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KR20040105736A - 스트레스 단백질의 올리고머화에 기초한 방법 및 산물 - Google Patents

스트레스 단백질의 올리고머화에 기초한 방법 및 산물 Download PDF

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Publication number
KR20040105736A
KR20040105736A KR10-2004-7013472A KR20047013472A KR20040105736A KR 20040105736 A KR20040105736 A KR 20040105736A KR 20047013472 A KR20047013472 A KR 20047013472A KR 20040105736 A KR20040105736 A KR 20040105736A
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KR
South Korea
Prior art keywords
heat shock
shock protein
hsp
complex
peptide
Prior art date
Application number
KR10-2004-7013472A
Other languages
English (en)
Inventor
제임스알 자브레키
추안리앙 리우
스티븐에이 몬크
앤드류 와서먼
프라모드케이 스리바스타바
Original Assignee
안티제닉스 아이엔씨
유니버시티 오브 코네티컷 헬스 센터
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Publication date
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Abstract

일 측면으로는 본 발명은 ATPase 활성 또는 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 구조에 기초하여 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 결정하는 방법을 제공하고 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 조절하는 물질을 검색하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면으로 본 발명은 복합체들, 조성물들 및 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질 및 항원 분자를 포함하는 복합체의 면역성을 증가시키는 방법을 제공한다.

Description

스트레스 단백질의 올리고머화에 기초한 방법 및 산물{METHODS AND PRODUCTS BASED ON OLIGOMERIZATION OF STRESS PROTEINS}
현대 의약에서, 면역 치료법 또는 백신접종은 소아마비, 파상풍, 폐결핵, 수두, 홍역, 간염 등과 같은 병을 사실상 근절하였다. 백신접종을 사용하는 접근은 감염성 질환을 예방하는 면역계의 능력을 이용하였다. 단백질들과 같은 비 생존 물질들을 이용한 백신접종은 일반적으로 항체나 CD4+ 헬터 T-세포 반응을 일으킨다(Raychaudhuri 및 Morrow (1993) Immunology Today 14:344-348).
반면에 살아 있는 세포 또는 감염성 바이러스들과 같은 살아 있는 물질들을 이용한백신접종은 일반적으로 CD8+ 세포독성 T-림포사이트(CTL) 반응을 일으킨다. CTL 반응은 암, 전염성 바이러스성 질환들 및 일부 박테리아들에 대한 방어에 결정적인 역할을 한다. CTL 반응을 이루는 유일한 방법이 그들 자신이 병원성인 살아 있는 물질들을 사용해야 한다는 것이 실질적인 문제로 위치한다.
이 문제는 일반적으로 약독화된 바이러스나 박테리아 균주를 사용하거나 백신에 사용될 수 있는 전체 세포들을 사멸시켜서 회피한다. 이 전략은 잘 작용하여 왔으나 약독화된 균주들의 사용은 늘 약독화된 물질이 숙주 DNA와 유전적으로 재조합하여 유독한 균주로 전환될 수 있는 위험을 수반한다.
따라서 특정한 것 방법에서 단백질들과 같은 비-생존 물질로 백신접종을 하여 CD8+ CTL 반응을 유도할 수 있는 방법이 필요하다.
열 충격 단백질- 펩타이드 복합체가 암 또는 감염성 질환에 대한 백신으로 특정한 용도를 갖는다는 것은 발견되었다(Srivastava 외, (1994) Curr.Op.Imbu. 6:728 ; Srivastava (1993) Adv. CancerRes. 62: 153).
스트레스 단백질들이라고도 명명되는 열 충격 단백질들(hsps)은 열 충격에 반응한 세포들에 의하여 합성된 단백질들로 처음 확인되었다. hsp들은 그들의 분자량에 기초하여 에를 들어 hsp90, hsp70, hsp60, sm hsp 등 몇 계열로 나누고, 각 계열은 약 1-5개의 밀접하게 관련된 단백질들로 구성된다(Srivastava, 2002,Annu.Rev.Immunol.20:395-425). 
비록 계열내에 일원들이 밀접하게 관련되어 있지만 , 각 hsp 계열들 사이에 확실한 동질성이 거의 없다.
열 충격 단백질들은 모든 종류의 생명체의 모든 세포들 및 다양한 세포내 위치들에서 발현된다. 그들은 정상상태하에서 다량으로 발현되고, 그들의 발현은 열충격 또는 독소에 노출, 산화적 스트레스, 포도당 결핍 등을 포함하는 다른 종류의 스트레스의 결과로 매우 높은 수준으로 강하게 발현될 수 있다 (Srivastava , 2002, Annu. Rev. Immunol.20: 395-425참조). 열 충격 및 다른 생리적인 스트레스에 대한 세포 반응에 대한 연구는 hsp들이 이들 악 조건에 대한 세포 보호 뿐 아니라 스트레스를 받지 아니한 세포들의 필수적인 생화학 및 면역학적 과정에도 관여한다는 것을 알았다. hsp들은 여러 종류의 쉐프런(chaperon) 역할을 수행한다. 예를 들어 세포 세포질, 핵, 미토콘드리아, 또는 세포질 망상 구조(ER)에 존재하는 hsp70 계열의 멤버들은 (Lindquist 외, 1988, Ann. Rev. Genetics 22: 631-677)은 면역계의 세포들에 항원 프레젠테이션에도 관여하고, 정상 세포들의 이동, 폴딩 및 어셈블리에도 관여한다.
hsp들은 또한 낮은 pH 또는 에이티피(ATP) 존재하에서 단백질들이나 펩타이드들에 결합할 수 있고, 결합한 단백질들이나 펩타이드들을 풀어 줄 수도 있다. Srivastava 등은 내교배(inbred) 생쥐의 메틸콜란쓰렌(methylcholanthrene) 유도된 육종에 대한 면역반응을 보였다(Srivastava 외, 1988, Immunol. Today 9: 78-83).
이들 연구에서, 이들 종양들의 개별적으로 독특한 면역성에 관여하는 분자들은 96kDa의 당단백질(gp96)들과 84에서 86kDa의 세포내 단백질들인 것을 발견하였다(Srivastava외, 1986, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 83 : 3407-3411; Ullrich 외, 1986,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 83 : 3121-3125). 
특정한 종양으로부터 분리한 gp96 또는 hsp84/86를 이용한 생쥐들의 면역화는 항원적으로 독특한 종양에 대해서가 아니라 그 특정한 종양에 대하여 생쥐에게 면역성을 준다. gp96와 hsp84/86를 코딩하는 유전자들의 분리 및 특성화는 그들 사이에 중요한 동질성을 보이고, gp96 및 hsp84/86 각각은 동일한 열 충격 단백질들의 ER 및 세포질 대조물(counterpart)이다(Srivastava  외,  1988,  Immunogenetics 28: 205-207;Srivastava 외, 1991,Curr. Top. Microbiol. Immunol. 167: 109-123).
게다가 hsp70은 항원적으로 독특한 종양에 대해서가 아니라 분리된 종양에 대하여 면역성을 일으킨다는 것을 보였다. 그러나, hsp70 결손된 펩타이들은 그것의 면역 활성을 잃는 것을 발견하였다(Udono 및 Srivastava, 1993, J Exp. Med. 178: 1391-1396). 이러한 발견은 열 충격 단백질들 자체는 면역원이 아니라 항원 펩타이드들과 비공유 복합체를 형성하고 그 복합체가 항원 펩타이드들에 특정한 면역성을 야기할 수 있다는 것을 제안하였다(Srivastava, 1993, Adv. Cancer Res. 62: 153-177; Udono 외, 1994, J. Immunol., 152: 5398-5403; Suto 외, 1995, Science 269 :1585- 1588). 이 현상은 공지된 및 비공지된 항원들을 이용한 종양 및 바이러스 모델 모두에서 관찰되었다(Srivastava 외 . (1998) Immunity 8: 657; Ciupitu 외, (1998) J. Exp.
Med. 5: 685; Arnold 외 (1995)J Exp. Med 182: 885).
gp96, hsc70, 및 hsp84/hsp86에 결합된 항원 펩타이드의 존재는 항원 펩타이드가 알려져 있는 세포들에서 구조적으로 나타났다(Nieland 외 (1996)  Proc.Nat'l Acad.Sci. USA 93: 6135; Breloer 외 (1998)  Eur. J Immunol.28: 1016; Ishii 외 28 : 1016 ; (1999) J. Immunol. 162: 1303).
열 충격 단백질-펩타이드 복합체들을 이용한 백신 접종은 암의 예방(Srivastava 외(1986) Proc.Nat'l.Acad. Sci.USA 83: 3407; Ullrich 외 (1986) Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA 83: 3121; Peng 외 (1997) J. I. Meth. 204: 13; Basu 및 Srivastava (1999) J. Exp. Med. 189: 797) 및 치료제(Tamura 외 (1997) Science 278: 117; Yedavelli 외 (1999) Int. J Mol. Med 3: 243) 및 감염성 질환의 예방(Ciupitu 외 (1998) J . Exp. Med. 5: 685)에 모두 적용된다.
인간의 암의 면역 치료법에 대한 이 접근의 번역은 자가세포로 gp96 복합체(Janetzki 외(1998) J Imnzunother.4: 269; Amato, 외(1999) ASCO 미팅 초록 1278; Lewis, 외 (1999) ASCO 미팅 초록 1687) 또는 hsp70 복합체를 사용하고 열충격 단백질들의 소스로 각 개별환자의 암을 사용하는(Menoret 및 Chandawarkar (1998) Semin. in Oncology 25: 654) 연구하에서 현재 진행 중이다.
104 hsp, hsp90, hsp70 및 hsp60를 포함하는 몇 hsp들은 ATPase 활성을 가지고 있는 것을 보인다(Scheibel, 외(1997) J. Biol. Chem. 272: 18608-18613; Richter 외
(2001) J. Biol. Chem 276: 33689 ; Lopez-Buesa, 외 (1998) Proc.Nat'l. Acad. Sci. 95: 15253; Schirmer, 외 (1998)J. Biol. Chem. 273: 15546).
hsp90에 대해서 그 ATP 결합과 가수분해는 그것의 분자적 쉐프론 기능과 관련이 있다는 것 또한 발혀졌다( Obermann 외 (1998) J. Cell Biol.143:901 ; Panaretou 외 (1998) EMBO J. 17: 4829). 그러나, hsp90의 ATPase 활성의 기능 및 in vivo 생물학적 활성을 야기하는 구조 변화는 더 연구대상인체로 남아 있다.
열 충격 단백질들의 hsp90 가족의 일원인 Gp96은 또한 ATPase 활성을 갖는다고 보고되었다(Liet 외 (1993) EMBO J. 12 : 3143). 그러나, 이 발견은 gp96의 펩타이드 결합 활성은 아데닌 뉴클레오타이드 독립적이고, ATP 결합 및 가수분해는 gp96의 타고난 특성은 아니다라고 제안한 Wearsch및 Nicchitta에 의하여 연구되었다((1997) J. Biol. Chem. 272: 5152). 이 연구자들은 또한 gp96 조제물에서 매우 온화한 ATPase 활성은 소량의 오염된 케시인 키나제에 기인한다는 것을 보였다. Wearsch, Voglino 및 Nicchitta는 gp96의 펩타이드 결합은 ATP 또는 ADP의 존재 또는 부존재시에 동일하였고, 결합은 화학적 변성/재원형화(renaturation) 또는 일시적인 열 충격에 의하여 각각 2배 또는 4 배를 증가되었다는 것이 보고 되었다( (1998) Biochem.37: 5709). Gp96는 비공유적으로 결합된 단위체의 다이머로 존재한다는 것도 알 수 있다(Wearsch 및 Nicchitta (1996) Prot. Exp. Pur.7: 114).
그 펩타이드들은 고차원 gp96 복합체들과 결합한다고 제안되었다(Sastry 및 Linderoth, J. Biol.Chem 274: 12023). 열 충격이 소수성 도메인에 용매나 펩타이드의 접근을 증가시키는 3차 구조 변화를 일으킨다고 알려졌다(Wassenberg, 외(2000) J. Biol. Chem. 275: 22806). 그러나, 상기 Wassenberg 등은 내부 ATP 결합 및 ATPase 활성의 지지에 대한 증거는 논쟁 중이고, gp96-기질 상호작용의 아데닌 뉴클레오타이드-매개 조절의 분자적 기초에 관한 컨센서스가 이제 출현하고 있다. gp96의 생물 물리학 그리고 생화학 연구에도 불구하고, gp96와 펩티드 기질 사이에 상호작용의 조절은 여전히 충분히 이해되지 않는다.
주요 조직 적합(major histocompatibility) 복합체 클래스 I 항원 프로세싱 및 프레젠테이션 경로에서 gp96-펩타이드 복합체들의 기능에 대한 구조 변화 및 뉴클레오타이드 결합의 효과에 대해서는 더욱 덜 알려져 있다. 면역치료제로 개발될 때 이들 상호작용의 기작을 이해하고 그들이 어떻게 이들 복합체의 생물학적 활성에 영향을 미치는지를 이해하는 것은 중요해 지고 있다.
일 측면에서 본 발명은 hsp-항원 복합체들에 기초한 면역치료제의 역가를 결정하는데 적용될 수 있는 hsp-항원 복합체 및 hsp의 생물학적 활성을 검출하고 측정하는 방법을 제공한다. gp96, hsp90, hsp70, 칼레티쿠린(calreticulin), hsp10 및 grpl70과 같은 hsp들은 넓은 범위의 펩타이드를 쉐프런할 수 있다고 알려졌다(리뷰하기 위해서는 Srivastava 외 1998, Immunity 8: 657- 665; Srivastava, 2002, Annu. Rev. Immunol. 20: 395-425를 참조). 예를 들면, 종양- 유래된 gp96는 종양 항원 펩타이드를 운반하고, 바이러스가 감염된 세포들로부터 온 gp96 조제물은 바이러스 에피토프를 운반하며(Suto와 Srivastava, 1995, Science 269: 1585-1588), 오발부민 또는 베타-갈락토사이데이즈와 같은 모델 항원들로 트랜스펙션된 세포들로부터 온 gp96 조제물은 해당하는 에피토프와 관련이 있다(Arnold 외 1995, J. Exp. Med. 182 : 885-889 ; Breloer 외 1998, Eur. J. Immunol. 28 : 1016-1021).
세포들로부터 분리(Tamura 외 1997, Science 278: 117-120)되거나 인 비트로에서 재구성(Blachere 외 1997, J. Exp. Med. 186: 1183-1406)된 Hsp-펩타이드 복합체들은 우수한 면역원들이고 hsp-쉐프론된 항원 펩타이드들에 특이적인 CD8+ T-세포 반응을 야기하기 위하여 광범위하게 사용되어 왔다(리뷰를 보기 위해서는 Srivastava, 2002,Annu. Rev. Immunol. 20: 395-425 참조). 암세포들로부터 정제된 hsp와 펩타이드의 비공유 복합체들은 암의 예방 및 치료에 사용될 수 있고, PCT 공개번호 WO 96/10411, 1996.4,11 및 WO 97/10001, 1997. 3. 20[각각 미국특허번호 5,750,119(1998년 4월 12일), 5,837,251(1998년 11월 17일 등록)]에 기재되어 있다. 예를 들면, 병원체 감염된 세포들로부터 스트레스 단백질-항원 복합체의 분리 및 정제 및 바이러스 및 다른 세포내 병원체와 같은 박테리아, 원생동물, 곰팡이 및 기생충을 포함하는 병원체에 의해 유발되는 감염의 치료 및 예방에 사용되는 것에 대해서는 PCT 공개번호 WO 95/24923(1995년 9월 21일)에 기재되어 있고, 면역 스트레스 단백질-항원 복합체들은 또한 시험관 내에서 스트레스의 단백질 그리고 항원 펩타이드를 합하여 제조할 수 있고, 그러한 복합체를 암 및 감염성 질환의 예방 및 치료에 사용할 수 있다는 것이 PCT 공개번호WO 97/10000(1997년 3월 20; 미국특허 6,030,618, 2000년 2월 29 등록)에 기재되어 있다. 채택된 면역 치료에 사용되기 위하여 시험관 내에서 항원 프레젠팅 세포들을 센시타이즈하기 위한 스트레스 단백질-항원 복합체의 사용은 PCT 공개 WO 97/10002, 1997년 3월 20일; 또한 미국특허5,985,270, 1999년 11월 16일 등록)에 기재되어 있다. 더 많은 면역반응을 이끌어내는 hsp와 펩타이드의 복합체들은 암 뿐만 아니라 감염성 질환의 면역치료를 증진시키기 위하여 유용하다.
또 다른 측면에서 본 발명은 열 충격 단백질과 항원 분자를 포함하는 복합체 또는 열 충격 단백질의 면역성을 증진시키는 방법 및 복합체, 조성물들을 제공한다.
명세서에 레퍼런스의 인용 또는 토론은 그러한 것이 본 발명의 선행기술이다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명은 면역학의 분야, 질병의 면역 치료법, 스트레스 단백질 매개 면역조절 및 백신 개발에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 결정하는 방법 및  열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 예를 들어 열 충격 단백질-펩타이드 복합체들의 올리고머화를 촉진시켜 면역치료 부위의 면역성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
도1은 hsp-펩타이드 복합체를 가열하였을 때 그 단백질이 빠르게 더 큰 분자량 집합체들을 혈성하는 것을 나타내는 SEC 트레이싱이다.
도 2의 그래프 A는 50℃ 및 60℃에서 gp96을 30분간 가열 후에 다이머 레벨이 감소된 것 및 60℃에서 가열한 경우에 감소속도가 더 빠른 것을 나타내고, 30분에는 어떤 샘플에도 다이머가 없었다는 것을 나타낸다.
그래프 B는 50℃ 및 60℃에서 가열시 gp96의 NECA 결합의 감소된 것 및 60℃에서 가열한 경우에 감소속도가 더 빠른 것을 나타내고, 30분에는 gp96의 어떤 샘플도 NECA에 결합할 수 없었다는 것을 나타낸다.
그래프 C와 D는 gp96 복합체를 50℃ 및 60℃에서 30분 가열시 MCP-1와 NO의 뮤라인 APC 분비를 자극하흔 gp96 복합체의 능력이 빠르게 감소하는 것을 보인다.
그래프 E와 F는 각각 gp96의 다이머 레벨 및 NECA 결합 능력에 대한 산성 pH의 효과를 나타낸다.
다이머 레벨 및 NECA 결합 능력 모두 pH 3.0에서 크게 감소한다.
그래프 G와 H는 각각 쥐 APC에 의한 MCP-1와 NO의 분비를 자극하는 gp96 복합체의 능력에 대한 산성 pH의 효과를 나타낸다.산성 페하의 결과를 증명합니다. MCP-1와 NO 분비 모두는 pH 3.0에서 현저하게 감소됩니다.
도 3은 인간 난소 종양 세포들로부터 제조된 gp96 복합체의 SEC 트레이싱이다. 8 - 10분획들이 hsp-펩타이드 복합체의 다이머 형태에 해당한다.
도 4는 인간 난소 종양 세포들로부터 제조된 gp96 복합체의 각 분획들의 SEC 트레이싱이다. 8 - 10분획들이 hsp-펩타이드 복합체의 다이머 형태에 해당한다.
도 5는 도3 및 도4에서 나타난 각 분획들의 실버 스테인한 SDS-PAGE 겔이다. 분획 2-5에 대부분의 gp96의 고 분자량의 집합체들을 포함하는 반면에 8 - 10분획들이 다이머를 나타낸다.
도6은 도 3-5에 나타난 분획들의 ATPase 활성이다. 다이머를 나타낸 8 - 10 분획들이 가장 높은 ATPase 활성을 가지고, 집합체들(분획 2-5) 및 다른 종류(분획 11-15)는 더 낮은 ATPase 활성을 갖는다.
도 7은 마우스 항원 AH1 19머(mer)와 복합체된 인간 유래 gp96은 gp96 또는 AH1 19머 단독과 비교하여 IFN-γ로 표시되는 항원 리-프레젠테이션의 용량 의존적증가를 일으킨다는 것을 보여주는 하이브리드 항원 리-프레젠테이션 어세이를 나타낸다. 최상의 패널은 APCs 및 CTLs 모두 적용된 샘플에 대한 IFN-γ 레벨을 보인다. 두번째 및 세번째 패널은 APCs 및 CTLs 단독에 대한 대조군이다.
각각의 데이터 세트는 음성 대조군으로 배지 만, 로딩되지 않은 gp96 및 AH1 19머를 포함하고, 양성 대조군으로 표면 MHC 1 분자에 직접 교환할 수 있는 AH1 9머 펩타이드를 포함한다. gp96/AHl l9머 복합체는 10㎍/ml 또는 로딩되지 않은(unloaded) gp96로 1:3, 1:10 또는 1:30으로 희석해서 적용된다.
그 결과는 용량 의존적인 IFN-γ 반응을 보이고 로딩되지 않은(unloaded) gp96에 의한 자극은 없다는 것을 보여준다.
대조군은 활성이 AH1 19머-로딩된 gp96에 대하여 특이적이다는 것을 나타낸다.
단백질-펩타이드 복합체를 단백질의 완전한 집합체를 야기하는 것으로 알려진 조건인 60℃에서 10분 가열시 T-세포 자극 능력은 파괴되었다.
도 8은 재조합 gp96를 10 분동안 지시된 온도에서 배양하여서 % 다이머와 ATPase 활성을 분석한 실험 결과이다.
도에서 온도 유도된 집합체화 및 ATPase 활성의 손실 사이에는 직접적인 상관관계가 있다는 것을 보인다.
발명의 요약
일 측면으로는 본 발명은 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 포함하는 면역치료제의 활성을 결정하고, 백신 또는 면역치료에 대한 대상의 반응을 평가하고 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 활성을 조절하는 물질을 검색하는 방법을 포함한다.
본 발명에서 사용된 hsp는 hsp70, hsp90, 및 hsp60 계열을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 어떠한 계열로부터 선택될 수 있다.게다가, 본 발명에서 사용되는 hsp는 hsp90, gp96(grp94), hsp 104, hsp 70 및 hsp 60을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 어떠한 hsp로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 의하여 평가될 수 있는 생물학적 활성은 예를 들어 항원 프레젠팅 세포들에 펩타이드 항원의 프레젠테이션[항원 재 프레젠테이션(re-presentation)] 및 T-세포 활성화를 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
일 실시예에서 생물학적 활성이란 용어는 면역학적 활성으로 제한된다.
hsp-펩타이드 복합체의 면역학적 활성은 질병 예방 그리고 치료 적용에 그들의 유용성이 직접 관련된다.
또 다른 많은 생물학적 활성이 당업계에 공지되었고, 예를 들어 인간 마크로파지 케모(chemo)-어트랙턴트(attractant) 단백질-1(MCP-1)과 같은 사이토카인 및 산화질소(NO) ; CD91(알파-2-마크로글로불린 수용체,α2MR)및/또는 CD36와 같은 수용체들의 결합 ; 항원 분자들의 결합 및 분리; 및 동물에서 종양들의 퇴보를 일으키는 능력; 암을 갖는 동물들의 생존의 연장 및 감염의 제거를 포함하나 이에 한정하지 않는 생물학적 반응 변형제의 생성 유도를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 것을 포함한다. 생물학적 활성은 생체내 및/또는 생체외에서 관찰될 수 있다.
일 실시예에서 본 발명은 생물학적 활성의 지표로 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 사용하고 상기 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 결정하는 것을 포함하는 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 검출하는 방법을 제공한다.ATPase 활성을 결정하는 것에 대하여는 빛-방출 효소들에 기초한 분석에 제한되지 아니하는 ATP 관여 효소 반응, ATP, ADP, AMP 및/또는 무기 인산의 농도 및/또는 양을 검출하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피, 바이오루미네센스, HPLC, 방사성 동위원소 분석 또는 면역친화(immunoaffinity) 분석과 같은 것을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 방법들을 사용할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 올리고머 형태의 양을 측정하고 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성의 지표로 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 올리고머 형태의 존재를 이용하는 것을 포함하는 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 검출하는 방법을 제공한다. 크기 배제 크로마토그래피, 젤 전기영동, 면역분석, 여과, 광 산란 분석, 구배차 원심분리 및 분석 초원심분리법과 같은 그러나 이에 한정되지 아니하는 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 사이즈 및/또는 구조를 측정하는 당업계의 공지 방법들이 사용될 수 있다.
여러 실시예에서 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태가 바람직하다.
본 발명의 방법은 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 포함하는 조성물의 생물학적 활성을 결정하기 위하여 조합하여 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 조절하는 잠재적으로 치유학적 화합물을 검색하는 방법을 제공한다. 화합물 부존재 상태에서 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 측정하는 단계; 화합물과 상기 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 접촉하는 단계; 화합물과 접촉한 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성과 접촉하지 아니한 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 비교하는 단계; 및 그 화합물이 생물학적 활성을 조절한다는 지표로 화합물과 접촉한 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성과 접촉하지 아니한 열 충격 단백질 또는 열충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성의 차를 이용하는 단계를 포함한다.
본 방법은 젤다나마이신(geldanamycin) 또는 NECA와 같은 hsp에 대한 뉴클레오타이드 결합의 특정한 저해제의 존재에서 ATPase 활성을 측정아는 것을 더욱 포함할 수 있고, 여기서 젤다나마이신(geldanamycin) 또는 다른 특정 뉴클레오타이드 결합의 저해제의 존재에 의하여 저해되는 ATPase 활성은 생물학적 활성의 지표로 사용될 수 있다.이 단계는 특히 다른 타입들의 ATPase가 존재할 때 유용하다.
또 다른 실시예에서 화합물 부존재 상태에서 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 올리고머 형태의 양을 측정하는 단계; 화합물과 상기 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 접촉하는 단계; 화합물과 접촉한 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 올리고머 형태의 양과 접촉하지 아니한 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 올리고머 형태의 양을 비교하는 단계; 및 그 화합물이 생물학적 활성을 조절한다는 지표로 화합물과 접촉한 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 올리로머 형태의 양과 접촉하지 아니한 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 올리고머 형태의 양의 차를 이용하는 단계를 포함하는 잠재적으로 치유학적인 화합물의 검색 방법을 제공한다.
여러 실시예에서 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태가 바람직하다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 변이체의 ATPase 활성 또는 변이체에 의하여형성된 올리고머 구조의 존재 또는 변이체 및 그들의 정상 대체물을 측정하는 것을 포함하는 그들의 생물학적 활성에 대한 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 변이체를 검색하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 열 충격 단백질 및 복합체의 ATPase 활성 또는 올리고머화를 조절하는 화합물로 열 충격 단백질 및 복합체를 접촉시키는 것을 포함하는 열 충격 단백질 및 복합체의 생물학적 활성을 조절하는 방법을 제공한다.
그와 같이 화합물들은 대상의 면역 기능을 조절하는데 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 대상의 면역계의 비정상 또는 준정상(subnormal) 기능에 부분적으로 기인하는 병태를 진단하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성의 지표로 대상으로부터 얻은 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 ATPase 활성 또는 올리고머 형태의 존재를 이용하는 것을 포함하고, 여기서 생물학적 활성은 대상의 하나 이상의 면역 기능들과 관련되고, ATPase 활성 또는 올리고머 형태의 양의 변화는 병태의 변화를 나타낸다. 여러가지 실시예에서 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태가 바람직하다.
일 실시예에서 본 발명은 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성의 지표로 대상(subject)으로부터 얻은 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성 또는 올리고머 형태의 존재를 이용하고, 상기 생물학적 활성은 대상에서 암세포 또는 감염성 질환을 일으키는 감염원에 반응하는 하나 이상의 면역 기능과 관련되고, 에이티피에이즈(ATPase) 활성의 변화 또는 올리고머 형태의 양의 변화는 예후의 변화를 나타내는 것을 포함하는 대상에서 암 또는 감염성 질환의 예후를 결정하는 방법을 제공한다.여러 실시예에서 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태가 바람직하다.
일 실시예에서 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체는 조직 샘플 또는 혈액 샘플과 같은 대상으로부터 온 샘플로부터 얻어질 수 있고 ; hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체는 더 분리되고 정제될 수 있다.본 발명의 방법은 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 매스(mass) 기초에 의한 특정 활성을 제공하는데 사용될 수 있다. 본 정보는 진단 또는 치료적 적용에 사용되는 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 질이나 능력을 조절하는데 사용될 수 있다.
본 정보는 더 경제적이고 효과적인 제제 및 복용량들을 고안하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성의 지표로 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 올리고머 형태의 양을 이용하는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 포함하는 조성물 및 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 올리고머 양을 결정하는 사용설명서(instruction)을 포함하는 키트를 더욱 제공한다. 여러 실시예에서 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태가 바람직하다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질과 항원 분자를 포함하는 복합체들의 면역성을 증진시키는 복합체들, 조성물들 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 더 효율적이고 따라서 더 강력한 백신 조제물을 제공하는 세포 속으로 개량된 항원 전달 수단에 관한 것이다.
일 실시예에서 본 발명은 올리고머화제는 4,4'-디아니리노(dianilino)-1,1'-바이나프틸(binaphthyl)-5, 5' 다이설포닉(disulfonic) 산("bis-ANS"), 글루타알데하이드 또는 설포서시니이미딜(sulfosuccinimidyl) [4-아지도살리실아미도(azidosalicylamido)] 헥사노에이트(hexanoate; SASD)이 아닌 조건에서 상기 열 충격 단백질은 올리고머화제와 접촉하여 올리고머화가 되고 올리고머화되고, 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 정제된 복합체를 제공한다.
일 실시예에서 본 발명은 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 상기 열 충격 단백질은 올리고머화제에 공유결합하여 올리고머화가되고, 올리고머화되고, 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 정제된 복합체를 제공한다. 일 실시예에서 상기 열 충격 단백질은 올리고머화제에 비공유결합되어 있다.
몇몇 실시예에서 상기 올리고머화제는 열 충격 단백질, 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙타비딘(streptavidin) 및 유도체화된 폴리 에틸렌글리콜(PEG")에 결합할 수 있는 이가특이적(bispecific) 또는 다가 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 열 충격 단백질은 gp96 또는 hsp90이다. 바람직한 실시예에서 열 충격 단백질 및 항원 분자는 세포 파쇄액 바람직하게는 암 세포 또는 감염성 질환감염원의 항원을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 복합체로 분리된다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 일 군 중 적어도 하나의 복합체가 상기 일군 중 또 다른 복합체의 항원 분자와 다른 항원 분자를 포함하고, 일 군 중 각 복합체가 올리고머화제와 접촉하여 올리고머화되고, 각 복합체가 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 일 군의 정제된 올리고머화된 복합체를 제공한다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 일 군 중 적어도 하나의 복합체가 상기 일군 중 또 다른 복합체의 항원 분자와 다른 항원 분자를 포함하고, 일 군 중 각 복합체가 올리고머화제와 공유결합에 의하여 올리고머화되고, 각 복합체가 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 일 군의 정제된 올리고머화된 복합체를 제공한다.
몇몇 실시예에서 열 충격 단백질은 올리고머화제와 비공유결합된다. 일 실시예에서 열 충격 단백질이 gp96 또는 hsp90이다. 바람직한 실시예에서 열 충격 단백질 및 항원 분자는 세포 파쇄액 바람직하게는 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 복합체로 분리된다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 열 충격 단백질이 올리고머화제와 접촉하여 올리고머화 된, 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질을 포함하는 정제된 복합체를 제공한다. 특정 실시예에서 본 발명은 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 열 충격 단백질이 올리고머화제와 공유결합에 의하여올리고머화된, 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질을 포함하는 정제된 복합체를 제공한다. 바람직하게는 상기 복합체는 항원 분자를 더욱 포함하고 더욱 바람직하게는 상기 열 충격 단백질은 올리고머화제와 접촉하기 전에 항원 분자와 복합체내에 있다. 대안적으로  열 충격 단백질은 처음에는 항원 분자가 없으나 그것의 올리고머화 후에 항원분자와 접촉한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 열 충격 단백질이 올리고머화제와 접촉하여 올리고머화된 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 정제된 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 몇몇 실시예에서, 본 발명은 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 열 충격 단백질이 올리고머화제와 공유결합하여 올리고머화된 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 정제된 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
몇몇 실시예에서, 본 발명은 열 충격 단백질이 올리고머화제와 공유 결합하여 올리고머화된 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 치료적으로 유효한 양의 정제된 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 실시예에서, 약학 조성물은 약학 조성물이 주사기에 존재하고, 열 충격 단백질이 올리고머화제와 공유 결합하여 올리고머화된 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 정제된 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함한다. 특정한 실시예에서, 열 충격 단백질은 올리고머화제와 비공유 결합한다. 일 실시예에서, 열 충격 단백질이 gp96 또는 hsp90이다.
바람직한 실시예에서 열 충격 단백질 및 항원 분자는 세포 파쇄액 바람직하게는 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 복합체로 분리된다. 또 다른 바람직한 실시예에서 약학 조성물 내의 복합체는 암 또는 감염성 질환의 치료 및 예방에 효과적인 양이 존재한다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 열 충격 단백질이 올리고머화제와 접촉하여 올리고머화되는 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질을 포함하는 정제된 복합체를 키트를 제공한다. 다른 실시예에서 상기 키트는 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 열 충격 단백질이 올리고머화제와 공유결합하여 올리고머화되는 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질을 포함하는 정제된 복합체를 포함한다. 몇몇 실시예에서 열 충격 단백질은 올리고머화제와 비공유결합한다. 몇몇 실시예에서, 열 충격 단백질이 gp96 또는 hsp90이다. 바람직하게는 상기 키트는 항원 분자를 더욱 포함한 복합체를 포함한다. 바람직한 실시예에서 상기 열 충격 단백질 및 항원 분자는 세포 파쇄액 바람직하게는 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 복합체로 분리된다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 복합체의 올리고머화를 야기하기 충분한 양의 올리고머화제와 상기 복합체를 접촉하여 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 복합체의 항원성 및 면역성을 증가시키는 방법을 제공한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 열 충격 단백질이 올리고머화제에 공유결합되어 있고, 복합체의 올리고머화를 야기하기 충분한 양의 올리고머화제로 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 복합체를 접촉하는 것을 포함하는 복합체의 항원성 및 면역성을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정한 실시예에서 본 방법에 사용된 복합체는 비공유 결합을 통하여 항원 분자와 복합체를 이루는 면역활성을 갖는 열 충격 단백질을 포함한다. 바람직한 실시예에서 상기 항원 분자는 펩타이드이다. 또 다른 바람직한 실시예에서 상기 복합체는 세포 파쇄액으로부터 분리된 상기 면역 활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자을 포함하고 바람직하게는 상기 세포 파쇄액은 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 것이다. 특정한 실시예에서 상기 열 충격 단백질은 gp96 또는 hsp90이다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 상기 hsp의 올리고머화를 야기하기 충분한 양의 올리고머화제와 상기 hsp를 처음 접촉하여 면역활성을 갖는 hsp-펩타이드 복합체의 항원성 및 면역성을 증가시키는 방법을 제공한다. 몇몇 실시예에서 상기 방법은 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 상기 열 충격 단백질은 올리고머화제와 공유결합되고, 상기 열 충격 단백질의 올리고머화를 야기하기 충분한 양의 올리고머화제와 상기 열 충격 단백질을 접촉하고 다음에 올리고머화된 열 충격 단백질과 항원 분자를 접촉하는 것을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자를 포함하는 치료적으로 유효한 양의 정제된 복합체를 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 여기서 올리고머화제는 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건이고, 항원 분자가 각각 암의 종양-특이적 또는 종양 관련 항원 또는 감염성 질환의 감염원을 나타내고, 열 충격 단백질이 올리고머화제와 접촉하여 올리고머화된다. 몇몇 실시예에서, 본 방법에 사용된 복합체는 올리고머화제와 공유 결합을 통하여 올리고머화된 열 충격 단백질을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 본 방법에 사용된 복합체는 올리고머화제는 글루타알데하이드가 아닌 조건에서 올리고머화제와 공유 결합을 통하여 올리고머화된 열 충격 단백질을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 올리고머화제는 bis-ANS 또는 SASD가 아니다. 몇몇 실시예에서, 상기 열 충격 단백질은 gp96 또는 hsp90이다. 바람직한 실시예에서 상기 열 충격 단백질 및 항원 분자는 세포 파쇄액 바람직하게는 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 복합체로 분리된다. 또 다른 바람직한 실시예에서 상기 세포는 대상으로부터 얻어진다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자를 포함하는 정제된 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 치료적으로 유효한 양의 약학적 조성물을 포함하는 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 상기 올리고머화제는 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건이고, 항원 분자가 각각 암의 종양-특이적 또는 종양 관련 항원 또는 감염성 질환의 감염원을 나타내고, 열 충격 단백질이 올리고머화제와 접촉하여 올리고머화된다. 몇몇 실시예에서, 상기 방법은 올리고머화되고, 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자를 포함하는 정제된 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 치료적으로 유효한 양의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 열 충격 단백질은 올리고머화제와 공유결합하여 올리고머화된다. 몇몇 실시예에서, 본 방법에 사용된 복합체는 올리고머화제는 글루타알데하이드가 아닌 조건에서 올리고머화제와 공유 결합을 통하여 올리고머화된 열 충격 단백질을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 올리고머화제는 bis-ANS 또는 SASD가 아니다.
특정한 실시예에서 본 방법은 (a) 열 충격 단백질이 올리고머화제와 공유결합하여 올리고머화되고, (b) 약학 조성물이 주사기 속에 존재하고, (c) 항원 분자가 각각 암의 종양-특이적 또는 종양 관련 항원 또는 감염성 질환의 감염원을 나타내고, 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자를 포함하는 정제된 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 치료적으로 유효한 양의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 열 충격 단백질은 gp96 또는 hsp90이다. 바람직한 실시예에서 상기 열 충격 단백질 및 항원 분자는 세포 파쇄액 바람직하게는 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 복합체로 분리된다. 또 다른 바람직한 실시예에서 상기 세포는 대상으로부터 얻어진다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 (a) 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 면역 활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자를 포함하는 복합체를 상기 복합체의 올리고머화를 야기하기 충분한 양의 올리고머화제와 접촉하는 단계; 및 (b) 약학적으로 수용가능한 담체로 상기 올리고머화된 복합체를 결합하는 단계를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다. 몇몇 실시예에서, 본 방법은 (a) 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 올리고머화제가 올리고머화제와 공유 결합하고, 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자를 포함하는 복합체를 상기 복합체의 올리고머화를 야기하기 충분한 양의 올리고머화제와 접촉하는 단계; 및 (b) 약학적으로 수용가능한 담체로 상기 올리고머화된 복합체를 결합하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 열 충격 단백질은 gp96 또는 hsp90이다. 바람직한 실시예에서 상기 열 충격 단백질 및 항원 분자는 세포 파쇄액 바람직하게는 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 복합체로 분리된다.
발명의 상세한 설명
일 면에서 본 발명의 명세서에 기재된 본 발명은 열 충격 단백질 및 열 충격 단백질-항원 분자 복합체들 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체들("hsp-펩타이드 복합체들" 또는 "hsp 복합체들")의 생물학적 활성을 검출하고 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 질병을 갖는 대상의 예후 및 치료에 대한 대상의 반응을 결정하는데 사용될 수 있다.
본 방법은 또한 hsp-펩타이드복합체의 생물학적 활성을 조절하는 치료제에 대한 검색; 및 증가된 또는 감소된 생물학적 활성을 갖는 변이체 hsp로 형성된 복합체 검색에 사용될 수 있다. 본 발명은 gp96-펩타이드 복합체의 구조와 그것의 기능 성질 사이에 상관관계에 대한 이해를 위하여 수행된 연구에 부분적으로 기반한다.
본 발명자들은 다이머 gp96은 ATPase 활성을 가지고 있고, 특정한 T 림프구세포들에 항원의 리프리젠테이션할 수 있고, MCP-1와 산화질소(NO) 생성을 유도할 수 있다는 것을 보였다. 더 큰 분자량 집합체들이 본 발명에서 예시한 바와 같이 열처리에 의하여 형성될 수있고, 집합체화된 gp96의 이 형태는 모든 네 종류의 생물학적 분석에서 불활성이다. 또한 섹션 6에 제공된 데이타는 항원 리프레젠테이션의 손실, MCP-1 생성, 및 산화질소 생성은 다이머 gp96의 손실과 동시에 일어난다는 것을 보인다.
본 발명자들의 연구 결과는 ATPase 활성이 gp96의 내부적인 기능이고; ATPase 활성이 gp96의 다이머 형태와 연관되고; 다이머 gp96은 ATPase 활성을 위하여 필요하고; ATPase 활성은 변성 또는 다른 구조 변화에 기인하여 불활성이라고 믿고 있는 예를 들어 고 분자량의 gp96의 집합체들인 gp96의 형태와 관련이 없다는 것을 증명하였다. 이 결과에 기초하여 본 발명자들은 다이머 gp96과 ATPase 활성 및 다이머 gp96과 항원 리프레젠테이션 및 T-세포 활성화의 상관관계에 기초하여 ATPase 활성이  생물학 활성 및 안정성의 적절하고 믿을 만한 척도라고 결정하였다. 여러가지 병을 치료하고 진단하는 것에 hsp와 hsp-펩타이드 복합체들의 효능에 수행되는 연구가 증가함에 따라 빠르고 값싸게 hsp-펩타이드 복합체들의 생물학적 활성을 결정할 필요가 있다.
본 발명은 정성적이고 민감한 ATPase 활성 및/또는 hsp-펩타이드 복합체 올리고머의 존재에 기초한 생물학적 활성을 검출하는 방법을 제공한다.
일 실시예에서 본 발명은 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 ATPase 활성을 결정하는데 기초하여 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 평가하는 방법을 제공한다. ATPase 활성의 존재는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체가 생물학적으로 활성이 있고, ATPase 활성의 결여가 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체가 생물학적으로 불활성이라는 것을 나타낸다.
본 발명에서 사용한 "생물학적 활성"이란 단어는 예를 들어 항원 프레젠팅 세포들에 펩타이드 항원의 프레젠테이션(항원 리-프레젠테이션) 및 T-세포 활성화와 같은 면역학적 활성을 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 일 실시예에서 생물학적 활성이란 단어는 면역학적 활성에 한정된다. hsp-펩타이드 복합체들의 면역학적 활성은 질병 예방 및 치료 적용에 그들의 유용성에 직접 관련된다. 또 다른 많은 생물학적 활성이 당업계에 공지되고 예를 들어 인간 마크로파지 케모(chemo)-어트랙턴트(attractant) 단백질-1(MCP-1)과 같은 사이토카인 및 산화질소(NO) ; CD91(알파-2-마크로글로불린 수용체,α2MR)및/또는 CD36와 같은 수용체들의 결합 ; 항원 분자들의 결합 및 분리; 및 동물에서 종양들의 퇴보를 일으키는 능력; 암을 갖는 동물들의 생존의 연장 및 감염의 제거를 포함하나 이에 한정하지 않는 생물학적 반응 변형제의 생성 유도를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 것을 포함한다. 생물학적 활성은 생체내 및/또는 생체외에서 관찰될 수 있다.
용어 "hsp"는 항원 분자와 비공유적으로 결합되지 아니한 열 충격 단백질을나타낸다. 용어 "hsp-펩타이드 복합체들"은 열 충격 단백질과 비공유적으로 결합되지 아니한 항원 분자를 포함하는 복합체를 나타낸다. 바람직하게, 상기 항원 분자는 항원 단백질 또는 펩타이드이다.
본 발명의 실행에 유용한 스트레스 단백질들로 상호교환적으로 명명되는 열 충격 단백질들은 (1) 세포가 스트레스에 노출될 때 세포내 농도가 증가하는 단백질; (2) 다른 단백질들 또는 펩타이드에 결합할 수 있는 것; 및 (3) ATP의 존재 및 낮은 pH 예를 들어 1,2, 3, 4,5 또는 6에서 결합된 단백질들 또는 펩타이드들을 방출할 수 있을 것과 같은 조건을 만족하는 세포내 단백질 또는 상기의 성질모두를 갖는 세포내 단백질과 적어도 35% 동종성을 보이는 단백질 중에서 선택될 수 있다.
바람직하게는 상기 hsp와 hsp-펩타이드 복합체는 인간 hsp와 hsp-펩타이드 복합체이다. hsp는 hsp90, 70 hsp 및 hsp 60 계열을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 hsp 계열로 나눈다. 일 실시예에서 상기 hsp와 hsp-펩타이드 복합체들은 hsp90, 70 hsp 및 hsp 60과 같은 hsp 계열의 일원을 포함한다. ATPase 활성을 가진다고 알려진 종류들은 hsp90, gp96(grp94), hsp 104, hsp 70 및 hsp 60을 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 몇 몇 실시예에서 grp94로도 알려진 gp96은 바람직한 hsp이고 gp96-항원 분자 복합체는 본 발명의 바람직한 hsp-펩타이드 복합체이다.
많은 방법들이 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체들의 ATPase 활성을 검출 및/또는 측정하기 위하여 이용할 수 있다. 일반적으로, 그러한 방법들은 ATP의 손실, AMP, ADP의 증가 및/또는 무기 인산의 증가에 의하여 결정될 수 있는 가수분해된 ATP의 양의 결정에 의하여 ATPase 활성을 측정한다. 비 한정적인 실시예들은 HPLC 및 [γ-32P] 표지된 ATP가 관여하는 면역친화 스트리핑 기술 및 얇은 판 크로마토그래피(TLC)를 포함한다. 그러한 방법의 상세한 것은 5.2장에 기재한다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 올리고머 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 존재 및/또는 농도의 결정에 기초하여 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 평가하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시예에서 상기 올리고머 구조는 gp96의 경우에서 관찰된 것과 같은 다이머 구조이다. 따라서 한정 없고 단순한 설명의 목적으로 다이머 또는 다이머화가 이하에서 사용된다. 샘플 내에 다이머 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 존재는 샘플 내에 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체가 생물학적으로 활성이 있다는 것이고, 샘플 내에 다이머 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 결여는 샘플 내에 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물학적 활성이 감소한다는 것을 나타낸다. 더 높은 차원의 집합체들과 다이머 형태를 구별하여서 모노머 및 분해 산물은 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 사이즈 및/또는 모양을 결정하여 수행될 수 있다.
본 발명은 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하나 이에 한정되지 아니한 일반적인 크로마토그래피 기술; 1차원 및 2차원 전기영동 및 모세관 전기영동을 포함하나 이에 한정되지 아니한 일반적인 전기영동 기술; 질량 분광기; 광 산란 분석; 분석적인 초원심분리(AUC) ; 및 분자량 컷오프 필터를 포함하나 이에 한정되지 아니한 필터의 사용을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 사이즈에 의한 hsp의 다이머 형태를 검출하는 방법을 제공한다. 그러한 방법의 상세한 것은 5.3장에서 기재한다.
본 발명은 또한 단백질의 특정한 구조(conformation)에 대하여 특이적으로 지시된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 사용을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 구조에 의한 hsp의 다이머 형태를 검출하는 방법을 제공한다. 일 실시예는 hsp의 모노머 및 올리고머 구조에 대하여 지시되는 항체의 사용을 포함한다. 바람직한 실시예에서 그러한 항체들은 상기 hsp 및/또는 hsp-펩타이드 복합체의 다이머 형태를 제외하고는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체들에 결합하지 아니한다. 그러한 방법의 상세한 부분은 5.10장에 기재한다. 특정한 실시예에서 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 평가하는 방법은 ATPase 활성을 검출 및/또는 측정하고 다이머 hsp 또는 다이머 hsp-펩타이드 복합체의 존재 및/또는 농도를 결정하는 것 모두를 포함한다.
본 발명의 방법은 많은 분야의 적용을 갖는다. 일 예로 본 방법은 hsp-펩타이드 복합체의 상업적인 생산에 사용될 수 있다. 본 발명은 비싸고 시간이 많이 소모되는 세포 기초한 생물학적 분석의 대안으로서 그것의 생물학적 활성에 대하여 hsp-펩타이드 복합체의 양을 조절하고 모니터하는 신속하고 저렴한 수단을 제공한다. 이 방법의 상세한 부분은 5.5장에 기재한다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 대상의 면역 요소를 갖는 질병의 진단 또는 암 또는 감염성 질환의 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 그러한 방법의 상세한 부분은 5.6장에 기재한다.
본 발명은 또한 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 조절하는치료제를 검색하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 방법의 상세한 부분은 5.8장에 기재한다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 변형되지 아니한 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 거의 동등한 생물학적 활성을 갖는 변이체, 절편들, hsp 및 그것의 복합체의 유도체들을 검색하기 위하여 사용될 수 있다.바람직하게는 변이체, 절편들, hsp 및 그것의 복합체의 유도체들의 생물학적 활성은 변형되지 아니한 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체에 비하여 더 높다.
5.7장에서 기재된 바와 같이 또 다른 실시예에서 본 발명은 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 ATPase 활성을 방해하거나 증진시키는 화합물 및/또는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 다이머 구조를 파괴/불안정화 또는 안정화하는 화합물로 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체를 접촉시켜 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 또 다른 예에서 본 발명은 열 충격 단백질들 또는 열 충격 단백질들을 포함하는 면역활성을 갖는 복합체의 올리고머화를 촉진하는 올리고머화제을 사용하는 것에 관한 것이다. 바람직한 실시에에서 올리고머화제는 gp96의 다이머 종류와 그것의 다수(multiplicity )의 형성을 촉진시킬 것이다. 특히 본 발명은 면역학적으로 활성 있는 부분 예를 들어 올리고머화제로 올리고머화된 열 충격 단백질을 포함하는 복합체의 제제를 제공한다.
암 및 감염성 질환의 치료 및 예방 및 대상에 면역반응을 야기하는 목적에 대한 제제의 사용방법들 또한 제공한다.
본 발명은 특정 및/또는 대체적인 수용체 또는 비 수용체 매개 이벤트에 의한 항원 프레젠팅 세포로 백신의 전달을 개량; 면역치료 부위의 전달을 개량;면역치료부위의 어쥬번트 능력을 개량; 또는 2차 면역치료/면역활성 부위를 포착하고 특정 수용체-매개된 섭취를 통하여 그것들을 항원 프레젠팅 세포로 전달하는 면역치료 부위의 생물학적 능력을 증진시키는데 바람직한 것과 같은 다양한 상황에 유용하다. 본 발명은 면역학적으로 활성 있는 부분 예를 들어 올리고머화제로 올리고머화된 열 충격 단백질을 포함하는 복합체의 조성물을 제공한다. 상기 복합체는 바람직하게는 암 또는 감염성 질환 감염원의 항원성을 나타내는 하나 이상의 항원 분자들을 더욱 포함한다. 바람직한 실시예에서 상기 본 발명의 올리고머화된 열 충격 단백질들과 hsp-항원 분자 복합체들은 ATPase 활성을 갖는다. 특정한 실시예에서 상기 본 발명의 올리고머화된 열 충격 단백질은 변성되지 아니한 즉 열 변성된 hsp들이 아니다.
본 발명에서 "올리고머"는 "다이머", "트라이머" 및 폴리머를 포함한 높은 수의 단위체를 포함한다. 특정 실시예에서 gp96의 "올리고머"는 다이머 또는 다수의 다이머들이다. 본 발명에서 복합체에 관하여 용어 "정제된"은 전체 단백질의 중량의 적어도 60 % 인 복합체의 조제물을 의미한다. 특정 실시예에서 그것은 단백질의 전체 중량의 적어도 70 %를 의미한다. 또 다른 실시예에서 그것은 단백질의 전체 중량의 적어도 80 %를 의미한다. 또 다른 실시예에서 그것은 단백질의 전체 중량의 적어도 90 %를 의미한다. 또 다른 실시예에서 그것은 단백질의 전체 중량의 적어도 95 %를 의미한다. 또 다른 실시예에서 그것은 단백질의 전체 중량의 적어도 99 %를 의미한다.
본 발명에서 열 충격 단백질에 관하여 용어 "정제된"은 전체 단백질의 중량의 적어도 60 %인 hsp의 조제물을 의미한다. 특정 실시예에서 그것은 단백질의 전체 중량의 적어도 70 %를 의미한다.또 다른 실시예에서 그것은 단백질의 전체 중량의 적어도 80 %를 의미한다. 또 다른 실시예에서 그것은 단백질의 전체 중량의 적어도 90 %를 의미한다. 또 다른 실시예에서 그것은 단백질의 전체 중량의 적어도 95 %를 의미한다. 또 다른 실시예에서 그것은 단백질의 전체 중량의 적어도 99 %를 의미한다.
몇몇 실시예에서 정제는 SDS-PAGE 겔 상의 모습에 의하여 분석된 것과 같은 동질체를 의미한다. 바람직한 실시예에서 상기 hsp는 항원 분자 예를 들어 펩타이드에 비공유적으로 결합된다.
본 발명은 또한 암 및 감염성 질환의 치료 및 예방에 효과적인 양의 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 상기 복합체는 올리고머화제로 올리고머화된 열 충격 단백질을 포함한다. 상기 복합체는 바람직하게는 암 또는 감염성 질환 감염원의 항원성을 나타내는 하나 이상의 항원 분자들 바람직하게는 펩타이드를 더욱 포함한다.
다른 언급이 없으면 본 발명에서 사용한 "면역활성을 갖는 hsp"는 면역 반응 바람직하게는 hsp가 복합체화된 항원 분자에 대하여 지시된 면역반응을 조절 바람직하게는 촉진 또는 증강시키는 hsp의 능력을 의미한다. 많은 올리고머화제가 당업계에 공지되어 있다.
용어 "올리고머화제"은 다른 분자들의 올리고머화 예를 들어 열 충격 단백질의 올리고머화를 촉진시키는 화합물을 의미한다. 올리고머화제는 분자 들 예를 들어 열 충격 단백질과 공유결합 또는 비공유결합할 수 있다. 일 실시예에서 올리고머화제는 둘 이상의 열 충격 단백질들에 공유결합하여 열 충격 단백질들의 올리고머화를 야기할 수 있다. 또 다른 실시예에서 올리고머화제는 둘 이상의 열 충격 단백질들에 비공유결합하여 열 충격 단백질들의 올리고머화를 야기할 수 있다. 또 다른 실시예에서 올리고머화제는 한 열 충격 단백질들에 공유결합할 수 있고 또 다른 열 충격 단백질들에 대한 유사한 또는 다른 올리고머화제에 비공유결합하여 올리고머화를 촉진시킬 수 있다. 몇몇 실시예에서 두 결합된 열 충격 단백질들은 동일하다. 바람직한 실시예에서 상기 올리고머화된 열 충격 단백질들은 항원 분자 예를 들어 펩타이드와 비공유결합하고 있다.
다른 언급이 없으면 본 발명에서 "분자", "복합체", "열 충격 단백질", "스트레스 단백질", "항원 분자" 및 "올리고머화제"은 사용한 단독으로 사용될 때 또한 복수의 분자들을 포함하고 언급한 분자들의 군을 의미할 수 있다. 몇몇 실시예에서 상기 열 충격 단백질은 암 또는 감염성 질환 감염원의 항원성을 나타낸다.
본 발명에서 사용된 용어"항원성" 및 "면역성"은 항체 또는 주조직적합성 복합체("MHC") 분자들에 결합하여 각각 면역 반응을 생성하는 분자의 능력을 의미한다.
본 발명에 사용된 "암 종류"는 예를 들어 가슴, 허파, 난소와 같은 기원의 조직의 세포타입을 의미한다. 또 다른 실시예에서 항원 분자는 감염원의 항원의 항원성을 나타낸다. 또 다른 실시예에서 항원 분자는 상기 세포 타입의 비종양 세포에서 발현에 비하여 암세포에서 과발현된 항원의 항원성을 나타낸다. 예를 들어 항원 분자는 종양-특이적인 항원 또는 종양-관련된 항원일 수 있다. 일 실시예에서 종양-관련된 항원은 정상 세포에 비하여 종양 세포에서 높은 수준으로 발현되는 항원이고; 종양-특이적인 항원은 정상세포에서는 발현되지 아니하고 종양세포에서만 발현되는 항원이다.
본 발명은 각 복합체가 올리고머화제로 올리고머화된 열 충격 단백질을 포함하는 일군의 정제된 복합체를 더욱 더 제공한다. 상기 복합체는 암 또는 감염성 질환 감염원의 항원성을 나타내는 하나 이상의 항원 분자들 예를 들어 펩타이드들을 더욱 포함할 수 있다. 일 실시예에서 상기 열 충격 단백질은 hsp70, hsp90, gp96, 칼레티쿠린(calreticulin), hsp110, grpl70, 또는 그것의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명은 암 또는 감염성 질환에 대한 면역성이 있는 복합체를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 열 충격 단백질의 올리고머화를 촉진시키기에 충분한 올리고머화제로 열 충격 단백질 또는 hsp-항원 분자 복합체를 접촉하는 것을 포함한다. 일 실시예에서 올리고머화된 복합체는 올리고머화제에 공유결합된 열 충격 단백질을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 항원 분자는 암 또는 감염성 질환 감염원의 항원성을 나타낸다.  또 다른 실시예에서, 올리고머화된 복합체는 면역활성을 갖는 열 충격 단백질을 포함한다.
본 발명은 여기에 기재된 방법들에 의하여 제조된 조성물을 더욱더 제공한다. 특정한 실시예에서, 올리고머화제는 레시틴이 아니다. 일 실시예에서 항원 분자들은 인 비보에서 hsp와 복합체화된 펩타이드들이고 상기 복합체들은 세포들로부터 분리될 수 있다.
대안적으로, 상기 복합체들은 hsp와 항원 분자의 정제된 조제물로부터 시험관 내에 만들어질 수 있다. 또 다른 실시예에서, 암 또는 감염원들은 자연계에서 정제에 의하여, 화합 합성 또는 재조합에 의하여 또 상기에서 기재한 것과 같은 인 비트로 과정으로부터 얻어질 수 있다. 일 실시예에서 본 발명은 복합체의 올리고머화를 촉진시키기에 충분한 올리고머화제로 상기 복합체를 접촉하여 올리고머화된 복합체를 제조하는 방법을 제공하고,여기서 상기 복합체는 면역활성을 갖는 hsp 및 항원 분자를 포함한다. 또 다른 실시예에서 올리고머화된 복합체는 먼저 hsp의 올리고머화를 촉진시키기에 충분한 올리고머화제로 상기 hsp를 접촉하여 면역활성을 갖는 hsp를 올리고머화하고 관심있는 항원 분자로 상기 올리고머화된 hsp를 접촉하는 것에 의하여 제조된다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 세포로부터 면역활성을 갖는 hsp-항원 분자 복합체를 분리하고 상기 hsp-항원 분자 복합체로부터 내생적인 항원 분자 예를 들어 펩타이드를 제거하고; 관심있는 외래 항원 분자 예를 들어 다른 펩타이드로 현재 외래 항원 분자와 복합체를 형성하는 상기 hsp를 접촉하고 새롭게 형성된 복합체의 올리고머화를 촉진하기에 충분한 양의 올리고머화제로 새롭게 형성된 복합체를 접촉하는 것을 포함하는 올리고머화된 복합체의 제조 방법을 제공한다,
또 다른 실시예에서, 본 발명은 세포로부터 면역활성을 갖는 hsp-항원 분자 복합체를 분리하고 상기 hsp-항원 분자 복합체로부터 내생적인 항원 분자 예를 들어 펩타이드를 제거하고; 상기 hsp의 올리고머화를 촉진하기에 충분한 양의 올리고머화제로 상기 hsp를 접촉하고; 관심있는 외래 항원 분자 예를 들어 다른 펩타이드로 현재 외래 항원 분자와 복합체를 형성하는 상기 올리고머화된 hsp를 접촉하는 것을 포함하는 올리고머화된 복합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 복합체가 열 충격 단백질인 복합체에 공유 또는 비공유적으로 올리고머화제을 결합하는 것을 포함하는 복합체의 면역성을 증가시키는 방법을 더 제공한다. 일 실시예에서 상기 복합체는 항원 분자와 결합된 열 충격 단백질을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법들은 여러 상황에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료가 바람직한 대상 또는 개인의 면역 반응을 야기하는데 사용될 수 있다. 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료가 바람직한 대상 또는 개인은 동물 바람직하게는 포유류, 인간이 아닌 영장류이고 가장 바람직하게는 인간이다.
여기에 사용된 용어 "동물"은 애완 동물(예를 들어 고양이 및 개), 동물원 동물들, 사슴, 여우들과 너구리들을 포함하는 야생 동물들, 농장 동물들, 가축 및 말, 소, 양, 돼지, 칠면조들, 오리들, 닭을 포함하는 가금, 및 설치류를 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에 따라서, 대상에 올리고머화된 면역활성을 갖는 복합체 투여는 관심있는 항원 원에 특이적인 항원 펩타이들에 대한 대상내의 면역 반응을 야기하고 촉진하고 증진 및/또는 유지하는 것과 같은 면역 반응을 조절을 일으킨다. 올리고머화된 복합체는 단일 용량 또는 다수 용량으로 투여될 수 있다. 면역원 용량은 여러 대상 및 여러 치료 또는 예방적 적용에 있어서 다를 수 있다.
일 실시예에서 본 발명은 백신 조성물의 준 면역원(sub-immunogenic) 양에 의한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 올리고머화는 올리고머화 없이 사용될 때 면역반응을 유도하기 불충분한 백신 조성물의 양에 의하여 면역 반응의 유도를 가능케한다.
본 발명은 또한 면역치료 부위의 올리고머화를 촉진하는 올리고머화제로 상기 부위를 접촉하여 면역치료 부위의 생물학적 활성을 증가시키는데 사용될 수 있다.
여기에 사용된 "면역치료 부위"는 면역치료 복합체의 일부를 의미한다. 여기에 사용된 "올리고머화"는 폴리머 또는 폴리머 중간체가 형성되는 과정을 의미한다. 일 실시예에서 면역치료 부위는 다이머 또는 다수의 다이머들을 형성한다. 또 다른 실시예에서 면역치료 부위는 고차원의 종류 즉 둘 이상의 단위체를 갖는 올리고머를 형성한다.
본 발명은 또한 수용체 매개 반응에 의하여 항원 프레젠팅 세포들(APC)로 백신 섭취를 증가시키는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 비수용체 매개 반응에 의하여 항원 프레젠팅 세포들(APC)로 백신 섭취를 증가시키는데 사용될 수 있다.
예를 들면, 열 충격 단백질 매개된 항원 펩타이드들은 피노사이토시스, 패고사이토시스 및 세포 표면 성분과 비 특이적인 상호작용과 차후의 삽입 및/또는 세포막을 가로지르는 hsp-펩타이드 복합체들의 이동을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 비수용체 매개 반응에 의하여 항원 프레젠팅 세포에 의하여 섭취될 수 있다. 열 충격 단백질들의 올리고머화는 그러한 섭취로 증가될 수 있다. 본 발명은 면역 부위의 어쥬번트 능력을 개량하는데 사용될 수 있다.
여기에 사용된 용어 "어쥬번트 능력"은 면역 반응 예를 들어 항체 생성 세포 또는 T-림파구와 같은 면역활성을 갖는 세포들의 국소적인 유입을 일으키는 염증성 반응의 유도와 같은 면역 반응을 증가시키는 항원과 함께 사용되는 비항원 물질의 능력을 의미한다. 어쥬번트 능력을 갖는 면역치료 부위는 적은 양의 항원에 대하여 항체 생성 또는 T-림파구 생성을 증가시키고, 항체 생성 또는 T-세포 활성화의 기간을 연장하기 때문에 백신의 조제물에 치료적으로 사용될 수 있다. 면역치료 부위의 올리고머화는 그들의 어쥬번트 능력을 증가시킬 수 있다.
여기에 사용된 면역치료 부위는 스트레스 단백질 예를 들어 열 충격 단백질을 의미한다. 일 실시예에서 열 충격 단백질은 hsp70, hsp90, gp96, 칼레티쿠린(calreticulin), hsp110, grpl70, 또는 그것의 혼합물이다.
본 발명은 예를 들면, 올리고머화를 촉진시키기 위하여 충분한 양의 올리고머화제로 그것을 접촉하는 것에 의하여 열 충격 단백질과 같은 면역치료 부위의 면역성또흔 항원성을 증가시키는데 더욱 사용될 수 있다. 항원성 또는 면역성의 증가는 5.15장에 논의된 바와 같이 몇가지 방법들로 나타낼 수 있다. 바람직한 실시예에서 증가된 항원성 또는 면역성을 나타내는 방법은 예를 들면, 8장에서 기술한 바와 같이 항원 리프레젠테이션 분석을 포함하나 이에 한정하지 아니한다.
여기에 사용된 "조절"은 예를 들어 면역치료 부위의 항원성 또는 면역성과 같은 특성들의 변화를 의미한다. 일 실시예에서 그것은 항원성 또는 면역성의증가, 증강, 또는 촉진을 의미한다. 또 다른 실시예에서 그것은 항원성 또는 면역성의 감소 또는 억제를 의미한다. 여기에 사용된 "조절자"는 따라서 또 다른 것의 특성들을 조절하는 화합물을 의미한다.
본 발명은 또한 면역치료 부위의 전달을 개량하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 올리고머화제 존재하에서 첫번째 단백질 및 두번째 단백질을 포함하는 복합체의 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는 대상에 수용체 매개 섭취를 통한 항원 프레젠팅 세포에 면역치료부위의 포착 및 상기 부위의 전달 방법을 더욱더 제공한다. 상기 복합체는 암 또는 감염성 질환 감염원의 항원성을 나타내는 하나 이상의 항원 분자들 바람직하게는 펩타이드를 더욱 포함할 수 있다. 일 실시예에서 두번째 단백질은 첫번째 단백질과 다르다. 또 다른 실시예에서, 첫번째 단백질과 결합된 항원 분자는 항원 프레젠팅 세포에 의하여 섭취될 수 있으나 두번째 단백질과 결합된 것은 항원 프레젠팅 세포에 의하여 정상적으로 섭취될 수 없다.
두번째 단백질에 대한 첫번째 단백질의 올리고머화는 두번째 단백질과 결합된 항원 분자를 항원 프레젠팅 세포에 의하여 섭취될 수 있게 한다. 일 실시예에서, 첫번째와 두번째 단백질들은 모두 열 충격 단백질들이다. 또 다른 실시예에서, 첫번째 단백질은 hsp70, hsp90, gp96, 칼레티쿠린, hsp110, grpl70, 또는 그것의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 열 충격 단백질이나 두번째 단백질은 열 충격 단백질이 아니다. 또 다른 실시예에서, 첫번째 단백질은 열 충격 단백질이 아니나 두번째는  열 충격 단백질이다. 일 실시예에서, 첫번째 단백질은 암의 항원또는 감염성 질환 감염원의 항원의 항원성을 나타내는 항원 분자과 더욱 결합될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 두번째 단백질은 암의 항원 또는 감염성 질환 감염원의 항원의 항원성을 나타내는 항원 분자과 더욱 결합될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방 방법을 더욱 더 제공한다. 일 실시예에서, 상기 조성물은 열 충격 단백질, 항원 분자 및 올리고머화제을 포함하는 복합체를 포함하고, 여기서 상기 항원 분자는 상기 암의 항원 또는 감염성 질환 감염원의 항원의 항원성을 나타낸다. 또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 상기 언급한 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이다. 또 다른 실시예에서 상기 언급한 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 상기 약학 조성물은 예를 들어 유리병 또는 주사기와 같은 용기에 존재한다. 또 다른 실시예에서, (a) 하나 이상의 열 충격 단백질, 올리고머화제 및 암의 항원 또는 감염성 질환 감염원의 항원의 항원성을 나타내는 첫번째 항원 분자를 포함하는 복합체를 대상에 투여; 그리고 (b) 대상에 상기 복합체의 투여 전, 동시 투여, 투여 후에 올리고머화제로 결합된 열 충격 단백질의 두번째 복합체의 센시타이징 양으로 인 비트로에서 세시타이즈된 항원 프레젠팅 세포 및 암의 항원 또는 감염성 질환 감염원의 항원의 항원성을 나타내는 두번째 항원 분자를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는 한 종류의 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 APC는 매크로파지, 덴트리틱 세포들, B 림프구들, 및 그것의 혼합을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 항원 프레젠팅 세포 중에 선택될 수 있고 바람직하게는 매크로파지이다. 일 실시에에서 첫번 복합체는 APC를 센시타이즈하는데 사용된 두번째 복합체와 동일하다. 또 다른 실시예에서, 첫번째 복합체는 APC를 센시타이즈하는데 사용된 두번째 복합체와 다르다. 특정한 실시예에서 본 발명의 상기 APC와 조성물은 동시에 투여되고, 같은 조성물(APC와 복합체를 포함하는) 또는 다른 조성물에 존재할 수 있다.
본 발명에 따라 채용한 면역치료법(센시타이즈된 APC를 사용한)은 올리고머화된 분자 복합체로 배양하여 면역 항원 프레제닝 세포들의 활성화를 가능케한다. 인 비보에서 세포들의 사용 전에 종양 또는 감염성 질환에 대한 반응성을 인 비트로에서 측정할 수 있다. 클론 선택 및/또는 확장이 수반되는 상기 인 비트로 부스트 및 환자 투여는 유용한 치료 및/또는 예방 전략을 구성한다. 일 실시에에서 예를 들어 암의 항원 또는 감염성 질환 감염원의 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드로 복합체화된 열 충격 단백질과 같은 상기 복합체의 면역활성을 갖는 부위는 대상에 자가적(autologous)즉 대상 그 차제의 세포로부터 분리된다(예를 들어 암 치료가 바람직한 경우에 환자의 종양 생검(biopsies)으로부터 제조된). 대안적으로 상기 복합체는 본 발명의 분자 복합체의 조성물이 투여될 대상에 동종이계(allogeneic)일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 복합체는 열 충격 단백질을 발현하는 배양된 세포와 같은 인 비트로에서 제조된다. 
특정 복합체들을 생성하는 열 충격 단백질로 복합체화된 용도를 위한 외래 항원들 및 그 절편 및 그것의 유도체들은 면역 반응을 일으키거나 항체 또는 MHC분자에 결합하는 능력에 의하여 당업계에 공지된 표준 면역분석법 뿐 아니라 당업계에 공지된 방법으로부터 선택될 수 있다. 열 충격 단백질들과 항원 분자의 특정한 복합체들은 환자의 암 또는 전암(precancerous) 조직 또는 암 세포주로부터 분리되거나 인 비트로(외래 항원이 항원 분자로 사용된 실시예에서 필요할 때)에서 제조될 수 있다. 
본 발명은 본 발명의 복합체를 포함하는 약학 제제 또는 조성물을 포함하는 키트를 더욱더 제공한다. 본 발명은 또한 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 또는 그것의 복합체 및 올리고머화제을 포함하는 용기를 포함하는 키트를 제공한다.
선택적으로, 본발명의 방법에 따라서 올리고머화된 복합체들을 조제하는 지시사항이 상기 키트에 포함될 수 있다. 특정한 실시예에서, 본 발명은 일차 및 전이된 종양 질환의 예방 및 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 치료 범위 및 약학 조성물은 부가적인 면역 반응 열 충격 단백질들, 치료제들 또는 사이코카인, 화학요법제, 면역치료제, 항-앤지오제닉제, 호르몬, 항체, 폴리뉴클레오타이드들, 방사선 및 포토다이나믹 치료제, 항생제, 항-바이러스제, 항-원생동물 화합물들 및 항-진균성 화합물들을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 생물학적 반응 변형체와 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료를 위하여 방사선 요법 또는 하나 이상의 화학요법제와 함께 투여된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물은 감염성 질환의 치료를 위하여 항세균,항바이러스 또는 항진균성 제제와 함께 투여된다. 암 치료 외에, 본 발명의 조성물들은 예를 들어 가계의 영향으로 병이 걸리기 쉽거나 환경 요인에 기인하여 암의 증가된 위험을 갖는 대상과 같은 대상들에서 여러가지 암의 예방을 위하여 활용될 수 있다.
특정한 치료 영역, 약학 조성물, 그리고 키트들은 또한 발명에 의하여 제공된다.
5.1 열 충격 단백질 제조
스트레스 단백질들로도 혼용해서 명명되는 열 충격 단백질들은 (1) 세포가 스트레스에 노출될 때 세포내 농도가 증가하는 단백질; (2) 다른 단백질들 또는 펩타이드에 결합할 수 있는 것; 및 (3) ATP의 존재 및 낮은 pH 예를 들어 1,2, 3, 4,5 또는 6에서 결합된 단백질들 또는 펩타이드들을 방출할 수 있을 것과 같은 조건을 만족하는 세포내 단백질 또는 상기의 성질모두를 갖는 세포내 단백질과 적어도 35% 동종성을 보이는 단백질 중에서 선택될 수 있다. 여기서 hsp-펩타이드 복합체들이 비-백신 치료제 형태(modality)의 투여와 함께 사용되고, 바람직하게는 상기 펩타이드들은 항원성 또는 병태와 관련된다. 특정한 바람직한 실시예에서, 특정한 타입의 암을 갖는 대상에 투여되는 치료제 형태의 치료적 결과는 hsp-펩타이드 복합체들의 투여에 의하여 개선되고, 여기서 상기 펩타이드는 그 타입의 암의 항원의 항원성을 나타낸다.
본 발명에서 상기 hsp는 결합되지 아니한 hsp 70, hsp 90, gp96, 칼레티쿠린, hsp110 또는 grpl70, 또는 펩타이드와 복합체화된 그것의 비공유 또는 공유 복합체를 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 일 실시예에서, 펩타이드와 복합체화된 hsp 70, hsp 90, gp96, 칼레티쿠린, hsp110 또는 grpl70의 공유 또는 비공유 복합체들은 본 발명의 조성물에서 특정한 복합체로 사용하기 위하여 암 환자로부터 얻은 종양세포들로부터 수술 후에 제조되고 정제될 수 있다. 여기에 기재된 방법들에 따라 hsp 또는 MHC와 내생적으로 복합체화된 면역성 또는 항원성 펩타이드들을 특정한 항원 분자들로 사용될 수 있다. 예를 들면, 여러 종양 항원들(예를 들어 타이로시나아제(tyrosinase), gp100, 메란(melan)-A, gp75, 뮤신(mucins)들 등) 및 면역 결핍 바이러스 타입 I(HIV-I), 인체 면역 결핍 바이러스 타입 Ⅱ(HIV-II), A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 수두, 아데노바이러스, 단순포진 바이러스 타입 I(HSV-I), 단순포진 바이러스 타입 Ⅱ(HSV-II), 우역(rinderpest), 리노바이러스(rhinovirus, 에코 바이러스, 로터바이러스(rotavirus), 호흡기 신시티움 바이러스, 유두종 바이러스, 파포바(papova) 바이러스, 사이토 메갈로 바이러스, 에키노바이러스(echinovirus), 아르보바이러스(arbovirus), 헌타바이러스 (huntavirus), 콕사키(coxsackie) 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스 및 소아마비 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 바이러스 단백질에 대한 세포독성 T-세포 반응을 촉진하는 펩타이드들이 제조될 수 있다.
상기 항원 분자들은 인 비보에서 hps와 복합체화된 펩타이드들인 실시예에서 상기 복합체는 세포들로부터 분리될 수 있고 또는 대안적으로 각 hsp들과 항원 분자들의 정제된 조제물로부터 인 비트로에서 생산될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 항원 분자들은 외래 항원들 및 절편들 또는 그것의 유도체들이다.
또 다른 실시예에서, 암들(예를 들어 종양들) 또는 감염원들(예를 들어 바이러스성 항원, 박테리아 항원들, 등)의 항원들은 자연계에서 정제에 의하여, 화합 합성 또는 재조합에 의하여 또 상기에서 기재한 것과 같은 인 비트로 과정으로부터 얻어질 수 있고 hsp와 복합체화 될 수 있다. 사용되어지는 특정한 hsp-항원 분자 복합체가 인 비보에서 세포들에서 생성되는 복합체인 실시예에서 하이게 기재된 것과 같은 예시적인 정제 과정이 채택될 수 있다. 대안적으로, 인 비트로에서 hsp들과 복합체화에 의한 항원 분자들을 사용하기 위한 실시예에서 hsp들은 ATP 또는 예를 들어 1,2, 3, 4,5 또는 6에서 낮은 pH 하에서 내생적인 hsp-펩타이드 복합체들로부터 그러한 사용을 위하여 정제될 수 있다. hsp들은 또한 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 생산될 수 있다. 여기에 기재된 프로토콜들은 예를 들면 조직들, 분리된 세포들 또는 미리선택된 세포내 병원체로 감염된 불멸(immortalized) 진핵 세포주들, 종양 세포들 또는 종양 세포주들과 같은 진핵 세포들로부터 특정한 hsp-펩타이드 복합체들 또는 상기 hsp 단독으로 분리될 수 있다.
5.1.1 hsp-펩타이드 복합체의 원(source)
회수된 hsp-펩타이드 복합체의 원은 그 결과 hsp-펩타이드 복합체의 의도된 사용에 기하여 선택될 수 있다. hsp-펩타이드 복합체는 모든 세포들에서 존재하기 때문에 어떤 조직 또는 세포 샘플이 원으로 사용될 수 있다. hsp-펩타이드 복합체는 괴사된 세포 사멸에 의하여 세포들로부터 세포환경으로 분비될 수 있고; 따라서 체액, 분비물, 배양 상등액, 발효 액, 및 그것의 유사체가 hsp-펩타이드 복합체가 회수되는 원일 수 있다. hsp-펩타이드 복합체는 암 또는 감염된 세포들로부터 얻을 수 있다. 감염된 세포 및 암 세포들은 당업계에 공지된 방법에 의하여 비 암 세포또는 비감염 세포(즉 정상 세포들)로부터 인비트로에서 적절하게 제조될 수 있다(예를 들어 미국특허 6,017,540을 참조). 감염성 질환들의 치료 및 예방과 관련된 적용을 위하여, 항원 hsp-펩타이드 복합체들은 조직들, 분리된 세포들 또는 세포내 병원체로 감염 또는 형질전환된 불멸(immortalized) 세포주들을 포함하는 감염된 세포들로부터 얻을 수 있다. 항원 hsp-펩타이드 복합체들은 감염원 특히 세포내 병원체로 감염된 세포들로부터 얻을 수 있다. 항원 hsp-펩타이드 복합체들을 갖는 백신이 세포내 병원체로 감염된 세포들로부터 분리되고 포유류에 투여된 것은 같은 병원체로 감염된 세포들에 대한 세포 면역 반응들을 효과적으로 촉진시킨다는 것을 나타낸다. 특히, 면역반응은 세포내 병원체를 갖는 세포를 타겟하고 파괴하는 세포독성 T-세포 캐스케이드를 통하여 중재된다. 비록 세포내 병원체에 한정되지 않지만, 여기에 기재된 세포내 병원체는 포유류 세포 내에서 존재하며 포유류에 질병을 야기할 수 있는 바이러스들, 박테리아들, 진균류들, 원생동물 및 세포내 기생충을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 생물체를 포함한다.
hsp-펩타이드 복합체들은 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 수두, 아데노바이러스, 단순포진 바이러스 타입 I(HSV-I), 단순포진 바이러스 타입 Ⅱ(HSV-II), 우역(rinderpest), 리노바이러스(rhinovirus, 에코 바이러스, 로터바이러스(rotavirus), 호흡기 신시티움 바이러스, 유두종 바이러스, 파포바(papova) 바이러스, 사이토 메갈로 바이러스, 에키노바이러스 (echinovirus), 아르보바이러스(arbovirus), 헌타바이러스 (huntavirus), 콕사키(coxsackie) 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스 및 소아마비 바이러스, HIV-I, HIV-II를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 바이러스로 감염된 세포들로부터 얻을 수 있다. 추가로, 항원 hsp-펩타이드 복합체들은 바이러스 유전자와 트랜스펙션된 세포들로부터 모아질 수 있다.
hsp-펩타이드 복합체들은 결핵, 임질, 장티푸스, 뇌막염, 골수염, 수막구균성 폐혈증, 자궁 내막염, 결막염, 복막염, 신우신염, 인두염, 폐혈증성 아르그리티스(arghritis), 봉와직염, 에피그로티티스(epiglottitis), 살핀기티스(salpingitis), 중이염, 시겔라(shigella) 이질, 가스트로엔테리티스(gastroenteritis) 등을 일으키는 박테리아로 감염된 세포들을 포함하나 이에 한정되지 아니한 박테이라-감염된 세포들로부터 얻을 수 있다. 바람직한 실시예에서, hsp들 또는 hsp-펩타이드 복합체들은 마이코박테리아(Mycobacteria), 리케차, 마이코프라즈마, 네이세리아(Neisseria) 및 레지오넬라를 포함하나 이에 한정되지 아니한 세포내 박테리아로부터 감염된 세포들로부터 얻을 수 있다. hsp-펩타이드 복합체들은 레이쉬매니아(Leishmania), 코크지디오아(Kokzidioa), 및 트리파노소마를 포함하나 이에 한정하지 아니하는 세포내 원생생물로 감염된 세포들로부터 얻을 수 있다. 게다가  hsp들 또는 hsp-펩타이드 복합체들은 클라미디아 및 리케차를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 세포내 기생충으로 감염된 세포들로부터 얻을 수 있다.
hsp-펩타이드 복합체들은 또한 박테리아로 감염된 세포들로부터 얻을 수 있다. 여러 부위로 전이된 암을 포함하는 암으로부터 분리된 조직 또는 세포들은 본 방법에서 hsp들 또는 hsp-펩타이드 복합체들의 공급원으로 사용될 수 있다.
예를 들어 혈액, 림프액 또는 다른 체액내에 순환하는 백혈병 세포들은 또한 사용될 수 있고, 고형 종양 조직물(예를 들어 생체검사로부터 온 일차 조직)은 사용될 수 있다.
hsp-펩타이드 복합체들은 예를 들어 기원이 간엽에 있는 종양들(육종), 즉
e. , 섬유육종;점액육종(myxosarcomas) ; 지방육종(liposarcomas); 연골육종; 골육종;혈관육종(angiosarcomas) ; 상피육종(endotheliosarcomas); 림프관육종(lymphangiosarcomas); 활막성육종(synoviosarcomas); 중피육종(mesotheliosarcomas); 유잉종(Ewing's tumors); 골수성 백혈병; 단구성 백혈병; 악성 림프종(malignant lymphomas); 림프성 백혈병; 형질세포종; 평활근육종 및 횡문근육종을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 종양 세포들로부터 얻을 수 있다.
추가로, 이 방법은 기원이 상피에 있는 종양(암종) 즉 편평세포 또는 상피 세포암종; 기저 세포 암종(basal cell carcinomas) ; 한선암 종(sweat gland carcinomas) ; 피지선 암종; 선암종(adenocarcinomas) ; 유두 암종; 유두 선암종;낭종암; 수질 암종(medullary carcinomas); 미분화된 암종(심플렉스 암종); 기관지 원성 암종(bronchogenic carcinomas); 기관지 암종; 흑색암(melanocarcinomas); 신장 세포 암종; 간세포 암종(hepatocellular carcinomas); 담관 암종(bile duct carcinomas); 유두 암종(papillary carcinomas) ; 이행세포 암종; 편평상피암; 융모암(choriocarcinomas); 정상피종(seminomas); 배아 암종 악성 기형종(embryonal carcinomas malignant teratomas) 및  기형암종(teratocarcinomas)과 같은 종양으로부터 온 종양세포들로부터 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 회수에 사용될 수 있다.
hsp들 또는 hsp-펩타이드 복합체들은 예를 들어 급성 림프성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병[골수아구(myeloblastic), 전골수세포
(promyelocytic), 골수단구성(myelomonocytic), 단구성(monocytic) 및  적백혈병(erythroleukemia)]; 만성 백혈병[만성 골수아구(과립구성(granulocytic) 백혈병 및 만성 림프성 백혈병]과 같은 백혈병; 및 진성적혈구증다증(polycythemia vera), 림프종[호치킨씨 병 및 비-호치킨씨 병(non-Hodgkin's disease)], 다발성 골수종,왈덴스트롬 거대 글로브린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 및 중쇄 질병의 세포들로부터 또한 얻을 수 있다.
hsp-펩타이드 복합체들은 화학적 발암 물질들 또는 방사선에 의하여 야기된 종양들로부터 온 종양 세포들로부터 얻을 수 있다.화학적 발암 물질들은 탄화수소와 같은 담배 흡연, 발암성 공기, 음식, 화장품들 또는 다른 오염원과 관련된 발암 물질들을 포함한다. hsp-펩타이드 복합체들은 종양 세포주로부터 얻을 수 있다.
질병의 진단, 예후 또는 특히 면역치료제 또는 백신과 관련한 치료에 대한 반응을 측정하는 것과 관련된 적용을 위하여, hsp-펩타이드 복합체들은 체액, 혈액, 림프액 등으로부터 얻을 수 있다.
5.1.2 Hsp70-펩타이드 복합체들의 제조 및 정제
hsp70-펩타이드 복합체의 정제는, 예를들면, Udono et al., 1993, J.Exp.Med. 178: 1391-1396 등 이전에 게재되었다. 사용될 수 있는 절차는, 예를들면 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:
우선, 종양세포는 30mM 탄산수소나트륨 pH 7.5 와 1mM 페닐메틸 술포닐 플루오라이드(phenyl methyl sulfonyl fluoride, PMSF)로 이루어진 1X 용균 버퍼(Lysis buffer)에 현탁시킨다. 그런 다음, 상기 펠렛을 현미경 검사에 의해 결정된 것과 마찬가지로 > 99% 세포들이 용균될때까지 얼음위에서 초음파로 처리하여 분해시킨다. 초음파 분해 대신에, 세포들은 기계적인 전단으로 용균될 수 있으며, 이러한 접근법에서 상기 세포들은 전형적으로 30mM 탄산수소나트륨 pH 7.5 와 1mM PMSF에서 재현탁되고, 얼음 위에서 20분동안 배양된 다음, > 95% 세포들이 용균될때까지 다운스 호모게나이저(Dounce homogenizer)에서 파쇄된다.
그 다음, 파쇄액은 1,000g에서 10분동안 원심분리하여 파쇄되지 않은 세포들, 핵, 그리고 다른 세포 파편들을 제거한다. 얻어진 상청액은 다시 100,000g에서 90분동안 원심분리시켜 상청액을 얻은 다음, 2mM Ca2+ 와 2mM Mg2+를 함유하는 포스페이트 완충 염수(PBS)로 평형을 이룬 콘 에이 세파로즈(Con A Sepharose)와 혼합시킨다. 상기 세포들이 기계적인 전단에 의해 용균된 경우, 상청액은 콘 에이 세파로즈(Con A Sepharose)와 혼합시키기 전에 같은 부피의 2X 용균 버퍼로 희석시킨다. 그 다음, 상기 상청액은 4℃에서 2 ~ 3시간 동안 콘 에이 세파로즈(Con A Sepharose)와 결합시켜둔다. 결합하지 못한 물질은 수집하여 36시간동안 lOmM 트리스-아세테이트(Tris-Acetate) pH 7.5, O.lmM EDTA, lOmM NaCl, 1mM PMSF에 대해서 투석(3회, 매회 100 부피)시킨다. 그런 다음, 투석물은 17,000rpm(Sorvall SS34 rotor)으로 20분간 원심분리시킨다. 이 때, 얻어진 상청액은 분리하여 20mM 트리스-아세테이트 pH 7.5, 20mM NaCl, O.lmM EDTA와 15mM 2-머캡토에탄올(2-mercaptoethanol)에서 평형을 이룬 Mono Q FPLC 컬럼에 적용된다. 상기 컬럼은 20mM에서 500mM NaCl 구배차(gradient)로 전개시킨 다음, 용출분획은 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)에 의해 분리되고, 적절한 항-hsp70 항체(클론 N27F3-4으로부터, StressGen으로부터와 같이)를 이용한 면역블럿팅에 의해 특징지워진다.
항-hsp70 항체와 함께 강한 면역활성을 갖는 분획들은 수집되고, hsp70-펩타이드 복합체는 암모늄 설페이트와 함께, 특히 50 ~ 70% 암모늄 설페이트 컷(cut)에서, 침전된다. 얻어진 침전물은 17,000 rpm (SS34 Sorvall rotor)에서 분리되고, 70% 암모늄 설페이트로 세척된다. 세척된 침전물을 가용화시키고, SephadexRG25 컬럼(Pharmacia)에서 겔 걸름에 의해 잔존 암모늄 설페이트가 제거된다. 필요하다면, 이와 같이 얻어진 hsp70 제제는 전술한 Mono Q FPLC 컬럼을 통해 재정제될 수 있다.
hsp70-펩타이드 복합체는 이러한 방법으로 명백한 균질성으로 정제될 수 있다. 일반적으로 hsp70-펩타이드 복합체 1mg은 세포/조직 1g으로부터 정제될 수 있다.
hsp70-펩타이드 복합체의 개량된 정제방법은 세포 단백질과 ADP 또는 파쇄액에서 hsp70이 ADP나 비가수분해성 ATP 유사물에 결합될 수 있는 고체 기질에 고정되어 있는 비가수분해성 ATP 유사물과 접촉하는 것과, 결합된 hsp70을 용출하는 것을 포함한다. 바람직한 방법은 고체 기저에 고정된 ADP(예를 들면, ADP-아가로즈)로 컬럼 크로마토그래피를 이용하는 것이다. 예를 들면, Peng, 1997, J.Immuno. Meth.204: 13-21를 참조한다. 얻어진 hsp70 제제는 순도가 높다. 또한, 상기 hsp70의 수율은 약 10배 이상 현저하게 증가된다. 선택적으로, ADP 대신 비가수분해성 ATP 유사물을 이용한 크로마토그래피가 hsp70-펩타이드 복합체의 정제에 사용될 수 있다. ADP-아라로즈 크로마토그래피에 의한 hsp70-펩타이드 복합체의 정제는 예를 들어 다음과 같이 실행될 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다:
메쓰 에이 육종세포(meth A sarcoma cells)(5억개의 세포)는 저장성 버퍼에서 파쇄되고, 4℃에서 90분동안 100,000g에서 원심분리된다. 상청액은 ADP-아가로즈 컬럼에 적용된다. 컬럼은 버퍼로 세척되고, 5컬럼 부피의 3mM ADP로 용출된다. hsp70-펩타이드 복합체는 용출된 전체 50분획 중 2 내지 10 분획에서 용출된다. 용출된 분획은 SDS-PAGE에 의해 분석된다. hsp70-펩타이드 복합체는 이러한 절차를 이용하여 명백한 균질성으로 정제될 수 있다.
5.1.3 HSP90-펩타이드 복합체의 제조 및 정제
사용될 수 있는 절차는, 예를들면 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:
우선, 종양세포는 30mM 탄산수소나트륨 pH 7.5 와 1mM 페닐메틸 술포닐 플루오라이드(phenyl methyl sulfonyl fluoride, PMSF)로 이루어진 1X 용균 버퍼(Lysis buffer)에 현탁시킨다. 그런 다음, 상기 펠렛을 현미경 검사에 의해 결정된 것과마찬가지로 > 99%의 세포들이 용균될때까지 얼음위에서 초음파로 처리하여 분해시킨다. 초음파 분해 대신에, 세포들은 기계적인 전단으로 용균될 수 있으며, 이러한 접근법에서 상기 세포들은 전형적으로 30mM 탄산수소나트륨 pH 7.5 와 1mM PMSF에서 재현탁되고, 얼음 위에서 20분동안 배양된 다음, > 95%의 세포들이 용균될때까지 다운스 호모게나이저(Dounce homogenizer)에서 파쇄된다.
그 다음, 파쇄액은 1,000g에서 10분동안 원심분리하여 파쇄되지 않은 세포들, 핵, 그리고 다른 세포 파편들을 제거한다. 얻어진 상청액은 다시 100,000g에서 90분동안 원심분리시켜 상청액을 얻은 다음, 2mM Ca2+와 2mM Mg2+를 함유하는 포스페이트 완충 염수(PBS)와 평형을 이룬 콘 에이 세파로즈(Con A Sepharose)와 혼합시킨다. 상기 세포들이 기계적인 전단에 의해 용균된 경우, 상청액은 콘 에이 세파로즈(Con A Sepharose)와 혼합시키기 전에 같은 부피의 2X 용균 버퍼로 희석시킨다. 그 다음, 상기 상청액은 4℃에서 2 ~ 3시간 동안 콘 에이 세파로즈(Con A Sepharose)와 결합시켜둔다. 결합하지 못한 물질은 수집하여 36시간동안 pH 7.4, l.0mM EDTA, 250mM NaCl, 1mM PMSF에 대해서 투석(3회, 매회 100 부피)시킨다. 그런 다음, 투석물은 17,000rpm(Sorvall SS34 rotor)으로 20분간 원심분리시킨다. 이 때, 얻어진 상청액은 수집하여 투석 버퍼와 평형을 이룬 Mono Q FPLC 컬럼에 적용된다. 단백질은 200mM에서 600mM NaCl의 염 구배차로 용출된다.
용출분획은 SDS-PAGE에 의해 분리되고, hsp90-펩타이드 복합체를 포함한 분획은 3G3(Affinity Bioreagents)과 같은 항-hsp90 항체를 이용한 면역블럿팅에 의해 식별된다. hsp90-펩타이드 복합체는 이러한 절차를 이용하여 명백한 균질성으로 정제될 수 있다. 일반적으로, hsp90-펩타이드 복합체 150 ~ 200㎍은 1g의 세포/조직으로부터 정제될 수 있다.
5.1.4 Gp96-펩타이드 복합체의 제조와 정제
사용될 수 있는 절차는, 예를들면 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:
종양 펠렛은 30mM 탄산수소나트륨 버퍼(pH 7.5)와 1mM PMSF로 이루어진 버퍼 3부피에 재현탁시키고, 세포들을 얼음위에서 20분간 팽윤시킨다. 그런 다음, 상기 세포 펠렛을 > 95%의 세포가 용균될 때까지 다운스 호모게나이저(호모게나이저의 적절한 틈(clearance)은 각각의 세포 타입에 따라 변경될 수 있다.)에서 파쇄시킨다.
파쇄액은 1,000g에서 10분동안 원심분리하여 파쇄되지 않은 세포들, 핵, 그리고 다른 세포 파편들을 제거한다. 이러한 원심분리 단계로부터 얻어진 상청액은 다시 100,000g에서 90분동안 원심분리시킨다. gp96-펩타이드 복합체는 100,000 펠렛으로부터 또는 상청액으로부터 정제될 수 있다.
상청액으로부터 분리된 때, 상청액은 같은 부피의 2X 용균버퍼로 희석시키고, 상청액을 2mM Ca2+와 2mM Mg2+를 함유하는 PBS로 평형을 이룬 콘 에이 세파로즈(Con A Sepharose)와 4℃에서 2 ~ 3시간 동안 혼합시킨다. 그런 다음, 상기 슬러리를 컬럼 안에 채우고, OD280이 베이스라인으로 떨어질 때까지 1X 용균버퍼로 세척한다. 그런 다음, 상기 컬럼은 2mM Ca2+와 2mM Mg2+를 포함하는 PBS에 용해된 10% α-메틸 만노사이드(α-MM) 1/3 컬럼 베드 부피로 씻어주고, 상기 컬럼을 파라필름으로 밀봉하고, 37℃에서 15분간 배양시킨다. 이어서, 상기 컬럼을 상온으로 냉각시키고, 파라필름을 컬럼의 바닥으로부터 제거한다. 5컬럼 부피의 α-MM 버퍼를 컬럼에 적용하고, 용출액을 SDS-PAGE로 분석한다. 일반적으로, 얻어진 물질은 약 60 ~ 95% 순도이지만, 이것은 세포타입과 사용된 조직-대-용균버퍼 비율에 의존한다. 그 다음, 상기 샘플은 5mM 소디움 포스페이트,pH 7과 평형을 이룬 Mono Q FPLC 컬럼(Pharmacia)에 적용된다. 단백질은 0 ~ 1M NaCl 구배차를 갖는 컬럼으로부터 용출되며, gp96 분획은 400mM과 550mM NaCl 사이에서 용출된다.
그러나, 상기 절차는 각각 또는 결합하여 사용되어지는 두개의 추가적인 단계에 의해 명백하게 균일한 gp96-펩타이드 복합체를 일관성있게 생산할 수 있도록 변형될 수 있다. 하나의 선택적인 단계는 콘 에이 정제단계 이전에 암모늄 설페이트 침전을 포함하고, 다른 선택적인 단계는 Mono Q FPLC 단계 대신에 콘 에이 정제단계 후에 DEAE-세파로즈 정제를 포함한다.
첫번째 선택적인 단계에서, 예를 들면 다음과 같은데, 100,000g 원심분리 단계에서 얻어진 상청액은 암모늄 설페이트를 추가하여 최종 농도가 50% 암모늄 설페이트가 되도록 한다. 찬물 트레이에 위치한 비이커 안의 용액을 서서히 교반하면서 암모늄 설페이트는 천천히 첨가된다. 상기 용액은 4℃에서 약 1/2 내지 12시간 동안 교반되며, 얻어진 용액은 6,000 rpm (Sorvall SS34 rotor)에서 원심분리된다. 이러한 단계에서 얻어진 상청액을 제거하고, 암모늄 설페이트 용액을 첨가하여 70% 암모늄 설페이트 포화를 만들고, 6,000 rpm (Sorvall SS34 rotor)에서 원심분리한다. 이 단계로부터 얻어진 펠렛은 수집되고, 펠렛을 세척하기 위하여 70% 암모늄 설페이트를 포함하는 PBS에 현탁된다. 이 혼합물은 6,000 rpm (Sorvall SS34 rotor)에서 원심분리되고, 펠렛은 2mM Ca2+과 Mg2+를 포함하는 PBS에 용해시킨다. 용해되지 않은 물질은 15,000 rpm (Sorvall SS34 rotor)에서 간단하게 제거된다. 그 다음, 상기 용액은 콘 에이 세파로즈와 혼합하고, 절차는 이전과 같다.
두번째 선택적인 단계에서, 예를 들면 다음과 같은데, 콘 에이 컬럼으로부터 용출된 분획을 포함하는 gp96은 수집되고, 상기 버퍼는 투석에 의해 또는 바람직하게 세파덱스 G25 컬럼상에 버퍼 교체에 의해 5mM 소디움 포스페이트 버퍼, pH 7, 300mM NaCl로 교환한다. 버퍼 교환 후, 상기 용액은, 이전에 5mM 소디움 포스페이트 버퍼, pH 7, 300mM NaCl과 평형을 이룬 DEAE-세파로즈와 혼합시킨다. 단백질 용액과 비드는 1시간동안 서서히 혼합되어 컬럼 내에 공급된다. 그런 다음, 상기 컬럼을 280nm에서의 흡광도가 베이스라인으로 떨어질 때까지 5mM 소디움 포스페이트 버퍼, pH 7, 300mM NaCl로 세척한다. 그 후, 결합된 단백질은 5mM 소디움 포스페이트 버퍼, pH 7, 700mM NaCl 5 부피로 컬럼으로부터 용출된다. 분획을 포함하는 단백질은 수집되고, 염 농도를 175mM로 낮추기 위해 5mM 소디움 포스페이트 버퍼, pH7 로 희석시킨다. 얻어진 물질은 5mM 소디움 포스페이트 버퍼, pH 7 로 평형을이룬 Mono Q FPLC 컬럼 (Pharmacia)에 적용되고, Mono Q FPLC 컬럼 (Pharmacia)에 결합된 단백질은 전술한 바와 같이 용출된다.
그러나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자가 일상적인 실험에 의해 두번째 선택적인 단계를 정제 프로토콜에 포함시키는 이익을 평가하더라도 가치가 있다. 또한, 각각의 선택적인 단계를 추가하는 이익은 출발물질의 근원에 의존한다는 것은 가치가 있다.
gp96 분획이 100,000g 펠렛으로부터 분리되는 경우, 상기 펠렛은 1% 소디움 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate)나 1% 옥틸 글루코피라노사이드(그러나, Mg2+와 Ca2+는 없이)를 포함하는 PBS 5부피에 현탁시키고, 얼음위에서 1시간 동안 배양한다. 상기 현탁액은 20,000g에서 30분간 원심분리되고, 얻어진 상청액은 수회의 PBS (역시 Mg2+와 Ca2+는 없이) 변화에 대해 투석시켜 세제를 제거한다. 투석물은 100,000g에서 90분간 원심분리시키고, 상청액을 수집하고, 칼슘과 마그네슘을 상청액에 첨가하여 최종 농도가 각각 2mM이 되게 한다. 그런 다음, 상기 샘플은 전술한 바와 같이 gp96-펩타이드 복합체를 100,000g 상청액으로부터 분리하기 위한 변형되지 않거나 혹은 변형된 방법에 의해 정제된다.
gp96-펩타이드 복합체는 이러한 절차를 이용하여 명백한 균질성을 갖도록 정제될 수 있다. 약 10 ~ 20㎍의 gp96은 1g의 세포/조직으로부터 분리될 수 있다.
gp96-펩타이드 복합체로부터 hsp를 분리하는 것은 ATP 존재 또는 낮은 pH 하에서 이루어질 수 있다. 이러한 두가지 방법은 gp96-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 용출하는데 사용될 수 있다. 첫번째 접근법은 gp96-펩타이드 복합체 제제를ATP 존재 하에서 배양하는 것을 포함한다. 다른 접근법은 gp96-펩타이드 복합체 제제를 낮은 pH 버퍼에서 배양하는 것을 포함한다. 이러한 방법들과 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 다른 어떠한 방법들은 hsp-펩타이드 복합체로부터 hsp와 펩타이드를 분리하는데 적용될 수 있다.
5.1.5 HspllO-펩타이드 복합체의 제조 및 정제
사용된 절차는 Wang etal.,2001,J. Immunol.166(1):490-7에 게재되어 있으며, 예를들면 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:
예를 들어, 종양 세포 조직과 같은 세포나 조직의 펠렛(40~60ml)은 다운스 파쇄에 의해 5 부피의 저장성 버퍼(30 mN 탄산수소 나트륨, pH7.2와 프로테아제 저해제) 내에서 파쇄된다. 파쇄액은 4,500x g와 그 다음에 100,000x g에서 2시간동안 원심분리된다. 만일 세포나 조직들이 간으로부터 기인한 것이면, 얻어진 상청액은 먼저 청색의 세파로즈 컬럼(Pharmacia)에 적용하여 알부민을 제거한다. 그렇지 않으면, 얻어진 상청액은 미리 결합 버퍼(20mM 트리스-HCI, pH 7.5; 100mM NaCl; lmM MgCl2; 1 mM CaCl2; 1 mM MnCl2; 및 15 mM 2-ME)와 평형을 이룬 콘 에이-세파로즈 컬럼 (Con A-Sepharose column, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)에 적용된다. 결합된 단백질은 15% α-D-o-메틸만노사이드(methylmannoside)(Sigma, St. Louis, MO)를 포함하는 결합 버퍼와 함께 용출된다.
콘 에이-세파로즈에 결합되지 않은 물질은 우선 20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 100 mM NaCl;및 15 mM 2-ME의 용액에 대해 투석시킨 다음, DEAE-세파로즈 컬럼에적용하고, 100 내지 500mM NaCl의 염 구배차에 의해 용출된다. hsp110을 포함하는 분획들은 모아지고, 투석되고, 20mM Tris-HCl, pH 7.5; 200 mM NaCl ;및 15 mM 2-ME와 평형을 이루는 Mono Q (Pharmacia) 10/10 컬럼에 로딩된다. 결합된 단백질은 200-500 mM NaCl 구배차와 함께 용출된다. 분획들은 Wang et al., 1999, J.Immunol. 162:3378에 기재된 바와 같이 hsp110에 대한 Ab로 면역블럿팅에 따라서 SDS-PAGE에 의해 분석된다. hsp110을 포함하는 모아진 분획들은 센트리플러스(Amicon, Beverly, MA)에 의해 농축되고, 수퍼로즈(Superose) 12 컬럼(Pharmacia)에 적용된다. 단백질은 0.2ml/min의 유속으로 40mM Tris-HCl, pH8.0; 150mM NaCl;및 15mM 2-ME에 의해 용출된다.
5.1.6 Grp-170-펩타이드의 제조 및 정제
사용될 수 있는 절차는 Wang et al.,2001,J.Immunol.166(1):490-7에 게재되어 있으며, 예를들면 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:
예를 들어, 종양 세포 조직과 같은 세포나 조직의 펠렛(40~60ml)은 다운스 파쇄에 의해 5 부피의 저장성 버퍼(30 mN 탄산수소 나트륨, pH7.2와 프로테아제 저해제) 내에서 파쇄된다. 파쇄액은 4,500x g와 그 다음에 100,000x g에서 2시간동안 원심분리된다. 만일 세포나 조직들이 간으로부터 기인한 것이면, 얻어진 상청액은 먼저 청색의 세파로즈 컬럼(Pharmacia)에 적용하여 알부민을 제거한다. 그렇지 않으면, 얻어진 상청액은 미리 결합 버퍼(20mM 트리스-HCI, pH 7.5; 100mM NaCl; lmM MgCl2; 1 mM CaCl2; 1 mM MnCl2; 및 15 mM 2-ME)와 평형을 이룬 콘 에이-세파로즈 컬럼 (Con A-Sepharose column, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)에 적용된다. 결합된 단백질은 15% α-D-o-메틸만노사이드(methylmannoside)(Sigma, St. Louis, MO)를 포함하는 결합 버퍼와 함께 용출된다.
콘 에이-세파로즈에 결합된 물질은 우선 20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 및 150 mM NaCl의 용액에 대해 투석시킨 다음, Mono Q (Pharmacia) 컬럼에 적용되어 150 내지 400 mM NaCl 구배차로 용출된다. 모아진 분획들은 농축되고, 수퍼로즈(Superose) 12 컬럼(Pharmacia)에 적용된다. 균질한 grp170을 포함하는 분획을 수집한다.
5.1.7 HSP의 재조합 발현 .
본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 방법은 hsp를 재조합하여 생산하는데 사용될 수 있다. 열 충격 단백질을 부호화하는 핵산 서열은 숙주세포 내에서 증식과 발현을 위한 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다.
본 명세서에서는 발현 구성(expression construct)은 적절한 숙주세포에서 hsp의 발현을 가능하게 하는 하나 이상 조절 영역과 실시가능하게 관계된 hsp를 부호화하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. "실시가능하게 관계된(Operably-associated)"은 조절영역과 발현되는 hsp 서열이 전사, 궁극적으로는 번역을 허용하는 방식으로 결합하고 위치되는 관계를 말한다.
hsp의 전사에 필요한 조절영역은 발현 벡터에 의해 공급될 수 있다. 또한, 번역 개시 코돈(ATG)은 같은 기원의 개시코돈이 모자란 hsp 유전자 서열이 발현되어지면 공급될 수 있다. 호환성이 있는 호스트 구성 시스템에서, RNA 폴리머레이즈와 같은 세포 전사 인자는 발현 구성상의 조절영역에 결합되어, 숙주 유기체에 변형된 hsp 서열의 전사에 영향을 미친다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역의 엄밀한성질은 숙주 세포로부터 숙주 세포로 다양할 수 있다. 일반적으로, RNA 폴리머레이즈를 결합하고 실시가능하게 관계된 핵산 서열의 전사를 촉진할 수 있는 프로모터가 필요하다. 그러한 조절 영역은 TATA 박스, 캐핑 서열, CAAT 서열 등과 같이 전사와 번역의 개시에 포함되는 5' 비암호화 서열을 포함할 수 있다. 암호화 서열에 3' 비암호화 영역은 종결인자와 폴리아데닐화 부위와 같은 전사 종료 조절 서열을 포함할 수 있다.
프로모터와 같이 조절기능을 갖는 DNA 서열을 hsp 유전자 서열에 첨가하거나, hsp 유전자 서열을 벡터의 클로닝 부위에 삽입하기 위하여, 적절한 호환성을 갖는 제한 부위를 제공하는 링커 또는 어댑터는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 기술(Wu etal., 1987, Methods in Enzymol, 152: 343-349)에 의해 cDNAs의 말단에 잡아매어질 수 있다. 제한 효소로 절단하는 것은 묶이기 전에 역으로 소화되거나 단일 사슬 DNA 말단에 채워짐에 의해 무딘 말단을 만들기 위한 변형이 뒤따를 수 있다. 선택적으로, 원하는 제한효소 부위는 원하는 제한효소 부위를 포함하는 프라이머를 갖는 PCR 의 사용에 의해 DNA의 증폭에 의한 DNA 조각으로 도입될 수 있다.
조절영역과 실시가능하게 관계된 hsp 서열을 포함하는 발현 구조는 더 이상의 복제없이 발현과 hsp-펩타이드 복합체의 생산에 적절한 숙주 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제5,580,859호를 참조하면 된다. 발현 구조는 또한 숙주세포의 게놈 내로 hsp 서열의 통합을 용이하게 하는,즉 동종의 재조합을 경유하여 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 숙주세포 내에서 hsp를 전파하고 발현하기 위하여 적절한 숙주세포에 적합한 복제 기원을 포함하는 발현벡터를 반드시 채용할 필요는 없다.
다양한 발현벡터들은 플라스미드, 코스미드(cosmid), 파지, 파지미드(phagemid)나 변형된 바이러스 등을 포함할 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 그러한 발현 벡터는 적절한 숙주세포, hsp 유전자 서열의 삽입을 위한 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 부위와 하나 이상의 선택 표지 내에서 벡터의 전파를 위한 복제의 기능적 기원을 포함한다. 발현 벡터는 박테리아, 이스트, 곤충, 포유류, 그리고 인간 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래된 호환성이 있는 숙주세포와 함께 사용되어져야 한다.
오랜 기간동안, 적절하게 가공된 hsp나 hsp-펩타이드 복합체의 높은 수율의 생산량, 포유류 세포 내에서의 안정한 발현이 바람직하다. hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체를 안정하게 발현하는 세포 라인은 선택적인 표지를 포함하는 벡터를 사용하여 처리될 수 있다. 예를 들면, 발현 구조의 도입 후에, 처리된 세포들은 영양강화 배지에서 1 ~ 2일동안 성장하게 되고난 다음, 선택적인 배지로 교체되는데, 이에 한정되지는 않는다. 발현 구조에서 선택가능한 표지는 선택에 대한 저항을 나타내며, 최적으로 세포들이 발현 구조가 그들의 염색체 내로 안정하게 통합하고 배양에서 성장하고, 세포 라인으로 확장되도록 해준다. 그러한 세포들은 hsp가 계속적으로 발현되는 동안 장기간 배양될 수 있다.
재조합형 세포들은 온도, 배양시간, 흡광도와 배지 조성의 표준 조건들 하에서 배양될 수 있다. 그러나, 재조합형 세포의 성장 조건은 hsp와 항원 단백질의 발현을 위한 조건들과는 다를 수 있다. 또한, 변형된 배양 조건과 배지는 hsp의 생산량을 향상시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 동종의 프로모터를 갖는 hsp를 함유하는 재조합형 세포들은 열이나 다른 환경 스트레스 또는 화학적 스트레스에 노출될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 어떠한 기술이라도 hsp와 hsp-펩타이드 복합체를 생산하기 위한 최적의 조건을 만들기 위하여 적용될 수 있다.
5.1.8 펩타이드 합성
재조합 기술에 의해 hsp를 생산하는 다른 방법은 펩타이드 합성이다. 예를 들면, 전체 hsp 또는 hsp 부분에 대응하는 펩타이드는 펩타이드 합성기(synthesizer)를 사용함으로써 합성될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 통상적인 펩타이드 합성이나 다른 합성 프로토콜이 사용될 수 있다.
hsp 또는 그에 해당하는 부분의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 Merrifield, 1963, J.Am. Chem.Soc., 85: 2149에 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여 고체상 펩타이드 합성에 의해 합성될 수 있다. 합성 중, 보호된 곁사슬을 갖는 N-α-보호된 아미노산은 C-말단에 의해 연결된 성장하는 폴리펩타이드 사슬에, 그리고 폴리스티렌 비드와 같은 불용성 고분자 지지체(support)에 서서히 부가된다. 펩타이드는 N-α-보호되지 않은(deprotected) 아미노산의 아미노기를 디시클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide)와 같은 시약과 반응하여 활성화된 N-α-보호된 아미노산의 α-카르복실기에 연결함으로써 합성된다. 유리 아미노기가 활성 카르복실기에 부착되는 것은 펩타이드 결합을 형성하게 한다. 가장 일반적으로 사용된 N-α-보호된기는 산에 불안정한 Boc와 염기에 불안정한 Fmoc이다. 적절한 화학, 수지, 보호기, 보호된 아미노산과 시약에 대한 세부적인 사항은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있고, 따라서 여기에서 구체적으로 설명하지 않는다. (Atherton, 외, 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press 및 Bodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2nd Ed. , Springer-Verlag 참조)
얻어진 hsp의 정제는 겔 투과, 분배 및/또는 이온교환 크로마토그래피를 이용한 prep. HPLC와 같은 통상적인 절차를 이용하여 이루어진다. 적절한 기질과 버퍼의 선택은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있으며, 따라서 여기에서 구체적으로 설명하지는 않는다.
5.2 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 결정하는 방법
본 발명에 따르면, hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈 활성은 서로 관련되어 사용될 수 있고, 따라서 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 결정한다. 본 발명의 방법은 생물학적으로 활성을 갖는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 존부를 샘플내에서 측정할 수 있다. 상기 방법은 샘플 내에 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 질량이 알려진 경우, 특정 생물학적 활성을 얻을 수 있는 것과 같이 정량적일 수 있다. hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체 샘플의 특정 생물학적 활성은 치료적 또는 예방적인 샘플의 양을 산정하는데 사용될 수 있다. 또한 특정 활성은 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체를 포함하는 샘플의 생물학적 활성을 비교하는데 사용될 수 있다. 본 방법은 젤다나마이신(geldanamycin)이나 hsp에 결합되는 뉴클레오티드의 다른 특정 저해제(예를들면, 아데노신 유사체 5'-N-에틸카르복스아미도(ethylcarboaxamido)-아데노신(NECA))의 존재 하에서 에이티피에이즈 활성을 결정하는 것을 더 포함한다. 여기에서, 젤다나마이신 또는 결합하는 뉴클레오티드의 다른 특정 저해제의 존재에 의해 저해되는 에이티피에이즈 활성은 생물학적 활성과 관련이 있다. 이러한 단계는 다른 유형의 에이티피에이즈가 샘플내에 존재할 수 있는 경우에 특히 유용하다.
에이티피에이즈의 활성을 측정하는 어떠한 방법도 사용될 수 있다. 제한없는 예는, 발광효소에 근거한 측정과 같이, 그러나 이에 제한되지는 않으며, ATP, ADP 및/또는 AMP의 발생 또는 소비를 포함하는 효소 반응과 이온 교환 크로마토그래피와 같이, 그러나 이에 제한되지는 않으며, ATP, ADP, AMP 및/또는 무기 포스페이트의 농도 및/또는 양을 측정하는 방법을 포함한다.
하나의 특별한 실시예에서, 바이오루미네센스 ATP 측정이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 측정은 다음과 같이 실행될 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다:
단백질 샘플은 밀리포어 바이오맥스(Millipore BIOMAX) 스핀 컬럼(10 Kda MWCO)을 사용하여 500 ㎍/ml의 단백질 농도로 농축된다. Gp96(1㎍)은 20% DMSO 또는 특정 저해제 젤다나마이신 400μM을 포함하는 20% DMSO를 포함하는 ATP (10-30 배 몰 초과) 용액과 혼합한다. 그 다음, 혼합물은37℃에서 4시간동안 배양된다. 그 후에, 개별적인 샘플은 PBS로 100μL로 희석된다. 각 샘플의 50μL에 포함된 ATP는Molecular Devices Lmax 루미노미터와 ROCHE CLII bioluminescence 키트를 이용하여 ATP 표준 곡선과 비교함으로써 정량된다. DMSO와 DMSO/젤다나마이신 측정 사이에 ATP 농도에서의 차이는 gp96에 대한 특정 ATP 가수분해 양을 나타낸다. 다른 방법으로서, 젤다나마이신은 이 측정에서 NECA로 대체될 수 있다.
다른 실시예로서, 이온 교환 크로마토그래피 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 이 측정은 다음과 같이 실행될 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다:
~5mg/mL에서 gp96 샘플은 PBS 내에서 5 mM MgCl2와 25 mM KCL 존재하에 37℃에서 ATP의 10X 몰비로 배양된다. 약수는 다양한 시간 포인트에서 얻어지고, 남은 ATP는 이온교환 HPLC 시스템을 이용하여 결정된다. 젤다나마이신 저해 실험에서, 젤다나마이신은 ATP에 대해 1:1, 2:1, 5:1, 및 10: 1인 비율로 혼합물에 첨가된다. 약수는 ATP 분석을 위한 다양한 시간 포인트에서 얻어진다. 카제인 키나제(casein kinase) II에 의한 ATP 가수분해는 다음과 같은 조건하에서 측정되었다:
0.5 U/mL 카제인 키나제II는 젤다나마이신과 함께 또는 젤다나마이신 없이(젤다나마이신은 ATP에 대해 1:1, 1:2, 1:5, 및 1:10인 비율) 20㎍/mL ATP, 2mg/mL 카제인과 혼합시키고, 37℃에서 10mM MgCl2, 130mM KCL 및 5mM DTT를 포함하는 40mM HEPES 내에서 배양된다. 약수는 다양한 시간 포인트에서 얻어지고, ATP 농도를 위해 분석된다.
ATP 농도는 Partisil SAX 컬럼 (2.1 x 250 mm, 10㎛, Alltech)를 이용하여 이온 교환 HPLC에 의해 측정되고, 용출은 0.3-1 M 암모늄 포스페이트 선 구배차를 이용하여 0.25 mL/min에서 25분간 이루어진다. 모든 크로마토그래피는 215nm에서흡광도가 측정되는 Waters Alliance HPLC 시스템에서 이루어졌다. ATP는 ADP와 AMP로부터 완전하게 분리되며, ATP 표준 곡선을 이용하여 봉우리 면적에 근거하여 정량화 된다. gp96에 대한 특정 에이티피에이즈 활성은 gp96 단백질의 mg당 시간당 가수분해된 ATP의 양(nmol/mg/hr)으로 표현된다. 카제인 키나아제 II에 대한 특정 에이티피에이즈 활성은 단백질의 유니트당 시간당 가수분해된 ATP의 양(nmol/U/hr)으로 표현된다. 모든 속도치는 gp96이나 카제인 키나아제 II 없이 ATP만을 포함하는 샘플에 대해 결정된 것처럼 배경(background) 가수분해에 대해 정정된다.
또한, 에이티피에이즈 활성은 면역친화 스트립핑 기술을 이용하여 측정될 수 있는데, [γ-32P]-표지된 ATP와 박막 크로마토그래피를 이용하며, 예를 들면 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다.(Li and Srivastava (1993) EMBO J. 12: 3143; Wearsch and Nicchitta (1997)J. Biol.Chem. 272: 5152):
일반적으로, 1㎍의 정제된 gp96이나 hsp 70은 20μM [γ-32P] ATP와 함께 20mM HEPES, pH 7.2, 20mM NaCL 및 2mM MgCl2를 포함하는 20㎕의 반응부피에서 37℃에서 1시간동안 배양된다. 그 다음, 1㎕의 반응 혼합물은 폴리에틸렌이민(PEI) 셀룰로오스 판 위에 점을 찍는다. 박막 크로마토그래피는 1M LiCl과 1M HCOOH를 1:1 비율로 하여 수행된다. 그 후, 상기 판을 건조시키고, 필름에 노출시키고, 대응되는 방사성 점을 잘라내고 산출한다. 에이티피에이즈 활성은 [γ-32P] ATP로부터 생성된 [α-32P] ADP와 [α-32P] AMP로부터 결정되는데, 다시 말하면 [ADP + AMP]/[ATP + AMP + ADP] x 100%으로 계산하여 가수분해된 ATP의 백분율을 구한다. 정제된 gp96 또는 hsp70이 부족한 배경 ATP 가수분해는 공제된다.
또한, 에이티피에이즈 활성은 HPLC를 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면 다음과 같으며, 이에 한정되는 것은 아니다:
Gp96(2㎍ ; 200 ㎍/ml in PBS)은 ATP (160 μM), 10mM MgCl2 및 20% DMSO를 포함하는 같은 부피의 PBS에 첨가된다. 대조 실험에서, DMSO에 용해된 젤다나마이신(160μM)은 단독의 DMSO를 대신한다. 샘플은 혼합되고 37℃에서 4시간동안 배양된다. 이 후에, 80㎕의 100mM KH2PO4 (pH 4.0)가 첨가되어 반응이 종료되고, 샘플은 주입을 위하여 HPLC 자동 샘플러 내에 로딩된다. ADP는 1% 아세토니트릴을 포함하는 60 mM KH2PO4 (pH 6.0)과 평형을 이룬 Aquasil C18 column (250 mm x 4.6 mm)을 이용하여 ATP로부터 분리된다. 유속은 0.5 ml/min이다. ADP의 양은 자동화된 봉우리 적분(peak integration)과 ADP 표준 곡선에 대한 비교 후에 정량화 된다.
또한, 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진방사성 동위원소 측정은 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈 활성을 결정하는데 사용될 수 있다.
5.3 사이즈에 의해 올리고머 구조를 결정하는 방법
본 발명에 따르면, hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 올리고머 구조는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물할적 활성을 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 샘플 내에 생물학적으로 활성이 있는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의존부를 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 샘플내에 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 질량이 알려져 있는 경우, 특정 생물학적 활성이 얻어질 수 있는 것처럼 정량적일 수 있다. hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체 샘플의 특정 생물학적 활성은 치료상 또는 예방상 샘플 양을 산출하는데 사용될 수 있다. 또한, 특정 활성은 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체를 포함하는 샘플의 생물학적 활성을 비교하는데 사용될 수 있다.
올리고머 구조의 존재를 검출하거나 측정하기 위한 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 어떠한 방법도 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 hsp와 함께 사용되고자 한다. 또한, 올리고머화 공정을 모니터하는 방법도 사용될 수 있다.
하나의 특별한 실시예에서, 크기 배제 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 절차는 예를 들면, Chadli etal., (1999)J. Biol.Chem. 274: 4133-4139에 기술되어 있으며, 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:
FPLC시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하는 크기배제 크로마토그래피는 4℃에서 50mM Tris-HCL, pH 8.65와 평형을 이룬 수퍼로즈(Superose)6 또는 수퍼로즈 12 10/30 컬럼 상에서 이루어진다. 용출은 0.2 ml/min의 유속에서 같은 버퍼를 이용하여 행해진다. 용출된 단백질은 280nm에서 UV 흡광도에 의해 검출된다. 컬럼은 고 및 저 분자량 교정 키트(Amersham Pharmacia Biotech)로 교정된다. 사용된 표준은 티로글로불린(thyroglobulin)(669 kDa), 페리틴(ferritin) (440 kDa), 카탈라제(catalase) (232 kDa), 알도라제(aldolase) (158 kDa), 보빈 세럼 알부민(bovine serum albumin) (67 kDa) 및 키모드립시노겐( chymotrypsinogen)(25kDa)이다. 청색 덱스트란과 포타슘 바이크로메이트는 공백 부피와 전체 부피를 각각 결정하는데 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, SDS와 Native PAGE가 사용될 수 있다. 절차는 예를 들면, Chadli etal., (1999)J. Biol.Chem. 274: 4133-4139에 기술되어 있으며, 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:
SDS와 Native PAGE와 은 염색은 파스트(Phast) 시스템 (Amersham Pharmacia Biotech)에서 수행된다. 분자량 교정 키트(Amersham Pharmacia Biotech)는 포스포릴라제 비(phosphorylase b) (94 kDa), 보빈 세럼 알부민(bovine serum albumin) (67 kDa), 오브알부민(ovalubumin) (43 kDa), 카르보닉 안하이드라제(carbonic anhydrase) (30 kDa), 소이빈 트립신 저해제(soybean trypsin inhibitor) (20 kDa) 및 α-락트알부민(α-lactalbumin) (14.4 kDa)를 포함한다.
Native PAGE는 4℃에서 멀티포어 II(Multipore II) (Amersham Pharmacia Biotech) 상에서 10% 폴리아크릴아미드 클린 겔, 375 mM 트리스 버퍼, pH 8.9를 이용하여 이루어진다. 티로글로불린(thyrglobulin) (669 kDa), 페리틴(ferritin) (440 kDa), 카탈라제(catalase) (232 kDa), 락테이트 디하이드로제나아제(lactate dehygrogenase) (140 kDa) 및 보빈 세럼 알부민(bovine serum albumin) (67 kDa)을 포함하는 교정 키트(Amersham Pharmacia Biotech)는 제조자의 권장에 따라 단백질의 겉보기 분자 질량을 측정하는데 사용된다. 은 염색된 밴드의 스캐닝은 바이오-이미지 소프트웨어(Millipore)를 이용하여 옴니 미디어 스캐너 장치 상에서 이루어진다.
네이티브(native) PAGE에서 분해된 hsp 샘플은 니트로셀룰로오스로 전기이동된다(electrotransfered). 공기-건조된 필터는 PBS, 0.05% Tween 20 (PBST)에서 10% 탈지 분유 내에서 2시간동안 배양되고, PBST로 세척되고, 2시간동안 항-hsp90 항체 Ab119 (37) (1: 4000) 또는 d7α(28) (1: 4000)와 함께 배양되고, PBST로 세척되고, 1시간 동안 항토끼(anti-rabbit) 또는 항쥐(anti-mouse) 항체와 배양되고, PBST로 세척되고, ECL (Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 드러난다.
다른 실시예에서, 겔 여과 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 절차는 예를 들면, Wearsch and Nicchitta (1996)Biochem.35: 16760-9에 기술되어 있으며, 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:
TSK-GEL g3000 SW 분석 겔 여과 컬럼(Tosohaus, Montgomeryville, PA)은 PBS(phosphate buffered saline) 또는 버퍼A(110 mM KOAc, 25nM K-HEPES, pH 7.2, 20 mM NaCl, 1 mM Mg(OAc)2, 0.1 mM CaCl2)에서 평형을 이루게 된다. 125㎕의 부피에서 샘플은 유속 0.6 mL/min으로 컬럼에 주입된다. 0.5 mL의 분획이 모아지고 SDS-PAGE에 의해 분석된다. 각 샘플에 대한 스트로크 반경(Stokes radius, Rs)은 표준(티로글로불린, Rs = 8.5nm, 660 kDa; 아포페리틴,Rs= 3.5nm, 66 kDa; 오브알부민,Rs = 3.1nm, 43 kDa)과 비교에 의해 결정된다. 표시되는 곳에서, 분석에 앞서, grp94는 45분간 상온에서 125㎕의 버퍼A 또는 1 x PBS 내에서 4 mM Zwittergent 3-12와 함께 배양된다.
또 다른 실시예에서, 2차원 전기영동법이 사용될 수 있다. 절차는 예를 들면, Wearsch and Nicchitta (1996) Prot. Exp. Pur.7:114-121에 기술되어 있으며,다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:
첫번째 (비감소) 차원에서, 샘플은 0.5 M 트리스, 5% SDS, 0.01% 브로모페놀 블루에 놓여지고, 55℃에서 10분간 가열된다. 정제된 grp94의 1㎍ 샘플 두개를 준비하는데, 하나는 샘플 버퍼내에 50 mM DTT를 포함한다. 5 마이크로그램의 고분자량 표준과 IgG가 대조로서 포함된다. 샘플은 모세관 내에 투입된 7.5% 겔 상에 로딩되고, Mini-Protean II 2-D Cell (Bio-Rad)에서 200V에서 이동한다. 튜브 겔은 추출되고, 0.5 M 트리스, 5% SDS, 0.1 M DTT에서 15분간 55℃에서 배양되고, 7.5% 준비한 슬랩 겔(preparative slab gel)상에 덮어지고, 두번째 차원에서 이동된다. 단백질은 쿠마시(Coomasie) 푸른 염색에 의해 보여진다.
또한, 침전속도는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 멀티머 구조를 결정하는데 사용될 수 있다. 다음의 측정은, 예를 들면, Wearsch and Nicchitta (1996)Biochem.35 : 16760-9에 의해 행해졌으며, 이에 한정되는 것은 아니다:
침전지수의 결정을 위해서, 샘플은 알려진 표준과 병행하여 수크로오스 구배차에서 분석된다. Native grp94, 엘라스타제-소화(elastase-digested) grp94, 및 시험관내 합성된 grp94-ΔC (구조 조제 참조)는 버퍼A로 보충된 15~30% 수크로오스 구배차에서 분석된다. 시험관내 합성된 grp94-Cexp 번역 결과물과 grp94-MBP 융합 단백질은 PBS로 보충된 10~25% 수크로오스 구배차에서 분석된다. 11.5 mL의 구배차는 Auto Densi-Flow IIc (Buchler Instruments, Lenexa, KS)로 제조되고 수집된다. 200㎕ 부피에서 샘플은 구배차에 로딩되고, Beckman SW41 rotor에서 40,000 rpm, 20시간동안 상온에서 원심분리된다. 카탈라제(Catalase) (11.3 S), 이스트 알콜 탈수소효소(yeast alcohol dehydrogenase) (7.4 S), BSA (4.3 S), 오브알부민(ovalbumin) (3.5 S), 및 키모트립시노겐 A(chymotrypsinogen A) (2.6 S)가 표준으로 사용된다. 0.5 mL의 분획이 구배차로부터 모아지고, SDS-PAGE (grp94 샘플) 또는 280 nm에서의 흡광도 (단백질 표준)에 의해 분석된다.
질량 분광법은 gp96 및/또는 gp 96 복합체의 올리고머 구조를 결정하기 위해 본 발명이 속하는 기술분야에서 누구에 의해서라도 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 예를 들어, 필터는 gp96 다이머 및/또는 gp96 복합체 다이머의 존재 및/또는 양을 결정하는데 사용될 수 있는데, 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 실시예에서, 그러한 필터는 분자량 차단 필터인데, 더 큰 분자는 잡아주는 동안에 소정 크기의 분자를 통과하도록 해준다.
본 발명의 다른 실시예는 gp96 및/또는 gp96 복합체의 올리고머 형태의 존재 또는 농도를 결정하기 위하여 광 산란 측정을 이용한다.
또 다른 실시예에서, gp96 다이머 및/또는 gp96 복합체의 다이머의 존재 또는 양을 결정하기 위하여 분석용 초원심분리법이 사용된다. 이 기술은 숙련된 기술자에게 잘 알려져있다.
다른 실시예에서, gp96 다이머 및/또는 gp96 복합체의 다이머의 존재 또는 양을 결정하기 위하여 구배 원심분리법이 사용된다. 이 기술은 숙련된 기술자에게 잘 알려져있다.
5.4 생물학적 활성을 결정하는 방법
본 발명에 따르면, hsp 및/또는 hsp-펩타이드 복합체의 올리고머 구조 또는 에이티피에이즈 활성은 hsp 및/또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물학적인 활성을 검출하거나 측정하기 위한 대리로서 사용될 수 있다. 특히 관심있는 hsp 및/또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물학적인 활성은 면역 활성, 예를 들면 펩타이드 항원에서 항원 전달 세포로 프리젠테이션(항원 재프리젠테이션)과 T세포 활성화; 생물학적 반응 조절물질의 생산 유도, 사이토카인과 같은 것이 있는데, 이에 한정되는 것은 아니며, 예를 들면 인간 매크로파지 화학유인물질 단백질-1(MCP-1), 및 니트릭 옥사이드(NO); CD91 (alpha-2-macroglobulin receptor, α2MR) 및/또는 CD36과 같은 수용체에 결합; 그리고 동물에서 종양의 퇴행을 유발하는 능력, 종양 동물의 생존을 연장하는 것과 감염을 제거하는 것을 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 생물학적 활성은 생체내 및/또는 시험관내에서 일어나거나 관찰될 수 있다.
hsp가 펩타이드에 결합하는 능력은 명백하지만, 이러한 펩타이드 로딩 메카니즘은 잘 이해되어지지 않는다. gp96은 시토졸(cytosol) 그물내에세 발견된 단백질이고, 시험관내와 생체내에 뚜렷한 아미노산 특이성 없이 다수의 펩타이드를 결합한다. 사실, gp96이 면역 반응에서 역할을 하기 위해서는 펩타이드가 먼저 hsp에 결합되어야 한다(Sastry and Linderoth (1999) J. Biol.Chem. 274: 12023-12035).
Sastry and Linderoth (supra)는 펩타이드가 gp96에 결합되는 것을 검출하기 위한 측정법을 기술하였다. 간단하게, 펩타이드-파이렌(pyrene)은 10분간 상온에서, 저 염 버퍼(20 mM HEPES, pH 7.9, 20mM NaCl,2mM MgCl2)에서 몰 과량의 gp96과 함께 배양된다. 혼합물은 분자량 70,000의 차단막을 이용하여 2시간 동안 투석되어, 결합되지 않은 펩타이드-파이렌가 제거된다. 리텐테이트(retentate)의 형광은 340nm에서 여기됨에 의해 측정된다. 이 파장에서, 단백질 발색단(Trp과 Tyr)은 UV 광을 흡수하지 않고, 단지 파이렌만 여기된다.
hsp에 의한 항원 펩타이드의 재프리젠테이션(Re-presentation)은 중요한 또 다른 생물학적 활성이다. 본 발명자들은 gp96의 다이머 구조의 손실이 그것의 항원 재프리젠테이션 활성과 관련이 있다는 것을 밝혀내었다. gp96 복합체 펩타이드에 특이한 RAW264.7 APCs 및 CTLs에 의해 매개된 면역 반응은 CTLs에 의해 분비된 IFN-γ 레벨에 의해 측정되었다. IFN-γ는 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적인 면역 상태의 지표로 알려져 있는 사이토카인이고; 또한, 종양 인지와 거부에 있어서 중요한 역할을 한다. 응집된 gp96은 IFN-γ의 분비를 자극할 수 없는 반면, 다이머 gp96은 용량의존 방식(dose-dependent manner)으로 IFN-γ의 분비를 자극할 수 있었다. 재프리젠테이션 측정은 예로서 8장에 기술되어 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체와 함께 전달됨에 대하여, 항원전달 세포는 MCP-1를 분비하고 NO를 생산한다. MCP-1은 혈액 단핵세포와 조직 매크로파지의 염증반응에 중요한 역할을 한다. 또한, NO는 면역 반응에 중요한 조정자라는 것이 밝혀졌다(Wei et al., (1995) Nature 375: 408-411).
CD91/α2M 수용체는 열 충격 단백질에 대한 세포 표면 수용체이다. CD91/α2M 수용체는 다양한 리간드의 엔도시토시스에서 중요한 역할을 한다. α2M에 추가하여, α2MR의 다른 리간드는 지질단백질-펩타이드 복합체, 락토페린, 조직타입 플라스미노겐 활성제(tPA), 유로키나제-타입 플라스미노겐 활성제(uPA) 및 외독소를 포함한다. 따라서, α2M 수용체는 엔도시토시스, 항원 전달, 콜레스테롤 조절, ApoE를 포함하는 지질단백질 청소 및 킬로미크론(chylomicron) 잔여물 제거를 포함하는 다양한 세포 과정에서 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 방법은 CD91/α2M 수용체에 결합되거나 다른 분자의 결합을 방해하는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 검출이나 측정을 가능하게 한다.
또한, CD36은 열 충격 단백질에 대한 수용체로서 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. CD36은 B 계층 청소 수용체 족의 일원이고, 주로 모세관 내피세포, 유방 분비 상피세포, 분화 지방세포, B 세포, 매크로파지 및 여러 타입의 종양세포에서 발현된다. CD36은 혈소판 부착과 응집, 아포프토틱(apoptotic) 세포의 포식작용, 긴 사슬 지방산의 물질대사에서 역할을 한다고 믿어진다. 특히, 열 충격 단백질 gp96은 CD36과 결합되고, 이러한 세포 내에서 나이트릭 옥사이드와 키모카인(chemokine)의 생산을 촉진한다는 것이 밝혀졌다.(Panjwani et. al., 2000, Cell Stress & Chaperones 5 (4): 373-397 ; U.S. Provisional Application No.60/238865, filed on October 6,2000). 따라서, 본 발명의 방법은 결합하거나 도는 다른 분자들이 CD36에 결합하는 것을 막아주는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 능력을 검출 또는 측정할 수 있게 할 수 있다.
5.5 품질관리와 표준화에서의 이용
본 발명에 따라, hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 올리고머 구조 또는 에이티리에이즈 활성은 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 샘플내에서 생물학적 활성이 있는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 존부를 검출하는데 사용될 수 있다. 본 방법은 샘플에서 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 질량이 알려진 경우, 특정 생물학적 활성을 얻을 수 있는 것을 정량할 수 있다. hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체 샘플의 특정 생물학적 활성은 치료적 또는 예방적인 샘플양을 산출하는데 사용될 수 있다. 또한, 특정 활성은 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체를 포함하는 샘플의 생물학적 활성을 비교하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 공업적인 생산과 저장하는 동안 hsp-펩타이드 복합체 제제의 품질관리에 사용될 수 있다. hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체 제제의 품질 측면은 그 특정 활성과 관련될 수 있는 제제의 효능; 저장 요건, 저장 역사와 효능에 대한 그것의 충격에 관련하는 제제의 안정성을 포함한다. 또한, 본 발명의 방법은 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 주어진 제제로부터 얻어질 수 있는 용량 수를, 특히, hsp-펩타이드 복합체의 환자-특이 제제에 비추어, 결정하거나 예측하는데 사용될 수 있다.
hsp와 그것의 복합체들은 많은 상업적인 용도를 갖고 있다. 암과 감염성 질환의 치료와 예방을 위한 hsp-펩타이드 복합체의 용도는 미국특허 제6,030, 618호; 제5,935, 576호; 제5,750, 119호; 제5,961,979호 ; 제6,048, 530호; 제5,837, 251호; 및 제6,017, 540호에 기술되어 있다. 시험관내 입양면역요법에서 사용을 위한 항원 전달 세포를 민감화하는 스트레스 단백질-항원 복합체의 용도는 PCT 공개 WO97/10002 (1997.3.20) (또한, 미국특허 제5,985,270호, 1999.11.16 참조)에 기술되어 있다. 또한, 본 발명의 방법은 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체를 포함하는 제형과 치료 효능을 향상시키기 위한 방법에 유용한데, 미국 가출원 제60/232,779호; 및 미국특허출원 제09/693,643호에 기재된 바와 같으며, 각각의 인용문헌은 인용에 의해서 그대로 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 방법은 상대적으로 비싸고 다루기 어려운 5.5장에 기재된 생물학적 측정을 대체할 수 있다. 본 발명의 방법은 제조 공정에서 조절 요구에 따른 순응도를 감시하는데 사용될 수 있다.
5.6 진단과 예후에서의 용도
한 실시예에서, 본 발명은 부분적으로 대상의 면역 시스템의 기능에 기인한 대상(subject)에서 조건을 진단하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈 활성이나 상기 대상으로부터 얻어진 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 존재가 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성과 관련됨을 포함한다. 생물학적 활성은 대상 내에서 하나 이상의 면역 기능과 관련이 있기 때문에. 에이티피에이즈 활성이나 다이머 형태의 양의 변화가 조건의 변화를 나타낸다. 본 발명의 방법은 면역 시스템의 건강의 일반적인 상태, 면역 시스템의 테논-항원 특정 측면(thenon-antigenic specific aspects) 및/또는 대상의 면역 반응도를 감시하는 편리한 방법을 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 대상에서 암이나 감염성 질환의 예후를 결정하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈 활성이나 상기 대상으로부터 얻어진 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 존재가 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성과 관련됨을 포함한다. 여기에서, 생물학적 활성은 암 세포나 감염성 질환을 유발하는 인자에 반응하거나 목표로 하는 하나이상의 면역 기능과 관련이 있다. 이러한 면역 반응은 특정 및 비특정 측면 모두에서 작동세포 기능 뿐만 아니라, 항원 전달, 항원에 대한 반응 증폭과 관련된다. 따라서, 에이티피에이즈 활성 또는 다이머 형태의 양의 변화는 예후의 변화를 나타낸다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 암 또는 감염성 질환의 예후는 에이티피에이즈 활성 및/또는 대상으로부터 암 세포 또는 감염세포로부터 분리된 hsp 및/또는 hsp-펩타이드 복합체의 멀티메릭 구조를 측정함으로써 확립될 수 있다. 그러한 세포들로부터 생산된 hsp 및/또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물학적 활성은 암 세포또는 감염세포의 생체내 면역원성을 반영하며, 암 또는 감염성 질환의 예후를 제공하는데 사용될 수 있다.
다양한 실시예에서, 또한 본 발명의 방법은 백신, 화학요법, 방사 또는 면역요법과 같은 치료를 받은 후에 대상의 감염상태를 감시하는데 사용될 수 있다.
5.7 HSP와 Hsp-펩타이드 복합체ES의 생물활성 조절
또 다른 실시예에서, 본 발명은 열 충격 단백질과 그들의 복합체의 생물학적 활성을 조절하는 방법을 제공하는데, 열 충격 단백질과 복합체가 에이티피에이즈 활성이나 열 충격 단백질과 복합체의 올리고머화를 조절하는 화합물과 접촉하는 것을 포함한다. 그러한 화합물은 대상의 면역 기능을 조절하는데 사용될 수 있고, 하기하는 바와 같이 본 발명의 방법에 의해 확인될 수 있다.
hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물활성의 조절은 면역결핍 상태(면역억제제, 화학요법 및 방사선 노출의 용도 같은것으로, 이에 한정되지는 않는다.) 또는 지나친 면역 시스템과 관련된 상태(알러지, 이식거부, 자가면역 질환과 같은 것으로, 이에 한정되지는 않는다)를 치료하는데 사용될 수 있다.
5.8 약물 선별
또한, 본 발명은 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 조절하는 치료제를 선별하는데 사용될수 있다. 하나의 실시예에서, 약물은 그것을 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체를 포함하는 조성물과 접촉시킨 후, 조성물 내에서 에이티피에이즈 활성이나 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 다이머화를 결정함으로써 선별될 수 있다.
비접촉(uncontacted) 조성물에 비하여 에이티피에이즈 활성이나 다이머의 증가는 생물학적 활성을 증가시키는 치료제로서 시험 화합물을 확인할 것이다.
비접촉 조성물에 비하여 에이티피에이즈나 다이머의 감소는 생물학적 활성을 감소시키는 치료제로서 시험 화합물을 확인할 것이다.
치료제의 예로서는 펩타이드, 작은 분자, 펩타이드 유사물, 항체, 지질, 탄수화물, 젤다나마이신 유사물(예를 들면, 17-알릴-아미노-젤다나마이신)을 포함하는 항생제; 및 뉴클레오티드 유사물(Rosser et al., J. Bio. Chem. 2000,275 : 22789 참조)을 포함하며, 이에 한정되지는 않는다.
또한 치료제는 그들이 hsp의 생물활성을 증가 혹은 감소시키는 약물이나 환경적인 요인에 대한 hsp의 저항성을 증가 혹은 감소시키는지 알아보기 위해서 시험될 수 있다. 이러한 실시예는 먼저 에이티피에이즈 활성이나 다이머의 검출에 의해 조성물내에서 hsp의 생물활성을 측정하고, 두번째, 선별된 약물과 hsp를 포함하는 조성물을 접촉시킨 다음, 생물학적 활성을 다시 측정하고, 마지막으로 조성물과 약물을 접촉하거나 본 발명이 속하는 기술분야에서 생물학적 활성을 저해하거나 촉진하는 것으로 알려진 환경 요인, 예를 들어 pH 또는 온도를 변경시키고, 그 다음에 세번째로 생물학적 활성을 측정하는 것을 포함한다. 이러한 방법으로, 알려진 hsp 생물학적 활성의 저해제 또는 촉진제의 효과를 증가 또는 감소시킴으로써 선별된 약물이 hsp의 생물학적 활성을 조절할 수 있는지가 결정될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 hsp 생물학적 활성을 조절하는 방법을 선별하는데 사용될 수 있다. 화합물을 첨가하고 hsp-펩타이드 복합체를 포함하는 조성물로부터 제거시킬 수 있는데, 화합물 첨가 전 후에 hsp-펩타이드 복합체의 생물 활성을 측정한다. 첨가되거나 조성물로부터 제거될 수 있는 화합물은 이온, 산, 염기, 염, 금속, 기체, 액체, 고체, 효소, 단백질, 지질, 탄수화물, 펩타이드 및 뉴클레오티드를 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 화합물들은 본 발명이 속하는기술 분야에서 hsp- 펩타이드 복합체의 생물활성을 증가 혹은 감소시키는 것으로 알려진 약물이나 환경적인 요인에 대한 hsp-펩타이드 복합체의 저항성을 그들이 증가 또는 감소시키는지 결정하기 위해서 시험될 수 있다.
5.9 생물학적 활성을 결정하기 위한 키트
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법 및/또는 치료요법을 실행하기 위한 키트를 제공한다. 하나의 실시예는, 예를 들어, 양성 대조군(control)으로서 알려진 특정 활성의 hsp와 hsp-펩타이드 복합체의 용기, ATP 용기 및 젤다나마이신 용기를 포함하는 키트일 것인데, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 실시예는, 예를 들어, 양성 대조군으로서 알려진 특정 활성의 hsp와 hsp-펩타이드 복합체의 용기, 및 gp96에 대해 입체형태-특정 항체를 포함하는 키트일 것인데, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 실시예에서, 예를 들어, 양성 대조군으로서 알려진 특정 활성의 hsp와 hsp-펩타이드 복합체의 용기, 및 분자량 차단 필터를 포함하는 키트인데, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 키트에는 열 충격 단백질이나 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈 활성이나 다이머 형태의 양을 결정하기 위한 사용설명서(instruction)가 포함된다.
5.10 재조합형 HSP의 합리적 설계
본 발명의 방법은 또한 증가 혹은 감소된 생물활성에 대해 hsp 변형들을 선별하는데 사용될 수 있다. 변형은 돌연변이, 이상 용이 PCR(error prone PCR), 유전자 끌림(gene shuffling)을 포함하는 DNA 재조합 기술을 이용하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련자에 의해 만들어질 수 있다. 일단 재조합형 hsp가 얻어지면, 재조합 hsp와 복합체는 본 발명의 방법을 이용하여 생물활성에 대해 측정될 수 있다.
5.11 hsp에 대한 입체형태-특정 항체
또 다른 실시예에서, 본 발명은, 예를 들어, 재조합 항체, 조각 및 그들의 유도체를 포함하되 이에 한정되지는 않는 입체형태-특정 다클론 또는 모노클론 항체를 이용함으로써 hsp의 올리고머 형태나 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 특정 입체형태의 검출하는 방법을 제공한다. 하나의 실시예에서, 그러한 항체들은 예를 들면, 다이머 형태와 같은 특별한 입체형태의 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체와 단지 결합하고, hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 다른 형태와 결합하지 않는다. 결합된 항체들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 기술, 예를 들어 ELISA에 의해 정량될 수 있다. 구체적인 실시예에서, 항체는 모노머 및 올리고머(다이머가 아님) hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체와 결합하는데, 다이머 형태와 결합하지는 않는다. 또 다른 실시예에서, 항체는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 모노머 형태에서 존재하는 에피토프와 결합한다. 여기에서, 상기 에피토프는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체가 올리고머화되거나 다이머화되는 경우에 표시된다.
특정 입체형태인 다클론 및/또는 모노클론 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 기술에 의해 만들어질 수 있다. 이 예에서, 항체는 측정되는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체의 다이머 형태에 특이하다.
입체형태-특정 항체는 또한 생물학적 활성을 나타내는 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체를 분리하거나 농축하는데 사용될 수 있다. 친화 정제(affinity purification)와 같이 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 어떠한 방법도 사용될 수 있다. 이것은 고 효능의 hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체를 포함하는 조성물을 제조할 수 있다.
hsp 또는 hsp-펩타이드 복합체에서 입체형태의 변화를 검출하기 위해 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 어떠한 방법이라도 사용될 수 있는데, 예를 들면 자체 형광(intrinsic fluorescence), 원편광 2색성 분광분석(circular dichroism), 열량측정법(calorimetry) 또는 단백질 입체형태가 다른 결합 리간드를 결정하는 측정법이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
5.12 항원 분자
다음의 일부는 본 발명의 hsp-펩타이드 복합체의 항원/면역원 구성요소로서 유용한 펩타이드의 개요와 그러한 펩타이드가, 예를 들어, 시험관내에 hsp와 항원 분자의 복합을 위한 펩타이드의 재조합 발현에서 사용을 위해 어떻게 식별될 수 있는가를 제공한다. 그러나, 본 발명의 실시에서, hsp/펩타이드-복합체의 항원 분자(들)의 식별은 알려질 필요가 없다. 예를 들어, hsp/펩타이드-복합체가 암 세포나 병원체로 감염된 조직으로부터 직접 복합체의 모집단이 정제될 수 있는 경우이다.
하나의 실시예에서, 항원 펩타이드는 암 세포나 감염질환을 유발하는 병원체 또는 감염된 인자에 의해 감염된 세포로부터 유래할 수 있다. 병원체나 감염된 인자의 예로서는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 원생 동물, 기생충 등 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게, 병원체들은 인간을 전염시키는 것이다. 항원 펩타이드는 암세포, 감염된 세포 또는 암세포, 감염세포 또는 바이러스 입자를 포함하는 병원체와 항원 결정인자를 공유하거나 비슷한 항원성을 나타내는 항원 세포로부터 얻어진 단백질(예를 들면, 시토졸 및/ 또는 막-유래 단백질)의 단백질 분해 소화에 의해 생성될 수 있다. 항원 펩타이드는 또한 단백질을 ATP, 구아디니듐 하이드로클로라이드(guanidium hydrochloride) 및/또는 산에 노출시킴으로써 생성될 수도 있다. 항원 펩타이드는 또한 감염성 질환을 유발하는 인자(병원체) 또는 그러한 인자의 변이의 항원성을 나타내는 항원세포로부터 생성될 수도 있다.
전체 암 세포들, 감염된 세포들이나 다른 항원 세포들은 본 발명에서 사용되므로, 본 방법을 사용하기 이전에 이러한 항원 펩타이드의 정체를 분리하거나 특징짓거나 심지어 알 필요도 없다. 항원세포의 근원은 항원이 관계되는 질명의 성질에 의존하여 선택되어질 수 있다. 본 발명에 따른 하나의 실시예에서, 많은 위치에 전이된 암을 포함하는 암으로부터 분리된 어떠한 조직 또는 세포들도 본 방법에서 항원 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 혈액, 림프 또는 다른 체액을 순환하는 백혈병 세포들 또한 사용될 수 있고, 고체상 종기 조직(예를 들면, 생체검사로부터 주요한 조직)가 사용될 수 있다. 여기에서 사용될 수 있는 암의 무제한 리스트, 세포들은 하기 5.18장에서 제공된다.
본 발명의 다른 실시예에서, 병원체나 감염된 인자로 감염된 어떠한 세포, 즉, 감염세포는 항원 펩타이드의 제조를 위하여 항원세포로서 사용될 수 있다. 특히, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 기생충, 또는 원생 동물처럼 세포내 병원체에 의해 감염된 세포는가 바람직하다. 여기에서 사용될 수 있는 세포를 감염시킬 수 있는 감염된 인자의 전형적인 리스트는 5.18장에 제공된다.
또 다른 실시예에서, 감염질환을 유발할 수 있는 어떠한 병원체 또는 감염된 인자도 항원 펩타이드의 제조를 위해 항원 세포로서 사용될 수 있다. 복제결손 변이들, 비병원성 또는 약화된 변이들, 비감염성 변이들과 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는 병원체 또는 감염성 인자의 변이들도 또한 이러한 목적을 위해 항원 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 시험관내에 배양될 수 있거나 감염된 물질들로부터 분리될 수 있는 많은 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 기생충 및 원생동물들은 항원 세포의 근원으로서 제공될 수 있다. 바이러스성 입자를 포함하는 그러한 병원체들을 번식시키기 위하여 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 방법이 사용될 수 있다. 항원세포로 사용될 수 있는 병원체 또는 감염성 인자의 전형적인 리스트는 5.18장에서 제공된다.
암 조직, 암세포 또는 감염세포로부터 유래된 세포 라인도 또한 항원 세포로서 사용될 수 있다. 인간 기원의 암 또는 감염 조직, 세포 또는 세포계가 바람직하다. 암세포, 감염세포 또는 항원세포는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 어떠한 방법에 의해 확인될 수 있고 분리될 수 있다. 예를 들면, 암 세포 또는 감염세포는 형태학, 효소분석, 증식분석 또는 병원체 또는 암 유발 바이러스에 의해 확인될 수 있다. 또한, 만일 관심있는 항원의 특성이 알려져 있으면, 항원 세포는 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 어떠한 생화학적 또는 면역학적인 방법에 의해확인되거나 분리될 수 있다. 예를 들면, 암세포나 감염세포는 외과수술, 내시경 검사, 다른 생체검사 기술, 체액(혈액과 같은)으로부터 분리, 친화 크로마토그래피 및 활성화된 세포 분류 형광법(fluorescence activated cell sorting) (예를 들면, 형광성으로 표지된 항체로 세포에 의해 항원 발현에 대하여)에 의해서 분리될 수 있다. 유사한 항원성을 나타내는 항원세포들은 일반적으로 대상 내에서 면역 반응이 바람직한(예를 들면, 치료상 또는 예방상 목적을 위해) 하나 이상의 항원 결정인자를 갖는다.
바람직하게는, 암을 치료 또는 예방하는데 사용되는 경우, 알려진 종양-특정 (즉, 종양 세포로 발현된) 또는 종양 관련 항원(즉, 종양 세포에서 상대적으로 과발현된) 또는 그들의 조각 또는 유도체들이 사용된다. 예를 들면, 그러한 종양 특정 또는 종양관련 항원은 KS 1/4 범암종 항원(Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142: 3662-3667; Bumal, 1988, Hybridoma 7 (4): 407-415); 난소 암종 항원 (CA125) (Yu, et al., 1991, Cancer Res. 51 (2): 468-475); 전립샘 산 포스페이트(prostatic acid phosphate) (Tailer, etal., 1990, Nucl. Acids Res. 18 (16): 4928); 전립선 특정 항원 (Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160 (2): 903-910; Israeli, etal., 1993, Cancer Res. 53: 227-230); 흑색종(melanoma)-관련 항원 p97 (Estin, et al., 1989, J.Natl.CancerInst. 81 (6): 445-446); 흑색종 항원 gp75 (Vijayasardahl, etal., 1990, J. Exp.Med. 171 (4): 1375-1380); 고분자량 흑색종 항원 (Natali, etal., 1987, Cancer 59: 55-63) 및 전립샘 특정 막 항원을 포함하는데, 이에 한정되지는 않는다. hsp에 복합화될 수있는 다른 외부적 원인에 의한 항원은 암 세포 내에 고 주파수에서 변이되는 부분이나 단백질을 포함하는데, 종양유전자(예를 들면, 라스, 특히 활성화 돌연변이를 갖는 라스의 돌연변이인데, 단지 네개의 아미노산 잔기에서 발생한다 (12,13, 59 또는 61) (Gedde-Dahl et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24 (2): 410-414) )와 종양 억제 유전자(예를 들면, p53, 이에 대해 세포독성 T-세포 반응을 자극할 수 있는 다양한 돌연변이 또는 다형 p53 펩타이드 항원이 확인되었다(Gnjatic etal., 1995, Eur. J. Immunol.25 (6): 1638-1642)와 같다.
바람직하게, 바이러스성 질환을 치료하거나 예방하는데 이용되는 경우, 알려진 바이러스의 에피토프를 포함하는 적절한 단백질과 펩타이드가 적절한 세포에서 발현될 수 있다. 예를 들면, 바이러스로부터 그러한 항원 에피토프는 간염(hepatitis)타입A, 간염타입 B,간염타입 C, 인플루엔자, 수두, 아데노바이러스, 단순포진 타입 I(HSV-I), 단순포진 타입 Ⅱ(HSV-II), 린더페스트(rinderpest), 리노바이러스(rhinovirus), 에코 바이러스, 로터바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 파필로마 바이러스, 파포바 바이러스, 사이토메갈로 바이러스, 에키노바이러스(echinovirus), 아르보바이러스, 훈타바이러스(huntavirus), 콕사키(coxsackie) 바이러스, 유행성 이하선염(mumps) 바이러스, 홍역(measles) 바이러스, 천연두(smallpox) 바이러스, 풍진(rubella) 바이러스, 소아마비 바이러스, 인체 면역 결핍 바이러스 타입 I(HIV-I), 그리고 인체 면역 결핍 바이러스타입 Ⅱ(HIV-II)를 포함하며, 이에 한정되지는 않는다.
바람직하게, 박테리아성 감염을 치료하거나 예방하는데 사용되는 경우, 알려진 박테리아의 에피토프를 포함하는 적절한 단백질과 펩타이드가 적절한 세포내에서 발현될 수 있다. 예를 들면, 그러한 박테리아성 에피토프는 그램 양성 바실루스균(예를 들면, 리스테리아, 탄저균(Barcillus anthracis)과 같은 바실루스균, 단독균(Erysipelothrix) 종), 그램 음성 바실루스균(예를 들면,Bartonella, Brucella, Campylobacter, Enterobacter, Escherichia, Francisella, Hemophilus, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Vibrio,그리고Yersinia종), 파상균(spirochete) 박테리아들(예를 들면, 라임병, 그리고 렙토스피라(Leptospira)를 일으킨Borrelia burgdorferi을 포함하는 보렐리아 종), 혐기성 박테리아 (예를들면, C.tetani, C.botulinum, C.perfingens를 포함하는 Actinomyces 과 Clostridium 종), 그램 양성 및 음성 코칼(coccal) 박테리아, Streptococcus종, Pneumococcus 종, Staphylococcus 종(예를들면, S. aureus 및 S. pneumonia), Neisseria species(예를 들면, N. meningitidis)를 포함하는 다양한 박테리아로부터 유래될 수 있는데, 이에 한정되지는 않는다.
바람직하게, 곰팡이성 감염을 치료하거나 예방하는데 사용되는 경우, 알려진 곰팡이의 에피토프를 포함하는 적절한 단백질과 펩타이드가 적절한 세포내에서 발현될 수 있다. 예를 들면, 그러한 항원 에피토프는 아스페르길루스(Aspergillus)(예를 들면, Aspergillus fumigatus), 크립토코쿠스(Cryptococcus)(예를 들면(Cryptococcus neoformans)), Sporotrix, Coccidioides, Paracoccidioides, Histoplasma, Blastomyces, Candida(예를 들면 Candida albicans), Rhizopus,Rhizomucor, Absidia 및 Basidiobolus종을 포함하는 다양한 곰팡이로부터 유래될 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게, 기생충성 감염을 치료하거나 예방하는데 사용되는 경우, 알려진 원생동물(protozoa), 선충류(nematode), 또는 연충(helminth)의 에피토프를 포함하는 적절한 단백질과 펩타이드가 적절한 세포내에서 발현될 수 있다. 예를 들면, 그러한 항원 에피토프는 엔토아모에바(Entoamoeba), 플라스모디움(Plasmodium), 레슈마니아(Leishmania), 에이메리아(Eimeria), 크립토스포리디움(Cryptosporidium), 기아디아시스(Giardiasis), 톡소플라스마(Toxoplasma), 및 트립파노소마 종(Trypanosoma species)을 포함하는 다양한 원생동물로부터 유래될 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다.
5.12.1 항원 단백질의 제조
본 발명의 한 실시예에서, 암세포, 감염세포, 또는 병원체로부터 유래된 단백질 제제가 제공된다. 예를 들면, 암 치료를 위해서, 단백질 제제는 수술 후에 암 환자로부터 얻어진 종양 세포로부터 제조된다. 본 발명의 다른 실시예에서, 관심있는 하나 이상의 항원 단백질은 이러한 항원을 암호화한 재조합 발현 시스템의 도입에 의해 변형된 세포계에서 합성되고, 그러한 세포들은 단백질을 제조하는데 사용된다. 상기 단백질들은 하나 이상의 세포 파편, 예를 들면 항원 세포의 시토졸(cytosol)로부터 얻어질 수 있거나, 또는 그들은 항원 세포의 막 또는 세포벽으로부터 추출 또는 용해시킬 수 있다. 세포 파쇄에 대한 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 어떠한 기술, 세포함량의 분획, 단백질 농축 또는 분리가 사용될 수 있다. 예를 들면 Current Protocols in Immunology, vol. 2, chapter 8, Coligan et al.(ed.), John Wiley & Sons, Inc.; Pathogenic and Clinical Microbiology: A Laboratory Manual by Rowland etal., Little Brown & Co. , June 1994;를 참조하는데, 이들은 인용에 의해서 그대로 본 명세서에서 포함된다. 세포 내용물을 분획하는데 사용되는 기술에 의존하여, 세포 분획은 적어도 20, 50, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 또는 20,000의 다른 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단백질 제제"란 용어는 항원세포, 항원세포의 세포 파편 또는 바이러스 입자로부터 얻어지는 단백질의 혼합물을 의미한다. 단백질은 시토졸(cytosol)과 같은 세포 분획으로 부터 얻어질 수 있다. 또한 단백질은 비시토졸 단백질(예를 들면, 세포벽, 세포막 또는 세포 소기관으로부터의 것들)이거나 또는 둘 다 일 수 있다. 세포 파편은 시토졸 분획, 막 분획, 그리고 핵, 미토세포콘드리아, 리소좀과 세포질 그물로부터 유래된 분획과 같은 세포소기관 분획을 포함할 수 있는데, 이에 한정되지는 않는다. 단백질 제제는 비조합형 또는 조합형 세포로부터 얻어질 수 있다.
특정 실시예에서, 단백질 제제는 항원 세포 내에서 다른 단백질들로부터 하나 이상의 특벌한 단백질을 선택적으로 제거하거나 유지하는 어떠한 제조방법에 종속되지는 않았다.
구체적인 실시예에서, 단백질 제제는 분획 및/또는 정제되지 않은 총 세포 파쇄액이고, 세포의 다른 비단백질성 물질을 포함할 수 있다.
다른 구체적인 실시에에서, 단백질 제제는 세포 분획에서 전체 단백질인데, 더 분획하거나 정제되지 않은 것이며, 세포의 비단백질성 물질을 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 단백질 제제는 바이러스성 입자의 제조에서 전체 단백질이다.
구체적인 실시예에서, 단백질 제제는 전체 세포 단백질, 전체 시토졸 단백질, 또는 항원 세포의 전체 막 결합 단백질을 포함한다.
다양한 실시예에서, 단백질제제는 적어도 20, 50, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 또는 20,000 의 다른 단백질을 포함한다. 다수의 다른 항원 단백질은 항원세포의 단백질 제제에 존재한다. 또한, 단백질 제제 내에 단백질은 시험관내에서 hsp로 복합화하기에 앞서 프로테아제 소화 단계에 종속될 수 있다. 다른 방법으로, 단백질제제 내의 단백질은 시험관내에서 hsp로 복합화하기에 앞서 프로테아제 소화 단계에 종속되지 않을 수 있다.
항원세포나 바이러스 입자의 단백질 제제를 만들기 위하여, 항원세포의 분해 또는 세포벽, 세포막이나 바이러스 입자 구조의 파쇄가 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 표준 프로토콜을 이용하여 이루어질 수 있다. 디앵힌 실시예에서, 항원 세포는 파쇄될 수 있는데, 예를 들면 기계적 전단, 초음파파쇄, 얼림과 녹임, 세포를 둘러싼 기질의 삼투농도의 조절 또는 기술의 결합등에 의한다. 다른 실시예에서, 항원 세포는 세제와 같은 화학물질에의해 파쇄될 수 있다.
일단 세포가 파쇄되면, 세포 파편, 비단백질성 물질 또는 시토졸을 포함하지 않는 물질, 및/또는 막으로부터 유래된 단백질(세포 소기관의 막에 단백질을 포함하는)이 제거될 수 있다. 이러한 성분들의 제거는 저속 원심분리 또는 여과법과 같은 기술에 의해 달성될 수 있다. 세포 파편과 무손상 세포를 제거한 후, 고속 원심분리 단계는 상청액에 있는 시토졸 단백질과 펠렛에 모아진 막-유래 단백질을 분리하는데 사용될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 알려진 표준절차는 상기 펠렛으로부터 막-유래 단백질이 더 분리될 수 있게 한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 알려진 표준 기술은 바이러스성 입자로부터 바이러스성 단백질을 추출하는데 사용될 수 있다. 이러한 분리 방법은 항원세포내, 시토졸내 또는 막내에 존재하는 분자의 일반적이고 전체적인 크기, 밀도, 및/또는 전하에 근거하여 실시한다. 이러한 분리 방법은 다른 단백질들로부터 하나 이상의 어떤 특별한 단백질을 선택적으로 제거하거나 유지하는데 바람직하지 않다.
다양한 실시예에서, 항원세포로부터 단백질은 크기, 밀도, 전하, 세포 위치 또는 이들의 조합과 같은 그들의 일반적인 생화학적 및/또는 생물리적 성질에 의해 선택적으로 분리될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 많은 기술들은 상기 분리를수행하는데 사용될 수 있다.
시토졸 단백질을 포함하는 단백질 제제를 만드는데 사용될 수 있는 전형적인 방법은 다음과 같은데, 이에 제한되는 것은 아니다:
환자의 생체검사로부터 유래된 종양세포이거나 시험관에서 배양된 종양세포, 또는 병원성 인자로 감염된 세포는 30mM 탄산수소나트륨 pH 7.5 와 1mM PMSF를 포함하는 3부피의 1X 용균 버퍼(Lysis buffer)에 현탁시키고, 얼음 위에서 20분간 배양시킨다음, 저장성으로 팽윤된 세포들은 > 95%의 세포들이 용균될때까지 다운스호모게나이저(Dounce homogenizer)에서 파쇄된다. 전단(shearing)에 대한 다른 방법으로서, 세포들은 현미경 검사에 의해 결정된 것과 마찬가지로 > 99%의 세포들이 용균될때까지 얼음위에서 초음파로 처리하여 분해시킨다. 초음파분해가 사용된 경우, 세포들은 초음파 분해 전에 1mM PMSF를 포함하는 포스페이트 버퍼 염수(PBS)와 같은 버퍼에서 현탁된다.
파쇄액은 1,000Xg에서 10분동안 원심분리하여 파쇄되지 않은 세포들, 핵, 그리고 다른 세포 파편들을 제거한다. 얻어진 상청액은 다시 100,000Xg에서 1시간동안 원심분리시키고, 상청액을 회수했다. 100,000Xg 상청액은 본 발명의 용해성 시토졸 단백질을 제공하기 위하여 36시간동안 4℃에서 PBS나 다른 적절한 버퍼에 대해서 투석될 수 있다(3회, 각 회에 100배 부피). 필요하다면, 제제내의 불용성 물질은 여과나 저속 원심분리법에 의해 제거될 수 있다.
막-유래 단백질을 포함하는 단백질 제제를 만드는데 사용될 수 있는 전형적인 방법은 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:
환자의 생체검사로부터 유래된 종양세포이거나 시험관에서 배양된 종양세포일 수 있는 세포들, 또는 병원성 인자로 감염된 세포는 30mM 탄산수소나트륨 pH 7.5 와 1mM PMSF를 포함하는 3부피의 1X 용균 버퍼(Lysis buffer)에 현탁시키고, 얼음 위에서 20분간 배양시킨 다음, 저장성으로 팽윤된 세포들은 > 95%의 세포들이 용균될때까지 다운스 호모게나이저(Dounce homogenizer)에서 파쇄된다. 전단(shearing)에 대한 다른 방법으로서, 세포들은 현미경 검사에 의해 결정된 것과 마찬가지로 > 99%의 세포들이 용균될때까지 얼음위에서 초음파로 처리하여 분해시킨다. 초음파분해가 사용된 경우, 세포들은 초음파 분해 전에 1mM PMSF를 포함하는 포스페이트 버퍼 염수(PBS)와 같은 버퍼에서 현탁된다.
그 다음, 파쇄액은 1,000Xg에서 10분동안 원심분리하여 세포막을 모은다. 막-유래 단백질은 지질 이중층으로부터 제거시킬 수 있고, 1% 소디움 디옥시콜레이트를 포함하는 PBS(Ca2+와 Mg2+ 없이) 5부피에 펠렛을 재현탁시킴으로써 100,000g 펠렛(막-유래 단백질이 존재하는)으로부터 분리될 수 있고, 얼음위에서 1시간 동안 배양된다. 얻어진 현탁액은 20,000g에서 30분간 원심분리되고, 얻어진 상청액을 수집하고 PBS(Mg2+와 Ca2+는 없이) 여러가지 변화에 대해 투석시켜 세제를 제거한다. 투석물은 100,000g에서 90분간 원심분리시키고, 상청액은 더 정제된다. 그런 다음, 칼슘과 마그네슘 모두를 상기 상청액에 첨가하여 최종농도가 2mM가 되게 한다. 필요하다면, 제제내의 불용성 물질은 여과 또는 저속 원심분리에 의해 제거될 수 있다.
특정 실시예에서, 항원세포로부터 얻어진 시토졸 및/또는 막-유래 단백질 모집단은 프로테아제 처리 또는 심화된 추출이나 선택공정 없이 직접적으로 hsp에 복합화될 수 있다. 다른 방법으로서, 상기 단백질은 복합화 이전에 프로테아제 처리될 수 있다.
5.12.2 항원 펩타이드의 제조
본 발명에 따르면, 항원세포로부터 얻어진 시토졸과 막-유래 단백질은 선택적으로 소화되어 항원 펩타이드를 생성할 수 있다. 하나의 실시예에서, 시토졸 또는 막-유래 단백질은 소화에 사용된다. 다른 실시예에서, 시토졸과 막-유래 단백질은 소화반응에서 결합하여 항원 펩타이드를 생성한다. 바람직한 실시예에서, 프로테아제 소화에 사용되는 단백질 제제는 항원세포내 또는 항원세포의 시토졸 또는 막에서 하나 이상의 특별한 단백질을 다른 단백질로부터 선택적으로 제거하거나 유지하는 어떠한 제조방법에도 종속되지 않았다.
다양한 프로테아제 또는 단백질 가수분해 효소들은 항원세포의 단백질 제제로부터 항원펩타이드를 포함하는 펩타이드 모집단을 생산하기 위하여 본 발명에서 사용될 수 있다. 효소소화는 트립신, 스타필로코칼 펩티다아제(Staphylococcal peptidase) I (또한 프로테아제 V8로도 알려진), 키모트립신, 펩신, 카텝신(cathepsin) G, 서몰리신(thermolysin), 엘라타제(elastase), 및 파파인(papain)을 포함하면서 이에 한정되지는 않는 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 어떤 단백질 가수분해 효소 각각 또는 이들의 적절한 조합으로 수행될 수 있다. 트립신은 리신과 아르기닌의 카르복실-말단에서 갈라진 고 특정 세린 단백분해효소이다. 분할위치의 제한된 수 때문에, 많은 MHC-결합 에피토프가 손상되지 않고 남겨지는 것이 기대된다. 스타필로코칼(Staphylococcal) 펩티다아제 I, 세린 단백분해효소는 글루타믹 또는 아스파틱 산 잔기 후에 분할에 대해 특이성을 갖는다. 소화는 단독 프로테아제 또는 프로테아제들의 혼합물을 가지고 이루어질 수 있다. 사용된 프로테아제 또는 단백질 가수분해 효소들은 특별한 효소에 적합한 조건하에서 배양된다. 바람직하게, 상기 효소는 정제된다. 시아노겐(cyanogen) 브로마이드 분할과 같은 비효소방법도 또한 펩타이드 생성을 위해 사용될 수 있다. 소화되는 단백질 제제는 각각 다른 효소를 이용한 다수의 반응들로 나누어질 수 있고, 얻어진 펩타이드는 선택적으로 사용하기 위해 함께 모아질 수 있다. 효소반응에서 단백질들을 완전하게 소화시킬 필요는 없을 것이다. 이러한 반응은 단백질 제제에 존재하는 각 단백질에 대한 다양하고 다른 집합의 펩타이드의 생성을 가져온다. 다른 펩타이드 집합의 생산은 hsp와 복합화될 때 단백질 제제 내 항원에 대한 면역반응을 유발할 수 있는 항원 펩타이드를 생성할 더 큰 확률을 있게한다. 바람직한 실시예에서, 소화된 단백질 제제는 두개의 분리된 반응으로 나누어지고, 두개의 다른 단백질 가수분해 효소가 상기 단백질 제제에 존재하는 단백질의 펩타이드의 서로 다른 두 집합을 생산하는데 사용된다. 단백질, 효소 및 반응조건에 의하여, 소화되지 않은 단백질은 반응에 남아있을 수 있다. 바람직한 실시예에서, 트립신과 포도상구균(Staphylococcal) 펩티다아제 I은 각각 단백질 제제를 소화하는데 사용된다.
다른 실시예에서, 효소 소화는 펩타이드가 hsp에 복합화되기 전에 종료된다. 본 발명의 한 실시예에서, 저해제는 효소 소화를 종료시키는데 사용될 수 있다. 단백질 소화에서 어떠한 효소가 사용되는지에 따라, 본 발명에서 사용될 수 있는 효소 저해제는 PMSF, 베스타틴, 아마스타틴(amastatin), 루펩틴(leupeptin) 및 시스타틴(cystatin)을 포함하며, 이에 한정되지는 않는다. 대부분의 프로테아제에 대한 저해제는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다. 다른 방법으로, 효소 소화를 종료시키는 다른 방법은 반응으로부터 효소를 물리적으로 제거하는 것이다. 이것은 선택 효소를 원심분리나 여과와 같이 잘 알려진 방법에 의해 반응으로부터 쉽게 제거될 수 있는 수지나 물질과 같은 고체상에 부착시킴으로써 행해질 수 있다.단백질 제제는 소정의 시간동안 고체상과 접촉하거나 고체상을 가로질러 흐르도록 된다. 그러한 고정화 효소는 상업적으로 얻어질 수 있거나 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 고정화 효소에 대한 절차에 의해 생산될 수 있다.
소화반응의 마지막에는, 펩타이드는 제제내에서 선택적으로 디펩타이드 또는 단독 아미노산 잔기와 같은 저 분자량 물질로부터 분리될 수 있다. 선택적으로, 펩타이드는 크기, 전하 또는 이들의 조합과같은 일반적인 생화학적 및/또는 생물리적 특성에 의해 분리될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 어떠한 기술도 상기 분리를 실행하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 항원 세포에 내부에 존재하는 펩타이드는 본 발명에서 단독으로 또는 시토졸 및 막-유래 단백질의 단백질 가수분해 소화에 의해 생성된 펩타이드의 조합으로 사용될 수 있다. 항원세포에 내부에 존재하는 펩타이드는 생체내에 hsp 및/또는 MHC 클래스 I과 II 분자에 복합화되는 펩타이드를 포함한다. 본 발명에 따르면, 항원 세포의 단백질 제제로부터 직접 분리된 그러한 펩타이드는 hsp에 복합화될 수 있다.
하나의 실시예에서, 항원 펩타이드는 ATP 존재 또는 낮은 pH 하에서 hsp-펩타이드 복합체로부터 용출될 수 있다. 이러한 실험 조건은 잠재적으로 유용한 항원성 결정인자를 포함할 수 있는 세포들로부터 펩타이드를 분리하는데 사용될 수 있다. 일단 분리되면, 각 항원 펩타이드의 아미노산 서열은 통상적인 아미노산 서열 방법론을 이용하여 결정될 수 있다. 그런 다음, 이러한 항원 분자는 화학 합성 또는 재조합 방법에 의해 생산되고, 정제되며, 시험관내에서 hsp와 복합화될 수 있다.
hsp-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 용출하는데 사용될 수 있는 전형적인 방법은 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:
관심있는 hsp-펩타이드 복합체는 Centricon 10 assembly (Millipore)을 통해 원심분리되어 복합체와 약하게 결합된 저 분자량 물질이 제거된다. 저분자량이 하기하는 바와 같이 HPLC에 의해 분석될 동안 큰 분자량 분획은 SDS-PAGE에 의해 제거되고 분석된다. 하나의 전형적인 방법에서, 큰 분자량 분획에서 hsp-펩타이드 복합체는 1OmM ATP와 상온에서 30분동안 배양된다. 다른 전형적인 방법에서, 아세트산 또는 트리플루오로아세트산(TFA)는 스트레스 단백질-펩타이드 복합체에 첨가되어 최종 농도가 10% (vol/vol)가 되게 하고, 혼합물은 상온에서 또는 끓는 물 배스에서 또는 그 사이 어떠한 온도에서 10분간 배양된다(Van Bleek, etal., 1990, Nature 348: 213-216; and Li, et al., 1993, EMBO Journal 12: 3143-3151 참조).
얻어진 샘플은 전술한 바와 같이 Centricon 10 assembly 를 통해 원심분리된다. 고 또는 저 분자량 분획은 회수된다. 남아있는 고 분자량 스트레스 단백질-펩타이드 복합체는 남아있는 펩타이드를 제거하기 위해서 ATP와 또는 낮은 pH에서 재 배양될 수 있다.
얻어진 저 분자량 분획은 모아지고, 증발에 의해 농축되고, 0.1 % TFA에 용해된다. 그런 다음, 용해된 물질은,예를 들면, 0.1% TFA와 평형을 이룬 VYDAC C18 역상 컬럼을 이용한 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분획된다. 그 후, 상기 컬럼을 0.1% TFA에서 0 내지 80% 아세토니트릴 선 구배차로 전개시킴으로써, 결합된 물질은 약 0.8 ml/min의 유속에서 용출된다. 펩타이드의 용출은 OD210에 의해 모니터될 수 있고, 펩타이드를 포함하는 분획은 모아진다.
다른 실시예에서, 항원 펩타이드는 MHC-펩타이드 복합체로부터 분리될 수 있다. 잠재적인 면역원 펩타이드를 MHC 분자로부터 분리하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Falk, etal., 1990, Nature 348:248-251 ;Rotzsche, et al., 1990, Nature 348: 252-254; Elliott,et al., 1990, Nature 348: 191-197; Falk,et al., 1991, Nature 351: 290-296; Demotz, etal., 1989, Nature 343: 682-684; Rotzsche,et al., 1990, Science 249: 283-287,를 참조하는데, 게재된 내용은 참고로서 본 명세서에 포함된다.
어떤 실시예에서,MHC-펩타이드 복합체는 통상적인 면역친화 절차에 의해 분리될 수 있다. 그 다음, 펩타이드는 아세토니트릴에서 약 0.1% TFA의 존재 하에 복합체를 배양함으로써 MHC-펩타이드 복합체로부터 용출될 수 있다. 용출된 펩타이드는 역상 HPLC에 의해 분획되고 정제될 수 있다. 용출된 펩타이드의 아미노산 서열은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 수동식 또는 자동화된 아미노산 서열 기술에 의해 결정될 수 있다. 일단 잠재적으로 방어 펩타이드의 아미노산 서열이 결정되면, 펩타이드는 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 통상적인 펩타이드 합성법 또는 다른 프로토콜을 이용하여 어떠한 양으로 합성될 수 있다.
상기 분리된 것들과 같은 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 Merrifield, 1963, J.Am. Chem.Soc., 85: 2149에 기재된 것고 유사한 절차를 이용하여 고체상 펩타이드 합성법에 의해 합성될 수 있다. 합성 중, 보호된 곁사슬을 갖는 N-α-보호된 아미노산은 C-말단에 의해 결합된 성장중인 폴리펩타이드 사슬과 불용성 폴리머 지지체, 즉 폴리스티렌 비드에 순차적으로 첨가되어진다. 펩타이드는 N-α-보호되지 않은(deprotected) 아미노산의 아미노기를 디시클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide)와 같은 시약과 반응하여 활성화된 N-α-보호된 아미노산의 α-카르복실기에 연결함으로써 합성될 수 있다. 유리 아미노기가 활성 카르복실기에 부착되는 것은 펩타이드 결합을 형성하게 한다. 가장 일반적으로 사용된 N-α-보호된기는 산에 불안정한 Boc와 염기에 불안정한 Fmoc이다.
하나의 실시예어서, C-말단 N-α-보호된 아미노산가 먼저 폴리스티렌 비드에 부착된다. 그런 다음, N-α-보호기는 제거된다. 보호되지 않은 α-아미노기는 다음 N-α-보호된 아미노산의 α-카르복실레이트기에 연결된다. 상기 과정은 원하는 펩타이드가 합성될 때 까지 반복된다. 그런 다음, 얻어진 펩타이드는 불용성 폴리머 지지체 및 보호되지 않은 아미노산 곁가지와 나누어진다. 더 긴 펩타이드는 보호된 펩타이드 조각의 축합에 의해 유도될 수 있다. 적절한 화학, 수지, 보호기, 보호된 아미노산 및 시약들의 세부적인 사항은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다 (Atherton, et al., 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, 및 Bodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2nd Ed. , Springer-Verlag 참조).
얻어진 펩타이드의 정제는 겔투과를 이용한 preparative HPLC, 분배 및/또는 이온교환 크로마토그래피와 같은 통상적인 절차를 이용하여 이루어질 수 있다. 적절한 기질과 버퍼의 선택은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있으며, 따라서 본 명세서에서는 구체적으로 설명하지 않는다.
5.12.3 외부적 원인에 의한 항원 분자
병원체의 알려진 항원 또는 암의 종양-특정 또는 종양-관련 항원의 항원성을 나타내는 분자들,예를 들면, 항원 또는 이들의 항원 부위들은 열 충격 단백질에 복합화하기 위하여 항원분자로서 사용하기 위해 선택될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 여러 측정이 면역원성 또는 항원성을 결정하는데 사용될 수 있는데, 방사선면역측정법, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), "샌드위치"면역측정(immunoassays), 면역방사측정법(immunoradiometric assays), 겔확산침전반응, 면역확산 측정법, 생체내 면역측정법(예를 들면, 콜로이드상 금, 효소 또는 방사성 동위원소 표지를 이용하는), 웨스턴 블롯(western blots), 면역침전반응, 응집측정법 (예를 들면, 겔 응집측정법, 혈구응집측정법 assays), 도움체결합측정법 , 면역형광측정법, 단백질A 측정법, 및 면역전기이동 측정법 등을 이용한 경쟁 및 비경쟁 측정 시스템을 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 실시예에서, 결합하는 항체는 일차 항체상에 표시를 검출함으로써 검출될 수 있다. 다른 실시예에서, 일차 항체는 이차 항체 또는 시약이 일차 항체에 결합하는 것을 검출함으로써 검출될 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 상기 이치 항체는 표지된다. 면역분석법에 결합하여 검출하는 많은 수단들이 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있고, 사용을 위하여 계획된다. 면역원성을 검출하기 위한 하나의 실시예에서, T-cell-매개 반응이 표준방법, 예를 들면 시험관내 세포독성 측정 또는 생체내 지연과민 측정법에 의해 측정될 수 있다.
또한, 항원 분자로서 사용하기 위해 잠재적으로 유용한 항원 또는 이들의 유도체는 병원체의 감염력(Norrby, 1985, Summary, in Vaccines 85, Lerner,et al. (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 388-389), 타입 또는 그룹 특이성, 환자의 항혈청(antisera) 또는 면역세포의 인지, 및/또는 항원에 대해 특이한 항혈청 또는 면역세포의 보호효과의 시범의 중화에서 항원의 연루와 같은 (여기에서, 그러한 병원체에 의해 감염을 치료하거나 예방하는 것이 바람직하다) 다양한 기준에 의해 확인될 수 있다. 또한, 병원체에 의해 유발되는 질병을 치료하거나 예방하는 것이 요구된 곳에서, 항원의 부호화된 에피토프는 바람직하게는 시간에 있어서 항원 변이 또는 같은 병원체의 다른 분리주 중에서의 작거나 없는 정도를 나타내야 한다.
5.13 시험관내에 hsp/항원 분자 복합체의 생산
hsp와 그들이 내부 원인으로 생체내에서 관련된 펩타이드의 특정 복합체가 사용되지 않은 실시예에서, hsp와 항원분자의 복합체는 시험관내에 생산된다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자들에 의해 평가될 바와 같이, 전술한 절차에 의해 분리되거나 화학적으로 합성되거나 재조합으로 만들어진 펩타이드는 다양한 정제된 천연 또는 재조합 스트레스 단백질과 시험관내에서 가공될 수 있어, 면역원성 비공유 스트레스 단백질 항원 분자 복합체를 생성할 수 있다. 다른 방법으로, 본 발명의 면역치료 또는 질병 예방 백신에서의 사용을 위해 외부원인의 항원이나 항원 또는 면역원성 조각이나 이들의 유도체는 스트레스 단백질에 복합화될 수 있다. 시험관 내에서 스트레스 단백질과 항원 분자를 복합화하기위한 바람직한 전형적인 프로토콜은 아래에서 설명한다.
복합화에 앞서, hsp는 관심있는 hsp와 관련될 수 있는 어떠한 펩타이드를 제거하기 위하여 ATP와 또는 낮은 pH에서 전처리된다. ATP 절차가 사용되는 경우, Levy, et al., 1991,Cell 67 : 265-274에 기재된 바와 같이, 과량의 ATP는 아피라네이즈(apyranase)의 부가에 의해 제제로부터 제거된다. 낮은 pH 절차가 사용되는 경우, 버퍼는 pH 조정 시약의 부가에 의해 중성 pH로 재조정된다.
항원분자(1㎍)와 전처리된 hsp(9㎍)는 혼합되어 약 5 항원분자:1 스트레스 단백질의 몰비가 된다. 그런 다음, 혼합물은 4 내지 45℃에서 15분 내지 3시간 동안 20mM 소디움 포스페이트, pH 7.2, 350mM NaCl, 3mM MgCl2 및 lmM 페틸메틸 술포닐 플루오라이드(PMSF)를 포함하는 것과 같은 적절한 결합 버퍼 내에서 배양된다. 상기 제제는 Centricon 10 어셈블리(Millipore)를 통해 원심분리되어 결합되지 않은 펩타이드를 제거한다. 펩타이드와 스트레스단백질의 연합은 SDS-PAGE에 의해 측정될 수 있다. 이것은 시험관내에서 내부 hsp-펩타이드 복합체로부터 분리된 펩타이드의 MHC-펩타이드 복합체로부터 분리된 펩타이드를 복합화하기 위한 바람직한 방법이다.
본 발명의 대안적인 실시예에서, 하나의 예로서 이에 한정되는 것은 아닌데, 단백질과 같은 외부 항원분자에 hsp70의 복합체를 생산하는데 바람직하고, 5-10 마이크로그램의 정제된 hsp는 20mM 소디움 포스페이트 버퍼 pH 7.5, 0.5M NaCl, 3mMMgCl2 및 1mM ADP에서, 100 마이크로리터 부피에서 37℃, 1시간동안 같은 몰양의 항원 분자와 배양된다. 이 배양 혼합물은 포스페이트-버퍼된 염수에 1㎖로 더 희석된다.
본 발명의 대안적인 실시예에서, 하나의 예로서 이에 한정되는 것은 아닌데, 펩타이드에 gp96 또는 hsp90의 복합체를 생산하는데 바람직하고, 5-10 마이크로그램의 정제된 gp96 또는 hsp90는 20mM 소디움 포스페이트 버퍼 pH 7.5, 0.5M NaCl, 3nM MgCl2를 포함하는 것과 같은 적절한 버퍼에서, 50-65℃에서, 5-20분동안 같은 몰양 또는 과량의 항원 펩타이드와 배양된다. 이러한 배양 혼합물은 상온으로 냉각하고, 결합되지 않은 펩타이드를 제거하기 위해 필요하다면 Centricon 10 어셈블리 (Millipore)를 통해 한번 또는 수회 원심분리된다.
복합화 후, 면역원성 스트레스 단백질-항원 분자 복합체는 선택적으로 예를들면 후술할 혼합 림프구 표적 세포 측정법(mixed lymphocyte target cell assay) (MLTC)를 이용하여 시험관내에서 측정될 수 있다. 일단 면역원성 복합체가 분리되면, 그들은 선택적으로 후술할 바람직한 투여 프로토콜과 부형제를 이용하여 동물 모델에서 더 특성화될 수 있다
5.14 hsp와 항원 분자의 올리고머화
본 발명의 올리고머화제는 2 이상의 hsp 또는 hsp와 항원 분자의 복합체의 올리고머화를 촉진하기 위해 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 어떠한 화합물이라도 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 올리고머화제는 공유결합에 의해 올리고머화를 촉진하는 분자와 열 충격 단백질이나 hsp-항원 분자 복합체에 비공유결합에 의해 올리고머화를 촉진하는 분자를 포함한다. 일반적으로, 공유결합에 의해 2 이상의 부분들 사이에 올리고머화를 촉진하는 올리고머화제는 "가교제(cross-linker)" 또는 "가교약물(cross-linking agent)"로 불리워진다. 가교제는 올리고머를 형성하기 위하여 둘 이상의 부분의 콘쥬게이션을 허용하도록 일반적으로 정해진 화학기와 반응할 수 있는 화합물이다.
가교제는 이 기능적(bifunctional), 다시말하면, 그들은 서로 다른 두개의 부위 또는 같은 부위에서 두개의 영역과 반응하거나 공유적으로 연결하는 두개의 반응기를 포함하며, 또는 다 기능적, 예를 들면 삼 기능적(trifunctional)일 수 있다. 또한, 가교제는 호모-기능적(homo-functional)(예를 들면, 단일 이 기능적, homobifunctional) 또는 헤테로-기능적(hetero-functional)(예를 들면, 헤테로 이 기능적)일 수 있다. 헤테로 이 기능적 가교제에서, 반응기는 동일하고, 이러한 시약은 동일한 작용기와 결합한다. 헤테로 이 기능적 가교제에서, 반응기는 다른 화학을 가지며, 다른 작용기 사이에 가교를 형성하게 한다. 여러가지 전형적인 호모 이 기능적 및 헤테로 이 기능적 가교제는 후술한다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 "올리고머화제"이라는 용어는, 예를 들면, 열 충격 단백질과 같은 면역치료 부위의 올리고머화를 비공유 결합을 통해 촉진하는 시약을 포함한다. 그러한 올리고머화제의 예로서는 2가(또는 2 특정) 항체를 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 바이오틴화(Biotinylation) 및 합텐화(haptenylation) 시약과 그들의 동종 결합 파트너들은 가교제 또는 비공유 올리고머화제로 고려될 수 있을 것이다. 이러한 시약들은 바이오틴 또는 합텐 부위를 올리고머화 되어질 표적에 교차결합하거나 공유적으로 결합한다. 이 때, 공유적으로 변형된 표적 상에 바이오틴 또는 헵탄 부위는 다른 표적 분자에 부착될 수 있는 아비딘(avidin), 스트렙트아비딘 (바이오틴) 또는 면역글로불린 G (IgG)과 비공유적으로 상호작용한다. 아비딘(Avidin), 스트렙트아비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(NeutrAvidin) 바이오틴-결합 단백질(biotin-binding protein) 및 캡트아비딘(CaptAvidin) 바이오틴-결합 단백질은 바이오틴화된 표적의 4개 분자에 단단히 결합할 수 있고, IgG는 두개의 합텐에까지 결합할 수 있다.
본 발명은 첫번째 열충격 단백질 분자가 두번째 열 충격 단백질 분자에 결합하기 위한 화학적 가교제를 제공하는데, 여기에서 첫번째 및 두번째 열 충격 단백질 분자는 동일할 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다. 하나의 실시예에서, 가교제는 호모 이 기능적 가교제이고, 일반적으로 첫번째 열 충격 단백질 분자 상의 아민 또는 티올기를 두번째 열 충격 단백질 분자상의 아민 또는 티올기와 각각 결합한다. 호모 이 기능적 가교제는, 예를 들어 글루타알데히드(glutaraldehyde), 비스(이미도 에스터), 비스(숙신이미딜 에스터), 디이소시아네이트 및 디애시드 클로라이드(diacid chlorides)와 같은 호모 이 기능적 아민 가교제 를 포함한다. 호모 이 기능적 가교제의 예로서는 p-아지도페닐 글리옥살 모노하이드레이트(Azidophenyl glyoxal monohydrate) (APG); 1,8-비스-말레이미도트리에틸렌글리콜(1,8-bis-Maleimidotriethyleneglycol) (BM[PEO]3); 3,3'-디티오비스[술포숙신이미딜프로피오네이트](3,3'-Dithiobis [sulfosuccinimidylpropionate]) ; (DTSSP); 비스[2-(술포숙신이미도옥시카보닐옥시)에틸]술폰 (Bis[2-(Sulfosuccinimidooxycarbonyloxy) ethyl] sulfone) (Sulfo-BSOCOES) ; 디숙신이미딜 기질(Disuccinimidyl suberate) (DSS); 에틸렌 글리콜 비스[술포숙신이미딜숙시네이트] (Ethylene glycol bis [sulfosuccinimidylsuccinate]) (Sulfo-EGS) ; N, N'-비스(3-말레이미드프로피오닐)-2-히드록시-1,3-프로판디아민 (N, N'-bis (3- maleimidpropionyl)-2-hydroxy-1, 3-propanediamine); PEG 비스(p-니트로-페닐 카보네이트) (PEG bis (p-nitro-phenyl carbonate)) 및 디메틸 수베리미데이트 디하이드로클로라이드 (Dimethyl suberimidate dihydrochloride) (DMS) 가 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 호모 이 기능적 가교제 뿐만 아니라 상기 가교제도 상업적으로 얻을 수 있는데, 예를 들면 Sigma (St. Louis, MO), Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL) 또는 Molecular Probes (Eugene, OR)에서 이다. 여기 기술에 근거하여, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명으로 사용하기위하여 다른 가교제를 선택하거나 고안할 수 있을 것이다.
다른 실시예에서, 가교제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 바람직하게는 결합 또는 활성 부분에 대해 파생된다 (예를 들면, 티올, 트리플레이트(triflate), 트레실레이트(tresylate), 아지리딘(aziridune), 옥시란(oxirane), 또는 바람직하게 말레이미드와). 말레이미도 모노메톡시 PEG(maleimido monomethoxy PEG)와 같은 화합물은 전형적인 활성화된 PEG 화합물이다. 다른 예로서는 모노메톡시 폴리(에틸렌글리콜)-말레이미드(mPEG-MAL) 또는 NHS-폴리(에틸렌 글리콜)-말레이미드(PEG-MAL)를 포함한다. 본 발명은 PEG 링커를 이용하여 1차 또는 2차 열 충격 단백질 분자를 가교하는 것을 포함한다.
다른 실시예에서, 가교제는 헤테로 이 기능적 가교제이고, 전형적으로 1차 열 충격 단백질 분자 상의 아민기를 2차 열 충격 단백질 분자 상의 티올기와 결합하거나 또는 그 역으로 한다. 헤테로 이 기능적 가교제의 예로서는 N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), N-숙신이미딜-3- (2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 설포숙신이미딜 4- (N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트 (sSMCC), 2- 이미도티오란(Iminothiolane) (Traut's 시약);N- [α-말레이미도아세톡시] 숙신이미드 에스테르(AMAS);N-β-말레이미도프로피오닉 애시드(BMPA);N- [β-말레이미도프로피오닉 애시드] 히드라지드 TFA (BMPH); l-에틸-3- [3-디메틸아미노프로필] 카르보디디미드 하이드로클로라이드(EDC);[N-e-말레이미도카프로일옥시] 숙신이미드 에스테르 (EMCS); N- [g-말레이미도부티릴옥시] 숙신이미드 에스테르(GMBS);m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (MBS) 및 N-숙신이미딜 아이오도아세테에트(Succinimidyl iodoacetate) (SIA)를 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 호모 이 기능적 가교제 뿐만 아니라 상기 가교제도 상업적으로 얻을 수 있는데, 예를 들면 Sigma (St. Louis, MO), Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL) 또는 Molecular Probes (Eugene, OR)에서 이다. 여기 기술에 근거하여, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명으로 사용하기 위하여 다른 가교제를 선택하거나 고안할 수 있을 것이다.
다른 실시예에서, 가교제는 삼 기능적이다. 삼 기능적 가교제는 하나의 분자당 세개의 다른 반응성 또는 복합화 기를 포함하며, 세개의 다른 생물학적 분자, 예를 들면 열 충격 단백질을 올리고머화할 수 있다. 삼 기능적 가교제의 예로서는 β- [트리스(하이드록시메틸)포스피노]프로피오닉 애시드 (THPP) 및 트리스-숙신이미딜 아미노트리아세테이트(TSAT)를 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 호모 이 기능적 가교제 뿐만 아니라 상기 가교제도 상업적으로 얻을 수 있는데, 예를 들면 Sigma (St. Louis, MO), Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL) 또는 Molecular Probes (Eugene, OR)에서 이다. 여기 기술에 근거하여, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명으로 사용하기위하여 다른 가교제를 선택하거나 고안할 수 있을 것이다.
본 발명의 가교제는 둘 이상의 열 충격 단백질 분자간에 올리고머화를 촉진할 수 있는 어떠한 화합물을 말한다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 가교제는 시클로알킬, 시클로헤테로알킬, 치환된 시클로알킬 또는 치환된 시클로헤테로알킬이다. 하나의 실시예에서, 가교제는 감광성이다.
하나의 실시예에서, 본발명의 올리고머화제는 스트렙트아비딘-바이오딘 가교제(streptavidin-biotin linker)이다. 이 실시예에서, 아비딘 또는 스트렙트아비딘은 2차 열 충격 단백질과 접합될 수 있는 반면,상기 바이오틴은 1차 열 충격 단백질과 접합될 수 있다. 바이오틴의 아비딘과 스트렙트아비딘에 대한 강한 친화성은 차례로 바이오틴과 아비딘/스트렙트아비딘과 접합된 열 충격 단백질 분자의 올리고머화를 촉진할 수 있는 안정한 바이오틴-아비딘 또는 바이오틴-스트렙트아비딘 결합을 이룬다. 몇몇 실시예에서, 1차 및 2차 열 충격 단백질 분자는 동일하다.
다른 실시예에서, 올리고머화제는 다가인데, 예를 들면 2가(2 특정(bispecific)이라고도 불리워짐) 항체이다. 2 특정 항체는 1차 및 2차 단백질, 예를 들면 열 충격 단백질에 비 공유결합적으로 결합하는데, 여기서 상기 항체는 특이적이고, 따라서 1차 및 2차 단백질의 올리고머화를 촉진한다. 몇몇 실시예에서, 1차 및 2차 열 충격 단백질 분자는 동일하다.
본 발명에 따르면, 올리고머화제는 열 충격 단백질 부위, 예를 들면 hsp-펩타이드 복합체의 면역조절 활성을 파괴하지 않는 것이 사용된다. 하나의 실시예에서, 올리고머화제는 항원 분자, 예를 들면 펩타이드의 열 충격 단백질에 대한 결합을 붕괴시키지 않는다. 다른 실시예에서, 올리고머화제는 중성 pH에서 활성이 있고 기능적이다.
상기 설명에 근거하여, 열 충격 단백질의 올리고머화를 촉진하기 위한 다른 올리고머화제는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 명백할 것이다. 다른 가교제 뿐만 아니라 상기 설명한 것도 Sigma (St. Louis, MO; Sigma catalog, 2002-2003, pages 573-580 참조), Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL; Pierce Biotechnology, Inc. catalog, 2001-2002, pages 294-334참조) 또는 Molecular Probes (Eugene, OR; see Molecular Probes Handbook,9th ed., 2002, chapter 5 참조)과 같은 여러 회사로부터 상업적으로 얻을 수 있는데, 각각의 인용문헌은 그대로 본 명세서에 참고로서 포함된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 특정 화합물은 올리고머화제로서 사용되지 않는다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 올리고머화제는 렉틴이 아니다. 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머화제는 렉틴이다. 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머화제는 글루타알데히드가 아니다. 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머화제는 설포숙신이미딜 (4- 아지도살리실아미도) 헥사노에이트 ("SASD")가 아니다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머화제는 BAG 계통 단백질 (Takayama and Reed, 2001, Nature Cell Biology 3:E237-E241 참조)의 일원이 아니다.
다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머화제는 4, 4'-디아닐리노-1,1'-비나프틸-5, 5'-디설포닉 애시드("bis-ANS"), 1,8-아닐리노나프탈렌 설포네이트("8-ANS") 또는 N-에틸카르복스아미도아데노신(ethylcarboxamidoadenosine)("NECA")이 아니다. 다른 실시예에서, 본 발명의 올리고머화제는 아데노신 부분이나 그들의 구조적 유사물을 포함하는 화합물이 아니다. 아데노신 부분의 구조적 유사물은 아데노신의 2', 3', 5' 위치에 다양한 치환을 갖는 분자를 포함한다(Gewirth et al., U. S.Patent Application Publication No. 2002/0160496 참조).
5.15 HSP-펩타이드 복합체의 면역원성의 결정
선택적으로, 본 발명의 특정 복합체와 희석된 복합체는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 어떠한 방법을 사용하여 면역원성을 위해 측정될 수 있다. 예를 들면, 다음의 절차들 중 하나를 사용할 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다.
5.15.1 MLTC 측정.
간단하게, 쥐는 어떤 투약의 간편한 경로를 이용하여 특정 또는 희석된 hsp-펩타이드 복합체의 양으로 주입된다. 음성 대조군으로서, 다른 쥐들은 비 특정 또는 희석 복합체로서 사용되는 hsp-펩타이드 복합체와 같은 것으로 주입된다. 특정 항원, 예를 들면, 종양세포 또는 감염성 질환의 인자로 감염된 세포를 포함하는 알려진 세포는 본 측정을 위해 양성 대조군으로 작용할 수 있다. 쥐는 7-10일 간격으로 두번 주입된다. 마지막 면역화 10일후, 비장이 제거되고 림프구가 방출된다. 그 후에, 방출된 림프구는 관심있는 항원을 발현하는 죽은 세포의 첨가에 의해 시험관내에서 재 자극될 수 있다.
예를 들면, 8x 106개의 면역 비장 세포는 처리된 4x104미토마이신(mitomycin) C 또는 관심있는 항원을 포함하는 (또는 가능한 경우로서 적절한 유전자로 전달감염된 세포) γ-선으로 조사된(5-10,000 rads)세포로 10% 태아 송아지 혈청을 포함하는 3ml RPMI 배지에서 자극될 수 있다. 특정한 경우에서, 33% 2차 혼합된 림프구 배양 상청액은 T세포 성장 인자의 근원으로서 배지에 포함될 수 있다(Glasebrook,et al., 1980,J Exp. Med. 151: 876 참조). 면역화 후에 1차 세포독성 T세포 반응을 측정하기 위해서, 비장 세포들은 자극없이 배양될 수 있다. 또한, 몇몇 실험에서는, 세포독성 T-세포 반응의 특이성을 결정하기 위해서 면역된 쥐의 비장 세포가 항원성으로 다른 세포로 재 자극될 수 있다.
6일 후에 배양은 4시간51Cr-방출 측정에서 세포독성에 대해 측정된다( Palladino, etal., 1987, Cancer Res. 47: 5074-5079 and Blachere, at al.,1993, J.Immunotherapy 14: 352-356 참조). 이 측정에서, 혼합된 림프구 배양은 표적세포 현탁액에 첨가되어, 다른 효과기: 표적 (E:T)비 (대체적으로 1:1 내지 40:1)를 나타낸다. 표적세포는 20 mCi51Cr/ml를 포함하는 배지에서 37℃, 1시간동안 1x106개의 표적 세포들을 배양함으로써 미리 표지된다. 상기 세포들은 라벨링에 이어서 3회 세척된다. 자연51Cr 방출(측정에 부가된 림프구 없음)과 100% 방출(세제로 용균된 세포)을 측정하기 위해 각각의 측정 포인트(E: T 비)는 삼중으로 수행되고, 적절한 대조군이 포함된다. 4시간동안 세포 혼합물을 배양한 후에, 세포들은 200g에서 5분간 원심분리되어 펠렛화된다. 상청액으로 방출된51Cr의 양은 감마 계수기에 의해 측정된다. 퍼센트 세포독성은 테스트 샘플 cpm에서 자연적으로 방출된 cpm을 제외한 것을, 방출된 전체 세제 cpm에서 자연적으로 방출된 cpm을 제외한 것으로 나누어 측정된다.
MHC 클래스 I 연속단계를 차단하기 위하여, 농축된 K-44 하이브리도마 세포(항-MHC 클래스 I 하이브리도마)로부터 유래된 하이브리도마 상청액은 최종 농도가 12.5%가 되도록 테스트 샘플에 첨가된다.
5.15 . 2CD4+ T-Cell 증식 측정
1차 T-세포는 비장, 신선한 혈액, 또는 CSF로 부터 얻어지고, FICOLL-PAQUE PLUS (Pharmacia, Upsalla, Sweden)를 이용하여 원심분리에 의해 정제되는데, 실질적으로 Kruse and Sebald, 1992, EMBO J.11: 3237-3244.에 기재된 바와 같다. 말초 혈액 단핵 세포는 항원 분자를 발현하는 세포의 파쇄액과 7-10일 동안 배양된다. 항원 전달 세포는 파쇄액에서 항원을 가공하고 전달하기 위해 측정 전에 24 내지48 시간동안 배양에 선택적으로 첨가될 수 있다. 그런 다음, 세포들은 원심분리에 의해 수집되고, RPMI 1640 배지 (GibcoBRL, Gaithersburg,Md.)에서 세척된다. 5x104개의 활성된 T-세포/웰 (PHA-blasts)은 96 웰 플레이트에서 10% 소태아혈청, 10 mM HEPES, pH 7.5, 2 mM L-글루타민, 100 units/ml 페니실린 G 및 100㎍/ml 스트렙토도마이신 설페이트(streptomycin sulphate)를 포함하는 RPMI 1640 배지에 72시간동안 37℃에 있고, 6시간동안 1μCi3H-티미딘 (DuPont NEN, Boston, Mass.)/웰로 펄스시키고, 수집되고, TOPCOUNT 신틸레이션 계수기(Packard Instrument Co. , Meriden, Conn.)에서 방사능이 측정된다.
5.15.3 항체 반응 측정
본 발명의 특정 실시예에서, hsp-펩타이드 복합체의 면역원성은 복합체로 예방접종에 반응하여 생산된 항체를 측정하여 결정된다. 하나의 실시예에서, microtitre plates (96-well Immuno PlateII, Nunc)는 백신(예를들면.Aβ42)에서 사용된 펩타이드의 정제되고 비hsp-복합 형태의 0.75㎍/ml 용액의 50㎕/웰로 PBS에서 4℃, 16시간 동안 및 20℃, 1시간동안 코팅된다. 웰은 200㎕ PBS-T-BSA (0.05% (v/v) TWEEN 20 and 1% (w/v) bovine serum albumin을 포함하는 PBS)로 웰 당 20℃에서 1시간동안 비워지거나 차단된 다음 PBS-T로 3번 세척된다. 백신화된 동물(모델 쥐 또는 인간 환자와 같은)로부터 플라스마 또는 CSF 50㎕/웰은 20℃에서 1시간동안 적용되고, 상기 플레이트는 PBS-T로 3회 세척된다. 그런 다음, 항 펩타이드항체 활성은 양 항-쥐 또는 항-인간 면역 글로불린의 50-웰로 20℃에서 1시간동안 배양한 후에 열량측정법으로 측정되고, 적절한만큼 PBS-T-BSA에서 1:1,500 희석된 홍당무 과산화효소(Amersham)와, 그리고 (상기와 같이 3번 더 PBS-T 세척한 후에) 50㎕ o-페닐렌 디아민(OPD)-H202기질 용액과 접합된다. 반응은 5분후에 2M H2SO4150㎕로 정지되고, 흡광도는 492 nm(ref. 620nm)에서 KontronSLT-210 photometer (SLT Lab-instr., Zurich, Switzerland) 로 결정된다.
5.15.4 사이토카인 검출 측정
본 반응의 hsp-펩타이드 복합체에 대해 CD4+ T-세포의 증식성 반응은 특정 사이토카인의 레벨의 검출 및 정량화에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시예에서, 본 발명의 복합체의 면역원성에 대한 테스트를 위하여 세포내 사이토카인은 IFN-γ 검출측정법을 이용하여 측정될 수 있다. 이 방법의 하나의 예에서, hsp-펩타이드 복합체로 처리된 대상으로부터의 말초 혈액 단핵 세포는 주어진 종양의 펩타이드 항원으로 또는 감염성 질환의 인자의 펩타이드 항원으로 자극된다. 그 다음, 세포들은 흐름세포측정에 의해 검출될 수 있는 T-세포-특정 표지된 항체로 염색되는데, 예를 들면 FITC-접합 항-CD8와 PerCP-표지된 항-CD4 항체이다. 세척 후, 세포는 고정되고, 투과성화되고, 인간 IFN-γ(PE-anti-IFN-γ)과 반응성있는 염색 표지된 항체와 반응된다. 샘플은 표준 기술을 이용하여 흐름 세포측정에 의해 분석된다.
다른 방법으로, 필터 면역측정, 효소-결합 면역스팟(ELISPOT) 측정가 T-세포를 둘러싼 특정 사이토카인을 검출하는데 사용될 수 있다. 하나의 실시예에서, 예를 들면, 니트로셀룰로오스로 지지된 microtiter 플레이트는 정제된 사이토카인-특정 1차 항체,즉, 항-IFN-γ로 코팅되고, 상기 플레이트는 다른 단백질의 비특정 결합에 의해 배경을 피하기 위해 차단된다. hsp-펩타이드 복합체로 처리된 대상으로부터 얻어진 사이토카인-분비 세포를 포함하는 단핵 혈액 세포의 샘플은 microtitre plate의 웰 상으로 희석된다. 표지된, 예를 들어 바이오틴-표지된 2차 항-사이토카인 항체가 첨가된다. 그런 다음, 항체 사이토카인 복합체는 검출될 수 있다. 효소-접합 스트렙트아비딘-사이토카인-분비 세포(enzyme-conjugated streptavidin-cytokine-secreting cells)는 육안, 현미경 또는 전자적 검출 방법에 의해 "점"으로서 나타나게 될 것이다.
5.15.5 테트라머 측정
다른 실시예에서, "테트라머 염색" 측정(Altman et al. , 1996, Science 274: 94-96)이 항원-특정 T-세포를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시예에서, 종양 특정 항원과 같이 특정 펩타이드 항원을 포함하는 MHC 분자는가용성 펩타이드 테트라머를 만들기 위해 멀티머화될 수 있고, 예를 들어 스트렙트아비딘에 복합화함에 의해 표지될 수 있다. 그런 다음, MHC-펩타이드 항원 복합체는 hsp-펩타이드 복합체로 처리된 대상으로부터 얻어진 T-세포 모집단과 혼합된다. 바이오틴은 관심있는 항원, 즉 종양 특정 항원을 발현하는 T-세포를 염색하는데 사용될 수 있다.
5.16 입양면역요법과의 접합
입양면역요법은 암이나 감염성 질병을 치료하기 위한 치료적 접근법을 말는데, 본 예에서 처럼, 여기에서 면역 세포들은 세포들이 직접 또는 간접적으로 특정 면역성을 종양세포 및/또는 항원성 구성요소 또는 종양의 퇴행 또는 감염성 질환의 치료를 매개할 목적으로 숙주에 투여된다(U. S. Patent No. 5,985, 270, issued November 16,1999 참조, 상기 인용문헌은 인용에 의해서 그대로 본 명세서 안에 포함된다). 선택적인 단계로서, 본 명세서에 기술된 방법에 부합하여, APC는 항원성 (또는 면역원성) 분자와 복합화된 hsp로 민감화되고, 입양면역용법에서 사용된다.
특정 실시예에서, 투약의 어떠한 경로를 사용하여, 희석된 복합체의 투여에 의한 치료는 hsp-항원성 분자 복합체로 민감화된 APC를 사용한 입양면역용법과 선택적으로 결합될 수 있다. hsp-펩타이드 복합체-민감화 APC는 단독으로, 희석된 hsp-펩타이드 복합체와 결합되어, 또는 희석된 hsp-펩타이드 복합체의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다. 나아가, 진피내로 또는 점막으로 하는 방식이 바람직하지만, 투여 방식은 예를 들면 피하로, 정맥내로 또는 근육내로 등을 포함하여 다양할 수 있는데, 이에 한정되지는 않는다.
5.16.1 매크로파지와 항원 전달 세포의 획득
Inaba, K., et al.,1992, J. Exp.Med., 176: 1693-1702에 기재된 바와 같이,마크로파지, 가지세포와 B -세포를 포함하는, 그러나 이에 한정되지는 않는,항원-전달 세포는 바람직하게는 인간 말초 혈액 또는 골수로부터 줄기 및 선조(progenitor) 세포로부터 시험관내에서 생산됨으로써 얻어진다.
APC는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 다양한 방법 중에 하나로 부터 얻어질 수 있다. 바람직한 측면에서, 인간 마크로파지가 사용되는데, 인간 혈액 세포로부터 얻어진다. 예로서, 마크로파지는 다음과 같이 얻어질 수 있는데, 이에 한정되지는 않는다:
단핵 세포는 Ficoll-Hypaque 구배 원심분리에 의해 환자(바람직하게는 치료된 환자)의 말초혈액으로부터 분리되고, 환자 자신의 혈청으로 또는 다른 AB+인간 혈청으로 미리 코팅된 조직 배양 접시위에 심겨진다. 세포는 37℃에서 1시간동안 배양된 다음, 비부착 세포들은 피펫으로 제거된다. 접시에 남겨진 부착 세포에, 차가운(4℃) 포스페이트-완충된 염수내의 1 mM EDTA가 첨가되고, 접시는 15분간 상온에 남겨진다. 세포들은 수집되고, RPMI 버퍼로 세척되고, RPMI 버퍼에서 현탁된다. K., etal., 1992,J Exp. Med., 176: 1693-1702에 상세하게 기재된 바와 같이, 매크로파지의 증가된 수는 매크로파지-콜로니 자극인자(M-CSF)와 37℃에서 배양함으로써 얻어질 수 있고; 가지세포의 증가된 수는 과립백혈구-매크로파지-콜로니 자극인자(GM-CSF)와 배양함으로써 얻어질 수 있다.
5.16.2 매크로파지 및 APC와 hsp-펩타이드 복합체의 민감화
APC는 바람직하게는 시험관내에서 세포를 복합체와 배양함으로써 항원 분자에 결합된 hsp로 민감화될 수 있다. APC는 37℃에서 15분 내지 24시간동안 시험관내에서 hsp-복합체와 배양함으로써 hsp와 항원분자의 복합체로 민감화될 수 있다. 예로서, 그러나 이에 제한되지는 않는데, 4x107개의 매크로파지는 ml당 10마이크로그람의 gp96-펩타이드 복합체 또는 ml당 100마이크로그람의 hsp90-펩타이드 복합체와 37℃에서 15분 내지 24시간 동안 1ml 단순 RPMI 배지에서 배양될 수 있다. 세포들은 3회 세척되고, 바람직하게는 멸균된 생리적 배지에서 알맞은 농도(예를 들면 1 x l07/ml)에서 환자에 주사하기 위하여 재 현탁된다. 바람직하게는, 민감화된 APC가 주입되는 환자는 APC가 원래 분리된 환자이다(자가 실시예).
선택적으로, 민감화된 APC가, 예를 들여, 항원-특정, 클래스 I-제한 세포독성 T-림프구(CTL)를 자극하는 능력은 종양괴사를 완화하도록 CTLs를 자극하는 그들의 능력에 의해, 그리고 그러한 CTLs의 표적으로서 행동하는 그들의 능력에 의해 모니터될 수 있다.
5.16.3 민감화된 APC의 재주입
hsp-항원분자-민감화된 APC는 환자에게 전신적으로, 바람직하게는 정맥내로 통상적인 임상절차에 의해 재주입된다. 이러한 활성화된 세포는 우선적으로 전신투여에 의해 자가 환자 내로 재주입된다. 일반적으로 환자들은 환자의 조건에 따라서 약 106에서 약 1012의 민감화된 매크로파지를 받는다. 몇몇 요법에서, 선택적으로환자들은 사이토카인 IFN-α,IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, TNF 또는 다른 사이토카인 성장 인자를 포함하되 이에 제한되지는 않는 생물학적 반응 조절제의 적당한 복용량을 추가적으로 받는다.
5.17 수동 면역요법
본 발명의 조성물은 또한 암과 감염성 질명에 대한 수동 면역요법을 위해 사용될 수 있다. 수동면역은 이종 유래의 유기체에 대해 지정된 미리 형성된 항체의 투여에 의해 획득되는 숙주의 단기 보호이다. 예를 들면, 감염된 유기체로 감염된 세포로부터 얻어진 희석된 hsp-펩타이드 복합체를 포함하는 본 발명의 조성물은 대상에서 면역반응을 유발하는데 사용될 수 있고, 혈청은 대상으로부터 제거되고 다른 대상에서 감염성 유기체를 유발하는 질병의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
5.18 질병의 예방과 치료
본 발명에 따라, 항원성 펩타이드, 예를 들어 항원 세포 또는 바이러스성 입자의 소화된 시토졸성 및/또는 막-유래 단백질 및 hsp로부터 유래된 펩타이드의 복합체를 포함하는 본 발명의 조성물은 암 또는 감염성 질병을 갖는 대상에 투여된다. 하나의 실시예에서, "치료(treatment)" 또는 "치료하는 것(treating)"은 암 또는 감염성 질병의 개선, 또는 적어도 이들의 식별할 수 있는 증상을 말한다. 다른 실시예에서, "치료" 또는 "치료하는 것"는 암 또는 감염성 질병과 관련된 적어도하나의 측정가능한 물리적 파라미터의 개선을 말하는데, 대상에 의해 식별할 수 있을 필요는 없다. 또 다른 실시예에서, "치료" 또는 "치료하는 것"은 암 또는 감염성 질병의 진행을 저해하는 것으로서, 물리적으로, 예를 들어 식별 가능한 증상의 안정화, 또는 생리적으로, 예를 들어 물리적 파라미터의 안정화, 또는 양자 모두를 말한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 그러한 암 또는 감염성 질병에 대한 예방적인 조치로서 대상에 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "예방(prevention)" 또는 "예방하는 것(preventing)"은 주어진 암 또는 감염성 질병을 얻는 위험의 감소를 말한다. 상기 실시예의 하나의 방법에서, 본 발명의조성물은 암에 대한 유전학적 소인을 갖는 대상에 대해 예방적인 조치로서 투여된다. 상기 실시예의 다른 방법에서, 본 발명의 조성물은 화학약품, 방사능, 흡연 또는 이들의 조합을 포함하되 이에 한정되지는 않는 발암물질에 노출되어 있는 대상 또는 감염성 질병 인자에 노출되어 있는 대상에게 예방적인 조치로서 투여된다. 특정 실시예에서, 본 발명의조성물은 흡연과 같은 발암물질에 환경적으로 노출된 대상에게 예방적인 조치로서 투여된다.
예를 들면, 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물의 투여는 상기 조성물이 부재시 성장에 비하여 적어도 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80 %, 적어도 75 %, 적어도 70 %, 적어도 60 %, 적어도 50 %, 적어도 45 %, 적어도 40 %, 적어도 45 %, 적어도 35 %, 적어도 30 %, 적어도 25 %, 적어도 20 %, 또는 적어도 10% 만큼 암성 세포 또는 감염성 인자의 성장의 저해 또는 감소를 가져온다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 조성물은 항원 단백질의 모집단과 열 충격 단백질의 복합체를 포함한다. 상기 조성물은 종양 부위에서 염증 반응을 유도하는 것처럼 보이고, 궁극적으로는 치료된 암환자에서 종양 부하의 퇴행을 일으킬 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 조성물은 대상의 면역성을 향상시킬 수 있고, 감염성 인자에 대한 특정 면역성 또는 종양전 및 종양세포에 대한 특정 면역을 유발할 수 있다. 이러한 조성물은 감염성 질병의 발병과 진행을 막아주고 종양 세포의 성장과 진행을 저해하는 능력이 있다.
결합치료는 암이나 감염성 질병을 예방하거나 치료하기 위하여 hsp-펩타이드 복합체 또는 본 발명의 조성물과 다른 양식의 사용을 말한다. 본 발명의 복합체의투여는 항암제 또는 항 감염제의 효과를 증대시킬 수 있고, 그 역 또한 같다. 바람직하게는 이러한 추가적인 형태의 양식은 비hsp 기초 양식인데, 다시 말하면 이러한 양식은 구성요소로서 열 충격 단백질을 포함하지 않는다. 이러한 접근법은 일반적으로 결합치료, 부속치료 또는 연결치료로 명명된다(본 명세서에서는 용어가 교환가능하게 사용된다). 결합치료로, 부가 효능 또는 부가 치료 효과가 관찰될 수 있다. 치료 효능이 부가 보다 큰 상승 결과가 또한 기대될 수 있다. 결합치료의 사용은 또한 치료 방식 또는 hsp-펩타이드 복합체 단독 투여보다 더 나은 치료상을 제공할 수 있다. 부가 또는 상승효과는 불필요하거나 역효과를 감소시키거나 피할 수 있도록 각각 또는 양 방식의 복용량 및/또는 복용횟수가 조정될 수 있도록 할 수 있다.
다양한 특정 실시예에서, 결합치료는 치료 방식으로 치료된 대상에게 hsp-펩타이드 복합체의 투여를 포함하는데, 여기서 투여된 치료 방식만으로는 임상적으로 대상을 치료하는데 충분하지 않아, 그 대상은 추가적으로 효과적인 치료가 필요한데, 예를 들면 대상이 hsp-펩타이드 복합체를 복용하지 않고는 치료 방식에 반응하지 않는다. hsp-펩타이드 복합체를 치료 방식을 수용하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법은 그러한 실시예에 포함된다. 여기서 상기 대상은 치료에 반응하지만, 부작용, 재발, 발달 저항(develops resistance) 등을 겪는다. 그러한 대상은 단독의 치료방식으로 치료에 대해 반응하지 않거나 고질적일 수 있다. 즉, 암 세포 또는 병원체의 적어도 몇몇의 중요한 부분은 사멸되지 않거나 그들의 세포 분열은 정지되지 않는다. 상기 실시예들은 단독의 치료 방식에는 무반응인 대상에게 본 발명의 방법에 의해 관찰된 바와 같이 투여된 경우 hsp-펩타이드 복합체의 투여를 포함하는 본 발명의 방법은 치료 방식의 치료 효능을 향상시킬 수 있다. 치료 방식의 효능의 결정은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 방법을 이용하여 생체내 또는 시험관내에서 측정될 수 있다. 내화물질(refractory)의 기술상 인정된 의미는 암과 관련하여 잘 알려져 있다. 하나의 실시예에서, 상대적으로 암 세포 또는 병원체의 수가 대단히 감소되지 않거나 또는 증가된 경우, 암과 감염성 질병은 고질적이거나 반응성이 없다. 치료되어진 이러한 대상들 중에서 화학요법 또는 방사능 요법을 받은 대상들이다.
본 발명에 따라, 본 발명의 복합체는 많은 다른 유형의 치료 방식과 결합으로 사용될 수 있다. 그러한 방식의 일부는 암 또는 감염성 질경의 특정 유형에 대해 특히 유용하다. 많은 다른 양식들은 면역 시스템의 기능에 영향을 미치고, 일반적으로 종양과 감염성 질병 모두에 적용될 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 복합체는 암 또는 감염성 질병을 치료하기 위하여 하나 이상의 생물학적 반응 조절제와 결합하여 사용될 수 있다. 생물학적 반응 조절제의 한 그룹은 사이토카인이다. 하나의 실시예에서, 사이토카인은 hsp-펩타이드 복합체를 수용하는 대상에게 투여된다. 다른 실시예에서, hsp-복합체는 사이토카인과 결합하여 화학요법제를 수용하는 대상에게 투여된다. 다양한 실시에에서, 하나 이상의 사이토카인은 사용될 수 있고, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12,IFNα,IFNβ, IFNγ, TNFα, TNFβ, G-CSF, GM-CSF, TGF-β, IL-15, IL-18, GM-CSF, INF-γ, INF-α, SLC, 내피 단핵세포 활성 단백질(endothelial monocyte activating protein)-2 (EMAP2), MIP-3α, MIP-3β, 또는 HLA-B7와 같은 MHC 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적으로, 다른 전형적인 사이토카인은 TNF 계의 다른 구성원을 포함하는데, TNF-α-관련 아포프토시스-유발 리간드 (TRAIL), TNF-α-관련 활성화-유발 사이토카인(TRANCE), TNF-α-관련 아포프토시스의 약한 유발인자 (TWEAK), CD40 리간드 (CD40L), 림프독소 알파(LT-a), 림프독소 베타(LT-β), OX40 리간드(OX40L), 파스 리간드(Fas ligand) (FasL), CD27 리간드 (CD27L), CD30 리간드(CD30L), 41BB 리간다(41BBL), APRIL, LIGHT, TL1, TNFSF16, TNFSF17, 및 AITR-L, 또는 이들의 기능적인 부분을 포함하는데 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, TMF 계의 일반적인 개요에 관하여 Kwon et al., 1999, Curr.Opin. Immunol.11: 340-345 를 참조한다. 바람직하게, hsp-펩타이드 복합체는 치료 양식에 앞서 투여된다. 특정 실시예에서,본 발명의 하나 이상의 복합체는 암의 치료를 위하여 IL-12 와 결합하여 시클로포스포아미드(cyclophosphamide)를 수용하는 대상에게 투여된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 복합체는 면약 시스템의 다양한 리간드, 수용체 및 신호 전환 분자의 작용제 또는 대항제인 하나 이상의 생물학적 반응 조절제와 결합하여 사용된다. 예를 들면, 생물학적 반응 조절제는 톨(Toll)과 같은 수용체의 작용제(TLR-2, TLR-7, TLR-8 및 TLR-9; LPS; 41BB 리간드,OX40 리간드, ICOS, 및 CD40의 작용제; 및 파스 리간드(Fas ligand),PD1, 및 CTLA-4의 대항제를 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 작용제와 대항제는 항체, 항체 조각, 펩타이드, 펩타이드 유사(peptidomimetic) 화합물 및 다당류일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 복합체는 면역자극 핵산인 하나 이상의 생물학적 반응 조절제와 병용하여 사용된다. 그러한 핵산은 (그것의 대부분은 비메틸화된 CpG 모티프(motif)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드임) 척추동물 림프구세포들에 미토제닉(mitogenic)하고, 면역반응을 촉진하는 것으로 알려졌다. Woolridge, et al., 1997, Blood 89: 2994-2998 참조하기 바람. 그러한 올리고뉴클레오타이드는 국제특허출원 제 WO01/22972호, 제WO01/51083호, 제WO98/40100호 및 제WO99/61056호와 미국특허 제6,207,646호, 제6, 194,388호, 제6,218,371호, 제6,239,116호, 제6,429,199호 및 제6,406,705호에 잘 개시되어 있다. 상기 인용문헌들은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 안에 포함된다. YpG- 와 CpR-모티프를 포함하는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 올리고데옥시뉴클레오타이드와 같은 다른 종류의 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 Kandimalla et al. "Effect ofChemical Modifications of Cytosine and Guanine in a CpG-Motif of Oligonucleotides: Structure-Immunostimulatory Activity Relationships." Bioorganic & Medicinal Chemistry 9: 807-813 (2001)에 잘 개시되어 있다. 상기 인용문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 안에 포함된다. CpG 디뉴클레오타이드가 부족한 면역자극 올리고뉴클레오타이드 또한 포함되는데, 그것은 CpG 핵산이 그러한 것처럼 점막 루트(낮은 투여량의 투여도 포함) 또는 비경구적 루트를 통하여 고 용량으로 투여되었을 때 항체 반응을 증가시킨다. 그러나 그 반응은 Th2에 기초한 것이다(IgGl>>IgG2a). 미국특허 공개번호 제20010044416 A1호를 참고하기 바람, 이로써 상기 인용문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 안에 포함된다. 면역자극 올리고뉴클레오타이드의 활성을 측정하는 방법은 앞서 언급한 특허와 문헌들에서 기술한 것처럼 수행될 수 있다. 더욱이 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 그 활성을 조절하기 위하여 포스페이트 백본, 당, 뉴클레오베이스 및 인터뉴클레오타이드(internucleotide) 연결에서 조정될 수 있다. 그러한 변형은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 복합체는 하나 이상의 애주번트(adjuvant)와 병용하여 사용된다. 애주번트는 분리되어 투여되거나 본 발명의 복합체와 혼합된 조성물에 존재하는 형태로 투여될 수도 있다. 전신적 애주번트는 비 경구적으로 투여가능한 애주번트이다. 전신적 애주번트는 데포(depot) 효과를 나타낼 수 있는 애주번트, 면역 시스템을 자극하는 애주번트, 및 양쪽 기능을 모두 가지고 있는 애주번트이다. 여기에서 사용된 데포 효과를 발휘하는 애주번트는 항원이 체내에서 천천히 방출되도록 하는 애주번트로, 이로써 면역 세포의 항원에의 노출을 지속한다. 이러한 종류의 애주번트는 알룸(alum)(예를 들어 알루니늄 포스페이트); 또는 Montanide 애주번트(예를 들어 Montanide ISA 720, AirLiquide, Paris, France)의 Seppic ISA 계열과 같은 미네랄 오일, 비-미네랄 오일, 오일 인-유중수(water-in-oil) 또는 수중유(oil-in-water) 에멀젼, 수중유 에멀젼을 포함하는 에멀젼-기초 제제; MF-59 (스팬 85와 트윈 80으로 안정화된 스쿠알렌-in-수 에멀젼; Chiron Corporation, Emeryville, Calif.); 및 PROVAX (안정화 계면활성제와 미셀형성제를 포함하는 수중유 에멀젼); IDEC (Pharmaceuticals Corporation, San Diego, Calif.)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 애주번트는 면역 시스템을 자극한다. 예를 들어 면역 세포가 사이토카인 또는 IgG를 생성 및 분비하도록 유도한다. 이러한 종류의 애주번트는 CpG 올리고뉴클레오타이드와 같은 면역자극 핵산; QS21과 같은Q. saponaria나무의 나무껍질로부터 정제된 사포닌; 폴리[디(카르복시라토펜(carboxylatophen)-옥시) 포스파젠(PCPP polymer; Virus Research Institute, USA); 모노포스포릴 리피드 A(MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.), 뮤라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide)(MDP; Ribi) 및 트레오닐(threomyl)-뮤라밀 디펩타이드(t-MDP; Ribi)와 같은 리포폴리사카라이드(LPS)의 유도체; OM-174(리피드 A와 관련된 글루코사민 디사카라이드; OM Pharma SA, Meyrin, Switzerland); 및 레슈마니아 에론게이션 인자(Leishmania elongation factor) (정제된 레슈마니아 단백질; Corixa Corporation, Seattle, Wash.), 아미노알킬 글루코사민 포스페이트(AGP; Corixa Corporation,Seattle, Wash.)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 전신적 애주번트는 데포 효과를 나타내고 면역 시스템을 자극하는 애주번트이다. 이러한 화합물은 전신적 애주번트의 위에서 확인된 두 가지 기능을 모두 가진 화합물이다. 이러한 종류의 애주번트는 ISCOMs (혼합된 사포닌, 지질을 포함하고 항원을 담을 수 있는 구멍을 가진 바이러스 크기의 입자를 형성하는 면역자극 복합체; CSL, Melbourne, Australia); SB-AS2 (SmithKline Beecham adjuvant system #2, 이것은 MPL과 QS21를 함유하는 수중유 에멀젼임: SmithKline Beecham Biologicals[SBB], Rixensart, Belgium); SB-AS4 (SmithKline Beecham adjuvant system #4, 이것은 alum과 MPL을 함유함; SBB, Belgium); CRL 1005(이것은 폴리옥시에틸렌 체인에 의하여 플랭크된(flanked) 소수성 폴리옥시프로필렌의 단일 선상 체인을 포함함; Vaxcel,Inc., Norcross, Ga.)와 같은 미셀을 형성하는 비-이온성 블록 코폴리머; 및 Syntex 애주번트 제제(SAF, 트윈 80과 비이온성 블록 코폴리머를 함유하는 수중유형 에멀젼; Syntex Chemicals,Inc., Boulder, Colo.)을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따라 유용한 점막 애주번트는 본 발명의 복합체와 함께 점막 표면에 투여되었을 때 대상에서 점막 면역 반응을 유도할 수 있는 애주번트이다. 점막 애주번트는 CpG 핵산(예를 들어 PCT특허 제WO99/61056호), 박테리아 톡신: 예를 들어 콜레라 톡신(CT), CT B 서브유닛(CTB)(Wu et al., 1998, Tochikubo et al., 1998); CTD53 (Val to Asp) (Fontana et al., 1995); CTK97 (Val to Lys) (Fontana et al., 1995); CTK104 (Tyr to Lys) (Fontana et al., 1995); CTD53/K63 (Val toAsp, Ser to Lys) (Fontanaet al., 1995); CTH54 (Arg to His) (Fontana et al., 1995); CTN107 (His to Asn) (Fontana et al., 1995); CTE114 (Ser to Glu) (Fontana et al., 1995); CTE112K (Glu to Lys) (Yamamoto et al., 1997a); CTS61F (Ser to Phe) (Yamamoto et al., 1997a, 1997b); CTS106 (Pro to Lys) (Douce et al., 1997, Fontana etal., 1995); 및 CTK63 (Ser to Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995)을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, CT 유도체;Zonula occludens톡신, zot, 대장균 열-민간(labile) 엔테로 톡신, 민간 톡신(Labile Toxin)(LT), LT B subunit (LTB) (Verweij et al., 1998); LT7K (Arg to Lys) (Komase et al., 1998, Douceet al., 1995); LT61F (Ser to Phe) (Komase et al., 1998) ;LT112K (Glu to Lys) (Komase et al.,1998) ; LT118E (Gly to Glu) (Komase et al., 1998); LT146E (Arg to Glu) (Komase et al., 1998); LT192G (Arg to Gly) (Komase et al., 1998); LTK63 (Ser to Lys) (Marchetti et al., 1998, Douce et al., 1997, 1998, DiTommaso etal., 1996); 및 LTR72 (Ala to Arg) (Giuliani et al., 1998)를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, LT 유도체, PT-9K/129G (Roberts et al., 1995, Cropleyet al., 1995)를 포함하는 백일해 독소, PT(Lycke et al., 1992, Spangler BD, 1992, Freytag and Clemments, 1999, Roberts et al., 1995, Wilsonet al., 1995); 독소 유도체(아래 참조) (Holmgren et al., 1993, Verweij et al., 1998, Rappuoli et al., 1995, Freytag and Clements, 1999); 리피드 A 유도체(예를 들어 모노포스포릴 리피드 A, MPL) (Sasaki et al., 1998, Vancott et al., 1998; 뮤라밀 디펩타이드(MDP) 유도체(Fukushima et al., 1996, Ogawa et al., 1989, Michalek et al., 1983, Morisaki et al., 1983); 박테리아 외막 단백질(예를 들어 Borrelia burgdorferi의 외막 단백질 A (OspA) 리포단백질,Neisseria meningitidis의 외막 단백질 (Marinaro et al., 1999, Van de Verget al., 1996); 수중유 에멀젼(예를 들어 MF59) (Barchfieldetal., 1999, Verschooret al., 1999, O'Hagan, 1998); 알루미늄 염(Isakaet al., 1998,1999); 및 사포닌 (예를 들어 QS21) Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worster, Me.) (Sasakietal., 1998, MacNeal et al., 1998), ISCOMs, MF-59 (a squalene-in-water emulsion stabilized with Span 85 and Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, Calif.); Montanide 애주번트의 Seppic ISA 계열 (예를 들어 Montanide ISA 720; AirLiquide, Paris, France); PROVAX (안정화 계면활성제와 미셀-형성화제를 포함하는 수중유 에멀젼; IDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego, Calif.); Syntext 애주번트 제제(SAF; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, Colo.); 폴리[디(카르복실라토페녹시(carboxylatophenoxy))포스파젠(PCPP polymer; Virus Research Institute, USA) 및 레슈마니아 에론게이션 인자 (Corixa Corporation, Seattle, Wash.)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
5.18.1 암의 치료
일 실시예에서, 병용 치료는 본 발명의 복합체의 투여에 더하여 암의 치료 또는 예방에 도움이 되는 하나 이상의 성분의 부속적 사용을 포함한다. 성분의 예는 화학요법제, 면역요법제, 항-안지오제닉 성분, 사이토카인, 호르몬, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 방사선 및 포토다이나믹 치료성분을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시예에서, 병용 치료는 암의 재발생을 막기 위해서, 전이를 억제하기 위해서, 또는 암 또는 전이의 성장 및/또는 전파를 억제하기 위해서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 치료 또는 예방될 수 있는 암의 종류는 예를 들어 피브로사코마(fibrosarcoma), 점액 육중, 리포사코마(liposarcoma), 콘드로사코마(chondrosarcoma), 골 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 시노비오마(synovioma), 메소테이로마(mesothelioma), Ewing's tumor, 평활근 육종(leiomyosarcoma), 횡문근 육종, 대장 육종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포(squamous cell) 육종, 기저 세포 육종, 선암종, 땀샘 육종, 지방선 육종, 유두 암종(papillary carcinoma), 유두 선암종, 낭샘 선아종(cystadenocarcinoma), 골수 육종, 기관지유래(bronchogenic) 육종, 신장 세포 육종, 간암, 담관 육종, 융모막암종(choriocarcinoma), 고환종(seminoma), 배아 육종, Wilms 종양, 목 암, 고환 암, 폐 육종, 작은 세포 폐 육종, 방광 육종, 상피 육종, 신경교종, 별아교세포종(astrocytoma), 속질모세포종(medulloblastoma), 머리인두종(craniopharyngioma), 뇌실막세포종(ependymoma), 솔방울샘종(pinealoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 청각 신경종(acoustic neuroma), 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 수막종(meningioma), 흑색종(melanoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma) 등과 같은 인간 육종(sarcoma)과암(carcinoma), 예를 들어 급성 림포구 백혈병, 급성 골수구 백혈병(myeloblastic, promyelocytic, myelomonocytic, monocytic 및 erythroleukemia)과 같은 백혈병; 만성 백혈병(만성 골수구 (과립세포) 백혈병과 만성 림포구 백혈병); 및 진성 적혈구 증가증, 림프종(Hodgkin 질환과 비-Hodgkin 질환), 다발 골수종(multiple myeloma), Waldenstrom 마크로글로블린혈증(macroglobulinemia), 및 중연쇄 질환(heavy chain disease)을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 실시예에서, 암을 가진 환자는 hsp-펩타이드 복합체 또는 hsp-민감화(sensitized) APC의 투여 전에 항-암 치료(예를 들어 화학치료 방사선)를 받기 때문에 면역 억제된다.
본 발명에 의해 제공되어 지는 면역치료가 암 환자를 위한 용도로 바람직한 많은 이유가 있다. 첫째, 마취제를 이용한 수술은 면역억제를 야기한다. 수술 전에 적절한 면역치료를 받는다면 이러한 면역억제는 예방되거나 막아질 수도 있다. 이것은 감염성 합병증의 발생을 줄일 것이고 더 빠른 상처 치료를 유도할 것이다. 둘째, 종양 크기는 수술 후 최소이고, 이러한 상황에서 면역치료는 가장 효과적일 것이다. 세 번째 이유는 종양 세포가 수술 시 순환계로 전파되고 이러한 경우에 적용된 효과적 면역치료는 이러한 세포를 제거할 수 있다는 가능성이다.
본 발명의 예방적 및 치료적 방법은 수술 전에, 도중에, 또는 후에 암 환자의 면역능력(immunocompetence)을 증진하고, 암-특이 면역이 암 세포를 죽이도록 유도하고, 총 암의 퇴화 및 박멸이라는 궁극적인 임상 목표에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 예를 들어 가족력 또는 환경적 위험 요인 때문에 특정 암이 걸릴 위험이 큰 개체에게 사용될 수 있다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 복합체와 함께, 하나 이상의 항암 성분이 암 환자를 치료하기 위하여 투여된다. 항-암 성분은 종양 또는 암의 치료에 도움이 되는 어떠한 분자 또는 화합물을 의미한다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 항-암 성분의 예는 아시비신(acivicin); 아크라루비신; 아코다졸 하이드로클로라이드; 아크로닌; 아도제레신; 알데스루킨; 알트레타민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 아미노글루데티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스퍼린; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이선; 바티마스타드(batimastat); 벤조데파; 비카루타마이드; 비산트렌 하이드로클로라이드; 비스나화이드 디메실레이트(bisnafide dimesylate); 비제레신; 블레오마이신 설페이트; 브레퀴나르 소디움; 브로피리민; 부설펀; 칵티노마이신; 카루스테론; 카라세마이드; 카르베티머; 카보플라틴; 카르무스틴; 카루비신 하이드로클로라이드; 카르제레신; 케데핀골; 클로람부실; 시로레마이신; 시스플라틴; 크라드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 사이클로포스파마이드; 사이타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 데시타빈; 덱소르마플라틴(dexormaplatin); 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지퀴논; 도세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 하이드로클로라이드; 드록속시펜(droloxifene); 드록속시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 다우조마이신; 에다트렉세이트; 에플로니틴(eflornithine) 하이드로클로라이드; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로페딘; 에피루비신 하이드로클로라이드; 에르부로졸; 에소루비신 하이드로클로라이드; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴포스페이트 소디움; 에타니다졸; 에토포사이드; 에토포사이드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 하이드로클로라이드; 파자라빈; 펜레디나이드; 플로쑤리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 소디움; 젬시타빈; 젬시타빈 하이드로클로라이드; 하이드록시우레아; 이다루비신 하이드로클로라이드; 이포스파마이드; 일모포신; 인터루킨 II (재조합 인터루킨 II 또는 rIL2 포함); 인터페론 α-2a; 인터페론 α-2b; 인터페론 α-nl; 인터페론 α-n3; 인터페론 β-Ia; 인터페론 γ-Ib; 이프로플리틴; 이리노테칸 하이드로클로라이드; 란레오타이드 아세테이트; 레트로졸; 루프로라이드 아세테이트; 리아로졸 하이드로클로라이드; 로메트렉솔 소디움; 로무스틴; 로소탄트론 하이드로클로라이드; 마소프로콜; 마이탄신; 메크로레타민 하이드로클로라이드; 메게스트롤 아세테이트; 멜파란; 메노가릴; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 소디움; 메토프린; 메투레데파; 미틴도마이드; 미토카신; 미토크로민; 미토기린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미토탄트론 하이드로클로라이드; 미코페놀릭 산; 노코다졸; 노가라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 파크리탁셀; 페가스파라가제; 페리마이신; 펜타무스틴; 페프로마이신 설페이트; 페포스파이드; 피포브로만; 피포설판; 피로탄트론 하이드로클로라이드; 프리카마이신; 플로메스탄; 포르피머(porifmer) 소디움; 포르리로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진 하이드로클로라이드; 푸로마이신; 푸로마이신 하이드로클로라이드; 피라조푸린; 리보프린; 로그레티마이드; 사핀골; 사핀골 하이드로클로라이드; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 소디움; 스파르소마이신; 스피로겔마니움 하이드로클로라이드; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 서로레누르(sulofenur); 탈리소마이신; 테코갈란 소디움; 테가푸르; 테로탄트론 하이드로클로라이드; 테모포르핀; 테니포사이드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 토레미펜 시트레이트; 트레스토론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트립토레린; 튜부로졸 하이드로클로라이드; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오타이드; 베르테포핀; 빈블라스틴 설페이트; 빈크리스틴 설페이트; 빈데신; 빈데신 설페이트; 빈에피딘 설페이트; 빈글리시네이트 설페이트; 빈루로신 설페이트; 빈오렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 설페이트; 빈조리딘 설페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 하이드로클로라이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
사용될 수 있는 다른 항-암 성분은 20-epi-1,25 디하이드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아크라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도제레신; 알데스루킨; ALL-TK 길항제; 알트레타민; 암부무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레부리닉 산; 암루비신; 암사크린; 아나그레라이드; 아나스트로졸; 안드로그라포라이드; 안지오제네시스 억제제; 길항제 D; 길항제 G; 안타레릭스; 항-도살라이징(dorsalizing) 형태생성 단백질-1; 안티안드로겐; 전립선 육종; 안티에스트로겐; 안티네오프라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 아피디콜린 글리시네이트; 아폽토시스 유전제 조절제; 아폽토시스 레귤레이터; 아퓨리닉 산; 아라-CDP-DL-PTBA; 아기니 디아미나제; 아설아크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자타이로신; 박카틴 III 유도체; 바라놀; 바티마스타트; BCR/ABL 길항제; 벤조크로린; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-아레틴; 베타트라마이신 B; 베투리닉 산; bFGF 억제제; 비칼루타마이드; 비산트렌; 비사지리디닐스퍼민; 비스나파이드; 비스트라텐 A; 비제레신; 레프레이트(reflate); 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 설폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄프토테신 유도체; 카나리폭스(canarypox) IL-2; 카페시타빈; 카복사마이드-아미노-트리아졸; 카복시아미도트리아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골 유래 억제제; 카르제레신; 카제인 키나제 억제제(ICOS); 카스타노스퍼민; 케트로핀 B; 세트로레릭스; 크로르린; 클로로퀴녹사린 설폰아미드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 크라리빈; 크로미펜 유사체; 크로트리마졸; 콜리스마이신; 시사프로스트; 시스-포피린; 클라드리빈; 크로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 유사체; 코나게닌; 크람베스시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 큐라신 A; 사이클로펜탄트라퀴논; 사이클로프라탐; 시페마이신; 사이타라비네오크포스페이트 (cytarabineocfosfate); 세포 용해 인자; 사이토스타틴; 다크릭시마브; 데시타빈; 데하이드로디뎀민 B; 데스로레린; 덱사메타손; 덱시포스파미드; 덱스라조탄; 덱스베라파밀; 이다지퀴온; 디뎀닌 B; 디독스; 디에틸노르스퍼민; 디하이드로-5-아자사이티딘; 디하이드로탁솔, 9-; 디옥사마이신; 디페닐 스피로무스틴; 도세탁셀; 도코사놀; 도라세트론; 독시플루리딘; 드록시펜; 드로나비놀; 듀오카르마이신 SA; 에브세렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레코로마브; 에프로니틴; 에레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에피리스테라이드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로겐 작용제; 에스트로겐 길항제; 에타니다졸; 에토포사이드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티나이드; 필그라스팀; 피나스테라이드; 플라보피리돌; 플레제라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 하이드로클로라이드; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가도리니움 텍사피린; 갈리움 니트레이트; 갈로시타빈; 가니레릭스; 젤라틴아제 억제제; 겜시타빈; 글루타치온 억제제; 헵설팜; 헤레구린; 헥사메틸렌 비사세타마이드; 하이퍼리신; 이반드로닉 산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 이로마스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역억제 펩타이드; 인슐린-유사 성장인잔-1 수용체 억제제; 인터페론 작용제; 인터페론; 인터루킨; 이오벤구안; 아이오도독소루비신; 이포메아놀, 4-; 이로프락트; 이르소그라딘; 이소벤가졸; 이소호모하리콘드린 B; 이타세트론; 자스프라키노라이드; 카하라라이드 F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오타이드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 설페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 억제 인자; 류코사이트 α 인터페론; 루프로라이드+에스트로겐+프로게스테론; 루프로레린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 유사체; 리포폴릭 디사카라이드 펩타이드; 리포폴릭 백금 화합물; 리스소크린아미드 7; 로바프라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로소탄트론; 로바스타틴; 록소리빈; 루토테칸; 루테티움 텍사피린; 라이소필린; 라이틱 펩타이드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트리라이신 억제제; 매트릭스 메탈로프로테인아제 억제제; 메노가릴; 메르바론; 메테레린; 메치오닌아제; 메토크로프라마이드; MIF 억제제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 미스매치 이중 가닥 RNA; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신유사체; 미토나파이드; 미토톡신 섬유아세포 성장 인자-사포닌; 미토싼트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 모노클로날 항체; 인간 크리오닉 고나도트로핀; 모노포스포릴 리피드 A+마오박테리움 세포 벽 sk; 모피다몰; 다발 약물 억제 유전자 억제제; 다발 종양 억제제 1-기초 치료; 머스타드 항-암 성분; 미카페록사이드 B; 마이코박테리알 세포 벽 추출물; 미라아포론; N-아세틸디나린; N-치환 벤즈아미드; 나파레린; 나그레스팁; 나록손+펜타조신; 나파빈; 나프테핀; 나르토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드로닉 산; 중성 엔도펩티다제; 니루타이드; 니사마이신; 니트릭 옥사이드 조절제; 니트록사이드 항산화제; 니트루린; 06-벤질구아닌; 옥트레오타이드; 오키세논; 올리고뉴클레오타이드; 오나프리스톤; 온단스테론; 온단스테론; 오라신; 경구용 사이토카인 인듀서; 오르마프라틴; 오사테론; 옥사리프라틴; 옥사우노마이신; 파크리탁셀; 파크리탁셀 유사체; 파크리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드로닉 산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가스파라가제; 펠데신; 펜토산 폴리설페이트 소디움; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스파미드; 페리릴 알코올; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 억제제; 피시바닐; 필로카르핀 하이드로클로라이드; 피라루비신; 피리트렉심; 프라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성화 억제제; 플라티눔 복합체; 플라티눔 화합물; 플라티눔-트리아민 복합체; 포르피머 소디움; 포르피로마이신; 프레드니손; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테오솜 억제제; 단백질 A-기초 면역 조절제; 단백질 키나제 C 억제제; 마이크로알갈; 단백질 타이로신 포스파타제 억제제; 퓨린 뉴클레오사이트 포스포릴아제 억제제; 퓨르푸린; 피라조로아크리딘;피리독실레이트 헤모글로빈; 폴리옥시에틸렌 컨주게이트; raf 길항제; 랄티트렉씨드; 라모세트론; ras 파네실 단백질 트랜스페라제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 레텔립틴 디메틸레이티드; 레니움 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레틴아미드; 로그레티마이드; 로히투킨; 로무타이드; 로퀴니멕스; 루비기논 B1; 루복실; 사핀골; 사인토핀; SarCNU; 사코피톨 A; 사르크라모스팀; Sdi 1 미메틱스(mimetics); 세무스틴; 세네센쓰 유래 억제제 1; 센스 올리고뉴클레오타이드; 시그날 트랜스덕션 억제제; 시그날 트랜스덕션 조절제; 싱글 체인 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 소디움 보로캅테이트; 소디움 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네민; 스파포식 산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스프레노펜틴; 스폰지스타틴 1; 스부알아민; 줄기 세포 억제제; 줄기 세포 분할 억제제; 스티피아마이드; 스트로메라이신 억제제; 설피노신; 초활성 혈관활성 장 펩타이드 길항제 (superactive vasoactive intestinal peptide antagonist); 수라디스타; 수라민; 스와인소닌; 합성 글루코사미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메티오다이드; 타우무스틴; 타자로텐; 테코갈란 소디움; 테가퓨어(tegafur); 텔루라피리리움; 텔로머라제 억제제; 테모포핀; 테모조로마이드; 테니포사이드; 테트라클로로데카옥사이드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 티오코라린; 트롭보포이에틴; 트롬보포이에틴 미메틱스(mimetics); 티말파신; 티모포이에틴 수용체 작용제; 티모트리난; 티로이드 자극 호르몬; 틴 에틸 에티오푸프푸린; 티라파자민; 티타노쎈 비클로라이드; 톱센틴; 토레미펜; 토티포텐트 줄기 세포 인자; 번역 억제제; 트레티노인; 트리아세틸우리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트리프토레린; 트로피세트론; 튜로스테라이드; 타이로신 키나제 억제제; 타이르포스틴; UBC 억제제; 우베니멕스; 우로게니탈 시누스-유래 성장 억제 인자; 우로키나제 수용체 길항제; 바프레오타이드; 바리오린 B; 벡터 시스템, 적혈구 유전자 치료; 베라레솔; 베라민; 베르딘; 베르테포핀; 비노렐빈; 빈쌀틴(vinxaltine); 비탁신; 비로졸; 자노테론; 제니플라틴; 지라스코르브; 및 지노스타틴 스티마라머(stimalamer)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
항-암 성분은 다음을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 화학요법제일 수 있다: 세포독성 항생제, 항대사제, 항-유사분열 성분, 알킬화제, 백금 화합물, 비소 화합물, DNA 토포아이소머라제 억제제, 탁산, 뉴클레오사이드 유사체, 식물 알칼로이드, 및 톡신; 및 그들의 합성 유도체. 표 1에 그 그룹의 예시적 화합물들을 개시하였다.
알킬화제
니트로겐 머스타드:(Nitrogen mustards) 사이클로포스파이드(cyclophosphamide)
이포스파미드
트로포스파미드
클로람뷰실
니트로소우레아: 카무스틴(BCNU)
로무스틴(CCNU)
알킬설포네이트: 부설판
크레오설판
트리아젠: 다카바진
백금 함유 화합물: 시스플라틴
카보플라틴
아로플라틴
옥사리플라틴
식물 알칼로이드
빈카 알칼로이드: 빈크리스틴
빈블라스틴
빈데신
비노렐빈
탁소이드(Taxoid): 파크리탁셀
도세탁솔
DNA 토포아이소머라제 억제제
에피포도필린: 에토포사이드
테니포사이드
토포테칸
9-아니모캄프토테씬
캄프로테씬
크리스나톨
미토마이신: 미토마이신 C
항-폴레이트(anti-folate)
DHFR 억제제: 메토트렉세이트
트리메트렉세이트
IMP 디하이드로게나제 억제제: 미코페놀릭 산
티아졸퓨린
리바비린
EICAR
리보뉴틀레오타이드 리덕타제 억제제: 하이드록시우레아
데페록사민
피리미딘 유사체:
우라실 유사체: 5-풀루오로우라실
플록스우리딘(floxuridine)
독시플루리딘
라티트렉세이드
사이토신 유사체: 사이타라빈(ara C)
사이토신 아라비노사이드
플루다라빈
퓨린 유사체: 머캅토퓨린
티오구아닌
DNA 항대사체: 3-HP
2'-데옥시-5-플루오로우리딘
5-HP
α-TGDR
알피디코린 글리시네이트
ara-C
5-아자-2'-데옥시사이티딘
베타-TGDR
사이클로시티딘
구아나졸
이노신 글리코디알데히드
마세베신 II
파이라졸로이미다졸
항-유사분열제: (antimitotic agents) 알로콜키친
할리콘드린 B
콜키친
콜키친 유도체
돌스타틴 10
마이탄신
리족신(rhizoxin)
티오콜키친
트리틸 시스테인
기타
이소프레닐레이션 억제제:(isoprenylation inhibitor)
도파민성 신경톡신: 1-메틸-4-페닐피리디니움 이온
세포 사이클 억제제: 스타우로스포린
액티노마이신: 액티노마이신 D
닥티노마이신
블레오마이신: 블레오마이신 A2
블레오마이신 B2
페프로마이신
안트라사이크린: 다우노루비신
독소루비신(아드리아마이신)
이다루비신
에피루비신
피라루비신
조루비신
미토산트론
MDR 억제제: 베라파밀
Ca+2APTase 억제제: 타프시가르긴(Thapsigargin)
하나 이상의 화학요법제(예를 들어 FLAG, CHOP)를 포함하는 조성물 또한 본 발명에 의해 개시되어 진다. FLAG은 플루다라빈, 사이토신 아라비노사이드(Ara-C) 및 G-CSF를 포함한다. CHOP는 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소구비신, 및 프레드니손을 포함한다. 앞서 나온 각각의 리스트는 예시적인 것이며, 본 발명을 제한하도록 의도된 것은 아니다.
일실시예에서, 유방암은 본 발명의 복합체와 함께 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 도세탁셀, 독소루비신, HERCEPTIN®, 젬시타빈, IL-2, 파크리탁셀, 및/또는 VP-16(에토포사이드)를 포함하는 조성물에 의하여 치료될 수 있다.
다른 실시예에서, 전립선암은 본 발명의 복합체와 함께 파크리탁셀, 도세탁셀, 미토산트론, 및/또는 안드로젠 수용체 길항제(예를 들어 플루타미드)를 포함하는 조성물에 의하여 치료될 수 있다.
다른 실시예에서, 백혈병은 본 발명의 복합체와 함께 플루다라빈, 사이토신 아라비노사이드, 젬투주마브(MYLOTARG), 다우노루비신, 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 6-머캅토퓨린, 이다루비신, 미토산트론, 에토포사이드, 아스파라기나제, 프레드니손 및/또는 사이클로포스파마이드를 포함하는 조성물에 의하여 치료될 수 있다. 다른 실시예로서, 골수종은 본 발명의 복합체와 덱사메타손을 포함하는 약학적 조성물에 의하여 치료될 수 있다. 바람직하게는, 백혈병은 만성 골수 백혈병(CML), Hsp-펩타이드 복합체는 hsp70-펩타이드 복합체를 포함하고, 치료적 성분은 이만티니브 메실레이트 또는 GLEEVECTM를 포함한다.
다른 실시예에서, 멜라닌종은 본 발명의 복합체와 다카바진(dacarbazine)을 함께 포함하는 약학적 조성물에 의하여 치료될 수 있다.
다른 실시예에서, 직장결장 암은 본 발명의 복합체와 이리노테칸(irinotecan)을 함께 포함하는 약학적 조성물에 의하여 치료될 수 있다.
다른 실시예에서, 폐암은 본 발명의 복합체와 파크리탁셀, 도세탁셀, 에토포사이드 및/또는 시스플라틴을 함께 포함하는 약학적 조성물에 의하여 치료될 수 있다.
다른 실시예에서, 비-Hodgkin 림프종은 본 발명의 복합체와 사이클로포스파이드, CHOP, 에토포사이드, 블레오마이신, 미토산트론 및/또는 시스플라틴을 함께 포함하는 약학적 조성물에 의하여 치료될 수 있다.
다른 실시예에서, 위암은 본 발명의 복합체와 시스플라틴을 함께 포함하는 약학적 조성물에 의하여 치료될 수 있다.
다른 실시예에서, 췌장암은 본 발명의 복합체와 젬시타빈(gemcitabine)을 함께 포함하는 약학적 조성물에 의하여 치료될 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 복합체는 암의 치료 또는 예방을 위하여 항-암 성분 투여 전에, 연속적으로, 또는 동시에 투여될 수 있다. 암의 종류, 대상의 병력 및 상태, 및 선택된 항-암 성분에 따라서, 본 발명의 복합체는 화학치료의 투여량과 투여시기에 따라 조정될 수 있다.
본 발명의 복합체의 사용은 화학요법의 처방에 더해질 수 있다. 일실시예에서, 화학요법제는 100 내지 1000mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 젬시타빈이다. 일실시예에서, 화학요법제는 200 내지 4000mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 다카바진이다. 바람직한 실시예에서, 다카바진의 투여량의 범위는 700 내지 1000mg/m2/cycle이다. 다른 실시예에서, 화학요법제는 25 내지 50mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 플루다라빈이다. 다른 실시예에서, 화학요법제는 200 내지 2000mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 사이토신 아라비노사이드(Ara-C)이다. 다른 실시예에서, 화학요법제는 1.5 내지 7.5mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 도세탁셀이다. 다른 실시예에서, 화학요법제는 5 내지 15mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 파크리탁셀이다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 5 내지 20mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 시스플라틴이다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 5 내지 20mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 5-플루오로우라실이다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 2 내지 8mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 독소루비신이다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 40 내지 160mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin)이다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 50 내지 200mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 사이클로포스파미드이다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 50 내지 75, 75 내지 100, 100 내지 125, 또는 125 내지 150mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 이리노테칸이다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 3.7 내지 5.4, 5.5 내지 7.4, 7.5 내지 11, 또는 11 내지 18.5mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 빈블라스틴이다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 0.7 내지 1.4, 또는 1.5 내지 2mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 빈크리스틴이다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 3.3 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 100, 또는 100 내지 1000mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 메토트렉세이트이다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 병용 치료 요법의 일부로써 투여될 때 낮은 용량의 화학요법제의 사용을 더욱 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 복합체를 이용한 초기 치료는 화학요법제의 투여를 이용한 계속적인 치료에 있어 암의 민감도를 증가시키고, 이 경우의 투여량은 그 화합요법제가 본 발명의 복합체 없이 투여되는 경우 투여량의 낮은 범위 보다 낮거나 유사하다.
일실시예에서, 본 발명의 복합체와 낮은 투여량(예를 들어 6 내지 60mg/m2/day이거나 더 작은 경우)의 도세탁셀은 암 환자에 투여된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 복합체와 낮은 투여량(예를 들어 10 내지 135mg/m2/day이거나 더 작은 경우)의 파크리탁셀은 암 환자에 투여된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 복합체와 낮은 투여량(예를 들어 2.5 내지 25mg/m2/day이거나 더 작은 경우)의 플루다라빈은 암 환자에 투여된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 복합체와 낮은 투여량(예를 들어 0.5 내지 1.5mg/m2/day이거나 더 작은 경우)의 사이토신 아라비노사이드(Ara-C)는 암 환자에 투여된다. 다른 실시예에서, 화학요법제는 10 내지 100mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 젬시타빈이다. 다른 실시예에서, 화학요법제는 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 40, 또는 40 내지 75mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 예를 들어 PLATINOL 또는 PLATINOL-AQ (Bristol Myers)와 같은 시스플라틴이다. 또 다른 실시예에서, 7.5 내지 75mg/m2/cycle 범위의 시스플라틴 투여량이 난소암을 가진 환자에게 투여된다. 또 다른 실시예에서, 5 내지 50mg/m2/cycle 범위의 시스플라틴 투여량이 방광암을 가진 환자에게 투여된다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 2 내지 4, 4 내지 8, 8 내지 16, 16 내지 35, 또는 35 내지 75mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 예를 들어 PARAPLATIN(Bristol Myers)와 같은 카보플라틴이다. 또 다른 실시예에서, 7.5 내지 75mg/m2/cycle 범위의 카보플라틴 투여량이 난소암을 가진 환자에게 투여된다. 다른 실시예에서, 5 내지 50mg/m2/cycle 범위의 카보플라틴 투여량이 방광암을 가진 환자에게 투여된다. 또 다른 실시예에서, 2 내지 20mg/m2/cycle 범위의 카보플라틴 투여량이 고환암을 가진 환자에게 투여된다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 6 내지 10, 10 내지 30, 또는 30 내지 60mg/m2/cycle의 범위로 투여되는 예를 들어 TAXOTERE(Rhone Poulenc Rorer)와 같은 도세탁셀(docetaxel)이다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 10 내지 20, 20 내지 40, 40 내지 70, 또는 70 내지 135mg/kg/cycle의 범위로 투여되는 예를 들어 TAXOL (Bristol Myers Squibb)과 같은 파크리탁셀이다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 0.5 내지 5mg/kg/cycle의 범위로 투여되는 5-플루오로우라실이다. 또 다른 실시예에서, 화학요법제는 2 내지 4, 4 내지 8, 8 내지 15, 15 내지 30, 또는 30 내지 60mg/kg/cycle의 범위로 투여되는 예를 들어 ADRIAMYCIN(Pharmacia & Upjohn), DOXIL(Alza), RUBEX(Bristol Myers Squibb)와 같은 독소루비신이다.
다른 실시예에서, 본 발명의 복합체는 항체 및 백신 같은 하나 이상의 면역치료제와 병용하여 투여된다. 바람직한 실시예에서, 항체는 암에 대항하여in vivo치료학적 및/또는 예방학적 용도를 가진다. 몇몇 실시예에서, 항체는 감염성 질환의 치료 및/또는 예방을 위하여 사용될 수 있다. 치료학적 및 예방학적 항체의 예는 최근 전립선암의 치료를 위해 임상학적 인간화된(humanized) 항-CTLA-4 항체인 MDX-010(Medarex, NJ); RSV 감염된 환자를 치료하기 위한 인간화된 항-호흡기 신시티움(syncytial) 바이러스(RSV) 모노클로날 항체인 SYNAGIS®(MedImmune, MD); 전이성 유방암 환자를 치료하기 위한 인간화된 항-HER2 모노클로날 항체인 HERCEPTIN®(Trastuzumab)(Genentech, CA) 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 예는 인간화된 항-CD18 F(ab')2(Genentech); 인간화된 항-CD18 F(ab')2인 CDP860(Celltech, UK); CD4와 융합된 항-HIV gp120 항체인 PR0542 (Progenics/Genzyme Transgenics); 인간 항-B형 간염 바이러스 항체인 Ostavir (Protein Design Lab/Novartis); 인간화된 항-CMV IgG1 항체인 PROTOVIRTM(Protein Design Lab/Novartis); 생쥐 항-TNF-α F(ab')2인 MAK-195(SEGARD)(KnollPharma/BASF); 항-CD14 항체인 IC14(ICOS Pharm); 인간화된 항-VEGF IgG1 항체(Genentech); 생취 항-CA 125 항체인 OVAREXTM(Altarex); 생쥐 항-17-IA 세포 표면 항원 IgG2a 항체인 PANOREX(Glaxo Wellcome/Centocor); 생쥐 항-아이오도타입 (GD3 에피토프) IgG 항체인 BEC2(ImClone System); 키메라 항-EGFRIgG 항체인 IMC-C225(ImClone System); 인간화된 항-αVβ3 인테그린(integrin) 항체인 VITAXINTM(Applied MolecularEvolution/MedImmune); 인간화된 항 CD52 IgG1 항체인 Campath1H/LDP-03(Leukosite); 인간화된 항-CD33 IgG 항체인 Smart M195(Protein DesignLab/Kanebo); 키메라 항-CD20 IgG1 항체인 RITUXANTM(IDECPharm/Genentech, Roche/Zettyaku); 인간화된 항-CD22 IgG 항체인 LYMPHOCIDETM(Immunomedics) ; 인간화된 항-HLA 항체인 Smart ID10(Protein Design Lab); 방사선표지된 생쥐 항-HLA DIAGNOSTIC REAGENT 항체인 ONCOLYMTM(Lym-1)(Techniclone); 인간 항-IL8 항체인 ABX-IL8(Abgenix); 인간화된 IgG1 항체인 anti-CD11(Genentech/Xoma); 인간화된 ICAM3 항체인 ICM3(ICOS Pharm); 영장류화된(primatized) 항-CD80 항체인 IDEC-114(IDECPharm/Mitsubishi); 방사선표지된 생쥐 항--CD20 항체인 ZEVALINTM(IDEC/Schering AG); 인간화된 항-CD40L 항체인 IDEC-131(IDEC/Eisai); 영장류화된 항-CD4 항체인 IDEC-151(IDEC); 영장류화된 항-CD23 항체인 IDEC-152(IDEC/Seikagaku); 인간화된 항-CD3 IgG인 SMART anti-CD3(Protein Design Lab); 인간화된 항-보체 인자 5(humanized anti-complement factor 5)(C5) 항체인 5G1.1(Alexion Pharm); 인간화된-TNF-α 항체인 D2E7(CAT/BASF); 인간화된 항-TNF-α Fab 절편인 CDP870(Celltech); 영장류화된 항-CD4IgG1 항체인 IDEC-151(IDECPharm/SmithKline Beecham); 인간 항-CD4 IgG 항체인 MDX-CD4(Medarex/Eisai/Genmab); 인간화된 항-TNF-α 항체인 CDP571(Celltech); 인간화된 항-α4β7 항체인 LDP-02(LeukoSite/Genentech); 인간화된 항-CD4 IgG 항체인 OrthoClone OKT4A(Ortho Biotech); 인간화된 항-CD40L IgG 항체인 ANTOVATM(Biogen); 인간화된 항-VLA-4 IgG 항체인 ANTEGRENTM(Elan); 인간 항-CD64 (FcyR) 항체인 MDX-33(Medarex/Centeon); 인간화된 항-IL-5 IgG4 항체인 SCH55700(Celltech/Schering); 각각 인간화된 항-IL-5와 IL-4 항체인 SB-240563와 SB-240683(SmithKline Beecham); 인간화된 항-IgE IgG1 항체인 rhuMab-E25(Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems); 생쥐 항 CD-147 IgM 항체인 ABX-CBL(Abgenix); 쥐 항-CD2 IgG 항체인 BTI-322(Medimmune/Bio Transplant); 생쥐 항-CD3 IgG2a 항체인 Orthoclone/OKT3(ortho Biotech); 키메라 항-CD25 IgG1 항체인 SIMULECTTM(Novartis Pharm); 인간화된 항-베타2-인테그린 IgG 항체인 LDP-01(LeukoSite); 생쥐 항-CD18 F(ab')2인 Anti-LFA-1(Pasteur-Merieux/Immunotech); 인간 항-TGF-베타2항체인 CAT-152(Cambridge Ab Tech); 및 키메라 항-인자 VII 항체인 Corsevin M(Centocor)이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 리스트된 면역반응 성분과 일정한 다른 면역반응 성분은 면역반응 성분의 공급자에 의해 추천되는 방법을 포함하여 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 일정 요법(방법)에 따라 투여될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 복합체는 안지오스타틴, 탈리도마이드, 크린글(kringle) 5, 엔도스타틴, 세핀(Serine Protease Inhibitor) 항-트롬빈, 피브로넥틴(fibronectin) 29kDa N-말단과 40kDa C-말단의 단백분해(proteolytic) 절편, 프로락틴의 16kDa의 단백분해 절편, 혈소판 인자-4의 7.8kDa 단백분해 절편, 혈소판 인자-4의 절편에 대응하는 13-아미노산 펩타이드(Maione et al., 1990, Cancer Res. 51: 2077-2083), 콜라겐 I의 절편에 대응하는 14-아미노산 펩타이드(Tolma et al., 1993, J. Cell Biol. 122: 497-511), 트롬보스폰딘 I의 절편에 대응하는 19-아미노산 펩타이드(Tolsma et al., 1993, J Cell Biol. 122: 497-511), SPARC의 절편에 대응하는 20-아미노산 펩타이드(Sage et al., 1995, J: Cell. Biochem. 57: 1329-1334), 또는 이들의 절편, 패밀리 멤버, 또는 변이체, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 항-혈관생성(angiogenic) 성분과 병용하여 투여된다.
혈관형성을 억제하고 라미닌, 피브로넥틴, 프로콜라겐, 및 EGF의 절편에 대응하는 다른 펩타이드 또한 잘 개시되어 있다(예를 들어 Cao, 1998, Prog Mol Subcell Biol. 20: 161-176 참조). RGD 단백질(즉 Arg-Gly-Asp 모티프를 함유)과 결합하는 일정 인테그린을 막는 모노클로날 항체와 사이클릭 펜타펩타이드는 항-혈관(anti-vascularization) 활성을 갖는 것으로 잘 알려져 있다(Brooks et al., 1994, Science 264: 569-571; Hammes et al., 1996, Nature Medicine 2: 529-533). 게다가, 수용체 길항제에 의한 유로키나제 플라스미노겐 활성화 수용체의 억제는 혈관형성, 종양 성자 및 전이를 억제한다(Min et al., 1996, Cancer Res. 56: 2428-33; Crowley et al., 1993, Proc Natl Acad Sci. 90: 5021-25). 본 발명의 복합체와 병용하여 그러한 항-혈관형성 성분의 사용 또한 본 발명에 의하여 개시된다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 복합체는 호르몬 치료와 함께 사용된다. 호르몬 치료는 호르몬 작용제, 호르몬 길항제(예를 들어 플루타미드, 비카루타마이드, 타목시펜, 라록시펜, 루프로라이드 아세테이트(LUPRON), LH-RH 길항제), 호르몬 생합성 및 프로세싱 억제제, 및 스테로이드(예를 들어 덱사메타손, 레티노이드, 델토이드, 베타메타손, 코티솔, 코티손, 프레드니손, 데하이드로테스토스테론(dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드, 미네랄코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 프로게스틴), 비타민 A 유도체(예를 들어 모두 트랜스인 레티노익 산(ATRA)); 비타민 D3 유사체; 항게스타겐(antigestagens)(예를 들어 미페프리스톤, 오나프리스톤), 및 항안드로겐(예를 들어 시프로테론 아세테이트)를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 복합체는 암치료를 위한 유전자 치료 프로그램에서 함께 사용된다. 일실시예에서, 암, 특히 유방암을 예방 또는 치료하기 위하여 인터루킨-2를 분비하는 재조합 세포를 이용한 유전자 치료가 본 발명의 복합체와 함께 투여된다(예를 들어 Deshmukh et al., 2001,J Neurosurg. 94: 287-92 참조). 다른 실시예에서, 유전자 치료는 폴리뉴클레오타이드 화합물을 사용한다. 폴리뉴클레오타이드 화합물은 그 뉴클레오타이드 서열이 종양 또는 암의 개시, 진행 및/또는 병리와 연관되어 있는 유전자의 DNA 및/또는 RNA의 뉴클레오타이드 서열과 관련된 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 리보자임(ribozyme), RNA 간섭 분자, 트리플 헬릭스 폴리뉴클레오타이드와 그 유사체를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 많은 종양유전자, 성장 인자 유전자, 성장 인자 수용체 유전자, 세포 사이클 유전자, DNA 회복 유전자가 있으며, 본 발명이 속한 분야에 잘 알려져 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 복합체는 방사선 치료 요법과 함께 투여된다. 방사선 치료에 있어, 방사선은 감마 레이 또는 X-레이이다. 본 발명은 외부-빔(external-beam) 방사선 치료, 방사선동위원소(I-125, 팔라디움, 이리디움)의 사이질(interstitial) 이식, 스트론티움-89와 같은 방사성동위원소, 가슴 방사선 치료, 복막내 P-32 방사선 치료, 및/또는 총 복부 및 골반 방사선 치료와 같은 방사선 치료를 포함하는 암치료를 포함한다. 방사선 치료의 일반적 개관을 위해서는 Hellman, Chapter 16: Principles of Cancer Management: Radiation Therapy, 6th edition, 2001, DeVita et al., eds., J.B. Lippencott Company, Philadelphia를 참조하기 바람. 바람직한 실시예에서, 방사선 치료는 방사선이 멀리 떨어진 공급원으로부터 나오는 외부 빔 방사선 도는 원격치료(teletherapy)이다. 다양한 바람직한 실시예에서, 방사선 치료는 방사활성 공급원이 암세포 또는 종양 덩어리 근처의 신체 내에 있는 내부 치료 또는 근접치료이다. 헤마토포피린 및 그 유도체, 베토포핀(Vertoporfin(BPD-MA)), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 광민감화제(photosensitizer) Pc4, 데메톡시(demethoxy)-하이포크레린(hypocrellin) A; 및 2BA-2-DMHA와 같은 광민감화제의 투여를 포함하는 광선역학요법과 본 발명의 복합체를 병용하여 사용하는 것도 본 발명에 포함된다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 복합체는 암을 치료하기 위하여 암 환자에게 짧은 치료 사이클 동안 적어도 하나의 화학요법제와 함께 투여된다. 화학요법제를 사용한 치료기간은 사용된 특정 암 치료제에 따라 다양하다. 본 발명은 또한 불연속적 투여 또는 여러 번의 부분적 투여로 나누어진 매일 투여도 개시한다. 특정 암 치료제에 대한 적절한 치료 시기는 숙련된 전문가에 의해 정해질 것이고, 본 발명은 각각의 암 치료제에 대한 최선의 치료 스케줄의 계속된 평가를 개시한다. 본 발명은, 그 동안 하나의 치료제 또는 일련의 치료제가 투여되는, 적어도 하나의 사이클, 바람직하게는 하나 이상의 사이클을 개시한다. 하나의 사이클에 대한 적절한 기간, 사이클의 총 수, 및 사이클 간의 인터벌은 숙련된 전문가에 의하여 평가될 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명의 복합체는 암의 증상(통증을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아님) 및 본 발명의 복합체에 의해 발생되는 부작용(열, 인플루엔자-유사 증상 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아님)을 개선하는 화합물과 병용하여 사용된다. 따라서 통증, 인플루엔자-유사 증상, 및 열을 줄이는 것으로 알려진 많은 화합물들이 본 발명의 복합체와 병용하여 또는 혼합되어 사용될 수 있다. 그러한 화합물은 진통제(예를 들어 아세트아미노펜), 울혈제거제(예를 들어 슈도에페드린), 항히스타민제(예를 들어 클로르페니라민 말레이트), 및 기침억제제(예를 들어 덱스트로메트르판)을 포함한다.
5.18.2 감염성 질환의 치료
본 발명의 방법에 의하여 치료 또는 예방될 수 있는 감염성 질환은 바이러스, 박테리아, 진균 프로토조아, 연충(helminth) 및 기생충(parasite)를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 감염원(infectious agent)에 의해 야기된다. 본 발명은 세포 내 병원체에 의해 야기된 감염성 질환을 치료 또는 예방하는 것에 한정되지는 않는다. 많은 치료적으로 관련된 미생물이 예를 들어 C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain1983와 같은 논문에 광범위하게 개시되어 있다. 상기 인용문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 안에 포함된다.
병용 치료는 본 발명의 복합체의 투여와 함께 감염성 질환의 치료 또는 예방에 도움이 되는 하나 이상의 종류의 사용을 포함한다. 그러한 종류는 항생제, 항바이러스제, 항프로토조아 화합물, 항진균 화합물, 및 항연충제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 감염성 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있는 다른 치료 종류는 앞서 설명된 면역치료, 폴리뉴클레오타이드, 항체, 사이토카인, 및 호르몬을 포함한다.
인간 및 비-인간 척추동물의 감염성 바이러스는 레트로바이러스, RNA 바이러스 및 DNA 바이러스를 포함한다. 인간에서 발견될 수 있는 바이러스의 예는Retroviridae(예를 들어 HIV-1(또는 HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III로 명명됨)와 같은 인간 면역결핍 바이러스; 및 HIV-LP와 같은 다른 분리물(isolates);Picomaviridae(예를 들어 소아마비 바이러스, A형 간염 바이러스; 엔테로바이러스, 인간 콕사키 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스;Calciviridae(예를 들어 위장염을 일으키는 세포주);Togaviridae(예를 들어 말 뇌염 바이러스(equine encephalitis viruses), 루벨라 바이러스;Flaviridae(예를 들어 뎅구 바이러스, 뇌여 바이러스, 황열 바이러스);Coronaviridae(예를 들어 코로나바이러스);Rhabdoviridae(예들 들어 소포 위염 바이러스, 라비스 바이러스);Filoviridae(예를 들어 에볼라 바이러스);Paramyxoviridae(예를 들어 파라인플루엔자 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스 호흡기 신시티움 바이러스);Orthomyxoviridae(예를 들어 인플루엔자 바이러스);Bungaviridae(예를 들어 한탄 바이러스, 분가(bunga) 바이러스, 프레보바이러스(phleboviruse) 및 나이로 바이러스);Arenaviridae(출혈 열 바이러스);Reoviridae(예를 들어 레오바이러스, 오비바이러스, 및 로타바이러스);Birnaviridae;Hepadnaviridae(B형 간염 바이러스);Parvovirida(파르보바이러스);Papovaviridae(유두종 바이러스, 폴리오마바이러스);Adenoviridae(대부분의 아데노바이러스);Herpesviridae(단순 포진 바이러스(HSV) 1과 2, 수두 띠 바이러스, 사이코메갈로바이러스(CMV), 헤르퍼스 바이러스);Poxviridae(바리오라 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스); 및Iridoviridae(예를 들어 아프리카 돼지 열 바이러스); 및 분류되지 않은 바이러스(예를 들어 스폰지형 뇌염의 병인학적 감염원, 델타 간염의 감염원(B형 간염 바이러스의 불완전 부수체(defective satellite)로 생각되는), 비-A, 비-B 간염의 감염원(클래스 1: 내부적으로 전이; 클래스 2: 비경구적으로 전이 (즉 C형 간염바이러스); 노르워크(Norwalk) 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스(astroviruses))를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
개시되는 레트로바이러스는 단순 레트로바이러스와 복합 레트로바이러스 모두를 포함한다. 단순 레트로바이러스는 B-타입 레트로바이러스의 서브그룹들, C-타입 레트로바이러스 및 D-타입 레트로바이러스를 포함한다. B-타입 레트로바이러스의 예는 생쥐 유방 종양 바이러스(MMTV)이다. C-타입 레트로바이러스는 서브그룹 C-타입 그룹 A(로우스(rous) 육종 바이러스(RSV), 조류 백혈병 바이러스(ALV), 및 조류 마이에로블라스토시스(myeloblastosis) 바이러스(AMV)를 포함함) 및 C-타입 그룹 B(생쥐 백혈병 바이러스(MLV), 고양이 백혈병 바이러스(FeLV), 생쥐 육종 바이러스(MSV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV), 비장 괴사 바이러스(SNV), 세망내피증 바이러스(RV) 및 원숭이 육종 바이러스(SSV)를 포함함)를 포함한다. D-타입 레트로바이러스는 Mason-Pfizer 원숭이 바이러스(MPMV) 및 원숭이 레트로바이러스 타입 1(SRV-1)을 포함한다. 복합 레트로바이러스는 렌티바이러스의 서브그룹, T-세포 백혈병 바이러스 및 거품형성 바이러스를 포함한다. 렌티바이러스는 HIV-1, HIV-2, SIV, 비스나(Visna) 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 및 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV)를 포함한다. T-세포 백혈병 바이러스는 HTLV-1, HTLV-II, 원숭이 T-세포 백혈병 바이러스(STLV), 및 소 백혈병 바이러스(BLV)를 포함한다. 거품형성 바이러스는 인간 거품형성 바이러스(HFV), 원숭이 거품형성 바이러스(SFV) 및 소 거품형성 바이러스(BFV)를 포함한다.
척추동물에서 항원인 RNA 바이러스의 예는 후술하는 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다: 오쏘레오바이러스(Orthoreovirus) 속(포유류와 조류 레트로바이러스의 멀티플 혈청타입), 오르비바이러스(Orbivirus) 속 (블루톤그(Bluetongue) 바이러스, 유게나기 바이러스, Kemerovo 바이러스, 아프리카 말 질환 바이러스, 및 콜로라도 틱(Tick) 열 바이러스), 로타바이러스 속 (인간 로타바이러스, 네브라스카 송아지 설사 바이러스, 생쥐 로타바이러스, 원숭이 로타바이러스,소 또는 양 로타바이러스, 조류 로타바이러스)를 포함하는 Reoviridae 과; 엔테로바이러스 속(폴리오바이러스, 콕사키바이러스 A와 B, 장 세포병리 인간 오판(ECHO) 바이러스, A형 간염 바이러스, 조류 엔테로바이러스, 생쥐 뇌척수염(ME) 바이러스, 폴리오바이러스 무리스(muris), 소 엔테로바이러스, 돼지 엔테로바이러스), 카르디오바이러스(Cardiovirus) 속 (뇌심근염 바이러스(EMC), 멘고바이러스), 리노바이러스 속(적어도 113개의 서브타입을 포함하는 인간 리노바이러스; 다른 리노바이러스), 압쏘바이러스(Apthovirus) 속 (구제역(FMDV))을 포함하는 Picornaviridae 과; 돼지 바이러스의 소포발진, San Miguel 바다사자 바이러스, 고양이 피코나바이러스 및 노르워크(Norwalk) 바이러스를 포함하는 Calciviridae 과; 알파바이러스 속(동부 말 뇌염 바이러스, 셈리키(Semliki) 숲 바이러스, 신드비스 바이러스, Chikungunya 바이러스, O'Nyong-Nyong 바이러스, 로스강 바이러스, 베네수엘라 돼지 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스), 플라비리어스(Flavirius) 속 (모기 함유 황열 바이러스,덴구 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 성 루이스 뇌염 바이러스, 머리(Murray) 계곡 뇌염 바이러스, 서부 나일 바이러스, 군진 바이러스, 중유럽 틱(tick) 본 바이러스, 극동 틱 본 바이러스, Kyasanur 숲 바이러스, Louping III 바이러스, 포와산(Powassan) 바이러스, Omsk 출혈열 바이러스), 루비바이러스 속(루벨라 바이러스), 페스티바이러스 속(점막 질환 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스, 경계성 질환 바이러스)를 포함하는 Togaviridae 과; 부니바이러스(Bunyvirus) 속(Bunyamwera 및 관련 바이러스, 캘리포니아 뇌염 그룹 바이러스), 플레보바이러스 속(모래바람 열 시시리안(Sicilian) 바이러스, Rift 계곡 열 바이러스), 나이로바이러스 속(Crimean-Congo 출혈열 바이러스, 나이로비 양 질환 바이러스), 및 우쿠바이러스(Uukuvirus) 속(Unkumiemi 및 관련 바이러스)를 포함하는 Bunyaviridae과; 인플루엔자 바이러스 속(인플루엔자 바이러스 타입 A, 많은 인간 서브타입); 돼지 인플루엔제 바이러스, 및 조류 및 말 인플루엔자 바이러스; 인플루엔자 타입 B(많은 인간 서브타입), 및 인플루엔자 타입 C(가능한 분리 속)를 포함하는 Orthomyxoviridae 과; 파라믹소바이러스 속(파라인플루엔자 바이러스 타입 1, 센다이 바이러스, 혈구흡착 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 타입 2 내지 5, 뉴캐슬 질환 바이러스, 이하선염 바이러스), 모빌리바이러스(Morbillivirus) 속 (홍역 바이러스, 아급성 경화성 범뇌염 바이러스, 디스템퍼(distemper) 바이러스, 린더페스트(Rinderpest) 바이러스), 폐렴바이러스 속(호흡기 신소티움 바이러스(RSV), 소 호흡기 신소티움 바이러스 및 생쥐의 폐렴 바이러스)를 포함하는 paramyxoviridae 과; 숲 바이러스, 신드비스 바이러스, Chikungunya 바이러스, O'Nyong-Nyong 바이러스, 로스강 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스), 플라비바이러스 속(모기 함유 황열 바이러스, 덴구 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 성 루이스 뇌염 바이러스, 머레이 계곡 뇌염 바이러스, 서 나일 바이러스, 군진 바이러스, 중 유럼 틱 본 바이러스, 극동 틱 본 바이러스, Kyasanur 숲 바이러스, Louping III 바이러스, 포와산 바이러스, Omsk 출혈열 바이러스), 루비바이러스 속 (루벨라 바이러스), 페스티바이러스 속 (점막 질환 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스, 경계 질환 바이러스); 부니바이러스 속 (Bunyamwera 및 관련 바이러스, 캘리포니아 뇌염 그룹 바이러스), 프레보바이러스 속 (모래바람 열 시시리안 바이러스,Rift 계곡 열 바이러스), 나이로바이러스 속 (Crimean-Congo 출혈 열 바이러스, 나이로비 양 질환 바이러스), 및 우쿠바이러스 속 (Uukuniemi 및 관련 바이러스)를 포함하는 Bunyaviridae 과; 인플루엔자 바이러스(인플루엔자 바이러스 타입 A, 많은 인간 서브타입), 돼지 인플루엔자 바이러스, 및 조류 및 말 인플루엔자 바이러스; 인플루엔자 타입 B(많은 인간 서브타입), 및 인플루엔자 타입 C(가능한 분리 속)를 포함하는 Orthomyxoviridae 과; 파라믹소바이러스 속(파라인플루엔자 바이러스 타입 1, 센다이 바이러스, 혈구흡착 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 타입 2 내지 5, 뉴캐슬 질환 바이러스, 볼거리 바이러스), 모빌리바이러스 속 (홍역 바이러스, 아급성 경화성 범뇌염 바이러스, 디스템퍼 바이러스, Rinderpest 바이러스), 폐렴바이러스 속(호흡기 신소티움 바이러스(RSV), 소 호흡기 신소티움 바이러스 및 생쥐의 폐렴 바이러스)를 포함하는 paramyxoviridae 과; 베시큐로바이러스(vesiculovirus) 속(Chandipura 바이러스, Flanders-Hart Park 바이러스), 라이사바이러스 속(라비스 바이러스), 물고기 라브도바이러스, 및 두 개의 예상되는 라브도바이러스(Rhabdovirus)(Marburg 바이러스 및 에볼라 바이러스)를 포함하는 Rhabdoviridae 과; 림파구 맥락수막염 바이러스(LCM), Tacaribe 바이러스 복합체 및 라사 바이러스를 포함하는 Arenaviridae 과; 전염성 기관지염 바이러스(IBV), 생쥐 간염 바이러스, 인간 장 코로나 바이러스, 및 고양이 전염성 복막염(고양이 코로나바이러스)를 포함하는Coronoaviridae과.
척추동물에 있어 항원인 예시적인 DNA 바이러스는 오쏘폭스바이러스 속(바리오라 메이저, 바리오라 마이너, 원숭이 폭스 백시니아, 카우폭스, 버팔로폭스, 토끼폭스, 엑트로메리아(Ectromelia)), 레포리폭스바이러스(Leporipoxvirus) 속 (믹소마, 피브로마), 아비폭스바이러스(가금류폭스, 다른 조류 폭스바이러스), 카프리폭스바이러스 속 (양폭스, 염소폭스), 수이폭스바이러스 속 (돼지 폭스), 파라폭스바이러스 속 (전염성 자세 피부염 바이러스, 슈도카우폭스, 소 자세 위염 바이러스)를 포함하는Poxviridae과;Iridoviridae과 (아프리카 돼지 열 바이러스, 개구리 바이러스 2 및 3, 물고기의 림포시스티스(Lymphocystis) 바이러스); α-헤르퍼스 (단순포진 타입 1 및 2, Varicella-Zoster, 말 낙태 바이러스, 말 헤르퍼스 바이러스 2 및 3, 슈도라비스 바이러스, 감염성 소 각막결막염 바이러스, 감염성 소 리노트라케이티스 바이러스, 고양이 리노트라케이티스 바이러스, 전염성 후두기관염 바이러스), 베타-헤르퍼스바이러스(인간 사이토메갈로바이러스 및 돼지, 원숭이, 및 설치류의 사이토메갈로바이러스)를 포함하는Herpesviridae과; γ-헤르퍼스 바이러스(Epstein-Barr 바이러스(EBV), Marek 질환 바이러스, Herpes saimiri, 헤르퍼스바이러스 아테레스(ateles), 헤르퍼스바이러스 실비라구스(sylvilagus), 기니아픽 헤르퍼스 바이러스, Lucke 종양 바이러스); 마스타데노바이러스 속(인간 서브그룹 A, B, C, D, E 및 비그룹; 원숭이 아네도바이러스(적어도 23개의 혈청타입), 감염성 개 간염, 및 양, 돼지, 소, 개구리 및 많은 다른 종류의 아데노바이러스, 아비아데노바이러스 속(조류 아데노바이러스)를 포함하는 Adenoviridae과; 및 배양 불가능한 아데노바이러스; 파필로마바이러스 속(인간 유두종 바이러스, 소 유두종 바이러스, Shope 토끼 유두종 바이러스, 및 다른 종의 다양한 병원성 유두종 바이러스), 폴리오마바이러스 속(폴리오마바이러스, 원숭이 공포형성 감염원(SV-40), 토끼 공포형성 감염원(RKV), K 바이러스, BK 바이러스, JC 바이러스, 및 림포트로픽 유두종 바이러스와 같은 다른 주요한 폴리오마)를 포함하는 Papoviridae 과; 아데노-관련 바이러스 속, 파르보바이러스 속(고양이 범백혈구감소증 바이러스, 소 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, Aleutian 밍크 질환 바이러스 등)을 포함하는Parvoviridae과를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 마지막으로, DNA 바이러스는 Kuru 및 Creutzfeldt-Jacob 질환 바이러스 및 만성 감염성 신경병적 감염원과 같이 상기 언급된 과에 적당하지 않은 바이러스도 포함할 수 있다.
본 발명의 복합체와 함께 사용될 수 있는 많은 항바이러스 화합물의 예는 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있다. 그러한 화합물은 리팜피신, 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(예를 들어 AZT, ddI, ddC, 3TC, d4T), 비-뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(예를 들어 에파비렌즈(Efavirenz), 네비라핀(Nevirapine)), 프로테아제 억제제(예를 들어 로피나버(lopinavir), 암프레나버(amprenavir), 인디나버, 리토나버, 및 사퀴나버), 이독수리딘, 시도포비어, 아시클로버, 간시크로버, 자나미비어, 아만타딘, 및 파리비주마브를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 항바이러스제의 다른 예는 아세만난; 아시클로버; 아시클로버 소디움; 아데포비어; 아로부딘; 알비르셉트 수도톡스; 아만타딘 하이드로클로라이드; 아라노틴; 아릴돈; 아테비르딘 메실레이트; 아브리딘; 시도포비어; 시팜필린; 사이타라빈 하이드로클로라이드; 데라비르딘 메실레이트; 데시클로버; 디다노신; 디속사릴; 에독수딘; 엔비라덴; 엔비록심; 팜시클로버; 파모티딘 하이드로클로라이드; 피아시타빈; 피아루리딘; 포사리레이트; 포스카메트 소디움; 포스포네트 소디움; 간시클로버; 간시클로버 소디움; 이독수리딘; 케톡살(Kethoxal); 라미부딘; 로부카비어; 메모틴 하이드로클로라이드; 메티사존; 네비라핀; 펜시클로버; 피로다비어; 리바비린; 리만타딘 하이드로클로라이드; 사퀴나비어 메실레이트; 소만타딘 하이드로클로라이드; 소리부딘; 소타토론; 스타부딘; 티로론 하이드로클로라이드; 트리플루딘; 바라사이클로버 하이드로클로라이드; 비다라빈; 비다라빈 포스페이트; 비다라빈 소디움 포스페이트; 비록심; 잘시타빈; 지도부딘; 진비록심을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 의하여 치료 또는 예방될 수 있는 박테리아 감염 또는 질환은 마이코박테리아(예들 들어 마이코박테리아 튜버큘로시스,M. bovis, M. avium, Ad leprae,또는M. africanum)와 같이 그것의 라이프 사이클에서 내세포 단계를 가지는 박테리아, 리켓차, 마이코플라즈마, 클라미디아, 및 레지오넬라를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 박테리아에 의해 야기된다. 박테리아 감염의 다른 예는 그람 양성 바실루스(예를 들어 리스테리아,Bacillus anthracis와 같은 바실루스, Erysipelothrix 종), 그람 음성 바실루스(예를 들어Bartonella, Brucella, Campylobacter, Enterobacter, Escherichia, Francisella, Hemophilus, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Vibrio,및Yersinia종), 스피로케테(spirochete) 박테리아(예를 들어 Lyme 질환을 야기하는 Borrelia burgdorferi를 포함하는 보렐리아 종), 혐기성 박테리아(예를 들어 Actinomyces 및 Clostridium 종), 그람 양성 및 음성 코칼 박테리아, 엔테로코칼 종, Streptococcus 종, Pneumococcus 종,Staphylococcus 종, Neisseria 종에 의한 감염을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 감염성 박테리아의 특정 예는Helicobacterpyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae, Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes(그룹 A 스트렙토코쿠스),Streptococcus agalactiae(그룹 B 스트렙토코쿠스),Streptococcus viridans, Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Fusobacterium mucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Richettsia, 및Actinomyces israelli를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 복합체와 병용하여 사용될 수 있는 항박테리아제 또는 항생제는 아미노글리코사이드 항생제(예를 들어, 아프라마이신, 아베카신, 밤베르마이신, 부티로신, 디베카신, 네오마이신, 네오마이신, 언데실레네이트, 네틸미신, 파로모마이신, 리보스타마이신, 시소미신, 및 스펙티모마이신), 암페니콜 항생제(예를 들어, 아지담페니콜, 클로람페니콜, 플로르페니콜, 및 티암페니콜), 안사마이신 항생제(예를 들어, 리파마이드 및 리팜피신), 카바세펨(예를 들어 로라카베프), 카바페넴(예를 들어비아페넴 및 이미페넴), 세파로스포린(예를 들어 세파클러, 세파드록실, 세파만돌, 세파트리진, 세파제돈, 세포조프란, 세프피미졸, 세프피라마이드, 및 세프리롬), 세파마이신(예를 들어 세프부페라존, 세프메타졸, 및 세프미녹스), 모노박탐(예를 들어 아즈트레오남, 카루모남, 및 티게모남), 옥사세펨(예를 들어 프로목세프, 및 목사락탐), 페니실린(예를 들어 아디노실린, 암디노실린 피복실, 아목시실린, 바캄피실린, 벤질페니실리닉 산, 벤질페니실린 소디움, 에피실린, 펜베니실린, 프록사실린, 펜암실린, 페네타메이트 하이리오다이드, 페니실린 o-베네타민, 페니실린 0, 페니실린 V, 페니실린 V 벤자틴, 페니실린 V 하이드라바민, 페니메피사이클린, 및 펜시히실린 포타시움), 린코사미드(예를 들어 클린다마이신, 및 린코마이신), 마크로라이드(예를 들어 아지스로마이신, 카보마이신, 클라리스로마이신, 디리스로마이신, 에라이스로마이신, 및 에라이트로마이신 아시스트레이트), 암포마이신, 바시트라신, 카프레오마이신, 코리스틴, 엔두라시딘, 엔비오마이신, 테트라사이클린(예를 들어 아피사이클린, 클로르테트라사이클린, 클로모사이클린, 및 데메크로사이클린), 2,4-디아미노피리미딘(예를 들어 브로디모프림), 니트로퓨란(예를 들어 퓨랄타돈, 및 퓨라조리움 클로라이드), 퀴놀론 및 그 유사체(예를 들어 시녹사신, 시프로플록사신, 크리나플록사신, 프루메퀸, 및 그레파그록사신), 설폰아미드(예를 들어 아세틸 설파메톡시피라진, 벤질설파미드, 노프릴설파미드, 프탈릴설파세타미드, 설파크리소이딘, 및 설파사이틴), 설폰(예를 들어 디아티모설폰, 글루코설폰 소디움, 및 소라설폰), 사이클로스포린, 무피로신 및 튜버린을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
항박테리아제의 다른 예는 아세답손; 아세토설폰 소디움; 아라메신; 알렉시딘; 암디노실란; 암디노실린; 피복실; 아미사이클린; 아미프록사신; 아미프록사신 메실레이트; 아미카신; 아미카신 설페이트; 아미노살리실릭 산; 아미노살리실레이트 소디움; 아목시실린; 암피실린; 암피실린 소디움; 아팔실린 소디움; 아프라마이신; 아스파토신; 아스트로미신 설페이트; 아빌라마이신; 아보파르신; 아지쓰로마이신; 아즈로실린; 아즈로실린 소디움; 바캄피실린 하이드로클로라이드; 바시트라신; 바시트라신 메틸렌 디살리실레이트; 바시트라신 진크; 밤베르마이신; 벤조일파스 칼슘; 베리쓰로마이신; 베타미신 설페이트; 비아페넴; 비니라마이신; 비페나민 하이드로클로라이드; 비스피리티온 마크설펙스; 부티카신; 부티로신 설페이트; ??레오마이신 설페이트; 카바독스; 카베니실린 디소디움; 카베니실린 인다닐 소디움; 카베니실린 페닐 소디움; 카베니실린 포타시움; 카루모남 소디움; 세파클러; 세파드록실; 세파만돌; 세파만돌 나페이트; 세파만돌 소디움; 세파파롤; 세파트리진; 세파자플루 소디움; 세파조린; 세파조린 소디움; 세프부페라존; 세프디니어; 세페핌; 세페핌 하이드로클로라이드; 세페테콜; 세픽심; 세픔네녹심 하이드로클로라이드; 세피메타졸; 세프메타졸 소디움; 세포니시드 모노소디움; 세포니시드 소디움; 세포페라존 소디움; 세포라나이드; 세포탁심 소디움; 세포테탄; 세포테탄 디소디움; 세포티암 하이드로클로라이드; 세폭시틴; 세폭시틴 소디움; 세프피미졸; 세프피미졸 소디움; 세프피라마이드; 세프피라마이드 소디움; 세프리롬 설페이트; 세프포독심 프록세틸; 세프프로질; 세프로산딘; 세프설로딘 소디움; 세프타지딤; 세프티부텐; 세프티족심 소디움; 세프트리악손 소디움; 세푸록심; 세푸록심 아세틸; 세푸록심 피복테틸; 세푸록심 소디움; 세파세트릴 소디움; 세파렉신; 세파렉신 하이드로클로라이드; 세파로그리신; 세파로리딘; 세파로틴 소디움; 세파피린 소디움; 세파라딘; 세토사이클린 하이드로클로라이드; 세토페니콜; 클로람페니콜; 클로람페니콜 팔미테이트; 클로람페니콜 판토테네이트 복합체; 클로람페니콜 소디움 석시네이트; 클로르헥시딘 포스파니레이트; 크로록실레놀; 크로테트라사이클린 비설페이트; 크로테트라사이클린 하이드로클로라이드; 시녹사신; 시프로플록사신; 시프로플록사신 하이드로클로라이드; 시로레마이신; 클라리스로마이신; 크리나플록사신 하이드로클로라이드; 클린다마이신; 클린다마이신 하이드로클로라이드; 클린다마이신 팔미테이트 하이드로클로라이드; 클린다마이신 포스페이트; 크로파지민; 클록사실린 벤자틴; 클록사실린 소디움; 클록시퀸, 코리스티메세이트 소디움; 코리스틴 설페이트; 쿠메르마이신; 쿠메르마이신 소디움; 사이크라실린; 사이클로세린; 달포프리스틴; 답손; 다프토마이신; 데메크로사이클린; 데메크로사이클린 하이드로클로라이드; 데메사이클린; 데노퓬긴; 디아베리딘; 디크록사실린; 디클록사실린 소디움; 디하이드로스트렙토마이신 설페이트; 디피리티온; 디리스로마이신; 독시사이클린; 독시사이클린 칼슘; 독시사이클린 포스파텍스; 독시사이클린 하이크레이트; 드록사신 소디움; 에녹사신; 에피실린; 에피테트라사이클린 하이드로클로라이드; 에라이스로마이신; 에라이스로마이신 아시스트레이트; 에라이스로마이신 에스토레이트; 에라이스로마이신 에틸석시네이트; 에라이스로마이신 글루셉테이트; 에라이스로마이신 락토비오네이트; 에라이스로마이신 프로피오네이트; 에라이스로마이신 스테아레이트; 에탐부톨 하이드로클로라이드; 에티온아미드; 프레록사신; 플록사실린; 프루다라닌; 프루메퀸; 포스포마이신; 포스포마이신 트로메타민; 푸목시실린; 프라조리움 클로라이드; 루라조리움 타르트레이트; 푸시데이트 소디움; 푸시딕 산; 겐타마이신 설페이트; 글록시모남; 그라미시딘; 하로프로긴; 헤타실린; 헤타실린 포타시움; 헥세딘; 이바플록신; 이미페넴; 이소코나졸; 이세파미신; 이소니아지드; 조사마이신; 카나마이신 설페이트; 키타사마이신; 레보푸랄타돈; 레보프로필실린 포타시움; 렉시스로마이신; 린코마이신; 린코마이신 하이드로클로라이드; 레메플록사신; 로메플록사신 하이드로클로라이드; 로메플록사신 메실레이트; 로라카베프; 마페나이드; 메크로사이클린; 메트로사이클린 설포살리실레이트; 메가로미신 포타시움 포스페이트; 메퀴독스; 메로페넴; 메타사이클린; 메타사이클린 하이드로클로라이드; 메테나민; 메테나민 히퓨레이트; 메테나민 만델레이트; 메티실린 소디움; 메티오프림; 메트로니다졸 하이드로클로라이드; 메트로니다졸 포스페이트; 메즈로실린; 메즈로실린 소디움; 미노사이클린; 미노사이클린 하이드로클로라이드; 미린카마이신 하이드로클로라이드; 모넨신; 모넨신 소디움; 나프실린 소디움; 나리딕세이트 소디움; 나리딕식 산; 나타마이신; 네브라마이신; 네오마이신 팔미테이트; 네오마이신 설페이트; 네오마이신 운데실레네이트; 네틸미신 설페이트; 뉴크라마이신; 니푸라덴; 니푸랄데존; 니푸티아졸; 니트로사이클린; 니트로푸란토인; 니트로마이드; 노르플록사신; 노보비오신 소디움; 오플록사신; 오르메토프림; 옥사실린 소디움; 옥시모남; 옥시노남 소디움; 옥소리닉 산; 옥시테트라사이클린; 옥시테트라사이클린 칼슘; 옥시테트라사이클린 하이드로클로라이드; 팔디마이신; 파라클로로페놀; 파울로마이신; 페프록사신; 페프록사신 메실레이트; 페나메실린; 페니실린 G 벤자틴; 페니실린 G 포타시움; 페니실린 G 프로카인; 페니실린 G 소디움; 페니실린V; 페니실린 V 벤자틴; 페니실린 V 하이드라바민; 페니실린 V 포타시움; 펜티지돈 소디움; 페닐아미노살리실레이트; 피페라실린 소디움; 피르베니실린 소디움; 피리디실린 소디움; 피리마이신 하이드로클로라이드; 피밤피실린 하이드로클로라이드; 피밤피실린 파모에이트; 피밤피실린 프로베네이트; 폴리마이신 B 설페이트; 포르피로마이신; 프로피카신; 피라지나미드; 피리티온 진크; 퀸데카민 아세테이트; 퀴누프리스틴; 라세페니콜; 라모프라닌; 라니마이신; 레오마이신; 레프로미신; 리파부틴; 리파메탄; 리파멕실; 리파마이드; 리팜핀; 리파펜틴; 리팍시민; 로리테트라사이클린; 로리테트라사이클린 니트레이트; 로사라미신; 로사라미신 부티레이트; 로사라미신 프로피오네이트; 포사마리신 소디움 포스페이트; 로사라미신 스테아레이트; 로속사신; 록사르손; 록시스로마이신; 산사이클린; 산페트리넴 소디움; 사목시실린; 사르피실린; 사토파린긴; 시소미신; 시소미신 설페이트; 사프플록사신; 스펙티노마이신 하이드로클로라이드; 스피라마이신; 스탈리마이신 하이드로클로라이드; 스테피마이신; 스트렙토마이신 설페이트; 스트렙토니코지드; 설파벤즈; 설파벤자미드; 설파세타미드 소디움; 설파사이틴; 설파디아진; 설파디아진 소디움; 설파독신; 설파렌; 설파메라진; 설파메테; 설파메타진; 설파메티졸; 설파메속사졸; 설파모노메속신; 설파목솔; 설파니레이크 진크; 설파니트란; 설파살라진; 설파소미졸; 설파티아졸; 설파자메트; 설피속사졸; 설피속사졸 아세틸; 설피속사졸 디올아민; 설포믹신; 서로페넴; 설타미실린; 선실린 소디움; 타람피실린 하이드로클로라이드; 테이코플라닌; 테마플록사신 하이드로클로라이드; 테모실린; 테트라사이클린; 테트라사이클린 하이드로클로라이드; 테트라사이클린 포스페이트 복합체; 테트록소프림;티암페니콜; 티펜실린 포타시움; 티카르실린 크레실 소디움; 티카르실린 디소디움; 티카르실린 모노소디움; 티크라톤; 티오도니움 클로라이크; 토브라마이신; 토브라마이신 설페이트; 토서프록사신; 트리메소프림; 트리메소프림 설페이트; 트리설파피리미딘; 트로레안도마이신; 트로스펙토마이신 설페이트; 타이로스리신; 반코마이신; 반코마이신 하이드로클로라이드; 버기니아마이신; 조바마이신을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 진균 질환은 아스페르길리오시스(aspergilliosis), 크리토코코시스(crytococcosis), 스포로트리코시스(sporotrichosis), 코시디오이도마이코시스(coccidioidomycosis), 파라코시디오이도마이코시스(paracoccidioidomycosis), 히스토프라스모시스(histoplasmosis), 블라스토마이코시스(blastomycosis), 자이고마이코시스(zygomycosis), 및 칸디디아시스(candidiasis)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 복합체와 함께 사용될 수 있는 항 진균 화합물은 폴리엔(예를 들어 암포테리신 b, 칸디시딘, 메파르트리신, 나타마이신, 및 니스타틴), 알릴아민(예를 들어 부테나핀, 및 나프티핀), 이미다졸(예를 들어 비포나졸, 부토코나졸, 클로르단토인, 플루트리마졸, 이소코나졸, 케토코나졸, 및 라노코나졸), 티오카바메이트(예를 들어 톨시크레이트, 토린데이트, 및 톨나프테이트), 트리아졸(예를 들어 플루코나졸, 이트라코나졸, 사페코나졸, 및 터코나졸), 브로모살리실클로라니라이드, 부크로사미드, 칼슘 프로피오네이트, 클로르페네신, 시트로피록스, 아자세린, 그리세오플빈, 올리고마이신, 네오마이신, 운데실레네이트, 피롤니트린, 시카닌,투버시딘, 및 비리딘을 포함하고 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 항 진균 화합물의 추가적 예는 아크리소신; 암브루티신; 암포테리신 B; 아자코나졸; 아자세린; 바시푼긴; 비포나졸; 비페나민 하이드로클로라이드; 비스피리티온 마그설펙스; 부토코나졸 니트레이트; 칼슘 운데실레네이트; 칸디시딘; 카볼-푸치신(Carbol-Fuchsin); 클로르단토인; 시크로피록스; 시크로피록스 올아민; 시로푼긴; 시스코나졸; 클로트리마졸; 쿠프리믹신; 데노푼긴; 디피리티온; 도코나졸; 에코나졸; 에코나졸 니트레이트; 에닐코나졸; 에토남 니트레이트; 페니코나졸 니트레이트; 피리핀; 플루코나졸; 플루사이토신; 푼기마이신; 그리세오플빈; 하마이신; 이소코나졸; 이트라코나졸; 카라푼긴; 케토코나졸; 로모핀긴; 리디마이신; 메파르트리신; 미토나졸; 미코나졸 니트레이트; 모넨신; 모넨신 소디움; 나프티핀 하이드로클로라이드; 네오마이신 운데실레네이트; 니푸라텔; 니푸메론; 니트랄아민 하이드로클로라이드; 니스타틴; 옥타노익 산; 오코나졸 니트레이트; 옥시코나졸 니트레이트; 옥시푼긴 하이드로클로라이드; 파코나졸 하이드로클로라이드; 파트리신; 포타시움 아이오다이드; 프로크로놀; 피리티온 진크; 파이롤니트린; 루타마이신; 산구이나리움 클로라이드; 사페코나졸; 사코파푼긴; 셀레니움 설파이드; 시네푼긴; 설코나졸 니트레이트; 터비나핀; 테코나졸; 티람; 티크라톤; 티오코나졸; 톨시크레이트; 토린데이트; 톨나프테이트; 트리아세틴; 트리아푸긴; 운데실레닉 산; 비리도프릴빈; 진크 운데실레네이트; 및 지노코나졸 하이드로클로라이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 의하여 치료 또는 예방될 수 있는 기생충 질환은 아메비아시스, 말라리아, 레이슈마이나, 코시디아, 기아디아시스, 크립토스포리디오시스, 톡소플라즈모시스, 및 트리파노소미아시스를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 아스카리아시스(ascariasis), 안시로스토미아시스(ancylostomiasis), 트리추리아시스(trichuriasis), 스트론지로이디아시스(strongyloidiasis), 토소카리아시스(toxoccariasis), 트리키노시스(trichinosis), 온코세시아시스(onchocerciasis), 필라리아, 및 디로필라리아를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 벌레에 의한 전염병 또한 포함된다. 쉬스토소미아시스, 파라고니미아시스, 및 클로노키아시스를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 다양한 흡충에 의한 전염병 또한 포함된다. 이러한 질병을 야기하는 기생충은 그들이 세포내 또는 세포외 인가에 기초하여 분류될 수 있다. 여기에서 사용된 "세포내 기생충"은 전체 라이프 사이클이 세포내에서 이루어지는 기생충이다. 인간 세포내 기생충의 예는Leishmania spp., Plasmodium spp., Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii, Babesia spp., 및Trichinellaspiralis를 포함한다. 여기에서 사용된 "세포외 기생충"은 그의 전체 라이프 사이클이 세포외에서 이루어지는 기생충이다. 인간을 감염시킬 수 있는 세포외 기생충은Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Enterocytozoon bieneusi, Naegleria및Acanthamoeba와 대부분의 연충을 포함한다. 기생충의 또 다른 클래스는 주로 세포외에서 존재하지만 그들의 라이프 사이클에서 중요한 단계를 의무적으로 세포내에서 존재하는 것으로 정의된다. 그러한 기생충은 여기에서 "의무적 세포내 기생충(obligate intracellular parasites)"으로 명명된다. 이러한 기생충은 그들 삶의 대부분 또는 그들 삶의 단지 적은 부분을 세포외 환경에서 존재하지만, 그들 모두는 그들의 라이프 사이클에 있어 적어도 한 번의 의무적 세포내 단계를 가진다. 기생충의 이러한 클래스는Trypanosoma rhodesiense와 Trypanosoma gambiense; Isospora spp., Cryptosporidium spp, Eimeria spp., Neospora spp., Sarcocystis spp.,및Schistosoma spp.을 포함한다.
기생충 질환을 치료하기 위한 본 발명의 복합체와 함께 사용될 수 있는 항프로토조아(antiprotozoal) 화합물의 예는 본 발명이 속한 분야에 잘 알려져 있다. 그러한 화합물은 퀴닌, 클로로퀸, 메프로퀸, 프로구아닐, 피리메타민, 메트로니다졸, 디록사니데푸로에이트, 티니다졸, 암포테리신, 소디움 스티보글루코네이트, 트리목사졸, 및 펜타미딘 이세티오네이트를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 기생충 질환을 치료하기 위한 본 발명의 복합체와 함께 사용될 수 있는 항기생충 약물의 많은 예는 본 발명이 속한 분야에 잘 알려져 있다. 그러한 화합물은 메벤다졸, 레바미솔, 니크로사마이드, 프라지퀴안텔, 알벤다졸, 이베르멕틴, 디에틸카바마진, 및 티아벤다졸을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 항-기생충 화합물의 또 다른 예는 아세답손; 아모디아퀸 하이드로클로라이드; 암퀴네이트; 아테프렌; 클로로퀸; 클로로퀸 하이드로클로라이드; 클로로퀸 포스페이트; 사이클로구아닐 파모에이트; 엔피로린 포스페이트; 할로판트린 하이드로클로라이드; 하이드록시클로로퀸 설페이트; 메프로퀸 하이드로클로라이드; 메녹톤; 미린카마이신 하이드로클로라이드; 프리마퀸 포스페이트; 피리메타민; 퀴닌 설페이트; 및 테부퀸이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
일실시예에서, 본 발명의 복합체는 비-hsp 백신 조성물과 병용하여 사용될수 있다. 인간을 위한 그러한 백신의 예는 The Jordan Report 2000, Accelerated Development of Vaccines, National Institute of Health에 잘 개시되어 있다. 상기 인용문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 안에 포함된다. 비-인간 척추동물의 치료를 위한 많은 백신이 Bennett, K. Compendium of Veterinary Products, 3rd ed. North American Compendiums, Inc., 1995에 잘 개시되어 있다. 상기 인용문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 안에 포함된다.
5.18.3 자가 실시(Autologous Embodiment)
hsp의 특이 면역원성은 hsp 자체로부터 유래되는 것이 아니라, 그것에 결합되어 잇는 항원성 단백질 및/또는 펩타이드로부터 유래된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 암 백신으로서의 사용을 위한 본 발명의 조성물에서 복합체는 자가(autologous) 복합체이고, 그것에 의하여 암 면역치료의 가장 힘든 장애물 중 2가지가 피해진다. 첫째, 실험동물의 암처럼 인간 암이 항원적으로 분명할 가능성이다. 이러한 장애물을 피하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예에서, hsp는 항원성 단백질 및 펩타이드와 복합체화되고, 복합체는 단백질 또는 펩타이드가 유래된 동일한 대상에서 암을 치료하기 위하여 사용된다. 둘째, 암 면역치료의 대부분의 최근 접근은 암 세포 라인의 CTL-인식 에피토프를 결정하는 것에 초점이 맞추어져 있다. 이러한 접근은 세포 라인과 암에 대한 CTL의 이용이 필요하다. 이러한 시약은 인간 암의 압도적 부분에 대하여 이용불가능하다. 자가 항원성 단백질 및/또는 펩타이드의 사용에 관한 본 발명의 실시예에서, 암 면역치료는 세포 라인 또는 CTL의 유용성에 의존하지 않고, 그것은 암 세포의 항원성 에피토프의 정의를 필요로 하지도 않는다. 이러한 이점은 자가 항원성 단백질 및/또는 펩타이드에 결합된 hsp 복합체를 암에 대한 매력적인 면역원으로 만든다.
다른 실시예에서, 치료적 또는 예방적 복합체 내의 항원성 펩타이드는 그 복합체가 투여될 대상과 알로제닉(allogeneic)한 대상으로부터 유래한 동일 타입 암의 암 조직으로부터 준비된다.
5.19 키트, 투여 요법, 투여 및 제제
본 발명의 방법에 따라 준비된, 열 쇼크 단백질에 결합한 항원성 단백질/펩타이드의 복합체는 세포 증식성 장애 또는 감염성 질환을 개선 또는 치료하기 위하여 치료학적으로 유효한 양만큼 환자에게 투여된다. 치료학적으로 유효한 양은 그러한 장애의 증상의 개선을 가져오기에 충분한 복합체의 양을 의미한다. 복합체의 유효량은 다른 치료 성분이 병용하여 사용되었을 때 다를 수 있다. 화합요법제, 방사선 치료 및 사이토카인과 같은 생물학적/면역치료적 성분과 같은 치료 성분들을 위한 적절한 및 추천되는 투여량, 요법 및 투여경로는 본 발명이 속한 분야에 잘 알려져 있고, Physician's Desk Reference (56'ed., 2002)와 같은 문헌에 잘 개시되어 있다.
5.19.1 유효한 투여량(Effective Dose)
열 쇼크 단백질과 일군의 항원성 펩타이드의 복합체의 면역원적, 유효한 양을 포함하는 본 발명의 조성물은 암 또는 감염성 질환에 대한 면역 반응을 야기하는 방법으로써 암 또는 감염성 질환의 치료가 필요한 대상에게 투여될 수 있다. 그러한 복합체의 독성 및 치료학적 유효성은 세포 배양 또는 LD50(일정 군의 50% 치사량)측정 및 ED50(일정 군의 50%가 치료학적으로 유효한 양)측정과 같은, 실험동물에 있어 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료학적 효과 사이의 투여량 비율은 치료계수이고, 그것은 LD50/ED50비율로 표시될 수 있다. 큰 치료계수를 보이는 복합체가 바람직하다. 독성 부작용을 보이는 복합체가 사용될 수 있는 반면, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적 손해를 최소화하고, 그것에 의하여 부작용을 줄기기 위하여 감염된 조직의 부위에 그러한 복합체를 타겟팅하는 약물전달 시스템의 설계에 관심이 요구된다.
일실시예에서, 세포 배양 분석과 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에 적용하기 위한 투여량의 범위를 설계하는데 이용될 수 있다. 복합체의 투여량은 바람직하게는 독성이 없거나 또는 거의 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 이내이다. 투여량은 이러한 범위 내에서 적용된 제형과 이용된 투여경로에 따라서 다양하다. 본 발명의 방법에서 사용된 복합체에 있어, 치료학적으로 유효한 투여량은 초기에 세포 배양 분석으로부터 측정될 수 있다. 투여량은 세포 배양에서 결정된 것처럼 IC50(즉, 증상의 반-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 혈장 농도 범위를 얻기 위하여 동물 모델에서 설계된다. 그러한 정보는 인간에 있어 유용한 투여량을 더 정확히 결정하기 위하여 사용될 수 있다. 혈장 내 레벨은 예를 들어 고속 액체 크로마토그래피에 의하여 결정될 수도 있다.
다른 실시예에서, hsp70- 및/또는 gp96-항원성 분자 복합체, 또는 그들의 병용물(combination)은 인간 환자에 대해서 약 0.1 내지 약 600ug의 범위로 투여될 수 있고, 바람직하게는 약 1 내지 약 60ug의 범위로 투여될 수 있다. 투여될 hsp70- 및/또는 gp96-복합체의 양은 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 0.8, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600ug일 수 있다. 바람직하게, 그 양은 100ug 보다 적다. 더욱 바람직하게, 투여될 hsp70- 및/또는 gp96-복합체의 양은 5ug, 25ug, 또는 50ug이다. 인간 환자에 있어 본 발명에 의하여 제공되는 hsp-90 펩타이드 복합체의 투여량은 5 내지 5,000ug의 범위이다. 바람직하게, 투여되는 hsp90 복합체의 양은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000ug이고, 더욱 바람직한 투여량은 100ug이다. 이러한 복용량은 바람직하게는 피내 또는 피하 투여된다. 이러한 투여량은 단회 또는 매일, 격일, 매주, 격주, 또는 매달과 같이 반복적으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 복합체는 약 4-6주의 기간 동안 매주 한 번씩 주어지고, 투여 모드 또는 부위는 바람직하게는 각 투여마다 변화한다. 따라서, 제한이 아닌 일예로, 첫 번째 주사는 왼쪽 팔 피하에 주어질 수 있고, 두 번째는 오른쪽 팔, 세 번째는 왼쪽 배, 네 번째는 오른쪽 배, 다섯 번째는 왼쪽 넓적다리, 여섯 번째는 오른쪽 넓적다리, 등에 주어진다. 동일한 부위가 하나 이상의주사의 간격 후에 반복될 수도 있다. 또한, 분할 주사될 수도 있다. 따라서, 예를 들어, 투여량의 반이 한 부위에 주어지고 다른 반이 동일 다른 부위에 주어질 수도 있다. 대안적으로 투여 모드는 순차적으로 변화된다. 즉, 매주 주사는 피내, 근육내, 피하, 정맥내 또는 복강내로 순차적으로 주어진다. 바람직하게는, 매주 1회 투여가 4주의 기간 동안 주어진다. 4-6주 후에, 추가 주사가 바람직하게는 한 달 이상의 기간이 경과한 후, 또는 복합체의 공급원이 소모된 후에 2주 간격으로 주어진다. 후 주사는 한달 간격으로 주어질 수도 있다. 후 주사의 페이스는 환자의 임상적 진전과 면역치료에 대한 반응에 따라서 조정될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 피내 투여가 순차적으로 다른 각각의 투여 부위로 주어진다.
따라서, 본 발명은 종양전 및/또는 종양 세포 또는 감염 세포에 대한 숙주 개체의 면역능력을 촉진하고 특이 면역을 이끌어 내는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 개체에 있어 암 또는 감염성 질환을 치료하고 예방하는 방법을 제공한다.
특정 실시예에서, 병용 치료 동안, hap-펩타이드 복합체는 서브-최적 양으로 투여된다. 즉 치료적 성분의 부재 하에서 투여될 때 본 발명이 속한 분야에 잘 알려진 방법으로 평가된다면 검출 가능한 치료적 이익을 나타내지 않는 양이 투여된다. 그러한 방법에서, hsp-펩타이드 복합체의 그러한 서브-최적 양이 치료적 성분을 투여 받은 대상에게 투여된다면 치료 효과에 있어 총체적인 개선이 일어난다.
바람직한 실시예에서, hsp-펩타이드 복합체는 치료적 성분의 부존재 하에서 투여될 때 암 세포가 중대하게 줄어들지 않거나 또는 증가하는 양으로 투여되거나 또는 종양 억제 또는 암 후퇴를 야기하지 않는 양으로 투여된다. 바람직한 실시예에서, hsp-펩타이드 복합체의 서브-최적 양은 치료 성분을 투여 받은 대상에게 투여되는 경우, 그것에 의하여 총체적인 치료 효과가 개선된다. hsp-펩타이드 복합체로 치료받는 대상 사이에 화학요법 또는 방사선 치료를 받는 대상들도 포함된다. 서브-최적 양은 적절한 동물 연구를 통하여 결정될 수 있다. 인간에 있어 그러한 서브-최적 양은 동물 실험으로부터 외삽에 의하여 결정될 수 있다.
일정 특정 실시예에서, hsp-펩타이드 복합체는 예를 들어 GLEEVECTM(예를 들어 캡슐 제형으로 매일 400-800mg, 400-600mg 투여량이 매일 한번에 투여되거나, 또는 800mg 투여량이 400mg씩 두 번의 투여로 투여됨)와 같은 화학요법제를 이미 받고 있는 대상에게 투여된다. GLEEVECTM은 이하에서 병용하여 사용될 수 있는 비-한정적 화학요법제 약물의 예이다. 많은 다른 화학요법제 약물에 있어, 유사한 투여 요법이 사용될 수 있다. 그러한 실시예에서, 적절한 hsp-펩타이드 복합체가 hsp-펩타이드 복합체의 부존재 하에서 이미 2일, 2일 내지 1주, 1주 내지 1달, 1달 내지 6개월, 또는 6개월 내지 1년 동안 GLEEVECTM을 투여 받은 대상에게 처음으로 투여된다. 특정 실시예에서, hsp-펩타이드 복합체는 GLEEVECTM단독으로 치료 시 저항성을 보이는 대상에게 투여된다.
다른 실시예에서, hsp-펩타이드 복합체는 GLEEVECTM을 처음으로 투여하는 대상에게 동시에 처음으로 투여된다.
또 다른 특정 실시예에서, GLEEVECTM(예를 들어 캡슐 제형으로 매일 400-800mg)은 hsp-펩타이드 복합체의 투여를 포함하는 치료를 이미 받은 대상에게 투여된다. 그러한 실시예에서, GLEEVECTM은 GLEEVECTM의 부존재 하에서 이미 2일, 2일 내지 1주, 1주 내지 1달, 1달 내지 6개월, 또는 6개월 내지 1년 동안 hsp-펩타이드 복합체를 투여 받은 대상에게 처음으로 투여된다.
특정 실시예에서, GLEEVECTM과 같은 화학요법제 약물은 경구로 투여된다. 다른 특정 실시예에서, hsp-펩타이드 복합체는 피내로 투여된다.
위에서 설명된 각각의 방법에서, 대상은 (일실시예로 주어지는 것임) 매일 GLEEVECTM과 같은 화학요법제 약물의 50mg 내지 100mg, 100mg 내지 200mg, 200mg 내지 300mg, 300mg 내지 400mg, 400mg 내지 500mg, 500mg 내지 600mg, 600mg 내지 700mg, 700mg 내지 800mg, 800mg 내지 900mg, 또는 900mg 내지 1000mg을 투여 받는다. 특정 실시예에서, 매일의 총 투여량이 25mg 내지 50mg, 50mg 내지 100mg, 100mg 내지 200mg, 200mg 내지 300mg, 300mg 내지 400 mg, 또는 400mg 내지 500mg의 두 번의 매일 투여로 대상에게 투여된다.
5.19.2 치료적 요법(Therapeutic Regimens)
암 및 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위해 전술한 병용 치료의 어는 것에 있어서, 본 발명의 복합체는 비-hsp 기초 성분의 투여 전에, 투여와 동시에, 또는투여 후에 투여될 수 있다. 비-hsp 기초 성분은 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위해 위에서 설명된 성분 중 어느 하나일 수 있다.
일실시예에서, 본 발명의 복합체는 다른 성분과 동시에 합리적으로 대상에게 투여된다. 이러한 방법은 각각으로부터 1분 이하의 시간 내지 약 5분, 또는 최대 약 60분까지의 시간 내에, 예를 들어 동일한 의사의 방문 시에, 두개의 투여가 이루어지는 것을 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명의 복합체와 일 성분은 정확하게 동일 시간에 투여된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 복합체와 그 성분은 일정 시간 내에 순차적으로 투여되어서 본 발명의 복합체와 그 성분이 단독으로 투여될 때보다 상승된 효과를 제공하도록 함께 작용한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 복합체와 일 성분은 바람직한 치료적 또는 예방적 결과를 제공하기 위하여 시간적으로 충분히 근접하게 투여된다. 각각은 적절한 제형 및 일정 적절한 경로를 통하여 동시에 또는 분리되어 투여될 수 있다. 일실시예에서, 본 발명의 복합체와 그 성분은 다른 경로로 투여된다. 대안적 실시예에서, 각각은 동일한 투여경로로 투여된다. 본 발명의 복합체는 예를 들어 팔과 다리와 같이 동일 또는 다른 부위에 투여될 수 있다. 동시에 투여될 때, 본 발명의 복합체와 그 성분은 동일 투여 경로로 동일한 투여 부위에 혼합되어 투여될 수 있다. 그러나 반드시 그러할 필요가 있는 것은 아니다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 복합체는 5.19.1항에서 설명된 요법에 따라 투여된다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 복합체와 그 성분은 1시간 이하의 시간, 약 1시간, 1시간 내지 2시간, 2시간 내지 3시간, 3시간 내지 4시간, 4시간 내지 5시간, 5시간 내지 6시간, 6시간 내지 7시간, 7시간 내지 8시간, 8시간 내지 9시간, 9시간 내지 10시간, 10시간 내지 11시간, 11시간 내지 12시간, 24시간 이하의 시간 또는 48시간 이하의 시간동안 떨어져 투여된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 복합체와 백신 조성물은 2 내지 4일, 4 내지 6일, 1주, 1주 내지 2주, 2주 내지 4주, 1달, 1달 내지 2달, 또는 2달 이상의 기간 동안 떨어져 투여된다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 복합체와 그 성분은 양쪽 모두 활동적(active)인 시기에 투여된다. 본 발명의 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 각 투여 성분의 반감기를 결정함으로써 그러한 시간을 정할 수 있다.
일실시예에서, 본 발명의 복합체와 그 성분은 동일한 환자 방문 이내에 투여된다. 특정 바람직한 실시예에서, 본 발명의 복합체는 그 성분의 투여 전에 투여된다. 대안적 특정 실시예에서, 본 발명의 복합체는 그 성분의 투여에 계속하여 투여된다. 특정 실시예에서, 본 발명의 복합체와 그 성분은 대상에게 주기적으로 투여된다. 주기 치료(cycling therapy)는 일정 시간 동안 본 발명의 복합체를 투여하고, 그 후 일정 시간 동안 일정 성분의 투여를 하는 것 및 이러한 계속적 투여를 반복하는 것을 포함한다. 주기 치료는 하나 이상의 치료에 대한 저항성의 생성을 줄일 수 있고, 그 치료 중 하나의 부작용을 피하거나 줄일 수 있고, 및/또는 치료 효율을 개선할 수 있다. 그러한 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 복합체의 투여 4 내지 6일 후에 일정 성분을 투여하는 대안적 투여를 개시하고, 바람직하게는 2 내지 4일 후에, 더욱 바람직하게는 1 내지 2일 후에 투여하는 것이다. 여기에서 그러한 사이클이 필요한 만큼 반복될 수 있다. 일정 실시예에서, 본 발명의 복합체와그 성분은 3주 이내의 사이클로, 2주마다 한번, 10일마다 한번, 또는 매주의 사이클로 번갈아 투여된다. 특정 실시예에서, 본 발명의 복합체는 일정 성분의 투여 1시간 내지 24시간 내에 대상에게 투여된다. 시간 프레임은 일정 성분 전달 시스템이 느린-또는-계속적인 방출 타입이라면 수일 또는 그 이상 더 연장될 수도 있다.
5.19.3 제제와 사용(Formulations and Use)
본 발명에 따른 사용을 위한 약학적 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 캐리어 또는 첨가제를 사용하여 통상적인 방법으로 제제화될 수 있다.
따라서, 복합체와 그들의 생리학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물은 흡입 또는 통기경로 (입 또는 코를 통함), 경구경로, 버칼경로, 비경구경로, 직장경로, 또는 트랜스더말 경로로 투여되도록 제제화될 수 있다. 비-침습적 투여 방법 또한 개시된다.
경구 투여를 위하여 약학적 조성물은 예를 들어 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 이용하여, 통상적인 방법으로 제조된 정제 또는 캡슐 제형일 수 있다. 그러한 첨가제로는 결합제(예를 들어, 프리젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로오스); 충진제(예를 들어 락토스, 미결정셀룰로오스 또는 칼슘 하이드로젠 포스페이트); 활택제(예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예를 들어 감자 전분 또는 소디움 스타치 글리콜레이트); 습윤제(예를 들어 소디움 라우릴 설페이트) 등이 있다. 정제는 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 방법에 의해 코팅될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제형은 예를 들어 용액, 시럽 또는 현탁제형 이거나, 또는 사용 전에 물 또는 다른 적당한 비히클로 구성되는 건조 프로덕트의 제형일 수도 있다. 그러한 액상 제제는 현탁화제(예를 들어 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화 식용 오일); 유화제(예를 들어 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예를 들어 알몬드 오일, 오일리 에스터, 에틸 알코올 또는 분별된 식물 기름); 및 보존제(예를 들어 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르빅 산)과 같은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 사용하여 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 제제는 또한 적절한 완충 염, 향료, 색소 및 감미 성분을 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 제제는 활성 복합체를 조절 방출하도록 적절히 제제화될 수 있다.
버칼 투여를 위하여, 조성물은 통상적인 방법으로 제조된 정제 또는 로젠지(lozenge) 제형일 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위하여, 본 발명에 따른 사용을 위한 복합체는 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 카본디옥사이드 또는 다른 적절한 가스와 같은 적절한 프로펠런트(propellent)를 사용하여 압축된 팩 또는 네뷰라이저(nebuliser)로부터 에어로졸 스프레이 프리젠테이션의 제형으로 편리하게 전달될 수 있다. 압축된 에어로졸의 경우에 있어, 투여 유닛은 정해진 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서의 사용을 위한, 예를 들어 젤라틴의, 캡슐과 카트리지는 락토스 또는 전분과 같은 적절한 파우더 베이스와 복합체의 혼합 파우더를 함유하도록 제제화될 수 있다.
복합체는 예를 들어 대량 주사(bolus injection) 또는 계속 주입과 같은 주사에 의한 비경구적 투여를 위해 제제화될 수 있다. 주사를 위한 제제는 첨가된 보존제와 함께, 예를 들어 앰플 또는 멀티-투여 컨테이너와 같은, 유닛 투여 제형으로 제공될 수 있다. 조성물은 현탁제, 용액제 또는 오일리 또는 수성 비히클 내의 유제 제형일 수 있고, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산화제와 같은 제제화 성분을 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 예를 들어 멸균 파이로젠-프리 물과 같은 적절한 비히클로 사용 전에 구성되는 파우더 제형일 수 있다.
복합체는 또한 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드와 같은 통상적인 좌제 기제를 포함하는 좌제 또는 보류 관장제(retention enemas)와 같은 직장 조성물로 제제화될 수 있다.
앞서 설명된 제제들 이외에, 복합체는 또한 데포 제제로 제제화될 수 있다. 그러한 장기 작용 제제는 이식(예를 들어 피하 또는 근육 내) 또는 근육 내 주사에 의하여 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 복합체는 적당한 폴리머 또는 소수성 물질 (예를 들어 허용 가능한 오일 내 유제와 같은) 또는 이온 교환 수지, 또는 용해되기 어려운 유도체, 예를 들어 용해되기 어려운(적당히 용해되는) 염을 이용하여 제제화될 수 있다.
조성물은, 필요하다면, 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 유닛 투여 제형을 포함하는 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일 (예를 들어 블리스터 팩)을 포함한다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 사용설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 복합체와 병용되거나 혼합되는 애주번트의 사용도 또한 포함된다. 개시된 애주번트는 5.18장에서 설명된 바와 같이 미네랄 염 애주번트 또는 미네랄 염 겔 애주번트, 입자성 애주번트, 마이크로파티클 애주번트, 점막성 애주번트, 및 면역자극 애주번트를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 애주번트는 5.19.2 장에서 설명된 바와 같이 복합체와 병용하여 사용되거나 또는 본 발명의 복합체와 혼합되어 대상에게 투여될 수 있다.
본 발명의 복합체와 혼합하여 또는 병용하여 아데노신 디포스페이트(ADP), 특히 gp96 복합체의 사용 또한 본 발명에서 개시된다.
5.19.4 키트
본 발명은 또한 본 발명의 방법 및/또는 치료적 요법을 수행할 수 있는 키트를 제공한다.
일실시예에서, 그러한 키트는 하나 이상의 컨테이너 내에 두 번째 컨테이너에서 제공되는 hsp와 혼합되기 위한 항원성 단백질과 펩타이드를 포함하는 단백질 제제 포함한다. 다른 실시예에서, 그러한 키트는 하나 이상의 컨테이너 내에 두 번째 컨테이너에서 제공되는 hsp와 혼합되기 위한 항원성 펩타이드를 포함하는 처리된 펩타이드를 포함한다. 대안적으로, 단백질 및/또는 펩타이드는 자가 투여를 위하여, 특정 환자로부터 분리된 hsp와 복합체화되기 위하여 하나 이상의 컨테이너에서 제공된다. 선택적으로, 단백질과 펩타이드와 복합체화되기 위한 정제된 hsp가두 번째 컨테이너에서 더욱더 제공된다.
다른 실시예에서, 그러한 키트는 하나 이상의 컨테이너에서 약학적으로 허용 가능한 형태로 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양의 hsp와 단백질/펩타이드의 복합체, 바람직하게는 정제된 복합체를 포함한다. 키트는 선택적으로 두 번째 컨테이너에서 감작된 APC, 바람직하게는 정제된 것을 더 포함한다.
다른 실시예에서, 키트는 하나의 컨테이너에서 hsp-펩타이드 복합체, 두 번째 컨테이너에서 상기 복합체의 올리고머화를 위한 올리고머화제 및 올리고머화된 복합체의 제조를 위한 사용설명서를 포함한다. 다른 실시예에서, 키트는 항원성 펩타이드를 포함하는 컨테이너, hsp를 포함하는 다른 컨테이너, 키트의 hsp를 올리고머화하기 위한 올리고머화제를 포함하는 세 번째 컨테이너 및 올리고머화된 hsp-펩타이드 복합체의 제조를 위한 사용설명서를 포함한다.
본 발명의 키트의 컨테이너 내의 hsp-펩타이드 복합체는, 예를 들어 멸균 식염수, 덱스트로스 용액, 또는 완충 용액, 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 멸균 용액과 병용하여, 약학적으로 허용 가능한 용액 형태일 수 있다. 대안적으로, hsp-펩타이드 복합체는 동결건조되거나 또는 건조될 수 있다. 이러한 경우, 키트는 선택적으로 주사 목적을 위한 용액을 형성하기 위하여 컨테이너 내에 hsp-함유 복합체를 재구성하기 위한 약학적으로 허용 가능한 용액(예를 들어 식염수, 덱스트로스 용액 등), 바람직하게는 멸균 식염수를 더 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 키트는 hsp-펩타이드 복합체를 주사하기 위한 주사바늘(needle) 또는 실린지, 바람직하게는 멸균 형태로 포장된 주사바늘 또는실린지, 및/또는 포장된 알콜 패드를 더 포함한다. 사용설명서는 임상의 또는 환자에 의한 hsp-펩타이드 복합체의 투여를 위해 선택적으로 포함된다.
키트는 또한 본 발명의 병용 치료를 수행하기 위하여 제공된다. 일실시예에서, 키트는 암의 치료를 위하여 하나 이상의 정제된 hsp-펩타이드 복합체를 포함하는 첫 번째 컨테이너와 비-hsp 기초 치료 성분을 포함하는 두 번째 컨테이너를 포함한다. 바람직하게는, 암은 CML, hsp-펩타이드 복합체는 hsp70-펩타이드 복합체를 포함하고, 치료 성분은 GLEEVECTM. 특정 실시예에서, 두 번째 컨테이너는 이마티니브 메실레이트(imatinib mesylate)를 포함한다. 다른 실시예에서, 이마티니브 메실레이트는 정제된다.
특정 실시예에서, 키트는 단독으로 투여될 때 질병 또는 장애를 치료하기에 불충분한 양의 정제된 하나 이상의 hsp-펩타이드 복합체를 포함하는 첫 번째 컨테이너; 및 첫 번째 컨테이너 내의 hsp-펩타이드 복합체의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여될 때 각 성분 단독 투여 시의 효율성과 비교하여 전체적인 치료 효율을 개선하기에 효과적인 양의 비-hsp 기초 치료 성분을 포함하는 두 번째 컨테이너를 포함한다. 다른 특정 실시예에서, 키트는 단독으로 투여될 때 질병 또는 장애를 치료하기에 불충분한 양의 정제된 하나 이상의 hsp-펩타이드 복합체를 포함하는 첫 번째 컨테이너; 및 첫 번째 컨테이너 내의 hsp-펩타이드 복합체의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여될 때 단독으로 투여된 hsp-펩타이드 복합체 또는 단독으로 투여된 치료 성분의 효율과 비교하여 전체적인 치료 효율을 개선하기에 효과적인 양의 비-hsp 기초 치료 성분을 포함하는 두 번째 컨테이너를 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 키트는 단독으로 투여될 때 질병 또는 장애를 치료하기에 불충분한 양의 정제된 하나 이상의 hsp-펩타이드 복합체를 포함하는 첫 번째 컨테이너; 및 첫 번째 컨테이너 내의 hsp-펩타이드 복합체의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여될 때 단독으로 투여된 hsp-펩타이드 복합체 또는 단독으로 투여된 치료 성분의 효율과 비교하여 전체적인 치료 효율을 개선하기에 효과적인 양의 비-hsp 기초 치료 성분을 포함하는 두 번째 컨테이너를 포함한다. 보다 바람직한 특정 실시예에서, 본 발명은 첫 번째 컨테이너 내에 본 발명의 일군의 비공유 hsp-펩타이드 복합체를 포함하는 하나 이상의 정제된 hsp-펩타이드 복합체; 두 번째 컨테이너 내에 항암 성분을 포함하는 조성물; 및 세 번째 컨테이너 내에 사이토카인 또는 애주번트를 포함하는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 예를 들어 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스트 호일을 포함한다. 키트는 투여를 위한 하나 이상의 재사용가능한 또는 1회용 장치 (예를 들어 실린지, 주사바늘, 분배 펜) 및/또는 투여를위한 사용설명서를 포함할 수 있다.
5.20 면역치료 동안 효과의 모니터링
종양 질환의 전개와 진전에 대한 hsp-항원성 분자 복합체를 이용한 면역치료의 효과는 a) 세포 면역의 평가로써 지연된 과감작(hypersensitivity); b) 세포독성 T-임파구in vitro활성; c) 예를 들어, 암배아(carcinoembryonic, CEA) 항원과 같은 종양 특히 항원의 레벨; d) 컴퓨터 단층(CT) 스캔과 같은 기술을 사용하는 종양 형태의 변화; e) 고 위험군의 개체에 있어 특정 암에 대한 위험의 추정 바이오마커의 레벨의 변화; 및 f) 소노그람을 사용한 종양의 형태의 변화를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 방법에 의하여 모니터될 수 있다.
5.20.1 지연 과감작 피부 테스트(Delayed Hypersensitivity Skin Test)
지연 과감작 피부 테스트는 총 면역능력 및 항원에 대한 세포면역에 있어 큰 가치가 있다. 일반 피부 항원의 전지(battery)에 반응하지 않는 것은 아네르기(anergy)라 칭한다(Sato, T., et al, 1995, Clin. Immunol. Pathol., 74: 35-43).
피부 테스트의 적절한 기술은 항원이 4℃에서 멸균 상태로 보관되고, 빛으로부터 보호되고 사용 전에 짧게 재구성될 것을 필요로 한다. 25- 또는 27-게이지 주사바늘은 항원의 피하 투여 보다는 피내 투여에 적당하다. 항원의 피내 투여 24시간 및 48시간 후에, 가장 큰 홍반(erythema)과 경화(induration)가 자를 이용하여 측정된다. 어떤 항원 또는 항원 그룹에 대한 저활성(hypoactivity)은 더 높은 농도의 항원으로 시험하거나 또는 모호한 상황에서는 중간체 테스트를 이용한 반복테스트에 의하여 확인된다.
5.20.2 세포독성 T-세포의 In Vitro 활성
Ficoll-Hypaque 구배차 원심분리 기술로 분리한 8x106개의 말초 혈액 유래 T임파구는 10%의 송아지 태아 혈청을 함유하는 3ml RPMI 배지에서 4x104개의 미토마이신 C 처리 암 세포로 재 자극된다. 몇몇 실험에서, 33%의 2차 혼합 임파구 배양 상등액 또는 IL-2가 T-세포 성장 인자의 공급원으로써 배양 배지 안에 포함된다.
면역화 후에 세포독성 T-임파구의 주 반응을 평가하기 위하여, T-세포는 자극용 암 세포 없이 배양된다. 다른 실험들에서, T-세포는 항원적으로 구분되는 세포로 재 자극된다. 6일 후에, 배양물은 4 시간 51Cr-방출 분석으로 세포독성이 테스트된다. 타겟의 자발적인 51Cr-방출은 20% 이하의 레벨에 도달하여야 한다. 항-MHC 클래스 I 억제 활성에 대하여, W6/32 하이브리도마의 10배 농도의 상등액이 12.5%의 최종 농도로 테스트에 첨가된다(Heike M., et al., J, Immunotherapy, 15: 165-174).
5.20.3 종양 특정 항원의 레벨
비록 모든 종양에 있어 독특한 종양 항원을 검출 가능한 것은 아니지만, 많은 종양은 정상 세포로부터 그들을 구별 가능한 항원을 나타낸다. 모노클로날 항체 시약은 그 항원의 분리와 생화학적 특성을 밝혀주고, 비-형질전환된 세포와 형질전환된 세포의 구별 및 형질전환된 세포의 세포 계통 정의를 위해 진단학적으로 매우 가치있다. 가장-특성화된 인간 종양-관련 항원은 태아종양(oncofetal) 항원이다. 이러한 항원은 배아형성 동안 발현되지만, 정상 성인 조직에서는 존재하지 않거나 검출되기 어렵다. 원형(prototype) 항원은 태아 위 및 인간 결장 암 세포에서 발견되지만 정상 성인 결장 세포에서는 발견되지 않는 암배항원(carcinoembryonic antigen (CEA))이다. CEA는 결장 암종 세포로부터 벗어나 혈청 내에서 발견되기 때문에, 이러한 항원의 혈청 내 존재는 결장암을 가진 환자를 검색하기 위해 사용될 수 있다고 원칙적으로 생각되었다. 그러나, 췌장암 및 유방암과 같이 다른 암을 가진 환자 또한 CEA의 증가된 혈청 레벨을 가진다. 그러므로, 치료를 받는 암 환자에 있어 CEA 레벨의 상승과 하강을 모니터링하는 것은 암의 진행과 치료에 대한 반응을 예측하는데 유용하다는 것이 증명되었다.
몇몇 다른 태아종양 항원이 인간 종양을 진단하고 모니터링하는데 유용하다. 예를 들어 태아 간과 요크 색(yolk sac) 세포에서 일반적으로 분비되는 α-글로블린인 α-페토단백질은 간 및 종자(germinal) 암을 가진 환자의 혈처에서 발견되고 질병 상태의 지표(marker)로써 사용될 수 있다.
5.20.4 컴퓨터 단층(CT) 스캔
CT는 암의 정확한 단계측정에 대한 선택 기술로 남아 있다. CT는 전이 검출을 위한 어떠한 다른 이미징 기술보다 민감하고 특이적이라는 것이 증명되었다.
5.20.5 추정적(putative) 바이로마커의 측정
특정 암의 위험에 대한 추정적 바이오마커의 레벨이 펩타이드에 비공유적으로 결합한 hsp 복합체의 효과를 모니터하기 위해 측정된다. 예를 들어 전립선암에 대하여 고 위험인 개체에서, 혈청 전립선-특이 항원(PSA)이 Brawer, M.K., et.al., 1992, J. Urol., 147: 841-845, 및 Catalona, W.J., et al., 1993, JA M A, 270: 948-958에 설명된 절차에 의하여 측정된다. 또는 결장직장암에 대하여 고 위험인 개체에서, CEA가 위에서 설명된 방법으로 측정되고 유방암에 대하여 고 위험인 개체에서, 에스트라디올의 16--하이드록실레이션이 Schneider, J.et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. ISA , 79: 3047-3051에 개시된 방법에 의하여 측정된다.
5.20.6. 소노그람(sonogram)
소노그람은 암의 정확한 단계평가를 위한 대안적 선택기술로 남아있다.
in vitro 생물학적 활성과 다이머 존재 간의 상관관계
다음의 실시예는 본 발명에 대한 기초를 제공한다. Gp96-펩타이드 복합체는 생쥐 CT-26 종양으로부터 분리된다. 각 조제물의 분리된 일정부분(aliquot)은 4℃(비처리된 상태)로 보관되거나 복합체를 변성시키기 위하여 미열 처리된다. 도 1은 SEC 크로마토그람인데 표시된 조건 하에서 그 단백질이 빠르게 높은 분자량 응집체로 전환되는 것을 보여준다.
그 후 동일 샘플이 IFN-γ 발현에 의하여 평가됨으로써 항원 재-프리젠테이션 및 T-세포 활성에 대하여 평가되었다. 각각의 시험을 3회 반복하여 그 결과를 아래의 표 2에 나타내었다. 결과는 열에 의해 유도되어 다이머로부터 응집체로의 전이가 있는 경우, 항원 재-프리젠테이션 및 T-세포 활성이 동반하여 감소한 것을 보여준다.
조건 SEC에 의한 다이머% 특정 NECA 활성(ug NECA결합gp96/ug gp96) 암 특이 T-세포 활성화(IFN-γ방출)(pg/ml)
실험 1
4℃ 75.8 3.27 102600
60℃, 60분 0 0.08 9350
60℃, 120분 0 0.10 8100
실험 2
4℃ 84.44 1.68 19600
49.5℃, 30분 0 0.12 3150
60℃, 30분 0 0.04 50
실험 3
4℃ 87 1.96 8000
49℃, 15분 74 1.97 0
49℃, 25분 54 1.80 0
60℃, 30분 0 0.07 0
다이머 함량은 또한 NECA에 결합하는 gp96의 능력과 또한 상관성이 있다. CT-26 종양으로부터 분리된 gp96-펩타이드 복합체의 사용에서, 각 조제물의 일정부분이 또한 NECA 리간드 결합에 대하여 분석되었다. 3회 측정한 결과를 표 2에 나타내었다. 다이머에서 응집체로 열 유도 전이되는 경우, NECA 결합 활성이 동반되는 감소한다.
다른 실험은 다이머 함량이 항원 표현 세포(antigen presenting cell)의 케모카인/니트로 옥사이드 방출을 자극하는 gp96의 능력과 상관관계가 있다는 것을 보여준다. Meth-A 생쥐 섬유육종 종양으로부터 정제된 gp96는 열 및 pH 변성 양쪽 모두에 종속된다. 이러한 물질은 생쥐 항원 표현 세포가 MCP-1과 니트릭 옥사이드를 분비하도록 유도하는 그들의 능력이 SEC와 NECA 결합에 의하여 평가되었다. 그 결과를 도 2에 요약하였다. 열처리는 gp96 다이머를 변성 또는 다른 구조적 변화 때문에 불활성화된다고 생각되는 더 높은 차수의 응집체로의 전환을 야기하였다. NECA 리간드 결합 및 MCP-1과 NO 생산은 다이머의 감소와 함께 동반하여 줄어들었다. 유사한 경향이 gp96를 pH 3에 노출시켰을 때 관찰되었다. pH 7 또는 9에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 분자의 구조적 및 생화학적 성질과 생물학적 반응 사이의 인식된 긍정적 관련성과도 일치한다.
ATPase 활성과 다이머 존재의 상관성
다음의 실험의 결과는 정제된 gp96 복합체의 ATPase 활성(단백질 mg 당 ATP 가수분해의 비율로 측정됨)이 직접적으로 다이머의 존재와 관련되어 있다는 것을증명한다.
두 세트의 실험이 gp96 아이소폼(isoform)이 ATPase 활성을 가지고 있는지 여부를 결정하기 위하여 인간 gp96-펩타이드 복합체를 가지고 수행되었다. 실험의 첫 번째 세트(도 3-6)는 인간 난소 종양 유래 gp96-펩타이드 복합체를 이용하였다. 도 3은 이러한 조제물에 대한 예비적 및 분석적 SEC 프로파일을 보여준다. 다른 분석에 사용될 분획들이 표시된 바와 같이 모아졌다. 도 4는 분석 SEC 크로마토그람(점선은 다이머 형태의 용출 위치를 표시함)을 나타낸다. 도 5는 각 개체 분획의 실버 염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 비록 대부분의 분획이 주로 변성 조건 하에서 96kDa의 폴리펩타이드를 포함하지만, 그들은 SEC 위 비-변성 조건 하에서 다른 분자량 계열로 깨끗하게 분해되었다. 분획 2-5는 대부분의 고분자량 응집체를 포함하는 반면, 분회 8-10은 다이머이다. 분획 11과 12는 SDS-PAGE 분석에 기초하면 모노머 계열을 함유하는 것으로 생각된다. 분획 13과 그 이상은 분해산물과 낮은 분자량 계열을 함유한다.
마직막으로, 각 분획의 ATPase 활성이 루시페린-루시페라제 루미네슨스(luminescence) 분석을 사용한 ATP의 손실에 기초하여 결정되었다. 수치들은 mg 단백질 당 ATP 가수분해의 비율로 나타내었다. 도 6에 나타나는 바와 같이, ATPase 활성은 직접적으로 다이머의 존재와 상관성이 있다. ATPase 활성은 고 분자량 응집체 및 모노머 분획에서 최소이었고, 다이머를 함유한 분획에 존재하였다. 이러한 결과는 다이머형의 gp96가 ATP의 효소적 가수분해를 위해 필요하다는 것을 나타낸다.
이러한 실험들이 신장 암 유래 gp96-펩타이드 복합체 샘플을 사용하여 반복되었다. 결과는 완전하게 위에서 설명된 결과와 일치하였고, 다이머형의 gp96-펩타이드 복합체가 ATPase 활성을 함유하고, 정제 과정 중에 생성된 모노머형 gp96 또는 고 분자량의 응집체 (크로스-링킹제의 부존재 하에서)는 그러한 활성이 없다는 결론을 뒷받침하였다. 활성의 부존재 이유는 변성 또는 다른 구조적 변화 때문이라고 여겨진다.
항원 재-프리젠테이션과 ATPsse 활성 사이의 상관성
역가의 생물학적 측정으로써 ATPase 활성의 관련성을 증명하려는 노력에서, 일정 세트의 실험이 항원 재-프리젠테이션과 ATPase 활성을 연관시키기 위하여 인간 gp96을 사용하여 시작되었다. 이러한 실험은 생쥐 모델에서 다이머 gp96와 항원 재-프리젠테이션를 연결짓는 데이터를 얻기 위해 또 인간 유래 복합체에서 다이머 gp96과 ATPase 활성을 연결짓은 데이터를 얻기 위해 의도되었다.
이러한 목적에서, 하이브리드 항원 재-프리젠테이션 바이오어세이 분석이 생쥐 항원, AH1 펩타이드(이것에 대해서는 생쥐 CD8 T-세포 라인이 유용함)가 인간 종양 유래 hsp 위로in vitro교환되는 방식으로 개발되었다. gp96-펩타이드 복합체는 그 후 항원 재-프리젠테이션 및 항원-특이 T-세포 자극을 촉진하는 능력에 대하여 시험되었다. 아래에 제시된 두 개의 인간 종양 타입을 이용한 세 번의 실험결과는 ATPase 활성 분석 결과, 항원 재-프리젠테이션과 SEC에 의한 다이머% 사이의 상관성을 보여준다. 이러한 결과는 우리의 기초 지식에 더해지고, ATPase 활성이그들의 생물학적 활성에 있어 중요한 hsp 및 hsp-펩타이드 복합체의 다른 결정적인 생물학적 및 구조적 기여와 뜻있는 방식으로 관련되었다는 것을 또 증명한다.
gp96 조제물은 인간 자궁내막 또는 신장 세포 암종 암 샘플로부터 만들어진다. 간단하게 인간 암 조직은 균질화되고(homogenized), 원심분리에 의해 분류되고, 50% 암모니움 설페이트 침전이 행하여진다. 결과적으로 발생하는 상등액은 Con A 및 DEAE 크로마토그라피를 사용하여 더 정제된다. 정제된 단백질은 사용 때까지 -80℃에서 보관되었다.
항원 표현 세포 라인(RAW264.7(ATCC#TIB-71))은 Abelson 생쥐 백혈병 바이러스로 형질전환된 마크로파지 세포 라인이고, 그것은 BALB/c 세포주(H-2d)이다. 생쥐 CT26 종양 유래 AH1 에피토프에 특이적인 CTL 라인은 P. Srivastava(U. of Conn. Medical Center)로부터 얻어진다. 그들은 AH1 펩타이드가 더해진 조사된 BALB/c 비장세포(splenocyte)로 매주 재-자극되었다. 9개 아미노산 AH1 펩타이드 에피토프(SPSYVYHQF)와 이러한 에피토프를를 포함한 19mer 펩타이드(RVTYHSPSYVYHQFERRAK)가 Sigma Genosys 1442 lake Front Circle, The Woodlands, Texas 77380-3600로부터 얻어졌다.
AH1 19mer 펩타이드는 정제된 gp96 조제물에 50:1 펩타이드 대 단백질의 비율로 더해졌고 이러한 혼합물은 37℃에서 30분 동안 배양되었다. 결합되지 않은 펩타이드는 30K MWCO Centricon 스핀 여과 유닛(Millipore)을 이용하여 10배 부피의 PBS를 가지고 스핀 투석을 4회 실시하여 제거되었다. 총 단백질은 Bradford 분석에의하여 결정되었다.
in vitro항원 재-프리젠테이션 분석이 설명된다. 간단하게, 104AH1 펩타이드-특이 CTL(자극 후 8일)이 96-웰 편평 바닥 플레이트에서 104RAW264.7와 함께 공동-배양되었다. 10ug/ml로in vitro로딩된 gp96 샘플은 일정한 단백질 농도를 유지하기 위하여 그 자체로 또는 로딩되지 않은 gp96으로 표시된 양만큰 희석되어 분석되었다. 단백질 샘플과 대조군은 웰에 더해지고 37℃에서 18시간 동안 배양되었다. 원심분리 후에, 상등액은 IFN-γ 레벨을 ELISA(R&D Systems)로 분석하기 위하여 모아졌다. 보고된 수치는 6회 실험의 평균치이다. AH1 9mer 펩타이드는 양성 대조군으로 이용하였고, 로딩되지 않은 gp96, AH 19mer 펩타이드 및 매질 단독은 음성 대조군으로 이용하였다. 추가적 음성 대조군은 동일한 세트의 샘플을 CTL 또는 APC 단독으로 포함한 플레이트에 적용하여 이용하였다.
ATPase 활성은 루시페린-루시페라제 루미네슨스 분석을 사용하여 37℃에서 4시간 배양 후에 ATP의 손실을 측정함으로써 평가되었다. 수치는 mg 단백질 당 ATP 가수분해의 비율로써 표시되고, 단지 열 쇼크 단백질의 hap90 계열들의 특이성을 확인하기 위하여 억제 가능한 젤다나마이신(geldanamycin)인 활성을 나타낸다.
분석은 다음과 같이 수행되었다. gp96 샘플(2uL, 500ug/mL in PBS)이 10배 몰 과량의 ATP를 포함하는 PBS (12.5mM MgCl2과 400M 젤다나마이신을 포함하는 20%(v/v) DMSO 또는 DMSO를 포함) 용액 2uL와 혼합되었다. 그 혼합물은 37℃에서 4시간 동안 배양되었다. 샘플은 드 후 PBS를 가지고 100ul로 희석되었고, 각 샘플의50ul 안에 포함된 ATP는 ROCHE CLSII bioluminescence ATP 분석 키트를 사용하여 정량되었다. 생물학적발광(Bioluminescence)은 Molecular Devices Lmax 루미노미터를 사용하여 평가되었다. 억제되지 않는 측정과 젤다나마이신-억제 측정 사이의 ATP 농도의 차이는 gp96에 특이적인 ATP 가수분해의 양을 반영한다. 비율은 mg 단백질 당, 시간 당 가수분해된 ATP의 nmole로 이러한 분별적이고 발현적인 것으로부터 계산되었다.
HPLC 크기 배제 크로마토그라피가 최근에 최적화되어지고 있고 적은 수의 다른 체제에서 이용되었다. 컬럼은 10mM 인산 완충액, pH 7.1(300mM NaCl 이용)로 평형화된 TSK 3000SWXL (Toso Haus) 또는 Superose 6 (Amersham Pharmacia)이다. 모든 실험은 실온에서 수행되었고, Waters Alliance 또는 HP1100 HPLC 시스템을 이용하였으며, 유속은 0.5 mL/min이었다. 인간 종양 유래 gp96(아래의 표 3 참조)에 대한 다음의 결과는 모두 Superose 6 컬럼에서 분석되었다. % 다이머 수치는 전체 피크 면적 대비 다이머 피크의 면적 퍼센트를 나타낸다.
실험 일자 종양타입 항원 재-프리젠테이션 ATPase(Nmol/mg/hr) 다이머%
비처리 가열 비처리 가열 비처리 가열
1 10-12-01 인간자궁내막(10-10-01) 양성 음성 8.5±0.3 0 86 0
2 10-19-01 인간자궁내막(10-10-01) 양성 음성 9.4±0.5 0 83 0
3 10-19-01 인간 신장(10-17-01) 양성 음성 10.3±0.1 0 84 0
표 3은 인간 종양 유래 gp96 조제물에 대한 크기 배제 크로마토그라피의 항원 재-프리젠테이션, ATPase 및 다이머% 결과를 요약한 것이다. gp96 샘플은 AH119mer 펩타이드로 로딩되고, 결합되지 않은 펩타이드를 제거하기 위하여 세척되었다. 그 후 두개의 샘플로 나뉘고, 그중 하나는 60℃에서 10분 동안 가열되었다. 처리되지 않은 샘플과 처리된 샘플이 각각의 분석에서 평가되었다. "양성"은 IFN-γ 방출이 검출되었다는 것을 의미한고, "음성"은 IFN-γ 방출이 검출되지 않았다는 것을 의미한다.
열 처리 샘플은 분석 전에 10분 동안 60℃로 열사이클러 또는 순환수조에서 배양되었다.
하이브리드 재-프리젠테이션 분석은 항원 특이 T-세포의 자극을 유도하는 재-프리젠테이션을 촉진하는 생쥐 APC에 대한 항원을 전달하기 위하여 AH1 19mer 펩타이드로 로딩된 인간 gp96의 능력을 측정한다. 인간 자궁내막 유래 gp96을 사용한 실험의 결과는 도 7에 나타내었다. 꼭대기 패널은 APC 및 CTL 양쪽에 적용된 샘플의 IFN-감파 레벨을 나타낸다. 두 번째 및 세 번째 패널은 CTL과 APC 단독에 대한 대조군이다. 각각의 데이터 세트는 매질 단독, 로딩되지 않은 gp96 및 AH1 19mer를 음성 대조군으로 포함하고, 표면 MHC I 분자위에서 직접적으로 교환 가능한 AH1 9mer 펩타이드를 양성 대조군으로 포함한다. gp96/AH1 19mer 복합체는 10ug/mL로 적용되거나 로딩되지 않은 gp96을 이용하여 1:3, 1:10 또는 1:30의 비율로 희석되었다. 결과는 용량 의존적 IFN-γ 반응과 로딩되지 않은 gp96의 비 자극을 보여준다. 대조군은 활성이 AH1 19mer-로딩 gp96에 특이적이라는 것을 나타낸다. 단백질-펩타이드 복합체 샘플이 단백질의 완전한 응집을 야기하는 것으로 알려진 조건인 10분 동안 60℃로 가열될 때, T-세포를 자극하는 능력은 없어진다. 실험은 동일한물질로 반복되었고 동일한 결과가 얻어졌다.
동일한 실험 프로토콜이 인간 신장세포 암종 표본으로부터 제조한 gp96 단백질을 사용하여 또한 반복되었다. 다시, 특이적이고 용량 의존적인 T-세포 자극이 열처리에 의해 폐지된다는 동일한 결과가 얻어졌다.
재-프리젠테이션 분석으로부터 얻은 gp96-펩타이드 복합체 샘플의 ATPase 활성 및 다이머 %가 SEC로 더 분석되었다. 결과를 표 3에 요약하였다. 항원 재-프리젠테이션 분석이 양성인 샘플은 ATPase 활성을 가지고 있고, SEC 시 주로 다이머를 포함한다. 열처리 후에, 모든 ATPase 활성은 없어졌고, 모든 다이머 단백질은 높은 분자량 응집체로 전환되었다. 이러한 결과는 ATPase 활성, SEC에 의해 측정된 구조적 속성에 의해 평가된 효소적 활성과in vitro생물학적 활성 사이에 양성적 상관관계가 있다는 것을 보여준다.
ATPase 활성은 안정성을 나타냄 (ATPASE ACTIVITY IS STABILITY INDICATING)
여기에서 제시된 데이터는 ATPase 활성이 안정성-표시 분석이라는 것을 나타낸다. gp96의 다이머 형을 이용한 가속 안정성 연구는 ATPase 활성에 있어 일정한, 일치되는 손실을 일으켰다. 이러한 실험은 gp96의 응집과 함께 분열 프로덕트를 생성하는 단백질분해를 일으키는 미열처리를 포함한다. 도 8은 재조합 gp96 샘플이 표시된 온도에서 10분 동안 배양되고, 그 후 SEC로 ATPase 활성 및 다이머 %가 분석된 샘플의 실험 결과를 나타낸다. 이 실험에서 온도 유도 변성의 결과로 발생한 ATPsse 활성의 손실과 다이머 gp96 사이의 직접적 상관성이 있었다. 유사한 결과가인간 gp96-펩타이드 복합체를 사용하여 얻어졌다. 미열처리는 ATPase 활성을 없애고, 다이머 단백질을 더 높은 분자량의 응집체로 전화하였다.
본 명세서에서 언급된 모든 인용문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 모든 목적에 있어 각각의 개별 문헌 또는 특허 또는 특허출원서가 특징적 및 개별적으로 모든 목적에 있어 그 전체가 그 인용에 의하여 포함되는 것과 같이 표시된 바처럼 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 많은 수정과 변경이 본 발명의 사상과 범위로부터 벗어남 없이 만들어 질 수 있음은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 본 명세서에서 설명된 특정 실시예는 단지 예시적 목적으로 제공되는 것이고, 본 발명은 단지 첨부된 청구항의 용어와 그러한 청구항이 부여하는 균등의 총 범위에 의해 정하여 진다.
<110> ANTIGENIC INC. UNIVERSITY OF CONNECTICUT HEALTH CENTER <120> METHODS AND PRODUCTS BASED ON OLIGOMERIZATION OF STRESS PROTEINS <150> US60/361257 <151> 2002-02-28 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Murine leukemia virus <400> 1 Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Murine leukemia virus <400> 2 Arg Val Thr Tyr His Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe Glu Arg 1 5 10 15 Arg Ala Lys

Claims (81)

  1. 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성의 지표로 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 이용하는 것을 포함하는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 검출하는 방법.
  2. gp96-펩타이드 복합체의 생물학적 활성의 지표로 gp96-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 이용하는 것을 포함하는 gp96-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 검출하는 방법.
  3. 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성의 지표로 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 존재를 이용하는 것을 포함하는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 검출하는 방법.
  4. gp96-펩타이드 복합체의 생물학적 활성의 지표로 gp96-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 존재를 이용하는 것을 포함하는 gp96-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 검출하는 방법.
  5. (a) 화합물 부존재 상태에서 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 측정하는 단계;
    (b) 화합물과 상기 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 접촉하는 단계;
    (c) 화합물과 접촉한 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 ATPase 활성과 접촉하지 아니한 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 비교하는 단계; 및
    (d) 그 화합물이 생물학적 활성을 조절한다는 지표로 화합물과 접촉한 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성과 접촉하지 아니한 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성의 차를 이용하는 단계를 포함하는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 조절하는 화합물의 검색 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 에이티피에이즈(ATPase) 활성은 이온 교환 크로마토그래피, 바이오루미네센스 분석, HPLC, 방사성 동위원소 분석 또는 면역친화(immunoaffinity) 분석에 의하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 뉴클레오타이드 - hsp 결합의 저해제의 존재하에서 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 측정하고, 상기 저해제의 존재하에서 저해되는 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 생물학적 활성의 지표로 사용하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드-hsp 결합의 저해제는 젤다나마이신(geldanamycin) 또는 NECA인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 방법은 상기 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 질량 기초한 비 활성(specific activity)이 주어진다면, 상기 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 질량을 결정하는 단계를 더욱 포함하는 방법.
  10. (a) 화합물 부존재 상태에서 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 양을 측정하는 단계;
    (b) 화합물과 상기 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 접촉하는 단계;
    (c) 화합물과 접촉한 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 양과 접촉하지 아니한 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 양을 비교하는 단계; 및
    (d) 그 화합물이 생물학적 활성을 조절한다는 지표로 화합물과 접촉한 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 양과 접촉하지 아니한 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 양의 차를 이용하는 단계를 포함하는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성을 조절하는 화합물의 검색 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 양은 크기 배제 크로마토그래피, 젤 전기영동, 면역분석, 여과, 광 산란 분석, 구배차 원심분리 및 분석 초원심분리에 의하여 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성의 지표로 대상(subject)으로부터 얻은 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 존재를 이용하고, 상기 생물학적 활성은 대상에서 하나 이상의 면역 기능과 관련되고, 에이티피에이즈(ATPase)에이티피에이즈(ATPase) 활성의 변화 또는 다이머 형태의 양의 변화는 질병의 변화를 나타내는 것을 포함하는 면역계의 적당한 기능에 부분적으로 기인하는 대상의 질병을 진단하는 방법.
  13. 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성의 지표로 대상(subject)으로부터 얻은 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 이용하고, 상기 생물학적 활성은 대상에서 암세포 또는 감염성 질환을 일으키는 감염원에 반응하는 하나 이상의 면역 기능과 관련되고, 에이티피에이즈(ATPase) 활성의 변화 또는 다이머 형태의 양의 변화는 예후의 변화를 나타내는 것을 포함하는 대상에서 암 또는 감염성 질환의 예후를 결정하는 방법.
  14. 제5항, 제10항, 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 hsp-펩타이드 복합체 내의 hsp는 gp96인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항, 제2항, 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 방법은 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 결정하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 에이티피에이즈(ATPase) 활성은 이온 교환 크로마토그래피, 바이오루미네센스 분석, 또는 면역친화(immunoaffinity) 분석에 의하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제3항, 제4항, 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 방법은 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 양을 결정하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 양은 크기 배제 크로마토그래피, 젤 전기영동, 면역분석, 여과, 광 산란 분석, 구배차 원심분리 및 분석 초원심분리에 의하여 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 15항에 있어서, 상기 방법은 뉴클레오타이드 - hsp 결합의 저해제의 존재하에서 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 측정하고, 상기 저해제의 존재하에서 저해되는 에이티피에이즈(ATPase) 활성을 생물학적 활성의 지표로 사용하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드-hsp 결합의 저해제는 젤다나마이신(geldanamycin) 또는 NECA인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 방법은 상기 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 질량 기초한 비 활성(specific activity)이 주어진다면, 상기 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 질량을 결정하는 단계를 더욱 포함하는 방법.
  22. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 방법은 대상으로부터 얻은 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 분리하고 정제하는 것을 더욱 포함하는 방법.
  23. 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 생물학적 활성의 지표로 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 형태의 양을 이용하는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 포함하는 조성물 및 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 에이티피에이즈(ATPase) 활성 또는 열 충격 단백질-펩타이드 복합체의 다이머 양을 결정하는 사용설명서(instruction)을 포함하는 키트.
  24. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제10항, 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 생물학적 활성은 면역 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 면역 활성은 항원 재프리젠테이션(representation)이나 T-세포 활성화인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 생물학적 활성은 면역 활성인 것을 특징으로 하는 키트.
  27. 제23항에 있어서, 상기 면역 활성은 항원 재프리젠테이션(representation)이나 T-세포 활성화인 것을 특징으로 하는 키트.
  28. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제10항, 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 생물학적 활성은 항원 분자의 결합 및 방출, MCP-1 생성 및 산화 질소 생성 유도, 및 CD91 및 CD36의 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 23항에 있어서, 상기 생물학적 활성은 항원 분자의 결합 및 방출; MCP-1 생성 유도; 산화 질소 생성 유도; 및 CD91 및 CD36의 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 키트.
  30. 제1항, 제3항, 제5항, 제10항, 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 hsp-펩타이드 복합체의 hsp는 hsp 70 계열, hsp 90 계열 및 hsp 60 계열로 구성된 군으로부터 선택된 hsp 계열의 일원인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제23항에 있어서, 상기 hsp-펩타이드 복합체의 hsp는 hsp 70 계열, hsp 90 계열 및 hsp 60 계열로 구성된 군으로 부터 선택된 hsp 계열의 일원인 것을 특징으로 하는 키트.
  32. 제1항, 제3항, 제5항, 제10항, 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 hsp-펩타이드 복합체의 hsp는 hsp 90, gp 96(grp94), hsp 104, hsp 70 및 hsp 60으로 구성된 군으로 부터 선택된 hsp인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제23항에 있어서, 상기 hsp-펩타이드 복합체의 hsp는 hsp 90, gp 96(grp94), hsp 104, hsp 70 및 hsp 60으로 구성된 군으로 부터 선택된 hsp인 것을 특징으로 하는 키트.
  34. 올리고머화제가 레시틴, 4,4'-디아니리노(dianilino)-1,1'- 바이나프틸 (binaphthyl)-5, 5' 다이설포닉(disulfonic) 산("bis-ANS"), 글루타알데하이드 또는 설포서시니이미딜(sulfosuccinimidyl) [4-아지도살리실아미도 (azidosalicylamido)] 헥사노에이트(hexanoate; SASD)이 아닌 조건에서 올리고머화제와 상기 열 충격 단백질을 접촉하여 올리고머화가 된 올리고머화되고, 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 정제된 복합체.
  35. 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 올리고머화제에 상기 열 충격 단백질을 공유결합하여 올리고머화가된 올리고머화되고, 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 정제된 복합체.
  36. 제34항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 올리고머화제에 비공유적으로 결합된 것을 특징으로 하는 복합체.
  37. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 gp96 또는 hsp 90인 것을 특징으로 하는 복합체.
  38. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 및 항원 분자는 세포 파쇄액으로부터 복합체로 분리된 것을 특징으로 하는 복합체.
  39. 제26항에 있어서, 상기 세포 파쇄액은 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 것을 특징으로 하는 복합체.
  40. 올리고머화제가 레시틴, bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 일 군 중 적어도 하나의 복합체가 일군 중 또 다른 복합체의 항원 분자와 다른 항원 분자를 포함하고, 일 군 중 각 복합체가 올리고머화제와 접촉하여 올리고머화되고, 각 복합체가 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 일 군의 정제된 올리고머화된 복합체.
  41. 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 일 군 중 적어도 하나의 복합체가 일군 중 또 다른 복합체의 항원 분자와 다른 항원 분자를 포함하고, 상기 복합체가 올리고머화제와 공유 결합하여 올리고머화되고, 일 군의 각 복합체가 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 일 군의 정제된 올리고머화된 복합체.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 gp96 또는 hsp 90인 것을 특징으로 하는 일군의 복합체.
  43. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 및 항원 분자는 세포 파쇄액으로부터 복합체로 분리된 것을 특징으로 하는 일군의 복합체.
  44. 제43항에 있어서, 상기 세포 파쇄액은 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 것을 특징으로 하는 일군의 복합체.
  45. 올리고머화제가 레시틴, bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 열 충격 단백질이 올리고머화제와 접촉하여 올리고머화된 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 정제된 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  46. 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 열 충격 단백질이 올리고머화제와 공유 결합하여 올리고머화된 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 정제된 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  47. 열 충격 단백질이 올리고머화제와 공유 결합하여 올리고머화된 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 치료적으로 유효한 양의 정제된 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  48. 제45항, 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 gp96 또는 hsp 90인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  49. 제45항, 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 복합체는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료에 유효한 양이 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  50. 제45항, 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 및 항원 분자는세포 파쇄액의 복합체로 분리된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  51. 제51항에 있어서, 상기 세포 파쇄액은 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  52. 올리고머화제가 레시틴, bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 열 충격 단백질이 올리고머화제와 접촉하여 올리고머화되는 정제된 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 키트.
  53. 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 열 충격 단백질이 올리고머화제와 공유 결합하여 올리고머화되는 정제된 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 키트.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 gp96 또는 hsp 90인 것을 특징으로 하는 키트.
  55. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 항원 분자는 암의 항원 또는 감염성 질환 감염원의 항원을 나타내는 것을 특징으로 하는 키트.
  56. 제55항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 및 항원 분자는 세포 파쇄액으로부터 복합체로 분리된 것을 특징으로 하는 키트.
  57. 제56항에 있어서, 상기 세포 파쇄액은 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 것을 특징으로 하는 키트.
  58. 올리고머화제가 레시틴, bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 복합체의 올리고머화를 야기하기 충분한 양의 올리고머화제와 상기 복합체를 접촉하여 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 복합체의 항원성 및 면역성을 증가시키는 방법.
  59. 열 충격 단백질이 올리고머화제와 공유결합하고, 올리고머화를 야기하기 충분한 양의 올리고머화제와 상기 복합체를 접촉하여 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 물질을 포함하는 복합체의 항원성 및 면역성을 증가시키는 방법.
  60. 제 58항 또는 제 59항에 있어서, 상기 면역활성을 갖는 열 충격 단백질은 항원 분자와 비공유 결합을 통하여 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 58항 또는 제59항에 있어서, 상기 항원 분자는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 58항 또는 제59항에 있어서, 상기 복합체는 세포 파쇄액으로부터 분리된 상기 면역 활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 세포 파쇄액은 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 gp96 또는 hsp 90인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 올리고머화제가 레시틴, bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 항원 분자가 각각 암의 종양-특이적 또는 종양 관련 항원 또는 감염성 질환의 감염원을 나타내고, 열 충격 단백질이 올리고머화제와 접촉하여 올리고머화되는 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자를 포함하는 치료적으로 유효한 양의 정제된 복합체를 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방 방법.
  66. 열 충격 단백질이 올리고머화제와 공유결합에 의하여 올리고머화되고, 항원분자가 각각 암의 종양-특이적 또는 종양 관련 항원 또는 감염성 질환의 감염원을 나타내는 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자를 포함하는 치료적으로 유효한 양의 정제된 복합체를 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 gp96 또는 hsp 90인 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 65항 또는 제66항에 있어서, 상기 복합체는 세포 파쇄액으로부터 분리된 상기 면역 활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 세포 파쇄액은 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원성을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제68항에 있어서, 상기 세포는 대상으로부터 얻은 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 올리고머화제가 레시틴, bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 항원 분자가 각각 암의 종양-특이적 또는 종양 관련 항원 또는 감염성 질환의 감염원을 나타내고, 열 충격 단백질이 올리고머화제와 접촉하여 올리고머화되는 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자를 포함하는 정제된 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 치료적으로 유효한 양의 약학 조성물을 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방 방법.
  72. 열 충격 단백질이 올리고머화제와 공유결합에 의하여 올리고머화되고, 항원 분자가 각각 암의 종양-특이적 또는 종양 관련 항원 또는 감염성 질환의 감염원을 나타내는 올리고머화되고 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자를 포함하는 정제된 복합체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 치료적으로 유효한 양의 약학 조성물을 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방 방법.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 gp96 또는 hsp 90인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제71항 또는 제72항에 있어서, 상기 복합체는 세포 파쇄액으로부터 분리된 상기 면역 활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 세포 파쇄액은 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의항원성을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제74항에 있어서, 상기 세포는 대상으로부터 얻은 것을 특징으로 하는 방법.
  77. (a) 올리고머화제가 레시틴, bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 면역 활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자를 포함하는 복합체를 상기 복합체의 올리고머화를 야기하기 충분한 양의 올리고머화제와 접촉하는 단계; 및
    (b) 약학적으로 수용가능한 담체로 상기 올리고머화된 복합체를 결합하는 단계를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법.
  78. (a) 올리고머화제가 bis-ANS, 글루타알데하이드 또는 SASD가 아닌 조건에서 올리고머화제가 올리고머화제와 공유결합되어 있고, 면역활성을 갖는 열 충격 단백질 및 항원 분자를 포함하는 복합체를 상기 복합체의 올리고머화를 야기하기 충분한 양의 올리고머화제로 접촉하는 단계; 및
    (b)약학적으로 수용가능한 담체로 상기 올리고머화된 복합체를 결합하는 단계를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 및 항원 분자는 세포 파쇄액으로부터 복합체로 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 세포는 암 세포 또는 감염성 질환 감염원의 항원성을 나타내는 물질로 감염된 세포로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제77항 또는 제78항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 gp96 또는 hsp 90인 것을 특징으로 하는 방법.
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