KR20040074108A - Gfp-transfected clon pig, gt knock-out clon pig and methods for production thereof - Google Patents
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Abstract
Description
형질전환동물(transgenic animals)을 생산하는 기술은 지난 20년간 가장 각광받고 있는 기술분야 중 하나이다. 상업적 유용성뿐 아니라, 생체의학과 생물학 연구에 있어서도 그 중요성은 압도적이다. 형질전환동물 생산기술의 산업적 적용분야는 고품질의 축산식품 생산, 고부가가치의 약리활성물질 생산, 각종 병원균에 대한 생체저항력 향상동물 생산, 질환모델동물의 생산 및 유전자치료 분야에 이르기까지 매우 광범위하다.The technology for producing transgenic animals has been one of the hottest technologies in the last 20 years. In addition to their commercial utility, their importance in biomedical and biological research is overwhelming. Industrial applications of transgenic animal production technology range from the production of high-quality livestock foods, the production of high value-added pharmacologically active substances, the production of animals that improve resistance to various pathogens, the production of disease model animals and gene therapy.
형질전환동물 생산을 위한 유전자도입 기술의 기본 단계로 GFP 유전자의 적중은 염색체 단백질 표지 및 특정 염색체 부위의 태깅(tagging)의 용이성, 세포질의 많은 단백질과 결합이 가능하며 그 무해성으로 인하여 살아있는 세포에서 같은 성질의 세포골격사(cognate cytoskeletal filaments)를 발현시키데 많이 이용되고 있다. 1994년 샬피(Chalfie) 등은 해파리(Aequorea victoria)에서 얻은 GFP를 형광성 단백질 인식지표로 적용하여 돼지의 배아를 비롯한 살아있는 세포의 다양한 분자생물학적 변화를 관찰하였다. 이후 더욱 기능이 향상된 EGFP(enhanced GFP)가 개발되어 여러 동물에서 마커 유전자(marker gene)로 이용되고 있다.As a basic step of transgenic technology for the production of transgenic animals, the targeting of the GFP gene is able to bind chromosomal protein labeling, tagging of specific chromosomal sites and many proteins of the cytoplasm, and its harmlessness in living cells It is widely used to express cognate cytoskeletal filaments. In 1994, Halfie et al. Applied GFP obtained from Aequorea victoria as a fluorescent protein recognition marker to observe various molecular biological changes in living cells including pig embryos. Since then, EGFP (enhanced GFP) has been further improved and used as a marker gene in various animals.
이러한 형질전환 동물생산을 위한 외래 유전자도입 방법으로 고든(Gordon) 등이 제시한 전핵내 미세주입법(pronuclear microinjection)이 있는데 이 방법은외래유전자를 수정란의 전핵에 직접주입하는 방법으로 마우스를 비롯한 실험동물에서 많이 이용되고 있지만 산업동물에서는 극히 낮은 생산효율(소 0.5 %, 돼지 1.5 %, 양 2.5 %)과 모자이키즘(Mosaicism)이 대부분의 경우에 나타나는 단점이 있다. 이를 극복하기 위해 외래유전자가 도입된 형질 전환체세포를 이용한 동물복제기술이 대안으로 제시되고 있다. 형질전환동물 복제기술은 유전자가 도입된 세포만을 핵이식함으로써 모자이키즘이 없는 100％ 형질전환 복제수정란을 생산하여 대리모이식을 통해 형질전환복제동물을 효율적으로 생산할 수 있다. 또한 이 과정에서 체세포의 성을 미리 판별하여 인위적으로 태어나는 복제동물의 성을 조절할 수 있어 산업적 유용성이 극대화 될 수 있다.As a foreign gene introduction method for the production of such transgenic animals, there is a pronuclear microinjection method proposed by Gordon et al. This method is a method of directly injecting a foreign gene into the pronucleus of fertilized eggs. Although it is widely used in industrial animals, extremely low production efficiency (0.5% cow, 1.5% pig, 2.5% sheep) and mosaicism are found in most cases. In order to overcome this problem, an animal cloning technology using transformant cells into which foreign genes have been introduced has been proposed as an alternative. Transgenic animal cloning technology can produce 100% transgenic cloned eggs without maternalism by nuclear transplantation of only cells into which genes are introduced, thereby efficiently producing transgenic cloned animals through surrogate mother transplantation. In addition, in this process, the sex of the somatic cell can be determined in advance to control the sex of artificially born cloned animals, thereby maximizing industrial usefulness.
체세포 복제 기법에 의한 형질전환돼지의 생산을 위해서는 먼저 원하는 유전자의 분리 및 유전자도입 벡터의 제작과 유전자를 체세포에 도입하는 분자생물학적 기술과 체세포 복제기술을 융합해야 한다. 유전자 분리를 위해 돼지 게노믹 DNA 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 많이 이용되고 있다. 유전자도입 벡터는 외인성 프로모터의 유무, 유전자의 크기 및 양성/음성 선택표지인자 유무 등을 고려하여 목적에 따라 다른 형태의 벡터가 제작되고 있다. 유전자 도입기술은 원하는 유전자를 핵공여세포내로 트랜스펙션(transfection)하는 것으로 생화학적 방법(biochemical method), 물리적 방법(physical method), 바이러스 매개 트랜스펙션 방법(virus mediated transfection method)등이 있다. 생화학적 방법으로는 칼슘을 매개체로 하는 칼슘침전법, 세포막 성분인 양이온 리피드를 매개체로하는 리포펙션(lipofection) 또는 리피드는 아니지만 양전하를 지니는 폴리머을 매개체로 하는 방법등이 있는데, 이는 실험의 용이성과 효율성 및 안정성 측면에서 많이 이용되고 있다. 물리적 방법으로 일렉트로포레이션(electroporation), 유전자 총(gene gun), 세포내 직접 미세주입법등이 있다. 바이러스-매개 방법으로서는 아데노바이러스(adenovirus)나 레트로바이러스(retrovirus)의 바이러스 게놈(virus genome)에 원하는 DNA를 클론닝하여 세포에 감염시키는 방법이다. 체세포복제기술은 본 출원인에 의해 2000년 6월 30일에 출원된 국제특허출원 PCT/KR00/00707의 "체세포 복제동물 및 그 생산방법이 이용되는데 즉, 먼저 탈핵(enucleation)과정에 의해 유전물질(genetic material)을 포함한 핵이 제거된 미수정란에 다른 세포의 핵(nucleus)을 주입함으로써 이루어진다. 이렇게 생산된 수정란을 "복제수정란(reconstructed embryo)"이라 하는데, 이 복제수정란을 후활성화시키고 체외배양을 거쳐 발육된 핵이식 수정란을 대리모에 이식하여 산자를 생산한다.For the production of transformed pigs by somatic cloning techniques, it is necessary to first fuse the somatic cell cloning technology with the molecular biological technology of isolating the desired gene, making a transgenic vector, and introducing the gene into somatic cells. Screening for swine genomic DNA libraries for gene isolation is widely used. The transgenic vectors are produced in different forms according to the purpose in consideration of the presence of the exogenous promoter, the size of the gene and the presence of a positive / negative selection marker. Gene transfection technology transfects desired genes into nuclear donor cells, including biochemical methods, physical methods, and virus mediated transfection methods. Biochemical methods include calcium precipitation mediated by calcium, lipofection mediated by cationic lipids as cell membrane components, or mediated polymers with positive but not positive lipids. And in terms of stability. Physical methods include electroporation, gene guns, and intracellular direct microinjection. As a virus-mediated method, a desired DNA is cloned into the viral genome of an adenovirus or a retrovirus to infect cells. The somatic cloning technology is used in the international patent application PCT / KR00 / 00707, filed on June 30, 2000, by the present applicant, and the method of producing a somatic cell cloned animal and its production method, that is, genetic material (enucleation) process first. This is done by injecting the nucleus of another cell into the embryo that has had its genetic material removed, called the "reconstructed embryo," which is then post-activated and in vitro cultured. Nucleus embryos developed after transplantation are transplanted into surrogate mothers to produce litters.
인간의 장기이식술은 인간 장기에 관련된 불치, 난치 질환을 치료하는 유용한 수단이며 과거 10여년간 장기이식 수술예는 점차 증가하였다. 그럼에도 불구하고 같은 기간의 미국 내 수술 대기자 수는 3배가 증가하였다. 이와 같은 현상은 수요의 공급의 불균형에 의한 것으로 인간의 장기 부족 현상을 초래하였다. 이와 같이 장기 이식수술에서 장기공급원이 절대적으로 부족하지만 이를 해결할 만족스런 방법은 아직도 없는 형편이다. 이와 같은 장기부족 문제를 해결하는 방안으로 의공학적 접근법에 의한 인공장기의 개발과 형질전환동물의 생산 등이 있다. 이 중에서 형질전환동물에서 공급받기 위해서는 일반적으로 돼지가 장기공여동물로 선택된다. 그 이유는 인간의 그것과 생리학적 유사성과 장기나 혈관계의 크기, 심지어 적혈구의 지름크기 및 모세혈관의 크기가 인간의 그것과 유사하며 윤리적으로 영장류를 이용하는 것보다 용이하기 때문이다.Human organ transplantation is a useful means of treating incurable and intractable diseases related to human organs. Nevertheless, the number of waiters in the United States has tripled in the same period. Such a phenomenon is caused by an unbalanced supply of demand, resulting in a shortage of human organs. As such, there is an absolute shortage of organ supply in organ transplantation, but there is still no satisfactory solution to this problem. In order to solve such a problem of organ shortage, the development of artificial organs and the production of transgenic animals by a medical approach. Pigs are generally selected as organ donors in order to be supplied from transgenic animals. This is because the physiological similarity to that of humans, the size of organs or vascular systems, even the diameter of red blood cells and the size of capillaries, is similar to that of humans and ethically easier than using primates.
하지만, 돼지의 장기를 인체에 이식하면 초급성거부반응이 일어나 이식받은 환자에 심각한 부작용이 발생되어 실패하게 되는데 이는 돼지의 세포나 조직의 주된 이종항원이 인간의 혈장 내에 존재하는 갈(Gal) 에피톱(epitope) 이라는 이종항체에 감작되기 때문이다. 이러한 면역거부반응을 극복하기 위해서 여러가지 방안이 제시되어 왔는데, 인체 내의 보체활성을 억제시키기 위한 유전자 조작기술 또는 인체의 면역기작의 활성을 떨어뜨리기 위한 지속적인 약물복용의 방법 등이 있으나 그 효과는 그리 뛰어나지 못하였다. 즉, 인체의 면역능력을 떨어뜨려 미생물이나 바이러스 등의 침입에 의해 쉽게 감염되는 문제가 발생하게 된다. 하지만 본원 발명은 면역거부반응의 근원적인 해결책으로 문제가 되는 이종항원 GT 유전자적중기술로 사전에 제거하여 인간의 면역 능력을 떨어뜨리지 않으면서 면역거부 반응이 없이 장기를 이식받을 수 있다.However, transplanting organs of pigs into the human body causes acute rejection reactions and causes serious side effects in the transplanted patients, causing them to fail. Gal epi, which is the major heterologous antigen of pig cells or tissues, is present in human plasma. This is because it is sensitized by a heterologous antibody called epitope. In order to overcome this immune rejection reaction, various methods have been proposed, such as genetic manipulation techniques to suppress the complement activity in the human body or continuous drug use to reduce the immune mechanism activity in the human body, but the effect is not so excellent. I couldn't. In other words, the body's immune capacity is reduced, causing a problem of being easily infected by invading microorganisms or viruses. However, the present invention can be transplanted without an immune rejection reaction without removing the anti-rejection of the human body in advance by removing the heterologous antigen GT gene targeting technology as a fundamental solution of the immune rejection reaction.
본 발명은 돼지에 있어서, 원하는 유전자의 체세포 내 도입(transfection) 및 적중(targeting) 기술과 유전자가 도입된 체세포의 핵이식 기술을 이용하여 특정 유전형질을 지닌 복제돼지를 생산하는 방법 및 이러한 방법에 의해 생산된 돼지에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a cloned pig having a specific genotype using a technique for transfection and targeting of a gene of interest and a nuclear transfer technique for somatic cells into which a gene is introduced. It is about a pig produced by.
보다 구체적으로, 본 발명은 특정 유전자 즉, 특정 범위 파장의 빛에서 초록색을 발현하는 유전자, 구체적으로는 GFP(Green Fluorescent Protein)유전자가 도입된 복제돼지 및 이것의 생산방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 면역거부반응관련 유전자, 구체적으로 GT(α1,3galactrosyltransferase) 유전자가 제거된 복제돼지 및 이것의 생산방법에 관한 것이다.More specifically, the present invention relates to a specific gene, that is, a gene expressing green in a specific range of light, specifically, a cloned pig in which a GFP (Green Fluorescent Protein) gene is introduced and a method of producing the same. In addition, the present invention relates to a cloned pig from which an immune rejection-related gene, in particular, the GT (α1,3galactrosyltransferase) gene, has been removed and a method of producing the same.
또한, 본 발명은 GFP유전자 또는 조작된 GT유전자를 세포에 효율적으로 도입하여 적중시키는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method of efficiently introducing and targeting a GFP gene or an engineered GT gene into a cell.
또한, 본 발명은 GT 유전자를 이용하여 효율적으로 제거할 수 있는 벡터에 관한 것이다.The present invention also relates to a vector that can be efficiently removed using the GT gene.
특히, 본 발명은 외래성 유전자, 즉 GFP유전자의 성공적 도입에 의해 질환모델 동물의 대량 생산가능성을 시사하며, GT유전자가 제거된 돼지의 생산이 가능하게 됨으로서 돼지의 장기를 초급성 면역거부반응(hyperacute xenograft rejection)없이 이식 가능하게 한다.In particular, the present invention suggests the possibility of mass production of a disease model animal by the successful introduction of a foreign gene, ie, a GFP gene, and enables the production of pigs from which the GT gene has been removed. Enables transplantation without xenograft rejection
도 1은 배양중인 GFP 발현 체세포의 사진이다.1 is a photograph of GFP expressing somatic cells in culture.
도 2는 GFP 발현 체세포를 수핵난자에 이식한 핵이식란의 사진이다.Figure 2 is a photograph of a nuclear transfer egg transplanted with GFP expressing somatic cells into a nucleus ova.
도 3은 GFP가 발현되는 돼지 배반포핵이식란의 사진이다.Figure 3 is a photograph of porcine blastocyst nucleus transplanted with GFP.
도 4는 형질전환된 핵이식란을 대리모의 난관 내에 이식하는 사진이다.Figure 4 is a photograph of the transplanted transformed nuclear transfer egg into the fallopian tube of the surrogate mother.
도 5는 1차 풀 돼지 BAC 게노믹 라이브러리의 1차 스크리닝 결과사진이다.5 is a photograph of the primary screening results of the primary pooled pig BAC genomic library.
도 6은 2차 풀 돼지 BAC 게노믹 라이브러리의 2차 스크리닝 결과사진이다.Figure 6 is a secondary screening results photograph of the secondary pool pig BAC genomic library.
도 7은 3차 풀 돼지 BAC 게노믹 라이브러리의 3차 스크리닝 결과사진이다.7 is a photograph of the third screening results of the tertiary pool pig BAC genomic library.
도 8은 클론된 GT 유전자의 제한효소 맵핑 사진이다.8 is a restriction map of cloned GT gene.
도 9는 GT 유전자적중벡터의 모식도이다.9 is a schematic diagram of the GT gene vector.
본 발명은 상기에서와 같은 선행기술들을 토대로 하여 유전자적중 및 도입기술과 체세포복제기술을 이용하여, GFP 유전자를 발현하는 복제돼지 및 GT유전자가 제거된 복제돼지를 생산하는 방법 및 이러한 방법에 의해 생산된 돼지를 제공한다. 이하, 구체적으로 본 발명을 설명한다.The present invention is a method for producing a cloned pig expressing the GFP gene and a cloned pig from which the GT gene is removed using the gene targeting and introduction technique and the somatic cloning technique based on the prior art as described above, and produced by such a method. To serve pigs. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 체세포 단계에서, 특정 유전자의 도입 및 적중기술과 체세포 핵이식 기술을 병합하여, 원하는 유전자가 발현 또는 제거되는 형질전환 복제돼지를 제공하는 것을 특징으로 한다.The present invention is characterized in that, in the somatic phase, by combining the introduction and targeting of specific genes and somatic cell nuclear transfer technology, to provide a transgenic cloned pig that the desired gene is expressed or removed.
좀 더 구체적으로, 본 발명은 유전자 도입기술을 이용하여 GFP가 도입된 또는 GT유전자가 제거된 체세포를 핵이식 기술을 이용하여 GFP 발현 또는 GT 유전자가 제거된 형질전환 복제돼지를 제공한다.More specifically, the present invention provides a transgenic cloned pig in which GFP expression or GT gene is removed using a gene transduction technology or GFP expression or GT gene is removed using nuclear transfer technology.
먼저, GFP 발현 복제 돼지를 생산하는 방법은 (a) 돼지에서 채취하여 배양한 세포주를 핵공여세포로 준비하는 단계; (b) GFP 유전자를 포함하는 DNA 구조체와 리피드 성분 또는 비리피드 양전하 폴리머 매개체를 혼합하여 리피드(또는 양전하 폴리머)-DNA 구조 복합체를 형성시킨 후, 상기 리피드 (또는 양전하 폴리머)-DNA 구조 복합체를 상기 핵공여 세포배양액에 첨가 후 배양하여 상기 GFP 유전자를 상기 핵공여 세포에 도입하여 발현시키는 단계; (c) 상기의 GFP 유전자가 도입된 핵공여 세포를 탈핵된 돼지 수핵단에 이식하여 형질전환된 핵이식란을 생산하고, 활성화시키는 단계; 및 (d) 상기 핵이식란을 대리모에 이식하여 산자를 생산하는 단계를 포함한다.First, a method for producing a GFP-expressing cloned pig includes (a) preparing a cell line collected and cultured from pigs as nuclear donor cells; (b) mixing the DNA construct comprising the GFP gene with a lipid component or a non-positive positively charged polymer mediator to form a lipid (or positively charged polymer) -DNA structure complex, and then the lipid (or positively charged polymer) -DNA structure complex Adding to the nuclear donor cell culture solution and culturing to introduce and express the GFP gene into the nuclear donor cell; (c) transplanting the nuclear donor cells into which the GFP gene is introduced into a denuclearized swine nucleus pulposus to produce and activate a transformed nuclear transfer embryo; And (d) transplanting the nuclear transfer embryos into surrogate mothers to produce litters.
이하에서는, 상기의 GFP 유전자가 발현되는 복제돼지의 생산방법을 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the production method of the cloned pigs in which the GFP gene is expressed will be described in more detail by dividing step by step.
제1단계: 핵공여세포의 준비, 체외배양 및 유지Stage 1: Preparation, in vitro culture and maintenance of nuclear donor cells
체세포 핵이식 기술에 의한 GFP 유전자를 발현하는 형질전환동물의 생산에는 핵공여세포가 필요하다. 핵이식시 이용되는 공여세포에는 체세포 유래 및 수정란 유래 세포 등 여러 종류가 있지만, 돼지의 태아에서 분리한 섬유아세포를 이용한다. 이 세포의 특징은 초기 분리시 다수의 세포를 얻을 수 있고, 세포 배양도 비교적 쉬우며 체외에서 배양 및 조작이 용이하다는 장점을 지니고 있다.Nuclear donor cells are required for the production of transgenic animals expressing the GFP gene by somatic cell nuclear transfer technology. There are various types of donor cells used for nuclear transfer, such as somatic cells and fertilized egg-derived cells, but fibroblasts isolated from pig embryos are used. The characteristics of these cells have the advantage that a large number of cells can be obtained at initial separation, the cell culture is relatively easy, and the culture and manipulation are easy in vitro.
핵공여세포로 주로 이용되는 태아 섬유아세포를 분리하기 위하여, 임신돼지에서 채취한 돼지 태아의 체장(crown-rump)길이를 측정하며 번식기록부와 대조하여 임신 일령을 산정한다. 돼지 태아를 태막으로부터 분리하고 탯줄도 태아에 근접한 부위에서 제거한다. 이 후 분리된 태아를 항생제와 소혈청알부민(BSA; bovine serum albumin)이 함유된 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)에서 수 회 세척한다. 수술용 기구로 태아의 사지와 두부 및 내부 장기를 제거하고 다시 PBS로 세척한다. 조직으로부터의 세포분리는 남은 조직을 기계적으로 잘게 분쇄한 후 바로 조직편(explant)배양에 의해 세포를 분리하거나, 효소(trypsin-EDTA)를 이용하여 유리된 세포를 얻는 방법으로 태아 섬유아세포(fetal fibroblast)를 분리한다. 핵공여세포의 배양은 38℃ 및 95%의 습도인 항온 및 항습과 5% CO2와 95% 공기의 조건으로 조성된 배양기에서 실시한다. 배양 후 핵공여세포가 배양 용기에 90-100% 증식(confluent)하면 계대 배양을 실시하고, 잉여분은 동결하여 보존한다.In order to isolate fetal fibroblasts, which are mainly used as nuclear donor cells, the crown-rump length of a pig fetus collected from a pregnant pig is measured, and the gestational age is compared with a breeding record. The pig fetus is separated from the fetal membrane and the umbilical cord is removed in the vicinity of the fetus. The separated fetuses are then washed several times in phosphate buffered saline (PBS) containing antibiotics and bovine serum albumin (BSA). The surgical instrument removes the limbs, head and internal organs of the fetus and washes again with PBS. Cell separation from tissues is performed by mechanically crushing the remaining tissues and then immediately separating the cells by explant culture, or by using a enzyme (trypsin-EDTA) to obtain free cells. ). Cultivation of nuclear donor cells is carried out in an incubator at 38 ° C. and 95% humidity with constant temperature and humidity, and 5% CO 2 and 95% air. Subsequent cultures are performed when nuclear donor cells proliferate 90-100% in the culture vessel after culture, and the excess is frozen and preserved.
제2단계: GFP 유전자의 체세포 도입 및 적중Step 2: Introduce and Hit Somatic Cells of GFP Gene
GFP 유전자의 도입 및 적중에 있어서 사용된 벡터는 상업적으로 시판되고 있는 pEGFP-N1(Clontech Labratories Inc., Palo Alto CA)을 이용하였다. pEGFP-N1은 포유동물의 세포에서 밝은 형광과 높은 발현을 위한 와일드-타입 GFP(wild-type GFP)의 변형 GFP이다. 생화학적 도입매개체로 퓨진6 (FuGENE 6, Roche DiagnosticsCorp. IN, USA), 리포펙타민 플러스(LipofectAmine Plus, Life Technologies) 및 엑스진 500(ExGen 500, MBI Fermentas)을 이용하였다. 퓨진6는 다성분 지방계 시약(multi-component lipid based reagent)으로서 다양한 세포타입에서 높은 도입 효율을 가지고 세포독성이 없으며 혈청 첨가여부에 관계없이 기능을 발휘하고 최소한의 최적화 작업이 쉬운 장점을 지닌다. 리포펙타민 플러스는 양전하 지방(cationic lipid)이며 엑스진 500은 비지방 양전하 중합체(non lipid cationic polymer)로 여러가지 세포타입에서 높은 효율이 보고되었다.The vector used for introduction and targeting of the GFP gene was pEGFP-N1 (Clontech Labratories Inc., Palo Alto CA) which is commercially available. pEGFP-N1 is a modified GFP of wild-type GFP for bright fluorescence and high expression in mammalian cells. As biochemical media, FuGENE 6 (Roche Diagnostics Corp. IN, USA), Lipofectamine Plus (Life Technologies), and Xgene 500 (ExGen 500, MBI Fermentas) were used. Fugen6 is a multi-component lipid based reagent, which has high transduction efficiency in various cell types, no cytotoxicity, functions regardless of serum addition, and has the advantage of minimal optimization. Lipofectamine plus is a cationic lipid and Xgene 500 is a non lipid cationic polymer that has been reported to have high efficiency in various cell types.
유전자 도입에 이용될 세포는 최적조건에서 성장시킨 후 효소처리 (trypsin-EDTA)를 통해 단세포로 만들어 계대배양하면 최소한 실험 하루 전에 신선한 배양액으로 교체하고, 실시 4시간 전에 다시 신선한 배양액을 공급한다. 생화학적 매개체에 따라 최적의 세포밀도가 될때까지 세포를 배양하여 유전자를 도입시킨다.The cells to be used for gene introduction are grown at optimal conditions and then made into single cells through enzymatic treatment (trypsin-EDTA), subcultured at least one day before the experiment, and fresh culture is again supplied 4 hours before the experiment. Genes are introduced by culturing the cells until the optimal cell density is achieved, depending on the biochemical mediator.
본 발명에서는 GFP 유전자의 도입 및 적중을 위하여 리피트 및 비리피드 계통의 생화학적 매개체를 이용하였다. GFP 유전자를 리피드 및 비리피드 매개체와 혼합하여 복합체(complex)를 형성하고 이 복합체를 핵공여세포내로 도입시켰다. 유전자의 세포내 도입을 효과적으로 하기 위해 매개체에 따라 GFP 유전자의 양, 매개체의 부피, 세포밀도, 도입시간, 혈청사용 여부등 여러가지 변수를 선정하고 각 변수(parameter)들을 최적화하여 GFP 유전자의 도입 및 발현을 극대화하였다.In the present invention, the biochemical mediators of the repeat and non- lipid lines were used for the introduction and targeting of the GFP gene. The GFP gene was mixed with lipid and non-lipid mediators to form a complex and introduced into the nuclear donor cell. In order to effectively introduce the gene into the cell, various variables such as the amount of GFP gene, the volume of the medium, the cell density, the introduction time, and the use of serum are selected according to the medium, and the parameters are optimized to introduce and express the GFP gene. Maximized.
제3단계: GFP 유전자가 도입된 핵공여세포의 선별, 증식 및 동결보존Step 3: Selecting, Proliferating and Cryopreserving Nuclear Donor Cells Introduced with GFP Gene
GFP 유전자의 세포내 도입 후 세포가 완전증식(confluency)이 될 때까지 새로운 배지에서 3-5일간 배양하여 GFP 유전자의 염색체내 도입을 유도한 후 효소처리에 의해 단세포로 만든다. 이러한 단세포들을 현미경 상에서 자외선 필터를 이용하여 관찰하여 초록색을 띄우는 세포만을 선별하여 핵이식에 이용한다. 또한 GFP유전자가 도입된 핵공여세포를 항생제를 이용하여 선별한다. GFP 유전자 벡터에 이용된 양성 마커(positive marker)인 네오마이신(neomycin) 저항유전자는 GFP 유전자와 함께 세포내로 도입되어 발현되면 네오마이신 저항성단백질을 생산한다. 따라서 적중된 세포를 항생제가 포함된 세포배양액에 배양하면 GFP 유전자 벡터가 도입된 세포는 생존하게 되고, 그 외의 세포들은 항생제의 독성에 의해 사멸되어 일정 시간 후 배양 용기에는 유전자가 적중된 세포만 증식한다(도1). 이와 같은 항생제에 의한 선별은 항생제의 적정 선별 농도를 정함으로서 효과적으로 이루어지도록 한다. 네오마이신(neomycin)을 200ug/ml ∼ 800ug/ml 의 농도로 4-5일간 첨가하여 세포를 2-3주간 배양하여 적중된 세포들을 선별할 수 있다. 핵공여세포의 종류에 따라 차이가 있으나, 적중된 세포는 하나의 세포로부터 증식을 시작하게 되므로 다음 단계의 확인을 위해서는 일정 수 이상으로 증식시켜야 한다. 항생제를 통한 선별 과정이 이루어지면 정상 배양으로 전환하고, 세포의 신속한 증식과 배양시 세포 사멸에 의한 불필요한 손실을 감소시키기 위해 적절한 성장인자와 세포사멸 억제제 등을 첨가하는 방법을 적용한다. 증식 배양한 세포의 효율적 보존을 위해 최적 조건을 확립하여 각 단계마다 동결을 실시한다.After intracellular introduction of the GFP gene, the cells are cultured for 3-5 days in fresh medium until the cells become confluent and induces the introduction of the GFP gene into chromosomes, followed by enzymatic treatment to form single cells. These single cells are observed using a UV filter on a microscope to select only those cells that display green color and use them for nuclear transfer. In addition, nuclear donor cells into which the GFP gene has been introduced are selected using antibiotics. The neomycin resistance gene, a positive marker used in the GFP gene vector, is introduced into the cell together with the GFP gene and expressed to produce neomycin resistance protein. Therefore, when the targeted cells are cultured in the cell culture medium containing antibiotics, the cells into which the GFP gene vector is introduced survive, and the other cells are killed by the toxicity of the antibiotics. (Fig. 1). The selection by antibiotics is effected effectively by setting the appropriate selection concentration of the antibiotic. Neomycin (neomycin) can be added to the concentration of 200ug / ml ~ 800ug / ml for 4-5 days to cultivate the cells for 2-3 weeks to select the cells hit. There are differences depending on the type of nuclear donor cells, but since the targeted cells start proliferating from one cell, they must be proliferated more than a certain number to confirm the next step. When antibiotics are screened, they switch to normal culture and apply appropriate growth factors and apoptosis inhibitors to reduce the unnecessary loss of cells by rapid proliferation and cell death. Optimal conditions are established for efficient preservation of proliferated cultured cells and freezing is performed at each step.
제4단계: 체세포의 핵이식을 통한 복제수정란의 생산Fourth step: Production of cloned fertilized eggs through somatic cell nuclear transfer
본 발명은 상기 전 단계에서 형질전환된 핵공여세포의 형질을 그대로 지닌 동물을 생산하기 위해 체세포 핵이식을 통한 복제기술을 접목한다. 즉, 복제수정란을 생산한다. 먼저, 수핵 난자를 선별해야 하는데, 미성숙 난자를 체외에서 성숙시켜 이용한다. 주로 도축장에서 돼지의 난소를 채취하고 검란하여 3회의 세정을 거쳐, 소혈청알부민이 없는 성숙용 NCSU23(North Carolina State University 23; NCSU23-M, 참조: 표1)에 10％ 돼지 난포액(porcine follicular fluid; PFF), 성선자극호르몬(gonadotropic hormone; GTH, pregnant mare serum gonadotropin; PMSG, Intervet Folligon, hCG-Intervet, Chorulon), 10ng/㎖의 표피성장인자(epidermal growth factor; EGF)를 첨가한 체외성숙 배지에서 배양한다.The present invention incorporates a replication technology through somatic cell nuclear transfer to produce an animal with the traits of the nuclear donor cells transformed in the previous step. In other words, it produces cloned fertilized eggs. First, the nucleus of the nucleus pulposus should be selected, and the immature eggs are matured in vitro. Porcine ovaries were collected from pig slaughterhouses, swollen and washed three times, and 10% porcine follicular fluid in mature NCSU23 (North Carolina State University 23; NCSU23-M, see Table 1) without bovine serum albumin. PFF), gonadotropic hormone (GTH), pregnant mare serum gonadotropin (PMSG, Intervet Folligon, hCG-Intervet, Chorulon), in vitro maturation medium with 10 ng / ml epidermal growth factor (EGF) Incubate in.
이렇게 배양된 수핵난자 및 핵공여세포를 준비하고, 절개용, 탈핵 및 주입용의 피펫을 준비한다. 배양액의 준비과정에서, 모든 작업은 세정용 NSCU23(NCSU23-W, 참조: 표2)을 기초 배양액으로 이용한다. 수핵난자를 0.1% 히알루로니다아제 (hyaluronidase)가 첨가된 NCSU23-W 내에 난자를 분주하여 난구세포를 벗겨낸다. 완전히 벗겨진 난자는 NCSU23-W 미소적 내에서 세정한다.The nucleated oocytes and nuclear donor cells thus cultured are prepared, and a pipette for dissection, denuclearization and injection is prepared. In the preparation of the cultures, all operations use washing NSCU23 (NCSU23-W, see Table 2) as the basal culture. Nucleated oocytes are dispensed with egg cells in NCSU23-W to which 0.1% hyaluronidase is added to remove the oocytes. Completely stripped eggs are washed within the NCSU23-W microspheres.
세정이 끝난 난자를 고정용 피펫으로 고정하고, 예리한 피펫으로 제1극체 상부의 투명대에 절개창을 만든다. 고정용 피펫으로 수핵난자를 고정시키고 투명대 절개창 제조에 이용된 피펫으로 절개창과 제1극체가 잘 보이는 위치에서 스퀴징(squeezing) 방법으로 극체와 세포질 일부를 제거하여 탈핵시킨다. 탈핵 후 난자는 NCSU23-W로 세정하고 핵이식 전까지 NCSU23-M 미소적에 정치시켜 둔다. 핵공여세포를 준비하고, 이를 탈핵된 수핵난자의 주란강에 주입한다. 이때 절개창을 양 피펫과 일직선상에 놓고 주입용 피펫으로 핵공여세포를 흡입하여 절개창을 통해 핵공여세포를 주란강에 주입함으로서 핵이식란을 작성한다(도2).The washed egg is fixed with a fixing pipette, and an incision is made in the transparent zone above the first polar body with a sharp pipette. The nucleus is fixed with a fixative pipette and denuclearized by removing the polar body and a part of the cytoplasm by squeezing from the position where the incision and the first polar body are visible with the pipette used for the preparation of the transparent incision. After denuclearization, the eggs are washed with NCSU23-W and allowed to stand in NCSU23-M microscopically until nuclear transfer. Nuclear donor cells are prepared and injected into the oocytes of denucleated nucleated oocytes. At this time, the incision is placed in line with both pipettes and the nuclear donor cells are inhaled by the injection pipette and the nuclear donor cells are injected into the oviduct through the incision to prepare a nuclear transplanted egg (FIG. 2).
이렇게 하여 형성된 핵이식란은 비.티.엑스 세포조작기(BTX Electro cell manipulator, ECM 2001, BTX, USA)에 1.8kV/cm의 직류전압에서 30㎲의 통전시간으로 단일통전으로 전기적 세포융합을 시도한다. 융합이 확인된 수정란은 NCSU23-W로 옮겨 세정한다. 그 후 배양용 NCSU23(NCSU23-D, 참조: 표3)로 옮겨 배양한다. 배양 4일째에 NCSU23-D에다 혈청을 10%가 되게 첨가하여 재배양한 후 7일째에 배반포로의 발생 및 GFP 발현 여부를 확인한다(도3).The nuclear transfer cell thus formed attempts electrical cell fusion with a single energization at a current of 30 kV at a DC voltage of 1.8 kV / cm to a BTX Electro cell manipulator (ECM 2001, BTX, USA). . Fertilized eggs with fusion confirmed are transferred to NCSU23-W for cleaning. Thereafter, transfer to culture NCSU23 (NCSU23-D, see Table 3) and incubate. After 4 days of culture, the serum was added to NCSU23-D so that 10% of the serum was cultured to confirm the development of blastocyst and expression of GFP on day 7 (FIG. 3).
제5단계: 복제수정란의 대리모 이식 및 산자생산Step 5: transplantation of surrogate mothers and production of cloned eggs
복제수정란을 이식하여 정상적으로 태아로 발생시킬 수 있는 대리모를 선발한다. 경산돼지 중 발정기를 파악하여 이식적기를 선정한다. 일반적으로, 적당한 수정시기는 발정 징후를 보이기 시작하고부터 대략 30∼40시간 후이므로 복제 수정란의 대리모 이식은 이로부터 계산하여 복제 수정란의 체외발육 단계에 맞추어 정한다.A cloned fertilized egg is implanted to select a surrogate mother that can normally develop into the fetus. Identify the mating season among the breeding pigs and select the transplantation time. In general, the appropriate fertilization time is approximately 30-40 hours after the onset of estrous signs, so surrogate mother transplantation of cloned fertilized eggs is calculated from this and determined according to the in vitro development stage of cloned fertilized eggs.
복제수정란의 대리모 이식은 개복수술에 의하여 난소쪽의 수란관 2cm내에 주입한다(도4). 핵이식란의 이식 후 4주째에 초음파 검사를 실시하여 임신여부를 확인한다. 이 후에도 2주일 간격으로 초음파검사를 통하여 임신지속여부 및 태아의 발육상태 등을 확인한다.Surrogate mother transplantation of cloned fertilized eggs is implanted into 2cm of the oviduct in the ovary by laparotomy (Figure 4). Four weeks after the transplantation of the nuclear transfer embryos, ultrasound is performed to confirm pregnancy. After this, the ultrasound status is checked at 2 weeks intervals to determine whether the pregnancy continues and the development of the fetus.
태아의 출산은 분만간격이 30분 이상이 지났는데도 새끼돼지가 태어나지 않으면 분만을 도와야 하며, 분만 예정일이 지난 모돈은 호르몬 제제 주사 또는 제왕절개와 같은 수술방법을 통하여 산자를 생산하게 된다.If the birth of the fetus is more than 30 minutes after the birth interval, if the piglet is not born to help delivery, sows past the scheduled delivery date will produce live birth through surgical methods such as hormonal injection or cesarean section.
상기의 방법으로, 돼지 태아섬유아세포를 핵공여세포로 하여 GFP 유전자가 도입된 체세포를 핵이 제거된 수핵난자에 핵이식하고 이를 7일간 체외배양하여 정상적으로 배반포 단계로 발육되었고 GFP도 발현된 복제수정란을 에스엔유-피1(돼지 엔티 배아, SNU-P1[Porcine NT Embryo])으로 명명하여, 이를 2001년 12월 27일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원(KRIBB) 유전자 은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 'KTCT 10145 BP'로 기탁하였고, 상기 기탁된 핵이식란 SNU-P1를 대리모에 이식하여 정상 산자를 생산한다.By the above method, the somatic cells in which the GFP gene was introduced were nuclear transplanted into the nucleus-derived nucleated oocytes using porcine fetal fibroblasts as the nuclear donor cells, and then cultured in vitro for 7 days to develop the blastocyst stage and express the GFP embryo. Is named SNU U-P1 (SNU-P1 [Porcine NT Embryo]), and as of December 27, 2001, the Korea Deposit Research Institute (KRIBB) Gene Bank (KCTC, Yuseong-gu, Daejeon Metropolitan City, Korea) Eoeundong 52) was deposited with the accession number 'KTCT 10145 BP', the nuclear transfer embryo SNU-P1 deposited in the surrogate mother to produce a normal living.
한편, GT 유전자가 제거된 복제돼지를 생산하는 방법은, (a) 돼지에서 채취하여 배양한 세포주를 핵공여 세포로 준비하는 단계, (b) 돼지 게노믹 BAC 라이브러리로부터 GT 유전자 클론을 분리한 후, 상기 GT 유전자 클론을 이용하여, GT 유전자의 단백질발현부위 일부분에서 상동재조합을 통하여 GT 단백질 발현부위를 표지 유전자로 대치하여 정상적인 GT 단백질이 발현되지 않도록 하는 유전자 적중용 벡터를 작제하는 단계; (c) 상기의 유전자 적중 벡터를 리피드 또는 비리피드 성분과 혼합하여 복합체를 형성시킨 후, 상기 복합체를 상기 핵공여 세포배양액에 첨가하여 상기 재조합 GT 유전자를 핵공여 세포내에 도입하여 적중시키는 단계; (d) 상기 재조합 GT 유전자가 도입된 핵공여 세포를 탈핵된 돼지 수핵난에 이식하여 형질전환된 핵이식란을 생산하고, 활성화시키는 단계; 및 (e) 상기 핵이식란을 대리모에 이식하여 산자를 생산하는 단계를 포함한다.Meanwhile, a method of producing a cloned pig in which the GT gene has been removed includes (a) preparing a cell line obtained from pigs and cultured as a donor cell, and (b) separating the GT gene clone from the pig genomic BAC library. Using the GT gene clone, constructing a gene targeting vector by replacing the GT protein expression site with a label gene through homologous recombination in a portion of the protein expression site of the GT gene such that a normal GT protein is not expressed; (c) mixing the gene targeting vector with a lipid or non-lipid component to form a complex, and then adding the complex to the nuclear donor cell culture solution to introduce the recombinant GT gene into a nuclear donor cell and to target it; (d) transplanting the nuclear donor cells into which the recombinant GT gene has been introduced into denuclearized porcine nucleolar eggs to produce and activate a transformed nuclear transfer embryo; And (e) transplanting the nuclear transfer embryos into surrogate mothers to produce litters.
이하에서는, GT 유전자가 제거된 복제돼지의 생산방법을 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the production method of cloned pigs from which the GT gene is removed will be described in more detail by dividing step by step.
제1단계: 핵 공여세포의 준비, 체외배양 및 유지Stage 1: Preparation, in vitro culture and maintenance of nuclear donor cells
체세포 핵이식 기술에 의한 GT 유전자를 제거시킨 형질전환동물의 생산에는 핵공여세포가 필요한데, 이 과정은 상기 GFP 발현 복제돼지 생산을 위한 제 1단계와 동일하게 수행된다.Nuclear donor cells are required for the production of transgenic animals from which the GT gene has been removed by somatic cell nuclear transfer technology. This process is performed in the same manner as in the first step for producing the GFP expressing pig.
제 2단계: GT 유전자의 분리Step 2: Isolate the GT Gene
총 3개의 풀(pools)로 구성되어 있는 돼지 게노믹 BAC 라이브러리(pig genomic BAC library)를 영국 HGMP(Human Genome Mapping Project)사에서 구입한 후 이를 스크리닝(screening) 하여 GT 유전자를 분리한다. 라이브러리 스크리닝 전 단계로 돼지 GT cDNA(승인번호 : AF221517)를 바탕으로 작제한 프라이머(primer) 와 돼지 게노믹 DNA를 이용하여 중합효소연쇄반응을 시행하여 양성 신호(positive signal)을 얻음으로써 프라이머의 정확성 및 중합효소연쇄반응 방법을 검증한다. 검증된 방법으로 3개의 돼지 BAC 게노믹라이브러리 풀을 스크리닝하여 원하는 크기의 중합효소연쇄반응 산물이 얻어지는 단일클론을 얻는다. 그후 통상적인 서던블랏(Southern blot) 법을 이용하여 GT 유전자 클론을 검정한다.Pig genomic BAC library consisting of a total of three pools (pig genomic BAC library) is purchased from the UK Human Genome Mapping Project (HGMP) screening and screening (GT) to isolate the GT gene. Prior to library screening, primer primers were constructed based on porcine GT cDNA (approval number: AF221517) and polymerase chain reaction using porcine genomic DNA to obtain positive signal. And polymerase chain reaction methods. The validated method screens three porcine BAC genomic library pools to obtain monoclonals from which a polymerase chain reaction product of the desired size is obtained. GT gene clones are then assayed using conventional Southern blot methods.
제3단계: GT 제거된 벡터 제작 및 핵공여세포로의 도입Step 3: Construction of GT-Removed Vector and Introduction to Nuclear Donor Cells
위에서 분리된 GT 유전자 클론을 이용하여 유전자 적중용 벡터를 작제한다. 즉, GT 유전자의 단백질 발현 부위 일부분을 대치한 표지유전자가 상동 재조합 (homologous recombination)을 통하여 GT 단백질 발현부위를 대치하여 정상적인 GT 단백질이 발현되지 않도록 적중벡터를 작제한다. 적중된 세포의 선별 효율을 높이기 위해 적중 벡터는 외인성 프로모터(exogenous promoter)를 지니지 않도록, 즉 프로모터 트랩(promoter trap) 방법을 이용한다. 적중 벡터는 GT 유전자중 인트론(intron) 8의 일부분, 단백질 발현 부위(엑손[Exon] 9), 및 인트론 9의 일부 서열를 포함하는 상동 절편과, GT 유전자의 단백질 발현 부위 중 Ava I 과 Dra III 제한효소로 절단된 단편의 아미노산 서열에 해당하는 유전자의 염기서열을 대치하는 푸로마이신 저항유전자 발현부위-SV40 폴리(A) 서열을 포함한다. 이러한 적중벡터는 상동 절편에서는 상동 재조합이 일어나 푸로마이신 저항유전자 발현부위-SV40 폴리(A) 서열부위가 정상적인 엑손에 삽입되어 GT 유전자를 파괴한다(도9). 상기 적중 벡터를 핵공여세포로 GFP 형질전환 동물 생산방법에서 언급된 퓨진6을 이용하여 도입한다. 적중벡터가 도입된 체세포는 적절한 항생제가 포함된 배지에서 1 - 2주일 동안 배양하여 선별한 후 적중 여부를 서던블랏 또는 중합효소연쇄반응 등의 통상적인 방법으로 확인한다.Gene targeting vectors are constructed using the GT gene clone isolated above. That is, a target vector is constructed so that a label gene in which a part of the protein expression region of the GT gene is replaced, replaces the GT protein expression region through homologous recombination so that normal GT protein is not expressed. In order to increase the screening efficiency of the hit cells, the hit vector does not have an exogenous promoter, that is, a promoter trap method is used. The hit vector is a homologous fragment comprising a portion of intron 8 of the GT gene, a protein expression site (Exon 9), and a partial sequence of intron 9, and Ava I and Dra III restriction of the protein expression site of the GT gene. It comprises a puromycin resistance gene expression site-SV40 poly (A) sequence which replaces the nucleotide sequence of the gene corresponding to the amino acid sequence of the fragment cut by the enzyme. This hit vector is a homologous recombination in the homologous fragment, the furomycin resistance gene expression site-SV40 poly (A) sequence region is inserted into the normal exon to destroy the GT gene (Fig. 9). The targeting vector is introduced into nuclear donor cells using Fuxin6 mentioned in GFP transgenic animal production method. Somatic cells introduced with a hit vector were selected by culturing for 1 to 2 weeks in a medium containing an appropriate antibiotic and then checked for hit by a conventional method such as Southern blot or polymerase chain reaction.
제4단계:체세포의 핵이식을 통한 복제수정란의 생산Step 4: Production of cloned fertilized eggs by nuclear transfer of somatic cells
상기 GFP 발현 복제돼지 생산의 제 4단계와 동일하게 수행된다.The GFP expression is carried out in the same manner as the fourth step of production of cloned pigs.
제5단계: 복제수정란의 대리모 이식 및 산자생산Step 5: transplantation of surrogate mothers and production of cloned eggs
상기 GFP 발현 복제돼지 생산의 제 5단계와 동일하게 수행된다.The GFP expression is carried out in the same manner as the fifth step of replicating pig production.
상기한 방법으로 돼지 태아섬유아세포를 핵공여세포로 하여 GT 유전자가 제거시켜 핵을 이식한, 배반포 단계의 돼지 복제 수정란을 에스엔유-피2(돼지 엔티 배아)(SNU-P2[Porcine NT Embryo])로 명명하여, 이를 2001년 12월 27일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원(KRIBB) 유전자 은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 'KCTC 10146BP'로 기탁하였고, 상기 기탁된 핵이식란 SNU-P2를 대리모에 이식하여 정상 산자를 생산한다.Porcine fetal fibroblasts were used as nuclear donor cells, and GT genes were removed to transfer the nucleus to the embryonic blastocyst stage embryo cloned embryos (SNU-P2 [Porcine NT Embryo]). It was deposited on December 27, 2001, with the deposit number 'KCTC 10146BP' to KRIBB Gene Bank (KCTC, 52 Ue-dong, Yuseong-gu, Daejeon, Korea). Transplantation SNU-P2 is transplanted into surrogate mothers to produce normal litters.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.These examples are only for illustrating the present invention in detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples according to the gist of the present invention.
실시예 1: 핵 공여세포의 준비, 핵 공여세포의 체외배양 및 유지Example 1 Preparation of Nuclear Donor Cells, In Vitro Culture and Maintenance of Nuclear Donor Cells
임신된 돼지자궁을 채취한 후 무균상태로 실험실로 옮겨온다. 생후 30일령, 체장 25mm 정도의 태아를 주로 이용하며 양막에 쌓여 있는 태아를 무균적으로 분리한다. 분리된 태아의 머리, 사지 및 복강내부장기를 제거한 다음 항생제와 항균제가 첨가된 인산완충액으로 수회 세정한다. 0.25% 트립신 이.디.티.에이(trypsin-EDTA)가 들어있는 디쉬에서 외과용 가위를 이용하여 태아조직을 분리한다. 분리된 태아 조직을 38℃, 5% CO2세포 배양기에 30분 정도 배양한다. 이후 수회 원심분리로 트립신을 세척하고 소태아혈청이 10% 함유된 세포배양배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM)에서 배양한다. 분리 후 배양 디쉬에 세포가 90-100% 증식하면 일부는 계대 배양을 하고 잉여세포는 동결한다. 세포의 동결은 체세포 핵이식의 핵공여세포로 장기간 이용하기 위한 목적이며, 배양을 하는 경우 세포의 질을 향상시키기 위하여 성장인자와 세포사멸 억제제를 첨가한 배양액을 이용한다.The pregnant pig womb is collected and transferred to the laboratory aseptically. 30 days of age, 25mm in length of the fetus is mainly used, and fetuses stacked on the amniotic membrane are separated aseptically. The separated fetus's head, limbs and intraperitoneal organs are removed and washed several times with phosphate buffer with antibiotics and antimicrobial agents. Fetal tissues are separated using surgical scissors in a dish containing 0.25% trypsin-EDTA. The isolated fetal tissue is incubated for 30 minutes in a 38 ℃, 5% CO 2 cell incubator. The trypsin is then washed by centrifugation several times and incubated in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum. After isolation, when cells are grown 90-100% in a culture dish, some are passaged and excess cells are frozen. Cell freezing is intended for long-term use as a nuclear donor cell for somatic cell nuclear transfer, and when cultured, a culture medium containing growth factors and apoptosis inhibitors is used to improve cell quality.
실시예 2: GT유전자의 분리Example 2: Isolation of GT Gene
돼지 게놈 라이브러리(Pig genome library)에서 GT의 시그널을 검색하기 전에, 양성 대조군으로서, 랜드레이스(Landrace) 품종의 6개월령 돼지 자궁중 약 5g을 잘게 잘라 액체 질소를 넣은 약사발에 넣고 조직을 파괴시킨다. 단백질융해제 K(proteinase K)를 11mg/ml의 농도로 처리한 후 페놀 추출을 통하여 돼지 게놈 DNA를 준비한다.Before searching for the signal of GT in the pig genome library, as a positive control, about 5 g of the 6-month-old pig uterus of Landrace varieties are chopped and placed in a medicine bowl with liquid nitrogen to destroy tissue. After treating proteinase K at a concentration of 11 mg / ml, porcine genomic DNA is prepared through phenol extraction.
돼지 GT 스크리닝을 위하여 돼지 BAC 게노믹 라이브러리를 구입하였다. 최종 단일 클론을 분리하기 위해 단계별로 총 세 개의 풀(pools)로 구성되어 있는 라이브러리를 스크리닝해야 하며, 각각의 풀의 구성은 다음과 같다. 제1풀은 A에서 R (K제외)까지 17 바이알(vials)로 구성되어 있으며, 제2풀은 96-웰 마이크로플레이트(microplate)에 각 15개의 풀이고 제3풀은 각 384-웰 마이크로플레이트로 구성되어 있다. 먼저 돼지 게노믹 DNA(100ng/㎕)를 이용하여 원하는 크기의 양성 GT 신호를 찾기 위해 돼지 GT cDNA (승인번호 : AF221517)에서 유래된 프라이머를 제작하여 중합효소연쇄반응을 시행하였다. 이때 이용된 프라이머는 돼지 GT5(5 - GAT CAA GTC CGA GAA GAG GTG GCA A 3)와 돼지 GT3(5 TCC TGG AGG ATT CCC TTG AAG CACT 3)로서 두 가지 프라이머를 이용하여 증폭되는 산물의 크기는 342bp이다.Pig BAC genomic libraries were purchased for pig GT screening. To separate the final monoclones, a library consisting of three pools must be screened in stages. Each pool consists of: The first pool consists of 17 vials from A to R (excluding K), the second pool is 15 pools each in a 96-well microplate and the third pool is each 384-well microplate. Consists of First, primers derived from porcine GT cDNA (approval number: AF221517) were prepared using a pig genomic DNA (100 ng / μl) to find a positive GT signal of a desired size. The primers used were porcine GT5 (5-GAT CAA GTC CGA GAA GAG GTG GCA A3) and porcine GT3 (5 TCC TGG AGG ATT CCC TTG AAG CACT 3). to be.
위 증폭산물을 생성하기 위하여 이용되는 중합효소연쇄반응은 1U의 내열성 DNA 중합효소, 10mM dNTPs, 200mM Tris-Cl(pH 8.8), 100mM KCl, 100mM (NH4)2SO4, 1% TritonX-100, 1mg/ml BSA, 주형으로 100ng/㎕ 게노믹 DNA 및 2㎕, 프라이머(40 pmol/㎕ 센스프라이머, 40pmol/㎕ 안티센스프라이머)로 구성되어 있으며 총 부피는 20㎕ 이다. PCR 조건은 첫 주기(cycle)에서 95℃ 5분간 변성단계, 두 번째 주기(cycle)부터는 95℃ 1분 변성, 55℃ 1분간 서냉복원(annealing), 72℃ 1분 30초간 중합화(polymerization)로 구성된 사이클을 40회 반복하였으며, 마지막 사이클에서 72℃ 15분간 증폭(extension)을 시행하였고, 증폭된 산물은 겔 전기영동과정을 통하여 확인하였다.The polymerase chain reaction used to generate the above amplified product was performed with 1 U of heat-resistant DNA polymerase, 10 mM dNTPs, 200 mM Tris-Cl (pH 8.8), 100 mM KCl, 100 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 1% TritonX-100 , 1 mg / ml BSA, 100 ng / μl genomic DNA and 2 μl as template, primer (40 pmol / μl senseprimer, 40 pmol / μl antisense primer) with a total volume of 20 μl. PCR conditions were denatured at 95 ° C. for 5 minutes in the first cycle, 95 ° C. for 1 minute in the second cycle, slow cooling at 55 ° C. for 1 minute, and polymerization at 72 ° C. for 1 minute 30 seconds. The cycle consisting of 40 iterations were repeated, and the final cycle was amplified (extension) at 72 ℃ 15 minutes, the amplified product was confirmed through gel electrophoresis process.
돼지 게노믹 DNA(100ng/㎕)를 이용하여 중합효소연쇄반응을 시행한 결과 342bp의 산물(product)을 확인할 수 있었으며 이를 양성 대조군으로 하여 제 1차로 돼지 BAC 게노믹 라이브러리 제1 풀(A-R, K제외, 총 17개)을 돼지 GT5와 돼지 GT3 프라이머를 이용하여 게노믹 DNA와 동일한 조건에서 PCR을 시행한 결과 게노믹 DNA와 마찬가지의 342bp 크기(size)의 산물(product)을 F, G 풀(pool)에서 얻었다(도5). 제1 풀에서 양성 시그널이 나타난 F, G 풀의 제2 풀(secondary pool)(F : 76-90, G : 91-105로 구성, 각 15개)을 위와 동일한 조건에서 중합효소연쇄반응을 시행한 결과 F, G 각각의 제 2 풀(secondary pool)에서 게노믹 DNA와 동일한 산물(product)을 얻었다. 또한 F 풀(pool)은 81, 88번에서, G 풀(pool)은 91번에서 342bp의 PCR 산물(product)을 확인할 수 있었다 (도6). 이 중 시그널(signal)이 가장 강하게 나타난 88번 풀(pool)의 384개의 각각의 단일 클론으로 구성된 제3 풀(tertiary pool) (384-well microplate, 1A-24P)을 이용하여 PCR을 시행한 결과 8F에서 게노믹 DNA와 동일한 시그널(signal)이 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도7).As a result of polymerase chain reaction using pig genomic DNA (100ng / μl), the product of 342bp was identified. The first pool of pig BAC genomic library was first used as a positive control (AR, K). PCR was performed on the same conditions as genomic DNA using porcine GT5 and porcine GT3 primers, and 342 bp sized products similar to genomic DNA were obtained from F and G pools. pool) (Figure 5). Secondary pools (F: 76-90, G: 91-105, 15 each) of F and G pools showing positive signals in the first pool were subjected to polymerase chain reaction under the same conditions. As a result, the same product as the genomic DNA was obtained from the second pool of each of F and G. In addition, the pool F was 81, 88, G pool (91) at 342bp was able to identify the PCR product (Fig. 6). PCR was performed using a tertiary pool (384-well microplate (1A-24P)) consisting of 384 single clones of pool 88, which showed the strongest signal. At 8F, the same signal as the genomic DNA was confirmed to appear strongly (FIG. 7).
실시예 3: GT 제거된 벡터 제작Example 3: GT Removed Vectors
돼지 GT의 대략적인 절단 맵핑은 돼지 GT 엑손9 유전자(승인번호; AF221517, 3.9kb)를 웹커터 프로그램 (Webcutter program; http://www.firstmarket.com/ firstmarket/cutter/)으로 하였다. 서던 하이브리디제이션 (Southern hybridization)을 실행하기 위해 프로브(probe)에 이용할 DNA는 중합효소연쇄반응을 이용하여 만든 산물(351bp)를 8% 페이지(PAGE) 젤(gel)에서 전기영동 후, 젤 일렉트로-일루션(gel electro-elution)을 이용하여 얻었다. 이를 무작위 프라이머 표지 킷트(Random primer labelling kit, Life Technologies, USA)를 이용하여 프로브(α-32P[dCTP])를 만들었다.Approximate cleavage mapping of porcine GT was the pig GT exon9 gene (approved number; AF221517, 3.9 kb) as the Webcutter program (http://www.firstmarket.com/firstmarket/cutter/). The DNA to be used for the probe to perform Southern hybridization was subjected to gel electrophoresis after electrophoresis of a product (351bp) made using a polymerase chain reaction on a 8% PAGE gel. Obtained using gel electro-elution. The probe (α- 32 P [dCTP]) was made using a random primer labeling kit (Life Technologies, USA).
GT BAC DNA를 준비하기 위해, 3번째 풀에서 1ul의 클론된 대장균을 3ml LB 브로쓰(broth)(CM+)에 접종하여 37℃에서 300rpm으로 12시간 배양, 500ml LB 브로쓰(CM+)에 재접종하여 같은 방법으로 16시간 배양하였다. 퀴아젠(QIAGEN) 대형-구조 킷트(Large-construct kit; Qiagen, Germany)를 이용하여 순수한 BAC DNA를 얻었다. 돼지 GT DNA(5ug)를 10 유니트(unit)의 제한효소(EcoR I, Hind III, BamHI, and Not)로 3시간 동안 절단한 후 1% 아가로즈 젤에 50V로 12시간 전기영동 하였다. 전기영동한 젤을 변성화 용액 (denaturation solution; 0.5M NaOH, 1.5M NaCl)에 15분간, 중성화 용액(Neutralization solution; 0.5M Tris-Cl, 1.5M NaCl, pH 8)에 같은 시간동안 담근 후, 진공 전달기(vacuum transfer)를 이용하여 DNA를 나이론 막(nylon membrane)에 옮겼다. 이 막을 3시간 프리하이브리다이제이션(prehybridazation) 시킨 후, 16시간 하이브리다이제이션(hybridization)을 시켰다. 이 막을 엑스레이 필름에 노출시켜 절단된 BAC 단편을 동정하였다.To prepare GT BAC DNA, 1 ul of cloned E. coli was inoculated in 3 ml LB broth (CM +) in a third pool, incubated at 300 rpm for 12 hours at 37 ° C, and re-inoculated in 500 ml LB broth (CM +). Incubated for 16 hours in the same manner. Pure BAC DNA was obtained using the QIAGEN Large-construct kit (Qiagen, Germany). Porcine GT DNA (5ug) was digested with 10 units of restriction enzymes (EcoR I, Hind III, BamHI, and Not) for 3 hours and electrophoresed at 50V on 1% agarose gel for 12 hours. The electrophoretic gel was immersed in a denaturation solution (0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl) for 15 minutes and then neutralized in a neutralization solution (0.5 M Tris-Cl, 1.5 M NaCl, pH 8) for the same time. DNA was transferred to a nylon membrane using a vacuum transfer. This membrane was prehybridazated for 3 hours, followed by 16 hours of hybridization. This membrane was exposed to the x-ray film to identify the cleaved BAC fragment.
서브클론(subclone)을 만들기 위해 벡터(pUC 19)를 절단효소(EcoR I)로 1시간 반 동안 절단시킨 후, 페놀/클로로폼(phenol/chlorform)으로 순수화시켜 -20℃에 보관하며 사용하였다. 절단된 BAC DNA 와 벡터(100ng), 10배합성중합제(ligation buffer), 2ul T4 중합효소(ligase; 10 unit/ul)를 튜브에 넣은 후 15-16℃에서 16시간 이상 배양하였다. 그 후 C-세포(competent cell) 200ul에 중합 혼합액(ligation mixture) 10ul를 첨가하여 30분간 얼음에서 놓아 둔 뒤, 42℃에서 90초간 열 충격(heat shock)을 시키고 800ul LB 브로쓰를 첨가하여 45분간 37℃ 배양기에서 배양하였다. 이 혼합액과 IPTG와 X-gal이 도말 된 LB 플레이트(Amp+)에 도포하여 37℃ 배양기에서 하룻저녁 배양하였다. 다음 날 색선별(color selection)을 통해 흰색군(white colony)를 골라서 배양한 후 중합효소연쇄반응을 통하여 원하는 단편이 삽입되었는지 확인하였다.To make a subclone, the vector (pUC 19) was digested with cleavage enzyme (EcoR I) for 1 and a half hours, purified with phenol / chloroform and stored at -20 ° C. . The cleaved BAC DNA and the vector (100ng), 10 ligation buffer, 2ul T4 polymerase (10 unit / ul) was added to the tube and incubated for 16 hours at 15-16 ℃. Then, add 10ul of the polymerization mixture (ligation mixture) to 200ul of C-cell (competent cell) and leave it on ice for 30 minutes, heat shock at 42 ℃ for 90 seconds and add 800ul LB broth. Incubated in a 37 ° C. incubator for min. The mixed solution, IPTG, and X-gal were applied to a smeared LB plate (Amp +) and incubated overnight at 37 ° C. incubator. The next day, the white colony was selected and cultured by color selection, and then the desired fragment was inserted through the polymerase chain reaction.
맵핑(Mapping)을 수행한 결과 밤 에이취I(Bam HI)을 제외한 나머지 효소(EcoRI, Hind III, Not I) 부위가 돼지 GT 엑손9 에는 존재하지 않음을 알았다. 그리고, BAC DNA를 각각의 제한효소(EcoR I, Hind III, Bam HI, Not I)로 절단하여 1% 아가로스 젤런링 한 결과 다양한 크기의 DNA 밴드를 볼 수 있었다(도8). 이 젤로 서던 하이브리다이제이션(southern hybridization)을 시행한 결과 GT 엑손 9을 포함하고 있는 DNA 단편이 Bam HI을 제외한 모든 제한효소는 단일 밴드를 나타냈고, 그 단편은 8-12kb사이에 위치하였다. EcoR I으로 자른 DNA 절편은 약 8kb의 크기로 GT 엑손9을 포함하고 양쪽의 인트론 부위를 8kb 정도 포함할 수 있는 크기여서 돼지 BAC DNA를 EcoRI으로 자른 후 서브클로닝을 하였다. 상기에서 분리된 GT 유전자 클론을 이용하여 유전자 적중용 벡터를 작제하였다. 적중된 세포의 선별 효율을 높이기 위해 적중 벡터는 외인성 프로모터를 가지지 않도록 즉 프로모터 트랩(promoter trap) 방법을 이용하였다. 서브클론된 GT 유전자(1ug)를3유니트(unit)의 Ava I 과 Dra III 제한 효소로, 푸로 카세트(puro cassette)를 포함하는 플라스미드(Clontech 사)를 Hind III 와 Bam HI 제한효소로 37℃에서 2시간 이상 반응시켜 절단한다. 절단된 유전자를 dNTP와 크레노우 단편 DNA 폴리머레이즈(Klenow fragment DNA polymerase)를 이용하여 무딘끝 (blunt end)을 가지도록 하였다. 순수화를 위해 1% 아가로즈젤상에서 전기영동한 후 젤내에 있는 유전자를 DNA 일루션 킷트(elution kit) (Qiagen, Germany)를 이용하여 분리하였다. 분리된 GT 유전자 단편과 푸로마이신 저항유전자 발현부위-SV 40 폴리(A) 유전자 절편을 중합효소를 이용하여 라이게이션(ligation)하여 적중용 벡터를 작제하였다.(도9).As a result of mapping, it was found that no residue (EcoRI, Hind III, Not I) site except for Bal HI was present in pig GT exon9. In addition, BAC DNA was digested with respective restriction enzymes (EcoR I, Hind III, Bam HI, Not I) and subjected to 1% agarose gelling, and DNA bands of various sizes could be seen (FIG. 8). Southern hybridization of the gel showed that the DNA fragment containing GT exon 9 showed a single band of all restriction enzymes except Bam HI, and the fragment was located between 8-12 kb. DNA fragments cut with EcoR I were about 8 kb in size and could include GT exon 9 and 8 kb of intron sites on both sides. Thus, the pig BAC DNA was cut with EcoRI and subcloned. The gene targeting vector was constructed using the GT gene clone isolated above. In order to increase the screening efficiency of the hit cells, the hit vector was used to have an exogenous promoter, that is, a promoter trap method. The subcloned GT gene (1ug) was used as a 3 unit Ava I and Dra III restriction enzyme, and the plasmid containing puro cassette (Clontech) was used as a Hind III and Bam HI restriction enzyme at 37 ° C. React by cutting for 2 hours or more. The cleaved gene was blunt end using dNTP and Klenow fragment DNA polymerase. After electrophoresis on 1% agarose gel for purification, the genes in the gel were isolated using a DNA elution kit (Qiagen, Germany). The isolated GT gene fragment and the furomycin resistance gene expression site-SV 40 poly (A) gene fragment were ligated using a polymerase to construct a hit vector (FIG. 9).
실시예 4; GFP 유전자와 GT 제거된 유전자의 도입 및 적중Example 4; Introduction and hit of GFP gene and GT removed gene
세포가 완전 증식된 60mm 배양 디쉬에서 세포 배양액을 제거한 뒤 인산완충생리식염수로 1회 세정하였다. 이후 0.25％ 트립신-EDTA를 적용하고 10%의 소태아혈청이 첨가된 세포배양배지 2ml에 세포를 재부유 시켜 35mm배양 디쉬에 태아 섬유아세포를 도포하였다. 다음 날 50-90%의 세포 밀도가 확인되면 유전자를 도입시켰다.Cell culture medium was removed from the 60 mm culture dish in which the cells were fully grown, and then washed once with phosphate buffered saline. After applying 0.25% trypsin-EDTA and resuspended the cells in 2ml cell culture medium to which 10% fetal bovine serum was added to the fetal fibroblasts were applied to a 35mm culture dish. The next day, when 50-90% cell density was confirmed, the genes were introduced.
본 발명에서 퓨진6의 경우, 35mm 디쉬당 DNA양은 1㎍, 유전자 도입액 용량을 3.0㎕로 하여 유전자를 도입하였다. 35mm 디쉬 하나를 기준으로 에펜도르프 튜브에 97㎕의 혈청을 첨가하지 않은 세포배양배지를 분주하였다. 1㎍의 pEGFP-N1벡터를 넣은 후 퓨진6을 3㎕ 넣고 3000rpm에서 10초간 원심하였다. 원심 후 15분간 실온에서 방치한 다음 35mm 배양 디쉬에 100㎕씩 분주하여 잘 흔들어 골고루 확산되게 한다음 세포배양기에서 배양하였다. 양전하 리포좀을 이용하는 방법인 리포펙트아민 플러스(LipofectAmin plus, Life Technologies)는 적은 양의 DNA로도 높은 유전자 도입율을 얻을 수 있는 장점이 있다. 먼저, 인산완충생리식염수, 소태아혈청 및 항생제가 첨가되지 않은 배지를 30분전에 37℃ 항온수조에 담가놓고 클린벤치내에서 멸균 에펜도프 튜브에 DNA를 혼합한다. 혈청이 첨가되지 않은 배지 또는 옵티 엠.이.엠(Opti-MEM) 100㎕ 와 플러스 리에젼트(Plus reagent) 4㎕를 혼합하여 이를 DNA와 잘 혼합한(피켓 사용) 후 15분간 실온에 정치시켰다. 정치하는 동안 90% 의 세포밀도를 지닌 6웰 플레이트(well plate)를 인산완충생리식염수로 2회 세척하였다. 혈청을 첨가하지 않는 배지를 웰당 0.8ml 씩 가한 후 DNA 혼합액을 각 웰에 넣고 디쉬를 가볍게 흔들어 골고루 섞은 다음 CO2배양기에서 배양한다. 양전하 중합체 제제인 엑스젠 500(ExGen 500, MBI Fermentas)은 최적화 작업을 통해 100㎕의 150mM NaCl에 2㎕의 벡터 DNA을 넣은 후 6.6㎕ 엑스젠 500을 넣고 10초간 3000rpm으로 원심한 뒤 실온에 10분간 정치하고 60%의 세포밀도를 가진 35 mm 배양 디쉬에 분주한 후 CO2배양기에서 배양하였다.In the present invention, in the case of fugin6, the gene amount was introduced with 1 µg of DNA per 35 mm dish and 3.0 µl of the gene introduction solution. Cell culture media without addition of 97 μl of serum were dispensed into Eppendorf tubes based on one 35 mm dish. After inserting 1 μg of pEGFP-N1 vector, 3 μl of Fuxin 6 was added and centrifuged at 3000 rpm for 10 seconds. After centrifugation, the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes, then dispensed into a 35 mm culture dish in 100 μl, shaken well, and spread evenly. LipofectAmin (LipofectAmin plus, Life Technologies), which uses positively charged liposomes, has the advantage of obtaining high gene transduction rates even with a small amount of DNA. First, the medium without phosphate buffered saline, fetal bovine serum and antibiotics was soaked in a 37 ° C. constant temperature water bath 30 minutes before, and the DNA was mixed in a sterile eppendorf tube in a clean bench. 100 μl of medium or Opti-MEM without serum added and 4 μl of Plus reagent were mixed, mixed well with DNA (using a picket), and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. . During standing, a 6 well plate with a cell density of 90% was washed twice with phosphate buffered saline. After adding 0.8ml of each medium without the serum, add the DNA mixture to each well, shake the dishes gently and evenly and incubate in the CO 2 incubator. Exgen 500 (MBI Fermentas), a positively charged polymer formulation, was optimized by placing 2 µl of vector DNA in 100 µl of 150 mM NaCl, 6.6 µl of Exzen 500, centrifugation at 3000 rpm for 10 seconds, and then at room temperature. It was allowed to stand for a minute and dispensed into a 35 mm culture dish having a cell density of 60%, followed by culturing in a CO 2 incubator.
실시예 5: GFP 유전자가 도입된 핵공여세포의 선별, 증식 및 동결보존Example 5: Selection, proliferation and cryopreservation of nuclear donor cells into which the GFP gene has been introduced
각기 다른 3가지 방법으로 유전자를 도입시킨 돼지 태아섬유아세포를 3-5일간 배양하여 완전증식 시킨 후 효소처리로 단세포로 분리하였다. 이와같은 단세포 중 현미경하에서 자외선 필터를 이용하여 GFP 단백질이 발현되는 세포만을 선택하여 핵이식에 적용한다. 또한 항생제를 이용한 세포선별을 위해 유전자 도입 후 4-5일 간격으로 3주간 네오마이신을 400ug/ml 용량으로 적용하여 선별을 실시한다. 선별 후 세포들은 하나의 집락(colony)으로 자라게 되는데 이를 트립신으로 처리하여 96-웰(96-well)의 배양용기로 옮겨 배양 한 후 이들이 증식되면 이후 24-웰로 옮겨 배양하고 더 나아가서 12-웰과 6-웰까지 증식 배양을 실시하였다. 일정 수 이상 배양된 세포의 게노믹 DNA(genomic DNA)를 분리하여 염색체상에서 GFP 유전자가 삽입되었는지를 확인하기 위해 5'-GCGATGCCACCTACGGCAAGCTGA-3', 5'-GAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGAT-3' 의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응법과 GFP 프로브를 이용한 서던 블랏(Southern blotting)을 통해 선별된 세포의 GFP 유전자 도입 여부를 확인하였다. GFP유전자 도입과 항생제 선별이 끝나 증식배양된 세포를 15 % 소태아혈청과 10 % 세포배양배지를 이용하여 세포를 부유한 다음 4℃에서 2시간, -70℃에서 12시간 이상 정치시킨 후 -150℃에서 동결보관하였다. 이후 동결된 세포를 이용하여 체세포 핵이식을 실시하였다.Porcine fetal fibroblasts into which genes were introduced by three different methods were cultured for 3-5 days, completely proliferated, and isolated into single cells by enzyme treatment. Of these single cells, only the cells expressing GFP protein are selected and applied to nuclear transfer using an ultraviolet filter under a microscope. In addition, for selection of cells using antibiotics, screening is performed by applying neomycin at a dose of 400ug / ml for 3 weeks at intervals of 4-5 days after gene introduction. After selection, the cells grow into a colony, which is treated with trypsin and transferred to a 96-well culture vessel. After they are grown, they are transferred to 24-well and further grown to 12-well and Proliferation cultures were performed up to 6-well. In order to check genomic DNA of cells cultured over a certain number and to confirm that the GFP gene was inserted on the chromosome, primers of 5'-GCGATGCCACCTACGGCAAGCTGA-3 'and 5'-GAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGAT-3' were used. The chain reaction and Southern blotting using GFP probes confirmed the introduction of GFP gene into selected cells. After the introduction of GFP gene and selection of antibiotics, the proliferated cells were suspended using 15% fetal bovine serum and 10% cell culture medium and allowed to stand for 2 hours at 4 ℃ and at least 12 hours at -70 ℃. Cryopreserved at ° C. Then, somatic cell nuclear transfer was performed using frozen cells.
실시예 6: 수핵난자의 준비Example 6 Preparation of Nucleated Oocytes
도축장에서 채취한 도축돼지의 난소로부터 18 게이지 주사침이 장착된 5ml 주사기를 사용하여 직경 3-6mm 내외의 난포를 흡입한 다음, 1㎝ 간격의 격자 눈금을 그은 100mm 디쉬에 흡입한 난포액을 옮겨 난구세포가 충분히 부착되어 있고 세포질이 균질한 난자를 선별하였다. 선별된 난자를 NCSU23-W가 2ml씩 분주된 35㎜ 디쉬에서 3회에 걸쳐 세정하고, NCSU23-M으로 최종적으로 세정한다. 그후 소혈청알부민이 첨가되지 않은 NCSU23-M에 10% 돼지 난포액, 성선 자극 호르몬, 10ng/ml의 표피성장인자를 첨가하여 4-웰 디쉬에 480㎕씩 분주하였다. 각각의 웰에 미성숙 난자를 50-60개씩 넣고 5% CO 2 의 조건하에 12시간 동안 배양한 후 상기한 호르몬이 첨가되지 않은 NCSU23-M에서 20-22시간 동안 체외성숙시켰다.From the ovary of the slaughterhouse, the follicle cells were inhaled in 3-100mm diameter follicles using a 5ml syringe equipped with an 18-gauge needle. Eggs with sufficient adherence and homogeneous cytoplasm were selected. Selected eggs are washed three times in a 35 mm dish dispensed with 2 ml of NCSU23-W and finally washed with NCSU23-M. Subsequently, 10% porcine follicle solution, gonadotropin, and 10 ng / ml epidermal growth factor were added to NCSU23-M without bovine serum albumin, and 480 µl was dispensed into a 4-well dish. 50-60 immature eggs were placed in each well and incubated for 12 hours under conditions of 5% CO 2 , followed by in vitro maturation for 20-22 hours in NCSU23-M without the above-mentioned hormone.
실시예 7: 체세포 핵이식Example 7: Somatic Cell Nuclear Transplantation
실시예 4에서 준비된 수핵난자를 NCSU23-W 배양액에서 1회 세정하고 0.1% 하일알루로니다제가 첨가된 NCSU23-W 용액 내에 옮긴 다음 난구세포를 제거하였다. 이어 7.5mg/ml의 농도가 되도록, 다이메틸설폭사이드(DMSO; dimethyl sulfoxide)에 사이토칼라신 B(cytochalasin B, Sigma Chemicla Co.,USA)를 용해시킨 용액 1㎕와 10% 소태아혈청이 첨가된 NCSU23-W를 1ml을 혼합한 사이토칼라신 B 용액으로 난자를 옮겼다. 미세조작기로 수핵난자를 고정하고 투명대를 관통하여 고정용 피펫과 마찰을 가해 절개창을 형성시킨 후, 난자 상부에서 미세피펫으로 전체 양의 10 내지 15%에 해당하는 세포질을 압박압력을 가해 제거함으로써 난자에서 탈핵시켰다(스퀴징 탈핵, squeezing법).The nucleated nuclei prepared in Example 4 were washed once in NCSU23-W culture and transferred into NCSU23-W solution added with 0.1% hyaluronidase, followed by removal of cumulus cells. Then, to the concentration of 7.5 mg / ml, 1 μl of a solution of cytocarlasin B (Sigma Chemicla Co., USA) dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and 10% fetal bovine serum were added. The eggs were transferred to cytocalin B solution containing 1 ml of NCSU23-W. After fixation of the nucleus pulposus egg with a micromanipulator, the incision is made by applying a friction pipette to the fixation pipette, and then removing the cytoplasm corresponding to 10-15% of the total amount with the micropipette from the upper part of the egg by applying pressure to remove the egg. Denuclearization (squeezing denuclearization, squeezing method).
탈핵후 미세조작기에서 탈핵된 수핵난자에, 준비된 핵공여세포를 이식하였다. 먼저, 5mg의 피.에이치.에이-피(phytohemagglutinin; PHA-P)를 10ml의 NCSU23-W에 용해시킨 용액 100㎕와 400㎕의 NCSU23-W에 혼합한 용액으로 작업용 디쉬 상단 중앙에 4㎕의 이식용 미소적을 만든다. 그 후 0.5% 소태아혈청이 첨가된 PBS로 이식용 미소적 위 아래에 각각 1개씩의 4㎕의 핵공여세포용 미소적을 만든다. 이들 미소적을 미네랄 오일로 도포한 후, 작업용 디쉬를 미세작업판에 위치시킨다. NCSU-M에 정치된 탈핵 난자를 세정용 NCSU-W로 3회 세정하고, 이식용 미소적으로이동시킨 다음, 이식용 피펫을 사용하여 공여세포를 이식용 미소적으로 이동시킨다. 이식용 피펫에 GFP 발현이 확인된 세포 또는 GT 유전자가 제거된 세포를 주입하여 이 세포를 수핵난자의 주란강에 주입하였다(도3). 이런 과정을 거쳐 형성시킨 핵이식란을 NCSU-W로 옮겨서 3회 세정 후, 정치시켰다.The prepared nuclear donor cells were transplanted into the nucleated nucleated ovules in a post-nucleated micromanipulator. First, 100 μl of 5 mg of phytohemagglutinin (PHA-P) dissolved in 10 ml of NCSU23-W was mixed with 400 μl of NCSU23-W. Make a smile for the transplant. Thereafter, 4 microliters of nuclear donor cells, one each above and below the microfibers for transplantation, are made with PBS added with 0.5% fetal bovine serum. After applying these microparticles with mineral oil, the working dish is placed on the microworking board. The denucleated eggs placed on the NCSU-M are washed three times with the NCSU-W for washing, and microscopically transferred for transplantation, and then the donor cells are microscopically transferred for transplantation using a transplant pipette. In the pipette for transplantation, cells in which GFP expression was confirmed or cells in which the GT gene was removed were injected, and the cells were injected into the oocyte of the nucleus pulposus egg (FIG. 3). The nuclear transfer embryo formed through this process was transferred to NCSU-W, washed three times, and allowed to stand.
실시예 8: 세포융합 및 활성화Example 8: Cell Fusion and Activation
비티엑스 세포조작기를 사용하여 핵이식란의 전기융합 및 활성화를 실시하였다. 만니톨 용액(참조: 표 4) 15㎕를 세정용 마우스 피펫으로 핵이식란이 들어있는 NCSU23-W에 첨가하고, 1분간 정치시켰다. 세정용 마우스 피펫을 사용하여 핵이식란을 NCSU23-W가 첨가된 만니톨 용액에 주입하여 다시 1분간 정치시키고, 세정용 만티톨 용액에 넣었다. 이어, 비티엑스 세포조작기에 연결시킨 만니톨이 들어있는 전극 용기에 핵이식란을 넣고 공여세포가 (+)전극을 향하도록 핵이식란을 위치시켰다. 핵이식란의 세포 융합은 1.8kV/cm의 직류전압에서 30㎲의 시간으로 1회 통전하는 조건을 설정함으로써 유도하였다. 전기자극 후 20분 이내에 현미경하에서 세포융합여부를 확인하여 융합되지 않은 핵이식란은 재차 융합을 시도하였다. 세포융합이 확인된 핵이식란은 NCSU23-W로 옮겼다.Electrofusion and activation of nuclear transfer eggs was performed using a BTI-X cell manipulator. 15 μl of mannitol solution (see Table 4) was added to the NCSU23-W containing the nuclear transfer egg using a washing mouse pipette and allowed to stand for 1 minute. Using a mouse pipette for washing, the nuclear transfer embryos were injected into the mannitol solution to which NCSU23-W was added, and allowed to stand for another minute, and placed in the washing mantitol solution. Subsequently, the nuclear transfer egg was placed in the electrode container containing the mannitol connected to the BTI-X cell manipulator, and the nuclear transfer cell was positioned so that the donor cells face the positive electrode. Cell fusion of nuclear transfer embryos was induced by setting the conditions of energizing once at a time of 30 Hz at a DC voltage of 1.8 kV / cm. Within 20 minutes after the electrical stimulation, the cell fusion was confirmed under a microscope, and the unfused nuclear transfer embryos were fused again. Nuclear transplants with confirmed cell fusion were transferred to NCSU23-W.
실시예 9: 핵이식란의 배양Example 9 Culture of Nuclear Transplanted Eggs
세포융합과정이 끝난 형질전환 핵이식란은 NCSU23-W로 활성화 후 NCSU23-D로 옮겨 배양하였다. 그 후 배양 4일째 NCSU23-D에 소태아혈청이 10%가 되도록 첨가한 배지에서 배양하였다. 이와 같은 과정을 통해 발육된 각각의 형질전환 핵이식란은 배양 7일째에 배반포로의 발육여부와 GFP 발현 핵이식란의 경우 자외선하에서 발현 여부를 확인하였다(도4).After the cell fusion process, the transgenic nuclear transfer embryos were activated with NCSU23-W and transferred to NCSU23-D for culture. After 4 days of culture, the medium was cultured in NCSU23-D added with 10% fetal bovine serum. Each of the transgenic nucleus embryos developed through the above process was confirmed whether the blastocyst developed on the 7th day of culture and whether the GFP-expressed nucleus embryos were expressed under UV light (FIG. 4).
실시예 10: 핵공여세포의 GFP 도입여부에 따른 핵이식란의 발육성적 비교Example 10 Developmental Comparison of Nuclear Transplanted Eggs According to GFP Introduction of Nuclear Donor Cells
핵공여세포의 GFP 도입(GFP-transfection) 여부에 따른 핵이식란 발육성적의 차이를 비교하기 위해 실시예 4에서 GFP를 도입한 핵공여세포와 그렇지 않은 정상체세포를 실시예 6, 실시예 7, 실시예 8 및 실시예 9의 방법으로 체세포 핵이식하여 분할율, 배반포로의 발육률 및 배반포 세포수를 비교하였다(참조: 표 5). GFP도입여부는 핵이식란의 발육성적에 유의적인 차이를 초래하지 않았다.In order to compare the difference of nuclear transfer embryo developmental results according to whether GFP-transfection of nuclear donor cells (GFP-transfection), nuclear donor cells in which GFP was introduced in Example 4 and normal somatic cells which were not in Example 4 were carried out. Somatic cell nuclear transfer by the method of Example 8 and Example 9 to compare the split rate, development rate to blastocyst and blastocyst cell number (see Table 5). The presence of GFP did not cause any significant difference in the developmental status of nuclear transfer embryos.
실시예 11: 공여핵의 GFP 도입방법에 따른 핵이식란의 발육성적 비교Example 11 Developmental Comparison of Nuclear Transplanted Eggs According to GFP Introduction Method of Donor Nuclei
GFP 도입 방법에 따른 핵이식란의 발육율을 비교하기 위해, 실시예 4에서 3가지 방법으로 GFP를 핵공여세포에 도입하고 실시예 6, 실시예 7, 실시예 8 및 실시예 9의 방법으로 체세포 핵이식하여 이들의 분할율, 배반포로의 발육률 및 배반포 세포수를 비교하였다(표 6). GFP 도입방법에 따라 핵이식란의 발육성적에 유의적인 차이를 초래하지 않았다.In order to compare the growth rate of nuclear transfer embryos according to the GFP introduction method, GFP was introduced into nuclear donor cells by three methods in Example 4 and somatic cells by the method of Example 6, Example 7, Example 8 and Example 9 Nuclear transplantation compared their splitting rate, blastocyst development rate and blastocyst cell number (Table 6). According to the method of GFP introduction, there was no significant difference in the developmental history of nuclear transfer embryos.
실시예 12; 핵이식란의 대리모에의 이식Example 12; Transplantation of surrogate mothers into nuclear transfer eggs
실시예 1에서 실시예 11까지 과정에 의해 생산된 GFP 유전자 도입 및 GT유전자가 제거된 핵이식란의 대리모 이식을 위한 수란돼지는 산과학적 질병에 이환되지 않고 정상적인 발정주기가 반복되는 암퇘지 중에서 자궁상태가 정상인 개체를 대상으로 선발하였다.Bovine pigs for the introduction of GFP genes and surrogate mother transplantation of nuclear transfer embryos from GT genes produced by the procedure from Example 1 to Example 11 have a uterine condition in sows in which normal estrous cycles are repeated without being affected by an obstetric disease. Normal subjects were selected.
체외배양과정에 있는 양질의 형질전환 핵이식란을 선별하여 20%의 소태아혈청이 첨가된 인산완충생리식염수와 함께 수란 돼지의 난소쪽 난관 2cm부위에 주입하였다(도5). 그 과정을 약술하면, 수란돼지의 마취는 전마취제로 황산아트로핀(atropine)을 1mg/kg의 용량으로 근육주사한 뒤 진정제인 아자페론(Azaperone; Stresnil, P/M; Mallinckrodt)을 2-4mg/kg 용량으로 근육 내주사하였다. 10분 뒤 20mg/kg 의 염산 케타민(ketamine HCl)을 근육 주사하여 마취를 유도하였다. 피부 절개부 주위에 대한 국소마취는 2% 리도카인(lidocaine)으로 주사하였다. 일반적인 개복수술법에 따라 복부의 정중선을 따라 7cm 정도 절개하며 절개창의 혈액이 복강 내로 유입되지 않도록 하였다. 손으로 복강 내를 촉진하여 난소와 난관 및 자궁을 절개창으로 견인하였다. 견인된 난소의 난소간막을 조심스레 다루어 난관이 개구부를 인지하여 1.0ml의 튜버큘린(tuberculin) 주사기(Latex free, Becton Dickinson ＆ CO. Franklin lakes, NJ 07417)가 장착된 톰켓카테타(Tom cat catheter, 50cm, 5 French, open ended catheter, Williams A Cook, , MO 63103)를 난관 내로 2cm 정도 삽입하였다(도5). 삽입된 카테터의 전방에 충분한 공간을 확보하고 핵이식란을 주입하였다. 핵이식란의 완벽한 주입 여부는 현미경으로 검경하고 항생제를 섞은 생리식염수 500ml을 복강 내 주입하였다.복부의 봉합은 흡수성 봉합사를 이용하고 이후 피부봉합을 실시하였다. 수술 후 감염을 방지하기 위해 광범위 항생제를 5일간 투여하였다.High-quality transgenic nuclear transfer embryos in vitro were selected and injected with 2% of ovarian fallopian tubes of oviparous pigs with phosphate-buffered saline added with 20% fetal bovine serum (Fig. 5). To outline the process, anesthesia of the oviparous pigs is a pre-anesthetic and intramuscular injection of atropine (atropine) at a dose of 1 mg / kg, followed by a sedative azaperone (Stresnil, P / M; Mallinckrodt) 2-4 mg / Intramuscular injection at kg dose. After 10 minutes, anesthesia was induced by intramuscular injection of 20 mg / kg ketamine hydrochloride (ketamine HCl). Local anesthesia around the skin incision was injected with 2% lidocaine. According to the general laparotomy, the incision was made 7 cm along the midline of the abdomen to prevent blood from the incision into the abdominal cavity. The abdominal cavity was promoted by hand to pull the ovaries, fallopian tubes and uterus into the incision. Carefully handle the ovarian mesentery of the towed ovary, the fallopian tube recognizes the opening, and Tom cat catheter with 1.0 ml tuberculin syringe (Latex free, Becton Dickinson & CO. Franklin lakes, NJ 07417) 50 cm, 5 French, open ended catheter, Williams A Cook, MO 63103) was inserted into the fallopian tube by about 2 cm (FIG. 5). Sufficient space was secured in front of the inserted catheter and the nuclear transplanted eggs were injected. Complete injection of nuclear transplanted eggs was examined under a microscope and 500ml of saline mixed with antibiotics was injected intraperitoneally. Abdominal sutures were made using absorbent sutures and then skin-sealed. Broad antibiotics were administered for 5 days to prevent postoperative infection.
실시예 13; 임신 감정 및 GFP 유전자 도입 및 GT 제거된 산자의 출산Example 13; Pregnancy Emotion and GFP Transduction and Birth of GT-removed Sans
핵이식란의 대리모 이식 후 4주째에 초음파 검사 방법으로 임신여부를 확인하였다.Four weeks after the transplantation of the surrogate mother, the pregnancy was confirmed by ultrasonography.
임신 확인 후에도 2주 간격으로 초음파검사로 임신 지속여부를 관찰하였다. 임신된 GFP 발현 복제돼지는 핵이식란 이식 후 114일에 7두가 태어났으며 GT 제거된 복제돼지는 이식 후 114일에 3두가 태어났다.Even after confirmation of pregnancy, the presence of ultrasound was observed at 2 weeks intervals. Seven pregnant GFP-expressing cloned pigs were born on the 114th day after the transplantation, and three GT cloned pigs were born on the 114th day.
실시예 14; 각각의 형질전환 복제돼지의 유전자 확인Example 14; Gene identification of each transgenic cloned pig
실시예 13에서 생산된 각각의 형질전환 산자는 육안적 방법 및 분자생물학적 방법으로 유전자 분석을 하였다. GFP 발현 복제돼지는 외견관찰 및 조직을 이용한 서던블랏, 웨스턴 블랏 및 세포배양을 통하여 GFP 발현 및 유전자 도입을 분석하였다. GFP의 발현 여부는 육안적으로 산자의 피부조직, 구강조직, 혀 등을 관찰하여 초록빛이 나타나는지를 조사하였다. 분자생물학적 검사로는 서던블랏으로 산자의 게노믹 DNA를 분석하였으며 웨스턴블랏으로 산자 조직의 단백질을 분석하여 GFP 발현 복제돼지임을 확인하였다. 이후 산자의 조직을 실시예 1의 방법으로 배양하여 세포주를 확립한 후 현미경의 자외선 필터을 이용하여 GFP 단백질이 발현됨을 확인하였다. GT 제거된 복제돼지의 유전자 분석은 분자생물학적 방법으로 서던블랏으로 산자의 DNA를 분석하여 GT 제거된 복제돼지임을 확인하였다.Each transgenic litter produced in Example 13 was genetically analyzed by visual and molecular biological methods. GFP expression The cloned pigs were analyzed for GFP expression and transduction through Southern blot, Western blot and cell culture using external observation and tissue. The expression of GFP was visually observed by examining the skin tissues, oral tissues, and tongues of the litters to see if green color appeared. As a molecular biological test, the genomic DNA of the litter was analyzed by Southern blot, and the protein of the litter tissue was analyzed by Western blot to confirm that it was a GFP expression cloned pig. Thereafter, the tissues of the litter were cultured by the method of Example 1 to establish a cell line, and the GFP protein was expressed using a microscopic ultraviolet filter. Genetic analysis of GT-removed cloned pigs was confirmed by GT-removed cloned pigs by analyzing the DNA of the litter with Southern blot by molecular biological methods.
이상에서와 같이, 본 발명은 체세포에서 GFP유전자를 도입 또는 GT유전자 제거시킨 후, 상기 체세포를 핵이식 복제기술을 접목하여 GFP유전자가 발현되는 돼지 또는 GT 제거된 돼지를 제공함으로써, 질환모델동물의 생산가능성 및 초급성 면역거부반응없이 인체에 이식 가능한 장기공급 동물의 생산 가능성을 제공한다.As described above, the present invention by introducing a GFP gene in a somatic cell or GT gene removal, by combining the somatic cell nuclear transfer cloning technology to provide a pig or GT removed pig expressing a GFP gene, the disease model of animals Producibility and production of organ-supply animals implantable in the human body without superimmune rejection.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 있어서, 이러한 기술을 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the content of the present invention in detail, for those skilled in the art, such a technology is only a preferred embodiment, the actual scope of the present invention is the appended claims and their equivalents. It will be defined by.
Claims (15)
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Cited By (3)
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| KR100846647B1 (en) * | 2005-10-31 | 2008-07-16 | 닛토덴코 가부시키가이샤 | Spiral separation membrane element |
| WO2015072760A1 (en) | 2013-11-13 | 2015-05-21 | Konkuk University Industrial Cooperation Corp. | Recombination activating gene 2 gene targeting vector, production of scid-like miniature pigs by talen-mediated gene targeting and use thereof |
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-
2001
- 2001-12-29 KR KR1020047010333A patent/KR20040074108A/en not_active Application Discontinuation
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| US9807987B2 (en) | 2013-11-13 | 2017-11-07 | Konkuk University Industrial Cooperation Corp. | Recombination activating gene 2 gene targeting vector, production of SCID-like miniature pigs by TALEN-mediated gene targeting and use thereof |
| US10058079B2 (en) | 2013-11-13 | 2018-08-28 | Konkuk University Industrial Cooperation Corp. | Interleukin 2 receptor gamma gene targeting vector, production of immune cell-deficient transgenic cloned mini pig having vector introduced therein, preparation method therefor and use thereof |
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