KR20030067935A - 올티프라즈를 포함하는 간경화(간경변증) 치료를 위한 간 조직 재생용 제약 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 5-(2-피라지닐)-4-메틸-1,2-디티올-3-티온 [5-(2-pyrazinyl)-4-methyl-1,2-dithiol-3-thione; 올티프라즈(oltipraz)]의 간경화 조직 재생제로서의 용도 및 올티프라즈를 주성분으로 함유하는 간경화 치료를 위한 간 조직 재생용 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 올티프라즈를 포함하는 제약 조성물은 경화된 간에서 간 조직의 재생을 촉진하며, 이를 통하여 간경화 치료 효과를 나타내는 효과적인 약제로서 임상적으로 사용이 가능하다.

Description

올티프라즈를 포함하는 간경화 치료를 위한 간 조직 재생용 제약 조성물 {Pharmaceutical Composition Comprising Oltipraz for Regeneration of Cirrhotic Liver}

본 발명은 5-(2-피라지닐)-4-메틸-1,2-디티올-3-티온 [5-(2-pyrazinyl)-4-methyl-1,2-dithiol-3-thione; 올티프라즈(oltipraz)]의 간경화 조직 재생제로서의 용도 및 이를 주성분으로 함유하는 간경화 조직 재생용 조성물에 관한 것이다.

간은 체외에서 들어온 물질 및 체내의 물질 대사에서 중추적인 역할을 담당하며 지속적으로 효소 반응 및 에너지 대사가 일어나는 생체기관이다. 현재 한국내의 만성적 질병 중에서 간염, 간경화 및 간암이 차지하는 비중은 순환기계 질환과 함께 가장 높은 것으로 나타나고, 질병으로 인한 사망 원인의 큰 비중을 차지하는 실정이다. 특히 만성적인 음주 또는 폭음은 높은 비율로 간 손상을 일으킨다. 바이러스 감염이나 음주에 의한 지속적인 간 조직의 손상은 간섬유화 및 간경화로 발전될 수 있다.

간경화는 간 실질세포의 소멸 및 결체조직의 축적을 증상으로 하는 사망률이 높은 만성 간질환이다. 간경화는 간염 등 만성 간질환 중 그 위험성이 가장 높다고 알려져 있으며, 손상된 간 조직이 정상적인 간세포로 복구되는 것이 아니라 콜라겐과 같은 섬유조직으로 변형되고, 동시에 간 실질세포가 소멸되어 간의 기능 및 크기가 상당히 위축된 상태를 칭한다. 간경화 상태가 지속될 때에는 사망에까지 이른다는 점에서 적절한 치료제의 개발은 신약개발의 중요한 과제가 된다. 그러나 현재까지 간세포 재생에 의하여 간경화를 치료하는 약물은 개발되지 않은 실정이다.

여러 합성 화합물 및 생약제 등 다양한 물질들이 시험관내 또는 생체 내에서 간 보호 작용을 나타낸다. 실리마린 및 비테인이 여기에 속하는데 그 작용 기전은 시토킨의 억제나 글루타치온의 증가로 알려져 있으나, 그 효과가 적다는 단점 때문에 치료 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.

십자화과에 속하는 채소류에 천연으로 존재하는 황 함유 화합물인 디티올디티온의 몇몇 치환체들은 간 보호 효과가 있는 것으로 알려졌으며, 이 중 올티프라즈는 1980년대 초에 주혈흡충(schistosomiasis) 치료제로 사용된 약으로 다음 구조식을 갖는다.

이 약물은 생체의 여러 조직에서 세포내 티올 함량을 증가시키고 글루타치온 풀[(glutathione(GSH) pool]의 유지에 관련된 효소 외에 친전자성 물질의 해독화 과정에 관여하는 효소의 발현을 유도/증가시킨다. 올티프라즈에 의하여 그 활성이 증가하는 효소로서는 NAD(P)H 퀴논 리덕타제, 마이크로소말 에폭사이드 하이드롤라제(microsomal epoxide hydrolase), 글루타치온 S-트랜스퍼라제 (GST) 및 UDP-글루쿠로닐트랜스퍼라제 (GT) 등을 들 수 있으며, 이중 GST는 사염화탄소 또는 아세트아미노펜과 같은 독성 물질에 의한 간독성을 방어한다 (Ansher SS, Dolan P and Bueding E. Chemoprotective effects of two dithiolthiones and of butylhydroxyanisole against carbon tetrachloride and acetaminophen toxicity. 1983 Hepatology 3, 932-935).

또한, 올티프라즈는 벤조[a]피렌, NDEA 및 우라실 머스타드(uracil mustad)에 의한 발암 과정을 억제하고, 아플라톡신 B1(aflatoxin B1)에 의한 간암 발생, 아족시메탄(azoxymethane)에 의한 대장암 발생도 억제하는 것으로 나타났다 (Bolton MG, Munoz A, Jacobson LP, Groopman JD, Maxuitenko YY, Roebuck BD and Kensler TW. Transient intervention with oltipraz protects against aflatoxin-induced hepatic tumorigenesis. 1993 Cancer Res. 53, 3499-3504).

올티프라즈의 발암 억제 기전으로 다음과 같은 몇 가지를 들 수 있다. 첫째 중요한 체내 항산화물질인 환원형 GSH의 조직내 수준을 증가시킨다. 둘째, 제1상 (phase I) 효소 (예, cytochrome P450)를 억제하여 발암물질의 활성화를 억제한다. 셋째, 제2상 (phase II) 대사효소 (예, GST, UDP-GT)를 유도하여 발암물질의 해독화 과정을 촉진시킨다. 넷째, 시험관내에서 인간의 면역 억제 바이러스 type I의 복제를 억제한다. 다섯째, 세포내 티올을 증가시켜 반응성 중간체를 제거하고 DNA 수복 과정을 증대시킨다. 이미 올티프라즈는 생체 대부분의 조직에서 GSH 양을 증가시켜 방사선이나 제노바이오틱스(xenobiotics)에 의하여 생성되는 유리 라디칼을 제거하거나 방사선 손상에 대한 생체 적응 반응으로서 세포의 항상성 유지에 기여하여 방사선 보호 효과를 나타내는 것으로도 보고된 바 있다.

이상의 작용 기전을 갖는 올티프라즈는 실제 중국인을 대상으로 수행된 간암발생 억제에 대한 임상시험에서 약한 보호 효과가 나타났으며, 독성물질에 의한 간 독성을 중등도 이상 억제하는 것으로 잘 알려져있다.

또한, 올티프라즈는 쥐 및 개에 대한 독성 시험에서 그 안전성이 입증된 바 있다 (Fund Appl Toxicol 1997 Jan, 35(1):9-21).

최근 간 조직 내의 대식쿠퍼세포와 이토세포에서 유리되는 시토킨인 형질전환 성장 인자-베타[Transforming growth factor-beta (TGF-β)]가 간 섬유화의 중요한 매개물로 밝혀졌다. 또한, TGF-β의 항체, 안티센스 RNA, 세포의 TGF-β수용체 변형을 통하여 TGF-β의 작용을 차단하였을 때에는 간 섬유화 과정이 현저히 억제된다고 보고되었다. 본 발명자들은 올티프라즈가 TGF-β발현을 억제함으로써 간 섬유화 및 간경화의 진행을 차단한다는 것을 한국 특허 제2001-10686호에서 규명하였다.

그러나, 상기 한국 특허 출원은 올티프라즈가 간섬유화를 예방 및 치료하고 간경화의 진행을 억제하는 효과를 갖는다는 사실만을 제시하였을 뿐이며, 간경화 상태의 간세포 재생에 효능을 갖는 화합물을 제시한 문헌은 현재까지 존재하지 않는다. 따라서, 간 조직의 생리적 특성 및 중요성을 고려할 때 궁극적으로 간경화 치료에 응용할 수 있는 의약의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 이미 경화가 일어난 간 조직의 재생에 우수한 효과를 보이는 제약 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 올티프라즈 투여에 의한 간경화 래트의 생존율 증가를 보여주는 그래프.

도 2는 간경화 래트의 간 조직 사진과 올티프라즈 투여군의 간 조직 사진(Masson's Trichrome 염색).

도 3a는 올티프라즈 투여에 의한 간경화 래트의 복수 감소를 보여주는 그래프.

도 3b는 올티프라즈 투여에 의한 간경화 래트의 혈장 알부민 증가를 보여주는 그래프.

도 4a는 올티프라즈 투여에 의한 간경화 래트의 간 조직 중량 증가를 보여주는 그래프.

도 4b는 간경화 래트에 올티프라즈를 투여할 때 나타나는 간세포 분열을 보여주는 사진.

도 5a는 간경화 래트에 올티프라즈를 투여할 때 간세포의 분열 및 재생을 보여주는 간 조직 사진 (PCNA 염색).

도 5b는 경화 간 조직에서 올티프라즈에 의한 미분화 줄기세포의 분화 촉진을 보여주는 간 조직 사진 (상단: Thy1.1 염색, 하단: Flt-3 염색).

도 6a는 간경화 래트에서 올티프라즈 투여에 의한 간 조직 중 c-Met 발현의 증가를 보여주는 전기영동 사진.

도 6b는 간경화 래트에서 올티프라즈 투여에 의한 간 조직 중 C/EBP-β의 활성형인 LAP의 증가와 간증식 억제 인자인 LIP의 감소 및 C/EBP-α발현의 회복을 보여주는 전기영동 사진.

도 7a는 1차 배양 간세포에 직접적으로 올티프라즈를 처치할 경우 간세포의 핵내 C/EBP-β의 양이 경시적으로 증가함을 보여주는 전기영동 사진.

도 7b는 간세포주에 올티프라즈를 처치할 경우 C/EBP-β가 세포의 핵내로 이동하는 것을 보여주는 면역화학적 세포사진.

본 발명자들은 간경화 환자를 궁극적으로 치료하기 위해서는 간경화의 진행을 억제할 뿐 만 아니라 경화된 간 조직을 복구 및 재생시키는 작용이 필요하다는 사실에 착안하여 임상에 응용할 수 있는 부작용이 낮은 경화된 간 조직 재생용 제약 조성물을 개발하고자 연구를 거듭하여 올티프라즈가 간경화 상태의 간세포를 재생하는 효능을 갖는다는 것을 규명하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 이러한 올티프라즈의 효능에 기초하여 올티프라즈를 주성분으로 함유하는 간경화 치료를 위한 간 조직 재생용 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 올티프라즈를 포함하는 제약 조성물은 경화된 간에서 간세포의 재생을 촉진하며, 이를 통하여 간경화 치료 효과를 나타내는 효과적인 약제로서 임상적으로 사용이 가능한 조성물이다.

본 발명자들은 한국 특허 제2001-10686호에서 올티프라즈가 TGF-β발현을 억제함으로써 간 섬유화를 예방 및 치료하고, 나아가 간경화의 진행을 억제한다는 사실을 밝힌 바 있다.

그러나, 상기 한국 특허 출원은 올티프라즈가 간 섬유화 및 간경화 진행을 억제한다는 것만을 제시하는 것으로서, 본 발명에 의해 처음으로 밝혀진 바와 같이, 올티프라즈가 간경화 상태에서의 간세포 재생에 우수한 효능을 갖는다는 것에 대해서는 언급하거나 제시하지 않았다.

간경화 상태는 간의 기능 뿐만 아니라 실질세포인 간세포의 소멸로 간 조직의 크기 자체가 작아진 상태이므로 간세포의 재생 없이는 간경화의 궁극적인 치료가 불가능하다. 본 발명은 올티프라즈가 간세포의 증식 및 분열을 자극하여 간경화에 의해 위축된 간 조직을 재생 및 복구시키는 효과를 갖는다는 것을 규명하여 올티프라즈를 투여함으로서 간세포를 재생시키고 이에 의해 간경화를 치료할 수 있다는 것을 처음으로 밝힌 것이다.

올티프라즈가 간세포 재생능을 갖는다는 것은 이하에서 설명하는 바와 같이 본원 발명에서 실시된 실험에서 입증되었다.

본 발명에서는 디메틸니트로사민 (dimethylnitrosamine, DMN)을 4주간 투여하여 간경화 또는 간 섬유화로 된 래트 모델을 제작하고, 이들 래트에 올티프라즈를 투여하여 래트의 사망률, 간경화 치료 및 간 조직 재생 효과를 관찰하였다. 그결과, 간경화 래트의 생존율은 경시적으로 감소하지만, 올티프라즈를 투여한 후에는 통계적으로 유의성있게 래트의 생존율을 증가시킴이 입증되었다. 또한, 간경화시 혈장내 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 활성이 증가한 데 비하여, 올티프라즈를 처치할 때 혈장내 AST 활성 증가가 감소하였다.

혈장내 알부민 함량은 간기능의 대표적인 지표 중의 하나일 뿐만 아니라, 혈장 삼투압의 조절에 있어서 필수적이다. 올티프라즈는 간경화 래트에서 현저히 감소된 혈장 알부민을 정상 수준으로 회복시키고, 나아가 혈장 삼투압을 정상화시켜서 간경화시에 생성되는 복수를 현저히 감소시키는 치료 효과를 보인다.

조직 검경에 의한 섬유화 수치(fibrosis score) 및 노델 수치(Knodell score) 평가 소견에 따르면 간경화시 간 문맥 주변에 다량의 섬유소가 축적되고 염증 부위가 관찰되었으나, 올티프라즈를 투여한 간경화 동물에서는 이같은 경화성 간병변이 탁월하게 치료되었다.

이러한 간경화 치료 효능 이외에도, 올티프라즈 투여군에서는 간경화로 위축되었던 간의 무게가 증가하였으며, 조직병리학적 검경 분석에 따르면 간경화 조직에서 간세포의 분열 현상이 빈번히 관찰되었다. 또한 세포의 증식 주기에만 나타나는 증식세포 핵항원 (proliferating cell nuclear antigen, PCNA)을 면역화학적으로 염색한 후 조직을 검경할 때, 올티프라즈를 투여한 간경화 래트에서 PCNA 양성 간세포의 수가 현저히 증가하였다. 이 같은 PCNA 단백질 발현의 증가는 웨스턴 블롯에 의해서도 증명되었다.

또한, 간세포의 증식과 관련된 간세포 성장인자 (HGF)의 수용체인 c-Met, 간세포 증식 관련 전사인자 (Liver-enriched activating protein, LAP)인 CCAAT/인핸서 결합 단백질-β (C/EBP-β)는 간경화 래트에서 그 발현이 감소하였으나, 올티프라즈를 투여한 후에 회복되었다. 반면, 간경화에 의하여 증가한 간내 증식억제 인자(Liver-enriched inhibitory protein, LIP)인 C/EBP-β 절단동종형(truncated isoform)의 발현은 올티프라즈 투여로 감소하였다.

간내 미분화 줄기세포를 염색하였을 때 간경화 래트의 간 조직 내에는 줄기세포가 많이 관찰되었으나, 올티프라즈를 투여한 간경화 래트에서는 간 조직내 줄기세포의 수가 현저히 줄었다. 이 같은 결과는 올티프라즈에 의하여 간내 미분화 줄기세포의 간세포로의 분화가 촉진되었음을 지지한다.

따라서, 본 발명의 제약 조성물에 활성 성분으로 포함되는 올티프라즈의 간경화 치료 효능은 이 약물에 의한 간세포의 분열 및 증식 증가를 수반한 간 조직의 재생에 의한 것이다.

실제로 사용할 때 본 발명의 제약 조성물은 바람직하게는 약제학적인 분야에서 통상적인 방법에 따라 경구 투여에 적합한 단위 투여형의 제제, 주사제, 시럽제 등의 형태로 제형화시켜 투여한다.

적합한 경구 투여용 제형에는 경질 및 연질 캅셀제, 정제, 산제 등이 포함된다. 이러한 경구투여용 제제에는 약물학적 활성 성분인 올티프라즈 이외에 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 불활성인 통상적인 담체, 예를 들면 전분, 락토스, 카복시메틸셀룰로오즈, 카올린 등의 부형제, 물, 젤라틴, 알코올, 글루코즈, 아라비아 고무, 트라가칸타 고무 등의 결합제, 전분, 덱스트린, 나트륨 알기네이트 등의붕해제, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 유동 파라핀 등의 활탁제와 같은 추가의 첨가제 성분들이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 간경화 정도, 발병 시기, 연령, 건강 상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 올티프라즈 10 내지 1000 mg, 바람직하게는 50 내지 300 mg을 1일 1 내지 2회 분할하여 투여한다. 그러나, 간 손상의 정도가 심한 환자의 경우 본 발명의 제약 조성물을 상기 범위를 벗어나는 대용량까지 증량하여 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 제약 조성물은 경화된 간에서 올티프라즈의 우수한 세포 재생 능력을 통하여 치료 효과를 제공하며 약물에 의한 독성 및 부작용도 거의 없어 장기간 복용할 때에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

이하 실험예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.

실험예

하기 실험예에는 6주령의 체중 140 - 160 g의 스프라그-돌리 (Sprague-Dawley) 래트를 실험 동물로써 사용하였다.

<실험예 1> 간경화 동물의 생존율

래트에 디메틸니트로사민 [dimethylnitrosamine (DMN)] 10 ㎍/kg을 주 3회씩 4주 동안 투여하여 간경화 동물 모델을 확립하였다. 이때 간경화 상태에 이르지 못하고 간 섬유화만을 나타내는 일부 동물을 별도의 실험군으로 분류하였으며, 이들 간경화 래트 및 간섬유화 래트의 4주간 생존율을 관찰하였다.

간경화 동물은 시간이 지남에 따라 생존율이 감소하여 4주 후에는 48%로 되었고, 올티프라즈 30 mg/kg을 주 3회씩 투여한 간경화 래트에서는 생존율이 83%로 증가하여 통계적으로 유의성 있는 생존율 개선 효과가 관찰되었고, 간 섬유화 래트의 경우에는 사망하는 동물이 관찰되지 않았다 (도 1).

<실험예 2> 간경화 개선 효과 - 조직 표본

올티프라즈에 의한 간경화 치료 효과를 조직병리학적으로 관찰하였다. 간경화 래트의 간 조직에서는 상당히 많은 양의 섬유소원이 혈관을 중심으로 축적되었고, 섬유소원의 축적으로 인하여 결절 (nodule)이 형성되는 것이 관찰되었으나, 간경화 래트에 올티프라즈(1회 15 내지 30 mg/kg 체중, 주 3회씩 4주간 경구 투여)를 투여했을 때 축적된 간 조직의 섬유소가 약물용량 의존적으로 감소하였다.

간경화의 치료 효과는 조직병리학적 지표인 마슨스 트리크롬(Masson's trichrome) 염색법에 따라 염색한 후 섬유화 수치로 계량화하였으며, 간 조직의 염증과 섬유화 정도를 계량적으로 반영한 병리학적 지표인 노델 수치로도 평가하였다 (도 2, 표 1). 올티프라즈를 15 내지 30 mg/kg의 용량으로 투여했을 때 간경화의 효과적인 치료가 관찰되었다.

도 2에서, A는 정상 래트의 간 조직 사진이고, B는 간경화 래트의 간 조직 사진이고, C는 올티프라즈 15 mg/kg을 주 3회씩 4주간 후처치한 간경화 래트의 간 조직 사진이고, D는 올티프라즈 30 mg/kg을 주 3회씩 4주간 후처치한 간경화 래트의 간 조직 사진이다.

올티프라즈에 의한 간경화 치료 효과

군	섬유화 수치	노델 수치
대조군	0	0
간경화 래트	3.8 ± 0.2	14.0 ± 0.8
간경화 래트 + 올티프라즈15 mg/kg	2.9 ± 0.4	8.7 ± 1.1**
간경화 래트 + 올티프라즈30 mg/kg	2.8 ± 1.1*	6.8 ± 2.5**
간섬유화 래트	2.2 ± 0.5 a	6.0 ± 1.2 a
간섬유화 래트 + 올티프라즈15 mg/kg	2.8 ± 0.4	7.0 ± 1.2
간섬유화 래트 + 올티프라즈30 mg/kg	1.0 ± 0.0**	2.6 ± 0.4*

상기 표에서, 각 수치는 평균 ±표준오차로 표시하였고, 사용한 동물수는 5 - 10이었다. 각 실험군간 유의성은 스튜던트 티 테스트에 의한 분석(paired Student's t-test)으로 표시하였다. 유의성 표시는 간경화 래트나 간섬유화 래트에 비하여 *p<0.05, **p<0.01로 표시하였고 간 섬유화 래트는 간경화 래트에 비하여 유의성있게 섬유화 수치와 노델수치가 낮았다 (a, p<0.05). 섬유화 정도는 0=정상, 1=약한 섬유조직 발견, 2=경등도 섬유조직 발견, 3=뚜렷한 섬유조직 발견, 4=심한 섬유화 진행으로 표시하였다. 노델 수치는 간조직 말단의 가교상 형성 (최고=10), 엽내 세포 소실 (최고=4), 간내 염증 (최고=4), 섬유화 (최고=4)의 합산 점수로 표시하였다.

<실험예 3> 간경화 동물의 혈액생화학적 지표

간경화 래트에서는 정상 동물에 비하여 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 활성이 각각 3-4배 증가하였다. 간경화 래트에 올티프라즈를 15 mg/kg 용량으로 4주간 주 3회 투여했을 때 혈장내 ALT 및 AST 활성이 상기 간경화 래트에 비하여 감소하는 경향을 보였으며, 30 mg/kg을 투여한 경우에는 AST 수치가 통계적으로 유의성 있게 약 70% 억제되었다 (표 2).

혈장내 빌리루빈(bilirubin) 함량은 간 기능의 대표적인 지표로 이용된다. 간경화 래트에 올티프라즈를 처치한 결과, 간경화에 의해 증가한 혈장내 총 빌리루빈 함량이 올티프라즈 투여 후에 감소하는 경향을 나타냈다. 혈장내 총 콜레스테롤 수치는 간경화 동물에 대한 올티프라즈 처치에 의해서 유의성 있는 변화를 보이지 않았다 (표 2).

ALT, AST, 빌리루빈 및 혈장 총 콜레스테롤 수치

군	ALT	AST	빌리루빈	콜레스테롤
대조군	55 ±4	141 ±18	1.1 ± 0.1	97 ±6
간경화 래트	138 ± 14*	275 ±36*	2.7 ±0.8	152 ±30
간경화 래트 + 올티프라즈15 mg/kg	124 ±47	206 ±24	1.8 ±0.4	116 ±9
간경화 래트 + 올티프라즈30 mg/kg	110 ± 39	185 ± 22#	1.4 ± 0.2	104 ± 7

각 수치는 평균 ±표준오차로 표시하였고, 사용한 동물수는 8 - 11이었다. 각 실험군간 유의성은 스튜던트 티 테스트에 의한 분석(paired Student's t-test)으로 표시하였다. 유의성 표시는 대조군에 비하여 * p<0.05, 간경화 래트에 비하여^#p<0.05로 표시하였다.

<실험예 4> 혈장 알부민 수치 및 복수 생성에 미치는 올티프라즈의 효과

간경화의 대표적 임상 증상으로 복수를 들 수 있다. 간경화 래트(10마리)에서 복수 생성율을 복수 생성 지표 (0=복수가 전혀 관찰되지 않음, 1=장기 사이에 소량의 복수 관찰됨, 2=개복시 축적된 복수가 체외로 흐르는 것을 육안으로 관찰 가능, 3=개복시 축적된 복수가 체외로 분출되는 것을 관찰 가능)로 관찰한 결과, 간경화 래트의 경우 그 수치가 1.7로 나타났고, 올티프라즈를 15 mg/kg 및 30 mg/kg 투여했을 때 그 수치가 각각 0.9 및 0.4로 현저히 개선됨을 관찰할 수 있었다 (도 3a).

간경화에 의한 복수의 생성은 간 조직에서 합성되는 혈장 단백질(특히 알부민)의 생성 감소에 따른 혈장 삼투압 평형의 교란 때문이다. 간경화 래트에서는 혈장 알부민 함량이 현저히 감소하였으며, 간경화 래트에 올티프라즈 30 mg/kg을 주3회씩 4주간 투여했을 때 알부민 수치가 정상 수준으로 회복되었다 (도 3b).

<실험예 5> 간경화 래트에서 올티프라즈에 의한 간 조직 재생 효과

간경화시에는 간 기능의 저하와 함께 간 조직의 위축이 일어난다. 본 실험예에서 10마리의 간경화 래트의 간 무게는 정상 래트의 약 56%로 감소하였고, 올티프라즈 15 또는 30 mg/kg을 주3회씩 4주 투여한 간경화 동물의 간 무게는 거의 정상 수준으로 유의성있게 회복되었다 (도 4a). 반면, 신장의 무게는 전 실험 동물군에서 유의성 있는 변화를 보이지 않았다 (도 4a 상단). 간경화는 체중 감소를 수반하므로, 실험 결과의 표준화를 위하여 본 실험예에서는 간경화에 의하여 영향받지 않는 뇌를 사용하여 장기의 상대적 무게를 계량화하여 평가하였다.

상기 간경화 래트에 올티프라즈를 30 mg/kg으로 주 3회씩 4주간 경구투여했을 때 실제 분열하는 간세포를 현미경적으로 관찰할 수 있었다. 도 4b (좌측)는 간경화 래트에 올티프라즈를 투여한 후 적출한 간 조직을 마슨스 트리크롬을 사용하여 염색한 사진으로서 정상 조직 또는 경화 간 조직에서는 거의 관찰되지 않는 세포분열 모습을 뚜렷하게 보여준다. 핵을 선택적으로 염색하는 Nuclear Fast Red를 사용하여 염색한 경우에도 올티프라즈를 투여한 간경화 래트에서 분열 세포 및 염색체의 이동을 관찰할 수 있었다 (도 4b 우측).

PCNA 면역화학적 염색법은 세포의 증식 유무를 동물 모델에서 판단할 때 보편적으로 사용되는 실험법이다. PCNA는 안정한 세포 주기 관련 핵 단백질 (36 kDa)로서 G1 후기 및 S기의 분열 세포에서 발현되고 세포 증식의 지표로 사용된다. (Kawamura K, Kobayashi Y, Tanaka T, Ikeda R, Fujikawa-Yamamoto K, Suzuki K. Intranuclear localization of proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle in renal cell carcinoma. 2000 Anal Quant Cytol Histol 22, 107-113.).

PCNA 면역화학적 분석은 PCNA에 대한 특이항체 (Santa Cruz Biotech)를 사용하여 수행하였다. 분석은 간접 아비딘-비오틴-알칼린 포스파타제 기술 (InnoGenex)을 제조자가 제공한 프로토콜에 따라 실시하였다. 정상 래트, 올티프라즈로 처리되지 않은 간경화 래트 및 올티프라즈를 30 mg/kg 용량으로 주 3회씩 4주간 경구투여한 간경화 래트의 간 조직 절편을 슬라이드 상에서 탈파라핀화한 후 실온에서 수화시켰다. 차단용 혈청을 사용하여 비특이적 항체 결합을 방지하였다.이어서, 절편을 가습 챔버에서 실온에서 30분 동안 항체와 함께 인큐베이션하였다. 항체와 인큐베이션한 후에 0.1% Tween-20을 함유하는 인산 생리 식염 완충액 (PBS)으로 슬라이드를 세척하였다. 절편에 비오티닐화 2차 항체를 가한 후 37℃에서 5분 동안 반응시키고, 스트렙타비딘-알칼린 퍼옥시다제 복합체를 가하여 37℃에서 5분 동안 추가로 반응시켰다. 5-브로모-4-클로로-3-인도일포스페이트(BCIP) 및 니트로블루 테트라졸륨 (NBT)을 포스파타제의 기질로 사용하여 슬라이드 상의 시료를 적합한 색상이 가시화될 때까지 인큐베이션한 후, 절편을 Nuclear Fast Red로 다시 염색하였다.

이와 같은 PCNA 면역화학적 염색 방법으로 시험한 결과, 정상 동물에서는 PCNA 양성 세포가 관찰되지 않았으나, 간경화 동물에서는 혈관 섬유소 부근에 양성 반응을 보였다. 올티프라즈를 투여한 간경화 래트에서는 PCNA 양성 세포가 간 조직 표본 전범위에서 광범위하게 관찰되어 약물을 투여하지 않은 간경화 래트에 비하여 약 2배 이상 많았다 (도 5a).

정상 래트, 올티프라즈로 처리되지 않은 간경화 래트 및 올티프라즈를 30 mg/kg 용량으로 주 3회씩 4주간 경구투여한 간경화 래트의 간 핵분획을 소듐도데실설페이트 (SDS)를 함유하는 시료 희석용액으로 용해하여 시료를 제조한 후, -70℃에서 보관하였다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시한 후, 면역블롯 분석을 수행하였다. 시료를 12% 겔 전기영동에 의해 분획화시키고, 니트로셀룰로스 막에 전기적으로 이송하였다. 니트로셀룰로스 막을 폴리클로날 마우스 항-PCNA 항체 (1:1000) (Santa Cruz Biotech)와 함께 인큐베이션한 후, 홀스래디쉬 퍼옥시다제가컨쥬게이션된 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 최종적으로, 아머샴사의 이씨엘 형광 발색 키트를 사용하여 현상하였다.

이와 같은 웨스턴 블롯으로 PCNA 발현을 관찰할 때에도 올티프라즈를 투여한 간경화 동물의 간 조직에서는 대조군 및 약물을 투여하지 않은 간경화 래트에 비해 36 kDa의 PCNA 밴드가 크게 증가하여 PCNA 발현이 현저히 증가함을 알 수 있었다 (도 5a).

간 조직을 재생하는 세포는 줄기세포에서 기원하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 줄기세포 특이적 표면 단백질인 Thy1.1과 Flt-3 (Santa Cruz Biotech)를 상기 PCNA 면역화학적 염색 방법과 유사한 방법으로 염색하여 간경화시 출현하는 간 조직 중 줄기세포의 분포를 관찰하였다. 정상 래트에서는 이들 항원에 대하여 양성인 세포가 전혀 관찰되지 않았으나, 간경화 래트의 간 조직에서는 다수의 Thy1.1과 Flt-3 양성 세포가 관찰되었다 (도 5b). 올티프라즈를 30 mg/kg 용량으로 주 3회씩 4주간 경구투여한 간경화 래트의 간 조직 중 Thy1.1과 Flt-3 양성 세포는 간경화 래트에 비하여 현저히 감소하였다 (도 5b). 이 결과는 간경화 래트에서 발생한 미분화 줄기세포를 올티프라즈가 간세포로 분화를 촉진하므로써 발생한 현상으로 해석된다.

<실험예 6> 간경화로 억제된 c-Met 발현에 대한 올티프라즈의 효과

c-Met는 간세포 성장 인자 (HGF)의 수용체로서 간세포 증식 및 분화에 작용하며, 간경화시에 c-Met의 발현이 하향 조절된다 (도 6a). c-Met가 적절하게 발현되지 않으면, HGF 존재시에도 간 조직이 재생되지 않는다.

올티프라즈를 30 mg/kg 용량으로 주 3회씩 4주간 경구투여한 결과, c-Met 발현 수준이 올티프라즈를 투여하지 않은 간경화 래트에 비해 현저하게 증가하였다. 이 실험 결과는 올티프라즈가 경화된 간조직을 재생하는 현상과 일치한다 (도 6a).

<실험예 7> C/EBP 단백질의 핵내 이동에 대한 올티프라즈의 효과

간세포의 증식에 관련된 전사인자 중 핵심적인 것은 C/EBP 패밀리인 C/EBP-β 및 C/EBP-α이고, 그 중에서도 C/EBP-β가 간세포의 증식에 가장 중요한 것으로 인정된다. 실제로 C/EBP-β 유전자를 제거한 생쥐에서는 부분 간 절제술시 간 크기의 회복이 현저히 감소된다 (Greenbaum LE, Li W, Cressman DE, Peng Y, Ciliberto G, Poli V, Taub R., CCAAT enhancer-binding protein beta is required for normal hepatocyte proliferation in mice after partial hepatectomy. J Clin Invest. (1998) 102:996-1007).

간 재생 조절을 위한 표적으로서의 C/EBP의 중요성 측면에서, 본 실험예에서는 올티프라즈를 30 mg/kg 용량으로 주 3회씩 4주간 경구투여한 간경화 래트에서 C/EBP-β및 C/EBP-α의 발현 정도를 측정하였다. 간경화 래트에서 그 발현이 저하된 C/EBP-β(간 활성화 단백질, LAP)의 발현은 올티프라즈를 투여함으로써 증가하였다. 간경화 래트에서 그 발현이 증가한 C/EBP-β의 절단 동종형인 간증식 억제 단백질 (LIP)은 올티프라즈를 30 mg/kg 용량으로 주 3회씩 4주간 경구투여 하였을 때 거의 완벽하게 억제되었다. 정상적인 래트의 간에서 발현되는 C/EBP-α는 간경화로 인하여 현저히 억제되었지만, 간경화 래트에 올티프라즈를 30 mg/kg 용량으로 주 3회씩 4주간 경구투여 하였을 때 C/EBP-α의 발현은 현저히 회복되었다 (도6b).

올티프라즈를 투여한 간경화 래트에서 C/EBP가 활성화되는 것을 발견하였으므로, 다음 실험예에서는 1차 배양 간세포에서 핵내로 이동된 C/EBP의 양을 웨스턴블롯으로 정량함으로써 올티프라즈가 직접적으로 간세포의 C/EBP 활성에 영향을 미치는지를 실험하였다. 1차 배양 간세포에 올티프라즈를 30 μM 농도로 처치하였을 때, 간세포의 핵내 C/EBP-β와 C/EBP-α의 양이 경시적으로 증가하였다 (도 7a). 그러나, 간경화 쥐에서 분리된 간세포에 올티프라즈를 처치할 때에는 별다른 변화가 관찰되지 않았다. 따라서, 이 결과는 올티프라즈가 직접적으로 간세포의 C/EBP를 활성화시키는 것을 증명한다.

다음으로는 실제 올티프라즈가 핵내로 C/EBP-β이동을 촉진시키는 지를 알아보기 위하여 래트 간세포주에 올티프라즈를 30 μM 농도로 6시간 동안 처치하였다. 면역화화적 세포사진 분석법에 따르면, 올티프라즈는 핵내로의 C/EBP-β이동을 현저히 증가시켰다 (도 7b).

따라서, 올티프라즈에 의한 경화된 간 조직의 재생은 C/EBP의 활성화를 매개로 한다.

이상의 실험예에서 입증된 바와 같이, 올티프라즈는 경화된 간 조직의 재생에 대해 매우 우수한 효과를 갖기 때문에, 본 발명의 올티프라즈를 포함하는 제약 조성물은 간경화 상태의 간 조직의 재생 및 이에 따른 간경화 치료에 탁월한 효능을 보일 수 있다.

<실시예 1>

올티프라즈 25 mg

유당 50 mg

전분 10 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조 방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<실시예 2>

올티프라즈 100 mg

유당 50 mg

전분 10 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조 방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<실시예 3>

올티프라즈 250 mg

유당 50 mg

전분 10 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 전분의 제조 방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<실시예 4>

올티프라즈 25 mg

유당 30 mg

전분 28 mg

탈크 2 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 캅셀제의 제조 방법에 따라서 젤라틴 경질캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

<실시예 5>

올티프라즈 100 mg

유당 30 mg

전분 28 mg

탈크 2 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캅셀제의 제조 방법에 따라 젤라틴 경질캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

<실시예 6>

올티프라즈 250 mg

이성화당 10 g

설탕 30 mg

나트륨 CMC 100 mg

레몬향 적량

정제수 적량 가하여 전체 100 ml

상기의 성분을 통상의 현탁제의 제조 방법에 따라 현탁제를 제조하고 100 ml용량의 갈색병에 충진하고 멸균하여 현탁제를 제조하였다.

<실시예 7>

올티프라즈 500 mg

이성화당 20 g

설탕 20 g

나트륨 알지네이트 100 mg

오렌지향 적량

정제수 가하여 전체 100 ml

상기의 성분을 통상의 현탁제의 제조 방법에 따라 현탁제를 제조하고 100 ml용량의 갈색병에 충진하고 멸균하여 현탁제를 제조하였다.

<실시예 8>

올티프라즈 250 mg

유당 30 mg

전분 20 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 긴밀히 혼합하고 폴리에틸린이 코팅된 포에 충진한 후 밀봉하여 산제를 제조하였다.

<실시예 9>

연질캅셀제 1정중 함량

올티프라즈 100 mg

폴리에틸렌글리콜 400 400 mg

농글리세린 55 mg

정제수 35 mg

폴리에틸렌글리콜과 농글리세린을 혼합한 다음 정제수를 투입하고 이 혼합물을 약 60°C로 유지한 상태에서 올티프라즈를 넣고 교반기로 약 1,500 rpm으로 교반하면서 균일하게 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 서서히 교반하면서 실온으로 냉각하고 진공펌프를 사용하여 기포를 제거하여 연질캅셀에 충진하였다.

연질캅셀의 피막은 일반적으로 널리 알려진 젤라틴, 가소제의 소프트 처방으로 하여 1캅셀당 젤라틴 132 mg, 농글리세린 52 mg, 디소르비톨액 70% 6 mg 및 착향제로서 에틸바닐린 적량, 코팅기제로서 카르나우바납을 사용하여 통상의 조제 방법으로 제조하였다.

본 발명의 올티프라즈를 포함하는 제약 조성물은 경화된 간에서 간 조직의 재생을 촉진하며 이를 통하여 간경화 치료에 탁월한 효능을 보이기 때문에, 간경화 치료 효과를 나타내는 효과적인 약제로서 임상적으로 사용이 가능하다.

Claims (3)

1. 5-(2-피라지닐)-4-메틸-1,2-디티올-3-티온(올티프라즈) 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는, 간경화 치료를 위한 간 조직 재생용 제약 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 제약 조성물이 캅셀제, 정제, 연질캅셀제, 현탁화제, 시럽제, 주사제 및 산제로 이루어지는 군 중에서 선택된 제제로 제형화된 것인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 제약 조성물이 경구 투여를 위한 것인 제약 조성물.