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KR20040004614A - 글루칸의 생성방법 및 제조방법 - Google Patents

글루칸의 생성방법 및 제조방법 Download PDF

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KR20040004614A
KR20040004614A KR10-2003-7014399A KR20037014399A KR20040004614A KR 20040004614 A KR20040004614 A KR 20040004614A KR 20037014399 A KR20037014399 A KR 20037014399A KR 20040004614 A KR20040004614 A KR 20040004614A
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KR
South Korea
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glucan
sucrose
phosphatase
reaction
amylose
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KR10-2003-7014399A
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후지이카주토시
테라다요시노부
야나세미치요
오단코지
타카타히로키
타카타타케시
쿠리키타카시
오카다시게타카
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에자끼구리고가부시키가이샤
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Publication date
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Abstract

글루칸을 생성하는 첫 번째 방법은 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 반응 용액을 반응하게 하여 글루칸을 생성하는 단계로 구성된다. 상기 반응의 시작부터 반응의 종료까지 반응 용액의 슈크로스-인산 비율의 최대 수치는 17 이항다. 글루칸을 생성하는 두 번째 방법은 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 반응 용액을 반응하게 하여 글루칸을 생성하는 단계로 구성된다. 상기 반응은 약 40∼70℃의 온도에서 수행된다.

Description

글루칸의 생성방법 및 제조방법{Production method and preparation method of glucans}
글루칸은 사카라이드 성분이 D-글루코스로만 구성된 폴리사카라이드에 대한 일반적 용어이다. 대표적인 글루칸의 예는 전분, 셀룰로스 등을 포함한다. 전분은 사카라이드 성분이 α-글루코시드 결합에 의해 결합된 α-글루칸이다. 전분에는 직쇄 α-1,4-글루칸인 아밀로스 및 분지된 구조를 지닌 아밀로펙틴이 존재한다. 아밀로펙틴에 대한 아밀로스의 풍부한 비율은 식물 보관 전분에 따라 달라진다. 따라서 이는 정해지지 않은 조성비에서 아밀로스 및 아밀로펙틴을 함유한 전분을 수득하는 것은 매우 어렵다. 아밀로스가 안정하게 생성되는 경우 이러한 아밀로스는 정해지지 않은 아밀로스 함량을 지닌 전분을 생성하기 위해 통상의 전분과 혼합될 수 있다.
통상적으로 정해지지 않은 구조를 지닌 아밀로스 및 아밀로펙틴은 가수분해 효소, 트랜스퍼라제의 작용을 이용함으로서 생성된다. 그러나 그의 α-1,4-글루칸 체인 확장에 의한 전분의 구조적 변화에 대한 보고는 제한된다. 아밀로스가 생성될 수 있고 전분의 구조가 정해지지 않고 변형될 수 있기 때문에 α-1,4-글루칸 체인을 효과적으로 확장하는 방법을 개발하는 것이 유용하다.
전분-함유 식품에서 전분 내 아밀로스의 함량 및 구조는 식품의 물리적 성질에 크게 영향을 미침이 알려져 있다. 그러나 전분 내 아밀로스의 함량 및 구조는 비가공 재료로 사용된 전분에 의해 측정된다. 아밀로스 함량 및 구조가 정해지지 않고 변화될 수 있다면 신규한 질감을 지닌 식물의 개발이 기대될 수 있다.
불용성 아밀로스는 식이섬유와 동일한 기능을 지닌 것으로 기대되고, 건강식품에 이용될 수 있는 것으로 기대될 수 있다. 또한 아밀로스는 아밀로스가 분자 내 예를 들어 요오드, 지방산 등을 포함할 수 있다는 특징을 지닌다. 따라서 아밀로스는 약품, 화장품 및 위생품 분야에 이용될 것으로 기대된다. 또한 아밀로스는 아밀로스와 동일한 함유 용량을 지닌 시클로덱스트린(cyclodextrin) 및 시클로아밀로스의 생성의 비가공 물질로 사용될 수 있다. 또한 피막 함유 아밀로스는 일반-목적 플라스틱 못지 않은 장력 강도를 지니고 아밀로스는 생분해가능 플라스틱의 매우 유망한 물질이다. 따라서 아밀로스는 많은 적용을 지닌 것으로 기대된다. 그러나 실질적으로 순수한 아밀로스를 수득하는 것이 어렵고 이러한 아밀로스는 매우 고가이다. 따라서 이러한 아밀로스는 시약 등급으로서만 유통되고 산업용 물질로는 거의 이용되지 않는다. 따라서 안정하고 저렴한 방식으로 아밀로스를 생성하는 방법이 요구된다.
일부 알려진 아밀로스를 생성하는 방법이 있다. 아밀로스는 약 0∼70%의 비율로 전분 내에 존재한다. 아밀로스는 T.J. Schoch et al., J. American Chemical Society, 64, 2957(1942) 내에 기술된 방법에 의해 부탄올과 같은 침전제를 이용하여 천연 물질 전분으로부터 추출될 수 있다. 그러나 이러한 추출 실시는 복잡하고 낮은 산출량을 지닌다. 또한 추출 실시에 의해 어떤 α-1,6-글루코시다제 결합도 함유하지 않은 직쇄 글루칸을 수득하는 것은 어렵다. 더욱이 낮은 분자량 분포를 지닌 직쇄 글루칸을 추출하는 것은 어렵다.
효소적으로 α-1,4-글루칸 체인을 확장하기 위한 방법으로서 당 뉴클레오타이드가 기질로서 사용되고 당 반(moiety)이 글리코겐 신타제, 전분 신타제 등에 의해 프라이머로서 말토테트라오스(maltotetraose)로 이동되는 합성적 방법이 있다. 그러나 이러한 방법은 기질로 사용되는 당 뉴클레오타이드가 매우 고가라는 단점을 지니고 따라서 산업적으로 이용될 수 없다.
감자로부터 유도된 글루칸 가인산분해효소(GP)에 의해 말토헵타오스(maltoheptaose)와 같은 프라이머에 α-글루코스-1-인산의 글리코실 그룹을 이동시킴으로서 α-1,4-글루칸 체인을 합성하는 방법이 있다.
또한 글루코스-1-불화물가 기질로 사용되고 슈크로스 가인산분해효소(SP) 및 글루칸 가인산분해효소가 동시에 프라이머에 작용하게 하는 방법이 개시된다(미국 특허 제5,405,449 및 EP 0590736).
이들 합성방법은 반응 용액 내에서 반응의 시작시 프라이머에 대한 기질의 비율이 정해지지 않고 있어서 수득된 직쇄 글루칸의 분자량이 조절될 수 있다는 장점이 있다. 그러나 기질, α-글로코스-1-인산 및 글루코스-1-불화물이 고가이고 따라서 광범위한 산업에 이용되는 직쇄 α-1,4-글루칸의 저비용 생성에 적당하지 않다.
더욱 저비용 방식으로 직쇄 글루칸을 생성하는 방법으로서 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 인산효소가 동시에 프라이머 및 당에 작용하게 되는 방법(이후 SP-GP 방법으로 표기)이 개시되었다(Waldmann, H. et al., Carbohydrate Reserch, 157 (1986) c4-c7). Waldmann et al.은 류코노스토크(Leuconostoc)속(Leuconostoc mesenteroides)으로부터 유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 감자 괴경으로부터 유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 높은 산출량으로 슈크로스로부터 직쇄 글루칸을 합성하였다. Waldmann et al.의 SP-GP 방법은 저비용의 기질이 직쇄 글루칸을 생성하는데 사용될 수 있다는 점에서 유망하나 하기에 나타난 바와 같은 개선이 필요하다는 문제점이 있다.
먼저, 많은 양의 효소가 사용되기 때문에 생산 비용이 높고 저비용 생산이 불가능하다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 사용되는 효소의 양이 감소될 필요가 있거나 유니트 효소 당 아밀로스 생산성이 반응 조건을 연구함으로서 개선될 필요가 있다.
SP-GP 방법에서 사용되는 효소의 양 또는 효소 당 아밀로스 생산성을 결정하는 인자 중 하나는 예를 들어 반응의 시작시 용액 내에서 SP의 기질인 슈크로스에 대한 무기 인산의 농도비이다. Waldmann et al.의 선행기술에서 반응의 시작시 용액 내 슈크로스 농도에 비교하여 상당히 낮은 농도를 지닌 무기 인산이 사용되어 글루칸이 높은 산출량으로 생성된다. 슈크로스가 먼저 글루코스-1-인산으로 전환된 후 글루코스-1-인산이 글루칸으로 전환되는 SP-GP 방법에서 고-농도 무기 인산이 사용되면 중간물, 글루코스-1-인산이 높은 농도로 축적된다. 따라서 최종 물질, 글루칸이 감소되는 것으로 여겨진다. 따라서 낮은 무기 인산 농도가 통상의 SP-GP 방법에 채택되어야 할 것으로 여겨진다. 본 발명전에 반응 시작시 용액 내 무기 인산에 대한 슈크로스의 농도비의 변화가 사용되는 효소의 양 및 효소 당 아밀로스 생산성에 얼마나 영향을 미치는 뿐만 아니라 이러한 변화의 영향의 예측의개시가 없었다.
2가지 타입의 가인산분해효소가 SP-GP 방법과 유사하게 결합되고 탄수화물이 무기 인산을 통해 합성되는 방법이 보고되었다. 예를 들어 Chaen et al. (Journal of Bioscience and Bioengineering, 92 (2001) 177-182)은 말토스 가인산분해효소 및 코지비오스(kojibiose) 가인산분해효소의 결합을 이용하여 말토스로부터 코지올리고사카라이드를 합성하는 방법을 개시하였다. Chaen et al.은 반응의 시작시 용액 내 무기 인산 농도가 더 낮을수록 반응 생성물 즉, 코지올리고사카라이드의 산출량이 더 많아진다고 기술하였다. 따라서 2개의 가인산분해효소가 결합된 반응 시스템에서 반응 시작시 용액 내 무기 인산 농도는 바람직하게는 최종 생성물의 산출량을 증가시키기 위해 낮은 것으로 통상적으로 여겨진다.
SP-GP 방법에서 사용되는 효소의 양 또는 효소 당 아밀로스 생산성을 결정하는 두 번째 인자는 반응 온도이다. 일반적으로 효소 반응에서 반응 온도가 더 높을수록 반응 속도가 너 높아진다. 따라서 반응이 높은 온도 조건 하에서 수행되는 것이 바람직하다. 그러나 효소 단백질이 가열에 불안정하기 때문에 실질적인 효소 반응은 효소 단백질이 열적으로 불활성화되지 않는 온도 범위 내에서 수행된다. Waldmann et al.의 선행기술에서 류코노스토크속으로부터 유도된 슈크로스 가인산분해효소가 사용되었고 글루칸 합성 반응이 이러한 효소의 열 안정성을 고려하여 37℃에서 수행되었다. 본 발명전에 반응 용액의 슈크로스 농도의 변화가 슈크로스 가인산분해효소의 안정성에 얼마나 영향을 미치는지가 개시되지 않았고, 그의 효과가 예측될 수 없었다. 또한 스트렙토코커스속으로부터 유도된 슈크로스 가인산분해효소의 열 안정성에 대한 개시도 없었다. 따라서 글루칸 합성에 이러한 슈크로스 가인산분해효소를 이용하는 어떠한 효과도 예측하는 것이 불가능하였다.
두 번째 문제점으로서 실시가능성 문제점이다. 글루칸, 특히 아밀로스는 노화되어 불용성이 되어 침전 또는 겔 형성을 초래한다. 노화 속도는 온도에 따라 달라진다. 반응 온도가 낮으면 실시가능성 문제점은 아밀로스 용액의 겔화와 같은 생성 후 하위 단계에서 발생한다. 따라서 반응 온도는 바람직하게는 가능한 높다. 그러나 Waldamann et al.의 선행기술에서 아밀로스가 생성되는 반응 온도는 의심스럽게도 37℃ 정도로 낮다.
글루칸 외에 분지 구조가 없는 직쇄 아밀로스가 특이적으로 생성되면 직쇄 말토-올리고사카라이드는 프라이머로서 사용되어야 한다. Waldamann et al.의 선행기술에서 정제된 말토헵타오스가 직쇄 말토-올리고사카라이드로서 사용된다. 그러나 정제된 말토헵타오스는 시약 등급으로서만 유통되고 매우 고가이다. 저비용의 프라이머 후보는 적당히 전분을 하이브리다이즈함으로서 수득된 말토-올리고사카라이드의 혼합물을 포함한다. 그러나 많은 글루칸 가인산분해효소에 있어서말토테트라오스 보다 더 높거나 동일한 정도의 중합반응을 지닌 말토-올리고사카라이드만이 프라이머로서 사용될 수 있으나 말토테트라오스 보다 더 작거나 동일한 정도의 중합반응을 지닌 말토-올리고사카라이드는 프라이머로서 사용될 수 없다고 알려져 있다. 말토-올리고사카라이드 혼합물은 프라이머로서 기능할 수 있는 말토헥사오스보다 더 크거나 동일한 정도의 중합반응을 지닌 말토-올리고사카라이드 이외에 말토트리오스, 말토스 및 글루코스를 포함한다. 또한 말토-올리고사카라이드 혼합물 내에 포함된 글루코스는 슈크로스 가인산분해효소의 억제자라고 알려져 있다. 따라서 말토트리오스, 말토스 및 프라이머로서 기능할 수 없는 글루코스 및 슈크로스 가인산분해효소의 억제자인 글루코스를 함유한 말토-올리고사카라이드 혼합물이 SP-GP 방법에 효과적으로 기능할 수 있는지 여부가 본 발명전에 개시되지 않았고 그의 효율성이 용이하게 추측될 수 없었다.
본 발명의 방법의 경우 많은 양의 프럭토스가 효소 반응의 종결 후 반응 용액 내에서 글루칸과 함께 이차적으로 생성된다. 따라서 본 발명의 방법을 이용한산업적 글루칸 생성의 경우 글루칸 합성 반응 단계 후 글루칸을 효과적으로 정제하는 방법이 필수적이다. Waldamann et al.의 선행기술에서 아밀로스를 정제할 때 부탄올을 이용하여 아밀로스를 선택적으로 침전시키는 방법이 사용된다. 그러나 아밀로스가 산업적으로 대량으로 생산될 때 유기 용매를 이용한 방법은 비용, 신체에 대하 안전성 및 환경적 이슈의 측면에서 우수한 방법이 아니다. 어떤 유기 용매도 사용하지 않는 방법은 개시되지 않았다.
본 발명은 글루칸 및 그의 유도체의 생성방법에 관한 것이다. 더욱 특별하게는 본 발명은 α-1,4-글루칸 체인을 확장시키는 방법에 관한 것이다.
도 1은 슈크로스로부터의 글루칸 합성의 생성 공정을 나타내는 개략도이다.
도 2 37℃ 및 45℃의 반응 온도에서 4% 초기 슈크로스, 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행될 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 3은 45℃의 반응 온도에서 다양한 초기 슈크로스 농도에서 반응이 수행될 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 4는 37℃ 및 45℃의 반응 온도에서 다양한 초기 슈크로스 농도에서 반응이 수행될 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 5는 다양한 초기 슈크로스 농도로 스트렙토코커스 뮤탄스(열-저항성 박테리아)-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 45℃ 및 50℃일 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 6은 다양한 초기 슈크로스 농도로 도 5에서 사용된 효소 활성의 반에 상응하는 양으로 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 45℃ 및 50℃일 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 7은 다양한 초기 슈크로스 농도로 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 45℃일 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 8은 다양한 초기 슈크로스 농도로 도 7에서 사용된 효소 활성의 반에 상응하는 양으로 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 45℃일 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 9는 다양한 초기 슈크로스 농도로 스트렙토코커스 뮤탄스(열-저항성 박테리아)-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 50℃일 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 10은 다양한 초기 슈크로스 농도로 도 9에서 사용된 효소 활성의 반에 상응하는 양으로 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 50℃일 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 11은 다양한 초기 슈크로스 농도로 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 45℃일 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 12는 다양한 초기 슈크로스 농도로 도 11에서 사용된 효소 활성의 반에 상응하는 양으로 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 37℃ 및 45℃일 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 13은 다양한 초기 슈크로스 농도로 스트렙토코커스 뮤탄스(열-저항성 박테리아)-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 50℃일 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 14는 다양한 초기 슈크로스 농도로 도 13에서 사용된 효소 활성의 반에 상응하는 양으로 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 45℃ 및 50℃일 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 15는 반응 시작시 초기 슈크로스 농도가 50%이고 스트렙토코커스 뮤탄스(열-저항성 박테리아)-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소 또는 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 65℃일 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 16은 다양한 초기 무기 인산 농도로 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 37℃일 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 17은 다양한 초기 무기 인산 농도로 스트렙토코커스 뮤탄스(열-저항성 박테리아)-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 45℃일 때 아밀로스의 산출량을 나타내는 그래프이다.
도 18은 다양한 슈크로스 농도의 슈크로스 용액 내에서 55℃에서 가열된 재조합 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소의 잔여 활성을 나타낸 그래프이다.
도 19는 다양한 슈크로스 농도의 슈크로스 용액 내에서 55℃에서 가열된 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소의 잔여 활성을 나타낸 그래프이다.
도 20은 슈크로스 가인산분해효소의 안정성 상의 슈크로스 또는 프럭토스의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 슈크로스 가인산분해효소의 안정성 상의 무기 인산의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 다양한 슈크로스 농도로 프라이머로서 풀룰란을 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 50℃일 때 글루칸의 산출량을 나타낸 그래프이다.
도 23은 다양한 무기 인산 농도로 프라이머로서 풀룰란을 이용하여 반응이 수행되고 반응 온도가 50℃일 때 글루칸의 산출량을 나타낸 그래프이다.
도 24는 글루코스-1-인산이 기질로 사용될 때 글루칸 산출량을 나타낸 그래프이다.
발명의 요약
본 발명은 상기-기술된 문제점을 해결하고자 한다. 본 발명의 목적은 통상적인 방법 보다 더욱 실용적인 조건 하에서 안정하고 저비용의 방식으로 글루칸, 특히 아밀로스를 생성하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 더욱 특별하게는 본 발명의 목적은 슈크로스로부터 아밀로스를 생성할 때 가능한 필요한 효소의 양을 감소시키고 높은 온도에서 반응을 수행하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 유기 용매를 이용하지 않고 생성된 아밀로스 용액으로부터 효과적으로 아밀로스를 정제하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 상기-기술된 문제점을 해결하기 위해 연구하였고 마침내 특정한 범위 내에서 반응의 시작에서부터 반응의 종결까지의 시간 동안 무기 인산 및 글루코스-1-인산의 총 몰 농도에 대한 슈크로스의 몰 농도의 비율의 최대 수치를 셋팅함으로서 통상의 방법 보다 더 높은 수준의 생산성이 수득될 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 발견에 기초하여 발명자들은 본 발명을 완성하였다.
또한 발명자들은 슈크로스 가인산분해효소의 열-저항성이 적어도 특정한 농도를 지닌 슈크로스의 존재시 증가하여 반응 온도가 증가될 수 있고; 그 결과로서 필요한 효소의 양이 감소될 수 있거나 유니트 효소 당 글루칸 생산성이 증가될 수 있고; 또한 반응이 높은 온도에서 수행되어 아밀로스가 노화없이 생성될 수 있음을 발견하였다. 이러한 관찰에 기초하여 발명자들은 본 발명을 완성하였다.
또한 본 발명자들은 반응 온도가 스트렙토코커스속으로부터 유도된 슈크로스 가인산분해효소를 이용함으로서 증가될 수 있고; 그 결과로서 필요한 효소의 양이 감소될 수 있거나 유니트 효소 당 글루칸 생산성이 증가될 수 있고; 또한 반응이 높은 온도에서 수행되어 아밀로스가 노화없이 생성될 수 있음을 관찰하였다. 이러한 관찰을 기초로 발명자들은 본 발명을 완성하였다.
또한 본 발명자들은 SP-GP 방법에서 사용되기 위한 프라이머로서 정제된 말토-올리고사카라이드 보다 말토-올리고사카라이드 혼합물(특히, 말토트리오스, 말토스 및 많은 글루코스 가인산분해효소에 대해 프라이머로서 기능할 수 없는 글루코스 및 슈크로스 가인산분해효소의 억제자인 글루코스를 함유한 것)이 사용되더라도 목적 글루칸의 합성이 특별한 문제점 없이 수행될 수 있음을 발견하였다. 이러한 발견에 기초하여 발명자들은 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 글루칸을 생성하기 위해 하기 과정의 어느 하나에 의해 프럭토스가 반응 용액으로부터 효과적으로 제거될 수 있고, 이러한 발견을 기초로 본발명을 완성하였다 :
(1) 유기 용매를 사용하지 않고 생성된 글루칸을 정제하고;
(2) 반응 후 반응 용액을 냉각시켜 글루칸을 침전시키고 고형-액체 분리 방법에 의해 침전된 글루칸을 정제하고;
(3) 글루칸 생성 반응 동안 또는 그 후 반응 용액을 냉각시켜 글루칸을 겔화하고, 물로의 세척, 동결-해동, 여과, 압착, 흡입 및 원심분리로 구성된 군으로부터 선택된 실시에 의해 겔화된 글루칸으로부터 프럭토스를 제거하고;
(4) 물에 용해된 글루칸을 침전시키지 않고, 글루칸 생성 반응 후 한외여과막 또는 크로마토그래피를 이용한 막 분획화에 의해 프럭토스를 제거한다.
글루칸을 생성하기 위한 본 발명의 첫 번째 방법은 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 반응 용액이 글루칸을 생성하도록 반응시키는 단계로 구성된다. 반응 시작부터 반응 종료까지 슈크로스-인산 비율의 최대 수치는 약 17 이하이다.
하나의 실시태양에서 상기 최대 수치는 0.5 이상이고 15 이하이고, 바람직하게는 1 이상 10 이하이고, 더욱 바람직하게는 2 이상 7 이하이다.
하나의 실시태양에서 상기 글루칸은 아밀로스이다.
하나의 실시태양에서 상기 슈크로스 가인산분해효소는 스트렙토코커스속에 속하는 박테리아로부터 유도된다. 바람직하게는 스크렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 써모필러스, 스트렙토코커스 뉴모니에 및 스트렙토코커스 미티스로 구성된 군으로부터 선택된 스트렙토코커스속에 속하는 박테리아로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서 상기 글루칸 가인산분해효소는 식물로부터 유도된다. 더욱 특별하게는 글루칸 가인산분해효소는 조류 또는 감자로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서 상기 글루칸 가인산분해효소는 써머스 아쿠아티커스 또는 바실러스 스테아로써모필러스로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서 상기 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 모두 또는 적어도 하나는 재조합 미생물로부터 생성된다.
하나의 실시태양에서 상기 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 모두 또는 적어도 하나는 담체 상에 고정된다.
하나의 실시태양에서 상기 슈크로스는 정제되지 않은 사카라이드이다.
하나의 실시태양에서 상기 프라이머는 말토-올리고사카라이드, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 덱스트린, 풀룰란, 커플링 당, 전분 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서 상기 말토-올리고사카라이드는 말토-올리고사카라이드 혼합물이다.
하나의 실시태양에서 상기 말토-올리고사카라이드 혼합물은 말토테트라오스 보다 더 크거나 동일한 중합반응 정도를 지닌 말토-올리고사카라이드 이외에 적어도 하나 이상의 말토트리오스, 말토스 및 글루코스를 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 전분은 가용성 전분, 왁스성 전분, 높은 아밀로스 전분, 디브랜칭(debranching) 효소에 의해 분해된 전분, 가인산분해효소에 의해 분해된 전분, 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분, 가공된 전분 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 유기 용매를 사용하지 않고 생성된 글루칸을 정제하는 단계로 더욱 구성된다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 반응 후 반응 용액을 냉각시켜 글루칸을 침전시키고, 고형-액체 분리 방법에 의해 침전된 글루칸을 정제하는 단계로 더욱구성된다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 글루칸 생성 반응 동안 또는 그 후 반응 용액을 냉각시켜 글루칸을 겔화시키고, 겔화된 글루칸을 회수하고, 물로의 세척, 동결-해동, 여과, 압착, 흡입 및 원심분리로 구성된 군으로부터 선택된 실시에 의해 겔화된 글루칸으로부터 프럭토스를 제거하는 단계로 더욱 구성된다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 글루칸 생성 반응 후 침전없이 한외여과막 또는 크로마토그래피를 이용하여 물 내에 용해된 글루칸을 막 분획화시켜 프럭토스를 제거하는 단계로 더욱 구성된다. 한외여과막은 약 30,000의 분자량 컷오프(cutoff)를 지닌다. 한외여과막은 할로우 파이버(hollow fiber) 타입이다. 크로마토그래피에 사용되는 담체는 겔 여과 크로마토그래피용 담체, 리간드 교환 크로마토그래피용 담체, 이온 교환 크로마토그래피용 담체 또는 소수성 크로마토그래피용 담체이다.
하나의 실시태양에서 상기 반응 용액은 디브랜칭 효소, 브랜칭 효소, 4-α-글루카노트랜스퍼라제 및 글리코겐 디브랜칭 효소로 구성된 군으로부터 선택된 효소를 더욱 포함한다.
글루칸을 생성하기 위한 본 발명의 두 번째 방법은 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 반응 용액이 글루칸을 생성하도록 반응하게 하는 단계로 구성된다. 반응은 약 40∼70℃의 온도에서 수행된다.
하나의 실시태양에서 상기 반응 온도는 약 45∼65℃이다.
하나의 실시태양에서 상기 반응 용액의 슈크로스 농도는 반응 시작시 약 5∼100%, 바람직하게는 약 8∼80%, 더욱 바람직하게는 약 15∼50%이다.
하나의 실시태양에서 상기 글루칸은 아밀로스이다.
하나의 실시태양에서 상기 슈크로스 가인산분해효소는 스트렙토코커스속에 속하는 박테리아로부터 유도된다. 바람직하게는 스크렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 써모필러스, 스트렙토코커스 뉴모니에 및 스트렙토코커스 미티스로 구성된 군으로부터 선택된 스트렙토코커스속에 속하는 박테리아로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서 상기 글루칸 가인산분해효소는 식물로부터 유도된다. 더욱 특별하게는 글루칸 가인산분해효소는 조류 또는 감자로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서 상기 글루칸 가인산분해효소는 써머스 아쿠아티커스 또는 바실러스 스테아로써모필러스로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서 상기 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 모두 또는 적어도 하나는 재조합 미생물로부터 생성된다.
하나의 실시태양에서 상기 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 모두 또는 적어도 하나는 담체 상에 고정된다.
하나의 실시태양에서 상기 슈크로스는 정제되지 않은 사카라이드이다.
하나의 실시태양에서 상기 프라이머는 말토-올리고사카라이드, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 덱스트린, 풀룰란, 커플링 당, 전분 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서 상기 말토-올리고사카라이드는 말토-올리고사카라이드 혼합물이다.
하나의 실시태양에서 상기 말토-올리고사카라이드 혼합물은 말토테트라오스 보다 더 크거나 동일한 중합반응 정도를 지닌 말토-올리고사카라이드 이외에 적어도 하나 이상의 말토트리오스, 말토스 및 글루코스를 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 전분은 가용성 전분, 왁스성 전분, 높은 아밀로스 전분, 디브랜칭(debranching) 효소에 의해 분해된 전분, 가인산분해효소에 의해 분해된 전분, 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분, 가공된 전분 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 유기 용매를 사용하지 않고 생성된 글루칸을 정제하는 단계로 더욱 구성된다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 반응 후 반응 용액을 냉각시켜 글루칸을 침전시키고, 고형-액체 분리 방법에 의해 침전된 글루칸을 정제하는 단계로 더욱 구성된다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 글루칸 생성 반응 동안 또는 그 후 반응 용액을 냉각시켜 글루칸을 겔화시키고, 겔화된 글루칸을 회수하고, 물로의 세척, 동결-해동, 여과, 압착, 흡입 및 원심분리로 구성된 군으로부터 선택된 실시에 의해 겔화된 글루칸으로부터 프럭토스를 제거하는 단계로 더욱 구성된다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 글루칸 생성 반응 후 침전없이 한외여과막 또는 크로마토그래피를 이용하여 물 내에 용해된 글루칸을 막 분획화시켜 프럭토스를 제거하는 단계로 더욱 구성된다. 한외여과막은 약 30,000의 분자량 컷오프(cutoff)를 지닌다. 한외여과막은 할로우 파이버(hollow fiber) 타입이다. 크로마토그래피에 사용되는 담체는 겔 여과 크로마토그래피용 담체, 리간드 교환 크로마토그래피용 담체, 이온 교환 크로마토그래피용 담체 또는 소수성 크로마토그래피용 담체이다.
하나의 실시태양에서 상기 반응 용액은 디브랜칭 효소, 브랜칭 효소, 4-α-글루카노트랜스퍼라제 및 글리코겐 디브랜칭 효소로 구성된 군으로부터 선택된 효소를 더욱 포함한다.
글루칸을 생성하기 위한 본 발명의 세 번째 방법은 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 포함한 반응 용액이 글루칸을 생성하도록 반응하게 하는 단계로 구성된다. 반응 시작부터 반응 종료까지 슈크로스-인산 비율의 최대 수치는 약 17 이하이고, 반응은 약 40∼70℃의 온도에서 수행된다.
하나의 실시태양에서 상기 최대 수치는 0.5 이상이고 15 이하이고, 바람직하게는 1 이상 10 이하이고, 더욱 바람직하게는 2 이상 7 이하이다.
하나의 실시태양에서 상기 반응 온도는 약 45∼65℃이다.
하나의 실시태양에서 상기 반응 용액의 슈크로스 농도는 반응 시작시 약 5∼100%, 바람직하게는 약 8∼80%, 더욱 바람직하게는 약 15∼50%이다.
하나의 실시태양에서 상기 글루칸은 아밀로스이다.
하나의 하나의 실시태양에서 상기 슈크로스 가인산분해효소는 스트렙토코커스속에 속하는 박테리아로부터 유도된다. 바람직하게는 스크렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 써모필러스, 스트렙토코커스 뉴모니에 및 스트렙토코커스 미티스로 구성된 군으로부터 선택된 스트렙토코커스속에 속하는 박테리아로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서 상기 글루칸 가인산분해효소는 식물로부터 유도된다. 더욱 특별하게는 글루칸 가인산분해효소는 조류 또는 감자로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서 상기 글루칸 가인산분해효소는 써머스 아쿠아티커스 또는 바실러스 스테아로써모필러스로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서 상기 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 모두 또는 적어도 하나는 재조합 미생물로부터 생성된다.
하나의 실시태양에서 상기 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 모두 또는 적어도 하나는 담체 상에 고정된다.
하나의 실시태양에서 상기 슈크로스는 정제되지 않은 사카라이드이다.
하나의 실시태양에서 상기 프라이머는 말토-올리고사카라이드, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 덱스트린, 풀룰란, 커플링 당, 전분 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서 상기 말토-올리고사카라이드는 말토-올리고사카라이드 혼합물이다.
하나의 실시태양에서 상기 말토-올리고사카라이드 혼합물은 말토테트라오스 보다 더 크거나 동일한 중합반응 정도를 지닌 말토-올리고사카라이드 이외에 적어도 하나 이상의 말토트리오스, 말토스 및 글루코스를 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 전분은 가용성 전분, 왁스성 전분, 높은 아밀로스 전분, 디브랜칭(debranching) 효소에 의해 분해된 전분, 가인산분해효소에 의해 분해된 전분, 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분, 가공된 전분 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 유기 용매를 사용하지 않고 생성된 글루칸을 정제하는 단계로 더욱 구성된다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 반응 후 반응 용액을 냉각시켜 글루칸을 침전시키고, 고형-액체 분리 방법에 의해 침전된 글루칸을 정제하는 단계로 더욱 구성된다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 글루칸 생성 반응 동안 또는 그 후 반응 용액을 냉각시켜 글루칸을 겔화시키고, 겔화된 글루칸을 회수하고, 물로의 세척, 동결-해동, 여과, 압착, 흡입 및 원심분리로 구성된 군으로부터 선택된 실시에 의해 겔화된 글루칸으로부터 프럭토스를 제거하는 단계로 더욱 구성된다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 글루칸 생성 반응 후 침전없이 한외여과막 또는 크로마토그래피를 이용하여 물 내에 용해된 글루칸을 막 분획화시켜 프럭토스를 제거하는 단계로 더욱 구성된다. 한외여과막은 약 30,000의 분자량 컷오프(cutoff)를 지닌다. 한외여과막은 할로우 파이버(hollow fiber) 타입이다. 크로마토그래피에 사용되는 담체는 겔 여과 크로마토그래피용 담체, 리간드 교환 크로마토그래피용 담체, 이온 교환 크로마토그래피용 담체 또는 소수성 크로마토그래피용 담체이다.
하나의 실시태양에서 상기 반응 용액은 디브랜칭 효소, 브랜칭 효소, 4-α-글루카노트랜스퍼라제 및 글리코겐 디브랜칭 효소로 구성된 군으로부터 선택된 효소를 더욱 포함한다.
글루칸을 생성하기 위한 본 발명의 네 번째 방법은 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 반응 용액이 글루칸을 생성하도록 반응시키는 단계로 구성되고, 상기 반응 시작부터 반응 종료까지 슈크로스-인산 비율의 최대 수치는 약 17 이하임을 특징으로 한다.
하나의 실시태양에서 어떤 무기 인산 또는 글루코스-1-인산도 반응 시작 후 더욱 첨가되지 않는다.
하나의 실시태양에서 반응은 약 40∼70℃의 온도에서 수행된다.
글루칸을 생성하기 위한 본 발명의 다섯 번째 방법은 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 반응 용액이 반응을 시작하도록 하고; 슈크로스, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산을 반응 용액에 더욱 첨가시키고; 글루칸을 생성시키도록 반응을 지속시키는 단계로 구성되고, 상기 첨가 단계의 종료시점에서 반응 용액의 슈크로스-인산 비율이 약 17 이하임을 특징으로 한다.
하나의 실시태양에서 반응은 약 40∼70℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 글루칸은 어떠한 상기-기술된 방법에 의해서도 생성된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 방법에서 글루칸이 생성된다. 본 명세서에서 "글루칸"은 구성성분 유니트가 D-글루코스이고 α-1,4-글루코시드 결합에 의해 결합된 적어도 2개 이상의 사카라이드 유니트를 지닌 사카라이드를 나타낸다. 글루칸은 직쇄, 분지된 또는 환형 분자이다. 직쇄 글루칸 및 α-1,4-글루칸은 동의어이다. 직쇄 글루칸에서 사카라이드 유니트는 단지 α-1,4-글루코시드 결합에 의해서만 결합된다. 적어도 하나 이상의 α-1,6-글루코시드 결합을 포함한 글루칸은 분지된 글루칸이다. 바람직하게는 글루칸은 어느 정도 직쇄 부분을 포함한다. 분지가 없는 직쇄 글루칸이 가장 바람직하다.
일부의 경우 적은 수의 분지(즉, α-1,6-글루코시드 결합)를 지닌 글루칸이 바람직하다. 이러한 경우 분지의 수는 대표적으로 0∼10,000, 바람직하게는1∼1,000, 더욱 바람직하게는 0∼500, 특히 바람직하게는 0∼100, 특히 더 바람직하게는 0∼50, 특히 더욱 바람직하게는 0∼25, 특히 더 바람직하게는 0이다.
본 발명의 글루칸에서 α-1,6-글루코시드 결합 수가 1일 때 α-1,6-글루코시드 결합 수에 대한 α-1,4-글루코시드 결합 수의 비율은 바람직하게는 1∼10,000, 더욱 바람직하게는 10∼5,000, 특히 더 바람직하게는 50∼1,000, 특히 더 바람직하게는 100∼500이다.
α-1,6-글루코시드 결합은 무작위로 또는 균일하게 글루칸 내에 분포된다. 글루칸에서 적어도 5개 이상의 사카라이드 유니트 길이인 직쇄 부분이 존재하는 것이 바람직하다.
글루칸은 단지 D-글루코스로만 구성되거나 글루칸의 성질인 손상되지 않는 범위로 변형된 유도체이다. 변형되지 않은 글루칸이 바람직하다.
글루칸은 대표적으로 적어도 약 8 ×103이상, 바람직하게는 적어도 약 1 ×104이상, 더욱 바람직하게는 적어도 약 5 ×104이상, 특히 더 바람직하게는 적어도 약 1 ×105이상, 특히 더 바람직하게는 적어도 약 6 ×105이상의 분자량을지닌다. 글루칸은 대표적으로 약 1 ×108이하, 바람직하게는 약 1 ×107이하, 더욱 바람직하게는 약 5 ×106이하, 특히 더 바람직하게는 약 1 ×106이하의 분자량을 지닌다.
원하는 분자량을 지닌 글루칸이 본 발명의 생성 방법에 사용되는 기질의 양, 효소의 양, 반응 시간 등을 적당히 세팅함으로서 수득될 수 있다.
〈글루칸을 생성하기 위한 물질〉
본 발명의 생성방법에서 예를 들어 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 완충제, 슈크로스 가인산분해효소, 글루칸 가인산분해효소 및 이들을 용해시킬 수 있는 용매가 주요 물질로 사용된다. 이들 물질의 모두가 일반적으로 반응의 시작시 첨가되더라도 이들 물질의 어떤 것도 반응의 진행 중에 더욱 첨가된다. 본 발명의 생성방법에서 필요한 경우 디브랜칭 효소, 브랜칭 효소, 4-α-글루카노트랜스퍼라제 및 글리코겐 디브랜칭 효소로 구성된 군으로부터 선택된 효소가 사용될 수 있다. 디브랜칭 효소, 브랜칭 효소, 4-α-글루카노트랜스퍼라제 및 글리코겐 디브랜칭 효소로 구성된 군으로부터 선택된 효소는 글루칸의 의도된 구조에 따라 달리 본 발명의 생성방법의 시작시 또는 방법 진행 중 반응 용액에 첨가된다.
(1) 슈크로스 :
슈크로스는 C12H22O11로 표현되고, 약 342의 분자량을 지닌 디사카라이드이다. 슈크로스는 광합성 가능한 어떠한 식물에도 존재한다. 슈크로스는 식물로부터 분리되거나 화학적으로 합성된다. 비용 측면에서 슈크로스는 바람직하게는 식물로부터 분리된다. 많은 양의 슈크로스를 함유한 식물의 예는 사탕수수, 사탕무 등을 포함한다. 사탕수수는 그의 즙 내에 약 20%의 슈크로스를 포함한다. 사탕무는 그의 즙 내에 약 10∼15%의 슈크로스를 포함한다. 슈크로스는 슈크로스를 함유한 식물의 즙으로부터 정제된 사카라이드로의 정제 처리의 단계로부터 수득된 어떤 물질에 의해서도 제공된다.
본 발명의 방법에 사용되기 위한 슈크로스는 바람직하게는 순수한 것이다. 그러나 슈크로스는 본 발명에서 슈크로스의 효과를 억제하지 않는 한 어떤 다른 오염을 포함한다.
용액 내 함유된 슈크로스의 농도는 대표적으로 약 5∼100%, 바람직하게는 약 8∼80%, 더욱 바람직하게는 8∼50%이다. 본 명세서 내에서 슈크로스 농도는 중량/부피 즉,
(슈크로스 중량) ×100/(용액의 부피)
에 의해 계산됨이 주지되어야 한다.
슈크로스의 중량이 과도하게 크면 반응하지 않은 슈크로스가 반응 동아 침전된다. 사용된 슈크로스의 양이 과도하게 적으면 산출량이 고온 반응에서 감소된다.
상기-기술된 첫 번째 방법의 경우 즉, 반응의 시작부터 반응의 종료까지 반응 용액 내 슈크로스-인산 비율의 최대 수치가 약 17 이하인 경우 슈크로스 농도는 상기-기술된 범위에 항상 제한될 필요는 없다는 것이 주지되어야 한다. 또한 상기-기술된 네 번째 방법의 경우 즉, 반응의 시작시 반응 용액 내 슈크로스-인산 비율이 약 17 이하인 경우 및 상기-기술된 다섯 번째 방법의 경우 즉, 반응 용액에 슈크로스, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산을 더욱 첨가하는 단계를 포함하는 경우 슈크로스 농도는 상기-기술된 범위에 항상 제한될 필요는 없다. 본 명세서에서 반응 용액 내 슈크로스의 몰 농도를 반응 용액 내 무기 인산 및 글루코스-1-인산의 총 몰 농도로 나눔으로서 수득된 비율은 슈크로스-인산 비율로 표현된다. 즉 :
슈크로스-인산 비율 =
(슈크로스의 몰 농도) / (무기 인산 및 글루코스-1-인산의 총 몰 농도)
반응되는 모든 물질이 반응의 시작시 혼합되고 어떤 물질도 반응 동안 첨가되지 않으면 슈크로스-인산 비율은 반응 시작시 최대이다.
(2) 프라이머 :
본 발명에 사용되기 위한 프라이머는 글루칸 합성을 위한 시작 물질로서 기능하는 물질이다. 프라이머가 사카라이드 유니트가 α-1,4-글루코시드 결합으로 결합할 수 있는 적어도 하나 이상의 자유로운 부분을 지니면 다른 부분은 사카라이드 이외의 반(moiety)에 의해 형성된다. 본 발명의 방법에서 사카라이드 유니트는 α-1,4-글루코시드 결합으로 프라이머에 연속적으로 결합된다. 프라이머는 사카라이드 유니트가 글루칸 가인산분해효소에 의해 첨가될 수 있는 어떤 사카라이드도 포함한다.
프라이머는 본 발명의 반응을 위한 어떠한 시작 물질도 될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 방법에 의해 합성된 글루칸은 다시 본 발명의 방법에 의해 α-1,4-글루코시드 체인을 확장시키는데 프라이머로서 사용될 수 있다.
프라이머는 α-1,4-글루코시드 결합만을 포함하는 α-1,4-글루칸이 되거나 α-1,6-글루코시드 결합을 부분적으로 포함하는 α-1,4-글루칸이 된다. 당업자는 원하는 글루칸에 따라 다르게 적당한 프라이머를 용이하게 선택한다. 직쇄 아밀로스의 합성의 경우 직쇄 아밀로스가 디브랜칭 효소를 이용하지 않고 합성될 수 있기 때문에 α-1,4-글루코시드 결합만을 포함하는 α-1,4-글루칸을 사용하는 것이 바람직하다.
프라이머의 예는 말토-올리고사카라이드, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 덱스트린, 풀룰란, 커플링 당, 전분 및 그의 유도체를 포함한다.
본 명세서에서 말토-올리고사카라이드는 2∼10개의 글루코스의 탈수-축합에 의해 생성되고 α-1,4 결합에 의해 결합된 물질을 나타낸다. 말토-올리고사카라이드는 바람직하게는 4∼10개의 사카라이드 유니트, 더욱 바람직하게는 5∼10개의 사카라이드 유니트, 특히 더 바람직하게는 7∼10개의 사카라이드 유니트를 포함한다. 말토-올리고사카라이드의 예는 말토스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 말토옥타오스, 말토노나오스, 말토데카오스 등을 포함한다. 바람직하게는 말토-올리고사카라이드는 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 또는 말토헵타오스이다. 말토-올리고사카라이드는 단일-성분 생성물 또는 다수의 말토-올리고사카라이드의 혼합물이다. 말토-올리고사카라이드의 혼합물은 그의 저비용 때문에 바람직하다. 하나의 실시태양에서 말토-올리고사카라이드의 혼합물은 말토테트라오스 보다 더 크거나 동일한 중합반응 정도를 지닌 말토-올리고사카라이드 이외에 적어도 하나 이상의 말토트리오스, 말토스 및 글루코스를 포함한다. 여기서 "말토테트라오스 보다 더 크거나 동일한 중합반응 정도를 지닌 말토-올리고사카라이드"는 적어도 4 이상의 중합반응 정도를 지닌 말토-올리고사카라이드를 나타낸다. 올리고사카라이드는 직쇄 올리고사카라이드 또는 분지된 올리고사카라이드이다. 올리고사카라이드는 그의 분자 내 환형 부분을 지닌다. 본 발명에서 직쇄 올리고사카라이드가 바람직하다.
아밀로스는 α-1,4 결합으로 결합된 글루코스 유니트로 구성된 직쇄 분자이다. 아밀로스는 자연 발생한 전분 내에 포함된다.
아밀로펙틴은 글루코스 유니트가 α-1,6 결합으로 결합된 α-1,4 결합으로 결합된 글루코스로 구성된 분지된 분자이다. 아밀로펙틴은 자연 발생한 전분 내에 포함된다. 아밀로펙틴으로서 예를 들어 100%의 아밀로펙틴으로 구성된 찰옥수수 전분이 사용된다. 예를 들어 적어도 약 1 ×105이상의 중합반응 정도를 지닌 아밀로펙틴이 비가공 물질로 사용된다.
글리코겐은 글루코스로 구성되고 고-빈도로 분지를 지닌 글루칸 타입이다. 글리코겐은 입자의 형태로 대체로 동물 및 식물의 어떠한 세포 내에도 보관 폴리사카라이드로서 널리 분포된다. 글리코겐에서 12∼18의 평균 중합반응 정도를 지닌 α-1,4-결합 당 체인이 α-1,6 결합으로 3개 글루코스 유니트 당 하나의 체인의 비율로 글루코스의 α-1,4-결합 당 체인에 결합된다. α-1,6-결합으로 결합된 분지는 α-1,6-결합으로 글루코스의 α-1,4-결합 당 체인에 유사하게 결합된다. 따라서 글리코겐은 네트워크 구조를 지닌다.
글리코겐의 분자량은 대표적으로 약 1 ×105∼1 ×108, 바람직하게는 약 1 ×106∼1 ×107이다.
풀룰란은 말토트리오스가 단계적인 방식으로 α-1,6 결합으로 규칙적으로 결합된 약 100,000∼300,000(즉, 약 200,000)의 분자량을 지닌 글루칸이다. 예를 들어 풀룰란은 비가공 물질로서 전분을 이용하여 오레오바시디움(Aureobasidium) 풀룰란을 배양함으로서 생성된다. 풀룰란은 예를 들어 Hayashibara Shoji, Inc.,로부터 수득된다.
커플링 당은 슈크로스, 글루코실 슈크로스 및 말토실 슈크로스가 주요 구성성분인 혼합물이다. 커플링 당은 예를 들어 바실러스 메가테리움에 의해 생성되는 시클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제가 슈크로스 및 전분의 혼합된 용액에 작용하게 함으로서 생성된다. 커플링 당은 예를 들어 Hayashibara Shoji, Inc.,로부터 수득된다.
전분은 아밀로스 및 아밀로스펙틴의 혼합물이다. 전분으로서 일반적으로통상의 어떠한 전분도 사용된다. 전분 내 함유된 아밀로펙틴에 대한 아밀로스의 비율은 전분을 생성하는 식물 타입에 따라 달라진다. 찹쌀, 찰옥수수 등에 함유된 대부분의 전분은 아밀로펙틴이다. 이와는 반대로 어떠한 아밀로펙틴도 없이 아밀로스로만으로 구성된 전분은 일반 식물로부터 수득된다.
전분은 자연 발생한 전분, 전분 분해 생성물 및 가공된 전분으로 나뉜다.
자연 발생한 전분은 유도된 비가공 물질에 의해 괴경 전분 및 곡물 전분으로 나뉜다. 괴경 전분의 예는 감자 전분, 타피오카(tapioca) 전분, 고구마 전분, 칡 전분, 고사리 전분 등을 포함한다. 곡물 전분의 예는 옥수수 전분, 소맥 전분, 쌀 전분 등을 포함한다. 자연 발생한 전분의 예는 전분을 생성하는 식물의 번식결과 50∼70%의 증가된 아밀로스 함량을 지닌 고-아밀로스 전분(즉, 고-아밀로스 옥수수 전분)이다. 자연 발생한 전분의 또다른 예는 전분을 생성하는 식물이 번식 결과 아밀로스를 함유하지 않는 왁스성 전분이다.
가용성 전분은 자연 발생한 전분을 다양한 처리함으로서 수득된 수용성 전분을 나타낸다.
가공된 전분은 사용하기에 더욱 용이한 성질을 부여하기 위해 자연 발생한 전분을 가수분해, 에스테르화, 겔화 등과 같은 처리함으로서 수득된 전분이다.예를 들어 겔화가 시작되는 온도, 전분 페이스트의 점성, 전분 페이스트의 투명도, 노화 안정성 등과 같은 성질의 다양한 조합을 지닌 다양한 가공된 전분이 사용될 수 있다. 다양한 타입의 가공된 전분이 있다. 이러한 전분의 예는 전분의 겔화 온도 이하의 온도에서 산 내에 전분 입자를 침수시켜 전분 분자가 분해되나 입자는 파괴되지 않게 함으로서 수득된 전분이다.
전분 분해 생성물은 전분을 효소처리, 가수분해와 같은 처리함으로서 수득된 처리 전보다 더 낮은 분자량을 지닌 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드이다. 전분 분해 생성물의 예는 디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분, 가인산분해효소에 의해 분해된 전분 및 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분을 포함한다.
디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분은 디브랜칭 효소가 전분에 작용하게 함으로서 수득된다. 디브랜칭의 작용 시간을 다양한 정도로 변화시킴으로서 분지 부분(즉, α-1,6-글루코시드 결합)이 정해지지 않은 정도로 분해되는 디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분이 수득될 수 있다. 디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분의 예는 1∼20개의 α-1,6-글루코시드 결합을 지닌 4∼10,000개 사카라이드 유니트의 분해 생성물, α-1,6-글루코시드 결합이 없는 3∼500개 사카라이드 유니트의 분해 생성물, 말토-올리고사카라이드 및 아밀로스를 포함한다. 디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분의 경우 수득된 분해 생성물의 분자량 분포는 분해된 전분 타입에 따라 달라진다. 디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분은 다양한 길이를 지닌 당 체인의혼합물이다.
가인산분해효소에 의해 분해된 전분은 글루칸 가인산분해효소(가인산분해효소로도 표현됨)가 전분에 작용하게 함으로서 수득된다. 글루칸 가인산분해효소는 전분의 비-환원 말단으로부터의 글루코스 잔기를 사카라이드-유니트-바이(by)-사카라이드-유니트 기초로 다른 기질로 전달한다. 글루칸 가인산분해효소는 α-1,6-글루코시드 결합을 분해할 수 없다. 따라서 글루칸 가인산분해효소가 충분히 긴 시간 동안 전분에 작용하게 되면 분해가 α-1,6-글루코시드 결합에서 종결되는 분해 생성물이 수득된다. 본 발명에서 가인산분해효소에 의해 분해된 전분 내에 함유된 많은 사카라이드 유니트는 바람직하게는 10∼100,000, 더욱 바람직하게는 50∼50,000, 특히 더 바람직하게는 100∼10,000이다. 가인산분해효소에 의해 분해된 전분의 경우 분해 생성물의 분자량의 분포는 분해되는 전분 타입에 따라 달라진다. 가인산분해효소에 의해 분해된 전분은 다양한 길이를 지닌 당 체인의 혼합물이다.
덱스트린 및 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분은 산, 알칼리, 효소의 작용에 의해 부분적으로 전분을 분해함으로서 수득된 분해 생성물을 나타낸다. 본 발명에서 덱스트린 및 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분 내에 함유된 많은 사카라이드 유니트는 바람직하게는 10∼100,000, 더욱 바람직하게는 50∼50,000, 특히 더 바람직하게는 100∼10,000이다. 덱스트린 및 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분의 경우 수득된 분해 생성물의 분자량 분포는 분해되는 전분 타입에 따라 달라진다. 덱스트린 및 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분은 다양한 길이를 지닌 당 체인의 혼합물이다.
전분은 바람직하게는 가용성 전분, 왁스성 전분, 고-아밀로스 전분, 디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분, 가인산분해효소에 의해 분해된 전분, 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분, 가공된 전분 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법에서 상기-기술된 다양한 사카라이드의 유도체는 프라이머로 사용된다. 예를 들어 상기-기술된 사카라이드의 적어도 하나 이상의 알코올성 하이드록실 그룹이 하이드록시알킬레이트, 알킬레이트, 아세틸레이트, 카르복시메틸레이트, 설페이트, 포스포릴레이트된 유도체가 사용된다. 또한 적어도 2 이상의 상기-기술된 유도체를 포함한 혼합물이 비가공 물질로 사용된다.
(3) 무기 인산 또는 글루코스-1-인산 :
본 명세서에서 무기 인산은 SP 반응에 인산 기질을 제공하는 것이 가능한 물질을 나타낸다. 여기서 인산 기질은 글루코스-1-인산의 인산 반(moiety)에 대한 비가공 물질인 물질을 나타낸다. 슈크로스 가인산분해효소에 의해 촉매된 슈크로스 가인산분해에서 무기 인산은 인산 이온의 형태로 기질로서 작용하는 것으로 여겨진다. 당 분야에서 이러한 기질은 통상적으로 무기 인산으로 불리고, 본 발명에서 이러한 기질은 무기 인산으로 표기된다. 무기 인산은 인산(phosphoric acid) 및 인산의 무기염을 포함한다. 일반적으로 무기 인산은 알칼리 금속 이온과 같은 양이온 함유 물에서 사용된다. 이러한 경우 인산, 인산염 및 인산 이온은 평형을 이루어 인산 염으로부터 인산을 구별해내는 것이 어렵게 된다. 따라서 편의를 위해 인산 및 인산 염은 무기 인산으로 표현된다. 본 발명에서 무기 인산은 바람직하게는 인산의 금속염, 더욱 바람직하게는 인산의 알칼리 금속염이다. 바람직한 무기 인산의 특별한 예는 인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨, 인산삼나트륨, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 인산삼칼륨, 인산(H3PO4), 인산이수소암모늄, 인산수소이암모늄 등을 포함한다.
하나만의 타입 또는 다수의 타입의 무기 인산이 SP-GP 반응 시스템 내에 반응 시작시 포함된다.
무기 인산은 예를 들어 물리적, 화학적 또는 효소적 반응에 의해 분해된 폴리인산(즉, 피로인산(pyrophosphoric acid), 트리인산 및 테트라인산) 또는 그의 염과 같은 축합된 인산의 분해 생성물을 반응 용액 내에 첨가함으로서 제공된다.
본 명세서에서 글루코스-1-인산은 글루코스-1-인산(C6H13O9P) 및 그의 염을 나타낸다. 글루코스-1-인산은 바람직하게는 한정된 의미로 글루코스-1-인산(C6H13O9P)의 금속염, 더욱 바람직하게는 글루코스-1-인산(C6H13O9P)의 알칼리 금속염이다. 바람직한 글루코스-1-인산의 특별한 예는 글루코스-1-인산 이나트륨, 글루코스-1-인산 이칼륨, 글루코스-1-인산(C6H13O9P)을 포함한다. 본 명세서 내에서 괄호쳐진 화학식이 없는 글루코스-1-인산은 넓은 의미의 글루코스-1-인산을 및 글루코스-1-인산(C6H13O9P) 및 그의 염은 한정된 의미를 나타낸다.
하나만의 타입 또는 다수의 타입의 글루코스-1-인산은 반응의 시작시 SP-GP 반응 시스템 내에 포함된다.
본 발명의 방법에서 반응의 시작시 반응 용액 내 인산 및 글루코스-1-인산의 비율은 정해지지 않은 비율이다.
반응 용액 내 무기 인산 및 글루코스-1-인산의 총 몰 농도는 대표적으로 약 1∼1000 mM, 바람직하게는 약 10∼500 mM, 특히 더 바람직하게는 20∼250 mM이다. 무기 인산 및 글루코스-1-인산의 각각의 몰 농도는 반응의 시작부터 반응의 종료까지 반응 용액 내 슈크로스-인산 비율의 최대 수치가 대표적으로 약 17 이하, 바람직하게는 0.5 이상 15 이하, 특히 더 바람직하게는 1 이상 10 이하, 특히 더 바람직하게는 2 이상 7 이하가 되도록 조정된다. 상기-기술된 본 발명의 네 번째 방법의 경우 무기 인산 및 글루코스-1-인산의 각각의 몰 농도는 반응의 시작부터 반응의 종료까지 반응 용액 내 슈크로스-인산 비율이 상기-기술된 범위 내에 있도록 조정된다. 상기-기술된 본 발명의 다섯 번째 방법의 경우 무기 인산 및 글루코스-1-인산의 각각의 몰 농도는 반응 용액 내에 슈크로스, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산을 더욱 첨가하는 단계가 완료될 때 용액의 슈크로스-인산 비율이 상기-기술된 범위 내에 있도록 조정된다. 무기 인산 및 글루코스-1-인산의 양이 과도하게 크면 글루칸 산출량이 감소된다. 사용되는 양이 과도하게 적으면 글루칸을 합성하는데 장시간이 소요된다.
SP-GP 반응 시스템의 무기 인산 함량은 하기 섹션 1. 4.에 기술된 방법에 의해 질량화된다. SP-GP 반응 시스템의 글루코스-1-인산 함량은 하기 섹션 1. 3.에 기술된 방법에 의해 질량화된다. 반응에 포함되지 않은 인-함유 물질이 사용되지 않으면 글루코스-1-인산은 원자 흡수 측광기에 의해 측정된다.
상기-기술된 두 번째 방법의 경우 즉, 반응이 약 40∼70℃의 반응 온도에서 수행되면 상기-기술된 최대 수치는 항상 17 이하일 필요는 없다.
(4) 슈크로스 가인산분해효소(EC. 2. 4. 1. 7) :
본 명세서에서 "슈크로스 가인산분해효소"는 슈크로스의 α-글리코실 그룹을 인산 그룹으로 전달함으로서 가인산분해를 수행하는 효소를 나타낸다. 슈크로스 가인산분해효소에 의해 촉매된 반응은 하기 식에 의해 표현된다 :
슈크로스 + 무기 인산 ↔α-D-글루코스-1-인산 + D-프럭토스
슈크로스 가인산분해효소는 자연계에 다양한 생물체 내에 포함된다. 슈크로스 가인산분해효소를 생성하는 생물체의 예는 스트렙토코커스속(즉, 스트렙토코코커스 써모필러스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 뉴모니에 및 스트렙토코커스 미티스), 류모노스토크 메센테로이드, 슈도모나스 sp., 클로스티리다움 sp., 풀룰라리아 풀룰란스, 아세포박터 자일리눔, 아그로박테리움 sp., 시네코코커스 sp., E. coli, 리스텔아 모노시토게네스, 비피오박테리움 아도레센티스, 아스퍼길러스 니거, 모니리아 시토필라, 스클레로티네 에스크레오티오룸 및 클라미도모나스 sp.를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
슈크로스 가인산분해효소는 슈크로스 가인산분해효소를 생성하는 어떠한 생물체로부터도 유도된다. 슈크로스 가인산분해효소는 바람직하게는 어느 정도 열-저항성을 지닌다. 단독으로 존재하는 슈크로스 가인산분해효소의 열-저항성이 높을수록 슈크로스 가인산분해효소가 더욱 바람직하다. 예를 들어 슈크로스 가인산분해효소가 4% 슈크로스의 존재시 55℃에서 30분간 가열될 때 가열 전 슈크로스 가인산분해효소의 활성과 비교하여 적어도 50% 이상의 슈크로스 가인산분해효소의 활성을 보유한 슈크로스 가인산분해효소가 바람직하다. 슈크로스 가인산분해효소는 바람직하게는 스트렙토코커스속의 박테리아로부터 유도되고, 더욱 바람직하게는 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 써모필러스, 스트렙토코커스 뉴모니아 또는 스트렙토코커스 미티스로부터 유도된다.
본 명세서에서 특정한 생물체로부터 "유도된" 효소는 생물체로부터 직접적인 분리를 의미할 뿐만 아니라 어떤 방식으로 생물체의 이용에 의해 수득된 효소를 의미하기도 한다. 예를 들어 생물체로부터 수득된 효소를 인코드하는 유전자가 E. coli에 도입되고 E. coli로부터 효소가 분리되면 효소는 생물체로부터 "유도된다"고 기술된다.
본 발명에 사용되는 슈크로스 가인산분해효소는 상기 기술된 바와 같이 자연계에 존재하고 슈크로스 가인산분해효소를 생성하는 생물체로부터 직접적으로 분리된다. 본 발명에 사용되는 슈크로스 가인산분해효소는 상기-기술된 생물체로부터 분리된 슈크로스 가인산분해효소를 인코드하는 유전자를 이용하여 유전자 재조합에 의해 수득된 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)로부터 분리된다.
본 발명의 방법에 사용되는 슈크로스 가인산분해효소는 예를 들어 하기 기술된 바와 같이 제조된다. 먼저 슈크로스 가인산분해효소를 생성하는 미생물(즉,박테리아, 진균 등)이 배양된다. 이러한 미생물은 슈크로스 가인산분해효소를 직접 생성하는 미생물이다. 대안으로 슈크로스 가인산분해효소를 인코드하는 유전자가 클론되고 수득된 유전자를 이용하여 슈크로스 가인산분해효소의 발현에 유용한 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)이 유전자 재조합되어 재조합 미생물을 수득하게 된다. 슈크로스 가인산분해효소는 수득된 미생물로부터 수득된다.
슈크로스 가인산분해효소 유전자를 이용하여 유전자 재조합에 사용되는 미생물은 슈크로스 가인산분해효소의 발현 용이성, 배양 용이성, 생장률, 안전성 등과 같은 다양한 조건을 고려함으로서 용이하게 선택된다. 슈크로스 가인산분해효소가 오염원으로서 아밀로스를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 따라서 전혀 없거나 또는 낮은 레벨의 아밀로스를 생성하거나 발현하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)이 유전자 재조합에 사용되는 것이 바람직하다. 슈크로스 가인산분해효소의 유전자 재조합에 있어서 E. coli 또는 바실러스 섭틸리스와 같은 중온균이 바람직하게 사용된다. 전혀 없거나 또는 낮은 레벨의 아밀로스를 생성하거나 발현하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)에 의해 생성된 슈크로스 가인산분해효소는 실질적으로 어떤 아밀로스도 포함하지 않고, 따라서 본 발명의 방법에 사용되기에 바람직하다.
클론된 유전자를 이용한 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)의 유전자 재조합은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 수행된다. 클론된 유전자가 사용되면 유전자는 바람직하게는 구성적(constitutive) 프로모터 또는 유도가능한 프로모터에 실시적을-결합된다. "실시적으로-결합된"은 프로모터 및 유전자가 함께 결합되어 유전자의 발현이 프로모터에 의해 조절됨을 나타낸다. 유도가능한 프로모터가 사용되면 배양은 바람직하게는 유도 조건 하에서 수행된다. 다양한 유도가능한 프로모터가 당업자에게 알려져 있다.
클론된 유전자에 있어서, 시그날 펩타이드를 인코드하는 염기 서열은 박테리아 세포의 외부로 생성된 슈크로스 가인산분해효소를 분비하기 위해 유전자에 결합된다. 시그날 펩타이드를 인코드하는 염기 서열은 당업자에게 알려져 있다.
당업자는 슈크로스 가인산분해효소를 생성하기 위해 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)을 배양하는 조건을 적당히 결정할 수 있다. 미생물을 배양하는 적당한 배지, 각각의 유도가능한 프로모터를 유도하는 적당한 조건 등은 당업자에게 알려져 있다.
배양의 적당한 시간 후 슈크로스 가인산분해효소가 배양액으로부터 회수된다. 생성된 슈크로스 가인산분해효소가 박테리아 세포 외부로 분비되면 박테리아 세포는 상청액 내에 슈크로스 가인산분해효소를 수득하기 위해 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 박테리아 세포 내부에 생성된 슈크로스 가인산분해효소가 박테리아 세포 외부로 분비되지 않으면 미생물은 파괴된 박테리아 세포 용액을 수득하기위해 소니케이션(sonication), 기계적 파괴, 화학적 파괴에 의해 파괴된다.
본 발명의 방법에서 파괴된 박테리아 세포 용액은 정제없이 사용된다. 이후 파괴된 박테리아 세포 용액은 박테리아 세포의 잔해를 제거하기 위해 원심분리되어 상청액을 수득한다. 수득된 상청액은 본 발명의 효소를 회수하기 위해 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온- 또는 양이온-교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피 및 렉틴(lectin) 크로마토그래피를 포함한 잘-알려진 방법이 수행될 수 있다. 회수된 생성물은 필요한 경우 정제된다.
바람직한 실시태양에서 슈크로스 가인산분해효소는 슈크로스(대표적으로 약 4∼30%, 바람직하게는 약 8∼30%, 더욱 바람직하게는 약 8∼25%)의 존재시 정제 처리의 정해지지 않은 단계에서 가열된다. 이러한 가열 처리시 용액의 온도는 바람직하게는 이러한 용액이 30분간 가열될 때 가열 전 용액 내 함유된 슈크로스 가인산분해효소의 활성과 비교하여 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 이상의 슈크로스 가인산분해효소 활성이 보유되게 하는 것이다. 이러한 온도는 바람직하게는 약 50∼80℃, 더욱 바람직하게는 약 55∼70℃이다. 예를 들어 스트렙토코커스 뮤탄스로부터 유도된 슈크로스 가인산분해효소의 경우 반응 온도는 바람직하게는 약 50∼60℃이다. 가열이 수행될 때 가열 시간은 슈크로스 가인산분해효소의 활성이 유의적으로 손상되지 않는 한 반응 온도를 고려함으로서 정해지지않고 결정된다. 가열 시간은 대표적으로 약 10∼90분, 더욱 바람직하게 약 30∼60분이다.
반응의 시작시 용액 내 함유된 슈크로스 가인산분해효소의 양은 대표적으로 시작시 용액 내 슈크로스에 대해 약 0.05∼1,000 U/g 슈크로스, 바람직하게는 약 0.1∼500 U/g 슈크로스, 더욱 바람직하게는 약 0.5∼100 U/g 슈크로스이다. 슈크로스 가인산분해효소의 중량이 과도하게 크면 반응 내 변성된 효소가 응집하기 쉽고, 사용되는 양이 과도하게 적으면 글루칸 산출량이 감소된다.
슈크로스 가인산분해효소는 정제되거나 정제되지 않는다. 슈크로스 가인산분해효소는 고정되거나 고정되지 않는다. 슈크로스 가인산분해효소는 바람직하게는 고정된다. 당업자에게 잘 알려진 고정의 방법으로서 담체 결합 방법(즉, 공유결합 결합 방법, 이온 결합 방법 또는 물리적 흡착 방법), 교차-결합 방법, 인트랩먼트(entrapment) 방법(격자 타입 또는 마이크로캡슐 타입) 등이 사용된다. 슈크로스 가인산분해효소는 바람직하게는 담체 상에 고정된다.
(5) 글루칸 가인산분해효소(EC. 2. 4. 1. 1) :
글루칸 가인산분해효소는 α-1,4-글루칸의 가인산분해를 촉매하는 효소의 유전적 용어이고 또한 가인산분해효소, 전분 가인산분해효소, 글리코겐 가인산분해효소, 말토덱스트린 가인산분해효소 등으로 불린다. 또한 글루칸 가인산분해효소는 가인산분해에 대한 역반응인 α-1,4-글루칸 합성 반응도 촉매할 수 있다. 반응을 진행하는 방향은 기질의 양에 따라 달라진다. 생물체에서 무기 인산의 양이 풍부하면 글루칸 가인산분해효소는 가인산분해 방향으로 반응을 진행시킨다. 본 발명의 방법에서 무기 인산이 슈크로스의 가인산분해에 사용되어 반응 용액 내 무기 인산의 양이 적기 때문에 반응은 α-1,4-글루칸 합성 방향으로 진행된다.
글루칸 가인산분해효소 전분 및 글리코겐을 저장할 수 있는 다양한 식물, 동물 및 미생물 내에 보편적으로 존재하는 것으로 여겨진다.
글루칸 가인산분해효소를 생성하는 식물의 예는 조류, 괴경 채소(즉, 감자, 고구마, 참마, 토란, 카사바 등), 채소(즉, 양배추, 시금치 등), 곡물(즉, 옥수수, 쌀, 소맥, 보리, 호밀, 조 등), 콩(즉, 완두콩, 대두, 팥, 우주라(uzura) 콩 등)을 포함한다.
글루칸 가인산분해효소를 생성하는 동물의 예는 포유류(즉, 인간, 토끼, 래트, 돼지 등)를 포함한다.
글루칸 가인산분해효소를 생성하는 미생물의 예는 써머스 아쿠아티커스, 바실러스 스테아로써모필러스, 데이노코커스 라디오두란스, 써모코커스 리토랄리스,스트렙토마이스 코엘리코롤, 피로코커스 호리코시, 미코박테리움 투버쿨로시스, 써모토가 마리티마, 아쿠니펙스 에롤리커스, 메타노코커스 잔나스키, 슈도모나스 에로가노사, 클라미디아 뉴모니에, 클로렐라 불가리스, 아그로박테리움 튜메파시엔스, 클로스트리디움 파스테리아눔, 클레브시엘라 뉴모니에, 시네코코커스 sp., 시네코시스티스 sp., E. coli, 뉴로스포라 크라싸, 사카로마이스 세레비시에, 클라미도모나스 sp. 등을 포함한다. 글루칸 가인산분해효소를 생성하는 생물체는 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용되는 글루칸 가인산분해효소는 바람직하게는 감자, 써모스 아쿠아티커스 또는 바실러스 스테아로써모필러스, 더욱 바람직하게는 감자이다. 바람직하게는 본 발명에 사용되는 글루칸 가인산분해효소은 높은 최적 반응 온도를 지닌다. 예를 들어 높은 최적 반응 온도를 지닌 글루칸 가인산분해효소는 극도의 호열성 박테리아로부터 유도된다.
본 발명에 사용되는 글루칸 가인산분해효소는 상기 기술된 바와 같이 자연계에 존재하고 글루칸 가인산분해효소를 생성하는 동물, 식물 및 미생물로부터 직접 분리된다.
본 발명에 사용되는 글루칸 가인산분해효소는 동물, 식물 또는 미생물로부터 분리된 글루칸 가인산분해효소를 인코드하는 유전자를 이용한 유전자 재조합에 의해 수득된 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)로부터 분리된다.
글루칸 가인산분해효소는 상기 기술된 바와 같이 슈크로스 가인산분해효소와 유사한 방식으로 재조합 미생물로부터 수득된다.
상기-기술된 슈크로스 가인산분해효소와 유사하게 유전자 재조합에 사용되는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)은 글루칸 가인산분해효소의 발현 용이성, 배양 용이성, 생장률, 안전성 등과 같은 다양한 조건을 고려함으로서 용이하게 선택된다. 글루칸 가인산분해효소는 오염원으로서 아밀로스를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 따라서 전혀 없거나 또는 낮은 레벨의 아밀로스를 생성하거나 발현하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)에 의해 생성된 글루칸 가인산분해효소가 유전자 재조합에 사용되는 것이 바람직하다. 글루칸 가인산분해효소의 유전자 재조합에 있어서, E. coli 또는 바실러스 섭틸리스와 같은 중온균이 바람직하게 사용된다. 전혀 없거나 또는 낮은 레벨의 아밀로스를 생성하거나 발현하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)에 의해 생성된 슈크로스 가인산분해효소는 실질적으로 어떤 아밀로스도 포함하지 않고, 따라서 본 발명의 방법에 사용되기에 바람직하다.
유전자 재조합에 의해 수득된 글루칸 가인산분해효소의 생성 및 정제는 상기-기술된 슈크로스 가인산분해효소와 유사한 방식으로 수행될 수 있다.
반응의 시작시 용액 내 함유된 글루칸 가인산분해효소의 양은 대표적으로 시작시 용액 내 슈크로스에 대해 약 0.05∼1,000 U/g 슈크로스, 바람직하게는 약 0.1∼500 U/g 슈크로스, 더욱 바람직하게는 약 0.5∼100 U/g 슈크로스이다. 글루칸 가인산분해효소의 중량이 과도하게 크면 반응 내 변성된 효소가 응집하기 쉽고, 사용되는 양이 과도하게 적으면 글루칸 산출량이 감소된다.
글루칸 가인산분해효소는 정제되거나 정제되지 않는다. 글루칸 가인산분해효소는 고정되거나 고정되지 않는다. 글루칸 가인산분해효소는 바람직하게는 고정된다. 당업자에게 잘 알려진 고정의 방법으로서 담체 결합 방법(즉, 공유결합 결합 방법, 이온 결합 방법 또는 물리적 흡착 방법), 교차-결합 방법, 인트랩먼트(entrapment) 방법(격자 타입 또는 마이크로캡슐 타입) 등이 사용된다. 글루칸 가인산분해효소는 바람직하게는 담체 상에 고정된다. 또한 글루칸 가인산분해효소는 슈크로스 가인산분해효소와 동일한 담체 상에 또는 또다른 담체 상에 고정되고, 바람직하게는 동일한 담체 상에 고정된다.
(6) 디브랜칭 효소 :
본 발명의 방법에서 α-1,6-글루코시드 결합을 포함한 시작 물질이 사용될 때처럼 분지가 생성물 내에 생성될 때 디브랜칭 효소가 필요한 경우 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 디브랜칭 효소는 α-1,6-글루코시드 결합을 분열시키는 것이 가능한 효소이다. 디브랜칭 효소는 2개의 카테고리 즉, 아밀로펙틴과 아밀로스 모두에 잘 작용하는 이소아밀라제(EC 3. 2. 1. 68) 및 아밀로펙틴, 글리코겐 및 풀룰란에 작용하는 α-덱스트린 엔도-α-1,6-글루코시다제(풀룰라나제로도 표기됨)(EC 3. 2. 1. 41)이다.
디브랜칭 효소는 미생물, 박테리아 및 식물 내에 존재한다. 디브랜칭 효소를 생성하는 미생물의 예는 사카로마이스 세레비시에 및 클라미도모나스 sp.를 포함한다. 디브랜칭 효소를 생성하는 박테리아의 예는 바실러스 브레비스, 바실러스 애시도풀룰리티커스, 바실러스 마세란스, 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 씨르큘란스, 써모스 아쿠아티커스, 클레브시엘라 뉴모니에, 써모아크티노미스 쌀포필러스, 써모아나에로박테르 에타노리커스, 슈도모나스 아밀로데라모사 등을 포함한다. 디브랜칭 효소를 생성하는 식물의 예는 감자, 고구마, 옥수수, 쌀, 소맥, 보리, 귀리, 사탕무 등을 포함한다. 디브랜칭 효소를 생성하는 생물체는 이들에 한정적이지 않다.
본 발명에 사용될 수 있는 디브랜칭 효소는 클레브시엘라 뉴모니에, 바실러스 브레비스, 바실러스 애시도풀룰리티커스, 슈도모나스 아밀로데라모사로부터 유도되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 클레브시엘라 뉴모니에 또는 슈도모나스 아밀로데라모사이다. 바람직하게, 본 발명에 사용되는 디브랜칭 효소는 높은 최적 반응 온도를 지닌다. 예를 들어 높은 최적 반응 온도를 지닌 디브랜칭 효소는 극도의 호열성 박테리아로부터 유도된다.
본 발명에 사용될 수 있는 디브랜칭 효소는 자연계에 존재하고 디브랜칭 효소를 생성하는 상기 기술된 미생물, 박테리아 및 식물로부터 직접 분리된다.
본 발명에 사용될 수 있는 디브랜칭 효소는 동물, 식물 또는 미생물로부터 분리된 디브랜칭 효소를 인코드하는 유전자를 이용한 유전자 재조합에 의해 수득된 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)로부터 분리된다.
디브랜칭 효소는 상기 기술된 바와 같이 슈크로스 가인산분해효소와 유사한 방식으로 재조합 미생물로부터 수득된다.
상기-기술된 슈크로스 가인산분해효소와 유사하게 유전자 재조합에 사용되는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)은 디브랜칭 효소의 발현 용이성, 배양 용이성, 생장률, 안전성 등과 같은 다양한 조건을 고려함으로서 용이하게 선택된다. 디브랜칭 효소는 오염원으로서 아밀로스를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 따라서 전혀 없거나 또는 낮은 레벨의 아밀로스를 생성하거나 발현하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)에 의해 생성된 디브랜칭 효소가 유전자 재조합에 사용되는 것이 바람직하다. 디브랜칭 효소의 유전자 재조합에 있어서, E. coli 또는 바실러스 섭틸리스와 같은 중온균이 바람직하게 사용된다. 전혀 없거나 또는 낮은 레벨의 아밀로스를 생성하거나 발현하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)에 의해 생성된 디브랜칭 효소는 실질적으로 어떤 아밀로스도 포함하지 않고, 따라서 본 발명의 방법에 사용되기에 바람직하다.
유전자 재조합에 의해 수득된 디브랜칭 효소의 생성 및 정제는 상기-기술된 슈크로스 가인산분해효소와 유사한 방식으로 수행될 수 있다.
반응의 시작시 용액 내 함유된 디브랜칭 효소의 양은 대표적으로 시작시 용액 내 슈크로스에 대해 약 0.05∼1,000 U/g 슈크로스, 바람직하게는 약 0.1∼500 U/g 슈크로스, 더욱 바람직하게는 약 0.5∼100 U/g 슈크로스이다. 디브랜칭 효소의 중량이 과도하게 크면 반응 내 변성된 효소가 응집하기 쉽고, 사용되는 양이 과도하게 적으면 글루칸 산출량이 감소된다.
디브랜칭 효소는 정제되거나 정제되지 않는다. 디브랜칭 효소는 고정되거나 고정되지 않는다. 디브랜칭 효소는 바람직하게는 고정된다. 당업자에게 잘 알려진 고정의 방법으로서 담체 결합 방법(즉, 공유결합 결합 방법, 이온 결합 방법 또는 물리적 흡착 방법), 교차-결합 방법, 인트랩먼트(entrapment) 방법(격자 타입 또는 마이크로캡슐 타입) 등이 사용된다. 디브랜칭 효소는 바람직하게는 담체 상에 고정된다. 또한 디브랜칭 효소는 적어도 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 중 하나와 동일한 담체 상에 또는 또다른 담체 상에 고정되고, 바람직하게는 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소 모두와 동일한 담체 상에 고정된다.
(7) 브랜칭 효소(EC. 2. 4. 1. 18) :
본 발명의 방법에서 분지가 생물체 내에서 생성되는 것이 바람직할 때 브랜칭 효소가 필요한 경우 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 브랜칭 효소는 α-1,4-글루칸 체인의 일부분을 α-1,4-글루칸 체인 내 글루코스 잔기의 포지션 6으로 옮겨 분지를 생성할 수 있는 효소이다. 브랜칭 효소는 α-1,4-글루칸 브랜칭 효소, 분지-생성 효소 또는 Q 효소로도 불린다.
브랜칭 효소는 미생물, 박테리아 및 식물 내에 존재한다. 브랜칭 효소를 생성하는 미생물의 예는 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 섭틸리스, 바실러스 칼도리티커스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 칼도베록스, 바실러스 써모카테눌라터스, 바실러스 스미티, 바실러스 메가테리움, 바실러스 브레비스, 알칼로필릭(alkalophillic) 바실러스 sp., 스트렙토마이스 코엘리콜로, 아퀴펙스 에오리커스, 시네코시스티스 sp., E. coli, 아그로박테리움 튜메파시엔스, 써머스 아쿠아티커스, 로도써머스 오바멘시스, 뉴로스포라 크라싸, 효모 등을 포함한다. 브랜칭 효소를 생성하는 동물은 인간, 토끼, 래트, 돼지 등과 같은 포유류 등을 포함한다. 브랜칭 효소를 생성하는 식물은 조류, 괴경 채소(즉, 감자, 고구마, 참마, 토란, 카사바 등), 채소(즉, 시금치 등), 곡물(즉, 옥수수, 쌀, 소맥, 보리, 호밀, 조 등), 콩(즉, 완두콩, 대두, 팥, 우주라(uzura) 콩 등)을 포함한다. 브랜칭 효소를 생성하는 생물체는 이들에 한정적이지 않다.
본 발명에 사용될 수 있는 브랜칭 효소는 바람직하게는 감자, 바실러스 스테아로써모필러스 또는 아퀴펙스 에오리커스, 더욱 바람직하게는 바실러스 스테아로써모필러스 또는 아퀴펙스 에오리커스이다. 바람직하게, 본 발명에 사용되는 브랜칭 효소는 높은 최적 반응 온도를 지닌다. 예를 들어 높은 최적 반응 온도를 지닌 브랜칭 효소는 극도의 호열성 박테리아로부터 유도된다.
본 발명에 사용될 수 있는 브랜칭 효소는 자연계에 존재하고 브랜칭 효소를 생성하는 상기 기술된 미생물, 박테리아 및 식물로부터 직접 분리된다.
본 발명에 사용될 수 있는 브랜칭 효소는 동물, 식물 또는 미생물로부터 분리된 브랜칭 효소를 인코드하는 유전자를 이용한 유전자 재조합에 의해 수득된 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)로부터 분리된다.
브랜칭 효소는 상기 기술된 바와 같이 슈크로스 가인산분해효소와 유사한 방식으로 재조합 미생물로부터 수득된다.
상기-기술된 슈크로스 가인산분해효소와 유사하게 유전자 재조합에 사용되는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)은 브랜칭 효소의 발현 용이성, 배양 용이성, 생장률, 안전성 등과 같은 다양한 조건을 고려함으로서 용이하게 선택된다. 브랜칭 효소는 오염원으로서 아밀로스를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 따라서 전혀 없거나 또는 낮은 레벨의 아밀로스를 생성하거나 발현하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)에 의해 생성된 브랜칭 효소가 유전자 재조합에 사용되는 것이 바람직하다. 브랜칭 효소의 유전자 재조합에 있어서, E. coli 또는 바실러스 섭틸리스와 같은 중온균이 바람직하게 사용된다. 전혀 없거나 또는 낮은 레벨의 아밀로스를 생성하거나 발현하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)에 의해 생성된 브랜칭 효소는 실질적으로 어떤 아밀로스도 포함하지 않고, 따라서 본 발명의 방법에 사용되기에 바람직하다.
유전자 재조합에 의해 수득된 브랜칭 효소의 생성 및 정제는 상기-기술된 슈크로스 가인산분해효소와 유사한 방식으로 수행될 수 있다.
반응의 시작시 용액 내 함유된 브랜칭 효소의 양은 대표적으로 시작시 용액 내 슈크로스에 대해 약 10∼100,000 U/g 슈크로스, 바람직하게는 약 100∼50,000 U/g 슈크로스, 더욱 바람직하게는 약 1,000∼10,000 U/g 슈크로스이다. 브랜칭 효소의 중량이 과도하게 크면 반응 내 변성된 효소가 응집하기 쉽고, 사용되는 양이 과도하게 적으면 글루칸 산출량이 감소된다.
브랜칭 효소는 정제되거나 정제되지 않는다. 브랜칭 효소는 고정되거나 고정되지 않는다. 브랜칭 효소는 바람직하게는 고정된다. 당업자에게 잘 알려진 고정의 방법으로서 담체 결합 방법(즉, 공유결합 결합 방법, 이온 결합 방법 또는 물리적 흡착 방법), 교차-결합 방법, 인트랩먼트(entrapment) 방법(격자 타입 또는 마이크로캡슐 타입) 등이 사용된다. 브랜칭 효소는 바람직하게는 담체 상에 고정된다. 또한 브랜칭 효소는 적어도 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 중 하나와 동일한 담체 상에 또는 또다른 담체 상에 고정되고, 바람직하게는 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소 모두와 동일한 담체 상에 고정된다.
(8) 4-α-글루카노트랜스퍼라제(EC. 2. 4. 1. 25)
본 발명의 방법에서 환형 구조가 생성물 내에서 생성될 때 4-α-글루카노트랜스퍼라제가 필요한 경우 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 4-α-글루카노트랜스퍼라제는 불균형화(disproportionating) 효소, D-효소, 아밀로말타제, 불균형(disproportionation) 효소 등으로 불리고, 말토-올리고사카라이드의 사카라이드 전이 반응(불균형 반응)을 촉매할 수 있다. 4-α-글루카노트랜스퍼라제는 기증(donor) 분자의 비-환원 말단으로부터 수용 분자의 비-환원 말단으로 글리코시 그룹 또는 말토실 또는 말토-올리고실 유니트를 전이시키는 효소이다. 따라서 효소 반응은 먼저 제공된 말토-올리고사카라이드의 중합반응 정도의 불균형을 이끈다. 기증 분자가 수용 분자와 동일하면 분자내 전이가 발생하여 환형 구조를 지닌 생성물을 초래한다.
4-α-글루카노트랜스퍼라제는 미생물 및 식물 내에 존재한다. 4-α-글루카노트랜스퍼라제를 생성하는 미생물의 예는 아퀴펙스 에오리커스, 스트렙토코커스 뉴모니에, 클로스트리움 부틸리컴, 데니코커스 라디오듀란스, 헤모필러스 인플루엔자, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 써모코커스 리트랄리스, 써모타가 마리토가, 써모토가 네아폴리타나, 클라미디아 시타시, 피로코커스 sp., 디크티오클로머스 써모필리움, 보렐리아 부르그도리페리, 시네코시스티스 sp., E. coli, 써머스 아쿠아티커스 등을 포함한다. 4-α-글루카노트랜스퍼라제를 생성하는 식물은 조류, 괴경 채소(즉, 감자, 고구마, 참마, 토란, 카사바 등), 채소(즉, 시금치 등), 곡물(즉, 옥수수, 쌀, 소맥, 보리, 호밀, 조 등), 콩(즉, 완두콩, 대두, 팥, 우주라(uzura)콩 등)을 포함한다. 4-α-글루카노트랜스퍼라제를 생성하는 생물체는 이들에 한정적이지 않다.
본 발명에 사용될 수 있는 4-α-글루카노트랜스퍼라제는 바람직하게는 감자, 써머스 아쿠아티커스 또는 써모코커스 리트랄리스, 더욱 바람직하게는 써머스 아쿠아티커스이다. 바람직하게, 본 발명에 사용되는 4-α-글루카노트랜스퍼라제는 높은 최적 반응 온도를 지닌다. 예를 들어 높은 최적 반응 온도를 지닌 4-α-글루카노트랜스퍼라제는 극도의 호열성 박테리아로부터 유도된다.
본 발명에 사용될 수 있는 4-α-글루카노트랜스퍼라제는 자연계에 존재하고 4-α-글루카노트랜스퍼라제를 생성하는 상기 기술된 미생물 및 식물로부터 직접 분리된다.
본 발명에 사용될 수 있는 4-α-글루카노트랜스퍼라제는 미생물 및 식물로부터 분리된 4-α-글루카노트랜스퍼라제를 인코드하는 유전자를 이용한 유전자 재조합에 의해 수득된 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)로부터 분리된다.
4-α-글루카노트랜스퍼라제는 상기 기술된 바와 같이 슈크로스 가인산분해효소와 유사한 방식으로 재조합 미생물로부터 수득된다.
상기-기술된 슈크로스 가인산분해효소와 유사하게 유전자 재조합에 사용되는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)은 4-α-글루카노트랜스퍼라제의 발현 용이성, 배양 용이성, 생장률, 안전성 등과 같은 다양한 조건을 고려함으로서 용이하게 선택된다. 4-α-글루카노트랜스퍼라제는 오염원으로서 아밀로스를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 따라서 전혀 없거나 또는 낮은 레벨의 아밀로스를 생성하거나 발현하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)에 의해 생성된 4-α-글루카노트랜스퍼라제가 유전자 재조합에 사용되는 것이 바람직하다. 4-α-글루카노트랜스퍼라제 효소의 유전자 재조합에 있어서, E. coli 또는 바실러스 섭틸리스와 같은 중온균이 바람직하게 사용된다. 전혀 없거나 또는 낮은 레벨의 아밀로스를 생성하거나 발현하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)에 의해 생성된 4-α-글루카노트랜스퍼라제는 실질적으로 어떤 아밀로스도 포함하지 않고, 따라서 본 발명의 방법에 사용되기에 바람직하다.
유전자 재조합에 의해 수득된 4-α-글루카노트랜스퍼라제의 생성 및 정제는 상기-기술된 슈크로스 가인산분해효소와 유사한 방식으로 수행될 수 있다.
반응의 시작시 용액 내 함유된 4-α-글루카노트랜스퍼라제의 양은 대표적으로 시작시 용액 내 슈크로스에 대해 약 0.05∼1,000 U/g 슈크로스, 바람직하게는 약 0.1∼500 U/g 슈크로스, 더욱 바람직하게는 약 0.5∼100 U/g 슈크로스이다. 4-α-글루카노트랜스퍼라제의 중량이 과도하게 크면 반응 내 변성된 효소가 응집하기 쉽고, 사용되는 양이 과도하게 적으면 글루칸 산출량이 감소된다.
4-α-글루카노트랜스퍼라제는 정제되거나 정제되지 않는다. 4-α-글루카노트랜스퍼라제는 고정되거나 고정되지 않는다. 4-α-글루카노트랜스퍼라제는 바람직하게는 고정된다. 당업자에게 잘 알려진 고정의 방법으로서 담체 결합 방법(즉, 공유결합 결합 방법, 이온 결합 방법 또는 물리적 흡착 방법), 교차-결합 방법, 인트랩먼트(entrapment) 방법(격자 타입 또는 마이크로캡슐 타입) 등이 사용된다. 4-α-글루카노트랜스퍼라제는 바람직하게는 담체 상에 고정된다. 또한 4-α-글루카노트랜스퍼라제는 적어도 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 중 하나와 동일한 담체 상에 또는 또다른 담체 상에 고정되고, 바람직하게는 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소 모두와 동일한 담체 상에 고정된다.
(9) 글리코겐 디브랜칭 효소(EC. 2. 4. 1. 25 / EC. 3. 2. 1. 33)
본 발명의 방법에서 환형 구조가 생성물 내에서 생성될 때 글리코겐 디브랜칭 효소가 필요한 경우 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 글리코겐 디브랜칭 효소는 2가지 타입의 활성 즉, α-1,6-글루코시다제 활성 및 α-1,4-글루코시다제 활성을 지닌 효소이다.글리코겐 디브랜칭 효소에 의해 보유된 α-1,4-글루코시다제 활성 때문에 환형 구조를 지닌 생성물이 수득된다.
글리코겐 디브랜칭 효소는 미생물 및 동물 내에 존재한다. 글리코겐 디브랜칭 효소를 생성하는 미생물의 예는 효모 등을 포함한다. 글리코겐 디브랜칭 효소를 생성하는 동물은 인간, 토끼, 래트, 돼지 등을 포함한다. 글리코겐 디브랜칭 효소를 생성하는 생물체는 이들에 한정적이지 않다.
본 발명에 사용될 수 있는 글리코겐 디브랜칭 효소는 바람직하게는 효모로부터 유도된다. 바람직하게, 본 발명에 사용되는 글리코겐 디브랜칭 효소는 높은 최적 반응 온도를 지닌다. 예를 들어 높은 최적 반응 온도를 지닌 글리코겐 디브랜칭 효소는 단백질 공학 기술을 이용하여 중간의 온도에서 작용할 수 있는 효소를 변형시킴으로서 수득된다.
본 발명에 사용될 수 있는 글리코겐 디브랜칭 효소는 자연계에 존재하고 글리코겐 디브랜칭 효소를 생성하는 상기 기술된 미생물 및 동물로부터 직접 분리된다.
본 발명에 사용될 수 있는 글리코겐 디브랜칭 효소는 미생물 및 동물로부터 분리된 글리코겐 디브랜칭 효소를 인코드하는 유전자를 이용한 유전자 재조합에 의해 수득된 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)로부터 분리된다.
글리코겐 디브랜칭 효소는 상기 기술된 바와 같이 슈크로스 가인산분해효소와 유사한 방식으로 재조합 미생물로부터 수득된다.
상기-기술된 슈크로스 가인산분해효소와 유사하게 유전자 재조합에 사용되는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)은 글리코겐 디브랜칭 효소의 발현 용이성, 배양 용이성, 생장률, 안전성 등과 같은 다양한 조건을 고려함으로서 용이하게 선택된다. 글리코겐 디브랜칭 효소는 오염원으로서 아밀로스를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 따라서 전혀 없거나 또는 낮은 레벨의 아밀로스를 생성하거나 발현하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)에 의해 생성된 글리코겐 디브랜칭 효소가 유전자 재조합에 사용되는 것이 바람직하다. 글리코겐 디브랜칭 효소의 유전자 재조합에 있어서, E. coli 또는 바실러스 섭틸리스와 같은 중온균이 바람직하게 사용된다. 전혀 없거나 또는 낮은 레벨의 아밀로스를 생성하거나 발현하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)에 의해 생성된 글리코겐 디브랜칭 효소는 실질적으로 어떤 아밀로스도 포함하지 않고, 따라서 본 발명의 방법에 사용되기에 바람직하다.
유전자 재조합에 의해 수득된 글리코겐 디브랜칭 효소의 생성 및 정제는 상기-기술된 슈크로스 가인산분해효소와 유사한 방식으로 수행될 수 있다.
반응의 시작시 용액 내 함유된 글리코겐 디브랜칭 효소의 양은 대표적으로 시작시 용액 내 슈크로스에 대해 약 0.05∼1,000 U/g 슈크로스, 바람직하게는 약 0.1∼500 U/g 슈크로스, 더욱 바람직하게는 약 0.5∼100 U/g 슈크로스이다. 글리코겐 디브랜칭 효소의 중량이 과도하게 크면 반응 내 변성된 효소가 응집하기 쉽고, 사용되는 양이 과도하게 적으면 글루칸 산출량이 감소된다.
글리코겐 디브랜칭 효소는 정제되거나 정제되지 않는다. 글리코겐 디브랜칭 효소는 고정되거나 고정되지 않는다. 글리코겐 디브랜칭 효소는 바람직하게는 고정된다. 당업자에게 잘 알려진 고정의 방법으로서 담체 결합 방법(즉, 공유결합 결합 방법, 이온 결합 방법 또는 물리적 흡착 방법), 교차-결합 방법, 인트랩먼트(entrapment) 방법(격자 타입 또는 마이크로캡슐 타입) 등이 사용된다. 글리코겐 디브랜칭 효소는 바람직하게는 담체 상에 고정된다. 또한 글리코겐 디브랜칭 효소는 적어도 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 중 하나와 동일한 담체 상에 또는 또다른 담체 상에 고정되고, 바람직하게는 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소 모두와 동일한 담체 상에 고정된다.
(10) 용매 :
본 발명의 방법에 사용된 용매는 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소의 효소 활성을 손상시키지 않는 어떤 용매도 된다.
용매는 글루칸을 생성하는 반응이 진행될 수 있는 한 본 발명의 방법에 사용되는 물질을 완전하게 용해시킬 필요는 없다. 예를 들어 효소가 고형 담체 상에서 운반될 때 효소는 용매 내에 항상 용해될 필요는 없다. 또한 반응하는 모든 물질이 항상 용해될 필요는 없고 물질의 일부가 반응이 진행될 수 있는 정도로 용해된다.
대표적인 용매는 물이다. 용매는 상기-기술된 슈크로스 가인산분해효소 또는 글루칸 가인산분해효소를 제조할 때 슈크로스 가인산분해효소 또는 글루칸 가인산분해효소와 함께 수득된 파괴된 세포 용액의 물이다.
물은 연수, 중수 및 경수도 된다. 연수는 적어도 20°이상의 경도를 지닌 물을 나타낸다. 중수는 10°이상 20°이하의 경도를 지닌 물을 나타낸다. 경수는 10°이하의 경도를 지닌 물을 나타낸다. 물은 바람직하게는 연수 또는 중수이고, 더욱 바람직하게는 연수이다.
(11) 다른 구성성분 :
슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 용액은 물질이 슈크로스 가인산분해효소와 슈크로스 사이의 상호작용 및 글루칸 가인산분해효소와 프라이머 사이의 상호작용을 방해하지 않는 한 어떠한 물질도 포함한다. 이러한 물질의 예는 완충제, 슈크로스 가인산분해효소를 생성하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)의 구성성분, 글루칸 가인산분해효소를 생성하는 미생물(즉, 박테리아, 진균 등)의 구성성분, 염, 배양 배지 성분 등을 포함한다.
〈글루칸의 생성〉
본 발명의 글루칸은 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 반응 용액 내 반응을 수행하는 단계에 의해 생성된다.
도 1은 본 발명에 사용되는 슈크로스로부터의 글루칸 합성을 개략적으로 나타낸다. 글루코스-1-인산은 슈크로스 가인산분해효소에 의해 슈크로스 및 무기 인산으로부터 생성된다. 생성된 글루코스-1-인산 및 반응 용액에 첨가된 글루코스-1-인산은 글루칸 가인산분해효소에 의해 적당한 프라이머로 즉시 전이되어 α-1,4-글루칸 체인을 확장시킨다. 또한 이러한 경우 생성된 무기 인산은 슈크로스 가인산분해효소 반응에 다시 재순환된다.
먼저 반응 용액에 제조된다. 예를 들어 반응 용액은 적당한 용매에 고형슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 첨가함으로서 제조된다. 대안으로 반응 용액은 각각 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 용액들을 혼합함으로서 제조된다. 대안으로 반응 용액은 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 일부 함유한 용액과 다른 고형 성분을 혼합함으로서 제조된다. pH를 적정하는 목적으로 어떠한 완충제도 효소 반응을 억제하지 않는 한 선택적으로 첨가된다. 디브랜칭 효소, 브랜칭 효소, 4-α-글루카노트랜스퍼라제 및 글루칸 디브랜칭 효소로 구성된 군으로부터 선택된 효소가 반응 용액 내에 선택적으로 첨가된다.
이후 반응은 당분야에 알려진 방법에 의해 선택적으로 가열함으로서 반응된다. 반응 온도는 본 발명의 효과가 수득될 수 있는 한 어떠한 수치도 된다. 반응 용액의 슈크로스 농도는 반응 시작시 약 5∼100%이고, 반응 온도는 대표적으로 약 40∼70℃이다. 이러한 반응 단계에서 용액의 온도는 바람직하게는 미리결정된 반응 시간 후 용액 내 함유된 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소의 적어도 하나 이상, 바람직하게는 둘 모두 반응 전 활성의 적어도 약 50% 이상, 바람직하게는 적어도 약 80% 이상을 보유하게 하는 것이다. 온도는 바람직하게는 약 40∼70℃, 더욱 바람직하게는 약 45∼70℃, 더욱 바람직하게는 약 45∼65℃이다.
상기-기술된 첫 번째 방법의 경우 즉, 반응의 시작부터 반응의 종료까지 반응 용액 내 슈크로스-인산 비율의 최대 수치가 약 17 이하일 때 반응 온도는 상기-기술된 범위 보다 낮음을 주지해야 한다. 상기-기술된 네 번째 방법의 경우 즉, 반응의 시작시 반응 용액 내 슈크로스-인산 비율이 이하일 때 및 상기-기술된 다섯 번째 방법의 경우 즉, 반응 용액 내로 슈크로스, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산을 더욱 첨가하는 단계를 포함할 때 반응 온도는 상기-기술된 범위보다 낮다. 예를 들어 반응은 가열없이 상온에서 수행될 수 있다.
반응 시간은 반응 온도, 반응에 의해 생성되는 글루칸의 분자량 및 효소의 잔여 활성을 고려함으로서 정해지지 않고 결정된다. 반응 시간은 대표적으로 약 1∼100시간, 바람직하게는 1∼72시간, 더욱 바람직하게는 2∼36시간, 특히 더 바람직하게는 2∼24시간이다.
가열은 어떤 방법으로도 수행된다. 바람직하게는 가열은 열이 용액 전체로 균일하게 전달되기 위해 교반하면서 수행된다. 예를 들어 용액은 뜨거운-물 자켓(jacket) 및 교반 장치로 구성된 스테인레스 반응 탱크 내에 놓인 후 교반된다.
본 발명의 방법에서 반응이 어느 정도 진행되면 글루코스 가인산분해효소 및글루칸 가인산분해효소 중 적어도 하나 이상이 반응 용액 내에 첨가된다.
이러한 방식으로 글루칸 함유 용액이 생성된다.
반응이 종료된 후 반응 용액은 예를 들어 10분간 100℃에서 선택적으로 가열되어 반응 용액 내 효소를 불활성화시킨다. 대안으로 하위 단계는 효소의 불활성화 처리 없이 수행된다. 반응 용액은 변화없이 보관되거나 생성된 글루칸을 분리하기 위해 처리된다.
〈정제 방법〉
생성된 글루칸은 필요한 경우 정제된다. 정제에 의해 제거된 불순물의 예는 프럭토스이다. 글루칸을 정제하는 방법의 예로서 유기 용매를 이용한 방법(T. J. Schoch et al., J. American Chemical Society, 64, 2957 (1942)) 및 어떤 유기 용매도 사용하지 않는 방법이 있다.
유기 용매를 이용한 정제에 사용될 수 있는 유기 용매의 예는 아세톤, n-아밀알코올, 펜타졸, n-프로필알코올, n-헥실알코올, 2-에틸-1-부탄올, 2-에틸-1-헥산올, 라우릴알코올, 시클로헥산올, n-부틸알코올, 3-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, d,l-보르네올, α-테르피네올, 이소부틸알코올, 세크-부틸알코올, 2-메틸-1-부탄올, 이소아밀알코올, 테르트-아밀알코올, 멘톨, 메탄올, 에탄올 및 에테르를 포함한다.
어떤 유기 용매도 사용하지 않는 정제 방법의 예는 하기에 기술될 것이다.
(1) 글루칸을 정제하기 위해 반응 용액을 냉각시키고, 침전된 글루칸을 막 분획화, 여과, 원심분리 등과 같은 일반적인 고형-액체 분리 방법을 수행하는 글루칸 생성 반응 후 글루칸을 침전시키는 방법
(2) 글루칸 생성 반응 동안 또는 그 후 반응 용액을 냉각시켜 글루칸을 겔화시키고 겔화된 글루칸을 회수하고 물로의 세척, 동결-해동, 여과 등에 의해 겔화된 글루칸으로부터 프럭토스를 제거하는 방법 ; 및
(3) 물에 용해된 글루칸을 침전시키지 않고 글루칸 생성 반응 후 한외여과막 또는 크로마토그래피를 이용한 막 분획화에 의해 프럭토스를 제거하는 방법.
정제에 사용되는 한외여과막의 예는 약 1,000∼100,000, 바람직하게는 약 5,000∼50,000, 특히 더 바람직하게는 10,000∼30,000의 분자량 컷오프(cutoff)를 지닌 한외여과막(Daicel Chemical Industries, Ltd. 제조 UF 막 유니트)을 포함한다.
크로마토그래피에 사용될 있는 담체의 예는 겔 여과 크로마토그래피용 담체, 리간트 교환 크로마토그래피용 담체, 이온 교환 크로마토그래피용 담체 및 소수성 크로마토그래피용 담체를 포함한다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명된다. 본 발명은 하기 실시예에만 한정되지 않는다.
(1. 측정 및 계산 방법)
본 발명의 각각의 물질은 하기 측정방법에 의해 측정되었다.
(1. 글루코스 정량화)
글루코스는 통상의 측정 키트를 이용하여 정량화되었다. 측정시 글루코스 AR-Ⅱ 발색 시약(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)이 사용되었다.
(1. 2 프럭토스 정량화)
프럭토스는 통상의 측정 키트를 이용하여 정량화되었다. 측정시 F-키트 D-글루코스/D-프럭토스(Roche 제조)가 사용되었다.
(1. 3 글루코스-1-인산 정량화)
글루코스-1-인산은 하기 방법을 이용하여 정량화되었다. 600 ㎕의 적당히 희석된 글루코스-1-인산을 함유한 용액이 300 ㎕의 측정 시약(200 mM Tris-HCl (pH 7.0), 3 mM NADP, 15 mM 염화마그네슘, 3 mM EDTA, 15 μM 글루코스-1,6-이인산, 6 ㎍/ml의 포스포글루코뮤타제, 6 ㎍/ml의 글루코스-6-인산 탈수소효소) 내로 첨가되었고 교반되어 반응 시스템을 수득하였다. 이러한 반응 시스템은 30분간 30℃에 유지되었다. 이후 흡광도는 측광기를 이용하여 340 nm에서 측정되었다. 알려진 농도를 지닌 글루코스-1-인산 나트륨의 흡광도가 유사한 방식으로 측정되어 표준 곡선을 만들었다. 표본으로부터 수득된 흡광도가 표준 곡선에 적용되어 표본의 글루코스-1-인산 농도를 결정하였다. 일반적으로 1분 당 1 μmol의 글루코스-1-인산을 생성하는 활성이 하나의 유니트로서 정의된다. 이러한 정량화 방법에서 무기 인산이 아닌 글루코스-1-인산만이 정량화되었다.
(1. 4 무기 인산 정량화)
무기 인산은 무기 인산이 인산 이온으로 간주되는 하기 방법에 의해 정량화되었다. 무기 인산을 함유한 용액(200 ㎕)은 800 ㎕의 몰리브덴 시약(15 mM 몰리브덴산암모늄, 100 mM 아세트산아연)과 혼합되었고, 200 ㎕의 568 mM 아스크로브산(pH 5.0)이 첨가되고 교반되어 반응 시스템을 수득하였다. 이러한 반응 시스템은 20분간 30℃에 유지되었다. 이후 흡광도가 측광기를 사용하여 850 nm에서 측정되었다. 알려진 농도를 지닌 무기 인산의 흡광도가 유사한 방식으로 측정되어 표준 곡선을 만들었다. 표본으로부터 수득된 흡광도가 표준 곡선에 적용되어 표본의 무기 인산 농도를 결정하였다. 이러한 정량화 방법에서 글루코스-1-인산이 아닌 무기 인산만이 정량화되었다.
(1. 5 글루칸 산출량을 계산하는 방법)
시작 물질로서 무기 인산을 이용하여 생성된 글루칸 산출량은 하기 식을 이용하여 반응의 종료 후 용액 내 글루코스, 프럭토스 및 글루코스-1-인산의 양으로부터 계산된다.
(글루칸 (mM 글루코스 등량)) =
(프럭토스 (mM)) - (글루코스-1-인산 (mM)) - (글루코스 (mM))
이러한 식은 하기 원리에 기초한다.
본 발명의 방법에서, 먼저 하기 식에 의해 나타난 반응 (A)가 발생할 수 있다.
(A) 슈크로스 + 무기 인산 →글루코스-1-인산 + 프럭토스
이러한 반응은 슈크로스 가인산분해효소에 의해 촉매된다. 이러한 반응에서 슈크로스는 무기 인산과 반응하여 동일한 몰 양의 글루코스-1-인산과 프럭토스를 생성한다. 생성된 프럭토스는 더 이상 다른 물질과 반응하지 않는다. 따라서 프럭토스의 양을 측정함으로서 생성된 글루코스-1-인산의 몰 양이 측정될 수 있다.
슈크로스 가인산분해효소는 상기-기술된 반응 (A) 외에 부가 반응으로서 하기 반응 (B)에서 슈크로스의 가수분해를 촉매할 수 있다.
(B) 슈크로스 →글루코스 + 프럭토스
글루칸이 되는 글루코스의 양은 :
(글루칸이 되는 글루코스의 양) =
(반응 A에 의해 생성된 글루코스-1-인산의 양) - (반응하지 않은 글루코스-1-인산의 양) = (반응 A에 의해 생성된 프럭토스의 양) - (반응하지 않은 글루코스-1-인산의 양)
에 의해 계산된다.
반응 (B)에서 생성된 프럭토스를 고려하여 반응 (A)에 의해 생성된 프럭토스의 양은 :
(반응 A에 의해 생성된 프럭토스의 양) =
(반응의 종료 후 프럭토스의 양) - (반응의 종료 후 글루코스의 양)
에 의해 계산된다.
따라서 글루칸 산출량은 하기 식에 의해 수득된다.
(글루칸 (mM 글루코스 등량)) =
(프럭토스 (mM)) - (글루코스-1-인산 (mM)) - (글루코스 (mM))
시작 물질로서 글루코스-1-인산을 사용하여 생성된 글루칸 산출량은 하기 식에 의해 글루코스-1-인산의 초기 양 및 반응 종료 후 용액 내 글루코스, 프럭토스및 글루코스-1-인산의 양으로부터 계산된다.
(글루칸 (mM 글루코스 등량)) =
(초기 글루코스-1-인산 (mM)) + (프럭토스 (mM)) - (글루코스 (mM)) - (반응 후 글루코스-1-인산 (mM))
이러한 식은 하기 원리에 기초한다.
반응 용액에서 초기 글루코스-1-인산 외에 반응 A가 글루코스-1-인산을 생성한다. 따라서 초기 글루코스-1-인산 및 생성된 글루코스-1-인산이 글루칸 합성에 사용된다. 반응의 종료 후 글루칸 합성에 사용될 수 있는 글루코스-1-인산의 양에서 반응 용액 내 잔존하는 글루코스-1-인산의 양을 뺌으로서 반응에 사용된 글루코스-1-인산의 양 즉, 글루칸이 되는 글루코스의 양이 계산될 수 있다. 따라서 글루칸이 되는 글루코스의 양이 상기-기술된 식에 의해 수득될 수 있다. 이러한 식이 SP-GP 반응 시스템에서 무기 인사과 글루코스-1-인산이 시작 물질로서 사용되는 경우에 적용될 수 있음이 주지되어야 한다.
(1. 6 글루칸 산출량)
시작 물질로서 무기 인산을 사용하여 생성된 글루칸 산출량은 하기 식에 의해 수득된다.
(글루칸 산출량 (%)) =
(글루칸 (mM 글루코스 등량)) / (초기 슈크로스 (mM)) ×100
시작 물질로서 글루코스-1-인산을 사용하여 생성된 글루칸 산출량은 하기 식에 의해 수득된다.
(글루칸 산출량 (%)) =
{(초기 글루코스-1-인산 (mM)) + (프럭토스 (mM)) - (글루코스 (mM)) - (반응 후 글루코스-1-인산 (mM)} / {(초기 슈크로스 (mM)) + (초기 글루코스-1-인산 (mM))} ×100
이러한 식은 SP-GP 반응 시스템에서 무기 인산과 글루코스-1-인산 모두 시작 물질로 사용되는 경우에 적용될 수 있음이 주지되어야 한다.
(1. 7 글루칸 가인산분해효소 활성의 측정)
글루칸 가인산분해효소의 활성 유니트는 하기 방법에 의해 측정되었다.
50 ㎕의 4% 클러스터 덱스트린 수용액 및 50 ㎕의 50 mM 글루코스-1-인산 나트륨 수용액이 혼합되었고 100 ㎕의 적당히 희석된 효소가 첨가되어 반응을 시작하였다. 혼합물은 15분 동안 37℃에서 반응되었다. 이후 10 ㎕의 20% SDS가 첨가되어 반응을 정지시켰다. 이후 반응 용액 내 무기 인산의 양이 상기 1. 4.에서 기술된 방법에 의해 정량화되었다. 이러한 방법에서 분 당 1 μmol의 무기 인산을 생성하는 활성이 하나의 유니트로 정의된다. 써머스 아쿠아티커스로부터 유도된 글루칸 가인산분해효소의 경우 글루칸 가인산분해효소의 활성은 37℃ 대신 50℃에서 반응시킴으로서 측정되었다.
(1. 8. 슈크로스 가인산분해효소 활성의 측정)
슈크로스 가인산분해효소의 활성은 하기 방법에 의해 수득되었다.
25 ㎕의 10% 슈크로스 및 20 ㎕의 500 mM 인산 완충된 용액(pH 7.0)이 혼합되었다. 불용성 단백질이 제거된 5 ㎕의 적당히 희석된 효소가 혼합물에 첨가되었고 교반되어 반응 시스템을 수득하였다. 이러한 반응 시스템은 20분간 37℃에서 반응되었다. 이후 반응 시스템은 5분간 100℃에서 가열되어 반응을 정지시켰다. 이후 반응 후 용액 내 글루코스-1-인산이 정량화되었다. 일반적으로 분 당 1 μmol의 글루코스-1-인산을 생성하는 활성이 하나의 유니트로서 정의된다.
(2. 효소의 제조)
본 발명의 실시예에 사용된 다양한 효소가 하기 각각의 방법에 의해 제조되었다.
(2. 1 감자 괴경으로부터 유도된 글루칸 가인산분해효소의 제조방법)
1.4 kg의 통상의 감자 괴경의 껍질이 벗겨졌다. 껍질이 벗겨진 괴경은 과즙기로 갈아져서 즙을 수득하였다. 이후 즙은 거즈(gauze)로 여과되어 여과물을 수득하였다. Tris 완충액(pH 7.0)이 100 mM의 최종 농도로 여과물에 첨가되어 효소 액체를 수득하였다. 이러한 효소 액체는 액체의 온도가 50℃에 도달한 후 10분간 55℃에서 워터 배쓰 내에서 가열되었다. 가열 후 이러한 효소 액체는 원심분리기(AVANTI J-25I; Beckman 제조)를 이용하여 8,5000 rpm으로 20분간 원심분리되어 불용성 단백질 등을 제거하고 상청액을 수득하였다.
황산암모늄은 수득된 상청액에 100 g/L이 되도록 첨가되었다. 혼합물은 2시간 동안 4℃에서 정치되어 단백질을 침전시켰다. 이후 혼합물은 원심분리기(AVANTI J-25I; Beckman 제조)를 이용하여 8,5000 rpm으로 20분간 원심분리되어 불용성 단백질 등을 제거하고 상청액을 수득하였다. 또한 황산암모늄이 수득된 상청액에 첨가되어 250 g/L의 최종 농도가 되었다. 혼합물은 2시간 동안4℃에서 정치되어 단백질을 침전시켰다. 이후 혼합물은 원심분리기(AVANTI J-25I; Beckman 제조)를 이용하여 8,5000 rpm으로 20분간 원심분리되어 불용성 단백질 등을 회수하였다.
회수된 불용성 단백질은 150 ml의 25 mM Tris 완충액 (pH 7.0) 내에 현탁되었다. 현탁된 효소 액체는 동일한 완충액 내에서 밤새 투석되었다. 투석 후 표본은 미리-평형된 Q-Sepharose 음이온 교환 수지(Pharmacia 제조)에 흡착되고 200 mM의 염화나트륨을 함유한 완충액으로 세척되었다. 이후 단백질은 400 mM의 염화나트륨을 함유한 완충액으로 용출되었고, 용출액이 회수되었다. 용출액은 부분적으로 정제된, 감자 괴경-유도된 글루칸 가인산분해효소를 함유한 용액으로 명명되었다.
일부 구입한 감자에서 본 발명에서 사용될 수 있는 글루칸 가인산분해효소-함유 용액은 이러한 단계에서 수득될 수 있으나 대부분의 경우 더한 정제가 요구된다. 필요한 경우 Sephacryl S-200HR(Pharmacia 제조)를 이용한 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분획화 및 Phenyl-TOYOPEARL 650M(Tosoh Corporation 제조)를 이용한 소수성 크로마토그래피에 의한 분획화는 정제된, 감자 글루칸 가인산분해효소-함유 용액을 수득하는 것을 가능하게 한다.
(2. 2 재조합 감자 글루칸 가인산분해효소의 제조방법)
감자 글루칸 가인산분해효소(Nakano et al., Journal of Biochemistry (Tokyo) 106 (1989) 691) 및 선택가능한 마커 유전자 Ampr이 발현 벡터 pET34(STRATAGENE 제조) 내로 통합되어 플라스미드 pET-PGP113을 수득하였다. 이러한 플라스미드에서 글루칸 가인산분해효소 유전자가 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG) 유도가능 프로모터의 조절 하에 실시적으로-결합되었다. 이러한 플라스미드는 E. coli TG-1(STRATAGENE 제조) 내로 컴피턴트(competent) 세포 방법에 의해 도입되었다. 이러한 E. coli는 항생 암피실린을 함유한 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물(모두 Difco 제조), 1% 염화나트륨, 1.5% 한천)를 포함한 플레이트 위에 놓이고 37℃에서 밤새 인큐베이트되었다. 이러한 플레이트에서 생장한 E. coli를 선택함으로서 도입된 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소 유전자를 지닌 E. coli가 수득되었다. 도입된 유전자 서열의 분석은 수득된 E. coli가 글루칸 가인산분해효소 유전자를 지녔음을 확인시켰다. 또한 글루칸 가인산분해효소의 활성은 수득된 E. coli가 글루칸 가인산분해효소를 발현하는지 확인하기 위해 측정되었다.
E. coli는 항생 암피실린을 함유한 1 리터의 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물(모두 Difco 제조), 1% 염화나트륨) 내로 접종되었고 37℃에서 3시간 동안 120 rpm으로 진탕하면서 진탕 배양되었다. 이후 IPTG 및 피리독신이 배지 내에각각 0.1 mM 및 1 mM로 첨가되었고 20시간 동안 22℃에서 진탕 배양되었다. 이후 배양액은 5분간 5,000 rpm으로 원심분리되어 E. coli 세포를 수집하였다. 수득된 세포는 0.05% Triton X-100을 함유한 20 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0) 50 ml 내에 현탁되고 소니케이션에 의해 파괴되어 50 ml의 파괴된 박테리아 세포 용액을 수득하였다. 이러한 파괴된 박테리아 세포 용액은 4.7 U/mg의 글루칸 가인산분해효소를 포함하였다.
이러한 파괴된 박테리아 세포 용액은 30분간 55℃에서 가열되었다. 가열 후 액체는 20분간 8,500 rpm에서 원심분리되어 불용성 단백질 등을 제거하고 상청액을 수득하였다. 수득된 상청액은 미리-평형된 Q-Sepharose 음이온 교환 수지를 통과하여 글루칸 가인산분해효소가 수지에 흡착되게 하였다. 수지는 200 mM 염화나트륨을 함유한 완충액으로 세척되어 불순물을 제거하였다. 이후 단백질은 300 mM 염화 나트륨을 함유한 완충액으로 용출되었다. 수득된 용출액은 재조합 글루칸 가인산분해효소 용액으로 명명되었다.
(2. 3 써머스 아쿠아티커스 글루칸 가인산분해효소의 제조방법)
Takaha et al. (J. Appl. Glycosci., 48(1) (2001) 71)의 방법에 의해 제조된 효소가 써머스 아쿠아티커스 글루칸 가인산분해효소로 표기된다.
(2. 4 재조합 써머소 아쿠아티커스 글루칸 가인산분해효소의 제조방법)
써머스 아쿠아티커스 글루칸 가인산분해효소 유전자(J. Appl. Glycosci., 48(1) (2001) 71) 및 선택가능한 마커 유전자 Ampr및 Tecr이 pKK388-1(CLONTECH 제조)로 통합되어 플라스미드 pKK388-GP를 수득하였다. 이러한 플라스미드에서 글루칸 가인산분해효소 유전자는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG) 유도가능 프로모터의 조절 하에 실시적으로-결합된다. 이러한 플라스미드는 컴피턴트 세포 방법에 의해 E. coli MC1061(Pharmacia 제조) 내로 도입되었다. 이러한 E. coli는 항생 암피실린 및 IPTG를 함유한 LB 배지를 포함한 플레이트 위에 놓였고 37℃에서 밤새 인큐베이션되었다. 이러한 플레이트 위에서 생장한 E. coli를 선택함으로서 도입된 글루칸 가인산분해효소 유전자를 지닌 E. coli가 수득되었다. 도입된 유전자의 서열 분석은 수득된 E. coli가 글루칸 가인산분해효소 유전자를 지녔음을 확인시켰다. 또한 글루칸 가인산분해효소의 활성이 수득된 E. coli가 글루칸 가인산분해효소를 발현하는지 확인하기 위해 측정되었다.
E. coli는 항생 암피실린을 함유한 1 리터의 LB 배지 내로 접종되었고 37℃에서 4∼5시간 동안 120 rpm으로 진탕하면서 진탕 배양되었다. 이후 IPTG가 0.01 mM로 배지 내에 첨가되었고 20시간 동안 37℃에서 진탕 배양되었다. 이후 배양액은 5분간 5,000 rpm으로 원심분리되어 E. coli 세포를 수집하였다.
수득된 세포는 20 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0) 50 ml 내에 현탁되고 소니케이션에 의해 파괴되어 50 ml의 파괴된 박테리아 세포 용액을 수득하였다. 이러한 파괴된 박테리아 세포 용액은 4.2 U/mg의 글루칸 가인산분해효소를 포함하였다.
이후 이러한 파괴된 박테리아 세포 액체는 30분간 70℃에서 가열되었다. 가열 후 액체는 원심분리기(AVANTI J-25I; Beckman 제조)로 20분간 8,500 rpm에서 원심분리되어 불용성 단백질 등을 제거하고 상청액을 수득하였다. 수득된 상청액은 써머스 아쿠아티커스 글루칸 가인산분해효소 용액으로 명명되었다.
(2. 5 재조합 스트렙토코커스 뮤탄스 슈크로스 가인산분해효소의 제조방법)
스트렙토코커스 뮤탄스 슈크로스 가인산분해효소 유전자(Ferretti, J. J. et a., Ingbritt. Infect. Immun. 56:1586-88) 및 선택가능한 마커 유전자 Ampr및 Tetr이 pKK388-1 내로 통합되어 플라스미드 pKK388-SMSP을 수득하였다. 이러한 플라스미드에서 슈크로스 가인산분해효소 유전자는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG) 유도가능 프로모터의 조절하에 실시적으로-결합되었다. 이러한 플라스미드는 컴피턴트 세포 방법에 의해 E. coli TG-1(STRATAGENE 제조) 내로 도입되었다. 이러한 E. coli는 항생 암피실린 및 IPTG를 함유한 LB 배지를 포함한 플레이트 위에 놓였고 37℃에서 밤새 인큐베이션되었다. 이러한 플레이트 위에서 생장한 E. coli를 선택함으로서 도입된 슈크로스 가인산분해효소 유전자를 지닌 E. coli가 수득되었다. 도입된 유전자의 서열 분석은 수득된 E. coli가 슈크로스 가인산분해효소 유전자를 지녔음을 확인시켰다. 또한 슈크로스 가인산분해효소의 활성이 수득된 E. coli가 슈크로스 가인산분해효소를 발현하는지 확인하기 위해 측정되었다.
E. coli는 항생 암피실린 및 테트라시클린(tetracycline)을 함유한 1 리터의 LB 배지 내로 접종되었고 37℃에서 6∼7시간 동안 120 rpm으로 진탕하면서 진탕 배양되었다. 이후 IPTG가 0.04 mM로 배지 내에 첨가되었고 18시간 동안 30℃에서 진탕 배양되었다. 이후 배양액은 5분간 5,000 rpm으로 원심분리되어 E. coli 세포를 수집하였다. 수득된 세포는 20 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0) 50 ml 내에 현탁되고 소니케이션에 의해 파괴되어 50 ml의 파괴된 박테리아 세포 용액을 수득하였다. 이러한 파괴된 박테리아 세포 용액은 10 U/mg의 슈크로스 가인산분해효소를 포함하였다.
이후 슈크로스가 파괴된 박테리아 세포 내로 첨가되어 10%의 슈크로스-함유 파괴된 박테리아 세포 액체를 수득하였다. 이러한 파괴된 박테리아 세포 액체는 30분간 55℃에서 가열되었다. 가열 후 액체는 원심분리기(AVANTI J-25I; Beckman 제조)로 20분간 8,500 rpm에서 원심분리되어 불용성 단백질 등을 제거하고 상청액을 수득하였다. 수득된 상청액은 미리-평형된 Q-Sepharose 음이온 교환 수지를 통과하여 슈크로스 가인산분해효소가 수지에 흡착되게 하였다. 수지는 100 mM 염화나트륨을 함유한 완충액으로 세척되어 불순물을 제거하였다. 이후 단백질은 300 mM 염화나트륨을 함유한 완충액으로 용출되었다. 수득된 용출액은 재조합 스트렙토코커스 뮤탄스 슈크로스 가인산분해효소 용액으로 명명되었다.
(2. 6 재조합 바실러스 스테아로써모필러스 글루칸 가인산분해효소의 제조방법)
Takaha et al. (J. Appl. Glycosci., 48(1) (2001) 71)의 방법에 의해 제조된 효소가 재조합 바실러스 스테아로써모필러스 글루칸 가인산분해효소로 표기된다.
(3. 글루칸의 분자량 측정)
본 발명에서 합성된 글루칸의 분자량은 하기 방법에 의해 측정되었다.
본 발명에서 합성된 글루칸은 1N 수산화나트륨 내에 완전히 용해되고 적당한 양의 염산으로 중성화되었다. 이후 약 300 ㎍의 글루칸이 차별적 굴절측정기 및 다각도 광 산포 검출기와 결합된 겔 여과 크로마토그래피를 행하여 평균 분자량을수득하였다.
특히 Shodex SB860M-HQ(Showa Denko K.K. 제조)가 컬럼으로 사용되었다. 검출기로서 다각도 광 산포 검출기(DAWN-DSP, Wyatt Technology 제조) 및 차별적 굴절측정기(Shodex RI-71, Showa Denko K.K. 제조)가 사용되었고, 이러한 순서로 연결되었다. 컬럼은 40℃에 보관되었고, 0.1 M 질산나트륨 용액이 1 mL/분의 유속으로 용출액으로 사용되었다. 수득된 시그날은 데이터 분석 소프트웨어(브랜드명 ASTRA, Wyatt Technology 제조)에 의해 수집되고 분석되어 평균 분자량을 계산하였다.
(비교실시예 0-1 및 0-2 : 반응 온도 37℃와 45℃ 사이의 산출량 비교)
비교실시예 0-1 및 0-2에서 사용된 반응 시작시 반응 용액의 조성이 하기 표 1에 나타나 있다.
슈크로스 G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예 0-1 4 2 20 10 10 37℃
비교실시예 0-2 4 2 20 10 10 45℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 슈크로스, 무기 인산, 류코노스토크 메센테로이드 슈크로스 가인산분해효소(Oriental Yeast Co., Ltd. 제조), 상기 2. 1.에서 제조된 감자 괴경-유도된 글루칸 가인산분해효소 및 말토헵타오스가 100 mM의 구연산 완충액(pH 7.0) 내에 용해되어 4% 슈크로스, 20 mM 무기 인산, 10 U/g 류코노스토크 메센테로이드 슈크로스 가인산분해효소의 슈크로스, 10 U/g 감자 괴경-유도된 글루칸 가인산분해효소의 슈크로스 및 2 mM 말토헵타오스를 함유한 용액을 수득하였다. 이러한 용액은 37℃ 및 45℃에서 18시간 동안 반응하게 하여 아밀로스를 합성하였다. 반응의 부피는 1 ml였다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 1. 6.에 기술된 방식으로 측정되었다. 결과는 도 2에 나타나 있다.
본 명세서에서 류코노스토크 메센테로이드 슈크로스 가인산분해효소(Oriental Yeast Co., Ltd.에서 구입), 감자 괴경-유도된 글루칸 가인산분해효소 및 4% 슈크로스를 이용하여 37℃에서 아밀로스를 생성하는 방법은 통상적인 방법으로 명명된다.
도 2에 기술된 바와 같이 반응이 37℃에서 수행될 때 아밀로스 산출량이 79%인 반면 반응이 45℃에서 수행될 때 아밀로스 산출량은 33.8%로 낮았다.
따라서 통상의 물질 농도는 고온에서의 아밀로스 생성에 산업적으로 불편하다. 사용된 류코노스토크 메센테로이드 슈크로스 가인산분해효소의 최적 온도는 37℃이다. 따라서 이러한 효소는 낮은 수준의 열-저항성을 지닌 것으로 여겨진다. 고온에서의 낮은 아밀로스 산출량은 효소의 낮은 열-저항성 때문인 것으로 고려된다.
(실시예 1-1 내지 1-5 및 비교실시예 1-1 : 다양한 슈크로스 농도 및 고온 반응 온도를 이용한 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 2에 나타난 조성물을 지닌(반응의 시작시) 반응 혼합물을 이용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예1-1 4 2 20 10 10 45℃
실시예1-1 8 4 40 10 10 45℃
실시예1-2 10 5 50 10 10 45℃
실시예1-3 15 7.5 75 10 10 45℃
실시예1-4 20 10 100 10 10 45℃
실시예1-5 25 12.5 125 10 10 45℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 3에 나타나 있다.
슈크로스 농도는 통상의 방법에서 사용된 4%(비교실시예 1-1)에서 적어도 8% 이상(실시예 1-1 내지 1-5)으로 증가되어 45℃에서 반응을 달성할 수 있게 하였다. 따라서 아밀로스 산출량이 증가하였다.
특히, 상기-기술된 조건 하에서 물질들(즉, 슈크로스, 말토헵타오스 및 무기 인산) 간의 비율 및 효소의 양은 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화하여 아밀로스의 산출량이 증가되었다. 도 3에 나타난 바와 같이 산출량은 슈크로스 농도가 8%일 때 45℃에서 76.4%이었다. 이는 슈크로스 농도가 4%이고 반응 온도가 45℃일 때의 적어도 2배이고, 통상의 방법에 의해 수득된 것과 실질적으로 동일한 산출량이 수득되었다. 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 아밀로스 산출량은 실질적으로 100%이었다. 따라서 45℃에서 슈크로스로부터의 아밀로스 합성의 경우 낮은 슈크로스 농도가 낮은 산출량과 부족한 효율성을 유발하나 높은 슈크로스 농도는 45℃에서의 산업적 생성을 가능하게 한다.
(실시예 2-1 내지 2-5 및 비교실시예 2-1 내지 2-7 : 적은 양의 효소로의 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 3에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 이용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예2-1 4 2 20 5 5 37℃
비교실시예2-2 8 4 40 5 5 37℃
비교실시예2-3 10 5 50 5 5 37℃
비교실시예2-4 15 7.5 75 5 5 37℃
비교실시예2-5 20 10 100 5 5 37℃
비교실시예2-6 25 12.5 125 5 5 37℃
비교실시예2-7 4 2 20 5 5 45℃
실시예2-1 8 4 40 5 5 45℃
실시예2-2 10 5 50 5 5 45℃
실시예2-3 15 7.5 75 5 5 45℃
실시예2-4 20 10 100 5 5 45℃
실시예2-5 25 12.5 125 5 5 45℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 실시예 2-1 내지 2-5 및 비교실시예 2-1 내지 2-7에서 효소의 양은 비교실시예 1-1 및 실시예 1-1 내지 1-5의 반이었고 반응은 37℃ 및 45℃에서 수행되었다. 이를 제외하고는 각각의 아밀로스 합성은 비교실시예 1-1 및 실시예 1-1 내지 1-5에서와 동일한 방식으로 수행되었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6.에 따라 측정되었다. 결과는 도 4에 나타나 있다.
슈크로스 농도가 적어도 약 15% 이상일 때 45℃에서의 반응시 아밀로스 산출량은 37℃에서의 반응와 마찬가지였다.
도 4에 나타난 바와 같이 이러한 조건 하에서 아밀로스의 산출량이 통상의 방법에 의해 약 60%가 된 반면 슈크로스 농도가 4%이고 반응 온도가 45℃인 경우 산출량은 22.1%로 낮았다. 그러나 물질들(즉, 슈크로스, 말토헵타오스 및 무기 인산) 간의 비율 및 효소의 양은 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화할 때 45℃에서의 아밀로스 산출량이 증가되었다. 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상이고 반응 온도가 45℃인 반응의 경우 아밀로스 산출량은 37℃에서 수득된 것 보다 더 높았다. 따라서 슈크로스 농도가 적어도 약 15% 이상일 때 반응이 수행되면 반응은 45℃에서 수행될 수 있을 뿐만 아니라 37℃에서의 반응보다 더 높은 생산성이 실현될 수 있다.
(실시예 3-1-1 내지 3-2-5 및 비교실시예 3-1-1 및 3-2-1 : 열-저항성 슈크로스 가인산분해효소가 사용된 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 4에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예3-1-1 4 2 20 10 10 45℃
실시예3-1-1 8 4 40 10 10 45℃
실시예3-1-2 10 5 50 10 10 45℃
실시예3-1-3 15 7.5 75 10 10 45℃
실시예3-1-4 20 10 100 10 10 45℃
실시예3-1-5 25 12.5 125 10 10 45℃
비교실시예3-2-1 4 2 20 10 10 50℃
실시예3-2-1 8 4 40 10 10 50℃
실시예3-2-2 10 5 50 10 10 50℃
실시예3-2-3 15 7.5 75 10 10 50℃
실시예3-2-4 20 10 100 10 10 50℃
실시예3-2-5 25 12.5 125 10 10 50℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 상기 섹션 2. 5에 따라 수득된 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소의 슈크로스 10 U/g(활성 유니트)이 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소 대신 사용되었고, 글루칸 가인산분해효소의 슈크로스 10 U/g(활성 유니트)가 사용되었고, 효소 반응은 45℃ 또는 50℃에서 수행되었다. 이를 제외하고는 각각의 아밀로스 합성은 비교실시예 2-1 및 실시예 2-1- 내지 에서와 동일한 방식으로 2-5 비교실시예 3-1-1 및 3-2-1 및 실시예 3-1-1 내지 3-2-5에서 수행되었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 5에 나타나 있다.
슈크로스 가인산분해효소가 통상의 방법에 사용된 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소에서 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소로 변화되었더라도 아밀로스는 반응 온도가 45℃일 때 생성될 수 있었다.
또한 슈크로스 가인산분해효소가 통상의 방법에 사용된 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소에서 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소로 변화되고 슈크로스 농도가 4%에서 적어도 8% 이상으로 증가되었을 때 50℃에서의 매우-효과적인 반응이 가능하여 아밀로스 산출량이 증가되었다.
도 5에 나타난 바와 같이 반응 온도가 45℃일 때 아밀로스 산출량은 슈크로스 농도가 4%일 때 97.4%이었다. 또한 물질들 간의 비율 및 효소의 양이 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화되더라도 아밀로스 산출량은 높은 수준으로 일정하였다. 따라서 슈크로스 가인산분해효소가 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소일 때 45℃에서의 매우-효과적인 아밀로스 생산이 가능하였다.
또한 도 5에 나타난 바와 같이 반응 온도가 50℃이면 아밀로스 산출량은 슈크로스 농도가 4%일 때 21.8%로 낮았다. 그러나 물질들 간의 비율 및 효소의 양이 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화될 때 아밀로스 산출량은 증가하였다. 슈크로스 농도가 8%일 때 산출량은 55.4%로 슈크로스 농도가 4%일 때의 산출량의 적어도 2배 이상이었다. 따라서 아밀로스 산출량 합성은 슈크로스 농도가 4%이고 반응 온도가 50℃일 때 낮고 비효과적인 반면 50℃에서의 매우-효과적인 아밀로서 생성은 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소를 이용함으로서 가능하였고 슈크로스 농도를 증가시켰다.
(실시예 4-1-1 내지 4-2-5 및 비교실시예 4-1-1 및 4-2-1 : 효소의 양이 적고 열-저항성 슈크로스 가인산분해효소가 사용된 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 5에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예4-1-1 4 2 20 5 5 45℃
실시예4-1-1 8 4 40 5 5 45℃
실시예4-1-2 10 5 50 5 5 45℃
실시예4-1-3 15 7.5 75 5 5 45℃
실시예4-1-4 20 10 100 5 5 45℃
실시예4-1-5 25 12.5 125 5 5 45℃
비교실시예4-2-1 4 2 20 5 5 50℃
실시예4-2-1 8 4 40 5 5 50℃
실시예4-2-2 10 5 50 5 5 50℃
실시예4-2-3 15 7.5 75 5 5 50℃
실시예4-2-4 20 10 100 5 5 50℃
실시예4-2-5 25 12.5 125 5 5 50℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 효소의 양은 실시예 3-1-1 내지 3-2-5 뿐만 아니라 비교실시예 3-1-1 및 3-2-1의 반이었다. 이를 제외하고는 각각의 아밀로스 합성은 실시예 3-1-1 내지 3-2-5 뿐만 아니라 비교실시예 3-1-1 및 3-2-1에서와 동일한 방식으로 수행되었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 6에 나타나 있다.
슈크로스 가인산분해효소가 통상의 방법에 사용된 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소에서 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소로 변화되고, 효소의 양이 통상의 방법의 반일 때 50℃에서의 반응에 의한 아밀로스 산출량은 슈크로스 농도가 15% 이하일 때 45℃에서의 반응에 의한 것과 마찬가지였다.
도 6에 나타난 바와 같이 45℃에서의 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 슈크로스 농도가 4%일 때 약 50%인 반면, 50℃에서의 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 슈크로스 농도가 4%일 때 9.2%로 낮았다. 그러나 물질들 간의 비율 및 효소의 양이 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화될 때 50℃에서의 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 증가되었다. 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 50℃에서의 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 45℃에서의 반응에 의해 수득된 것 보다 더 높았다. 따라서 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소가 사용되고 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 반응이 50℃에서 수행될 수 있을 뿐만 아니라 45℃에서의 반응보다 더 높은 생산성이 실현될 수 있다.
(실시예 5-1 내지 5-5 및 비교실시예 5-1 : 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 극도의 호열성 박테리아-유도된 글루칸 가인산분해효소가 사용된 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 6에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예5-1 4 2 20 10 10 45℃
실시예5-1 8 4 40 10 10 45℃
실시예5-2 10 5 50 10 10 45℃
실시예5-3 15 7.5 75 10 10 45℃
실시예5-4 20 10 100 10 10 45℃
실시예5-5 25 12.5 125 10 10 45℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소가 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소 대신에 사용되었다. 이를 제외하고는 아밀로스 합성은 비교실시예 1-1 및 실시예 1-1 내지 1-5와 동일한 방식으로 수행되었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 7에 나타나 있다.
써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 사용되고, 슈크로스 농도가 통상의 방법의 4%에서 적어도 8% 이상으로 증가하면 반응은 45℃에서 수행될 수 있어서 아밀로스 산출량이 증가되었다.
특히, 상기-기술된 조건 하에서 물질들 간의 비율 및 효소의 양이 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화될 때 아밀로스 산출량은 증가되었다. 도 7에 나타난 바와 같이 슈크로스 농도가 4%이고 반응 온도가 45℃일 때 산출량이 28.0%인 반면, 슈크로스 농도가 8%일 때 산출량은 69.0%이었다. 또한 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 아밀로스 산출량은 실질적으로 100%이었다. 따라서 써머스 아쿠아티커스(극도의 호열성 박테리아)-유도된 글루칸 가인산분해효소가 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소 대신 사용될 때 아밀로스가 45℃에서 생성될 수 있었다.
(실시예 6-1 내지 6-5 및 비교실시예 6-1 내지 6-7 : 적은 양의 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 극도의 호열성 박테리아-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용한 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 7에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예6-1 4 2 20 5 5 37℃
비교실시예6-2 8 4 40 5 5 37℃
비교실시예6-3 10 5 50 5 5 37℃
비교실시예6-4 15 7.5 75 5 5 37℃
비교실시예 6-5 20 10 100 5 5 37℃
비교실시예6-6 25 12.5 125 5 5 37℃
비교실시예6-7 4 2 20 5 5 45℃
실시예6-1 8 4 40 5 5 45℃
실시예6-2 10 5 50 5 5 45℃
실시예6-3 15 7.5 75 5 5 45℃
실시예6-4 20 10 100 5 5 45℃
실시예6-5 25 12.5 125 5 5 45℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 실시예 6-1 내지 6-5 및 비교실시예 6-1 내지 6-7에서 효소의 양은 실시예 5-1 내지 5-5 및 비교실시예 5-1의 반이고 반응은 37℃ 및 45℃에서 수행되었다. 이를 제외하고는 아밀로스 합성은 실시예 5-1 내지 5-5 및 비교실시예 5-1과 동일한 방식으로 수행되었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 8에 나타나 있다.
써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 사용되고, 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상이고 반응 온도가 45℃일 때 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 37℃에서 의 반응에 의해 수행된 것 보다 높았다.
도 8에 나타난 바와 같이 이들 조건 하에서 통상의 방법의 경우 아밀로스 산출량이 34.2%인 반면 슈크로스 농도가 4%이고 반응 온도가 45℃일 때 산출량은 15.6%로 낮았다. 그러나 물질들 간의 비율 및 효소의 양이 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화될 때 반응 온도가 45℃인 경우 아밀로스 산출량이 증가되었다. 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상이고 반응 온도가 45℃일 때 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 37℃에서 수득된 것 보다 더 높았다. 따라서 써머스 아쿠아티커스(극도의 호열성 박테리아)-유도된 글루칸 가인산분해효소가 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소 대신 사용되고, 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 반응이 수행되면 반응이 45℃에서 수행될 수 있을 뿐만 아니라 37℃에서 보다 더 높은 생산성이 달성될 수 있었다.
(실시예 7-1 내지 7-5 및 비교실시예 7-1 : 스트렙토코커스 뮤타스-유도된슈크로스 가인산분해효소 및 극도의 호열성 박테리아-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용한 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 8에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예7-1 4 2 20 10 10 50℃
실시예7-1 8 4 40 10 10 50℃
실시예7-2 10 5 50 10 10 50℃
실시예7-3 15 7.5 75 10 10 50℃
실시예7-4 20 10 100 10 10 50℃
실시예7-5 25 12.5 125 10 10 50℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 상기 섹션 2. 4에 따라 수득된 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소가 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소 대신 사용되었다. 이를 제외하고는 비교실시예 7-1 및 실시예 7-1 내지 7-5에서 아밀로스 합성은 실시예 비교실시예 3-2-1 및 실시예 3-2-1 내지 3-2-5와 동일한 방식으로 수행되었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 9에 나타나 있다.
슈크로스 가인산분해효소가 통상의 방법에서 사용되는 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소에서 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 가인산분해효소로 변화되고, 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소에서 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸으로 변화되고, 슈크로스 농도가 4%에서 적어도 8%이상으로 증가될 때 반응은 50℃에서 수행될 수 있고 아밀로스 산출량이 증가되었다.
특히 상기-기술된 조건 하에서 물질들 간의 비율 및 효소의 양이 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화될 때 아밀로스 산출량이 증가되었다. 도 9에 나타난 바와 같이 슈크로스 농도가 4%이고 반응 온도가 50℃일 때 아밀로스 산출량이 56.2%인 반면, 슈크로스 농도가 8%이고 반응 온도가 50℃일 때 산출량은 78.4%이고, 슈크로스 농도가 15%일 때 산출량은 실질적으로 100%이었다. 따라서 슈크로스 가인산분해효소가 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소로 변화되고 글루칸 가인산분해효소가 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소로 변화될 때 50℃에서의 아밀로스 생성이 가능하였다.
(실시예 8-1-1 내지 8-2-5 및 비교실시예 8-1-1 및 8-2-1 : 적은 양의 스트렙토코커스 뮤타스-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 극도의 호열성 박테리아-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용한 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 9에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예8-1-1 4 2 20 5 5 45℃
실시예8-1-1 8 4 40 5 5 45℃
실시예8-1-2 10 5 50 5 5 45℃
실시예8-1-3 15 7.5 75 5 5 45℃
실시예8-1-4 20 10 100 5 5 45℃
실시예8-1-5 25 12.5 125 5 5 45℃
비교실시예8-2-1 4 2 20 5 5 50℃
실시예8-2-1 8 4 40 5 5 50℃
실시예8-2-2 10 5 50 5 5 50℃
실시예8-2-3 15 7.5 75 5 5 50℃
실시예8-2-4 20 10 100 5 5 50℃
실시예8-2-5 25 12.5 125 5 5 50℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 효소의 양은 비교실시예 7-1 및 실시예 7-1 내지 7-5의 반이고, 반응 온도는 45℃ 및 50℃이었다. 이를 제외하고는 각각의 아밀로스 합성은 비교실시예 7-1 및 실시예 7-1 내지 7-5에서와 동일한 방식으로 수행되었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 10에 나타나 있다.
슈크로스 가인산분해효소가 통상의 방법에 사용된 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소에서 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소로 변화되고, 글루칸 가인산분해효소가 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소에서 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소로 변화되고, 효소의 양이 통상의 방법의 반일 때 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 45℃에서 반응에 의해 수득된 것보다 50℃에서 반응에서 더 높았다.
도 10에 나타난 바와 같이 슈크로스 농도가 4%이고, 반응 온도가 45℃일 때아밀로스 산출량이 48.9%인 반면, 슈크로스 농도가 4%이고, 반응 온도가 50℃일 때 아밀로스 산출량은 21.5%로 낮았다. 그러나 물질들 간의 비율 및 효소의 양이 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화될 때 50℃에서의 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 증가되었다. 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 50℃에서의 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 45℃에서의 반응에 의해 수득된 것 보다 더 높았다. 따라서 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소가 사용되고 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 반응이 50℃에서 수행될 수 있을 뿐만 아니라 45℃에서의 반응에 의해 수득된 것 보다 더 높은 생산성이 실현될 수 있었다.
(실시예 9-1 내지 9-5 및 비교실시예 9-1 : 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용한 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 10에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예9-1 4 2 20 10 10 45℃
실시예9-1 8 4 40 10 10 45℃
실시예9-2 10 5 50 10 10 45℃
실시예9-3 15 7.5 75 10 10 45℃
실시예9-4 20 10 100 10 10 45℃
실시예9-5 25 12.5 125 10 10 45℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소가 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소 대신 사용되었다. 이를 제외하고는 아밀로스 합성은 비교실시예 5-1 및 실시예 5-1 내지 5-5에서와 동일한 방식으로 수행되었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 11에 나타나 있다.
바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소가 사용되고 슈크로스 농도가 통상의 방법의 4%에서 적어도 8% 이상으로 증가될 때 반응은 45℃에서 수행될 수 있었고 아밀로스 산출량은 증가되었다.
특히, 상기-기술된 조건 하에서 물질들 간의 비율 및 효소의 양이 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화될 때 아밀로스 산출량이 증가되었다. 도 11에 나타난 바와 같이 슈크로스 농도가 4%이고 반응 온도가 45℃일 때 아밀로스 산출량이 40.7%인 반면, 슈크로스 농도가 8%이고 반응 온도가 45℃일 때 산출량은 70.6%이었다. 또한 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 아밀로스 산출량은 약 90%이었다. 따라서 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소가 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소 대신에 사용될 때 아밀로스 합성이 45℃에서 수행될 수 있음이 확인되었다.
(실시예 10-1 내지 10-5 및 비교실시예 10-1 내지 10-7 : 적은 양의 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용한 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 11에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예10-1 4 2 20 5 5 37℃
비교실시예10-2 8 4 40 5 5 37℃
비교실시예10-3 10 5 50 5 5 37℃
비교실시예10-4 15 7.5 75 5 5 37℃
비교실시예 10-5 20 10 100 5 5 37℃
비교실시예10-6 25 12.5 125 5 5 37℃
비교실시예10-7 4 2 20 5 5 45℃
실시예10-1 8 4 40 5 5 45℃
실시예10-2 10 5 50 5 5 45℃
실시예10-3 15 7.5 75 5 5 45℃
실시예10-4 20 10 100 5 5 45℃
실시예10-5 25 12.5 125 5 5 45℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 실시예 10-1 내지 10-5 및 비교실시예 10-1 내지 10-7에서 반응은 효소의 양이 비교실시예 9-1 및 실시예 9-1 내지 9-5의 반이고, 반응 온도는 37℃ 및 45℃일 때 수행되었다. 이를 제외하고는 아밀로스 합성은 비교실시예 9-1 및 실시예 9-1 내지 9-5에서와 동일한 방식으로 수행되었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 12에 나타나 있다.
바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소가 사용되고 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 45℃에서의 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 37℃에서의 반응에 의해 수득된 것과 마찬가지이었다.
도 12에 나타난 바와 같이 이러한 조건 하에서 통상의 방법의 경우 아밀로스 산출량이 60.2%인 반면, 슈크로스 농도가 4%이고, 반응 온도가 45℃일 때 아밀로스 산출량은 22.1%로 낮았다. 그러나 물질들 간의 비율 및 효소의 양이 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화될 때 45℃에서의 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 증가되었다. 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 45℃에서의 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 37℃에서의 반응에 의해 수득된 것 보다 더 높았다. 따라서 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소가 감자-글루칸 가인산분해효소 대신 사용되고 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 반응이 45℃에서 수행될 수 있을 뿐만 아니라 37℃에서의 반응에 의해 수득된 것 보다 더 높은 생산성이 실현될 수 있었다.
(실시예 11-1 내지 11-5 및 비교실시예 11-1 : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용한 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 12에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예11-1 4 2 20 10 10 50℃
실시예11-1 8 4 40 10 10 50℃
실시예11-2 10 5 50 10 10 50℃
실시예11-3 15 7.5 75 10 10 50℃
실시예11-4 20 10 100 10 10 50℃
실시예11-5 25 12.5 125 10 10 50℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 상기 섹션 2. 5에 따라 수득된 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소가 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소대신 사용되었고, 효소 반응은 50℃에서 수행되었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 13에 나타나 있다.
슈크로스 가인산분해효소가 통상의 방법에서 사용되는 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소에서 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소로 변화되고 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소가 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소로 변화되고, 슈크로스 농도가 4%에서 적어도 8% 이상으로 증가될 때 반응은 50℃에서 수행될 수 있었고 아밀로스 산출량은 증가되었다.
특히, 상기-기술된 조건 하에서 물질들 간의 비율 및 효소의 양이 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화될 때 아밀로스 산출량이 증가되었다. 도 13에 나타난 바와 같이 슈크로스 농도가 4%이고 반응 온도가 50℃일 때 아밀로스 산출량이 39.1%인 반면, 슈크로스 농도가 8%이고 반응 온도가 50℃일 때 산출량은 70.4%이고, 슈크로스 농도가 15%일 때 아밀로스 산출량은 적어도 90% 이상이었다. 따라서 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소 슈크로스 가인산분해효소로 사용되고 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소가 글루칸 가인산분해효소로 사용될 때 50℃에서의 아밀로스 생성이 가능하였다.
(실시예 12-1-1 내지 12-2-5 및 비교실시예 12-1-1 및 12-2-1 : 적은 양의 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소를 이용한 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 13에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예12-1-1 4 2 20 5 5 45℃
실시예12-1-1 8 4 40 5 5 45℃
실시예12-1-2 10 5 50 5 5 45℃
실시예12-1-3 15 7.5 75 5 5 45℃
실시예12-1-4 20 10 100 5 5 45℃
실시예12-1-5 25 12.5 125 5 5 45℃
비교실시예12-2-1 4 2 20 5 5 50℃
실시예12-2-1 8 4 40 5 5 50℃
실시예12-2-2 10 5 50 5 5 50℃
실시예12-2-3 15 7.5 75 5 5 50℃
실시예12-2-4 20 10 100 5 5 50℃
실시예12-2-5 25 12.5 125 5 5 50℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 효소의 양은 비교실시예 11-1 및 실시예 11-1 내지 11-5의 반이고, 반응 온도는 45℃ 및 50℃이었다. 이를 제외하고는 아밀로스 합성은 비교실시예 11-1 및 실시예 11-1 내지 11-5에서와 동일한 방식으로 수행되었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 14에 나타나 있다.
슈크로스 가인산분해효소가 통상의 방법에 사용된 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소에서 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소로 변화되고, 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소가 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소로 변화되고, 효소의 양이 통상의 방법의 반일 때 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 45℃에서 반응에 의해 수득된 것보다 50℃에서 반응에서 더 높았다.
도 14에 나타난 바와 같이 슈크로스 농도가 4%이고, 반응 온도가 45℃일 때아밀로스 산출량이 32.9%인 반면, 슈크로스 농도가 4%이고, 반응 온도가 50℃일 때 아밀로스 산출량은 19.6%로 낮았다. 그러나 물질들 간의 비율 및 효소의 양이 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화될 때 50℃에서의 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 증가되었다. 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 50℃에서의 반응에 의해 수득된 아밀로스 산출량은 45℃에서의 반응에 의해 수득된 것 보다 더 높았다. 따라서 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 바실러스 스테아로써모필러스-유도된 글루칸 가인산분해효소가 사용되고 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 반응이 50℃에서 수행될 수 있을 뿐만 아니라 45℃에서의 반응에 의해 수득된 것 보다 더 높은 생산성이 실현될 수 있었다.
(실시예 13 : 높은 온도 조건 하에서의 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 14에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예13-1 4 2 20 50 50 65℃
실시예13-1 50 25 250 50 50 65℃
비교실시예13-2 4 2 20 50 50 65℃
실시예13-2 50 25 250 50 50 65℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소(비교실시예 13-1 및 실시예 13-1)
써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소(비교실시예 13-2 및 실시예 13-2)
특히, 효소의 양은 비교실시예 3-1-1의 5배이고 반응 온도는 65℃이었다. 이를 제외하고는 비교실시예 13-1에서 아밀로스 합성은 비교실시예 3-1-1에서와 동일한 방식으로 수행되었다. 실시예 13-1에서 아밀로스 합성은 실시예 3-1-1의 물질들 간의 비율 및 효소의 양이 변하지 않고 슈크로스 농도가 50%로 증가되어 수행되었다. 또한 비교실시예 13-2 및 실시예 13-2에서 아밀로스 합성은 비교실시예 13-1 및 실시예 13-1의 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소 대신 섹션 2. 4에 따라 제조된 써머스 아쿠아티커스-유도된 글루칸 가인산분해효소가 사용되어 수행되었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 15에 나타나 있다.
사용된 글루칸 가인산분해효소에 관계없이 어떠한 아밀로스도 65℃에서 합성될 수 없었다. 슈크로스 농도가 증가되면 아밀로스는 65℃에서 생성될 수 있었다.
(실시에 14 : 말토테트라오스가 프라이머로 사용될 때 아밀로스 생성)
상기-기술된 실시예에서 말토헵타오스가 아밀로스 생성시 프라이머로 사용되었다. 그러나 고-순도 말토-올리고사카라이드가 고비용이고 산업적으로 사용가능한 정도로 유통되지 않는다. 말토테트라오스-함유 시럽은 저가의 말토-올리고사카라이드이다. 그러나 이러한 시럽은 프라이머로 기능하지 않는 것으로 여겨지는 글루코스, 말토스 말토트리오스를 포함한다. 또한 말토테트라오스는 말토헵타오스 보다 더 낮은 글루칸 가인산분해효소에 대한 친화력을 지닌다. 이러한 시럽이 글루칸 합성 반응을 수행하는데 사용될 수 있는지 여부는 불분명하다. 따라서 본 발명자는 말토헵타오스 대신 말토테트라오스를 함유한 시럽이 아밀로스를 합성하는데 사용될 수 있는지 여부를 연구하였다.
특히 적어도 70% 이상의 말토테트라오스를 함유한 Tetrup H(Hayashibara Shoji, Inc.)가 사용되었다. 이를 제외하고는 아밀로스는 실시예 7-2에서와 동일한 방식으로 합성되었다. 그 결과로서 고분자량 아밀로스가 Tetrup H를 이용하여도 생성될 수 있었다.
(실시예 15 : 막 여과를 이용한 아밀로스의 정제)
2% 슈크로스, 10 mM 무긴 인산, 50 U/g 슈크로스 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소(Oriental Yeast Co., Ltd. 제조), 섹션 2. 2에 따라 제조된 50 U/g 슈크로스 재조합 감자 괴경-유도된 글루칸 가인산분해효소 및 프라이머로서 말토헵타오스가 37℃에서 18시간 동안 아밀로스를 합성하는데 사용되었다. 이러한 경우 반응 부피는 2,000 ml이었다.
반응 후 2,000 ml의 아밀로스 용액이 30,000의 분자량 컷오프를 지닌 한외여과막(UF 막 유니트 : Daicel Chemical Industries Ltd. 제조)을 이용하여 1,200 ml로 농축되었다. 이후 정용여과(diafiltration)가 10 L의 증류수에 대해 수행되었고 증류수가 첨가되어 2,000 ml를 수득하였다. 프럭토스 함량 및 아밀로스의 평균-분자량이 막 여과 전과 후에 측정되었다. 결과는 표 15에 나타나 있다.
막 여과에 의한 프럭토스의 제거
번호 프럭토스 (mM) 평균-분자량 (KDa)
막 여과 전 57.5 715
막 여과 후 <0.1 712
표 15에 나타난 바와 같이 한외여과막은 아밀로스를 정제하는데 사용 될 수 있어서 반응 용액 내에 존재하는 프럭토스가 제고될 수 있음이 확인되었다. 아밀로스의 평균-분자량이 막 여과에 의해 크게 변하지 않았음이 확인되었다.
따라서 한외여과막을 이용하여 아밀로스를 정제함으로서 아밀로스는 아밀로스 정제에 통상적으로 사용되는 부탄올, 메탄올, 에탄올, 에테르 등과 같은 많은 유기 용매없이 정제될 수 있었다.
(실시예 16-1 내지 16-7 및 비교실시예 16-1 : 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소가 사용되고 무기 인산 농도에 대한 슈크로스 농도의 비율이 변화된 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 16에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예16-1 125 0.35 7.2 20 20 37℃
실시예16-1 125 0.35 10 20 20 37℃
실시예16-2 125 0.35 20 20 20 37℃
실시예16-3 125 0.35 30 20 20 37℃
실시예16-4 125 0.35 50 20 20 37℃
실시예16-5 125 0.35 75 20 20 37℃
실시예16-6 125 0.35 100 20 20 37℃
실시예16-7 125 0.35 125 20 20 37℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 류코노스트코 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 슈크로스, 무기 인산, 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소, 상기 섹션 2. 1에 따라 수득된 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소 및 말토헵타오스가 100 mM 구연산 완충액(pH 7.0) 내에 용해되어 125 mM 슈크로, 20 U/g 슈크로스 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소, 20 U/g 슈크로스 감자 괴경-유도된 글라칸 가인산분해효소, 0.35 mM 말토헵타오스 및 7.2 mM 무기 인산(비교실시예 16-1) 또는 10∼125 mM 무기 인산(실시예 16-1 내지 16-7)을 함유한 용액을 수득하였다. 이러한 용액은 37℃에서 4시간 동안 반응하여 아밀로스를 합성하게 되었다. 반응 부피는 1 ml이었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 16에 나타나 있다.
도 16에 나타난 바와 같이 7.2 mM 무기 인산이 첨가되고 125 mM 슈크로스와 반응하게 될 때 아밀로스 산출량은 20.1%로 낮았으나, 적어도 10 mM 이상의 무기 인산이 첨가되고 125 mM 슈크로스와 반응하게 될 때 산출량은 증가하였다. 또한 20∼75 mM 무기 인산이 첨가되고 125 mM 슈크로스와 반응하게 될 때 산출량은 적어도 40% 이상이었다.
(실시예 17-1 내지 1707 및 비교실시예 17-1 : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소 및 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소가 사용되고 무기 인산 농도에 대한 슈크로스 농도의 비율이 변화될 때 아밀로스 합성)
아밀로스 합성은 하기 표 17에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예17-1 125 0.35 7.2 20 20 45℃
실시예17-1 125 0.35 10 20 20 45℃
실시예17-2 125 0.35 20 20 20 45℃
실시예17-3 125 0.35 30 20 20 45℃
실시예17-4 125 0.35 50 20 20 45℃
실시예17-5 125 0.35 75 20 20 45℃
실시예17-6 125 0.35 100 20 20 45℃
실시예17-7 125 0.35 125 20 20 45℃
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 실시예 17-1 내지 17-7 및 비교실시예 17-1에서 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소가 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소 대신 사용되었고 반응 온도는 45℃이었다. 이를 제외하고는 아밀로스는 실시예 16-1 내지 16-7 및 비교실시예 16-1에서와 동일한 방식으로 합성되었다.
반응 후 합성된 아밀로스의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다.결과는 도 17에 나타나 있다.
도 17에 나타난 바와 같이 7.2 mM 무기 인산이 첨가되고 125 mM 슈크로스와 반응하게 될 때 아밀로스 산출량은 26.7%로 낮았으나, 적어도 10 mM 이상의 무기 인산이 첨가되고 125 mM 슈크로스와 반응하게 될 때 산출량은 증가하였다. 또한 20∼75 mM 무기 인산이 첨가되고 125 mM 슈크로스와 반응하게 될 때 산출량은 적어도 60% 이상이었다.
따라서 통상의 방법에 사용된 슈크로스-인산 비율의 최대 수치는 높은 수준의 생산성을 이끌지 않고 산업적 생성에 불리하고 미리결정된 범위 내로 슈크로스-인산 비율의 최대 수치를 셋팅함으로서 2배 수준의 생산성이 달성될 수 있다.
(실시예 18 : 슈크로스 존재시 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소의 열-저항성)
슈크로스가 용해 후 용액에 대해 4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 25% 또는 30%의 최종 슈크로스 농도를 지닌 용액을 수득하기 위해 상기 섹션 2. 5에 따라 슈크로스 가인산분해효소를 생성하는 E. coli를 파괴함으로서 제조된 액체에 첨가되어 용해되었다. 슈크로스가 없는 슈크로스 가인산분해효소 효소 액체가 대조군으로 사용되었다(0% 슈크로스). 이들 용액은 워터 배쓰에서 55℃로 가열되었다. 용액은가열 시작시(0분) 및 가열 시작 후 30분, 60분 및 90분에 표본 추출되어 여기 기술된 방법에 따라 슈크로스 가인산분해효소의 활성을 측정하였다.
측정된 활성에 기초하여 잔여 활성이 계산되었다.
잔여 활성이 하기와 같이 계산되었다 :
(잔여 활성 (%)) = {(각 표본의 슈크로스 가인산분해효소 활성)/(가열 후 0분에서의 슈크로스 가인산분해효소 활성)} ×100
잔여 활성 결과는 도 18에 나타나 있다. 그 결과로서 하기가 발견되었다. 슈크로스가 존재하지 않으면(0%) 활성이 55℃에서의 30분 가열 후 약 10%로 감소되었다.
적어도 4% 이상의 슈크로스가 존재하면 잔여 활성은 30분 가열 후 적어도 50% 이상이었다. 특히, 적어도 8% 이상의 슈크로스가 존재하면 잔여 활성은 30분 가열 후 적어도 80%이었다.
(실시예 19 : 슈크로스 존재시 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소의 열-저항성)
슈크로스가 용해 후 용액에 대해 12%, 16%, 20%, 25% 또는 30%의 최종 슈크로스 농도를 지닌 용액을 수득하기 위해 류코노스토크 메센테로이드-유도된 슈크로스 가인산분해효소(Oriental Yeast Co., Ltd.에서 구입)를 함유한 효소 액체에 첨가되어 용해되었다. 슈크로스가 없는 슈크로스 가인산분해효소 효소 액체가 대조군으로 사용되었다(0% 슈크로스). 이들 용액은 워터 배쓰에서 50℃로 가열되었다. 용액은 가열 시작시(0분) 및 가열 시작 후 30분, 60분 및 90분에 표본 추출되어 여기 기술된 방법에 따라 슈크로스 가인산분해효소의 활성을 측정하였다.
측정된 활성에 기초하여 잔여 활성이 상기-기술된 식에 의해 계산되었다.
잔여 활성 결과는 도 19에 나타나 있다. 그 결과로서 하기가 발견되었다. 슈크로스가 존재하지 않으면(0%) 활성이 50℃에서의 30분 가열 후 약 10%로 감소되었다.
적어도 12% 이상의 슈크로스가 존재하면 잔여 활성은 30분 가열 후 적어도 50% 이상이었다. 특히, 적어도 20% 이상의 슈크로스가 존재하면 잔여 활성은 30분 가열 후 적어도 80%이었다.
(비교실시예 20 : 슈크로스 가인산분해효소의 안정성 상의 프럭토스 효과)
슈크로스 이외에 프럭토스, 무기 인산 및 글루코스-1-인산이 슈크로스 가인산분해효소에 대한 물질이다. 슈크로스 가인산분해효소의 안정성 상의 프럭토스 효과는 하기 방식으로 연구되었다.
프럭토스가 용해 후 용액에 대해 5% 또는 10%의 최종 농도를 지닌 용액을 수득하기 위해 상기 섹션 2. 5에 따라 제조된 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소를 함유한 효소 액체에 첨가되어 용해되었다. 프럭토스가 없는 슈크로스 가인산분해효소 효소 액체가 대조군으로 사용되었다(0% 슈크로스). 또한 대조군으로서 슈크로스가 동일한 농도로 첨가된 경우도 연구되었다. 이들 용액은 워터 배쓰에서 55℃로 가열되었다. 용액은 가열 시작시(0분) 및 가열 시작 후 30분, 60분 및 90분에 표본 추출되어 여기 기술된 방법에 따라 슈크로스 가인산분해효소의 활성을 측정하였다.
측정된 활성에 기초하여 잔여 활성이 계산되었다.
잔여 활성 결과는 도 20에 나타나 있다. 그 결과로서 프럭토스는 슈크로스에 대해 나타난 바와 같이 슈크로스 가인산분해효소를 안정화시키는 효과를 지니는 것으로 인식되지 않았다.
(비교실시예 21 : 슈크로스 가인산분해효소 안정성 상의 무기 인산 효과)
슈크로스 가인산분해효소의 안정성 상의 무기 인산 효과는 하기 방식으로 연구되었다.
인산나트륨이 용해 후 용액에 대해 40 mM, 100 mM 및 400 mM의 최종 농도를 지닌 용액을 수득하기 위해 상기 섹션 2. 5에 따라 제조된 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소를 함유한 효소 액체에 첨가되어 용해되었다. 첨가된 인산나트륨이 없는 슈크로스 가인산분해효소 효소 액체가 대조군으로 사용되었다(비첨가). 또한 대조군으로서 슈크로스가 10%의 농도로 첨가된 경우도 연구되었다. 이들 용액은 워터 배쓰에서 55℃로 가열되었다. 용액은 가열 시작시(0분) 및 가열 시작 후 30분, 60분 및 90분에 표본 추출되어 여기 기술된 방법에 따라 슈크로스 가인산분해효소의 활성을 측정하였다.
측정된 활성에 기초하여 잔여 활성이 계산되었다.
잔여 활성 결과는 도 21에 나타나 있다. 그 결과로서 무기 인산은 슈크로스에 대해 나타난 바와 같이 슈크로스 가인산분해효소를 안정화시키는 효과를 지니는 것으로 인식되지 않았다.
(실시예 22-1 내지 22-5 및 비교실시예 22-1 : 프라이머로서 풀룰란을 사용한 글루칸 합성)
글루칸 합성은 하기 표 18에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) P-5(%) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예22-1 4 0.2 20 20 20 50℃
실시예22-1 8 0.4 40 20 20 50℃
실시예22-2 10 0.5 50 20 20 50℃
실시예22-3 15 0.75 75 20 20 50℃
실시예22-4 20 1.0 100 20 20 50℃
실시예22-5 25 1.25 125 20 20 50℃
P-5 : 풀룰란(평균 분자량은 약 5,000임) ; %는 중량/부피에 의해 계산됨
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 0.2∼1.25%의 풀룰란 P-5(평균 분자량이 약 5,000임 ; Shoko Co., Ltd.로부터 구입)가 말토헵타오스 대신 사용되었고 슈크로스 가인산분해효소는 20U/g 슈크로스의 활성으로 사용되었고 글루칸 가인산분해효소는 20 U/g 슈크로스의 활성으로 사용되었다. 이를 제외하고는 비교실시예 22-1 및 실시예 22-1 내지 22-5에서 글루칸 합성은 비교실시예 3-2-1 및 실시예 3-2-1 내지 3-2-5에서와 동일한 방식으로 합성되었다.
반응 후 합성된 글루칸의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 22에 나타나 있다.
풀룰란이 말토헵타오스 대신 사용될 때 슈크로스 농도를 4%에서 8%로 증가시킴으로서 매우 효과적인 반응이 50℃에서 수행될 수 있었고, 글루칸 산출량이 증가되었다.
도 22에 나타난 바와 같이 반응 온도가 50℃일 때 슈크로스 농도가 4%인 경우 글루칸 산출량이 9.8%로 낮았다. 그러나 물질들 간의 비율 및 효소의 양이 변하지 않고, 슈크로스의 농도가 8%와 25% 사이에서 변화될 때 글루칸 산출량은 증가되었다. 슈크로스 농도가 적어도 8%일 때 산출량은 슈크로스 농도가 4%일 때의 산출량의 적어도 3배 이상인 32.0%이었다. 슈크로스 농도가 적어도 15% 이상일 때 글루칸 산출량은 약 80%이었다. 따라서 풀룰란이 말토-올리고사카라이드 대신 사용될 때에도 말토-올리고사카라이드가 사용될 때와 동일한 효과가 수득되었다.
(실시예 23-1 내지 23-7 및 비교실시예 23-1 : 프라이머로서 풀룰란을 이용한 글루칸 합성)
글루칸 합성은 하기 표 19에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) P-5(%) Pi(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예23-1 125 0.2 7.2 20 20 45℃
실시예23-1 125 0.2 10 20 20 45℃
실시예23-2 125 0.2 20 20 20 45℃
실시예23-3 125 0.2 30 20 20 45℃
실시예23-4 125 0.2 50 20 20 45℃
실시예23-5 125 0.2 75 20 20 45℃
실시예23-6 125 0.2 100 20 20 45℃
실시예23-7 125 0.2 125 20 20 45℃
P-5 : 풀룰란(평균 분자량은 약 5,000임) ; %는 중량/부피에 의해 계산됨
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 0.2%의 풀룰란 P-5(평균 분자량이 약 5,000임 ; Shoko Co., Ltd.로부터 구입)가 말토헵타오스 대신 사용되었다. 이를 제외하고는 비교실시예 23-1 및 실시예 23-1 내지 23-7에서 글루칸 합성은 비교실시예 17-1 및 실시예 17-1 내지 17-7에서와 동일한 방식으로 합성되었다.
반응 후 합성된 글루칸의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 23에 나타나 있다.
도 23에 나타난 바와 같이 7.2 mM 무기 인산이 첨가되고 125 mM 슈크로스와 반응하게 될 때 글루칸 산출량은 5.3%로 낮았다. 그러나 10 mM 무기 인산이 첨가되고 125 mM 슈크로스와 반응하게 될 때 산출량은 상기의 적어도 2배 이상인 11.7%이었다. 또한 20∼75 mM 무기 인산이 첨가되고 125 mM 슈크로스와 반응하게 될 때 산출량은 적어도 20∼25% 이상이었다.
따라서 풀룰란이 말토-올리고사카라이드 대신 사용될 때에도 말토-올리고사카라이드가 사용될 때와 동일한 효과가 수득되었다.
(실시예 24-1 내지 24-7 및 비교실시예 24-1 : G-1-P를 이용한 글루칸 합성)
글루칸 합성은 하기 표 20에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(mM) G-1-P(mM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) 반응 온도
비교실시예24-1 125 0.35 7.2 20 20 45℃
실시예24-1 125 0.35 10 20 20 45℃
실시예24-2 125 0.35 20 20 20 45℃
실시예24-3 125 0.35 30 20 20 45℃
실시예24-4 125 0.35 50 20 20 45℃
실시예24-5 125 0.35 75 20 20 45℃
실시예24-6 125 0.35 100 20 20 45℃
실시예24-7 125 0.35 125 20 20 45℃
G7 : 말토헵타오스
G-1-P : 글루코스-1-인산 나트륨
SP : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소
특히, 글루코스-1-인산이 무기 인산 대신 사용되었고 아세트산 완충액이 반응 액체를 pH 7.0으로 적정하는데 사용되었다. 이를 제외하고는 비교실시예 24-1 및 실시예 24-1 내지 24-7에서 글루칸 합성은 비교실시예 17-1 및 실시예 17-1 내지 17-7에서와 동일한 방식으로 합성되었다.
반응 후 합성된 글루칸의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 결과는 도 24에 나타나 있다.
도 24에 나타난 바와 같이 7.2 mM 글루코스-1-인산이 첨가되고 125 mM 슈크로스와 반응하게 될 때 글루칸 산출량은 16.4%로 낮았다. 그러나 10 mM 글루코스-1-인산이 첨가되고 125 mM 슈크로스와 반응하게 될 때 산출량은 상기의 적어도 2배 이상인 35.3%이었다. 또한 20∼75 mM 글루코스-1-인산이 첨가되고 125 mM 슈크로스와 반응하게 될 때 산출량은 적어도 40∼60% 이상이었다.
따라서 글루칸이 무기 이산 대신 글루코스-1-인산을 이용하여 합성될 때도 생산성이 통상의 방법의 슈크로스-인산의 최대 수치의 경우에 낮았다. 그러나 적어도 2배 이상의 생산성이 미리결정된 범위 내에 슈크로스-인산의 최대 수치를 셋팅함으로서 수득되었다.
(실시예 25-1 내지 25-5 : 브랜칭 효소를 함유한 SP-GP 반응 시스템을 이용한 글루칸 합성)
글루칸 합성은 하기 표 21에 나타난 조성물(반응 시작시)을 지닌 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다.
번호 슈크로스(%) G7(μM) G-1-P(μM) SP(U/g 슈크로스) GP(U/g 슈크로스) BE(U/g 슈크로스)
실시예24-1 8 40 40 20 20 2500
실시예24-2 8 40 40 20 20 5000
실시예24-3 8 40 40 20 20 10000
실시예24-4 8 40 40 20 20 5000
실시예24-5 8 40 40 20 20 10000
G7 : 말토헵타오스
Pi : 인산이수소칼륨-인산수소이나트륨 완충액
SP : 스트렙토코커스 뮤탄스-유도된 슈크로스 가인산분해효소
GP : 감자-유도된 글루칸 가인산분해효소
BE : 아퀴펙스 에올리커스-유도된 브랜칭 효소
이러한 용액은 45℃에서 18시간 동안 반응되어 글루칸을 합성하였다. 반응 부피는 1 ml이었다.
반응 후 합성된 글루칸의 산출량은 상기 섹션 1. 6에 따라 측정되었다. 또한 합성된 글루칸의 평균 유니트 체인 길이는 Takata et al.(Carbohydr. Res., Vol. 295, pp. 91∼101(1996))에 나타난 방법에 의해 측정되었다. 결과는 하기 표 22에 나타나 있다.
번호 산출량(%) 평균 체인 길이
실시예 24-1 69.7 N/A
실시예 24-2 79.7 18
실시예 24-3 64.8 9
실시예 24-4 85.3 20
실시예 24-5 87.9 13
N/A : 분석되지 않음
매우-분지된 글루칸이 이들 조건 하에서 높은 산출량으로 합성될 수 있었다.
본 발명에 따라 글루칸이 생성될 수 있다. 반응의 시작부터 반으의 종료까지의 시간 동안 무기 인산과 글루코스-1-인산의총 몰 농도에 대한 슈크로스 몰 농도의 비율의 최대 수치를 특정한 범위 내로 셋팅함으로서 통상의 방법 보다 더 높은 수준의 생산성으로의 글루칸 생성이 수득될 수 있다. 본 발명자들은 슈크로스 가인산분해효소의 열 안정성을 증진시키는 조건 하에서 반응을 수행함으로서 또는 더 높은 수준의 열-저항성을 지닌 슈크로스 가인산분해효소를 개발하고 사용함으로서 높은 온도에서 글루칸(바람직하게는 아밀로스)을 생성할 수 있었다.
이러한 글루칸은 전분 가공 산업, 식이 조성물, 식품 첨가물의 조성물, 점착성 조성물, 함유 화합물 및 흡수 화합물, 약품 및 화장품 조성물, 필름-타입 생성물 조성물 및 생분해가능 플라스틱에 사용되는 전분의 대체물의 비가공 물질로서 유용하다.

Claims (54)

  1. 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 반응 용액을 반응하게 하여 글루칸을 생성하는 단계로 구성되고, 반응의 시작부터 반응의 종료까지 반응 용액 내의 슈크로스-인산 비율의 최대 수치가 약 17 이하임을 특징으로 하는 글루칸을 생성하는 방법
  2. 제 1항에 있어서, 상기 최대 수치는 약 0.5 이상 15 이하임을 특징으로 하는 방법
  3. 제 2항에 있어서, 상기 최대 수치는 약 1 이상 10 이하임을 특징으로 하는 방법
  4. 제 3항에 있어서, 상기 최대 수치는 약 2 이상 7 이하임을 특징으로 하는 방법
  5. 제 1항에 있어서, 상기 글루칸은 아밀로스임을 특징으로 하는 방법
  6. 제 1항에 있어서, 상기 슈크로스 가인산분해효소는 스트렙토코커스속에 속하는 박테리아로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  7. 제 6항에 있어서, 상기 슈크로스 가인산분해효소는 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 써모필러스, 스트렙토코커스 뉴모니에 및 스트렙토코커스 미티스로 구성된 군으로부터 선택된 스트렙토코커스속에 속하는 박테리아로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  8. 제 1항에 있어서, 상기 글루칸 가인산분해효소는 식물로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  9. 제 8항에 있어서, 상기 글루칸 가인산분해효소는 조류로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  10. 제 8항에 있어서, 상기 글루칸 가인산분해효소는 감자로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  11. 제 1항에 있어서, 상기 글루칸 가인산분해효소는 써머스 아쿠아티커스로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  12. 제 1항에 있어서, 상기 글루칸 가인산분해효소는 바실러스 스테아로써모필러스로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  13. 제 1항에 있어서, 상기 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 모두 또는 적어도 하나는 재조합 미생물에 의해 생성됨을 특징으로 하는 방법
  14. 제 1항에 있어서, 상기 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 모두 또는 적어도 하나는 담체 상에 고정됨을 특징으로 하는 방법
  15. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머는 말토-올리고사카라이드, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 덱스트린, 풀룰란, 커플링 당, 전분 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
  16. 제 15항에 있어서, 상기 말토-올리고사카라이드는 말토-올리고사카라이드 혼합물임을 특징으로 하는 방법
  17. 제 16항에 있어서, 상기 말토-올리고사카라이드 혼합물은 말토테트라오스 보다 크거나 동일한 정도의 중합반응을 지닌 말토-올리고사카라이드 이외에 적어도 하나 이상의 말토트리오스, 말토스 및 글루코스를 포함함을 특징으로 하는 방법
  18. 제 15항에 있어서, 상기 전분은 가용성 전분, 왁스성 전분, 고-아밀로스 전분, 디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분, 가인산분해효소에 의해 분해된 전분, 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분, 가공된 전분 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
  19. 제 1항에 있어서, 유기 용매를 사용하지 않고 생성된 글루칸을 정제하는 단계로 더욱 구성됨을 특징으로 하는 방법
  20. 제 1항에 있어서, 반응 후 반응 용액을 냉각시켜 글루칸을 침전시키고 고형-액체 분리 방법에 의해 침전된 글루칸을 정제하는 단계로 더욱 구성됨을 특징으로 하는 방법
  21. 제 1항에 있어서,
    글루칸 생성 반응 동안 또는 그 후 반응 용액을 냉각시켜 글루칸을 겔화시키고 ;
    겔화된 글루칸을 회수하고 ;
    물로의 세척, 동결-해동, 여과, 압착, 흡입 및 원심분리로 구성된 군으로부터 선택된 실시에 의해 겔화된 글루칸으로부터 프럭토스를 제거하는 단계로 구성된 방법
  22. 제 1항에 있어서, 글루칸 생성 반응 후 물에 용해된 글루칸을 침전없이 한외여과막 또는 크로마토그래피를 이용하여 막 분획화시켜 프럭토스를 제거하는 단계로 더욱 구성됨을 특징으로 하는 방법
  23. 제 1항에 있어서, 상기 반응 용액은 디브랜칭 효소, 브랜칭 효소, 4-α-글루카노트랜스러파제 및 글리코겐 디브랜칭 효소로 구성된 군으로부터 선택된 효소를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
  24. 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 반응 용액을 반응하게 하여 글루칸을 생성하는 단계로 구성되고, 반응은 약 40∼70℃의 온도에서 수행됨을 특징으로 하는 글루칸을 생성하는 방법
  25. 제 24항에 있어서, 상기 반응 온도는 약 45∼65℃임을 특징으로 하는 방법
  26. 제 24항에 있어서, 상기 반응 용액의 슈크로스 농도는 반응 시작시 약5∼100%임을 특징으로 하는 방법
  27. 제 26항에 있어서, 상기 반응 용액의 슈크로스 농도는 반응 시작시 약 8∼80%임을 특징으로 하는 방법
  28. 제 27항에 있어서, 상기 반응 용액의 슈크로스 농도는 반응 시작시 약 15∼50%임을 특징으로 하는 방법
  29. 제 24항에 있어서, 상기 글루칸은 아밀로스임을 특징으로 하는 방법
  30. 제 24항에 있어서, 상기 슈크로스 가인산분해효소는 스트렙토코커스속에 속하는 박테리아로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  31. 제 30항에 있어서, 상기 슈크로스 가인산분해효소는 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 써모필러스, 스트렙토코커스 뉴모니에 및 스트렙토코커스 미티스로구성된 군으로부터 선택된 스트렙토코커스속에 속하는 박테리아로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  32. 제 24항에 있어서, 상기 글루칸 가인산분해효소는 식물로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  33. 제 32항에 있어서, 상기 글루칸 가인산분해효소는 조류로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  34. 제 32항에 있어서, 상기 글루칸 가인산분해효소는 감자로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  35. 제 24항에 있어서, 상기 글루칸 가인산분해효소는 써머스 아쿠아티커스로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  36. 제 24항에 있어서, 상기 글루칸 가인산분해효소는 바실러스 스테아로써모필러스로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법
  37. 제 24항에 있어서, 상기 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 모두 또는 적어도 하나는 재조합 미생물에 의해 생성됨을 특징으로 하는 방법
  38. 제 24항에 있어서, 상기 슈크로스 가인산분해효소와 글루칸 가인산분해효소 모두 또는 적어도 하나는 담체 상에 고정됨을 특징으로 하는 방법
  39. 제 24항에 있어서, 상기 프라이머는 말토-올리고사카라이드, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 덱스트린, 풀룰란, 커플링 당, 전분 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
  40. 제 39항에 있어서, 상기 말토-올리고사카라이드는 말토-올리고사카라이드 혼합물임을 특징으로 하는 방법
  41. 제 40항에 있어서, 상기 말토-올리고사카라이드 혼합물은 말토테트라오스 보다 크거나 동일한 정도의 중합반응을 지닌 말토-올리고사카라이드 이외에 적어도 하나 이상의 말토트리오스, 말토스 및 글루코스를 포함함을 특징으로 하는 방법
  42. 제 39항에 있어서, 상기 전분은 가용성 전분, 왁스성 전분, 고-아밀로스 전분, 디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분, 가인산분해효소에 의해 분해된 전분, 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분, 가공된 전분 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
  43. 제 24항에 있어서, 유기 용매를 사용하지 않고 생성된 글루칸을 정제하는 단계로 더욱 구성됨을 특징으로 하는 방법
  44. 제 24항에 있어서, 반응 후 반응 용액을 냉각시켜 글루칸을 침전시키고 고형-액체 분리 방법에 의해 침전된 글루칸을 정제하는 단계로 더욱 구성됨을 특징으로 하는 방법
  45. 제 24항에 있어서,
    글루칸 생성 반응 동안 또는 그 후 반응 용액을 냉각시켜 글루칸을 겔화시키고 ;
    겔화된 글루칸을 회수하고 ;
    물로의 세척, 동결-해동, 여과, 압착, 흡입 및 원심분리로 구성된 군으로부터 선택된 실시에 의해 겔화된 글루칸으로부터 프럭토스를 제거하는 단계로 구성된 방법
  46. 제 24항에 있어서, 글루칸 생성 반응 후 물에 용해된 글루칸을 침전없이 한외여과막 또는 크로마토그래피를 이용하여 막 분획화시켜 프럭토스를 제거하는 단계로 더욱 구성됨을 특징으로 하는 방법
  47. 제 24항에 있어서, 상기 반응 용액은 디브랜칭 효소, 브랜칭 효소, 4-α-글루카노트랜스러파제 및 글리코겐 디브랜칭 효소로 구성된 군으로부터 선택된 효소를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
  48. 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 반응 용액을 반응하게 하여 글루칸을 생성하는 단계로 구성되고, 반응의 시작부터 반응의 종료까지 반응 용액의 슈크로스-인산 비율의 최대 수치는 약 17 이하이고, 반응은 40∼70℃의 온도에서 수행됨을 특징으로 하는 글루칸을 생성하는 방법
  49. 제 1항에 따른 방법에 의해 생성된 글루칸
  50. 제 24항에 따른 방법에 의해 생성된 글루칸
  51. 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 반응 용액을 반응하게 하여 글루칸을 생성하는 단계로 구성되고, 반응의 시작시 반응 용액의 슈크로스-인산 비율은 약 17 이하임을 특징으로 하는 글루칸을 생성하는 방법
  52. 제 51항에 있어서, 상기 반응은 약 40∼70℃의 온도에서 수행됨을 특징으로하는 방법
  53. 슈크로스, 프라이머, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산, 슈크로스 가인산분해효소 및 글루칸 가인산분해효소를 함유한 반응 용액을 반응을 시작하도록 하고;
    슈크로스, 무기 인산 또는 글루코스-1-인산을 반응 용액에 더욱 첨가시키고;
    글루칸을 생성시키도록 반응을 지속시키는 단계로 구성되고 :
    상기 첨가 단계의 종료시점에서 반응 용액의 슈크로스-인산 비율이 약 17 이하임을 특징으로 하는 글루칸을 생성하는 방법
  54. 제 53항에 있어서, 상기 반응은 약 40∼70℃의 온도에서 수행됨을 특징으로 하는 방법
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