KR20040065567A

KR20040065567A - 재조합 인간 에리트로포에틴의 크로마토그래피 정제

Info

Publication number: KR20040065567A
Application number: KR10-2004-7008088A
Authority: KR
Inventors: 페터 알리거; 노르베르트 팔마
Original assignee: 산도즈 게엠베하
Priority date: 2001-11-28
Filing date: 2002-11-26
Publication date: 2004-07-22
Also published as: ES2525945T3; WO2003045996A1; JP2005518196A; IL161855A0; HRP20040476A2; HUP0500061A2; BR0214568A; US20060099674A1; EP1453857B1; CA2466627A1; NO20042185L; AU2002356733A1; MXPA04005189A; ZA200403461B; CN1596268A; JP4293908B2; SI1453857T1; RU2004119818A; NZ533083A; EP1453857A1

Abstract

본 발명은

(a) 디스크 적층 분리기를 사용하여 원심분리한 후에 심층 여과 단계로 숙주 세포, 세포 구성성분 및 파편을 세포 배양 배지로부터 제거하여 청정화된 배양 배지 상청액을 수득하는 단계;

(b) 상청액의 전도도를 5 mS/cm 이하로 조정하고, pH를 약 7.0 내지 8.0으로 조정하는 단계;

(c) 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함하는 칼럼에 단계 (b)로부터의 상청액을 가하고, 칼럼을 세척하고, 칼럼으로부터의 rhEpo를 용리하고, rhEpo를 함유한 피크 분획(들)을 수집하는 단계;

(d) 매질 압력 (< 10 바아) 하에 유출될 수 있고 고농도의 NaOH에 내성인 폴리스티렌 수지, 예컨대 소스 30RPC를 사용하여 단계 (c)로부터의 합한 피크 분획을 역상 크로마토그래피 단계로 처리하며 rhEpo를 유기 용매의 선형 구배를 사용하여 용리하는 단계;

(e) rhEpo를 함유하며 단계 (d)에서 용리된 하나 이상의 분획을 Q-Seph HP 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함하는 칼럼에 가하고, 칼럼을 세척하고, 선형 염 구배를 사용하여 rhEpo를 용리하는 단계;

(f) rhEpo를 함유하며 단계 (e)에서 용리된 하나 이상의 분획을 rhEpo의 시알릴화 정도에 기초하여 선별하는 단계; 및

(g) 수퍼덱스 75 프렙 그레이드를 사용하는 1회 이상의 크기별 배제 크로마토그래피 단계에 의해 rhEpo를 함유하며 단계 (f)에서 용리된 하나 이상의 분획을 처리하여 잠재적인 이량체 및 더 고도의 응집체를 제거하고; rhEpo를 함유한 용리액을 수집하는 단계

를 포함하는, 숙주 세포를 포함하는 세포 배양 배지로부터의 재조합 인간 에리트로포에틴 (rhEpo)의 회수 및 정제 방법을 제공한다.

Description

재조합 인간 에리트로포에틴의 크로마토그래피 정제 {Chromatographic Purification of Recombinant Human Erythropoietin}

에리트로포에틴은 적혈구 전구 세포의 증식 및 분열 및 순환 적혈구의 생리학상 수준의 유지를 조절하는 주요 호르몬이다. 태아에서 Epo는 간에서 주로 생산되고, 그 생산의 약 90％는 생후에 신장으로 바뀌어진다. 만성 또는 급성 신부전증 때문에 Epo 수준이 떨어질 경우 Epo는 빈혈 발병을 예방하기 위해 외부에서 투여되어야 한다. 치료 활성 인간 에리트로포에틴은 설치류 세포에서의 Epo 유전자 발견 및 그의 발현 이후에 사용가능하였다.

인간 Epo 유전자는 계산 분자량이 18396 달톤인 27개 아미노산의 신호 펩티드 및 166개 아미노산의 단백질을 코딩한다. 숙성 단백질은 보통 1개 아미노산의 N-말단 결실을 가지고, 길이가 165개 아미노산이다. 신호 서열은 3개의 N-글리코실화 부위 및 1개의 O-글리코실화 부위를 갖는 숙성 단백질로 유도하며 적절한 글리코실화와 관련된 세포 구획으로 펩티드를 향하게 한다. 총 분자량의 약 40％인 당 잔기가 Epo의 완전 생물학적 활성에 대해 필수적이다. 몇몇 연구는 시험관내 활성, 즉 수용체에 대한 결합이 비- 또는 부분-글리코실화 형태에서 최고일지라도 말단 시알산 잔기 수가 생체내 반감기에 대해 양성 효과를 가진다는 것을 나타낸다 (Takeuchi and Kobata, 1991, Glycobiology 1(4): 337-346). 시알릴화의 정도는 반감기에 직접적으로 비례하며, 여기서 시알산을 덜 갖는 이소형은 유기체로부터 매우 더 빨리 제거되므로 덜한 활성을 나타낸다.

높은 활성 재조합 에리트로포에틴을 생산하는 목적은 잘 최적화된 발효 방법 및 선택적인 정제 프로토콜로 높은 정도의 말단 시알산 잔기를 갖는 생성물을 생성하는 것이다.

상이한 공급원로부터의 Epo의 정제에 대해 다수의 문헌이 있다. 에리트로포에틴의 클로닝 및 재조합 DNA 기술의 사용 전에, 대부분의 기술된 정제는 인간 뇨를 천연 공급원으로 사용하였다. Epo 정제에 대한 하기 프로토콜 모두는 정의된 이소형의 축적에 대한 강조 없이 순수한 생성물로 끝난다. 문헌 (T. Miyake et al., 1977, J. Biol. Chem 252(15): 5558-5564)에는 이온-교환 크로마토그래피, 에탄올 침전, 겔 여과 및 흡수 크로마토그래피를 포함하는 7 단계 절차에 의한 뇨 Epo의 정제가 기재되어 있다. 인간 뇨로부터 Epo를 정제하기 위해 음이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과, 렉틴 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 사용하는 상이한 절차가 문헌 (N. Inoue et al., 1994, Biol. Pharm. Bull., 17(2): 180-184)에 기재되어 있다. 뇨는 또한 문헌 (G. Krystal et al., 1986, Blood, 67(1):71-79)에서 Affi-블루, 크로마토포커싱, 렉틴-크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 분취 SDS-PAGE를 사용하는 5 단계 정제에 대한 공급원이다. 상기 정제 단계의 상이한 조합은 문헌 (H. Yianagi et al., 1987, J. Chromatogr.417: 178-182)에 공개되어 있다. 그의 하류-프로세싱 (DSP) 프로토콜은 뇨를 에탄올 침전, 2단계 렉틴-크로마토그래피, 수산화인회석 및 역상 크로마토그래피로 정제하는 것으로 시작한다.

문헌 (V. Broudy et al., 1988, Arch. Biochem. Biophys. 265(2): 329-336)에서는 형질감염된 BHK 세포주를 사용하여 Affi-Gel 블루 크로마토그래피 , 음이온-교환 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피로 에리트로포에틴을 정제한다. 정제된 Epo는 특정 이소형에 대해 풍부하지 않다.

문헌 (A.B. Ghanem, 1994, Prep. Biochem. 24(2): 127-142 및 A. Gokana et al., 1997, J. Chromatogr. 791: 109-118)에서는 친화성 크로마토그래피 단계 후에 DEAE-Sephacel을 사용하여 B-임파양 세포주에서 생성된 이소형의 에리트로포에틴을 분리하였다. 등전점 집속으로 정제된 생성물을 분석하였지만, 분획을 정의된 이소형과 합하지는 않았다.

문헌 (J. Burg et al., WO99/28346)에는 탄수화물 구조의 4-안테나 가지 및(또는) N-아세틸-락토스아민 유닛에 대해 높은 정도로 Epo를 정제하였다. DSP 서열은 세포 배양 상청액으로 시작하고, 친화성 크로마토그래피로 포획하고, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 수산화인회석 및 역상 크로마토그래피로 정제한다. 이 절차의 결점은 블루-세파로스 캡처 매트릭스의 시바크론 블루 3G 다이-리간드(Cibacron Blue 3G dye-ligand)의 가능성 있는 누출, HIC 단계에 의한 숙주 세포 단백질의 다소 약한 분리 및 NaOH에 의해 위생에 안정하지 않은 실리카 기재 RPC 수지이다.

<발명의 요약>

본 발명은

(a) (i) 원심분리에 이어지는 심층 여과 단계, (ii) 심층 여과 단계, 및 (iii) 원심분리로 이루어진 군으로부터 선택되는 절차를 수행함으로써 숙주 세포, 세포 구성성분 및 파편을 세포 배양 배지로부터 제거하여 청정화된 배양 배지 상청액을 수득하는 단계;

(c) 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함하는 칼럼에 단계 (b)로부터의 상청액을 가하고, 칼럼을 세척하고, 칼럼으로부터의 재조합 인간 에리트로포에틴 (rhEpo)을 용리하고, rhEpo를 함유한 피크 분획(들)을 수집하는 단계;

(d) 매질 압력 (< 10 바아) 하에 유출될 수 있고 고농도의 NaOH에 내성인 수지를 사용하여 단계 (c)로부터의 합한 피크 분획을 역상 크로마토그래피 단계로 처리하며 유기 용매의 선형 구배를 사용하여 rhEpo를 용리하는 단계;

(e) 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함하는 칼럼에 rhEpo를 함유하며 단계 (d)에서 용리된 하나 이상의 분획을 가하고, 칼럼을 세척하고, 선형 염 구배를 사용하여 rhEpo를 용리하는 단계;

(g) 겔 여과 매질을 사용하는 1회 이상의 크기별 배제 크로마토그래피 단계에 의해 rhEpo를 함유하며 단계 (f)에서 용리된 하나 이상의 분획을 처리하여 잠재적인 이량체 및 더 고도의 응집체를 제거하고; rhEpo를 함유한 용리액을 수집하는 단계

본 발명은 매우 순수한 형태로 당형 (glycoform)의 정의된 조성물을 갖는, 즉 적은 양의 숙주 세포 단백질을 갖는 재조합 인간 에리트로포에틴 (Epo)의 제조 방법에 관한 것이다. 이는 분리된 이소형 (isoform)을 정량하는 분석 수단과 조합하는 특정 순서의 정제 단계로 달성된다.

강직하고 1 M NaOH 또는 아세트산을 포함하는 작업 장소에서 거친 세정을 견디는 최신 중합체성 수지의 사용을 가능하게 하는 신규 정제 프로토콜을 개발하였다. 또한, 이들 수지는 높은 결합능을 가지고, 생산 규모에서 효율적인 공정에 대한 높은 유속을 가능하게 한다. 잠재적으로 누출가능한 리간드를 갖는 수지, 예컨대 환자에 대한 문제를 내포할 수 있는 렉틴 또는 염료는 사용되지 않는다.

이행되는 정제 단계는 숙주 세포로부터의 소량의 단백질 또는 DNA를 갖는 매우 순수한 생성물을 유도하는 상이한 선택력을 갖는다. 또한, 본원에 약술된 바와 같이 본 발명에 따른 정제 방법에서 몇몇, 바람직하게는 3 이상의 크로마토그래피 단계가 개개의 이소형을 분리하는 잠재력을 가진다. 특히, 제2 음이온-교환 크로마토그래피 단계 (즉, 단계 (e), 하기 참조)의 분획을 CZE [모세관 구역 전기영동]로 분석하고, 합치고, 추가로 최종 겔 여과 크로마토그래피로 가공될 수 있다. 변법으로 또는 추가로, 역상 크로마토그래피 단계 (즉, 단계 (d), 하기 참조)의 분획을 CZE로 분석하고, 그에 따라서 처리될 수 있다. 또다른 가능성은 (변법으로 또는 추가로) 제1 음이온-교환 크로마토그래피 (즉, 단계 (c), 하기 참조)를 수행함으로써 수득한 분획으로 CZE를 수행하는 것이다. CZE를 사용하여, 분석될 분획(들) 중에 이소형의 혼합물 또는 조성물로서 함유되는 글리코실화 단백질 또는 폴리펩티드를 특정 이소형으로 분리한다. 공지된 이소형 표준, 특히 글리코실화 패턴에 대한 표준, 예컨대 시알릴화 패턴과 비교하여, CZE로 분리한 이소형 각각에 특정 구조를 지정할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 이는 공급원의 품질에 독립적인 고도로 글리코실화된 이소형의 정의된 조성물을 갖는 분획 풀을 생성한다. 더 일반적으로, 본 발명의 절차에서 CZE가 단백질 또는 폴리펩티드 그 자신의 성질에 독립적으로 단백질 또는 폴리펩티드의 글리코실화 이소형을 포함하는 단백질성 조성물 생산에 유익한 수단으로 확립된다. 따라서, 본 발명은 글리코실화 단백질 또는 폴리펩티드의 이소형의 정의된 조성물의 생산에 분석 수단으로서 CZE의 용도를 제공한다. 특히, 이러한 사용은 재조합 인간 에리트로포에틴의 정의된 이소형 조성물의 생산에 유익하게 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 글리코실화 단백질 또는 폴리펩티드, 특히 재조합 인간 에리트로포에틴의 정의된 이소형 조성물의 생산 방법을 포함하며, 상기 방법은 글리코실화 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 이소형을 포함하는 샘플 (크로마토그래피 정제 단계의 분획일 수 있음)을 CZE를 사용하여 분석하는 것을 포함하고, 경우에 따라 이러한 글리코실화 단백질 또는 폴리펩티드의 정의된 이소형(들)을 함유하는 이러한 샘플을 풀링하는 것을 포함하며,특히 여기서 글리코실화 단백질 또는 폴리펩티드의 상기 이소형은 재조합 인간 에리트로포에틴의 이소형이다.

또한, 이 방법은 전단 응력 및 세포 융해를 감소시키고, 잔여 프로테아제가 활성이 아니고 생성물에 유해하지 않는 조건을 사용하여 제1 분리 동안 단지 매우 소량의 세포 프로테아제를 유리하도록 디자인된다. 이는 밀봉 디자인된 디스크 적층 원심분리기로 세포 분리하여 세포를 무손상으로 유지하는 제1 단계와, 중성 pH에서 작동하는 음이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 포획하는 제2 단계로 달성된다. pH 6 미만은 내생의 낮은 pH 활성 프로테아제에 의한 절단을 발생시킬 것이다.

마지막으로, 하류 프로세싱 (DSP) 순서에서 몇몇 단계는 바이러스 제거 및(또는) 불활성화에 강하다. 이는 바이러스 오염을 불가능하게 할 수 없기 때문에 포유류 세포 유래 치료법에 중요한 요건이다. 이행되는 나노-여과는 특히 심지어 매우 적은 및 비-외피보유 바이러스, 예컨대 파르보바이러스 (parvovirus)의 제거를 돕는다. 역상 크로마토그래피 동안 및(또는) 후의 용매 노출은 외피보유 바이러스의 불활성화를 유도하는 또다른 강한 단계이다.

따라서, 본 발명은

바람직하게는, 단계 (a)의 원심분리를 디스크 적층 분리기를 사용하여 수행한다.

바람직한 실시양태에서, 단계 (b)의 전도도를 2 내지 5 mS/cm, 바람직하게는 약 3 mS/cm로 조정한다.

유리하게는, 단계 (c)에 사용되는 음이온 교환 매질은 BioSepra로부터 입수가능한 세라믹-기재 이온 교환 매질 Q-HyperD F (등록상표)이다. 단계 (d)에 사용되는 수지는 유리하게는 약 0.5 M의 NaOH 농도에 내성인 수지이며; 바람직하게는 폴리스티렌 수지이고, 유리하게는 소스 (Source) 30RPC (등록상표) (아머샴 바이오사이언스 (Amersham Biosciences)로부터 입수가능함)인 반면, 단계 (e)에 사용되는 음이온 교환 매질은 바람직하게는 세파로스 음이온 교환 크로마토그래피 매질이고, 유리하게는 Q 세파로스 하이 퍼포먼스 (Sepharose High Performance) (등록상표) (아머샴 바이오사이언스로부터 입수가능함)이다. 단계 (g)에 사용되는 겔 여과 매질은 바람직하게는 수퍼덱스 75 프렙 그레이드 (Superdex 75 prep grade (등록상표)) (아머샴 바이오사이언스로부터 입수가능함)이다.

바람직한 실시양태에서, 단계 (d) 전에 바람직하게는 합쳐질 수 있는 단계 (c)로부터의 피크 분획을 황산암모늄 침전 단계로 처리하여 오염 숙주 세포 단백질을 침전시키며, 이어서 상청액의 황산암모늄 농도를 단계 (d)에 적합한 농도로 조정한다. 단계 (d)의 역상 칼럼을 적하하기 전에, 이러한 농도는 바람직하게는 0.24 M 미만의 황산암모늄이다.

전형적으로, pH를 단계 (b)에서 약 pH 7.5로 조정한다. 바람직하게는, 단계 (c)의 세척을 적절한 수성 완충액, 예컨대 NaCl과 같은 염을 포함하는 Tris 완충액으로 수행한다. 바람직한 실시양태에서, pH가 7.5이고 50 mM NaCl을 포함하는 20 mM Tris 완충액을 사용한다. 용리는 마찬가지로 적절한 수성 완충액, 예컨대 NaCl과 같은 염을 포함하는 Tris 완충액으로 수행한다. 단계 (c)의 용리 단계를 일반적으로 100 mM 내지 1 M, 특히 125 mM 초과, 바람직하게는 150 mM의 염 농도를 갖는 완충액을 사용하여 수행한다. 바람직한 실시양태에서, pH가 7.5이고 150 mM NaCl을 포함하는 20 mM Tris 완충액을 이 용리 단계에 사용한다. 단계 (d)의 유기 용매는 바람직하게는 아세토니트릴, 에탄올 및 헥실렌 글리콜 (즉, 2-메틸-2,4-펜탄디올)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 아세토니트릴이 가장 바람직하다. 바람직하게는, 에리트로포에틴을 포함하는 분획을 역상 크로마토그래피에 가하기 전에, 분획을 유기 용매, 바람직하게는 아세토니트릴을 포함하는 20 mM Tris/HCl, pH 7.0과 같은 수성 완충액으로 희석한다. 역상 칼럼 상에 희석된 분획을 가한 후에, 바람직하게는 칼럼을 유기 용매, 바람직하게는 아세토니트릴을 포함하는 20 mM Tris/HCl, pH 7.0과 같은 수성 완충액으로 세척한다. 바람직하게는, 단계 (d)에서 Epo 폴리펩티드를 약 10％ 내지 약 100％의 유기 용매의 선형 구배를 사용하여 용리한다. 그의 특히 바람직한 실시양태에서, 단계 (d)에서 전형적으로 약 25％ 내지 50％의 아세토니트릴의 선형 구배를 용리에 사용한다. 단계 (e)의 선형 염 구배는 전형적으로 0 내지 300 mM이다. 바람직하게는, 단계 (c) 및 (e)의 염은 NaCl이다.

본 발명의 일 실시양태에서, 유기 용매, 바람직하게는 아세토니트릴을 포함하는, 단계 (d)에서 용리된 분획을 하기 음이온 교환 크로마토그래피 단계와 상용가능한 적절한 수성 완충액으로 희석한다. 바이러스 오염물을 불활성화시키기 위해, 단계 (e) 전에 희석한 분획을 이러한 바이러스 오염물의 목적하는 불활성화를 달성하기에 충분히 적절한 양의 시간 동안 방치해둔다. 예를 들면, 분획을 수성 완충액 (특히, 20 mM Tris/HCl, pH 7.0)으로 그의 0.5 용적으로 희석하고, 약 20분 이상 약 40분 이하, 또는 심지어 더 길게 인큐베이션하고, 이어서 추가로 수성 완충액으로 분획의 원래 용적의 3.5 부피로 희석할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단계 (a)에서 임의의 절차 (i), (ii) 또는 (iii) 후에 멸균 여과 단계가 이어진다. 전형적으로, 이는 2 ㎛ 여과 유닛을 사용하여 수행한다.

본 발명의 추가로 실시양태에서, 본 발명의 공정 동안 크로마토그래피 칼럼으로부터 유래된 분획을 특히 농축을 위해 한외여과 단계로 처리를 할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 단계 (g)에서 분획을 크기별 배제 크로마토그래피 단계 전에 한외여과 단계로 처리한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (d)에서 분획을 역상 크로마토그래피 전에 한외여과 단계로 처리한다. 마찬가지로 바람직한 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이 본 발명의 공정이 황산암모늄 침전 단계를 포함하는 경우, 단계 (c)로부터의 단일 또는 합해진 피크 분획을 이러한 황산암모늄 침전 단계 전에 한외여과 단계로 처리한다. 바람직하게는, 본원에 기재된 3개의 한외여과 단계 모두를 본 발명의 방법에 사용한다. 예를 들면, 5 kDa 내지 10 kDa, 예를 들면 10 kDA 컷오프, 바람직하게는 5 kDa 컷오프를 갖는 막을 이러한 한외여과 공정에 사용할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 데드-엔드 나노-여과 단계가 단계 (g) 전 또는 바람직하게는 단계 (g) 후에 바이러스를 제거하기 위해 포함된다. 유닛의 실례에는 플라노바 (Planova) 15N (아사히 (Asahi)), PALL 울티포 VF 그레이드 DV20 (Ultipor VF Grade DV20) 또는 밀리포어 비레솔브 (Millipore Viresolve) NFP 카트리지 또는 캡슐이 포함된다.

상기 논의된 바와 같이, 정제 단계 동안 바람직한 이소형을 선별할 수 있는 것이 바람직하고, 이는 본 발명의 정제 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 구체적으로, 이는 상이한 이소형이 역상 크로마토그래피 단계 및 제2 음이온 교환 크로마토그래피 단계 모두 동안 용해되기 때문에 달성될 수 있다. 상이한 분획의 함량은 공정의 대조군으로서 모세관 구역 전기영동에 의해 측정되고, 적절하게 합해지거나 또는 제거되는 분획을 선별할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술된 바와 같이 하나 이상의 단계 (f)의 선별 절차 또는 단계 (d) 내지 단계 (e)의 선별 절차를 상기 약술된 바와 같이 모세관 구역 전기영동을 사용하여 수행한다.

본 발명의 맥락에서, 바람직하거나 또는 본원에 기재된 특정 실시양태는 각각 다른 것과 합해질 수 있으며, 그에 의해 그의 추가로 바람직한 실시양태를 만들 수 있다.

따라서 바람직한 실시양태에서, 본 발명은

(a) (i) 디스크 적층 분리기를 사용하는 원심분리에 이어지는 심층 여과 단계, (ii) 심층 여과 단계, 및 (iii) 원심분리로 이루어진 군으로부터 선택되는 절차를 수행하며, 각각의 절차 후에 0.2 ㎛ 여과 단계를 수행함으로써 세포 배양물을수확하고, 숙주 세포, 세포 구성성분 및 파편을 배양 배지로부터 제거하여 청정화된 배양 상청액을 수득하는 단계;

(c) Q-HyperD F로 충전된 음이온 교환 칼럼에 단계 (b)로부터의 상청액을 가하고, 칼럼을 세척하고, 칼럼으로부터의 rhEpo를 용리하고, rhEpo를 함유한 피크 분획(들)을 수집하는 단계; 및

(d) 매질 압력 (< 10 바아) 하에 유출될 수 있고 NaOH CIP 조건에 내성인 폴리스티렌 수지, 예컨대 소스 30RPC를 사용하여 단계 (c)로부터의 합한 피크 분획을 역상 크로마토그래피 단계로 처리하며 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 rhEpo를 용리하는 단계; 및

(e) rhEpo를 함유하며 단계 (d)에서 용리된 하나 이상의 분획을 rhEpo의 시알릴화 정도에 기초하여 선별하고, 상기 분획을 Q-세파로스 HP로 충전된 고성능 음이온 교환 칼럼에 가하고, 칼럼을 세척하고, 선형 염 구배를 사용하여 rhEpo를 용리하는 단계; 및

(f) rhEpo를 함유하며 단계 (e)에서 용리된 하나 이상의 분획을 rhEpo의 시알릴화 정도에 기초하여 선별하고, 상기 분획을 수퍼덱스 75 프렙 그레이드를 사용하는 크기별 배제 크로마토그래피에 적용시켜 잠재적인 이량체 및 더 고도의 응집체를 제거하고; rhEpo를 함유한 용리액을 수집하는 단계

를 포함하는, 수확된 세포 배양으로부터의 재조합 인간 에리트로포에틴 (rhEpo)의회수 및 정제 방법을 제공한다

바람직하게는, 단계 (d) 및 단계 (e)에서 각각 수득한 하나 이상의 분획이 추가 크로마토그래피 정제를 위해 단계 (e) 및(또는) 단계 (f)에서 각각 선택될 수 있는지의 결정은 모세관 구역 전기영동에 의해 결정된다. 견본으로서, rhEpo의 더 고도의 글리코실화 형태가 RPC 단계에서 제1 절반의 용리 피크에 존재하는 반면 Q 세파로스 HP 단계에서 고도의 글리코실화 및 시알릴화된 이소형은 제2 절반의 용리 피크에 존재하는 것으로 나타났다. 상기 약술된 바와 같이, 바람직한 실시양태에서 단계 (d) 전에 단계 (c)로부터의 합한 피크 분획을 황산암모늄 침전 단계로 처리하여 오염 숙주 세포 단백질을 침전시키고, 상청액의 황산암모늄 농도를 이어서 단계 (d)와 상용될 수 있는 농도로 조정한다. 바람직하게는, 상기 농도가 0.24 M 미만의 황산암모늄이다. 마찬가지로 이 문맥에서 바람직하게는, 본 발명의 바람직한 방법은 단계 (f) 전 또는, 바람직하게는 단계 (f) 후에 바이러스를 제거하기 위해 데드-엔드 나노-여과 단계를 추가로 포함한다.

정제 절차에 대한 공급원 물질에 관하여, 숙주 세포가 혈청-무함유 배양 배지에서 배양되는 것이 바람직하다. 숙주 세포는 불연속 공급 배치 발효 공정을 사용하여 배양되는 것이 또한 바람직하다. 특히, 숙주 세포는 재조합 인간 에리트로포에틴을 발현하고, 에리트로포에틴을 배양 배지 내로 유리할 수 있다. 숙주 세포는 일반적으로 포유류 세포이다. 바람직한 숙주 세포는 CHO 세포이다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산되는 정제된 재조합 인간 에리트로포에틴을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 정제된 재조합 인간 에리트로포에틴 및 상기 정제된 에리트로포에틴을 포함하는 조성물, 특히 제약 조성물을 추가로 제공한다.

바람직하게는, 조성물은 rhEpo의 글리코실화/시알릴화 이소형의 정의된 함량을 가진다. 이는 상이한 형태가 역상 크로마토그래피 단계 및 제2 음이온 교환 크로마토그래피 단계 모두 동안 용해되기 때문에 달성될 수 있다. 상이한 분획의 함유물은 모세관 구역 전기영동에 의해 공정의 대조군으로서 측정되고, 선별된 분획을 적절하게 합하거나 또는 제거할 수 있다. 특히, 제1 절반의 용리 피크는 이것이 더 고도의 글리코실화 형태가 존재하는 곳이기 때문에 RPC 단계로부터 풀링된다. 대조적으로, Q 세파로스 HP 단계에서의 제2 절반의 용리 피크는 전형적으로 고도로 글리코실화 및 시알릴화된 이소형을 함유한다.

바람직하게는 본 발명의 방법을 사용하여 발현되고 정제된 재조합 폴리펩티드, 특히 Epo를 포함하는 조성물에서 재조합 폴리펩티드는 순도 90％, 95％, 99％ 또는 99.5％ 이상과 같이 실질적으로 순수하다.

정제된 단백질의 생물학적 활성은 시험관내 및(또는) 생체내에서 측정될 수 있다. 적합한 시험관내 시험은 적혈구 세포주의 증식 자극 시험과 관련된 문헌 (Hammerling et al., 1996, J Pharm Biomed Anal 14(11):1455-69)에 기재되어 있다. 적합한 생체내 시험은 적혈구증가증 마우스의 적혈구 내로의⁵⁹Fe의 도입 측정과 관련된 문헌 (Ghanem et al., 1994, 상기문헌)에 기재되어 있다.

바람직한 측면에서, 본 발명은 (a) (i) 목적하는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및 (ii) 선별가능 마커를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열 (여기서, 제2 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포가 선별제와 접촉될 때 증폭됨)을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터, 및 (b) 제2 뉴클레오티드 서열이 상이한 선택가능 마커를 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열로 교체되는 것 이외에 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 제1 폴리뉴클레오티드 벡터로서 갖는 제2 폴리뉴클레오티드 벡터를 포함하며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 벡터 및 제2 폴리뉴클레오티드 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 핵산 벡터 및 숙주 세포를 사용하여 수행될 수 있다.

바람직하게는 숙주 세포는 포유류 세포, 더 바람직하게는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.

바람직하게는 제2 뉴클레오티드 서열은 디히드로폴레이트 환원효소 폴리펩티드를 코딩하고, 선별제는 메토트렉세이트이다. 바람직하게는 목적하는 재조합 폴리펩티드는 인간 에리트로포에틴이다. 이러한 시스템은 본원의 실시예 부분에 기재되어 있다.

세포는 유리하게는 (a) 목적하는 재조합 폴리펩티드를 코딩하고 숙주 세포에서 목적하는 재조합 폴리펩티드의 발현을 지시하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공하고; (b) (i) 물, 식물-유래 펩톤, 몰랄삼투압 조절제, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산, 지질 공급원 또는 전구체, 철 공급원, 비철 금속 이온 및 하나 이상의 비타민 및 보조인자를 포함하고; (ii) 임의의 전장 폴리펩티드를 포함하지 않는 혈청-무함유 배양 배지를 제공하고; (c) 목적하는 재조합 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 배양 배지에서 숙주 세포를 배양함으로써 배양된다.

바람직하게는 목적하는 재조합 폴리펩티드는 인간 에리트로포에틴이다. 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포일 수 있다. 이러한 기술은 본원의 실시예 부분에 기재되어 있다.

달리 정의되어있지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 (예컨대, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 혼성화 기술 및 생화학 분야에서) 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 표준 기술은 분자 유전학적 및 생화학적 방법 (일반적으로, 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nded. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4^thEd, John Wiley & Sons, Inc. - and the full version entitled Current Protocols in Molecular Biology) 참조, 이는 본원에 참조로 인용됨) 및 화학 방법에 대한 표준 기술을 사용한다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 기술되며, 이 실시예는 단지 설명을 위한 것이지 이에 제한되지 않는다. 특히, 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 것이다.

재료

숙주 세포주

차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 디히드로폴레이트-환원효소 결핍 (ATCC CRL-9096). 이 세포주를 부다페스트 조약하에 기탁 번호 ATCC PTA-3672로 아메리칸 타입 컬처 콜렉션 (ATCC) (미국 20852 메릴랜드주 록빌 소재)에 2001년 8월 29일자로 기탁하였다.

세포 배양 배지

배양 배지: 4 mM L-글루타민, 10％ FCS, 1 x HT (히폭산틴, 티미딘)를 보충한 DMEM,

선별 배지: 4 mM L-글루타민, 투석된 10％ FCS 및 G418 0.5 ㎎/㎖를 보충한 DMEM

증폭 배지: 4 mM L-글루타민, 투석된 10％ FCS, G418 0.5 ㎎/㎖, 및 4.8 x 10^-8M - 1.54 x 10^-6M MTX (메토트렉세이트)를 보충한 DMEM

동결 배지: 4 mM L-글루타민, 10％ FCS 및 10％ DMSO를 보충한 DMEM.

재조합 세포주용 혈청-무함유 적응 배지: 하기의 것이 보충된 DMEM/햄스 (Ham's) F12 (1:1)

6 mM L-글루타민, 0.25％ 소야(Soya)-펩톤/UF, 1 x 하이브리도마 서플리먼트 (Supplement), 0.1％ Pluronic-F68, G418 0.5 ㎎/㎖, 1.54 x 10^-6M MTX

혈청-무함유 생산 배지: 하기의 것이 보충된 DMEM/햄스 F12 (1:1);

0.25％ 소야-펩톤/UF, 1 x 하이브리도마 서플리먼트, 0.1％ 루트롤(Lutrol), 1.54 x 10^-6M MTX, 글루코스 1 g/ℓ, NaHCO₃2.5 g/ℓ

재조합 세포주용 혈청-무함유 동결 배지: PBS, 20％ PVP-10, 5％ DMSO, 하이브리도마 서플리먼트 (x 100) 2.5 x 10^-3M 에탄올아민, 2.5 x 10^-2M 구연산철, 2.0 x 10^-3M L-아스코르빈산, 5.0 x 10^-6M 소듐 셀레나이트

플라스미드 작제물

pEpo/neo

이 플라스미드는 Epo 및 네오마이신 내성 유전자의 코딩 영역을 SV40 초기 프로모터/터미네이터 서열의 조절하에 각각 2개의 상이한 발현 카세트로 코딩한다. 작제 세부사항을 실시예 1에서 제공한다.

pEpo/dhfr

이 플라스미드는 Epo 및 dhfr의 코딩 영역을 SV40 초기 프로모터/터미네이터 서열의 조절하에 각각 2개의 상이한 발현 카세트로 코딩한다. 작제 세부사항을 실시예 2에서 제공한다.

세포 배양 방법

CHO-dhfr ^- 의 성장

디히드로폴레이트 환원효소 결핍 CHO 세포 (Urlaub et al., 1980, PNAS 77(7):4216-4220) (CHO dhfr로서 칭함)를 1주에 2회로 분할률 1:10으로 DMEM 배양 배지에서 배양하였다.

CHO 세포의 형질감염

리포펙틴 (lipofectin) 형질감염을 수행하기 1일 전에 1 ㎠ 당 1 내지 5 x 10⁴세포를 25 ㎠ T-플라스크 병 또는 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 상응하는 플라스미드를 적절한 비율로 혼합하고, 제조자 프로토콜에 따라 리포펙틴 제제 (GIBCO/BRL) (0.5 내지 1 ㎕/㎠)에 첨가하였다. 이어서, 4 내지 16시간 동안 혈청-무함유 DMEM에서 형질감염 칵테일로 세포를 오버레이한 후에, DNA-함유 배지를 배양 배지로 교환하였다. 24 내지 48시간 동안 혈청-함유 배지에서 배양한 후에 세포를 선별 배지로 교체하였다. 형질감염된 세포 풀을 먼저 선별 배지에서 배양하여 전면생장시키고, 이어서 증폭 배지 (4.8 x 10^-8M MTX)에서 배양한 후에 Epo 생산을 위해 ELISA로 세포 배양 상청액을 스크리닝하였다. 최고의 생산자를 결정하였으며, MTX 농도가 2배 증가하였고, 최고 생산자를 추가로 배양에 사용하였다.

분석 방법

ELISA에 의한 상이한 매트릭스의 Epo 탐지

항체

폴리클로날 혈청: 비오티닐화된 래빗 항 Epo (R&D 시스템; 카탈로그 # AB-286-NA)

모노클로날 항체: 마우스 항 Epo (게네자임 (Genezyme); Cat. 코드 AE7A5)

ELISA 완충액

코팅 완충액: NaHCO₃8.4 g/ℓ, Na₂CO₃4.2 g/ℓ, pH 9.6 내지 9.8

세척 완충액: KCl 0.2 g/ℓ, Na₂HPO₄x 2H₂O 1.15 g/ℓ, KH₂PO₄0.2 g/ℓ, NaCl 8 g/ℓ, 0.1％ 트윈 (Tween) 20

희석 완충액: 세척 완충액 중의 2％ PVP (시그마 (Sigma) Cat.No. PVP-4OT)

샘플 완충액: 희석 완충액 중의 0.5％ 알파 모노-티오-글리세롤

염색 완충액: 시트르산 x 2H₂O 7.3 g/ℓ, Na₂HPO₄x 2H₂O 11.86 g/ℓ, pH 4.8 내지 5.0

염색 용액: OPD 용액 100 ㎕/염색 완충액 10 ㎖

H₂O₂5 ㎕/염색 완충액 10 ㎖

OPD 저장-용액: PP: L0017

방법

ELISA 방법을 사용하여 Epo를 농도 범위 ng/㎖로 탐지하며, 특히 탐지 한계가 약 10 ng/㎖의 범위이고, 500 ng/㎖ 및 8개의 2배 희석물로 시작하였다. Epo의 제1의 26개 아미노산에 대한 하나의 모노클로날을 코팅 층으로서 기능하며, Epo와 결합하였다. 다음 단계에서 Epo는 캐처 항체에 의해 특이적으로 결합되었다. 래빗 항혈청을 인식하는 비오티닐화된 Epo를 통해 탐지하였다. 스트렙타비딘-퍼옥시다제를 플레이트에 커플링한 후에 OPD로 염색하여 시각화를 수행하였다.

면역형광

Epo 발현 CHO-세포를 6-웰 플레이트 중의 커버 슬립 상에 5 x 10⁴세포/200 ㎕로 접종하고, 24 내지 72시간 동안 인큐베이션하였다. 점착성 세포를 PBS로 2회세척하고, 5분 동안 -20 ℃의 메탄올로 고정하고, 이어서 통풍 건조시킨 후에, 다시 PBS에 젖셨다. 비특이적 단백질을 PBS 중의 20％ FCS를 사용하여 15분 동안 인큐베이션하여 포화시키고, 이어서 항-Epo를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응을 컨쥬게이트된 항-마우스 IgG FITC로 시각화시켰다. 형광을 공초점 현미경으로 488 nm의 여기 파장 및 515 nm보다 더 높은 방출 파장에서 탐지하였다.

핵 크기 측정

재료

쿨터 카운터 (Coulter Counter (등록상표)) 모델 ZM (쿨터 일렉트로닉스 인크. (Coulter Electronics Inc.))

쿨터 채널라이저 (Coulter Channelyzer (등록상표)) 모델 256

인큐베이션 용액: 0.1M 시트르산, 2％ 트리톤 X 100,

일렉트롤라이트 아이소톤 (Electrolyte Isoton) II (Kat-No.844 8011; 쿨터 유로 다이어그노스틱 게엠베하 (Coulter Euro Diagnostic GmbH))

쿨터 카운터로 전기 전도성 유체에 현탁된 입자를 크기 및 수로 정량하였다. 양쪽에 전극을 갖는 모세관을 통해 진공으로 유체를 흡수하였다. 저항의 변화는 쿨터 채널라이저로 계수될 수 있는 전압 임펄스를 유도하였다. 핵 크기는 세포의 DNA 함량과 상호관련되어 염색체의 이배수 내지 다배수 세트 간의 구별이 가능하다.

방법

약 1 x 10⁶CHO-세포를 PBS로 1회 세척하고, 인큐베이션 용액 2 ㎖에 재현탁하고, 4 내지 5시간 동안 방치하였다. 하기 단계는 쿨터 카운터에 특이적이다.

SDS 폴리아크릴아미드-전기영동 및 웨스턴 블로팅

재료

SDS 겔: 4 내지 20％ 노벡스 (Novex) Tris-글리신

샘플 완충액: 2 x Tris 글리신 SDS (노벡스 LC 2676)

유출 완충액: Tris 글리신 SDS (노벡스 LC 2675)

블로팅 완충액: 50 mM Na₂B₄O₇x 10H₂O, 0.1％ SDS, 20％ 메탄올

블로팅 매트릭스: PVDF 임모빌론 (Immobilon) P 0.45 μM 밀리포어; K8JM8238H

세척 완충액: ELISA 세척 완충액 참조

희석 완충액: 세척 완충액 중의 1％ 밀크 파우더

탐지 완충액: 0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-HCl pH 9.5

방법

Epo 함유 샘플을 1％ α-MTG를 갖는 1 x 샘플 완충액 중에서 30 ng/20 ㎕로 조정하고, SDS 겔에 가하였다. 유출 말미에, 단백질을 PVDF 임모빌론 막에 2시간 동안 블로팅하고, 이어서 Epo의 제1의 26개 아미노산을 탐지하는 모노클로날 항체로 Epo를 특이적으로 염색하였다. 알칼리 포스파타제에 컨쥬게이트된 항 마우스 IgG 및 NBT/BCIP 염색으로 시각화하였다.

등전점 집속

재료

시스템: 멀티포르 (Multiphor) II, 아머샴 바이오사이언스

IPG 겔: pH 2.5 내지 7

재팽윤 완충액: 우레아 9 g, CHAPS 0.5 g, DTE 0.04 g, 리솔라이트 (resolyte) (pH 3.5 내지 10) 0.5 ㎖, 브롬페놀-블루 (0.1％) 10 ㎕, H₂O로 25 ㎖로 조정함

샘플 완충액: H₂O 625 ㎕ 중의 IPG 샘플 완충액 25 ㎕ (pH 3 내지 10)

블로팅 완충액: 글리신 2.93 g, Tris 5.81 g, 메탄올 20 ㎖, SDS 0.375 g, H₂O로 1000 ㎖로 조정함

블로팅 매트릭스: PVDF 임모빌론 P 0.45 ㎛ 밀리포어; K8JM8238H

세척 완충액: ELISA 세척 완충액 참조

희석 완충액: 세척 완충액 중의 1％ 밀크 파우더

탐지 완충액: 0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-HCl pH 9.5

방법

Epo 함유 샘플을 500 내지 1000 ng/50 ㎕로 조정하고, 탈염하고, 샘플 완충액에 1:1로 희석하고, 재팽윤된 IPG 겔에 가하였다. 유출 조건은 먼저 1분, 300 V이고, 이어서 선형으로 3500 V로 상승시키고, 마지막으로 1시간, 3500 V로 하였다. 전체 집속 공정 동안 10 mA 및 10 W의 제한을 설정하였다. 이후에, 단백질을 하룻밤 확산 또는 전자블롯으로 PVDF 임모빌론 막에 블로팅하고, 이어서 Epo의 제1의 26개 아미노산을 탐지하는 모노클로날 항체로 Epo를 특이적으로 염색하였다. 컨쥬게이트된 항 마우스 IgG AP 및 NBT/BCIP 염색으로 시각화하였다.

DNA 함량의 측정

재조합 세포주의 DNA 함량을 FACS 분석으로 CHO-dhfr^-숙주 세포주와 비교하였다.

재료

세척-완충액: 0.1 M Tris-HCl, pH 7.4, 2 mM MgCl₂, 0.1％ 트리톤 X100

염색 완충액: 세척 완충액 중의 DAPI (훽스트 (Hoechst)) 0.3 ㎍/㎖

방법

5 x 10⁵세포를 PBS로 세척하고, 빙냉 70％ 에탄올로 고정하였다. 이후에, 세포를 세척 완충액으로 2회 세척하고, 이어서 염색 완충액에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. DNA 함량을 FACS 밴티이지 (Vantage) (벡톤 (Becton) 및 딕킨손 (Dickinson))로 여기 359 nm 및 방출 450 nm에서 측정하였다.

시험관내 특이성 시험

인간 적백혈병 세포주 TF-1 (저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘 앤드 셀 컬쳐스)은 IL3 또는 hGM-CSF에 대해 성장-의존적이다. 이들 사이토카인은 증식에 대해 상승효과를 나타내는 반면, Epo는 일부 시간 동안 생존성을 유지할 수 있다. 세포를 GM-CSF 및 Epo 함유 배양 배지에서 일상적으로 성장시켰다.

시험 보충물

배양 배지: 4mM Gln, 10％ FCS, 트란스페린 20 ㎍/㎖, 10 μM 베타-메르캅토-에탄올, rhGM-CSF 12ng/㎖, rh Epo 3U/㎖를 보충한 RPMI 1640

시험 배지: 4 mM Gln, 트란스페린 100 ㎍/㎖, BSA 2 ㎎/㎖를 보충한 RPMI 1640

방법

기능 시험을 MTT 생존성 시험으로서 96-웰 플레이트에서 수행하였다 (Hammerling et al., 1996, J Pharm Biomed Anal 14(11):1455-69). 샘플을 1:2배로 8회 희석하고, 시험 배지에서 1 ㎖ 당 Epo 100 ng으로 시작하였다. 샘플 희석물, 표준 희석물 또는 블랭크 각각 50 ㎕를 96-웰 시험 플레이트에 옮겼다. TF-1 세포를 냉각 PBS로 3회 세척하고, 시험 배지에서 1 ㎖ 당 2 x 10⁵세포로 적응시켰다. 96-웰 시험 플레이트 각각의 웰을 세포 현탁액 50 ㎕로 오버레이하고, 이들 세포를 72시간 동안 CO₂인큐베이터 내에 방치하였다. 이후에 MTT 용액 (PBS 중에 6 ㎎/㎖) 10 ㎕를 첨가하고, 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 염료를 SDS/HCl (0.1 M HCl 중의 10％ SDS) 100 ㎕로 또다른 4시간 동안 어둠에서 용해시키고, Epo 의존 생존성을 550/690 nm에서 광도계로 측정하였다.

실시예 1 - 플라스미드 Epo/neo의 작제

1. p2-neo의 작제

1.1 SV40 초기 프로모터를 함유한 pSV2neo로부터의 벡터 단편의 제조

벡터 작제의 기초는 pSV2neo를 함유한 pBR322 플라스미드 백본이었다. 더 작은 EcoRI - PvuII 제한효소절단 단편은 이 pBR322 백본을 포함하고, SV40로부터의 인접한 PvuII - HindIII 단편은 SV40 초기 프로모터의 관련 단편을 가졌다.

플라스미드 pSV2neo (ATCC 37149)를 제한 효소 EcoRI 및 HindIII로 절단하였다. 2개의 생성된 단편의 크기는 3092 bp 및 2637 bp이었다. 2637 bp 단편은 pBR322 백본을 포함하는 EcoRI - PvuII 제한효소절단 단편 및 SV40 초기 프로모터 단편을 포함하는 인접한 PvuII - HindIII 단편으로 이루어졌다. 2637 bp를 분취하고, 겔 전기영동을 퉁해 정제하였다.

1.2 네오마이신 내성 유전자의 제조

neo 유전자를 pSV2neo의 트랜스포손 Tn5으로부터 취하였다. 유전자의 코딩 영역을 단독으로 함유하는 단편으로서 증폭하였다. 클로닝 방법의 부분로서, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 양 끝에 도입시켰다. HindIII 부위를 상류 증폭 프라이머에 부설하고, EcoRI 및 a SpeI 부위를 하류 프라이머에 부설하였다. 증폭된 영역은 pSV2neo (Genbank 번호 U02434)의 서열 중 뉴클레오티드 2846 내지 1938에 상응하였다. 올리고뉴클레오티드를 하기와 같이 디자인하였다:

프라이머 2004-01 및 2004-02의 증폭 생성물을 Pwo 중합효소 (로체 다이어그노스틱스 (Roche Diagnostics))를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. 공정의 파라미터는 하기와 같았다: 총용적이 50 ㎕인 공급된 완충액 중에 pSV2neo 20 ng, 10 pmol 프라이머 각각, 10 mmol dNTP, 2.5 U Pwo 중합효소; 온도 프로파일: 5분 95 ℃, 35회 (30초 95 ℃, 20초 65 ℃, 90초 72 ℃), 3분 72 ℃, 추가 사용때까지 4 ℃로 냉각시킴.

935 bp의 생성된 DNA 단편을 DNA 단리 칼럼 (Mini, Wizard Promega GmbH)으로 정제하고, EcoRI 및 HindIII로 절단하고, 아가로스 겔을 통해 정제하고, 스핀 (Spin) 칼럼 (Supelco)을 사용하여 용리하였다.

1.3 p1-neo의 작제

증폭된 EcoRI-HindIII neo 유전자 단편을 pSV2-neo로부터의 EcoRI-HindIII 벡터 단편에 라이게이션 익스프레스 (Ligation Express) (Clontech)를 사용하여 라이게이션하고, 이. 콜라이 (E. coli) 숙주 (이. 콜라이 SURE (Stratagene)) 내로 형질전환시켰다. 형질전환물을 암피실린 50 ㎎/ℓ이 보충된 LB 배지 상에서 성장시켜 선별하였다.

플라스미드 DNA를 클론으로부터 단리하고, EcoRI 및 NcoI (각각 2527 bp, 780 bp 및 251 bp의 3가지 단편)를 사용하는 제한효소절단 분석으로 확인하였다. 예상된 단편을 나타내는 플라스미드 DNA를 작제물의 관련 부분을 서열분석함으로써 추가로 확인하였다. 확인된 SV40 초기 프로모터 및 네오마이신 내성 유전자를 함유한 플라스미드 DNA를 p1-neo로서 지정하였다.

1.4 SV40 종결 영역 SV40LTpolyA/IVS의 제조

pSV2neo에 존재하는 SV40 종결 영역의 단편 (뉴클레오티드 751 내지 1598)을 증폭하기 위해 PCR 프라이머를 디자인하였다. 상류 프라이머는 또한 SpeI에 대한 제한효소절단 부위를 함유하였다. pSV2-neo의 위치 751에 이미 포함된 BamHI 부위 외에 EcoRI 부위를 BamHI로부터의 6개 뉴클레오티드 간격 (spacing) 영역에 의해 분리되는 하류 프라이머 내로 도입시켰다. 프라이머 2개의 서열은 하기와 같았다:

프라이머 2004-05 + 2004-06의 증폭 생성물을 상술한 바와 같이 Pwo 중합효소 (로체 다이어그노스틱스)를 사용하여 PCR함으로써 제조하였다. 873 bp의 생성된 DNA 단편을 DNA 단리 칼럼으로 정제하고, EcoRI 및 SpeI로 절단하고, 겔-정제하였다.

1.5 p2-neo의 제조

p1-neo 플라스미드 DNA를 EcoRI + SpeI를 사용하여 절단하였다. 생성된 선형화된 단편을 정제하고, SV40LTpolyA/IVS를 함유한 증폭된 단편과 라이게이션하고, 이. 콜라이 숙주 내로 형질전환하였다. 형질전환물을 암피실린 50 ㎎/ℓ을 보충한 LB 배지 상에 성장시켜 선별하였다.

플라스미드 DNA를 클론으로부터 단리하고, EcoRI (4411 bp의 1가지 단편) 및 NcoI (크기 3631 bp 및 780 bp의 2가지 단편) 및 SphI (크기 3499 bp, 840 bp 및 72 bp의 3가지 단편)으로 제한효소절단 분석하여 확인하였다. 예상된 단편을 나타내는 플라스미드 DNA를 작제물의 관련 부위를 서열분석하여 추가로 확인하였다. 확인한 SV40LTpolyA/IVS를 함유한 플라스미드 DNA를 p2-neo로서 지정하였다.

2. 플라스미드 p3의 작제

2.1 SV40 초기 프로모터 단편의 제조

플라스미드 pSV2neo를 SV40 초기 프로모터 단편에 대한 공급원으로서 사용하였다. 단편 크기는 p2 플라스미드의 작제에 사용된 것과 거의 동일하였다. 그러나, 단편의 말단을 개질하여 BamHI 및 NotI에 대한 인식 부위를 도입하였다. 프로모터를 증폭하기 위해 사용하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 하기와 같이 디자인하였다:

프라이머 2004-07 + 2004-08의 증폭 생성물을 상술한 바와 같이 Pwo 중합효소 (로체 다이어그노스틱스)를 사용하여 PCR함으로써 제조하였다. 365 bp의 생성된 DNA 단편을 DNA 단리 칼럼으로 정제하고, BamHI 및 NotI로 절단하고, 겔-정제하였다.

2.2 pBluescript 벡터 부분의 제조

pBluescript II SK+ DNA를 순차적으로 BamHI 및 NotI 각각으로 제한효소절단하였다. DNA를 알칼리 포스파타제로 탈인산화시켰다. BamHI/NotI 단편을 라이게이션 전에 아가로스 겔 전기영동을 통해 작은 단편으로부터 정제하였다.

2.3 플라스미드 p3의 제조 및 확인

SV40 초기 프로모터를 함유한 증폭된 BamHI-NotI 단편을 T4 DNA 리가제 (Promega GmbH)를 사용하여 제조된 pBluescript II SK+ 벡터 내로 라이게이션하였다. 이. 콜라이 SURE (Stratagene) 형질전환물로부터의 플라스미드 DNA를 단리하고, 암피실린 100 ㎎/ℓ을 보충한 LB 배지 상의 콜로니로부터 정제하였다 .

생성된 DNA를 EcoRI 및 NcoI (크기 3039 bp 및 253 bp의 2가지 단편)로 제한효소절단 분석하여 확인하였다.

예상된 단편을 나타내는 2개의 플라스미드 DNA를 서열분석으로 추가로 확인하였다. SV40 초기 프로모터의 가닥 모두를 서열분석하여 각각의 위치를 확인할 수 있었다. 플라스미드를 p3로서 지정하였다.

3. 인간 Epo cDNA의 단리

3.1 TRIZol (등록상표) 제제를 사용한 전체 RNA의 단리

인간 신장 조직 (라인저 크란켄하우스 (Lainzer Krankenhaus) 병원로부터 얻음)으로부터 Epo RNA를 단리하기 위해 사용되는 TRIzol (등록상표) 제제는 페놀 및구아니딘 이소티오시아네이트의 단일-상 용액이다. 세포 융해 동안 구아니딘 이소티오시아네이트는 RNA와 수용성 복합체를 형성하는 동시에 세포를 파열시켰다. 클로로포름을 첨가한 후에 원심분리하고, 용액을 RNA 함유 수상 및 유기상 내로 분리하였다. 수상을 분리한 후에 RNA를 이소프로필 알콜로 침전시키고, 에탄올로 세척하고, 통풍 건조시키고, RNAse 무함유 물에 재현탁하였다.

인간 신장 조직 단편을 작은 조각으로 절단하고, 100 ㎛ 세포 여과기를 통해 강압하고, 원심분리하고 (179 x g/10분), 생성된 펠렛을 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 펠렛을 PBS 중에 재현탁하고, 멸균 튜브에 분취하고, -196 ℃로 동결시키고, -80 ℃에서 추가로 사용할 때까지 저장하였다.

TRIzol (등록상표) 제제 1 ㎖를 첨가하여 동결 조직을 융해시키고, 균질화하고, 15 내지 30 ℃에서 5분 동안 인큐베이션하여 완전한 분리를 확실하게 하였다. 클로로포름 200 ㎕를 첨가한 후에 튜브를 진탕하고, 2 내지 3분 동안 15 내지 30 ℃에서 인큐베이션하고, 튜브를 12000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에 상위 수상을 조심스럽게 새로운 튜브로 옮기고, 이소프로필 알콜 500 ㎕와 혼합하고, 15 내지 30 ℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 침전 RNA를 원심분리하고 (12000 x g, 10분), 펠렛을 에탄올로 세척하고, 다시 원심분리하고, 통풍 건조시키고, RNAse 무함유 DEPC 물 중에 용해시켰다. 전체 RNA 함량을 260 nm에서 광도계로 측정하였다.

1 OD_260nm= RNA 40 ㎍/㎖

OD_260nm및 OD_280nm의 비율 (단백질의 최대 흡광도)을 평가하여 RNA 단리의 순도를 평가할 수 있다. 범위가 1.6 내지 1.8이어야 한다.

3.2 디나비드 (Dynabead) 올리고 (dT)25를 사용한 mRNA 단리

폴리스티렌 입자의 표면에 공유결합된 데옥시-티미딜레이트의 25개 뉴클레오티드 길이 쇄를 함유한 초자성 (supermagnetic) 폴리스티렌 입자에 진핵세포 mRNA의 폴리아데노신 꼬리 RNA를 혼성화시키는 것에 디나비드 올리고 (Dynabeads Oligo) (dT)₂₅mRNA DIRECT 키트를 사용하였다. 디날 (Dynal) 자석 입자 농축기 (디날 MPC (등록상표))로 자석 비드에 결합한 mRNA를 분리할 수 있었다.

세척 완충액: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.15 mM LiCl; 1mM EDTA

2 x 결합 완충액: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM LiCl; 2 mM EDTA

전체 RNA 10 ㎍에 대해, 디나비드 올리고 (dT)₂₅100 ㎕를 디날 MPC (등록상표)에서 분리하고, 2 x 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 한편 전체 RNA를 1 x 세척 완충액으로 200 ㎕의 용적으로 조정하고, 65 ℃에서 4분 동안 인큐베이션하여 변성시켰다. 이어서, RNA를 비드와 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고, 디날 MPC (등록상표)에서 분리하였다. 비드를 1 x 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 폴리아데닐화된 RNA를 디날비드 올리고 (dT)₂₅로부터 용리 완충액 (2 x 10 ㎕)과 4분 동안 65 ℃에서 인큐베이션하였다. 디나비드를 디날 MPC (등록상표)에서 분리하고, 상청액을 새로운 RNAse 무함유 미세원심분리 튜브로 즉시 옮겼다. 용리액은 역상 전사에 직접적으로 사용한다.

3.3 역 전사

Epo에 대한 특정 프라이머를 80 ℃에서 4분 인큐베이션으로 변성시키고, mRNA를 65 ℃에서 5분 인큐베이션으로 변성시켰다. 하기 구성성분을 얼음 상의 멸균 1.5 ㎖ 미세원심분리 튜브에 첨가하였다:

제제	최종 농도
mRNA	10 ㎕
MMLV (200 U/ ㎕)	0.25 ㎕
뵈링거 (Boehringer) PCR 완충액 (10 x)	2 ㎕
dNTP (10 mM)	2 ㎕
MgCl₂(50 mM)	1 ㎕
Epo 정방향 (100 pmol/ ㎕)	1 ㎕
DTT (0.1 M)	0.25 ㎕
RNAse 억제제 (40 U/㎕)	0.25 ㎕
H₂O	3.25 ㎕

인큐베이션: 60분 37 ℃

불활성화: 5분 100 ℃

3.4 중합효소 연쇄 반응

하기 구성성분을 멸균 1.5 ㎖ 미세원심분리 튜브에 4 ℃에서 첨가하였다. PCR 조건을 하기에 열거한다.

제제	Epo
주형	cDNA Epo 5 ㎕
중합효소	벤트 (Vent) 1U (0.5 ㎕)
중합효소 완충액 (10 x)	벤트 완충액 1 x (10 ㎕)
dNTP (10 mM)	200 μM (2 ㎕)
MgCl₂(50 mM)	/
프라이머 정방향 (10 pM)	30 pM (3 ㎕)
프라이머 역방향 (10 pM)	30 pM (3 ㎕)
DMSO	/
H₂O	76.5 ㎕

PCR 사이클
1 변성	95 ℃ 2분
2 변성	94 ℃ 45초
3 프라이머 어닐링	58 ℃ 30초
4 연장	72 ℃ 1분
5. 최후 연장	72 ℃ 10분
6. 사이클	30

PCR 증폭 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다.

3.5 아가로스 겔 전기영동

6 x BX 완충액: 0.25％ 브롬페놀 블루; 0.25％ 크실렌 시아놀, 30％ 글리세롤

TAE 완충액: Tris 염기 242g; 빙초산 57.1 ㎖; EDTA (0.5 M, pH 8.0) 100 ㎖; H₂O로 1000 ㎖로 조정함

람다-마커 III: 박테리오파지 람다-야생형-단 (Dann) 10 ㎍

(Hind III 2.5 ㎕ + Eco R I 2.5 ㎕ + 완충액 R (Fermentas) 20 ㎕, 200 ㎕까지 H₂O로 충전하고; 37 ℃에서 1시간 절단하고, 65 ℃에서 20분 불활성시키고; BX-적하 완충액 40 ㎕를 보충함)

아가로스 1 g 및 1 x TAE 완충액 99 g을 마이크로파 오븐에서 용융시키고, 약 60 ℃로 냉각시키고, 에티듐 브로마이드 저장 용액 (10 ㎎/㎖) 3 ㎕를 보충하였다. 겔을 1 x TAE 완충액 중에서 100 내지 300 V에서 약 30 분 동안 유출시키며, DNA 단편의 길이에 따라 분리되었다. 각각의 레인이 6 x BX 완충액 2 ㎕와 혼합한 10 ㎕ 샘플을 함유하였다. DNA 단편의 확인은 람다/Hind III 절단 분자량 표준과의 비교를 기준으로 하였다.

3.6 라이게이션을 위한 PCR 생성물 및 벡터의 제조

3.6.1 점착성 말단 클로닝을 위한 벡터 DNA 및 삽입물의 제한효소절단

제한 효소 및 적절한 제한효소절단 완충액 10 u를 제조자 사용설명서에 따라 벡터 DNA 및 삽입물 1 ㎍과 혼합하였다. 사용되는 효소, 벡터 및 삽입물에 따라 혼합물을 37 ℃ (SmaI의 경우 30 ℃)에서 30 내지 60분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 효소를 65 ℃ 이하로 10분 동안 가열하여 불활성화시키고, 반응 혼합물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다.

3.6.2 라이게이션

pIRESneoSV40 벡터

pIRESneo 벡터 (Clontech laboratories)는 하나의 메신저 RNA로부터 2개의 오픈 리딩 프레임의 번역을 가능하게 하는 뇌심근염 (encephalomyocarditis) 바이러스 (ECMV)의 내부 리보솜 이입 부위 (IRES)를 함유하였다. pIRESneo의 발현 카세트를 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 주요 극초기 프로모터/인핸서에 이어지는 다중 클로닝 부위 (MCS), ECMV IRES에 이어지는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 소과 성장 호르몬의 폴리아데닐화 신호를 함유하였다. 이 벡터에서 CMV 프로모터를 SV40 초기 프로모터로 대체하였다.

벡터 및 PCR 생성물을 T4 DNA 리가제로 라이게이션하였다. 최적 라이게이션의 경우 벡터 약 20 ng 및 삽입물 200 ng (길이에 따름)을 몰비 약 1:10로 사용하고, 하기 시약을 총용적 H₂O 10 ㎕에서 혼합하였다. 인큐베이션을 밤새 15 ℃에서 수행하고, 3 시간 동안 실온에서 수행하였다. 이어서, 리가제를 65 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하여 열-불활성화시켰다.

시약	최종 양
벡터 (pIRESneoSV40)	~ 20 ng
삽입물 (Epo)	~ 200 ng
T4 DNA 리가제	1U (1 ㎕)
완충액 (5x)	1x (2 ㎕)
H₂O	10 ㎕까지 첨가함

3.6.3 박테리아 및 배양 배지

JM109: (Promega, USA)

LB-배지: 카제인으로부터의 펩톤 10 g; 효모 추출물 5 g; NaCl 10 g, H₂O로 1000 ㎖로 조정하고, 5M NaOH로 pH 7.0로 조정함

LB 한천: LB-배지 1000 ㎖ 중의 한천 15 g

LB-Amp: LB-배지 1000 ㎖ 중의 암피실린 100 ㎕ (100 ㎎/㎖)

SOC 배지: 박토 트립톤 20 g; 효모 추출물 5 g; 10 mM NaCl; 3 mM KCl; 10 mM MgCl₂; 20 mM 글루코스, 10 mM MgSO₄

3.6.4 CaCl ₂ 를 사용하는 형질전환

수용능 박테리아 (JM109)의 제조

LB 배지 10 ㎖에 이. 콜라이 (JM109)를 접종하고, 밤새 37 ℃에서 성장시켰다. 박테리아 배양물 4 ㎖를 LB 배지에 1:100로 희석하고, OD_{260 nm}가 0.8에 도달할때까지 성장시켰다. 박테리아를 4500 rpm에서 10분 동안 4 ℃에서 원심분리하고, 세포 펠렛을 0.1 M CaCl₂(4 ℃) 10 ㎖/사용한 박테리아 현탁액 50 ㎖에 재현탁하였다. 세포를 원심분리하고, 펠렛을 0.1 M CaCl₂2 ㎖에 재현탁하고, 총 용적 100 ㎕로 분취하고, 액체 질소에서 동결시키고, -80 ℃에 저장하였다.

형질전환

예비-냉각 17 x 100 mm 폴리프로필렌 배양 튜브에서 플라스미드 DNA 5 내지 10 ng을 JM109 수용능 박테리아에 첨가하고, 완만하게 혼합하고, 30분 동안 얼음 상에 두었다. 이어서, 세포를 45초 동안 수조에서 정확하게 42 ℃에서 진탕 없이 열-충격을 주고, 즉시 2 분 동안 얼음 상에 두었다. 이어서, SOC 배지 900 ㎕를 튜브에 첨가하고, 30분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하고, 박테리아 현탁액 100 ㎕를 LB-Amp 플레이트 상에 플레이팅하였다.

3.6.5 글리세린 배양의 스크리닝 및 확립

암피실린 내성 콜로니를 삽입된 DNA 단편에 대해 PCR 기술로 스크리닝하였다. 암피실린 내성 콜로니의 부분들을 PCR 반응 혼합물 및 클로닝된 DNA 단편 (하기 참조)에 대한 특정 프라이머와 혼합하였다. 양성 콜로니는 PCR-증폭된 DNA 밴드를 아가로스 겔 전기영동에서 나타냈다. 이들 콜로니를 이어서 추가 분석 및 플라스미드 정제를 위해 LB-Amp 배지에 증식시켰다. 추가 사용 및 저장의 경우 목적하는 박테리아 배양물 1 ㎖를 글리세린 (87％) 500 ㎕와 혼합하고, -80 ℃에서 저장하였다.

3.6.6 위자르드 (등록상표) 플러스 SV 미니프렙 DNA 정제 시스템 (Wizard (등록상표) Plus SV Minipreps DNA Purification System)

세포 재현탁 용액: 50 mM Tris-HCl, pH7.5; 10 mM EDTA, RNase A 100 ㎍/㎖

세포 융해 용액: 0.2 M NaOH, 1％ SDS

중화 용액: 4.09 M 구아니딘 히드로클로라이드, 0.759 M 아세트산칼륨; 2.12 M 빙초산, pH 4.2

칼럼 세척 용액: 60 mM 아세트산칼륨, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 60％ 에탄올

LB-Amp 배지 2 내지 3 ㎖에 단일 콜로니를 접종하고, 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 용액을 원심분리하고 (12000 x g, 5분), 생성된 펠렛을 재현탁 용액 250 ㎕에 완전히 재현탁하고, 이어서 세포 융해 용액 250 ㎕에 재현탁하고, 튜브를 4회 뒤집기하여 혼합하고, 실온에서 1 내지 5분 동안 인큐베이션하였다. 이후에, 알칼리 프로테아제 용액 (5분 동안 실온에 인큐베이션함) 10 ㎕ 및 중화 용액 350 ㎕를 첨가하였다. 튜브를 4회 뒤집기하여 즉시 혼합하고, 박테리아 융해물을 12000 x g에서 10분 동안 실온에서 원심분리하였다. 맑은 융해물을 스핀 칼럼에 옮기고, 원심분리하고 (12000 x g, 5분), 칼럼을 세척 용액 (750 ㎕/250 ㎕)으로 2회 세척하였다. DNA를 뉴클레아제-무함유 물 100 ㎕로 용리하였다.

3.6.7 플라스미드의 서열분석

삽입된 서열을 특정 프라이머를 사용하여 IBL (Gerasdorf, Austria) 및 GenXpress (Maria Woerth, Austria)로 서열분석하였다. Epo 및 SV40 초기 프로모터의 증폭 및 서열 분석에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 하기에 열거한다.

4. 플라스미드 p5의 작제

4.1 Epo 유전자 단편의 제조

Epo (인간 에리트로포에틴)에 대한 구조 유전자를 pSVGPIRNEO를 주형 DNA로서 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. Epo의 서열을 GenBank 수탁 번호 M 11319.1로 얻었다. NotI 및 KspI에 대한 인식 부위를 상류 및 하류 프라이머 각각에 도입하였다. 프라이머를 하기와 같이 디자인하였다:

프라이머 2004-09 + 2004-10의 증폭 생성물을 상기와 같이 Pwo 중합효소 (로체 다이어그노스틱스)를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. 604 bp의 생성된 DNA 단편을 DNA 단리 칼럼을 사용하여 정제하고, KspI 및 NotI로 절단하고, 겔-정제하였다. 생성된 592 bp KspI/NotI 단편을 하기에 기재된 삼중 라이게이션에 사용하였다.

4.2 종결 영역 SV40LTpolyA/IVS의 제조

프라이머를 상이한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 사용하여 디자인한 것을 제외하고는 p2-neo의 작제에 대해 상기 1.4 단락에 상술된 간단한 방식으로 PCR에 의해 pSV2neo로부터 SV40LTpolyA/IVS의 종결 영역을 재클로닝하였으며: KspI (=SacII)에 대한 부위를 상류 프라이머 내에 도입시키고, SacI 및 EcoRI에 대한 부위를 하류 프라이머 내에 도입시켰다.

프라이머 2004-11 + 2004-12의 증폭 생성물을 상술된 바와 같이 Pwo 중합효소 (로체 다이어그노스틱스)를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. 873 bp의 생성된 DNA 단편을 DNA 단리 칼럼을 사용하여 정제하고, KspI 및 SacI로 절단하였다. 858 bp의 생성된 DNA 단편을 이어서 겔-정제하였다.

4.3 p3 벡터 부분의 제조

p3 플라스미드 DNA를 순차적으로 NotI 및 SacI 각각 사용하여 절단하였다. DNA를 알칼리 포스파타제로 처리하고, 벡터 단편을 겔-정제하였다.

4.4 플라스미드 p5의 삼중 라이게이션 및 단리

플라스미드 p3의 NotI/SacI 벡터 부분, KspI/NotI Epo 유전자 및 KspI/SacI 종결 영역 SV40LTpolyA/IVS를 하나의 라이게이션 반응 (라이게이션 익스프레스, Clontech)으로 라이게이션하였다. 형질전환물을 암피실린 100 ㎎/ℓ을 보충한 LB 배지 상에서 선별하였다.

증폭된 단편 2004-09/2004-10 및 2004-11/2004-12 양쪽을 표지된 프로브로서 사용하여 콜로니 혼성화에 의해 삽입된 단편 모두를 함유한 양성 형질전환물을 스크리닝하였다. 프로브 양쪽과 양성 혼성화 신호를 갖는 10개의 콜로니를 "midi (미디)" 규모 플라스미드 제조 (Qiagen)를 위해 선택하였다 .

제한효소절단 분석을 효소 BamHI (1가지 단편, 4723 bp), EcoRI (2가지 단편, 2913, 1810 bp) 및 PvuII (4가지 단편, 2513, 1204, 903, 103 bp)를 사용하여 수행하였다. 올바른 제한효소절단 단편을 나타내는 2개의 콜로니를 선별하고, 서열분석으로 확인하였다. pBluescript II SK+내로 클로닝된 모든 카세트를 서열분석하고, 예상된 뉴클레오티드 서열과 비교하였다. 모든 단일 뉴클레오티드를 성공적으로 확인할 수 있었다. 이 플라스미드를 p5로 지정하였다.

5. pEpo/neo의 작제

5.1 pEpo/neo 12-1의 작제

p5 플라스미드 DNA를 BamHI 및 EcoRI로 절단하고, SV40프로모터-Epo유전자-SV40터미네이터의 카세트를 나타내는 생성된 1792 bp 단편을 겔-정제하였다.

플라스미드 p2-neo를 BamHI 및 EcoRI로 또한 절단하고, 선형화된 벡터를 겔-정제하였다. 추가로, DNA를 알칼리 포스파타제로 탈인산화시키고, 아미콘 마이크로퓨어 (Amicon Micropure) 효소 제거기로 정제하였다.

p5로부터의 4411 bp p2-neo 벡터 및 1792 bp 카세트 단편 양쪽을 라이게이션하고 (라이게이션 익스프레스, Clontech), 이. 콜라이 SURE 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 70 ㎎/ℓ가 보충된 LB 배지 상에서 성장시킨 다양한 형질전환물로부터 단리하고, 제한 엔도뉴클레아제 PvuII, EcoRI 및 NcoI를 사용하여 절단함으로써 분석하였다.

예상된 단편 (EcoRI: 6191 bp, NcoI: 4085, 1326 및 780 bp, PvuII: 3273, 2130, 685 및 103 bp)을 나타내는 클론을 선별하고, pEpo/ neo12로서 절단하였다.

추가 정제를 위해, DNA를 이. 콜라이 SURE (상기 참조) 내로 재형질전환시키고, 단일 콜로니 (pEpo/neo-12-1)로 접종한 배양물로부터 "미디-프렙" 방법 (Qiagen)을 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 제한효소절단 분석을 하기 효소를 사용하여 수행하였다: BamHI, HindIII, EcoRI, NcoI, NotI, PstI, SpeI, SphI, PvuII, NarI. 예상된 단편 및 크기를 볼 수 있었고, 정확한 pEpo/neo 클론으로서 클론을 확인하였다.

5.2 pEpo/neo의 최종 작제

pEpo/neo-12-1에서 Epo 유전자의 상류 영역을 출발 ATG로부터 -3 위치에서 변화시켰다. 부가의 뉴클레오티드 A를 도입하여 출발 ATG로부터 -3 위치에 퓨린 염기 G를 생성시켰다. 상기 위치의 퓨린 염기는 유전자의 발현 수준을 개선시킬 수 있다. 그러한 목적으로, 개조된 상류 프라이머 2004-09-a를 사용하여 Epo 유전자를 다시 증폭시켰다.

올리고 2004-09-a: 길이: 46머

5'- gggggcggccgcaatgggggtgcacgaatgtcctgcctggctgtgg -3' 서열 32

상기 설명한 바와 같이, Pwo 중합효소 (로체 다이어그노스틱스)를 사용한 PCR에 의해 프라이머 2004-09-a + 2004-10의 증폭 산물을 제조하였다. 생성된 605 bp의 DNA 단편은 DNA 단리 컬럼을 이용하여 단리하고, KspI 및 NotI을 사용하여 분해하였다. 이어서, 생성된 593 bp의 단편을 겔-정제하였다.

pEpo/neo-12-1 플라스미드 DNA를 각각 KspI 및 NotI으로 분해하여 Epo 유전자를 제거하였다. 이어서, 5599 bp의 단편을 겔-정제하였다. 제조된 2개의 DNA를 서로 라이게이션시켰다 (라이게이션 익스프레스 (Ligation Express, Clontech)). 형질전환물로부터 유래한 플라스미드 DNA를, 70 ㎎/ℓ의 암피실린이 보충된 LB 배지에서의 콜로니로부터 단리 및 정제하였다. 1차 스크리닝으로, NcoI을 사용하여 DNA를 제한효소에 의해 분석하였다.

양성 클론을 선별하여, "미디 프렙" 절차 (Qiagen)를 이용하여 DNA를 단리하였다. BamHI, HindIII, EcoRI, NcoI, NotI, PstI, SpeI, SphI, PvuII, NarI을 이용하여 확장된 제한효소 분석을 수행하였다. 예상된 단편 및 크기를 확인할 수 있었고, 이로부터 올바른 pEpo/neo 클론임이 증명되었다. pBR322 벡터 부분에 삽입된 전체 카세트 (SV40 초기_프로모터 - neo 유전자 - SV40LT폴리A/IVS - SV40 초기_프로모터 -Epo 유전자- SV40LT폴리A/IVS)의 모든 단일 뉴클레오티드도 서열분석에 의해 확인하였다.

실시예 2 - 플라스미드 Epo/dhfr의 작제

1. p2-dhfr-CDS의 작제

1.1 dhfr 유전자의 제조

벡터 작제에 사용된 dhfr 유전자는 플라스미드 pLTRdhfr26 (ATCC 37295)에 존재하는 마우스 cDNA로부터 채취하였다. 마우스 dhfr cDNA (MUSDHFR)의 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 허가번호 L26316호로서 입수가능하다.

dhfr은 위치 56의 출발 ATG에서 위치 619의 정지 코돈 TAA까지의 코딩 영역을 함유하는 단편을 생성하도록 디자인된 프라이머를 사용하여 pLTRdhfr26으로부터 증폭하였다. 상기 설명한 네오마이신 내성 유전자의 증폭에 있어서는, HindIII 및 SpeI 부위를 각각 증폭 프라이머의 상류 및 하류에 도입하였다. 또한, EcoRI 부위를 역방향 프라이머의 SpeI 부위 옆에 도입하였다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 아래와 같다.

올리고 2004-13: 길이: 39머

5'- ggg gaa gct t at ggt tcg acc att gaa ctg cat cgt cgc -3' 서열 33

5' HindIII:aagctt-A(=MUSDHFR의 위치 56)TGgttcgaccattg...... 서열 34

올리고 2004-14: 길이: 42머

5'- ggggaa ttc act ag t tag tct ttc ttc tcg tag act tca aac - 3' 서열 35

5' EcoRI /SpeI:

gaattc actag-t(=MUSDHFR의 위치 619)tagtctttcttctcgtagacttcaaact..... 서열 36

프라이머 2004-13 + 2004-14의 증폭 산물은 상기 설명한 바와 같이 Pwo 중합효소 (로체 다이어그노스틱스)를 사용한 PCR에 의해 제조하였다. 생성된 588 bp의 DNA 단편은 DNA 단리 컬럼을 이용하여 정제하고, HindIII 및 EcoRI을 사용하여 분해하여, 겔-정제하였다.

1.2 p1-dhfr-CDS의 제조

증폭된 EcoRI-HindIII dhfr 유전자 단편을 라이게이션 익스프레스 (Ligation Express; Clontech)를 이용하여 pSV2-neo로부터의 EcoRI-HindIII 벡터 단편에 라이게이션시키고, 이를 이. 콜라이 숙주에 형질전환시켰다. 암피실린 50 ㎎/ℓ가 보충된 LB 배지에서 배양함으로써 형질전환물을 선별하였다. 암피실린 50 ㎎/ℓ가 보충된 LB 배지 상의 콜로니로부터 형질전환물의 플라스미드 DNA를 단리하고 정제하였다.

콜로니로부터 플라스미드 DNA를 단리하여, EcoRI + ScaI (각각 2225 bp, 514 bp 및 473 bp의 3가지 단편)을 이용하여 제한효소 분석으로 확인하였다.

예상된 단편을 나타내는 플라스미드 DNA를 작제물의 관련 부분에 대한 서열분석에 의해 추가 확인하였다. 증명된 SV40 초기 프로모터 및 디히드로폴레이트 환원효소 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA를 p1-dhfr-CDS라 명명하였다. 서열을 분석한 결과, 공개된 MUSDHFR 서열로부터의 dhfr 유전자 내에 1개의 차이가 있음이 밝혀졌다 (구체적으로, MUSDHFR 서열의 451 위치에 있는 T가 C로 변화됨). 이후의 서열분석 결과, 이 변화는 공급원 플라스미드에도 존재하는 것으로 나타났다. 그러나, CTT와 CTC 둘 다 루이신을 코딩하기 때문에 그러한 변화가 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열의 변화를 유발하지는 않았다.

1.3 p2-dhfr-CDS의 제조

p1-dhfr-CDS 플라스미드 DNA를 EcoRI + SpeI을 이용하여 분해하였다. 생성된 선형화 단편을 정제하고, SV40LT폴리A/IVS (상기 설명함)를 함유하는 증폭된 단편과 라이게이션시켰다. 형질전환 및 선별 후, 생성된 플라스미드를 AccI을 이용하여 제한효소 분석하였다 (2994, 855 및 216 bp의 3가지 단편). 몇몇을 선별하여, HincII (각각 3466 bp 및 599 bp의 2가지 단편), AflIII (각각 2872 bp 및 1193 bp의 2가지 단편) 및 BglI (각각 2371 bp 및 1694 bp의 2가지 단편)을 이용하여 추가로 분석하였다.

예상된 모든 단편을 올바른 크기로 나타내는 플라스미드 DNA를 서열분석에 의해 추가 확인하였다. 증명된 플라스미드를 p2-dhfr-CDS라 명명하였다.

2. pEpo/dhfr의 작제

2.1 pEpo/dhfr 21의 제조

p5 플라스미드 DNA를 BamHI 및 EcoRI으로 분해하고, SV40프로모터-Epo유전자-SV40터미네이터의 카세트를 나타내는 1792 bp의 생성 단편을 겔-정제하였다.

플라스미드 p2-dhfr-CDS를 또한 BamHI 및 EcoRI으로 분해하고, 선형화된 벡터를 겔 정제하여 수펠코 (Supelco) 스핀 컬럼으로 용리하였다. 추가로, 알칼리성 포스파타제를 사용하여 DNA를 탈인산화시키고, 아미콘 마이크로퓨어 (Amicon Micropure) 효소 제거기로 정제하였다.

4053 bp의 p2-dhfr-CDS 벡터와 1792 bp의 p5로부터의 카세트 둘 다의 단편을 라이게이션 (라이게이션 익스프레스; Clontech)시키고, 이. 콜라이 SURE로 형질전환시켰다. 암피실린 70 ㎎/ℓ가 보충된 LB 배지에서 배양된 형질전환물 콜로니를, 프로브로서 Epo 유전자 (PCR 산물)를 사용하여 혼성화시켰다. 플라스미드 DNA를 다양한 양성 콜로니로부터 단리하고, 제한효소 NcoI을 이용하여 분해함으로써 분석하였다.

예상된 단편 (NcoI: 4085 bp 및 1760 bp)을 나타내는 클론을 선별하고, 이를 pEpo/dhfr-21이라 명명하였다. 추가의 정제를 위해, DNA를 이. 콜라이 SURE로 (상기 참조) 다시 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단일 콜로니에 의해 접종된 배양물로부터 "미디-프렙" 절차 (Qiagen)를 이용하여 제조하였다 (pEpo/dhfr-21-1).

BamHI, HindIII, EcoRI, NcoI, NotI, PstI, SpeI, SphI, PvuII, NarI의 효소를 이용하여 제한효소 분석을 수행하였다. 모든 예상된 단편 및 크기를 확인할 수 있었고, 따라서 이 클론이 올바른 pEpo/dhfr-21임이 증명되었다.

2.2 pEpo/dhfr의 최종 작제

동시에, pEpo/neo의 경우에는 Epo/dhfr-21 중 Epo 유전자의 상류 영역을 출발 ATG를 기준으로 -3 위치에서 변화시켰다. 추가로 뉴클레오티드 A를 도입시켜 출발 ATG로부터 -3 위치에 퓨린 염기 G를 생성하였다. 실시예 1의 4.2 단락에 기재된 바와 같이 Epo 유전자를 다시 증폭시켰다.

pEpo/dhfr-21 플라스미드 DNA를 KspI 및 NotI으로 분해하여 Epo 유전자를 제거하였다. 이어서, 5259 bp의 단편을 겔-정제하였다.

제조된 DNA 둘 다를 서로 라이게이션 (라이게이션 익스프레스; Clontech)시켰다. 암피실린 70 ㎎/ℓ가 보충된 LB 배지에서 배양된 콜로니로부터 형질전환물의 플라스미드 DNA를 단리 및 정제하였다. 1차 스크리닝으로 NcoI을 이용한 제한효소 분석을 수행하였다.

양성 클론을 선별하고, "미디-프렙" 절차 (Qiagen)를 이용하여 DNA를 단리하였다. BamHI, HindIII, EcoRI, NcoI, NotI, PstI, SpeI, SphI, PvuII, NarI의 효소를 이용하여 확장된 제한효소 분석을 수행하였다. 예상된 단편 및 크기를 확인할 수 있었고, 따라서 이 클론이 올바른 pEpo/dhfr임이 증명되었다.

pBR322 벡터 부분에 삽입된 전체 카세트 (SV40초기 프로모터 -dhfr 유전자- SV40LT폴리A/IVS - SV40초기 프로모터 -Epo 유전자- SV40LT폴리A/IVS)의 모든 단일 뉴클레오티드도 서열분석에 의해 확인하였다.

실시예 3 - pEpo/neo 및 pEpo/dhfr로부터 생성된 재조합 CHO 세포

1 내지 5×10⁴개 세포/cm²을 25 cm²T-25 플라스크 병 또는 96-웰 플레이트에 시딩하고, 하루가 지난 후에 리포펙션 형질감염을 수행하였다. 2개의 플라스미드를 50:5 = Epo/neo:Epo/dhfr의 비율로 혼합하고, 제조자의 프로토콜에 따라 리포펙틴 시약 (GIBCO/BRL)에 흡착시켰다.

요컨대, 본 발명자들은 0.25 ㎍ DNA/cm²및 1.5 ㎕ 리포펙틴-시약/cm²을 사용하였으며, 이 DNA/지질 칵테일을 세포층 1 cm²당 200 ㎕가 되도록 조정하였다. 이어서, 혈청-무함유 DMEM 배지 중의 세포 위쪽에 형질감염 칵테일을 4시간 동안 첨가한 후, DMEM-함유 배지를 배양용 배지로 교체하였다. 혈청-함유 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 본 발명자들은 선별 배지로 교환하였다. 형질감염된 세포-집합체를 우선 선별 배지에서 플레이트가 가득 차도록 배양한 후, 증폭 배지 (4.8×10^-8M MTX)에서 배양하고, Epo 생산에 대해 ELISA에 의해 세포 배양 상청액을 스크리닝하였다. 생산성이 가장 높은 것을 결정하고, MTX 농도를 2배 증가시켜 가장 우수한 생산자를 추가의 배양에 사용하였다. 7개의 재조합 세포 집합체를 선별하고, 증식 특성, Epo 생산성, 단백질 패턴 (웨스턴 블롯 분석에 의해), Epo 기능성 및 염색체 안정성을 비교하였다.

T25-플라스크에서의 형질감염은 T25-플라스크 당 2.5 ㎍ pEpo/neo, 0.05 ㎍ pEpo/dhfr 및 15 ㎕ 리포펙틴 (09/T25/1 및 09/T25/2)으로 수행하고, T25-플라스크 당 2 ㎍ pEpo/neo, 0.4 ㎍ pEpo/dhfr 및 15 ㎕ 리포펙틴 (09/T25/3 및 09/T25/4)으로 수행하였다.

추가로, 5개의 플레이트를 각각 플레이트 당 10 ㎍ pEpo/neo, 0.2 ㎍ pEpo/dhfr 및 60 ㎕ 리포펙틴 (09/96/1 - 09/96/5)으로 형질감염시키고, 5개의 플레이트를 플레이트 당 8 ㎍ pEpo/neo, 1.6 ㎍ pEpo/dhfr 및 60 ㎕ 리포펙틴 (09/96/6 - 09/96/10)으로 형질감염시켰다. 플레이트 11 및 12는 각각 6.25 ㎍ pEpo/neo, 0.08 ㎍ pEpo/dhfr 및 37.5 ㎕ 리포펙틴으로 형질감염시켰다.

요컨대, 0.25 ㎍ DNA/cm²및 1.5 ㎕ 리포펙틴-시약/cm²을 사용하여, 이 DNA/지질 칵테일을 세포층 1 cm²당 200 ㎕가 되도록 조정하였다.

형질감염 순서는 주로 마이크로타이터 플레이트에서 수행하였는데, 이는 선행 실험에서 1개의 배양 단위 당 클론의 수가 최대 3 내지 5개로 밝혀졌기 때문이었다. 이는 T-플라스크에서의 수백개 클론으로부터 단리하는 것보다 모노 클론성 형질감염체의 단리가 보다 용이함을 의미한다. 표 1은 96-웰 플레이트 당 클론의 수, 및 증폭 압력의 존재 및 부재 하의 ELISA 역가를 기재한 것이다. 형질감염된 세포 집합체를 우선 선별 배지에서 플레이트가 가득 차도록 배양한 후, 증폭 배지 (4.8×10^-8M)에서 배양하고, Epo 생산성에 대해 ELISA에 의해 세포 배양 상청액을 스크리닝하였다. 대략 1000개의 웰을 스크리닝하였고, 상기 배양물 중 50개가 MTX농도 증가시에 Epo-비(比)생산성을 나타내는 것으로 시험되었다. 생산성이 가장 높은 것을 결정하고, MTX 농도를 2배 증가시켜 가장 우수한 생산자를 추가의 배양에 사용하였다.

선별 및 제1 증폭 단계는 96-웰 플레이트에서 수행하였고, 4.8×10^-8M MTX에서 증식하는 모든 클론을 스크리닝하고, 7개의 클론을 선별하여 09/96/1F5, 09/96/3D5, 09/96/3H5, 09/96/5D4, 09/96/5H1, 09/96/6C5 및 09/96/7E6으로 명명하였으며, 이들의 증식 특성, Epo 생산성, 웨스턴 블롯에서의 단백질 패턴, Epo 기능성 시험 및 염색체 안정성을 비교하였다.

모든 클론에 있어 2배 증식 시간 (doubling time)은 동일한 것으로 보였으며, 이들은 1주일에 1:2 내지 1:5로 2회 분할될 수 있었다. MTX 농도를 9.6×10^-8M에서 1.9×10^-7M로 증대시키는 것도 또한 생산성을 개선시킨 반면, 추가로 MTX 농도의 2배 증가는 ELISA 값에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 3.8×10^-7M MTX에서 서브클로닝을 수행하였다. 단일 배양물이 유의하게 다르지 않은 1.9×10^-7M MTX에서 면역형광을 분석하였다.

광학 현미경 및 콜터 카운터 핵 DNA 분석에 의해 세포 형태를 비교하였다. 클론 09/96/7E9, 09/96/6C5, 09/96/5H1, 09/96/5D4 및 09/96/3D5는 숙주 세포주로서의 CHO-DHFR^-에서 동일한 핵 크기 분포를 나타냈다. 반대로, 세포주 09/96/1F5및 09/96/3H5는 보다 큰 핵을 가졌다. 선행 실험으로부터, 이러한 결과는 염색체의 수 증가에 기인함이 알려져 있다. 따라서, 추가의 안정화 시험을 위해 09/96/3D5를 사용하기로 결정하였다.

TF-1 세포에서 Epo에 대한 기능성 시험은 모든 7가지 배양 상청액에 있어 재조합 제약 제품과 비교시 동일한 기울기를 나타냈다.

각 MTX 농도에서 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 재조합 단백질을 시험하였으며, 모든 재조합체 배양 상청액에서 미미한 변화만이 관찰되었다. 이 클론들은 Epo를 생산하였다.

요약 및 논의

Epo를 발현하는 재조합 CHO-세포주의 선별 (진핵세포 발현 벡터의 작제에서부터 포유동물 세포의 형질감염까지) 및 폴리 클론성 Epo 발현 세포 집합체에 대해 설명하였다. 분석의 기초는 주로 ELISA, 면역형광법, 웨스턴 블롯팅 및 시험관내 기능성 시험이었다. 이들 모든 방법은 단지 ng/㎖ 양의 소량 생산 세포 집합체 뿐만 아니라 보다 안정화된 재조합 세포의 배양 상청액을 스크리닝할 수 있는 농도 범위에서 확립되었다.

유전자 카피수가 3.8×10^-7M MTX까지 단계적으로 증폭되는 재조합 CHO-집합체를 생성하였다. 이들 세포는 1주일에 1:3 내지 1:4로 2회 분할될 수 있으며, 매번 ELISA에서 상승된 Epo 수준이 탐지되었다.

실시예 4 - 재조합 세포주의 추가 선별

재조합 세포 집합체 09/96/3D5를 추가의 안정화 시험에 사용하였다. MTX의 농도는 0.38 μM까지 단계적으로 증가하였다. 이 증폭 수준에서 재조합 3D5 세포를 웰 1개 당 10 및 20개의 세포로 서브클로닝하였다. ELISA에 의해, 웰의 배양 상청액을 단일 클론으로 스크리닝하였다. 표 2는 서브클로닝 조건, 및 0.38 μM MTX 존재 하의 재조합 세포 집합체 3D5의 효율을 나타낸 것이다. 단일 클론의 상청액 300가지를 시험하였다. 계대 배양 4일 후에 상승된 Epo 역가를 갖는 클론을, 24 웰 플레이트에서 0.77 μM MTX로 선별하였다.

이들 클론 중 7개를 액체 질소에 보관하고, MTX 농도를 1.54 μM까지 증가시켜 유전자 카피수의 추가 증폭에 대해 선별하였다.

표 3은 플레이팅 조건 및 제2 라운드 안정화 시험 효율을 작성한 것이다. 여기서, 클론 09/96/3D5/1H9 및 09/96/3D5/18E5는 1.54 μM MTX로 최종 서브클로닝하였다. 웰 당 세포의 계수값이 4개의 세포로 감소하였다. 260가지 단일 클론을 스크리닝하였으며, 이중 각 계대배양물에서 20개를 초과하는 클론을 T-플라스크로 옮기고 비(比)생산성에 대해 스크리닝하였다. 최종 생성 클론을 비(比)발현율, 배양 조건 및 핵 크기 분포와 같은 기준에 따라 분류하였다. 4배체성 (tetraploidy)을 나타내는 클론은, 이러한 세포들이 생물반응조에서 복잡한 증식 패턴을 나타내는 경향이 있다는 경험상의 이유로 폐기하였다. 하기 6개의 서브클론 (1H9 서브클론 4가지 및 18E5 서브클론 2가지)을 선택하여 액체 질소에 동결시켰다.

09/96/3D5/1H9/4C2 09/96/3D5/1H9/6C2 09/96/3D5/1H9/6D4

09/96/3D5/1H9/15B4 09/96/3D5/18E5/7A6 09/96/3D5/18E5/15C3

실시예 5 - 혈청-무함유 배양 배지에 대한 적응

실시예 4로부터의 최종 재조합 세포주 6개를, 마지막 서브클로닝 단계 이후에 혈청-무함유 배양 조건에 대한 적응을 위해 선택하였다.

T25-플라스크 내에 약 5×10⁴개 세포/cm²으로 서브클로닝한 후 7 내지 12회 계대배양으로 세포를 시딩하고, 플레이트가 가득 차도록 3 내지 4일 배양하였다. 이 시점에서 배지를 혈청-무함유 적응 배지로 완전히 교체하고, 그 후 80％의 배지를 매일 새로 교체하였다. 현탁된 모든 세포를 배양하였다. 적응 시간 후 거의 모든 세포가 현탁액 중에 배양될 때, 클론을 1주일에 2회 계대배양하여 현탁 배양물로 배양하였다.

동결보관 전에 클론을 혈청-무함유 적응 배지에서 11 내지 13회 계대배양하였다. 각 세포 5×10⁶개가 들어있는 6개의 앰풀을 혈청-무함유 동결 배지를 사용하여 모든 세포주에 대해 액체 질소로 동결시켰다. 해동 후, 클론을 혈청-무함유 생산 배지에서 배양하였다. 생산 클론을 선별하기 위한 분석용 특성화는 해동 후 2회 또는 3회 계대배양물의 상청액을 사용하여 수행하였다.

분석 시험에는 하기 시험이 포함되었다.:

ㆍ비(比)증식율 [μ] - (μ=ln(X₂/X₁)/일)

ㆍ비(比)생산성 [q_p] - (q_p= 산물-생성량×10⁶/(세포 계수값×일))

ㆍ웨스턴 블롯

ㆍ등전점 집속 (isoelectric focusing)

ㆍDNA 함량 및 안정성

ㆍ클론 안정성

모든 6가지 세포주는 혈청-무함유 배지에서 증식할 수 있었고, 1주일에 2회 분할되었다. 또한, 동결보관도 혈청없이 수행하였으며, 해동 후에 배양 배지를 혈청-무함유 생산 배지로 교환하였다. 이 제제는 글루코스 및 아미노산이 풍부화된 것이었다.

5회 계대배양 후, 다른 단백질 및 세포성 파라미터를 측정하고, 하나의 생산 클론 (09/96/3D5/1H96C2; 6C2로 약기함) 및 하나의 대용 (back up) 클론 (09/96/3D5/1H9/4C2; 4C2로 약기함)을 선별하였다.

실시예 6 - 재조합 세포주의 비교

실시예 4 및 5에서 유래한 6가지 세포주의 증식 특성을, 배양물 중 세포의 계수값을 측정할 뿐만 아니라 계대 배양시의 분할 비율을 측정함으로써 수주에 걸쳐 계산하였다. Epo 생산성은 ELISA에 의해 시험하였다. 이 데이타로부터 상기 설명한 바와 같은 비생산성 및 비증식율을 계산하였다.

표 4는 1:3의 분할 비율로 표준 배양 조건하에서 3일 동안 배양한 후에 얻은 데이타를 요약한 것이다.

분할 후 및 추가의 3일 후에 측정한 세포 계수값 (콜터 카운터에 의해 측정함)을 나타냈다.

환원 조건 하에서의 SDS-PAGE

6가지 세포주의 상청액을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 분자량의 차이를 비교하였다. 6가지 상청액은 고도로 글리코실화된 단백질에서 통상적으로 나타나는 번지는 (smear) 형태의 동일한 SDS 패턴을 나타냈다 (데이타 도시하지 않음).

이에 필적하는 시판품은 보다 뚜렷한 밴드를 나타내며 이동하였는데, 이는 이후의 프로세싱 단계 동안 뚜렷한 밴드를 분리하여 생긴 것으로 추정된다.

IEF-웨스턴 블롯

IEF-웨스턴 블롯 분석은 당단백질의 미세 불균질성 (microheterogeneity)을 반영할 것이다. 겔에 로딩된 단백질의 양에 따라 14개의 밴드가 가시화되었다. 겔의 중간 부근에서 웨스턴 블롯 상에 특징적인 이중 밴드 1개가 나타났는데, 이 이중 밴드의 바로 아래 밴드를 밴드 번호 1로 정의하였고, 겔의 산성 부분에서 9 내지 10개의 밴드가 가시화되었다. 필적하는 시판품은 불균질 산물에서 밴드 번호 6 내지 9에 상응하는 4개의 주요 밴드를 나타냈다.

재조합 세포의 DNA 함량

DNA 함량은 세포주의 염색체 수와 비례한다. 재조합 세포주의 안정성은 부분적으로 염색체 계수값에 의해 영향을 받고, DNA 함량의 동일성은 숙주 세포주 (CHO dhfr^-)와의 비교에 의해 입증되었다.

요약 및 논의

Epo를 발현하는 CHO 세포주의 재조합체 단리는 본원에 설명되어 있다. 2 라운드 서브클로닝 후에, 6가지 세포주를 하나의 최종 생산 클론의 지정을 기초로 상이한 특성에 대해 비교하였다. 분석의 기초는 주로 ELISA, 웨스턴 블롯팅 및 IEF 시험 뿐만 아니라, FACS 분석에 의한 DNA 측정이었다.

재조합 배양 상청액의 웨스턴 블롯 패턴은 시판되는 정제 단백질에 비해 저분자량의 몇몇 부가 밴드를 나타냈다. 한가지 가능한 설명은 이들 부가 밴드가 이후의 프로세싱 단계에서 제거되어 비교 대상인 시판품과 동일한 패턴을 초래하는 이소형을 나타낸다는 것이다. 다른 가능성은 인공 밴드가 SDS의 불완전한 흡수에 의해 탐지된다는 것이다. 등전점 집속은 모든 세포 배양 상청액에 대해 이들의 Qp와 무관하게 동일한 이소형 분포를 나타냈다.

가장 우수한 생산 클론이며 취급이 가장 용이한 클론은 클론 6C2이며, 이것을 생산 클론으로서 선택하였다. 대용 클론 4C2를 선택하였다. 이들 클론 둘 다는 롤러 병에서 증식할 수 있다.

실시예 7 - T-플라스크에서의 CHO 세포 배양

재조합 인간 에리트로포에틴은 T-플라스크 중의 차이니즈 햄스터 난소 세포주 (CHO)에서 혈청-무함유 조건 하에 생산되었다. 이 배양물은 2.67×10⁵개 세포/㎖로 시딩되었다. 인큐베이션 기간 3일 후, 최종 세포 밀도 9.35×10⁵개 세포/㎖에 도달하였다 (μ = 0.42 일^-1)

실시예 1 내지 6은 Epo를 발현하는 다수의 CHO 클론의 제조를 설명한 것이다. 실시예 4 및 5에서 얻은 6가지 클론 중에서, 클론 CHO 6C2는 매우 높은 세포 비생산성 및 높은 비증식율로 인하여 선택되었다.

실시예 8 - 생물반응조에서의 CHO 세포 배양

아미노산이 보충된 50:50 DMEM/햄스 F12로 구성되고 0.25％ 식물 펩티드, 0.1％ 루트롤, 1.54 M 메토트렉세이트 (MTX), 1 g/ℓ 글루코스, 2.5 g/ℓ NaHCO₃, 에탄올아민, 구연산철, 아스코르빈산 및 소듐 셀레나이트를 함유하는 세포 배양 배지를 이용하여, CHO 세포주 6C2를 공급-배치식 (Fed-Batch)(T43C6C2) 모드로 150 ℓ생물반응조에서 배양하였다. 이 배지는 어떠한 값비싼 기능성 단백질 (재조합체 또는 천연 공급원으로부터 유래)도 함유하지 않았다. 동물 기원으로부터 유래한 성분들이 존재하였다. 이 세포들을 약 5×10⁵개 세포/㎖로 56 ℓ 배지 중에 시딩하였다. pO₂는 50％ 공기 포화로 설정하였고, 온도는 37℃로 설정하였고, pH는 7.0으로 설정하였으며, 이들을 발효 기간 동안 일정하게 유지하였다.

글루코스 농도는 1 g/ℓ가 넘도록 유지하였다. 4일 후, 반응기를 150 ℓ의 신선한 배지로 채웠다. 9일 후, 아미노산, 탄수화물 및 식물 유래 펩톤을 함유하는 양분 농축물 1875 ㎖를 첨가하여 배치를 확장시켰다. 10일 후, 양분 농축물 1875 ㎖을 더 첨가하였다. 2일 후 (12일), 에리트로포에틴 함유 상청액을 수확하였다.

실시예 9 - 메토트렉세이트 부재 하 생물반응조에서의 에리트로포에틴 생산

CHO 세포주 6C2를 공급-배치식 (Kamp 4 B5-1 및 2) 모드로 5 ℓ 생물반응조에서 배양하였다. 배지는 실시예 9에서와 같았다. 제1 생물반응조 (Kamp 4 B5-1)는 배지 중 1.54 μM MTX가 되도록 설정하였고, 제2 생물반응조 (Kamp 4 B5-2)는MTX가 부재하도록 설정하였다.

글루코스 농도는 1 g/ℓ가 넘도록 유지하였다. 이 세포들을 약 5×10⁵개 세포/㎖로 1250 ㎖ 배지 중에 시딩하였다. pO₂는 50％ 공기 포화로 설정하였고, 온도는 37℃로 설정하였고, pH는 7.0으로 설정하였으며, 이들을 발효 기간 동안 일정하게 유지하였다. 2일 후, 반응기를 5 ℓ의 신선한 배지로 채웠다. 6, 7, 8, 9 및 10일 후, 아미노산, 탄수화물 및 식물 유래 펩톤을 함유하는 양분 농축물 50 내지 122 ㎖를 첨가하여 배치를 확장시켰다. 11일째에, 에리트로포에틴 함유 상청액을 수확하였다.

메토트렉세이트 부재 하의 배양은 더 양호한 글리코실화 패턴으로 인해 보다 우수한 것으로 나타났다.

실시예 10 - 풍부화 배지를 사용한 생물반응조에서의 에리트로포에틴 생산

CHO 세포주 6C2를 공급-배치식 (Kamp 11B 5-1 및 2) 모드로 5 ℓ 생물반응조에서 배양하였다. 생물반응조 1은 실시예 10 (Kamp 4 B5-2)에서와 같이 작동시켰다. 생물반응조 2에서는 풍부화 아미노산이 보충된 50:50 DMEM/햄스 F12로 구성되고 0.325％ 식물 펩티드, 0.1％ 루트롤, 6.4 g/ℓ 글루코스, 2.5 g/ℓ NaHCO₃, 에탄올아민, 구연산철, 아스코르빈산 및 소듐 셀레나이트와 0.6 g/ℓ 인산염을 함유하는 배양 배지를 사용하였다. 이 세포들을 약 5×10⁵개 세포/㎖로 1250 ㎖ 배지 중에 시딩하였다. pO₂는 50％ 공기 포화로 설정하였고, 온도는 37℃로 설정하였다.pH는 초기에 7.1로 설정하였다. 발효 절차 동안 pH를 6.9로 단계적으로 감소시켰다.

배양 절차에 걸쳐 생물반응조 2의 글루코스 농도는 3 내지 4 g/ℓ 사이로 유지하였다. 2.5일 후, 반응기를 5 ℓ의 신선한 배지로 채웠다. 6, 7, 8, 9 및 10일 후, 아미노산, 탄수화물 및 식물 유래 펩톤을 함유하는 양분 농축물을 첨가하여 배치를 확장시켰다. 11일째에, Epo 함유 상청액을 수확하였다.

양분이 풍부화된 배지 (아미노산, 글루코스, 식물 펩톤 및 인산염) 뿐만 아니라 7.1에서 6.9로의 pH 이동을 이용한 배양은 필적하는 글리코실화 프로파일에서 최종 Epo 농도를 2배가 넘게 증가시킴을 확인하였다.

실시예 11 - 동물로부터의 성분이 결핍된 생물반응조에서의 에리트로포에틴 생산

CHO 세포주 6C2를 공급-배치식 (Kamp 17 B5-1 및 3) 모드로 5 ℓ 생물반응조에서 배양하였다. 모든 파라미터는 달리 기재하지 않는 한 실시예 10 (Kamp 4 B5-2)에서와 같이 설정하였다. 생물반응조 2에서는 동물로부터 유래한 어떤 성분도 함유하지 않는 세포 배양 배지를 사용하였다. 예를 들어, 통상적으로 동물 (예를 들어, 연어 또는 인간 모발)에서 유래한 아미노산인 티로신 또는 시스테인은 합성 아미노산으로 치환하였다.

2.5일 후, 반응기를 5 ℓ의 신선한 배지로 채웠다. 5, 6, 7, 8 및 9일 후, 아미노산, 탄수화물 및 식물 유래 펩톤을 함유하는 양분 농축물을 첨가하여 배치를 확장시켰다. 9일 내지 10일째에, 에리트로포에틴 함유 상청액을 수확하였다.

동물 기원의 어떠한 성분도 함유하지 않는 배지는 필적할만한 최종 Epo 농도를 수득함이 밝혀졌다. 그러나, 배양물은 더 서서히 증식하였고, 부가의 양분 농축물을 첨가할 필요가 있었다.

실시예 12 - 풍부화된 배지 (비타민, 미량 원소)를 사용한 생물반응조에서의 에리트로포에틴 생산

CHO 세포주 6C2를 공급-배치식 (Kamp 12 C) 모드로 10 ℓ 생물반응조에서 배양하였다. 생물반응조는 하기 예외사항을 제외하고는 실시예 11 (Kamp 11 B5-2)에서와 같이 작동시켰다.

세포 배양 배지는, 풍부화 아미노산이 보충된 50:50 DMEM/햄스 F12로 구성되고 0.325％ 식물 펩티드, 0.1％ 루트롤, 6.4 g/ℓ 글루코스, 2.5 g/ℓ NaHCO₃, 에탄올아민, 구연산철, 미량 원소 및 소듐 셀레나이트와 0.6 g/ℓ 인산염을 함유하는 것을 사용하였다. 농축물의 함량을 2배로 하고, 비타민을 풍부화시켰다.

이 세포들을 약 5×10⁵개 세포/㎖로 4500 ㎖ 배지 중에 시딩하였다. pO₂는 50％ 공기 포화로 설정하였고, 온도는 37℃로 설정하였다. pH는 초기에 7.1로 설정하였다. 발효 절차 동안 pH를 6.9로 단계적으로 감소시켰다.

배양 절차에 걸쳐 생물반응조의 글루코스 농도는 3 내지 4 g/ℓ 사이로 유지하였다. 3일 후, 반응기를 10 ℓ의 신선한 배지로 채웠다. 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12일 후, 풍부화된 양분 농축물을 첨가하여 배치를 확장시켰다. 13일째에, 에리트로포에틴 함유 상청액을 수확하였다.

실시예 13 - Epo의 단리

세포 분리

재조합 인간 에리트로포에틴은 차이니즈 햄스터 난소 세포주 (CHO)에서 불연속 공급 배치 발효에 의해 혈청-무함유 조건 하에서 생산하였다. 발효 (4회, 약 1+2 배치 방식, 확장 단계, 2개의 다른 생물반응조 중에서) 후 1 ℓ 당 약 200 내지 300 ㎎의 rhEpo를 함유한 수확된 브로쓰 (broth)를 2 내지 8℃로 냉각시키고, 중간 보관 기간 없이 먼저 디스크 적층 분리기를 통한 원심분리에 의해, 그 후 심층 여과 (Seitz Bio 10 또는 Cuno A90M08, 처리량 = 약 300 ℓ/m²필터 면적) 및 0.2 μ 여과 [PP 폴리그라드 (Polygrad) 0.1 ㎛, 사토브란 (Satobran) P (Satorius) 또는 듀로포어 (Duropore) 0.22 μ (Milipore)]에 의해 투명하게 하였다. 과도한 세포 용해 및 그에 따른 다량의 HCP (숙주 세포 단백질; host cell protein) 산물 오염을 피하기 위해, 먼저 최적 시점 (주 배양물 중에서 약 12일, 산소 소모 정체)에서 수확하는 것과, 두번째로 연약한 진핵 세포의 분리를 위해 특별히 디자인된 분리 장비 [예를 들어, 수소밀봉 (hydrohermetic) 공급 유입구가 설치된 CSC6 (6000 m²ECA, 15500 x g, 약 200 ℓ/h, Westfalia) 또는 부드러운 디스크 유입구 및 가시형 (porcupine) 유출구가 설치된 BTPX 250 (11000 m²ECA, 13000 xg, 300 ℓ/h, Alfa Laval)]를 사용하는 것이 중요하다. 접선 흐름 여과 (tangential flow filtration) 및 원심분리를 비롯한 다른 분리 기술의 비교 결과, 전단 응력 (세포내 마커 효소인 LDH의 방출에 의해 측정)에 의한 세포 용해의 차이가 밝혀졌다. 원심분리는 가장 부드러운 분리 (< 3U LDH/㎎ rhEpo)를 제공하며, 따라서 바람직하다.

별법으로, 상기 설명한 디스크 적층 분리기를 통한 원심분리만을 (심층 여과 단계 없음) 세포 분리 단계에 이용하였다. 별법으로, 상기 설명한 심층 여과 단계 (원심분리 단계 없음)를 이용하였다.

음이온 교환 크로마토그래피 (AEX)에 의한 포획

투명하게 한 후, 조 상청액을 약 3배 부피의 물로 희석하여 최종 전도율이 5 mS/cm 이하가 되도록 하고, Tris 염기를 사용하여 pH를 7.5로 조정한 후, AEX-포획 수지에 로딩하였다.

사용된 AEX-컬럼의 베드 (bed) 높이는 약 10 내지 20 cm였고, 이 컬럼은 유동성이 양호한 Q 세라믹 하이퍼D F (Q Ceramic HyperD F; Biosepra)로 패킹하였다. 이 컬럼을 20 mM Tris (pH 7.5), 50 mM NaCl로 평형화시켰다. 이어서, 희석된 세포 상청액을 4 내지 8 cm/분의 유속으로 컬럼에 로딩 (수지 1 ㎖ 당 10 내지 15 ㎎의 rhEpo)하고, 컬럼을 10 내지 15배 컬럼 부피 (CV)의 평형 완충액으로 세척하였다. 고전도율의 완충액 (20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl)으로 교환함으로써 달성된 단계 용리에 의해 산물을 용리하였다. 피크 분획을 수집하였고, 그 수율은 약 50 내지 60％였다.

별법으로, 분획 수집액을 한외여과에 의해 농축시켜 중간 부피를 감소시키고 하기 침전 조건으로 표준화시켰다. 바람직하게는 5 내지 10 kDa 컷오프의 막을 사용하고, 약 20 ㎎/㎖의 표적 산물 농도로 조정하였다.

황산 암모늄 침전

이전 단계로부터의 포획 수집액을, 통상적으로 2.4 M (NH₄)₂SO₄를 사용하여 숙주 세포의 오염 단백질을 침전시킴으로써 추가로 정제하였다. 이 황산 암모늄-농축 결과, 침전물에는 산물이 거의 발견되지 않고 순수한 HCP-무함유 상청액만 잔존시켰으며, 이는 하기 RPC 정제 전에 RPC 로딩액 중 (NH₄)₂SO₄의 농도가 240 mM 미만이 되도록 희석해야만 했다.

침전은 1.5배 부피의 황산 암모늄 원액 (4 M (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris (pH 7.5))을 1배 부피의 포획 수집액에 첨가하고, 10 내지 15℃에서 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 수행하였고, 침전물의 분리는 심층 여과 (Seitz Bio 10 또는 Cuno A90M08) 및 0.2 μ 여과 (사토브란 P; Satorius) 또는 듀로포어 0.22 μ; Milipore)에 의해 수행하였다. 용리 부피가 큰 경우에는, rhEpo 용리 수집액을 희석 (< 5 ㎎ rhEpo/㎖)하고 HCP 침전은 임의의 UF-여과 단계 (10 kDa 컷오프)에 의해 개선될 수 있다.

황산 암모늄 침전은 소수성 상호작용 크로마토그래피보다 효과적이다.

선행 침전 단계에서 황산 암모늄의 함량을 감소시키기 위해, 산물을 함유하는 상청액은 상기 언급한 바와 같이 희석해야만 한다. 다른 방법은 한외여과/투석여과 단계를 거치는 것이다. 바람직하게는 5 내지 10 kDa 컷오프 막을 사용하고, 표적 황산 암모늄 농도를 240 mM 미만으로 하며, 산물 농도를 약 30 ㎎/㎖로 조정한다. 투석여과 단계에 사용된 완충액은 20 mM Tris/HCl (pH 7.0)이다.

역상 크로마토그래피

다음 정제 단계는 하기의 몇몇 관점에서 유용한 역상 크로마토그래피이다: a) 상이한 이소형이 당 백본에 따라 잘 분리됨 (낮게 글리코실화/사알릴화된 형태 이전에 고도로 글리코실화/시알릴화된 용리액), b) 잔류 숙수 세포 단백질이 고성능 크로마토그래피에 의해 제거됨, 및 c) 크로마토그래피가 바이러스 제거 뿐만 아니라 유기 용매에 의한 바이러스 불활성화를 위해 강력한 단계임. 공급원 30RPC (Amersham Biosciences)는 중합체 수지로, a) 중간 압력 (< 10 bar)에서 러닝될 수 있고, b) 높은 NaOH 농도에서 제거될 수 있다. 바람직한 베드 높이는 10 내지 15 cm이며, 권장 로딩 범위는 패킹된 수지 1 ml 당 rhEpo 8 내지 12 ㎎이다.

RPC 단계 이전에, 산물을 함유하는 상청액은 황산 암모늄의 최종 농도를 0.24 M 미만으로 조정해야 한다. 이러한 조건화는, RPC 로딩 단계에서 이후의 온라인 희석 단계 (1배 부피의 rhEpo-상청액 + 4배 부피의 20 mM Tris/HCl pH 7.0 + 5배 부피의 20 mM Tris/HCl pH 7.0 중 50 부피/부피％ ACN)에 의해, 또는 값비싼 유기 용매를 절약하기 위해서 바람직하게는 로딩 단계 전에 다시 20 mM Tris/HCl pH 7.0에 대한 투석여과/농축 (10 kDa을 컷오프하는 UF)에 의해 수행될 수 있다. 컬럼은 20 mM Tris/HCl pH 7.0 중 25 부피/부피％ 아세토니트릴 (ACN)을 로딩하기 전에 평형화시켰고, 로딩한 후에 세척하였다. 산물은 ACN 25％에서 50％로의 선형 구배로 용리시켰고, 용매 농도를 즉각 감소시키기 위해 미리 4배 부피의 희석 완충액 (50 mM Tris pH 7.0)을 채워놓고 작은 분획으로 (특히 약 0.2 CV, 별법으로 약 0.3 내지 0.5 CV) 수집하였는데, 이는 응집을 유도하여 하기 AEX 크로마토그래피에좋지 않은 영향을 미칠 수 있다. 용리 피크의 대략 처음 절반의 분획을 수집하여 RPC-수집액으로 하고, 이를 추가로 가공하였다. 이 수집액은 고도의 글리코실화를 선호하는 이소형을 함유하고 있었다. 이 분획화 체계에 의해, 세포 배양물에서 최대 20％까지 존재하는 O-글리칸이 Ser126 위치에서 손실된 des-O-글리코실화 rhEpo 산물이 제거되었다.

별법으로, 유기 용매에 노출시킴으로써 바이러스의 불활성화를 유도하기 위해, 분획을 미리 4배 부피의 상기 동일한 완충액 대신 0.5배 부피의 20 mM Tris pH 7.0으로 채워놓고 20 내지 40분 이상 인큐베이션시켰다. 이 인큐베이션 단계 후, 희석되지 않은 원래 분획의 부피를 기준으로 3.5배 부피의 20 mM Tris pH 7.0을 추가로 첨가하여 바이러스 불활성화를 중지시켰다.

바이러스가 불활성화된 분획 또는 불활성화되지 않은 분획을 수집하여 추가로 정제하였다. 수집은 대체로 상승 부위 중 최대 OD의 50 내지 100％에서 시작하여, 대략 하강 부위에서 70 내지 80％가 넘는 분획으로 종결하였다. 초기 용리 분획은 숙주 세포 단백질을 함유할 수 있는 반면, 후기 용리 분획은 낮은 시알릴화의 낮은 활성 이소형을 함유한다. 추가로, CZE 분석을 수행하여 특정 이소형에 대한 수집을 지지할 수 있다.

음이온 교환 크로마토그래피

이어서, 희석된 RPC-수집액을 고성능 AEX 컬럼에 로딩하였는데, 이 컬럼은 특정 이소형에 대한 선택을 추가로 보조하고 숙주 세포 단백질을 제거한다. 이때, 이소형은 등전점에 따라 (즉, 글리코실화의 등급에 비례하는 시알산의 수에 따라)분리된다. 훌륭한 분리 효율을 나타내는 고성능 수지 Q-세파로스 HP (Amersham Biosciences)를 사용하였다. 베드 높이는 15 내지 20 cm 사이였다. 로딩량, 구배 및 베드 높이와 같은 모든 조건은 다소 낮은 산물 농도를 유지하도록 규정하였는데, 이와 같이 하지 않으면 용리시 용매에 의한 산물의 응집으로 인해 상당량의 포스트-피크 (post-peak)가 초래된다.

RPC-수집액은, 20 mM Tris pH 7.0으로 평형화된 Q 세파로스 HP에서 수지 1 ㎖ 당 2 내지 4 ㎎의 Epo로 로딩되었다. 평형 완충액을 사용한 세척 단계 후, 산물을 평형 완충액 중 0에서 300 mM NaCl로의 선형 염 구배 10 CV로 용리하였다. 용리 피크는 0.1 CV 또는 0.25 CV 분획으로 수집하였고, 분석 도구는 CZE에 의해 분석하여 원하는 에리트로포에틴 이소형을 함유하는 올바른 분획 수집액을 찾아내었다. AEX-수집액은 통상 용리 분획의 제2 절반으로 구성되며, 여기서 고도로 글리코실화되고 시알릴화된 이소형이 용리된다.

상이한 발효 조건 또는 숙주 시스템으로 인해 공급원이 고도로 시알릴화된 이소형을 단지 소량으로만 함유하더라도, 정제 절차 중의 대조군으로서 모세관 구역 전기영동 (CZE)을 이용하여, 정확하게 규정된 에리트로포에틴 이소형들의 혼합물을 제조하는 것이 가능하다.

CZE는 상이하게 대전된 이소형들을 분리할 수 있는 고해상도 방법이다. CZE는 각 분획에서 모든 단일 이소형에 대한 정량적 결과를 제공한다. 이 정보는 배치들 사이에서 일관된 이소형 프로필을 나타내는 특별한 분획의 수집을 가능하게 한다. 통상적으로, 후기 용리 분획만을 수집하기 때문에 초기에 용리되는 낮은 시알릴화 이소형은 누락된다.

크기별 배제 크로마토그래피

마지막 크로마토그래피 단계에서, AEX-수집액을 크기 배제에 의해 마무리 처리하여 잠재적 이량체 및 고분자량 응집물을 제거하고 최종 제제를 위해 완충액 교환을 수행하였다. 이 단계에 사용된 수퍼덱스 75 정제 그레이드 (Pharmacia)는 컬럼 부피의 15％까지의 높은 로딩 부피에서도 양호한 해상도를 나타낸다. 바람직한 베드 높이는 60 내지 80 cm 사이이다.

AEX-수집액 중에 산물이 높은 농도로 존재하도록 이전 단계의 AEX-크로마토그래피를 수행하는 것이 불가능하기 때문에, 겔 여과 전에 수집액을 농축해야만 했다. 이는 10 kDa UF-막을 사용한 한외 여과 단계에 의해 수행하여, 에리트로포에틴이 약 10 ㎎/㎖로 약 10배 농축된 UF-체류물을 얻었다.

약 3 내지 7 CV의 UF-체류물을, 20 mM Na-포스페이트 pH 7.0, 75 mM NaCl로 미리 평형화된 수퍼덱스 75 pg 컬럼에 직접 로딩하였다. 약 1 내지 1.5 CV 후에, 산물이 컬럼으로부터 용리되기 시작하였으며, 용리 피크를 수집하여 SEC-수집액을 얻었다.

나노 여과

잠재적 바이러스 로드 (load)를 제거하기 위해, 추가로 데드-엔드 바이러스-여과 단계를 수행하였다. 이 여과는 15 nm만큼 작은 입자를 제거하도록 디자인된 특별한 막, 예를 들어 플라노바 (Planova) 15N (Asahi)을 사용하여 수행하였다. 다른 데드-엔드 나노여과 단위로는 PALL 울티포르 (Ultipor) VF 등급 DV20 또는 밀리포어 비레솔브 (Millipore Viresolve) NEF 카트리지 또는 캡슐이 있다. 특히 외피가 없는 작은 바이러스 (예를 들어, 파르보바이러스)의 경우, 바이러스를 제거하거나 불활성화시키는 다른 도구가 거의 없다.

멸균 여과된 SEC-수집액을 적합한 막으로 데드-엔드 필터를 통과시켰고, 여액은 최종 벌크 약물 물질을 나타냈다. 별법으로, 나노여과는 UF-농축과 크기별 배제 크로마토그래피 사이에 삽입될 수도 있다.

상기 명세서에 언급한 모든 문헌은 본원에 참고로 포함된 것으로 간주한다. 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않는 본 발명의 바람직한 방법 및 시스템에 대한 다양한 변형 및 변화가 당업자에게는 명백할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 청구된 본 발명은 그러한 특정 실시양태로만 한정되는 것이 아님을 이해해야 한다. 더욱이, 분자생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한, 본원에 기재된 본 발명의 실시 모드에 대한 다양한 변형도 하기 청구항의 범위 내에 포함되는 것이다.

Claims

(a) (i) 원심분리에 이어지는 심층 여과 단계, (ii) 심층 여과 단계, 및 (iii) 원심분리로 이루어진 군으로부터 선택되는 절차를 수행함으로써 숙주 세포, 세포 구성성분 및 파편을 세포 배양 배지로부터 제거하여 청정화된 배양 배지 상청액을 수득하는 단계;

(b) 상청액의 전도도를 5 mS/cm 이하로 조정하고, pH를 약 7.0 내지 8.0으로 조정하는 단계;

(c) 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함하는 칼럼에 단계 (b)로부터의 상청액을 가하고, 칼럼을 세척하고, 칼럼으로부터의 재조합 인간 에리트로포에틴 (rhEpo)을 용리하고, rhEpo를 함유한 피크 분획(들)을 수집하는 단계;

(d) 매질 압력 (< 10 바아) 하에 유출될 수 있고 고농도의 NaOH에 내성인 수지를 사용하여 단계 (c)로부터의 합한 피크 분획을 역상 크로마토그래피 단계로 처리하며 유기 용매의 선형 구배를 사용하여 rhEpo를 용리하는 단계;

(e) 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함하는 칼럼에 rhEpo를 함유하며 단계 (d)에서 용리된 하나 이상의 분획을 가하고, 칼럼을 세척하고, 선형 염 구배를 사용하여 rhEpo를 용리하는 단계;

(f) rhEpo를 함유하며 단계 (e)에서 용리된 하나 이상의 분획을 rhEpo의 시알릴화 정도에 기초하여 선별하는 단계; 및

(g) 겔 여과 매질을 사용하는 1회 이상의 크기별 배제 크로마토그래피 단계에 의해 rhEpo를 함유하며 단계 (f)에서 용리된 하나 이상의 분획을 처리하여 잠재적인 이량체 및 더 고도의 응집체를 제거하고; rhEpo를 함유한 용리액을 수집하는 단계

를 포함하는, 숙주 세포를 포함하는 세포 배양 배지로부터의 재조합 인간 에리트로포에틴 (rhEpo)의 회수 및 정제 방법.
제1항에 있어서, 단계 (a)에서 원심분리를 디스크 적층 분리기 (disc stack separator)를 사용하여 수행하는 방법.
제1항에 있어서, rhEpo를 함유하며 단계 (d)에서 용리된 하나 이상의 분획을 rhEpo의 시알릴화 정도에 기초하여 선별하는 추가 단계를 단계 (d)와 단계 (e) 사이에 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (d) 전에 단계 (c)로부터의 피크 분획을 황산암모늄 침전 단계로 처리하여 오염 숙주 세포 단백질을 침전시키며, 이어서 상청액의 황산암모늄 농도를 단계 (d)에 적합한 농도로 조정하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 농도가 0.24 M 미만의 황산암모늄인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b)에서 pH가 약 pH 7.5인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)에서 용리 단계를 염 농도가 125 mM 초과인 완충액을 사용하여 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (d)에서 유기 용매를 아세토니트릴, 에탄올 및 헥실렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (d)에서 Epo 폴리펩티드를 약 10％ 내지 약 100％의 유기 용매의 선형 구배를 사용하여 용리하는 방법.
제8항에 있어서, 단계 (d)에서 유기 용매가 아세토니트릴이고, Epo 폴리펩티드를 약 25％ 내지 약 50％의 구배를 사용하여 용리하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (e) 전에 단계 (d)에서 용리된 분획을 적절한 수성 완충액으로 희석하는 방법.
제11항에 있어서, 단계 (e) 전에 희석된 분획을 바이러스 오염물을 불활성화시키기에 충분히 적절한 양의 시간 동안 정치시키는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (g)에서 분획을 크기별 배제 크로마토그래피 단계 전에 한외여과 단계로 처리하는 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서, 단계 (d)에서 분획을 역상 크로마토그래피 전에 한외여과 단계로 처리하는 방법.
제4항에 있어서, 단계 (c)로부터의 합한 피크 분획을 황산암모늄 침전 단계 전에 한외여과 단계로 처리하는 방법.
제1항에 있어서, 바이러스를 제거하는 데드-엔드 (dead-end) 나노-여과 단계를 단계 (g)의 전 또는 후에 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (a)에서 임의의 절차 (i), (ii) 또는 (iii) 후에 0.2 ㎛ 여과 단계가 이어지는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 단계 (f)에서 또는 단계 (d)와 단계 (e) 사이의 하나 이상의 선별 절차를 모세관 구역 전기영동을 사용하여 수행하는 방법.
(a) (i) 원심분리에 이어지는 심층 여과 단계, (ii) 심층 여과 단계, 및 (iii) 원심분리로 이루어진 군으로부터 선택되는 절차를 수행함으로써 숙주 세포, 세포 구성성분 및 파편을 세포 배양 배지로부터 제거하여 청정화된 배양 배지 상청액을 수득하며, 여기서 원심분리는 디스크 적층 분리기로 수행하는 단계;

(b) 상청액의 전도도를 5 mS/cm 이하로 조정하고, pH를 약 7.0 내지 8.0으로 조정하는 단계;

(c) Q-HyperD F (BioSepra) 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함하는 칼럼에 단계 (b)로부터의 상청액을 가하고, 칼럼을 세척하고, 칼럼으로부터의 rhEpo를 용리하고, rhEpo를 함유한 피크 분획(들)을 수집하는 단계;

(d) 소스 (Source) 30RPC (아머샴 바이오사이언스 (Amersham Biosciences))를 비롯한, 매질 압력 (< 10 바아) 하에 유출될 수 있고 고농도의 NaOH에 내성인 폴리스티렌 수지를 사용하여 단계 (c)로부터의 합한 피크 분획을 역상 크로마토그래피 단계로 처리하며, 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 rhEpo를 용리하는 단계;

(e) rhEpo를 함유하며 단계 (d)에서 용리된 하나 이상의 분획을 rhEpo의 시알릴화 정도에 기초하여 선별하고, Q-Seph HP (아머샴 바이오사이언스) 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함하는 칼럼에 가하고, 칼럼을 세척하고, 선형 염 구배를 사용하여 rhEpo를 용리하는 단계; 및

(f) rhEpo를 함유하며 단계 (e)에서 용리된 하나 이상의 분획을 rhEpo의 시알릴화 정도에 기초하여 선별하고, 상기 분획을 수퍼덱스 75 프렙 그레이드 (Superdex 75 prep grade) (아머샴 바이오사이언스)를 사용하는 크기별 배제 크로마토그래피로 처리하여 잠재적인 이량체 및 더 고도의 응집체를 제거하고; rhEpo를 함유한 용리액을 수집하는 단계

를 포함하는, 숙주 세포를 포함하는 세포 배양 배지로부터의 재조합 인간 에리트로포에틴 (rhEpo)의 회수 및 정제 방법.
제19항에 있어서, 하나 이상의 분획을 단계 (e) 및(또는) 단계 (f)에서 모세관 구역 전기영동으로 선별하는 방법.
제20항에 있어서, 단계 (d) 전에 단계 (c)로부터의 합한 피크 분획을 황산암모늄 침전 단계로 처리하여 오염 숙주 세포 단백질을 침전시키고, 이어서 상청액의 황산암모늄 농도를 단계 (d)에 적합한 농도로 조정하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 농도가 0.24 M 미만의 황산암모늄인 방법.
제19항에 있어서, 바이러스를 제거하는 데드-엔드 나노-여과 단계를 단계 (f)의 전 또는 후에 추가로 포함하는 방법.
제19항에 있어서, 배양 배지가 혈청-무함유이고, 숙주 세포를 불연속 공급 배치 발효 공정으로 배양하는 방법.
CZE를 사용하여 글리코실화 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 이소형 (isoform)을 포함하는 샘플을 분석하는 것을 포함하는, 글리코실화 단백질 또는 폴리펩티드의 정의된 이소형 조성물의 제조 방법.
제25항에 있어서, 상기 이소형의 글리코실화 단백질 또는 폴리펩티드가 재조합 인간 에리트로포에틴의 이소형인 방법.