상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자연형의 뉴클레오타이드의 당인 오환의 리보오스를 육환의 아자슈거로 치환한 뉴클레오타이드 유도체를 포함하고 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합으로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 에이즈 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 자연형의 뉴클레오타이드의 당인 오환의 리보오스를 육환의 아자슈거로 치환한 뉴클레오타이드 유도체를 포함하고 포스포로티오에이트 결합으로 이루어진화학식 1의 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
상기화학식 1에서
n은 0∼30이며,
1) B는 보호기를 갖거나 갖지 않은 자연 뉴클레오베이스 또는 변형된 뉴클레오베이스이고,
2) X는 수소, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트기, 또는 올리고뉴클레오타이드이며,
3) Y는 수소, 포스페이트, 활성화된 포스페이트, 활성화된 포스파이트, 또는 고체지지물, 컨쥬게이트기, 올리고뉴클레오타이드이다.
상기화학식 1에서 n은 위와 아래의 뉴클레오타이드를 포함하여 0∼30이며, 바람직하게는 6∼21이다. 본 발명의 모노머는 올리고뉴클레오타이드의 어떤 위치에도 존재할 수 있으며, 4개 이상의 변형된 염기가 올리고뉴클레오타이드에 존재하는 것이 에이즈 치료에 사용하는데 바람직하다. 바람직한 에이즈 치료용 올리고뉴클레오타이드에는서열번호 1내지서열번호 29로 기재되는 올리고뉴클레오타이드가 있으며, 더욱 바람직하게는서열번호 2,서열번호 3,서열번호 11,서열번호 17,서열번호 18,서열번호 19,서열번호 20,서열번호 21,서열번호 22,서열번호 23및서열번호 29로 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 고체상 또는 액체상에서 제조될 수 있으나 고체상의 방법이 바람직하다. 고체상에서의 올리고뉴클레오타이드의 구체적인 합성 방법은 Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, Gait(ed.), IRL Press, Washington D. C.(1984), Caruthers and etal., U.S. Pat. No. 4,458,066 및 4,500,707 등에 기재되어 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 하기화학식 2의 뉴클레오타이드 모노머(대한민국 특허출원 제99-26947호)를 이용하여 합성기의 축합반응을 통해 제조되는데, 이때 뉴클레오타이드 당에 연결된 한 개의 1차 알콜기는 다이메톡시트리틸기로 치환되고, 다른 한 개의 2차 알콜기는 포스포아미다이트기로 치환되어야 하며, 또한 핵염기도 티민을 제외하고는 적절한 보호기로 보호되어야 한다.
상기화학식 2에서
1) B는 보호기를 갖거나 갖지 않은 자연 뉴클레오베이스 또는 변형된 뉴클레오베이스이고,
4) X는 수소 또는 하이드록실 보호기이며,
5) Y는 수소, 포스페이트, 활성화된 포스페이트, 활성화된 포스파이트(phosphite) 또는 고체지지물이다.
상기화학식 2의 뉴클레오타이드 모노머를 올리고뉴클레오타이드의 3'-위치에 도입할 경우 고체지지물에 이 유도체를 부착하여야 한다. 상업적으로 구매할 수 있는 아미노기를 가진 콘트롤드 포어 글래스(controlled pore glass, CPG)를 이용하여 모노머를 헤미석시네이트(hemisuccinate)로 만들어 메시틸렌-2-설포닐 클로라이드/1-메틸-1H-이미다졸(mesitylene-2-sulfonylchloride/1-methyl-1H-imidazole) 하에서 축합반응시켜 완성한다.
상기화학식 2의 모노머를 올리고뉴클레오타이드의 3'-끝 위치 외의 위치에 도입할 경우 DNA 합성기를 사용하여 주로 표준 포스포아미다이트 제법을 이용하여이루어진다(예를 들면 ABI 392 등). 일반적으로화학식 2의 모노머의 농도와 고체 수지와의 반응시기는 DNA 합성기의 일반적인 포스포아미다이트 시약과 동일하나, 2'-위치에 수소 이외의 작용기가 있는 경우는화학식 1에서의 모노머 축합반응 시간을 일반적인 60초에서 600초로 연장시키는 것이 바람직하다.
일단 목적하는 올리고뉴클레오타이드가 만들어지면 이는 고체 지지물로부터 분리되어야 하며 보호기 또한 제거되어야 한다. 이 두 과정은 동시에 행해질 수도 있고 따로 이루어질 수도 있다. 일반적으로 고체지지물은 암모니아수를 상온 처리하여 완성되고 보호기의 분리는 열을 가한 상태에서(일반적으로 55도에서 17시간) 암모니아수를 사용하여 완성된다. 올리고뉴클레오타이드의 5'-하이드록실기의 보호기는 다이메톡시트리틸기로서, 이의 분리는 합성의 마지막 단계에서 이루어지는데, 이는 DNA 합성기에서 내장된 프로그램을 이용하거나, 80% 초산, 다이클로로초산(dichloroacetic acid), 트리클로로초산(trichloroacetic acid)을 사용할 수 있다.
상기화학식 1의 구조를 갖는 뉴클레오타이드 유도체를 포함하고 포스포로티오에이트 결합으로 이루어진 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 제조방법은, 육환의 아자슈거(피페리딘골격, piperidine)의 3'-탄소 위치에 핵염기(nucleobase)를 부착함으로써 제조과정을 간편하게 하였다. 즉, 아미날(aminal) 위치에 염기를 부착할 경우에는 주로 알파, 베타 위치 모두에 핵염기가 도입되어 이성체의 분리가 요구되는데, 본 발명에서는 아미날 위치가 아닌 탄소 위치에 염기를 도입함으로써원하는 베타 위치에만 염기가 도입된 뉴클레오타이드를 얻을 수 있다. 또한, 질소 위치에 여러 작용기(group)를 도입함에 있어서, 그 도입이 용이한 아자슈거를 이용함으로써 강한 염기성 시약을 사용하는 번거로움을 없앴으며, 그 생성물인 질소 위치에 각종 기가 도입된 올리고뉴클레오타이드들은 RNA에 대한 높은 Tm 값을 갖는 것으로 보아 mRNA에 대한 친화력이 높은 효과적인 안티센스 약물로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 제조방법은 리보오스 대신 육환의 아자슈거를 사용하고 이에 소수성기를 부착시킴으로써, 세포막 친화성에 개선을 가져올 수 있다. 이러한 카르보사이클릭 뉴클레오타이드를 가진 올리고뉴클레오타이드는 효소에 대한 내성이 높아 안정한 것으로 알려져 있으며, 실제 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레아제에 대한 내성 또한 자연 DNA에 비해 월등히 우수한 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스페이트 연결부위를 일부 혹은 전부를 포스포로티오에이트로 바꿈으로써 결합력 증가 및 효소에 대한 안정성을 동시에 확보할 수 있다.
한편, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 포스페이트 연결부위 중앙에 포스포다이에스터(phosphodiester) 또는 포스포로티오에이트(phosphothioate) 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 키메릭 올리고뉴클레오타이드의 형태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 에이즈 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 상기와 같이 제조된 올리고뉴클레오타이드를 에이즈 치료를 위한 안티센스 약물로 사용할 수 있는 가능성을 확인하기 위하여, 바람직한 실시예로서 HIV-1의 TAR 유전자, SIV(simian immunodeficiency virus)의 TAR 유전자, 폴리오 바이러스(polio virus)의 IRES(internal ribosomal entry site), 그리고 HIV의 sd(splicing doner), LTR, gag 유전자 등 다양한 작용부위를 가지며, 대부분 포스페이트의 산소 한 개가 황으로 치환된포스포로티오에이트의 구조를 가지는 올리고뉴클레오타이드를 제조하였다(표 1참조).
상기와 같이 제조된 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 HIV-1 증식에 대한 항 바이러스 활성을 신시티움 형성 실험으로 측정한 결과, 자연상태의 안티센스 올리고뉴클레오타이드나 포스포로티오에이트만으로 구성된 올리고뉴클레오타이드보다 항 바이러스 활성이 월등히 우수하였으며(도 1,도 2,표 2및표 4참조), 동일 농도에서의 항 바이러스 활성을 비교할 경우 현재 사용되고 있는 에이즈 치료제인 AZT보다 항 바이러스 활성이 우수하였다(표 2및표 3참조).
본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 HIV-1을 감염시킨 세포배양액에 처리한 후 HIV-1의 증식을 역전사 효소활성으로 측정한 결과, 혈청유무나 배지에 상관없이 바이러스 증식이 완전히 억제됨을 확인하였다(도 3및도 4참조). 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 자연형의 올리고뉴클레오타이드(P=O 결합)와 비슷한 세포 독성을 나타내었으나(표 8참조) 항바이러스 효능이 상대적으로 우수하므로 자연형의 올리고뉴클레오타이드 보다 치료계수가 월등히 높아 치료시 안전성 면에서도 우수할 것으로 판단된다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 세포 배양시 배지에 분비되는 핵산 분해 효소에 대한 안정성을 조사하기 위하여, 세포 배양에 사용한 배지 상청액(도 5참조)과 동종의 신선한 배지(도 6참조)에 올리고뉴클레오타이드를 첨가하고 이를 일정 시간 방치한 후, 시료 일부를 전기영동하여 올리고뉴클레오타이드가 분해되는 정도를 조사한 결과, 6환의 아자슈거를 가진 핵산 유도체의 포함 유무와 상관없이포스포로티오에이트(P=S) 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 세포 배양 상청액 에서도 6일 이상 분해되지 않고 안정성을 유지하였으나 P=O 결합만 존재하는 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 2시간 이내에 완전히 분해되었다(도 5참조). 또한, 안정성이 있던 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 경우 혈청이 포함된 신선한 배지에서는 15일까지 분해되지 않고 안정성을 유지하였다(도 6참조).
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 세포막 투과여부 및 세포내 항 바이러스 활성을 세포내의 HIV-1 LTR(TAR 유전자서열을 포함하고 있으며 HIV의 발현을 총괄적으로 조절하는 부분)의 활성 억제 여부로 확인하기 위하여, HIV-1 LTR에 CAT 혹은 β-갈락토시다제(galactosidase) 유전자가 리포터(reporter) 유전자로 결합된 플라스미드를 세포에 도입한 후 리포터 유전자 발현 정도로 LTR 활성을 측정하였다. LTR-β-갈락토시다제 유전자를 가진 Magi 세포에 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 처리하거나 혹은 형질감염시켜 HIV-1 LTR의 활성억제 여부를 조사한 결과,본 발명의 올리고뉴클레오타이드 처리에 의해서는 LTR 활성이 억제되지 않았으며(도 7의A참조) 형질감염시에는서열번호 4로 기재되는 올리고뉴클레오타이드만 유전자 서열 특이적으로 LTR 활성을 억제하였다(도 7의B참조). 또한서열번호 4로 기재되는 올리고뉴클레오타이드의 LTR 활성억제 효과는 처리한 올리고뉴클레오타이드의 양과 비례하였으나 다른 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 처리량을 증가시켜도 전혀 LTR 활성억제 효과를 보이지 않았다(도 8참조). 상기한 결과를 다시 확인하기 위하여 LTR-CAT 유전자를 형질감염시킨 세포를 배양하면서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 배지에 첨가한 결과 LTR에 의해 조절되는 CAT 활성에 전혀 영향을 미치지 않았다(도 9참조). 또한 각각의 올리고뉴클레오타이드를 LTR-CAT 플라스미드와 함께 세포 내에 형질감염시킨 다음 CAT 유전자 발현을 조사한 결과서열번호 4로 기재되는 올리고뉴클레오타이드에서는 비교적 강한 LTR 활성억제 효과가 나타났으나, 항 바이러스 활성이 높은 다른 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 세포 내에서 전혀 LTR 활성을 억제하지 못하였다(도 10참조).
상기의 결과로부터, 아자슈거의 핵산 유도체를 포함한 포스포로티오에이트 결합의 올리고뉴클레오타이드가 특정 유전자 서열에 특이적으로 작용하는 기존의 안티센스와는 다른 기전으로 항 바이러스 활성을 나타낸다는 사실을 시사해 준다. 또한 특정 올리고뉴클레오타이드(서열번호 4로 기재되는 올리고뉴클레오타이드)의 LTR 활성억제 현상이 배지 첨가시는 전혀 나타나지 않다가 형질감염 방법으로 인위적으로 세포내에 주입시 크게 증가하는 것을 볼때 올리고뉴클레오타이드를 단순히배지에 첨가할 때의 세포막 투과성은 매우 낮을 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고 여타의 올리고뉴클레오타이드들에 의해 항 바이러스 활성이 나타나는 것은 이들이 세포 밖에서 작용하여 바이러스 부착을 방해함으로 1차적으로 HIV-1의 감염을 효과적으로 차단하여 나타나는 현상으로 추측된다.
다음으로 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 AIDS 치료제로서의 가능성을 알아보기 위하여 감염 1주일 후 상당한 세포병변이 진전된 상태에서(현미경으로 무수한 신시티아 관찰) 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 첨가한 후 세포병변의 변화를 관찰한 결과, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 첨가에 의해 신시티아의 갯수나 크기가 현저히 줄어들었으나 단순히 포스포로티오에이트로만으로 구성된 올리고뉴클레오타이드(서열번호 4로 기재되는 올리고뉴클레오타이드)의 경우에는 오히려 올리고뉴클레오타이드를 처리하지 않은 대조군보다 더 크고 많은 신시티아를 형성하였다(도 11참조). 상기 결과는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 뛰어난 항 바이러스 효과와 함께 감염된 세포에 대해서도 치료 능력을 가지고 있음을 시사한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 다른 바이러스에 대한 항 바이러스 활성을 조사한 결과, SIV TAR 유전자 서열에 대한 특이성 여부와는 상관없이 어느 것도 SIV의 증식을 억제하지 못하였으며(도 12참조), 소아마비 바이러스의 IRES (internal ribosomal entry site) 부위의 유전자 서열에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 서열 비특이적인 올리고뉴클레오타이드 역시 소아마비 바이러스증식을 억제하지 못하였다(도 13참조). 상기 결과로부터, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 HIV외 다른 바이러스에 대해서는 염기서열과 상관없이 항 바이러스 효과를 나타내지 못함을 확인하였다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성에 대한 혈청의 영향을 확인하기 위하여, 다른 종류 및 여러 농도의 혈청이 첨가된 배지에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성을 신시티움 형성 실험으로 측정한 결과, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 중 다수가 혈청의 첨가에 의해 다소간 활성이 약화되었으나 이 중 특정 올리고뉴클레오타이드(서열번호 22로 기재되는 올리고뉴클레오타이드)는 혈청 유무와 상관없이 동일한 활성을 유지하였다. 그러나 약화된 정도는 혈청의 농도나 종류에 무관하게 일정하였다(표 5참조).
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 임상투여시에 비경구 또는 경구로 투여가 가능하다. 경구투여를 위한 고형 제재에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제재는 상기화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제재로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 캡슐, 동결건조제제, 연고제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 특히 리포좀(liposome), PEG화된 리포좀(PEGylated liposome), 혹은 양이온성 지질(cationic lipid)과 같이 올리고뉴클레오타이드를 세포내로 용이하게 전달시키는 전달체를 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 에이즈 치료제로 사용하기 위한 유효 용량은 0.1 내지 15 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.5 내지 2 ㎎/㎏이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 서열번호 1의 올리고뉴클레오타이드의 합성
모든 올리고뉴클레오타이드는 어플라이드 바이오시스템 392(DNA/RNA Synthesizer)를 이용하여 1 마이크로몰 스케일로 트리틸-온(trityl-on) 상태로 합성되었으며, 합성방법은 대한민국 특허 출원번호 제99-26947에 잘 나타나있다. 일반적인 올리고뉴클레오타이드의 축합시간이 1분인데 반하여, 본 발명의 안티센스올리고뉴클레오타이드와 같이 아자슈거의 4'-위치에 수소 외의 반응기가 존재하는 뉴클레오타이드 축합의 경우에는 축합시간이 10분이었다. 고체지지물과 보호기는 암모니아수를 사용하여 55℃에서 17시간 동안 가열하여 제거하였고, 디메톡시트리틸(dimethoxytrityl, DMT) 보호기의 분리를 막기 위해 1시간 마다 트리에틸아민 5방울을 가하면서 동결건조시켰다. 잔사를 1 ㎖의 100 mM 트리에틸암모니움 아세테이트(triethylammonium acetate[pH 7.0], 이하 "TEAA"라 칭함) 용액에 녹이고 이를 역상 고성능 액체 크로마토그래피(Hamilton PRP-1, 300 mm x 7 mm, 18 - 28% 아세토나이트릴/100 mM TEAA, pH 7, 260 nm에서 UV로 모니터)로 정제하였다. 원하는 분획을 동결건조하고 1 ㎖의 증류수를 두 번 가하여 다시 동결건조함으로써, 잔류하는 TEAA 염을 완전히 제거하였다. 남은 잔사에 0.3 ㎖의 80% 초산을 가하고 볼텍스(votex)하여 완전히 용해시킨 다음 20분간 상온에서 방치하여 디메톡시트리틸기를 분리하였다. 상기 용액에 0.3 ㎖의 에탄올을 가하여 과량의 초산을 제거하고 이를 동결건조하였다. 잔사에 1 ㎖의 증류수를 가하여 볼텍스로 잘 용해시키고 여기에 1 ㎖의 에테르를 가하여 볼텍스로 완전히 교반시켰다. 상층의 에테르를 피펫으로 제거하고 다시 1 ㎖의 에테르를 가한 후, 동일한 과정을 두 번 반복하였다. 이로부터 얻은 물층을 동결 건조한 후 잔사에 1 ㎖의 증류수를 가한 다음, 상기 용액을 70℃에서 UV 흡광도를 측정하여 정량하였다. 농도 계산을 위한 자연 뉴클레오타이드의 흡광 계수는 dAMP, 15200; dCMP, 7700; TMP, 8830; dGMP, 11500이다. 아자슈거를 가진 뉴클레오타이드의 흡광 계수도 자연 뉴클레오타이드와 동일한 값으로 계산되었다. 올리고뉴클레오타이드의 구성은 효소분해 후 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Hewlett Packard, ODS hypersil, C-18; 20 mM K2HPO4, pH 5.6(A), MeOH(B), 100 % A to 40% B, 20 min)와 레이져 탈착(Laser Desorption) 질량 분석으로 확인되었다. 이로부터 염기서열 내의 여러 위치에 하기화학식 3의 새로운 구조를 가진 아데노신 유도체(ⓐ)를 포함하는서열번호 1로 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.
<실시예 2 ∼ 실시예 29> 서열번호 2 ∼ 서열번호 29로 기재되는 올리고뉴클레오타이드의 합성
실시예 1과 동일한 방법으로화학식 3의 구조를 가지는 아데노신 유도체의 전구물질을 합성한 후 염기서열 내의 여러 위치에화학식 3의 구조를 가지는 아데노신 유도체를 포함하는서열번호 1 ∼ 서열번호 29로 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.
합성된 올리고뉴클레오타이드는 HIV-1의 TAR 유전자, SIV(simian immunodeficiency virus)의 TAR 유전자, 폴리오 바이러스(polio virus)의IRES(internal ribosomal entry site), 그리고 HIV의 sd, LTR, gag 유전자 등에 작용부위를 가진다. 그 외에도 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 대상 유전자가 없이 무작위 염기서열을 가지는 렌덤 올리고뉴클레오타이드(서열번호 20내지서열번호 23의 올리고뉴클레오타이드) 및 아자슈거의 위치는 무작위적인 렌덤 올리고뉴클레오타이드(서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드)와 비슷하나 in vivo에서 강한 면역유도능을 보이는 CpG 유전자 서열을 가진(A. M. Crieg 등Nature, 271:546, 1995; D. E. McFarlane 및 L. Manzel.J. Immunol., 160:1122, 1998; A. Yi 등,J. Immunol., 160:4755, 1998) 올리고뉴클레오타이드(서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드) 등으로 올리고뉴클레오타이드의 결합은 포스포다이에스테르 결합의 산소 한 개가 황으로 치환된포스포로티오에이트의 구조를 가진다(예외;서열번호 5,서열번호 13및서열번호 24의 올리고뉴클레오타이드는 포스포다이에스테르 결합임).
합성된 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 염기서열과 아데노신 유사체인 ⓐ의 위치 및 올리고 핵산의 유전자는표 1에 요약하였다.
올리고뉴클레오타이드 리스트(list)
시료번호 |
서열* |
결합 |
작용부위 |
서열목록 |
실시예 1 |
AGC TCC CⓐG GCT CⓐG ATC |
P=S |
HIV-1 TAR |
서열번호 1 |
실시예 2 |
ⓐGC TCC CⓐG GCT CⓐG ATC |
P=S |
HIV-1 TAR |
서열번호 2 |
실시예 3 |
ⓐGC TCC CⓐG GCT CAG ⓐTC |
P=S |
HIV-1 TAR |
서열번호 3 |
실시예 4 |
AGC TCC CAG GCT CAG ATC |
P=S |
HIV-1 TAR |
서열번호 4 |
실시예 5 |
ⓐGC TCC CⓐG GCT CAG ⓐTC |
P=O |
HIV-1 TAR |
서열번호 5 |
실시예 6 |
ⓐTC TGC TCⓐ GAG ATA CⓐA |
P=S |
SIV TAR |
서열번호 6 |
실시예 7 |
ⓐGT CⓐC TCA GGⓐ CTC TGG |
P=S |
SIV TAR |
서열번호 7 |
실시예 8 |
ⓐCT CAT CⓐG CCT ⓐAG CTA |
P=S |
Polio IRES |
서열번호 8 |
실시예 9 |
ⓐGC TCC CAG GCT CAG ⓐTC |
P=S |
HIV-1 TAR |
서열번호 9 |
실시예 10 |
ⓐTT TTT GGC CTⓐ CTC ⓐCC |
P=S |
HIV-1 sd |
서열번호 10 |
실시예 11 |
ⓐTT GⓐG GCT TⓐA GCⓐ GTG |
P=S |
HIV-1 LTR |
서열번호 11 |
실시예 12 |
CⓐG AAT ⓐGA GGⓐ CTG CTⓐ T |
P=S |
HIV-1 gag |
서열번호 12 |
실시예 13 |
AGC TCC CAG GCT CAG ATC |
P=O |
HIV-1 TAR |
서열번호 13 |
실시예 14 |
ⓐGC TCC CⓐG GCT CAG ATC |
P=S |
HIV-1 TAR |
서열번호 14 |
실시예 15 |
ⓐGC TCC CAG GCT CⓐG |
P=S |
HIV-1 TAR |
서열번호 15 |
실시예 16 |
ⓐGC TCC CⓐG |
P=S |
HIV-1 TAR |
서열번호 16 |
실시예 17 |
ⓐGC TCC CⓐG GCT CⓐG ⓐTC |
P=S |
HIV-1 TAR |
서열번호 17 |
실시예 18 |
ⓐ GⓐG ⓐGC TCC CⓐG GCT CⓐG ⓐT |
P=S |
HIV-1 TAR(475-495) |
서열번호 18 |
실시예 19 |
ⓐGⓐ GCT CCC ⓐGG CTC ⓐGⓐ T |
P=S |
HIV-1 TAR |
서열번호 19 |
실시예 20 |
ⓐGC TCC ⓐGC TCC ⓐGC TCC ⓐG |
P=S |
Random 1 |
서열번호 20 |
실시예 21 |
ⓐGC TCⓐ GCT CⓐG CTC ⓐGC TⓐG |
P=S |
Random 2 |
서열번호 21 |
실시예 22 |
ⓐCT CⓐC TCⓐ CTC ⓐCT CⓐC |
P=S |
Random 3 |
서열번호 22 |
실시예 23 |
ⓐCG ⓐCG ⓐCG ⓐCG ⓐCG ⓐCG ⓐC |
P=S |
Random 4 |
서열번호 23 |
실시예 24 |
DMT-ⓐGGGⓐG |
P=O |
Random 5 |
서열번호 24 |
실시예 25 |
ⓐTGGGGⓐT |
P=S |
G-quartet |
서열번호 25 |
실시예 26 |
A0G0C0T*C*C*C*ⓐ*G*G*C*T*C*ⓐ*G0A0T0C |
0P=O,*P=S |
HIV-1 TAR |
서열번호 26 |
실시예 27 |
A*G0C*T0C*C0C*ⓐ0G*G0C*T0C*ⓐ0G*A0T*C |
0P=O,*P=S |
HIV-1 TAR |
서열번호 27 |
실시예 28 |
A0G*C*T*C*C*C*ⓐ*G*G*C*T*C*ⓐ*G*A*T0C |
0P=O,*P=S |
HIV-1 TAR |
서열번호 28 |
실시예 29 |
ⓐCG CⓐC GCⓐ CTC ⓐCG CⓐC |
P=S |
CpG-Random |
서열번호 29 |
* : 올리고뉴클레오타이드의 결합이 포스포로티오에이트일 경우에는 P=S, 포스포다이에스테르일 경우에는 P=O로 표기하였으며, 이들 결합이 섞여있는 키메라의 경우에는 P=O는oP=O로, P=S는*P=S로 표기하였다.
<실험예 1> 올리고뉴클레오타이드의 HIV-1 증식에 대한 항 바이러스 활성 조사
본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 HIV 바이러스의 증식에 미치는 항 바이러스 활성을 조사하기 위하여 Jurkat-Tat 세포에 HXBc2/Δtat 바이러스를 감염시킨 후 각 올리고뉴클레오타이드를 첨가한 상태에서 형성되는 신시티움(syncytium)의 개수를 조사하거나 역전사효소의 활성을 측정하여 시료 내의 바이러스를 정량하였다.
<1-1> 신시티움 형성 실험
본 실험을 위해 tat 유전자를 돌연변이시킨 HXBc2/Δtat 바이러스와 Tat을 발현하는 Jurkat-Tat 세포(Tat-expressing Jurkat cells)를 미국 하바드 대학교 다나-파머 암연구소 소드로스키 박사(Dr, Sodroski at Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School)로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. HXBc2/Δtat 바이러스를 Jurkat-Tat 세포에 감염시키면 세포 표면에 바이러스 외막 단백(gp120과 gp41)이 발현되면서 이것이 인접한 비감염세포 표면항원인 CD4와 결합하여 세포융합이 일어나 다핵의 거대세포(multinucleated giant cells)인 신시티움을 형성한다. 이러한 원리를 이용하여 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 항 HIV-1 활성을 확인하기 위하여, 감염된 HIV-1의 증식 정도를 시간이 지나면서 형성되는 신시티움의 갯수를 조사하여 판단하였다.
구체적으로, 왕성하게 자라는 Jurkat-Tat 세포를 수획하여 2번 인산염 완충용액으로 씻어준 다음 혈청이 첨가되지 않은 배양액에서 HXBc2/Δtat 바이러스를 1×105세포당 TCID(tissue culture infectious dose)5050이 되게 섞어 37℃ 이산화탄소 배양기에서 1시간 동안 감염시켰다. 감염이 끝나면 세포를 동일한 완충용액으로 세척하여 감염되지 않은 바이러스를 제거하고 24-웰 플레이트에 웰 당 2×105세포가 되게 10%의 소태아혈청이 첨가된 배지(RPMI10)와 혈청이 첨가되지 않은 배지(Opti-MEM)를 첨가하여 이를 각각 배양하였고, 각각의 경우에 상기 실시예 1에서 합성된 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 0.1 μM의 농도로 종류별로 배양 초기 1회 첨가한 후 날마다 플레이트를 관찰하여 초기 신시티움이 생성되는 날짜와 신시티움의 갯수를 조사하여 각 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성을 측정하였으며, 그 결과를 하기표 2및표 3에 나타내었다. 이때 AZT를 0.1 μM로 첨가한 것을 비교군으로 삼았다.
혈청이 첨가되지 않은 배지(Opti-MEM)에서의 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성
감염후 경과일 |
1∼3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
대조군 |
|
|
+ |
++ |
+++ |
+++ |
++++ |
++++ |
+++++ |
+++++ |
비교군(AZT) |
|
|
- |
- |
+/- |
+ |
++ |
++ |
+++ |
+++ |
서열번호 1 |
|
|
- |
- |
+/- |
+/- |
+ |
++ |
++ |
++ |
서열번호 2 |
|
|
- |
- |
- |
+/- |
+/- |
++ |
++ |
++ |
서열번호 3 |
|
|
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+/- |
+ |
+++ |
+++ |
서열번호 4 |
|
+ |
+++ |
++++ |
++++ |
++++ |
++++ |
++++ |
+++++ |
+++++ |
서열번호 5 |
|
+ |
++ |
+++ |
+++ |
+++ |
+++ |
++++ |
+++++ |
+++++ |
서열번호 8 |
|
|
- |
+/- |
+/- |
++ |
++ |
+++ |
+++ |
+++ |
서열번호 9 |
|
|
- |
+/- |
+ |
+ |
++ |
+++ |
+++ |
+++ |
서열번호 10 |
|
|
- |
- |
- |
+/- |
++ |
++ |
+++ |
+++ |
서열번호 11 |
|
|
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+ |
++ |
+++ |
+++ |
서열번호 12 |
|
|
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+/- |
+ |
++ |
+++ |
서열번호 13 |
|
|
+ |
++ |
++ |
+++ |
++++ |
++++ |
+++++ |
+++++ |
서열번호 14 |
|
|
- |
- |
+/- |
+/- |
++ |
+++ |
+++ |
++++ |
서열번호 15 |
|
|
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+/- |
+ |
++ |
+++ |
서열번호 16 |
|
|
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+/- |
+ |
++ |
+++ |
서열번호 17 |
|
|
- |
- |
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+/- |
+/- |
서열번호 18 |
|
|
- |
- |
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+ |
+ |
서열번호 19 |
|
|
- |
- |
+/- |
+/- |
+ |
+ |
+ |
++ |
서열번호 20 |
|
|
- |
- |
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+/- |
+ |
서열번호 21 |
|
|
- |
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+ |
+ |
+ |
서열번호 22 |
|
|
- |
- |
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+/- |
+/- |
서열번호 23 |
|
|
- |
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+ |
+ |
+ |
서열번호 24 |
|
|
- |
+/- |
+ |
+ |
++ |
+++ |
+++ |
+++ |
서열번호 25 |
|
|
- |
+/- |
+/- |
+ |
++ |
+++ |
+++ |
+++ |
서열번호 26 |
|
|
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+/- |
++ |
++ |
+++ |
서열번호 27 |
|
|
- |
+/- |
+ |
++ |
+++ |
+++ |
+++ |
++++ |
서열번호 28 |
|
|
- |
+/- |
+/- |
+ |
++ |
++ |
++ |
+++ |
서열번호 29 |
|
|
- |
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+/- |
+ |
+ |
* 신시티움의 수 +/-:<10, +:∼20, ++:∼50, +++:∼100, ++++:∼200, +++++:>500
10% 혈청이 첨가된 배지(RPMI10)에서의 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성
감염후 경과일 |
0∼1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
대조군 |
- |
+ |
+ |
++ |
++ |
++++ |
++++ |
+++++ |
+++++ |
비교군(AZT) |
- |
- |
- |
+/- |
+/- |
+ |
++ |
+++ |
++++ |
서열번호 2 |
- |
- |
- |
- |
+/- |
+/- |
+/- |
+ |
++ |
서열번호 4 |
- |
++ |
++++ |
++++ |
++++ |
++++ |
++++ |
+++++ |
+++++ |
서열번호 11 |
- |
- |
- |
- |
- |
+/- |
+/- |
++ |
++ |
서열번호 17 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+/- |
+ |
+ |
서열번호 22 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+/- |
+/- |
서열번호 29 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+/- |
+ |
* 신시티움의 수 +/-:<10, +:∼20, ++:∼50, +++:∼100, ++++:∼200, +++++:>500
그 결과,표 2에서 보는 바와 같이 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 중서열번호 2,서열번호 3,서열번호 11,서열번호 17내지서열번호 23및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드는 AZT보다 항 바이러스 활성이 우수하였으며, 올리고뉴클레오타이드 중에서도서열번호 17,서열번호 20및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드는 다른 것에 비해 항바이러스 활성이 현저히 뛰어난 것으로 나타났다. 항 바이러스 효과를 보이는 군들은 모두 P=S 결합으로 이루어져 있었으며 육환의 아자슈거 뉴클레오타이드 유도체를 3개 이상 포함하고 있는 것들로 이중서열번호 20내지서열번호 23및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드는 HIV의 유전자 서열 특이성과 상관없이 항 HIV-1 활성을 보여주었다. 그러나, 육환의 아자슈거 유도체가 없는 P=S 결합을 가지는서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드의 경우는 0.1 μM 농도에서 오히려 대조군보다 신시티움 생성이 빨리 나타났을 뿐 아니라 시간이 지날수록 신시티움이 대조군보다 현저히 크고 많이 생성되었다(도 1).
한편, 육환의 아자슈거 유도체를 가지고 있을지라도 P=O 결합으로된서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드의 경우에는서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드와 같이 신시티움이 대조군보다 일찍 관찰되었으나 그 후 나타나는 신시티움의 갯수는 대조군과 비슷하였다. 상기 두 올리고뉴클레오타이드는 0.1 μM 농도에서 HIV 증식을 오히려 촉진시키는 것으로 나타났다. 육환의 아자슈거가 없으면서 P=O 결합을 가진서열번호 13의 올리고뉴클레오타이드나 그 외 부분적으로 P=O 결합을 가진 올리고뉴클레오타이드(서열번호 26내지서열번호 28의 올리고뉴클레오타이드)의경우, 어떤 것도 유의할만한 항 HIV 활성을 보이지 않았다. 항 바이러스 활성을 보이는 것들은 아자슈거 유도체의 위치나 갯수에 따라 활성이 달리 나타났으며 이에 대한 특별한 규칙을 발견하지는 못하였으나 육환의 아자슈거가 4개 이상 포함된 올리고뉴클레오타이드들이 비교적 항 바이러스 활성을 높게 나타내었다.
혈청이 첨가되지 않은 배지(Opti-MEM)에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 농도에 따른 HIV-1 증식 저해효과를 측정한 결과,서열번호 2,서열번호 11,서열번호 17,서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드의 경우에, 0.06 μM 이상의 농도에서 HIV-1의 증식을 효과적으로 억제하였다. 반면,서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 0.1 μM의 농도까지 전혀 항 바이러스 효과를 보이지 않았다(도 2).
표 2및표 3의 결과에서 대조군으로 올리고뉴클레오타이드를 첨가하지 않은 경우를 비교해 보면, 혈청이 첨가된 경우에 신시티움이 2-3일 일찍 나타나며 생성되는 신시티움의 수도 더 많은 것을 볼 때 혈청이 첨가될 때 HIV-1 바이러스의 증식이 더 빨리 일어남을 알 수 있었다.
한편, 혈청이 첨가된 상태에서 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성은서열번호 2,서열번호 11및서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 혈청이 없을 때에 비해 활성이 다소 떨어지는 것을 발견하였으나서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 혈청 첨가 여부에 별로 영향을 받지 않음을 확인하였다. 또한, 이들 5종의 올리고뉴클레오타이드 모두 혈청 존재하에서도 0.1 μM 농도에서 비교군으로 사용된 AZT보다 항 바이러스 효과가 뛰어남을 알 수 있었다. 혈청 존재하에서 올리고뉴클레오타이드의 농도별 항 바이러스 활성을 감염 후 처음 신시티움이 관찰되는 날짜로 조사한 후 그 결과를 하기표 4에 요약하였다.
혈청 존재 하에서 올리고뉴클레오타이드의 농도별 항 바이러스 활성
시료AS 농도 |
감염 후 경과일* |
서열 번호 2 |
서열 번호 4 |
서열 번호 11 |
서열 번호 17 |
서열 번호 18 |
서열 번호 19 |
서열 번호 20 |
서열 번호 21 |
서열 번호 22 |
서열 번호 23 |
서열 번호 28 |
0 μM |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
0.015 μM |
5 |
2~3 |
5 |
3 |
5 |
3 |
5 |
3 |
6 |
4 |
6 |
0.03 μM |
5 |
2 |
5 |
6 |
4 |
4~5 |
5 |
3 |
6∼7 |
5 |
6∼7 |
0.06 μM |
5 |
2∼3 |
6 |
6~7 |
5 |
5 |
6∼7 |
6∼7 |
6∼7 |
5 |
7 |
0.125 μM |
6 |
2∼3 |
6 |
8 |
9 |
6∼7 |
8 |
8∼9 |
9 |
7 |
9 |
0.25 μM |
8∼9 |
2 |
8 |
8∼9 |
- |
11 |
- |
11 |
- |
8∼9 |
11 |
0.5 μM |
9 |
2∼3 |
9∼10 |
11 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
1 μM |
- |
3 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
* : Jurkat-tat 세포에 HXBc2/Δtat 바이러스를 감염 후 10%의 소태아 혈청이 첨가된 배지(RPMI1640-10% FBS)에서 각 올리고뉴클레오타이드를 농도별로 첨가한 상태에서 최초로 신시티움이 관찰된 날.
그 결과, 올리고뉴클레오타이드를 처리하지 않은 대조군의 경우 감염 3일째에 모두 신시티움이 관찰되었으나서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드를 처리한 세포에서는 0.015 μM에서도 HIV 증식이 현저히 억제되어 6일째 처음 신시티움이발견되었으며 0.25 μM 이상에서는 신시티움이 생성되지 않았다.서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드와 함께 HIV 유전자 서열과 상관없는 올리고뉴클레오타이드군들 중서열번호 20,서열번호 21및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드와 HIV-1 TAR 유전자의 안티센스 서열을 가진 것 중서열번호 11및서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드가 0.06 μM 농도에서 HIV-1 증식을 효과적으로 억제하였으며 이들이 바이러스 증식을 완전히 차단하는데는 0.5 μM 이상의 농도가 필요하였다.서열번호 18의 올리고뉴클레오타이드의 경우 EC50값은서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드보다 높게(0.12 μM) 나타났으나 바이러스 증식을 완전히 차단하는데는 0.25 μM이 필요한 것으로 나타나 오히려서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드보다 효과적인 것으로 보였다.서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 혈청이 없는 배지(Opti-MEM)에서는 0.1 μM 정도에서서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드와 비슷한 항 바이러스 활성을 보였으나 혈청이 첨가된 배지에서는 활성이 현저히 떨어져 0.125 μM 이상에서서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드의 0.015 μM과 비슷한 항 바이러스 활성을 보였다.
상기 결과로부터 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 혈청에 의해 영향을 받는 정도가 유전자 서열에 따라 일정하지 않음을 시사해 주며, 이 경우 혈청의 농도에 따라서도 활성이 달라질 가능성이 있으므로 혈청의 농도별로 이들 올리고뉴클레오타이드의 활성에 미치는 영향을 조사하여 그 결과를 하기표 5에 요약하였다.
올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 효과에 대한 혈청의 저해효과
시료효능혈청의종류 및 농도** |
감염후 경과일* |
대조군 |
서열 번호 2 |
서열 번호 4 |
서열 번호 11 |
서열 번호 20 |
서열 번호 22 |
서열 번호 29 |
FBS |
0 % |
4 |
8 |
4 |
8 |
8 |
8 |
8 |
5 % |
3 |
5 |
2 |
6 |
7 |
8 |
8 |
10 % |
3 |
5 |
2 |
6 |
7 |
8 |
7∼8 |
50 % |
3 |
5 |
2 |
5∼6 |
6∼7 |
7∼8 |
7∼8 |
Human serum 10% |
3 |
5 |
2 |
6 |
7 |
8 |
8 |
Horse serum 10% |
3 |
5 |
2 |
6 |
7 |
8 |
8 |
* 여러 종류 및 농도의 혈청 존재하에서 HIV-1 감염 후 최초로 신시티움이 발견되는 날짜.
** 혈청이 첨가되지 않은 경우는 Opti-MEM 배지를 사용하였으며 혈청이 첨가된 경우는 RPMI 배지를 사용.
*** 올리고뉴클레오타이드의 농도 ; 0.1 μM.
그 결과, 혈청의 종류나 농도와는 크게 상관없이 각 올리고뉴클레오타이드의 종류별로 혈청의 존재 유무에 따라 활성에 영향을 받는 정도는 일정하였으며 이들 중서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드가 혈청의 존재 유무에 영향을 가장 적게 받는 것으로 나타났다.서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드는 혈청 첨가시 다른 올리고뉴클레오타이드에 비해 활성이 현저히 떨어지는 것으로 나타났다. 상기의 결과는 본 발명의서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드를 AIDS 환자에 투여하여도 항 바이러스 성질을 그대로 유지할 수 있음을 시사해 준다.
<1-2> 역전사 효소활성 측정(reverse transcriptase assay)
Jurkat-Tat 세포에 상기 실험예 <1-1>과 같이 HXBc2/Δtat 바이러스를 감염시키고 3일 간격으로 세포를 포함한 배양액의 2/3를 수획하였다. 수획한 배양액만큼의 새 배양액을 용기에 첨가하여 지속적으로 배양하고 이로부터 수획한 배양액을 1분간 강하게 볼텍싱(vortexing)한 다음 15000 rpm에서 10초간 원심분리하여 세포 파쇄물을 제거하였다.
역전사효소 활성은 기존의 방법을 변형시켜 측정하였다. 상등액을 새 용기에 옮기고 용액의 1/2에 해당하는 PEG/NaCl 용액(30% PEG in 0.4 M NaCl)을 첨가하여 잘 혼합한 후 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 상기 용액을 15000 rpm에서 45분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 바이러스 침전물에 분해 완충액(0.25% Triton X-100, 20% glycerol, 50 mM Tris-HCl 7.5, 0.1% DTT, 250 mM KCl) 10 ㎕를 첨가하여 침전물을 완전히 용해시켰다. 여기에 드라이아이스/에탄올 용액을 첨가하여 37℃ 항온수조에서 3회 얼림/녹임을 반복하여 침전물을 파쇄한 다음 각 용기에 50 ㎕씩 역전사효소 반응용액(1 unit/㎕ of RNasin, 1 uCi of3H-TTP, 0.025 unit Poly(A)-(dT), 50 μM Tris-HCl 7.5, 5 mM DTT, 0.1% Triton X-100)을 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 전 용액을 DE51 필터용지(Whatman)에 흡착시켜 건조시킨 다음 2X SSC 용액(3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate, pH 7.0)으로 3회 세척하고 95% 에탄올 용액으로 2회 세척한 후 건조시켰다. 상기 필터 용지를방사선 측정용기(scintillation vial)에 넣고 3-5 ㎖ 정도의 방사선 측정용 칵테일을 첨가한 후 방사능 측정기(liquid scintillation counter)에서 삽입된 방사선 양을 측정하였고 그 결과를도 3및도 4에 나타내었다.
그 결과,도 3및도 4에 나타낸 바와 같이 바이러스가 감염된 세포를 혈청이 첨가되지 않은 배지(Opti-MEM)에서 배양하면서 역전사효소 활성을 측정한 경우에는 6일이 지난 후부터 12일까지 시료 내의 역전사효소 활성이 급격하게 증가하였고 12일이 지난 후 다시 효소활성이 감소해서 이후 일정하게 유지되었다. 반면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(서열번호 2및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드)가 0.5 μM의 농도로 첨가된 상태에서 배양된 세포의 경우에는 시료내의 역전사효소 활성이 접종한 후 18일째까지 전혀 증가하지 않았다(도 3).
상기 결과로부터 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 의해 감염된 세포에서 HIV-1의 증식이 완전히 억제되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 혈청이 첨가된 배지에서도 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(서열번호 2,서열번호 17,서열번호 20및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드)의 HIV-1 역전사효소 활성 억제효과는 혈청이 없는 배지에서와 비슷한 결과를 보여 주었다(도 4). 그러나, 기존에 발표된 P=S 결합만으로 이루어진 올리고뉴클레오타이드인서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드의 경우는 동일 농도에서 대조군보다 더 빨리 역전사효소 활성이 나타났으며 항 바이러스 활성은 없는 것으로 나타났다.
<실험예 2> 올리고뉴클레오타이드의 다양한 HIV-1 주에 대한 항 바이러스 활성 조사
Tat 활성을 제거한 HIV-1 실험실 주인 HXBc2/Δtat(tat-defective HIV-1 strain) 바이러스 외에 야생주인 IIIB 주(미국 NIH 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 분양) 및 재조합의 맹독성 균주인 SHIV89.6주(미국 NIH 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 플라스미드 형태(p89.6)로 분주받아 제시된 방법대로 C8166 세포에 형질감염시켜 바이러스를 수획)에 대해서도 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 항 바이러스 활성을 나타내는지를 조사하였다.
SHIV89.6바이러스 주는 C8166 세포(미국 NIH 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 분주받음)에 실험예 <1-1>의 방법대로 감염시키고 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 최종 농도 0.2 μM 및 0.5 μM 처리 후 시간이 지나면서 형성되는 신시티아의 수를 관찰하였고 그 결과를 하기표 6에 나타내었다.
올리고뉴클레오타이드의 SHIV89.6바이러스에 대한 항 바이러스 활성
시 료 |
감염후날짜농도. |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
대조군 |
no AS |
- |
+/- |
+ |
++ |
++++ |
+++++ |
+++++ |
서열번호 2 |
0.2 μM |
- |
- |
- |
+/- |
+ |
++ |
++++ |
0.5 μM |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
서열번호 4 |
0.2 μM |
- |
+/- |
++ |
++++ |
+++++ |
+++++ |
+++++ |
0.5 μM |
- |
+/- |
++ |
++++ |
+++++ |
+++++ |
+++++ |
서열번호 17 |
0.2 μM |
- |
- |
- |
+/- |
+ |
+++ |
++++ |
0.5 μM |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
서열번호 20 |
0.2 μM |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
0.5 μM |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
서열번호 22 |
0.2 μM |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
0.5 μM |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
* 신시티아 개수; -: 없음, +/-: <10 , +: >20, ++: >40, +++: >60, ++++: >80, +++++: >100
표 6에 나타낸 바와 같이,서열번호 20및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드(서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드도 동일한 결과를 보임)은 0.2 μM 에서도 7일 동안 전혀 신시티아 형성이 관찰되지 않았으며서열번호 2및서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드의 경우 0.5 μM에서는 신시티아 형성이 관찰되지 않았으나 0.2 μM에서는 4일째부터 신시티아 형성이 관찰되었으며 시간이 지날수록 갯수가 증가하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드를 처리한 경우 2일째부터 신시티아가 관찰되기 시작하여 그 이후 갯수가 급속히 증가하였으며 특히서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드의 경우는 실험실 주인 HXBc2/Δtat에서 나타난 것과 비슷한 양상으로 대조군 보다 오히려 신시시아 형성이 현저히 빠르게 나타났다(표 6).
또한, 상기와 동일한 실험을 HIV-1 IIIB/MT-4 세포(미국 NIH 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 분주받음) 및 SHIV89.6/C8166에서 진행하고 4일 후 바이러스에 의해 파괴되고 남은 세포를 MTT 분석법으로 조사하여 대조군에 비해 바이러스 증식을 50% 저해하는 시료의 농도인 EC50값을 결정하였고 이를 HXBc2/Δtat/Jurkat-Tat에서 얻은 결과와 함께 하기표 7에 나타내었다.
올리고뉴클레오타이드의 여러 HIV-1 주에 대한 항 바이러스 활성
시료바이러스/숙주 |
EC50(μM) |
서열번호 2 |
서열번호 4 |
서열번호 17 |
서열번호 20 |
서열번호 22 |
서열번호 29 |
AZT |
ddC |
ddI |
HXBc2/Δtat /Jurkat-Tat |
0.12 |
>10 |
0.06 |
0.08 |
0.05 |
0.08 |
0.01 |
ND* |
ND |
HIV-1 IIIB/MT-4 |
0.13 |
>2.0 |
0.14 |
0.10 |
0.08 |
0.12 |
0.007 |
0.659 |
35.9 |
SHIV89.6p/C8166 |
0.23 |
>2.0 |
0.16 |
0.12 |
0.10 |
0.16 |
>400 |
2.673 |
70.7 |
* ND ; 실험을 수행하지 않음.
그 결과, 올리고뉴클레오타이드 중 실험실 주에 대해 효과가 있던서열번호 2,서열번호 17,서열번호 20,서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드 시료들은(0.05 μM < EC50< 0.12 μM) 독성주인 HIV-1 IIIB 및 HIV-189.6p 바이러스 주에 대해서도 효과적인 항 바이러스 활성을 나타내었으며(0.08 μM < EC50<0.23 μM) 이들 중서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드가 가장 효과적임을 확인하였다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 ddC 및 ddI와 같은 다른 핵산 유도체들에 비해서는 항 바이러스 활성이 월등히 뛰어난 것으로 나타났다.
한편 대조군으로 에이즈 치료제로 널리 쓰이는 AZT(Sigma, 삼천리제약)의 항바이러스 활성을 조사한 결과, HXBc2/Δtat 및 IIIB 주에 대해 단기적으로는 올리고뉴클레오타이드에 비해 10배 이상 효과적이었으나(감염 4일 후 MTT 분석 결과), 1회 처리 후 추가 투여 없이 9 내지 12일간의 장기적인 항 바이러스 활성은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 AZT보다 오히려 우수하였다(표 2 및 표 3). 또한 AZT는 SHIV-189.6p 바이러스 주에 대해서는 전혀 항 바이러스 활성을 나타내지 못하였다.
상기의 결과는 올리고뉴클레오타이드가 AZT보다 안정하여 배지에서 비교적 오래 활성을 유지하기 때문으로 생각되며 또한 AZT가 작용하지 못하는 SHIV89.6에 대해서도 효과적인 항 바이러스 활성을 나타내는 것으로 보아 HIV-1의 변이주에 대해서 폭넓게 작용할 수 있어 기존 AIDS 치료제에 대해 내성을 보이는 환자의 치료에도 효과가 좋을 것으로 기대된다.
<실험예 3> 올리고뉴클레오타이드의 세포독성 실험
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 세포독성을 확인하기 위하여 하기와 같은실험을 수행하였다.
본 발명의 세포독성을 확인하기 위하여 미국 NIH의 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 공급받은 C8166, 174xCEM 및 MT-4 세포와 ATCC에서 구입한 HeLa(ATCC CCL 2), Jurkat E6(TIB 152), Vero(CCL 81) 및 U-937(CRL 1593) 세포를 사용하였다. 올리고뉴클레오타이드에 대한 세포독성 실험은 이들 시료를 각 세포에 처리하고 4일 후 생존하는 세포의 양을 측정하여 비교하였다. 생존하는 세포의 양은 기존의 MTT 분석법을 조금 변형시켜 측정하였다. 96-웰 미세정량 플레이트(96-well microtiter plate)에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 함유된 RPMI1640(RPMI 10%) 배양액을 200 ㎕되게 채우고 각 웰당 1×105MT-4 세포와 여러 농도(0 μM부터 100 μM까지)의 올리고뉴클레오타이드를 각각 섞어 4일간 배양하였다. 각 웰에 MTT 용액(PBS에 MTT[Sigma Chem Co.]를 7.5 ㎎/㎖ 농도로 준비하여 4℃에 보관한 것) 10 ㎕를 첨가한 후 37℃에서 4시간 더 배양하고 각 웰로부터 상등액을 조심스럽게 제거한 한 다음 최종 30 ㎕ 정도의 잔여 용액이 있는 상태에서 이소프로판올(isopropanol)에 0.04 M 농도로 용해되어 있는 HCl 용액 100 ㎕을 첨가하였다. 이를 상온에서 5분간 방치한 후 570 nm 파장에서 효소항체 면역 분석기(ELISA)로 흡광도를 측정하여 생존 세포의 양을 조사함으로써 각 올리고뉴클레오타이드의 세포독성 정도를 결정하였다. 세포독성 정도는 올리고뉴클레오타이드를 처리하지 않은 대조군의 흡광도를 100%로 보았을 때 흡광도가 50% 이하로 떨어지는 시료의 양(CC50)으로 표시하였으며, 이 양이 100 μM 이상인 경우 그 이상의 농도에서는 독성을 측정하지 않았다. 실험결과 나타난 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세포독성을 하기표 8에 요약하였다.
여러 세포에서 올리고뉴클레오타이드의 세포독성
세포시료 |
CC50에 의한 세포독성(μM) |
MT-4 |
Jurkat |
C8166 |
Vero |
CEMx174 |
U937 |
HeLa |
서열번호 2(ⓐ:3) |
>100 |
80 |
80 |
>100 |
>100 |
40 |
>100 |
서열번호 4(ⓐ:0) |
>100 |
80 |
90 |
60 |
80 |
20 |
>100 |
서열번호 11(ⓐ:4) |
>100 |
>100 |
60 |
>100 |
>100 |
40 |
>100 |
서열번호 13(P=O) |
80 |
>100 |
>100 |
>100 |
>100 |
>100 |
>100 |
서열번호 17(ⓐ:4) |
>100 |
>100 |
55 |
>100 |
>100 |
45 |
>100 |
서열번호 20(ⓐ:4) |
>100 |
>100 |
>100 |
>100 |
>100 |
40 |
>100 |
서열번호 22(ⓐ:5) |
>100 |
>100 |
>100 |
80 |
>100 |
50 |
>100 |
서열번호 29(ⓐ:5) |
>100 |
80 |
>100 |
80 |
>100 |
50 |
>100 |
* 괄호안은 각 올리고뉴클레오타이드에 포함된 육환의 아자슈거의 갯수.
* CC50; 처리하지 않은 샘플에 비해 50%의 세포가 치사하는 시료의 농도.
* 세포독성은 올리고뉴클레오타이드를 일정 배율로 희석하여 세포에 처리 후 4일째에 생존하는 세포의 수를 MTT 분석법으로 계산한 것임.
상기표 8의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 U937 세포를 제외하고는 대부분의 세포에서 CC50값이 50 μM 이상으로, CC50/EC50으로 표현되는 치료계수(TI, Therapeutic Index)(N. Jing et al,J. Biol. Chem., 275, 3421-3430, 2000)로 볼 때 거의 100 이상으로 나타났으며, 특히서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드의 경우 TI 값은 U937 세포에서도 최소한250 이상으로 나타났다. 약물에 있어 TI 값은 안전성을 나타내는 수치로 TI 값이 클수록 약물의 치료농도와 치사농도의 차이가 크므로, 상기 결과로부터 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 세포독성으로 인한 부작용은 없는 것으로 판단되었다.
<실험예 4> 올리고뉴클레오타이드의 안정성 조사
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 안정성을 조사하기 위하여, 10% 소태아혈청이 첨가된 RPMI1640 배지 중 세포배양 후 수거한 상청액과(도 5) 세포 배양에 사용되지 않은 신선한 배지(도 6)에 최종농도 13 μM이 되도록 올리고뉴클레오타이드를 첨가하여 37℃ CO2배양기에 보존하였다. 세포 배양에 사용된 상청액의 경우에는 용액에 핵산 분해효소들이 많을 것으로 간주하여 0, 1, 2 시간 및 1, 2, 4, 6 일에서, 그리고 세포 배양에 사용되지 않은 신선한 배지에서는 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15일에 10 ㎕씩 수획하여 20% SDS-PAGE 젤에서 전기영동하고 젤을 EtBr 용액으로 염색하여 올리고뉴클레오타이드가 분해되는 정도를 조사함으로써 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 안정성을 결정하였다.
그 결과,도 5에 나타난 바와 같이 세포 배양에 사용된 배지에서는 P=O 결합만으로 구성되고 6환의 아자슈거가 없는 올리고뉴클레오타이드인서열번호 13의 올리고뉴클레오타이드의 경우 세포에 의해서 분비되는 여러 가지 분해효소들에 의해 2시간 이내에 올리고뉴클레오타이드가 완전히 분해되었으나, P=S 결합으로 이루어진서열번호 2또는서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드 뿐 아니라 P=O 결합이지만 6환의 아자슈거 구조를 가진서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드의 경우 모두 세포배양 상청액에서 6일 이상 분해되지 않을 정도로 안정함을 확인하였다. 이는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 사람에 투여하여도 체내에서 상당기간 분해되지 않고 약효가 지속될 수 있음을 시사해 준다. 특히 P=O 결합이 매우 불안정한데 비하여 18개의 뉴클레오타이드 중 6환의 아자슈거가 3개만 포함되어도 안정성을 나타낸다는 것은 특기할 만한 사실이며 앞으로 안티센스의 안정성 연구에 필요한 좋은 자료가 될 것이다.
한편,도 6에서와 같이 10% 소 혈청이 포함된 신선한 배지에서는 본 발명의서열번호 2및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드 모두 15일 이상 안정성을 유지함을 알 수 있었다. 상기 결과는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 인체에서 장기간 분해되지 않고 항 바이러스 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
<실험예 5> 올리고뉴클레오타이드의 세포막 투과여부 및 세포내 항 바이러스 활성 측정
<5-1> 올리고뉴클레오타이드의 세포막 투과능 측정
올리고뉴클레오타이드의 세포막 투과능을 측정하기 위하여, MAGI 세포(LTR-β-갈락토시다제[galactosidase] 유전자를 가진 HeLa 세포로 외부에서 Tat 단백질이 들어오면 LTR 프로모터[promoter]가 Tat에 의해 활성화되어 β-갈락토시다제가발현되도록 고안된 세포)와 Tat 발현 벡터인 pSV2-Tat 플라스미드 및 LTR-CAT 플라스미드를 미국 NIH의 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 공급받아 사용하였다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 의한 항 바이러스 활성이 세포막을 통과하여 세포내에서 일어나는지를 확인하기 위하여, 1×106MAGI 세포에 2 ㎍의 pSV2-Tat 플라스미드를 GenePorterTM키트(Gene Therapy Systerms, Inc. San Diego, CA, 미국)를 이용하여 형질감염시킨 후 배지에 올리고뉴클레오타이드를 최종농도 0.25 μM 되게 처리하거나(도 7의A), 2 μg의 pSV2-Tat 플라스미드와 여러 농도의 올리고뉴클레오타이드를 함께 형질감염시켰다(도 7의B). 형질감염 48시간 후 배지를 제거하고 세포에 1% 포름알데히드(formaldehyde)와 0.2% 글루탈알데히드(glutalaldehyde) 용액을 처리하여 5분간 고정하고 이를 인산염 완충용액으로 세척한 다음 0.04% X-gal 염색용액(인산염 완충용액에 최종농도 4 mM potassium ferricyanide, 2 mM MgCl2, 0.04% 5-bromo-4-chloro-3-indoryl-β-D-galactopyraoside를 포함)을 넣고 37℃에서 50분간 반응시켜 푸른색으로 염색되는 세포를 관찰하고 염색된 세포의 갯수를 세어 올리고뉴클레오타이드에 의한 LTR의/Tat의 활성억제 정도를 측정하였다(도 7).
그 결과,서열번호 2,서열번호 4및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드를 처리한 세포에서 파랗게 염색된 세포의 수가 대조군과 별 차이가 없는 것으로 보아 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 어느 경우도 배지에서 세포막을 통과하지 못하여 세포안의 LTR 활성을 억제하지 못하는 것으로 생각된다(도 7의A). 한편 세포 안으로 들어가서도 활성이 없기 때문에 상기와 같은 결과가 나올 가능성이 있으므로 이를 배제하기 위하여 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 pSV2-Tat(Tat 발현 벡터)와 동시 형질감염시키고 LTR/Tat 활성에 의해 세포내 β-갈락토시다제의 발현으로 푸른색을 띄게 되는 세포의 수를 조사한 결과, 6환의 아자슈거가 없는서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드는 LTR/Tat 활성을 억제하여 푸른색으로 염색되는 세포의 수가 현저히 줄어듬을 확인하였으나 6환의 아자슈거를 가진서열번호 2및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드의 경우는 푸른색을 띄는 세포의 개수가 대조군과 별차이가 없음을 관찰하였다(도 7의B).
상기 결과를 정량적으로 분석하기 위하여 2 ㎍의 pSV2-Tat 플라스미드와 여러 농도(0, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2.5 및 5 ㎍)의 올리고뉴클레오타이드를 동시에 형질감염시키고 48시간 후 세포를 고정하여 β-갈락토시다제를 발현하여 푸른색을 띄는 세포의 수를 세어 대조군 대비 백분율(%)로 나타내었다(도 8).
그 결과,서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드은 세포 내로 주입 시 농도에 비례하여 LTR/Tat 활성을 억제하는 것을 확인하였으나, 배지에 처리하였을 때 항 바이러스 활성을 나타내는서열번호 2,서열번호 17및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드(서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드)을 세포 내로 주입 시에는 LTR/Tat의 활성을 억제하지 못하여 대조군과 비슷한 양상을 나타내었다. 상기의 결과는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 세포막을 투과하지 못하거나 혹은 항 바이러스 활성이 LTR에 특이적인 것이 아님을 시사한다. 이러한 결과는 본 발명의올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성이 세포내의 HIV-1 유전자 발현을 특이적으로 저해하여 나타나는 현상이 아니라 올리고뉴클레오타이드가 세포밖에서 단백질과 결합하여 바이러스의 부착을 방해함으로써 HIV-1 바이러스의 증식을 억제하기 때문인 것으로 해석된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세포표면 단백질과의 결합 가능성은 몇몇 연구 결과에서도 이미 제시된 바 있다(P. Hawley et al.,Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 9, 61-69, 1999; P. Rockwell et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 6523-8, 1997; Hotoda H. et al.,J. Med.C hem., 41, 3655-3663, 1998; Jing N. et al.,J. Biol. Chem., 275, 3421,2000). 세포 표면에 작용하여 HIV-1에 대해 항 바이러스 활성을 나타낸다는 점에서는 기존의 보고된 안티센스 기작과 유사하나 6환의 아자슈거를 올리고뉴클레오타이드에 첨가하여 P=S 결합만으로 이루어진서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드보다 항 바이러스 활성이 월등히 뛰어나며 안전성 및 안정성을 현저히 증가시켰다는 점이 본 발명의 기술적 신규성이라 하겠다.
<5-2> 올리고뉴클레오타이드의 세포내 항 바이러스 활성 측정
본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 세포막을 통과하여 세포내에서 목적한 HIV-1의 유전자 서열을 인식하며, 특이성을 가지고 해당 RNA 부위(TAR 유전자 서열)와 결합하여 항 바이러스 활성을 나타내는지 아니면 세포 밖에서 작용하여 HIV-1의 감염을 억제하는지를 확인하기 위하여 2×106Jurkat-tat 세포에 5 ㎍의 LTR-CAT만을 형질감염시키고 2 ㎍의 올리고뉴클레오타이드를 배지에 첨가하거나(도 9), 2×106Jurkat-tat 세포에 5 ㎍의 LTR-CAT과 2 ㎍의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 동시에 형질감염시키고(도 10) 48시간 후 세포 내에서 LTR/Tat 활성에 의해 발현되는 CAT(chloramphenicol acetyl transferase) 효소의 활성을 측정하였다. GenePorterTMtransfectant(Gene Therapy System Inc. Sandiage, CA, USA) 키트를 사용하여 형질감염을 시켰으며 제조사의 지침에 따라 실험을 진행하였다.
CAT 활성을 측정하기 위하여 형질감염된 세포를 48시간 후 수획하여 4℃ 인산염 완충용액으로 2회 세척하고 1 ㎖ TNB 용액(40 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl)을 첨가하여 혈구세포 분석기로 세포 수를 확인한 다음 드라이아이스/에탄올 수조와 37℃ 항온수조에서 얼림과 녹임을 3회 반복하여 세포를 파쇄하고 60℃ 수조에서 10분간 열처리하여 세포 자체의 CAT 활성을 제거하였다. 이렇게 준비된 시료 안의 CAT 효소활성 측정은 기존의 Promega사에서 제시하는 방법을 따랐다.
그 결과, 올리고뉴클레오타이드를 배지에 처리한 경우 CAT 활성이 전혀 영향을 받지 않은 것으로 보아 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 세포 안의 LTR/Tat의 활성을 억제하지는 못하였음을 알 수 있었다(도 9). 또한, 올리고뉴클레오타이드를 형질감염시켜 강제로 세포내로 주입하였을 경우에는, 항 바이러스 활성이 약한 6환의 아자슈거가 없는서열번호 4및서열번호 13의 올리고뉴클레오타이드나 6환의 아자슈거가 있어도 올리고뉴클레오타이드의 양쪽 끝에 위치한서열번호 9의 올리고뉴클레오타이드를 처리한 세포에서는 LTR/Tat 활성이 억제되어 CAT 활성이 현저히 낮아지거나 대조군에 비해 상대적으로 감소한 경향을 보였다. 반면에 육환의 아자슈거를 3개 이상 포함한 것으로서 배양액에 처리시 강한 항 바이러스 효과를 보였던서열번호 2,서열번호 11및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드는 형질감염시켜 세포내로 강제로 주입하여도 LTR/Tat의 활성을 거의 억제하지 못하였다(도 10). 이는 아마도 육환의 아자슈거 갯수가 증가할수록 서열 특이적인 표적 mRNA에 친화도가 떨어져 발현을 억제하지 못하기 때문인 것으로 해석된다.
상기의 결과를 종합하면 육환의 아자슈거가 포함된 올리고뉴클레오타이드의 HIV-1에 대한 항 바이러스 효과는 세포막을 투과하여 세포안에서 HIV-1에 대한 유전자 서열 특이적인 안티센스 기작에 의한 바이러스 증식을 억제하기 보다는 세포 밖에서 작용하여 HIV-1의 증식을 억제하는 방법으로 항 바이러스 활성을 나타내는 것으로 판단된다. 이러한 특성은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 다양한 HIV-1 바이러스 주 뿐 아니라 약제내성 돌연변이 주에 대해서도 동일한 항 바이러스 효능을 보일 가능성을 시사해 준다. 상기 실험예 2의 결과에서 본 바와 같이 본 발명의서열번호 20및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드가 실험실 주 및 야생의 IIIB 주 뿐 아니라 AZT로는 효과가 없는 맹독성의 재조합 바이러스인 SHIV89.6에 대해서도 매우 효과적으로 항 바이러스 활성을 나타내는 것도 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 이러한 세포 밖에서 감염을 차단하는 특성 때문일 것으로 생각된다.또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 역전사효소 억제제에 내성을 나타내는 HIV-1 주(Y181C, K103N, Y188H, L1001, 및 V106A)들에 대해서도 증식 억제효과를 조사한 결과 상기의 바이러스들과 유사하게 강력한 항 바이러스 활성을 나타내었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 올리고뉴클에오타이드는 역전사효소 활성 억제제나 단백질 분해효소 억제제와는 달리 HIV-1 바이러스 전반에 대해 항 바이러스 효능을 보임으로써 폭넓은 AIDS 치료제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
<실험예 6> 감염된 세포의 회복실험
Jurkat-Tat 세포에 상기 실험예 <1-1>과 같이 HXBc2/Δtat 바이러스를 감염시키고 10% 혈청 존재하에서 배양하며 5일 후 신시티움이 왕성하게 생성되었을 때, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 각각 최종농도 0.5 μM되게 처리하고 36시간이 지난 후 신시티움이 사라지는 정도를 관찰하였다(도 11).
그 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군의 경우 7일째에 매우 크고 왕성한 신시티움이 관찰되었으나서열번호 2,서열번호 17,서열번호 20및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드를 첨가해 준 웰에서는 신시티움 형성이 현저히 감소되었으며 특히서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드의 경우 대부분의 신시티움이 사라지고 세포가 정상적으로 회복되었음을 확인하였다. 그러나, 6환의 아자슈거를 포함하지 않고 P=S 결합만으로 합성한서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드의 경우는 오히려대조군보다 더 왕성한 신시티움이 관찰되었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 6환의 아자슈거를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 초기 감염을 억제하는 효과 뿐 아니라, 감염된 세포가 주위의 정상 세포와 gp120-CD4 결합을 통해 생성하는 신시티움 형성을 효과적으로 차단하여 바이러스의 전파를 억제함으로써 에이즈 환자에 투여시 더 이상의 정상세포의 감염을 막고 기존 신시티움의 진전을 억제하여 전체적으로 회복효과를 나타낼 수 있음을 단적으로 시사해 준다.
<실험예 7> 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 다른 바이러스에 대한 항 바이러스 활성조사
본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 HIV-1 외의 다른 바이러스에도 항 바이러스 활성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 원숭이에 감염되어 사람의 AIDS와 비슷한 증상을 일으키는 SIV 바이러스(미국 NIH 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 분양)의 TAR 부위에 대해 6환의 아자슈거를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(서열번호 6및서열번호 7의 올리고뉴클레오타이드)와 소아마비 바이러스의 IRES(internal ribosomal entry site) 유전자 서열에 해당하는 부분에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(서열번호 8의 올리고뉴클레오타이드)를 이용하여 하기 실험을 수행하였다.
<7-1> 올리고뉴클레오타이드의 SIV에 대한 항 바이러스 활성 조사
CEMx174 세포를 10% 소태아 혈청이 포함된 RPMI 배지에서 배양하면서 SIV 바이러스를 0.01 MOI가 되도록 실험예 <1-1>에서와 같이 1시간 감염시키고, 감염 후 각 웰에 여러 종의 올리고뉴클레오타이드를 최종 농도가 0.5 μM 되도록 처리한 다음 2일 간격으로 상청액을 수획하여 실험예 <1-2>에서와 같은 방법으로 역전사효소 활성을 측정함으로써 항 바이러스 활성을 조사하였다(도 12).
그 결과, 본 발명의 올리고 뉴클레오타이드 중 어느 것도 SIV 증식을 억제하지 못하였으며 유전자 서열과 무관하게서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드은 HIV-1에서와 같이 SIV 증식을 오히려 촉진하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명의 6환의 아자슈거를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 HIV-1에만 특이적으로 항 바이러스 효과를 보임을 의미한다. SIV는 HIV-1와 유전자 구조는 비슷하나 유전자 서열상의 상동성(homology)은 50% 정도 밖에 되지 않으며 숙주 특이성도 달라 인체에는 감염되지 않는다. SIV의 기주특이성이 HIV-1와 틀린 점을 감안할 때 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 HIV-1 감염에 필요한 수용체나 바이러스 외막 단백질 중 숙주세포와의 결합에 관여하는 단백질과 결합하여 HIV-1의 감염만을 특이하게 차단하는 기작으로 항 바이러스 효과를 보이는 것으로 해석된다.
<7-2> 올리고뉴클레오타이드의 소아마비 바이러스에 대한 항 바이러스 활성 조사
30 mm 세포 배양용 페트리 접시에 사람 자궁경부암 세포(HeLa cell)를 단층 배양하고 여기에 소아마비 바이러스 Sabin 1형(뉴욕 주립대학 E. Wimmer 박사로부터 분양 받음)을 MOI 0.1이 되도록 1시간 동안 감염시킨 다음 인산염 완충용액으로 세포를 2회 세척하여 감염되지 않은 소아마비 바이러스를 제거하였다. 상기 세포에 각각의 올리고뉴클레오타이드가 최종농도 1 μM이 되도록 포함된 배지(10% 소태아 혈청이 포함된 DMEM 배지: GIBCO/BRL)를 첨가하여 배양하면서 3시간 간격으로 상등액을 수획하여 TCID50법으로 생산된 바이러스의 양을 측정하였다(도 13).
그 결과, 발명의 올리고뉴클레오타이드 중 어느 것도 유전자 서열 특이성과 무관하게 소아마비 바이러스의 증식에 전혀 영향을 주지 못하였다. 상기 결과는 올리고뉴클레오타이드를 배지에 처리할 경우 리포좀을 이용한 인위적인 조작없이 세포안으로 들어가 항 바이러스 활성을 나타내지 않으며 세포 표면에 발현되는 다량의 소아마비 바이러스 수용체(poliovirus receptor)에 대해서도 전혀 영향을 미치지 않음을 보여준다.
상기 실험예 <7-1>과 <7-2>의 결과를 종합하여 볼 때, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 비록 세포 안으로 들어가 HIV 유전자의 발현을 특이적으로 억제하지는 않으나 기존의 다른 보고(P. Hawley et al.,Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 9, 61-69, 1999; P. Rockwell et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 6523-8, 1997)에서처럼 세포 표면에 작용시 HIV-1의 감염에 관련된 세포 표면단백질에 특이적으로 결합하거나, 기존의 보고(J. Suzuki et al.,Nucleic Acids Symp.Ser.,(42), 227-8, 1999; J.R. Wyatt et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 1356-1360, 1994)에서와 같이 HIV-1 외막 단백질 중 V3 부분만을 효과적으로 차단하는 등의 방법으로 항 바이러스 활성을 나타내는 것으로 생각되며, 이 경우 수용체가 상이한 다른 바이러스의 증식에는 전혀 영향을 주지 않는 것으로 보아 세포 표면의 다른 단백질에는 영향을 미치지 않아 정상적인 세포 활성에는 지장을 주지 않을 것으로 기대된다.
<실험예 8> 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성에 대한 혈청의 영향
본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 인체에 투여할 경우 고 농도의 혈청 존재 하에서 항 바이러스 활성을 나타내어야 한다. 본 발명자들은 첨가된 혈청의 농도나 종류에 따라 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성이 영향을 받는지 조사하기 위하여, 세포 배양액을 혈청이 첨가되지 않은 배지(Opti-MEM: GIBCO/BRL)에서와 10%의 소태아 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지(GIBCO/BRL), 10%의 말 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지, 10% 사람 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지 및 농도를 달리한 소태아 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성을 측정하였다. 상기 실험예 <1-1>과 같이 Jurkat-tat 세포에 HIV-1/Δtat 바이러스를 감염시키고 0.1 μM의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리한 후 최초로 신시티움이 분명하게 형성되는 날짜를 조사하여 그 결과를표 5에 나타내었다.
표 5에 나타낸 바와 같이 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 혈청이 없는Opti-MEM 배지에서는서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드를 제외하고는서열번호 2,서열번호 11,서열번호 17,서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드 모두 처리 후 8일이 지나서야 처음 신시티움 형성이 발견되는 등 매우 효과적인 항 바이러스 활성을 보였다. 그러나 혈청이 첨가되면 종류에 따라 항 바이러스 활성이 다소 줄어들어 2-3일 일찍 신시티움이 형성됨을 관찰하였다. 특히, 이 중서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드의 활성이 혈청에 영향을 제일 크게 받았으며서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드이 가장 영향을 적게 받는 것으로 나타났다. 그러나 혈청이 올리고뉴클레오타이드의 항바이러스 활성에 미치는 영향은 혈청의 종류나 처리 농도와는 거의 무관한 것으로 나타났으며 일단 소량이라도 혈청이 첨가되면 활성이 저해되고 그 이상 혈청의 농도를 높여도 활성의 저해 정도에는 거의 차이가 없는 것으로 나타났다. 이는 아마도 소량의 혈청만으로도 올리고뉴클레오타이드와의 반응이 포화되어 그 이상의 농도에서는 별 영향을 받지 않는 것으로 생각되며, 이 경우 체내의 고농도 혈청에서도 상기 정도 이상의 활성저해 영향은 없을 것으로 생각된다. 이러한 가운데서도서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드는 혈청의 유무, 혈청의 종류나 농도에 거의 영향을 받지 않고 항 바이러스 활성을 유지하는 것으로 나타났다.
<실험예 9> 마우스에 대한 비경구투여 급성 독성실험
5주령의 특정병원부재(SPF) ICR계 마우스를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 3 마리씩의 동물에 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 각각인산 완충식염수(PBS)에 녹여 100 mg/kg의 용량으로 단회 정맥에 투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 모두 마우스에서 100 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 정맥 투여 무해 용량은 100 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.