KR20030043799A - 피복 효소 함유 촉매 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효소물질을 함유하는 코팅물을 가지는 내부 코어를 함유하며 물 중에 비분산성인 과립 형태의 효소촉매로, 상기 코팅물이 30 내지 400 마이크론의 두께를 가지고 코어 크기 대 코팅물 두께의 비가 2 내지 20 인 것을 특징으로 하는 효소촉매에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 촉매의 제조방법, 및 2-히드록시-4-메틸티오 부티로니트릴의 암모늄 2-히드록시-4-메틸티오 부타노에이트로의 전환에 있어서의 상기 촉매의 용도에 관한 것이다.

Description

피복 효소 함유 촉매 {COATED ENZYME-CONTAINING CATALYST}

가교 폴리머에 의해 고정된 대장균 (E. coli) 함유 코팅물이 불활성 운반체 상에 있는 것을 특징으로 하는, 효소활성을 가지는 고정화 세포를 함유하는 조성물이 유럽특허 제89165호에 예시되어 있다. 상기 조성물은 L-아스파르트산 제조에 사용된다. 또한 코팅물이 생물 물질 및 가교 폴리머를 함유하는 것을 특징으로 하는 피복입자를 함유하는 생물학적 활성 물질이 유럽 특허출원 제297912호에 개시되어 있다.

본 발명자들은 코팅물이 적용되는 과립의 내부 코어에 대하여 특정 두께의 코팅물을 가지는 피복 과립 효소물질이 공지의 효소촉매 물질에 비하여 특이하고 유익한 이점을 가짐을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 물 중에 비분산성인 과립 형태의 효소촉매를 제공하는데, 상기 촉매는 코팅물이 30 내지 400 마이크론의 두께를 가지고 코어 크기 대 코팅물 두께의 비가 2 내지 20 인 것을 특징으로 하는, 효소물질을 함유하는 코팅물을 가지는 내부 코어를 함유한다.

본 발명의 효소촉매는 선행 기술에 비하여 코팅물의 두께가 조절되며 생성되는 과립 촉매가 더욱 큰 효소 활성을 나타낸다는 점에서 이점을 제공한다.

본 발명은 효소촉매, 특히 과립 형태의 효소촉매에 관한 것으로, 상기 과립은 효소를 함유하는 코팅물을 가진다.

본 발명은 과립 형태의 효소촉매 (이하에서 과립 효소촉매라 함) 에 관한 것이다. 촉매는 물 중에 비분산성, 바람직하게는 수(水)불용성이어야 한다. 이러한 성질은 물 중에 비분산성, 바람직하게는 수불용성인 내부 코어에 의해 제공된다. 내부 코어로 사용하기에 적합한 물질은 알루미나, 실리카, 제올라이트, 수지, 스테아르산과 같은 지방물질, 유리 비드 및 플라스틱 비드를 포함한다. 바람직한 코어는 알루미나이다.

코어는 예를 들면, 규칙적 또는 불규칙적 원형, 타원형 등의 적합한 형태를 가질 수 있지만, 바람직한 형태는 0.1 내지 5 밀리미터, 바람직하게는 0.4 내지 2.5 밀리미터의 평균 직경을 가지는 규칙적인 원형이다. 코어는 큰 다공성, 중간다공성 또는 미세다공성일 수 있다. 바람직하게는, 효소물질이 코어에 들어가지 않도록 하기 위해 코어가 큰 다공성은 아니다.

코어의 코팅물은 30 내지 400 마이크론, 바람직하게는 100 내지 250 마이크론의 두께를 가진다. 코어 크기 대 코팅물 두께의 비는 2 내지 20, 바람직하게는 3 내지 15 이다. 본 발명의 목적을 위해, 코어 크기는 최대 내부 직경, 즉 코어의 주변 벽 상의 2개의 외측 점 사이의 최대 거리로 정의된다.

과립 촉매의 코팅물은 효소물질을 함유한다. 효소물질은 용해성 또는 세포 결합성 효소, 미생물 (생존가능한 또는 생존불가능한 완전한 또는 파괴된 세포),항체 및 조효소 또는 그 혼합물일 수 있다. 특히 적합한 효소물질은 글루코스 이성화효소, 페니실린 아세일라아제, 니트릴 히드라타아제, 니트릴라아제, 아미데아제, 리파아제, 프로테아제 및 에스테라아제를 포함한다. 바람직한 효소물질은 니트릴라아제이다.

효소물질에 추가하여, 코팅물이 폴리머 및 가교제를 추가로 함유하는 것이 바람직하다. 이러한 화합물의 존재는 효소물질이 폴리머의 가교 네트워크 중에 삽입되는 것을 허용한다. 상기 네트워크는 고정화의 문제점 중 하나, 즉 목적 효소가 고정화 물질로부터 빠져나가는 것을 극복한다. 따라서, 고분자량의 물질이 통과할 수 없는 제한 장벽을 만드는 것이 유용하다. 적합한 폴리머는 폴리아제티딘 폴리머, 폴리에틸렌이민과 같은 폴리아민 폴리머, 단백질과 같은 폴리아미드 폴리머, 이소시아네이트 폴리머 또는 그 혼합물을 포함한다. 바람직한 폴리머는 코팅물층의 양호한 기계적 강도를 부여하는 폴리아제티딘 폴리머이다. 사용 가능한 폴리아제티딘 폴리머로 Polycup 2002, Kymene 617 및 Kymene 450 (모두 미국 Hercules Inc. 의 상표명) 와 같은 시판 폴리머가 예시된다. 적합한 가교제는 헥사메틸렌디아민과 같은 아민, 글루타르알데히드 또는 아크롤레인과 같은 알데히드, 아디프산과 같은 산, 헥사메틸렌 디이소시아네이트와 같은 이소시아네이트를 포함한다. 바람직한 가교제는 글루타르알데히드이다. 본 발명의 목적을 위해 특히 바람직한 코팅물은 니트릴라아제, 폴리아제티딘 폴리머 및 글루타르알데히드의 혼합물이다.

촉매 물질의 코팅물 중 효소물질, 폴리머 및 가교제의 양에 관하여, 건조 코팅물 중 각 성분의 양은 효소물질의 경우, 적합하게는 50 내지 80 %, 바람직하게는 40 내지 60 %; 폴리머 물질의 경우, 적합하게는 5 내지 20 %, 바람직하게는 10 내지 15 %; 가교제의 경우, 적합하게는 1 내지 5 %, 바람직하게는 2 내지 3 % 이다. 또한 코팅물 중, 예를 들면, 글루코오스, 수크로스, 트레할로스, 말티톨, 소르비톨 및 글리세롤 등의 폴리올, 및/또는 염과 같은 추가의 성분이 존재할 수 있다. 이러한 성분은 0 내지 35 %의 양으로 존재할 수 있다. 또한 코팅물은 한정된 양의 물을 함유할 수 있다. 적합하게는, 물은 코팅물의 0 내지 30 % 의 양으로 존재한다.

본 발명의 효소촉매는 예를 들면 겔 포획 또는 흡착과 같은 당업자에게 알려진 임의의 적합한 고정화 방법에 의해 제조될 수 있다. 유럽 특허출원 제297912호, 제206687호 및 제502035호에는 효소물질을 포함하는 수성 혼합물이 흡수에 의해 과립상에 침전되는 방법이 개시되어 있다. 효소물질을 함유하는 페이스트를 형성하고, 페이스트를 과립에 적용한 후, 생성되는 과립을 건조하는 것을 포함하는 대안적인 코팅물 침전 방법이 EP089165 에 개시되어 있다.

또한 본 발명자들은 코팅 물질의 혼합물로 코어를 분무함으로써 피복 과립 효소촉매를 제조할 수 있음을 발견하였고, 따라서 본 발명의 또 다른 측면은 상술한 효소촉매의 제조방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 효소물질, 폴리머 및 가교제의 수성 현탁액을 생성하고 상기 현탁액을 코어에 분무하여 상기 코어를 코팅하는 것을 함유한다.

분무 기술을 사용한 피복 효소촉매의 제조는 일반적으로 "분무 코팅"이라 불리며, 코팅물의 두께를 조절할 수 있어 원하는 두께를 제공할 수 있다는 점에서 다른 공지의 고정화 방법에 비하여 이점을 제공하며, 이는 본 발명의 효소촉매의 중요한 특징이다.

분무 코팅 기술을 사용한 피복 과립 효소촉매의 제조를 위해, 효소물질, 폴리머 및 가교제의 수성 현탁액이 사용된다. 효소물질은 직접적으로 사용되거나, 본 발명의 방법에서 사용 전에 정제될 수 있다. 이는 원심분리, 여과, 침전 또는 응결에 의해 회수될 수 있다. 효소물질은 물, 또는 염화나트륨과 같은 염, 인산염, EDTA 또는 마그네슘을 함유하는 수용액으로 세척할 수 있다. 바람직한 출발물질은 배양액을 여과 또는 원심분리하여 발효조로부터 회수된 효소적으로 활성인 세포 슬러지이다. 세포 슬러지는 그대로 사용될 수 있으며, 또는 사용 전에 세척될 수 있다. 세포는 정용여과 (diafiltration), 또는 재현탁 및 원심분리에 의해 세척될 수 있다.

현탁액은 5 내지 25 % 의 효소물질, 1 내지 12 % 의 폴리머 및 0.2 내지 4 % 의 가교제를 함유할 수 있으며, 이러한 양은 수성 현탁액의 총 중량을 기준으로 한 것이다. 현탁액 중 물의 양은 결정적인 요인은 아니며, 당업자에 의해 분무용 물질에 사용될 수 있을 것이다. 현탁액 중 고체 함량은 중량 대 부피 기준으로 10 내지 30 % 의 양으로 사용되는 것이 바람직하다. 현탁액은 또한 예를 들면, 글루코오스, 수크로스, 트레할로스, 말티톨, 소르비톨 및 글리세롤 등의 폴리올; 및 염화나트륨과 같은 염 등의 물질을 미량 함유할 수 있다.

필수적인 것은 아니지만, 현탁액의 pH 는 pH 5 내지 9.5, 가장 바람직하게는pH 7.5 내지 8.5 로 설정하는 것이 바람직하다. 이를 위해, 버퍼가 사용될 수 있다. 적합하게는, 버퍼는 모노- 또는 디-칼륨 인산염 또는 모노- 또는 디-나트륨 인산염과 같은 인산염; 또는 탄산염일 수 있다. 바람직한 버퍼는 인산염 버퍼이다. 버퍼가 현탁액 중에 존재하는 경우, 건조 효소물질 중량에 대하여 15 내지 50 중량 %의 버퍼가 첨가된다.

현탁액은 임의의 적합한 방법에 따라 제조될 수 있다. 바람직하게는, 현탁액은 먼저 물 또는 버퍼 중 효소물질의 현탁액을 형성함으로써 제조된다. 그 후, 효소물질의 현탁액에 가교제가 첨가될 수 있다. 가교제는, 폴리머의 첨가 전에, 효소물질의 아민, 하드록실, 또는 카르복실기와 충분히 반응할 수 있을 기간 동안 효소물질과 접촉시킬 수 있다. 분무 단계 수행 전, 폴리올, 버퍼 및 염화나트륨과 같은 임의의 시약이 현탁액에 첨가될 수 있다.

현탁액은 0 내지 50℃, 바람직하게는 10 내지 35℃ 의 온도에서 적합하게 제조된다.

그 후 수득된 현탁액은 분무 전에 수일간 특별한 주의없이 보관될 수 있다. 보관 온도는 편리하게 0℃ 내지 주위 온도일 것이다.

현탁액은 임의의 분무-코팅 장치, 바람직하게는 유동 공기층을 사용하여 코어에 침전시킬 수 있다. 공기 유량 (flow rate) 은 고형 지지체의 양호한 유동화를 얻기 위해 적합하게 조정된다. 공기 도입 온도는 30 내지 90℃ 에서 적합하게 조정되고, 수성 현탁액의 분무 속도는 층 온도가 조작 동안 10 내지 60℃, 바람직하게는 20 내지 40℃ 로 유지될 수 있도록 조정된다. 생성되는 코어상 코팅층은30 내지 400 마이크론의 두께를 가진다.

상기 제조방법에 따라 생성된 효소촉매는 물 또는 버퍼 배지 중에서, 또는 건조 형태로 사용 전 수개월 보관될 수 있다.

본 발명의 과립 효소촉매는 임의의 효소 반응에 사용될 수 있다. 특히. 본 발명의 효소촉매는 2-히드록시-4-메틸티오 부티로니트릴 (HMTBN) 이 상응하는 암모늄 염, 즉 암모늄 2-히드록시-4-메틸티오 부타노에이트 (HMTBS) 로의 전환에 사용될 수 있다. 또한 촉매는 나일론 66 올리고머의 가수분해에 사용될 수 있다. 본 발명 촉매의 특이한 이점은 공지의 다른 효소 촉매에 비해 더 큰 반감기를 나타내는 것이다. 특히 과립 피복 효소촉매는 30 시간 이상, 바람직하게는 70 시간 이상의 반감기를 나타낸다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 설명될 것이다:

하기 실시예에서 하기의 약자가 사용된다:

HMTBN - 2-히드록시-4-메틸티오 부티로니트릴

HMTBS - 2-히드록시-4-메틸티오 부타노에이트

실시예 1

1.1 효소촉매의 제조:

대장균 BIOCAT 714 균주의 구축

P _trp 프로모터, 페이지 cⅡ 유전자의 리보소옴 결합 자리 (RBScⅡ) 및 알칼리제네스 파에칼리스 (Alcaligenes faecalis) ATCC8750 으로 부터의 니트릴라아제 유전자 (nitB) 를 포함하는 1.27 kb 단편을 제한효소 EcoRⅠ 및 XbaⅠ을 사용하여 플라스미드 pRPA-BCAT6 (특허출원 WO/98/18941) 로부터 추출하고, 그 후 벡터 pXL642 중에서 복제하고 (미국특허 제5,629,190호에 기재), 동일한 제한효소로 절개하였다. 생성되는 플라스미드 pRPA-BCAT15 를 효소 StuⅠ 및 BsmⅠ로 절개하고, 4.3 kb 단편을 pRPA-BCAT4 (특허출원 WO/98/18941) 로부터의 정제된 136 bp StuⅠ- BsmⅠ단편과 연결하여 플라스미드 pRPA-BCAT19 를 얻었다. pRPA-BCAT19 의 부분서열분석으로 니트롤라아제의 Asp279 잔기 코돈이 Asn279 잔기 코돈으로 치환된 것을 확인하였다. 그 후,P _trp ::RBScⅡ::nitB 융합을 포함하는 pRPA-BCAT19 로부터의 1.2 kb EcoRⅠ- XbaⅠ단편을 동일한 효소로 절개된 벡터 pRPA-BCAT28 중에서 복제하여 6.2 kb 플라스미드 pRPA-BCAT29 를 얻었다. 암피실린 내성 표지를 테트라싸이클린 내성 표지로 치환하기 위해 pXL642 (CIP 출원번호 08/194,588) 로부터의 3.9 kb SspⅠ-ScaⅠ단편을 pHP45 Tc (Fellay 등, 1987, Gene 52: 147-154) 로부터의 2.1 kb SmaⅠ단편과 연결하여 벡터 pRPA-BCAT28 을 수득하였다. NdeⅠ 부분소화 및 대장균 폴리머라아제 Ⅰ(클레노우 단편) 에 의해 플라스미드 pRPA-BCAT29 의 복제원점에 가까운 NdeⅠ자리를 파괴함으로써, 플라스미드 pRPA-BCAT41 을 수득하였다.

플라스미드 pRPA-BCAT41 및 pXL2035 (Levy-Schill 등, 1995, Gene 161: 15-20) 를 대장균 균주 W (ATCC9637) 에 표준 전기충격법 (electroporation) 에 의해 도입하였다. 수득된 클론은 BIOCAT 714 라 칭한다.

균주의 배양:

알칼리제네스 파에칼리스 (Alcaligenes faecalis) ATCC8750 으로 부터의 니트릴라아제를 함유하는 대장균 균주 W (BIOCAT 714) 를 80 리터의 배지를 포함하는 100 리터 발효조에 배양하였으며, 배지의 조성은 표 1 에 나타나 있다.

화합물	배지 중 농도 (g/ℓ)
K2HPO4	8
(NH4)2SO4	0.75
MgSO4·7H2O	2.5
황산철	0.04
CaCl2·2H2O	0.04
황산망간	0.026
염화코발트	0.004
황산아연	0.013
몰리브덴산 나트륨	0.001
염화구리	0.001
붕산	0.00025
AlCl3	0.00125
Citric·H2O	1.7
글루코스 모노히드레이트	2
L-트립토판	0.1
이스트 추출물	3
고기 펩톤	5

수성 암모니아를 첨가하여 pH 를 7.0 으로 유지시켰다. 1분당 1 부피/부피의 속도로 배지에 공기를 첨가하고 교반하여 산소 포화를 20 %로 유지시켰다. 글루코스는 처음에는 2 g/ℓ의 농도로 도입하였다. 그 후, 700 g/ℓ의 글루코스 저장 용액 및 19.6 g/ℓMgSO₄·7H₂O 를 사용하여 추가의 글루코스를 계속 도입하였다. 추가 속도는 배지 1 리터당 2.2 g 의 글루코스/시간이었다. 24 시간 발효시킨 후, 원심분리에 의해 세포를 회수하였다. 26 % 의 고형 성분을 가지는 페이스트를 직접 고정화에 사용하였다.

26.0 중량% 의 건조 세포를 함유하는 950 g 의 세포 펠렛을 571.5 g 의 1몰/리터 인산염 버퍼 용액 중에 희석시켰다. 3-패들 나선 교반기를 갖춘 반응기 중 주위 온도에서 희석을 수행하였다. 희석 후, pH 는 8.0 이었다.

165.5 g 의 K₂HPO₄및 6.8 g 의 KH₂PO₄를 1 리터의 탈이온수 중에 용해하여 1 몰/리터 인산염 버퍼 용액을 제조하였다. 상기 용액의 최초 pH 는 9.0 이었다.

164.6 g의 수성 글루타르알데히드 용액 (6 중량%) 을 세포 현탁액에 천천히 첨가하였다. 395.2 g 의 수성 폴리아제티딘 (Kymene 617) 용액 (12.5 중량 %) 의 첨가 전, 수득된 혼합물을 주위 온도에서 1 시간 이상 교반하였다. 따라서, 세포 현탁액을 수득하였으며, 그 조성은 하기 표 2에 나타나 있다:

성분	고형성분(%)	양(g)	건조 중량(g)	합계 %	물 1 리터당 건조 g (%)
세포 펠렛	26.0	950.0	247.0	11.9	14.7
인산염 버퍼 용액	15.23	571.5	87	4.2	5.9
글루타르알데히드 용액	6.0	164.6	9.9	0.5	0.6
폴리아제티딘 용액	12.5	395.2	49.4	2.4	2.9
합계		2081.3	404.6	19.4

1800 g 의 상기 세포 현탁액을 직경 2.0 mm 의 알루미나 비드 350 g 상에 분무하고, 열풍 스트림 (도입 온도 53℃) 에서 유동화시켰다. 분무 속도는 비드의 온도가 35℃ 로 유지될 수 있도록 조정하였다. 170 분 동안 분무 후, 25.5 중량% 의 건조 세포 및 16.6 %의 잔류수를 포함하는, 841 g 의 생촉매를 수득하였다. 코팅물의 두께는 330 마이크론이었다. 피복 과립의 직경은 2.6 mm 였다. 과립 크기 대 코팅물 두께의 비는 7 이었다.

1.2 HMTBN 의 HMTBS 로의 촉매적 전환

0.1 몰/리터의 HMTBN 존재하, pH 6.6, 25℃ 에서 측정된 상기 촉매의 활성은촉매 1 킬로그램당 1 시간에 0.56 kg 의 HMTBN 을 암모늄 2-히드록시-4-메틸티오 부타노에이트 (HMTBS) 로 전환시켰다.

3 ㎝ 의 내부 직경 및 45 ㎝ 의 길이를 가지는 자동온도조절 컬럼을 100 g 의 촉매로 충전하였다. 컬럼에는 재순환 루프를 경유하는 펌프를 설치하였다. 반응기의 전체 부피는 430 ml 였다. 루프를 암모늄염 HMTBN 25% 용액으로 충전하였다. 컬럼의 최상부로 용액을 주입하고, 시간당 20 리터의 속도로 저부로 통과시켰다. 컬럼 주위의 이중 외피에서 물을 순환시켜 온도를 35℃ 로 유지시켰다. 광천수를 시간당 40 그램의 속도로 루프에 도입하였다. 과잉의 액체를 컬럼의 바닥으로부터 제거함으로써 반응기의 부피를 일정한 수준으로 유지시켰다. 계속적인 흐름으로 95% 니트릴을 전환시켰다. 반응기에 잔류하는 HMTBS 의 농도는 25% 였다. 0.2 몰/리터의 HMTBN 존재하, 35℃ 에서의 반감기는 30 시간이었다.

실시예 2

2.1 효소촉매의 제조:

26 중량% 의 건조 세포를 함유하고 실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조된 1100 g 의 세포 펠렛을 9 g/ℓ 의 염화나트륨을 함유하는 13.2 kg 의 수용액 중에 희석시켰다. 잘 교반되는 탱크 반응기 중에서 30 분 동안 실온에서 현탁액을 교반하였다. 원심분리로 세포를 회수하였다.

26 중량% 의 건조 세포를 함유하는 950 g 의 세척 세포 펠렛을 상기 실시예 1 에 기재된 바와 같이 처리하여 1800 g 의 처리된 현탁액을 생성시켰다. 170 분동안 분무 후, 25.5 중량% 의 건조 세포 및 17 %의 잔류수를 함유하는 850 g 의 촉매를 수득하였다. 코팅물의 두께는 190 마이크론이었다. 코어의 직경은 2.2 mm 였다. 코어 크기 대 코팅물 두께의 비는 11.6 이었다.

2.2 HMTBN 의 HMTBS 로의 촉매적 전환

0.1 몰/리터의 HMTBN 존재하, pH 6.6, 35℃ 에서 실시예 1 에 기재된 바와 같이 촉매의 활성 및 반감기를 측정하였다. 활성은 촉매 1 킬로그램당 1 시간에 0.5 kg 의 HMTBN 을 암모늄 2-히드록시-4-메틸티오 부타노에이트 (HMTBS) 로 전환시켰다. 반감기는 70 시간이었다.

실시예 3

3.1 효소촉매의 제조:

23 % 의 폴리에틸렌이민 및 77 %의 폴리아제티딘을 함유하는 폴리머 메트릭스를 사용한 것을 제외하고 실시예 1 의 과정을 반복하였다. 세포 현탁액의 최종 조성은 하기의 표에 요약되어 있다.

성분	고형성분(%)	양(g)	건조 중량(g)	합계 %	물 1 리터당 건조 g (%)
세포 펠렛	26.0	400.0	104.0	7.5	8.5
인산염 버퍼 용액	6.9	600.0	41.4	3.0	3.4
글루타르알데히드 용액	3.0	139.0	4.2	0.3	0.3
폴리아제티딘 용액	5.0	208.0	10.4	0.8	0.9
폴리에틸렌이민 용액	8.0	39.0	3.1	0.2	0.3
합계		1386.0	163.1	11.8

1300 g 의 상기 세포 현탁액을 실시예 2 와 동일한 조작 조건하 알루미나 비드 400 g 상에 분무하였다. 130 분 동안 분무 후, 17.6 중량% 의 건조 세포 및 7.5 %의 잔류수를 포함하는 553 g 의 촉매를 수득하였다. 코팅물의 두께는 210 마이크론이었다. 코어의 직경은 2.2 mm 였다. 코어 크기 대 코팅물 두께의 비는 10 이었다.

생성된 촉매를 HMTBN 의 HMTBS 로의 전환에 사용하여 상술한 다른 촉매와 유사한 결과를 얻었다.

실시예 4

4.1 폴리아미데아제 활성을 가지는 효소촉매의 제조:

프랑스 특허출원 제9508916호 (참고자료로 삽입) 에 기재되 바와 같이 제조된, 폴리아미데아제 활성을 포함하는 재조합 대장균의 세포 페이스트 134 g 을 230 g 의 인산염 버퍼 (0.2M, pH 8.0) 에 희석시켰다. 실시예 3 에 기재된 과정을 반복하고 실시예 1 에 기재된 조건하에서 540 g 의 세포 현탁액을 400 g 의 알루미나 비드 상에 분무하였다.

4.2 나일론 66 의 촉매적 분해

프랑스 특허 제95098016호에 기재된 과정에 따라 효소 활성을 측정하였다. 5 g/ℓ의 나일론 66 올리고머의 존재하 pH 7, 30℃ 에서 측정된 촉매 활성은 촉매 1 리터당 1시간에 140 g 의 나일론 66 올리고머를 아디프산으로 전환시켰다. 반감기는 790 시간을 초과하였다.

비교예 A

A.1 효소촉매의 제조:

실시예 1 에 기재되 바와 같이 제조된 100 g 의 세포 현탁액을 직경 2.0 mm 의 알루미나 비드 350 g 상에 분무하고, 열풍 스트림 (도입 온도 53℃) 에서 유동화시켰다. 비드의 온도가 35℃ 로 유지될 수 있도록 분무 속도를 조정하였다.170분 동안 분무 후, 3 중량% 의 건조 세포를 포함하는 385 g 의 촉매를 수득하였다. 코팅물의 두께는 20 마이크론이었다. 코어의 직경은 2 mm 였다. 코어 크기 대 코팅물 두께의 비는 100 이었다.

A.2 HMTBN 의 HMTBS 로의 촉매적 전환

0.1 몰/리터의 HMTBN 존재하, pH 6.6, 25℃ 에서 실시예 1 에 기재된 바와 같이 생촉매의 활성 및 반감기를 측정하였다. 활성은 촉매 1 킬로그램당 1 시간에 0.06 kg 의 HMTBN 을 암모늄 2-히드록시-4-메틸티오 부타노에이트 (HMTBS) 으로 전환시켰다. 반감기는 11 시간이었다.

Claims (19)

1. 효소물질을 함유하는 코팅물을 가지는 내부 코어를 함유하며 물 중에 비분산성인 과립 형태의 효소촉매로서, 상기 코팅물이 30 내지 400 마이크론의 두께를 가지고 코어 크기 대 코팅물 두께의 비가 2 내지 20 인 것을 특징으로 하는 효소촉매.
2. 제 1 항에 있어서, 효소촉매가 수(水)불용성인 효소촉매.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 코팅물의 두께가 100 내지 250 마이크론인 효소촉매.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 코팅물 두께 대 코어 크기의 비가 3 내지 15 인 효소촉매.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 코어가 0.1 내지 5 밀리미터의 평균 직경을 가지는 효소촉매.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 코어가 중간다공성 또는 미세다공성인 효소촉매.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 코어가 알루미나, 실리카, 제올라이트, 수지, 지방물질, 유리 비드 및 플라스틱 비드로부터 선택되는 효소촉매.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 효소물질이 글루코스 이성화효소, 페니실린 아세일라아제, 니트릴 히드라타아제, 니트릴라아제, 아미데아제, 리파아제, 프로테아제 및 에스테라아제로부터 선택되는 효소촉매.
9. 제 8 항에 있어서, 효소가 니트릴라아제인 효소촉매.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 코팅물이 폴리머 및 가교제를 추가로 함유하는 효소촉매.
11. 제 10 항에 있어서, 폴리머가 폴리아제티딘 폴리머, 폴리아민 폴리머, 폴리아미드 폴리머, 이소시아네이트 폴리머로부터 선택되고, 가교제가 아민, 알데히드, 산 및 이소시아네이트로부터 선택되는 효소촉매.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 코팅물이 니트릴라아제, 폴리아제티딘 폴리머 및 글루타르알데히드를 함유하는 효소촉매.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 코팅물이 0 내지 30 % 의 물을 함유하는 효소촉매.
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 효소촉매가 30 시간 이상 , 바람직하게는 70 시간 이상의 반감기를 가지는 효소촉매.
15. 효소물질, 폴리머 및 가교제의 현탁액을 형성하고 상기 현탁액을 코어상에 분무하여 상기 코어를 코팅하는 것을 포함하는, 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 과립 효소촉매의 제조방법.
16. 제 15 항에 있어서, 효소물질이 현탁액의 제조 전에 세척된 효소적으로 활성인 세포 슬러지인 방법.
17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 효소촉매의 효소적 전환 과정 에서의 용도.
18. 제 17 항에 있어서, 2-히드록시-4-메틸티오 부티로니트릴의 암모늄 2-히드록시-4-메틸티오 부타노에이트로의 전환에 있어서의 용도.
19. 제 17 항에 있어서, 나일론 66 의 가수분해에서의 용도.