KR20010016520A

KR20010016520A - 한우고기 판별을 위한 중합효소연쇄반응-단일가닥구조다형 유전자 감식법 개발

Info

Publication number: KR20010016520A
Application number: KR1020000077369A
Authority: KR
Inventors: 정의룡; 김연수; 김우태
Original assignee: 정의룡
Priority date: 2000-12-16
Filing date: 2000-12-16
Publication date: 2001-03-05

Abstract

우리나라 축산업과 축종을 대표하는 한우산업의 국제경쟁력 강화는 물론 쇠고기 및 생우의 완전수입 개방에 따라 위기에 처한 한우 산업의 보호 및 육성을 위하여 한우와 젖소고기 및 수입쇠고기와의 품종식별을 위한 과학적인 판별기술 개발에 대한 필요성과 중요성이 강조되고 있는 시점에서 본 발명은 소 모색관련 MC1R 유전자의 PCR-SSCP 분석기법을 이용하여 보다 경제적이면서도 간편하고 신속 정확하게 한우고기를 판별하는 기술을 개발하였다. 즉, 한우고기와 국내산 젖소고기 및 수입쇠고기의 혈액 및 원료육에서 genomic DNA를 분리한 후 소 모색관련 MC1R 유전자의 특정 염기서열 영역의 증폭을 위한 oligonucleotide primer를 설계 합성하고 PCR을 이용하여 증폭한 다음 SSCP DNA marker를 분석하였다. MC1R 유전자의 SSCP DNA band 양상은 한우육에서는 E⁺/e와 e/e 유전자형만이 검출되었으나, 국내산 젖소고기에서는 E^D/E^D와 E^D/e 유전자형이 검출되었고 대표적인 수입소 품종으로서 앵거스종은 E^D/E^D, E^D/E⁺및 E^D/e 유전자형이 검출되었다. 이상의 결과로부터 한우 품종에 특이적인 SSCP 유전자형의 존재 유무에 따라서 한우육을 홀스타인종 젖소육 및 앵거스 수입육으로부터 완전한 구별이 가능하였다. 따라서 본 연구팀이 개발한 PCR-SSCP marker 분석기술은 종래의 RAPD 또는 SCAR 방법은 물론 비교적 최근에 개발되어 보고된 PCR-RFLP 방법을 이용한 한우육 판별기술과 비교해 볼 때도 제한효소를 전혀 사용하지 않기 때문에 제한효소 처리과정없이 PCR 증폭후 바로 전기영동 gel에서 DNA band를 검출하여 MC1R 유전자의 SSCP 유전자형을 판정할 수 있으므로 기존의 어떤 방법에 비해서도 가장 경제적이고 간편하면서 신속 정확하게 판별할 수 있어 정확성, 효율성, 실용성, 편리성, 간편성 및 경제성을 고루 갖춘 한우고기 판별 기술이라고 할 수 있다.

Description

한우고기 판별을 위한 중합효소연쇄반응-단일가닥구조다형 유전자 감식법 개발{Development of PCR-SSCP method for Identification of Hanwoo Meat}

축산물 수입개방에 대비한 우리나라 한우산업의 국제경쟁력 강화 및 고품질 한우고기 생산을 유도하기 위해서는 수입쇠고기 또는 국내산 젖소고기와 차별화 전략이 초미의 관심사로 대두되고 있다. 그러나, 국내 쇠고기 유통과정에서 값싼 외국산 수입육과 젖소육이 고급 한우육으로 둔갑 판매되는 사례가 성행하여 소비자 및 양축농가의 막대한 경제적 손실과 피해를 초래하고 있음은 물론 사회적으로도 큰 물의를 야기시키는 심각한 문제점으로 지적되고 있다. 이번 농림부 국정감사 자료에 의하면 지난 98년부터 올해까지 젖소, 육우의 한우둔갑 판매로 약 4천 8백 97억원의 손해를 소비자가 입은 것으로 보고되었다.

특히, 2001년 수입쇠고기 전면개방에 따른 외국산 생우가 국내로 반입되어 6개월 사육 후 도축할 경우 국산쇠고기로 유통이 허용되어 수입생우의 한우둔갑이 새로운 문제로 제기되고 있다. 최근 인사이트 리서치가 서울 정육업자 1백명을 대상으로 「한우 쇠고기의 이미지 및 경쟁력 실증확인」을 위한 설문조사 결과에서 자신들이 판매한 한우 쇠고기중 둔갑판매된 양은 총량의 36.2%라고 응답하였고, 「한우고기를 속아서 샀다」는 소비자들이 10명당 47%에 달하고 있어 소비자의 과반수 가까이 한우고기를 속아서 구매한 것으로 조사되었고 이처럼 한우육 둔갑판매 가능성에 대한 소비자의 불신감이 매우 높아 오히려 수입육 등 비 한우고기를 더욱 선호하는 결과를 초래하고 있다. 이처럼 쇠고기 둔갑 유통의 부조리현상이 만연할 경우 한우 차별화 및 원산지 표시제 정책이 올바르게 정착하기 어렵고 한우고기에 대한 소비자의 불신감 증폭과 부정적 인식의 확산으로 말미암아 한우산업 및 쇠고기 유통관련 산업의 경쟁력을 약화시키는 주요 원인이 되고 있다. 따라서, 한우고기 둔갑판매 행위를 막기위해서 행정당국의 지속적인 유통단속과 지도감시가 필요하겠지만 과학적이고 객관적인 한우육 판별 및 진단기술이 뒷받침될 때 비로서 소비자들의 한우육에 대한 신뢰감 회복과 불신감 해소를 가져와 수입쇠고기 및 젖소고기와의 품질 차별화가 올바르게 정착될 수 있을 것이다. 또한, 식생활 패턴의 서구화로 축산물 소비가 증가되고 곡물류 소비가 줄어드는 식생활 구조의 변화를 보이고 있을 뿐 만 아니라, 국내 1인당 육류 소비량도 1997년에 29.3㎏이었던 것이 2001년에는 34.7㎏, 그리고 2004년에는 37.3㎏으로 증가할 전망이다. 그러나, 현재 순수 한우고기 자급율은 40% 미만으로서 국내에서 유통되고 있는 쇠고기의 60% 이상을 젖소고기 및 수입쇠고기로 그 수요를 충당하고 있는 실정이다. 따라서 우리나라 고유 가축으로서 한우만의 독특한 유전적 특성을 DNA 수준에서 파악하여 수입쇠고기 및 국내산 젖소고기와 명확히 구별할 수 있는 한우육 판별 기술 개발은 국내산 한우고기의 국제 경쟁력은 물론 둔갑육 유통의 근본적인 차단 및 사육농가 및 쇠고기 시장보호를 위해 반드시 해결해야 할 과제이다.

소의 외형적 특징인 모색은 현재까지 품종을 식별할 수 있는 유일한 대상형질이며 개체 및 품종을 식별하는 수단으로 이용될 수 있는 대표적인 질적 형질의 하나이다. 그러나, 모색의 표현형으로 구별되는 소 품종이라 할지라도 도축하여 쇠고기 형태로 전환되면 사실상의 품종 식별은 거의 불가능하게 된다.

최근 분자 유전학 및 유전공학기술의 눈부신 발달로 DNA 수준에서 종 특이적인 DNA 염기서열 차이에 따른 축종 판별은 물론 동종 내 품종판별의 가능성이 여러 연구자들에 의해 보고되고 있다. 국내의 경우도 그 동안 우리나라 고유의 쇠고기 유전자원인 한우를 타 품종과 식별하기 위한 한우 품종에 특이적인 기술개발은 많은 연구자들에게 흥미와 관심의 대상이 되었다. 특히, PCR을 이용하는 DNA 다형분석기법으로서 RAPD(random amplified polymorphic DNA)기법이 한우육 판별을 위한 한우 특이적 DNA marker 탐색에 주로 이용되어져 왔으나, 이 RAPD 기법은 PCR 증폭조건에 대한 민감성이 매우 높고 결과의 재현성과 판정의 정확성이 낮기 때문에 실용화에는 문제점이 많은 것으로 지적되어 왔다. 한편, 최근에 소 모색발현에 관련된 MC1R(melanocortin 1 receptor) 유전자의 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)를 분석하여 한우육을 홀스타인 젖소육 및 앵거스 수입육과 명확하게 구별할 수 있는 기술이 개발되었다(정 등, 2000; 김 등, 2000).

이 PCR-RFLP 기술은 기존에 보고된 PCR-RAPD 방법과 비교하여 신뢰성 높은 판별기술로 평가되고 있으나 RFLP 유전자형을 검출하기 위해서는 반드시 특정 제한효소가 인지할 수 있는 염기서열 부위가 존재해야 하고 따라서 제한효소를 사용하여야 하는 등 분석과정이 다소 복잡하고 분석시간이 오래 소요되는 단점이 있다. 특히, 한우고기 판별기술을 산업적으로 실용화하여 다량의 시료를 대상으로 본격적으로 수행하고 관련기술을 널리 확대 보급하고자 할 때 무엇보다도 먼저 판별기술의 간편성 및 판정결과의 신속성과 정확성이 요구된다.

따라서, 기존의 RAPD 및 RFLP 분석에 의한 한우고기 판별기술이 안고 있는 문제점과 한계성을 극복하면서 보다 간편하고 신속 정확하며 경제적이고 효율적인 한우고기 판별기술을 개발하고자 하는 목적에서 새로운 한우고기 판별기술로서 PCR-SSCP(single strand conformation polymorphisms) 기법을 개발하였다.

II. 재료 및 방법

1. 공시재료

본 연구에 사용된 공시재료는 도축장에서 한우 100개체와 젖소 50개체로부터 각각 정육시료를 채취하였다. 또한, 축산기술연구소 대관령지소에서 사육되고 있는 수입육우로서 Angus, Hereford 및 Charolais 3품종 각 10두씩을 임의로 선정하고 이들 각 공시축으로부터 혈액시료를 채취하였다.

2. 실험방법

1) Genomic DNA의 분리 및 정제

혈액(3ml)과 근육조직(10g)으로부터 genomic DNA의 분리 및 정제는 Miller 등(1989)의 방법을 일부 변형하여 수행하였으며, 분리한 DNA는 TE buffer(10mM Tris-HCl pH 7.4, 1mM EDTA)에 용해하였다. 그리고 각 시료의 DNA 농도는 spectrophotometor로 260nm의 UV 흡착에 의해 측정하였다.

2) MC1R primer 합성 및 PCR 증폭

MC1R 유전자는 GenBank(S71017)에 등록된 bovine receptor BDF3의 318에서 455번째 염기서열 부위에 위치한 E-좌위의 138bp 단편을 증폭하기 위한 primer로서 forward primer는 5'-CAAGAACCGCAACCTGCACT-3'와 reverse primer는 5'-GCCTGGGTGGC CAGGACA-3' 그리고 318에서 707번째 염기서열 부위의 390bp를 증폭하기 위한 primer 로서 forward primer는 5'-CAAGAACCGCAACCTGCACT-3'와 reverse primer는 5'-CCAACGAGGCACAGCAGGAT-3'의 염기배열을 각각 설계하여 합성하였으며, PCR 증폭은 GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer Cetus, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에서 실시하였다. 즉, 반응액은 0.5㎖ tube에 template DNA 20-40ng, primer 각 0.5μM, dNTP 각 200μM, 10×PCR buffer 그리고 Taq DNA polymerase 1unit를 첨가하여 PCR 반응액을 총 10㎕로 조정하였다. PCR cycle은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 후 94℃에서 1분, 66℃에서 1분 그리고 72℃에서 1분간의 cycle을 총 30회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 5분간 가열한 후 종료했다.

3) SSCP marker 분석

MC1R 유전자의 돌연변이 영역을 포함하는 2종류의 특이적 primer쌍을 각각 이용하여 증폭시킨 후 PCR 증폭산물 3㎕에 5∼6배의 formamide dye(98% formamide, 20 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylen cyanol)를 첨가하였다. 각 희석액을 95℃에서 5분간 변성시킨 후 즉시 ice에 5분간 보관하여 reannealing을 방지한 다음, 12∼15% 비변성 polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시한 후 Silver staining법으로 SSCP의 DNA band를 검출하였다.

III. 결과 및 고찰

MC1R은 포유동물의 멜라닌 확산 및 합성을 자극하는 호르몬 수용체로서 모색 발현에 중요한 역할을 담당한다는 사실이 규명됨에 따라 MC1R 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 방법으로 PCR-RFLP 분석기법을 이용하여 여러 동물 종내에서 모색변이 관한 연구가 진행되어 왔다(Robbins 등, 1993; Klungland 등, 1995; Vage 등, 1997, 1999; Kijas 등, 1998; 김 등, 2000; 이 등, 2000; 정 등, 2000). 본 연구에서는 기존의 PCR-RFLP 방법에 비해 보다 신속 정확하고 간편하게 MC1R 유전자의 돌연변이를 검출하기 위하여 PCR-SSCP 분석기법을 이용하여 MC1R 유전자내의 염기치환에 따른 DNA 단일가닥의 형태 또는 구조변경에 의한 각 품종간 전기영동상의 구조적 차이를 비교 분석하였다. MC1R 유전자의 SSCP 분석을 위하여 BDF3 cDNA 영역의 318-455번째와 318-707번째 염기배열을 갖는 두 종류의 primer를 합성하여 각각 증폭한 후 138bp와 390bp의 증폭산물을 변성시킨 다음 비변성 polyacrylamide gel로 검출한 각 품종별 SSCP 양상은 그림-1 및 2와 같다. 즉, 〈그림-1〉에서 보는 바와 같이 138bp의 증폭산물을 전기영동했을 때 점돌연변이의 염기치환에 따라 99번과 104번 아미노산을 결정하는 codon에서 단일 염기치환(T→C) 및 결실(G)에 의하여 E^D/E^D, E^D/e, E⁺/e 및 e/e 4종류의 유전자형이 검출되었다. 또한, PCR 증폭산물의 분자량의 크기에 따른 SSCP 분리능력을 상호 비교하기 위하여 319-707번째 염기배열을 포함하는 390bp의 증폭산물의 SSCP 유전자형을 검출한 결과는 〈그림-2〉에 제시한 바와 같이 99번과 104번 아미노산 영역에 단일 염기치환 및 결실 부위가 존재하고 있으나 분리능력의 한계로 단순히 두 개의 haplotype 만이 검출되었다. 이같은 결과는 PCR 증폭산물의 분자량이 200bp 이하에는 70 - 95%의 정확도로 변이의 검출이 가능하나 약 400bp 이상인 경우 50% 이하로 분리능력이 저하되어 나타난 현상으로 해석된다(Michaud 등, 1992).

M Hanwoo Holstein Angus Hereford Charolais M

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^{1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30}

〈그림-1〉 한우육, 홀스타인 젖소육 및 수입육우 품종(앵거스, 헤어포드 및 샤로레)에서 MC1R 유전자의 PCR-SSCP 유전자형을 비교한 전기영동상. 전기영동상에서 1, 2, 3, 4, 6과 22에서 30 lane은 e/e 유전자형, 5 lane은 E⁺/e 유전자형, 7, 9, 10, 12와 13에서 21 lane은 E^D/E^D유전자형 그리고 8과 11 lane은 E^D/E⁺유전자형. M: 표준 size 마커.

Hanwoo Holstein Angus Hereford Charolais

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〈그림-2〉 한우육, 홀스타인 젖소육 및 수입육우 품종(앵거스, 헤어포드 및 샤로레)

에 대한 MC1R 유전자의 PCR-SSCP 표지인자를 비교한 전기영동상.

이상과 같이 138bp와 390bp 두 종류의 PCR 증폭산물을 각각 이용하여 검출한 MC1R 유전자의 PCR-SSCP 유전자형을 한우육과 젖소육 및 수입 육우 품종간에 비교한 결과 〈그림-1과 2〉에서 보는 바와 같이 DNA 단일가닥의 치환 및 결실에 의한 전기영동상의 이동도에 따라 한우와 Holstein 및 Angus종간에 확실한 차이를 보이는 품종 특이적인 SSCP 유전자형이 확인되었다. 즉, 138bp의 PCR 증폭산물을 이용하여 SSCP 유전자형을 검출한 결과(그림-1)에서 한우는 E⁺/e 및 e/e 2 종류의 유전자형만이 검출되었으나 Holstein 젖소는 E^D/E^D와 E^D/e 그리고 Angus 종은 E^D/E^D유전자형만이 검출되어 품종간의 SSCP 유전자형 출현에 명확한 차이가 인정되었다. 또한, 390bp의 PCR 증폭산물을 이용하여 SSCP 유전자형을 분석한 결과(그림-2) 분자량이 비교적 큰 관계로 세부적이고 정확한 유전자형의 판정이 곤란하였으나 한우는 2개의 band 그리고 Holstein 젖소 및 Angus 종은 1개의 band 만이 각각 검출되어 SSCP band 출현양상에 확실한 차이가 인정되었다. 이러한 실험결과는 390bp의 증폭산물의 경우 다수의 쇠고기 시료를 대상으로 상세한 유전자형 구분에 관계없이 단순히 전기영동 gel상에서 발현된 DNA band 양상만으로 한우육을 손쉽고도 신속하게 판별하는데 매우 실용적인 방법이 될 수 있다고 판단된다.

따라서, 본 연구에서 개발한 모색 특이적인 MC1R 유전자의 SSCP 유전자형은 최근에 개발되어 보고된 RFLP 유전자형과 비교해 보다 신속 정확하면서도 간편하게 한우육을 국내산 및 수입산 젖소고기와 Angus 수입육을 감별하는데 매우 유용한 DNA marker로서 이용할 수 있을 것이다. 이러한 한우와 Holstein 및 Angus종간의 SSCP band의 이동도에 따른 검출 능력의 차이는 MC1R 유전자의 99번 염기서열에서 단일염기의 치환(CTG(Leu)→CCT(Pro)) 및 103번 아미노산을 결정하는 codon에서 GGT (Gly)→GTG(Val)로 두 번째 G 단일염기의 결실로 모색 표현형이 서로 상이한 한우와 Holstein 및 Angus의 품종간에 구별이 가능한 것으로 해석된다(Klungland 등, 1995; 정 등, 2000).

한우와 젖소 그리고 수입육우 3품종을 대상으로 MC1R 좌위의 SSCP 유전자형 빈도를 분석한 결과 〈표-1〉에 제시한 바와 같이 한우는 E⁺/e와 e/e 2종류의 유전자형을 보유하고 있었으며 이 가운데 e/e형이 89%로 매우 높은 출현율을 보인 반면 E⁺/e 형은 11%로 출현빈도가 낮은 경향이었다. 그러나, 흑반점의 모색을 갖는 Holstein종은 한우에서 전혀 출현되지 않는 E^D/E^D와 E^D/e 2종류의 유전자형이 각각 96%와 4%로서 E^D/E^D형이 매우 높은 출현율을 나타냈고 또한, 단일 흑모색 품종인 Angus종에서도 한우에 존재하지 않는 E^D/E^D유전자형이 검출되었다. 이처럼, 축우 품종간의 MC1R 유전자형 출현빈도에 뚜렷한 차이가 존재하고 있으며 이같은 결과는 품종간의 모색 표현형 변이에 따른 유전적 차이로 해석되며 또한 품종적 특징을 잘 반영해 주고 있음을 알 수 있다.

〈표-1〉 PCR-SSCP 방법에 의해 검출된 MC1R 유전자형의 품종별 출현빈도

품종	표본수	MC1R 유전자형
품종	표본수	E^D/E^D	E^D/E⁺	E^D/e	E⁺/E⁺	E⁺/e	e/e
Hanwoo	100					11(0.11)	89(0.89)
Holstein	50	47(0.96)		3(0.04)
Angus	10	10(1.00)
Hereford	10						10(1.00)
Charolais	10						10(1.00)

그 동안 소 품종에서 MC1R 유전자와 여러 가지 다양한 모색 표현형들과의 관련성을 명확하게 분석한 연구결과는 많지 않은 실정이나 특정 염기서열을 인지하는 제한효소를 사용하는 PCR-RFLP 분석을 통하여 모색 표현형에 따라 E^D, E⁺및 e 3종류의 대립유전자를 분류하였고 이들에 의해 지배되는 6종류의 유전자형이 보고되어져 있다(Klungland 등, 1995; Klungland와 Vage, 1999). 또한, Joerg 등(1996)은 MSHR 유전자의 염기서열을 분석한 결과 적모색을 갖는 Holstein종은 특정 염기의 결실로 흑모색 품종과 구별이 가능하다고 하였다. 소 품종 이외에도 Kijas 등(1998)은 모색 표현형이 다른 돼지 품종에서 MC1R 좌위의 염기서열에 대한 차이를 규명하고자 PCR-RFLP와 SSCP 방법으로 분석한 결과 missense 돌연변이가 모색변이와 관련되어 있음을 보고하였다. 또한, Marklund 등(1996)은 말 MSHR의 염기서열을 분석한 결과에서도 단일 missense 돌연변이는 밤색(chestnut) 표현형과 관계가 있음을 시사하였다. 최근에 정 등(2000), 김 등(2000) 및 이 등(2000)은 한우를 Holstein종 젖소 및 Angus 수입육과 판별하기 위하여 서로 다른 특이적 primer와 제한효소를 이용하여 PCR-RFLP법으로 MC1R 유전자를 분석하고 특정 품종의 특이적 유전자형의 출현빈도에 근거하여 한우를 젖소 및 수입육우 품종 가운데 앵거스 품종과 확실하게 구별할 수 있음을 보고한 바 있다. 현재, 전세계적으로 사육되고 있는 소 품종은 매우 다양하며 모든 소의 품종을 구별한다는 것은 이론적으로 불가능할지도 모르나 국내에서 사육되고 있는 Holstein 젖소와 수입품종 가운데 Angus 종의 모색은 흑반점 및 흑색으로 한우의 황갈색과는 근본적으로 다르기 때문에 국내 쇠고기 유통과정에서 국내산 쇠고기란 이름으로 둔갑판매의 주류를 이루는 Holstein 종 젖소와 수입육 가운데 높은 비중을 차지하고 있는 Angus 품종의 경우 모색 표현형 차이에 의해 MC1R 유전자형이 한우와 완전히 다르므로 도축 후 쇠고기 형태로 전환되더라도 한우육을 젖소육과 Angus 수입육과 명확히 구별할 수 있어 한우육의 품질인증 및 부정육 검출에 이용할 수 있다.

특히, PCR-SSCP 유전자형은 기존의 RFLP와 같이 Mendel의 유전양식을 따르며 RFLP 방법으로 확인 불가능한 변이까지 간편하고 신속하게 검출할 수 있는 고감도 DNA 다형성 검출법으로 잘 알려져 있다(Blanche 등1997; Hennessy 등, 1998). 따라서, 본 연구에서 개발한 MC1R 유전자의 PCR-SSCP marker는 2종류의 제한효소를 각각 이용하여 분석하는 기존의 PCR-RFLP 방법에 비하여 특정 염색체 좌위에 존재하는 주 유전자를 대상으로 특정 제한효소 사용없이도 신속 정확하고도 간편하게 돌연변이로 유발된 유전자의 다형성을 직접 검출할 수 있는 장점을 지니고 있어 신속성, 정확성, 경제성, 편리성 및 실용성을 겸비한 한우고기 판별법이라고 할 수 있다. 따라서, MC1R 유전자의 PCR-SSCP 유전자형은 한우육을 젖소고기 및 Angus 수입육과 구별하는데 매우 효율적이고 경제적이며 유용한 DNA marker로서 이용할 수 있다.

1. 발명이 속하는 기술분야

생물공학 및 유전공학 - 동물 유전자 공학

본 연구팀이 개발한 「한우육 판별을 위한 PCR-SSCP 유전자 감식법 개발」이 속하는 기술은 유전공학 분야로서 세부전공으로는 분자유전학적 기술을 이용하는 동물 유전공학 분야이다. DNA 표지인자를 이용하여 한우고기와 수입쇠고기 및 젖소고기의 품종식별을 위한 유전자 감식기법으로서 기존에 보고되어진 기술이 RAPD 및 SCAR 분석기술이며, 최근에 PCR-RFLP marker를 이용하는 판별기술이 새롭게 보고되었다.

2. 그 분야의 종래기술

① RAPD 및 SCAR marker를 이용한 한우고기 판별법

PCR-RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)기법은 짧은 염기서열(10bp)을 갖는 임의의 oligonucleotide primer(random primer)를 사용하여 genome내 DNA 염기서열 부위를 임의로 증폭시켜 품종 특이적인 DNA band를 검출하고 이를 품종 특이 RAPD marker로 이용하여 소의 품종 구별을 시도하는 기술이다. 그러나, RAPD 기술은 PCR 증폭에 대한 민감성이 매우 높을 뿐만 아니라 재현성과 정확성에 대한 신뢰도가 매우 낮아(Yu 와 Pauls, 1992; Ellsworth 등, 1993; Macpherson 등, 1993; Meunier 와 Grimont 등, 1993) 실제적으로 이용하기에는 많은 문제점들을 내포하고 있기 때문에 판정결과에 대한 신뢰성을 보장할 수 없어 산업적 실용화 기술로의 이전이 어려운 실정이다.

RAPD 기법을 이용하여 한우와 타 품종간의 차이를 보이는 band를 cloning하여 염기배열을 분석한 후 유전자를 보다 안정화시켜 증폭할 수 있는 새로운 primer를 제작하는 과정을 거쳐 보다 바람직한 기술의 재현성을 얻고자 수행된 것이 SCAR (sequence characterized amplified regions)기법으로서, 기본적으로는 PCR-RAPD 기법과 동일하지만 품종 특이적 band에 대하여 염기서열을 결정한 후 10bp의 RAPD marker에 끝에서 안쪽으로 10bp 정도의 염기를 추가하여 합성한 primer를 SCAR primer로 이용하여 검출하는 방법으로서 RAPD의 재현성을 일부 개선시킨 기술이라고 할 수 있다. 그러나, 이 방법 역시 기본적으로 PCR-RAPD 기술을 이용하는 것으로 아직까지 한우고기 판별용 SCAR marker에 대한 충분한 연구와 검증이 이루어지지 않은 상태로서 실용화에는 이르지 못하고 있는 실정이다.

② PCR-RFLP marker를 이용한 한우고기 판별법

최근에 개발된 PCR-RFLP marker를 이용한 한우고기 판별법은 소 모색발현에 관여하는 MC1R의 특정 유전자의 RFLP 분석에 의한 품종 특이적 유전자형을 이용하여 한우육을 Holstein종 젖소육과 앵거스(Angus) 수입육우 품종과 구별할 수 있는 기술로서 RAPD 및 SCAR marker를 이용하는 방법과 비교하여 정확성과 재현성이 매우 우수하며 신뢰도가 높은 한우고기 판별법이라고 할 수 있다. 그러나, PCR-RFLP 유전자형을 검출하기 위해서는 반드시 특정 제한효소가 인지할 수 있는 염기서열 부위가 존재하여야 하며 따라서 극히 한정된 제한효소 인지부위만을 검출할 수 있는 한계성이 있으며 나아가 제한효소 처리과정이 필수적으로 요구되어 분석과정이 다소 복잡하고 분석시간이 오래 걸린다는 단점이 지적되고 있다. 따라서, 한우고기 판별기술의 실용화와 범용화를 위해서는 보다 단순하면서도 판별기술의 신속 정확하고 분석 비용이 저렴하며 경제적인 한우고기 판별기술의 개발이 요구된다.

기존의 한우육 판별기술의 문제점을 살펴보면 앞서 설명한 바와 같이 RAPD marker를 통한 한우육, 젖소육 및 수입육간의 구별은 그 동안 많은 연구자들에 의하여 수행되어져 왔다(이창수 등, 1994; 조병욱과 한재용, 1994; 민병록 등, 1995; 정의룡 등, 1995). 그러나, RAPD 기술은 PCR 증폭에 대한 민감성이 매우 높을 뿐 만 아니라 재현성과 정확성에 대한 신뢰도가 매우 낮아(Yu 와 Pauls, 1992; Ellsworth 등, 1993; Macpherson 등, 1993; Meunier 와 Grimont 등, 1993) 실제적으로 이용하기에는 많은 문제점들을 내포하고 있기 때문에 판정결과에 대한 신뢰성을 보장할 수 없어 산업적 실용화 기술로의 이전이 어려운 실정이다.

특히, RAPD 기술이 지니고 있는 기술의 특성상 실험자, 시료 DNA, PCR 반응액 조성, PCR 증폭조건(반응온도 및 cycle 수)등 많은 실험요인에 의하여 민감하게 반응하여 동일한 실험결과를 얻기가 매우 어려워 재현성이 결여되어 있다. 또한, RAPD 기술의 매우 낮은 재현성을 개선하고자 하여 10bp의 RAPD primer 보다 긴 약 20bp primer를 사용하는 SCAR(sequence characterized amplified regions) marker가 단편적으로 보고되어 있으나 이 방법 역시 기본적으로 PCR-RAPD 기술을 이용하는 것으로 아직까지 한우고기 판별용 SCAR marker에 대한 충분한 연구와 검증이 이루어지지 않은 상태로서 실용화에는 이르지 못하고 있는 실정이다.

한편, 최근에 개발된 유전자 감식기술로서 소 모색관련 MC1R 유전자의 PCR-RFLP marker를 이용한 한우고기 판별법은 대립유전자 특이적 primer와 2종류의 제한효소를 이용하여 한우, 젖소 및 Angus 종을 명확하게 구별할 수 있어 지금까지 보고된 한우고기 판별법 가운데 판별결과에 대한 정확성과 신뢰도가 가장 높은 검사법으로 평가되고 있다. 그러나, 한정된 제한효소 인지부위만을 검출할 수 있고 제한효소 처리과정이 필수적으로 요구되어 고가의 제한효소가 필요하고 분석과정이 복잡하며 분석시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 따라서, 본 연구개발의 기술적 과제는 기존에 보고된 방법들 보다 효율적이며 분석의 신속성과 정확성, 저렴한 분석 비용과 경제성 그리고 기술적으로 재현성을 보장할 수 있을 뿐 만 아니라 기술상의 독창성, 신규성 및 진보성 등의 우수한 특성과 장점을 지니고 있는 PCR-SSCP 기법을 이용한 한우육 판별기술을 개발하고 이를 산업적으로 실용화하여 실제의 한우육 검사 업무에 활용할 수 있는 새로운 한우육 감별 기술 체계를 확립하는데 있다.

본 PCR-SSCP 기술의 장점과 우수성을 기존의 방법들과 비교 분석하여 〈표-2〉에 제시하였다.

〈 표 - 2 〉 한우고기 판별기술의 비교

판 별기 술	PCR-RAPD	PCR-RFLP	PCR-SSCP
분 석방 법	PCR증폭 : 3-4시간 /45Cycles전기영동 : 3-4시간 /50Volts총 분석시간 : 6-8시간	PCR증폭 : 2-3시간/30Cycles제한효소 처리 : 2-3시간전기영동 : 1.5-2시간/50Volts총 분석시간 : 6-8시간	PCR증폭 : 2-3시간/30Cycles전기영동 : 1.5-2시간/300VoltsSilver 염색 : 1시간 총 분석시간 : 4.5-5시간
경제성	중	하	상
정확성	하	상	상
재현성	하	상	상
신뢰성	하	상	상
신속성	중	하	상
간편성	상	중	상

RAPD marker 또는 SCAR marker를 이용한 기존의 한우품종 판별 기술은 PCR 증폭조건에 대한 민감성이 매우 높고 분석결과의 재현성과 정확성에 대한 신뢰도가 낮아 실제의 검사 업무 수행 등 실용화에 문제점이 많아 한우육 판별에 이용되지 못하고 있다. 또한, PCR-RFLP marker는 RAPD marker에 비해 정확성 및 재현성이 매우 우수하지만 반드시 제한효소 처리과정을 거쳐야하기 때문에 분석과정이 복잡 불편 하고 분석시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 그러나, 본 연구진이 개발한 새로운 한우육 판별 기술은 축우의 모색 발현에 관여하는 Melanocortin 1 receptor(MC1R) 유전자를 이용한 첨단 한우 유전자 감식기술로서 모색관련 MC1R 유전자의 돌연변이 영역을 특이적 primer를 이용하여 PCR 기술로 증폭시킨 후 PCR 증폭산물(138bp 또는 390bp) 3㎕에 5∼6배의 formamide dye(98% formamide, 20 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylen cyanol)를 첨가하고 원심침전 후 95℃에서 5분간 변성시킨 후 즉시 아이스에 5분간 보관하여 reannealing을 방지한 다음, 10∼15% non-denaturing polyacrylamide gel(40% Acryiamide solution 7.5㎖, 10X TBE buffer 5㎖, 10% Ammonium persulfate 170㎕, 70㎕ TEMED)을 이용하여 전기영동을 실시한 후 Silver 염색법으로 DNA band를 발현시켜 품종 특이적인 SSCP 유전자형을 DNA 표지인자로 하여 한우육과 국내산 젖소고기 및 Angus종 수입육간의 판별을 수행한다.

본 한우고기 유전자 감식 기술의 작동 원리 및 구성 그리고 분석 기술방법에 대한 상세한 내용은 다음에 기술한 바와 같다.

〈# 그림-3. PCR-SSCP 기법을 이용한 한우육 판별 기술 체계도〉

쇠고기 원료육

↓

Genomic DNA 분리

↓

특이적 primer 합성 및 PCR 증폭

↓

SSCP marker 분석

↓

한우육 감별(Holstein종 젖소육과 Angus 수입육과 구별)

가. 검사방법

1) 재료준비 : 원료육 또는 혈액

2) 시약 - DNA 추출용액

- MC1R 유전자 특이적 primer :

Primer 1(138bp 증폭용) forward primer : 5'-CAAGAACCGCAACCTGCACT-3'

reverse primer : 5'-GCCTGGGTGGCCAGGACA-3'

Primer 2(390bp 증폭용) forward primer : 5'-CAAGAACCGCAACCTGCACT-3'

reverse primer : 5'-CCAACGAGGCACAGCAGGAT-3'

- Taq DNA polymerase

- 10X PCR buffer, 500mM KCl, 100mM Tris-HCl(pH 9.0) 15mM MgCl2

- dNTP : 25mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP 혼합액

기구 - Spectrophotometer, Thermal cycler(DNA 증폭기)

2) 방법

① DNA 추출 : 원료육 시료 5g으로부터 genomic DNA의 추출 및 정제는 일반적인 분리·정제 방법을 이용하여 추출하였으며, 수집된 DNA는 TE buffer에 용해하였고, 추출된 DNA 농도는 spectrophotometor로 260nm의 UV 흡착에 의해 측정한다.

② DNA 증폭 : 추출된 DNA(50-100ng)을 아래와 같은 시약(DNA 증폭반응액)에 들어있는 20ul 튜브에 혼합하고 다음과 같은 PCR 반응조건하에서 DNA 증폭을 수행한다.

* DNA 증폭 반응액 10X PCR buffer 10X dNTP Primer(50ng/㎕) Taq DNA polymerase dH2O	5㎕ 5㎕ 1㎕ 1㎕ 8㎕	* PCR 반응조건예비변성(Predenaturing) 변성(Denaturing) 중합(Annealing) 확장(Extension) Final-extension	94℃/5분94℃/1분66℃/1분72℃/1분72℃/5분
Total	20㎕		30Cycles

③ SSCP 분석 : PCR 증폭산물 3㎕에 5∼6배의 formamide dye(98% formamide, 20 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylen cyanol)를 첨가한 희석액을 95℃에서 5분간 변성시킨 후 즉시 ice에 5분간 보관한 다음, 12∼15% 비변성 polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시한 후 Silver 염색한다.

④ DNA 검출 : 12-15% 비변성 polyacrylamide gel에서 전기영동한 후 silver 염색하여 SSCP band를 검출한다.

1) 본 연구진이 개발한 모색관련 MC1R 유전자의 PCR-SSCP 분석기법을 이용한 한우육 판별기술은 종래의 RAPD 또는 SCAR marker를 이용한 한우 품종 판별 기술에 비하여 정확성과 재현성이 완벽하여 매우 안정된 기술이며 동시에 특정 제한효소 사용없이 신속 정확하고도 간편하게 돌연변이로 발생한 유전자의 다형성을 쉽게 검출할 수 있는 장점을 지니고 있어 신속성, 정확성, 경제성, 편리성 및 실용성을 겸비한 한우고기 유전자 감식 기술이라고 할 수 있다.

2) 본 PCR-SSCP 기술은 한우육 판별에 있어서 보다 효율적이고 산업적으로 실용화할 수 있는 새로운 한우육 판별기술로서 한우육과 국내산 젖소고기 및 Angus종 수입육을 보다 신속 간편하고 정확하게 판별할 수 있어 한우고기 부정육 유통 단속을 위한 검사 기술로 활용할 수 있고 동시에 쇠고기 원료육 제품의 품질인증 등 품질의 차별화를 유도함으로써 한우사육 농가의 소득 증대 및 소비자 보호에 기여할 수 있다.

3) 본 유전자 감식 기술은 한우고기에 대한 객관적이고 과학적인 지표를 제공하므로써 한우고기 둔갑 현상 등 쇠고기 부정 불법 유통체계의 문제점을 근본적으로 해결할 수 있어 고급육 생산을 통한 한우고기의 국내 수요창출과 품질 경쟁력의 확보로 국내 한우산업의 국제경쟁력을 강화할 수 있다.

4) 국민보건 향상을 위한 양질의 동물성 단백질을 국내에서 안정적으로 생산·공급하여야하는 정책적인면과 한우육의 소비 특성을 최대로 활용하여 부가가치를 높이고 값싼 젖소고기 및 수입쇠고기와 차별화 할 수 있는 원료육의 과학적이고 객관적인 육종(肉腫) 판별 기술은 한우고기에 대한 일반 소비자들의 불신감 해소 및 신뢰성 확보에 기여할 수 있을 것이다.

Claims

MC1R 유전자 특이적 primer 1(forward primer : 5'-CAAGAACCGCAACCTGCACT-3' 와 reverse primer : 5'-GCCTGGGTGGCCAGGACA-3')과 primer 2(forward primer : 5'-CAAGAACCGCAACCTGCACT-3'와 reverse primer : 5'-CCAACGAGGCACAGCAGGAT-3')에 의해 증폭된 MC1R 유전자 산물을 열변성(95℃에서 5분간)시킨 후 12∼15% 비변성 polyacrylamide gel을 이용하여 SSCP band를 분리하고 silver 염색하여 처리하는 과정을 포함하는 PCR-SSCP 유전자 분석에 의한 한우육 판별방법