KR20010079907A

KR20010079907A - 바이러스 감염 및 관련 질병의 치료 및 예방 방법

Info

Publication number: KR20010079907A
Application number: KR1020017003734A
Authority: KR
Inventors: 씨 영도로씨; 알 베일리토마스
Original assignee: 비로파마 인코포레이티드
Priority date: 1998-09-25
Filing date: 1999-09-24
Publication date: 2001-08-22
Also published as: BR9913935A; US6316492B1; WO2000018231A1; CA2345347A1; EP1115286A4; EP1115286A1; AU6161999A; AU751457B2; JP2002525295A; CN1324212A

Abstract

본 발명은 바이러스 감염 및 그러한 감염과 관련한 질병의 치료 및 예방 방법에 관한 것이다.

Description

바이러스 감염 및 관련 질병의 치료 및 예방 방법{METHODS FOR TREATING OR PREVENTING VIRAL INFECTIONS AND ASSOCIATED DISEASES}

플라비비리다에 과는 3개의 속 및 현재 특정 속(genus)으로 배정되지 않은 몇몇 바이러스로 구성된다. 헤파시바이러스(hepacivirus) 속은 간염 C 바이러스 (HCV)를 포함한다. 몇몇 바이러스, 예를 들어, GB 바이러스-A 및 GB 바이러스-A-류 약물, GB 바이러스-D 및 GBV-C 또는 간염 G 바이러스 등은 현재 공식적으로 헤파시바이러스 속에 속하는 것으로 분류되지는 않지만, HCV와 매우 관련되며, 플라비비리다에 과의 비배정 구성원으로 표현된다. 또한, 플라비비리다에 과에는 소과 바이러스성 설사 바이러스(bovine viral diarrhea virus: BVDV), 경계성 질병 바이러스(border disease virus) 및 전형적인 돼지 발열 바이러스(swine fever virus) 등을 포함하는 페스티바이러스 속, 및 뎅그열(dengue), 황색열(yellow fever), 일본 뇌염(Japanese encephalitis) 및 참진드기-운반 뇌염 바이러스(tick-borne encephalitis virus) 등의 바이러스를 포함하는 플라비바이러스 속이 있다.

이들 과에 속하는 바이러스는 인간 및 동물 개체군에 상당한 질병을 야기한다. HCV는 세계적으로 인간 간염의 주요 원인이 되고 있다. 세계 보건 기구 (World Health Organization)는 세계적으로 1억 7천만 인구가 현재 바이러스에 감염되어 있다고 추정한다. 대부분의 감염은 지속되며, 약 60%의 경우는 만성적 간 질환으로 발전된다. 만성적 HCV 감염은 경변, 간세포성 암종 및 간기능 부전의 발병을 유발할 수 있다.

미국에서는 인터페론(interferon) 및 리바비린(ribavirin)과 배합된 인터페론을 HCV에 의한 간염용으로 사용한다. 이러한 치료는 몇몇 환자에 있어서 개선된 혈청 효소 반응과 관련된다. 나머지는 치료에 대하여 반응을 나타내지 않는다. 응답자에 있어서, 지속된 임상적 개선은 단지 낮은 %의 환자에게서만 나타나고, 환자의 대부분은 치료를 중단하면 병이 재발한다. 따라서, 만성적 감염 C에 대한 치료의 유효성은 가변적이며, 그 치료율은 낮다. 또한, 치료는 종종 상당한 역효과와 관련된다.

가축의 페스티바이러스 감염은 세계적으로 상당한 경제적 손실을 야기한다. 페스티바이러스는 유산, 기형 발생, 호흡 작용의 문제, 만성 소모성 질병, 면역 시스템 기능장애 및 2차 바이러스 및 박테리아 감염에 대한 질병 소인 (predisposition)을 비롯한 일련의 임상적 증상을 야기한다. 일정 BVDV 변형은 급성 불치병을 야기한다. BVDV는 또한 지속적 감염(PI) 동물이 일생 동안 바이러스혈증 상태로 남아있고, 계속해서 바이러스의 숙주로서 기능하도록 할 수 있다. PI 동물은 종종 치명적 점막 질병으로 죽는다.

플라비바이러스는 인간의 중요한 병원체이며, 또한 전세계에 널리 퍼져 있다. 인간의 질병과 관련된 38종 이상의 플라비바이러스가 있는데, 이에는 뎅그열 바이러스, 황색열 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스 등이 있다. 플라비바이러스는 일련의 급성 열병 및 뇌염 및 출혈성 질병을 야기한다.

현재, 페스티바이러스 또는 플라비바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 항바이러스제가 없다.

플라비비리다에 과의 바이러스에 의한 감염 및 질병에 대한 새로운 치료법 및 예방법이 명백히 필요하다.

바이러스에 의한 감염 및 관련 질병의 진단, 제어, 예방 및 치료에 대한 접근법을 고려함에 있어서, 그러한 접근법에 이용될 수 있는 바이러스-특이적 기능을 확인하는 것이 종종 바람직하다. 특히, 바이러스-암호화 폴리펩티드의 효소 활성은 매우 유용하다. 이들 바이러스-특이적 성분은 종종 바이러스 복제를 위하여 필수적이며, 항바이러스제 발견 전략에 있어서 적당한 표적일 수 있다.

많은 RNA 바이러스의 라이프 사이클에 있어서 중심적 역할을 하는 그러한 표적의 하나가 바이러스-암호화 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제(RdRp) 단백질이다. 플라비비리다에 과의 바이러스에 관하여, 상기 단백질은 헤파시바이러스 및 페스티바이러스의 경우에는 NS5B로 호칭되며, 플라비바이러스의 경우에는 NS5로 호칭된다(총괄적으로는 NS5로 언급됨). RdRp 단백질은 바이러스 레플리카아제 복합체의 주요 성분이며, 바이러스가 그의 RNA 게놈을 복제하여 자손 바이러스를 생성하도록 할 수 있다. RNA 바이러스의 RdRp는 항바이러스제 개발에 있어서 흥미로운 표적이다.

본 발명은 바이러스 감염 및 그러한 감염과 관련한 질병, 특히 플라비비리다에 과(Flaviviridae family)에 속하는 바이러스에 의한 바이러스 감염 및 관련 질병의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.

발명의 요약

본 발명에 따라, 바이러스 감염 및 그와 관련한 질병을 지닌 살아있는 숙주(host)에게 하기 화학식(1)의 화합물 또는 그 전구체, 및 상기 화합물의 이성체 및 약학적 허용염 치료 유효량을 투여함에 의하여 상기 숙주의 상기 바이러스 감염 및 그와 관련한 질병을 치료하는 방법을 제공한다:

상기 식에서,

W는 O, S 또는 N(R_a)를 나타내고, 여기에서, R_a는 수소 또는 탄소수 1∼5의 알킬기이며;

X, Y 및 Z는 동일하거나 상이할 수 있고, 이들 각각은 수소, 또는 할로겐, 니트로, 카복시, 하이드록시, 탄소수 1∼5의 알킬, 트리플루오로메틸, 알콕시, 아실옥시, 시아노, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 설폰아미도, 카복스아미도, 카브알콕시, 티오, 알킬티오, 알킬설피닐 및 알킬설포닐로 구성된 군으로부터 선택되는 치환체를 나타내며;

R₁은 비치환되거나 치환된 헤테로사이클기, 비치환되거나 치환된 바이사이클 고리 부분, 비치환되거나 치환된 페닐(C₆H₅)기, 비치환되거나 치환된 바이페닐(C₆H₅-C₆H₄)기, 비치환되거나 치환된 ω-페닐알케닐(C₆H₅(CH=CH)_n)기[여기에서, n은 1 내지 5의 정수임], 예를 들어, 페닐에테닐, 비치환되거나 치환된 ω-페닐알키닐 (C₆H₅(C≡C)_p)기[여기에서, p는 1 내지 5의 정수임], 또는 비치환되거나 치환되고 직쇄이거나 분지쇄일 수 있는 탄소수 1∼5의 알킬기로 구성된 군으로부터 선택되는 라디칼을 나타내고, 여기에서, 상기 헤테로사이클기는 퓨란, 티오펜, 옥사졸, 옥사디아졸, 피리딘, 피리미딘, 피라졸, 트리아졸, 피리다진, 1,3-옥사티올란, 티아졸, 티아디아졸, 이미다졸, 피롤, 테트라졸 및 트리아진으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 바이사이클 고리 부분은 벤조퓨란, 이소벤조퓨란, 벤조티오펜, 이소벤조티오펜, 벤족사졸, 벤조피롤(인돌), 이소인돌, 벤즈피라졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 1,2-벤조디아진, 1,3-벤조디아진, 1,2,3-벤조트리아졸, 벤조티아졸, 벤즈이미다졸, 1,2,3-벤조트리아진 및 1,2,4-벤조트리아진으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 헤테로사이클기 및 바이사이클 고리 부분 치환체는 탄소수 1∼5의 알킬, 할로겐, 알콕시, 하이드록시, 니트로 또는 비치환되거나 치환된 페닐기로 구성된 군으로부터 선택되며; 상기 페닐기 치환체, 바이페닐기 치환체, ω-페닐알케닐기 치환체 및 ω-페닐알키닐기 치환체는 할로겐, 니트로, 카복시, 하이드록시, 탄소수 1∼5의 알킬, 트리플루오로메틸, 알콕시, 아실옥시, 시아노, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 설폰아미도, 카복스아미도, 카브알콕시, 티오, 알킬티오, 알킬설피닐 및 알킬설포닐로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이고; 상기 알킬기 치환체는 카복시, 하이드록시, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 티오 또는 알킬티오로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.

상기 화학식(1)에 있어서, 상기 헤테로사이클기, 바이사이클 고리 부분, 페닐기, 바이페닐기 등의 치환체는 또한 퍼할로알킬, 디할로알킬, 모노할로알킬일 수 있고, 상기 헤테로사이클기 및 바이사이클 고리 부분은 또한 카복시, 카브알콕시, 설포, 설포네이트(즉, 설폰산 에스테르) 티오, 알킬티오, 알킬설피닐 또는 알킬설포닐 치환체로 치환될 수 있다.

상기 화합물은 바이러스 감염 및 그와 관련한 질병에 대한 감수성을 지닌 숙주에게 상기 화합물 또는 그 전구체 예방 유효량을 투여함에 의하여 상기 감수성 숙주의 상기 바이러스 감염 및 그와 관련한 질병을 예방하는데 사용할 수도 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 방법에 사용하는 화합물은 하기에 도시하는 일반적 합성 도식에 따라 공지된 출발 물질로부터 편리하게 제조할 수 있다.

본 발명의 실시에 사용할 수 있는 특정 항-헤파시바이러스 화합물의 제조법을 하기에 예시한다.

상기 일반적 합성 도식을 수행함에 있어서, 적당한 치환된 2-머캅토벤조산 또는 O-티오산 또는 이미드산 동족체[여기에서, X, Y 및 Z는 전술한 정의와 같고, 공지 문헌의 방법에 따라 제조됨]와 에틸 아세토아세테이트 및 촉매량의 진한 황산을 45∼50℃에서 반응시켜 치환된 벤조티오페논을 수득한다. 예를 들어, 문헌 [Craik and Macbeth, J. Chem. Soc., 127: 1638 (1925); Smiles and McClelland, J. Chem. Soc., 119: 1813 (1921): 및 Hutchison and Smiles, J. Chem. Soc., 101: 573 (1912)]를 참조하라. 별법으로서, 티오노벤조티오펜 동족체는 반응 매질로 벤젠을 사용하여 머큐릭 옥사이드의 존재하에 적당한 벤조티오펜과 요오드를 반응시킴으로써 3-요오도벤조티오펜을 수득하고, 요오드의 존재하에 마그네슘 및 황과 추가로 반응시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ghaisas and Tilak, J. Sci. Ind. Res., 16B: 345-46 (1957)]을 참조하라. 이미노벤조티오펜은 동일한 3-요오도벤조티오펜을 암모니아수로 처리함으로써 제조할 수 있다. 마지막으로 언급된 두개의 중간체는 토토머 형태로 존재할 수 있다. 이들 중간체는 염기로서 피페리딘의 존재하에 다양한 알데히드 중 임의의 1종과 반응시켜 소정 생성물을 제공할 수 있다. 여기에서, R₁은 전술한 정의와 같다.

본 발명의 실시에 유용한 기타 화합물은 상기 반응 도식에서 출발물질을 적당하게 치환하여 유사한 방법으로 제조할 수 있다.

생체외 연구들은 항바이러스제로서 본 명세서에 기술된 화합물의 유용성을증명하여 주었다. 항바이러스 활성은 RNA 합성에 대한 효소학적 분석에 있어서 바이러스 RaRp에 대한 그 화합물의 억제 활성에 의하여 측정하였다.

상기 화학식(1)의 가능한 모든 이성체는 본 발명의 범위 안에 있다. 그러한 이성체의 대표적인 예에는 시스 및 트랜스 이성체가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 사용된 용어 "알킬"은 탄소 원자 길이 1 내지 5의 지방족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 유사하게, 알콕시, 알킬아미노 등과 같은 치환체를 가리키는 관련 형태에서 사용되는 용어 "알킬" 또는 그 임의의 변형체도 탄소 원자 길이 1 내지 5의 지방족 탄화수소 라디칼을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "카복스아미도"는 화학식 -C(=O)-NR''R'''[여기에서, R'' 및 R'''은 수소 또는 알킬을 나타냄]의 라디칼 또는 치환체를 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "설폰아미도"는 화학식 -SO₂NR''R''' 또는 -NR''-SO₂R'''[여기에서, R'' 및 R'''은 전술한 정의와 같음]의 라디칼 또는 치환체를 의미한다.

본 발명의 실시에 특히 유용한 화합물(그 이성체 형태 포함)은 하기 화학식(2)의 화합물, 및 그 이성체 및 약학적 허용 염이다:

상기 식에서,

W, X, Y 및 Z는 전술한 정의와 같고, W'는 -O-, -S- 또는 N(R_b)를 나타내며, 여기에서, R_b는 수소 또는 탄소수 1∼5의 알킬이고, R₂는 H, 또는 비치환되거나 치환된 페닐을 나타내며, 여기에서, 상기 페닐 치환체는 할로겐, 니트로, 카복시, 하이드록시, 탄소수 1∼5의 알킬, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 아실옥시, 알콕시, 시아노, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 설폰아미도, 카브알콕시, 티오, 알킬티오, 알킬설피닐, 알킬설포닐 또는 카복스아미도로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이다. 화학식(2)에서 R₂는 또한 설포 치환체일 수 있다.

상기 화학식(1) 및 화학식(2)의 화합물 및 그 약학적 허용 염은 항바이러스 활성을 나타낸다. 본 발명의 방법은 플라비비리다에 과의 바이러스에 대하여 특히 효과적이고, 살아있는 숙주에 있어서 이러한 바이러스에 의한 감염 및 그와 관련한 질병의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

또한, 본 발명의 화합물 또는 그의 전구체(예, 프로드러그) 및 그의 약학적 허용 염은, 인터페론, 리바비린, 프로테아제 억제제, 면역글로불린, 면역조절제, 간보호제, 항-염증제, 항생제, 항바이러스제, 항-감염제 등을 비롯한 보조 활성제(단, 상기 예에 한정되는 것은 아님)와 혼합하여 사용할 때, 살아있는 숙주의 바이러스 감염 및 질병의 치료 및 예방에 유용하다.

본 명세서에 기술한 화합물은 세포, 조직 또는 기관 배양 및 기타 생체외 적용에 있어서의 바이러스 감염을 예방 또는 분해하는 데 또한 유용하다. 예를 들어, 세포 또는 조직 배양 성장 매질 및 세포 또는 조직 배양 성분 중의 보충물로서 본 발명의 화합물을 함유시키면 바이러스로 이미 감염되어 있지 않은 배양물의 바이러스 감염 또는 오염을 막을 수 있다. 상기 기술된 화합물은, 당업자에 의하여 결정된 임의의 수의 처리 조건하에 적당한 처리 기간 후, 바이러스로 감염 또는 오염된 배양물 또는 기타 생물학적 물질(예, 혈액)로부터 바이러스를 제거하는 데 또한 사용할 수 있다.

염기성 치환체를 함유하는 것과 같은 본 발명의 방법에 사용하는 화합물의 일부는 다양한 무기 및 유기산과 유용한 염을 형성할 수 있다. 여기에서, 무기 및 유기산에는 염산 또는 아세트산 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 산성 기능기를 함유하는 것과 같은 본 발명의 방법에 사용하는 화합물의 일부는 무기 및 유기 염기와 염을 형성할 수 있다. 여기에서, 무기 및 유기 염기에는 알칼리 금속 하이드록사이드, 알칼리 토금속 하이드록사이드, 피페리딘, 암모늄 하이드록사이드, 트리에틸아민 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

화학식(1) 및 화학식(2) 화합물의 약학적 허용 염은 당업자에게 익숙한 방법에 따라 제조한다.

본 발명의 방법에 사용하는 항바이러스성 약학 조성물은 약학적 허용 담체 매질 또는 보조제와 함께 활성 성분으로서 상기 화학식(1) 또는 화학식(2)의 화합물 1종 이상을 포함하며, 선택적으로 보조 활성제 1종 이상을 포함한다.

상기 조성물은 정제, 캐플릿, 환제 또는 당의정을 비롯한 다양한 제형으로 제조할 수 있고, 또는 캅셀과 같은 적당한 용기에 충진할 수 있으며, 또는 현탁제의 경우에는 병에 충진할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "약학적 허용 담체 매질"은 소정의 특정 제형에 적당한 임의의 모든 용매, 희석제 또는 기타 액체 비히클, 분산 보조제 또는 현탁 보조제, 계면 활성제, 등장제, 증점제 또는 에멀션화제, 방부제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함한다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, E.W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, PA, 1975)]은 약학적 조성물을 제형화하는 데 사용하는 다양한 담체 및 그 제조를 위한 공지된 기법을 공개한다. 본 발명의 실시에 사용하는 항바이러스성 화합물과 함께 사용하기에 부적합한 담체 매질, 예를 들어, 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성시키거나, 또는 상기 약학 조성물의 기타 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용하는 담체 매질을 제외한 통상의 담체 매질의 사용은 본 발명의 범위 안에 있는 것으로 이해된다.

본 발명의 약학 조성물에 있어서, 활성 약물은 담체 매질 및/또는 보조 활성제(사용하는 경우)를 포함하는 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.5 중량% 이상 및 일반적으로 90 중량% 이하의 양으로 존재할 수 있다. 활성 약물의 비율은 조성물의 중량을 기준으로 하여 2 내지 50 중량% 사이에서 변화시키는 것이 바람직하다.

장내 투여 또는 비경구 투여용으로 적당한 유기 또는 무기의 고체 또는 액체 약학적 담체 매질을 사용하여 상기 조성물을 제조할 수 있다. 젤라틴, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 식물성 지방, 동물성 지방, 식물성 오일, 동물성 오일, 고무, 폴리알킬렌 글리콜, 또는 기타 의약용으로 공지된 담체 또는 부형제는 담체 매질 또는 부형제로서 모두 적당할 수 있다.

전술한 화합물은 바이러스의 감염성을 약화시키는데 효과적인 임의의 투여량 및 임의의 투여 경로를 이용하여 투여할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용된 "바이러스의 감염성을 약화시키는데 유효한 양"이라는 표현은 바이러스 감염의 소정 치료를 제공하기에 충분한 항바이러스제의 양, 그러나 비독성인 양을 의미한다. 필요한 정확한 양은 피검체에 따라 달라지며, 개개 환자의 종(species), 연령 및 일반적 증상, 감염의 심각도, 특정 항바이러스제 및 그의 투여 모드 등에 따라 달라진다.

항바이러스 화합물은 용이한 투여 및 균일한 투여 용량을 위한 단위 제형으로 제형화는 것이 바람직하다. 본 명세서에 사용된 "단위 제형"이란 치료될 환자에게 적절한 항바이러스제의 물리적 분리 단위를 의미한다. 각각의 제형은 소정 치료 효과를 제공하도록 산정된 활성 물질의 양 그 자체, 또는 그러한 활성 물질과 선택된 약학 담체 매질을 혼합한 것을 함유하여야 한다. 전형적으로, 항바이러스 화합물은 상기 조성물의 중량을 기준으로 항바이러스제 약 0.1 mg 내지 약 500 mg, 바람직하게 약 1 mg 내지 약 100 mg을 함유하는 단위 용량으로 투여될 것이다.

본 명세서에 기술된 항바이러스 화합물은 그 자체로, 또는 프로드러그와 같이 그로부터 활성 약물이 유도될 수 있는 전구체의 형태로 투여될 수 있다. 프로드러그는 본 명세서에 기술된 화합물의 유도체이고, 그의 약리학적 작용은 생체내에서 화학적 또는 대사적 과정에 의하여 활성 화합물로의 전환을 초래한다. 프로드러그에는 카복실 또는 하이드록실 작용기를 지닌 상기 화학식(1) 또는 화학식(2)의 화합물들의 에스테르가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러한 에스테르들은 단순 또는 작용성 지방족 알콜 또는 카복실산으로부터 제조할 수 있다. 그러한 프로드러그는 약품 화학 및 약제학 분야에 주지된 방법에 따라 제조할 수 있다.

항바이러스 화합물은 경구 투여, 직장내 투여, 비경구 투여, 예를 들어, 근육내 주사, 피하 주사, 정맥내 주입 등의 방법으로 투여할 수 있고, 조(槽; cisternal)내 투여, 질(膣; vaginal)내 투여, 복막내 투여, 국부 투여 방식으로, 예를 들어, 분말, 연고, 점적제 등으로 투여하거나, 에어로졸 등의 흡입제로 투여할 수 있으며, 이러한 투여 방식은 치료되는 감염의 심각도 및 성질에 따라 달라진다. 투여 경로에 따라, 본 발명의 화합물은 1일에 약 0.001 내지 약 120 mg/kg(피검체 체중)의 투여 수준으로, 바람직하게 1일에 약 0.01 내지 약 30 mg/kg(피검체 체중)의 투여 수준으로 1일에 1회 이상 투여하여 소정 치료 효과를 얻을 수 있다.

예를 들어, 적당한 경구 투여 용량은 1일에 약 30 mg/kg(체중)일 수 있으나, 통상의 정맥내 투여 용량은 1일에 약 10 mg/kg(체중)일 수 있다.

이들 항바이러스 화합물은 전술한 1일 투여 용량을 전달하기 위하여 1일에 통상 1 내지 4회 투여될 것이다. 그러나, 본 명세서에 기술된 화합물 및 조성물의 정확한 투여 방법은 치료되는 개개 숙주의 필요, 투여되는 치료 유형 및 의사의 판단에 따라 물론 달라질 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "숙주(host)"는 인간 및 동물 양자 모두를 포함한다.

본 발명의 방법에서 사용하는 화합물에 의하여 생성되는 바이러스 RNA 합성에 대한 억제 효과의 관점에서, 이들 화합물은 바이러스 감염의 치료학적 치료뿐만아니라 바이러스 감염의 예방에도 마찬가지로 유용할 것이라는 점이 예견된다. 투여 용량은 바이러스 감염의 치료용이든 예방용이든 본질적으로 동일할 것이다.

하기 실시예에서 본 발명을 보다 상세하게 기술한다. 본 발명을 수행하기 위하여 현재 생각되고 있는 바람직한 실시 형태를 기술하는 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니다.

하기 실시예들은 본 발명의 방법에 사용되는 화합물의 화학적 합성을 설명한다.

실시예 1

4-(5-(3-옥소-3H-벤조[ b ]티오펜-2-일리덴메틸)퓨란-2-일)벤조산의 제조

a) 벤조-2,4-디하이드로티오펜-3-온

티오살리실산 646mg (4.19mmol), 에틸 아세토아세테이트 680mg (5.24mmol) 및 황산 촉매량의 혼합물을 4시간 동안 45℃ 내지 50℃로 가열하였다. 상기 혼합물을 얼음에 붓고, 분홍색 고체를 분리하였다. 상기 고체를 수집하여 물과 헥산으로 세척하였다. 그 후, 상기 고체를 에틸아세테이트로 세척하고, 혼합물을 여과기에 통과시켰다. 여액을 농축시켜 분홍색 고체 557mg을 수득하였다.

b) 5-브로모-2-퓨란카복스알데히드 디메틸 아세탈

무수 메탄올 20㎖ 중의 피리디늄 p-톨루엔설포네이트 10mg, 트리메틸오르토포메이트 4㎖ 및 5-브로모-2-퓨르알데히드 5.0g (28.6mmol)의 용액을 아르곤 하에서 18시간 동안 환류로 가열하였다. 용액을 건조 상태로 농축시킨 후, 미정제 황색 오일을 염기성 알루미나에 통과시킨 후, 헥산:에틸 아세테이트 4:1로 용리시켜 생성물 6.03g을 수득하였다.

c) 5-트리-n-부틸스타닐-2-퓨란카복스알데히드 디메틸 아세탈

아르곤 하 -78℃에서, 무수 THF 75㎖ 중의 상기 단계 b)에서와 같이 제조한 5-브로모-2-퓨란카복스알데히드 디메틸아세탈 6.03g (0.0273mol)의 용액에 2.5M n-부틸 리튬 12㎖ (1.1 당량)를 첨가하였다. 10분 후, 그 황색 용액을 트리부틸틴 클로라이드 8.88g (1 당량)으로 퀀칭시킨 후, 그 반응물을 서서히 실온으로 가온하였다. 상기 용액을 물로 추출한 후, 무수 소듐 설페이트로 유기 층을 건조시키고, 용매를 제거하여, 붉은 빛 오일 생성물 11.3g을 수득하였다.

d) 5-(4-카브에톡시페닐)-2-퓨란카복스알데히드 디메틸 아세탈

무수 테트라하이드로퓨란 5㎖ 중의 팔라듐(II) 클로라이드 디-트리페닐포스핀 204mg (5mol%), 메틸 4-요오도벤조에이트 1.5g (5.7mmol) 및 상기 단계 c)에서 수득한 생성물 2.72g (5.7mmol)의 현탁액을 아르곤 하에서 24시간 동안 환류로 가열하였다. 냉각시켜 어두운 갈색 용액을 고체화시키고, 그 고체를 헥산으로 세척하였다. 상기 고체를 i-프로필 아세테이트에 용해시킨 후, 염기성 알루미나를 통하여 여과시킨 후, 그 용액을 농축시켜 오렌지색 오일을 얻고 헥산으로 연마하였다. 형성된 고체를 수집하고, 헥산으로 세척한 후, 건조시켜 생성물 1.0g을 수득하였다.

e) 5-(4-카복시페닐)-2-퓨란카복스알데히드 디메틸 아세탈

메탄올 15㎖ 및 물 5㎖ 중의 포타슘 하이드록사이드 0.5g 및 상기 단계 d)에서 수득한 에스테르 유도체 865mg (3.1mmol)의 현탁액을 질소 하에서 48시간 동안 환류로 가열하였다. 냉각시켜 짙은 녹색 혼합물을 5㎖로 농축시킨 후 에틸 아세테이트에 용해시키고, 물을 첨가하였다. 상기 혼합물을 차가운 아세트산 1㎖로 산성화한 후, 셀라이트를 통하여 여과시켰다. 유기 여액을 물로 수회 세척한 후, 소듐 설페이트로 건조시켰다. 여과 후, 그 용액을 건조 상태로 농축시켜 올리브 녹색 고체 690mg을 수득하였다.

f) 5-(4-카복시페닐)-2-퓨란카복스알데히드

아세톤 100㎖ 중의 피리디늄 p-톨루엔설포네이트 10mg 및 상기 단계 e)에서 수득한 산 유도체 690mg의 용액을 아르곤 하에서 48시간 동안 실온에서 교반하였다. 상기 현탁액을 건조 상태로 농축시킨 후, 에틸 아세테이트 및 헥산의 혼합물 중에 현탁된 잔류물을 여과하고 건조시켜 황갈색 분말 569mg을 수득하였다.

g) 4-(5-(3-옥소-3H-벤조[ b ]티오펜-2-일리덴메틸)퓨란-2-일)벤조산

상기 단계 a)에 기술된 바와 같이 제조한 벤조-2,4-디하이드로티오펜-3-온 295mg (1.96mmol), 상기 단계 f)에서 수득한 퓨란카르복스알데히드 119mg (0.55mmol), 피페리딘 2 방울 및 에탄올 10㎖의 혼합물을 아르곤 하 85℃에서 12시간 동안 가열하였다. 상기 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 1N 염산을 첨가하여 pH 1∼2로 만들었다. t-부틸 메틸에테르 10㎖를 첨가한 후, 그 용액을 물 15㎖에 부었다. 유기 고체를 분리·수집하고, 물과 헥산으로 세척한 후, 건조시켜 생성물 175mg을 수득하였다.

실시예 2

4-(3-옥소-3H-벤조[ b ]티오펜-2-일리덴메틸)벤조산의 제조

무수 에탄올 2㎖ 중의 피페리딘 1 방울, 4-카복시벤즈알데히드 56mg (0.37 mmol) 및 벤조-2,4-디하이드로티오펜-3-온 73mg (0.48mmol)의 현탁액을 아르곤 하 80℃에서 18 시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시키고, 1N HCl을 사용하여 그 반응 혼합물을 pH 2로 조정한 후, t-부틸 메틸 에테르 및 물을 첨가하였다. 여과하여 황갈색 침전물을 수집하고, 공기 건조시켜 황갈색 고체 생성물 73mg을 수득하였다.

실시예 3

2-(5-(2-클로로-5-니트로페닐)티오펜-2-일메틸리덴)벤조[ b ]티오펜-3-온의 제조

a) 5-트리-n-부틸스타닐티오펜-2-카복스알데히드 디메틸 아세탈

표제 화합물은 시판되는 5-브로모-티오펜카복스알데히드를 출발 물질로 하여 상기 실시예 1의 단계 b) 및 c)에서 기술된 바와 같은 5-브로모-2-티오펜카복스알데히드 디메틸 아세탈과 유사하게 제조하여 오렌지색 오일 생성물 10.15g을 수득하였다.

b) 5-(2-클로로-5-니트로페닐)티오펜-2-카복스알데히드 디메틸 아세탈

무수 THF 20㎖ 중의 3-브로모-4-클로로니트로벤젠 2.0g (8.4mmol), 본 실시예의 단계 a)에서와 같이 제조한 5-트리-n-부틸스타닐티오펜-2-카복스알데히드 디메틸 아세탈 4.16g (9.2mmol) 및 팔라듐(II) 클로라이드 디-트리페닐포스핀(5mol%) 0.297g의 현탁액을 아르곤 하에서 20 시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각시키고, 그 반응물을 진공 중에서 농축시켜 중성 알루미나의 플러그를 통하여 우선 통과시킨 적색 오일을 수득하였다. 생성 적색 오일을 예비 HPLC(실리카겔; 20% 에틸 아세테이트/ 80% 헥산을 용리액으로 사용) 처리하여 점성 황색 오일 생성물 1.93g을 수득하였다.

c) 5-(2-클로로-5-니트로페닐)티오펜-2-카복스알데히드

아세톤 100㎖ 중의 본 실시예의 단계 b)에서와 같이 제조한 5-(2-클로로-5-니트로페닐)티오펜-2-카복스알데히드 디메틸 아세탈 1.93g 및 피리디늄 p-톨루엔설포네이트 10mg의 용액을 아르곤 하 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. 상기 황색 용액을 진공 중에서 농축시키고, 그 미정제 생성물을 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 유기 상을 물(2 x 100㎖)로 세척한 후, 무수 소듐 설페이트로 건조시켰다. 농축물은 황색 분말 생성물 1.46g을 제공하였다.

d) 2-(5-(2-클로로-5-니트로페닐)티오펜-2-일메틸리덴)벤조[ b ]티오펜-3-온

무수 에탄올 2㎖ 중의 피페리딘 1 방울, 본 실시예의 단계 c)에서와 같이 제조한 5-(2-클로로-5-니트로페닐)티오펜-2-카복스알데히드 100mg (0.37mmol) 및 벤조-2,4-디하이드로티오펜-3-온 73mg (0.48mmol)의 현탁액을 아르곤 하 80℃에서 18 시간 동안 가열하였다. 냉각시키고, 물과 t-부틸 메틸에테르를 참가한 후, 여과하여 오렌지색 침전물을 수집하였다. 상기 고체를 물로 세척한 후 t-부틸 메틸 에테르로 세척하여 mp 215∼216℃의 오렌지색 고체 생성물 0.145g을 수득하였다.

본 발명의 실시에 있어서 유용한 기타 화합물들은 상기 실시예 1에 기술된 것에 대하여 선택적으로 2-머캅토벤조산 및 알데히드 반응물을 치환시켜 유사하게제조할 수 있다.

실시예 4

바이러스 RNA 복제의 억제

바이러스 폴리머라아제 및 관련 단백질의 억제제의 발견은 일반적으로 다수의 화학적 화합물 또는 화학적 화합물의 혼합물의 평가를 요한다. 따라서, 고 부피 스크리닝이 가능한 폴리머라아제 활성에 대한 분석, 환언하면 고-작업 처리 분석(high-throughput assay)이 바람직하다. 다수의 샘플을 효율적으로 스크리닝할 수 있는 당업자에게 주지된 다양한 분석 방법이 있다. 예를 들어, 문헌[Cole, JL, Meth Enzymology, 275: 310-328(1996)]을 참조하라. 이들 분석법 중 어떠한 것도 바이러스 RdRp 활성의 경우에 적당할 수 있다.

플라비비리다에 과의 바이러스의 경우에 있어서 바이러스 RaRp 활성을 측정하기 위한 한 가지 접근법은 생체외 RdRp 분석법에서 정제된 재조합 NS5 단백질을 사용하는 것이다. 예를 들어, 문헌[Behrens et al., EMBO J., 15: 12-22 (1996) 및 Lohmann et al., J. Virol., 71: 8416-8428 (1997)]에서는 바큘로바이러스 발현, 정제 및 HCV NS5B RdRp의 효소 활성을 기술한다. 박테리아 발현, 정제 및 HCV NS5B RdRp 단백질의 효소 활성은 PCT/US96/15571 [WO 97/12033] 및 Yuan 등의 문헌[Biochem Biophys Res Comm, 232;231-235 (1997)]에 공개되어 있다. 또 다른 예로서, Collett의 PCT/US99/07404가 있는데, 이는 본 출원과 공통으로 소유되는 것으로서, 기능성 HCV NS5B 서열을 포함하는 조성물 및 헤파시바이러스 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 데 있어서 그의 용도를 공개한다. HCV RdRp에 대하여 상기 예에서와 같이, 박테리아-발현 뎅그열 바이러스 NS5 단백질을 정제하여, 재조합 바큘로바이러스-감염 세포로부터 정제한 페스티바이러스 BVDV의 NS5B 단백질이 가지는 것[Zhong et al., J. Virol., 72; 9365-9369 (1998)]과 같은 RdRp 활성을 나타냄을 보였다[Tan et al., Virology, 216: 317-325 (1996)].

예로서, 후보 항바이러스 화합물의 억제 활성은 본질적으로 Collett의 PCT/US99/07404에 따라 제조한 NS5 단백질을 사용하여 생체외 RdRp 분석법에 의하여 측정할 수 있다. 정제된 NS5 단백질은 표준 RdRp 반응 혼합물에서 항온 처리한다. 그러한 반응 혼합물은 일반적으로 완충액, 염, 양이온, 환원제 등뿐만 아니라, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 RNA 주형-프라이머로 구성된다. 그러한 반응 혼합물의 개개 성분의 변화는 개개의 NS5 단백질의 특정 반응 선호도를 조절하기 위하여 요구될 수 있다. 그러한 변화는 당업자에게 주지되어 있다. 상기 실시예 1 내지 3 및 하기 표 1a 및 표 1b에 나타낸 바와 같은 화학식(1)에 속하는 대표적 화합물은 이러한 분석법을 사용하여 항바이러스 활성을 평가하였다. 시험 화합물의 억제 활성은 IC₅₀값으로 표현하였다. IC₅₀값은 RdRp 활성의 50%를 억제하는 화합물의 농도를 나타낸다. 플라비비리다에 과의 1종 이상의 바이러스에 있어서 RdRp 활성의 억제에 대한 시험 화합물의 분석 결과는 0.2μM 내지 약 30μM 범위의 IC₅₀값을 나타내었다.

HCV RdRp 활성의 50% 억제를 달성할 수 있는 시험 화합물의 저농도는 본 발명의 방법이 플라비비리다에 과 복제에 관여하는 바이러스 RdRp 효소에 의한 RNA합성을 억제하는 데 효과적이라는 것을 지시한다.

본 발명을 특정 바람직한 실시 형태의 관점에서 기술하고 예시하였으나, 다른 실시 형태도 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 기술되고 예시된 특정 실시 형태로 한정되는 것이 아니고, 첨부된 청구의 범위에 기술된 완전한 범위의 본 발명의 정신에서 벗어나지 않는 수정 및 변경이 가능하다.

* o-클로로, m-클로로, p-클로로 및 p-브로모

Claims

살아있는 숙주에 있어서 플라비비리다에 과(Flaviviridae family)의 1종 이상의 바이러스에 의한 감염 및 그러한 감염과 관련한 질병을 치료하는 방법으로서,

상기 감염증을 지닌 상기 숙주에게 하기 화학식(1)의 화합물 또는 그 전구체, 및 상기 화합물의 이성체 및 약학적 허용염 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법:

[화학식 1]

상기 식에서,

W는 O, S 또는 N(R_a)를 나타내고, 여기에서, R_a는 수소 또는 탄소수 1∼5의 알킬기이며;

X, Y 및 Z는 동일하거나 상이할 수 있고, 이들 각각은 수소, 또는 할로겐, 니트로, 카복시, 하이드록시, 탄소수 1∼5의 알킬, 트리플루오로메틸, 알콕시, 아실옥시, 시아노, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 설폰아미도, 카복스아미도, 카브알콕시, 티오, 알킬티오, 알킬설피닐 및 알킬설포닐로 구성된 군으로부터 선택되는 치환체를 나타내며;

R₁은 비치환되거나 치환된 헤테로사이클기, 비치환되거나 치환된 바이사이클 고리 부분, 비치환되거나 치환된 페닐(C₆H₅)기, 비치환되거나 치환된 바이페닐(C₆H₅-C₆H₄)기, 비치환되거나 치환된 ω-페닐알케닐(C₆H₅(CH=CH)_n)기[여기에서, n은 1 내지 5의 정수임], 비치환되거나 치환된 ω-페닐알키닐 (C₆H₅(C≡C)_p)기[여기에서, p는 1 내지 5의 정수임], 또는 비치환되거나 치환되고 직쇄이거나 분지쇄일 수 있는 탄소수 1∼5의 알킬기로 구성된 군으로부터 선택되는 라디칼을 나타내고, 여기에서, 상기 헤테로사이클기는 퓨란, 티오펜, 옥사졸, 옥사디아졸, 피리딘, 피리미딘, 피라졸, 트리아졸, 피리다진, 1,3-옥사티올란, 티아졸, 티아디아졸, 이미다졸, 피롤, 테트라졸 및 트리아진으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 바이사이클 고리 부분은 벤조퓨란, 이소벤조퓨란, 벤조티오펜, 이소벤조티오펜, 벤족사졸, 벤조피롤, 이소인돌, 벤즈피라졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 1,2-벤조디아진, 1,3-벤조디아진, 1,2,3-벤조트리아졸, 벤조티아졸, 벤즈이미다졸, 1,2,3-벤조트리아진 및 1,2,4-벤조트리아진으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 헤테로사이클기 및 바이사이클 고리 부분 치환체는 탄소수 1∼5의 알킬, 할로겐, 알콕시, 하이드록시, 니트로, 퍼할로알킬, 디할로알킬, 모노할로알킬, 카복시, 카브알콕시, 설포, 설포네이트, 티오, 알킬티오, 알킬설피닐, 알킬설포닐 또는 비치환되거나 치환된 페닐기로 구성된 군으로부터 선택되며; 상기 페닐기 치환체, 바이페닐기 치환체, ω-페닐알케닐기 치환체 및 ω-페닐알키닐기 치환체는 할로겐, 니트로, 카복시, 하이드록시, 탄소수 1∼5의 알킬, 퍼할로알킬, 디할로알킬, 모노할로알킬, 알콕시, 아실옥시, 시아노,아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 설폰아미도, 카복스아미도, 카브알콕시, 티오, 알킬티오, 알킬설피닐 및 알킬설포닐로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이고; 상기 알킬기 치환체는 카복시, 하이드록시, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 티오 또는 알킬티오로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.
제1항에 있어서, 상기 화합물 약 0.001 내지 약 120mg/kg(환자 체중)/일 (day)을 함유하는 단위 제형으로 상기 화합물을 투여하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 단위 제형이 약학적 허용 담체 매질을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물의 전구체를 프로드러그의 형태로 투여하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물 또는 그 전구체와, 인터페론, 리바비린, 프로테아제 억제제, 면역글로불린, 면역조절제, 간보호제, 항-염증제, 항생제, 항바이러스제 또는 항-감염제로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 보조 활성제를 배합하여 투여하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 화합물 또는 그 전구체 및 상기 1종 이상의 보조 활성제를 동시에 투여하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여 경로가 경구 투여, 직장내 투여, 비경구 투여, 조(槽; cisternal)내 투여, 질(膣; vaginal)내 투여, 복막내 투여, 국부 투여 및 흡입 투여로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
살아있는 숙주에 있어서 플라비비리다에 과의 1종 이상의 바이러스에 의한 감염 및 그러한 감염과 관련한 질병을 예방하는 방법으로서,

상기 감염증에 대한 감수성을 지닌 상기 숙주에게 하기 화학식(1)의 화합물 또는 그 전구체, 및 상기 화합물의 이성체 및 약학적 허용염 예방 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법:

[화학식 1]

상기 식에서,

W는 O, S 또는 N(R_a)를 나타내고, 여기에서, R_a는 수소 또는 탄소수 1∼5의 알킬기이며;

X, Y 및 Z는 동일하거나 상이할 수 있고, 이들 각각은 수소, 또는 할로겐, 니트로, 카복시, 하이드록시, 탄소수 1∼5의 알킬, 트리플루오로메틸, 알콕시, 아실옥시, 시아노, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 설폰아미도, 카복스아미도,카브알콕시, 티오, 알킬티오, 알킬설피닐 및 알킬설포닐로 구성된 군으로부터 선택되는 치환체를 나타내며;

R₁은 비치환되거나 치환된 헤테로사이클기, 비치환되거나 치환된 바이사이클 고리 부분, 비치환되거나 치환된 페닐(C₆H₅)기, 비치환되거나 치환된 바이페닐(C₆H₅-C₆H₄)기, 비치환되거나 치환된 ω-페닐알케닐(C₆H₅(CH=CH)_n)기[여기에서, n은 1 내지 5의 정수임], 비치환되거나 치환된 ω-페닐알키닐 (C₆H₅(C≡C)_p)기[여기에서, p는 1 내지 5의 정수임], 또는 비치환되거나 치환되고 직쇄이거나 분지쇄일 수 있는 탄소수 1∼5의 알킬기로 구성된 군으로부터 선택되는 라디칼을 나타내고, 여기에서, 상기 헤테로사이클기는 퓨란, 티오펜, 옥사졸, 옥사디아졸, 피리딘, 피리미딘, 피라졸, 트리아졸, 피리다진, 1,3-옥사티올란, 티아졸, 티아디아졸, 이미다졸, 피롤, 테트라졸 및 트리아진으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 바이사이클 고리 부분은 벤조퓨란, 이소벤조퓨란, 벤조티오펜, 이소벤조티오펜, 벤족사졸, 벤조피롤, 이소인돌, 벤즈피라졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 1,2-벤조디아진, 1,3-벤조디아진, 1,2,3-벤조트리아졸, 벤조티아졸, 벤즈이미다졸, 1,2,3-벤조트리아진 및 1,2,4-벤조트리아진으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 헤테로사이클기 및 바이사이클 고리 부분 치환체는 탄소수 1∼5의 알킬, 할로겐, 알콕시, 하이드록시, 니트로, 퍼할로알킬, 디할로알킬, 모노할로알킬, 카복시, 카브알콕시, 설포, 설포네이트, 티오, 알킬티오, 알킬설피닐, 알킬설포닐 또는 비치환되거나 치환된 페닐기로 구성된 군으로부터 선택되며; 상기 페닐기 치환체, 바이페닐기 치환체, ω-페닐알케닐기치환체 및 ω-페닐알키닐기 치환체는 할로겐, 니트로, 카복시, 하이드록시, 탄소수 1∼5의 알킬, 퍼할로알킬, 디할로알킬, 모노할로알킬, 알콕시, 아실옥시, 시아노, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 설폰아미도, 카복스아미도, 카브알콕시, 티오, 알킬티오, 알킬설피닐 및 알킬설포닐로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이고; 상기 알킬기 치환체는 카복시, 하이드록시, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 티오 또는 알킬티오로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.
제8항에 있어서, 상기 화합물 약 0.001 내지 약 120mg/kg(환자 체중)/일 (day)을 함유하는 단위 제형으로 상기 화합물을 투여하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 단위 제형이 약학적 허용 담체 매질을 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 화합물의 전구체를 프로드러그의 형태로 투여하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 화합물 또는 그 전구체와, 인터페론, 리바비린, 프로테아제 억제제, 면역글로불린, 면역조절제, 간보호제, 항-염증제, 항생제, 항바이러스제 또는 항-감염제로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 보조 활성제를 배합하여 투여하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 화합물 또는 그 전구체 및 상기 1종 이상의 보조 활성제를 동시에 투여하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 투여 경로가 경구 투여, 직장내 투여, 비경구 투여, 조(槽)내 투여, 질(膣)내 투여, 복막내 투여, 국부 투여 및 흡입 투여로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.