집된 혈청에 대해 플라크 감소 중화 시험(PRNT)을 행하였다. 유전자 총에 의하여 pWRG/SEO-M으로 면역접종된 모든 생쥐(10/10)는 40∼1280 범위의 PRNT50% 역가를 나타내었다(도4). 주사 주입에 의하여 pWRG/SEO-M으로 면역접종된 생쥐 1/10만이 검출가능한 중화항체 반응(PRNT50%=40)을 나타내었다. 유전자 총 또는 주사 접종에 의하여 pWRG/SEO-S 또는 pWRG7077으로 면역접종된 생쥐는 중화 항체를 만들지 않았다(도4).

실시예3

햄스터의 면역접종 및 챌린지

나 DNA 한타바이러스 백신의 보호 효능을 연구하기 위하여, 다섯 햄스터 그룹을 유전자 총을 사용하여 pWRG/SEO-M, pWRG/SEO-S 또는 음성 대조군 플라스미드 pWRG7077로 면역접종하였으며(제1차 면역접종 후 4주간격으로 2번의 부스터 접종을 하였다), 그 후 최종 면역접종 6주 후에 SEOV로 챌린지하였다. IFAT, ELISA 및 PRNT는 면역접종 전, 챌린지를 하는 날 및 챌린지 4주 후에 취해진 혈청 시료에 대하여 행하였다. 성숙 설치류에서의 한타바이러스에 대한 질병 모델이 없기 때문에, 본 발명의 DNA 백신이 질병을 예방할 수 있는지를 평가하는 대신 감염으로부터 보호를 제공할 수 있을지를 평가하였다.

IFAT 및 ELISA 결과에 의하면, 면역접종 전에는 어떠한 햄스터도 SEOV G1-G2 또는 N 단백질(데이터는 나타내지 않음) 양성이 아니었다. 면역접종 후(챌린지 하는 날 취해진 챌린지 전 혈청)에는, pWRG/SEO-M으로 면역접종된 5마리 햄스터 중 5마리가 항-G1-G2 항체를 만들었고, pWRG/SEO-S로 면역접종된 5마리 햄스터 중 4마리가 IFAT에서 항-N 항체를 보였다(표2). 챌린지 전 ELISA 결과에서도 5마리의 pWRG/SEO-M 면역접종된 햄스터 중 4마리만이 항-SEOV ELISA에서 양성이었다는 것을 제외하고는 비슷한 항체 반응이 검출되었다. pWRG7077 면역접종된 햄스터는 챌린지 전 IFAT 및 ELISA에 의해 G1-G2- 및 N-특이적 항체를 만들지 못하였다.

챌린지 후, pWRG/SEO-M으로 미리 면역접종된 햄스터 유래의 혈청 시료는IFAT에서 항-뉴클레오캡시드 항체에 대하여 음성이었으며, 이는 SEOV로 감염되지 않았다는 것을 나타낸다. 대조적으로, pWRG/SEO-S 및 pWRG7077 면역접종된 햄스터 유래의 챌린지 후 혈청 시료는 G1-G2 및 N 항체 모두에 대하여 양성이었으며, 이는 SEOV로 챌린지 하였을 때 감염되었다는 것을 나타낸다. 챌린지 후 ELISA 결과 역시 IFAT 결과와 비슷하였다; 그러나, pWRG/SEO-M 면역접종된 햄스터 5마리 중 3마리가 챌린지 후 약한 항-N 반응을 보였으며, 이는 비록 IFAT는 음성이었으나, 햄스터가 챌린지 바이러스에 대한 항체를 만들었다는 것을 나타낸다.

면역접종 전에는, 어떠한 햄스터도 SEOV 중화항체 역가(데이터는 나타내지 않음)를 보이지 않았다. 면역접종 후에는, pWRG/SEO-M으로 면역접종된 모든 햄스터가 PRNT80% 역가 160 내지 640 범위의 중화항체를 만들었다(표2). 중화항체는 면역접종된 햄스터 유래의 pWRG/SEO-S 및 pWRG7077 챌린지 전 혈청에서는 검출되지 않았다. SEOV 챌린지 후, pWRG/SEO-M 면역된 햄스터의 중화항체 역가는 챌린지 전과 본질적으로 동일하게 유지되었다(+ 또는 - 2배). 대조적으로, pWRG/SEO-S 및 pWRG7077 챌린지 후 중화항체 역가는 <20로부터 1,280∼>81,920사이로 상당히 증가하였다.

표2. 나 DNA 백신으로 면역접종된 햄스터의 혈청학적 반응 및 보호

백신a	햄스터	IFATb	PRNT50%c	보호
		항-N			항-G1-G2
		전	후		전	후	전	후
pWRG/SEO-M	12345	-----	-----	+++++	+++++	320(20)320(40)320(20)80(<20)640(20)	64064012801601280	예예예예예
pWRG/SEO-S	12345	++++-	+++++	-----	+++++	<20(<20)<20(<20)<20(<20)<20(<20)<20(<20)	>640>640>640>640>640	아니오아니오아니오아니오아니오
pWRG7077	12345	-----	+++++	-----	+++++	<20(<20)<20(<20)<20(<20)<20(<20)<20(<20)	>640>640>640>640>640	아니오아니오아니오아니오아니오

^a3번의 면역접종은 4주 간격으로 투여된 4 유전자 총 카트리지(약 1.5㎍/카트리지)로 구성된다.

^b혈청은 각각 항-N 및 항-G1-G2에 대한 표적 항원으로서의 pWRG/SEO-M 또는 pWRG/SEO-S 단독으로 형질도입된 세포에 대한 IFAT에서 1:200에서 검색되었다. - 반응성 없음; + 반응성

^cPRNT 값은 플라크수를 50% 감소시키는 혈청 희석배수의 역수(reciprocal serum dilution)이다. 검사는 5% 기니 피그 보조체 존재하에서 이루어졌다. 괄호안의 숫자는 보조체 부재하에서 열처리된 혈청(heated serum)의 PRNT 값이다.

전: 챌린지하는 날 취한 챌린지 전 혈청 시료; 후: 챌린지 4주 후 취한 챌린지 후 혈청 시료.

이 연구를 진행하는 중, 본 발명자들은, 혈청이 열-불활성화(56℃, 30분)되는 경우, PRNT 역가가 극적으로 감소하는 것을 관찰하였다. 중화 활성이 보조체에의하여 증진될 가능성을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 5% 기니 피그 보조체의 존재하에서 PRNT 검사를 행하였으며, 그 결과 보조체를 첨가하므로써 열처리된 혈청의 PRNT 역가가 4 내지 32배 증가되는 것을 확인하였다(표2). 보조체 단독으로는 SEOV 플라크 수에 어떠한 영향도 미치지 않았다(데이터는 나타내지 않음).

실시예4

pWRG/SEO-M 면역접종에 의한 한탄 바이러스 감염에 대한 교차보호

pWRG/SEO-M으로 면역접종된 햄스터는 챌린지 전에는 항-N 항체가 검출되지 않았으며, 챌린지 후 항-N 반응은 검출할 수 없거나 아주 낮았다(≤1:200)(도6). 대조적으로, 음성 대조군 플라스미드로 면역접종된 햄스터는 항-N 항체의 갑작스런 증가를 보였다(배경값에 대하여 약 2로그 값 증가). PRNT에 의하면, pWRG/SEO-M에 의한 면역접종에 의하여 4마리의 햄스터 중 3마리에서 교차 중화 항체의 검출할 수 있는 수준을 유도하였다. 이들 햄스터의 PRNT 역가는 챌린지 후에 증가하지 않았다. 검출할 수 없는(<1:20) 한탄 중화 항체가를 보인 한마리의 햄스터에 있어서, PRNT 역가가 증가하였다; 그러나, 그 증가는 음성 대조군 플라스미드로 면역접종된 햄스터에서 관찰된 값보다 적어도 32배 낮았다.

한탄 바이러스로 챌린지한 후 한탄 구조 단백질에 대한 항체 역가(ELISA 및 PRNT로 측정함)의 증가가 낮거나 전혀 없는 것은, 서울 바이러스 M 유전자(pWRG/SEO-M)로 면역접종하는 것은 한탄 바이러스 감염에 대한 보호를 제공한다는 것을 나타낸다.

실시예5

pWRG/SEO-M 면역접종에 의한 도브라바 바이러스 감염에 대한 교차 보호

pWRG/SEO-M으로 면역접종된 햄스터는 챌린지 전에는 항-N 항체가 검출되지 않았으며, 챌린지 후 항-N 반응은 검출할 수 없었다. 대조적으로, 음성 대조군 플라스미드로 면역접종된 햄스터 중 하나를 제외한 모든 햄스터가 항-N 항체의 갑작스런 증가를 보였다(1:200∼1:204,800의 챌린지 후 항-N 역가). PRNT에 의하면 pWRG/SEO-M으로 면역접종 하는 것에 의하여 5마리의 햄스터 중 5마리에서 낮은 수준의 교차 중화 항체가 유도되었다. 이들 햄스터의 PRNT 역가는 챌린지 후에 1:80 위로는 증가하지 않았다. 대조적으로, 음성 대조군 플라스미드로 면역접종된 한마리의 햄스터를 제외한 모든 햄스터가 높은 챌린지 후 PRNT(1:5120)을 나타내었으며, 이는 햄스터가 도브라바 바이러스에 감염되었다는 것을 나타낸다. 햄스터 #182가 왜 감염되지 않았는지는 아직 분명하지 않다.

도브라바 바이러스로 챌린지한 후 도브라바 구조 단백질에 대한 항체 역가(ELISA 및 PRNT로 측정함)의 증가가 낮거나 전혀 없는 것은, 서울 바이러스 M 유전자(pWRG/SEO-M)로 면역접종하는 것은 도브라바 바이러스 감염에 대한 보호를 제공한다는 것을 나타낸다.

실시예6

pWRG/SEO-M 면역접종에 의하면 푸우말라 바이러스 감염에 대해 교차 보호하지 못함.

pWRG/SEO-M으로 면역접종된 햄스터는 챌린지 전에는 항-N 항체가 검출되지 않았다. 챌린지 후에는 한마리의 햄스터를 제외한 모든 햄스터가 1:200이상의 챌린지 후 항-N 반응을 보였으며, 이는 햄스터가 푸우말라 바이러스로 감염되었다는 것을 나타낸다. 음성 대조군 햄스터도 비슷한 챌린지 전 및 후 항-N 역가를 보였다. PRNT 결과는, pWRG/SEO-M에 의한 면역접종에 의하여 서울 바이러스(속이 빈 원)에 대한 중화항체가 유도되지만, 이들 항체는 푸우말라 바이러스를 교차중화하지 못하고 감염에 대하여 보호하지 못한다는 것을 나타낸다. pWRG/SEO-M 및 음성 대조군으로 면역접종된 햄스터의 챌린지 후 푸우말라 바이러스 PRNT 역가는, 한마리의 음성 대조군 햄스터가 감염되지 않았다는 예외를 제외하고는, 모두 비슷하였다(1:160이상). 왜 음성 대조군 햄스터 #220이 감염되지 않았는지는 아직 분명하지 않다.

푸우말라 바이러스로 챌린지 한 후 푸우말라 바이러스 구조 단백질에 대한 항체 역가(ELISA 및 PRNT에 의하여 측정됨)의 증가는, 서울 바이러스 M 유전자(pWRG/SEO-M)로 면역접종하는 것에 의하여 푸우말라 바이러스 감염에 대한 보호를 제공하지 못한다는 것을 나타낸다. 가장 큰 챌린지 후 항-서울 바이러스 PRNT 역가를 가진 햄스터가 1:640(햄스터 # 209)였다는 것에 주목하여야 한다. 더 큰 챌린지 전 중화 항체가를 가진 햄스터는 푸우말라 바이러스에 대하여 교차보호할 가능성이 있다.

토론

본 발명자들은 나 DNA가 한타바이러스에 대한 면역접종 방식의 하나로서 가능성을 보고하였다. 본 발명자들의 결과에 의하여, SEOV M 또는 S 게놈 절편을 나타내는 cDNA로 면역접종하는 것에 의하여 BALB/c 생쥐 및 시리아 햄스터에서 항체 반응을 유도할 수 있다는 것이 입증되었다. S절편이 아닌, M 절편을 발현하는 DNA로 면역접종된 햄스터는 중화항체를 만들었고, SEOV 감염에 대하여 보호되었다.

본 발명의 초기 항원성 실험에서, ELISA 및 PRNT에 의해 측정된 바에 의하면 pWRG/SEO-M 및 pWRG/SEO-S 모두에 대하여 BALB/c 생쥐를 유전자 총으로 면역접종하는 것이 근육내 주사 접종의 경우보다 더 높은 혈청전환을 야기시켰다. 이들 예비 데이터에 따라 DNA 전달의 근육내 경로보다 유전자 총에 집중하였다. 그러나, 단지 하나의 근육내 DNA 도우즈만이 시험되었기 때문에(25㎍/시험동물), 혈청전환율 및/또는 역가가 주입되는 DNA의 양, 주입 부위 또는 면역접종 계획(schedule)과 같은 인자를 조정하므로써 증가될 수 있다. 또한, 주사 접종은, 다른 보고된 바(Feltquate 등, 1997, J. Immunol. 158, 2278∼2284; Robinson 및 Torres, 1997, Semin. Immunol. 9, 271∼283; Gregoriadis, 1998, Pharm. Res. 15, 661∼670)와 같이, DNA 면역접종에 대한 체액성 반응 보다는 오히려 주로 세포-매개성 반응을 유도할 수도 있다.

pWRG/SEO-M를 유전자 총으로 면역접종하는 것에 의하여, 1) 검출할 수 없거나, 거의 검출할 수 없는 챌린지 후 항-N 항체 반응, 2) SEOV 챌린지 후 본질적으로 변화하지 않는 PRNT 역가에 의하여 측정된 바와 같이, SEOV 감염에 대하여 모든 햄스터가 보호되었다. IFAT 결과는 pWRG/SEO-M 면역접종된 햄스터 중 어느 것도 챌린지 후 항-N 항체를 만들지 않았다는 것을 나타내지만, 더 민감한 항-N ELISA에 의하여 3마리의 햄스터가 약한 챌린지 후 항-N 항체를 가진다는 것을 밝혔다. 이들 햄스터의 챌린지 후 항-N ELISA GMT(GMT = 50)가 음성 대조군 pWRG7077 면역접종된 햄스터(GMT > 3,195)보다 50배 더 낮기 때문에, 항-N 항체는 투입 SEOV 항원(복제없음) 또는 제한 감염(예를 들면, 1회의 복제)에 대한 항체 반응을 나타낼 수도 있다. PRNT 데이터는 pWRG/SEO-S가 아닌, pWRG/SEO-M으로 면역접종하는 것에 의해 SEOV 감염으로부터 햄스터가 보호된다는 추가의 증거를 제공한다. 음성 대조군 pWRG7077-면역접종된 햄스터의 PRNT 역가가 챌린지 후 <20으로부터 10,280∼81,920 로 증가된 반면, pWRG/SEO-M-면역접종된 햄스터 PRNT 역가는 챌린지 전 수준의 두배 이내로 유지되었다. 더욱이, pWRG/SEO-M-면역접종된 햄스터의 챌린지 후 PRNT 역가(GMT = 368)는 pWRG7077-면역접종된 햄스터의 챌린지 후 PRNT 역가(GMT > 27,024)보다 훨씬 낮게 유지되었다. pWRG/SEO-S로 면역접종된 햄스터는 챌린지 후 SEOV에 감염되었다. pWRG/SEO-S-면역접종된 햄스터의 챌린지 후 PRNT 역가는 <20으로부터 2,560∼20,480으로 증가하였다. pWRG/SEO-S의 챌린지 후 PRNT 역가는 높지만(GMT = 5,885), 이들 역가는 음성 대조군(pWRG7077)의 챌린지 후 역가(GMT > 27,024) 보다 약 5배 더 낮다는 것이 주목할만 하다.

보조체가 있든 없든, pWRG/SEO-S로 면역접종된 생쥐 및 햄스터에서 중화항체반응이 없는 것은 N이 아닌, G1 및 G2에 대한 단일클론 항체가 중화활성을 가지고(Dantas 등, 1986, Virology 151, 379∼384; Arikawa 등, 1989, J. Gen. Virol. 70, 615∼624; Schmaljohn 등, 1990, J. Virol. 64, 3162∼3170; Arikawa 등, 1992, Arch. Virol. 70, 615∼624), N이 아닌, G1 및/또는 G2를 발현하는 백시니아 재조합체로 면역접종하는 것에 의하여 중화 반응이 유도된다(Pensiero 등, 1988, J. Virol. 62, 696~702; Schmaljohn 등, 1992, Vaccine 10, 10~13; Xu 등, 1992, Am. J. Trop. Med. Hyg. 47, 397~404; Chu 등, 1995, 상게서)는 공개된 데이터와일치된다.

다른 연구자들이 곤충세포, 박테리아 내에서 또는 키메라 HBV 코아 입자로서 발현된 재조합 N으로 면역접종하는 경우 피접종체가 감염으로부터 보호된다는 것을 밝혔기 때문에(Schmaljohn 등, 1990, 상게서; Yoshimatsu 등, 1993, Arch. Virol. 130, 365~376; Lundkvist 등, 1996, Virology 216, 397~406; Ulrich 등, 1998, Vaccine 16, 272~280), 항-N 면역 반응에 의하여 피접종체가 감염으로부터 보호되지 못하는 것은 예상하지 못한 것이다. 또한, SEOV S 절편을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스로 면역접종하는 것에 의하여 모래쥐가 SEOV 감염으로부터 부분적으로 보호되었다(Xu 등, 1992, 상게서). 본 발명자들의 실험에서 S 절편으로 나 DNA 면역 접종하는 것에 의하여 햄스터가 보호되지 않는 것은 질적인 결여보다는 양적인 결여와 관련되는 것일 수 있다. pWRG/SEO-S로 면역접종된 햄스터 5마리 중 4마리가 IFAT 및 ELISA에서 검출될 수 있는 항체 반응을 보였으나, 그 역가는 상대적으로 낮았다(1:1,600이하의 ELISA 역가). 생쥐가 아닌, 햄스터에서 이러한 낮은 항-N 항체 역가를 보이는 이유는 아직 명확하지 않다. 동일한 로트가 같은 날에 햄스터 및 생쥐를 면역접종하기 위하여 사용되었고, 상기 생쥐 혈청전환율은 90%이고 ELISA GMT 값이 7,000을 넘기 때문에 유전자 총 카트리지에 오류가 있을 수는 없다. 낮은 항체가는 햄스터에서 pWRG/SEO-S로 면역접종하는 것에 대한 전체적인 면역반응이 약하다는 것을 반영하거나, 또는 유전자 총으로 S DNA를 피하에 투여하는 경우 N에 대하여 체액성 반응보다 주로 세포-매개성 반응을 야기시킬 가능성이 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 결과에 의하면, pWRG/SEO-S를 나 DNA유전자 총 면역접종한 후 5마리의 햄스터 중 4마리에서 검출할 수 있는 항-N 면역 반응이 있었고, 이 반응이 체액성이든 및/또는 세포-매개성이든, 피접종체를 SEOV 감염에 대하여 보호하기에는 불충분하다는 것이 입증된다. pWRG/SEO-S로 면역접종된 햄스터와 pWRG7077로 면역접종된 햄스터의 챌린지 후 PRNT 역가에 있어서의 약 5배의 차이는 pWRG/SEO-S 면역접종이 SEOV 감염을 제한할 수 없다는 것을 보여주는 것이다.

혈청이 열 불활성화(56℃, 30분)되는 경우, 생쥐 및 햄스터에서 유도된 SEOV 중화 활성은 4 내지 32배 감소한다는 것을 본 발명자들은 밝혔다. 이 중화 활성의 손실은 기니 피그 보조체를 PRNT에 포함시키므로써 완전히 회복될 수 있었다. 이들 데이터는 인간, 생쥐 및 특히 래트로부터 유래한 혈청에서 한타바이러스 중화활성이 보조체에 의하여 증진된다고 보고한 다른 연구자들의 데이터(Takenaka 등, 1985, Arch. Virol. 84, 197~206; Asada 등, 1989, J. Gen. Virol. 70, 819~825)와 일치된다. PRNT 역가는 한타바이러스 백신의 항원성 및 효능 예측을 검사하는데 통상적으로 사용되기 때문에, 한타바이러스 중화에 있어서 보조체가 중요한 역할을 한다는 관찰은 주목할만 하다. 외래 보조체(예컨대, 정제된 단백질 분획 또는 신선한 동물 혈청으로서)의 열 불활성화 또는 첨가와 같은 보조체를 고갈시키거나 첨가하는 조건들은 PRNT 역가를 변화시킬 수 있고, 따라서 후보 백신의 평가를 변화시킬 수 있다.

실시예7

HTNV M DNA 백신으로부터 G1 및 G2의 발현

HTNV M 게놈 절편을 나타내는 cDNA를 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터-기초 발현 플라스미드인 pWRG7077내로 클로닝하여, pWRG/HTN-M을 제조하였다. 폴리클론 및 단일클론 항체(MAbs)를 사용하는 방사성-면역침전 분석법(RIPA) 실험 결과, pWRG/HTN-M으로 형질도입된 세포내에서 G1 및 G2 단백질 모두가 일시적으로 발현되었음을 알 수 있었다(도 8).

기능적인 HTNV M DNA 백신을 개발하려는 초기의 시도는 성공하지 못하였다(즉, G1 이외의 G2만 발현)(데이터 생략). 본 발명의 SEOV M 플라스미드(pWRG/SEO-M)는, NotI 클로닝 부위와 SEOV M 비코딩 영역 사이에서 발견되는 24 염기쌍(bp)의 외래 DNA(도 9A)가 제거되면 G1을 효과적으로 발현하지 못한다는 사실을 발견한 후에, 본 발명자들은 이러한 문제를 해결하였다. 상기 외래 DNA는 SEOV M 유전자의 초기 클로닝과 서브클로닝 동안에 사용된 방법으로부터 유래되었다. 24bp 서열이 제거된 SEOV M 구조체는 G1 발현에 실패하였지만, G2는 발현하였다(도 9B). 만약 24bp 서열이 역방향이 아닌 정방향으로 구조체내로 재삽입되면, G1의 발현은 회복되었다. 이러한 결과는, 뉴클레오티드수가 아닌 뉴클레오티드 서열이 G1 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다. 효율적인 G1 발현을 위한 서열 지도 제작을 위해, 1~12번째 또는 13~24번째의 뉴클레오티드로 된 외래 서열이 포함된 구조체를 제작하였다. 플라스미드에 13~24번째의 뉴클레오티드가 아닌 1~12번째의 뉴클레오티드가 존재할 때, G1이 발현되었다(도 9B). 4~10번째의 뉴클레오티드로 된 DNA(TCTGCAG)는 인트론 A(즉, 스플라이스 수용체 부위:splice acceptor site)(Stenberg 등, 1984, 상게서)의 마지막 7개의 뉴클레오티드와 동일하였다. 추정되는 스플라이스 수용체 부위의 2개의 뉴클레오티드 AG를 CC로 변이시키는 것은 G1의 발현에 영향을 미치지 않았으며, 이는 이 영역이 스플라이싱에 관여하여도, 인트론 A 스플라이스 부위에서 정확한 서열을 유지할 필요가 없음을 의미한다(도 9B). 1~8번째 뉴클레오티드로 된 외래 DNA를 포함하는 구조체를 제조하였으며, 이는 G1의 효율적인 발현을 회복시키기에 충분하였다(도 9C). 따라서, NotI 클로닝 부위와 SEOV M 유전자의 5' 비코딩 영역 사이에 위치하는 GGATCTGC 서열이, pWRG7077-기초 DNA 백신으로부터 G1의 효율적인 발현을 위해 필요하다는 결론을 내렸다.

상기 SEOV M의 발견을 기초로, HTNV M 유전자의 상류에 외래 서열을 포함하는 것이 DNA 백신 플라스미드로부터 HTNV G1 및 G2 모두를 발현할 수 없는 문제를 해결할 수 있다는 가정을 하였다. HTNV M 유전자의 상류에 외래 서열이 포함된 플라스미드를 제작하였고, 이로써 G1 및 G2 모두를 발현하는 클론인 pWRG/HTN-M(도 9D)을 획득하였다. 외래 서열이 결실되면 G1은 발현되지 않았고, 외래 서열이 회복되면 G1이 효과적으로 발현되었다(도 9D). 이러한 데이터는 외래 서열이 SEOV G1의 성공적인 발현뿐만 아니라, HTNV G1의 성공적인 발현을 위하여도 필요하다는 것을 확실히 하였다. 상기 서열은 SEOV 또는 HTNV로부터 G2 발현에는 영향을 미치지 않았다(도 9). 외래 서열이 G1 발현에는 영향을 미치나, G2 발현에는 영향을 미치지 않는 메커니즘은 알려져 있지 않다.

실시예8

pWRG/HTN-M에 의한 DNA 면역접종은 중화항체를 유도하고, HTNV로 감염된 햄스터를 보호함.

HTNV M DNA 백신 플라스미드가 면역원성이 있는지 여부를 결정하기 위햐여, 유전자 총을 사용하여 pWRG/HTN-M(pWRG/HTN-M 또는 pWRG/HTN-M(x), 상기 방법 참조) 또는 음성 대조군으로 햄스터를 면역접종하였다. 최종 면역접종 3주 후, 햄스터들을 채혈하여 혈청을 플라크-감소 중화 시험(PRNT)에 의해 중화항체에 대해 평가하였다. 2개의 독립된 실험에서, pWRG/HTN-M로 면역접종된 모든 햄스터들이 HTNV-중화항체 반응을 나타었다(도 11). 첫번째 실험에서, 역가(PRNT_80%)는 20~1280범위, GMT(geometric mean titer)=104이고, 두번째 실험에서, 역가(PRNT_80%)는 20~10240범위, GMT=493이었다. 음성 대조군은 혈청음성 상태였다. 따라서, pWRG/HTN-M에 의한 유전자 총 면역접종은 햄스터에서 면역원성이 있었다.

pWRG/HTN-M의 보호 효율을 결정하기 위하여, 상기한 감염모델(Hooper 등, 1999, 상게서)을 사용하였다. 이 모델은 면역접종된 햄스터를 바이러스로 챌린지하고, 4주후에 감염의 증거를 탐지하기 위해 혈청학적 분석법을 사용하는 것을 포함한다. 특히, 챌린지된 햄스터가 한타바이러스 N 단백질(이는 백신 성분이 아니다)에 대한 항체를 생성한다면, 상기 햄스터는 감염된 것으로 생각되었다. 반면에, 챌린지된 햄스터가 N-특이적 항체반응을 개시하지 못한다면, 상기 햄스터는 감염되지 않았다(즉, 감염에 대해 보호받음). 또한, 챌린지 이후에 중화항체 반응이 4배 이상 증가된 것은 감염 증거에 대한 하나의 표지였다.

면역접종된 햄스터를 2,000 플라크-형성 유니트(ID₅₀이 약 2 플라크-형성 유니트[PFU]임, 미발표된 데이터임)의 HTNV로 근육내 챌린지시켰다. 챌린지 4주 후, 혈액 샘플을 모아서 ELISA에 의해 N-특이적 항체, PRNT에 의해 중화항체에 대한 혈청검사를 수행하였다. 챌린지 전후 항-N 역가 및 PRNT 역가를 도 11에 나타내었다. 챌린지 후 N-특이적 항체 반응이 없는 것에 의해 밝혀졌듯이, pWRG/HTN-M으로 면역접종된 모든 햄스터는 감염에 대해 보호되었다. 또한, 챌린지 전후 PRNT 역가들은 4배 이하로 차이가 났다. 반대로, 챌린지 후 N-특이적 항체와 중화항체의 발생에 의해 입증되는 바와 같이, pWRG7077로 면역접종되었거나 또는 비면역접종된 모든 음성 대조군 햄스터는 감염되었다. 따라서, 심지어 챌린지 전 PRNT_80%역가가 20 정도로 낮을 때에도, pWRG/HTN-M(또는 pWRG/HTN-M(x))으로 유전자 총 면역접종을 하면 HTNV에 의한 증식성 감염에 대해 보호되었다.

실시예9

이형 한타바이러스 챌린지에 대해 pWRG/SEO-M 또는 pWRG/HTN-M 교차-보호를 갖는 DNA 면역접종

SEOV M 및 HTNV M 유전자-기초 DNA 백신은 동형 바이러스 감염에 대해 햄스터를 보호할 수 있다는 결론 하에, 이들 백신 중 어느 하나가 다른 HFRS-관련 한타바이러스에 대해 교차-보호할 수 있는지 여부를 결정하고자 하였다. 우선, HFRS 한타바이러스-감염 햄스터, 및 SEOV M 또는 HTNV M 백신으로 면역접종된 햄스터 유래의 혈청의 교차-중화 활성을 측정하였다(표 3). SEOV-감염 햄스터 유래의 혈청은 낮은 수준의 HTNV 중화활성을 가지며, DOBV 또는 PUUV 중화활성은 갖지 않는다는것을 발견하였다. HTNV-또는 DOBV-감염 햄스터 유래의 혈청은 SEOV, DOBV 및 PUUV에 대해 낮은 수준의 중화항체를 나타내었다. PUUV-감염 햄스터 유래의 혈청은 HTNV 또는 SEOV를 중화시키지 못하였으며, DOBV-중화활성은 거의 발견되지 않았다. 면역접종된 햄스터 유래의 혈청은 감염된 햄스터 유래의 혈청 보다 교차-중화활성이 더 높게 나타났다. pWRG/SEO-M 또는 pWRG/HTN-M으로 면역접종하면 SEOV, HTNV 및 DOBV는 교차-중화하나, PUUV는 교차-중화하지 못하는 항체 반응을 유도하였다.

표3. 감염된 또는 DNA 면역접종된 햄스터 유래 혈청에서의 교차-중화활성

혈청소스a	PRNTd
	SEOV	HTNV	DOBV	PUUV
	80%	50%	80%	50%	80%	50%	80%	50%
SEOV감염b	640	5120	*	80	*	*	*	*
HTNV감염	*	160	1280	5120	40	320	*	20
DOBV감염	20	320	20	160	2560	10240	*	40
PUUV감염	*	*	*	*	*	20	5120	20480
pWRG/SEO-M으로 면역접종c	5120	10240	320	320	160	320	*	*
pWRG/HTN-M으로 면역접종	40	80	5120	5120	160	640	*	*

^a적어도 160의 동형 역가를 갖는 3~4마리의 햄스터 유래의 혈청풀.

^b2,000 PFU의 상기 바이러스로 근육내 주사된 햄스터.

^c상기 DNA 백신 플라스미드로 3주 간격으로 3번 유전자 총 면역접종된 햄스터.

^dPRNT 값은 상기 바이러스 플라크수를 80% 또는 50%까지 중화시키는 혈청희석배수의 역수(reciprocal serum dilution)이다. 동형 역가는 굵은체로 표시하였다.

^*20 미만의 역가.

본 발명자들은 이전에 SEOV M DNA 백신이 SEOV 뿐만 아니라 HTNV 챌린지로부터 대부분의 햄스터를 보호한다(Kamrud 등, 1999, Virology 263, 209~219)는 것을 밝혔다. 이러한 발견을 확실히 하기 위하여, 그리고 다른 한타바이러스에 대한 교차-보호를 위한 SEOV M 백신의 능력을 평가하기 위하여, HTNV, DOBV 및 PUUV에 대한 pWRG/SEO-M의 보호능력을 시험하였다. 본 연구의 결과는 챌린지 후의 항-N 항체 반응의 미발생에 의해 알 수 있는 바와 같이, pWRG/SEO-M으로 면역접종된 햄스터들은 PUUV를 제외한 HTNV 및 DOBV에 대하여 보호되었다(도 12). 동형 PRNT_80%역가가 160을 초과하는 경우는 HTNV에 대하여 보호되었고, 역가가 80 미만인 경우는 DOBV에 대하여 보호되었으나, 역가가 1280 정도로 높은 경우는 PUUV에 대하여 보호받지 못하였다(도 12A, 12B 및 12C). 한마리의 면역접종된 햄스터 및 한마리의 대조군 햄스터는 PUUV 챌린지에 대한 반응을 나타내는 데에 실패하였으며, 이는 아마도 PUUV 챌린지 투여량이 10 ID₅₀인 반면에, 다른 바이러스에 대한 투여량은 1000 ID₅₀이었기 때문이다(데이터 생략).

SEOV 또는 DOBV에 대한 pWRG/HTN-M의 교차-보호 능력을 시험하였다. 그 결과는 pWRG/HTN-M에 의한 면역접종이 SEOV 및 DOBV 모두에 대해 교차-보호 면역성을 유도한다는 것을 나타내었다(도 12D 및 12E). 640 미만의 동형 PRNT_80%역가는 SEOV에 대한 햄스터의 보호와 관련있고, 320 미만의 역가는 DOBV에 대한 보호와 관련있다. SEOV DNA 백신으로는 보호되지 않는다는 것을 발견하였기 때문에(도 12C), 그리고 백시니아-벡터 HTNV 백신이 PUUV 감염에 대해 햄스터를 보호하지 않았기 때문에(Schmaljohn 등, 1995, Virology 206, 963~972), pWRG/HTN-M로 면역접종하여 PUUV 감염에 대해 보호하는 능력을 측정하지 않았다. 더불어, 이들 데이터는 pWRG/SEO-M 또는 pWRG/HTN-M에 의한 DNA 면역접종이 4가지의 HFRS-관련 한타바이러스 중 3가지: SEOV, HTNV 및 DOBV에 대해 교차-보호한다는 것을 나타내었다.

실시예10

비인간 영장류에서 pWRG/SEO-M 또는 PWRG/HTN-M에 의한 DNA 면역접종이 고역가 중화항체 반응을 유도함.

SEOV M 유전자(Hooper 등, 1999, 상게서) 또는 HTNV M 유전자를 발현하는 플라스미드로 면역접종한 본 발명의 데이터는 이들 백신이 인간에 유효할 수 있다는 것을 암시한다. 이들 백신의 임상 개발을 위한 단계로서, 비인간 영장류에서 항체 반응을 유도하는 이들의 능력을 시험하였다. 2마리의 레서스 마카크 원숭이를 SEOV M DNA 백신으로 면역접종하고, 3마리의 레서스 마카크 원숭이를 HTNV M DNA 백신으로 면역접종하였다. 음성 대조군으로서, 3마리의 원숭이(monkeys)를 관련없는 유전자를 발현하는 pWRG7077로 면역접종하였다; 그리고, 양성 대조군으로서, 3마리의 원숭이를 HTNV M 및 S 유전자인 rVV/HTN-M+S를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스(Schmaljohn 등, 1992, Vaccine 10, 10~13)로 면역접종하였다. rVV/HTN-M+S는 이전에 햄스터에서 중화항체를 포함하는 HTNV-특이적 면역성을 유도(Chu 등, 1995, J.Virol. 69, 6417~6423)하고, 인간에서 중화항체를 유도(McClain 등, 2000, J. Med. Virol. 60, 77~85)하는 것으로 밝혀졌다. DNA 백신을 3주 간격으로 3번 투여하였다. rVV/HTN-M+S 백신을 인간 단계 Ⅱ 시도에서 사용되는 투여량 및 스케쥴(즉, 1차 피하지방층 면역접종한 후 42일째에 2차 면역접종)에 의해 투여하였다.

1차 면역접종 3주 후, pWRG/HTN-M(x)로 면역접종된 3마리의 원숭이 중 2마리는 중화항체를 나타내었다(도 13). 2차 유전자 총 면역접종 3주 후, pWRG/SEO-M(x) 또는 pWRG/HTN-M(x)로 면역접종된 모든 원숭이는 검출할 수 있는 수준의 중화항체를 나타내었다. 3차 면역접종 3주 후, pWRG/SEO-M(x) 또는 pWRG/HTN-M(x)로 면역접종된 모든 원숭이에서 중화항체의 역가는 상당히 높았다. 음성 대조군-면역접종된 원숭이는 결코 중화항체를 발생시키지 않았다(데이터 생략). rVV/HTN-M+S로 면역접종된 원숭이는 한번의 면역접종 후에 중화항체 반응을 발생시키지 못하였으나, 42일째 2차 면역접종 후에 중화항체 반응을 발생시켰다. 최종 면역접종 3주 후, pWRG/SEO-M(x), pWRG/HTN M(x) 또는 rVV/HTN-M+S로 면역접종된 원숭이의 PRNT_80%GMT는 각각 905, 2032 및 160이었다. 이들 데이터는 한타바이러스 M 유전자 산물을 발현하는 DNA 백신이 비인간 영장류에서 면역원성이 있고, 비교적 높은 수준의 중화항체를 유도한다는 사실을 최초로 입증하는 것이다.

DNA 백신 및 재조합 백시니아 바이러스 백신에 의해 유도되는 면역성의 지속성을 평가하기 위하여, 면역접종된 원숭이 유래의 혈청을 최종 면역접종 후 2, 4 및 6개월 후에 수집하여 중화활성을 시험하였다. 최종 면역접종 2개월 후, DNA-면역접종된 햄스터 유래의 혈청내 중화항체 역가가 2~4배로 저하되었다(도 14, 표 9 및 10). 면역접종 4개월 후, pWRG/SEO-M(x) 또는 pWRG/HTN-M(x)로 면역접종된 원숭이는 PRNT_80%GMT가 각각 160 및 80이었다. 6개월 후, pWRG/SEO-M(x) 또는 pWRG/HTN-M(x)로 면역접종된 모든 원숭이는 여전히 검출할 수 있는 수준의 중화항체, 즉 PRNT_80%GMT가 각각 113 및 63이었다. 8개월 후, HTNV M DNA 면역접종된 원숭이들 중 한마리(CH27)는 PRNT_80%역가가 20 미만이었으나, 여전히 검출할 수 있는 수준의 중화항체 반응, 즉 PRNT_50%역가가 20이었다. 반대로, 양성 대조군 백신인 rVV/HTN-M+S로 면역접종된 원숭이는 최종 면역접종 4개월 후에 검출할 수 있는 수준의 중화항체가 거의 없거나 전혀 없었다.

실시예11

pWRG/SEO-M 또는 pWRG/HTN-M에 의한 비인간 영장류의 DNA 면역접종은 DOBV를 교차-중화하는 항체를 유도함.

면역접종된 원숭이 유래의 혈청을 PRNT에 의해 교차-중화활성에 대하여 시험하였다(표 4). pWRG/SEO-M(x) 또는 pWRG/HTNV-M(x)로 면역접종된 모든 원숭이는 DOBV를 교차-중화하는 항체를 가졌다. rVV/HTN-M+S 면역접종된 원숭이 또한 낮은 역가이기는 하나 DOBV-교차 중화항체를 가졌다. 놀랍게도, pWRG/SEO-M(x)로 면역접종된 원숭이는 HTNV-중화항체가 거의 없거나, 또는 전혀 없었다: 그리고, pWRG/HTN-M(x)로 면역접종된 원숭이는 SEOV-중화항체가 거의 없거나, 또는 전혀 없었다. 단지 pWRG/SEO-M(x)로 DNA 면역접종된 한마리의 원숭이(원숭이 CH32)만 검출할 수 있는 수준의 PUUV 중화항체를 나타내었다.

표4. 면역접종된 원숭이 유래 혈청에서의 교차-중화활성

혈청소스a	원숭이e	PRNTd
		SEOV	HTNV	DOBV	PUUV
		80%	50%	80%	50%	80%	50%	80%	50%
pWRG/SEO-M(x)로 면역접종b	CH03	640	1280	*	*	40	160	*	*
	CH32	1280	1280	*	80	320	640	*	40
pWRG/HTN-M(x)로 면역접종b	CH28	*	*	2560	2560	*	320	*	*
	CH02	*	*	5120	10240	160	320	*	*
	CH27	*	20	640	1280	80	320	*	*
rVV/HTN-M+S로면역접종c	62F	*	*	40	160	*	80	*	*
	CH21	*	*	320	640	*	160	*	*
	AA016	*	*	320	320	*	20	*	*

^a최종 면역접종 3주 후에 수집된 원숭이 혈청.

^b상기 DNA 백신 플라스미드로 3주 간격으로 3번 유전자 총 면역접종된 원숭이.

^c42일 간격으로 2번 재조합 백시니아 바이러스 백신으로 피하지방층에 주사된 원숭이

^dPRNT 값은 상기 바이러스 플라크수를 80% 또는 50%까지 중화시키는 혈청 희석배수의 역수(reciprocal serum dilution)이다. 동형 역가는 굵은체로 표시하였다.

^*20 미만의 역가.

토론

HTNV V 유전자 클론의 일시적인 발현은 우선 재조합 백시니아 바이러스 및 바큘로바이러스 시스템(Pensiero 등, 1988, J. Virol. 62, 696~702; Schmaljohn 등, 1989, 상게서)을 사용하므로써 수행되었다. G1 및 G2 단백질 모두가 발현되었고, 이는 원래의 바이러스 단백질과 생화학적으로, 항원적으로 동일한 것으로 보였다. HTNV G1 및 G2는 또한 백시니아 바이러스/T7 RNA 폴리머라제 발현 시스템(Kamrud 및 Schmaljohn, 1994, Virus Res. 31, 109~121)을 사용하여, T7 프로모터에 의해 조절되는 HTNV 유전자를 포함하는 플라스미드로부터 일시적으로 발현되었다. 그러나, HTNV M 유전자가 CMV 프로모터를 사용하는 플라스미드내로 클로닝되었을 때는, 당단백질 발현에 문제점이 발생하였다. 대부분의 경우에, G1 이외의 G2는 RIPA에 의해 측정되는 바와 같이 발현되었다(데이터 생략). 예를 들면, 최근의 가형(pseudotype) 연구(Ma 등, 1999, Virus Res. 64, 23~32)에서 사용되는 플라스미드인 pcHTN-M은 G1 및 G2 모두를 발현하는 것으로 여겨졌다; 그러나, 본 발명자들의 실험실에서 수행된 연속적인 RIPA 결과는 단지 G2만이 올바르게 발현되었음을 나타낸다(데이터 생략). G1은 발현은 되지만, 부정확하게 가공(process)(즉, 부정확하게 접히거나, 세포로부터 부정확하게 분비되거나, 핵에 부정확하게 타겟팅되거나 또는 부정확하게 분해)되거나 또는 부분적으로 발현(예, 절단된 형태(truncated))될 가능성이 있다.

SEOV 또는 HTNV M 유전자의 외래 DNA 상류의 짧은 서열을 포함시키면, DNA 백신 벡터 pWRG7077로부터 G1 발현을 발생시킨다는 것을 발견하였다. pWRG7077에서, CMV 프로모터와 인트론 A는 이웃한다. 인트론 A는 클론된 유전자의 발현수준을증가시키는 기능을 하는 성분을 포함한다(Chapman 등, 1991, Nucl. Acids. Res. 19, 3979~3986). 전사 후, 인트론 A 서열은 RNA로부터 절제(excised)되고, 그 절제된 전사체는 핵으로부터 발현 장소인 세포질로 운반된다. 본 발명자들은 G2가 정상적인 수준으로 발현해도, 인트론 A의 스플라이싱(splicing)이 비정상적이어서 G1 서열의 파괴가 다소 발생하면, G1 발현상의 결점이 관찰될 수 있다고 생각하였다. 인트론 A와 한타바이러스 M 유전자 사이에 위치한 외래 서열이 비정상적인 스플라이싱을 방지하여 G1 및 G2의 정상적인 발현을 가능케할 수 있다고 생각하였다. 이러한 가정은 외래서열내의 7개의 뉴클레오티드 서열이 인트론 A 스플라이스 수용부위인 TCTGCAG(Stenberg 등, 1984, 상게서)와 동일하다는 것을 발견하였을 때 지지되었다. 그러나, 외래서열에서 추정되는 스플라이스 수용체의 돌연변이가 G1 발현에 영향을 미치지는 않았다(도 9B). 이것은 몇몇 다른 스플라이싱 과정이 pWRG7077 플라스미드로부터의 G1 발현에 영향을 미칠 가능성을 배제한다. 클로닝된 SEOV 및 HTNV M 유전자의 상류에 위치한 짧은 길이의 뉴클레오티드 GGATCTG가 어떻게 G1의 발현에는 영향을 미치나, G2의 발현에는 영향을 미칠 수 없는 지를 밝히기 위한 다른 실험이 필요할 것이다. 메카니즘에 관계 없이, 이러한 발견은 HTNV에 대한 DNA 백신 후보를 개발하도록 할 것이다.

본 명세서에서 HTNV M DNA 백신의 면역원성 및 보호능력을 나타내는 보고 결과와 함께 SEOV M DNA 백신에 관한 본 발명의 이전의 결과는, 전장 M 유전자를 다른 한타바이러스에 대한 DNA 백신에 사용하기 위한 유력한 케이스를 만든다. G1 단독, G2 단독, 또는 당단백질의 절편이 중화항체를 유도하고, 감염에 대해 보호할수 있는지 여부는 불분명한 상태이다. G1 또는 G2를 단독으로 포함하는 재조합 바큘로바이러스-감염 세포 용해액, 및 G1 또는 G2를 단독으로 발현하는 재조합 백시니아 바이러스에 의한 면역접종은 중화항체를 유도하지 못하였고, 햄스터 감염모델(Schmaljohn 등, 1990, J. Virol. 64, 3162~3170)에서 불완전한 보호를 나타내었다. 이러한 데이터는 G1 및 G2를 발현할 수 있는 전장 M 유전자가 보호성 면역을 위하여 필요할 수 있다는 것을 나타낸다. 반대로, Bharadwai 등은 신놈버 바이러스(SNV) 및 HPS-관련 한타바이러스의 M 유전자의 짧은 부분(~166 아미노산)을 포함하는 DNA 백신 플라스미드로 생쥐를 근육내 바늘주사한 후, 낮은 수준의 중화항체가 발생하였음을 보고하였다(Bharadwai 등, 1999, Vaccine 17, 2836~2843). 이러한 발견은, 중화항체 반응을 유도하기 위하여 전장 M 유전자가 필요하지 않을 뿐 아니라, 단지 G1 또는 G2의 소단위체가 발현되어도 유도된다는 것을 암시한다. 현재, 본 발명자들은 HTNV G1 단독, G2 단독, 또는 G1 및 G2를 조합(다른 플라스미드로부터 발현)하여 발현하여, 중화항체를 유도하고 감염으로부터 햄스터를 보호하는 DNA 백신의 능력을 시험하기 위한 실험을 수행하고 있다.

적어도 10가지 한타바이러스가 HFRS 또는 HPS를 야기하는 것으로 알려져 있고, 한타바이러스 중에서 교차-중화 및 교차-보호에 대한 정보는 교차-보호 백신의 합리적인 디자인에 중요하다. 연구자들은 한타바이러스에 감염된 (인간을 포함하는) 다양한 종들 유래 혈청이 다른 한타바이러스를 교차-중화하는지 그 능력을 평가하였다(Chu 등, 1995, 상게서; Niklasson 등, 1991, Am. J. Trop. Med. Hyg. 45, 660~665 ; Lee 등, 1985, J. Clin. Microbiol. 22, 940~944 ; Lundkvist 등 1997,J. Med. Virol. 53, 51~59). 다른 종들, 및 하나의 종내의 다른 개체는 다른 수준의 교차-중화항체를 나타내는 것으로 보인다. 일반적으로, 이러한 실험 데이터는 비록 혈청형간에 역가가 약 4배 정도 차이가 난다 해도, HTNV-, SEOV- 또는 DOBV-감염 개체 유래의 혈청이 교차-중화항체를 공유한다는 것을 나타낸다. 반면에, PUUV-감염 개체 유래의 혈청은 SEOV-, HTNV- 또는 DOBV-교차-중화항체를 거의 나타내지 않거나, 또는 전혀 나타내지 않는다. 감염되거나 또는 DNA-면역접종된 햄스터 유래의 혈청으로부터 얻어진 본 데이터는 이전의 발견들과 일치한다. DNA-면역접종된 햄스터 유래의 혈청풀내의 교차-중화항체의 수준이 감염된 햄스터 유래의 혈청풀 보다 더 높다는 것을 발견하였다. 이것은 DNA 면역접종 후에 유도된 항체와 감염에 의해 유도된 항체 사이에 질적인 차이가 있음을 반영하는 것이며, 또는 단지 항체 수준의 양적인 차이를 반영하는 것일 수 있다. 면역접종된 햄스터내 높은 동형 중화항체 수준이 반드시 교차-중화 활성과 관련있는 것은 아니었다(도 12).

햄스터 혈청풀을 이용한 교차-중화 시험은, 만약 중화항체가 보호 면역성을 나타낼 수 있다면, pWRG/SEO-M 또는 pWRG/HTN-M에 의한 면역접종이 PUUV 이외의 SEOV, HTNV에 대하여 보호할 수 있다는 것을 나타내었다; 그리고 이것은 일반적으로 사실이라는 것을 발견하였다. 도 12의 데이터는 하나의 예외가 있으나, 교차-중화항체의 존재가 보호효과와 상관관계가 있다는 것을 나타낸다. 햄스터 2119는 교차-중화항체를 나타냈지만, 항-N 반응이 있었기 때문에 명확하게 보호받지는 못하였다. 그러나, 검출할 수 있는 수준의 교차-중화항체의 부존재가 반드시 보호가 부족하다는 것을 나타내는 것은 아니다. 후자의 경우의 예들은 도 12의 햄스터 1437,1434, 2122 및 2133에서 발견될 수 있다. 교차-중화항체가 존재하지만, 분석법의 한계로 인하여 검출되지 않거나, 또는 비중화반응이 보호될 가능성이 있다

본 연구에서, pWRG/SEO-M 또는 pWRG/HTN-M에 의한 면역접종이 SEOV, HTNV 및 DOBV에 대하여 교차-보호하였다는 것을 밝혔다. 다른 실험 한타바이러스 백신도 교차-보호 능력을 가진다. 예를 들면, HTNV G1, G2 및 N을 발현하는 백시니아 재조합체(rVV/HTN-M+S)가 PUUV 이외에 SEOV 감염에 대하여 교차-보호하였고(Chu 등, 1995, J. Virol. 69, 6417~6423), SEOV G1 및 G2 또는 N을 발현하는 백시니아 재조합체가 HTNV에 대하여 교차-보호하였다(Xu 등, 1992, Am. J. Trop. Med. Hyg. 47, 397~404). 본 연구는 DOBV에 대한 보호를 입증하는 최초의 보고이다.

한타바이러스 M 유전자-기초 DNA 백신은 레서스 마카크 원숭이에서 양성반응을 유도할 뿐만 아니라, 비교적 높은 수준의 중화항체를 유도하였다. SEOV 및 HTNV M 유전자 DNA로 3번 면역접종된 원숭이 유래의 혈청 데이터를 조합한 결과, PRNT_80%GMT가 1470이었다. 이러한 중화항체 반응은 재조합 백시니아 바이러스 백신에 의해 유도된 반응(PRNT_80%GMT=160, PRNT_5O%GMT=320) 보다 거의 10배 높았다. rVV/HTN-M+S 중화항체 반응은 이전에 인간에 대해 보고되었던 중화항체 반응(PRNT_50%GMT=160)(McClain 등, 2000, 상게서)과 유사하였다. 또한, 인간에 투여된 불활성화된 한타바이러스 백신은 일반적으로 ~100의 중화항체 역가를 유도하였다(Yu 등, 1999, In: Factors in the Emergence and Control of Rodent-borne Viral Diseases(Hantavirus and Arenal Diseases), J. F. Saluuzo 및 B. Dodet, Eds.,pp. 157~161. Elsevier Press, Paris; Zhu 등, 1994, Chinese Med. J. 107, 167~170).

면역접종된 원숭이에서의 중화항체 수준이 최종 유전자 총 면역접종 수개월 후에 저하되었다는 것을 발견하였다. 그러나, 심지어 6개월 후에도, 중화항체가 여전히 pWRG/SEO-M(x) 또는 pWRG/HTN-M(x)로 면역접종된 모든 원숭이에서 검출될 수 있었다. 이에 반하여, rVV/HTN-M+S로 면역접종된 원숭이는 4개월 후에도 검출할 수 있는 수준의 중화항체를 갖지 않았다(도 14).

중국에서, 한타바이러스에 대한 몇몇 불활성화된 바이러스 백신이 개발되어 인간에서 시험되었고, PRNT 분석법이 백신의 능력을 평가하기 위하여 사용되었다(Zhu 등, 1994, 상게서, Yu 등, 1999, 상게서에서 리뷰). 세포 배양액에서 만들어진 대부분의 불활성화된 바이러스 백신은 3회 투여 후, 피접종자의 90~100%에서 GMT≤100의 중화항체를 유도한다. 혈청양성 비율(seropositive rate)은 최종 접종 6개월 후에 ~50%까지 저하되나, 2차 면역접종(booster vaccination)에 의해 회복되었다. 비록, 아시아에서 개발된 한타바이러스 백신이 효력의 면에서 전망이 있으나, 본 발명자들은 불활성화된 바이러스 백신에 내재하는 안전문제를 피할 수 있는 재조합 한타바이러스 백신의 개발에 노력을 기울여 왔다. 더욱이, 외래 단백질(예, 면역증강제(adjuvant)와 조합된 베타-프로피오락톤-처리 비리온(virion))에 의한 반응 보다, 피접종자의 세포내에서 G1 및 G2의 발현을 야기하는 백신 플렛폼(예, DNA 백신)을 사용하여 좀 더 강한 중화항체 반응을 유도하는 것이 가능하다고 생각된다. 본 발명의 DNA-면역접종된 원숭이에서 유도된 높은 중화항체 반응은, 상기백신 접근법에 의해 매우 높은 수준의 중화항체가 얻어질 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예12

치명적인 ANDV 챌린지에 대하여 pWRG/HTN-M(x)는 부분적으로 보호함.

본 발명자들은 이전에 HTNV M 유전자-기초 DNA 백신인 pWRG/HTN-M(x)가, HFRS를 유발하는 네가지의 한타바이러스 중 세가지에 대하여 교차보호할 수 있음을 밝혔다. 이 백신이 HFRs를 유발하는 한타바이러스에 대하여 보호할 수 있는지를 결정하기 위하여, 3주 간격으로 3회 pWRG/HTN-M(x) 또는 음성 대조군 플라스미드를 햄스터에게 면역접종한 다음, 최종 면역접종 3주 후에 ANDV로 그들을 챌린지하였다(250 LD₅₀, i.m.). 두가지의 별도의 실험이 시행되었고, 그 결과를 취합하여 도 15에 나타내었다. 한마리의 햄스터를 제외하고는 모두에서, 백신이 HTNV NAb(50% 중화 기하학적 평균 역가 [GMT]=226; 범위< 20~5120)를 유도하였다. ANDV 교차-NAb는 하나의 예외(#514, 역가=20)를 제외하고는 검출되지 않았다. 챌린지 후, pWRG/HTN-M(x)를 면역접종한 24마리의 햄스터 중 15마리가 죽었고, 음성 대조군군은 15마리 중 14마리가 죽었다. 양 그룹에서 평균 사망일은 13일이었다. 따라서 pWRG/HTN-M(x)의 면역접종에 의하여 제공된, 치명적인 ANDV의 챌린지에 대한 보호작용은, 통계학적으로 유의적이지는 않았으나 시사적인 것이었다(p=0.0569). 챌린지로부터 살아남은 햄스터들에 대하여 그들이 바이러스에 노출되었었는지를 확인하기 위하여 ANDV로 재차 챌린지하였다. 최소한 한마리(ID#504)는 두차례의 연속적인 챌린지 후에도 항체반응을 보이지 않았으나, 치명적인 질명으로부터는 완전하게 보호되었다.

실시예13

ANDV M 유전자-기초 DNA 백신은 G1 및 G2를 발현함.

본 실험에서 pWRG/HTN-M(x)에 의하여 제공된 보호수준이 불과 38%였기 때문에, ANDV M 유전자-기초 DNA 백신을 만드는 데에 전력하였다. ANDV종 칠레-9717869의 전장 M 유전자를 pWRG7077내로 RT-PCR 클로닝하여 pWRG/AND-M(서열번호8)을 얻었다. 전체 M 유전자의 오픈 리딩 프레임을 서열분석하였다. 클로닝된 M 유전자의 서열은 공표된 ANDV의 M 유전자 서열인 Genbank 기탁번호 AF291703과 거의 동일하였는데, 바이러스 분리물이 같은 설치류 종(마이스너 등, 2002, Virus Res. 89, 131~143)으로부터 유래한 것이므로 놀라운 일은 아니다. 두개의 아데닌이 구아닌 뉴클레오티드로 변이되어 있었다. 1504번째 염기 위치에서는 침묵변이가 있었으나, 1840번째 염기 위치에서의 변이는 597번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환되는 결과를 가져왔다.

형질도입된 COS 세포에 있어서 G1 및 G2의 발현은 RIPA로 평가하였다. 회복기 HPS 환자로부터 얻은 혈청에서, pWRG/AND-M-형질도입된 세포 또는 ANDV-감염 세포 유래의 예측된 크기의 G1 및 G2를 가지는 폴리펩티드를 면역침전시켰다(도 17A~B). 발현산물의 크기는 다른 한타바이러스의 G1 및 G2의 크기와 유사하였다; G1은 68~76kDa의 범위이고, G2는 52~58kDa의 범위였다(Schmaljhon 및 Hooper, 2001, In: Fields Virology, 4th Ed. 리핀커트, 윌리암스 및 윌킨스, 필라델피아, PA, pp. 1581~1602). pWRG/AND-M 형질도입 세포가 아닌, ANDV-감염 세포 내의~46kDa의 단백질이, ANDV 뉴클레오캡시드 단백질이라고 추정하였다. 폴리펩티드가 G1 및 G2라는 것을 확인하기 위하여, pWRG/AND-M 또는 pWRG/HTN-M(x)로 형질도입된 세포로부터 ANDV 당단백질을 면역침전시키는 능력에 대하여 HTNV G1- 및 G2-특이적 MAbs의 배터리를 스크린하였다. ANDV G1 단백질과 교차반응하는 HTNV G1-특이적 MAbs를 확인할 수 없었다; MAb-2D5, MAb-6D4, MAb-8B6(도 17C), MAb-10F11 또는 MAb-3D5(데이터 생략). HTNV G2-특이적 MAb-23G10, MAb-16E6 및 MAb-HCO2는 ANDV G2를 면역침전시키지 않았다; 그러나, HTNV G2-특이적 MAb-3D7은 pWRG/AND-M 형질도입 세포(도 17C)로부터 ANDV G2를 면역침전시켰다. 추론하자면, G2-특이적 MAb-3D7이 아닌, HPS 환자의 혈청에서 침전되는 69-kDa 표지하에 이동성을 가지는 단백질이 ANDV-G1이라는 결론을 내렸다. ~70kDa의 단백질의 동정은 아직 밝혀지지 않았다.

실시예14

pWRG/AND-M DNA 백신은 햄스터에 대하여 면역원성도 없고, 보호작용도 없음.

pWRG/AND-M의 면역원성 시험을 위하여, 유전자총을 사용하여 3주 간격으로 3번 24마리의 햄스터에 면역접종하고, 혈청 샘플을 수집하여, 그것에 대하여 PRNT로 NAb에 대한 테스트를 하였다. ANDV-특이적 NAb는 검출되지 않았다(데이터 생략). 같은 날에 pWRG/HTN-M(x)로 면역접종한 햄스터는, 역가 10240정도의 HTNV-특이적 Nab가 발생하였다(데이터 생략). pWRG/AND-M에 의한 면역접종이 ANDV G1- 또는 G2-특이적 비중화 항체를 유도하는지 여부를 확인하기 위하여, pWRG/AND-M으로 형질도입시킨 세포로 IFAT를 수행하였다. pWRG/AND-M으로 면역접종한 햄스터로부터 얻어진 대표 혈청에서는 G1 또는 G2에 대한 어떤 항체도 검출되지 않았으나, 미리 ANDV로 감염시킨 햄스터로부터 얻은 혈청인 양성 대조군 샘플에서는 검출되었다(데이터 생략). 7마리의 햄스터로 이루어진 제2 그룹에 대하여 전체 면역접종 실험을 반복하였으나, 역시 NAb 반응은 검출되지 않았다(데이터 생략). pWRG/AND-M으로 면역접종하는 것이 비체액성이지만 그럼에도 불구하고 보호성의 면역반응을 유도할 가능성이 있기 때문에, 우리는 첫번째 실험의 8마리의 햄스터와 두번째 실험의 7마리의 햄스터를 250 LD₅₀의 ANDV로 챌린지하였다. pWRG/AND-M으로 면역접종한 14마리의 햄스터중 12마리가 HPS가 발병하여 죽었다. 면역접종하지 않은 햄스터 8마리 중 6마리가 HPS가 발병하여 죽었다. 평균 사망일은 면역접종한 그룹과 면역접종하지 않은 그룹 모두에 대하여 12~13일이었다. 이러한 부정적인 데이터로부터, pWRG/AND-M은 시리아 햄스터에 대하여 면역원성이 없다는 결론을 내렸다.

실시예15

pWRG/AND-M은 레서스 마카크 원숭이에서 고역가의 NAb반응을 유도함.

햄스터에서 pWRG/AND-M의 면역원성이 없는 것이 종특이적 현상 때문인지를 확인하기 위하여, 우리는 이 플라스미드를 레서스 마카크 원숭이에서 테스트하였다. ID# CH69인 상기 원숭이에게 3주 간격으로 4번 pWRG/AND-M을 유전자총으로 면역접종하였다. 양성 대조군으로서, 두마리의 레서스 마카크 원숭이에게 pWRG/HTN-M(x)를 면역접종하였는데, 이것은 이미 비인간 영장류에 면역원성이 있는 것으로 알려진 것이다. 각 면역접종 전에 혈청을 수집하고, 4차 면역접종 3주후에 HTNV 및ANDV NAbs의 존재를 시험하였다(도 18A, 도 18C). pWRG/AND-M으로 면역접종한 원숭이 CH69와 pWRG/HTN-M(x)로 면역접종한 양성 대조군 원숭이는 2차 면역접종 후에 NAb반응을 나타내었고, 4차 면역접종 후의 NAb 역가는 극히 높았다(도 18A, 도 18C).

다른 HPS-관련 한타바이러스를 교차 중화시키는 능력을 확인하기 위하여 면역접종된 원숭이로부터 얻은 혈청을 시험하였다. pWRG/HTN-M(x)가 아닌 pWRG/AND-M으로 면역접종한 원숭이의 혈청은 SNV 및 BCCV를 중화시켰다(도 18A). pWRG/AND-M 또는 pWRG/HTN-M(x)로 면역접종한 원숭이로부터 얻은 혈청은 각각 HTNV 또는 ANDV를 교차중화시키지 않았다.

면역접종 전, 후(최종 면역접종후 6주), ANDV 당단백질을 면역침전시키는 능력을 확인하기 위하여, 원숭이 CH69로부터 혈청을 수집하고 RIPA로 검사하였다. 면역접종 전에는 그렇지 않았으나, 면역접종 후에 혈청은 회복기의 인간 혈청에 의해 면역침전되는 것과 유사한 단백질들을 면역침전시켰다: 강한 G2 밴드, 약한 G1 밴드, 및 미확인의 ~70kDa의 밴드(도 18B).

pWRG/AND-M으로 면역접종하는 것이 레서스 마카크 원숭이에게 면역원성이 있는지 확인하기 위하여, 우리는 두번재 동물에 대하여 3주 간격으로 4번 면역접종하였다. 이 원숭이(ID# 90BD25)는 2차 면역접종 후에 5120의 PRRNT₅₀역가를 나타내었고, 4차 면역접종 3주 후에 10240의 역가를 나타내었다(도 18C). 따라서 비인간 영장류에 있어서 고 역가의 NAb를 유도하는 pWRG/AND-M의 능력은 재현성이 있는 것이었다.

HPS 또는 HFRS DNA 백신으로 면역접종된 원숭이에 있어서 NAb 반응의 지속시간을 알아보기 위하여, 약 6개월 동안 혈청 샘플을 주기적으로 수집하였다. pWRG/AND-M으로 면역접종된 원숭이는, 각각 최종 면역접종 20 및 25주 후에도 여전히 320(원숭이 ID# 90BD25)~2560(원숭이 ID# CH69)의 PRNT₅₀역가를 보이고 있었다(도 18C). pWRG/HTN-M(x)로 면역접종한 2마리의 양성 대조군군 원숭이는 여전히 최종 면역접종 25주 후에도 같은 PRNT₅₀역가(640)를 보이고 있었다.

실시예16

이중 구조체는 HTNV 및 ANDV 감염에 대하여 보호함.

한탄 M 유전자와 안데스 M 유전자를 모두 포함하는 하나의 구조체를 제조하였다. 한탄 M 유전자와 안데스 M 유전자를 pWRG7077내로 클로닝하여 pWRG/HA-M(서열번호9)를 생성시켰다. 각 M 유전자를 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터와 인트론 A(CMV 인트론 A) 및 소 성장호르몬 폴리아데닐 첨가 부위로 플랭킹시켰다. 대부분의 5' 및 3' 비코딩 서열 뿐아니라, 한탄 바이러스와 안데스 바이러스의 전체 M 유전자의 오픈 리딩 프레임들이 그 구조체 내에 포함된다. 또한 각 한타바이러스 M 서열과 그것의 각각의 CMV 인트론 A 서열 사이에 24bp 서열이 위치한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 이유는 알려지지 않았으나, 이 24bp 서열(또는 그 위치)이 G1 당단백질의 발현에 필요하다는 것을 발견하였다.

pWRG/HA-M이 포유동물의 세포에 도입되었을 때, 한탄 바이러스와 안데스 바이러스 M 유전자가 발현되었다. 그 발현 산물은 한탄 바이러스 G1 및 G2 당단백질과 안데스 바이러스 G1 및 G2 당단백질을 포함한다.

한탄/안데스 이중-M 유전자 한탄 바이러스 DNA 백신인 pWRG/HA-M을 레서스 마카크 원숭이의 면역원성용으로 시험하였다. 그 백신은 한탄 바이러스와 안데스 바이러스를 중화시키는 항체반응을 유도하였다(표 8 참조). 단일 햄스터 실험에서, 이 플라스미드가 안데스 바이러스의 플라스미드와 유사하다는 것을 발견하였는데, 그것은 햄스터에서 항체반응을 유도하지 않는다는 점이었다. 그러나, 상기 플라스미드가 원숭이에서 중화항체를 유도한다는 사실은, 그것이 인간에서도 중화항체를 유도할 수 있음을 시사한다. 이것은, 심각한 질병을 유발하는 HPRS-관련 및 HPS-관련 한타바이러스 모두에 대하여 보호할 수 있게 고안된 최초의 DNA 백신이다.

실시예17

챌린지 1일전 pWRG/AND-M으로 면역접종한 원숭이로부터 얻은 혈청의 수동 전달은 햄스터에서 HPS를 지연시키거나 예방함.

HPS DNA 백신으로 레서스 마카크 원숭이를 성공적으로 면역접종하여, 이 백신에 의하여 유도된 NAb 반응이 치명적인 ANDV 감염으로부터 햄스터를 보호할 수 있는지를 확인하는 데에 관심을 가졌다. 이를 시험하기 위하여, pWRG/AND-M으로 면역접종한 원숭이 또는 음성 대조군 플라스미드로 면역접종한 원숭이로부터 얻은 혈청을 4마리의 햄스터 그룹에 주사하였다. 다음날, 동물들을 ANDV(250 LD₅₀, i.m.)로 챌린지하고, 4주간 매일 관찰하였다. ANDV ANb를 함유한 혈청을 투여받은 모든 햄스터는 살아남았고, 음성 대조군 혈청을 투여받은 모든 햄스터는 챌린지 후 10~13일 사이에 죽었다(표 5). 챌린지 당일(0일)에 수집한 혈청 샘플과 28일째에 생존한 동물로부터 수집한 혈청샘플에 대하여 PRNT를 수행하였다. 20480의 ANDV PRNT₅₀역가를 가지는 보호성 원숭이 혈청을 주사받은 햄스터는 챌린지 시점에 320~1280의 PRNT₅₀역가를 나타내었다. 4주 후에, 이 햄스터들에서는 ELISA로 측정되는 뉴클레오캡시드-특이적 항체와 NAb가 검출되지 않았다. 따라서, 이 햄스터들은 살아남았을 뿐 아니라, 챌린지로부터 감염에 대한 무균 면역성을 가지게 된 것을 이 데이터는 시사하고 있다.

두번째 실험에서, pWRG/AND-M로 면역접종된 원숭이로부터 얻은 다른 혈청 샘플(ANDV PRNT₅₀역가=640)을 4마리의 햄스터에게 주사하였다. 음성 대조군군으로서, 음성 대조군 플라스미드로 면역접종된 원숭이로부터 얻은 혈청을 4마리의 햄스터에게 주사하였다. 이 햄스터들을 ANDV(250 LD₅₀, i.m.)로 챌린지하고, 14주간 매일 관찰하였다. 예측대로, 음성 대조군 원숭이 혈청을 주사받은 햄스터는 전부 HPS가 발병하여 10~14일 사이에 죽었다(표 5). 첫번째 실험에서, pWRG/AND-M로 면역접종된 원숭이로부터 얻어진 혈청을 주사한 햄스터 전부가 무균적으로 보호된 데에 반하여, 두번째 실험에서는 햄스터들 중의 2마리가 23일째에 죽었고, 다른 두마리가 40일째에 죽었다. 이전에 언급한 실험과 같이, 챌린지 전날에 pWRG/AND-M로 면역접종된 원숭이로부터 얻어진 혈청의 수동 전달은, 치명적인 ANDV 챌린지로부터 햄스터를 무균적으로 보호하거나, 또는 질병의 개시와 사망을 유의적으로 지연시킬 수있다.

표 5. pWRG/AND-M로 면역접종된 레서스 마카크 원숭이 유래 혈청의 햄스터로의 챌린지 전/후 수동 전달.

표 5(계속).

표 5(계속).

.

^apWRG/AND-M(AND-M) 또는 음성 대조군 혈청(-)으로 면역접종된 원숭이로부터 얻은 혈청

^b챌린지(0일째)에 대한 항체 주사일

^c챌린지 당시의 햄스터 혈청중의 NAb역가

^d0일째에 2000 PFU의 ANDV(250 LD₅₀), 또는 PBS를 근육주사

^e-, 생존한 동물

^f실험1(ID# 909~924)의 28일째의 최종 채혈, 실험2(ID#109~124)의 98일째의 최종 채혈

^g플라크의 50%를 중화시키는 최고 희석 배수의 역수; na, 비적용

^hELISA 역가의 종점

ⁱ무균 면역성은 뉴클레오캡시드에 대한 항체반응이 검출되지 않음을 나타냄.

표 6. 비치명적인 감염모델에 있어서 pWRG/HTN-M(x)로 면역접종된 NHP로부터 얻은 혈청의 수동 전달.

표 6(계속).

^aHTN-M은 pWRG/HTN-M(x)로 면역접종된 원숭이로부터 얻은 혈청을 의미함; (-)는 관련없는 플라스미드로 면역접종된 음성 대조군 원숭이로부터 얻은 혈청을 의미함; '없음'은 수동 전달이 없음을 의미함.

^b챌린지 당시의 햄스터 혈청중의 NAb역가(50%)

^c0일째에 2000 PFU의 HTNV(1000 LD₅₀)를 근육주사

^d플라크의 50%를 중화시키는 최고 희석 배수의 역수; ND, 수행되지 않음.

^eELISA 역가의 종점.

^f최종 채혈은 챌린지후 35일째이었다.

ⁱ무균 면역성은 뉴클레오캡시드에 대한 항체반응이 검출되지 않음을 의미함. Y는 무균 면역성이 있음을, N은 무균 면역성이 없음을 의미함.

표 7. 칠레 HPS 환자로부터 얻은 혈장을 햄스터에게 챌린지 전후 수동 전달.

표 7(계속).

^aHPS는 인간 HPS 환자로부터 얻은 혈장을 의미함; 정상은 정상 인간의 혈청을 의미함.

^b챌린지(0일째)에 대한 항체 주사일(1ml 근육주사)

^c챌린지 시점의 햄스터 혈청내의 NAb 역가

^d2000 PFU의 ANDV(250 LD₅₀)를 근육주사, 또는 무처리(없음)

^e-, 생존한 동물

^f98일째의 최종 채혈

^g플라크의 50%를 중화시키는 최고 희석 배수의 역수; na, 비적용

^hELISA 역가의 종점

ⁱ감염으로부터의 보호(무균 면역성)는 뉴클레오캡시드에 대한 항체반응이 검출되지 않음을 의미함.

실시예18

pWRG/AND-M으로 면역접종한 원숭이로부터 얻은 혈청을 ANDV 챌린지 4~5일 후 햄스터에 수동 전달하면 치명적인 HPS로부터 완전히 보호됨.

ANDV 챌린지 후 3, 4, 5, 6 및 9일째에 햄스터에게 투여한 경우, pWRG/AND-M으로 면역접종한 원숭으로부터 얻은 혈청의 보호효과를 시험하였다(표 5). 3, 4 또는 5일째에 항체를 투여받은 햄스터 16마리 중에서 15마리가 생존하였다. 그러나 항체를 챌린지후 6일째에 투여하면 8마리 중에 단 3마리가 생존하였다; 그리고 챌린지후 9일째에 투여하면 4마리 중에 겨우 1마리가 살아남았다. 노출후 실험(postexposure experiments)(ID# 909, 3일째)에서 살아남은 한마리를 제외한 생존동물 전부는, PRNT와 뉴클레오캡시드-특이적 ELISA로 측정한 바에 따르면 ANDV에 감염되었다. 상기의 챌린지전(pre-challenge) 수동 전달 실험과는 달리, 챌린지 후수동 전달 실험에서, 어떤 나중의 죽음도 관찰하지 못했다. 따라서 pWRG/AND-M으로 면역접종된 원숭이로부터 얻은 혈청으로, ANDV의 치명적인 챌린지가 있은 후 5일까지 면역예방하면, ANDV-챌린지 햄스터의 88~100%가 보호되었다.

실시예19

HTN-M DNA 면역접종한 원숭이로부터 얻은 혈청의 수동 전달은 햄스터를 HTNV 감염으로부터 보호함.

초기 연구에서, pWRG/HTN-M(x)로 면역접종한 햄스터들은 NAbs를 유도하여, 감염에 대해 보호된다는 것을 언급하였다; 그러나 유도된 항체 자체로 보호에 충분한지 여부를 실험한 바 없다. 이러한 의문에 답하기 위하여, 햄스터군에 아무것도 주사하지 않거나, 또는 pWRG/HTN-M(x)(PRNT₅₀역가=20480)로 4회 면역접종된 원숭이 또는 음성 대조군 플라스미드로 면역접종된 원숭이로부터 얻은 혈청을 주사하였다. 수동 전달후 1일째에 햄스터를 채혈하였고, HTNV로 챌린지하였다. 챌린지후 5주째에, 햄스터들을 최종 채혈하였고, 0일부터 35일째 사이에 모은 혈청에 대하여 PRNT로 HTNV NAbs를 시험하였고, ELISA로 뉴클레오캡시드-특이적 항체를 시험하였다(표 6). 음성 대조군 혈청을 주사하거나 또는 혈청을 주사하지 않은 모든 햄스터는, 높은 PRNT 역가 및 뉴클레오캡시드-특이적 ELISA 역가에 의해 시사하는 바와 같이, 완전히 감염되었다. 대조군적으로, pWRG/HTN-M(x)로 면역접종된 원숭이로부터 얻은 혈청을 주사한 햄스터 8마리 중 6마리는, ELISA에 의하여 검출가능한 항-뉴클레오캡시드 항체가 발생되지 않았다. 햄스터 #495는 낮은 수준의 감염을 시사하는 낮은 ELISA 역가를 나타내었다. 비록 햄스터 #498이 면역혈청을 주사한 그룹에 속하기는 하였지만, 챌린지시점에 어떤 NAb 반응도 검출되지 않았으므로, 항체가 성공적으로 전달된 것으로는 생각할 수 없었고, 따라서 이 동물은 HTNV 감염에 대하여 보호받지 못한 것으로 설명된다. 따라서 pWRG/HTN-M(x)로 면역접종한 비인간 영장류로부터 얻은 혈청을 챌린지전 1일째에 투여하는 것은, HTNV 감염에 대하여 햄스터를 보호하는 데에 충분하다.

실시예20

인간 HPS 환자로부터 얻은 혈장의 수동 전달

ANDV-M 유전자-기초 DNA 백신으로 면역접종된 원숭이로부터 얻은 혈청을 노출전 또는 노출후에 투여하면 치명적인 ANDV 챌린지에 대하여 보호할 수 있다는 점을 강조하면서, 칠레 HPS 환자(인간-HPS 혈장)로부터 얻은 인간의 회복기 혈장의, ANDV/햄스터의 치명적인 질병 모델에 있어서의 보호 능력을 조사하였다. 초기 ANDV NAb PRNT₅₀역가가 10240인 인간-HPS 혈장을 각각 다른 햄스터 군에게 -1, 3, 4, 또는 5일째에 주사하였다. 대조군군에는 -1일째에 정상인의 혈청을 주사하였다. 0일째에, 햄스터로부터 혈액을 수집한 후, 그 햄스터들을 ANDV(250 LD₅₀, i.m.)로 챌린지하였다. 독성시험을 위한 대조군군으로서, 인간-HPS 혈장을 -1일째에 투여한 세마리의 햄스터들은 챌린지되지 않았다. 햄스터들을 98일동안 모니터하였으며, 생존 동물들은 실혈치사시키고, 0일째와 98일째의 혈청 샘플에 대하여 PRNT 및 ELISA를 시행하였다(표 7). 정상인의 혈청을 투여받은 모든 햄스터는 챌린지 10~12일 사이에 죽었다. 인간-HPS 혈장을 -1일째에 투여받은 4마리 햄스터중 2마리는 생존하였다. -1일 군의 다른 두마리 햄스터는 HPS가 발병하여 챌린지 후 57일째와 68일째에 죽었다. 항체를 챌린지후 3, 4 또는 5일째에 투여받은 햄스터 12마리 중 7마리는 생존하였다. 이 군에서 죽은 햄스터들은 챌린지후 11일째와 15일째에 죽었다. 독성 실험 대조군군내의 3마리의 햄스터는 모두 건강한 상태를 유지하였다.

챌린지후 혈청으로부터 얻은 혈청학적 결과는, -1일째에 인간-HPS 혈장을 주사받고 생존한 두마리의 햄스터는 감염으로부터 보호되었음을 시사한다(즉, 그들은 항-뉴클레오캡시드 항체를 생성하지 않았다)(표 7). 챌린지 후에 인간- HPS 혈장을 투여받은 햄스터 중 한마리를 제외한 전부가 생존하였고, 그럼에도 불구하고 그들 전부가 항-뉴클레오캡시드 항체를 생성하였기 때문에 감염되었다. 따라서 인간-HPS 혈장은 최소한 -1, 3, 4 또는 5일째에 투여되었을 때에 챌린지된 햄스터의 최소한 반을 보호하였다. -1일째에 혈장을 투여받은 햄스터는 감염으로부터 보호되었거나, 대조군군보다 4배 이상 오래 생존하였다.

토론

최근까지, HPS에 대하여 보호하거나 또는 HPS를 치료하기 위한 백신, 효과적인 항바이러스제 또는 면역제제가 없었다. 이는 HPS가 모든 연령군에서 이전에 건강했던 개체도 괴롭히고, 병이 진행이 빠르며, 알려진 어떤 급성 바이러스 질환 중에서도 가장 높은 치사율을 가지는 것중 하나이기 때문에 당황스러운 일이다. 남아르헨티나와 칠레에서 ANDV-관련 HPS의 대인 전염에 대한 보고는, 이 매우 치명적인 질병에 대하여 긴급히 대응조치를 취하게 하였다(파둘라 등, 1998, Virology 241, 323~330; 토로 등, 1997, Emerg. Infect. Dis. 4, 687~694; 웰스 등, 1997, Emerg. Infect. Dis. 3, 171~174). 본 명세서에서는, 비인간 영장류에서 높은 역가의 NAb를 유도하는 HPS DNA 백신의 후보물질의 개발을 보고한다. 또한, 이 백신에 의하여 유도된 항체가, 심지어 챌린지후 5일째에 투여되어도 치명적인 HPS로부터 햄스터를 보호할 수 있음을 보고한다.

이것은 성장한 실험동물의 한타바이러스 질병 모델을 백신, 약물 또는 면역예방의 후보물질의 보호작용의 효능을 평가하기 위하여 사용한 최초의 연구이다. 이전의 연구들에서는 백신과 면역예방물질로서의 평가를 위하여 마우스, 햄스터 또는 제방쥐(bank voles)를 포함하는 한타바이러스 감염모델을 사용하였고, 약물의 평가를 위하여 석클링마우스(suckling mouse)의 신경생리학적 질병 모델을 사용하였다(후퍼와 리, 2001, In. Hantaviruses, p.171~191, 스프링거-페르락, 베를린, 독일; 슈멀존과 후퍼, 2001, 상게서). 본 실험에서는, 최근에 발표된 ANDV/햄스터의 치명적인 질병 모델을 사용하였다(후퍼 등, 2001, Virology 289, 6~14). ANDV가 성숙한 시리아 햄스터에게 치명적인 HPS를 유발한다는 것을 확신하였고, 그러한 챌린지는 상대적으로 지속적인 결과를 가져온다는 결론을 내렸다. 능동 면역접종 또는 수동 전달 실험에서 음성 대조군이었던 35마리의 햄스터 중에서, ANDV-챌린지햄스터의 100%가 감염되었고, 91%는 치명적인 HPS가 발병하였다(평균 사망일=12일, 10~15일 범위). 증상(예컨대, 호흡곤란)의 개시는 빨랐고, 보통 개시 24시간 내에 죽었다.

초기 연구에서, HTNV, SEOV, DOBV, PUUV 또는 SNV로 미리 감염시키는 것은 치명적인 ANDV 챌린지로부터 햄스터를 보호할 수 있음을 밝혔다(호퍼 등, 2001, 상게서). 이로부터, HTNV M 유전자-기초 DNA 백신인 pWRG/HTN-M(x)를 사용하여, ANDV 챌린지에 대하여 햄스터를 보호할 가능성이 있을지도 모른다고 추론하였다. 이 가능성을 시험하여 pWRG/HTN-M(x)는 치명적인 ANDV 챌린지으로부터 24마리 중 9마리의 햄스터를 보호하였다는 것을 밝혀내었다. 이 보호작용의 수준은 통계학적인 유의성은 없는 것이었으나(P=0.0569), 이 백신이 ANDV에 대한 어떤 면역작용을 유도한다는 점을 제시하였다. pWRG/HTN-M(x) 백신이 250 미만의 LD₅₀챌린지 투여량에 대하여, 또는 다른 챌린지 경로(예컨대, 에어로졸이나 경구 경로)에 대하여 더 높은 수준의 보호작용을 나타낼 가능성도 있다. pWRG/HTN-M(x) 면역접종된 햄스터의 혈청(도 14), 또는 초기 연구(후퍼 등, 2001. 상게서)에서 보호된 HTNV 감염 햄스터의 혈청에서 ANDV 교차중화 항체가 반드시 존재하지는 않았다. 이점은 미리 감염시킨 햄스터에서 관찰된 교차-보호작용이 뉴클레오캡시드와 당단백질 모두를 타킷으로 하는 세포-매개-면역반응에 기인하는데에 비하여; pWRG/HTN-M(x)-면역접종된 햄스터에서 발견한 부분 교차-보호작용은 단지 당단백질만을 타깃으로 하는 세포-매개-면역반응인 것으로 보인다는 것을 제시한다. L-게놈 절편 산물이, 미리 감염시킨 햄스터에서 관찰되는 보호작용에서 중요한 역할을 할 수 있다는 것이 이론적으로는 가능하다; 그러나 현재로서는 바이러스 중합효소(polymerase)가 체액- 또는 세포-매개-면역반응을 유도한다는 증거는 없다. HTNV 당단백질로 접종한 후에는 그렇지 않지만, HTNV로 감염시킨 후의 교차-보호작용은, HTNV 뉴클레오캡시드와 당단백질 모두를 발현하는 플라스미드(들)로 면역접종하면 HTNV 감염, 및 ANDV에 대한 교차-보호작용에 유사한 작용이 일어난다는 것을 제시한다.

HPS 백신 개발에 대한 또다른 접근법으로서, HPS를 유발하는 바이러스에 대하여 특이적으로 보호하도록 고안된 플라스미드를 만들었다. 그 플라스미드인 pWRG/AND-M은 완전한 ANDV M 유전자 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 세포배양에서 G1 및 G2 당단백질을 모두 발현하였다. 우리의 지식범위에서, BCCV M 유전자는, 성공적으로 클로닝되고 발현된 유일한 다른 HPS-한타바이러스의 완전한 M 유전자이다(라프코프 등, 1998, J. Virol. 72, 2865~2870). 이 연구에서, BCCV M 유전자는 신드비스(Sindbis) 바이러스 레플리콘(replicon) 시스템인 SIN-rep5내로 클로닝되었고, 그 발현은 면역침전법에 의하여 BHK21 세포내에서 검출된다.

레서스 마카크 원숭이에게 pWRG/AND-M으로 면역접종하면 강력한 NAb 반응이 유도되었다. 이것은 어떤 실험동물에서 NAb 반응을 명백하게 유도하는 것으로 보이는 최초의 HPS 백신의 후보물질이다. 이 원숭이들에서 NAbs가 생성되었을 뿐만이아니라, 1) NAbs는 단 2회의 면역접종 후에 검출되었고; 2) NAbs 역가가 매우 높았으며(즉, HPS 환자의 회복기 혈청에서 나타나는 정도로 높은 역가); 3) 최소한 다른 두가지의 HPS 관련 한타바이러스인 SNV 및 BCCV를 교차 중화시켰고; 그리고 4) NAbs가 최종 면역접종후 6개월째에도 여전히 검출되었다. SNV의 중화는 pWRG/AND-M 백신이 각각 남미와 북미에서의 주요 HPS-한타바이러스류인 ANDV 및 SNV에 대하여 보호할 수 있으리라는 점을 제시한다. BCCV의 중화는 pWRG/AND-M에 의한 면역접종이 광역의 HPS-관련 한타바이러스에 대하여 보호작용이 있을수 있다는 것을 제시한다(표 8참조). 이들 자료들은 본 발명의 HFRS DNA 백신 데이터와 더불어, pWRG/HPN-M(x) 및 pWRG/AND-M 모두를 포함하는 백신은, 인간에게 매우 치사율이 높다고 알려진 몇가지 주된 한타바이러스에 대하여 가능한 정도의 보호작용을 나타낼 수 있다는 것을 시사하고 있다.

표 8. 비인간 영장류에 있어서 한타바이러스 M 유전자-기초 DNA 백신의 면역원성: 1~4차 면역접종후의 반응.

^a3개의 별도의 실험이 시행되었다. 원숭이들은 면역접종당 8g의 백신을 투여받았다.

^b동형 바이러스에 대한 PRNT₅₀역가. pWRG/HA-M에 대하여, 한탄(HTN)과 안데스(AND)에 대한 역가를 나타내었다.

^cpWRG/HA-M은 안데스 바이러스와 한탄 바이러스 M-유전자를 모두 포함하는 플라스미드이다.

본 발명의 한탄, 서울, 안데스 또는 한탄/안데스 M 유전자-기초 DNA 백신으로 면역접종된 모든 원숭이는 6개월 후에도 여전히 검출될 수 있었던 수준의 중화항체를 유도하였다. pWRG/HTN-M(x)로 면역접종된 원숭이 3마리 중 2마리는 최종 면역접종후 2년째까지도 검출가능한 정도의 중화항체 수준을 나타내었다(표 9). 면역성의 지속기간에 관한 자료의 개략을 표 10에 나타내었다.

표 9. 비인간 영장류에 있어서 한타바이러스 M 유전자-기초 DNA 백신의 면역원성: 면역성의 지속기간.

^a3개의 별도의 실험이 시행되었다. 원숭이들은 면역접종당 8g의 백신을 투여받았다.

^b동형 바이러스에 대한 PRNT₅₀역가.

표 10. 비인간 영장류에 있어서 한타바이러스 M 유전자-기초 DNA 백신의 면역원성: 면역성의 지속기간.

본 연구 과정 중 우리가 얻은 더욱 당황스러운 결과 중의 하나는, pWRG/AND-M이 햄스터에서 검출될만한 면역반응을 유도하는 데에 실패하였다는 점이었다. 두개의 별도의 실험에서, pWRG/AND-M으로 3회 면역접종된 햄스터는 PRNT 또는 IFAT로 검출가능한 항체의 생성에 실패하였고, 치명적인 ANDV 챌린지에 대하여 보호받지도 못했다. 그에 비하여, pWRG/AND-M으로 2회밖에 면역접종받지 못한 레서스 마카크 원숭이는 검출가능한 NAb 반응을 나타내었다. 가능성은 낮아 보이지만, DNA 백신은 기술적인 이유로 햄스터에게는 비면역원성일 가능성이 있다. pWRG/AND-M이 햄스터에서 면역반응을 일으키는 데에 실패할 수 있었던 원인에 대한 매커니즘과, 이 현상이 시리아 햄스터에서 ANDV의 고치사성과 관계가 있는지 여부를 추적하기 전에,pWRG/AND-M 백신을 햄스터와 비인간 영장류의 양 종에 대하여 백신 로트(lot)와 면역접종 스케쥴이 같도록 병행 실험하여 평가하는 것이 신중한 것일 것이다. 최근의 연구에서, 중요한 점은 pWRG/AND-M이 비인간 영장류에서 매우 면역원성이 높다는 것이다.

이전의 연구에서, 우리는 SEOV 또는 HTNV의 당단백질을 발현하는 DNA 백신이 마우스, 햄스터 및 비인간 영장류에서 NAb를 유도하였음을 입증하였고, 또한 면역접종된 햄스터에서 나타나는 NAb의 존재는 감염에 대한 보호작용과 상관관계가 있다는 것을 입증하였다(후퍼 등, 1999, Virology 255, 269~78; 캠러드 등, 1999, Virology 263, 209~219). 본 발명에서, pWRG/HTN-M(x)로 DNA 면역접종하여 유도된 체액성 반응이 HTNV 감염에 대하여 보호하는 데에 충분하다는 것을 처음으로 밝혀내었다. 특히, 챌린지 1일전에 pWRG/HTN-M(x)로 면역접종된 원숭이로부터 얻은 혈청의 수동 전달이, HTNV로 챌린지된 8마리의 햄스터 중 6마리에서 무균 보호작용을 제공하였음을 밝혀내었다. 보호받지 못한 2마리의 햄스터는, 매우 낮은 챌린지후 항뉴클레오캡시드 역가를 나타내는 것으로부터 결정되는 바와 같이, 제한된 감염반응을 나타내거나(햄스터 #495); 또는 챌린지 당일에 검출가능한 NAb가 존재하지 않는다는 것으로부터 결정되는 바와 같이, 적절한 혈청을 주사받지 않은 것이었다(햄스터 #498). 유사한 수동 전달 검정법을, pWRG/HTN-M(x)로 면역접종된 인간으로부터 얻은 혈청을 평가하고, 또 백신의 효능을 예측하는 임상연구의 일부로서 사용할 수도 있다.

현재는, HPS 한타바이러스에 노출되거나, 잠재적으로 노출된 개인에 대한 치료방법이 없다. 입원환자의 높은 NAb 역가가 바람직한 임상 과정과 관련이 있다는 보고는, NAb가 병을 완화시키고 그 결과 HPS 바이러스에 노출된 사람에 대하여 면역요법이 실용적인 치료방법의 선택사항이 될 수 있음을 제시한다(바라자흐 등, 2000, J. Infect. Dis. 182, 43~48). HFRS-관련 한타바이러스에 대하여, 감염된 래트의 면역혈청 또는 마우스의 MAbs의 수동 전달은, 햄스터의 감염이나, 신생 래트 또는 석클링 마우스의 신경생리학적 질병에 대한 보호작용을 부여하였다(아리카와 등, 1989, J. Gen. Virol. 70, 615~24; 리앙 등, 1996, Virology 217, 262~271; 슈멀존 등, 1997, J. Virol. 71, 9563~9569; 장 등, 1989, Arch. Virol. 105, 235~246). HPS 한타바이러스에 대하여, 보호성 면역성의 수동 전달에 대한 보고는 없었다. ANDV/햄스터 치사 질환 모델의 발견은, 처음으로 인간의 질환과 유사한 한타바이러스 질환에 대하여 보호하는 항체의 능력을 평가할 수 있게 하였다. 이 모델을 사용하여, pWRG/AND-M으로 면역접종된 원숭이로부터 얻은 혈청의 수동 전달에 있어서, 노출후 4일 또는 5일째에 투여하였을 때에 치명적인 ANDV 감염으로부터 챌린지된 햄스터를 100% 보호한다는 것을 밝혀내었다. 이 결과는, 특히 HPS의 대인감염이 입증된 곳인 남미에서, 한타바이러스에 노출된 연구소 종사자들, HFRS 또는 HPS 환자의 가족 구성원이나 다른 가까운 접촉자들, 또는 HPS 건을 다루는 의료관계자들을 치료하는 데에 사용할 수 있는 제품(예컨대, ANDV 및/또는 HTNV를 중화하는, pWRG/AND-M 및/또는 pWRG/HTN-M(x) 또는 MAbs로 면역접종된, 인간을 포함한 영장류로부터 얻어진 폴리클론 면역글로블린)의 개발 가능성이 있음을 시사한다(파둘라 등, 1998, Virology 241, 323~330; 토로 등, 1997, 상게서; 웰스 등, 1997,Emerg. Infect. Dis. 3, 171~174)

HPS-환자의 회복기 혈장은 노출후 3일째에 투여하였을 때 원숭이의 혈청과 실질적으로 동등하였지만(보호작용의 비 75% : 88%), 노출후 4일 또는 5일째에 투여되었을 때는 단지 햄스터들중 50%만이 보호되었다. 낮은 샘플수 때문에, 이 차이는 인위적일 수도 있다. 또한, 인간의 NAbs는 레서스 마카크 원숭이의 NAbs보다 더 신속하게 소실되어 챌린지 시점에서는 더 낮은 유효 NAb 역가가 되었을 수도 있다. 원숭이 또는 인간의 한타바이러스-특이적 NAbs가 햄스터에서 소실되는 것에 대한 동역학적 평가는 시행하지 않았다.

pWRG/AND-M으로 면역접종된 원숭이로부터 얻은 혈청 또는 HPS 환자 혈장의 수동 전달을 챌린지 1일전에 부여한 결과, 치명적인 ANDV 챌린지에 대하여 무균 면역성에 의하여 햄스터가 보호되거나, 또는 질병의 개시 또는 사망은 2배에서 거의 4배까지 지연되었다. ANDV NAb를 함유하는 혈청의 수동 전달과 관련한 실험에서(표 5 및 표 7), 나중에 죽은 햄스터는 챌린지 1일전에 혈청을 주사한 것이었을 뿐이었다. 6마리의 햄스터는 23, 23, 40, 40, 57 및 68일째에 사망했고, 평균 사망일은 42일이었다. 이것은 음성 대조군 혈청(원숭이 또는 인간의)을 주사한 12마리의 햄스터가 모두 10~14일째에 사망하였고 평균 사망일은 12일이었으므로, 사망이 유의적으로 지연된 것이었다. 우리는 -1일째에 항체를 주사한 햄스터의 지연된 사망이, 이종성(heterologous)인 원숭이 또는 인간의 ANDV-특이적 NAb의 소실, 및 "외부로부터(from without)" 도입된 바이러스(예컨대, 같은 방안의 다른 케이지(cage) 내의 햄스터로부터 유래된 ANDV) 또는 "내부로부터(from within)" 도입된 바이러스(예컨대, 수동 전달된 항체에 의한 중화를 일으키지 않고 세포를 감염시킨 바이러스)의 증폭이 이어진 결과라고 추정한다. 노출후 혈청을 투여받은 햄스터가 나중에 사망하는 것을 관찰하지 못했는데, 이는 챌린지된 햄스터가 챌린지 바이러스의 능동 면역반응의 정점에 있었기 때문이라고 가설화하였다. 이 능동 면역반응은 보통 ANDV에 대하여 햄스터를 보호할만큼 충분하지는 않을 것이다; 그러나 3~5일째에 투여받은 수동 전달 면역성(즉, pWRG/AND-M으로 면역접종된 원숭이로부터 얻은 혈청내의 NAbs)이 햄스터에게 유리한 쪽으로 균형을 기울게하여 생존하게 한 것일 수도 있다(28마리 중 22마리 생존, 표 6 및 표 7 참조). 능동 면역반응은 햄스터가 수동 면역성이 소실된 후 ANDV에 노출되었다면, 지속적으로 햄스터를 보호할 수 있다. 이것을 뒷받침하는 실험에서, 챌린지 수주 후에 검출가능한 항뉴클레오캡시드 및/또는 NAb로 알 수 있는 바와 같이, 3, 4, 5, 6 또는 9일째에 항체가 수동 전달된 26마리의 생존동물 중 하나(#902, 표 5)를 제외한 전부가 역시 감염되었다. 지연된 사망이 "내부" 또는 "외부"로부터의 재노출에 의한 것인지 여부를 불문하고, 이 데이터는 한타바이러스에 노출된 후의 예방적 치료요법은 반복투여를 요하거나, 또는 항체의 수동 전달 및 능동 면역접종 모두를 요하는 것일 수도 있다는 것을 제시한다.

노출후 예방에 대한 수동/능동 면역접종이라는 접근방법은 A형 간염, B형 간염 및 공수병을 포함한 다른 바이러스성 질환의 방지에 통상적으로 사용된다(질병통제센터, 아틀랜타, 조지아 1991, MMWR 40, 1~19, MMWR 48, 1~21, MMWR 48, 1~37).

ANDV-특이적 NAb를 6일 또는 9일째에 투여받은 햄스터의 대부분이 죽었는데, 이는 면역예방법이 질환의 진행중에는 덜 효과적일 수 있다는 것을 암시한다. 대부분의 환자에 대하여 약물치료는 임상징후가 개시된 후에 시작되기 때문에, 저분자 약물인 리바비린(ribavirin)이 HPS 환자의 치료에는 효과가 없을지도 모른다는 다른 보고들이 있다(채프먼 등, 1999, Antivir. Ther. 4, 211~219). 감염에 의하여 유발되는 손상의 회복이 불가능하고, 예방이 가능하지 않은 임계적인 병리학적 시기는 명확하지 않다. 안데스/햄스터의 치명적인 질병 모델에 있어서의 HPS의 시간경과 과정의 특징을 밝히기 위한 장래의 연구는, HPS의 병인에 대한 식견을 제공할 것이며, 우리로 하여금 노출전 및 노출후 예방과 치료에 대한 전략을 세우도록 도와 줄 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases Hooper, Jay W. Schmaljohn, Connie S. Custer, Max <120> DNA Vaccines Against Hantavirus Infections <130> 003/260/SAP <140> PCT/US03/08810 <141> 2003-03-21 <150> US 60/367,128 <151> 2002-03-22 <150> US 60/398,985 <151> 2002-07-26 <160> 22 <170> Apple Macintosh Microsoft Word 6.0 <210> 1 <211> 3651 <212> DNA <213> Seoul hantavirus <220> <400> 1 tagtagtaga ctccgcaaga aacagcagtt aaagaacaat 40 aggatcatgt ggagtttgct attactggcc gctttagttg 80 gccaaggctt tgcattaaaa aatgtatttg acatgagaat 120 tcagttgccc cactcagtca actttgggga aacaagtgtg 160 tcaggctata cagaatttcc cccactctca ttacaggagg 200 cagaacagct agtgccagag agctcatgca acatggacaa 240 ccaccagtca ctctcaacaa taaataaatt aaccaaggtc 280 atatggcgga aaaaagcaaa tcaggaatca gcaaaccaga 320 attcatttga agttgtggaa agtgaagtca gctttaaagg 360 gttgtgtatg ttaaagcata gaatggttga agaatcatat 400 agaaatagga gatcagtaat ctgttatgat ctagcctgta 440 atagtacatt ctgtaaacca actgtttata tgattgttcc 480 tatacatgct tgcaacatga tgaaaagctg tttgattggc 520 cttggcccct acagaatcca ggttgtctat gaaaggacat 560 actgcactac gggtatattg 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3 <211> 8001 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> pWRG-SEO-M = Seoul hantavirus M segment, strain SR-11, subcloned into DNA vector pWRG7077 <400> 3 gggggggggg ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg 40 ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag 80 ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg 120 taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca 160 cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc 200 cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccga 240 cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa 280 ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc 320 aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac 360 catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa 400 ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat 440 cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta 480 ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa 520 atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa 560 agcttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc 600 cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc 640 gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg 680 cgatcgctgt taaaaggaca 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gagactgaca cggactctgt atttttacag gatggggtcc 2360 catttattat ttacaaattc acatatacaa caacgccgtc 2400 ccccgtgccc gcagttttta ttaaacatag cgtgggatct 2440 ccacgcgaat ctcgggtacg tgttccggac atgggctctt 2480 ctccggtagc ggcggagctt ccacatccga gccctggtcc 2520 catgcctcca gcggctcatg gtcgctcggc agctccttgc 2560 tcctaacagt ggaggccaga cttaggcaca gcacaatgcc 2600 caccaccacc agtgtgccgc acaaggccgt ggcggtaggg 2640 tatgtgtctg aaaatgagct cggagattgg gctcgcaccg 2680 tgacgcagat ggaagactta aggcagcggc agaagaagat 2720 gcaggcagct gagttgttgt attctgataa gagtcagagg 2760 taactcccgt tgcggtgctg ttaacggtgg agggcagtgt 2800 agtctgagca gtactcgttg ctgccgcgcg cgccaccaga 2840 cataatagct gacagactaa cagactgttc ctttccatgg 2880 gtcttttctg cagtcaccgt ccaagcttgc ggccaattcg 2920 gcacgagaga gtagtagact ccctaaagag ctactacact 2960 aacaagaaaa atggcaacta tggaagaaat ccagagagaa 3000 atcagtgctc acgaggggca gcttgtgata gcacgccaga 3040 aggtcaagga tgcagaaaag cagtatgaga aggatcctga 3080 tgacttaaac aagagggcac tgcatgatcg ggagagtgtc 3120 gcagcttcaa tacaatcaaa aattgatgaa ttgaagcgcc 3160 aacttgccga cagattgcag cagggaagaa catccgggca 3200 ggaccgggat cctacagggg tagagccagg tgatcatctt 3240 aaggaaagat cagcactaag ctacgggaat acactggacc 3280 tgaatagtct tgacattgat gaacctacag gacagacagc 3320 tgattggctg accataattg tctatctgac atcattcgtg 3360 gtcccgatca tcttgaaggc actgtacatg ttaacaacac 3400 gaggtaggca gacttcaaag gacaacaagg ggatgaggat 3440 cagattcaag gatgacagct catatgagga tgtcaatgga 3480 atcagaaagc ccaaacatct gtatgtgtca atgccaaacg 3520 cccaatccag catgaaggct gaagagataa caccaggaag 3560 attccgcact gcagtatgtg gactatatcc tgcacagata 3600 aaggcaagga atatggtaag ccctgtcatg agtgtagttg 3640 ggttcttggc actggcaaaa gactggacat cgagaattga 3680 agaatggctc ggtgcaccct gcaaattcat ggcggagtct 3720 cttattgccg ggagtttatc tgggaatcct gtgaatcgtg 3760 actatatcag acagagacaa ggtgcacttg cagggatgga 3800 gccaaaggaa tttcaagccc tcaggcaaca ttcaaaggat 3840 gctggatgta cactagttga acatattgag tcaccatcat 3880 caatatgggt gtttgctggg gcccctgata ggtgtccacc 3920 aacatgcttg tttgtcggag ggatggctga attaggtgcc 3960 ttcttttcta tacttcagga tatgaggaac acaatcatgg 4000 cttcaaaaac tgtgggcaca gctgatgaaa agcttcgaaa 4040 gaaatcatca ttctatcaat catacctcag acgcacacaa 4080 tcaatgggaa tacaactgga ccagaggata attgttatgt 4120 ttatggttgc ctggggaaag gaggcagtgg acaactttca 4160 tctcggtgat gacatggatc cagagcttcg tagcctggct 4200 cagatcttga ttgaccagaa agtgaaggaa atctcaaacc 4240 aggaacctat gaaattataa gtacataaat atataatcaa 4280 tactaactat aggttaagaa atactaatca ttagttaata 4320 agaatataga tttattgaat aatcatatta aataattagg 4360 taagttaact agtatttagt taagttagct aattgattta 4400 tatgattgtc acaattaaat gtaatcataa gcacaatcac 4440 tgccatgtat aatcacgggt atacgggtgg ttttcatatg 4480 gggaacaggg tgggcttagg gccaggtcac cttaagtgac 4520 ctttttttgt atatatggat gtagatttca attgatcgaa 4560 tactaatcct actgtcctct tttcttttcc tttctccttc 4600 tttactaaca aactacctcg tgccgaattg gccgcggatc 4640 ctcgcaatcc ctaggaggat taggcaaggg cttgagctca 4680 cgctcttgtg agggacagaa atacaatcag gggcagtata 4720 tgaatactcc atggagaaac ccagatctac 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actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 5600 tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 5640 actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 5680 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 5720 tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 5760 tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 5800 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 5840 gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 5880 tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 5920 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 5960 taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg 6000 cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 6040 tgcctgactc 6050 <210> 5 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence from plasmid pWRG/SEO-M in Figure 9A <400> 5 gcggccgcgg atctgcagga attcggcacg agagtagtag 40 actccgcaag aaacagcagt taaagaacaa taggatcatg 80 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of 24 bp extraneous sequence <400> 6 ggatctgcag gaattcggca cgag 24 <210> 7 <211> 7807 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of plasmid pWRG/HTN-M(x) <400> 7 gggggggggg ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg 40 ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag 80 ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg 120 taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca 160 cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc 200 cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccgc 240 cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa 280 ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc 320 aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac 360 catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa 400 ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat 440 cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta 480 ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa 520 atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa 560 agcttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc 600 cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc 640 gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg 680 cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat 720 gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt 760 ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct 800 gttttcccgg ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat 840 caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat 880 aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta 920 acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca 960 actctggcgc atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt 1000 cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac 1040 ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc 1080 tcgagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc 1120 ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt 1160 catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga 1200 gattttgaga cacaacgtgg ctttcccccc ccccccggca 1240 tgcctgcagg tcgacaatat tggctattgg ccattgcata 1280 cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc 1320 atgtccaata tgaccgccat gttgacattg attattgact 1360 agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 1400 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 1440 tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 1480 acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 1520 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 1560 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 1600 agtccgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 1640 cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc 1680 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 1720 atggtgatgc ggttttggca gtacaccaat gggcgtggat 1760 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 1800 tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 1840 gactttccaa aatgtcgtaa taaccccgcc ccgttgacgc 1880 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 1920 cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc 1960 catccacgct gttttgacct gcatcgaaga caccgggacc 2000 gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaacgcg 2040 gattccccgt gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga 2080 ctctataggc acaccccttt ggctcttatg catgctatac 2120 tgtttttggc ttggggccta tacacccccg cttccttatg 2160 ctataggtga tggtatagct tagcctatag gtgtgggtta 2200 ttgaccatta ttgaccactc ccctattggt gacgatactt 2240 tccattacta atccataaca tggctctttg ccacaactat 2280 ctctattggc tatatgccaa tactctgtcc ttcagagact 2320 gacacggact ctgtattttt acaggatggg gtcccattta 2360 ttatttacaa attcacatat acaacaacgc cgtcccccgt 2400 gcccgcagtt tttattaaac atagcgtggg atctccacgc 2440 gaatctcggg tacgtgttcc ggacatgggc tcttctccgg 2480 tagcggcgga gcttccacat ccgagccctg gtcccatgcc 2520 tccagcggct catggtcgct cggcagctcc ttgctcctaa 2560 cagtggaggc cagacttagg cacagcacaa tgcccaccac 2600 caccagtgtg ccgcacaagg ccgtggcggt agggtatgtg 2640 tctgaaaatg agctcggaga ttgggctcgc accgctgacg 2680 cagatggaag acttaaggca gcggcagaag aagatgcagg 2720 cagctgagtt gttgtattct gataagagtc agaggtaact 2760 cccgttgcgg tgctgttaac ggtggagggc agtgtagtct 2800 gagcagtact cgttgctgcc gcgcgcgcca ccagacataa 2840 tagctgacag actaacagac tgttcctttc catgggtctt 2880 ttctgcagtc accgtccaag cttgcggccg cggatctgca 2920 ggaattcggc acgagagtag tagactccgc aagaaacagc 2960 agtcaatcag caacatgggg atatggaagt ggctagtgat 3000 ggccagttta gtatggcctg ttttgacact gagaaatgtc 3040 tatgacatga aaattgagtg cccccataca gtaagttttg 3080 gggaaaacag tgtgataggt tatgtagaat taccccccgt 3120 gccattggcc gacacagcac agatggtgcc tgagagttct 3160 tgtagcatgg ataatcacca atcgttgaat acaataacaa 3200 aatataccca agtaagttgg agaggaaagg ctgatcagtc 3240 acagtctagt caaaattcat ttgagacagt gtccactgaa 3280 gttgacttga aaggaacatg tgctctaaaa cacaaaatgg 3320 tggaagaatc ataccgtagt aggaaatcag taacctgtta 3360 cgacctgtct tgcaatagca cttactgcaa gccaacacta 3400 tacatgattg taccaattca tgcatgcaat atgatgaaaa 3440 gctgtttgat tgcattggga ccatacagag tacaggtggt 3480 ttatgagaga tcttattgca tgacaggagt cctgattgaa 3520 gggaaatgct ttgtcccaga tcaaagtgtg gtcagtatta 3560 tcaagcatgg gatctttgat attgcaagtg ttcatattgt 3600 atgtttcttt gttgcagtta aagggaatac ttataaaatt 3640 tttgaacagg ttaagaaatc ctttgaatca acatgcaatg 3680 atacagagaa taaagtgcaa ggatattata tttgtattgt 3720 agggggaaac tctgcaccaa tatatgttcc aacacttgat 3760 gatttcagat ccatggaagc atttacagga atcttcagat 3800 caccacatgg ggaagatcat gatctggctg gagaagaaat 3840 tgcatcttat tctatagtcg gacctgccaa tgcaaaagtt 3880 cctcatagtg ctagctcaga tacattgagc ttgattgcct 3920 attcaggtat accatcttat tcttccctta gcatcctaac 3960 aagttcaaca gaagctaagc atgtattcag ccctgggttg 4000 ttcccaaaac ttaatcacac aaattgtgat aaaagtgcca 4040 taccactcat atggactggg atgattgatt tacctggata 4080 ctacgaagct gtccaccctt gtacagtttt ttgcgtatta 4120 tcaggtcctg gggcatcatg tgaagccttt tctgaaggcg 4160 ggattttcaa cataacctct cccatgtgct tagtgtcaaa 4200 acaaaatcga ttccggttaa cagaacagca agtgaatttt 4240 gtgtgtcagc gagtggacat ggacattgtt gtgtactgca 4280 acgggcagag gaaagtaata ttaacaaaaa ctctagttat 4320 tggacagtgt atatatacta taacaagctt attctcatta 4360 ctacctggag tagcacattc tattgctgtt gaattgtgtg 4400 tacctgggtt ccatggttgg gccacagctg ctctgcttgt 4440 tacattctgt ttcggatggg ttcttatacc agcaattaca 4480 tttatcatac taacagtcct aaagttcatt gctaatattt 4520 ttcacacaag taatcaagag aataggctaa aatcagtact 4560 tagaaagata aaggaagagt ttgaaaaaac aaaaggctca 4600 atggtatgtg atgtctgcaa gtatgagtgt gaaacctata 4640 aagaattaaa ggcacacggg gtatcatgcc cccaatctca 4680 atgtccttac tgttttactc attgtgaacc cacagaagca 4720 gcattccaag ctcattacaa ggtatgccaa gttactcaca 4760 gattcaggga tgatctaaag aaaactgtta ctcctcaaaa 4800 ttttacacca ggatgttacc ggacactaaa tttatttaga 4840 tacaaaagca ggtgctacat ctttacaatg tggatatttc 4880 ttcttgtctt agaatccata ctgtgggctg caagtgcatc 4920 agagacacca ttaactcctg tctggaatga caatgcccat 4960 ggggtaggtt ctgttcctat gcatacagat ttagagcttg 5000 atttctcttt aacatccagt tccaagtata cataccgtag 5040 gaggttaaca aacccacttg aggaagcaca atccattgac 5080 ctacatattg aaatagaaga acagacaatt ggtgttgatg 5120 tgcatgctct aggacactgg tttgatggtc gtcttaacct 5160 taaaacatcc tttcactgtt atggtgcttg tacaaagtat 5200 gaataccctt ggcatactgc aaagtgccac tatgaaagag 5240 attaccaata tgagacgagc tggggttgta atccatcaga 5280 ttgtcctggg gtgggcacag gctgtacagc atgtggttta 5320 tacctagatc aactgaaacc agttggtagt gcttataaaa 5360 ttatcacaat aaggtacagc aggagagtct gtgttcagtt 5400 tggggaggaa aacctttgta agataataga catgaatgat 5440 tgttttgtat ctaggcatgt taaggtctgc ataattggta 5480 cagtatctaa attctctcag ggtgatacct tattgttttt 5520 tggaccgctt gaaggtggtg gtctaatatt taaacactgg 5560 tgtacatcca catgtcaatt tggtgaccca ggagatatca 5600 tgagtccaag agacaaaggt tttttatgcc ctgagtttcc 5640 aggtagtttc aggaagaaat gcaactttgc tactacccct 5680 atttgtgagt atgatggaaa tatggtctca ggttacaaga 5720 aagtgatggc cacaattgat tccttccaat cttttaatac 5760 aagcactatg cacttcactg atgaaaggat agagtggaaa 5800 gaccctgatg gaatgctaag ggaccatata aacattttag 5840 taacgaagga cattgacttt gataaccttg gtgaaaatcc 5880 ttgcaaaatt ggcctacaaa catcttctat tgagggggcc 5920 tggggttctg gtgtggggtt cacattaaca tgtctggtat 5960 cactaacaga atgtcctacc tttttgacct caataaaggc 6000 ttgtgataag gctatctgtt atggtgcaga gagtgtaaca 6040 ttgacaagag gacaaaatac agtcaaggta tcagggaaag 6080 gtggccatag tggttcaaca tttaggtgtt gccatgggga 6120 ggactgttca caaattggac tccatgctgc tgcacctcac 6160 cttgacaagg taaatgggat ttctgagata gaaaatagta 6200 aagtatatga tgatggggca ccgcaatgtg ggataaaatg 6240 ttggtttgtt aaatcagggg aatggatttc agggatattc 6280 agtggtaatt ggattgtact cattgtcctc tgtgtatttc 6320 tattgttctc cttggtttta ctaagcattc tctgtcccgt 6360 aaggaagcat aaaaaatcat agctaaattc tgtgactatc 6400 ctgttcttat gtatagcttt aacatatata ctaattttta 6440 tattccagta tactctatct aacacactaa aaaaaatagt 6480 agctttctaa ccacaaaacg gatctacgta tgatcagcct 6520 cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 6560 ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 6600 actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 6640 gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 6680 gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 6720 catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg 6760 aaagaaccag ctggggctcg acagctcgac tctagaattg 6800 cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 6840 gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 6880 ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 6920 gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 6960 cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 7000 gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 7040 acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 7080 aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 7120 accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 7160 cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 7200 gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 7240 cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 7280 gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 7320 ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 7360 gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 7400 acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 7440 gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 7480 tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 7520 ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 7560 tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 7600 cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 7640 gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 7680 aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 7720 acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 7760 ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 7800 ctgactc 7807 <210> 8 <211> 7913 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of plasmid pWRG/AND-M(x) <400> 8 gggggggggg ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg 40 ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag 80 ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg 120 taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca 160 cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc 200 cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccgc 240 cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa 280 ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc 320 aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac 360 catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa 400 ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat 440 cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta 480 ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa 520 atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa 560 agcttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc 600 cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc 640 gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg 680 cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat 720 gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt 760 ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct 800 gttttcccgg ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat 840 caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat 880 aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta 920 acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca 960 actctggcgc atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt 1000 cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac 1040 ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc 1080 tcgagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc 1120 ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt 1160 catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga 1200 gattttgaga cacaacgtgg ctttcccccc ccccccggca 1240 tgcctgcagg tcgacaatat tggctattgg ccattgcata 1280 cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc 1320 atgtccaata tgaccgccat gttgacattg attattgact 1360 agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 1400 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 1440 tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 1480 acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 1520 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 1560 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 1600 agtccgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 1640 cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc 1680 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 1720 atggtgatgc ggttttggca gtacaccaat gggcgtggat 1760 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 1800 tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 1840 gactttccaa aatgtcgtaa taaccccgcc ccgttgacgc 1880 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 1920 cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc 1960 catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc 2000 gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaacgcg 2040 gattccccgt gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga 2080 ctctataggc acaccccttt ggctcttatg catgctatac 2120 tgtttttggc ttggggccta tacacccccg cttccttatg 2160 ctataggtga tggtatagct tagcctatag gtgtgggtta 2200 ttgaccatta ttgaccactc ccctattggt gacgatactt 2240 tccattacta atccataaca tggctctttg ccacaactat 2280 ctctattggc tatatgccaa tactctgtcc ttcagagact 2320 gacacggact ctgtattttt acaggatggg gtcccattta 2360 ttatttacaa attcacatat acaacaacgc cgtcccccgt 2400 gcccgcagtt tttattaaac atagcgtggg atctccacgc 2440 gaatctcggg tacgtgttcc ggacatgggc tcttctccgg 2480 tagcggcgga gcttccacat ccgagccctg gtcccatgcc 2520 tccagcggct catggtcgct cggcagctcc ttgctcctaa 2560 cagtggaggc cagacttagg cacagcacaa tgcccaccac 2600 caccagtgtg ccgcacaagg ccgtggcggt agggtatgtg 2640 tctgaaaatg agctcggaga ttgggctcgc accgctgacg 2680 cagatggaag acttaaggca gcggcagaag aagatgcagg 2720 cagctgagtt gttgtattct gataagagtc agaggtaact 2760 cccgttgcgg tgctgttaac ggtggagggc agtgtagtct 2800 gagcagtact cgttgctgcc gcgcgcgcca ccagacataa 2840 tagctgacag actaacagac tgttcctttc catgggtctt 2880 ttctgcagtc agggtccaag cttgcggccg cggatctgca 2920 ggaattcggc acgagagtag tagactccgc acgaagaagc 2960 aaaaaattaa agaagtgagt ttaaaatgga agggtggtat 3000 ctggttgttc ttggagtctg ctatacgctg acactggcaa 3040 tgcccaagac catttatgag cttaaaatgg aatgcccgca 3080 cactgtgggt ctcggtcaag gttacatcat tggctcaaca 3120 gaactaggtt tgatctcaat tgaggctgca tctgatataa 3160 agctcgagag ctcttgcaat tttgatcttc atacaacatc 3200 tatggcccag aagagtttca cccaagttga atggagaaag 3240 aaaagtgaca caactgatac cacaaatgct gcgtccacta 3280 cctttgaagc acaaactaaa actgttaacc ttagagggac 3320 ttgtatactg gcacctgaac tctatgatac attgaagaaa 3360 gtaaaaaaga cagtcctgtg ctatgatcta acatgtaatc 3400 aaacacattg tcagccaact gtctatctga ttgcacctgt 3440 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gaagacaggt tgcacggaga atgcattgca gggttattat 9280 gtgtgttttt taggaagtca ttcagaacct ttaattgttc 9320 cgagtttgga ggacatacgg tctgctgaag ttgttagtag 9360 gatgcttgta caccctaggg gagaagacca tgatgccata 9400 cagaattcac aaagtcactt aagaatagtg ggacctatca 9440 cagcaaaagt gccatcaact agttccacag ataccctaaa 9480 ggggacagcc tttgcaggcg tcccaatgta tagctcttta 9520 tctacactag tcagaaatgc agacccagaa tttgtatttt 9560 ctccaggtat agtacctgaa tctaatcaca gtacatgtga 9600 taagaagaca gtacctatca catggacagg ctacctacca 9640 atatcaggtg agatggaaaa agtgactgga tgtacagttt 9680 tttgtacact agcaggacct ggtgctagtt gtgaggccta 9720 ttctgaaaat ggtatattta acatcagttc tccaacatgt 9760 cttgtaaaca aagtccaaag atttcgtgga tctgaacaga 9700 aaataaattt tatctgtcag cgggtagatc aggatgttgt 9840 tgtatactgc aatgggcaaa agaaagtcat attaaccaaa 9880 actttggtta ttgggcagtg tatttataca ttcacaagcc 9920 tattttcatt gatgcctgat gtagcccact cattggctgt 9960 agaattatgt gtcccgggat tacatgggtg ggccactgtc 10000 atgcttctat caacattctg ctttgggtgg gtcttgattc 10040 ctgcggtcac attaataata ttaaagtgtc taagggtttt 10080 gacgttttct tgttcccatt acactaatga gtcaaaattt 10120 aaattcatcc tggaaaaagt taaaattgaa taccaaaaga 10160 ctatgggatc aatggtgtgc gatgtatgtc atcatgagtg 10200 tgaaacagca aaagaacttg aatcacatag acagagttgt 10240 atcaatggac aatgtcctta ttgcatgaca ataactgaag 10280 caactgaaag tgccttgcaa gcccattatt ccatttgtaa 10320 attggcagga agatttcagg aggcactgaa aaagtcactt 10360 aaaaagccag aggtaaaaaa aggttgttac agaacactcg 10400 gggtatttag atataaaagt agatgttatg tgggtttggt 10440 atggtgccta ttgttgacat gtgaaattgt tatttgggcc 10480 gcaagtgcag agactccact aatggagtca ggctggtcag 10520 atacggctca tggtgttggt gagattccaa tgaagacaga 10560 cctcgagctg gacttttcac tgccttcttc atcctcttac 10600 agttatagga gaaagctcac aaacccagcc aataaagaag 10640 agtctattcc cttccacttc cagatggaaa aacaagtaat 10680 tcatgctgaa atccaacccc tgggtcattg gatggatgcg 10720 acatttaata ttaagactgc atttcattgt tatggtgcat 10760 gccagaaata ctcttatcca tggcagacat ctaagtgctt 10800 ctttgaaaag gactaccagt atgaaacagg ctggggctgt 10840 aatcctggtg actgcccagg ggttgggact ggatgcactg 10880 cttgtggtgt ttatctcgat aaactaaaat ctgttgggaa 10920 ggcctataag ataatttctt taaaatatac cagaaaggtt 10960 tgtattcagt taggaacaga acaaacttgc aagcatattg 11000 atgcaaatga ttgtttagtg acaccatctg tgaaagtttg 11040 catagtgggc acagtttcaa aacttcaacc atctgatact 11080 cttttgttct taggtccact agaacaaggg ggaatcattc 11120 ttaagcaatg gtgcacaaca tcatgtgcat ttggggaccc 11160 tggtgatatc atgtccactc ccagtggtat gaggtgtcca 11200 gagcacactg gatcatttag gaaaatttgc ggttttgcta 11240 ctacaccagt ttgtgaatat caaggaaata ccatttctgg 11280 atataaaaga atgatggcaa caaaagattc attccaatca 11320 tttaacttaa cagaacctca catcacaaca aacaagcttg 11360 aatggatcga cccagatggg aatacaagag accacgtaaa 11400 ccttgtctta aatagagatg tctcatttca ggatttaagt 11440 gataacccct gtaaagtaga cctacacaca caagcaatag 11480 aaggggcatg gggttctggt gtagggttta cactcacatg 11520 tactgtcgga ttaacagagt gcccaagttt tatgacatca 11560 attaaggcat gtgacctagc tatgtgttat ggatcaacag 11600 taacaaacct tgccaggggc tctaatacag tgaaagtagt 11640 tggtaaagga ggccattcag ggtcctcatt taaatgctgt 11680 catgatacag attgctcctc tgaaggttta cttgcatcag 11720 cccctcatct tgagagggta acaggattca atcaaattga 11760 ttcagataag gtttatgatg atggtgcacc accttgcaca 11800 ttcaaatgct ggttcactaa gtcaggtgag tggcttcttg 11840 ggatcttaaa cgggaattgg attgttgttg tagtgcttgt 11880 tgtgatactc attctctcta tcataatgtt cagtgttttg 11920 tgtcccagga gagggcacaa gaaaactgtc taagcattga 11960 cctcaactcc tacattagat catatacatt tatgcacttc 12000 ctcatattta gctgcactaa gatattaata aactctagtt 12040 attgacttta taagattatt atggaactaa cctcacttaa 12080 aaaaaacaaa tactttactc atatataact ccatattctc 12120 ttaccgagga ttttgttcct gcggagcata ctactaggat 12160 ctacgtatga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag 12200 ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 12240 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 12280 ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt 12320 ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 12360 gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 12400 tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctcgaca 12440 gctcgactct agaattgctt cctcgctcac tgactcgctg 12480 cgctcggtcg ttcggctgcg gccagcggta tcagctcact 12520 caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 12560 cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 12600 aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 12640 ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 12680 aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 12720 caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 12760 ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 12800 cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 12840 aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 12880 gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 12920 cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 12960 cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 13000 ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 13040 gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 13080 tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 13120 aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 13160 tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 13200 cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 13240 ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 13280 agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 13320 tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 13360 aaagtatata tgagtaaact tgttctgaca gttaccaatg 13400 cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 13440 cgttcatcca tagttgcctg actc 13464 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 0 <400> 10 gcgcgcggcc gcagtagtag actccgcaag aaac 34 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 11 gcgcggatcc cgggtaccgg gccccccctg g 31 <210> 12 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 1-24 <400> 12 ggccgcggcc gcggatctgc aggaattcgg cacgagagta 40 gtagactccg caagaaacag ca 62 <210> 13 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 24-1 <400> 13 ggccgcggcc gcgagcacgg cttaaggacg tctaggagta 40 gtagtctccg caagaaacag ca 62 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 1-12 <400> 14 ggccgcggcc gcattcggca cgagagtagt agactccgca 40 agaaacagca 50 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 13-24 <400> 15 ggccgcggcc gcggatctgc aggaagtagt agactccgca 40 agaaacagca 50 <210> 16 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 1-24* <400> 16 ggccgcggcc gcggatctgc ccgaattcgg caccagagta 40 gtagactccg caagaaacag ca 62 <210> 17 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 1-8 <400> 17 ggccgcggcc gcggatctgc agtagtagac tccgcaagaa 40 acagca 46 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer SEOMX <400> 18 gcgcggatcc agattgggag atagaagaga g 31 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer M5B <400> 19 tcaggactcc tgtcatgcaa taagatctc 29 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer HTNMX <400> 20 gcgcggatcc gtttgtggtt agaaagctac 30 <210> 21 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer SN-Fj <400> 21 ggccgcggcc gcggatctgc aggaattcgg cacgagagta 40 gtagactccg cacgaagaag c 61 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer PUUM-R <400> 22 gcgcggatcc tagtagtatg ctccgcagga ac 32

Claims (61)

1. 서열번호6의 핵산.
2. 한탄 한타바이러스 M 유전자 절편과 제 1항의 서열을 인코드하는 DNA 단편.
3. 서울 한타바이러스 M 유전자 절편과 제 1항의 서열을 인코드하는 DNA 단편.
4. 안데스 한타바이러스 M 유전자 절편과 제 1항의 서열을 인코드하는 DNA 단편.
5. 다음을 포함하는 재조합 DNA 구조체:

   (i) 벡터,

   (ii) 적어도 하나의 한타바이러스 M 유전자 핵산 단편 및

   (iii) 제 1항의 핵산 단편.
6. 제 5항에 있어서, 상기 구조체는 서열번호1의 pWRG/SEO-M인 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 구조체.
7. 제 5항에 있어서, 상기 구조체는 서열번호7의 pWRG/HTN-M(x)인 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 구조체.
8. 제 5항에 있어서, 상기 구조체는 서열번호8의 pWRG/AND-M(x)인 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 구조체.
9. 제 5항에 있어서, 상기 구조체는 2개의 상기 한타바이러스 M 유전자 핵산 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 구조체.
10. 제 9항에 있어서, 상기 구조체는 서열번호9의 pWRG/HA-M인 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 구조체.
11. 불활성 입자; 및 핵산 도포 입자를 생성하도록 상기 불활성 입자상에 도포된 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 포유류의 세포에서 작동하는 프로모터 및 하나 이상의 한타바이러스 유래의 G1 및 G2를 인코드하는 한타바이러스 폴리뉴클레오티드 M 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 상기 한타바이러스는 서울 바이러스, 도브라바 바이러스, 푸우말라 바이러스, 한탄 바이러스, 신놈버 바이러스, 블랙크릭카날 바이러스, 베이유 바이러스, 뉴욕 바이러스, 안데스 바이러스 및 라구나네그라 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 11항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호6의 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제 13항에 있어서, 상기 한타바이러스는 SEOV인 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제 14항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호1의 pWRG/SEO-M인 것을 특징으로 하는 조성물.
16. 제 13항에 있어서, 상기 한타바이러스는 HTNV인 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제 16항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호7의 pWRG/HTN-M(x)인 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 제 13항에 있어서, 상기 한타바이러스는 ANDV인 것을 특징으로 하는 조성물.
19. 제 18항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호8의 pWRG/AND-M인 것을 특징으로 하는 조성물.
20. 제 11항에 있어서, 상기 핵산은 2종의 한타바이러스 유래의 M 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
21. 제 20항에 있어서, 상기 2종의 한타바이러스는 HTNV 및 ANDV인 것을 특징으로 하는 조성물.
22. 제 21항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호9의 pWRG/HA-M인 것을 특징으로 하는 조성물.
23. 제 11항에 따른 조성물을 상기 핵산이 발현되도록 포유류의 표피세포내로 생체내 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 한타바이러스 감염에 대한 보호성 면역반응 유도방법.
24. 제 15항에 따른 조성물을 상기 핵산이 발현되도록 포유류의 표피세포내로 생체내 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 SEOV, HTNV 및 DOBV 한타바이러스 감염에 대한 보호성 면역반응 유도방법.
25. 제 17항에 따른 조성물을 상기 핵산이 발현되도록 포유류의 표피세포내로 생체내 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 HTNV, SEOV 및 DOBV 한타바이러스 감염에 대한 보호성 면역반응 유도방법.
26. 제 19항에 따른 조성물을 상기 핵산이 발현되도록 포유류의 표피세포내로 생체내 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 ANDV, SNV 및 BCCV 한타바이러스 감염에 대한 보호성 면역반응 유도방법.
27. 제 22항에 따른 조성물을 상기 핵산이 발현되도록 포유류의 표피세포내로 생체내 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 HTNV, SEOV, DOBV, ANDV, SNV 및 BCCV 한타바이러스 감염에 대한 보호성 면역반응 유도방법.
28. 제 15항의 조성물을 포함하는, SEOV, DOBV 및 HTNV 한타바이러스 감염에 대한 백신.
29. 제 17항의 조성물을 포함하는, SEOV, DOBV 및 HTNV 한타바이러스 감염에 대한 백신.
30. 제 19항의 조성물을 포함하는, ANDV, SNV 및 BCCV 한타바이러스 감염에 대한 백신.
31. 제 22항의 조성물을 포함하는, SEOV, HTNV, DOBV, ANDV, SNV 및 BCCV 한타바이러스 감염에 대한 백신.
32. 입자상에 핵산이 도포된 불활성 입자를 포함하는 조성물을 포함하고, 상기 핵산은 다른 한타바이러스들 유래의 2개 이상의 한타바이러스 M 절편을 포함하며, 상기 각 M 절편은 각각의 한타바이러스 유래의 G1 및 G2를 인코드하고, 포유류의 세포에서 활성이 있는 프로모터에 작동적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 HFRS 한타바이러스 감염에 대한 보호용 다가 백신.
33. 제 32항에 있어서, 상기 한타바이러스는 SEOV, PUUV, HTNV 및 DOBV로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 다가 백신.
34. 2개 이상의 불활성 입자를 포함하는 조성물을 포함하고, 상기 각 입자는 그 위에 핵산이 도포되어 있으며, 상기 핵산은 G1 및 G2를 인코드하고 포유류의 세포에서 활성이 있는 프로모터에 작동적으로 연결된 HFRS-관련 한타바이러스 유래의 한타바이러스 M 절편을 포함하며, 상기 M 절편은 다른 한타바이러스들로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는, 하나 이상의 HFRS 한타바이러스 감염에 대한 보호용 다가 백신.
35. 제 34항에 있어서, 상기 한타바이러스는 HTNV, DOBV, PUUV 및 SEOV로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 다가 백신.
36. 입자상에 핵산이 도포된 불활성 입자를 포함하는 조성물을 포함하고, 상기핵산은 다른 HPS-관련 한타바이러스들 유래의 2개 이상의 한타바이러스 M 절편을 포함하며, 상기 각 M 절편은 각각의 한타바이러스 유래의 G1 및 G2를 인코드하고 포유류의 세포에서 활성이 있는 프로모터에 작동적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 HPS 한타바이러스 감염에 대한 보호용 다가 백신.
37. 제 36항에 있어서, 상기 한타바이러스는 ANDV, SNV 및 BCCV로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 다가 백신.
38. 2개 이상의 불활성 입자를 포함하는 조성물을 포함하고, 상기 각 입자는 그 위에 핵산이 도포되어 있으며, 상기 핵산은 G1 및 G2를 인코드하고 포유류의 세포에서 활성이 있는 프로모터에 작동적으로 연결된 HPS-관련 한타바이러스 유래의 한타바이러스 M 절편을 포함하며, 상기 M 절편은 다른 한타바이러스들로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는, 하나 이상의 HPS 한타바이러스 감염에 대한 보호용 다가 백신.
39. 제 38항에 있어서, 상기 한타바이러스는 ANDV, SNV 및 BCCV로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 다가 백신.
40. 2개 이상의 불활성 입자를 포함하는 조성물을 포함하고, 상기 각 입자는 그 위에 핵산이 도포되어 있으며, 상기 핵산은 G1 및 G2를 인코드하고 포유류의 세포에서 활성이 있는 프로모터에 작동적으로 연결된 한타바이러스 M 절편을 포함하며, 상기 M 절편은 적어도 하나의 HPS-관련 한타바이러스 및 적어도 하나의 HFRS-관련 한타바이러스를 포함하는 다른 한타바이러스들로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는, 하나 이상의 HFRS 및 HPS 한타바이러스 감염에 대한 보호용 다가 백신.
41. 제 40항에 있어서, 상기 한타바이러스는 ANDV, HTNV 및 SEOV로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 다가 백신.
42. 입자상에 2개 이상의 핵산이 도포되어 있는 불활성 입자를 포함하는 조성물을 포함하고, 상기 각 핵산은 G1 및 G2를 인코드하고 포유류의 세포에서 활성이 있는 프로모터에 작동적으로 연결된 한타바이러스 M 절편을 포함하며, 상기 M 절편은 적어도 하나의 HPS-관련 한타바이러스 및 적어도 하나의 HFRS-관련 한타바이러스를 포함하는 다른 한타바이러스들로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는, 하나 이상의 HFRS 및 HPS 한타바이러스 감염에 대한 보호용 다가 백신.
43. 제 42항에 있어서, 상기 한타바이러스는 ANDV, HTNV 및 SEOV로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 다가 백신.
44. 한타바이러스 M 유전자 절편을 발현하는 플라스미드를 포함하는 DNA 백신으로 면역접종된 피접종자군 유래의 폴리클론 항체를 포함하는 조성물.
45. 제 44항에 있어서, 상기 한타바이러스는 서울 바이러스, 도브라바 바이러스, 푸우말라 바이러스, 한탄 바이러스, 신놈버 바이러스, 블랙크릭카날 바이러스, 베이유 바이러스, 뉴욕 바이러스, 안데스 바이러스 및 라구나네그라 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
46. 제 44항에 있어서, 상기 백신은 pWRG/SEO-M을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
47. 제 44항에 있어서, 상기 백신은 pWRG/HTN-M(x)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
48. 제 44항에 있어서, 상기 백신은 pWRG/AND-M을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
49. 제 44항에 있어서, 상기 백신은 pWRG/HA-M을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
50. 제 44항에 있어서, 상기 조성물은 대상의 생체내 한타바이러스 감염을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
51. 제 50항에 있어서, 상기 대상은 포유류인 것을 특징으로 하는 조성물.
52. 제 44항에 있어서, 상기 조성물은 상기 조성물이 한타바이러스 감염 후의 대상에게 투여될 때, 한타바이러스 감염의 징후를 개선시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
53. 제 52항에 있어서, 상기 대상은 포유류인 것을 특징으로 하는 조성물.
54. 제 44항에 있어서, 상기 폴리클론 항체는 생체외에서 한타바이러스를 중화시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
55. 제 44항의 조성물과 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 한타바이러스 감염의 징후 개선용 치료 조성물.
56. 제 44항의 조성물을 포함하는, 한타바이러스 감염에 대한 수동 백신.
57. 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께, 한타바이러스의 M 유전자 절편을 포함하는 DNA 백신으로 면역접종된 피접종자 유래의 폴리클론 항체를 한타바이러스 감염 억제를 위한 유효량으로 포함하는, 항-한타바이러스 조성물.
58. 유효량의 제 55항에 따른 조성물을 한타바이러스 감염 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 한타바이러스 감염 치료방법.
59. 한타바이러스 감염 의심 대상 유래의 샘플을 제 44항에 따른 항체와 접촉시키고, 한타바이러스 항원과 이것에 특이적인 항체간에 형성된 복합체의 존부를 검출하므로써 한타바이러스의 존부를 검출하는 것을 포함하는, 한타바이러스 감염 검출방법.
60. 다음의 단계를 포함하는 한타바이러스 감염 진단방법:

    (i) 한타바이러스 감염 의심 대상 유래의 샘플을 제 44항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계; 및

    (ii) 한타바이러스 항원과 이것에 특이적인 항체간에 형성된 복합체의 존부를 검출하므로써 한타바이러스의 존부를 검출하는 단계.
61. 제 44항의 조성물 및 샘플에서 한타바이러스 항원의 존부 검출용에 적합한 보조제를 포함하는, 한타바이러스 감염 진단 키트.