KR20030025200A

KR20030025200A - 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물, 이를함유하는 비만증 또는 당뇨병 치료 또는 예방용 의약적조성물 및 식품 첨가물 그리고 그들의 제조방법

Info

Publication number: KR20030025200A
Application number: KR1020020056818A
Authority: KR
Inventors: 방영배; 김항래; 강선경; 정칠만; 박한오; 이정래; 김재호; 이용주
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2001-09-19
Filing date: 2002-09-18
Publication date: 2003-03-28
Also published as: WO2003024468A1

Abstract

본 발명은 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물을 제공한다. 본 발명에 따른 옥수수 추출물은 옥수수를 물 또는 극성 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 된 추출용매로 추출하는 단계, 상기 추출단계에서 얻은 추출액으로부터 고형분을 제거하는 단계, 및 상기 추출액으로부터 상기 추출용매를 제거하여 옥수수 추출물을 얻는 단계를 포함하는 추출 공정에 의하여 얻을 수 있다. 본 발명의 옥수수 추출물은 탄수화물 소화 효소인 아밀라제의 활성을 억제함으로써 저당류의 체내 흡수를 억제하여 혈당의 상승을 막고, 영양분의 과다 섭취를 줄임으로써 당뇨병 또는 비만증의 예방 및 치료에 효과를 나타내며, 소화되지 않는 탄수화물로 인하여 포만감을 유도할 수 있어 다이어트 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 식용 식물로부터 추출한 것이므로 인체에 해가 없다.

Description

아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물, 이를 함유하는 비만증 또는 당뇨병 치료 또는 예방용 의약적 조성물 및 식품 첨가물 그리고 그들의 제조방법{Substances extracted from corn which can inhibit the activities of amylase, pharmaceutical compositions and food additives containing the same extracts for treatment or prevention of obesity and diabetes mellitus, and processes for their preparation}

본 발명은 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기의 옥수수 추출물을 함유하는 비만증 또는 당뇨병의 치료 또는 예방용 의약적 조성물 및 상기의 옥수수 추출물을 함유하는 혈당 조절용 식품 첨가물에 관한 것이다.

미국 국립보건연구소(National Institutes of Health, NIH)의 보고서(the evidence report: clinical guideline on the identification, evaluation, and treatment of overweight and obesity in adults, 1999, NIH)에 의하면, 미국인 가운데 약 9,700 만 명이 비만 상태에 있으며, 비만과 관련된 질환 중의 하나인 제 2 형 당뇨병 환자가 약 1,570 만 명에 이른다.

또한, 당뇨병 환자는 세계 보건 기구(WHO)에 의하면, 2025 년에는 약 3 억명이 될 것으로 추정하고 있으며, 인슐린에 의한 혈당조절 기능을 상실한 비만증과 밀접한 연관성을 갖는 제 2 형 당뇨병 환자는 현재 미국 전체 인구의 약 5.9%에 달한다고 알려져 있다(Current Pharmaceutical Design, 2001, 7:417-450). 급속히 증가하는 비만증과 당뇨병, 특히 비만증을 수반하는 당뇨병은 만성질환의 하나로서 막대한 경제적, 사회적 피해를 야기한다.

비만증의 발생에 대한 정확한 기작은 현재까지 밝혀지지 않았지만, 비만증은 에너지의 섭취와 소모간의 불균형에 의해서 생기는 것으로 보고 있다. 따라서 현재까지의 비만증 치료를 위한 치료제의 개발 방향은 주로 3 가지로 나뉘어진다 (Nutrition, 2000, 16:953-960). 첫째는 식욕을 감퇴시켜 음식의 섭취량을 줄이는 약물들로서, 주로 교감신경흥분제 계열들의 약물들이다. 이러한 계열의 비만증 치료용으로 FDA에 승인된 약물로는 펜터민(phentermine), 마진돌(mazindol), 시부트라민(sibutramine)이고, 아직 승인되지 않은 약물로는 펜프로프렉스(fenproprex) 등이 있다. 둘째는 섭취한 음식의 소화 및 장내 흡수에 영향을 주는 것으로, 이와 관련된 약물로는 지방의 소화를 억제하는 올리스트(orlist; Xenical(TM), Roche pharmaceuticals) 등이 있다. 또한, 비만증 및 당뇨병 치료제 이외의 용도로 FDA의 승인을 받은 후에, 비만증 치료제로 사용되기에 이른 것은 테스토스테론 (testosterone) 같은 호르몬도 있다. 세 번째는 몸 안에 축적된 에너지의 소비를 증가시키는 약물로서 에페드린(ephedrine), 카페인(caffeine) 등이 있으며, 아직개발 중인 것으로 β₃-아드레날린 수용체(β₃-adrenoreceptor) 길항제가 있다. 결국, 혈당을 감소시키거나, 당의 흡수를 저해하거나, 인슐린의 작용을 강화시키거나, 식욕의 감소를 유발하는 약제들에 의해서 비만증 또는 비만증을 수반하는 당뇨병을 치료 또는 예방하고자 하는 약물 요법이 현재 활발히 연구되고 있다.

또한, 제 2 형 당뇨병의 치료를 위한 약물로는, 혈당 조절 호르몬인 인슐린의 작용을 증가시키는 술포닐우레아 (sulfonylureas), 로지글리타존(rosiglitazone), 메트포르민(metformin) 등이 있으며, 당의 흡수를 억제하는 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase) 억제제, 아밀라제(amylase) 억제제, 식이섬유 등이 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 장내 소화효소인 아밀라제의 활성을 억제하여 탄수화물이 체내로 흡수될 수 있는 저당류 물질로 분해되는 것을 크게 줄여주는 효과, 즉 아밀라제 활성 억제 효과를 갖는 옥수수 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 옥수수로부터 아밀라제 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기의 추출물의 약학적 유효량을 투여하여 체내로 흡수되는 저당류의 생성을 억제시킴으로써, 당뇨병 또는 비만증의 예방 또는 치료를 위한 의약적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 빵, 국수, 밥 등과 같은 음식물에 첨가되어, 당뇨병 또는 비만증의 예방 효과를 나타내는 옥수수 추출물을 포함하는 식품첨가물을 제공하는 것이다.

도 1은 스프래이-달리(Spraue-Dawley) 쥐에 전분과 옥수수 추출물을 투여한 후 측정된 혈당치 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 아이 씨 알 (ICR) 마우스에 전분과 옥수수 추출물을 투여한 후 측정된 혈당치 변화를 나타낸 그래프이다.

도 3은 아이 씨 알 (ICR) 마우스에 전분과 옥수수 추출물의 추가적 정제에 의하여 얻은 활성 화합물 3을 투여한 후 측정된 혈당치 변화를 나타낸 그래프이다.

도 4는 스프래이-달리(Spraue-Dawley) 쥐에 옥수수 전분과 옥수수 추출물을 투여한 후 측정된 혈당치 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 스프래이-달리(Spraue-Dawley) 쥐에 밀가루와 옥수수 추출물을 투여한 후 측정된 혈당치 변화를 나타낸 그래프이다.

도 6은 옥수수 옥겨 조추출물을 음이온 교환수지에 의한 이온교환 용리 방법(용출 용액: pH 2~6.5의 산 수용액)으로 정제하여 얻은 옥수수 추출물의 돼지 췌장 아밀라제에 대한 저해 효과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 옥수수 옥겨 조추출물을 음이온 교환수지에 의한 이온교환 용리 방법(용출 용액: 0.01~0.5 M 농도의 NaCl 수용액)으로 정제하여 얻은 옥수수 추출물의 돼지 췌장 아밀라제에 대한 저해 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물을 제공한다.

본 발명에 따른 옥수수 추출물은 옥수수를 물 또는 극성 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 된 추출용매로 추출하는 단계, 상기 추출단계에서 얻은 추출액으로부터 고형분을 제거하는 단계, 및 상기 추출액으로부터 상기 추출용매를 제거하여 옥수수 추출물을 얻는 단계를 포함하는 추출 공정에 의하여 얻을 수 있다.

본 발명에서 사용되는 옥수수는 옥수수 낟알 (corn kernel) 또는 옥수수 옥겨 (corn husk) 인 것이 바람직하며, 추출 용매로는 탄소수 1~4 개인 저급 알코올을 사용할 수 있다. 추출은 0~100℃의 온도에서 수행될 수 있으며, 고형분의 제거는 원심분리 또는 여과에 의하여 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 유효성분이 추출물에 더욱 높은 비율로 포함되도록 하기 위하여, 상기의 추출물을 정제할 수 있다.

이러한 추출물의 정제 과정은 상기 추출물을 물에 녹이거나 현탁시키는 단계, 상기 추출물 수용액 또는 수현탁액을 물과 혼합되지 않는 비극성 유기용매와 접촉시켜서 상기 추출물 수용액 또는 수현탁액에 있는 아밀라제 억제활성을 갖지 않는 성분을 상기 비극성 유기용매로 분배시키는 단계, 상기 비극성 유기용매의 용액을 제거하는 단계, 상기 추출물 수용액 또는 수현탁액을 물과 혼합되지 않는 극성 유기용매와 접촉시켜서 상기 추출물 수용액 또는 수현탁액에 있는 아밀라제 억제활성을 갖는 유효성분을 상기 극성 유기용매로 분배시키는 단계, 및 상기 극성 유기용매의 용액을 회수하고, 이로부터 상기 극성 유기용매를 제거하여 부분적으로 정제된 옥수수 추출물을 얻는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 추출물의 정제 과정은 크로마토그래피에 의하여 수행될 수 있다. 즉, 크로마토그래피에 의하여 상기 추출물 중에 혼합되어 있는, 아밀라제 억제활성을 갖지 않는 성분을 제거할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의하여 추출한 옥수수 추출물과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 아밀라제 활성과 관련되는 질병을 치료 또는 예방할 수 있는 의약적 조성물을 제공한다. 여기에서, 아밀라제 활성과 관련되는 질병은 특히, 비만 또는 당뇨병이며, 본 발명의 의약적 조성물은 의약적 경구 투여에 적합한 형태를 가지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의하여 추출한 옥수수 추출물을 포함하는 식품 첨가물을 제공한다. 본 발명의 식품 첨가물은 식품 섭취시에 식품 섭취자의 혈당을 조절하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명의 식품 첨가물은 이당류 이상의 다당류를 함유하는 식품에 첨가되어야 한다.

이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 옥수수로부터 추출한, 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수추출물 및 추출방법을 제공한다.

본 발명에서 추출 대상이 되는 옥수수는 포시애(poaceae), 콘(corn), 메이즈(maize), 밀리(mealie), 인디언 콘(Indian corn) 등으로 알려진 지 매이즈(Zea mays)[시퍼랠러스 목(order Cyperales), 지 과(family Zea), 매이즈 속(genus mays)]에 속하는 일년생 식물이다. 즉, 본 발명에서 사용될 수 있는 옥수수는 지 매이즈로 분류될 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 상관없다. 또한, 본 발명의 아밀라제 활성 억제 옥수수 추출물은 옥수수 낟알(corn kernel 또는 corn seed) 또는 옥수수 옥겨(껍질; corn husk)로부터 추출되었지만, 그 외에도 옥수수 줄기(corn stalk) 및 옥수수 속(corn cob)으로부터도 추출될 수 있을 것이다.

본 발명의 추출물은 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 활성을 가지는 유효 성분을 포함하며, 옥수수(Zea mays)로부터 추출된다. 이 때, 추출 용매로는 물 또는 극성 유기용매 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 좋다. 바람직한 추출 용매로는 물 또는 알코올, 바람직하게는, 탄소수 1 ~ 4 개의 저급 알코올, 더욱 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올이 사용될 수 있으며, 그 외에도 적당한 극성을 가지는 극성 유기 용매가 사용될 수 있다. 그러한 극성 유기 용매는 디에틸에테르, 디클로로메탄(메틸렌클로라이드라고도 함), 아세톤, 에틸아세테이트, 아세토니트릴 등이 포함될 수 있다. 이러한 추출 용매들은 단독으로 사용될 수도 있고, 혼합되어 사용될 수도 있다.

추출은 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 통상적으로 추출은 밀폐된 용기에 옥수수 및 추출용매를 넣고 교반함으로써 수행된다. 추출은 0 ~ 100 ℃, 바람직하게는 30 ~ 55℃의 온도에서 추출물이 충분히 추출될 수 있을 정도의 시간동안, 통상적으로는 1 시간 ~ 1 달 동안 수행될 수 있다. 이 때, 추출 온도를 높이면, 추출시간을 단축할 수 있으나, 온도가 너무 높은 경우에는 유효성분이 화학적 반응에 의하여 분해되거나 변할 수 있으므로 적당한 온도를 유지하는 것이 좋다. 추출에 사용되는 옥수수, 예를 들어, 옥수수 낟알 또는 옥겨는 통째로 사용될 수도 있으나, 추출을 효율적으로 진행시키기 위하여, 분쇄한 상태로 사용되는 것이 바람직하다.

추출 후에는 추출 용매를 포함하는 추출액으로부터 고형분을 제거한다. 고형분을 제거하는 수단으로는 일반적으로 알려진 수단, 예를 들어, 원심분리, 여과, 정치후 기울여 따르기(decantation) 등을 사용할 수 있다. 고형분이 제거된 추출액으로부터 추출용매를 제거하면 본 발명의 옥수수 추출물을 얻을 수 있다. 이 때, 추출용매의 제거도 통상적인 방법에 의하여 수행될 수 있다. 추출용매 제거방법은 상압 증발, 진공 원심분리 증발기 등에 의한 진공 증발, 동결 건조, 건조 질소 또는 건조 공기에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 추출 용매의 제거시 조건에 따라서 열을 가할 수도 있고 가하지 않을 수도 있다. 그러나, 과도한 열을 가하는 것은 바람직하지 않다.

상기와 같은 추출에 의하여 얻은 옥수수 추출물로부터 아밀라제의 활성에 대한 억제 활성을 가지지 않는 성분을 제거하기 위하여, 추가적인 정제를 수행할 수 있다.

이러한 정제방법의 하나는 크로마토그래피이다. 이러한 크로마토그래피는 적당한 크로마토그래피의 종류, 용출용매, 및 용출 조건을 선택함에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck, 9385, 70-230 mesh)에서 적당한 용출용매, 예를 들어, 메틸렌클로라이드, 메탄올 및 증류수의 혼합 용매를 사용하여 상기에서 얻은 옥수수 추출물로부터 비활성 성분들을 제거할 수 있다. 이 때, 용출 용매는 용출 시간에 따라 점차 극성이 높아지도록 설정할 수 있다. 또한, 이렇게 부분적으로 정제된 옥수수 추출물을 더욱 정제하거나 단일의 활성 성분을 얻기 위하여, 예를 들어, 상기에서 얻은 옥수수 추출물의 활성 분획을 예를 들어, 메탄올을 용출 용매로 하여 세파덱스 LH20(pharmacia, 17-0090-01)을 이용한 크로마토그래피를 수행하고, 이어서 활성을 나타내는 활성 분획을 30%~10% 아세토니트릴을 용출 용매로 하는 역상 실리카겔 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 단일의 활성 성분을 얻기 위해서는 최종적으로 예를 들어, 아세토니트릴 및 메탄올의 혼합 용매와 같은 용매를 이용하여 재결정을 수행함으로써 순수한 활성 화합물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 옥수수 추출물의 추가적 정제과정에서의 안전성을 높이기 위하여 인체에 유해한 유기용매를 사용하지 않고, 에탄올(주정)과 물만을 용매로 사용하여 정제할 수 있다. 그러한 예의 하나는 음이온 교환 수지를 사용하는 것이다. 본 발명의 옥수수 추출물 중에서 아밀라제 활성을 억제하는 물질들 중 일부는 카복시기 또는 이와 유사한 작용기를 가지고 있으므로 이들을 분리하기 위하여 음이온 교환 수지를 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 옥수수 추출물이 약알칼리성의 수소이온농도(pH), 예를 들어, pH 8~9 정도를 가지도록 조정할 수 있다. 이 때, 옥수수 추출물의 용해를 위하여 추출물의 부피와 동량의 에탄올을 사용할 수 있다. 이러한 옥수수 추출물 용액을 중성 또는 약알칼리성의 수소이온농도, 예를 들어, pH 7~8 정도의 수용액으로 평형화되어 있는 음이온 교환수지에 통과시켜 해당하는 작용기를 가지는 활성 성분들을 음이온 교환수지에 결합시킬 수 있다. 이어서, 음이온 교환수지를 증류수 또는 수돗물로 세척하여 수지에 결합되지 않은 성분들을 제거할 수 있다. 그런 후, 음이온 교환수지에 결합된 활성 성분들을 적당한 농도의 산 수용액 또는 염 수용액으로 용출시킬 수 있다. 이 때, 산 수용액의 pH는 산성 범위에 있다면 특별히 제한되지는 않으나, 활성만을 고려할 경우 4~6 정도가 가장 바람직하다. 염 수용액은 사용되는 염의 종류에 따라 달라지지만, 0.001~0.5 M의 범위를 가질 수 있다. 음이온 교환수지를 이용하여 추가적으로 정제하는 것은 일반적으로 컬럼 크로마토그래피 방식으로 수행될 수 있지만, 다른 방식으로도 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 옥수수를 추출하는 과정 및 추가적 정제 과정에서 물 및 에탄올(주정)만을 용매로 사용한다면, 획득되는 옥수수 추출물의 안전성은 매우 높게 되므로 이 방법은 본 발명의 옥수수 추출물을 식품의 첨가물로 사용될 때 특히 적합할 수 있으며, 또한, 안전성 확보를 위한 엄격한 공정관리 등과 같은 비용의 증가가 발생하지 않으므로 경제적이다.

다른 정제방법으로는 극성도 및 용해도 특성에 따른 분배계수의 차이를 이용하는 것이다. 본 발명의 옥수수 추출물 중에 포함되어 있는 아밀라제의 활성에 대한 억제 활성을 가지는 성분(유효성분)은 물 및 비극성 용매보다 그 사이의 적당한극성도를 가지는 극성 용매에 더 잘 용해된다. 또한, 본 발명의 옥수수 추출물 중에는 아밀라제의 활성에 대한 억제 활성을 가지지 않는 성분(비유효성분)들이 포함되어 있으며, 이 성분들 중에는 물 또는 비극성 용매에 잘 용해되는 성분들이 있다. 따라서, 화학물질의 극성도에 따라 극성 용매 및 비극성 용매에 대한 용해도가 달라진다는 특성에 기초하여 분별장치를 사용하여 본 발명의 옥수수 추출물로부터 비극성 용매에 잘 용해되는 비유효성분 및 물에 잘 용해되는 비유효성분을 제거할 수 있다.

비극성 용매에 잘 용해되는 비유효성분을 제거하기 위하여, 먼저 추출공정에 의하여 얻은 옥수수 추출물을 물에 완전히 녹이거나 현탁시킨다. 이 때, 추출물을 물에 완전히 용해시키려면 많은 양의 물이 필요하거나 가열하여야 하지만, 취급의 불편이 수반되므로 추출물이 완전히 용해되지 않더라도 다음 단계를 수행할 수 있다. 다음으로 상기의 추출물 수용액 또는 수현탁액에 물과 혼합되지 않는 비극성 유기 용매를 접촉시킨다. 이러한 공정은 분별장치에서 수행될 수 있다. 그러면, 추출물 수용액 또는 수현탁액 중에 포함되어 있는 비극성 특성을 가지는 비유효성분은 비극성 유기용매에 용해된다. 즉, 비극성 용매로 더 많이 분배된다. 그런 후, 상기의 비극성 유기용매의 용액을 제거하고, 수용액으로부터 물을 제거하면 부분적으로 정제된 본 발명의 옥수수 추출물을 얻을 수 있다. 이러한 과정에 의하여, 추출 공정에 의하여 얻은 옥수수 추출물로부터 비극성 유기용매에 잘 용해되는 비유효성분을 제거할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 비극성 유기용매로는 일반적으로 분획을 위하여제공되는 극성도 표에서 석유에테르 이하의 극성도를 가지고 물과 혼합되지 않는 유기용매를 사용하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 비극성 용매는 헥산이다. 일반적으로 분획을 위하여 제공되는 극성도 표에 도시된 유기용매의 극성도 순서를 개략적으로 기술하면 다음과 같다.

시클로헥산 < n-펜탄 < 헥산 < 이소옥탄 < 석유에테르(petrolether) < 자일롤(xylol) < 이소프로필에테르 < 톨루엔 < 디에틸에테르 < 클로로포름 < 디클로로메탄 < 테트라히드로퓨란 < 아세톤 < 디옥산 < 에틸아세테이트 < n-프로판올 < n-부탄올 < 에탄올 < 메탄올 < 물 (비극성에서 극성의 순서로 기재). 여기에 기재되지 않은 용매들에 대해서는 보다 상세한 표에서 극성도를 참조할 수 있다.

보다 상세하고 체계화된 용매의 극성도는 딤로스 및 라이차트 (Dimroth and Reichardt)(Christian Reichant, "Solvents and solvent effects in organic chemistry", 2nd Ed., 1988 published by VCH Verlagsgesellschaft mbH 참조)에 의해 제안된 용매 극성도 파라미터, 특히 표준화된 용매 극성도 파라미터에 의하여 얻을 수 있다. 상기 용매 극성도 파라미터(E_T)는 하기 화학식 (1) 및 (2)의 피리디늄-N-페녹사이드 베타인 염료들(pyridinium-N-phenoxide betain dyes)의 장파장 용매색채 흡수 밴드(longest-wavelength solvatochromic absorption band)에 대한 전이 에너지를 수학식 (1)에 의하여 계산함으로써 구해진다.

화학식 1

화학식 2

수학식 1

상기 수학식에서, h는 플랑크 상수이고, c는 빛의 속도이며,는 전자적 여기(electronic excitation)를 생성하는 포톤(photon)의 파수(wavenumber)이고, N_A는 아보가드로수이다.

메탄올에 대하여 E_T값이 55.4라는 의미는 메탄올에 용해된 상기의 염료 1 몰을 전자적 바닥 상태(electronic ground state)로부터 첫 번째 여기 상태(first excited state)로 만드는데 필요한 전이 에너지(transition energy)가 55.4 kcal라는 것이다. 측정은 통상적으로 25℃ 및 1 바(bar)의 조건에서 수행된다.

한편, 상기 화학식 (1)의 피리디늄-N-페녹사이드 베타인 염료는 물에 약간 용해되고, 극성 용매에는 잘 용해되지 않으며, 비극성 용매에는 전혀 용해되지 않는다. 따라서, 이러한 용해도 문제를 해결하기 위하여, tert-부틸기가 다섯 개 치환된 화학식 (2)의 소수성 베타인 염료를 제2 참조 프로브(secondary reference probe)로서 추가적으로 사용한다.

또한, 상기의 용매 극성도 파라미터(E_T)를 수학식 (2)에 따라 표준화한 표준화 용매 극성도 파라미터 (normalized E_T ^N)를 사용하는 것이 편리하다. 이 표준화는 물과 테트라메틸실란(tetramethylsilane; TMS)를 극단 참조 용매(extreme reference solvent)로 사용하였다.

수학식 2

상기와 같은 계산에 의하여 여러 가지 용매들에 대하여 용매 극성도 파라미터를 얻을 수 있으며, 주요한 용매들에 대한 용매 극성도 파라미터를 다음 표에 나타낸다.

표 1

용매	E_T(kcal·mol^-1)	E_T ^N(표준화 값)
테트라메틸실란	30.7	0.000
n-펜탄	31.0	0.009
n-헥산	31.0	0.009
n-옥탄	31.1	0.012
사이클로헥산	30.9	0.006
디클로로메탄	40.7	0.309
1,2-디클로로에탄	41.3	0.327
벤젠	34.3	0.111
톨루엔	33.9	0.099
메탄올	55.4	0.762
에탄올	51.9	0.654
1-프로판올	50.7	0.617
1-부탄올	50.2	0.602
1-펜탄올	49.1	0.568
1-헥산올	48.8	0.559
1,2-에탄다이올	56.3	0.790
페놀	61.4 (40℃)	0.948
다이에틸 에테르	34.5	0.117
테트라하이드로퓨란	37.4	0.207
1,4-다이옥산	36.0	0.164
아세톤	42.2	0.355
2-헥사논	40.1	0.290
아세트산	51.7	0.648
에틸 아세테이트	38.1	0.228
피롤리딘-2-온	48.3	0.543
피리딘	40.5	0.302
물	63.1	1.000

본 발명에서 사용할 수 있는 비극성 용매로는 피리디늄-N-페녹사이드 베타인 염료들(pyridinium-N-phenoxide betain dyes)의 장파장 용매색채 흡수 밴드(longest-wavelength solvatochromic absorption band)에 대한 전이 에너지를 실험적으로 측정하여 얻은 상기의 용매 극성도 파라미터의 값이 0.15 이하, 바람직하게는 0.1 이하 인 것을 사용할 수 있다. 바람직한 비극성 용매의 예로는 n-헥산, 시클로헥산, n-펜탄, n-옥탄, 석유에테르, 톨루엔 등을 들 수 있다.

또한, 물에 잘 용해되는 비유효성분을 제거하기 위하여, 추출 공정에서 얻은옥수수 추출물의 수용액 또는 수현탁액에 물과 혼합되지 않는 극성 유기용매를 상기와 같은 방식으로 접촉시킨다. 그러면, 물에 잘 용해되는 비유효성분은 물에 더 많이 분배되고, 반면에 극성 유기용매에 잘 용해되는 유효성분은 극성 유기용매에 더 많이 분배된다. 따라서, 수용액을 제거하고, 극성 유기 용매의 용액으로부터 극성 유기용매를 제거하면, 부분적으로 정제된 옥수수 추출물을 얻을 수 있다. 이러한 과정에 의하여, 추출 공정에 의하여 얻은 옥수수 추출물로부터 물에 잘 용해되는 비유효성분을 제거할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 극성 유기용매로는 바람직하게, 일반적으로 분획을 위하여 제공되는 극성도 표에서 디에틸에테르 이상에서 부탄올 이하의 극성도를 가지고 물과 혼합되지 않는 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 극성 유기용매는 에틸아세테이트, 부탄올 및 이들의 혼합용매이다. 또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 극성 용매로는 피리디늄-N-페녹사이드 베타인 염료들(pyridinium-N-phenoxide betain dyes)의 장파장 용매색채 흡수 밴드(longest-wavelength solvatochromic absorption band)에 대한 전이 에너지를 실험적으로 측정하여 얻은 상기의 용매 극성도 파라미터의 값이 0.1~0.9의 범위, 바람직하게는 0.2~0.8의 범위 인 것을 사용할 수 있다. 바람직한 극성 용매의 예로는 디클로로메탄(MC), 클로로포름, 1-부탄올, 1-펜탄올, 1-헥산올, 시클로헥산올, 1-도데칸올, 디에틸 에테르, 테트라하이드로퓨란, 에틸 아세테이트, 에틸 아세토하세테이트, 에틸 벤조에이트 등을 들 수 있다.

상기에서 설명한 비극성 유기용매에 잘 용해되는 비유효성분의 제거 및 물에잘 용해되는 비유효성분의 제거는 순차적으로 진행하는 것이 바람직하며, 필요에 따라서는 어느 하나만을 수행할 수도 있다. 또한, 물에 잘 용해되는 비유효성분을 제거하기 위해서는 옥수수 추출물을 극성 유기 용매에 녹인 후 여기에 물을 접촉시킬 수도 있다.

상기에서 설명한 바와 같은 방법에 의하여 얻어진 옥수수 추출물 또는 부분적으로 정제된 옥수수 추출물은 장내에서 아밀라제의 활성을 억제함으로써 저당류의 흡수를 억제하여 혈당의 상승을 막고, 소화되지 않는 탄수화물로 인하여 포만감을 유도할 수 있다. 또한, 식용 식물로부터 추출한 것으로 인체 또는 동물에 해가 없다.

따라서, 본 발명의 옥수수 추출물은 아밀라제 활성과 관련되는 질병의 치료 또는 예방을 위하여 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 상기의 방법에 의하여 얻은 옥수수 추출물 또는 부분적으로 정제된 옥수수 추출물과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 아밀라제 활성과 관련되는 질병을 치료 또는 예방할 수 있는 의약적 조성물을 제공한다. 여기에서, 아밀라제 활성과 관련되는 질병이란 비만증 또는 당뇨병, 특히 비만증을 수반하는 당뇨병, 또는 고혈당증 등이다.

본 발명의 의약적 조성물은 아밀라제 활성을 억제하는 유효성분으로서, 옥수수로부터 추출된 옥수수 추출물을 포함한다. 이러한 옥수수 추출물은 통상적으로 담체와 조합되어 제형화된다. 본 발명의 의약적 조성물은 입자나 태블릿(Tablet) 형태와 같은 고형분의 제형으로도 사용될 수 있으며, 액상의 제형으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 옥수수 추출물을 함유하는 의약적 조성물의 제형을 제조함에 있어서, 옥수수 추출물을 담체, 부형제 및 희석제와 함께 혼합하거나 이들로 희석하여 제조된 조성물을 캅셀, 새세이(sachet) 또는 기타 용기의 형태의 담체 등에 봉입시키는 것이 바람직하다. 이러한 제형들은, 예를 들어, 정제, 환제, 과립제, 분말, 새세이, 엘렉실제, 현탁제, 유제, 액제, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라킨 캅셀제, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 특히, 경구 투여용으로 적합한 형태가 바람직하다.

본 발명의 의약적 조성물에 사용되는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 알루미늄염, 페녹시에틸에탄올, 물, 생리식염수, 락토즈, 덱스트로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 의약적 조성물의 제형은 충진제, 항응집제, 윤활유제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수 있다.

본 명세서에서 언급하는 유효량이란 포유동물의 장내에서 체내로 흡수되는 저당류의 양을 감소시킬 수 있는 최소량을 의미하며, 체내로 투여되는 본 발명의 추출물의 양은 투여경로, 투여대상을 고려하여 조정될 수 있다.

본 발명의 의약적 조성물은 투여 대상 개체에 매일 일 회 이상 투여될 수 있다. 단위 투여량은 사람 피험자 및 다른 포유동물을 위한 단위 투여에 적합하게 물리적으로 분리된 단위량을 의미하며, 각 단위 투여량은 적절한 약학적 담체와 치료효과를 나타내는 본 발명의 추출물을 함유한다.

성인의 경우, 경구 투여용 투여 단위량은 본 발명의 옥수수 추출물 0.1g 이상을 함유하는 것이 바람직하며, 본 발명의 옥수수 추출물의 약학적 유효량은 경구 투여량으로 일 회에 0.1 내지 10g, 바람직하게는 0.5 내지 5g 이다. 그러나, 투여량은 환자의 체중, 비만증 및 당뇨병의 심각도와 사용되는 추출물과 보조 유효성분에 따라 가변적이다. 또한, 일일 총 투여량을 여러 회로 분할하여 필요에 따라 연속적으로 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량의 범위는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 아니한다.

또한, 본 발명의 옥수수 추출물은 이당류 이상의 다당류, 특히 탄수화물을 포함하는 식품과 함께 식용할 경우, 탄수화물의 소화를 억제함으로써 체내로 흡수되는 저당류의 양을 줄여 혈당의 상승을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 옥수수 추출물은 식품 섭취시에 식품 섭취자의 혈당을 조절하기 위한 식품 첨가물로서 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 옥수수로부터 추출한 옥수수 추출물 또는 부분적으로 정제된 옥수수 추출물을 포함하는, 식품 섭취시에 식품 섭취자의 혈당을 조절하기 위한 식품 첨가물을 제공하는 것이다.

본 발명의 식품 첨가물은 빵, 쿠키, 청량음료, 씹는 껌, 치약, 구강청결제, 버터, 잼, 국수류, 쌀 등과 같은 2당류 이상의 다당류, 특히 탄수화물을 함유하는 음식의 제조과정에서 첨가될 수 있다. 본 발명의 식품 첨가물은 반드시 식품 또는 음식에 첨가되는 형태일 필요는 없으며, 식품의 섭취시 또는 섭취전후에 별도로 섭취할 수 있는 형태이어도 상관없다. 즉, 본 발명의 식품 첨가물이 식품에 첨가된형태가 아니라도 식품의 섭취시에 식품의 섭취자가 식품에 첨가하여 함께 식용하거나, 식품의 섭취시 또는 섭취전후에 식품과는 별도로 섭취하여, 결과적으로 섭취자의 장내에서 식품, 특히 탄수화물의 소화 및 흡수를 억제할 수 있는 형태로 사용된다면 이는 본 발명의 범위에 속하는 것이다. 다시 말하면, 본 발명의 식품 첨가물은 식품에 첨가되는 형태와 실질적으로 동일한 효과를 발휘하도록 제형화된 것을 포함한다.

한편, 본 발명의 옥수수 추출물 또는 부분적으로 정제된 옥수수 추출물을 포함하는 조성물은 반드시 의약품으로 허가되는 것만을 의미하지는 않으며, 통상적인 기능성 식품 또는 건강 보조식품까지도 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.

이하에서는, 구체적인 실시예(및 실험예)를 통하여 본 발명을 구체적으로 예시한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 구체적인 실시 형태를 예시하는 것에 불과하며, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다.

[실시예 1]

옥수수로부터 아밀라제 억제 활성 물질의 추출

옥수수로부터 탄수화물 소화 효소인 알파-아밀라제에 대해서 억제 효과가 있는 활성 추출물을 얻기 위해 옥수수 낟알(corn kernel, 이하 C)과 옥겨(corn husk 또는 corn bran, 이하 CH)를 구입하여 옥수수 낟알의 경우는 잘게 조각 내어 분말 형태로 만들고, 옥겨는 다음 공정에 그대로 사용하였다.

각 옥수수 낟알 분말과 옥겨 5 kg와 15 kg을 각각 10 L, 30 L의 메탄올에 하룻밤 동안 침지하였다. 효과적인 추출을 위해서 37℃에서 온침하고, 교반기를 이용하여 휘저어 주었다. 24 시간 후에 고형분이 가라앉도록 방치하고, 최종 부유물을 제거하기 위해서 깔대기에 탈지면을 넣어 걸러내었다. 증류기(rotary evaporator)로 여과액의 메탄올을 증발시키고, 획득한 추출물의 양을 측정하여 추출물 100 g 당 500 mL의 3차 증류수로 회수하였다.

물로 회수한 추출물을 1차로 동량의 헥산 (DAEJUNG chemicals & metals Co. Ltd., Korea, 이하 H)과 혼합하여 분리장치(separation funnel)에 넣고, 교반 후 24시간 동안 방치하여 상층의 헥산층만을 분리하였다. 헥산으로 2-3회 더 재 분획하고, 증류기를 이용하여 헥산 분획물을 농축한 후, 진공 오븐에서 용매를 완전히 제거하여 건조시켰다.

남은 물층은 2차로 동량의 메틸렌 클로라이드(methylene chloride, 이하 MC) (DAEJUNG)와 혼합하여 분리장치에 넣고, 교반 후 24 시간 동안 방치하여 하층의 MC 층만을 분리한다. MC로 2-3회 더 재 분획하고, 증류기를 이용하여 MC 분획물을 농축한 후, 진공 오븐에서 용매를 완전히 제거하여 건조시켰다.

남은 물층은 3차로 동량의 에틸 아세테이트(ethyl acetate, 이하 EA) (DAEJUNG)와 혼합하여 분리장치에 넣고, 교반 후 24 시간 동안 방치하여 상층의 EA 층만을 분리한다. EA로 2-3회 더 재 분획하고, 증류기를 이용하여 EA 분획물을 농축한 후, 진공 오븐에서 용매를 완전히 제거하여 건조시켰다.

남은 물층은 4차로 동량의 부탄올(butanol, 이하 Bu) (DAEJUNG)과 혼합하여 분리장치에 넣고, 교반 후 24 시간 동안 방치하여 상층의 Bu 층만을 분리한다. Bu로 2-3회 더 재 분획하고, Bu 분획물을 증류기를 이용하여 농축한 후, 진공 오븐에서 용매를 완전히 제거하여 건조시켰다.

최종적으로 남은 물층은 증류기를 이용하여 농축한 후, 진공 오븐에서 수분을 제거하여 건조시켰다.

각 분획은 시험관내 아밀라제에 대한 억제활성과 동물실험을 위해서 800 mg/ml의 농도로 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide; Sigma, D-5879)에 녹여 -20℃에서 보관하여 사용하였다.

[실시예 2]

옥수수 추출물의 추가적 정제

실시예 1에서 얻은 EA 분획물을 메틸렌 클로라이드, 메탄올 그리고 증류수의 혼합 비율을 50:3:0.2로 시작하여 점차 극성을 높이는 방법으로 실리카겔 (silicagel; Merck, 9385, 70-230mesh)을 이용한 크로마토그라피를 시행하였다.

EA 분획물은 극성별로 7개의 소분획으로 나누었고, 각 소분획은 시험관내 아밀라제 억제활성 시험 및 동물 실험을 통해 3번과 4번 분획에서 아밀라제 억제활성이 증가함을 확인할 수 있었다.

활성 소분획을 각각 메탄올을 용매로 하여 세파덱스 LH20 (sephadex LH20; pharmacia, 17-0090-01)을 이용한 크로마토그라피를 진행하여 다시금 재분획하였고, 시험관내 아밀라제 활성 시험 및 동물 실험을 통해 활성이 나타난 활성 분획을 30%~10% 아세토나이트릴 (Acetonitril, 이하 MeCN) (DAEJUNG)을 용매로 하는 역상실리카겔 크로마토그라피 그리고 5~20% MeCN 및 메탄올을 이용한 재결정 등을 통해서 분자량 100~300 정도의 활성 화합물들을 분리했다.

정제 과정시 만들어진 소분획은 아밀라제에 대한 억제활성과 동물실험을 통해 활성 분획을 위주로 실험을 진행하였으며 각 소분획 및 활성 화합물은 시험관내 아밀라제에 대한 억제활성과 동물실험을 위해서 100 mg/ml의 농도로 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide; Sigma, D-5879)에 녹여 -20℃에서 따로 보관하여 사용하였다.

[실시예 3]

시험관내 아밀라제 활성시험

옥수수 낟알 (corn kernel)과 옥겨(corn husk)로부터 추출물의 각 유기용매의 용해도에 따른 분획물의 아밀라제 활성 억제 정도를 시험하였다. 아밀라제는 돼지 췌장 아밀라제(porcine pancreatic amylase; sigma, A-6255, USA)을 사용하였고, 기질로는 파라-나이트로페닐-A-d-말토사이드(para-nitrophenyl-A-d-maltoside; sigma, N-5885, 이하 pNPM)를 사용하였다. 아밀라제 작용 완충용액(20 mM phosphate buffer, pH 6.9, 20 mM NaCl, 0.1 mM CaCl₂)에 최종 농도 40 mM 의 기질 pNPM과 추출물을 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에 넣고, 37℃에서 한시간 방치한 후, 돼지 췌장 아밀라제를 최종농도가 56 ug/ml가 되도록 넣고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 1시간 후 흡광도 분석기(spectrophotometry, ELISAreader; Molecular Device Inc., USA)를 이용하여 405 nm (reference 650 nm)에 흡광도를 측정하였다. 위의 실험은 3배수로 수행하였다.

본 명세서에서 억제활성은 다음과 같이 계산되었다.

아밀라제 억제활성 (%) = [(기질에 의한 흡광도 - 기질과 추출물에 의한 흡광도) / (기질에 의한 흡광도)] X 100.

옥수수 낟알(corn kernel)과 옥겨(corn husk) 추출 분획 그리고 분리된 활성 화합물들에 대한 아밀라제 억제 활성은 표 2, 과 표 3에서와 같이 나타났으며, 다른 유기용매에 비해 에틸 아세테이트 분획(C-EA, CH-EA)에서 억제 활성이 높았고, 옥수수 낟알과 옥겨에 대해서 각각 약 50%, 73%의 억제 활성을 보였다. 또한 옥겨의 에틸 아세테이트 분획(CH-EA, 이하 옥수수 추출물) 수율은 출발 물질인 옥겨의 건조 중량에 대해서 약 0.1% (w/w) 이었다.

이와 같은 결과에 의해, 본 발명의 옥수수 추출물은 탄수화물 소화 효소인 아밀라제의 활성을 억제하는데 효과가 있음을 알 수 있었다.

표 2. 옥수수 낟알(corn kernel)로부터 유기용매 분획 추출물의 아밀라제 억제 활성

	C-H	C-MC	C-EA	C-Bu	C-W
농도 (mg/ml)	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
억제활성 (%)	8.8	11.8	50.8	27.3	0.4

C-H : 옥수수 낟알의 추출물에 대한 헥산 분획물, C-MC : 옥수수 낟알의 추출물에 대한 메틸렌 클로라이드 분획물, C-EA : 옥수수 낟알의 추출물에 대한 에틸아세테이트 분획물, C-Bu : 옥수수 낟알의 추출물에 대한 에틸 아세테이트 분획물, C-W : 옥수수 낟알의 추출물에 대한 물 분획물, 아밀라제: 돼지 췌장 아밀라제 사용.

표 3. 옥겨(corn husk)로부터 유기용매 분획 추출물의 아밀라제 억제 활성

	CH-H	CH-MC	CH-EA	CH-Bu	CH-W
농도 (mg/ml)	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
억제활성 (%)	18.7	33.1	73.0	42.2	8.1

CH-H : 옥수수 옥겨의 추출물에 대한 헥산 분획물, CH-MC : 옥수수 옥겨의 추출물에 대한 헥산 분획물, CH-EA : 옥수수 옥겨의 추출물에 대한 에틸 아세테이트 분획물, CH-Bu : 옥수수 옥겨의 추출물에 대한 부탄올 분획물, CH-W : 옥수수 옥겨의 추출물에 대한 물 분획물, 아밀라제: 돼지 췌장 아밀라제.

표 4. 옥겨로부터의 EA 분획물에서 분리된 화합물들에 대한 IC₅₀값

억제제	추출물 1	추출물 3	추출물 4	추출물 5	추출물 7	추출물 10
IC₅₀(mM)	7.1	7.2	7.3	8.7	3.5	6.1

추출물 1~10 : CH-EA에서 분리된 분자량이 100~300 이하의 화합물들 (이하, 활성 화합물이라 함), 아밀라제: 돼지 췌장 아밀라제 사용.

한편, 추출공정에 의하여 옥수수 옥겨로부터 추출하여 얻은 옥수수 추출물 가운데 302g을 실시예 1과 같은 방법으로 각 유기용매의 분획물을 얻은 결과, 헥산(H) 분획물을 64.4g, 메틸렌 클로라이드(MC) 분획물을 12.84g, 에틸 아세테이트(EA) 분획물을 3.94g, 부탄올(Bu) 분획물을 114g, 물(W) 분획물을 106.65g 씩 얻었다. 이 결과와 상기 표 3의 억제 활성 결과로부터, 물층 및 헥산층에 아밀라제 활성을 억제하지 않는 비유효성분들이 상당히 포함되어 있음을 알 수 있고, 또한, 아밀라제 활성을 억제하는 유효성분들이 극성 유기용매에 상당히 포함되어 있음을 알 수 있다. 따라서, 상기의 결과들은, 본 발명에서는 옥수수 추출물 중에 포함되어 있는 유효성분들과 비유효성분들의 극성 및 각 용매에 대한 용해도 차이를 이용하여 본 발명의 옥수수 추출물을 추가적으로 정제할 수 있음을 보여준다. 또한, 대략적으로 평가하면, 에틸 아세테이트는 유효성분에 대한 선택성은 우수하지만, 용해도가 높지 않음을 알 수 있고, 부탄올은 유효성분에 대한 선택성은 에틸 아세테이트보다 떨어지지만, 용해도가 높음을 알 수 있으며, 메틸렌 클로라이드는 선택성 및 용해도 모두가 에틸 아세테이트와 부탄올 사이에 있음을 알 수 있다. 따라서, 옥수수 추출물로부터 아밀라제 활성 억제에 대한 비유효성분을 제거하는 효율은 이들의 혼합용매를 사용함으로써 높게 달성될 수 있을 것이다.

[실시예 4]

옥수수 추출물의 스프래이-달리(Spraue-Dawley) 쥐에서 식후 혈당 강하효과

본 실시예에서 사용한 스프래이-달리(Spraue-Dawley; SD) 쥐 (DAEHAN Biolink Co.Ltd., Korea)는 150~200 g 사이의 6주령, 수컷이다. 사육환경은 12시간 주기조명 (09:00~21:00까지는 조명, 21:00~09:00까지 차광)을 실시하였고, 온도와습도는 각각 22~24℃와 40~60%를 유지하였다.

본 발명의 옥수수 추출물(CH-EA)을 전분과 함께 투여하여 식후 혈당 강하효과를 평가하기 위해서 실시예 2에서 시험관내 아밀라제 억제 활성이 우수한 에틸 아세테이트 분획 추출물을 사용하였다. 전분은 감자 전분(potato starch; sigma, S-2630)을 생리식염수(0.9% NaCl)에 중탕하여 녹인 후, 부형제 (2% Tween-80)를 첨가하여 사용하였으며, 옥수수 추출물은 전분과 부형제를 첨가하여 사용하였다.

상기와 같은 방법으로 제조한 본 발명의 조성물을 투여하기 18 시간 전에 물만 공급함으로 SD 쥐를 절식 시킨 후, 절식 상태의 혈당치를 측정하기 위해 꼬리 끝(tail-tip)을 절단하여 항응고제가 있는 모세관을 사용하여 혈액을 채취하여 혈장(plasma)을 얻었다. 본 발명의 조성물의 식후 혈당 강하 효과를 보기 위해 전분만을 투여하는 군, 옥수수 추출물과 전분을 혼합하여 투여하는 군으로 4마씩 분리하여 전분과 옥수수 추출물을 SD 쥐 체중 kg 당 각각 1g, 100~400 mg이 되도록 경구로 투여 하였다. 투여 후 30, 60분에 상기와 같은 방법으로 채혈하였다.

혈당치는 효소 비색법을 이용한 트린더 키트(Trinder kit, sigma, 315-500)를 이용하여 흡광도 분석기를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액을 기준으로 혈당을 계산하였다. 혈당치의 두 군간의 차이는 언페어드 스튜던트 티-테스트(unpaired Student'st-test)로 검정하였다.

본 실시예에서 얻은 혈당치의 변화는 도 1과 같으며, 옥수수 추출물(CH-EA)을 400 mg/kg의 양으로 SD 쥐에 투여한 후 30분과 60분에 유의성 (p<0.001) 있는 혈당치 강하 효과를 보였다.

[실시예 5]

옥수수 추출물의 아이 씨 알 (ICR) 마우스에서 식후 혈당 강하효과

본 실시예에서 사용한 ICR 마우스(DAEHAN Biolink Co.Ltd., Korea)는 25~30 g 사이의 6주령, 수컷으로 사육환경은 실시예 4과 동일하다.

본 발명의 옥수수 추출물(CH-EA) 및 추가적 정제에 의하여 분리한 활성 화합물 3을 각각 전분과 함께 투여하여 식후 혈당 강하효과를 평가하기 위해서 실시예 4에서와 같은 경구 투여용 조성물을 제조하였다.

상기와 같은 방법으로 제조한 본 발명의 조성물을 투여하기 20 시간 전에 물만 공급함으로 ICR 마우스를 절식 시킨 후, 절식 상태의 혈당치를 측정하기 위해 안와정맥총 (retroorbital venous plexus)에서 항응고제가 있는 모세관을 사용하여 혈액을 채취하여 혈장을 얻었다. 본 발명의 조성물의 식후 혈당 강하 효과를 보기위해 전분만을 투여하는 군, 옥수수 추출물과 전분을 혼합하여 투여하는 군 및 활성 화합물 3과 전분을 혼합하여 투여하는 군으로 5마씩 분리한 후, 전분과 옥수수 추출물을 ICR 마우스 체중 kg 당 각각 1g, 100~400 mg이 되도록 경구로 투여 하였다. 투여 후 30, 60, 120분에 실시예 4와 같은 방법으로 채혈하였다. 혈당치는 효소비색법을 이용하여 실시예 4와 같은 방법으로 수행하였고, 실시예 4와 같은 방법으로 결과를 분석하였다.

본 실시예에서 얻은 혈당치의 변화는 도 2 및 도 3과 같으며, 옥수수 추출물(CH-EA) 및 활성 화합물 3을 100~400 mg/kg의 양으로 ICR 마우스에 투여한후 30분에 유의성 (p<0.001) 있는 혈당치 강하 효과를 보였다.

[실시예 6]

여러 곡물을 이용한 옥수수 추출물의 혈당 강하 효과

본 실시예에서 사용한 SD 쥐와 사육환경은 실시예 4와 동일하다. 본 발명의 추출물을 곡물과 함께 투여하여 식후 혈당 강하효과를 평가하기 위하여 곡류로는 식품으로 시판되는 옥수수 전분, 밀가루를 사용하였으며, 실시예 4에서와 같은 경구 투여용 약제 조성물을 제조하였다.

본 발명의 조성물의 식후 혈당 강하 효과를 보기 위하여, 곡류 투여군, 옥수수 추출물과 곡류를 혼합하여 투여할 군으로 5 마리씩 분리한 후, 곡류와 옥수수 추출물을 SD 쥐 체중 kg 당 각각 0.5g, 400mg 이 되도록 경구로 투여하였다. 투여 후, 30, 60 및 120 분에 상기와 같은 방법으로 채혈하였다. 혈당치는 효소 비색법을 이용하여 실시예 4와 같은 방법으로 수행하였고, 실시예 4와 같은 방법으로 결과를 분석하였다.

본 실시예에서 얻은 혈당치의 변화는 도 4 및 도 5와 같으며, 옥수수 추출물을 400 mg/kg의 양으로 SD 쥐에 투여하여 대조군에 비해 유의성 (p<0.001, p<0.01) 있는 혈당치 강하 효과를 보였다.

[실시예 7]

음이온 교환수지에 의한 추가적 정제 (산수용액에 의한 용출)

탄수화물 소화 효소인 알파-아밀라제의 활성을 억제하는 능력을 가지는 활성 추출물을 얻기 우하여 옥수수 옥겨 10 kg을 40℃에서 12 시간 동안 물과 95% 에탄올(주정)의 혼합 용매로 추출하였다. 물과 95% 에탄올의 혼합 비율에 따른 옥수수 옥겨 조추출물의 돼지 췌장 아밀라제에 대한 저해 효과를 하기 표 5에 나타내었다. 이렇게 추출하여 얻은 옥수수 추출물을 와트만(Watman) No. 1 여과지로 여과하고 증류기(rotary evaporator)로 물과 에탄올을 증발시켜 옥수수 조추출물(crude extracts)을 얻었다. 이 옥수수 조추출물에 1차 증류수 또는 수돗물 1 부피를 가해 40~80℃에서 1 시간 동안 교반하고 와트만 No. 1 여과지로 여과하였다. 다시 여과액을 농축하여 얻은 농축 추출물에 1 부피의 주정(95% 에탄올)을 가하여 1시간 동안 교반하고 와트만 No. 1 여과지로 여과한 후 희석 1N NaOH 수용액으로 여과액의 수소이온농도(pH)를 8~9로 조정하였다. 이렇게 pH를 조정한 추출액을 반응기에서 pH 7~8의 수용액으로 평형화되어 있는 음이온 교환수지(Diaion SA 10 AP resin)에 접촉시킨 후, 수지와 결합하지 않은 물질을 제거하기 위하여 1차 증류수 또는 수돗물로 수지를 세척하고 그 용액을 반응기로부터 제거하였다. 그런 후, 음이온 교환수지의 반응기에 희석된 염산(0.5N HCl)으로 pH가 2~6.5로 조정된 수용액을 첨가하고 2 시간 동안 교반하고 이어서 1 시간 동안 정치시킨 다음에 수용액을 회수하였다. 계속하여, 이 수용액을 희석 수산화 나트륨(1N NaOH)으로 중화시키고 여과지(Watman No. 1)로 여과한 후 농축하여 옥겨 추출물을 얻었다. 이 때, pH 2의 수용액을 사용한 경우 옥겨 추출물의 수율은 1%였다. 이렇게 하여 얻은 추출물의 돼지 췌장 아밀라제에 대한 저해 정도를 도 6에 나타내었다.

표 5

물과 주정의 혼합 비율에 따른 옥수수 옥겨 조추출물의 돼지 췌장 아밀라제에 대한 저해 효과

물과 에탄올 혼합비율	아밀라제 저해 %
물 100%	10
물 90% + 에탄올 10%	12
물 75% + 에탄올 25%	15
물 50% + 에탄올 50%	19
물 25% + 에탄올 75%	25
물 10% + 에탄올 90%	30
에탄올 100%	35

상기 표에서 에탄올은 주정(에탄올 95%)임.

[실시예 8]

음이온 교환수지에 의한 추가적 정제 (염수용액에 의한 용출)

탄수화물 소화 효소인 알파-아밀라제의 활성을 억제하는 능력을 가지는 활성 추출물을 얻기 위하여 옥수수 옥겨 10 kg을 40℃에서 12 시간 동안 물과 95% 에탄올(주정)의 혼합 용매로 추출하였다. 물과 95% 에탄올의 혼합 비율에 따른 옥수수 옥겨 조추출물의 돼지 췌장 아밀라제에 대한 저해 효과를 표 5에 나타내었다. 이렇게 추출하여 얻은 옥수수 추출물을 와트만(Watman) No. 1 여과지로 여과하고 증류기(rotary evaporator)로 물과 에탄올을 증발시켜 옥수수 조추출물(crude extracts)을 얻었다. 이 옥수수 조추출물에 1차 증류수 또는 수돗물 1 부피를 가해 40~80℃에서 1 시간 동안 교반하고 와트만 No. 1 여과지로 여과하였다. 다시 여과액을 농축하여 얻은 농축 추출물에 1 부피의 주정(95% 에탄올)을 가하여 1시간 동안 교반하고 와트만 No. 1 여과지로 여과한 후 희석 1N NaOH 수용액으로 여과액의 수소이온농도(pH)를 8~9로 조정하였다. 이렇게 pH를 조정한 추출액을 반응기에서 pH 7~8의 수용액으로 평형화되어 있는 음이온 교환수지(Diaion SA 10 AP resin)에 접촉시킨 후, 수지와 결합하지 않은 물질을 제거하기 위하여 1차 증류수 또는 수돗물로 수지를 세척하고 그 용액을 반응기로부터 제거하였다. 그런 후, 음이온 교환수지의 반응기에 0.01~0.5 M NaCl 수용액을 첨가하고 2 시간 동안 교반하고 이어서 1 시간 동안 정치시킨 다음에 수용액을 회수하였다. 계속하여, 이 수용액을 여과지(Watman No. 1)로 여과한 후 농축하여 옥겨 추출물을 얻었다. 이 때, 0.5 M NaCl의 수용액을 사용한 경우 옥겨 추출물의 수율은 1%였다. 이렇게 하여 얻은 추출물의 돼지 췌장 아밀라제에 대한 저해 정도를 도 7에 나타내었다.

본 발명의 옥수수 추출물은 탄수화물 소화 효소인 아밀라제의 활성을 억제함으로써 저당류의 체내 흡수를 억제하여 혈당의 상승을 막고, 영양분의 과다 섭취를 줄임으로써 당뇨병 또는 비만증의 예방 및 치료에 효과를 나타내며, 소화되지 않는 탄수화물로 인하여 포만감을 유도할 수 있어 다이어트 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 식용 식물로부터 추출한 것이므로 인체에 해가 없다.

따라서, 이러한 본 발명의 옥수수 추출물은 비만증 또는 당뇨병의 예방 및 치료를 위한 의약적 용도로 사용될 수 있으며, 또한, 식품 또는 음식에 첨가하여 탄수화물의 소화를 억제함으로써 섭취자의 혈당을 조절하고, 포만감을 유도할 수있는 식품 첨가물의 용도로 사용될 수 있다.

Claims

옥수수를 물 또는 극성 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 된 추출용매로 추출하는 단계,

상기 추출단계에서 얻은 추출액으로부터 고형분을 제거하는 단계, 및

상기 추출액으로부터 상기 추출용매를 제거하여 옥수수 추출물을 얻는 단계를 포함하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 옥수수는 옥수수 낟알 (corn kernel) 또는 옥수수 옥겨 (corn husk) 인 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 극성 유기용매는 탄소수 1~4 개인 저급 알코올인 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 추출단계는 0~100℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 고형분 제거 단계는 원심분리 또는 여과에 의하여 고형분을 제거하고 상등액 또는 여과액을 얻는 것임을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 추출물을 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제6항에 있어서,

상기 추출물의 정제 단계는

상기 추출물을 물에 녹이거나 현탁시키는 단계,

상기 추출물 수용액 또는 수현탁액을 물과 혼합되지 않는 극성 유기용매 또는 비극성 유기용매와 접촉시켜서 상기 추출물의 성분들을 분배시키는 단계, 및

상기 극성 유기용매의 용액 또는 상기 수용액을 회수하고, 이로부터 상기 극성 유기용매 또는 물을 제거하여 부분적으로 정제된 옥수수 추출물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제6항에 있어서,

상기 추출물의 정제 단계는

상기 추출물을 물에 녹이거나 현탁시키는 단계,

상기 추출물 수용액 또는 수현탁액을 물과 혼합되지 않는 비극성 유기용매와 접촉시켜서 상기 추출물 수용액 또는 수현탁액에 있는 아밀라제 억제활성을 갖지 않는 성분을 상기 비극성 유기용매로 분배시키는 단계,

상기 비극성 유기용매의 용액을 제거하는 단계,

상기 추출물 수용액 또는 수현탁액을 물과 혼합되지 않는 극성 유기용매와 접촉시켜서 상기 추출물 수용액 또는 수현탁액에 있는 아밀라제 억제활성을 갖는 유효성분을 상기 극성 유기용매로 분배시키는 단계, 및

상기 극성 유기용매의 용액을 회수하고, 이로부터 상기 극성 유기용매를 제거하여 부분적으로 정제된 옥수수 추출물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,

상기 극성 유기용매는 화학식 (1) 및 (2)의 피리디늄-N-페녹사이드 베타인 염료들(pyridinium-N-phenoxide betain dyes)의 장파장 용매색채 흡수 밴드(longest-wavelength solvatochromic absorption band)에 대한 전이 에너지를 실험적으로 측정하여 얻은 용매 극성도 파라미터의 값이 0.1~0.9의 범위의 극성도를 가지고, 물과 혼합되지 않는 유기용매인 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제9항에 있어서,

상기 극성 유기용매는 디클로로메탄(MC), 클로로포름, 1-부탄올, 1-펜탄올, 1-헥산올, 시클로헥산올, 1-도데칸올, 디에틸 에테르, 테트라하이드로퓨란, 에틸 아세테이트, 에틸 아세토아세테이트, 에틸 벤조에이트 또는 이들의 혼합용매 인 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,

상기 비극성 유기용매는 화학식 (1) 및 (2)의 피리디늄-N-페녹사이드 베타인 염료들(pyridinium-N-phenoxide betain dyes)의 장파장 용매색채 흡수밴드(longest-wavelength solvatochromic absorption band)에 대한 전이 에너지를 실험적으로 측정하여 얻은 용매 극성도 파라미터의 값이 0.15 이하의 극성도를 가지고, 물과 혼합되지 않는 유기용매인 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제11항에 있어서,

상기 비극성 유기용매는 n-헥산, 시클로헥산, n-펜탄, n-옥탄, 석유에테르, 톨루엔 또는 이들의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제6항에 있어서,

상기 추출물의 정제 단계는 크로마토그래피에 의하여 상기 추출물 중에 혼합되어 있는, 아밀라제 억제활성을 갖지 않는 성분을 제거하는 것임을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제13항에 있어서,

상기 크로마토그래피는 음이온 교환수지를 사용하는 것임을 특징으로 하는아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제14항에 있어서,

상기 옥수수 추출물을 상기 음이온 교환수지와 접촉시키는 단계,

상기 음이온 교환수지를 물로 세척하여 상기 수지에 결합되지 않은 물질을 제거하는 단계,

용출 용액에 의하여 상기 음이온 교환수지에 결합되어 있는 활성 성분들을 용출시키는 단계, 및

상기 용출된 활성 성분들을 농축시켜서 부분적으로 정제된 옥수수 추출물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
제15항에 있어서,

상기 용출 용액은 산 수용액 또는 염 수용액 인 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물의 제조방법.
옥수수를 물 또는 극성 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 된 추출용매로 추출하는 단계,

상기 추출단계에서 얻은 추출액으로부터 고형분을 제거하는 단계, 및

상기 추출액으로부터 상기 추출용매를 제거하여 옥수수 추출물을 얻는 단계를 포함하는 제조방법에 의하여 제조되는, 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물.
제17항에 있어서,

상기 옥수수는 옥수수 낟알 (corn kernel) 또는 옥수수 옥겨 (corn husk)인 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물.
제17항에 있어서,

상기 추출물을 물에 녹이거나 현탁시키는 단계,

상기 추출물 수용액 또는 수현탁액을 물과 혼합되지 않는 극성 유기용매 또는 비극성 유기용매와 접촉시켜서 상기 추출물의 성분들을 분배시키는 단계, 및

상기 극성 유기용매의 용액 또는 상기 수용액을 회수하고, 이로부터 상기 극성 유기용매 또는 물을 제거하여 부분적으로 정제된 옥수수 추출물을 얻는 단계를 포함하는 추가적인 정제 공정에 의하여 상기 추출물을 부분적으로 정제하여 얻어지는, 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물.
제17항에 있어서,

상기 추출물을 물에 녹이거나 현탁시키는 단계,

상기 추출물 수용액 또는 수현탁액을 물과 혼합되지 않는 비극성 유기용매와 접촉시켜서 상기 추출물 수용액 또는 수현탁액에 있는 아밀라제 억제활성을 갖지 않는 성분을 상기 비극성 유기용매로 분배시키는 단계,

상기 비극성 유기용매의 용액을 제거하는 단계,

상기 추출물 수용액 또는 수현탁액을 물과 혼합되지 않는 극성 유기용매와 접촉시켜서 상기 추출물 수용액 또는 수현탁액에 있는 아밀라제 억제활성을 갖는 유효성분을 상기 극성 유기용매로 분배시키는 단계, 및

상기 극성 유기용매의 용액을 회수하고, 이로부터 상기 극성 유기용매를 제거하여 부분적으로 정제된 옥수수 추출물을 얻는 단계를 포함하는 추가적인 정제 공정에 의하여 상기 추출물을 부분적으로 정제하여 얻어지는, 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물.
제17항에 있어서,

상기 옥수수 추출물을 음이온 교환수지를 사용하는 추가적인 정제 공정에 의하여 부분적으로 정제하여 얻어지는, 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물.
제21항에 있어서,

상기 음이온 교환수지를 이용하는 추가적인 정제 공정은

상기 옥수수 추출물을 상기 음이온 교환수지와 접촉시키는 단계,

상기 음이온 교환수지를 물로 세척하여 상기 수지에 결합되지 않은 물질을 제거하는 단계,

용출 용액에 의하여 상기 음이온 교환수지에 결합되어 있는 활성 성분들을 용출시키는 단계, 및

상기 용출된 활성 성분들을 농축시켜서 부분적으로 정제된 옥수수 추출물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물.
제22항에 있어서,

상기 용출 용액은 산 수용액 또는 염 수용액 인 것을 특징으로 하는 아밀라제의 활성을 억제할 수 있는 옥수수 추출물.
제17항 내지 제23항 중 어느 한 항의 옥수수 추출물과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 아밀라제 활성과 관련되는 질병을 치료 또는 예방할 수 있는 의약적 조성물.
제24항에 있어서, 상기 아밀라제 활성과 관련되는 질병은 비만증 또는 당뇨병인 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
제24항에 있어서, 상기 의약적 조성물은 의약적 경구 투여에 적합한 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
제17항 내지 제23항 중 어느 한 항의 옥수수 추출물을 포함하는, 식품 섭취시에 식품 섭취자의 혈당을 조절하기 위한 식품 첨가물.
제27항에 있어서, 상기 식품 첨가물은 이당류 이상의 다당류를 함유하는 식품에 첨가되는 것을 특징으로 하는 식품 첨가물.
제27항에 있어서, 상기 식품 첨가물은 섭취시 체중의 증가를 예방 또는 억제하기 위한 것임을 특징으로 하는 식품 첨가물.