KR20030019366A - 세균 감염의 치료 및 예방을 위한 화합물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포어-형성 독소의 돌연변이형을 제공한다. 이러한 돌연변이 독소들은 세균 감염의 예방을 위한 백신에 사용될 수 있다. 또한, 우세한 음성 돌연변이체들이 세균 감염의 치료를 위한 치료제로서 투여될 수도 있다.
Description
연방정부 자금에 의한 연구에 대한 진술
본 발명은 NIH(National Institute of Health)의 기금 R37-AI22021 및 2T32-AI07410에 의해 자금을 지원받았다. 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 갖는다.
탄저병(바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis))의 병인(etiologic agent)은, 에어로솔화된비. 안트라시스포자에의 노출이 인간과 같은 포유동물에 치명적일 수 있기 때문에, 세균전 또는 생물학적 테러의 약제로서의 위협이 될 가능성이 있다. 이 생물체에 의해 생산되는 주요한 유독 인자들은 폴리-D-글루탐산 캡슐과 탄저 독소(ATx)이다. 캡슐과 독소는 양자 모두 세균에 의한식민지화(colonization)와 면역 회피(immune evasion)에 일조한다. ATx는 단독으로 숙주의 사망을 초래할 수 있다. 독소에 대한 예방접종은 숙주를 감염으로부터 보호한다.
탄저 독소는 A-B 독소라 명명된 세균 독소 부류의 일원이다. A-B 독소는 두 개의 단위체(moiety)들로 구성되어 있다: A 단위체는 표적 세포 내의 세포질 표적 상에 독성 효과를 발휘하도록 촉매하는 독소의 효소적 부위이다. B 단위체는 세포수용체에 결합하여, A 단위체가 세포막을 횡단하여 세포의 세포질 내로 전위(translocation)되는 것을 촉진한다.
파상풍균, 보툴리누스균, 디프테리아균 및 탄저균으로부터의 A-B 독소의 B 단위체는 모두 막에 채널을 형성한다. 이러한 채널이 A 단위체의 막 전위를 위한 도관으로 작용할 것이라는 가설이 제안되어 왔다. 탄저 독소의 A 및 B 단위체는 별개의 폴리펩티드로서 세균 세포로부터 분비된다. 다른 A-B 독소의 A 및 B 서브유닛은 단일쇄 폴리페티드로 생산되거나, 또는 세균으로부터 방출되기 이전에 올리고머 독소로 조립되는 개별 쇄로 생산된다. 탄저 독소 A 서브유닛에는, 각각 부종 인자(EF)와 치사 인자(LF)라 불리우는 두 가지 대체형이 존재한다. EF 또는 LF와 보호성 항원(PA)인 B 서브유닛의 비공유결합성 복합체(noncovalent complex)는 각각 부종 독소와 치사 독소라 불리운다. PA는 EF와 LF 양자 모두의 막 전위를 촉진한다.
PA는 83kDa의 단량체형 폴리펩티드로 분비된다. 단량체형 PA는 포유동물 세포 표면의 수용체에 결합한 후, 단백분해적으로 절단된다. C-말단의 63kDa단편(PA63)은 세포에 결합한 채로 남아있고, N-말단의 20kDa(PA20)은 PA63으로부터 분리된다. 이러한 단백분해적 절단 및 PA20의 뒤이은 분리는 PA63에 다음의 두 가지 특성을 부여한다: (1) 프리포어(prepore)라 명명된, 고리형 7량체형 SDS-분리성 구조(ring-shaped heptameric SDS-dissociable structure)로 올리고머화하는 능력, 및 (2) EF와 LF에 결합하는 능력. PA63-EF, PA63-LF, 또는 PA63-EF와 PA63-LF의 조합을 함유하는 올리고머들은 세포내 이입되어 산성 분획으로 전달되며, 거기서 PA63 프리포어가 막 내에 삽입되어 포어(pore)를 형성한다. 포어 형성 중에 또는 그 이후에, EF와 LF는 엔도솜 막을 횡단하여 세포질 내로 전위된다. EF는 칼모듈린(calmodulin)-의존성 아데닐레이트 싸이클라제인데, 이것은 세균이 식세포(phagocyte)에 의해 파괴되는 것을 보호한다. LF는 마크로파지를 사멸시키거나, 또는 더 낮은 농도에서는 마크로파지가 싸이토카인을 과잉생산하도록 유도함으로써 숙주의 사망을 초래할 수 있는 메탈로프로테아제(metalloprotease)이다.
이러한 중독 경로의 결정적인 단계는 PA에 의한 포어 형성이다. 낮은 pH는 PA63 프리포어의 포어로의 전환을 촉발한다. 이러한 전환은 올리고머의 SDS-분리성 상태에서 SDS-내성 상태로의 변형, 및 막횡단(transmembrane) 14-가닥 β-배럴(barrel)의 형성을 수반한다. 이러한 단계들은 EF와 LF의 엔도솜 막을 가로지른 전위, 및 결과적으로는 독소 작용에 필요한 것으로 짐작된다.
[발명의 요약]
첫번째 측면에서, 본 발명은 포어 형성 이원성 A-B 독소의 B 단위체를 제공한다. 상기 B 단위체는 그의 포어-형성 능력의 저해를 초래하는 돌연변이를 보유한다. 한 바람직한 구현예에서, 이러한 돌연변이는 생체내에서(in vivo) 단백질의 포어-형성 능력의 저해를 초래한다. 다른 바람직한 구현예에서, 돌연변이 B 단위체는 시험관내(in vitro) 및/또는 생체내(in vivo)에서 포어-형성 능력이 결여되어 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, B 단위체는 탄저균의 보호성 항원(PA)이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, PA 돌연변이체는 자연발생적인 PA 단백질(서열 21과 같은; 도 13)과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일하며 다음의 변경(alteration)들 중 하나를 보유한 아미노산 서열을 갖는다: K397A, K397D, K397C, K397Q, D425A, D425N, D425E, D425K, F427A, K397 + D425K 이중 돌연변이, K395D + K397D + D425K + D426K 사중 돌연변이, K397D + D425K + F427A 삼중 돌연변이, F427A + △D2L2 이중 돌연변이, K397D + F427A + △D2L2 삼중 돌연변이, K397D + D425K + F427A + △D2L2 사중 돌연변이, F427D, 또는 F427K. 또 다른 바람직한 구현예에서, PA 돌연변이는 서열 1-11 및 13-18 중 임의의 것과 동일한 서열을 갖는다(표 1). 다른 바람직한 PA 돌연변이체들에는, 397번 잔기가 리신 이외의 임의의 아미노산인 PA 돌연변이체(서열 19), 425번 잔기가 아스파르트산 이외의 임의의 아미노산인 PA 돌연변이체(서열 20), 427번 잔기가 페닐알라닌 이외의 임의의 아미노산인 PA 돌연변이체(서열 23), 및 도메인 2(잔기 259-487)에 돌연변이를 가진 PA 돌연변이체가 포함된다. 또 다른 바람직한 돌연변이 B 단위체에는, 표 6에 열거된 변경들 중 하나 이상을 보유하거나 또는 PA의 도메인 2에 해당하는 영역에 돌연변이를 보유한,클로스트리듐 디피사일(Clostridium difficile),씨. 퍼프린겐스(C.perfringens),씨. 스피로포르메(C. spiroforme),씨. 보툴리눔(C. botulinum),바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 또는비. 츄린지엔시스(B. thuringiensis) 독소가 포함된다. 상기 돌연변이 B 단위체의 단편으로서, 해당 독소의 자연발생적인 B 단위체와 비교하여 감소된 포어-형성 능력을 가진 단편들 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 돌연변이 B 단위체, 또는 그러한 돌연변이 B 단위체의 타 폴리펩티드나 단백질에 공유결합된 단편을 보유한 융합 단백질들 또한 본 발명에 포함된다. PA의 아미노산 잔기 302-325(D2L2 루프)의 결실은 특별히 본 발명의 첫번째 측면에서 제외된다.
두번째 측면에서, 본 발명은 약제학상 허용가능한 담체 내에 상기 첫번째 측면의 돌연변이 B 단위체나 △D2L2 PA(잔기 302-325가 결실된 PA 돌연변이체), 또는 그의 단편을 함유한 백신조성물을 특징으로 한다. 바람직한 구현예에서, 백신은 화학적 또는 물리적 수단에 의해서 불활성화될 수 있다.
세번째 측면에서, 본 발명은 인간과 같은 포유동물의 세균 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 상기 두번째 측면의 백신을 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다. 한 바람직한 구현예에 있어서, 백신은 약제학상 적절한 담체 또는 아쥬번트(adjuvant)와 함께 투여된다. 백신은 경구로, 근육내로, 정맥내로, 피하로, 흡입에 의해, 또는 세균 감염을 예방 또는 치료하기에 적합한 도스(dose)를 공급하기에 충분한 임의의 다른 경로에 의해 투여될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서는, 돌연변이 탄저 보호 항원을 포함하는 백신이 탄저 감염을 예방 또는 치료하기 위해 투여된다.
네번째 측면에서, 본 발명은 포어-형성 이원성 A-B 독소의 돌연변이 B 단위체를 제공한다. 돌연변이 B 단위체는 그의 포어-형성 능력의 저해를 초래하는 돌연변이를 보유하고 있다. 돌연변이 B 단위체는 또한 해당 독소의 자연발생적인 B-단위체의 포어-형성 능력을 시험관내 및/또는 생체내에서 저해한다. 한 바람직한 구현예에서, 이러한 돌연변이는 단백질의 포어-형성 능력을 생체내에서 저해한다. 다른 바람직한 구현예에서, 돌연변이 B 단위체는 시험관내 및/또는 생체내에서 포어-형성 능력이 결여되어 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, B 단위체는 타저 보호 항원(PA)이다. 돌연변이 B 단위체는 해당 독소의 A 단위체에 결합할 수 있다. 예를 들어, PA 돌연변이체는 치사 인자 또는 부종 인자인 A 단위체에 결합할 수 있다. 돌연변이 B 단위체는 포유동물 세포의 표면에 있는 수용체에 결합하는데 있어서 자연발생적인 B 단위체와 경쟁할 수도 있다. 돌연변이 B 단위체는 또한 해당 독소의 자연발생적인 B 단위체에 결합할 수도 있다. 그러한 돌연변이체는 자연발생적인 B 단위체와 함께 올리고머화하여, 감소된 포어-형성 능력을 가지는 복합체를 형성하기도 한다. 한 바람직한 구현예에서, 그 복합체는 포어를 형성하여 A 단위체(예컨대, EF 또는 LF)를 막을 가로질러 숙주 세포의 세포질 내로 전위시키는 능력이 결여되어 있다.
네번째 측면의 한 바람직한 구현예에 있어서, 돌연변이 PA는 자연발생적인 PA 단백질(서열 21과 같은; 도 13)과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일하며 다음의 변경들 중 하나를 보유한 아미노산 서열을 갖는다: K397D + D425K 이중 돌연변이, △D2L2(PA의 잔기 302-325가 결실된), K395D + K397D + D425K + D426K 사중돌연변이, D425K, F427A, K397D + D425K + F427A 삼중 돌연변이, F427A + △D2L2 이중 돌연변이, K397D + F427A + △D2L2 삼중 돌연변이, K397D + D425K + F427A + △D2L2 사중 돌연변이, F427D, 또는 F427K. 다른 바람직한 구현예에서는, PA 돌연변이체는 서열 8-18(표 1) 중 임의의 것과 동일한 서열을 갖는다. 다른 구현예에서는, 자연발생적인 PA의 아미노산 395, 397, 425, 426, 또는 그의 조합이 돌연변이되어 있다. 또 다른 구현예에서는, PA의 도메인 2 내의 잔기가 돌연변이되어 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 돌연변이체는 PA의 D2L2 루프 내의 또는 다른 포어-형성 이원성 A-B 독소의 B 단위체의 해당 영역 내의 잔기들 중 적어도 5, 적어도 10, 또는 적어도 20 아미노산의 결실을 갖는다. 돌연변이체는 D2L2 루프의 전체 또는 일부의 결실, 및 그 루프에 대해 N- 또는 C-말단인 아미노산들의 결실을 가질 수 있다. 또 다른 바람직한 돌연변이 B 단위체에는, 표 6에 열거된 변경들 중 하나 이상을 보유하거나 또는 PA의 도메인 2에 해당하는 영역에 돌연변이를 보유한,클로스트리듐 디피사일(Clostridium difficile),씨. 퍼프린겐스(C. perfringens),씨. 스피로포르메(C. spiroforme),씨. 보툴리눔(C. botulinum),바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 또는비. 츄린지엔시스(B. thuringiensis) 독소가 포함된다. 상기 돌연변이 B 단위체의 단편으로서, 자연발생적인 B 단위체에 비하여 감소된 포어-형성 능력을 가지고 있으며 자연발생적인 B 단위체의 포어-형성 능력을 저해하는 단편들 또한 본 발명에 포함된다. 돌연변이 B 단위체, 또는 타 폴리펩티드나 단백질에 공유결합된 돌연변이 B 단위체의 단편을 보유한 융합 단백질들 또한 본 발명에 포함된다.
다섯번째 측면에서, 본 발명은 인간과 같은 포유동물의 세균 감염을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 자연발생적인 B 단위체의 포어-형성 능력을 저해하는, 상기 네번째 측면의 돌연변이 B 단위체 또는 그의 단편을 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서는, 상기 네번째 측면의 PA 돌연변이체 또는 그의 단편이비. 안트라시스(B. anthracis) 포자에 노출된 포유동물의 탄저 감염을 예방 또는 치료하기 위해 투여된다. 다른 구현예에서, 단백질은 예방적으로 투여된다. 한 바람직한 구현예에서, 돌연변이 B 단위체는 약제학상 적절한 담체와 함께 투여된다. 돌연변이체는 경구로, 근육내로, 정맥내로, 피하로, 흡입에 의해, 또는 탄저 감염을 예방 또는 치료하기에 적합한 도스(dose)를 공급하기에 충분한 임의의 다른 경로에 의해 투여될 수 있다. 한 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 자연발생적인 B 단위체에는 결합하나 우세한 음성 돌연변이(dominant negative mutant) B 단위체에는 결합하지 않는 항원과 같은, 항-B 단위체 항원을 포유동물에 투여하는 단계 또한 포함한다. 한 특정한 구현예에서, 항원은 자연발생적인 PA에는 결합하나 우세한 음성 PA 돌연변이체에는 결합하지 않는다.
여섯번째 측면에서, 본 발명은 상기 첫번째 또는 네번째 측면의 돌연변이 B 단위체(예컨대, PA 돌연변이체)를 코드화하는 핵산을 특징으로 한다.
일곱번째 측면에서, 본 발명은 상기 여섯번째 측면의 핵산을 보유한 벡터를 특징으로 한다.
여덟번째 측면에서, 본 발명은 자연발생적인 PA 또는 표 1에 열거된 PA 돌연변이 단백질에 특이적으로 결합하는 정제된 항체를 특징으로 한다. 한 구현예에서, 항체는 PA 단백질의 D2L2 루프, K397, D425, D426, 또는 F427에 결합한다. 항체는 단클론성 또는 다클론성 항체일 수 있다. 관련 측면에서, 본 발명은, 해당 독소로부터 유래된 본 발명의 B 단위체에 결합하는 것보다 더 큰 친화력을 가지고 포어-형성 이원성 A-B 독소의 자연발생적인 B 단위체에 특이적으로 결합하는 정제된 항체를 특징으로 한다. 다른 관련 측면에서, 본 발명은 해당 독소의 자연발생적인 B 단위체에 결합하는 것보다 더 큰 친화력을 가지고 본 발명의 B 단위체에 특이적으로 결합하는 정제된 항체를 특징으로 한다.
상기 첫번째 또는 네번째 측면의 한 구현예에서, 그들의 유일한 변경으로서 막횡단 포어의 친수성 면(hydrophillic face)에 위치한 잔기의 시스테인으로의 돌연변이를 보유하는 PA 분자들은 특별히 제외된다. 이들 측면의 다른 구현예에서, 그들의 유일한 변경으로서 막횡단 포어의 친수성 면 내의 아미노산의 돌연변이를 보유하는 PA 분자들은 특별히 제외된다. 한 구현예에서, 그들의 유일한 변경으로서, 자연발생적인 PA 내에 Glu302, His304, Asn306, Glu308, His310, Ser312, Phe313, Phe314, Asp315, Gly317, Ser319, Ser321, Gly323, 또는 Ser325에 돌연변이를 보유한 PA 분자들은 상기 첫번째 또는 네번째 측면에서 특별히 제외된다. 이들 측면의 한 구현예에서, 그들의 유일한 변경으로서 D2L2 루프의 아미노산 서열 상의 돌연변이를 보유한 PA 분자들은 특별히 제외된다. 다른 구현예에서, 그들의 유일한 변경으로서 막횡단 포어를 형성하는 아미노산의 돌연변이 또는 결실을 보유한 PA 분자들은 특별히 제외된다. 또 다른 구현예에서, △D2L2 PA는 특별히 제외된다. 또 다른 구현예에서, C-말단 63kDa 트립신분해성(tryptic) 단편(PA63)을 보유하며, 그들의 유일한 변경으로서 막횡단 포어를 형성하는 아미노산의 돌연변이를 보유하는 PA 분자들은 이들 측면 중 어느 하나로부터 특별히 제외된다. 다양한 다른 구현예들에 있어서, 특별히 제외된 PA 돌연변이에 해당하는 돌연변이를 갖는 다른 포어-형성 이원성 A-B 독소들은 이들 측면들 중 어느 하나로부터 특별히 제외된다. 이들 측면의 다양한 구현예에서, 돌연변이 B 단위체는, 자연발생적인 B-단위체가 동일한 A-B 독소로부터의 다른 자연발생적인 분자들에 결합하는 것보다 더 높은 평형상수를 가지고(즉, 더 큰 친화력을 가지고), 동일한 A-B 독소로부터의 자연발생적인 B 단위체에 결합한다. 바람직한 구현예에서, 돌연변이 PA 단백질은 자연발생적인 PA가 다른 자연발생적인 PA 분자에 결합하는 것보다 적어도 2, 5, 10, 또는 20배 더 큰 친화력을 가지고 자연발생적인 PA에 결합한다.
탄저 독소 이외에도, 다른 포어-형성 독소들이 본 발명의 화합물 및 방법에 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들면, 독소의 포어-형성 능력을 저해하거나 또는 자연발생적인 독소의 포어-형성 능력을 저해하는 돌연변이(예컨대, 점 돌연변이 또는 결실 돌연변이)를 보유한, 다른 A-B 독소와 같은 포어-형성 독소들이 본 발명에 포함된다. 이러한 돌연변이를 가진 포어-형성 독소들은, 독소의 병인에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 백신 조성물 또는 방법에 사용가능하다. 어떠한 식으로든 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니나, 타 A-B 이원성 독소들; 콜레라 독소와 같은 이종-올리고머형 독소들(AB5 독소들); 또는 파상풍, 보툴리누스, 또는 디프테리아 독소와 같은 단일 폴리펩티드 A-B 독소들이 사용가능하다. 사용가능한 다른 독소에는,스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 α-헤모리신,애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophyla)로부터의 애로리신,클로스트리듐 셉티쿰(Clostridium septicum)으로부터의 α-독소, 및슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 싸이토톡신이 포함된다. 본 발명은 또한 콜레스테롤-의존성 싸이토리신류, 6량체형 독소류, 또는 7량체형 독소류와 같은 기타 다른 포어-형성 독소에도 관계한다. 6량체형 독소와 7량체형 독소의 예에는 스태필로코쿠스의 α-독소와 관련된 독소들이 포함된다. 한 구현예에서,헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)로부터의 VacA 독소의 결실 돌연변이체는 특별히 제외된다.
"돌연변이"란, 그 핵산에 의해 코드화되는 아미노산 서열이 자연발생적인 서열로부터의 적어도 하나의 아미노산 변경을 갖게 되는 핵산 서열 상의 변경을 의미한다. 돌연변이는, 비제한적으로, 삽입, 결실, 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이, 또는 미스센스(missense) 돌연변이일 수 있다.
"포어-형성 독소"란, 막횡단 수성 포어를 형성하는 독소를 의미한다.
"포어-형성 A-B 독소"란, 두 개의 기능적 단위체들을 보유한 포어-형성 독소를 의미한다; 숙주 세포 배리어 막 내에 포어를 형성하는 한 단위체 (B), 및 막 배리어를 횡단하여 숙주 세포의 특이적 세포내 기질을 효소적으로 개질하는 다른 단위체(A).
"포어-형성 이원성 A-B 독소"란, 포어-형성 독소의 A와 B 단위체가 별개의 단백질 내에 존재하며 숙주 세포를 중독시키는 동안에 상호작용하는, 포어-형성 A-B 독소를 의미한다.
"B 단위체"란, 특이적인 숙주 세포-표면 수용체에 결합해서 독소의 A 단위체와 상호작용하여 A 단위체의 세포 내로의 내화(internalization)를 돕는, 포어-형성 A-B 독소의 구성성분을 의미한다. PA와 같은 다수의 B 단위체들 또한 막횡단 포어를 형성한다.
"보호성 항원(PA)"란, 본원에 기술된 탄저 PA 폴리펩티드의 생물학적 활성들 중 적어도 하나의 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 보유한 폴리펩티드를 의미한다. 상기 폴리펩티드는 Vodkinet al.(Cell 34:693-697, 1983)에 의해 보고된 PA 유전자에 의해 코드화될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 Milleret al.(Biochemistry 38(32):10432-10441, 1999)에 의해 특성화된 야생형 PA(서열 21) 또는바실루스 안트라시스의 한 균주로부터의 임의의 자연발생적인 PA 폴리펩티드와 동일할 수 있다. PA 폴리펩티드는에세리히아 콜라이 (Escherichia coli)또는바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 이종 숙주 내에 클로닝되어 거기에서 발현되기도 한다. 동종체(homolog) 및 유사체(analog)들이 본원에 기술된 탄저 PA의 특성을 가지며, 본 발명의 방법에 사용될 수 있음이 이해된다.
"PA63"이란, PA 폴리펩티드로부터 20kDa N-말단 분절(segment)이 단백분해에 의해 절단된 결과인 카르복시 말단 부분을 의미한다. PA63은 7량체형 프리포어를 형성하며, A 단위체의 두 가지 대체형, 즉 부종 인자(EF)와 치사 인자(LF)에 결합한다. 전체 복합체는 엔도솜 내로 이동되는데, 거기에서 PA63은 막 내로 삽입되어 막횡단 포어를 형성한 후 EF와 LF를 숙주 세포의 세포질 내로 전위시킨다.
"막횡단 포어"란, 막횡단 수성 채널을 의미한다. 예를 들면, 막횡단 포어는 PA63의 교호하는 친수성 및 혐수성 잔기들에 의해 형성된 β-배럴 채널일 수 있는데, 이때 혐수성 잔기들은 배럴의 외부의 막-접촉 표면을 형성하고, 친수성 잔기들은 숙주 세포 막을 횡단하는 포어의 수성 루멘(lumen)에 면한다.
"막횡단 포어의 친수성 면"이란, 숙주 세포 막을 횡단하는 포어의 수성 루멘에 면한 PA의 아미노산들을 의미한다.
"막횡단 포어를 형성하는 아미노산"이란, 막횡단 포어의 β-배럴 채널 내에 위치한 PA의 아미노산을 의미한다.
"D2L2 루프"란, PA 폴리펩티드의 2β2 및 2β3 가닥과 본원에 기술된 PA63 폴리펩티드를 연결하는 친양쪽성(amphiphatic) 루프를 의미한다.
"포어-형성 능력을 저해한다"라 함은, 막 내에 형성된 포어의 양을 감소시키거나, 또는 숙주 세포의 세포질 내로 전위되는 A 단위체의 비율 또는 양을 감소시킴을 의미한다. 포어 형성 또는 독소 전위에 있어서의 이러한 감소는, 본원에 기술된 바와 같은 세포 표면 전위 분석(cell surface translocation assay), LFnDTA 독성 분석, 또는 루비듐 방출 분석에서의 활성의 감소와 절대적으로 관련이 있을 뿐만 아니라, 그에 의해 예측될 수 있다. 이러한 감소된 활성은, 세포 표면 전위 분석에서 세포 내로 전위되는 방사성표지된 리간드의 양에 있어서의 감소, LFnDTA 독성 분석에서 리간드의 세포 내로의 전위에 기인하는 단배질 합성 저해에 있어서의 감소, 또는 루비듐 방출 분석에서 세포로부터의 방사성표지된 이온의 방출에 있어서의 감소와 연관이 있을 수 있다. 또한, 이러한 감소된 활성은 독성 리간드의세포 내로의 전위에 기인하는 독성의 감소와 연관이 있을 수 있다. 한 바람직한 구현예에서, 포어 형성 또는 A 단위체의 전위에 있어서의 감소는 해당 독소의 자연발생적인 B 단위체에 비하여 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 80%이다. 다른 바람직한 구현예에서, PA 돌연변이체에 의한 포어 형성 또는 EF나 LF의 전위에 있어서의 감소는 자연발생적인 PA63에 비하여 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 80%이다.
"포어-형성 능력이 결여되어 있다"라 함은, 막 내에 의미있는 양의 포어를 형성하지 않거나, 또는 의미있는 양의 EF 또는 LF를 숙주 세포의 세포질 내로 전달하지 않음을 의미한다. 의미있는 포어-형성 능력 또는 독소 전위 활성의 이러한 결여는, 본원에 기술된 바와 같은 세포 표면 전위 분석, LFnDTA 독성 분석, 또는 루비듐 방출 분석에서의 의미있는 활성의 결여와 절대적으로 관련이 있을 뿐만 아니라, 그에 의해 예측될 수 있다. 한 바람직한 구현예에서, 형성된 포어의 양 또는 전위된 독소의 양은 PA가 없는 대조 분석에서 검출된 양의 5배 보다 더 적다. 보다 바람직하게는, 그 양은 PA가 없는 대조 분석에서 검출된 양의 2배 보다 더 적다.
"단편"이란, PA 돌연변이체 내의 해당 영역과 동일한, 연속적인 아미노산들로 구성된 영역을 보유한 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 자연발생적인 PA와 비교하여 포어를 형성하거나 독소를 전위시키는 능력이 감소되어 있다. 단편은 또한 자연발생적인 PA의 포어-형성 능력을 저해하기도 한다. 포어 형성 또는 독소 전위에 있어서의 이러한 감소는 본원에 기술된 바와 같은 세포 표면 전위 분석, LFnDTA독성 분석, 또는 루비듐 방출 분석에서의 활성의 감소와 절대적으로 관련이 있을 뿐만 아니라, 그에 의해 예측될 수 있다. 이러한 감소된 활성은 세포 표면 전위 분석에서 세포 내로 전위되는 방사성표지된 리간드의 양에 있어서의 감소, LFnDTA 독성 분석에서 리간드의 세포 내로의 전위에 기인하는 단배질 합성 저해에 있어서의 감소, 또는 루비듐 방출 분석에서 세포로부터의 방사성표지된 이온의 방출에 있어서의 감소와 연관이 있을 수 있다. 한 바람직한 구현예에서, 포어 형성 또는 EF나 LF의 전위에 있어서의 감소는 자연발생적인 PA63에 비하여 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 80%이다. 자연발생적인 PA의 포어-형성 능력의 저해는, 자연발생적인 PA를 단독으로 사용하는 것과 비교하여 자연발생적인 PA와 PA 단편의 등몰(equimolar) 혼합물을 사용하는 상술한 바와 같은 분석에 있어서의 활성의 감소와 절대적으로 연관이 있을 뿐만 아니라, 그에 의해 예측될 수 있다. 한 바람직한 구현예에서, 감소는 자연발생적인 PA만을 사용한 경우의 활성에 비하여 적어도 20, 40, 60, 80, 또는 99%이다. 바람직하게는, 단편은 면역원성이며, 자연발생적인 PA에 대한 보호성 항체의 생산을 유도한다. 다른 바람직한 구현예에서, 실시예 9에 기술된 바와 같이, 단편의 포유동물에의 투여는 적어도 1달, 보다 바람직하게는 3달, 또는 가장 바람직하게는 6달의 기간 동안 탄저 감염을 예방하거나 감소시킨다. 가능한 단편의 예에는, PA 돌연변이체의 C-말단 63kDa 트립신분해성 단편, 또는 막횡단 포어를 형성하는 아미노산들이 결실된 PA 돌연변이체가 포함된다.
"정제된 항체"란, 자연상태에서 그 항체와 결합되어 있는 단백질들 및 자연발생적인 유기분자들이 적어도 60중량%로 제거된 항체를 의미한다. 바람직하게는, 조제물(preparation)은 적어도 75중량%, 보다 바람직하게는 90중량%, 그리고 가장 바람직하게는 99중량%가 항체이다. 정제된 항체는, 예를 들면 재조합 단백질이나 보존된 모티프 펩티드를 사용하는 친화성 크로마토그래피와 표준 기술을 사용하여 수득될 수 있다.
"특이적으로 결합한다"라 함은, 항체가 예를 들면 야생형 PA 또는 PA 돌연변이체를 인식하여 그에 결합하나, 자연적으로 단백질을 포함하는 시료, 예컨대 생물학적 시료 내의 기타 비-PA 분자들은 실질상 인식 및 결합하지 않음을 의미한다. 바람직한 항체는 표 1의 PA 돌연변이체 # 1-18 중 임의의 것에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 항체는 그들이 표 1의 PA 돌연변체들 중 하나 이상과 결합할 때보다 적어도 2, 5, 10, 또는 20배 더 큰 친화력으로 야생형 PA에 결합한다.
서열 동일성(identity)은 통상, 거기에서 지정된 디폴트 파라미터(default parameter)를 가진 서열 분석 소프트웨어(예컨대, 위스콘신주 53705, 매디슨, 1710 유니버시티 애비뉴, 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹의 시퀀스 어낼리시스 소프트웨어 패키지)를 사용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어 프로그램은 상동성의 정도를 다양한 치환, 결실 및 변형(modification)의 탓으로 돌림으로써 유사한 서열들을 매치시킨다. 보존적 치환에는 전형적으로 다음의 그룹들 내에서의 치환이 포함된다: 글리신, 알라닌, 발린, 이소루이신, 루이신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.
본 발명의 다른 특징들 및 이점들은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
포괄적으로, 본 발명은 탄저균(anthrax) 감염과 같은 세균 감염의 치료를 위한 화합물 및 방법을 특징으로 한다.
도 1은 ATx 독소에 의한 중독 경로를 개략적으로 도시한 것이다. ATx 독소의 PA 성분은, 상술한 바와 같이, 포유동물 세포 표면 상의 수용체에 결합하여, 그 독소의 효소성 A 단위체인 부종 인자(EF)와 치사 인자(LF)를 시토졸 내로 전달한다.
도 2A는 틈이난(nicked) PA 돌연변이 단백질의 형성, 및 야생형, K397Q, 및 △D2L2 PA에 의한 SDS-내성 올리고머의 형성을 보여주는 SDS-PAGE 겔의 사진이다. 도 2B는 야생형, K397A, 및 D425A PA에 의한 프리포어의 형성을 보여주는 네이티브 겔(native gel)의 사진이다.
도 3은 무-PA 대조구(no PA control)와 비교하여, 야생형, K397A, 또는 D425A PA와 함께 인큐베이션한 후에86RB 로딩된 세포로부터 방출된86RB의 양을 보여주는 막대 그래프이다.
도 4A는 야생형, K397A, 또는 D425A PA와 함께 인큐베이션된 세포에 의한35S-LFn(LF의 N-말단 1-255 아미노산 PA 결합 도메인) 결합의 유사한 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 도 4B는 야생형 PA와 비교하여, K397A 또는 D425A PA에 의해 매개되는35S-LFn의 세포 내로의 전위에 있어서의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 5는 LFnDTA 독성 분석에서, 세포를 야생형, K397A, 또는 D425A PA와 함께 인큐베이션한 후에 TCA 불용성 분획(단백질 분획) 내의3H-Leu의 퍼센트를 보여주는 그래프이다. 디프테리아 독소의 A-쇄에 융합된 LFn을 함유하는 LFnDTA의 세포 내로의 전위는 EF-2의 리보실화로 이어지며, 이는 결과적으로 단백질 합성의 저해, 및 단백질 분획 내의3H-Leu의 양의 감소를 초래한다.
도 6A는 야생형, △D2L2, 이중돌연변이체 K397D + D425K, 또는 야생형과 △D2L2 혹은 K397D + D425K PA의 혼합물과 함께 인큐베이션된 세포와35S-LFn의 유사한 결합을 보여주는 막대 그래프이다. 도 6B는 △D2L2 또는 K397D + D425K PA에 의한 야생형 PA-매개35S-LFn 전위의 감소를 보여주는 막대 그래프이다.
도 7은 야생형 PA 단독과 비교하여, △D2L2 또는 K397D + D425K PA와 야생형 PA의 인큐베이션 후의 TCA 불용성 분획 내의3H-Leu의 더 높은 퍼센트를 보여주는 그래프이다. 이러한 결과는 LFnDTA 독성 분석에서의 야생형 PA-매개 단백질 합성 저해의 감소와 일치한다.
도 8A는 LFnDTA 독성 분석에서의 야생형 PA-매개 단백질 합성 저해의 감소를 보여주는 그래프이다. 돌연변이 PA 단백질의 농도를 증가시키는 것은,3H-Leu의 TCA 불용성 분획 내로의 흡수에 대한 야생형 PA-매개 저해를 경감시킨다. 도 8B는, 도 8A에 열거된 돌연변이체들에 대해 요구되는 양과 비교하여, 야생형 PA에 비하여 훨씬 더 많은 양의 PA-SSR이3H-Leu 흡수의 야생형 PA-매개 저해를 경감시키는데 요구됨을 보여주는 그래프이다.
도 9는 점증하는 농도의 우세한 음성 PA 돌연변이체가 존재하는데 기인하는, LFnDTA 독성 분석에서의 야생형 PA-매개 단백질 합성 저해의 감소를 보여주는 그래프이다. 우세한 음성 돌연변이체인 K397D + D425K (), △D2L2 (), F427A (), D425K (), 및 K397D (), 그리고 대조구 돌연변이체인 SSSR ()의 효과가 이 도에 도시되어 있다.
도 10은 다음의 우세한 음성 PA 돌연변이체들 중 어느 하나가 점증하는 농도로 존재하는데 기인하는, LFnDTA 독성 분석에서의 야생형 PA-매개 단백질 합성 저해의 감소를 보여주는 그래프이다: K397D + D425K (), F427A + △D2L2 (), K397D + D425K + F427A (), 및 K397D + F427A + △D2L2 ().
도 11은 야생형 PA를 돌연변이 PA(K397D + D425K, △D2L2, F427A, 또는 D425K)와 혼합한 다음 PA 분자를 트립신으로 절단함으로써 형성된 이종-7량체에 의한 단백질 합성 저해를 보여주는 막대 그래프이다. 동등한 양의, 상응하는 돌연변이체와 야생형 동종-7량체의 1:1 혼합물에 의한 단백질 합성 저해 또한 측정되었다.
도 12는 우세한 음성 돌연변이체인 K397D + D425K, △D2L2, F427A, 및 D425K가 저-pH에 의해 촉발되는,35S-LFn의 플라스마 막을 가로지른 전위에 미치는 영향을 보여주는 막대 그래프이다. 도시된 결과는 3회의 실험의 평균값 ±SEM이다.
도 13은 본원에 기술된 분석에 사용되는 야생형 PA 단백질의 아미노산 서열(서열 21)이다. 본원에 개시된 PA 돌연변이 단백질들은 이러한 야생형 서열에 기초한 것이다.
도 14는 본원에 기술된 분석에 사용되는 야생형 PA 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열 22)이다.
도 15는 PA의 아미노산 서열과 ADP 리보실트랜스페라제 활성을 가진 다른 이원성 A-B 독소들을 정렬한 것이다.클로스트리듐 디피사일("cdADPRT"), 씨. 퍼프린겐스("cpiota"),씨. 스피로포르메("csiota"), 및씨. 보툴리눔("cbc2")으로부터의 독소들의 아미노산 서열이 나열되어 있다.씨. 퍼프린겐스와씨. 스피로포르메독소들은 종종 iota 독소라 불리우는 반면에, 보툴리눔 독소는 C2라 불리운다. 또한, 상기 정렬은 식물성 살충 단백질에 대해 종종 VIP라 불리우는,바실루스 세레우스(Bacillus cereus)에 의해 생산되는 독소("VIP1")의 서열을 포함한다.
도 16은 PA의 아미노산 서열과클로스트리듐 디피사일("cdADPRT"), 씨. 퍼프린겐스("cpiota"),씨. 스피로포르메("csiota"), 및씨. 보툴리눔("cbc2")으로부터의 독소들의 아미노산 서열을 정렬한 것이다. 이러한 정렬은 상기 독소들의 완전한 서열을 보여준다.
본 발명자들은 A-B 독소 생산 세균에 의한 감염을 정지시킬 수 있는 수단을 발견하였다. 즉, 본 발명은 탄저 및 괴저(gangrene)를 포함한 특정한 세균 감염증에 대한 해독제로 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 안정하고 면역원석이기 때문에, 그것은 백신으로도 사용될 수 있다.
탄저 PA의 다중 돌연변이체(multiple mutant)들을 작제(construct)하고 발현시켜서 정제한 다음, 그들이 야생형 PA에 비하여 감소된 활성을 갖는지 여부에 대해 분석하였다. 특히, 이들 돌연변이체는 PA 리간드 및 수용체에 결합하는 능력; 프리포어, SDS-내성 올리고머 및 포어를 형성하는 능력; 그리고 리간드를 막을 가로질러 전위시키는 능력에 대해 분석되었다. PA의 X-선 구조에 근거하면, 돌연변이된 잔기들은 PA 프리포어의 루멘 내로 돌출될 것으로 예측된다. 막 내에 포어를 형성하는 능력이 감소되어 있거나 또는 아예 검출되지 않는 PA 돌연변이체나 그의 단편들은 탄저 감염을 예방하기 위해 보호성 항체를 유도하기 위한 백신으로 사용가능하다. 또한, 이러한 돌연변이체들은 감염된 포유동물에서바실루스 안트라시스에 의해 분비되는 EF 및 LF를 전위시키는 능력이 감소되어 있기 때문에, 탄저 감염을 치료하는데 있어서 야생형 PA보다 더 효과적일 수도 있다.
이러한 점 돌연변이체들, 및 도메인 2의 추정상의 막 횡단 루프 2(membrane spanning loop 2)의 잔기 302-325가 결여된 이전에 보고된 결실 돌연변이체(△D2L2)를, 그들이 야생형 PA의 포어 형성을 감소시킴으로써 우세한 음성 저해제로 작용할 수 있는지 여부를 알아보기 위해 더 특성화하였다. 이러한 저해는, 리간드 또는 수용체가 돌연변이체와 결합함으로써 야생형 PA가 결합할 수 있는 분자들이 감소된데 따른 것일 수 있다. 돌연변이체는 또한 야생형 PA와, 포어를 형성하고 리간드를 전위시키는 능력이 감소되어 있거나 또는 아예 검출되지 않는 올리고머를 형성할 수 있다. 우세한 음성 PA 돌연변이체 및 그의 단편들은, 상술한 바와 같이, 탄저 감염의 예방 및 치료를 위해 보호성 항원을 촉발하는 백신으로 사용가능하다. 아울러, 우세한 음성 활성을 가진 돌연변이체 및 단편들은, 감염된 포유동물에서바실루스 안트라시스에 의해 분비되는 PA의 활성을 저해함으로써 탄저 감염을 치료하기 위한 치료제로 사용가능하다. 우세한 음성 돌연변이체는 보호성 항원의 생산을 유도하고 감염 세균에 의해 생산되는 PA의 활성을 저해할 수 있기 때문에, 탄저 감염증을 앓고 있거나 또는 탄저 감염증이 발병할 우려가 있는 개인을 치료하는데 특히 효과적인 백신/치료제 조합으로서 사용가능하다. 독소의 작용을 가능한한 신속하게 중단시켜야 할 필요성 이외에도, 에어로졸화된비. 안트라시스포자에 이미 노출된 개인을 예방접종(vaccination)하는 것 역시 중요하다. 이러한 예방접종은 오랜 기간 동안(최소한 1달) 신체 내에 남아있을 수 있는 포자의 발아에 의한 지연된 탄저 발병(contraction)을 방어하는데 있어 필수적이다.
본 연구에서는, 막 내에 포어를 형성하고 리간드를 전위시키는 능력이 결여되어 있어서 탄저 감염을 예방 또는 치료하기 위한 잠재적인 백신으로 여겨지는, PA의 몇 가지 돌연변이체들이 동정되었다(표 1). 돌연변이체 #1-12는 단백분해에 의해 활성화되고, SDS-분리성 PA 63 프리포어 상태를 형성하고, 그리고 세포 수용체, EF 및 LF에 결합할 수 있었다. 돌연변이의 일부는 프리포어의 SDS-내성 상태로의 전환을 방지하였다(표 1). 이러한 돌연변이체들(K397A, K397C, K397D, D425A, D425N, D425K D425E, D425K, K397D + D425K, 및 K395D + K397D + D425K + D426K)은 또한 포어 형성 및 막 전위에도 결함이 있었다. 다른 부류의 돌연변이체들(△D2L2 PA, K397Q, 및 F427A)은 SDS-내성 올리고머는 형성하나, 막 삽입 및 포어 형성을 거치지 않는다. 이러한 결과는 예기치 못한 것이었다.
| 돌연변이체 # | 서열 | 돌연변이 | SDS-내성 올리고머를 형성합니까? | 채널을 형성합니까? | 우세 음성입니까? |
| 1 | 1 | K397A | 아니오 | 아니오 | 아니오 |
| 2 | 2 | K397D | 아니오 | 아니오 | 아니오 |
| 3 | 3 | K397C | 아니오 | 아니오 | 아니오 |
| 4 | 4 | K397Q | 예 | 아니오 | 아니오 |
| 5 | 5 | D425A | 아니오 | 아니오 | 아니오 |
| 6 | 6 | D425N | 아니오 | 아니오 | 미측정 |
| 7 | 7 | D425E | 아니오 | 아니오 | 아니오 |
| 8 | 8 | D425K | 아니오 | 아니오 | 예 |
| 9 | 9 | F427A | 예 | 아니오 | 예 |
| 10 | 10 | K397D +D425K | 아니오 | 아니오 | 예 |
| 11 | 11 | K395D +K397D +D425K +D426K | 아니오 | 아니오 | 예 |
| 12 | 12 | △D2L2 | 예 | 아니오 | 예 |
| 13 | 13 | K397D +D425K +F427A | 미측정 | 미측정 | 예 |
| 14 | 14 | F427A +△D2L2 | 미측정 | 미측정 | 예 |
| 15 | 15 | K397D +F427A +△D2L2 | 미측정 | 미측정 | 예 |
| 16 | 16 | K397D +D425K +F427A +△D2L2 | 미측정 | 미측정 | 예 |
| 17 | 17 | F427D | 미측정 | 미측정 | 예 |
| 18 | 18 | F427K | 미측정 | 미측정 | 예 |
주) 이들 PA 돌연변이체는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제작되었다.
상기 돌연변이체들 중 몇몇(△D2L2, K397D + D425K 이중 돌연변이, K395D + K397D + D425K + D426K 사중 돌연변이, D425K, F427A, K397D + D425K + F427A 삼중 돌연변이, F427A + △D2L2 이중 돌연변이, K397D + F427A + △D2L2 삼중 돌연변이, K397D + D425K + F427A + △D2L2 사중 돌연변이, F427D, 및 F427K)은 야생형 PA에 의해 매개되는, 리간드의 막 횡단 전위를 저해한다. △D2L2와 K397D + D425K PA 돌연변이체들은 야생형 PA와 리간드를 전위시킬 수 없는 올리고머를 형성하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 예기치 못한 것이었다. 7량체형 프리포어 내에 이러한 돌연변이체들 중 어느 한 단일 분자의 존재는 포어로의 전환을 저해하는데 충분할 수 있다. 야생형 PA에 의한 포어 형성을 차단하는 이러한 능력은, 세포 수용체와의 결합에 대해 야생형 PA와 경쟁하고 EF와 LF를 순환계(circulation)로부터 제거하는 능력과 결합될 때, 이들 돌연변이체를 탄저 감염의 치료 및 예방용으로 특히 매력적으로 만든다.
PA 내의 다른 잔기들의 돌연변이 또한 포어 형성을 저해하거나 우세한 음성 활성을 낳을 수 있다. 예를 들면, Lys397 또는 Asp425의 하전된 측쇄와 정전기적으로 상호작용하는 잔기들도 PA에 의한 포어 형성에 요구될 수 있으며, 이러한 잔기들 중 하나 이상의 돌연변이는 포어 형성을 저해하고 우세한 음성 활성을 초래할 수 있다. 또한, 302-325 D2L2 루프의 더 작은 부분의 결실, 또는 그 루프에 측접하는 아미노산들 및 302-325 영역의 일부 또는 전부의 결실도 이러한 결과를 초래할 수 있다.
포어를 형성하거나 리간드를 전위시키는 능력이 전혀 검출되지 않는 PA 돌연변이체, 및 야생형 PA의 우세한 음성 저해제로 작용하는 돌연변이체를 수득할 수 있는 능력은, 유사한 돌연변이체가스태필로코쿠스 아우레우스로부터의 α-헤모리신,애로모나스 하이드로필라로부터의 애로리신,클로스트리듐 셉티쿰으로부터의 α-독소,슈도모나스 애루지노사로부터의 싸이토톡신, 및 이종-올리고머형 독소류(AB5 독소류)와 같은 다른 독소들, 또는 파상풍, 보툴리누스 혹은 디프테리아 독소의 B 단위체에서도 수득가능함을 제안한다. 아울러, 이러한 결과는 독소에서 애드헤신(adhesin)에 이르는 다수의 다른 올리고머형 독성 인자들의 우세한 음성 형태를 동정할 가능성을 예고한다.
탄저 독소, 및 조립 과정이 세포외 환경과의 접촉 시에 일어나는 다른 올리고머형 시스템들에서, 외부에서 첨가된 돌연변이 서브유닛은 원칙적으로는 최종 구조물 내로 통합될 수 있으며, 이는 그러한 서브유닛이 치료용으로 사용될 가능성을 증가시킨다. 전신 탄저는, 자연발생적인 질병으로서는 드물기는 하지만, 생물전 및 테러의 약제로서 우려되며, 우세한 음성 PA는 훌륭한 치료제 후보로 보인다. 투여된 우세한 음성 PA가 신체 내에서비. 안트라시스에 의해 생산된 야생형 PA와 자유롭게 혼합된다고 가정할 때, 그 단백질이 불활성의 막다른 복합체를 형성하여 LF와 EF 양자의 작용을 차단하기 위해서는 세포 상에서 공-조립(co-assemble)되어야만 한다. 명백한 증상들을 예방하는 이외에도, 우세한 음성 돌연변이체는 전문적인 식세포가 파괴되는 것을 방지함으로써 숙주가 감염을 박멸하는데 일조하기도 한다. 야생형 PA를 사람에게 주사한 이후에 어떠한 심각한 부작용도 관찰되지 않았으며, 따라서 상기 단백질의 돌연변이 불활성형은 전혀 위험을 야기하지 않아야한다.
우세한 음성 PA는 또한 탄저에 대한 새로운 백신의 주성분으로서도 유용하다. 그의 명칭이 내포하는 바와 같이, PA는 탄저에 대한 보호성 항체를 유도하며, 실로 미국에서 현재 허가된 백신의 주요한 면역원이다. 본원에 기술된 △D2L2, K397D + D425K, 및 F427A 돌연변이체들은 피셔 쥐(Fisher rat)에서 야생형 PA에 비하여 면역원성에 있어서 거의 또는 전혀 감소를 시현하지 않는다. 본 발명자들은 또한, 돌연변이체들이 예상 외로 우세한 음성이어서, 돌연변이체:야생형을 0.25:1의 비율로 투여하는 것은 쥐 모델에서 어떠한 검출가능한 탄저 감염 증상도 초래하지 않음을 발견하였다. 정제된 야생형 PA는 현재 허가된 백신의 대체물로서 고려 중에 있으며, 만일 PA의 우세한 음성형이 치료적으로 유효한 것으로 입증되면, 그것 역시 이러한 역할을 수행할 것이므로, 두 가지 거의 동일한 의약을 개발할 필요가 없어진다.
하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것이다. 이들 실시예는 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 달리 언급하지 않는 한, K397A와 D425A PA 돌연변이체들에 대한 데이터는 표 1에 열거된 PA 돌연변이체 #1-12에 대해 얻어진 데이터를 대표한다.
실시예 1: 일반적인 방법
세포 배양, 배지 및 화학물질
챠이니즈 햄스터 오버리-K1 (CHO-K1) 세포들을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American type culture collection)으로부터 입수하였다. 이 세포들을 10% 송아지 혈청, 500 units/mL 페니실린 G, 2mM L-글루타민 및 500units/mL 스트렙토마이신이 보충된 HAM's F-12 내에서 배양하였으며, 습윤 대기 중의 5% CO2조건에서 유지하였다. 세포들은 실험 16-18 시간 이전에 24- 또는 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Costar, Cambridge, MA)에 접종되었다. 세포 배양을 위한 모든 배지는 달리 언급하지 않는 한 Gibco BRL로부터 구입되었다. 모든 화학물질은 달리 언급하지 않는 한 Sigma Chemical Co.로부터 구입되었다.
PA 단백질의 제작 및 정제
PA의 아미노산 302-325를 함유하지 않는 △D2L2 PA 돌연변이체를 공지된 바와 같이 발현시키고 정제하였다(Milleret al., Biochemistry 38:10432-10441, 1999). 표 1의 점 돌연변이 # 1-11을 제조자(Stratagene, La Jolla, CA)의 프로토콜에 따라, 부위특이적 돌연변이유발법(site directed mutagenesis)의 QuickChange 방법을 이용하여 제작하였다. 이때, 야생형 PA를 코드화하는 밀러 등(상동)의 플라스미드가 주형으로 사용되었다. 상기 점 돌연변이체를 pET22-b(+)(Novagen) 발현 벡터 내에 클로닝한 다음, 발현을 위해 BL21(DE3)(Novagen) 내로 형질전환시켰다. 상기 점 돌연변이체는 공지된 바와 같이 발현 및 정제되었다(Miller, 1999). 간단히 요약하자면, 배양세포들은 LB 내에서 37℃에서 A600=1.0까지 배양되었다. 재조합 단백질의 발현은 β-D-이소프로필티오갈락토피라노사이드를 1mM로 첨가함으로써 유도되었다. 유도 후에, 세포들을 30℃에서 3시간 동안 더 배양한 다음, 8000×g에서 10분 동안 원심분리하여 회수하였다.
단백질은 삼투 충격(osmotic shock)에 의해 세포질로부터 방출되었다. 세포들을 20mM Tris-HCl, pH 8.0, 30% 글루코스 및 1mM EDTA 내에 재현탁한 다음, 실온에서 계속하여 교반하면서 10분 동안 인큐베이션 하였다. 세포들을 다시 원심분리하여 회수한 다음, 20mM 벤자미딘을 함유하는 5mM MgSO4내에 재현탁한 후, 4℃에서 계속하여 교반하면서 10분 동안 인큐베이션 하였다. 세포들을 다시 8000×g에서 원심분리하여 침전시킨 다음, 세포질 추출물(periplasmic extract)을 가만히 따라버렸다. Tris-HCl pH 8.0을 최종농도 20mM로 첨가한 다음, 시료 전부를 Q-세파로스 HP 컬럼 상에 로딩하였다. 결합되지 않은 단백질은 버퍼 A(20mM Tris, pH 8.0)를 사용하여 컬럼으로부터 세척되었다. 결합된 단백질은 0%-25% 버퍼 B 선형 구배(20mM Tris, pH 8.0, 1M NaCl)를 이용하여 용출되었다. PA-함유 분획들을 농축한 다음, 버퍼 A를 함유하는 pd-10 컬럼(Amersham-Pharmacia)을 사용하여 버퍼를 교체하였다. PA-함유 용출액(eluate)을 Mono-Q 컬럼 상에 로딩한 다음, 0%-25% 버퍼 B 구배를 이용하여 용출하였다. PA-함유 분획들을 SDS-PAGE로 분석한 후, -80℃에 보관하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 어세이 키트를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정되었다. 모든 액체 크로마토그래피는 AKTA-퓨리파이어 액체 크로마토그래피 시스템(Amersham-Pharmacia)을 사용하여 수행되었다.
다른 PA 돌연변이체들(표 1의 # 13-18)도 유사한 방식으로 제작, 발현 및 정제되었다.
단백분해에 의한 PA의 활성화
트립신을 사용하여 단백분해적으로 PA83을 틈이난 PA(nPA)로 절단하였다. PA를 프리포어-형성 분석용으로는 0.5mg/ml의 농도로, 그리고 다른 분석용으로는 0.2mg/ml의 농도로 희석하였다. 트립신을 트립신:PA의 최종 비율이 1:1000(w:w)이 되도록 첨가한 후, 그 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 10몰 과량의 콩 트립신 저해제를 사용하여 트립신을 저해하였다.
세포 표면 전위 분석
방사성표지된 LFn(LF의 N-말단 1-255 아미노산 PA 결합 도메인)의 PA-매개 전위를 측정하기 위한 세포 표면 전위 분석을 공지된 바와 같이 수행하였다(Wescheet al., Biochemistry 37:15737, 1998). 간단히 요약하자면, 우선 nPA(2×10-8M)를 CHO 세포에 결합시킨 다음, 세포 표면 상의 PA63에 결합하는35S-LFn을 첨가하였다. 과량의 LFn을 제거하고, 세포를 세척한 후, 37℃에서 pH 5.0 펄스를 적용하였다. 저-pH 펄스는 엔도솜의 산성화를 모방한 것으로, PA에 의해 매개되는 LFn의 플라스마 막을 횡단한 세포 내로의 전위를 초래한다. 시료를, 세포외35S-LFn은 단백분해적으로 분해하나 세포 내로 전위된35S-LFn은 분해하지 않는 프로나제(pronase)로 처리하였다. 이어서, 세포를 세척하고 용해(lysis)시켰다. 세포에 결합된35S-LFn의 총량을 결정하기 위해서, 세포의 일부는 프로나제로 처리하지 않았다. 용해에 이어, 상등액 내의35S-LFn의 양을 신틸레이션 카운터(scintillation counter)를 사용하여 측정하였다. % 전위는 다음과 같이 계산되었다:
(프로나제로부터 보호된 DPM)/(세포에 결합된 DPM) × 100 = % 전위.
돌연변이 PA 단백질이 야생형 PA에 의한 LFn의 전위를 저해하는지를 결정하기 위해, 이 분석은 또한, 트립신 처리 이전에 함께 배합된 후 세포에 첨가되기 직전에 2×10-8M PA(각 단백질 1×10-8M)로 희석된 등몰량의 돌연변이체 및 야생형 PA를 사용하여 수행되었다. 1×10-8M의 PA를 대조구로 사용한 경우, 전위 효율은 2×10-8M 야생형 PA를 사용한 상기 분석과 비교하여, PA의 감소에 의해 단지 약간만 영향을 받았으며, 이러한 결과는 전위 및 결합에 있어서의 임의의 감소가 야생형 PA의 농도 감소의 결과가 아님을 시사하였다.
단백질 합성의 저해
리간드의 세포 내로의 PA-매개 전위를 측정하는 또 다른 방법으로서, 단백질 합성의 LFnDTA 저해가 이용되었다(Milneet al., Mol. Microbiol. 15:66, 1995).표 1의 PA 돌연변이 # 1-12를 분석하기 위해서, CHO-K1 세포를 PA 단백질을 첨가하기 16시간 이전에 96웰 플레이트에 2.5×104세포/웰로 도말하였다. PA83(1×10-12M 내지 1×10-7M)을 1×10-8M LFnDTA의 존재 하에 4시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 1mCi/ml의3H-Leu이 보충된 무-루이신 HAM's F-12 배지로 교체하였다. 1시간 동안 인큐베이션한 후에, 세포를 차가운 PBS로 세척한 다음, 차가운 트리클로로아세트산(10%)으로 세척하여 단백질을 침전시켰다. TCA 불용성 물질 내로 도입된3H-Leu의 양을 신틸레이션 카운터를 이용하여 측정한 다음, 새로 합성된 단백질 양의 척도로 삼았다.
돌연변이 PA 단백질들 또한, 그들이 야생형 PA에 의해 매개되는3H-Leu 흡수 저해를 경감시키는지를 알아보기 위해 이 분석에서 시험되었다. 야생형 PA를 1×10-8M LFnDTA와 함께 1×10-9M로 CHO 세포에 첨가하였다. 또한, 돌연변이체들 중 하나를 점증하는 농도로 첨가하였다. 세포를 독소와 4시간 동안 인큐베이션한 다음, 시료를 상술한 바와 같이 처리하였다.
표 9에 열거된 PA 돌연변이체들을 유사한 방식으로 시험하였다. 96-웰 플레이트 내의 CHO-K1 세포(2.5×104세포/웰)를 LFnDTA(100pM) 및 다양한 양의 각 PA 돌연변이체들(K397D + D425K, △D2L2, F427A, D425K, K397D, 또는 SSSR)의 존재 하에 야생형 PA(100pM)와 함께 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 1μCi/ml의3H-Leu이 보충된 무-루이신 HAM's F-12 배지로 교체하였다. 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후에, 세포를 차가운 PBS로 세척한 다음, 차가운 트리클로로아세트산(10%)으로 세척하였다. TCA-침전성 물질 내로 도입된3H-Leu의 양을 측정하여, PA의 부재 시에 도입된 양의 퍼센트로 나타내었다. 선택된 야생형 PA 및 LFnDTA 농도에서, 단백질 합성은 돌연변이 PA의 부재 시에 약 90% 저해받았다(점선). 3회 실험의 평균값 ± SEM을 표시하였다. 초기 인큐베이션을 18시간이 아니라 4시간 동안 수행한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다. 도 10에 열거된 K397D + D425K + F427A, F427A + △D2L2, 및 K397D + F427A + △D2L2 PA 돌연변이체들도 유사한 방식으로 시험되었다.
야생형과 돌연변이 PA의 이종-7량체에 의한 PA-매개 단백질 합성 저해를 상응하는 동종-7량체들의 혼합물에 의한 PA-매개 단백질 합성 저해와 비교하였다. 야생형 PA63, 및 K397D + D425K, △D2L2, F427A, K397D 및 D425K 돌연변이체의 동종-7량체들이 상술한 바와 같이 제조되었다. 잠정적인 이종-7량체들은, 트립신 처리 및 컬럼 크로마토그래피 이전에, 각 돌연변이 PA와 야생형 PA를 1:1의 비율로 혼합함으로써 제조되었다(도 11). 야생형 PA(1nM), 이종-7량체(H)(최종 농도 2nM), 또는 상응하는 동종-7량체와 야생형 7량체의 등몰(각각 1nM) 혼합물(M)을 LFnDTA(100pM)의 존재 하에 CHO-K1 세포와 함께 18시간 동안 인큐베이션한 후에, 단백질 합성 저해를 도 9와 관련하여 위에서 설명한 바와 같이 측정하였다. 7량체의 농도는 단량체형 PA63 서브유닛으로 환산하여 나타내었다. 단백질 합성은 PA가없는 대조루의 퍼센트로 나타내었다. 3회 실험의 평균값 ± SEM을 표시하였다. 4시간 인큐베이션한 후에도 유사한 결과가 얻어졌다.
프리포어 및 SDS-내성 올리고머의 형성
프리포어 및 SDS-내성 올리고머의 형성을, nPA를 등몰량의 LFn과 함께 실온에서 30분간 인큐베이션함으로써 측정하였다. 프리포어가 형성되었는지를 판단하기 위해서, 시료를 런닝 버퍼(running buffer)로서 50mM CHES, pH 9.0, 2mg/ml CHAPS를 사용하는 4-12% 네이티브 그래디언트 겔(FMC)에서의 전기영동에 적용하였다. 저-pH가 SDS-내성 헵타머의 형성을 유도했는지를 판단하기 위해서, 100mM 소디움 아세테이트, pH4.5를 용액의 pH가 5.0에 도달할 때까지 첨가한 다음, 시료를 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 이어서, 시료를 SDS-PAGE 시료 버퍼에 용해시킨 다음, 4-12% SDS-PAGE 구배 겔 상에서 런닝시켰다. 겔 내의 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue)로 가시화하였다.
루비듐 방출
CHO-K1 세포를 2×105세포/웰의 밀도로 도말하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 배지를 흡인하고, 1μCi/ml86RbCl을 함유하는 배지로 교체한 후, 16시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 얼음 상에서 20분간 냉각한 다음, 배지를 제거하였다. 세포를 세척한 후에, HEPES 완충된 배지 내의 nPA(2×10-8M)를 첨가하였다. 세포를 얼음 상에서 2시간 동안 nPA와 인큐베이션한 다음에, 차가운 pH 5.0 버퍼를 첨가하였다. 30분 후에, 상등액으로부터 시료를 회수하여, 방출된86Rb의 양을 측정하기 위해 신틸레이션 카운터로 카운팅하였다.
이러한 표준 분석은 또한 다른 포어-형성 독소들이 방출된86Rb의 양에 미치는 영향을 결정하는데 사용될 수도 있다. 즉, 본 발명의 다른 돌연변이 독소들을, 그들의 막횡단 포어를 형성하는 능력이 감소되어 있는지를 결정하기 위해서, 이 분석으로 시험할 수도 있다.
실시예 2: 대부분의 돌연변이체들의 SDS-내성 올리고머 형성의 실패
표 1의 PA 돌연변이체 # 1-12 모두와 야생형 PA 단백질을 상술한 바와 같이 트립신을 사용하여 단백분해적으로 틈이나게 하여, SDS-PAGE로 분석시 더 낮은 분자량종처럼 이동하는 틈이난 PA(nicked PA, "nPA") 단백질이 생성되게 하였다(도 2A). 표 1의 PA 돌연변이체 # 1-12에 의한 SDS-분리성 프리포어의 형성이 단량체형 nPA와 비교하여 LFn과 복합체를 이룬 7량체형 PA63의 네이티브 겔에서의 감소된 이동성에 의해 검출되었다(도 2B). 단량체형 PA를 용출시키는 것보다 더 높은 염 농도에서 프리포어가 MonoQ 컬럼으로부터 용출된다는 사실은 K397A와 D425A PA 돌연변이체에 의한 프리포어의 형성을 더욱 지지해주었다. nPA 돌연변이체는 또한 SDS-내성 올리고머의 형성에 대해 분석되었다. 양성 대조구로서, 야생형 PA를 LFn으로 처리하였다. 저-pH 펄스는 야생형 PA를 SDS-내성 올리고머로 전환시켰는데,이 올리고머는 SDS-PAGE로 분석시 고분자량 복합체처럼 이동하였다. △D2L2(잔기 302-325가 결여된 PA) 및 K397Q(도 2B). 야생형, K397Q, F427A, 및 △D2L2 PA는 저-pH로 처리시 SDS-내성 올리고머를 형성하였다(도 2A 및 표 1).
실시예 3: PA 돌연변이체들의 막내 포어 형성 실패
대부분의 PA 돌연변이체들이 SDS-내성 올리고머를 형성하는데 실패하였다는 사실은, 세포막 내의 포어 형성 역시 저해받을 것임을 시사하였다. 포어 형성은, 실시예 1에 기술된 바와 같이, 방사성 칼륨 유사체인86Rb이 로딩된 세포에 nPA 단백질을 결합시키고, 저-pH 펄스를 가한 다음,86Rb의 주변 배지로의 방출을 측정함으로써 분석되었다. 야생형 nPA는86Rb의 방출을 유도하였는데, 이는 nPA가 막 내로 삽입되어 이온 투과성 포어를 형성하는데 기인한 것이다. 이와 대조적으로, 표 1의 돌연변이체 # 1-12 중 어느 것도86Rb 방출을 유도하지 않았다(도 3 및 표 1). 이와 같이, 대부분의 PA의 돌연변이체들의 SDS-내성 올리고머 형성 능력의 결여(실시예 2)는 이들 돌연변이체가 세포막 내에 포어를 형성하지 못하는 것과 연관이 있다.
실시예 4: PA 돌연변이체들에 의한 LFn의 막횡단 전위의 실패
포어 형성은 PA-의존적인 리간드(즉, LF, EF 또는 LFn)의 막횡단 전위에 필수적인 단계이다. 세포 표면 전위 분석이, PA 리간드의 세포의 세포질 내로의 전위를 직접적으로 측정하는데 이용되었다(실시예 1). 표 1의 PA 돌연변이체 # 1-12 중 어느 것도 현저히 감소된 LFn 결합 능력을 가지고 있지는 않았다(도 4A); 그러나, 분석된 돌연변이체들 모두가 이 분석에서 현저히 감소된 LFn 전위 능력을 가지고 있었다(도 4B 및 12). SSSR 대조 돌연변이체는 이러한 조건 하에서 거의 저해를 야기하지 않았다. 이러한 결과는, 돌연변이체들이 구조적 완전성(integrity)과 세포 수용체에 결합하는 능력은 보유하고 있으나, 포어를 형성하거나 리간드를 막을 가로질러 전위시킬 수는 없음을 시사한다.
실시예 5: PA 돌연변이체들에 의한 LFnDTA의 막횡단 전위의 실패
PA 리간드의 막횡단 전위를 측정하는데 사용된 또 다른 방법은 LFnDTA 독성 분석이다(실시예 1). 이 분석에서, CHO 세포들은 PA, 및 디프테리아 독소의 A-쇄인 DTA에 결합된 LFn(LFnDTA)을 함유하는 리간드로 처리되었다. 전위된 디프테리아 독소의 A-쇄는 세포질 단백질 EF-2를 ADP 리보실화시키며, 이는 단백질 합성의 저해 및 세포 사멸의 유도를 초래한다. 이 분석은, 실시예 4에서 측정된 바와 같이, 세포 표면에 반대되는 엔도솜 구획으로부터의 리간드의 전위의 척도이다. LFnDTA와 야생형 또는 돌연변이 PA와의 인큐베이션 후에, 세포를 세척한 다음,3H-루이신이 보충된 무-루이신 배지 내에서 인큐베이션하였다. 만일 단백질 합성이 저해되지 않는다면,3H-루이신은 새로 합성된 단백질 내로 삽입될 것이다. 만일 단백질 합성이 LFnDTA에 의해 저해받는다면,3H-루이신이 거의 삽입되지 않을 것이다. 시험된 돌연변이체들 모두가 이 분석에서 단백질 합성을 심각하게 저해하지 않았다(도 5). 이러한 결과는 PA 돌연변이체에 의한 중대한 포어 형성의 결여가 이러한 돌연변이체에 의한 PA 리간드의 감소된 막 전위를 초래한다는 가설을 더욱 지지해준다.
실시예 6: PA 돌연변이체에 의한 야생형 PA 포어 형성의 저해
표 1의 PA 돌연변이체 # 1-12 모두가 포어 형성에 결함이 있었기 때문에, 그들이 야생형 PA와 불활성 이종-올리고머를 형성함으로써 리간드의 PA 매개 막횡단 전위를 저해할 수 있는지 여부를 검사하였다. △D2L2, K397D + D425K, 및 K395D + K397D + D425K + D426K PA는 이러한 방식으로 야생형 PA를 저해하였다. 등몰량의 야생형 PA와 혼합시, 이들 세 가지 돌연변이체 각각은 세포 표면 전위 분석에서 세포 내로의35S-LFn의 전위를 현저히 저해하였다(도 6).35S-LFn의 세포에의 결합은 저해받지 않았다(도 6).
실시예 7: PA 돌연변이체에 의한 야생형 PA 포어 형성의 저해
PA-매개 LFnDTA 독성에 이들 돌연변이 단백질이 미치는 영향 또한 측정되었다. LFnDTA 분석에서 △D2L2, K397D + D425K 이중 돌연변이, 또는 K395D + K397D + D425K + D426K 사중 돌연변이 PA를 등몰량의 야생형 PA와 혼합시, 야생형 PA-매개3H-Leu 저해에 약 2-로그의 감소가 있었다(도 7). 즉, 돌연변이체는 PA-매개 전위를 99% 저해하였다. 돌연변이 단백질의 존재시에도 남아있는 활성은, 아마도 7개의 야생형 PA 분자와 0개의 돌연변이 PA 분자를 함유하는 7량체(WT7Mut0)의 결과일 것이다. 파스칼의 삼각형을 이용하면, 야생형 PA와 돌연변이 PA의 등몰 혼합물로부터 형성된 7량체의 1%는 100% 야생형(WT7Mut0)일 것으로 추측된다(표 2). 이러한 계산 결과는, 그 혼합물 내에 존재하는 실험적으로 측정된 1%의 잔여 활성과도 일치한다. 야생형 : △D2L2 또는 K397D + D425K 돌연변이 PA의 다양한 비율이 LFnDTA 분석으로 시험된 저해 연구는, 이 혼합물 내에서 유일하게 활성인 종은 아마도 WT7Mut0임을 시사한다. 즉, △D2L2 또는 K397D + D425K PA 한 분자를 함유하는 7량체의 대부분은 불활성인데(표 2), 이는 이러한 저해제의 우세한 음성 본성을 더욱 지지해준다.
| 돌연변이체:야생형(몰:몰) | 총 7량체 집단 중의 예측된 % | 잔여 활성 | |||
| WT7Mut0 | WT6Mut1 | WT5Mut2 | △D2L2 혼합물 | K397D +D425A 혼합물 | |
| 1:1 | 0.78% | 6% | 22% | 0.7%±.2 | 0.9%±.06 |
| 0.75:1 | 2% | 10.4% | 23.5% | 3.8%±2 | 1.2%±.2 |
| 0.5:1 | 5.8% | 25.8% | 56.8% | 13.5%±.5 | 5.8%±3.6 |
| 0.25:1 | 21% | 57% | 85% | 14.3%±2 | 10%±2 |
주) 상기 예측값은, 돌연변이체와 야생형 PA를 다양한 비율로 함유하는 혼합물 내에 적어도 표시된 갯수 만큼의 야생형 분자를 보유할 것으로 예상되는 총 7량체의 퍼센트를 나타낸다. WT7Mut0컬럼은, 일곱개의 야생형 PA 분자를 함유할 것으로 예상되는 총 7량체의 퍼센트를 나타낸다. WT6Mut1컬럼은, 적어도 여섯개의 야생형 PA 분자를 함유할 것으로 예상되는 총 7량체(즉, 6개의 야생형 PA 분자와 1개의 돌연변이 PA 분자를 함유하거나, 또는 7개의 야생형 PA 분자와 0개의 돌연변이 PA 분자를 함유하는 7량체)의 퍼센트를 나타낸다. 마찬가지로, WT5Mut2컬럼은, 적어도 다섯개의 야생형 PA 분자를 함유할 것으로 예상되는 총 7량체의 퍼센트를 나타낸다. "잔여 활성"란에 열거된 수치들은 이들 혼합물에서 관찰된 실제 실험값이다.
LFnDTA 분석에서 야생형 PA에 의한 돌연변이체의 적정(titration)이, 야생형 PA의 저해를 좀더 특성화하기 위해서 수행되었다. 돌연변이체들 중 어느 하나를 점증하는 양으로 야생형 PA 및 LFnDTA와 함께 세포 배양액에 첨가하였다(도 8A).164RKKR167에서 164SSSR167로 돌연변이된 퓨린(furin) 인식 부위를 갖고 있는 돌연변이체인 PA-SSSR이 대조구로 포함되었다. 이 돌연변이체는 퓨린 또는 퓨린-유사 프로테아제에 의해 틈이날 수 없고 따라서 포어를 형성할 수 없기 때문에, 오로지 수용체에 대해 경쟁하는 것에 의해서만 PA를 저해할 수 있다. △D2L2 및 K397D + D425K 양자 모두 PA-매개 전위를 크게 저해하였다. 가장 중요한 것은, 이들 돌연변이체들이 수용체에 대한 경쟁에 의해서만 저해하지 않는다는 것인데, 그 근거는 50% 저해를 달성하는데 있어서 PA-SSSR에 의해 요구되는 것보다 훨씬 더 적은 양의 단백질이 요구된다는 것이다(도 7B). K397D + D425K 이중 돌연변이체는 물론이거니와 그의 단일 돌연변이 구성성분은 저해하지 않으나, PA-SSSR 보다는 잘 저해한다. 이러한 데이터들은 모두 △D2L2, K397D + D425K, 및 K395D + K397D + D425K + D426K PA가 야생형 PA의 우세한 음성 저해제임을 시사한다.
F427A, D425K, K397D + D425K + F427A, F427A + △D2L2, 및 K397D + F427A + △D2L2 PA 돌연변이체들의 우세한 음성 저해 활성 또한 측정되었다. 이 분석을 위해서, 상술한 바와 같이 점증하는 양의 돌연변이형 PA를 일정한 양의 야생형 PA와 혼합하였다. 이 그룹에서 가장 유력한 멤버인 K397D + D425K + F427A 삼중 돌연변이체는 돌연변이체:야생형 PA =1:1의 비율에서 거의 완벽하게 독소 작용을 차단하였다. △D2L2, K397D + D425K, F427A, F427A + △D2L2, 및 K397D + F427A + △D2L2 PA 돌연변이체들 역시 저해 활성을 가지고 있었다. K397D + D425K + F427A + △D2L2, F427D, 및 F427K PA 돌연변이체들 역시 LFnDTA 독성 분석에서 우세한 음성 활성을 시현하였다. 이와 대조적으로, 다른 전위-결함 돌연변이체인 K397D는 1:1의 비율에서 실질상 거의 저해를 야기하지 않았는데, 이는 이러한 유형의 돌연변이체들 모두가 강력한 저해성은 아님을 보여준다(도 9). SSSR 대조구 돌연변이체에서는, 야생형 PA에 비하여 10배 과량인 경우에 조차 독성 작용의 저해가 검출되지 않았는데, 이는 수용체에 대한 경쟁이 다른 돌연변이체들의 저해 활성에 중대하게 기여하지 않음을 시사하는 것이다.
우세한 음성 돌연변이체들에 의한 저해가, 그들의 PA63 단위체가 야생형 PA63과 혼성 복합체(hybrid complex)를 형성하는 능력에 의존한다는 가설을, 정제된 동종 및 이종 7량체들을 사용하여 시험하였다. 용액 내의 PA는 온화한 트립신 처리(mild trypsinization)에 의해 퓨린 부위에서 절단할 수 있으며, 트립신에 의해 틈이난(trypsin-nicked) 분자들을 음이온-교환 컬럼 상에서 크로마토그래피함으로써 결과되는 단편들을 분리할 수 있다(Milleret al., Biochemistry 38, 10432, 1999). 이 방법에 의해 분리된 정제된 PA63은 7량체형이며, 이는 올리고머화 평형이 이러한 형태를 매우 선호하며 프리포어와 구조상 유사하거나 동일할 수 있음을 시사한다. 정제된 동종-7량체가 야생형 PA와 K397D + D425K, △D2L2, F427A, D425K, 및 K397D 전위-결함 PA 돌연변이체 각각으로부터 제조되었다. 추정상의 이종-7량체들은, 각 돌연변이 PA와 야생형 PA를 1:1로 혼합한 다음, 그 혼합물을 트립신 처리하고 결과되는 생성물을 음이온-교환 컬럼 상에서 크로마토그래피함으로써 제조되었다.
각 이종-7량체에 의한 LFnDTA-의존성 단백질 합성 저해, 및 해당 돌연변이체의 동종-7량체와 야생형 동종-7량체의 1:1 혼합물에 의한 LFnDTA-의존성 단백질 합성 저해를 측정하였다. K397D + D425K, △D2L2, F427A, 및 D425K 돌연변이체를 함유하는 이종-7량체들은 LFnDTA의 작용을 매개하지 않는 반면에, 동종 7량체의 상응하는 혼합물은 매우 활성적이었다(도 11). 이와 대조적으로, K397D와 야생형 PA를 혼합함으로써 형성된 추정상의 이종-7량체는 호모-K397D PA 및 호모-야생형 PA 만큼 활성적이었다. 이러한 결과는 이들 돌연변이체가 도 9에 도시된 실험에서 보여준 특성과 일치하는 것이며, 우세한 음성 돌연변이체로부터의 PA63이 야생형 단백질과 공-올리고머화함으로써 그 야생형 단백질을 불활성화시킨다는 생각을 뒷받침해준다. 이종-7량체 조제물(preparation) 내의 K397D의 저해 활성의 부재는, 야생형 단백질과 공-올리고머화하는 능력 또는 7량체 내의 야생형 단백질의 활성을 저해하는 능력에 있어서의 결함을 반영하는 것일지도 모른다. 돌연변이 동종-7량체가 야생형의 활성을 저해하지 않는다는 발견은, 실험 조건 하에서, 수용체에 대한 경쟁이 거의 일어나지 않았거나 또는 7량체들 간의 서브유닛 교환이 거의 혹은 전혀 일어나지 않았음을 암시한다.
상술한 바와 같이, K397D + D425K 이중 돌연변이체가 이러한 LFnDTA 독성 분석에서 활성을 거의 완전히 차단하였다는 사실은, 이 돌연변이체 한 분자가 하나의 7량체를 불활성화시킨다는 것과 올리고머화가 확률론적임을 시사한다. △D2L2, D425K, 및 F427A 돌연변이체들은 다소 덜 저해성인 것으로 보이는데, 이는 한 7량체 당 이들 돌연변이체 분자 한 개 이상이 불활성화에 필요할지도 모른다는 것 및/또는 그들의 야생형 PA와의 공-올리고머화가 전적으로 확률론적인 것은 아닐지도 모른다는 것을 암시해준다. 생장 중인 7량체에 B 단위체를 첨가하는 순서(예컨대, 가장 처음에 또는 가장 나중에 첨가되는 B 단위체)와 같은 다른 요인들 또한 불활성화에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명을 본 명세서에 개시된 임의의 제안된 저해 메카니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 8: 돌연변이체 및 야생형 PA를 함유하는 SDS-내성 올리고머의 형성
△D2L2 및 K397D + D425K 돌연변이체와 야생형 PA 간의 상호작용을 조사하기 위해서, 돌연변이체와 야생형 PA를 등몰 비율로 혼합한 다음, 트립신으로 틈을 내고, SDS-PAGE로 SDS-내성 올리고머 형성에 대해 분석하였다. 상기 두 돌연변이체들 중 어느 하나와 야생형 PA를 혼합한 경우, 새로운 SDS-내성 PA 종이 형성되었다. 겔에서 확산된 고분자량 스미어(diffuse high molecular weight smear)를 생성하는 야생형-PA 단독과 대조적으로, 돌연변이체와 야생형 PA의 혼합물은 샤프한 고분자량 밴드를 생성하였다. 이 샤프한 밴드는 또한 상기 두 돌연변이체들 중 어느 하나 단독에 대해 보여지는 밴드와도 달랐다: K397D + D425K 단독은 SDS-내성 올리고머를 형성하지 않고, △D2L2 PA 단독은 야생형 PA도 존재할 때 생성되는 밴드보다 겔 상에서 더 멀리 이동하는 올리고머를 형성한다. 이 밴드의 정확한 조성 또는 본성이 아직 파악되지 않긴 하였지만, 이 밴드는 상기 돌연변이체들이 SDS-내성 올리고머 내에서 야생형 PA와 상호작용하여 그 올리고머의 겔 상에서의 이동성에 변화를 초래함을 시사한다.
실시예 9: 생체내(
in vivo
) 독소 저해
우세한 음성 돌연변이체들에 의해 시험관내(in vitro)에서 시현되는 특성은, 그들이 생체내에서 독소 작용을 저해할 것임을 암시한다. 이 가설을 검증하기 위해서, 이들 돌연변이체 중 셋(K397D + D425K, △D2L2, 및 F427A)의 활성을 탄저 독소 작용에 대한 고전적인 생체내 모델인 피셔 344 쥐에서 측정하였다(Ivinset al., Appl. Environ. Microbiol. 55:2098, 1989). 8ug LF와 40ug PA의 혼합물(최소 치사량의 약 10배)이 정맥내 주사된 수컷 쥐(250-300g)는 약 90분 후에 빈사상태가 되었다(표 3). 야생형 PA를 임의의 우세한 음성 돌연변이체로 대체한 경우, 상기 동물은 희생되기 전 2주간의 기간 동안에 중독 증상을 전혀 보이지 않았다. 주사 전에 우세한 음성 PA를 야생형 PA/LF 혼합물에 첨가한 경우에도, 야생형에 대해 1:1의 비율(40ug의 우세한 음성 PA) 또는 0.25:1의 비율(10ug의 우세한 음성 PA)에서, 주사를 맞은 동물은 증상 없이 생존하였다. SSSR 돌연변이체는 독소 활성에 거의 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 본 발명자들의 시험관내 결과와 일치하는 것이며, 우세한 음성 돌연변이체가 생체내에서 야생형 PA에 대해 하위-화학량론적 비율(0.25:1)에서조차 탄저 독소의 작용을 제거할 수 있음을 입증해준다.
| 단백질의 양(ug) | |||||
| WT | △D2L2 | K397D +D425K | F427A | SSR | TTM |
| 40 | - | - | - | - | 90 ±11 분 |
| - | 40 | - | - | - | 생존함 |
| - | - | 40 | - | - | 생존함 |
| - | - | - | 40 | - | 생존함 |
| 40 | 40 | - | - | - | 생존함 |
| 40 | - | 40 | - | - | 생존함 |
| 40 | - | - | 40 | - | 생존함 |
| 40 | - | - | - | 40 | 100 ±3분 |
| 40 | 10 | - | - | - | 생존함 |
| 40 | - | 10 | - | - | 생존함 |
| 40 | - | - | 10 | - | 생존함 |
생체내에서 야생형 PA의 활성을 저해하는 K397D + D425K + F427A 삼중 돌연변이체("Triple")의 능력을 K397D + D425K 이중 돌연변이체("Double")의 능력과 비교하였다(표 4). 이 실험은, 40ug 야생형 PA, 10ug LF, 및 PBS 또는 우세한 음성 PA 돌연변이체의 혼합물을 주사한 쥐를 이용하여 상술한 바와 같이 수행되었다.
| 동물 | 돌연변이 PA의 양 | TTM | |
| PBS | 2 | - | ~ 100분 |
| 이중 | 2 | 40ug | 생존함 |
| 삼중 | 2 | 40ug | 생존함 |
| 이중 | 4 | 4ug | 생존함 |
| 삼중 | 4 | 4ug | 생존함 |
쥐를 K397D + D425K, △D2L2, 또는 F427A PA로 예방접종함으로써 생성된 항-PA 항체 및 중화 항체 역가(titer) 또한 측정되었다. 이 측정을 위해서, 여섯 마리의 쥐들로 구성된 그룹들을 각각 0주, 3주 및 6주 째에 Ribi Tri-Mix 아쥬번트(Sigma) 200ul 내의 50ug 단백질을 총 3회 엉덩이(hind-quarter)에 근육주사함으로써 예방접종하였다. 1차 접종 2일 전에, 그리고 매회 접종 14일 후에, 각 동물로부터 혈액을 채취하여 혈청을 회수하였다. 최종 접종 16일 후에, 표 5에 기재된 바와 같이 쥐에 치사량의 LF(30ug PA + 6ug LF)를 IV 주사로 투여하였다. 혈청 내의 평균 항-PA 항체 역가는 PA에 대한 표준 ELISA 분석으로 결정되었다. 역가는 혈청의 반응성이 사라지는 희석도의 기하학적 평균의 역수로서 표현되었다. 중화 항체는 1 ×10-10M PA 및 1 ×10-10M LFnDTA 에서 LFnDTA 분석으로 적정되었다.항체 희석액은 분석을 시작하기 이전에 1시간 동안 37℃에서 PA와 함께 인큐베이션되었다. 단백질 합성 저해는 상술한 바와 같이 LFnDTA 독성 분석을 이용하여 측정되었다. 중화 역가는 PA 활성을 50% 저해하는데 요구되는 희석도의 기하학적 평균의 역수로서 표현되었다. 표 5에 명시된 바와 같이, K397D + D425K, △D2L2, 및 F427A PA 돌연변이체들은 피셔 쥐에서 야생형 PA에 비하여 면역원성에 있어서 거의 또는 전혀 감소를 시현하지 않았다. 3회 주사 후의 중화 및 항-PA 항체 역가는 사용된 면역원에 상관없이 유사하였으며, 예방접종된 동물들은 모두 최종 주사 16일 후에 투여된 치사량의 야생형 PA + LF 주사를 견뎌내고 살아남았다.
| 동물 | 항-PA 역가 | 중화 역가 | TTM | |
| PBS | 6 | < 10 | < 10 | 74.2±1.5 |
| WT | 5 | 43,300 | 2,490 | 생존함 |
| △D2L2 | 6 | 47,500 | 3,350 | 생존함 |
| K397D + D425K | 6 | 65,500 | 2,260 | 생존함 |
| F427A | 6 | 132,000 | 6,090 | 생존함 |
실시예 10: PA에 대한 항체
PA 단백질에 대한 항체는 치료제 및/또는 진단제로서 사용될 수 있을 것이다. 항체는, B-세포-함유 생물학적 시스템, 예컨대 마우스 또는 토끼와 같은 동물을 B-세포에 의한 항-PA 항체 생산을 자극하는 PA 단백질 또는 그의 단편으로 면역학적으로 자극한 후에, 그 생물학적 시스템으로부터 항체를 분리함으로써 표준 방법에 의해 생산될 수 있다. 단클론성 항체(monoclonal antibody)를 생성하기 위해서는, ELISA로 측정시 PA 단백질에 대해 가장 강한 면역 반응을 보인 동물로부터 비장을 취하여, B-세포를 NS-1 미엘로마(myeloma) 세포에 융합시켜 하이브리도마(hybridoma)를 생산한다. PA에 결합하는 항체를 분비하는 하이브리도마는 표준 ELISA 분석 또는 웨스턴 블랏에 의해 선별된다. 고-항체 역가를 생산하며 PA 단백질을 특이적으로 인식하는 단클론성 세포계(cell line)는 보존된다.
상기 세포계는 또한, 돌연변이 PA에 보다 자연발생적인 PA에 더 큰 친화력으로 결합하는 항체를 생산하는 계를 동정하기 위해서 스크리닝되기도 한다. 이러한 항체는, K397, D425, D426, 또는 F427과 같은 잔기를 함유하는 자연발생적인 PA의 단편들을 동물에 투여함으로써 생산되기도 한다. 결과되는 항체는 이어서, 어떤 항체가 자연발생적인 PA에는 결합하나 K397, D425, D426 또는 F427 잔기들 중 하나 이상이 돌연변이되거나 결실된 돌연변이 PA 단백질에는 결합하지 않는지를 결정하기 위해서, 스크리닝된다. 예를 들면, 항체를 고정된 돌연변이 PA 단백질을 함유하는 컬럼에 적용한 다음, 돌연변이 단백질에 결합하지 않는 항체를 선별할 수 있다. D2L2 루프 내의 잔기들과 반응하는 항체 또한 생산될 수 있다; 이러한 항체는 D2L2 루프를 함유하는 PA 단편을 상술한 바와 같이 동물에 투여함으로써 생산될 수 있다. 자연발생적인 PA의 D2L2 루프 내의 잔기들과 반응성인 항체들 역시, D2L2 루프 내의 하나 이상의 잔기가 결실된 돌연변이 PA 단백질과 결합하지 않는 항체를 선별하기 위해서 스크리닝된다. 이와 달리, 돌연변이 PA 단편을 상술한 바와 같이 동물에 투여한 후 돌연변이형 PA에 대해 더 큰 친화력을 가진 항체를 선별함으로써, 자연발생적인 PA 분자에 보다 더 큰 친화력으로 돌연변이 PA에 결합하는 항체를 생산할 수도 있다. 이러한 항체는 자연발생적인 PA에는 존재하지 않는, 돌연변이 PA 내의 잔기에 결합한다.
항-PA 항체는, 시료를 그 항체와 접촉시킨 후 시료 내 PA 단백질의 척도로서 면역 복합체를 정량함으로써, 혈청과 같은 생물학적 시료 내의 PA 단백질을 정량하는데 사용되기도 한다. 따라서, 이러한 항체는 환자가 탄저 독소에 노출되었는지를 결정하기 위한 키트에 사용될 수도 있다.
PA에 대한 항체는 또한 탄저 감염을 치료 또는 예방하기 위한 치료제로서도 사용가능하다. 만일 야생형 PA에는 결합하나 우세한 음성 PA 돌연변이체에는 결합하지 않는 항-PA 항체를 탄저 감염에 대한 수동적인 면역화를 위해 환자에게 투여하는 경우, 우세한 음성 PA 돌연변이체 역시 야생형 PA의 활성을 저해하기 위한 치료제로서 동일 환자에게 투여될 수 있다. 투여된 항-PA 항체는 치료용의 우세한 음성 PA 돌연변이체와는 반응하지 않기 때문에, 항-PA 항체는 우세한 음성 PA 돌연변이체가 야생형 PA를 저해하는 능력을 감소시키지는 않는다. 또한, 치료용의 우세한 음성 PA 돌연변이체와는 반응하지 않는 항-PA 항체는, 우세한 음성 PA 돌연변이체로 처리된 환자로부터 얻은 시료 내에 존재하는 야생형 PA의 양을 측정하기 위해서 사용되기도 한다.
유사한 항체들이 본 발명의 다른 돌연변이 B 단위체들에 대해 생성될 수 있다.
실시예 11: PA 단백질 및 단편의 투여
본 발명의 PA 단백질 또는 단편의 투여가 특정한 투여 방식, 용량, 또는 투여 빈도 등으로 제한되는 것은 아니다; 본 발명의 투여 방식은, 경구, 근육내, 정맥내, 피하, 흡입, 또는 탄저 감염을 예방 또는 치료하는데 적합한 도스를 제공하기에 충분한 임의의 다른 경로를 포함하는 모든 투여 방식을 고려의 대상에 넣는다. 돌연변이 PA 단백질 또는 단편들 중 1종 이상이 단일 도스(single dose) 또는 중복 도스(multiple dose)로 포유동물에 투여된다. 중복 도스가 투여되는 경우, 투약은 1주 내지 1달 간격으로 분리될 수 있다. 모든 개별 환자마다, 개인의 필요 및 조성물을 투여하거나 그 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라서 소정의 기간에 걸쳐 구체적인 투약 양식(dosage regimes)이 조정되어야 한다.
1종 이상의 본 발명의 PA 단백질 또는 단편을 함유하는 약제학적 조성물은 E. W. Martin 저 Remington's Pharmaceutical Sciences에 개시된 바와 같이 제조가능하다. 약제학적인 안정화 화합물, 전달 비히클(delivery vehicle), 담체 비히클(carrier vehicle), 또는 아쥬번트가 사용되기도 한다. 예를 들면, 인간 혈청 알부민, 또는 다른 인간 혹은 동물 단백질이 사용가능하다. 인지질 비히클 또는 리포솜 현탁액이 쓸만한 약제학상 허용가능한 담체 또는 전달 비히클이다. 본 발명에 사용가능한 아쥬번트에는 알루미늄 히드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 및 알루미늄 히드록시 포스페이트와 같은 알루미늄 화합물들이 포함된다. 이러한 조성물은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조가능하다.
본 발명의 다른 돌연변이 B 단위체 또는 단편들도 유사하게 투여될 수 있다.
실시예 12: 다른 포어-형성 돌연변이체들
PA의 결정 구조는 PA의 네 개의 도메인들을 규명하였다(Petosaet al., Nature 385(6619): 833-838, 1997). 도메인 2(잔기 259-487)는, 프리포어에서 포어로 전환되는 동안에 중요한 형태학적 변화를 겪게되는 거대한 유연성이 있는 루프(flexible loop)를 함유하고 있다. 이 영역 내의 하나 이상의 아미노산의 돌연변이, 결실, 또는 삽입은, 생체내에서 단백질이 포어를 형성하는 능력의 저해를 초래하고/하거나 PA 돌연변이체가 자연발생적인 PA의 포어-형성 능력을 저해하는 능력을 초래한다. 예를 들면, 1종 이상의 다른 포어-형성 독소들(클로스트리듐 디피사일, 씨. 퍼프린겐스,씨. 스피로포르메,씨. 보툴리눔,바실루스 세레우스, 또는비. 츄린지엔시스로부터의 독소와 같은; 도 15 및 16) 내의 상응하는 잔기들과 동일한, PA의 도메인 2 내의 잔기들이 돌연변이될 수 있다. 이러한 잔기들이 PA 내에서 돌연변이되거나 결실되면 우세한 음성 PA 돌연변이체들이 생성되기도 한다. PA의 도메인 2 내의 다음의 잔기들은 도 15 및 16에 열거된 이원성 A-B 독소들 간에 상이하다: A259, P260, V262, V264, M266, E267, S272 E275 T298, N353, N361, N363 R365, Y366, N368, G370, T371, Y375, V377, P389, T380, T381, V384, T393, I394, P407, Y411, P412, A420, D425, F427, I432, N435, Q438, L450, T452, Q454, G457, G474, W477, 및 I484. 이들 잔기는 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 상기 잔기들은 글리신 또는 알라닌과 같은 보다 작은 측쇄를 가진 아미노산으로 변화되거나, 또는 트립토판, 루이신 또는 메티오닌과 같은 보다큰 또는 분지된 측쇄를 가진 아미노산으로 변화되기도 한다. 또한, 하전된 잔기들은 중성 측쇄를 가진 잔기 또는 반대 전하의 측쇄를 가진 잔기로 변화되기도 한다. 자연발생적인 잔기를 대체하는데 사용가능한 다른 잔기의 예가 표 1에 열거되어 있다.
탄저 독소 이외에도, 본 발명은 다른 포어-형성 독소들과도 관련이 있다. 이러한 독소들 또한, 올리고머화하는 능력, 막횡단 채널을 형성하는 능력, 또는 리간드를 전위시키는 능력이 감소되었거나 무시할 정도인 독소를 생성하도록, 돌연변이될 수 있다. 또한, 다른 포어-형성 독소들의 우세한 음성 돌연변이체들도 생성될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 PA 돌연변이에 해당하는 돌연변이가 PA와 유사한 다른 독소들(클로스트리듐 디피사일, 씨. 퍼프린겐스,씨. 스피로포르메,씨. 보툴리눔,바실루스 세레우스, 또는비. 츄린지엔시스로부터의 독소와 같은)에서도 이루어질 수 있다(도 15 및 16과 표 6). PA의 도메인 2 내의 잔기들에 해당하는, 다른 독소들의 잔기들이 상술한 바와 같이 돌연변이될 수 있다. 게다가, PA의 D2L2 루프에 해당하는 영역 내의 아미노산들 중 적어도 1, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 또는 24개가 다른 포어-형성 독소들에서 결실될 수도 있다. 또한, 하나 이상의 점 돌연변이가, 본원에 기술된 돌연변이된 PA 잔기에 해당하는 잔기에서 이루어지기도 한다.
포어-형성 독소의 이러한 돌연변이형들 중 임의의 것이, 해당 독소를 생산하는 병원체(예컨대, 세균)에 의한 감염을 치료 또는 예방하기 위한 목적으로 포유동물에 투여될 수 있다.
| 탄저균 PA | 씨. 디피사일독소 | 씨. 퍼프린겐스독소 | 씨. 스피로포르메독소 | 씨. 보툴리눔독소 | 비. 세레우스독소 |
| K397A | Q425A | Q424A | Q428A | Q398A | K879A |
| K397D | Q425D | Q424D | Q428D | Q398D | K879D |
| K397C | Q425C | Q424C | Q428C | Q398C | K879C |
| K397Q | Q425Q | Q424Q | Q428Q | Q398Q | K879Q |
| D425A | D453A | D452A | D456A | D426A | D907A |
| D425N | D453N | D452N | D456N | D426N | D907N |
| D425E | D453E | D452E | D456E | D426E | D907E |
| D425K | D453K | D452K | D456K | D426K | D907K |
| F427A | F455A | F454A | F458A | F428A | F909A |
| K397D +D425K | Q425D +D453K | Q424D +D452K | Q428D +D456K | Q398D +D426K | K879D +D907K |
| K395D +K397D +D425K +D426K | K423D +Q425D +D453K +Q454K | K422D +Q424D +D452K +Q453K | K426D +Q428D +D456K +Q457K | K396D +Q398D +D426K +Q427K | K877D +K879D +D907K +D908K |
| △D2L2 | △340-358 | △339-357 | △343-361 | △307-331 | △797-816 |
| K397D +D425K +F427A | Q425D +D453K +F455A | Q424D +D452K +F454A | Q428D +D456K +F458A | Q398D +D426K +F428A | K879D +D907K +F909A |
| F427A +△D2L2 | F455A +△340-358 | F454A +△339-357 | F458A +△343-361 | F428A +△307-331 | F909A +△797-816 |
| K397D +F427A +△D2L2 | Q425D +F455A +△340-358 | Q424D +F454A +△339-357 | Q428D +F458A +△343-361 | Q398D +F428A +△307-331 | K879D +F909A +△797-816 |
| K397D +D425K +F427A +△D2L2 | Q425D +D453K +F455A +△340-358 | Q424D +D452K +F454A +△339-357 | Q428D +D456K +F458A +△343-361 | Q398D +D426K +F428A +△307-331 | K879D +D907K +F909A +△797-816 |
| F427D | F455D | F454D | F458D | F428D | F909D |
| F427K | F455K | F454K | F458K | F428K | F909K |
대안으로, 임의의 돌연변이유발법이 표준 분자생물학적 방법을 이용하여 포어-형성 독소(예컨대, 콜레스테롤-의존성 싸이토리신, 또는 스태필로코쿠스 α-독소와 관련된 6량체형 또는 7량체형 독소와 같은)를 코드화하는 핵산 상에서 행해지기도 한다. 코드화되는 돌연변이 독소는 표준 방법을 이용하여 발현되고 선택적으로 정제될 수 있다. 본원에 기술된 류비듐 방출 분석이, 감소된 막횡단 채널 형성 능력을 가진 돌연변이 독소를 동정하는데 사용되기도 한다. 또한, 동물 모델이, 돌연변이 및 야생형 독소 양자가 동물에 투여된 경우에 해당 야생형 독소의 독성을 감소시키는 우세한 음성 독소 돌연변이체를 동정하는데 사용되기도 한다.
다른 구현예들
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허출원들은, 개개의 간행물 및 특허출원들이 참고자료로 포함된다고 구체적으로 그리고 개별적으로 지적된 것과 동일한 정도로 본원에 참고자료로 포함된다.
본 발명을 그의 구체적인 구현예와 연관하여 기술하였을지라도, 추가의 변형이 가능함은 물론, 본원은, 대체로 본원의 원리를 따르며, 당업계에 공지되어 있거나 통상적인 시행 내에 포함되고 위에서 개시된 필수적인 특징들에 적용가능한 본 개시로부터의 그러한 이탈을 포함하는, 본 발명의 임의의 변화, 용도 또는 개작을 포괄하고자 하며, 첨부된 청구의 범위의 범주 내에 든다는 것을 양지하여야 한다.
다른 구현예들은 청구의 범위 내에 있다.
Claims (27)
- 프리포어-형성 이원성 A-B 독소의 B 단위체로서, 상기 B 단위체가 그의 포어-형성 능력을 저해하는 돌연변이를 포함하되, 상기 돌연변이가 탄저균 보호성 항원(anthrax protective antigen)의 아미노산 302-325(서열 12)의 결실이 아닌 B 단위체.
- 제 1항에 있어서, 상기 B 단위체가 탄저균의 보호성 항원인 B 단위체.
- 제 1항에 있어서, 상기 B 단위체가 포어-형성 능력이 결여된 B 단위체.
- 제 1항에 있어서, 상기 B 단위체가 서열 21과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 가지고 있으며, 다음으로 구성된 군에서 선택되는 변경(alteration)을 보유하는 B 단위체:a) K397A;b) K397D;c) K397C;d) K397Q;e) D425A;f) D425N;g) D425E;h) D425K;i) F427A;j) K397 + D425K 이중 돌연변이;k) K395D + K397D + D425K + D426K 사중 돌연변이;l) K397D + D425K + F427A 삼중 돌연변이;m) F427A + △D2L2 이중 돌연변이;n) K397D + F427A + △D2L2 삼중 돌연변이;o) K397D + D425K + F427A + △D2L2 사중 돌연변이;p) F427D; 및q) F427K.
- 약제학상 허용가능한 담체 내에 포어-형성 이원성 A-B 독소의 B 단위체 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물로서, 상기 B 단위체가 그의 포어-형성 능력을 저해하는 돌연변이를 포함하는 백신 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 B 단위체가 탄저균 보호성 항원인 백신 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 B 단위체가 화학적 또는 물리적 수단에 의해 불활성화된 백신 조성물.
- 포유동물의 세균 감염을 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 포유동물에게 약제학상 허용가능한 담체 내에 포어-형성 이원성 A-B 독소의 B 단위체 또는 그의 단편을 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 B 단위체가 그의 포어-형성 능력을 저해하는 돌연변이를 포함하는 방법.
- 포유동물의 세균 감염을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 포유동물에게 약제학상 허용가능한 담체 내에 포어-형성 이원성 A-B 독소의 B 단위체 또는 그의 단편을 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 B 단위체가 그의 포어-형성 능력을 저해하는 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 백신이 아쥬번트(adjuvant)와 함께 투여되는 방법.
- 포어-형성 이원성 A-B 독소의 돌연변이 B 단위체로서, 상기 돌연변이 B 단위체가 그의 포어-형성 능력을 저해하는 돌연변이를 포함하며 상기 독소의 자연발생적인 B 단위체의 포어-형성 능력을 저해하는 돌연변이 B 단위체.
- 제 11항에 있어서, 상기 돌연변이 B 단위체가 탄저균 보호성 항원인 돌연변이 B 단위체.
- 제 12항에 있어서, 치사 인자(lethal factor) 또는 부종 인자(edema factor)에 결합하는 능력을 가진 돌연변이 B 단위체.
- 제 11항에 있어서, 포유동물 세포 표면 상의 수용체에 결합하는데 있어서 상기 자연발생적인 B 단위체와 경쟁하는 능력을 가진 돌연변이 B 단위체.
- 제 11항에 있어서, 상기 자연발생적인 B 단위체에 결합하는 능력을 가진 돌연변이 B 단위체.
- 제 11항에 있어서,상기 자연발생적인 B 단위체와 함께 올리고머화하여, 포어-형성 능력이 감소된 복합체를 형성하는 능력을 가진 돌연변이 B 단위체.
- 제 16항에 있어서, 상기 복합체가 포어-형성 능력이 결여된 돌연변이 B 단위체.
- 제 11항에 있어서, 상기 B 단위체가 서열 21과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 가지고 있으며, 다음으로 구성된 군에서 선택되는 변경(alteration)을 보유하는 돌연변이 B 단위체:a) K397D + D425K 이중 돌연변이;b) △D2L2;c) K395D + K397D + D425K + D426K 사중 돌연변이;d) D425K;e) F427A;f) K397D + D425K + F427A 삼중 돌연변이;g) F427A + △D2L2 이중 돌연변이;h) K397D + F427A + △D2L2 삼중 돌연변이;i) K397D + D425K + F427A + △D2L2 사중 돌연변이;h) F427D; 및i) F427K.
- 제 11항에 있어서, D2L2 루프의 적어도 5 아미노산의 결실을 포함하는 돌연변이 B 단위체.
- 포유동물의 세균 감염을 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 포유동물에게 포어-형성 이원성 A-B 독소의 돌연변이 B 단위체 또는 그의 단편을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 돌연변이 B 단위체가 그의 포어-형성 능력을 저해하는 돌연변이를 포함하며 상기 독소의 자연발생적인 B 단위체의 포어-형성 능력을 저해하는 방법.
- 포유동물의 세균 감염을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 포유동물에게 포어-형성 이원성 A-B 독소의 돌연변이 B 단위체 또는 그의 단편을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 돌연변이 B 단위체가 그의 포어-형성 능력을 저해하는 돌연변이를 포함하며 상기 독소의 자연발생적인 B 단위체의 포어-형성 능력을 저해하는 방법.
- 제 8항, 제 9항, 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 B 단위체 또는 돌연변이 B 단위체가 탄저균 보호성 항원이고, 상기 세균 감염이 탄저 감염인 방법.
- 제 8항, 제 9항, 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 포유동물에게 상기 자연발생적인 B 단위체에 결합하는 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 8항, 제 9항, 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
- 제 24항에 있어서, 상기 포유동물이비. 안트라시스(B. anthracis) 포자에 노출된 적이 있는 방법.
- 포어-형성 이원성 A-B 독소의 자연발생적인 B 단위체에 상기 독소의 돌연변이 B 단위체에 보다 더 큰 친화력으로 특이적으로 결합하는 정제된 항체로서, 상기돌연변이 B 단위체가 그의 포어-형성 능력을 저해하는 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제 26항에 있어서, 상기 돌연변이 B 단위체가 상기 독소의 자연발생적인 B 단위체의 포어-형성 능력을 저해하는 항체.
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