KR20020093612A

KR20020093612A - 펩티도글리칸 검출용 조성물, 및 이를 이용한펩티도글리칸 검출키트

Info

Publication number: KR20020093612A
Application number: KR1020020031856A
Authority: KR
Inventors: 박부수; 주창헌; 김문숙; 송승환; 윤종원; 박연성; 김홍락; 어중혁; 조태훈; 이복률; 박지원; 여정미; 김현식
Original assignee: 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 2001-06-08
Filing date: 2002-06-07
Publication date: 2002-12-16
Also published as: KR100471308B1

Abstract

본 발명은 시료내에 존재하는 극미량의 펩티도글리칸을 선택적으로 검출할 수 있는 조성물, 그것을 제조하는 방법, 및 펩티도글리칸 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 검출용 키트를 이용하여 사람의 혈액, 조직, 체액 또는 물, 식품에 포함된 미량의 펩티도글리칸을 정량할 수 있고 또한 펩티도글리칸을 세포벽 성분으로 가지는 미생물 오염 여부를 진단할 수 있어 병원성 그람 양성균 감염을 사전에 진단할 수 있는 진단시약으로 식중독, 폐혈증 예방이나 치료에 유용하다.

Description

펩티도글리칸 검출용 조성물, 및 이를 이용한 펩티도글리칸 검출키트{Composition for detecting peptidoglycan, and diagnostic kit detecting peptidoglycan}

본 발명은 펩티도글리칸을 검출할 수 있는 조성물, 및 이를 이용한 펩티도글리칸 검출용 키트에 관한 것이다.

병원성 그람 양성균 감염은 의원성 감염과 병원에 널리 퍼진 감염의 상당 부분을 차지하는 흔한 감염이고, 병원성 그람 양성균에 의한 식중독이나 세균 폐혈증은 생명에 위험을 주는 치명적인 질환이다. 혈액, 조직, 소변과 같은 임상용 검체나 식품에 존재하는 병원성 그람 양성균을 신속히 검출하는 시스템이 필요하다. 전통적인 방법에 의해 병원성 세균을 검출하는 데에는 수일이 소요되고, 식품의 경우이 기간동안 유통되어 소비자에게 섭취될 수 있어 위험의 소지가 있다.

여러 종류의 검체에 미량으로 존재하는 그람 양성 세균은 세균의 세포벽 성분인 펩티도글리칸을 검출, 측정하여 존재를 확인할 수 있다. 펩티도글리칸은 세균 세포벽의 한 성분으로 세포벽의 외막 내부의 얇은 층을 이루는 N-아세틸무라믹산 또는 N-글리코실무라믹산과 D-아미노산을 포함하는 당단백질 폴리머이다.

따라서, 펩티도글리칸을 검출, 측정하여 의약품의 안정성 검사, 물과 식품의 미생물 검사, 감염질환의 진단에 응용할 수 있다.

곤충의 생체 방어 반응중 프로페놀옥시다아제 시스템은 극미량의 리포폴리사카라이드, 펩티도글리칸, 및 베타-1,3-글루칸을 선택적으로 인식하여 지모겐 (zymogen) 형태의 프로페놀옥시다아제가 활성화 형태의 페놀옥시다아제로 변형되는 캐스케이드 반응으로 1000배 이상 그 신호가 증폭되는 사실이 알려져 있다. 그러나 프로페놀옥시다아제 시스템이 리포폴리사카라이드, 펩티도글리칸, 및 베타-1,3-글루칸을 전부 인식하므로 이중 특정 물질만을 선택적으로 인식하는 시스템이 필요하다.

완전변태 곤충의 생체 내에는 프로페놀옥시아다제가 존재하며, 베타-1,3-글루칸 또는 리포폴리사카라이드에 의해 활성화되는 캐스케이드 반응에 의해 페놀옥시다아제로 활성화된다. 일련의 캐스케이드 단계로 이루어지는 이 반응 시스템은 외부에서 침입한 병원균이나 이물질, 혹은 자신의 혈구 세포의 탈과립화 반응에 의해 유도되는 내부인자 등에 의하여 쉽게 활성화되어 페놀옥시다아제로 변화되어 카테콜 아민류를 이용하여 멜라닌을 형성해 버린다. 따라서 이 반응 시스템을 생체외로 분리하기 어려웠다(Ashida and Yoshida, (1988), Insect. Biochem. 18, 11-19).

Ashida 등은 Eur. J. Biochem, 188, 507-515 (1990)에 모기 유충으로부터 분리한, 베타-1,3-글루칸을 인식하는 조성물을 제시하면서 프로페놀옥시다아제의 활성에 2가 이온이 중요한 역할을 한다고 밝혔고, 곤충의 프로페놀옥시다아제 활성화 시스템은 칼슘이온이 필요하다고 알려져 있다.

펩티도글리칸을 검출하는 조성물과 방법의 한 예로, 미국특허 4,970,152호에서는 누에나방 유충의 플라즈마액으로부터 베타-1,3-글루칸과 반응하는 단백질을 제거함으로써 펩티도글리칸을 특이적으로 검출하는 조성물에 대해 보고하고 있으나, 상기 조성물은 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성이 발휘되기 위해 칼슘이온의 첨가가 필요하다. 즉, 미국특허 4,970,152호에 따르면 곤충의 체액 채취시에는 칼슘 이온에 의한 페놀옥시다아제의 활성화를 억제하여 페놀옥시다아제 조성물을 얻고, 그 조성물로 펩티도글리칸을 기질로 하여 발색을 일으키기 위해서는 칼슘 이온을 첨가하는 것이 요구된다.

미국특허 5,747,277호에서는 SLP 시약을 보고하였으나 이것은 베타-1,3-글루칸과 펩티도글리칸을 동시에 검출하므로 펩티도글리칸에만 특이적으로 반응하지는 않는다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 고려하여, 본 발명은 펩티도글리칸만을 선택적으로 검출할 수 있는 펩티도글리칸 검출용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 또다른 목적은 펩티도글리칸 검출용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 펩티도글리칸만을 선택적으로 검출할 수 있는 펩티도글리칸 검출용 조성물을 이용한 펩티도글리칸 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 펩티도글리칸만을 선택적으로 검출할 수 있는 펩티도글리칸 검출용 조성물을 이용한 펩티도글리칸 검출용 키트에 관한 것이다.

도 1은 꿀벌부채명나방 유충 플라즈마액으로 리포폴리사카라이드, 베타-1,3-글루칸 또는 펩티도글리칸에 대해 페놀옥시다아제 활성화를 칼슘을 첨가하거나 첨가하지 않은 조건에서 조사한 그래프이다.

도 2는 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마 분획 B로 리포폴리사카라이드, 베타-1,3-글루칸 또는 펩티도글리칸을 기질로 하여 페놀옥시다아제 활성화 정도를 나타내는 그래프이다.

도 3은 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마 분획 B로 펩티도글리칸 농도에 따른 페놀옥시다아제 활성화를 나타내는 그래프이다.

도 4는 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마 분획 B, 혈구 용혈물, 및 이들의 혼합물로 베타 1,3-글루칸, 또는 펩티도글리칸을 기질로 하여 페놀옥시다아제의 활성화 정도를 나타내는 그래프이다.

도 5는 단백질 함량이 600㎍ 및 200㎍인 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마 분획 B와 혈구 용혈물을 포함하는 용액으로 펩티도글리칸에 대한 페놀옥시다아제의 활성화 정도를 나타내는 그래프이다.

도 6은 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마 분획 B와 혈구 용혈물을 포함하는 용액으로 펩티도글리칸 농도에 따른 페놀옥시다아제의 활성화를 나타내는 그래프이다.

도 7은 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마 분획 B와 혈구 용혈물을 포함하는 용액으로 펩티도글리칸 농도 20ng/ml에 따른 페놀옥시다아제의 활성화 정도를 나타내는 표준곡선이다.

도 8은 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마 분획 B와 혈구 용혈물을 포함하는 용액으로 리포폴리사카라이드, 베타-1,3-글루칸, 또는 펩티도글리칸을 기질로 하여 페놀옥시다아제의 활성화를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 시료내의 펩티도글리칸을 검출할 수 있는 조성물, 그것을 제조하는 방법 및 그것을 이용한 펩티도글리칸 검출용 키트에 관한 것이다.

본 발명에서 페놀옥시다아제 시스템은 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella) 유충내에 존재하는, 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제로 활성화되는 시스템을 의미한다.

본 발명에서 페놀옥시다아제 조성물은 페놀옥시다아제 시스템 성분의 전부 또는 일부를 포함하며, 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 조성물을 의미한다.

본 발명에서는 꿀벌부채명나방의 페놀옥시다아제 시스템은 페놀옥시다아제를 활성화시키는데 칼슘 이온이 필요하지 않으며 오히려 칼슘이온을 첨가할 경우 페놀옥시다아제의 활성이 억제됨을 알 수 있다.

본 발명은 칼슘을 첨가하지 않는 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 곤충의 체액 추출물을 포함하는 펩티도글리칸 검출용 조성물에 관한 것이다. 상기 곤충의 체액 추출물이 곤충의 체액으로부터 분리한 플라즈마 용액일 수 있으며, 추가로 상기 곤충의 체액 추출물이 곤충 체액의 플라즈마 용액과 혈구 용혈물(lysate)를 포함하는 것인 경우에는 보다 미량의 플라즈마 용액으로도 펩티도글리칸을 정량할 수 있으며, 시료에 포함된 보다 미량의 펩티도글리칸도 검출할 수 있어 더욱 바람직하다. 상기 곤충의 체액 플라즈마 용액과 혈구 용혈물을 포함하는 용액은 곤충의 체액을 취한 후 플라즈마와 혈구를 분리하고 분리된 혈구를 용혈시켜 플라즈마에 혼합하거나, 혈구 용혈물 또는 부분 정제된 혈구 용혈물을 부분 정제된 플라즈마에 첨가하여 얻을 수 있다. 또다른 방법으로, 체액내의 혈구를 분리하지 않고 그대로 일부 또는 전부의 혈구를 용혈시켜 얻을 수 있다. 예를 들어 체액 또는 분리한 혈구를 초음파 분쇄(sonication)하거나 고속원심분리에 의해서 혈구를 용혈시킬 수 있다. 또한 상기 플라즈마 용액, 혈구 용혈물 및 이들의 혼합용액을 완충액 등과 같은 용액을 첨가하여 희석하거나, 통상의 농축방법으로 농축하여 사용할 수 도 있다. 상기 혈구 용혈물은 곤충 체액 추출물로부터 플라즈마 용액을 제외한 침전물을 혈구라고 하고, 용매를 첨가하여 혈구세포를 파쇄하여 얻어지는 용해물, 바람직하게는 상기 용해물중 침전물과 분리되는 상등액으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 펩티도글리칸 검출용 조성물은 상기 곤충의 체액 추출물이 꿀벌부채명나방 유충 유래인 것이 바람직하며, 즉 꿀벌부채명나방의 페놀옥시다아제 시스템 전부 또는 일부를 포함하여, 그 예로 프로페놀옥시다아제를 포함한다. 꿀벌부채명나방은 수명이 2개월 전후로 다른 곤충보다 짧고 번식력이 강하여 쉽게 대량으로 사육가능하므로 대량의 체액을 채취할 수 있다.

또한 상기 곤충 체액중 플라즈마 용액은 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마를용매 또는 완충액으로 처리하여 분획을 얻고, 얻어진 분획 중 칼슘을 첨가하지 않은 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 분획을 선택하는 것으로 이루어지며, 바람직하게는 상기 용매 또는 완충액이 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 함유하는 것이며, 더욱 바람직하게는 상기 분획이 컬럼 크로마토그래피에 의해 얻어지는 분획이다. 상기 컬럼 크로마토그래피는 예컨대 당을 담체로 하는 레진 또는 비닐을 원료로 하는 레진으로 충진된 것일 수 있다.

이와 같은 펩티도글리칸을 검출할 수 있는 본 발명의 조성물은 개체에서 포도상구균, 연쇄상구균, 폐렴균, 디프테리아균과 같은 그람양성균의 오염 여부를 확인하는 데 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마를 시료로 사용하여 칼슘을 첨가하지 않는 조건에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 곤충 체액 추출물을 포함하는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 꿀벌부채명나방 유충의 체액에서 플라즈마를 얻은 후 얻어진 시료를 용매 또는 완충액으로 처리하여 분획을 얻고, 얻어진 분획 중 칼슘을 첨가하지 않는 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 분획을 선택하는 것으로 이루어진다.

본 발명의 방법에서, 바람직하게는 꿀벌부채명나방 유충으로부터 시료를 채취할 때, 체액 응고를 억제할 수 있는 항응고 완충액을 사용한다. 항응고 완충액은 곤충의 체액 응고를 억제할 수 있는 완충액이면 모두 사용할 수 있으며, 특히 시트르산 완충액이 바람직하다. 항응고 완충액에 세린 프로테아제를 비가역적으로 저해할 수 있는 세린 프로테아제 저해제를 첨가할 수 있는데, 세린 프로테아제 저해제로서는 특별한 한정없이 세린 프로테아제를 비가역적으로 저해하여 꿀벌부채명나방 유충 체액으로부터 페놀옥시다아제 조성물인 분획을 분리할 수 있는 것이면 어떤 것이든지 사용할 수 있다. 바람직하게는, p-APMSF (파라-아미지노페닐)-메탄설포닐플루오라이드), PMSF (페닐메탄설포닐 플루오라이드), DFP (디이소프로필플루오로인산) 등을 사용할 수 있고 농도는 0.2mM 이상 되도록 사용할 수 있다. 또 체액 채취시에 세포간의 점착을 방지하고 페놀옥시다아제 시스템이 활성화되는 것을 방지하기 위해, 항응고 완충액에 킬레이팅제를 첨가할 수 있다.

본 발명의 방법에서 얻어진 시료를 용매 또는 완충액으로 처리하여 분획을 얻는 공정은 예를 들어 컬럼 크로마토그래피에 의하여 수행될 수 있다.

본 발명의 방법에서 분리공정에 사용하는 용매 또는 완충액의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 유충으로부터 시료를 채취할 때 사용하는 항응고 완충액을 사용할 수 있고, 바람직하게는 항응고 완충액에 킬레이팅제를 첨가하여 단백질응집에 관련된 반응을 저해하여 원하는 페놀옥시다아제 조성물을 얻을 수 있다.

시료 채취 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제로서, 종래에 알려져 있는 킬레이팅제는 특별한 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, EDTA, EGTA, 시트르산 등을 사용할 수 있다. 킬레이팅제의 양은 대상 곤충 시료나 컬럼의 종류, 사용 용매 등 분리공정 조건에 따라 달라질 수 있으며, 곤충 시료 및 분리공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 양일 수 있다. 따라서 이 분야의 통상의 전문가들은 과도한 실험 없이 킬레이팅제의 양을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명에서 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마를 용매 또는 완충액으로 처리하는 방법의 한 예는 컬럼 크로마토그래피로, 레진을 충진시킨 컬럼에 플라즈마를 로딩한 후 항응고 완충액과 같은 용매 또는 완충액으로 용출시켜 분획을 얻을 수 있다. 본 발명에서는 친화성 크로마토그래피와 같은 별도의 까다로운 정제과정없이 컬럼크로마토그래피를 수행함에 의해 펩티도글리칸을 특이적으로 검출할 수 있는 조성물을 정제할 수 있다.

본 발명에서 컬럼 크로마토그래피에서 사용할 수 있는 레진은 단당류나 다당류 등의 당을 담체로 하는 것으로서, 아가로오스 또는 덱스트란을 원료로 하는 레진이나 비닐을 원료로 하는 레진이 바람직하다. 한 예로 세파덱스 또는 토요펄(Toyoperal)을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 펩티도글리칸을 특이적으로 검출할 수 있고, 따라서 펩티도글리칸을 세포벽 성분으로 가지는 미생물 감염 진단에 이용할 수 있다.

따라서 본 발명은 검체에 펩티도글리칸의 존재를 검출하는 방법에 관한 것으로, 검체로부터 시료를 채취하고, 상기 시료에 칼슘이 첨가되지 않은 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 조성물을 첨가하고, 상기 시료에서 페놀옥시다아제 활성을 측정하는 것으로 이루어진다. 상기 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 조성물은 상기 펩티도글리칸 검출용 조성물을 포함하는 의도이며, 본 발명의 일례에서 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제의 존재하에서 회수된 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마를 상기 시료 및 분리공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 포함하는 용매로 처리하여 얻어진 분획 중 칼슘이온을 첨가하지 않은 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제를 활성화시키는 분획을 선택하여 제조되는 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 펩티도글리칸 검출 방법에서, 검체는 사람을 포함하는 동물이거나 생물이 서식하는 환경일 수 있다. 한 예로, 검체로부터 혈액을 채취하여 그람 양성균 감염을 진단할 수 있다. 또 다른 예로, 양식업에서는 양식장의 물을 채취하여 그람양성균과 같이 펩티도글리칸을 세포벽 성분으로 가지는 미생물 감염을 진단할 수 있다.

펩티도글리칸을 세포벽 성분으로 가지는 미생물 감염 진단의 특이성을 향상시키기 위해, 필요한 경우 검체 시료에 존재할 수 있는 리포폴리사카라이드를 제거하는 전처리를 할 수 있다. 예를 들어, 검체 시료를 폴리믹신(polymyxin)과 같이 리포폴리사카라이드와 특이적으로 결합하거나 리포폴리사카라이드를 침전시킬 수 있는 물질로 처리함에 의해 리포폴리사카라이드의 영향을 제거할 수 있다.

본 발명에서 페놀옥시다아제 활성을 측정하는 방법은, 기존에 알려진 페놀옥시다아제 측정 방법을 그대로 또는 변형시켜 이용할 수 있다. 한 예로, 아래에 설명한 4-메틸카테콜/4-하이도록시프롤린에틸에스테르(4-MC/4-HP)를 이용한 발색 반응이나 도파민을 이용한 멜라닌 형성 반응을 이용하여 흡광도를 측정함으로써 페놀옥시다아제 활성을 측정할 수 있으며, 이로부터 쉽게 펩티도글리칸의 존재여부를알 수 있다.

또한 본 발명은 펩티도글리칸 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 펩티도글리칸 검출용 키트는 상기 칼슘을 첨가하지 않은 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 조성물을 함유한다. 본 발명의 일례에서 상기 펩티도글리칸 검출용 조성물은 칼슘 이온을 첨가하지 않는 조건에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 조성물로서, 바람직하게는 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제 존재하에서 준비된 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마인 시료를 상기 시료 및 분리공정상에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 포함하는 용매로 처리하여 얻어진 분획 중 칼슘이온을 첨가하지 않는 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제를 활성화시키는 분획을 선택하여 제조되는 조성물일 수 있다.

하기 예시적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

실시예 1: 꿀벌부채명나방 유충에서의 플라즈마와 혈구 제조

꿀벌부채명나방(Galleria mellonella) 유충 중 길이 2.5∼3cm 정도의 유충만을 골라 얼음에서 10∼30분 동안 마취를 시킨 후, p-APMSF (Wako사, 일본) 0.2 mM이 함유된 항응고 완충액(pH 4.6)이 담긴 23G 주사바늘이 달린 5㎖ 주사기의 주사바늘을 유충의 두부에서 2번째 마디에 찔렀다. 미부에서 2번째 마디를 절반정도 절단한 뒤 주사기로 완충액을 밀어 넣어 4∼5 방울을 받아 꿀벌부채명나방 유충의 체액을 추출하였다. 상기 항응고 완충액은 NaCl 15mM, 트리소디움 시트레이트 30mM,시트르산 26mM, 및 EDTA 20mM를 포함한다.

상기 채취한 체액 50ml을 4℃, 371 ×g에서 20분간 원심분리를 하여 상등액을 플라즈마액(plasma)이라 명명하고 침전물을 혈구(hemocyte)라 명명하였다.

실시예 2: 플라즈마 용액의 제조

2-1: 추출된 플라즈마 용액의 전처리

플라즈마액을 한외여과키트 (막 cut off. 3000)를 이용해 최종 2㎖정도 되게끔 농축을 하여 농축된 액은 칼슘이 첨가되어 최종농도로 5mM 존재하는 조건 또는 첨가되지 않는 조건에서 페놀옥시다아제 활성을 측정하여 안정성을 확인하고 도 1에 나타내었다 (1: 플라즈마액 + Ca²⁺무첨가, 2: 플라즈마액 + 1㎍ 리포폴리사카라이드(LPS) + Ca²⁺무첨가, 3: 플라즈마액 + 1㎍ 베타-1.3-글루칸(BG) + Ca²⁺무첨가, 4: 플라즈마액 + 1㎍ 펩티도글리칸(PG) + Ca²⁺무첨가, 5: 플라즈마액 + Ca2+ 첨가, 6: 플라즈마액 + 1㎍ LPS + Ca²⁺첨가, 7: 플라즈마액 + 1㎍ BG + Ca²⁺첨가, 8: 플라즈마액 + 1㎍ PG + Ca²⁺첨가). 플라즈마액을 사용하여 1 ㎍ 의 리포폴리사카라이드, 펩티도글리칸, 베타-1,3-글루칸에 대한 페놀옥시다아제 활성을 각각 측정하여 본 결과, 채취한 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마액은 리포폴리사카라이드에는 낮은 페놀옥시다아제 활성(2번 막대)을 나타내지만 베타-1,3-글루칸 (3번 막대)과 펩티도글리칸 (4번 막대)에는 강한 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 사실을 관찰하였다. 또한 꿀벌부채명나방 유충의 시스템은 칼슘 이온 없이 페놀옥시다아제로 활성화될 수 있고 오히려 칼슘 이온이 첨가되면 페놀옥시다아제의 활성이 억제되었다.

2-2: 펩티도글리칸을 특이적으로 인식하는 분획의 분리

세파덱스(Sephadex) G-100 레진을 1.0X45cm의 컬럼에 충진시켜 항응고 완충액 (pH 5.0)으로 평형화시켰다. 농축된 시료(500mg 단백질)을 평형화된 컬럼에 로딩한 후 항응고 완충액을 3.0㎖/시험관의 속도로 흘려주면서, 용출액을 1∼30번까지 3 ml씩 분획을 받았다.

단백질이 분리된 패턴별로 그룹 A(분획 1~6), B(분획 7~10), C(분획 11~16)로 나누었다. 그룹 B 및 C는 한외여과키트를 이용해 그룹 A와 비슷한 단백질 농도까지 농축하고, 로딩전 시료, 그룹 A, B 및 C의 시료들을 사용해 β-1,3-글루칸, 펩티도글리칸, 리포폴리사카라이드에 의한 페놀옥시다아제 활성을 측정하였고 그 결과를 도 2에 나타냈다 (1: 플라즈마액, 2: 플라즈마액 + 1ug 리포폴리사카라이드(LPS). 3: 플라즈마액 + 1㎍ 베타-1,3-글루칸(BG), 4: 플라즈마액 + 1㎍ 펩티도글루칸(PG), 5: 그룹 A, 6: 그룹 A + 1㎍ LPS, 7: 그룹 A + 1㎍ BG, 8: 그룹 A + 1㎍ PG, 9: 그룹 B, 10: 그룹 B + 1㎍ LPS, 11: 그룹 B + 1㎍ BG, 12: 그룹 B + 1㎍ PG, 13: 그룹 C, 14: 그룹 C + 1㎍ LPS, 15: 그룹 C + 1㎍ BG, 16: 그룹 C + 1㎍ PG). 그룹 B에서는 펩티도글리칸만에 대한 페놀옥시다아제 활성을 나타냄을 알 수 있다.

실시예 3: 플라즈마 분획의 페놀옥시다아제 활성

펩티도글리칸에 대해 특이적으로 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 그룹 B로 펩티도글리칸에 대한 민감도를 조사하기 위해서 본 실시예를 수행하였다.

먼저 펩티도글리칸 용액은 불용성 펩티도글리칸(Fluka사) 1mg을 20mM 트리스 (pH8.0) 용액에 현탁시킨 후 100㎕를 취하여 다시 900㎕ 트리스 완충액에 가한 후 수초간 초음파로 처리하였다. 이중 10㎕을 취하여 페놀옥시다아제 활성 측정에 이용하였다.

페놀옥시다아제 활성 측정은 기질로 4-메틸카테콜 (4-MC)과 4-히드록시프롤린 에틸 에스테르 (4-HP)를 사용하는 Pye의 분광측정법을 변형시켜 사용하였다. 시료 30㎕ (단백질량 600ug)에 20mM 트리스완충액 (pH8.0)에 현탁된 펩티도글리칸을 1ug/10㎕을 혼합한 후 30℃에서 5분간 전반응시켰다. 음성대조구는 20mM 트리스완충액만 (pH8.0) 10㎕ 첨가하였다. 상기에서 시료중 단백질 함량은 280nm에서 흡광도를 측정하여 구하였고, 상기 방법으로 분리하여 얻어진 시료에 포함된 단백질의 총량을 말한다. 그 다음 20mM 트리스완충액 (pH8.0) 442㎕를 시험관에 분주한 후 기질로 사용되는 4-MC 1mM, 4-HP이 최종농도가 2mM 되게 하여 첨가한 후 부피 500㎕까지 맞추었다. 30℃에서 20분간 반응시킨 후 100㎕씩 시험관으로부터 시료를 떠서 항응고 완충액 (pH4.6) 100㎕에 2배 희석하여 나타나는 페놀옥시다아제 활성을 분광측정기의 520nm에서 흡광도를 측정하고 그 값의 희석배율을 곱해 실제 페놀옥시다아제 활성을 측정하였다. 페놀옥시다제 활성 측정시 칼슘을 첨가할 경우, CaCl₂5.65mM이 첨가된 20mM 트리스 완충액 (pH8.0)을 사용하여 위와 같은 방법으로 페놀옥시다아제 활성을 측정하였다.

상기 실시예 2에서 얻은 펩티도글리칸에 대해 특이적으로 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 그룹 B 용액 30㎕ (단백질 함량 600 ㎍)으로 수용성 펩티도글리칸의 각 농도별로 칼슘이온이 첨가되지 않은 상태에서 페놀옥시다아제 활성을 측정하고 그 결과를 도 3에 나타내었다 (1: 그룹 B, 2: 그룹 B + 3ng 펩티도글리칸(PG), 3: 그룹 B + 5ng PG, 4: 그룹 B + 10ng PG, 5: 그룹 B + 20ng PG, 6: 그룹 B + 30ng PG). 그룹 B용액은 펩티도글리칸을 3ng/ml 까지 정량할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: 꿀벌부채명나방의 혈구 용혈물(hemocyte lysate) 제조

상기 실시예 1에서 꿀벌부채명 나방의 체액으로부터 분리된 혈구를 50mM 트리스, 1mM EDTA가 포함되어 있는 pH 6.5의 트리스 완충액을 혈구 부피의 1/2이 되게 첨가하여 초음파를 2분간 5회 실시하여 혈구 세포를 깨뜨렸다. 그런 후에, 4℃에서 20분간 3,586 ×g의 조건에서 원심분리를 행하여 이 상등액을 제 1 시료로 명명하였다. 상등액을 제거한 침전물은 다시 트리스 완충액을 혈구 부피의 1/2 만큼 첨가하여 위와 동일한 방법으로 초음파와 원심분리를 1회 더 수행하여 이때 얻은 상등액을 제 2 시료라 하였다. 이렇게 제조된 제 1시료와 제 2시료를 합하여 용혈물 용액이라 하고, 사용전까지 -80℃의 냉동고에 보관하였다.

실시예 5: 혈구 라이세이트 용액의 페놀옥시다아제 활성 및 펩티도글리칸에 대한 특이성

혈구 용혈물이 펩티도글리칸에 특이적으로 반응하는지를 알아보기 위해 베타 1,3-글루칸과 펩티도글리칸에 대한 페놀옥시다아제 활성을 각각 측정하여 도 4에 나타내었다. 실험용액은 다음과 같다:

(1 : 실시예 2의 플라즈마 분획 B 용액(단백질 함량: 200㎍), 2 : 플라즈마분획 B 용액(200㎍) + 베타 1,3-글루칸(1㎍), 3 : 플라즈마 분획 B 용액(200㎍) + 펩티도글리칸(1㎍), 4 : 혈구 용혈물(단백질 함량: 100㎍), 5 : 혈구 용혈물(100㎍) + 베타 1,3-글루칸(1㎍), 6 : 혈구 용혈물(100㎍) + 펩티도글리칸(1㎍), 7 : 플라즈마 분획 B 용액(200㎍) + 혈구 용혈물(100㎍), 8: 플라즈마 분획 B 용액(200㎍) + 혈구 용혈물(100㎍) + 베타 1,3-글루칸(1㎍) 9 : 플라즈마 분획 B 용액(200㎍) + 혈구 용혈물(100㎍) + 펩티도글리칸(1㎍) )

그 결과, 실시예 2에서 얻은 플라즈마 분획 B에 항응고 완충액을 첨가한 용액 (단백질 함량: 200㎍)에 베타 1,3-글루칸과 펩티도글리칸 1㎍ 씩을 첨가한 경우에(2 및 3번 막대)는 페놀옥시다아제 활성이 나타나지 않았으며, 또한 혈구 용혈물 용액(단백질 함량 100㎍)에 베타 1,3-글루칸과 펩티도글리칸 1㎍을 넣었을 경우(5번 및 6번 막대)에도 페놀옥시다아제 활성이 나타나지 않았다. 그러나 플라즈마 분획 B 용액(단백질 함량: 200㎍)에 혈구 용혈물 용액 100㎍와 펩티도글리칸 1㎍를 첨가하였을 때(9번 막대), 페놀옥시다아제 활성이 증가함을 볼 수 있었다. 또한, 플라즈마 분획 B 용액(단백질 함량: 200㎍)에 혈구 용혈물 용액 100㎍와 베타 1,3 글루칸 1㎍을 첨가하였을 때에는 페놀옥시다아제 활성을 나타나지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 플라즈마 분획 B 용액과 혈구 용혈물 용액의 혼합액이 펩티도글리칸을 특이적으로 인식하여 페놀옥시다아제 활성을 나타내며, 플라즈마 분획 B 용액 단독으로 사용하였을 때보다 혈구 용혈물 용액을 첨가함으로써 적은 양의 플라즈마 분획 B 용액을 사용하여도 페놀옥시다아제 활성 측정이 가능함을 알 수가 있었다.

실시예 6: 혈구 용혈물이 페놀옥시다아제 활성에 미치는 영향

실시예 2에 따른 플라즈마 분획 B 용액(단백질 함량 600㎍), 플라즈마 분획 B 용액(단백질 함량 600㎍) + 펩티도글리칸(1㎍), 플라즈마 분획 B 용액(단백질 함량 600㎍) + 혈구 용혈물(단백질 함량 100㎍), 플라즈마 분획 B 용액(단백질 함량 600㎍) + 혈구 용혈물(단백질 함량 100㎍) + 펩티도글리칸(1㎍) 각 30㎕용액에 대해 반응 15분 후에 실시예 3의 페놀옥시다제 활성 측정법과 실질적으로 동일한 방법으로 페놀옥시다아제 활성을 측정하였다.

또한, 실시예 2에 따른 플라즈마 분획 B 용액에 항응고 완충액을 첨가하여 희석한 용액(단백질 함량 200㎍)으로 하는 것을 제외하고는 실질적으로 동일한 방법으로 페놀옥시다아제 활성을 측정하였다.실험 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 각각의 막대그래프는 다음과 같다: 1 : 분획 B 용액(600㎍), 2 : 분획 B 용액(600㎍) + 펩티도글리칸(1㎍), 3 : 분획 B 용액(600㎍) + 혈구 용혈물(100㎍), 4 : 분획 B 용액(600㎍) + 혈구 용혈물(100㎍) + 펩티도글리칸(1㎍), 5 : 분획 B 용액(200㎍), 6 : 분획 B 용액(200㎍) + 펩티도글리칸(1㎍), 7 : 분획 B 용액(200㎍) + 용혈물(100㎍), 8 : 분획 B 용액(200㎍) + 용혈물(100㎍) + 펩티도글리칸(1㎍)).

그 결과, 단백질 함량이 600㎍인 플라즈마 분획 B 용액의 경우 펩티도글리칸에 대한 페놀옥시다아제 활성이 높게 나타났지만(2번 막대), 단백질 함량이 200㎍인 플라즈마 분획 B 용액의 경우 펩티도글리칸에 대한 페놀옥시다아제 활성이 약하다는 사실(6번 막대)이 관찰되었다

따라서 페놀옥시다제의 활성을 더욱 높이기 위하여 상기 플라즈마 분획 B 용액(단백질 함량 200㎍)에 혈구 용혈물 용액(단백질 함량: 100㎍)을 첨가하였더니 플라즈마 분획 B 용액 600㎍의 경우 및 플라즈마 분획 B 용액 200㎍의 경우 모두 페놀옥시다아제 활성이 모두 매우 높게 나타났다(4번 막대, 8번 막대). 따라서, 혈구 용혈물의 성분 중에 펩티도글리칸에 특이적으로 페놀옥시다아제를 활성화시키는 성분이 존재할 것임을 알 수 있었다.

실시예 7: 플라즈마 분획 B 용액과 혈구 라이세이트를 포함하는 조성물의 페놀옥시다아제 활성

실시예 2에서 제조된 플라즈마 분획 B에 항응고 완충액을 첨가하여 희석하여 제조한 용액(플라즈마 분획B의 단백질 함량 200㎍)와 실시예 4에서 제조한 혈구 용혈물 용액을 포함하는 용액 30㎕ (분획B의 단백질 함량 200㎍, 혈구 용혈물의 단백질 함량 100㎍)에 대해 펩티도글리칸의 농도에 따른 페놀옥시다아제 활성을 측정하였다. 표준곡선을 구하기 위해서, 펩티도글리칸 농도를 2, 5, 10, 20ng/ml으로 사용한 것을 제외하고는 상기 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 페놀옥시다아제 활성을 측정하였고, 이에 따라 얻어진 자료로 표준곡선을 정하였다.

실시예 3에서 제조한 것과 실질적으로 동일한 방법으로 펩티도글리칸의 농도 2ng/ml, 20ng/ml 및 200ng/ml의 각 펩티도글리칸 용액을 제조하였다. 이 펩티도글리칸 용액에 대해 4-MC/4-HP 발색 반응으로 30 ℃에서 1시간 반응시켜서 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내고, 상기 펩티도글리칸 농도에 따른 실험결과의 표준곡선을 도 7에 나타냈다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 펩티도글리칸 농도와 페놀옥시다아제 활성의 상관계수가 0.98로 나타나 극미량의 펩티도글리칸을검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 8: 펩티도글리칸에 대한 특이성

실시예 2에 따른 플라즈마 분획 B 용액(단백질 함량 200㎍)과 혈구 용혈물(단백질 함량 100㎍) 30㎕ 용액에 대해 펩티도글리칸에 대한 특이성이 있는지를 알아보기 위해, 리포폴리사카라이드와 베타-1,3-글루칸에 대한 페놀옥시다아제 활성을 측정하였다.

20mM 트리스 완충액(pH 7.6)에 베타-1,3-글루칸을 현탁시켜 2ng/ml, 20ng/ml, 200ng/ml의 농도의 기질을 제조하였다. 20mM 트리스 완충액(pH 7.6)에 리포폴리사카라이드(시그마사)를 현탁시킨 후에, 2~3분 동안 초음파로 파쇄하여 2ng/ml, 20ng/ml, 200ng/ml 농도의 기질을 제조하였다. 상기 리포폴리사카라이드 용액과 베타-1,3-글루칸 용액을 기질로 하여 상기 페놀옥시다아제 조성물로 실시예 3과 실질적으로 동일한 방법으로 4-MC/4-HP 발색 반응을 수행하였으며 펩티도글리칸 20ng/ml을 기질로 사용했을 때와 비교하고 그 결과를 도 8에 나타낸다.

그 결과, 리포폴리사카라이드 및 베타-1,3-글루칸의 고농도, 즉 200 ng/ml에 대해서도 그 반응시간을 증가시켜도 페놀옥시다아제 활성을 나타내지 않으므로 본 발명의 페놀옥시다아제 조성물은 펩티도글리칸을 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 조성물에 의해 사람의 혈액, 조직, 체액 또는 물, 식품에 포함된 미량의 펩티도글리칸을 정량할 수 있고 또한 펩티도글리칸을 세포벽 성분으로 가지는 미생물 오염 여부를 진단할 수 있다. 동물이나 사람에서 병원성 그람 양성균 감염을 사전에 진단할 수 있는 진단시약으로 식중독, 폐혈증 예방이나 치료에 유용하게 이용될 것이 기대된다.

Claims

칼슘을 첨가하지 않는 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 곤충의 체액 추출물을 포함하는 펩티도글리칸 검출용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 곤충의 체액 추출물이 체액으로부터 분리한 플라즈마 용액인 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 곤충의 체액 추출물이 곤충 체액의 플라즈마 용액과 혈구 용혈물(lysate)를 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 곤충의 체액 추출물이 꿀벌부채명나방 유충 유래인 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 곤충의 체액 추출물이 곤충 체액 플라즈마를 용매 또는 완충액으로 처리하여 얻어진 분획중 칼슘을 첨가하지 않은 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 분획인 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 곤충의 체액 추출물이 플라즈마 용액과 혈구를 포함하는 곤충체액중 혈구를 용혈시키고, 용매 또는 완충액으로 처리하여 얻어진 분획중 칼슘을 첨가하지 않은 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 분획인 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 곤충의 체액이 꿀벌부채명나방 유충의 플라즈마를 용매 또는 완충액으로 처리하여 얻어진 분획에 혈구 용혈물 또는 부분 정제된 혈구 용혈물을 첨가하고, 칼슘을 첨가하지 않은 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 분획인 조성물.
제 5항, 6항, 및 7항중 어느 한항에 있어서, 상기 용매 또는 완충액이 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 함유하는 것인 조성물.
제 5항, 6항, 및 7항중 어느 한항에 있어서, 상기 분획이 컬럼 크로마토그래피에 의한 분획인 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 컬럼 크로마토그래피가 당을 담체로 하는 레진 또는 비닐을 원료로 하는 레진으로 충진된 것인 조성물.
검체로부터 시료를 채취하고, 상기 시료에 제 1항 내지 4항중 어느 한항에 따른 펩티도글리칸 검출용 조성물을 첨가하고 페놀옥시다아제 활성을 측정하는 것으로 이루어지는 펩티도글리칸 검출방법.
제 11 항에 있어서, 상기 곤충의 체액이 곤충 체액 플라즈마를 용매 또는 완충액으로 처리하여 얻어진 분획 중 칼슘을 첨가하지 않은 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 분획인 펩티도글리칸 검출방법.
제 11 항에 있어서, 상기 곤충의 체액 추출물이 플라즈마 용액과 혈구를 포함하는 곤충체액중 혈구를 용혈시키고 용매 또는 완충액으로 처리하여 얻어진 분획중 칼슘을 첨가하지 않은 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 분획인 펩티도글리칸 검출방법.
제 11 항에 있어서, 상기 곤충의 체액이 곤충 체액 플라즈마를 용매 또는 완충액으로 처리하여 얻어진 분획에 혈구 용혈물 또는 부분 정제된 혈구 용혈물을 첨가하고, 칼슘을 첨가하지 않은 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 분획인 펩티도글리칸 검출방법.
제 1항 내지 4항중 어느 한항에 따른 펩티도글리칸 검출용 조성물을 함유하는 펩티도글리칸 검출용 키트.
제 15 항에 있어서, 상기 곤충의 체액 추출물이 곤충 체액 플라즈마를 용매또는 완충액으로 처리하여 얻어진 분획중 칼슘을 첨가하지 않은 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 분획인 펩티도글리칸 검출용 키트.
제 15 항에 있어서, 상기 곤충의 체액 추출물이 플라즈마 용액과 혈구를 포함하는 곤충 체액중 혈구를 용혈시키고 용매 또는 완충액으로 처리하여 얻어진 분획중 칼슘을 첨가하지 않은 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 분획인 펩티도글리칸 검출용 키트.
제 15 항에 있어서, 상기 곤충의 체액이 곤충 체액 플라즈마를 용매 또는 완충액으로 처리하여 얻어진 분획에 혈구 용혈물 또는 부분 정제된 혈구 용혈물을 첨가하고, 칼슘을 첨가하지 않은 상태에서 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성을 나타내는 분획인 펩티도글리칸 검출용 키트.