KR20000069450A - 항미생물 활성 폴리펩타이드 - Google Patents

Abstract

펩타이드(I) 및 그의 기능적 유도체 및 제약학적으로 허용되는 그의 염으로부터 선택된 폴리펩타이드; 상술한 폴리펩타이드를 하나 이상 함유하는 제약학적 조성물; 및 이러한 폴리펩타이드를 사용하여 동물에서 미생물 성장을 억제시키는 방법이 기재되어 있다.

Description

항미생물 활성 폴리펩타이드{Antimicrobially active polypeptide}

개구리의 피부 분비물은 많은 상이한 종류의 항균 펩타이드를 함유한다(바라, 디. 및 시마코, 엠.(1995) 양서류 피부; 항미생물 펩타이드에 대한 유망한 자원, Trends Biotechnol. 13, 205-209, 최근호). 특히, 다양한 이러한 펩타이드는 몇 개의 라나(Rana) 종으로부터 분리된 바 있다. 이들은 모두 분자간 디술피드 브릿지를 형성하는 COOH-말단과 인접한 2개의 시스테인 잔기를 함유한다. 이들 펩타이드는 4개의 상이한 그룹으로 분류될 수 있다. 그중 하나는 라나 브레비포다 포르사(Rana brevipoda porsa)로 부터의 브레비닌 1 (모리가와, 엔., 하기와라, 케이. 및 나카지마, 티. (1992) 브레비닌-1 및 브레비닌-2, 라나 브레비포다 포스사(Rana Brevipoda porsa)의 피부로부터 유래한 독특한 항미생물성 펩타이드, Biochem. Biophys. Res. Commun. 189, 184-190), 라나 에스쿠렌타(Rana esculenta)로부터 브레비닌 1E (시마코, 엠., 미그노그나, 지., 바라, 디. 및 보사, 에프. (1994) 라나 에스쿨렌타(Rana esculenta)의 피부 분비물로 부터의 항미생물성 펩타이드, Molecular cloning of cDNA encoding esculentin and isolation of new active peptides, J. Biol. Chem. 269, 11956-11961), 라나 카테스베이아나 (Rana catesbeiana)로부터 라나렉신(ranalexin)(클라크, 이.피., 두렐, 에스., 말로이, 더블유.엘. 및 카스로프, 엠. (1994) Ranalexin, 황소개구리(라나 카테스베이아나: Rana catesbeiana) 피부로부터 유래한 신규한 항미생물성 펩타이드, 세균 항생제와 구조적으로 관련, 폴리믹신(polymixin), J. Biol. Chem. 269, 10849-10855) 및 라나 루고사(Rana rugosa)로부터 유래한 가애구린(gaegurin) 5 및 6 (박, 제이.엠., 정, 제이. 이. 및 리, 비. 제이. (1944) 한국 개구리인 라나 루고사(Rana rugosa)의 피부로부터 유래한 항미생물성 펩타이드, Biophys. Res. Commun. 205, 948-954)을 포함하는 브레비닌 1류이다. 이들 펩타이드는 20 내지 24개 아미노산 잔기로 구성되어 있다. 이들의 항균 작용 이외에, 브레비닌 1E 및 라나렉신은 높은 용혈 활성을 갖고 있다. 두 번째 그룹은 29 내지 34개 아미노산을 함유하는 브레비닌 2 펩타이드이다. 라나. 브레비포다 포르사(R. brevipoda porsa)로부터 유래한 브레비닌 2 (모리가와, 엔. 하기와라, 케이. 및 나카지마, 티. (1992) 브레비닌-1 및 브레비닌-2, 개구리의 피부로부터 유래한 독특한 항미생물성 펩타이드, Rana brevipoda porsa, Biochem. Biophys. Res. Commun. 189, 184-190) 이외에, 라나. 에스쿨렌타로부터 유래한 몇 개의 펩타이드 (시마코, 엠., 미그노그나, 지., 바라, 디. 및 보사, 에프. (1994) 라나 에스쿨렌타의 피부 분비물로부터 유래한 항미생물성 펩타이드, Molecular cloning of cDNA encoding esculentin and isolation of new active peptides, J. Biol. Chem. 269, 11956-11961), 가애구린(gaegurin) 1 내지 3 (박, 제이.엠., 정, 제이. 이. 및 리, 비. 제이. (1944) 한국 개구리인 라나 루고사(Rana rugosa)의 피부로부터 유래한 항미생물성 펩타이드, Biophys. Res. Commun. 205, 948-954) 및 라나 루고사(Rana rugosa)로부터 유래한 루고신 A 및 B (스즈키, 에스., 오에, 와이., 오쿠보, 티., 가케가와, 티. 및 타테모토, 케이. (1995) 신규 항미생물성 펩타이드의 분리 및 특징, 개구리 라나 루고사(Rana rugosa)의 피부로부터 유래한 루고신 A, B 및 C, Biochem. Biophys. Res. Commun. 212, 249-254)가 상기 류에 속한다. 세 번째 그룹은 라나 에스쿨렌타 (Rana esculenta)로부터 유래한 37개 잔기를 갖는 펩타이드인 에스쿨렌틴 2 (시마코, 엠., 미그노그나, 지., 바라, 디. 및 보사, 에프. (1994) 라나 에스쿨렌타의 피부 분비물로부터 유래한 항미생물성 펩타이드, Molecular cloning of cDNA encoding esculentin and isolation of new active peptides, J. Biol. Chem. 269, 11956-11961) 및 가애구린(gaegurin) 4 (박, 제이.엠., 정, 제이. 이. 및 리, 비. 제이. (1944) 한국 개구리인 라나 루고사(Rana rugosa)의 피부로부터 유래한 항미생물성 펩타이드, Biophys. Res. Commun. 205, 948-954) 및 라나 루고사(Rana rugosa)로부터 유래한 루고신 C (스즈키, 에스., 오에, 와이., 오쿠보, 티., 가케가와, 티. 및 타테모토, 케이. (1995) 신규 항미생물성 펩타이드의 분리 및 특징, 개구리 라나 루고사(Rana rugosa)의 피부로부터 유래한 루고신 A, B 및 C, Biochem. Biophys. Res. Commun. 212, 249-254)이다. 마지막으로, 모든 라나(Rana) 펩타이드의 항균 활성중 최고치를 갖는 46개 아미노산 펩타이드인 라나 에스쿨렌타 (Rana esculenta)의 피부 분비물로부터 유래한 에스쿨렌틴 1 (시마코, 엠., 미그노그나, 지., 바라, 디. 및 보사, 에프. (1994) 라나 에스쿨렌타의 피부 분비물로부터 유래한 항미생물성 펩타이드, Molecular cloning of cDNA encoding esculentin and isolation of new active peptides, J. Biol. Chem. 269, 11956-11961)으로 대별된다. 이것은 또한 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 사카로마이세스 세레비시아애(Sacchraromyces cerevisiae) 및 슈도모나스 아애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대해서도 활성을 나타낸다.

본 발명은 치료용 신규 폴리펩타이드 및 이들의 기능적 유도체 그리고 제약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 상기 신규 폴리펩타이드는 그자체로 또는 하나 이상의 펩타이드와 조합되어 항균 또는 항진균 용도를 갖는다.

도 1은 3개의 클론과 그속에 존재하는 삽입물의 뉴클레오타이드 서열과 추론된 아미노산 서열을 도시하고;

도 2는 라나 템포라리아(Rana temporaria)의 피부 분비물의 역상 HPLC상 다이아그램을 도시한다.

본 발명의 목적은 항미생물 활성을 갖는 비교적 작은 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항균 또는 항진균성을 갖는 신규한 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 제약학적으로 허용되는 매트릭스에 함유된 하나 이상의 상술한 폴리펩타이드를 함유하는 제약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 사람을 비롯한 포유류와 같은 동물에서 미생물 성장을 억제시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상세한 설명으로부터 분명히 드러나는 상술한 목적과 기타 목적을 위하여, 이하의 신규 펩타이드를 제공한다:

특히 바람직한 폴리펩타이드는 다음과 같다:

본 발명의 범위내에는 상술한 폴리펩타이드의 기능적 유도체 및 제약학적으로 허용되는 염도 포함된다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 단독으로 사용되거나 또는 2개 이상의 폴리펩타이드와 조합되어 사용될 수 있다.

상기 폴리펩타이드는 항균 또는 항진균 용도를 비롯한 항미생물 용도와 같은 치료용으로 효과적이다.

본 발명은 또한 항미생물 활성을 갖는 의약 제조를 위한 상기 기술된 하나 이상의 폴리펩타이드의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 활성 성분으로서 유효량의 상술한 하나 이상의 폴리펩타이드를 제약학적으로 하용되는 담체 또는 희석제와 함께 함유하는 제약학적 조성물을 제공한다. 상술한 담체 또는 희석제는 경구투여, 정맥내 투여, 근육내 투여 또는 피하 투여용으로 적합하게 조절된다.

본 발명에 따르면, 이하에 기술한 바와 같은 클론 Rt-5, Rt-6 및 Rt-17로 도시된 서열로부터 선택된 서열을 갖는 cDNA 클론이 제공된다.

마지막으로, 본 발명은 항미생물에 의해 유발된 장애를 갖는 동물검체에 상술한 바와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 그의 조성물을 억제 양만큼 투여하는 것을 포함하는 사람을 비롯한 포유류와 같은 동물에서 미생물 성장을 억제하는 방법을 제공한다.

상술한 방법은 상술한 바와 같은 조성물을 서방형으로 경구 투여하는 것에 의해 구성된 장내 사용에 관한 것일 수 있다. 이 방법은 또한 주사가능한 투여 형태로 상기와 같은 조성물을 주사에 의해 투여하는 것에도 관한 것일 수 있다.

"그의 기능적 유도체"라는 표현에 관하여는 본 발명이 관련된 기술 분야에서 공지되어 있으므로 폴리펩타이드의 기능에 영향을 주지 않거나 실질적으로 주지 않는 폴리펩타이드에 대해 최소의 아미노산 치환이 행해질 수 있는 것을 의미한다. 가능한 치환의 결정은 이 기술분야에 공지된 과정에 따라 실시될 수 있다. 따라서, 실질적으로 동일한 아미노산 서열, 실질적으로 동일한 헬리tm 구조 및 항미생물 및 용균 활성과 같은 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 모든 폴리펩타이드는 본 발명의 범위내에 포함된다.

본 발명의 범위내에서 본 발명의 폴리펩타이드의 제약학적으로 허용되는 염이 포함된다. 이러한 염은 이 기술분야에 공지된 방법에 의해 형성된다. 따라서 폴리펩타이드의 염기 염은 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 특허청구범위를 비롯한 본 발명의 기재내용에서, 용어 "폴리펩타이드"는 이 용어가 폴리펩타이드의 기능적 유도체 및 제약학적으로 허용되는 염을 포괄하여 의미하는 것으로 이해되어진다.

본 발명에 따른 활성 폴리펩타이드는 치료적 또는 예방적 용도로 사람 또는 가축용 의약으로 사용하기 위해 제제화될 수 있다. 이 활성 제제는 보통 경구적으로, 직장으로 또는 고형, 반고형 또는 액체일 수 있는 제약학적으로 허용되는 담체와 조합된 활성 성분을 포함하는 제약학적 제제 또는 조성물 형태로 주사하는 것과 같이 또는 비경구적으로 투여되거나 또는 경구 투여시 캡슐 형태일 수 있다. 투여는 국소 투여 형태로 실시될 수 있다. 제약학적 제제의 예로서는 정제, 점적약, 용액 및 좌약을 들 수 있다. 통상 활성 성분은 중량 기준해서 약 0.1 내지 약 50중량%와 같이 제제의 소량부를 구성한다.

경구 투여를 위한 투여 단위 형태로 제약학적 조성물을 제조하기 위하여 본 발명의 폴리펩타이드는 고형, 분말형 또는 기타의 담체, 예컨대 락토오스, 사카로오스, 소르비톨, 만니톨, 감자 녹말, 옥수수 녹말과 같은 녹말, 밀로펙틴, 셀룰로오스 유도체 또는 젤라틴과 혼합될 수 있고 또 스테아르산 마그네슘 또는 스테아르산 칼슘과 같은 윤활제, 또는 정제 또는 당의정용 물질(bodies) 형태로 압축된 폴리에틸렌 글리콜 왁스를 또한 포함할 수 있다.

몇 개층의 담체 또는 희석제를 사용함으로써 서서히 방출하도록 작용하는 정제가 제조될 수 있다.

경구 투여용 또는 주사용 액체 제제는 엘릭시르제, 시럽 또는 현탁액, 예컨대 0.1 내지 20중량%의 활성성분, 당 및 에탄올, 물, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 기타 통상의 첨가제의 혼합물을 함유하는 용액 형태로 제조될 수 있다.

활성 성분이 투여되는 투여량은 광범위로 다양하며 장애의 심각도, 환자의 연령 및 체중과 같은 상이한 인자에 따라 달리할 수 있고 또 개인에 따라 조절할 수 있다.

본 발명에 따른 신규 폴리펩타이드의 발견에는 중앙 유럽의 다수 지역에서 발견되는 적색 개구리인 라나 템포라리아(Rana temporaria)의 피부를 사용하였다. 상기 개구리의 피부로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 라나 에스쿨렌타(R. esculenta)로부터 유래한 에스쿨렌틴 1의 전구체의 시그날 펩타이드를 코딩하는 DNA 단편으로 스크리닝하였다. 상기 방법을 이용하여 신규 펩타이드의 전구체를 코딩할 가능성이 있는 삽입물을 갖는 몇 개의 클론을 단리할 수 있었다. 라나 템포라리아(R. temporaria)의 피부 분비물로부터 단리될 수 있는 신규 펩타이드를 템포린으로 명명하였고 또 이들은 그 자체로 또는 상승적용적으로 조합되어 항균 활성과 같은 생물학적 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

본 발명을 이하에 나타낸 설명을 통하여 비제한적인 실시예에 의해 자세하게 설명한다. 이하의 설명은 첨부한 도면을 참조하여 실시한다.

재료 및 방법

효소 및 시약. 분석용 화학약품은 머크(Merck)사로부터, HPLC용 용매는 카를로 에르바(Carlo Erba)사로부터, 서열분석용 화학약품은 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)사로부터 구입하였다. 항미생물 분석용 배지는 디프코(Difco)사로부터, 아가로오스(A603)는 시그마(Sigma)사로부터 구입하였다. 제한 효소 및 DNA 수식 효소는 베링거 만하임(Boehringer Mannheim)사로부터, 데옥시리보뉴클레오타이드는 파마시아(Pharmacia)사로부터 구입하였다. DNA 서열은 [a-³⁵S]dATP를 사용하여 "Sequence Kit" (2.0 버전, U.S. Biochemicals 제조)로 결정하였다. 합성 펩타이드는 TANA 래보라토리스(미국, 휴스톤 소재)로부터 구입하였다.

RNA의 분리 및 클로닝 과정. 상기 연구를 위하여 2종류의 라나 템포라리아(Rana temporaria)의 피부를 사용하였다. 올리고(dT)-셀룰로오스에 대한 치환성 크로마토그래피에 의한 폴리(A)-풍부 RNA 및 cDNA 라이브러리의 제조는 리히터 일행(1990b) (Richter, K., Egger, R. ＆ Kreil, G. (1990b) Molecular cloning of a cDNA encoding the bombesin precursor in skin of Bombina variegata, FEBS Lett. 262, 353-355)에 따라 실시하였다.

약 10,000개 클론을 포함하는 cDNA 라이브러리를 에스쿨렌틴 1 cDNA를 HindIII (시마코, 엠., 미그노그나, 지., 바라, 이. 및 보사, 에프. (1994) 라나 에스쿨렌타의 피부 분비물로부터 얻은 항미생물성 펩타이드, Molecular cloning of cDNA encoding esculentin and isolation of new active peptides, J. Biol. Chem. 269, 11956-11961)로 분해시켜 수득한 240 bp 단편으로 스크리닝하였다. 상기 단편은 에스쿨렌틴 1 전구체의 프리프로(prepro)-영역을 코딩한다. 탐침을 랜덤 프라이밍(베링거 만하임)에 의해 라벨링시켰다. 850 mM NaCl, 1mM EDTA, 10x 덴하트 용액, 0.1% SDS 및 100 mg/ml 효모 tRNA를 함유하는 100mM 인산 나트륨 완충액, pH 7.2중 55℃에서 16시간 동안 혼성화를 실시하였다. 여과지(와트만 541, 11 cm x 11 cm)를 SSPE(0.3M NaCl, 20mM 인산 나트륨, pH 7.4, 2mM EDTA), 0.2% SDS로 50℃에서 15분간 2회 세척하였다. 양성 클론을 선택하고 제한효소 분해 및 뉴클레오타이드 서열결정에 의해 분석하였다.

노던 블럿 분석. 0.8 M 포름알데히드를 함유하는 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동시키는 것에 의해 폴리(A)-풍부 RNA (5mg)을 분별결정(Arrand, J.E. (1985) Preparation of nucleic acid probes, in Nucleic acid hybridization: a practical approach (Hames, B. D. ＆ Higgins, S. J., eds) pp 17-45, IRL Press, Oxford)하고 나이트란 (Nytran) 쉬트상에 직접적으로 블로팅하였다(Schleicher ＆ Schuell). 클론 Rt-17의 삽입물을 랜덤 프라이밍에 의해 라벨링하고 노던 블롯의 탐침으로 사용하였다. 여과지를 0.1 x SSPE, 0.1% SDS으로 55℃에서 세척한 다음 자기방사기록법에 이용하였다.

피부 분비물의 수집 및 정제. 3종류의 라나 템포라리아(Rana temporaria) (각각 30 내지 35 g)를 오스트리아 짤츠부르크 근처에서 잡았다. 이들을 우리의 실험실내 사육장에서 1년간 유지시키고 테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor)의 유충에 영양을 공급하였다. 약한 전기적 충격(12V, 발에서부터 머리)을 가하는 것에 의해 3주 간격으로 피부 분비물을 수집하였다. 1개 개구리의 등부분을 10 ml 0.05% (체적) 아세트산으로 세척하는 것에 의해 개구리의 표면으로부터 분비물을 수집하였다. 세 개 개구리의 분비물을 모으고 동결건조시켰다. 적합한 정제수를 0.2% (체적) 트리플루오로아세트산중의 10 내지 70% 아세토니트릴/이소프로판올(4:1)로 1.8 ml/분의 유동속도로 용출되는 역상 컬럼(Aquapore RP-300, 7 mm x 250 mm, 어플라이드 바이오시스템사 제조)을 이용하여 베크만 모델 332계상의 HPLC에 의해 분별증류시켰다. 펩타이드의 용출은 220 nm에서 베크만 165 분광광도계상에서 조절하였다. 피이크 분획을 수집하고 동결건조시켰다. 각 피이크의 소량을 염화 단실로 유도화하고 역상 HPLC 분리에 의해 N-말단 분석처리하였다 (시마코, 엠., 드 비아제, 디., 바라, 디. 및 보사, 에프. (1990b) 염화 단실에 의한 예비-칼럼 유도화 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 아미드화된 잔기의 자동 아미노산 분석 및 결정, J. Chromatogr. 504, 129-138). 펩타이드의 정제는 상술한 바와 같은 동일 용매계의 적합하게 변형된 구배로써 전개되는 다공성 C₁₈칼럼(4.6 mm x 150 mm, 슈펠코 제조)을 이용하여 실시하였다.

구조 분석. 아미노산 분석은 6N HCl에서 24시간 동안 펩타이드(1-2 nmol)의 증기상 가수분해후에 이온 교환 칼럼 및 닌히드린 유도체를 구비한 벡크만 시스템 골드 분석기로써 실시하였다. 펩타이드 서열은 퍼킨 엘머 모델 AB476A 서열결정기로써 자동화 에드만 분해에 의해 결정하였다. 어떤 경우에는 C-말단의 아미드화 상태에 대한 정보는 질량 스펙트럼 분석 및/또는 카르복시펩티다제 Y 분해에 의해 확인하였다(시마코, 엠., 드 비아제, 디., 바라, 디. 및 보사, 에프.(1990b) 염화 단실에 의한 예비-칼럼 유도화 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 아미드화된 잔기의 자동화된 아미노산 분석 및 결정, J. Chromatogr. 504, 129-138).

항미생물 분석. 항균 활성은 2 x 10⁵생존 세균(훌트마르크, 디., 엔그트롬, 에이., 앤더슨, 케이., 슈타이너, 에이치., 베니히, 에이치. 및 보맨, 에이치. 지. (1983) Insect immunity, Attacin, 훌로포라 세로핀(Hyulophora cerropin)의 항균 단백질의 일원, EMBO J. 2, 571-576)을 파종한 LB 육즙/1% 아가로오스 플레이트상에서 억제 영역 분석을 이용하여 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium) BM11, 스타필로코커스 아우레우스 코왈(Staphylococcus aureus Cowahl), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) b 용혈군 A, 슈도모나스 아애루기노사 ATCC 15692, 대장균 D21, 대장균 D21e7, 대장균 D21f1, 대장균 D21f2 및 대장균 D22에 대하여 시험하였다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) ATCC 10261의 신선 배양액을 WB 육즙, pH 6.5에 배양하고, 37℃에서 약 0.6 OD₆₀₀까지 성장시켰다. 플레이팅하기 전에, 배양액을 300배 희석시킨 다음 시험 펩타이드 존재하, 37℃에서 철야로 배양하고 그의 농도는 아미노산 분석에 의해 실시하였다. 억제 영역을 측정하고 치사 농도(LC, 성장을 억제하는 최저 농도)는 훌트마르크, 디., 앵그스트롬, 에이., 앤더슨, 케이., 슈타이너, 에이치., 베니히, 에이치. 및 보만, 에이치. 지. (1983) Insect immunity, Attacin, 훌로포라 세로핀(Hyulophora cerropin)의 항균 단백질의 일원, EMBO J. 2, 571-576에 주어진 제형을 이용하여 시험 물질의 연속적인 희석으로 수득한 영역의 직경으로부터 산출하였다. 수득한 값을 희석 단계에서 1개 이하의 차이를 갖는 5개 이상의 실험의 평균값으로 나타내었다.

원형 이색성 측정. 2mm 통로 길이의 석영 셀을 갖는 DP 520 프로세서를 구비한 20℃의 Jasco J710 분광편광계상에서 CD 측정을 실시하였다. CD 스펙트럼은 일련의 3개 스캔의 평균이었다. 타원율은 평균 몰 잔기 타원율(q)로서 deg cm²dmol^-1로 표시한다. 펩타이드 농도는 아미노산 분석으로 결정하였다.

결과

전구체를 코딩하는 cDNA 클론의 분석. 에스쿨렌틴 1 전구체의 시그널 펩타이드 및 프로(pro)부분을 코딩하는 240 bp HindIII 단편을 라나 템포라리아(Rana temporaria)의 피부로부터 제조한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 탐침으로 사용하였다. 클론 Rt-5, Rt-6 및 Rt-17에 존재하는 삽입물의 서열은 도 1에 도시되어 있다. 폴리(A) 꼬리를 제외하고는, 이들 cDNA는 323, 356 및 329개의 뉴클레오타이드를 각각 포함한다. 처음의 메티오닌 코돈후에 이들은 58(Rt-6) 또는 61 아미노산 (Rt-5 및 Rt-17)을 함유하는 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. 추론된 서열은 모두 펩타이드 전구체의 전형적인 특징을 갖고 있다. 이들은 소수성 잔기의 응집체를 함유하는 시그널 펩타이드로 시작한다. 시그널 펩티다제에 대한 분해 부위는 위치 22에 존재하는 시스테인 잔기(von Heine, G. (1983) Patterns of amino acids near signal sequence cleavage sites, Eur. J. Biochem. 133, 17-21) 다음에 존재할 것으로 생각된다. 추론된 성숙 펩타이드의 서열은 프로호르몬 전환효소의 전형적인 가공 부위인 Lys-Arg 뒤에 존재한다. 이들 전구체 폴리펩타이드는 서열 Gly-Lys를 절단한다. 카르복시펩타디제 E에 의한 가수분해는 COOH-말단 아미드의 형성을 위해 필요한 C-말단 글리신을 노출시킬 것이다. 예상되는 최종 생성물은 클론 Rt-5 및 Rt-17에 대한 13개 아미노산을 함유하는 아미드화된 펩타이드일 것이고, Rt-6은 상기 영역에서 9개의 bp 결실을 가지므로 데카펩타이드만을 코딩한다.

노던 블로트 분석. 라나 템포라리아의 피부로부터 수득한 폴리(A)-풍부 RNA에서, 풍부한 메시지로 단일 인식된 클론 Rt-17로부터 유도된 탐침을 확인하였다. 동일한 조건하에 라나 에스쿨렌타(Rana esculenta), 제노푸스(Xenopus) 유충 및 부포 비리디스(Bufo viridis)와 같은 기타 양서류 종의 피부로부터는 시그널을 얻을 수 없었다.

피부 분비물로부터 펩타이드의 분리 및 분석. 3종류의 라나 템포라리아에 전기적으로 자극을 가한 후, 약 20 mg의 동결건조된 재료를 수득하였다. 예비적 HPLC 정제(도 2)를 실시한 후, cDNA 서열로부터 예상되는 바와 같은 아미노 말단 Leu 또는 Phe를 갖는 N 말단을 확인하기 위하여 각 분획을 N-말단 분석처리하였다. 관련 분획을 HPLC에 의해 더욱 정제한 다음 아미노산 서열 분석처리하였다. 이 방법에 이어, 세 개의 예상된 펩타이드가 분비물에 실제로 존재하고 있음이 밝혀졌다. 이들 펩타이드와 구조적으로 관련된 기타 분자를 분리하였다. 템포린으로 명명된 이들 펩타이드의 서열을 표 1에 도시한다. 표 1에는 분비물로부터 회수된 각 펩타이드의 양이 기재되어 있다. 도 2에 보고된 HPLC 프로필을 따라, 다양한 펩타이드의 용출 위치를 나타낸다. N-말단에 Val을 갖고 템포린 D와 함께 부분적으로 공동용출되는 템포린 E의 구조를 표에 도시한다. 템포린은 전구체의 구조로부터 예상되는 바와 같이 이들의 C-말단에서 모두 아미드화되며 또 다수의 소수성 아미노산을 함유한다. 이들 펩타이드 각각은 10개 잔기 길이를 갖는 템포린 H 및 K를 제외하고는 13개의 잔기를 함유한다. 템포린 C, D 및 E를 제외하고는 이들 모든 펩타이드는 하나 이상의 염기성 잔기(Lys 또는 Arg)를 갖는다. 상기 분석중에서, 22개 잔기의 펩타이드도 피부 분비물에서 발견되었다(표 1 참조). 이것의 서열은 꿀벌 독(Habermann, E. (1972) Bee and wasp venoms, Science 251, 1481-1485)으로부터 유래한 용혈 펩타이드의 서열과 어느 정도 유사성을 나타낸다. 따라서 멜리틴 유사 펩타이드(MLP)로 명명하였다.

생물학적 활성에 대한 분석. 정제된 템포린의 항미생물 활성은 비.메가테리움 및 대장균 D21에 대하여 맨처음 시험하였다. 템포린 A, B, F, G 및 L은 세균 균주에 대하여 활성인 반면에 템포린 C, D, E, H 및 K는 가장 민감한 세균인 비. 메가테리움에 대하여 약간의 활성을 나타내었다.

일부 템포린의 회수는 너무 적어서 이들의 생물학적 특성의 상세한 특징화는 불가능하였다. 구조를 확인하고 보다 많은 재료를 얻기 위하여, 템포린 A, B, D 및 H를 화학적으로 합성하였다. 이 합성 템포린 A 및 B의 항미생물 활성(치사 농도값으로 표시)은 적혈구 세포 용균시 수득되는 결과와 함께 표 2에 보고한다. 참고용으로 라나 에스쿨렌타(Rana esculenta)로부터 유래한 에스쿨렌틴 1(시마코, 엠., 미그노그나, 지., 바라, 디. 및 보사, 에프. (1994) 라나 에스쿨렌타(Rana esculenta)의 피부 분비물로 부터의 항미생물성 펩타이드, Molecular cloning of cDNA encoding esculentin and isolation of new active peptides, J. Biol. Chem. 269, 11956-11961), 곤충 혈림프로부터 유래한 세크로핀 (슈타이너, 에이치., 훌트마르크, 디., 앵그스트롬, 에이., 베니히, 에이치. 및 보만, 에이치. 지. (1981) 곤충 면역성에 관려된 2개의 항균 단백질의 서열 및 특이성, Nature 292, 246-248) 및 꿀벌 독으로부터 유래한 멜리틴(하베르만, 이. (1972) Bee and wasp venoms, Science 251, 1481-1485)을 포함한다.

합성 템포린 A 및 B는 이들의 천연물과 비교하여 동일한 활성을 나타낸 반면 템포린 D 및 H는 이들 고유의 또는 다른 라나(Rana) 펩타이드의 향상제로서의 생물학적 활성을 전혀 갖지 않는 것으로 드러났다. 템포린 A는 에스. 아우레우스(S. aureus) 및 에스. 피로게네스(S. pyrogenes)에 대하여 템포린 B에 비하여 3배 이상의 활성을 나타낸다. 반면에, 이들 2개 템포린은 대장균 D21에 대하여 정반대로 활성을 나타내고 또 피. 아애루기노사(P. aeruginosa)에 대하여는 아무런 활성을 나타내지 않는다. 이것은 템포린 A 및 B가 그람 양성 세균에 대하여 특이적으로 활성이라는 사실을 나타낸다.

세크로핀과 같은 선형 황 유리 항균 펩타이드는 진균에 대하여 불활성인 반면에 데펜신(세개의 S-S 브릿지를 가짐)은 항진균 활성을 나타낸다. 템포린 A 및 B는 씨.알비칸스(C. albicans)에 대하여 활성을 나타내고 또 이들의 잠재성은 미국 남부에 서식하는 개구리인 필로메두사 사우바게이(Phyllomedusa Sauvagei) (Mor, A., Hani, K. ＆ Nicolas, P. (1994) 척추동물 펩타이드 항균물질 데르마세프틴은 중복되는 구조적 특징을 갖지만 특이 미생물을 표적으로 한다, J. Biol. Chem. 269, 31635-61641)로부터 유래한 데르마셉틴에서 보고된 바와 같은 동일한 순서이다.

템포린 A 및 B의 항균 활성을 대장균 D21, D21e7, D21f1 및 D21f2의 세 개 균주에 대하여 시험하였으며, 연속적인 결실 돌연변이는 LPS에서 측쇄 양을 증가시켰다(Boman, H. G. ＆ Monner, D. A. (1975) 대장균 K12 돌연변이체로부터 얻은 리포다당류의 특징화, J. Bacteriol. 121, 455-464). 균주 D22는 envA 유전자(Normark, S., Boman, H. G. ＆ Matssson E. (1969), 비정상적인 세포 분열을 하고 암피실린과 몇 개의 항생물질에 대하여 에피솜 및 염색체 매개된 내성을 감소시키는 대장균의 돌연변이체, J. Bacteriol. 97, 1334-1342)에서 돌연변이에 의해 투과성 외막을 갖는다. 템포린의 활성을 기초 배지 E (Vogel, H. J. ＆ Bonner, D. . (1956) 대장균의 아세틸로르니티나제: 부분 정제 및 일부 특성, J. Biol. Chem. 218, 97-106)의 부재하 또는 존재하에서 실시하였다.

표 3의 결과는 배지 E가 시험된 모든 균주에서 템포린의 활성을 증가시키는 것을 나타낸다. 그러나 그람 양성 세균에 대하여는 아무런 유사한 효과를 나타내지 않았다. CD 스펙트럼은 활성 증가가 FALL-39 (Ageberth, G., Gunne, H., Odeberg, J., Kogner, P., Boman, H. G. ＆ Gudmundsson, G. H. (1995) FALL-39, 추론된 인간의 펩타이드 항생물질은 시스테인이 없으며 골수에서 발현되어 시험된다, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 195-199)에서 밝혀진 바와 같이 헬릭스 형성 증가와 관련이 있음을 나타내었다.

본 발명에서 사용된 용어 "기능적 유도체"는 유리 카르복시기를 갖는 펩타이드 및 그의 산 부가염을 포괄하여 의미한다. 따라서 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 펩타이드에 한정되지 않는다.

라나 템포라리아(Rana temporaria) 피부 펩타이드의 서열 및 상대적 분비양. 상 응하는 전구체의 구조를 cDNA로부터 예상해낼 수 있는 펩타이드에는 애스터리스 크(*) 표시를 하였다. a는 아미드화된 COOH-말단을 나타내고, MLP는 멜리틴 유사 펩타이드를 나타낸다. 동일한 잔기에 대해서는 볼드체로 나타낸다. 갭(-)은 동일 함을 최대화하기 위해 표시하였다.

펩타이드 서열 수율

nmol/mg 템포린 A FLPLIGRVLSGILa 14.5 템포린 B* LLPIVGNLIKSLLa 19.4 템포린 C LLPILGNLLNGLLa 37.5 템포린 D LLPIVGNLLNSLLa 1.1 템포린 E VLPIIGNLLNSLLa 1.2 템포린 F FLPLIGKVLSGILa 13.5 템포린 G* FFPVIGRILNGILa 16.8 템포린 H* LSP---NLLKSLLa 8.7 템포린 K LLP---NLLKSLLa 9.8 템포린 L FVQWFSKFLGRILa 3.6 MLP FIGSALKVLAGVLPSVISWVK---Qa 5.1 멜리틴 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQa

라나 템포라리아(Rana temporaria) 펩타이드의 항미생물 및 용균 활성. 치사 농도는 각 생물이 파종된 아가로오스 플레이트상의 억제 영역으로부터 산출 하였다. 세크로핀에 대한 데이터는 Hultmark 일행 (1983)으로부터 입수한 것이 다. 에스 피로게네스(S. Pyrogenes) β hem 그룹 A 및 Ps. aeruginosa ATCC15692 는 Rome La Sapienza.NT 대학의 미생물학 연구소의 파올로 비스카 박사가 친히 제공해준 임상학적 분리물이다.

미생물 및 균주 치사 농도 템포린A 템포린B 에스쿨렌틴1 세크로핀A MLP 멜리틴 μM비.메가테리움 BmII 1.2 2.8 0.1 0.5 NT 0.6에스.아우레우스 코왈 2.3 6.0 0.4 〉200 NT 0.2와이.슈도투베르쿨로시스 7.0 7.0 NT 0.5 NT NT에스.피로게네스 2.0 7.0 NT NT NT NTβhem.그룹A대장균 D21 11.9 21.0 0.2 0.3 NT 0.8Ps.아애루기노사ATCC15692 〉360 〉360 0.7 NT NT NT씨.알비칸스 3.4 4.0 0.5 NT NT NT인간 적혈구세포 〉120 〉120 〉200 〉400 0.5 0.9

대장균 D21 및 관련 LPS 변형 균주에 대한 템포린 A 및 B의 항균 활성. 분석은 배지 E (Vogel ＆ Bonner 1956) 부재하 또는 존재하에서 LB 육즙/1% 아가로오스에서 실시하였다. 세균 균주는 스톡홀름 대학의 H.G. Boman 교수님이 친히 제공해 주신 것이다.

화합물 치사농도 D21 D21e7 D21f1 D21f2 D22 μM 템포린 A 11.9 1.4 0.9 4.8 3.4 템포린 A + 배지 E 5.3 1.4 3.0 2.0 0.4 템포린 B 21.0 13.2 10.0 3.3 11.2 템포린 B + 배지 E 3.4 4.2 3.5 9.3 12.2

〈110〉 SBL VACCIN AB

〈120〉 Antimicrobially active polypeptides

〈150〉 SE 9604593-5

〈151〉 1996-12-13

〈160〉 3

〈170〉 KOPATIN 1.0

〈210〉 1

〈211〉 323

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Clone Rt-5

〈400〉 1

acaattctga gccaactgaa ccacccgagc ccaaagatgt tcaccttgaa gaaatccctg 60

ttactcctct ttttccttgg gaccatcaac ttatctctct gtgaggaaga gagaaatgca 120

gaagaagaaa gaagagatga accagatgaa agggatgttc aagtggaaaa acgactttta 180

ccaattgttg gaaacctgct caagagcttg ttgggaaaat aaccaaaaat gttaagaatg 240

gaattggaaa tcatctgatg tggaatatca tttagctaaa tgagcaacag atgtcttatt 300

taaaaaaata aatatgttcc atc 323

〈210〉 2

〈211〉 356

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Clone Rt-6

〈400〉 2

gctttgtagg atagacctgc actgaagtct tccagccgtc tacattctga gcaccaactg 60

aactacccga gcccaaagat gttcaccttg aagaaatccc tgttactcct ctttttcctt 120

gggaccatca acttatctct ctgtgaggaa gagagaaatg cagaagaaga aagaagagat 180

gaaccagatg aaagggatgt tcaagtggaa aaacgacttt caccaaacct gctcaagagc 240

ttgttgggaa aataaccaaa aatgttaaga atggaattgg aaatcatctg atgtggaata 300

tcatttagct aaatgcgcaa cagatgtctt atttaaaaaa taaatatgtt gcatac 356

〈210〉 3

〈211〉 329

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Clone Rt-17

〈400〉 3

cccctccagc tgtctacatt ctcataacca actgaaccac ccgagcccaa agatgttcac 60

cttgaagaaa tccctcttac tccttttctt ccttgggacc atcaacttat ctctctgtga 120

ggaagagaga gatgccgatg aagaaagaag agatgatctc gaagaaaggg atgttgaagt 180

ggaaaagcga ttttttccag tgattggaag gatactcaat ggtattttgg gaaaataacc 240

aaaaaaagtt aaaactttgg aaatggaatt ggaaatcatc taatgtggaa tgtcatttag 300

ctaaatgcac atcaaatgtc ttataaaaa 329

Claims (14)

1. 이하의 펩타이드로부터 선택된 폴리펩타이드 및 그의 기능적 유도체와 제약학적으로 허용되는 그의 염.
2. 제1항에 있어서, 치료용도로 사용하기 위한 하나 이상의 폴리펩타이드.
3. 제2항에 있어서, 항미생물 용도로 사용하기 위한 하나 이상의 폴리펩타이드.
4. 제4항에 있어서, 항균 또는 항진균 용도로 사용하기 위한 하나 이상의 폴리펩타이드.
5. 항미생물 활성을 갖는 의약을 제조하기 위한 제1항 내지 제4항중 어느 하나에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드의 용도.
6. 제5항에 있어서, 상기 의약이 항균 또는 항진균 활성을 갖는 용도.
7. 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 유효량의 제1항에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드를 활성성분으로 함유하는 제약학적 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 유효량이 항미생물 활성을 나타내는 제약학적 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 유효량이 항균 또는 항진균 활성을 나타내는 제약학적 조성물.
10. 제7항 내지 제9항중 어느 하나에 있어서, 상기 담체 또는 희석제가 경구, 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 적합한 제약학적 조성물.
11. 클론 Rt-5, Rt-6 및 Rt-17로 도시된 서열로부터 선택된 서열을 갖는 cDNA 클론.
12. 항미생물 공격에 의해 유발된 질병에 걸린 동물에 제1항에 따른 하나 이상의 폴리펩티드 또는 제7항 내지 제10항중 어느 하나에 따른 조성물을 억제량으로 투여하는 단계를 포함하는 사람을 포함한 포유동물과 같은 동물에서 미생물 성장을 억제시키는 방법.
13. 제12항에 이어서, 세균 또는 진균 성장을 억제시키는 방법.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 제7항 내지 제10항중 어느 하나에 따른 조성물을 주사 투여형태로 주사하는 것에 의해 투여하는 것을 포함하는 방법.