KR20020013508A - 외래 서열을 발현시키기위한 다성분 ｒｎａ 벡터 시스템 - Google Patents
외래 서열을 발현시키기위한 다성분 ｒｎａ 벡터 시스템 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 RNA 바이러스-유도된 RNA 레플리콘 및 헬퍼 바이러스를 포함하는 다성분 RNA 벡터 시스템과, 다성분 RNA 벡터 시스템을 사용하여 식물에서 외래 RNA, 이펙터 RNA, 단백질 또는 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이며, 또한 본 발명은 다성분 RNA 벡터 시스템을 사용하여 외래 RNA, 이펙터 RNA, 단백질 및 펩티드의 안정하고, 전체적인 제조방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
Description
RNA 바이러스는 다양한 감염체이고, 그의 숙주는 다양한 식물 및 동물을 포함한다. 이들의 게놈은 DNA 중간체를 형성하지 않고 복제할 수 있고, 하나의 숙주 세포에서 다른 숙주세포로 이동할 수 있는 RNA로 이루어진다. RNA 바이러스의 게놈은 하나 또는 다수의 RNA 조각으로 구성될 수 있다. 또한 RNA 바이러스는 단일가닥의 RNA(ssRNA) 또는 이중가닥 RNA(dsRNA) 바이러스로 구분될 수 있다. 또한 ssRNA는 포지티브-가닥 바이러스, 네가티브-가닥 바이러스 또는 앰비센스 바이러스로 구분될 수 있다. 포지티브-가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA는 메신저 의미이고, 이는 네이키드 RNA 감염체가 된다.
많은 식물 바이러스가 포지티브-가닥 RNA 바이러스과에 속한다. 이들은 담배 모자이크 토바모바이러스(tabacco mosaic tobamovirus, TMV), 브롬 모자이크 브로모바이러스(brome mosaic bromovirus, BMV), 카네이션 모틀 카모바이러스(carnation mottle carmovirus, CarMV) 등을 포함한다. RNA 식물 바이러스는 전형적으로 몇개의 일반적인 단백질로, 가령 바이러스 복제 및 mRNA 합성에 필수적인 복제효소/중합효소(비구조) 단백질, 세포외 통과를 위한 보호용 껍질을 제공하는 코트 단백질 및 세포 대 세포 이동, 전체감염 및 바이러스의 자기 조합에 요구되는 기타 단백질을 코딩한다.
몇가지 RNA 바이러스 감염은 두종류의 RNA로, 복제-결손 헬퍼-의존성 RNA 및 복제-적격 바이러스의 혼합물로 이루어진다. 복제-적격 바이러스는 복제-결손 RNA의 복제에 헬퍼 바이러스로 제공된다. 상기 우선 세가지 형태로, 복제-결손 RNA, 바이러스 게놈 RNA에서 유도되는 복제-결손 RNA(dRNA), 새틀라이트 RNA, 위성 바이러스가 있고, 상기 모두는 헬퍼 바이러스의 존재하에서만 복제할 수 있다. 새틀라이트 RNA 및 위성 바이러스는 그들의 헬퍼 바이러스에 대한 적은 상동성을 갖는 게놈을 갖는다(Francki, R., Am. Rev. Microbiol. 39:151-174(1985)). 몇가지의 dRNA는 그들의 헬퍼 바이러스의 복제에 좋지 않은 영향을 주고, 이를 결손 간섭(DI) RNA라 한다. DI RNA는 세포 배양에서 동물 바이러스의 높은 역가 계대접종과 결합한다(Holland, J., Virology, B.N. Fields and D.M. Knipe, Ed., 2ndEd., 1:151:165, Raven Press, New York(1990)). DI RNA는 추가적인 복제 사이클을 갖는 더 복잡한 구조를 획득할 수 있는 단순 결실 변이체로 기인되는 새로운 것을 나타낸다. DI RNA를 생성할 수 있는 바이러스의 예로는 신드비스 바이러스(Sindbisvirus) 및 코로나바이러스(coronaviruses)를 포함한다. 자연적으로 발생하는 DI RNA는 톰부스바이러스과로 토마토 부시 스턴트 바이러스(tomato bushy stunt virus, TBSV), 순무 주름 바이러스(turnip crinkle virus, TCV) 및 심비디움 링스팟 바이러스(cymbidium ringspot virus)와 같은 몇가지 식물 바이러스와 조합되어 발견되었다(Hillman et al., Cell 51:427-433(1987); Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9173-9177(1989); 및 Burgyan et al., J. Gen. Virol. 70:235-239(1989)). 또한, dRNA가 클로버 옐로우 모자이크 포텍스바이러스(White, et al., J. Virol. 66:3069-3076(1992)) 및 시트러스 트리스테자 클로스테로바이러스(citrus tristeza closterovirus, Yang, et al., J. Gen. Virol. 78:1765-1769(1997)) 감염과 결합되어 발견되었다. 새틀라이트 RNA, 위성 바이러스 및 dRNA는 헬퍼 바이러스에 의해서 제공되는 필수 기능을 요구하여 그들의 복제 사이클을 완성시킨다. 특정 바이러스 감염과 새틀라이트 또는 DI RNA의 조합은 헬퍼 바이러스의 병원성 효과의 개량 또는 향상을 이끌 수 있다.
새틀라이트 및 DI RNA는 헬퍼 바이러스 자체의 복제에 의해서 증대된다. 종종 반복된 계대배양으로, 감염된 세포에서 주된 병원체 RNA는 새틀라이트 RNA 또는 DI RNA이고, 최소의 헬퍼 바이러스 RNA가 검출가능하다. 몇 연구자들은 형질전환된 식물에서 새틀라이트 RNA를 발현시킴에 의해서 그의 성질을 밝히고, 헬퍼 바이러스에 의한 질병의 저항성을 비교하였다(Gerlach et al., Nature 328:802-805(1987); Harrison et al., Nature 328:799-802(1987)). 그러나 이러한 접근은 대부분의 식물 바이러스가 이들과 조합하여 자연적으로 발생하는 새틀라이트 RNA또는 DI RNA를 갖지 않고, 또한 상기 RNA는 예측할 수 없는 방법으로 몇가지 질병을 악화시킬 수 있기 때문에 넓은 이용가능성을 제공할 수 없다. 상기 문제를 해결하기위해서, 연구자들은 폴리오바이러스(Hagino-Yamagishi et al., J. Virol. 63:5386-5392(1989)) 및 BMV(Marsh et al., J. Gen. Virol. 72:1787-1792(1991))의 게놈으로부터 시험관내에서 dRNA의 구조를 밝혔다. 상기 바이러스-유도된 dRNA 또는 "RNA 레플리콘"이 상기 바이러스의 자동 복제되는 게놈 RNA로부터 내부 서열을 결실시킴에 의해서 인위적으로 제조되며, 이들은 몇가지 필수적인 성질이 결실되어 만들어진다. 상기 RNA는 더 이상은 자동적으로 복제될 수 없지만, 함께 접종된 헬퍼 바이러스에 의해서 자동적으로 공급되는 단백질이 요구될 수 있다. BMV의 경우에, RNA 레플리콘이 헬퍼 바이러스 RNA의 축적에서 놀라운 감소를 일으키는 복제 기작을 위해서 함께 접종된 헬퍼 바이러스와 경쟁하지 않는다(Marsh et al., J. Gen. Virol. 72:1787-1792(1991)). 이러한 경쟁은 RNA 레플리콘에서 해독될 수 있는 특정의 결손 단백질에 의존하지는 않지만, 더 작은 RNA가 거대한 헬퍼 RNA상에 갖는 고유한 복제 잇점의 결과이다. RNA 레플리콘이 형질전환된 식물에서 발현되는 경우에, 상기 세포는 BMV 감염에 대해 효과적인 저항성을 갖는다(Marsh et al., J. Gen. Virol. 72:1787-1792(1991)).
완전한 길이의 바이러스 게놈에서 RNA 레플리콘의 구조화는 간단한 문제가 아니다. 바이러스 게놈으로 도입된 많은 내부 결실은 RNA가 자동으로 복제할 수 없거나 또는 복제할 수 없게 만든다. 그럼에도 불구하고, 몇개의 복제되지 않는 바이러스-유도된 RNA 레플리콘의 존재는 함께 접종된 야생형 바이러스의 증대를 억제할 수 있다(Marsh et al., J. Gen. Virol. 72:2367-2374(1991)); Pogue et al., Virology 188:742-753(1992)). 내부 결실은 필수 단백질의 해독에 역효과를 줄 수 있고, 같은 유전자 클러스터(cis-작용 서열)내에서 서열의 기능을 약하게 하거나 또는 복제에 대한 저해 형태로 RNA 서열을 나란히 놓을 수 있다. 일단 구조화되면, RNA 레플리콘의 복제 경쟁이 예측할 수 없고, 식물에서 전체 이동을 위한 팩킹 또는 역량을 포함하는 적정화된 많은 다른 필수적 기능이 부족하다. 헬퍼 바이러스와 함께 식물에서 구조적으로 캡시드화되고, 운반될 수 있는 RNA 레플리콘의 능력은 KL, TMV-유도 RNA 레플리콘 및 TMV에 의해서 입증되었다(Raffo and Dawson, Virology 184:277-289(1991)). TMV의 비구조적인 코딩 영역의 커다란 부분이 결실된 RNA 레플리콘은 TMV로 함께 접종되었을 때 담배 식물에서 놀라운 수준으로 복제된다. 그러나 체조직에서 분리되는 경우, KL 레플리콘은 추가적으로 RNA 다양한 개체에서 확인되는 내부 결실의 혼합물로 진화된다. 식물에서 팩킹 및 조직적인 교환을 강제하는 연속적인 복제 사이클은 KL 레플리콘의 가압적으로 빠르게 진화하는 것으로 보인다.
발명의 요약
본 발명은 하나 이상의 복제가능한 헬퍼 바이러스 및 헬퍼 바이러스에 의해서 자동적으로 복제할 수 있는 하나 이상의 RNA 레플리콘으로 이루어진 다성분의 RNA 벡터 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다성분 RNA 벡터 시스템을 사용하여 식물에서 하나 이상의 외래 RNA, 다수의 이펙터 RNA, 단백질 또는 펩티드를 발현시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 다성분의 RNA 벡터 시스템을 사용하여 외래 RNA, 다수 이펙터 RNA, 단백질 또는 펩티드의 안정하고 전체적으로 발현시키는 방법을 제공한다.
하나의 구체예에서, RNA 레플리콘은 5' 비해독 영역(NTR), RNA 바이러스의 비구조 단백질의 자체 또는 절편의 ORF에 대해 상동인 오픈 리딩 프레임(ORF), RNA 바이러스에 비네이티브(non-native)인 서열 및 3' NTR을 포함하도록 유전자조작될 수 있다. RNA 레플리콘의 3' NTR은 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 공급원에 네이티브(native) 또는 비네이티브일 수 있다. 또한, RNA 레플리콘의 3' NTR은 두개 이상의 헬퍼 바이러스의 3' NTR의 하이브리드일 수 있다. RNA 레플리콘의 5' NTR은 헬퍼 RNA 바이러스의 5' NTR의 공급원에 대해 네이티브 또는 비네이티브일 수 있다. RNA 레플리콘은 헬퍼 바이러스, 하나 이상의 패킹 시그날, 내부 개시 자리, 서브게놈 mRNA 프로모터 서열, 코트 단백질 또는 이동 단백질에 네이티브 또는 비네이티브인 공급원을 추가적으로 포함할 수 있다. RNA 레플리콘은 또한 적당한 제한자리를 포함할 수 있고, 이는 비네이티브 서열의 삽입에 이용된다. 바람직하게, RNA 레플리콘의 5' ORF는 RNA 바이러스의 비구조 단백질의 자체 또는 절편에 상동인 서열을 코딩한다. RNA 레플리콘이 다양한 RNA 식물 및 동물 바이러스에서 유도될 수 있다. 또한, RNA 레플리콘은 하이브리드일 수 있고, 두개 이상의 바이러스 공급원으로부터의 네이티브 서열을 포함한다.
두번째 구체예에서, 헬퍼 바이러스 RNA는 야생형 바이러스 RNA 서열 또는 그의 변형된 서열을 포함하여 자동적으로 RNA 레플리콘을 복제할 수 잇는 헬퍼 바이러스 RNA를 만든다. 또한, 하이브리드 헬퍼 RNA 바이러스는 두개 이상의 RNA 바이러스 공급원으로부터 네이티브 서열을 포함하도록 구조화될 수 있다. 바람직하게, 야생형 담배 모자이크 바이러스 및 그의 변이체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 야생형 RNA 식물 바이러스의 변형은 서프레스 정지 코돈의 제거 또는 변이화, 코트 단백질에 있어서 ORF의 제거 또는 치환, 3' NTR의 치환 또는 하나 이상의 서브게놈 mRNA 프로모터의 사용을 포함할 수 있다. 코트 단백질, 3' NTR 또는 서브게놈 mRNA 프로모터를 코딩하는 야생형 헬퍼 바이러스의 변형된 형태로 삽입된 서열은 비네이티브 공급원에서 나올 수 있다. 헬퍼 바이러스의 다른 변형은 서프레스 정지코돈에서 및/또는 근처에서 RNA 서열의 변형을 포함하여, 야생형의 표현형을 바꾸는 것을 최소화하고, 예를들면 정지코돈에 대한 센스 코돈을 개정한다. 더욱 바람직하게, 서프레스 정지코돈을 치환할 수 있는 TMV 변이체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 상기 TMV 정지 코돈 변이화는 티로신(TMV183Y), 페닐알라닌(TMV183F), 세린(TMV183S) 등을 포함할 것이다. 더욱 바람직하게, TMV 정지코돈 돌연변이화된 TMV183F는 특히 헬퍼 바이러스로서의 기능에 효과적이다. RNA 레플리콘에 대해 이종의 헬퍼 바이러스가 RNA 레플리콘을 복제하는데 사용될 수 있다. 특히, 헬퍼 바이러스로서 오돈토글로섬 링스팟 바이러스(Odontoglossumringspot virus, ORSV)가 다양한 TMV RNA 레플리콘을 복제할 수 있다. RNA 헬퍼 바이러스는 또한 다양한 RNA 동물 바이러스로 가령 폴리오바이러스, 알파바이러스 또는 리노바이러스로부터 유도될 수 있다. 상기 헬퍼 바이러스는 다성분 벡터 시스템에서 RNA 레플리콘에 대해 상보적이다. 상기 헬퍼 바이러스는 게놈에서 제거된 하나 이상의 기능 및 구조 단백질을 가지며, 이는 헬퍼 바이러스의 세포 대 세포 이동을 저해하거나 또는막을 수 있다. 상기 필수 기능 및 구조 단백질은 RNA 레플리콘에 의해서 자동적으로 공급될 수 있다. 상기 기능 및 구조 단백질은 이동 단백질, 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 헬퍼 바이러스와 레플리콘 사이의 상호 관계는 또한 변형된 헬퍼 바이러스가 외래 RNA를 운반할 수 있고 및/또는 다수의 이펙터 RNA, RNA 레플리콘의 복제를 이용할때의 역할에 관여하는 단백질 또는 펩티드를 생성할 수 있다는 점이 반영된다.
세번째 구체예에서, RNA 레플리콘 및 적당한 헬퍼 바이러스가 식물로 운반되는 것은 시험관내 전사된 RNA, 비리온의 접종, 또는 핵 cDNA로부터 식물 세포의 내부 접종에 효과적일 수 있고, 이러한 과정에 의해서 전체 감염을 일으킬 수 있다. 벡터 시스템의 특정 성분이 상기 방법으로 운반될 수 있다. 모든 경우에, 식물세포에서 하나 이상의 외래 RNA, 이펙터 RNA, 단백질 또는 펩티드의 급성 및 침투성 전신 발현이 함께의 감염에 의해서 일어난다. 목적하는 단백질 유전자 또는 서열을 포함하는 RNA에 의해서 식물을 전신감염시키면, 목적하는 생성물을 제조하도록 감염된 숙주를 성장시키고, 필요하다면 목적하는 생성물을 분리 및 정제할 수 있다. 감염된 숙주의 성장은 종래 기술에 따르고, 생성된 생성물의 분리 및 정제도 종래 기술에 따른다.
본 발명은 RNA 바이러스 및 식물 유전학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 식물에서 외래의 RNA, 이펙터(effector) RNA, 단백질 또는 펩티드의 제조에 있어서 복제하는 RNA를 사용하는 방법에 관한 것이다.
도 1A-1C는 본 출원에 기술되어 있는 다양한 TMV 및 하이브리드 구조물의 도식도이다. TMV 126kDa, 183kDa, 이동 단백질(mp) 및 코트 단백질(cp)에 대한 ORF가 개시되어 있다. ORSV 서열이 음영진 박스로 표시되었다. 야생형(gfp) 및 사이클 3(c3gfp) 녹색 형광 단백질 β-글루쿠로니다제(gus)에 대한 ORF가 개시되어 있다. 126kDa ORF에 대한 정지코돈의 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F) 치환을 포함하는 구조가 개시되어 있다. TMV 코트 단백질 ORF의 3'-말단 부분에서의 서열이 블랙 박스로 표시되어 있다. 5' 및 3' NTR은 솔리드 라인으로 표시되어 있다. 코트 단백질 서브게놈 프로모터(P)가 개시되어 있다. 도 1은 웨스턴 블롯이 발현을 분석하는데 사용되는 실험에서 사용되는 몇가지 추가적인 레플리콘의 도식도를 또한 포함한다. 구조는 본 출원에서 기술된 것과 유사하다.
도 2는 RNA 레플리콘 TMV420 및 헬퍼 바이러스 TMV183F로 함께 감염된 니코티아나 실베스트리스(Nicotiana sylvestris) 식물에서 기인되는 녹색 형광 단백질(GFP) 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타내고 있다.
레인#
(GFP)
1. 정제된 GFP(15ng) +++
2. BioRad High range MW 마커
3. 정제된 GFP(15ng) +++
4. BioRad High range MW 마커
5. TMV183F+TMV420 엔. 타바쿰(N.tabacum) 접종되지 않음(상부잎) nd
6. TMV183F+TMV420 엔. 타바쿰 접종된 잎 ++
7.TMV183F+TMV420엔.실베스트리스(N.sylvestris)접종되지 않음(상부잎) nd
8. TMV183F+TMV420 엔.실베스트리스 접종된 잎 ++
9. TMV183F+TMV420 엔. 타바쿰 접종된 잎 ++
10. Sigma 전염색된 MW 마커
nd = 측정되지 않음
도 3은 외래 서열의 발현에 있어서 단일 성분 벡터 및 다성분 RNA 레플리콘 벡터로부터 담배 원형질체에서 GFP 발현의 웨스턴 블롯을 개시하고 있다.
레인#
(GFP)
1. 정제된 GFP(15ng) +++
2. 모크(물 접종된) 원형질체 -
3. TMV422(단일성분 벡터)(레인 4의 1:5 희석) ++
4. TMV422(단일성분 벡터) +++
5. TMV004+TMV420(RNA 레플리콘 벡터) nd
6. TMV004+TMV418(RNA 레플리콘 벡터) +
7. TMV004+TMV416(RNA 레플리콘 벡터) +
8. TMV004+TMV416(RNA 레플리콘 벡터) nd
9. TMV004 -
10. Sigma 전염색된 MW 마커
nd = 측정되지 않음
도 4의 왼쪽: TMV 3' NTR-특이성 프로브를 사용하여 니코티아나 타바쿰 식물에서 헬퍼 바이러스 TMV183F로 함께 접종된 TMV421 RNA 레플리콘 복제의 노던 블롯 분석. 도 4의 오른쪽: GFP-특이성 프로브를 사용하여 니코티아나 타바쿰 식물에서 헬퍼 바이러스 TMV183F로 함께 접종된 TMV421 RNA 레플리콘 복제의 노던 블롯 분석.
왼쪽 도
레인#TMV3'NTR-특이성 프로브
1. 183F 엔. 타바쿰(접종된 잎)
2. 183F + TMV421 엔. 타바쿰(접종된 잎)
3. 183F + TMV421 엔. 타바쿰(접종된 잎)
오른쪽 도
레인#GFP-특이성 프로브
1. 183F 엔. 타바쿰(접종된 잎)
2. 183F + TMV421 엔. 타바쿰(접종된 잎)
3. 183F + TMV421 엔. 타바쿰(접종된 잎)
도 5는 TMV 3' NTR-특이성 프로브를 사용하여 이종의 헬퍼 바이러스 오돈토글로섬(Odontoglossum) 링스팟 바이러스(ORSV)에 의해서 TMV계 RNA 레플리콘 복제의 노던 블롯 분석이 개시되어 있다.
레인#TMV 3'NTR-특이성 프로브
1. ORSV vRNA
2. ORSV vRNA+TMV420(영역 1 및 2 RNA 레플리콘 +GFP)
3. ORSV vRNA+TMV408(영역 1 RNA 레플리콘 +GFP)
4. ORSV vRNA+ΔCla(영역 1 RNA 레플리콘)
5. ORSV vRNA+ΔCla/152(완전한 서브게놈 mRNA 프로모터를 갖는 영역 1 RNA레플리콘)
6. ORSV vRNA+TMV142/152(완전한 서브게놈 mRNA 프로모터를 갖는 영역 1 및 2 RNA 레플리콘)
도 6은 TMV 3' NTR-특이성 프로브를 사용하여 야생형 TMV 및 다른 TMV-유도된 헬퍼 바이러스로 함께 접종된 원형질체에서 GFP를 발현하는 RNA 레플리콘 벡터 복제의 노던 블롯 분석이 개시되어 있다.
레인#TMV 3'NTR-특이성 프로브
1. 야생형 TMV+ΔCla/152/C303
2. TMV183Y+ΔCla/152/C303
3. TMV141+ΔCla/152/C303
4. TMV141Y+ΔCla/152/C303
5. TMV163+ΔCla/152/C303
6. TMV163Y+ΔCla/152/C303
7. TMV141/150+ΔCla/152/C303
8. TMV141/151+ΔCla/152/C303
9. TMV141/152+ΔCla/152/C303
10. S3-28+ΔCla/152/C303
11. TMV-CPO+ΔCla/152/C303
12. TB2-GUS+ΔCla/152/C303
도 7은 GFP-특이성 프로브를 사용하여 야생형 TMV 및 다른 TMV-유도된 헬퍼바이러스로 함께 접종된 원형질체에서 GFP를 발현하는 RNA 레플리콘 벡터 복제의 노던 블롯 분석이 개시되어 있다.
레인#GFP-특이성 프로브
1. 야생형 TMV+ΔCla/152/C303
2. TMV183Y+ΔCla/152/C303
3. TMV141+ΔCla/152/C303
4. TMV141Y+ΔCla/152/C303
5. TMV163+ΔCla/152/C303
6. TMV163Y+ΔCla/152/C303
7. TMV141/150+ΔCla/152/C303
8. TMV141/151+ΔCla/152/C303
9. TMV141/152+ΔCla/152/C303
10. S3-28+ΔCla/152/C303
11. TMV-CPO+ΔCla/152/C303
12. TB2-GUS+ΔCla/152/C303
본 발명은 다성분의 RNA 벡터 시스템에 관한 것으로서, 상기는 하나 이상의 적당한 헬퍼 바이러스에 의해서 복제될 수 있는 하나 이상의 RNA 레플리콘으로 이루어진다. 본 발명은 또한 다성분 RNA 벡터 시스템을 사용하여 식물에서 외래 RNA, 다수 이펙터 RNA, 단백질 및 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한본 발명은 다성분 시스템을 사용하여 외래 RNA, 다수 이펙터 RNA, 단백질 및 펩티드의 안정하고 전체적인 제조방법에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, RNA 레플리콘이 5' NTR, RNA 바이러스의 비구조 단백질의 자체 또는 절편의 ORF에 상동인 ORF, RNA 바이러스에 비네이티브 서열 및 3' NTR을 포함하도록 유전자 조작될 수 있다. RNA 레플리콘에서 3' NTR은 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR의 공급원에 네이티브 또는 비네이티브일 수 있다. 또한, RNA 레플리콘의 3' NTR은 두개 이상의 헬퍼 바이러스의 3' NTR의 하이브리드일 수 있다. RNA 레플리콘에서 5' NTR은 헬퍼 RNA 바이러스의 5' NTR의 공급원에 네이티브 또는 비네이티브일 수 있다. RNA 레플리콘은 추가적으로 헬퍼 바이러스에 네이티브 또는 비네이티브인 공급원으로부터 하나 이상의 팩킹 시그날, 내부 개시 자리, 서브게놈 mRNA 프로모터 서열, 코트 단백질 또는 이동 단백질을 포함할 수 있다. RNA 레플리콘은 또한 비네이티브 서열의 삽입을 용이하게하기위해서 적당한 제한 자리를 포함할 수 있다. 바람직하게, RNA 레플리콘의 5' ORF는 RNA 바이러스의 비구조 단백질의 자체 또는 절편에 상동인 서열을 코딩한다. RNA 레플리콘은 다양한 RNA 식물 바이러스로, 가령 포티바이러스, 토바모바이러스, 브로모바이러스, 카모바이러스, 포텍스바이러스, 클로스테로바이러스, 호데이바이러스, 코모바이러스, 알파파 모자이크 바이러스 또는 비모바이러스에서 유도될 수 있다. RNA 레플리콘은 또한 다양한 RNA 동물 바이러스로, 가령 알파바이러스, 폴리오바이러스 또는 리노바이러스에서 유도될 수 있다. RNA 레플리콘은 단일 바이러스로부터의 서열을 포함하지만, 하나 이상의 분류학적 군으로부터의 바이러스를 포함하는 하나 이상의바이러스로부터 서열을 포함할 수 있다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명을 사용하여 상기 바이러스에 근거한 RNA 레플리콘을 구조화할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 담배 모자이크 바이러스(TMV)는 RNA 레플리콘 구조에 대한 유전적인 배경으로 사용될 수 있다. TMV는 추정 복제효소의 두개의 비구조 단백질로, 126kDa 단백질(영역 1 및 2) 및 183kDa 단백질(영역 1, 2 및 3)을 생성한다. 단백질 발현 및 최소의 RNA 생성에 있어서 TMV-유도된 RNA 레플리콘은 5' 말단에서 3' 말단으로 TMV의 5' NTR에 대해 네이티브인 5' NTR, TMV 비구조 단백질 유전자의 일부에 상동인 ORF, TMV에 네이티브 또는 비네이티브인 서브게놈 mRNA 프로모터, 비네이티브 서열 및 TMV에 네이티브 또는 비네이티브인 3' NTR을 포함한다. 더 바람직하게, TMV-유도된 레플리콘은 TMV의 5' NTR에 대해 네이티브인 5' NTR, TMV 126kDa 비구조 단백질의 영역 1 및 2의 자체 또는 절편을 코딩하는 누클레오티드 서열, 서브게놈 mRNA 프로모터, 목적하는 RNA 또는 단백질을 코딩하는 서열 및 헬퍼 바이러스의 3' NTR에 네이티브 또는 비네이티브인 3' NTR을 포함할 수 있다. 상기 서브게놈 mRNA 프로모터는 TMV에 대해 네이티브 또는 비네이티브일 수 있다. 예를들면 TMV 코트 단백질에 대한 서브게놈 mRNA 프로모터가 사용될 수 있다. 3'NTR은 TMV에 대해 네이티브 또는 비네이티브일 수 있다. 예를들면 RNA 레플리콘의 3' NTR은 야생형 TMV의 3' NTR 또는 다른 토바모바이러스에서 나올 수 있다. 또한, TMV 코트 단백질 ORF의 자체 또는 절편을 코딩하는 서열은 TMV RNA 레플리콘의 게놈에 포함될 수 있다. 예를들면 TMV 코트 단백질의 3' 말단에서 대략 100, 200 또는 300개의 누클레오티드가 목적하는 외래 서열의 말단과 3'NTR사이에삽입될 수 있다. 생육가능한 RNA 레플리콘의 구조에 있어서, 게놈 RNA로부터의 저해 영역이 보통 제거된다. TMV-유도된 RNA 레플리콘에 있어서, 상기 저해 영역은 3' 말단으로부터의 TMV 126kDa 단백질의 일부, 이동 단백질의 일부, 코트 단백질의 일부, 또는 TMV 183 kDa 단백질의 읽고지나간 부분을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
두번째 구체예에서, 헬퍼 바이러스 RNA는 RNA 레플리콘을 자동적으로 복제하도록 헬퍼 바이러스 RNA를 제조하기위해서 야생형 바이러스 RNA 서열 및 그의 변형된 서열을 포함할 수 있다. 헬퍼 RNA 식물 바이러스는 적당한 RNA 식물 바이러스로 가령 포티바이러스, 토바모바이러스, 브로모바이러스, 카모바이러스, 포텍스바이러스, 클로스테로바이러스, 호데이바이러스, 코모바이러스, 알파파 모자이크 바이러스 또는 비모바이러스에서 유도될 수 있다. 또한 하이브리드 헬퍼 RNA 바이러스는 두개 이상의 RNA 바이러스원으로부터 네이티브 서열을 포함하도록 구조화될 수 있다. 바람직하게 야생형 담배 모자이크 바이러스 및 그의 변이체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 야생형 RNA 식물 바이러스의 변형은 서프레스 정지코돈의 제거 또는 변형, 코트 단백질에 대한 ORF의 제거 또는 치환, 3' NTR의 치환 또는 하나 이상의 서브게놈 mRNA 프로모터의 사용을 포함할 수 있다. 야생형 헬퍼 바이러스의 변형된 형태로 삽입된 서열로 가령 코트 단백질, 3' NTR 또는 서브게놈 mRNA 프로모터를 코딩하는 것은 비네이티브원으로부터 나온다. 헬퍼 바이러스의 다른 변형은 정지코돈에 대한 센스 코돈의 격세유전과 같이 야생형 표현형에 대한 격세유전을 최소화하기위해서 서프레스 정지 코돈내 및/또는 근처에 RNA 서열의 변형을포함할 수 있다. 서프레스 정지코돈의 플랜킹 서열의 변형의 예로는 Skuzeski et al., J.Mol. Biol. 218:365-373(1991)에서 찾을 수 있다. 더욱 바람직하게, 서프레스 정지코돈을 치환할 수 있는 TMV 변이체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 상기 TMV 정지코돈 돌연변이화는티로신(TMV183Y), 페닐알라닌(TMV183F), 세린(TMV183S) 등을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 TMV 정지코돈 돌연변이인 TMV183F는 헬퍼 바이러스로서 작용에 특히 효과적이다. RNA 레플리콘에 대한 이종의 헬퍼 바이러스가 RNA 레플리콘을 복제하는데 또한 사용될 수 있다. 특히, 헬퍼 바이러스로서 오돈토글로섬 링스팟 바이러스(ORSV)는 다양한 TMV RNA 레플리콘을 복제할 수 있다. RNA 헬퍼 바이러스는 또한 다양한 RNA 동물 바이러스로 가령 폴리오바이러스, 알파바이러스 또는 리노바이러스에서 유도될 수 있다. 상기 헬퍼 바이러스는 다성분 벡터 시스템에서 RNA 레플리콘에 대해 상보적이다. 상기 헬퍼 바이러스는 게놈으로부터 제거된 하나 이상의 기능 및 구조 단백질을 가질 수 있고, 헬퍼 바이러스의 세포 대 세포의 이동을 방해하거나 또는 불가능하게 할 수 있다. 필수 기능 및 구조 단백질이 자동적으로 RNA 레플리콘에 의해서 공급될 수 있다. 상기 기능 및 구조 단백질은 이동단백질, 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 헬퍼 바이러스와 레플리콘 사이의 상호 관계는 변형된 헬퍼 바이러스가 외래 RNA를 운반하고 및/또는 목적하는 다수의 이펙터 RNA, 단백질 또는 펩티드를 제조하며, 추가적으로 RNA 레플리콘의 복제에 이용할 수 있다는 점이 반영될 수 있다.
세번째 구체예에서, 식물로 RNA 레플리콘 및 적당한 헬퍼 바이러스의 운반은 시험관내에서 전사된 RNA의 접종, 비리온의 접종 또는 핵 cDNA에서 식물세포의 내부 접종 또는 상기 방법으로부터 기인한 전신감염에 의해서 영향을 줄 수 있다. 벡터 시스템의 특정 성분이 상기 방법에 의해서 운반될 수 있다. 모든 경우에, 공감염은 식물세포에서 하나 이상의 외래 RNA, 다수 이펙터 RNA, 단백질 또는 펩티드의 빠르고, 우세한 전체 발현을 이끌 수 있다. RNA 및 단백질 유전자 또는 목적하는 서열에 의해서 식물의 전신 감염이 목적하는 생성물을 제조하기위해서 감염된 숙주를 성장시키거나, 필요하다면 목적하는 생성물을 분리 및 정제할 수 있다. 감염된 숙주의 성장은 종래의 기술에 따르며, 생성된 생성물의 분리 및 정제도 종래의 기술에 따른다.
다성분 RNA 벡터 시스템을 사용하여 식물세포에서 제조된 외래 RNA, 이펙터 RNA, 단백질 또는 펩티드가 식물에서 적당한 특성을 개선하는데 사용될 수 있다. 식물에서 유용한 표현 특성은 이에 한정되는 것은 아니지만, 제초제에 대한 개선된 내성, 극도의 열 또는 냉해, 가뭄, 염도 또는 삼투압에 대한 개선된 내성, 해충(곤충, 선충 또는 거미) 또는 질병(균류, 세균류 또는 바이러스류)에 대한 개선된 저항성, 효소 또는 2차 대사물의 생성, 수꽃 또는 암꽃의 수정, 왜소화, 조기성숙, 향상된 수득율, 왕성한 생장력, 잡종강세, 영양품질, 향 또는 가공성, 맥아에서 뿌리성장의 저해 또는 억제 등을 포함할 수 있다. 단백질 또는 펩티드의 제조는 상업적인 용도에 관한 것으로서, 가령 상기 생성물은 효소, 항체, 호르몬, 의약품, 멜라닌, 백신, 색소, 항생제 등을 포함한다. 다성분 RNA 벡터 시스템에서 관찰되는 다중-유전자 발현 벡터는 특히 생합성 경로에서 다단계로 조작되는 유전자를 발현하고, 원하지 않는 식물 유전자의 내인성 발현을 억제하는 안티센스 서열, "억제된" 식물 유전자에 의해서 영향을 받는 생성물에 대한 유전자 또는 생체내에서 배가 및 완전히 조합되는 다수의 이종 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키는데 유익하다.
식물에서 외래 서열의 제조에 있어서 재조합 RNA 레플리콘 및 헬퍼 RNA 바이러스는 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있는 기술을 사용하여 구조화될 수 있다. 적당한 기술이 미국특허 제5,316,931호, 제5,811,653호, 제5,866,785호, 제5,589,367호 및 제5,889,190호에 개시되어 있으며, 모두 참고문으로 통합되어 있다.
본 발명에서 개시된 다성분 RNA 벡터 시스템은 식물에서 RNA 및 단백질을 제조하는데 사용될 수 있는 상업적으로 사용된 바이러스계 벡터 시스템의 향상을 나타낸다. 상기 상업적으로 사용되는 시스템은 비바이러스 서열이 삽입되고, 생성된 변형 바이러스가 감염된 숙주에 사용되는 단일성분 벡터이다. 본 발명에서의 개선점은 다수의 단백질 또는 RNA의 제조를 허용하고, 단일성분 벡터에서 안정하지 않은 단백질이 더 안정하게 제조되도록 한다. 특히, 본 발명은 식물세포에서 높은 수준으로 외래 단백질, RNA 또는 이펙터 RNA를 증폭 및 발현시킬 수 있는 안정한 다성분 RNA 벡터 시스템에 관한 것이다. RNA 및 단백질의 발현에 있어서 다성분 RNA 벡터 시스템의 많은 측면은 식물세포에서 외래 RNA 및 단백질의 발현에서 가요성 및 안정성을 제공하는데 있어서 유익하다. 먼저, 다성분 벡터 시스템에서 감소된 RNA 레플리콘 크기는 외래 RNA 또는 이펙터 RNA의 거대한 서열을 조절할 수 있고, 존재하는 단일성분 벡터에 대해 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열을 조절할수 있는 본 발명에서 RNA 레플리콘을 제조할 수 있다. 더 작은 RNA 레플리콘으로부터의 비리온이 또한 식물을 통해서 더 용이하게 전염시키는데 이용할 수 있다. 또한, 레플리콘의 더 작은 크기가 같은 RNA에서 외래 유전자 카세트 또는 다수의 서브게놈 mRNA 프로모터를 조절할 수 있다. 크기 억제는 추가의 외래 유전자 서열의 4kb미만으로 매우 긴 서열을 포함하면서 비로서 본 발명에서 RNA 레플리콘에서는 사용할 수 있다. 두번째, RNA 레플리콘이 예를들면 핵 유전자로부터 식물에서 "내부 접종"에 의해서 공급되며, 헬퍼 바이러스가 감염될때 각 세포에서 증폭될 것이다. 생성 시스템의 유전적 안정성은 각 세포에서 감염이 핵 전사에서 유도되는 새로운 RNA 레플리콘으로 재접종될 수 있다는 사실에 의해서 매우 높을 수 있다. 세번째, 헬퍼 바이러스와 RNA 레플리콘사이의 상보적인 관계가 또한 유익하다. 이러한 방법으로, 다성분 벡터는 상호-보충한다. RNA 레플리콘이 헬퍼 바이러스로부터 제거되는 하나 이상의 서열을 운반하고, 하나의 세포에서 다른 세포로의 헬퍼 바이러스의 이동은 저해되거나 또는 불가능하다. 상기 서열의 예로는 이동단백질 서열, 캡시드 서열 및 특정 동물 바이러스 또는 식물 바이러스의 다른 기능 및 구조 서열이 있다. 목적하는 외래 RNA, 이펙터 RNA, 단백질 또는 펩티드는 레플리콘 또는 헬퍼 바이러스내에서 포함될 수 있다. 마지막으로, RNA 레플리콘 발현 벡터는 단일 서브게놈 mRNA 프로모터, 두개 이상의 서브게놈 mRNA 프로모터로 기능을 하며, 동종 및 비네이티브 서브게놈 mRNA 프로모터의 조합물을 포함하며, 또는 서브게놈 mRNA 프로모터 및 내부 리보솜 개시자리의 조합물을 포함한다.
명세서 및 청구의 범위을 명확하고 일관성 있는 이해하기위해서, 상기에서사용된 용어에 대해서 하기에 정의를 제공한다:
5' 또는 3' NTR: 5' 또는 3' 말단에서 바이러스 게놈의 비해독 영역, 25 누클레오티드보다 길고, 500 누클레오티드보다 짧다.
시스-작용(시스-의존성): 발현될 수 있는 핵산을 갖는 유전자 생성물 사이의 분자 또는 복합물의 작용
코트 단백질(캡시드 단백질): 바이러스의 외부 구조 단백질
이펙터 RNA: 숙주에서 변화를 일으키도록 고안된 RNA, 가령 유전자 발현의 유전자 사일러싱 또는 조절
유전자: 별개의 세포성 생성물에 대해서 반응하는 별개의 핵산서열
헬퍼 바이러스: 숙주의 세포로 도입되었을때 RNA 레플리콘의 복제에 이용할 수 있는 RNA 서열의 배열
동종: 다른 것에 대해 기능적으로 상응하는 누클레오티드 서열. 실질적인 서열 상동성을 갖는 서열들 사이에서 누클레오티드 차이는 상기 서열에 의해서 코딩된 유전자 생성물 또는 RNA의 기능에 영향을 주는 것을 최소화한 것이다.
숙주: 벡터 또는 바이러스 핵산을 복제할 수 있는 세포, 조직 또는 생물체이고, 바이러스 벡터 또는 바이러스 핵산을 포함하는 바이러스에 의해서 감염될 수 있다. 상기 용어는 원핵 및 진핵세포, 기관, 조직 또는 생물체에 한정된다.
감염: 바이러스의 핵산을 숙주로 전달 또는 바이러스 핵산을 숙주로 도입할 수 있는 바이러스의 능력, 상기 바이러스 핵산이 복제되고, 바이러스 단백질이 합성되어 새로운 바이러스 입자가 조합된다.
내부 개시 자리: mRNA를 폴리펩티드로 리보솜-중개 해독에 관여하는 특정의 내부 영역
이동 단백질: 식물에서 RNA 레플리콘 또는 바이러스의 세포 대 세포 이동을 요구하는 캡시드가 아닌 단백질
비네이티브(외래): 바이러스 또는 생물체에서 자연적으로 발생하지 않는 특정의 서열로, 상기 서열은 비네이티브(외래)라 한다.
오픈 리딩 프레임: 적당한 길이의 누클레오티드 서열로 정지코돈이 없다.
팩킹 시그날: 캡시드 또는 코드 단백질내에서 RNA를 포함할 수 있는 RNA 서열로 성숙한 비리온을 형성한다.
식물세포: 식물의 구조 및 생리학적 단위로 원형질체와 세포벽으로 이루어져 있다.
식물 조직: 식물계 또는 배양에서 식물의 특정 조직. 상기 용어는 전체 식물, 식물세포, 식물 기관, 원형질체, 세포배양 또는 구조 및 기능 단위로 조직화된 식물 세포의 그룹에 한정된다.
프로모터: 코딩 서열의 전사의 개시를 포함하는 코딩 서열에 인접한 5'-인접 비-코딩 서열
원형질체: 세포벽이 업여 분리된 세포, 세포배양 또는 전체 숙주로 재생되는 정도
RNA 레플리콘: 같은 숙주 세포가 존재하는 경우 적당한 헬퍼 바이러스가 존재할 때 복제할 수 있는 하나 이상의 비네이티브 서열의 전사에 의해서 생성된 RNA서열의 배열. RNA 레플리콘은 효율적인 복제 및 안정성을 위해서 복제 기관 뿐만아니라 서열을 요구한다.
서브게놈 mRNA 프로모터: 크기에 있어서 완전한 길이의 게놈보다 작은 mRNA의 합성에 관여하는 프로모터
트란스-작용: 발현되는 핵산으로부터 독립적으로 다른 분자에 있어서 분자 또는 복합체의 반응
벡터: 비네이티브 서열을 포함하고, 세포들 사이에 RNA 조각을 전달하는 자기-복제성 RNA 분자
비리온: 바이러스 RNA, 바이러스 코트 단백질(또는 캡시드 단백질)로 이루어진 입자
바이러스: 단백질로 쌓인 핵산으로 이루어진 감염체
하기 실시예는 본 발명을 추가로 상술한다. 본 실시예는 주로 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 제한하기 위한 것은 아니다. 본 실시예는 본 발명의 범주내의 방법을 사용하여 얻어질 수 있는 RNA, 단백질 또는 펩티드의 회수를 설명하기 위한 것이다.
실시예 1
바이러스 복제에 필요한 비-구조 단백질의 동정
담배모자이크 바이러스(TMV)는 게놈이 6395개 누클레오티드로 된 포지티브-가닥 ssRNA 바이러스이다. 게놈 RNA는 짧은 5' NTR 이후에 4848개의 누클레오티드의 오픈리딩프레임(ORF)을 포함하며, 이는 누클레오티드 3417에서 앰버 정지코돈을 포함한다. 2개의 비-구조 단백질은 상기 ORF로부터 발현된다. 첫번째 단백질은 누클레오티드 결합 및 추정의 헬리카제 활성을 갖는 126kDa 단백질이다. 두번째 단백질은 해독 경우의 약 5-10%로, 앰버 정지코돈을 읽고 지나가면서 해독가능한 183kDa 단백질이다. 183kDa 단백질은 RNA-의존성 RNA 중합화효소와 상동한 새로운 영역 및 126kDa 단백질의 기능 영역을 포함한다. 통상적인 3' 말단을 갖는 적어도 2개의 서브게놈 mRNA는 TMV 주입후에도 생성된다. 상기는 30kDa 이동단백질 및 17.5kDa 코트 단백질을 코딩한다. TMV 게놈 RNA의 3' 말단은 슈도노트(pseudoknot) 시리즈후 tRNA-유사 구조로 중첩될 수있다.
126kDa 및/또는 183kDa 단백질이 TMV의 복제에 필수적인지를 조사하기 위해 실험을 진행하였다. 여러 돌연변이를 감염성 TMV cDNA 클론에 도입하기 위해 표준 분자생물학 방법을 사용하였다. TMV 복제에 두개의 비-구조단백질이 공헌하는 것은 T7 RNA 중합화효소를 사용하여 야생형 또는 돌연변이체 cDNA를 실험실내에서 전사하고, 그 전사물을 담배 원형질체로 접종함으로써 초기분석하였다. 접종후 여러 시간간격으로 식물세포를 수확하였다. 이후에 RNA를 추출하여 노던 블롯팅 과정으로 분석하였다. 각 바이러스에 의해 각각 감염된 원형질체내 바이러스 복제는 돌연변이 바이러스 RNA에 대응하는 포지티브-가닥 및 네가티브-가닥 RNA를 야생형 바이러스와 비교하여 측정하였다.
한 실험예에서, 서프레스 정지코돈을 TMV 돌연변이체인 TMV183Y를 생성하는 티로신에 대한 코돈으로 변환하였다. 단백질 면역블롯팅에 의해, 상기 TMV 돌연변이체가 126kDa 단백질을 축적하지 않으면서 183kDa 단백질만 생성한다는 것을 확인하였다. 상기 TMV 돌연변이체는 식물세포내 복제에 실용적이며, 이는 TMV의 183kDa 단백질이 기능바이러스 복제효소이고, TMV 바이러스를 복제하는데 필수적이라는 것을 입증해준다. 계속되는 실시예에서 183kDa 단백질이 또한 트랜스-작용하고, 이는 183kDa 단백질만 발현하는 돌연변이체 TMV 바이러스를 헬퍼 바이러스로서 기능하도록 한다는 것을 확인하였다. 다른 실험예에서, 서프레스 정지코돈은 다른 TMV 돌연변이체인 TMV183F를 생성하는 페닐알라닌에 대한 코돈으로 변환되었다. TMV183F 돌연변이체에 의한 연구는 183kDa 단백질이 RNA 레플리콘을 복제하도록 트랜스-작용하는 TMV183Y에 의해 계속되었다. 도 2는 헬퍼 바이러스 TMV183F 및 RNA 레플리콘 TMV420에 의한 니코티아나 실베스트리스(Nicotiana sylvestris)의 동시-감염으로부터 얻은 녹색형광단백질(GFP)의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 도 3은 여러 RNA 레플리콘 및 야생형 TMV에 의한 담배 원형질체의 동시감염 또는, 단일 성분 벡터에 의한 담배 원형질체로부터 얻은 GFP 발현의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 도 4는 TMV 3'-특이성 프로브(좌측) 또는 GFP-특이성 프로브(우측)를 사용하여 니코티아나 타바쿰 식물내 헬퍼 바이러스로서 TMV183F에 의해 동시-접종된 TMV421 RNA 레플리콘의 복제를 노던 블롯 분석하는 것을 도시한다.
본 실험예는 126kDa 단백질이 바이러스 RNA를 복제하는데 불필요하다는 것을 보여준다. 그리고, 추가의 실험예는 126kDa 단백질이 cis-의존성 방법에서 전체 바이러스 복제 및 기능을 향상시키는 역할을 제공한다는 것을 보여준다.
실시예 2
RNA 레플리콘내 최적서열 배열의 결정
A. 내부 결실
식물내에서 외래 서열을 발현할 수 있는 RNA 레플리콘을 제조하기 위해, TMV 게놈의 광범위한 결실분석을 실시하여, 헬퍼 바이러스로서 야생형 TMV에 의해 동시접종될때 효율적으로 복제되는, 내부 서열이 결여된 적당한 RNA 레플리콘을 확인하였다. TMV cDNA 클론내 상기 결실돌연변이를 제조하기 위해 표준 분자생물학 방법을 사용하였다. 성공적인 제조후에, 각 돌연변이체 cDNA를 T7 RNA 중합효소를 사용하여 시험실내에서 전사하고, 야생형 TMV cDNA로부터 담배 원형질체로 유도된 시험관내 전사물에 의해 동시접종하였다. 접종후 여러 시간간격으로 식물세포를 수확하였다. 이후에 RNA를 추출하고, 노던 블롯팅 과정에 의해 분석하였다. 내부 결실을 포함하는 돌연변이체 RNA 및 야생형 TMV RNA에 대응하는 포지티브-가닥 및 네가티브-가닥 RNA의 축적에 의해 TMV 복제를 측정하였다.
상기 결실 분석으로 인해, TMV 게놈의 일부 영역이 RNA 레플리콘의 복제에 영향을 미치지 않으면서 제거될 수 있다는 것을 알 수 있었다. C-말단으로부터 126kDa 단백질의 2/3, 전체 30kDa 이동단백질 및 TMV의 코트단백질을 코딩하는 서열은 복제에 사용될 수 있으며, RNA 레플리콘의 복제를 막지 않으면서 제거될 수 있다. 단백질내 RNA 레플리콘의 발견할 수 있는 축적을 위해, 183kDa 단백질의 읽고지나감 부분을 대략 코딩하는 서열을 제거할 필요가 있다. 예상치못하게는, 읽고지나감 영역을 대략 코딩하는 영역에 더해 일부 추가의 서열을 제거하면, RNA 레플리콘의 트랜스-복제가 매우 증가하였다.
결실분석으로 인해, 헬퍼 바이러스의 존재하에서 RNA 레플리콘을 복제하기 위해 여러 내부영역이 필요하다는 것이 발견되었다. 제1 영역은 게놈의 5' 말단이며, 첫번째 대략 256개의 누클레오티드는 필수적이며, TMV 게놈의 첫번째 대략 1342개의 누클레오티드는 RNA 레플리콘에 보유된 거의 최적의 서열길이를 제공한다. 필수 5' NTR에 더해, RNA 레플리콘의 복제를 위해 3' NTR이 RNA 레플리콘내에 존재하는 것이 요구된다. 유효한 RNA 레플리콘 복제에 필요한 마지막 특징은 RNA 레플리콘의 5'부분내에 완전한 리딩프레임이 존재하는 것이다. 프레임-쉬프트 돌연변이의 도입은 RNA 레플리콘이 유효하게 복제할 수 있는 능력에 역효과를 미친다.
TMV로부터 유도된 여러 기능 RNA 레플리콘의 복제수준을 비교하면, RNA 레플리콘 TMVΔCla가 거의 최대의 복제력을 부여한다는 것을 알 수 있다(도 1). TMVΔCla는 TMV의 5' 말단으로부터 첫번째 1342개의 누클레오티드를 가지며, 상기 지점으로부터 TMV 게놈의 누클레오티드 자리 5665까지 서열이 누락되어 있다. 상기 RNA 레플리콘의 3' 말단은 누클레오티드 5665로부터 RNA의 3' 말단(누클레오티드 6395)까지 야생형 TMV의 3' 말단과 연속되어 있다. 상기 RNA는 종종 야생형 TMV 헬퍼 바이러스의 게놈 RNA의 수준과 유사한 수준으로 축적한다. 상기 RNA 레플리콘의 한가지 부정적인 특성은 RNA 레플리콘내 완전한 서브게놈 mRNA 프로모터 서열이 누락되어 있다는 점이다. 서브게놈 mRNA 프로모터의 필수부분은 상기 RNA 레플리콘의 제조시에 결실되었다.
B. 3' 말단 서열
토바모바이러스의 3' NTR은 슈도노트 구조로서 기술되는 방법으로 인접서열을 갖는 염기쌍인 적어도 3개의 RNA 줄기-루프 영역에 의해 진행되는 tRNA 모의 활성을 갖는 정교하게 중첩된 RNA 구조를 포함한다. 상기 슈도노트 RNA 구조 셋트의 상류는 TMV 코트단백질을 코딩하는 ORF이다.
TMV 게놈의 3' 말단의 광범위한 분석은 바이러스 cDNA내 각 RNA 구조요소의 결실, 또는 이종 토바모바이러스로부터의 RNA 요소를 바이러스 cDNA(하이브리드 바이러스)로의 치환하는 것에 의해 실시되었다. 표준 분자생물학 방법은 전체 길이의 TMV 돌연변이체를 복제하는데 상기 요소들이 각각 공헌하는 바를 분석하기 위해 TMV cDNA 클론내 돌연변이체를 제조하는데 사용되었다. 성공적인 제조후에, 126kDa 및 183kDa 단백질에 대한 완전한 ORF를 함유하는 돌연변이체 cDNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 시험관내 전사되며, 전사물을 담배 원형질체로 접종하였다. 접종후 여러 시간간격으로 식물세포를 수확하였다. 그후에 RNA를 추출하고, 노던 블롯팅 과정에 의해 분석하였다. 복제에 미치는 효과는 돌연변이 바이러스 및 하이브리드 바이러스에 대응하는 포지티브-가닥 및 네가티브-가닥 RNA의 축적을 야생형 바이러스와 비교함으로써 측정하였다. 동일한 3' NTR 치환을 함유하는 하이브리드 RNA 레플리콘을 제조하고, 시험관내 전사하고, 야생형 TMV 헬퍼 바이러스의 시험관내 전사물에 의해 담배 원형질체로 동시접종하였다. 접종후 여러 시간간격으로 식물세포를 수확하였다. 이후에 RNA를추출하고, 노던 블롯팅 과정에 의해 하이브리드 RNA 레플리콘의 복제를 분석하였다. 하이브리드 RNA 레플리콘의 복제는 RNA 레플리콘의 포지티브-가닥 및 네가티브-가닥 RNA의 축적을 측정함으로써 변형되지 않은 TMV RNA 레플리콘의 복제와 대조하였다.
균질한 TMV 3' NTR을 함유하는 RNA 레플리콘 및 전체-길이 바이러스 RNA는 비-네이티브(비-TMV) 3' NTR을 함유하는 RNA보다 높은 수준으로 축적되었다. 그리고, 일부 RNA 레플리콘의 복제는 전체적으로 이종의 헬퍼 바이러스에 의해 지지된다. 예를 들어, ORSV와 같은 다른 이종의 헬퍼 바이러스에 의해 동시접종될때, 일부 TMVΔCla-유도된 RNA 레플리콘이 복제되고, 도 5는 이종의 헬퍼 바이러스 ORSV에 의한 TMV-계 RNA 레플리콘의 복제를 노던 블롯팅 분석한 것을 도시한다. 3' NTR내에서 tRNA-유사 영역 및 단일 3' 인접 슈도노트 구조만 복제에 필요하다. 일부 RNA 레플리콘의 복제는 균질한 하이브리드 및 완전히 이종의 헬퍼 바이러스에 의해 폭넓게 지지된다.
실시예 3
TMV-계 RNA 레플리콘을 유전자 백본으로서 사용하는 발현 벡터의 개발
실시예 2에 개시된 바와 같이, 야생형 TMV의 존재하에 최고의 복제수준을 갖는 RNA 레플리콘은 TMVΔCla이다. 그러나, 상기 dRNA는 완전한 서브게놈 mRNA 프로모터의 누락 및 게놈 RNA로부터의 해독을 방해하는 벡터내 다량의 5' 서열로 인해 외래 유전자를 고수준 발현할 수 없다.
TMVΔCla는 발현 벡터 TMVΔCla/152/C3O3으로 전환되었다(도 1 참조). 플라스미드 pTMVΔCla를 먼저 ClaI 제한효소에 의해 소화시키고, ClaI 자리의 접착성 말단을 T4 DNA 중합효소에 의한 처리에 의해 채웠다. 그후, DNA를 KpnI 제한효소로 소화시키고, 플라스미드 백본 및 TMV 게놈의 5' 1343개의 누클레오티드를 함유하는 큰 절편을 분리하였다. TMV 클론 pTMV152로부터의 TMV 게놈의 3' 1/3은 SalI로 소화하였다. SalI 접착성 말단을 T4 DNA 중합효소로 채운후 KpnI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켰다. TMV 누클레오티드 5460-6395이후의 채워진 SalI 자리로 구성된, 상기 작은 DNA 절편은 큰 pTMVΔCla 절편과 결찰하여 pTMVΔCal/152(누클레오티드 1344-5459 결실됨)를 생성하였다. 그후, pTMVΔCla/152를 ClaI 및 KpnI 절편에 의해 소화시키고, 큰 DNA 절편을 분리하였다. p30BGFPC3O3으로부터의 ClaI/KpnI 절편을 pTMVΔCla/152의 큰 절편으로 결찰시켰다. 결과 플라스미드 pTMVΔCla/152/C3O3은 5' 말단으로부터 3' 말단, 야생형 TMV로부터의 5' 1343개의 누클레오티드, SalI 제한효소 자리, 사이클 3 녹색형광 단백질(GFP)에 대한 ORF, XhoI 제한 자리, 및 TMV로부터의 3' NTR을 포함한다(도 1).
RNA 전사물은 KpnI-선형화 pTMVΔCla/152/C3O3로부터 전사하고, 야생형 TMV 전사물에 의해 담배 원형질체로 동시-접종하였다. 도 6 및 도 7에서 레인 1은 TMV 3' NTR-특이성 프로브와 GFP-특이성 프로브를 각각 사용하여 야생형 TMV에 의해 동시-접종된 원형질체내에서 GFP를 발현하는 TMVΔCla/152/C3O3 벡터의 복제를 노던 블롯 분석한 것을 도시한다. ΔCla/152/C3O3 RNA 레플리콘을 복제하고, GFP에 대한 서브게놈 mRNA를 발견하여 기능 RNA 레플리콘-계 벡터가 제조되었다는 것을 알았다. 상기 RNA 레플리콘은 기능 서브게놈 mRNA 프로모터의 존재로 인한 진발현벡터(true expression vector), 외래 서열을 삽입하기 위한 제한자리 및 트랜스-공급된 코트 단백질에 의한 캡시드화에 대한 완전한 패키징시그널(packaging signal)이다.
실시예 4
RNA 레플리콘의 복제를 향상시키기 위한 헬퍼 바이러스의 변형
발현도구로서 TMVΔCla/152/C3O3 RNA 레플리콘을 사용하기 위해, 상기 RNA 레플리콘의 복제는 최대 수준의 외래 유전자 발현을 확보하기 위해 최대화되어야 한다. 여러 다른 TMV 게놈을 TMVΔCla/152/C3O3 RNA 레플리콘의 복제를 촉진할 수 있는 그의 능력에 대해 분석하였다. TMV 및 다른 토바모바이러스에 대한 cDNA 클론을 사용하여 TMV 변형체를 제조하기 위해 표준 분자생물학 방법을 사용하였다. 성공적인 제조후에, 헬퍼 바이러스로서 시험되는 TMV 변형체는 담배 원형질체로 TMVΔCla/152/C3O3 전사물에 의해 동시-접종된 전사물과 T7 RNA 중합효소를 사용하여 시험관내 전사되었다. 접종후 여러 시간간격으로 식물세포를 수확하였다. 이후에 RNA를 추출하고, 노던 블롯팅 과정에 의해 분석하였다. TMV 변형체 및 TMVΔCla/152/C3O3 RNA 레플리콘의 복제는 포지티브-가닥 및 네가티브-가닥 RNA의 축적을 비교함으로써 측정하였다. 도 6 및 도 7은 TMV 3' NTR-특이성 프로브와 GFP-특이성 프로브를 각각 사용하여 다른 TMV-유도성 헬퍼 바이러스에 의해 동시-접종된 원형질체내에서 GFP를 발현하는 TMVΔCla/152/C3O3 벡터의 복제에 대한 노던 블롯 분석을도시한다.
헬퍼 기능을 위한 다른 TMV 변형체를 선별하여 성립한 일반적인 원리는 복제하는 TMV 변형체의 능력이 적을수록 입증되는 헬퍼 바이러스는 더 나아진다는 점이다. 이는 RNA 레플리콘의 복제가 헬퍼 바이러스의 과다 복제력으로부터 얻어진 것이기 때문이다. 헬퍼 바이러스가 그의 레플리카제를 유효하게 사용한다면, RNA 레플리콘을 복제하기 위해 보다 적은 합성장치를 사용할 수 있다. 또한, TMV RNA 레플리콘이 존재함으로써 헬퍼 바이러스중 어느 하나의 복제를 상당히 감소 또는 억제하지 않았다는 것을 알 수 있다. 이는 BMV RNA 레플리콘을 사용한 결과와 대조적이다(Pogue 외 다수, Virol. 178: 152-160(1990); Marsh 외 다수, J. Gen. Virol. 72: 2367-2374(1991)). 실험은 코트 단백질 ORF(S3-28, 도 1)가 누락되고, ORSV(TMV-CPO)의 ORF에 의해 대체된 TMV 코트 단백질의 ORF를 가지는 TMV 변형체 또는 이중 서브게놈 mRNA 프로모터 벡터(TB2-GUS)가 야생형 TMV보다 양호한 RNA 레플리콘의 복제를 지지한다는 것을 보여주었다(도 1, 6 및 7 참조).
변형된 183kDa 단백질 ORF에 대한 서프레스 정지코돈을 갖는 TMV 돌연변이체, TMV183Y 및 TMV183F는 TMVΔCla/152/C3O3 RNA 레플리콘을 증폭시킬 수 있었다(도 6 및 7 참조). 상기 결과는 183kDa 단백질 자체가 복제 뿐만 아니라 전사에 트랜스로 기능할 수 있다는 것을 확인해준다. 추가의 실험은 TMV183F가 헬퍼 바이러스로서 특히 효과적이라는 것을 보여주었다. 먼저, TMV183F 헬퍼 바이러스는 이후의 실시예에서 많은 dRNA-계 RNA 레플리콘을 지지하였다. 두번째로, TMV183F 바이러스는 동시-접종되는 RNA 레플리콘을 조직감염시키는 TMV183F 바이러스, 니코티아나 벤타미아나 및 엔. 실베스트리스는 담배내에서 세포에서 세포로 단독이동한다. 마지막으로, TMV183F 헬퍼 바이러스는 보다 안정하다. 이는 TMV183Y 헬퍼 바이러스와 비교하는 식물내 바이러스 감염연구에서 입증되었다.
실시예 5
TMV 헬퍼 바이러스에 의해 동시-접종된 TMV-유도성 RNA 레플리콘을 사용하여GFP 리포터 단백질을 발현하기 위한 다성분 RNA 벡터 시스템
식물세포내에서 기능 GFP 리포터 유전자를 발현하는 TMVΔCla/152/C3O3 RNA 레플리콘의 능력은 담배 원형질체내에서 먼저 분석하였다. TMVΔCla/152/C3O3에 대응하는 RNA 전사물을 야생형 TMV와 함께 담배 원형질체에 동시-접종하였다. 감염후 다른 시간간격으로 형광 현미경으로 GFP 단백질의 축적에 대해 원형질체를 관찰하였다. 접종후 20-24시간사이에, UV 조명하에 관찰된 원형질체는 GFP 단백질의 축적 특징인 녹색 "성장" 표현형을 나타냈다. 녹색 표현형의 강도는 원형질체 세포의 긴 배양동안 더 세졌다. 건강하거나 또는 "모방"(물 접종된) 원형질체 또는, 헬퍼 바이러스 단독 또는 RNA 레플리콘 단독 중 어느 하나에 의해 감염된 원형질체를 포함하는 음성대조군에서는 상기 녹색이 관찰되지 않았다. TMV183Y, TMVCPO, S3-28 및 TB2-GUS를 포함하는 다른 헬퍼 바이러스 구조물도 또한 복제할 수 있으며, 원형질체내에서 GFP 단백질을 발현하기 위해 TMVΔCla/152/C3O3 RNA 레플리콘을 트랜스-활성화하며, 이는 발현 시스템의 강함을 입증한다. GFP 단백질 축적이 TMVΔCla/152/C3O3의 복제, 및 GFP 단백질 ORF를 코딩하는 서브게놈 mRNA의 전사 및 해독에 의존한다는 사실을 가리키는 상당한 녹색이 감염된 원형질체의 10-30%에서 발생하였다. 노던 블롯 분석으로부터, TMVΔCla/152/C3O3 RNA 레플리콘에 대한 포지티브-가닥 및 네가티브-가닥 RNA의 존재 및 GFP 단백질의 ORF 서열을 코딩하는 서브게놈 mRNA의 축적을 확인하였다.
실시예 6
TMV 헬퍼 바이러스에 의해 동시-접종된 다른 TMV-유도성 RNA 레플리콘을 사용하여 GFP 리포터 단백질을 발현하기 위한 다성분 RNA 벡터 시스템
RNA 레플리콘을 제조하기 위해 TMV 게놈내 서열을 결실시키는 과정중에, 실험은 결실된 3' NTR아래의 126kDa 단백질 ORF에 대한 정지코돈의 서열하류를 갖는 RNA 레플리콘(TMV142)가 복제할 수 없지만, 그의 복제는 복제에 적당한 헬퍼 바이러스, 가령 야생형 TMV, 여러 TMV 변이체 및 다른 이종의 헬퍼 바이러스에 의해 지지될 수 있다는 것을 보여주었다. 특히, 상기 dRNA는 TMV 126kDa 단백질 자체(TMV183Y 및 TMV183F, 실시예 4 참조)를 발현할 수 없는 헬퍼 바이러스에 의해 보다 유효하게 복제되었다. 이동 단백질 및/또는 코트 단백질의 ORF로부터의 추가의 서열을 함유하는 TMV142 RNA 레플리콘에 대한 다른 변형체를 제조하고, 원형질체내에서 TMV142와 유사한 수준으로 복제하였다. 상기는 코트 단백질 서브게놈 mRNA 프로모터 및 야생형 TMV로부터의 코트단백질의 ORF를 포함하는 pTMV142/152의 구조물을 포함했다(도 1 참조). 상기 RNA 레플리콘은 XhoI 및 KpnI 제한효소에 의해 pTMV142를 소화시킴으로써 제조하였으며, 이를 3' NTR을 잘라내고, 코트 단백질 서브게놈 mRNA 프로모터, 코트 단백질 및 3' NTR을 함유하는 SalI/KpnI 절편을 pTMV152로부터 TMV142로 연결하였다. 상기 플라스미드는 여러 헬퍼 바이러스에 의해 트랜스로 복제되는 RNA 레플리콘으로 발생했다. 코트 단백질 서브게놈 mRNA도 또한 상기 RNA 레플리콘으로부터 발현되는 것으로 측정되었다.
TMV142/152 RNA 레플리콘의 게놈 조직화에 기초하는 외래 서열을 발현하기 위한 발현벡터를 제조하기 위해, 실시예 5의 pTMVΔCla/152/C3O3과 유사한 중간 GFP-발현 RNA 레플리콘(TMV409)을 먼저 제조하였다. 플라스미드 pTMVΔCla/152를ClaI 및 BsiWI로 소화시켰다. 플라스미드 백본, SalI 자리 이하의 5' TMV 서열, SalI와 ClaI 사이의 서브게놈 mRNA 프로모터 서열 및 BsiWI와 KpnI 사이의 3' NTR 서열을 함유하는 큰 절편이 보존된다. ClaI와 PacI 자리 사이의 서브게놈 mRNA 프로모터의 잔류물, GFP 단백질의 야생형 ORF 및 BsiWI 이하의 3' NTR 서열을 함유하는 pTMV30BGFP로부터의 ClaI/BsiWI 절편을 SalI/BsiWI-소화성 pTMVΔCla/152에 연결하여 pTMV409를 제조하였다. 상기로 인해 적당한 헬퍼 바이러스에 의해 동시-감염시에 GFP를 발현하고 복제할 수 있는 RNA 레플리콘을 얻었다. 비-구조 단백질의 영역 1 및 2를 코딩하는 RNA 레플리콘으로 GFP 단백질의 ORF 및 서브게놈 mRNA 프로모터를 삽입하기 위해, pTMV409를 SalI 및 KpnI로 소화시켰다. 서브게놈 mRNA 프로모터, GFP 단백질의 ORF 및 3' NTR을 함유하는 결과 절편을 XhoI/KpnI-소화성 pTMV142로 연결시켜 pTMV412를 제조하였다. TMV412 RNA 레플리콘을 담배 원형질체 및, TMV412 및 적당한 헬퍼 바이러스의 시험관내 RNA 전사물에 의해 동시감염된 엔. 벤타미아나의 잎내에서 복제하였다. TMV412는 5' 말단으로부터 3' 말단까지, TMV로부터의 5' NTR, 완전한 TMV 126kDa 단백질의 ORF, 전체 TMV 코트 단백질 서브게놈 mRNA 프로모터, PacI 자리, GFP 단백질의 야생형 ORF, XhoI 자리 및 TMV 3' NTR을 함유한다(도 1 참조). 이것이 외래 서열을 삽입하기 위한 PacI 및 XhoI 제한효소자리 및 헬퍼 바이러스에 의해 트랜스로 공급되는 코트 단백질에 의한 캡시드화를 위한 기능 패키징 시그널을 특징으로 하는 유효 발현벡터이다.
접종후 여러 시간에, RNA 및 단백질 샘플을 적당한 헬퍼 바이러스 및 RNA 레플리콘 TMV412에 의해 동시접종된 식물로부터 추출하고, 바이러스 RNA의 축적 및GFP 단백질의 축적에 대해 분석하였다. 또한, UV 조명하에 샘플을 분석하여 감염된 영역을 가시화하였다. 노던 블롯 분석에 의해 헬퍼 바이러스와, 잎조직으로부터의 GFP-발현 TMV412 RNA 레플리콘 모두의 존재를 확인하였다. TMV183F를 포함하는 그의 126kDa 단백질을 발현하지 않는 헬퍼 바이러스가 TMV412 RNA 레플리콘의 복제를 지지하기 위한 우수한 헬퍼 바이러스라고 측정되었다. GFP 단백질 발현은 엔. 벤타미아나 및 엔. 타바쿰의 동시-감염된 조직으로부터 웨스턴 면역블롯 분석함으로써 확인하였다. 다른 변형예는 외래 유전자를 삽입하기 위한 XhoI 자리와 3' NTR 사이에 TMV 코트 단백질의 ORF로부터의 추가 3' 프록시멀 서열을 삽입하는 것이다. 상기 서열들을 포함시킴으로써, RNA 레플리콘의 축적수준이 향상되고, GFP 발현 수준이 향상된다고 측정되었다(이하 실시예 참조).
실시예 7
TMV 헬퍼 바이러스에 의해 동시-접종된 TMV420, TMV421 및 TMV411 RNA 레플리콘을 사용한 단백질 발현을 위한 다성분 RNA 벡터 시스템
183kDa 단백질의 영역 1 및 2를 코딩하는 3개의 추가 RNA 레플리콘, TMV420, TMV421 및 TMV411을 실시예 6의 방법에 따라 제조하였다. 상기 3개의 RNA 레플리콘은 TMV 코트 단백질의 ORF 일부의 삽입물을 각각 함유하는 것을 제외하고는 TMV412 RNA 레플리콘의 유전자 조직과 유사하다. TMV420은 5' 말단으로부터 3' 말단, 5' NTR, 기능 126kDa 단백질의 ORF, 전체 TMV 코트 단백질 서브게놈 mRNA 프로모터, PacI 자리, GFP 단백질의 ORF, XhoI 및, 3' 말단으로부터 TMV 코트 단백질의 100개의 누클레오티드 및 3' NTR을 함유한다(도 1 참조). TMV421 및 TMV411은상기 RNA 레플리콘이 각각 3' 말단으로부터의 TMV 코트 단백질의 200 내지 300개의 누클레오티드를 포함하는 것 외에는 TMV420과 동일한 구조물을 함유한다(도 1 참조). RNA 레플리콘 TMV420, TMV421 및 TMV411의 복제는 헬퍼 바이러스 TMV183F에 의해 동시-접종될때 엔. 벤타미아나 및 엔. 타바쿰 식물의 잎 및 담배 원형질체내에서 확인하였다. 각 RNA 레플리콘의 성공적인 증폭은 노던 블롯 분석에 의해 입증되었다. 엔. 벤타미아나 및 엔. 타바쿰 식물의 잎내에 접종된 GFP 단백질의 발현은 UV 조명에 의해 시각측정되었다. 그리고, dRNA-계 RNA 레플리콘 TMV420은 헬퍼 바이러스 TMV183F에 의한 동시-접종에 의해 엔. 실베스트리스에서 시험하였다. TMV420의 복제는 노던 블롯 하이브리드화에 의해 나타났다. 접종된 엔. 실베스트리스의 잎내 GFP 단백질의 발현은 UV 조명 및 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 시각측정되었다.
실시예 8
TMV 헬퍼 바이러스에 의해 동시-접종된 RNA 레플리콘을 사용한 GFP 리포터 단백질의 조직발현
TMV420 RNA 레플리콘 및 헬퍼 바이러스 TMV183F에 의해 동시-접종된 엔. 벤타미아나 식물은 TMV183F 및 TMV420 RNA 레플리콘에 의한 식물세포의 조직감염을 나타냈다. 엔. 벤타미아나 식물을 TMV183F 및 TMV420의 시험관내 전사물에 의해 동시-접종된 담배 원형질체의 분해물로부터 제조된 비리온에 의해 접종하고 20시간 배양하였다. 접종후 6 내지 7일후에, GFP 리포터 단백질의 형광성은 장파 UV 조명에 의해 접종된 잎에서 발견할 수 있었다. UV 광 아래의 녹색형광인 조직은 노던블롯팅에 의해 추가로 분석하여 헬퍼 바이러스 TMV183F 및 RNA 레플리콘 TMV420으로부터의 게놈 RNA의 존재를 확인하였다. GFP 단백질 발현은 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 확인하였다. TMV183F 및 TMV420에 의해 동시-접종된 식물의 상부잎, 비-접종잎, 증후를 나타내는 잎 중 일부는 장파 UV 조명하에 녹색 형광인 영역을 발생시켰다. TMV183F에 의해서만 접종된 식물이 TMV183F 및 TMV420에 의해 동시-접종된 식물과 동일한 조직증상을 나타냈지만, TMV183F에 의해서만 접종된 식물은 어느것도 접종된 잎 또는 상부의 조직감염된 잎에서 녹색 형광을 가지지 않았다.
실시예 9
TMV 헬퍼 바이러스에 의해 동시-접종된 RNA 레플리콘을 사용한 다수 외래서열의 발현
다수 RNA 또는 단백질을 발현하기 위한 바이러스-계 다성분의 가능성을 입증하기위해, 헬퍼 바이러스로서 TB2-GUS 및 RNA 레플리콘으로서 TMVΔCla/152/C3O3에 의해 동시-접종되었다. TB2-GUS는 박테리아 β-글루쿠로니다제(GUS) 유전자, 비-네이티브 추가의 서브게놈 mRNA 프로모터 및 ORSV로부터의 코트단백질을 발현하는 TMV-계 이중 서브게놈 mRNA 프로모터 벡터이다. 20hpi 및 40hpi에서, GFP 및 GUS 단백질의 동시발현에 대해 원형질체를 분석하였다. GFP 발현은 녹색의 GFP-발현 세포를 발견하기 위해 형광현미경으로 관찰하였다.
GUS의 발현을 발견하기 위해, GFP 발현에 대해 분석된 세포의 유사 분취량을 기질 5-브로모-4-클로로-3-인도일-β-D-글루쿠로니드의 존재하에 37℃에서 배양하였다. TB2-GUS 및 TMVΔCla/152/C3O3에 의해 접종된 원형질체로부터의 샘플만 GFP및 GUS 발현에 대해 포지티브였다. RNA 샘플을 20hpi에서 채취하여 노던 블롯 하이브리드화에 의해 분석하였다. 노던 블롯팅으로 인해, 헬퍼 바이러스 TB2-GUS 및 RNA 레플리콘 TMVΔCla/152/C3O3 게놈 RNA 모두의 복제를 발견하였다. 그리고, GFP-특이성 하이브리드화는 GFP 서브게놈 RNA의 존재를 보여주었다. 본 실시예는 다성분 RNA 벡터 시스템에서 외래 RNA 또는 단백질을 발현하는데 있어서 우수한 융통성과 안정성을 제공하는 RNA 레플리콘내에 뿐만 아니라 헬퍼 바이러스내에 외래 RNA 또는 단백질이 포함된다는 것을 입증한다.
본 발명은 본 발명의 바람직한 구체예의 상세한 설명을 참고로 하여 기재되지만, 상기 기재가 제한의 의미보다는 상술의 의미이며, 본 발명의 정신 및 첨부된 청구의 범위의 범주내에서 당업자에 의해 쉽게 변형될 수 있을 것이다.
Claims (62)
- 적어도 하나의 RNA 레플리콘은 (1)5' NTR, (2)RNA 바이러스로부터 본래의 비구조 단백질 또는 그의 절편의 오픈 리딩 프레임에 상동인 오픈 리딩 프레임, (3)상기 RNA 바이러스에 비네이티브인 적어도 하나의 서열 및 (4)3' NTR로 이루어지는, RNA 바이러스에서 유도된 하나 이상의 RNA 레플리콘과, 적어도 하나의 헬퍼 바이러스는 RNA 레플리콘의 복제에 영향을 주는 하나 이상의 헬퍼 RNA 바이러스로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘의 3' NTR은 적어도 하나의 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 네이티브인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘의 3' NTR은 특정 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 비네이티브인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘의 3' NTR은 두개 이상의 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR의 하이브리드인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 또한 적어도 하나의 서브게놈 mRNA 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 5 항에 있어서,상기 서브게놈 mRNA 프로모터는 적어도 하나의 RNA 바이러스에 네이티브인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 6 항에 있어서,상기 네이티브 서브게놈 mRNA 프로모터는 적어도 하나의 RNA 바이러스의 코트 단백질에 대한 프로모터인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 7 항에 있어서,상기 서브게놈 mRNA 프로모터는 상기 RNA 바이러스에 대해 비네이티브인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 적어도 하나의 RNA 바이러스로부터 본래의 코트 단백질 또는 그의 절편의 오픈 리딩 프레임에 상동인 오픈 리딩 프레임을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 상기 RNA 바이러스에 비네이티브인 코트 단백질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 적어도 하나의 RNA 바이러스로부터 본래의 이동 단백질 또는 그의 절편의 오픈 리딩 프레임에 상동인 오픈 리딩 프레임을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 상기 RNA 바이러스에 비네이티브인 이동 단백질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 추가적으로 조합의 기원(origin of assembly)을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 적어도 하나의 내부 리보솜 개시자리를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,적어도 하나의 RNA 바이러스는 포지티브-가닥 ssRNA 바이러스인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 15 항에 있어서,상기 포지티브-가닥 ssRNA는 포티바이러스, 토바모바이러스, 브로모바이러스, 카모바이러스, 포텍스바이러스, 클로스테로바이러스, 비모바이러스 및 호데이바이러스로 이루어진 식물 바이러스 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 포지티브-가닥 ssRNA.
- 제 15 항에 있어서,상기 포지티브-가닥 ssRNA 바이러스는 알파바이러스, 폴리오바이러스 및 리노바이러스로 이루어진 동물 바이러스 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 포지티브-가닥 ssRNA.
- 제 16 항에 있어서,상기 포지티브-가닥 ssRNA 바이러스는 담배 모자이크 바이러스인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)토바모바이러스의 5' NTR에 네이티브인 5' NTR, (2)상기 토바모바이러스에서 본래의 비구조 단백질 또는 그의 절편의 오픈 리딩 프레임에 상동인 오픈 리딩 프레임, (3)서브게놈 mRNA 프로모터, (4)상기 토바모바이러스에 대해 비네이티브인 서열 및 (5)적어도 하나의 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 19 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)담배 모자이크 바이러스의 5' 말단에서 약 1340 누클레오티드에 상동인 서열, (2)서브게놈 mRNA 프로모터, (3)상기 담배 모자이크 바이러스에 비네이티브인 서열 및 (4)적어도 하나의 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 19 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)담배 모자이크 바이러스의 5' NTR에 네이티브인 5' NTR, (2)상기 담배 모자이크 바이러스에서 본래의 비구조 단백질 또는 그의 절편의 오픈 리딩 프레임에 상동인 오픈 리딩 프레임, (3)서브게놈 mRNA 프로모터, (4)상기 담배 모자이크 바이러스에 비네이티브인 서열 및 (5)적어도 하나의 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 21 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)담배 모자이크 바이러스의 5' NTR에 네이티브인 5' NTR, (2)상기 담배 모자이크 바이러스에서 본래의 126kDa 비구조 단백질의 오픈 리딩 프레임, (3)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질에 대한 서브게놈 mRNA 프로모터에 네이티브인 서브게놈 mRNA 프로모터, (4)상기 담배 모자이크 바이러스에 비네이티브인 서열 및 (5)적어도 하나의 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 22 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)담배 모자이크 바이러스의 5' NTR에 네이티브인 5' NTR, (2)상기 담배 모자이크 바이러스의 본래의 126kDa 비구조 단백질의 오픈 리딩 프레임, (3)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질에 대한 서브게놈 mRNA 프로모터에 네이티브인 서브게놈 mRNA 프로모터, (4)담배 모자이크 바이러스에 비네이티브인 서열, (5)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질의 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에서 약 100개의 누클레오티드에 상동인 서열 및 (6)적어도 하나의 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 22 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)담배 모자이크 바이러스의 5' NTR에 네이티브인 5' NTR, (2)상기 담배 모자이크 바이러스의 본래의 126kDa 비구조 단백질의 오픈 리딩 프레임, (3)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질에 대한 서브게놈 mRNA 프로모터에 네이티브인 서브게놈 mRNA 프로모터, (4)담배 모자이크 바이러스에 비네이티브인 서열, (5)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질의 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에서 약 200개의 누클레오티드에 상동인 서열 및 (6)적어도 하나의 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 22 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)담배 모자이크 바이러스의 5' NTR에 네이티브인 5' NTR, (2)상기 담배 모자이크 바이러스의 본래의 126kDa 비구조 단백질의 오픈 리딩 프레임, (3)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질에 대한 서브게놈 mRNA 프로모터에 네이티브인 서브게놈 mRNA 프로모터, (4)담배 모자이크 바이러스에 비네이티브인 서열, (5)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질의 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에서 약 300개의 누클레오티드에 상동인 서열 및 (6)적어도 하나의 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)토바모바이러스의 5' NTR에 네이티브인 5' NTR, (2)상기 토바모바이러스에서 본래의 비구조 단백질 또는 그의 절편의 오픈 리딩 프레임에 상동인 오픈 리딩 프레임, (3)서브게놈 mRNA 프로모터, (4)상기 토바모바이러스에 비네이티브인 서열 및 (5)상기 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 비네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 26 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)담배 모자이크 바이러스의 5' 말단에서 약 1340 누클레오티드에 상동인 서열, (2)서브게놈 mRNA 프로모터, (3)상기 담배 모자이크 바이러스에 비네이티브인 서열 및 (4)상기 헬퍼 RNA 바이러스에 3'NTR에 비네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 26 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)담배 모자이크 바이러스의 5' NTR에 네이티브인 5' NTR, (2)상기 담배 모자이크 바이러스에서 본래의 비구조 단백질 또는 그의 절편의 오픈 리딩 프레임에 상동인 오픈 리딩 프레임, (3)서브게놈 mRNA 프로모터, (4)상기 담배 모자이크 바이러스에 비네이티브인 서열 및 (5)상기 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 비네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 28 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)담배 모자이크 바이러스의 5' NTR에 네이티브인 5' NTR, (2)상기 담배 모자이크 바이러스의 본래의 126kDa 비구조 단백질의 오픈 리딩프레임, (3)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질에 대한 서브게놈 mRNA 프로모터에 상동인 서브게놈 mRNA 프로모터, (4)상기 담배 모자이크 바이러스에 비네이티브인 서열 및 (5)상기 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 비네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 29 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)담배 모자이크 바이러스의 5' NTR에 네이티브인 5' NTR, (2)상기 담배 모자이크 바이러스의 본래의 126kDa 비구조 단백질의 오픈 리딩 프레임, (3)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질에 대한 서브게놈 mRNA 프로모터에 네이티브인 서브게놈 mRNA 프로모터, (4)담배 모자이크 바이러스에 비네이티브인 서열, (5)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질의 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에서 약 100개의 누클레오티드에 상동인 서열 및 (6)상기 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 비네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 29 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)담배 모자이크 바이러스의 5' NTR에 네이티브인 5' NTR, (2)상기 담배 모자이크 바이러스의 본래의 126kDa 비구조 단백질의 오픈 리딩 프레임, (3)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질에 대한 서브게놈 mRNA 프로모터에 네이티브인 서브게놈 mRNA 프로모터, (4)담배 모자이크 바이러스에 비네이티브인 서열, (5)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질의 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에서 약 200개의 누클레오티드에 상동인 서열 및 (6)상기 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 비네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 29 항에 있어서,상기 RNA 레플리콘은 (1)담배 모자이크 바이러스의 5' NTR에 네이티브인 5' NTR, (2)상기 담배 모자이크 바이러스의 본래의 126kDa 비구조 단백질의 오픈 리딩 프레임, (3)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질에 대한 서브게놈 mRNA 프로모터에 네이티브인 서브게놈 mRNA 프로모터, (4)담배 모자이크 바이러스에 비네이티브인 서열, (5)담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질의 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에서 약 300개의 누클레오티드에 상동인 서열 및 (6)상기 헬퍼 RNA 바이러스의 3' NTR에 비네이티브인 3' NTR로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 헬퍼 RNA 바이러스는 포지티브-가닥 ssRNA 바이러스에서 유도되는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 33 항에 있어서,상기 포지티브-가닥 ssRNA 바이러스는 포티바이러스, 토바모바이러스, 브로모바이러스, 카모바이러스, 포텍스바이러스, 클로스테로바이러스, 비모바이러스 및 호데이바이러스로 이루어진 식물 바이러스 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는시스템.
- 제 33 항에 있어서,상기 포지티브-가닥 ssRNA 바이러스는 알파바이러스, 폴리오바이러스 및 리노바이러스로 이루어진 동물 바이러스 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,적어도 하나의 헬퍼 RNA 바이러스 및 적어도 하나의 RNA 레플리콘이 같은 바이러스원에서 유도되는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 헬퍼 RNA 바이러스는 상기 RNA 레플리콘에 비네이티브인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항에 있어서,상기 헬퍼 RNA 바이러스는 헬퍼 RNA 바이러스의 야생형보다 더 효율적으로 RNA 레플리콘의 복제에 유효하도록 변형되는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 38 항에 있어서,상기 변형된 헬퍼 RNA 바이러스가 포지티브-가닥 ssRNA 바이러스에서 유도되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 39 항에 있어서,상기 포지티브-가닥 ssRNA 바이러스는 포티바이러스, 토바모바이러스, 브로모바이러스, 카모바이러스, 포텍스바이러스, 클로스테로바이러스, 비모바이러스 및 호데이바이러스로 이루어진 식물 바이러스 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 39 항에 있어서,상기 포지티브-가닥 ssRNA 바이러스는 알파바이러스, 폴리오바이러스 및 리노바이러스로 이루어진 동물 바이러스 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 40 항에 있어서,상기 변형된 헬퍼 RNA 바이러스가 담배 모자이크 바이러스에서 유도되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 40 항에 있어서,상기 변형된 헬퍼 RNA 바이러스가 오돈토글로섬 링스팟바이러스(Odontoglossumringspot virus)에서 유도되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 42 항에 있어서,상기 헬퍼 RNA 바이러스가 담배 모자이크 바이러스의 서프레스 정지 코돈에서 변형되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 44 항에 있어서,상기 정지코돈이 하나 이상의 해독가능한 코돈으로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 45 항에 있어서,상기 해독가능한 코돈이 티로신, 페닐알라닌 및 세린을 코딩하는 코돈으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 44 항에 있어서,상기 정지코돈이 코딩 서열에서 결실되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 38 항에 있어서,상기 헬퍼 RNA 바이러스의 코트 단백질 오픈 리딩 프레임이 비네이티브 코트 단백질 오픈 리딩 프레임으로 치환되어 헬퍼 RNA 바이러스가 변형되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 38 항에 있어서,상기 헬퍼 RNA 바이러스의 코트 단백질 오픈 리딩 프레임이 제거되어 헬퍼 RNA 바이러스가 변형되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 38 항에 있어서,상기 헬퍼 RNA 바이러스의 이동 단백질 오픈 리딩 프레임이 비네이티브 이동 단백질 오픈 리딩 프레임으로 치환되어 헬퍼 RNA 바이러스가 변형되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 38 항에 있어서,상기 헬퍼 RNA 바이러스의 이동 단백질 오픈 리딩 프레임이 제거되어 헬퍼 RNA 바이러스가 변형되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 38 항에 있어서,상기 헬퍼 RNA 바이러스에 비네이티브인 제2 서브게놈 mRNA 프로모터가 첨가되어 헬퍼 RNA 바이러스가 변형되는 것을 특징으로 하는 변형된 헬퍼 RNA 바이러스.
- 제 1 항에 있어서,적어도 하나의 헬퍼 RNA 바이러스가 헬퍼 RNA 바이러스에 대해 비네이티브인 서열을 포함하도록 변형되는 것을 특징으로 하는 시스템.
- (a)RNA 바이러스에서 유도된 하나 이상의 RNA 레플리콘을 수득하고, 여기서 적어도 하나의 RNA 레플리콘은 (1)5' NTR, (2)RNA 바이러스로부터 본래의 비구조 단백질 또는 그의 절편의 오픈 리딩 프레임에 네이티브인 오픈 리딩 프레임, (3)상기 RNA 바이러스에 비네이티브인 적어도 하나의 서열 및 (4)3' NTR로 이루어지며;(b)적어도 하나의 헬퍼 바이러스는 RNA 레플리콘의 복제에 영향을 주는 하나 이상의 헬퍼 바이러스를 수득하고; 및(c)하나 이상의 RNA 레플리콘 및 하나 이상의 헬퍼 RNA 바이러스를 함께 접종시키는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물에서 RNA 또는 단백질을 제조하는 방법.
- (a)RNA 바이러스에서 유도된 하나 이상의 RNA 레플리콘을 수득하고, 여기서 적어도 하나의 RNA 레플리콘은 (1)5' NTR, (2)RNA 바이러스로부터 본래의 비구조 단백질 또는 그의 절편의 오픈 리딩 프레임에 네이티브인 오픈 리딩 프레임, (3)상기 RNA 바이러스에 비네이티브인 적어도 하나의 서열 및 (4)3' NTR로 이루어지며;(b)적어도 하나의 헬퍼 RNA 바이러스는 RNA 레플리콘의 복제에 영향을 주고, 적어도 하나의 헬퍼 RNA 바이러스는 헬퍼 RNA 바이러스에 비네이티브인 서열을 포함하는 하나 이상의 헬퍼 RNA 바이러스를 수득하고; 및(c)하나 이상의 RNA 레플리콘 및 하나 이상의 헬퍼 RNA 바이러스를 함께 접종시키는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물에서 RNA 또는 단백질을 제조하는 방법.
- 제 54 항 또는 제 55 항에 있어서,적어도 하나의 RNA 레플리콘이 내부 접종에 의해서 전달되는 것을 특징으로 하는 식물에서 RNA 또는 단백질을 제조하는 방법.
- 제 54 항 또는 제 55 항에 있어서,적어도 하나의 헬퍼 RNA 바이러스가 내부 접종에 의해서 전달되는 것을 특징으로 하는 식물에서 RNA 또는 단백질을 제조하는 방법.
- 제 54 항 또는 제 55 항의 방법에 따라 접종되는 것을 특징으로 하는 숙주식물.
- 제 54 항 또는 제 55 항의 방법에 따라 제조되는 것을 특징으로 하는 RNA 생성물.
- 제 54 항 또는 제 55 항의 방법에 따라 제조되는 것을 특징으로 하는 비네이티브 단백질 생성물.
- 제 54 항 또는 제 55 항의 방법에 따라 제조되는 것을 특징으로 하는 비네이티브 펩티드 생성물.
- 제 1 항의 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물숙주.
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