KR20020044733A

KR20020044733A - 유류분해 미생물제제 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20020044733A
Application number: KR1020000073791A
Authority: KR
Inventors: 문혜준
Original assignee: 정욱진
Priority date: 2000-12-06
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2002-06-19
Also published as: KR100464107B1

Abstract

본 발명은 유류분해 미생물제제 및 그 제조방법에 관한 것으로, 유류로 오염된 토양에서 유류를 분해할 수 있는 미생물들을 분리한 후, 이 중에서 유류분해능이 뛰어난 미생물을 선별하여 조합한 유류분해용 미생물제제를 제공한다. 본 발명에 따른 유류분해 미생물제제는 유류분해율 및 생태계 적응성을 향상시키는 효과가 있다.

Description

유류분해 미생물제제 및 그 제조방법{Microorganism consortia for the degradation of diesel and process for preparation thereof}

본 발명은 유류분해 미생물제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 토양으로부터 유류분해능이 우수한 균주를 선별하여 조합한 유류분해 미생물제제 및 상기 유류분해 미생물제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

디젤은 다양한 석유 탄화수소 및 이와 관련된 화합물들을 포함한다. 석유 탄화수소 및 이를 함유한 제품들은 인류의 산업발전에 커다란 기여를 하였지만 반면에 환경오염의 주요한 원인으로 작용하고 있다. 석유 탄화수소는 다양한 생물계에 대한 그들의 분해저항성, 생물로의 축적 및 독성으로 인하여 심각한 환경문제를 야기시키고 있다.

유류오염은 누출, 저장탱크의 파손 및 수송사고 등으로 인하여 발생하며, 디젤은 저장소 부근의 토양 및 지하수의 주요한 오염원이다. 오염물질들은 기화, 광화학적 및 토양화학적 반응, 그리고 생물분해에 의해 자연적으로 제거되나, 상당한시간이 소요된다. 그 동안 물리화학적인 토양처리방법이 주로 사용되어 왔으나, 처리효율 및 비용면에서 한계를 나타내고 있다. 따라서, 최근에는 유류의 자연분해에 중추적인 역할을 담당하는 미생물을 이용한 생물학적인 토양정화방법이 연구되고 있다.

본 발명자들은 토양으로부터 유류분해능이 우수한 미생물을 분리하여 특허출원(특허출원 제 1999-10776호)한 바 있다. 그러나, 단일균주일 때보다 분리균주들을 조합함으로써 유류분해율 및 생태계에 대한 적응성을 향상시킬 수 있다는 사실을 발견하였으며, 이에 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 유류로 오염된 토양으로부터 유류를 분해하는 미생물을 분리하고 이 중에서 유류분해능이 뛰어난 미생물을 선별하여 이들을 조합한 유류분해 미생물제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유류분해 미생물제제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 오염된 토양으로부터 유류분해 균주를 분리하여 선별한 후, 상기 선별된 균주들을 조합하면서 유류분해능을 조사함으로써 유류분해 미생물제제를 제조하였다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은 본 발명에 따라 선별된 유류분해균주(25℃에서 6일 동안 유일한 탄소원으로 디젤을 함유하는 최소영양배지에서 배양)의 디젤분해율을 나타낸 그래프,

도 2는 본 발명에 따른 유류분해 미생물제제(4% (v/v) 디젤을 함유하는 배지에서 6일 동안 배양)를 배양하여 디젤을 분해한 후 잔류하는 디젤을 가스크로마토그래피로 분석한 결과를 나타낸 그래프(큰 피크는 대조구로서 4% (v/v) 디젤),

도 3은 슈도모나스 Y2G1, 슈도모나스 Y2K4 및 스핑고모나스 D3K1으로 구성된 유류분해 미생물제제(유일한 탄소원으로 4% (v/v) 디젤을 함유하는 최소배지에서 6일 동안 25℃에서 배양)의 시간에 따른 세포성장, 디젤농도 및 pH의 변화를 나타낸 그래프,

도 4는 슈도모나스 Y2G1, 슈도모나스 Y2K4 및 스핑고모나스 D3K1을 각각 단독으로 배양하였을 경우와 균주조합으로 배양하였을 경우에 콜로니 수(CFU)의 변화를 나타낸 그래프(상기 균주는 4% (v/v) 디젤을 함유하는 최소배지 및 25℃에서 6일 동안 배양, 초기 접종량은 1 ×10⁶CFU/mL, 배양한 세포를 희석하여 영양한천배지에 도말한 후 25℃에서 3일 동안 배양함으로써 CFU를 측정),

도 5는 4% (v/v) 디젤을 함유하는 최소배지에서 성장한 선별된 분리균주의 소수성도(헥사데칸상으로 분배된 세포탁도의 백분율로 표현)를 나타낸 그래프,

도 6은 4% (v/v) 디젤을 함유하는 최소배지에서 성장한 선별된 분리균주의 유화활성을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 오염된 토양을 채취하여 유류분해 균주를 분리하여 선별하는 단계; 상기 분리균주를 동정하는 단계; 선별된 균주들을 조합하여 각 균주조합의 유류분해능을 조사하는 단계; 및 분리균주의 소수성도 및 유화활성을 조사하는 단계로 구성되어 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 유류분해 균주의 분리 및 선별

본 발명에 사용된 토양시료는 국내에 유류저장소 근처의 오염된 토양에서 채취하였다. 토양시료를 토양의 상단 15 cm로부터 채취하여 2 mm 직경의 체로 거른 후, 사용하기 전까지 4℃에 보관하였다. 각각의 장소에서 채취한 토양시료 10 g을 10 mL 최소영양배지에 넣고 4℃에서 15분 동안 1분의 on/off 주기로 초음파처리하였다. 상기 토양현탁액의 상등액(100 μL)을 10% (v/v) 디젤을 함유하는 최소영양배지 5 mL에 접종시키고 4℃에서 4주 동안 배양하였다. 상기 농화배양된 시료를 매주 새로운 배지에 접종시켜 계대배양하였다. 영양한천배지(Nutrient Broth Agar, Difco)에서의 마지막 계대배양시에 접종원을 희석하여 평판배양한 결과, 서로 다른 형태 및 성장속도를 나타내는 콜로니들이 형성되었다. 상기 최소영양배지의 조성은 하기 표 1과 같다.

최소영양배지의 조성

성분	농도(mg/L 증류수)
NaNO₃	4
KH₂PO₄	0.15
Na₂HPO₄	0.5
MgSO₄·7H₂O	0.2
FeCl₃·6H₂O	0.0005
CaCl₂·2H₂O	0.01
pH	7.0

각각 분리된 콜로니의 유류분해능은 DCPIP 시험법을 사용하여 다음과 같이 측정하였다. 10% (v/v) 디젤을 함유하는 최소영양배지 200 μL에 DCPIP (3 g/L) 5 μL를 첨가하여 각각의 균주 콜로니를 25℃에서 일주일 동안 배양하였다. 유류분해능은 유류분해 균주 콜로니를 포함하는 반응튜브의 색이 청색에서 무색으로 변화하는 것(Charlotte Schou 등, 1998)을 이용함으로써 측정하였다.

실험결과, 디젤을 분해할 수 있는 활성을 가진 128개의 균주를 분리하였고 DCPIP 시험을 통하여 그 중에서 다시 39개의 균주를 분리하였다. 상기 39개의 분리균주 중에서 디젤을 함유하는 최소영양배지에서 빠르게 성장한 11개의 분리균주에 대해 그 성장특성을 조사하였고 그 결과는 하기 표 2와 같다.

유류분해 균주의 분리 및 성장특성

No.	분리균주	속명	성장특성
			비성장속도(10^-3/hr)	흡광도_{660 nm}(배양 70시간)	최대성장
			비성장속도(10^-3/hr)	흡광도_{660 nm}(배양 70시간)	흡광도_{660 nm}	시간 (hr)
1	Y1K3	아쿠아스피릴럼 속	6.53	0.457	0.521	90
2	Y2G1	슈도모나스 속	7.40	0.48	0.499	100
3	Y2K4	슈도모나스 속	6.92	0.556	0.568	80
4	Y2C3	슈도모나스 속	3.67	0.424	0.64	120
5	Y5K2	슈도모나스 속	1.03	0.3	0.343	140
6	D3K1	스핑고모나스 속	3.33	0.427	0.474	140
7	D3K3	스테노트로포모나스 속	2.97	0.349	0.454	140
8	I2K3	슈도모나스 속	8.10	0.394	0.441	110
9	I2D2	플라보박테리엄 속	5.07	0.491	0.587	140
10	J1D1	플라보박테리엄 속	3.47	0.379	0.554	140
11	J1C2	슈도모나스 속	7.43	0.485	0.596	140

상기 11개의 균주 중에서 슈도모나스 I2K3가 가장 높은 성장속도를 나타내었고 슈도모나스 Y2K4가 가장 빠른 초기성장속도를 나타내었다.

실시예 2. 분리균주의 동정

상기 분리균주들을 트립신 소이(tryptic soy) 한천배지에서 48시간동안 28℃에서 배양하였다. 멸균된 루프(loop)로 긁어냄으로써 평판배양한 세포를 수집한 후 지방산 메틸 에스테르(FAME) 분석(Chung 등, 1997)에 사용하였다. 에스테르 가수분해(saponification), 메틸화 및 추출은 MIDI 매뉴얼(Microbial Identification, Inc.)에 기술된 절차(Sasser, M, 1990)를 이용함으로써 수행하였다.

디젤을 함유하는 최소영양배지에서 빠르게 성장한 균주를 FAME 분석을 통하여 동정한 결과, 표 2와 같이, Y1K3는 아쿠아스피릴럼 속(Aquaspirillum sp.)으로, D3K3은 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.)으로, I2D2 및 J1D1은 플라보박테리엄 속(Flavobacterium sp.)으로, D3K1은 스핑고모나스 속(Sphingomonas sp.)으로 확인되었으며, 상기 5개의 균주를 제외한 나머지 균주들은 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)으로 확인되었다.

본 발명에 따라 오염된 토양으로부터 분리동정한 상기 유류분해 미생물 중에서 스핑고모나스 D3K1을 1999년 3월 11일에 수탁번호 KCTC 8935P로, 슈도모나스 Y2G1 및 슈도모나스 Y2K4를 2000년 10월 30일에 각각 수탁번호 KCTC 18049P 및 KCTC 18050P로 생명공학연구소 소재 유전자은행에 기탁하였다.

실시예 3. 유류분해능 조사

실험예 1. 디젤분해

균주성장 및 디젤의 생분해는 유일한 탄소 및 에너지원으로서 4% (v/v) 디젤을 함유하는 최소영양배지 50 mL에서 분리균주를 배양함으로써 모니터하였으며, 배양조건은 25℃, 120 rpm이었다. 잔류 디젤농도 및 균주성장은 배양 6일 후에 측정하였다. 초기 세포농도는 1 ×10⁶CFU/mL로 조절하였고 접종량은 2% (v/v)이었다.

실험예 2. 분리균주의 조합

상기 11개의 분리균주 중 유류분해능이 우수한 5개의 균주를 선별하여 지수성장기 때의 각 균주를 1:1로 조합한 후 최소영양배지에 접종시켰다. 접종세포농도는 1 ×10⁶CFU/mL이었으며, 배양액의 2% (v/v)를 접종하였다. 상기 분리균주의조합을 25℃에서 6일 동안 배양한 후, 디젤의 분해율 및 세포성장(O.D. 660 nm)을 하기에 기술된 방법에 따라 측정하였다.

형성된 콜로니의 수(CFUs)는 종래의 방법(Venkateswaran, K. 등, 1991)에 따라 측정하였다. 단일균주배양 및 혼합균주배양시의 균주들의 변화를 모니터링하기 위하여 배양 2일 및 6일 후에 균체를 0.85% 소금물로 희석하여 영양한천배지에서 평판배양하였다. 상기 영양한천 평판배양을 통하여 모든 혼합균주들의 콜로니를 서로 구별할 수 있었다.

실험예 3. 디젤시료의 분석

배양액에 존재하는 디젤은 종래의 방법(EPA 3510C)에 따라 헥산으로 추출한 후, 모세관 컬럼(capillary column; HP-5, 전장 30 m, 직경 0.53 mm; Hewlette Packard Co., U.S.A.) 및 FID(flame ionization detector) 검출기를 탑재한 기체크로마토그래피(GC-HP 6890, Hewlette Packard Co., U.S.A.)를 사용하여 분석하였다. 검출기 및 주입구(injector)의 운전온도는 각각 250℃ 및 200℃이었다.

컬럼(오븐)온도는 처음 3분 동안은 45℃로 고정시킨 후 12℃/min의 속도로 275℃까지 증가시켰다. 운반기체(carrier gas)는 헬륨을 사용하였으며, 상기 기체의 유속은 5 mL/min이었다. 디젤의 양은 총 석유 탄화수소(TPH)의 정량분석법(EPA i8015B)에 따라 각 피크 면적의 합을 계산함으로써 결정하였다.

도 1은 선별된 11개의 유류분해 미생물의 디젤분해율을 나타낸 것이다. 이 중에서 스핑고모나스 D3K1의 디젤분해율이 83.77%로 가장 높았으며, 아쿠아스피릴럼 Y1K3 및 슈도모나스 Y5K2 두 균주가 50% 이상의 높은 디젤분해율을 나타냈다. 아쿠아스피릴럼 Y1K3, 슈도모나스 Y2G1 및 슈도모나스 Y2K4는 비교적 빠른 디젤 생분해율 및 세포성장속도를 나타냈으며, 반면에 슈도모나스 Y2C3의 디젤분해율을 매우 낮았다. 상기 11개의 균주 중에서 유류분해율이 상대적으로 우수한 균주, 즉 아쿠아스피릴럼 Y1K3, 슈도모나스 Y2G1, Y2K4, Y5K2 및 스핑고모나스 D3K1을 혼합균주의 배양에 의한 디젤분해시험에 사용하였고, 그 결과는 하기 표 3와 같다.

유류분해 균주조합의 디젤분해

균주조합	디젤분해율(%)	균주조합	디젤분해율(%)
1 & 2	76.47	1 & 2 & 6	89.46
1 & 3	16.83	2 & 3 & 5	94.39
1 & 5	75.76	2 & 3 & 6	93.53
1 & 6	73.57	2 & 5 & 6	80.06
2 & 3	75.16	3 & 5 & 6	40.41
2 & 5	75.27	1 & 2 & 3 & 5	70.80
2 & 6	82.07	1 & 2 & 3 & 6	78.83
3 & 5	69.01	1 & 2 & 5 & 6	89.86
3 & 6	86.07	1 & 3 & 5 & 6	90.69
5 & 6	93.43	2 & 3 & 5 & 6	70.17
1 & 2 & 3	33.81	1 & 2 & 3 & 5 & 6	72.14
1 & 2 & 5	72.09

대부분의 균주조합은 단일균주일 때보다 높은 디젤분해율을 나타냈다. 3개의 균주조합(1 & 3, 1 & 2 & 3, 3 & 5 & 6)을 제외하고는 모든 균주의 조합이 50% 이상의 디젤분해능을 나타냈다.

균주조합 2 & 3 & 5와 2 & 3 & 6이 각각 94.59% 및 93.53%로 가장 높은 디젤분해율을 나타냈다. 도 2는 균주조합 2 & 3 & 6에 의한 디젤분해를 기체크로마토그래피를 이용하여 잔류디젤의 피크로 분석한 결과로서, 대부분의 피크가 배양 6일 후에 사라지거나 감소하였음을 확인하였다.

도 3은 상기 균주조합을 디젤이 함유된 배지에서 배양하였을 때, 시간에 따른 세포성장, 잔류디젤 및 pH의 변화를 나타낸 것이다. 세포가 급속하게 성장함에 따라, 잔류하는 디젤의 양이 급격히 감소하였고, pH는 심하게 변화되지 않았다.

도 4는 상기 2, 3 및 6 균주의 단일배양과 혼합배양시에 콜로니 수(CFU)의 변화를 비교한 것이다. 슈도모나스 Y2G1은 혼합배양하였을 경우에 단독으로 배양하였을 경우에 비하여 콜로니 수가 배양 2일째에 40% 증가하였으며, 슈도모나스 Y2K4는 혼합배양하였을 경우에 콜로니 수가 배양 2일째에 370%로 급격히 증가하였다. 스핑고모나스 D3K1의 경우는 혼합배양시의 콜로니 수가 단독배양시보다 배양 6일째에 220% 증가하였다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, 상기 균주조합의 배양에서 초기 2일 동안에 잔류디젤의 양이 급속히 감소하였다. 상기 결과를 토대로 디젤의 초기분해에 슈도모나스 Y2K4가 주로 관여하였고, 배양후반기의 디젤분해에는 스핑고모나스 D3K1이 작용하였음을 확인하였다.

실시예 4. 분리균주의 소수성도 및 유화활성 측정

실험예 4. 소수성도 측정

분리균주의 상대 소수성도(relative hydrophobicity)는 BATH 시험법(Zhang 등, 1994)에 따라 측정하였으며, 분석할 세포를 다음의 절차에 의해 준비하였다. 배양된 세포를 10,000 ×g로 원심분리하여 수집한 후, 분석에 방해될 수 있는 물질을 제거하기 위하여 두번 세척한 다음, 400 nm에서의 광학밀도(OD)를 1.0으로 조절하기 위하여 상기 세포를 최소영양배지에 재현탁시켰다. 상기 세포용액(4.0 mL) 및 헥사데칸(1.0 mL)을 테스트튜브에 혼합하고 상기 튜브를 60초 동안 진동교반(vortex)한 후, 헥사데칸 및 수용액상을 30분 동안 정치시켜 상기 두 상을 분리하였다. 상기 수용액상을 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 제거한 후 수용액상의 탁도를 400 nm에서 측정하였다. 세포의 소수성도는 헥사데칸상으로 분배된 세포탁도의 백분율로 표현하였으며, 하기 식 1에 따라 계산하였다.

소수성도 = {(1 - 수용액상의 OD) ×100}/세포현탁액의 OD ---- [1]

실험예 5. 유화활성 측정

각 분리균주의 유화활성은 Ko 등(1998)에 의해 기술된 방법에 따라 측정하였다. 세포배양액을 원심분리하여 세포를 유리시킨 후 셀룰로오스 아세테이트 필터(0.45 ㎛ 직경, Adventec MFS. Inc., Japan)로 여과하였다. 상기 필터에 포집된 세포물질(0.5 mL)을 n-헥사데칸 0.1 mL가 첨가된 50 mM 인산칼륨 완충액 2.5 mL를 함유하는 테스트튜브에 첨가하였다. 수용액상의 유화활성은 610 nm에서의 광학밀도로 측정하였다.

도 5 및 6은 각각 선별된 11개 분리균주의 소수성도 및 유화활성을 나타낸 것이다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, D3K1 및 Y2C3을 제외한 대부분의 분리균주에서 소수성도 및 디젤제거율 사이에 비례관계가 존재하였으며, 즉 소수성도가 높은 균주일수록 디젤제거율이 높았다. 도 6에서 나타낸 바와 같이, 슈도모나스 Y2G1을제외하고, 10개의 분리균주는 낮은 유화활성을 나타냈다.

상기 실험결과, 균주조합 2 & 3 & 5(슈도모나스 Y2G1, 슈도모나스 Y2K4 및 슈도모나스 Y5K2)과 균주조합 2 & 3 & 6(슈도모나스 Y2G1, 슈도모나스 Y2K4 및 스핑고모나스 D3K1)이 디젤분해에 가장 적절한 균주조합이었다. 상기 균주조합에서 각각의 균주는 모두 디젤분해능이 우수한 균주이었으며, 슈도모나스 Y2G1 및 Y2K4는 디젤을 함유하는 최소영양배지에서 빠른 성장속도를 나타내었다. 균주조합 2 & 3 & 6에서, 가장 빠른 디젤분해 균주인 스핑고모나스 D3K1은 배양 후반기의 디젤분해에 작용하였고, 슈도모나스 Y2G1 및 Y2K4는 배양 초기의 디젤분해에 관여하였음을 확인하였다.

높은 소수성도 및 유화활성을 보유한 슈도모나스 Y2G1은 높은 디젤분해율 (57.69%)을 나타냈다. 그러나, 디젤분해율과 소수성도 및 유화활성 사이의 비례관계를 확증하기는 어려웠다. 또한, 단지 분해능이 우수한 균주의 조합만이 디젤분해율이 높다고 확증할 수는 없었다. 따라서, 디젤을 분해하는 적절한 미생물제제를 제조하기 위해서는 선별된 분리균주를 다양하게 서로 조합하여 초반과 후반기에 각각 유류분해능이 우수하여야 하며, 또한 생태계에 대한 적응성도 높아야 한다. 본 발명에 따른 유류분해 미생물제제는 상기 요건을 충족하였다.

이상, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 참조하여 상세하게 설명한 바와같이, 본 발명은 유류분해능이 우수한 혼합균주로 구성된 미생물제제를 제공함으로써 단일균주를 사용할 때보다 유류분해율 및 생태계 적응성을 향상시키는 뛰어난 효과가 있으므로 환경산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

오염된 토양으로부터 분리하여 선별한 슈도모나스 Y2G1(수탁번호: KCTC 18049P), 슈도모나스 Y2K4(수탁번호: KCTC 18050P) 및 스핑고모나스 D3K1(수탁번호: KCTC 8935P)으로 구성됨을 특징으로 하는 유류분해 미생물제제.
오염된 토양으로부터 유류를 분해할 수 있는 균주를 분리한 후, 이 중에서 유류분해능이 우수한 균주를 선별한 다음 상기 선별된 균주들을 조합함을 특징으로 하는 유류분해 미생물제제의 제조방법.