KR20030097036A - 엔테로키나제 경사슬의 아미노말단 또는 카르복실말단이변형된 재조합 엔테로키나제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 엔테로키나제(enterokinase) 경사슬(light chain) 단백질의 아미노말단 또는 카르복실말단을 변형시킨 재조합 엔테로키나제 단백질에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 엔테로키나제 경사슬의 카르복실말단에 친화 태그를 삽입하거나 아미노말단의 이소루이신을 발린으로 치환한 재조합 엔테로키나제 단백질, 그의 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 형질전환된 형질전환체 및 상기 재조합 엔테로키나제 단백질을 이용하여 목적단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 엔테로키나제 단백질은 친화태그에 의해 단백질의 제거 또는 회수가 용이하고, 상기 재조합 엔테로키나제 단백질을 고정화하여 사용할 수도 있고, 재조합 엔테로키나제의 아미노말단의 변형을 통하여 대장균에서 재접힘을 통한 대량생산이 가능하므로 목적단백질을 산업적으로 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

엔테로키나제 경사슬의 아미노말단 또는 카르복실말단이 변형된 재조합 엔테로키나제{Recombinant enterokinase by modifying N-terminus or C-terminus of enterokinase light chain}

본 발명은 엔테로키나제(enterokinase) 경사슬(light chain) 단백질의 아미노말단 또는 카르복실말단을 변형시킨 재조합 엔테로키나제 단백질에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 엔테로키나제 경사슬의 카르복실말단에 친화 태그를 삽입하거나 아미노말단의 이소루이신을 발린으로 치환한 재조합 엔테로키나제 단백질, 그의 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 형질전환된 형질전환체 및 상기 재조합 엔테로키나제 단백질을 이용하여 목적단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

유전자 재조합 기술이 발달되면서 동물세포, 효모(yeast) 또는 대장균과 같은 원핵생물(prokaryote) 등을 이용한 유용한 외래 단백질이 많이 생산되고 있으며 이들 단백질이 의약품 등으로 생물공학 산업에 널리 이용되고 있다. 특히 대장균은 세포의 성장 속도가 빠르고 그의 유전자에 대한 규명이 다른 생물체에 비하여 잘 연구되어 있으므로, 유전자 재조합 기술에서 외래 단백질을 생산하기 위한 숙주세포 등으로 많이 이용되고 있다. 그러나 대장균은 진핵생물(eukaryote)에서 단백질을 성숙시키는데 필요한 다양한 세포내 요소를 갖추고 있지 못하는 결정적인 단점이 있다. 구체적으로, 대장균에는 진핵생물이 가지고 있는 번역 후 변형(post-translational modification), 이중 황 결합(disulfide bond formation), 글리코실레이션(glycosylation) 및 구획(compartment) 등의 기능이 수행되지 않는다. 또한, 대장균에서 외래 단백질이 과량으로 발현되는 경우 이들 단백질이 응집체(inclusion body = insoluble aggregate) 형태로 세포질 내에 축적되는 경우가 많다. 따라서 외래 단백질이 응집체 형태로 생산될 때 유발되는 상기 문제점을 개선하기 위하여, 대장균에서 외래 단백질을 수용성 단백질 형태로 발현시키는 것은 중요한 의미가 있다. 대장균에서 외래단백질을 수용성 발현하는데 가장 효과적인 것은 단백질 융합발현기술(fusion protein technology)이다. 이 기술은 포스트 게놈학 이후에 많은 단백질의 기능 게놈믹스(functional genomics)과 구조 게놈믹스(structural genomics)에서 중요성이 증가하고 있다. 융합단백질에서 목표단백질을 얻기 위하여 특정 단백질 서열을 특이적으로 절단하는 엔테로키나제, 트롬빈 및 인자 Xa 등과 같은 효소가 필수적이다. 그런데 이들 절단 효소 가격은 비싸서 융합단백질 기술의 많은 장점에도 불구하고 이 기술이 산업화에 사용되는데 가장 큰 방해요인으로 작용하고 있다. 따라서 성능이 향상된 재조합 엔테로키나제를 개발하는 것은 융합단백질 기술에 크게 기여하리라 예상된다.

엔테로키나제는 트립시노겐의 아미노 말단 펩티드인서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열 Val-(Asp)₄-Lys을 절단하여 트립신으로 변환시키고 많은 췌장(pancreatic) 자이모겐(zymogen)을 활성화시킨다(Kunitz,J. Gen. physiol.,1939, 22:429-446; Yamshina,Acta Chem. Scand., 1956, 10:739:743).서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열 (Asp)₄-Lys는 많은 척추동물에서 엔테로키나제의 인식부위로서 보존된 부위인데, 상기 서열은 트립신에 의한 트립시노겐의 자동활성(auto-activation)을 저해한다(Maroux et al.,J. Biol. Chem., 1971, 246:5031-39). 따라서, 엔테로키나제는서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열에 대한 높은 특이성으로 융합단백질의 위치-특이적 절단을 위한 용도로 많이 쓰이고 있다(LaVallie et al.,J. Biol. Chem., 1993, 268:23311-17).

소 엔테로키나제는 단일 가닥의 전구체에서 유래한 35 kDa 경사슬과 115 kD의 중사슬의 구성으로 이중 황결합으로 이어진 헤테로다이머(heterodimer)이다(Kitamoto et al.,Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 1994, 91:7588-92). 이중에서 엔테로키나제 경사슬(이하 "EK_L"이라 약칭한다)는 전효소(holoenzyme)의 부분 환원에 의해 분비되어 단백질 분해능을 나타내며(Light and Fonseca,J. Biol. chem., 1984, 259:13195-98), 중사슬은 트립시노겐의 인식과 막 결합에 관여한다(Fonseca and Light,J. Biol. Chem., 1983, 258:14516-20). 두오데나제(duodenase)는 전-엔테로키나제(pro-enterokinase)를 활성화시키는 역할을 하는 것으로 여겨진다(Zamolodchikaba et al.,FEBS Lett., 2000, 466:295-299). 소 EK_L을 인코딩하는 cDNA를 분리하여 포유류 COS 세포(LaVallie et al.,J. Biol. Chem. 1993, 268:23311-17), 융합파트너로 DsbA를 사용한 대장균(Collins-Racie et al.,Bio/technology, 1995, 13:982-987) 및 메틸로트로픽 효소 피치아파스도리스(Pichia pastoris)(Vozza et al.,Bio/technology,1996, 14:77-81) 등의 숙주에서 발현시킨 연구결과가 보고되고 있다.

엔테로키나제의 아미노말단은 이소루이신이어서 대장균에서 직접 생산시에 메티오닌 아미노펩티다제(methionine aminopeptidase)에 의해 메티오닌이 제거가 되지 않아서 활성단백질 생산이 매우 어렵다.

엔테로키나제의 인식부위가 매우 특이성이 있다고 알려져 있음에도 불구하고, 절단을 위한 최소의 서열은 P2 위치((Asp)₄-Lys에서 마지막 Lys가 P1이고 반대로 처음의 Asp가 P5위치이다)의 산성 아미노산(글루탐산 또는 아스파르트산) 및 P1 위치의 염기성 아미노산(라이신 또는 아르기닌)인 것으로 알려져 있다. 또한, P3-P5 부위에 위치하는 산성 잔기가 증가할수록 가수분해 속도가 증가한다.

융합 단백질을 절단한 후에도 엔테로키나제가 반응액 속에 잔류하면 목적 단백질을 분해할 수 있으므로, 이러한 목적 단백질의 분해를 방지하기 위하여 융합 단백질이 절단되 후에는 엔테로키나제를 제거하는 것이 바람직하다. 그러나 종래에는 값싸게 엔테로키나제를 제거를 하는 방법이 없어서 목적단백질을 분리하는데 많은 어려움이 있었다.

이에, 본 발명자들은 융합단백질의 절단 동안에 엔테로키나제가 목표 단백질을 분해하여 최종 산물의 수율을 떨어뜨린다는 것을 알고 엔테로키나제 경사슬의효율적인 정제와 제거를 위하여 친화 태그를 엔테로키나제 경사슬의 카르복실말단 또는 카르복실말단에 삽입시킨 재조합 엔테로키나제를 제조하고, 상기 재조합 엔테로키나제가 쉽게 정제될 수 있고, 이를 이용하여 융합단백질의 절단 과정 후 재조합 엔테로키나제를 용이하게 제거하여 원하는 목적 단백질의 수득률을 높일 수 있음을 밝히고 아미노말단의 체계적인 돌연변이(mutagenesis)를 수행하여 대장균에서 재접힘하여 대량생산함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 재조합 엔테로키나제 경사슬의 아미노말단과 카르복실말단의 변형을 통하여 효소 기능이 향상된 재조합 엔테로키나제, 상기 재조합 엔테로키나제를 이용하여 단백질의 분리, 절단 후 제거와 회수, 고정화 컬럼 등에 응용될 수 있으며 융합단백질기술에서 목표단백질 쉽게 얻을 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 소 엔테로키나제 경사슬의 cDNA를 발현 벡터 pIL20GH의 제한효소 XbaI 및 BamHI 위치에 삽입한 벡터 pIL20EK_L의 모식도이고,

Ap : 앰피실린 저항 유전자, 2μ: 2μ플라스미드의 복제 오리진,

GAL4 : 효모에서 갈락토스-유도 유전자 양성 조절 단백질,

URA3 : 오로티딘-5-포스페이트 디카르복실라제를 인코딩하는 유전자,

pMFα1 : 효모 메이팅 인자 α1의 프로모터,

UASg : GAL1-10 상위 활성 서열, ktl : 킬러 톡신 리더 서열,

tGAPDH : 글리세랄데히드 포스페이트 디하이드로지나제의 전사 종결자,

도 2는 벤자미딘 세파로스 컬럼 크로마토그래피로 정제한 재조합 EK_L을 엔도글리코시다제 H로 처리하여 SDS-PAGE로 분석한 전기영동 사진이고,

레인 1 : 사이즈 마커,

레인 2 : 벤자미딘 세파로스 컬럼 크로마토그래피로 정제한 재조합 EK_L,

레인 3 : 엔도글리코시다제 H로 처리한 재조합 EK_L,

도 3a는 재조합 EK_L을 이용한 융합단백질 T2GH의 절단 반응을 SDS-PAGE로 분석한 전기영동 사진이고,

레인 1 : 사이즈 마커, 레인 2 및 레인 5 : 융합단백질 T2GH,

레인 3 : 재조합 EK_L로 2시간 반응, 레인 4 : 재조합 EK_L로 4시간 반응,

레인 6 : 재조합 EK_L로 8시간 반응,

도 3b는 소 엔테로키나제 및 다른 재조합 엔테로키나제의 효모 배양 상등액으로 융합 단백질 T2GH의 절단 반응을 SDS-PAGE로 분석한 전기영동 사진이고,

레인 1 : 사이즈 마커, 레인 2 : 융합단백질,

레인 3 : 소 엔테로키나제로 0.5 ㎍으로 처리,

레인 4 : 소 엔테로키나제 0.5 ㎍ 및 배지 배양액 10 ㎕로 처리,

레인 5 : pIL20X 벡터가 도입된 형질전환체의 배양 상등액으로 처리,

레인 6 : pIL20XΔEK_L벡터가 도입된 형질전환체의 배양 상등액으로 처리,

레인 7 : pIL20XGH 벡터가 도입된 형질전환체의 배양 상등액으로 처리,

레인 8 : pIL20XEK_L벡터가 도입된 형질전환체의 배양 상등액으로 처리,

도 4는 재조합 EK_L-Ca-His를 니켈 친화 크로마토그래피로 한번에 정제한 것을 SDS-PAGE로 분석한 전기영동 사진이고,

레인 1 : 사이즈 마커,

레인 2 : 버퍼 B로 세척한 컬럼으로부터 추출,

레인 3 : 정제된 재조합 EK_L-Ca-His,

도 5는 EK_L, 재조합 EK_L-Ca-His 및 재조합 N-His-EK_L의 엔테로키나제 활성을 형광을 내는 기질을 이용하여 비교한 그래프이고,

△ : EK_L, Ｏ : 재조합 EK_L-Ca-His, □ : 재조합 N-His-EK_L,

도 6은 엔테로키나제 경사슬의 아미노말단을 돌연변이시킨 돌연변이 발현벡터의 모식도이고,

도 7은 I1V 돌연변이와 와일드 타입 엔테로키나제의 효소활성을 비교한 그래프이고,

■ : I1V 돌연변이, ▲ : 와일드 타입 엔테로키나제(EK_L),

△ : 인간 성장호르몬(hGH)(대조군)

도 8은 I1V 돌연변이와 와일드 타입 엔테로키나제의 온도에 따른 효소활성을 측정한 그래프이고,

A : 45℃, B : 65℃,

■ : I1V 돌연변이, ▲ : 와일드 타입 엔테로키나제(EK_L),

도 9는 니켈 NTA 스핀 컬럼으로 EK_L및 재조합 EK_L-Ca-His을 제거한 것을 비교한 그래프이다.

△ : EK_L, Ｏ : 재조합 EK_L-Ca-His

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엔테로키나제 경사슬의 아미노말단 또는 카르복실말단이 변형된 재조합 엔테로키나제 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 엔테로키나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 엔테로키나제 단백질을 이용하여 융합단백질을 절단하고 반응액 내에서 재조합 엔테로키나제 단백질을 회수하여 목적단백질을 분리하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 엔테로키나제 경사슬의 아미노말단 또는 카르복실말단이 변형된 재조합 엔테로키나제 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 재조합 엔테로키나제 단백질은 엔테로키나제 경사슬의 카르복실말단에 친화 태그를 추가할 수 있고, 친화 태그로는 히스티딘 태그, 헤마글루티닌 (HA) 태그, 폴리 아르기닌(poly Arginine) 태그, 폴리 라이신(poly Lysine) 태그, 플래그 (flag) 태그 및 myc 태그 등을 사용할 수 있고, 반드시 상기 친화태그에 한정되는 것은 아니며, 분리, 정제가 용이한 친화태그는 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 재조합 엔테로키나제 단백질은 상기 친화태그를 이용한 공지의 분리 방법에 의해 반응액 내에서 재조합 엔테로키나제 단백질은 용이하게 회수 또는 제거할 수 있으며, 친화태그를 사용하여 고정화시켜 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명은 재조합 엔테로키나제 단백질은 엔테로키나제 경사슬의 아미노말단 이소루이신을 발린으로 치환한 재조합 엔테로키나제 단백질을 제공한다. 상기와 같이 아미노말단 이소루이신을 발린으로 치환한 재조합 엔테로키나제 단백질은 대장균에서 대량 발현되어 대량 생산이 가능하므로 산업적으로 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 엔테로키나제 단백질은 엔테로키나제 경사슬의 카르복실말단이 친화태그가 추가되고, 아미노말단 이소루이신을 발린으로 치환된 재조합 엔테로키나제 단백질인 것이 바람직하다.

본 발명의 재조합 엔테로키나제 단백질에서 친화태그는 아미노말단 또는 카르복실말단에 위치할 수 있으나 카르복실말단에 위치하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 친화 태그의 수는 용이하게 변경될 수 있으며, 예를 들어 His-태그에서 히스티딘의 수는 용도에 맞게 변할 수 있다. 또한, 엔테로키나제 경사슬의 카르복실 말단과 친화태그 사이에 스페이서(spacer)를 삽입할 수 있다. 예를 들어, 중간에 글리신-세린-글리신-세린-글리신 스페이서를 삽입하여도 효소의 활성에는 변화가 없다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 엔테로키나제 경사슬의 카르복실말단에 His-태그된 재조합 엔테로키나제 단백질은서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 유전자는서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가진다. 그러나, 상기 염기서열 이외에도 번역되었을 때 상기 아미노산 서열을 제조할 수 있는 모든 염기서열이 본 발명의 범주에 포함되는 것은 당업자에 있어서는 당연하다. 이러한 염기서열은 상기서열번호 10으로 기재되는 염기서열의 치환, 결실 또는 삽입 등으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예에서 엔테로키나제 경사슬의 아미노말단 이소루이신을 발린으로 치환한 재조합 엔테로키나제 단백질은서열번호 17로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 유전자는서열번호 18로 기재되는 염기서열을 가진다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 카르복실말단에 His-태그된 본 발명의 rEK_L-Ca-His의 활성은 재조합 EK_L과 비슷하게 시간에 따라 활성이 증가하였으나, 카르복실말단에 His-태그된 His-N-rEK_L은 EK_L활성이 없다(도 5참조). 이는 카르복실말단 보다는 재조합 EK_L의 아미노말단 잔기의 성질이 엔테로키나제 활성에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다. 이는 재조합 EK_L의 아미노말단 아미노산 이소루이신이 구조내에서 결정적인 염 브리지(salt bridge)에 관여하고 따라서 아미노말단 연장은 효소의 활성을 억제한다는 이런 기술과 일치한다(Fehlhammer et al.,J. Mol. Biol., 1977, 11:415-438; Collins-Racie et al.,Bio/technology, 1995, 13:982-987). 또한, 재조합 EK_L의 3차원적 구조는 아미노말단 이소루신 잔기가 염 브리지를 위한 단백질의 내부에 위치해 있고, 반면 카르복실말단 부위는 외부로 나와 있다(Lu et al.,J. Mol., Biol., 1999, 292:361-373).

또한, 본 발명은 상기 재조합 엔테로키나제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 재조합 엔테로키나제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 재조합 엔테로키나제 단백질을 대량 생산할 수 있는 발현벡터를 제공한다.

본 발명자들은 이전에 분비 촉진제로 인간 IL-1β의 아미노말단 서열을 사용하여 재조합 사카로마이세스 세레비지(Saccharomyces cerevisiae)에서 새로운 분리 시스템을 제조한 바 있다. 기존의 분비 리더(reader)와 촉진 펩타이드의 조합은 여러 단백질의 분비를 증가시켰다(Lee et al.,Biotechnol. Prog., 1999, 15:884-890).

본 발명의 바람직한 실시예에서, 발현벡터는 킬러톡신 리더서열, 인터루킨 1β의 아미노말단 24 잔기의 유전자, KEX2 단백질 분해효소 절단 위치에 해당하는 유전자 및서열번호 10으로 기재되는 유전자를 포함하는 발현벡터(pIL20XEK_L-Ca-His)를 제공한다. 또한, 상기 발현벡터(pIL20XEK_L-Ca-His)를 효모에 형질전환시킨 형질전환체를 제조하고, 이를 2002년 5월 21일 부로 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM 10381).

또한, 본 발명의 바람직한 실시예에서 발현벡터는 킬러톡신 리더서열, 인터루킨 1β의 아미노말단 24 잔기의 유전자, KEX2 단백질 분해효소 절단 위치에 해당하는 유전자 및서열번호 18로 기재되는 유전자를 포함하는 발현벡터(pIL20-I1V-EK_L)를 제공한다. 또한, 상기 발현벡터(pIL20-I1V-EK_L)를 효모에 형질전환시킨 형질전환체를 제조하고, 이를 2002년 5월 21일 부로 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM 10382).

또한, 본 발명은 재조합 단백질을 생산하는 방법에 있어서, 친화 태그를 이용하여 재조합 엔테로키나제 단백질을 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명에서는 본 발명의 재조합 엔테로키나제를 발현하는 형질전환체를 배양하고, 상기 배양액으로부터 친화 태그를 이용하여 재조합 엔테로키나제를 분리한다. 친화태그는 재조합 엔테로키나제에 결합되어 있는 결합태그를 사용하여 분리하고, 친화태그로는 히스티딘 태그, 헤마글루티닌 (HA) 태그, 폴리 아르기닌(poly Arginine) 태그, 폴리 라이신(poly Lysine) 태그, 플래그 (flag) 태그 및 myc 태그 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 대량 배양된 효모 배양액으로부터 EBA(Expanded bed adsorption) 방법을 이용하여 재조합 엔테로키나제를 대량으로 분리하여 재조합 엔테로키나제를 생산하였다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 엔테로키나제 단백질을 이용하여 융합단백질을 절단하고 반응액 내에서 재조합 엔테로키나제 단백질을 회수하여 목적단백질의 분해를 방지함으로써 목적단백질의 수득률을 높일 수 있는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 엔테로키나제를 융합단백질의 절단에 이용하여 목적 단백질의 수득률을 높이는 방법은

1) 융합단백질에 본 발명의 재조합 엔테로키나제를 첨가하여 절단하는 단계;

2) 절단 반응이 끝난 후, 상기 절단 반응액으로부터 재조합 엔테로키나제를 제거하는 단계로 구성된다.

상기 단계 2에 있어서, 재조합 엔테로키나제의 제거는 재조합 엔테로키나제의 친화태그와 결합하는 리간드가 고정된 크로마토그래피를 이용하여 용이하게 분리될 수 있다.

친화태그는 특정 리간드와 친화성을 가지는 성질을 가지고 있다. 친화성이 있는 리간드가 붙어있는 레진을 이용한 액체 크로마토그래피를 이용하여 재조합 엔테로키나제를 간단하게 분리해 낼 수 있다. 또한 재조합 융합단백질의 절단에 상기 재조합 엔테로키나제를 사용할 경우 절단 후 융합 파트너와 목적 단백질, 그리고 엔테로키나제의 혼합액을 친화성 리간드가 있는 액체 크로마토그래피를 통과시키면 엔테로키나제는 리간드에 흡착하므로 통과액에는 융합파트너와 목적단백질만 남게 된다. 특히 엔테로키나제가 가진 태그와 같은 친화성 태그를 갖는 융합파트너의 경우에는 한번 크로마토그래피를 통과시킴으로 목적단백질만을 얻을 수도 있다. 또한 대장균을 이용한 엔테로키나제의 제조에 있어서 활성이 없는 응집체 형태로 발현되는 엔테로키나제를 친화성 태그를 이용하여 크로마토그래피 컬럼에 고정시키고 재접힘함으로써 활성단백질을 고농도로 얻어낼 수 있다.

본 발명자들은 융합단백질의 절단 반응에 재조합 EK_L을 제거하지 않고 계속해서 방치하면 목표단백질보다 작아진 단백질이 생성되고 목표 단백질의 수득률이 떨어지는 것을 관찰하고, 상기의 원인이 엔테로키나제를 준비할 때 오염된 단백질 분해효소에 의한 것인지 또는 엔테로키나제의 폭넓은 기질 특이성에 의한 것인지 확인한 결과, 융합단백질의 추가로 진행되는 절단은 오염된 단백질 분해효소에 의한 것이 아니라 엔테로키나제 자체에 의한 것임을 확인하였다. 또한, 재조합 EK_L과 천연 엔테로키나제(이하 "bEK"라 약칭한다)는 기질 특이성이 다르다는 것도 알 수 있었다. 전효소(holoenzyme)의 촉매 소단위를 나타내는 rEK_L은 크기가 작기 때문에 접근이 어려운 위치에 접근하기에 더욱 좋은 가능성이 있다. 종래 기술에서 엔테로키나제를 융합단백질의 절단을 위해 사용할 때 목표 단백질의 추가적인 분해가 관찰되었고 이것은 엔테로키나제를 분리하는 과정에 오염된 단백질 분해효소에 의한 것이라고 여겨져 왔다(Dykes et al.,Eur.J. Biochem., 1988, 174:411-416). 그러나, 본 발명에서는 상기의 추가로 분해되는 것이 오염된 단백질 분해효소에 의한 것이 아니라 엔테로키나제 자체의 폭넓은 기질 특이성에 기인한 것이라는 것을 증명하였다. 상기 결과로부터, 목표단백질의 추가적인 분해를 막기 위해서는 절단 반응이 끝난 후 엔테로키나제를 제거하는 것이 필수적임을 알 수 있었다.

본 발명의 재조합 엔테로키나제 단백질은 형질전환체로부터 배양하여 이를 니켈 친화 크로마토그래피, 배치 흡착(batch adsoption)등의 방법으로 단일 단계로 정제할 수 있고 정제된 재조합 엔테로키나제는 완전한 활성을 나타낸다.

이런 단일 단계 정제 절차는 또한 목적 단백질의 원하지 않는 절단을 방지하기 위하여 융합단백질을 절단한 후 엔테로키나제의 제거에도 사용되어진다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 rEK_L-Ca-His은 니켈-NTA 스핀 컬럼으로 간단한 원심분리를 통하여 쉽게 효과적으로 제거되었으나 친화태그가 없는 재조합 EK_L은 쉽게 제거되지 않았다(도 9참조). rEK_L-Ca-His는 또한 배치 흡착(batch adsorption)에 의해서 쉽게 제거될 수 있다. His-태그 EK_L을 제거하기 위해서는 니켈 친화 크로마토그래피가 벤자미딘 또는 콩 트립신 저해 크로마토그래피보다 장점이 많다. 레진은 안정적이고, 경제적이며 또한 매우 특이적이다(Porath et al.,Nature, 1975, 258:598-599). 게다가 히스티딘 태그는 고염, 계면활성제 및 변성제와 같은 넓은 범위의 조건하에서 금속-킬레이팅 매트릭스에 단단히 결합한다. 따라서 절단 반응은 원하는 단백질에 맞는 조건의 넓은 범위에서 사용이 가능하다. 또한, 효소는 투석 또는 젤 투과 등과 같은 하위 공정이 필요없이 반응액으로부터 직접 제거할 수 있다. 히스티딘 태그는 가장 잘 알려진 친화 태그로 원핵 또는 진핵세포에서 융합단백질에 많이 쓰인다(Porath et al.,Protein Expr. Purif., 1992, 3:263-281). His-태그 EK_L은 His-태그 융합단백질로부터 목적단백질을 얻을 수 있고, 니켈 친화 컬럼에서 단일 단계로 EK_L을 제거할 수 있기 때문에 His-태그 융합 단백질의 절단을 위해 보다 유익하다.

따라서, 본 발명의 카르복실말단 His-태그 EK_L은 배양액으로부터 단백질을 생산하고 정제하는 하류 공정(downstream process) 및 반응하는 동안의 효소의 회수 및 재활용에 사용되어 산물의 수득률을 극대화시키는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, rEK_L-Ca-His가 니켈 친화 컬럼에 고정되는 것은 공유결합이 아니고 가역적인 작용이다. 게다가 본 발명의 rEK_L-Ca-His는 친화 태그의 특이 방향이 컬럼 매트리스를 향하여 효소 활성 부위의 입체제한(steric hindrance)을 최소화함으로써 효소가 완전한 활성을 나타내는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 카르복실말단 친화 태그 엔테로키나제는 융합단백질 기술에서 매우 유용하게 사용될 수 있으며 여러 재조합 단백질의 생산 비용을 절감할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<참고예 1> 재조합 EK _L 의 발현 및 특성 조사

<1-1> EK _L 을 포함하는 발현벡터의 제조

본 발명자들은 EK_L을 포함하는 발현벡터를 제조하기 위하여, EK_LcDNA를 PCR을 수행하여 클로닝하였다

구체적으로, 올리고텍스 RNA 키트(Qiagen Oligotex RNA kit, Qiagen)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하여 소 십이지장(duodenal) 조직으로부터 모든 RNA를 분리하였다. 모든 RNA로부터 소 EK_L의 아미노말단과 카르복실말단에 해당하는서열번호 3및서열번호 4로 기재되는 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 소 EK_L을 코딩하는 cDNA를 얻었다. PCR 산물을 제한효소 KpnI 및 HindⅢ를 사용하여 절단하고 프로퓨즈(ProFuse) 벡터 pGE-lysN(프로테온, 한국)에 클로닝하였고, 소 EK_L의 염기서열은 생거의 디데옥시 방법(Sanger et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 1977, 74:5463-67)으로 분석하였다.

상기에서 EK_L의 염기서열을 분석해 본 결과 엔테로키나제는 두가지 종류의 cDNA가 있음이 확인되었는데, 이중 하나는서열번호 11로 기재되는 235 아미노산 잔기를 코딩하고 있었으며 다른 하나는 전체 235 부분 중 107-138 부분의 32 아미노산이 결손된 203 아미노산 잔기를 코딩하고 있었다. EK_L의 cDNA 염기서열은 이전의 문헌(LaVallie et al.,J. Biol. Chem., 1993, 268:23311-17)에서 보고된 클론과 매우 유사하였으나, 615 위치가 A에서 G로 바뀌고 669 위치에서 G가 C로 바뀐 두 부분이 차이가 있었다.

상기와 같이 PCR 방법으로 두가지 형태의 엔테로키나제 유전자 EK_L및 EK_L의 아미노산 107-138 부분에 해당하는 32개의 잔기가 결실된 ΔEK_L을 얻었다. 상기 엔테로키나제 유전자를서열번호 5및서열번호 6으로 기재되는 프라이머를 사용하여 두 번째 PCR을 수행하고 상기 PCR 산물을 제한효소 XbaI 및 BamHI으로 절단하여 효모 발현벡터인 SecHancer 벡터 pIL20GH(프로테온, 한국)에 삽입하여 pIL20EK_L플라스미드 및 pIL20ΔEK_L플라스미드를 얻었다. 상기 플라스미드에서 엔테로키나제 유전자는 킬러 톡신 리더 서열 다음에 분비 촉진자로 인간 인터루킨-1β의 카르복실말단 24 잔기가 연결되어 있다(Lee et al.,Biotechnol. Prog., 1999, 15:884-890). KEX2 단백질 분해효소 절단 위치는 상기 분비 촉진자와 EK_L사이에 위치한다(도 1). 유전자 발현은 S. 세레비지에(S. cerevisiae) α-메이팅 인자 프로모터의 상위에 있는 Gal-10 활성 서열에 의해 조절되고 2% 갈락토스(galactose)에 의해 유도된다.

<1-2> EK _L 을 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체의 제조

본 발명자들은 상기 참고예 <1-1>에서 제조한 EK_L을 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 제조하였다. 구체적으로, 상기 참고예 <1-1>에서 제조한 발현벡터 pIL20EK_L플라스미드 및 pIL20ΔEK_L플라스미드를 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces. cerevisiae)2805(pep4::HIS3, pro1-δ, can1, Gal2, his3δ, ura3-52)에 형질전환시켰다. 상기 효모 형질전환체를 이전의 기술(Lee et al.,Biotechnol. Prog., 1999, 15:884-890)과 동일한 방법으로 SD Ura 배지(0.8 g/L 완전 보충 배지(BIO101), 아미노산이 없는 6.7 g/L 효모 질산염(DIFCO), 2% 글루코스) 10 ㎖에서 30℃, 250 rpm으로 밤새도록 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 YPGal 배지(1% 효모추출물, 2% 박토-펩톤, 2% 갈락토스)에서 세포 침전물을 현탁하여 발현을 유도하였다. 발현 유도는 30℃에서 250 rpm으로 20시간 동안 계속하였다.

<1-3> EK _L 의 발현 및 정제

본 발명자들은 상기 참고예 <1-2>에서 제조한 형질전환체를 배양하여 재조합 EK_L을 발현시켰으며, 상기 재조합 EK_L단백질을 벤자미딘 세파로스 컬럼으로 한번에 정제하였다. 구체적으로, 분비된 엔테로키나제를 포함하는 효모 배양액을 버퍼 A(50 mM 트리스-HCl, pH8.4)에서 투석하였고, 버퍼 A로 미리 충진시킨 벤자미딘 세파로스 컬럼(benzamidine Sepharose column, Phamacia, 1.6 ㎝ X 5 ㎝)에 적용(load)하였다. 이때, 유속은 20 ㎖/h로 조정하였다. 컬럼을 버퍼 A 100 ㎖로 세척한 후, 다시 100 mM 트리스-HCl(pH 8.4) 50 ㎖로 세척하였다. 재조합 EK_L를 1 M NaCl이 포함된 pH 5.6의 0.5 M 트리스/아세테이트 버퍼에서 50 부피% 에틸렌 글리콜로 용출하였다. 엔테로키나제 활성을 갖는 분획을 선별하여 검 아라빅(Gum Arabic, Sigma)으로 투석 튜브에서 농축시켰으며, 마지막 분획을 pH 8.0인 50 mM 트리스-HCl 4리터로 밤새 투석하였다.

그 결과, 배양액 1리터로부터 약 1 ㎎의 EK_L을 얻을 수 있었다. 정제된 단백질의 서열을 분석한 결과 분비되는 동안 KEX2 단백질 분해효소에 의해 카르복실말단이 정확히 절단된 것을 확인하였다. 예상되는 EK_L의 분자량은 26.3 kDa이었으나 SDS-PAGE에서 측정한 EK_L의 분자량은 44 kDa이었고, 이는 글리코실레이션(glycosylation) 되었기 때문이다. 재조합 EK_L을 만노스 글리칸을절단하는 엔도글리코시다제 H(endoglycosidase H)로 처리하면 44 kDa보다 낮은 위치의 EK_L을 얻을 수 있었다(도 2).

<1-4> EK _L 을 이용한 융합단백질의 절단

본 발명자들은 융합단백질(T2GH)(Shin et al, 1998,J. Biotechnol.62: 143-151)을 재조합 EK_L로 절단하여 벤자미딘 세파로스 컬럼에서 정제하였다.

그 결과, 22 kDa을 갖는 hGH(human growth hormone) 산물을 SDS-PAGE에서 확인할 수 있었다. 절단 산물의 아미노말단을 서열분석하면 융합단백질의서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열 (Asp)₄-Lys 인식 서열에서 정확히 절단된 것을 알 수 있었다. 그러나, 반응 혼합물을 계속해서 반응시키면 hGH 단백질의 감소와 함께 원래보다 분자량이 작아진 단백질이 관찰되었다(도 3a).

<1-5> 재조합 EK _L 의 기질 특이성 조사

본 발명자들은 상기 참고예 <1-4>에서 융합단백질의 절단 후에 재조합 EK_L을 제거하지 않고 계속해서 방치하면 목표단백질보다 작아진 단백질이 생성되고 목표 단백질의 수득률이 떨어지는 것을 관찰하였다. 본 발명자들은 상기의 원인이 엔테로키나제를 분리할 때 오염된 단백질 분해효소에 의한 것인지 또는 엔테로키나제의 폭넓은 기질 특이성에 의한 것인지 확인하기 위하여, 융합단백질을 여러 가지 형태의 효모 형질전환체 발효 상등액 또는 소 십이지장으로부터 유래한 천연 엔테로키나제(이하 "bEK"라 약칭한다)로 처리하였다.

먼저, 벤자미딘 세파로스 컬럼을 이용하여 정제한 재조합 EK_L을 준비하는 과정에서 다른 단백질 분해효소가 오염되어 있을 가능성이 있으므로, 본 발명자들은 엔테로키나제를 배양한 발효 상등액을 사용하였다. 음성 대조구로 사용한 3개의 다른 발효 상등액, y(pIL20X), y(pIL20GH) 또는 y(pIL20ΔEK_L)은 각각 아무런 단백질도 생산하지 못하거나, hGH 또는 아무런 활성이 없는 내부가 결손된 EK_L을 생산하였다.

그 결과, bEK에 의한 융합단백질의 절단으로 인간 hGH에 해당하는 22 kD 분자량의 산물과 더 작은 사이즈의 절편 A가 생겼다(도 3b, 레인 3 및 레인 4). 재조합 EK_L이 포함된 발효 상등액으로 상기와 동일하게 처리하면 절편 A 및 절편 B를 생산하였다(도 3b, 레인 8). 상기 3가지 음성 대조구에서는 절단된 산물을 관찰할 수 없었다(도 3b, 레인 5-7). 상기 결과는 융합단백질의 추가로 진행되는 절단은 오염된 단백질 분해효소에 의한 것이 아니라 엔테로키나제 자체에 의한 것임을 알 수 있었다. 또한, 절편 B는 bEK로 처리한 것에는 검출되지 않고 재조합 EK_L로 절단한 것에서만 검출되었다. 상기 결과로부터, 재조합 EK_L과 bEK는 기질 특이성이 다르다는 것을 알 수 있었다.

전효소(holoenzyme)의 촉매 소단위를 나타내는 rEK_L가 크기가 작기 때문에 접근이 어려운 위치에 접근하기에 더욱 좋을 가능성이 있는데, 본 발명의 결과는 트립시노겐을 활성화하는데 있어서 rEK_L보다 bEK의 활성이 100배 정도 높고 반면 rEK_L은 bEK보다 융합단백질을 절단하는 활성이 높다는 이전의 기술(LaVallie et al.,J. Biol. Chem., 1993, 268:23311-17)과 일치한다. 이전 기술에서 엔테로키나제를 융합단백질의 절단을 위해 사용할 때 목표 단백질의 추가적인 분해가 관찰되었고 이것은 엔테로키나제를 분리하는 과정에 오염된 단백질 분해효소에 의한 것이라고 여겨져 왔다(Dykes et al.,Eur.J. Biochem., 1988, 174:411-416). 그러나, 본 발명에서는 상기의 추가로 분해되는 것이 오염된 단백질 분해효소에 의한 것이 아니라 엔테로키나제 자체의 폭넓은 기질 특이성에 기인한 것이라는 것을 증명하였다.

상기 결과로부터, 목표단백질의 추가적인 분해를 막기 위해서는 절단 반응이 끝난 후 엔테로키나제를 반드시 제거해야 한다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 1> His-태그 EK _L 을 포함하는 발현벡터의 제조

본 발명자들은 융합 단백질의 절단 후 재조합 EK_L의 정제와 제거를 쉽게 하기 위하여, 재조합 EK_L의 아미노말단 또는 카르복실말단에 히스티딘 태그를 삽입하여 아미노말단 His-태그 EK_L(이하 "His-N-rEK_L"라 칭한다) 또는 카르복실말단 His-태그 EK_L(이하 "rEK_L-Ca-His"라 칭한다)을 제조하였다.

구체적으로, 상기 참고예 <1-1>에서 제조한 pIL20EK_L벡터를서열번호 6및서열번호 7로 기재되는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 아미노말단 His-태그 EK_L유전자를 pIL20GH 벡터의 XbaI/BamHI 위치에 클로닝하여 pIL20X-N-His-EK_L플라스미드를 제조하였다. 또한,서열번호 5및서열번호 8로 기재되는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 카르복실말단 His-태그 EK_L유전자를 pIL20GH 벡터에 클로닝하여 pIL20XEK_L-Ca-His플라스미드를 제조하였다. N-His-EK_L및 EK_L-Ca-His는 각각 His₆-D₄K-EK_L및 EK_L-His₅과 같이 발현된다. 히스티딘 태그의 수는 용도에 맞게 변경될 수 있고 상기 실험에 국한된 것은 아니다.

<실시예 2> 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체의 제조

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조한 발현벡터를 이용하여 상기 참고예 <1-2>와 동일한 방법으로 형질전환체를 제조하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 발현벡터 N-His-EK_L및 rEK_L-Ca-His 플라스미드를 S. 세레비지에 2805(pep4::HIS3, pro1-δ, can1, Gal2, his3δ, ura3-52)에 형질전환시켰다. 효모세포를 이전의 기술(Lee et al.,Biotechnol. Prog., 1999, 15:884-890)과 동일한 방법으로 SD Ura 배지(0.8 g/L 완전 보충 배지(BIO101), 아미노산이 없는 6.7 g/L 효모 질산염(DIFCO) 및 2% 글루코스) 10 ㎖에서 30℃에서 250 rpm으로 밤새도록 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 YPGal 배지(1% 효모추출물, 2% 박토-펩톤 및 2% 갈락토스)에서 세포 침전물을 현탁하여 발현을 유도하였다. 이때, 발현 유도는 30℃에서 250 rpm으로 20시간 동안 계속하였다.

본 발명자들은 카르복실말단 His-태그 EK_L유전자를 포함하는 형질전환체를 2002년 5월 21일 부로 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호 : KCCM 10381).

<실시예 3> rEK _L -Ca-His의 정제

본 발명자들은 rEK_L-Ca-His의 카르복실말단에 위치한 His-태그를 이용하여 니켈 킬레이팅 세파로스 크로마토그래피에서 단일 스텝으로 본 발명의 rEK_L-Ca-His를 정제하였다. 구체적으로, 발현액을 20 mM 소듐 포스페이트(pH 7.5), 300 mM NaCl(buffer B로 약칭)에 투석을 하고, 이것을 니켈 킬레이팅 세파로스 컬럼(1.6 cm X 5 cm) 에 흘려 보낸 다음 버퍼 B로 세척을 하고 위의 버퍼 B에 50 mM 이미다졸이 첨가된 용액으로 다시 세척을 한 다음 단백질을 100 mM 이미다졸이 첨가된 버퍼 B로 용출하였다. 상기 용출된 용액을 단백질 활성을 조사하여 활성이 있는 것만 모아 센트리프렙 10(Centriprep 10; Amicon)으로 농축을 하여 단백질을 분리하였다.

그 결과, 정제 수득률은 1리터의 발효 상등액당 1 ㎎ 이었다. 엔테로키나제 활성은 100 mM 이미다졸을 포함한 버퍼에서 추출한 분획에서 관찰되었다. 50 mM 이미다졸을 포함하는 버퍼로 우선 세척하면 엔테로키나제의 대부분은 추출되지 않고 약 47-50 kDa 크기의 숙주유래 단백질이 추출되었다(도 4, 레인 2). His-N-rEK_L는 같은 조건하에서 EK_L-Ca-His와 같이 효율적으로 정제되지는 않았으므로, 본 발명자들은 부분적으로 정제한 것을 절단 반응에 사용하였다. 상기 결과로 엔테로키나제 경사슬의 카르복실 말단이 히스티딘 친화 태그된 재조합 엔테로키나제는 산업적으로 매우 유용함을 알았다. 그러나 본 연구가 카르복실말단이 효소의 활성에 영향을 주지 않고 외부로 노출되어 있음을 밝힌 것이기 때문에 히스티딘 태그에 국한된 것이 아니고 지금까지 밝혀진 모든 친화 태그의 사용이 가능하다.

<실시예 4> rEK _L -Ca-His의 특성 조사

본 발명자들은 rEK_L-Ca-His를 이용하여 융합단백질을 절단하고 또한 EK_L의 카르복실말단 또는 카르복실말단의 변형이 효소 활성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 형광을 내는 기질을 사용하여 재조합 EK_L,His-N-rEK_L및 rEK_L-Ca-His 세가지 플라스미드의 활성을 비교하였다.

효소 활성은 형광 분석법으로 측정하였고(Grant and Herman-Taylor,Biochim. Biophys. Acta., 1979, 16:207-215), 재조합 EK_L용액에서의 단백질 농도는 마이크로 BSA(bovine serum albumin) 분석으로 측정하였다. 구체적으로 70 mM Tris-HCl 및 10% DMSO의 혼합액(pH 8.0)에 용해시킨 50 uM 농도의 형광 기질 Gly-(Asp)₄-Lys-β-나프틸아미드 용액에 상기 효소를 첨가하였다. 형광은 337 nM에서 여기(excitation)되는 정도와 420 nM에서 방출되는 정도로 측정하였고 효소의 활성은 시간이 경과함에 따른 형광의 변화로부터 계산하였다

그 결과, rEK_L-Ca-His의 활성은 재조합 EK_L과 비슷하게 시간에 따라 증가하였으나, His-N-rEK_L은 감지할만한 활성을 검출할 수 없었다(도 5). 상기 결과에서 카르복실말단 보다는 아미노말단 잔기의 성질이 엔테로키나제 활성에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 재조합 EK_L의 아미노말단 아미노산 이소루이신이 단백질 구조내에서 결정적인 염 브리지(salt bridge)에 관여하고 따라서 아미노말단을 연장하는 것은 단백질의 활성을 억제하였다(Fehlhammer et al.,J. Mol. Biol., 1977, 11:415-438; Collins-Racie et al.,Bio/technology, 1995, 13:982-987). 사실 재조합 EK_L의 3차원적 구조는 카르복실말단 이소루이신 잔기가 염 브리지를 위한 단백질의 내부에 위치해 있고, 반면 카르복실말단 부위는 외부로 나와 있다(Lu et al.,J. Mol., Biol., 1999, 292:361-373). 상기 결과로부터, 이미 알고 있는구조와 아미노말단의 예상되는 역할이 일치함을 확인하였다.

<실시예 5> 아미노 말단이 변형된 엔테로키나제 돌연변이체 제조와 선별

His-N-rEK_L은 EK_L활성이 없어서(도 5참조) 엔테로키나제 경사슬의 아미노말단이 효소에 미치는 영향을 조사하기 위하여 먼저 아미노 말단이 변형된 엔테로키나제 돌연변이체 제조와 선별을 하였다. 엔테로키나제의 아미노 말단에 변형을 준 돌연변이 엔테로키나제 발현 플라스미드를 제조하였다. pIL20EK_L-Ca-His를 주형으로 하여 아미노 말단의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 것, 메티오닌을 덧붙인 것, 5개 아미노산과 (Asp)₄-Lys 부위를 삽입한 것, 아미노 말단 아미노산을 제거한 것을 중합효소연쇄반응을 이용하여 제조하였다. 각각의 돌연변이 제조에 사용된 프라이머 염기서열은 다음과 같다.서열번호 12로 기재되는 프라이머 1 은 안티센스 프라이머로 모든 돌연변이 제조에 동일하게 사용되었다. 아미노말단 아미노산(아이소루이신) 치환을 위해서열번호 13으로 기재되는 프라이머 2는 아미노 말단 아미노산의 코돈을 NNN으로 하여 프라이머를 제조하였다.서열번호 12및서열번호 13으로 기재되는 프라이머를 이용해 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 염기서열 분석을 통해 17가지 서로 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이 DNA를 얻었다. 아미노 말단에 메티오닌을 덧붙인 돌연변이는서열번호 12와서열번호 14로 기재되는 프라이머, 5개 아미노산과 (Asp)₄-Lys 부위를 삽입한 돌연변이는서열번호 12와서열번호 15로 기재되는 프라이머, 그리고 아미노 말단 아미노산을 제거한 돌연변이는서열번호 12와서열번호 16으로 기재되는 프라이머를 이용해 중합효소 연쇄반응을 실시하여 얻었다.

상기 PCR 수행을 통해 얻어진 DNA를 제한효소 BamHI, XbaI을 처리하여 pIL20 벡터에 T4 리가제를 이용하여 삽입하여서 각각의 돌연변이 발현벡터(pIL20Xi-EK_L(i=1-17), pIL20Metα-EK_L, pIL20Ex-EK_L, pIL20ΔIle-EK_L)를 제조하였다(도 6).

상기에서 제조한 각 발현벡터로 효모균주(Saccharomyces cerevisiae 2805)를 형질전환시켰다. 형질전환된 효모균주는 10 ㎖ SD Ura-배지(0.8 g/L Complete Supplement Media (BIO101), 6.7 g/L 아미노산이 없는 효모 질소염(DIFCO), 2% glucose)에 접종하여 30 ℃, 24시간동안 200 rpm 속도로 진탕배양 하였다. 배양액을 원심분리하여 펠렛을 다시 유도(induction) 배지(1% yeast extract, 2% Bacto-peptone, 2% galactose)에 다시 현탁시킨 후 30 ℃, 24시간 동안 200 rpm 속도로 진탕배양 하였다. 배양액을 원심분리하여 상층액만 모은 후 이를 이용하여 효소활성을 측정하였고, 웨스턴 블럿팅을 이용하여 발현정도를 알아보았다. 효소활성측정은 형광성 기질 Val-(Asp)₄-Lys-β나프틸아미드(naphtylamide, Sigma)를 이용하여 시간에 따라 형광을 띄는 β나프틸아민의 생성되는 정도를 형광 스펙트로포토미터를 이용하여 측정하였다. 25 mM Tris-HCl(pH 8.4), 10 mM CaCl₂, 10% DMSO 용액에 0.5 mM 기질을 섞고 여기에 배양 상층액을 넣고 넣는 순간부터 37℃를 유지시키면서 λex = 337 nm, λem = 420 nm 파장의 빛으로 5분간 형광이 증가되는 것을 측정하였다.

그 결과, 아미노 말단 아미노산을 치환한 17개 돌연변이와 메티오닌을 덧붙인 돌연변이, 5개 아미노산과 (Asp)₄-Lys 부위를 삽입한 돌연변이, 아미노 말단 아미노산을 제거한 돌연변이, 총 20개 돌연변이가 발현은 거의 다 되는 것으로 보이나 효소활성은 유전자 변형이 없는 엔테로키나제와 아미노 말단 아미노산이 발린으로 치환된 돌연변이에서만 볼 수 있었다(표 1).

본 발명자들은 상기 엔테로키나제 아미노말단이 이소루이신에서 발린으로 치환된 돌연변이 발현벡터를 "pIL20-I1VEK_L"이라 명명하고, 상기 발현벡터 pIL20-I1V-EK_L를 효모에 형질전환시킨 형질전환체를 제조하고, 이를 2002년 5월 21일 부로 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM 10382).

컨스트럭트	발현수준	활성	컨스트럭트	발현수준	활성
pIL20X1EKL(I1A)	+	-	pIL20X11EKL(I1M)	++++	-
pIL20X2EKL(I1R)	+	-	pIL20X12EKL(I1F)	++++	-
pIL20X3EKL(I1C)	+++	-	pIL20X13EKL(I1P)	+++	-
pIL20X4EKL(I1Q)	+++	-	pIL20X14EKL(I1S)	+	-
pIL20X5EKL(I1E)	+++	-	pIL20X15EKL(I1T)	++++	-
pIL20X6EKL(I1G)	+	-	pIL20X16EKL(I1Y)	++	-
pIL20X7EKL(I1H)	++	-	pIL20X17EKL(I1V)	++++	+++++
pIL20X8EKL(WT)	++++	+++++	pIL20Metα-EKL	++	-
pIL20X9EKL(I1L)	++++	-	pIL20Ex-EKL	++	-
pIL20X10EKL(I1K)	+++	-	pIL20ΔIle-EKL	++++	-

<실시예 6> I1V 돌연변이와 와일드타입 엔테로키나제의 특성 비교

본 발명자들은 엔테로키나제 아미노말단이 이소루이신에서 발린으로 치환된 I1V 돌연변이 엔테로키나제와 와일드타입 엔테로키나제의 효소활성을 분석하였다.

그 결과, 동일조건에서 얻은 I1V 돌연변이와 와일드타입 엔테로키나제를 효소활성을 비교하였을 때 거의 비슷한 활성을 나타내었다(도 7). 단백질의 온도에 따른 안정성을 알아보기 위하여 45 ℃, 65 ℃에서 시간에 따른 상대적 효소활성을 측정하여 보니 거의 비슷한 패턴을 보였다(도 8).

카르복실말단에 첨가된 6개의 히스티딘이 니켈과 흡착하는 성질이 있으므로 Ni-NTA 스핀 컬럼(Qiagen)을 사용하여 배양액으로부터 각 효소를 정제하였다. 배양액을 농축시킨 후 50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0) 완충액에 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸을 첨가한 용액에 투석시키고 Ni-NTA 스핀 컬럼에 통과시켰다. 흡착된 단백질을 위의 용액에 250 mM 이미다졸을 첨가한 용액으로 용출하였다. 정제된 두 단백질을 기질의 농도에 따른 활성을 비교하여 각 효소의K _m 값 및k _cat 값을 구하여 비교하였다(표 2).

효소	Origin	KM(mM)	k cat (s-1)	k cat /KM(M-1s-1)	참고문헌
정제된 엔테로펩티다제 (다이머)	Human	0.28	28.3	101000	(1)
정제된 엔테로펩티다제 (다이머)	Bovine	0.22	24.0	109000	(2)
정제된 엔테로펩티다제 (다이머)	Bovine	0.20	16.7	83000	(3)
L-BEK대장균에서 발현된 재조합 단백질	Bovine	0.61	42.7	70400	(4)
rEKL효모에서 발현된 재조합 단백질	Bovine	0.78	28.0	35897	본 발명
I1V 돌연변이 rEKL효모에서 발현된 재조합 단백질	Bovine	0.69	40	57971	본 발명

참고문헌 (1) Grant, D.A.W., and Hermon-Taylor, K. (1979) Biochim. Biophys. Acta 567; 207-215; (2) Lu, D. et al., (1997)J. Biol. Chem. 272; 31293-31300; (3) Mikhailova, A.G. and Rumsh, L. D. (1999)FEBS Letters442; 226-230; (4) Lu, D. et al., (1999)J. Mol. Biol. 292; 361-373

그 결과, I1V 돌연변이 엔테로키나제는 와일드 타입 엔테로키나제와 비교하여 효소 활성이 거의 유사하였다. 엔테로키나제를 대규모로 생산하기 위해서는 대장균을 이용한 생산이 가능하여야 하는데 대장균을 이용하여 발현할 경우 효소활성에 매우 중요한 아미노말단의 이소루이신이 메티오닌 아미노 펩티다제에 의해 잘 노출되지 않고 메티오닌이 덧붙여져 있어 효소활성을 잃게 된다. 그러나 메티오닌 아미노 펩티다제는 아미노말단에 발린으로 치환할 경우 용이하게 절단을 하는 성질을 가지고 있으므로 I1V 돌연변이 엔테로키나제는 대장균을 이용한 효소 대량 생산에 응용될 수 있다는 장점을 가지고 있다.

<실시예 7> rEK _L -Ca-His의 제거

본 발명자들은 rEK_L-Ca-His를 이용하여 융합단백질을 절단한 후 더 이상의 목적 단백질의 분해가 이루어지지 않도록 rEK_L-Ca-His를 제거하였다. 구체적으로, 분리된 단백질 1 ㎍을 500 ㎕의 버퍼(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole, pH 8.0)와 섞은 다음 니켈 NTA-스핀 컬럼에 로딩한 다음 700 g에서 2 분간 원심분리하여 용출액의 효소활성을 비교하였다.

그 결과, 카르복실말단 His-태그 rEK_L은 배양액에서 단일 단계로 니켈 친화 크로마토그래피로 제거되어 활성을 거의 보이지 않았으나 재조합 EK_L은 제거되지 않아 높은 활성을 보였다(도 9).

상기 결과로부터, 본 발명의 카르복실말단 His-태그 EK_L은 배양액으로부터 단백질을 생산하고 정제하는 하부과정(downstream process) 및 반응하는 동안의 효소의 회수 및 재활용에 사용되어 산물의 수득률을 극대화시키는데 유용하게 사용될 수 있다. rEK_L-Ca-His이 니켈 친화 컬럼에 고정되는 것은 공유결합이 아니고 가역적인 작용이다. 게다가 본 발명의 rEK_L-Ca-His은 친화 태그의 특이 방향이 컬럼 매트리스를 향하여 효소 활성 부위의 입체제한(steric hindrance)을 최소화함으로써 효소가 완전한 활성을 나타내는 것을 가능하게 한다.

따라서, 본 발명의 카르복실말단 친화 태그 엔테로키나제는 융합단백질 기술에서 매우 유용하게 사용될 수 있으며 여러 재조합 단백질의 생산 비용을 절감할 수 있다.

<실시예 8> EBA 방법을 이용한 rEK _L -Ca-His의 정제

본 발명자들은 EBA(Expanded bed adsorption) 방법을 이용하여 대량 배양된 효모 배양액으로부터 빠르고 간편하게 rEK_L-Ca-His 및 I1V-EK_L을 분리하였다. 구체적으로, 발효기를 이용하여 rEK_L-Ca-His 또는 I1V-EK_L을 발현하는 형질전환체를 대량으로 배양한 배양액에 20 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0)을 첨가하여 pH를 조정한 후 니켈 충전된(charge) 킬레이팅 세파로스 EBA 컬럼(Streamline 25, Amersham-Pharmacia Biotech Inc.)에 아래에서 위방향으로 통과시켰다(flow rate: 300 cm/hr). 50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸 용액으로 같은 방향으로 세척하고 50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0), 300 mM NaCl, 300 mM 이미다졸 용액을 반대방향으로 흘려주어 용출하였다. 약 87% 수율로 배양액에 있는 단백질을 효과적으로 얻을 수 있었다.

상기 방법은 배양액으로부터 세포를 침전시켜 제거하고 배양액으로 분비된 단백질을 농축하는데 드는 시간과 비용을 절약하며 농축과정에 있어서의 열 또는 거품 발생으로 인한 단백질 변성을 막을 수 있는 효과적인 방법이다. 이는 단일 단계로 단백질의 농축과 분리를 가능케 하고 또한 스케일 업(scale up)을 쉽게 하여 재조합 엔테로키나제 생산에 획기적인 발전을 한 것으로 판단된다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 엔테로키나제 경사슬의 카르복실말단 또는 아미노말단을 변형시킨 재조합 엔테로키나제 단백질은 단백질의 분리, 융합단백질의 절단 반응 후 쉽게 회수 및 제거될 수 있고 효과적인 컬럼 고정화가 가능할 뿐만 아니라 대장균에서 대량생산이 가능하므로, 융합단백질로부터 목적단백질을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (14)

1. 엔테로키나제 경사슬(enterokinase light chain)의 아미노말단 또는 카르복실말단이 변형된 재조합 엔테로키나제 단백질.
2. 제 1항에 있어서, 상기 카르복실말단이 변형된 재조합 엔테로키나제 단백질은 엔테로키나제 경사슬의 카르복실말단에 친화 태그(tag)를 추가하는 것을 특징으로 하는 재조합 엔테로키나제 단백질.
3. 제 2항에 있어서, 상기 친화 태그는 히스티딘(His) 태그, 헤마글루티닌(HA) 태그, 폴리 아르기닌(poly Arginine) 태그, 폴리 라이신(poly Lysine) 태그, 플래그(flag) 태그 및 myc 태그로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 엔테로키나제 단백질.
4. 제 3항에 있어서, 상기 재조합 엔테로키나제 단백질은서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 엔테로키나제 단백질.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노말단이 변형된 재조합 엔테로키나제 단백질은 엔테로키나제 경사슬의 아미노말단의 이소루이신이 발린으로 치환된 것을 특징으로 하는 재조합 엔테로키나제 단백질.
6. 제 5항에 있어서, 상기 재조합 엔테로키나제 단백질은서열번호 17로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 엔테로키나제 단백질.
7. 제 4항의 재조합 엔테로키나제 단백질을 코딩하는서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 포함하는 유전자.
8. 킬러 톡신 리더서열, 인터루킨 1β의 아미노말단 24 잔기의 유전자, KEX2 단백질 분해효소 절단 위치에 해당하는 유전자 및 상기서열번호 10으로 기재되는 유전자를 포함하는 발현벡터.
9. 제 8항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(수탁번호 : KCCM 10381).
10. 제 6항의 재조합 엔테로키나제 단백질을 코딩하는서열번호 18로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자.
11. 킬러 톡신 리더서열, 인터루킨 1β의 아미노말단 24 잔기의 유전자, KEX2 단백질 분해효소 절단 위치에 해당하는 유전자 및서열번호 18로 기재되는 유전자를 포함하는 발현벡터.
12. 제 11항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(수탁번호 : KCCM 10382).
13. 융합단백질을 절단하여 목적단백질을 제조하는 방법에 있어서, 제 1항의 재조합 엔테로키나제 단백질을 융합단백질에 첨가하여 반응시키고, 절단 반응이 끝난 후 반응액으로부터 재조합 엔테로키나제 단백질을 제거하여 목적단백질을 분리하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법.
14. 제 1항의 재조합 엔테로키나제를 발현하는 형질전환체를 배양하고, 상기 배양액으로부터 친화 태그를 이용하여 재조합 엔테로키나제를 분리하는 방법.