KR20000049250A

KR20000049250A - 렌티바이러스 벡터

Info

Publication number: KR20000049250A
Application number: KR1019990703355A
Authority: KR
Inventors: 킹스만알랜존.; 킹스만수잔매리
Original assignee: 옥스포드 바이오메디카 (영국) 리미티드
Priority date: 1996-10-17
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 2000-07-25
Also published as: NO991742D0; PL332876A1; GB9621680D0; CN1195864C; AU4712397A; CA2268271A1; HUP0000442A2; CZ137299A3; HUP0000442A3; AU737801B2; IL128564A0; HK1018481A1; WO1998017816A1; US6235522B1; JP2001502903A; BG103334A; GB2331522A; CN1234075A; ATE520783T1; GB2331522B

Abstract

분열하지 않는 포유류 표적 세포를 감염시키고 형질도입할 수 있으며, HIV와 같은 렌티바이러스에 기초할 수 있고, DNA 프로바이러스내에서 프로바이러스의 5' LTR내에 비-렌티바이러스 발현 제어 요소를 제공하도록 구조화된 RNA 게놈을 갖는 레트로바이러스 벡터 입자가 제공된다.

Description

렌티바이러스 벡터{LENTIVIRAL VECTORS}

얼마동안 레트로바이러스의 소 아군(亞君, subgroup)인 렌티바이러스에 기초한 레트로바이러스 벡터 시스템의 개발에 상당한 관심이 있었다. 이 관심은 첫째로 HIV 민감한 세포에 항-HIV 치료 유전자를 표적화하도록 HIV-기초 벡터를 사용하는 개념드로부터 출발하며, 둘째 렌티바이러스가 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있기 때문에(Lewis & Emerman 1993 J. Virol. 68, 510), 이들 바이러스에 기초한 벡터 시스템은 분열하지 않는 세포를 형질도입할 수 있을 것이라는 예측에 기인한다.(예를 들면 Vile & Russel 1995 Brit. Med. Bull. 51,12). HIV에 기초한 벡터 시스템이 제조되었으며(Buchschacher & Panganiban 1992 J. Virol, 66. 2731) 이들은 CD4+ 세포 및 예상한 바대로 분열하지 않는 세포를 형질도입하는데 사용되었다(Naldini등, 1996 Science 272, 263). 그러나 일반적으로 유전자 전이 효율은 쥐의 레트로바이러스 벡터 시스템과 비교시 그다지 높지 않다.

지금까지 제조된 HIV-기초 벡터는 그 말단에서 HIV LTR을 갖는 형질도입된 세포내에 통합된 프로바이러스를 제조한다. 이는 내부 촉진제가 사용되지 않는다면 LTR이 어떠한 삽입된 유전자에 대한 발현 신호로서 사용되어야 하므로 이들 벡터의 사용을 제한한다. 내부 촉진제의 사용은 후술되는 현저한 단점을 갖는다. HIV 및 기타 렌티바이러스 LTR은 유전자 발현을 위한 바이러스-특이한 요건을 갖는다. 예를 들면, HIV LTR은 바이러스 Tat 단백질의 부재시 활성화되지 않는다(Cullen 1995 AIDS 9, S19). 따라서 유전자 발현을 위한 요건을 변화시키는 방식으로 LTR을 변형하는 것이 바람직하다. 특히 조직 특이한 유전자 발현 신호가 몇몇 유전자 치료 적용처에 필요로 될 수 있거나 혹은 외인성(exogenous) 신호에 응답하는 신호가 필요할 수 있다.

쥐 레트로바이러스에 있어서, 이는 MLV LTR의 U3 영역내에 증진제-같은 요소를 바람직한 신호에 응답하는 증진제로 종종 대체함으로써 간단히 얻어진다. 이는 그 LTR의 U3 및 R 영역내에 IST 및 TAR로 알려진 서열이 있기 때문에, 유전자 발현을 억제할 수 있으며, 이종(heterologous), 아마도 조직 특이한, 제어 서열이 U3 영역내에 삽입될 때, Tat 단백질에 응답이 있을 수도 있고 없을 수도 있기 때문에 HIV와 같은 바이러스로 실행가능하지 않다(Cullen 1995 AIDS 9, S19; Alonso등, 1994 J.Virol.68,6505; Retnasabapathy등, 1990 4, 2061; Sengupta등, 1990 PANS 87, 7492;Parkin등, 1988 EMBO.J 7, 2831)). 신호가 응답성이 있다고 하더라도, 이들은 또한 시스템을 복잡하게 하고 Tat이 종양 단백질의 몇몇 특성을 갖기 때문에 Tat을 제공하여야 하는 것은 바람직하지 않다.(Vogel등, 1988 Nature 335, 606). 종합적으로 이러한 요건은 LTR내 비-렌티바이러스 서열로 부터의 효과적인 발현을 얻고자 한다면 HIV의 R영역 및 다른 렌티바이러스 벡터를 제거해야만 하는 것을 의미한다.

본 발명자들은 레트로바이러스 벡터 게놈의 U3 및 R 영역 모두를 대체하는 방법에 대해서 PCT/GB96/01230에 개시한 바 있다. 예전에는 RNA 바이러스 게놈을 예비 통합된 형태의 프로바이러스 DNA로 전환하기 위해서 역전사효소를 제공하는 것은 바이러스에 대한 특이성이 있는 것으로 믿어져 왔기 때문에 R 영역이 대체될 수 있다는 관찰은 놀라운 것이다. PCT/GB96/01230은 표적 세포내 발현이 HIV-의존적인 치료 유전자를 전달하기 위한 특정 레트로바이러스 벡터를 기술하고 있다. 여기서는 분열하지 않거나 서서히 분열하는 세포에 대한 전달에 역점을 두는 것은 아니며, 본 발명의 HIV 혹은 어떠한 다른 렌티바이러스-기초 벡터의 적용에 역점을 두는 것은 아니다. PCT/GB96/01230에 기술된 일반적인 접근법은 현재 적절한 폴리아데닐화 및 전사 말단 영역이 R영역내에 포함되면 어떠한 서열 선택로 대체된 U3 증진제 및 R영역을 갖는 HIV-기초 벡터를 제조하는 수단을 제공한다.

본 발명은 레트로바이러스 벡터 입자 및 레트로바이러스 벡터를 위하여 RNA 게놈을 엔코딩하는 DNA구조에 관한 것이다. 보다 상세하게는 유전자 물질을 분열하지 않거나 서서히 분열하는 세포로 전달할 수 있는 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 일견지에 의하면, 제1 레트로바이러스에 기초한 레트로바이러스 벡터 입자가 제공되며,

상기 레트로바이러스 벡터 입자는 분열하지 않는 포유류 표적 세포를 감염 및 형질도입할 수 있으며,

상기 레트로바이러스 벡터 입자는 DNA 프로바이러스의 형태일 때, 표적 세포 게놈내로 삽입될 수 있는 포장가능한 RNA 게놈으로 이루어지며,

상기 RNA 게놈은 DNA 프로바이러스내에 제공하는 서열:

a)제1 레트로바이러스의 촉진제 기능을 대신하여 프로바이러스의 5' 긴 말단 반복(LTR)내에 위치된 비-렌티바이러스 발현 제어 요소; 및

b) a)내에 비-렌티바이러스 발현 제어 요소의 전사 제어하에 LTR간에 위치된, 선택된 유전자 또는 유전자들;로 이루어진다.

본 발명의 제2 견지에 의하면, 본 발명은 본 명세서내에 기술되고, 실시가능하게 촉진제에 결합된, 레트로바이러스 벡터 입자에 대하여 포장가능한 RNA 게놈을 엔코딩하는 DNA 구조가 제공된다. DNA구조에 있어서, 상기 선택된 유전자 혹은 유전자들은 존재할 수 있거나 상기 구조가 선택된 유전자 혹은 유전자들이 삽입될 수 있는 삽입 부위, 예를 들면 억제 효소 부위를 갖을 경우에는 부재할 수도 있다.

본 발명의 제3견지에 의하면, 본 발명은 본 명세서에 기술된 DNA구조로 형질감염되거나 형질도입된 숙주 세포로 이루어진 레트로바이러스 벡터 입자 생성 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 본 명세서에 기술된 레트로바이러스 벡터 입자를 제조할 수 있다.

본 발명의 제4견지에 의하면, 본 발명은 본 명세서에 기술된 레트로바이러스 벡터 입자의 성분을 엔코딩하는 헥산 서열 셋트로 이루어진 레트로바이러스 벡터 입자 제조 시스템이 제공된다.

본 발명의 제5견지에 의하면, 본 발명은 유전자 치료 및 유전자 치료에 사용하기 위한 약물 제조시 사용하는 본 명세서에 기술된 레트로바이러스 벡터 입자; 및 본 명세서에 기술된 레트로바이러스 벡터 입자를 사용하여 표적 세포를 감염 및 형질도입하는 표적 세포상에서 유전자 치료를 수행하는 방법이 제공된다. 나아가 본 발명은 상기 용도 및 방법으로 부터 제조된 형질도입된 표적 세포가 제공된다. 따라서 본 발명은 의약품에 사용하기 위한 유전자 전달 시스템이 제공된다.

본 발명에 의한 벡터 입자가 제1 레트로바이러스에 "기초한다"는 것은 레트로바이러스로부터 유도되는 것을 의미한다. 벡터 입자의 게놈은 레트로바이러스로부터의 성분을 백본(backbone)으로서 포함한다. 모든 벡터 입자는 역전사 및 삽입 시스템을 포함하여, RNA 게놈과 양립가능한 필수 벡터 성분을 포함한다. 보통 이들은 제1 레트로바이러스로부터 유도된 gag 및 pol 단백질을 포함할 것이다.

바람직하게는 상기 제1 레트로바이러스는 분열하지 않는 세포를 감염 및 형질도입하는 능력을 제공하는 렌티바이러스이다. 감염 공정도중, 렌티바이러스는 인테그라제(integrase), 코어 단백질 및 프로바이러스 DNA를 포함하는 표적 세포 세포질내에 예비-통합 복합체를 형성한다. 상기 복합체는 단백질내 신호 서열에 의해 표적 세포의 핵막을 가로질러 통과할 수 있다. 나머지 레트로바이러스는 단백질이 부족하거나, 혹은 단백질은 가지고 있으나, 적당한 신호 서열이 없다. 따라서 렌티바이러스이외의 레트로바이러스내로 분열하지 않는 세포를 감염시키는 능력을 도입하는 것이 이론적으로 가능할 것으로 예측된다.

렌티바이러스의 예는 HIV, SIV, FIV, BLV, ElAV, CEV 및 비스나(visna) 바이러스이다. 이중, HIV 및 SIV가 현재 최상으로 여겨진다. 그러나 면역결핍 바이러스가 이들에 안정성 측면 및 손상을 불가피하게 가져오기 때문에, 유전자 치료에 사용하기 바람직한 것은 비-면역결핍 렌티바이러스일 것이다.

상기 비-렌티바이러스 발현 제어 요소는 보통 한계(term)가 공지된 촉진제를 부분적으로 혹은 전체로 포함하며, 이는 조직적으로 기능될 수 있거나 혹은 이는 예를 들어 조절 단백질의 존재하에 특정 조건하에서만 유도가능한 조절된 촉진제일 수 있다. 이는 예를 들어 특정 세포 타입 혹은 특정 외인성 신호가 존재하는 세포를 억제하고자 하는 선택된 유전자 혹은 유전자들을 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 유전자의 중금속 유입은 금속티오닌(metallothionein) 촉진제 성분들을 사용함으로써 달성될 수 있다. 스테로이드 호르몬에 의한 발현 제어는 또다른 유용한 접근법일 수 있다. 뇌 특이성, 간세포 특이성 혹은 종양-특이성 유전자 발현 신호가 대신하여 사용될 수 있다.

상기 비-렌티바이러스 촉진제는 렌티바이러스 5' LTR의 렌티바이러스-단백질 의존적 촉진제 기능을 대신한다. HIV에 대하여, 이는 5' LTR이 HIV Tat 단백질에 더이상 응답하지 않는다는 것을 의미한다. Tat은 R의 TAR 영역에서 기능한다; 본 발명에 의한 HIV-기초 벡터내에서, TAR 구조에 의한 해독의 환원을 피하기 위해서 기능성 TAR 서열은 부재한다. HIV U3 영역내에 함유된 증진제 서열은 또한 배제되는 것이 바람직하다. 따라서 바람직한 벡터 LTR을 얻기 위한 간단한 방법은 렌티바이러스 R영역과 가능한한 U3영역을 대체하는 것이나, 삽입에 필요한 U3 영역의 간단한 서열과 같이 필수적인 렌티바이러스 서열은 남겨두어야 한다.

명백한 바와 같이, 벡터로서 기능하기 위하여, 본 발명에 의한 레트로바이러스 벡터 입자는 프로바이러스의 전환 및 이중-스트랜드된 DNA를 숙주 세포 게놈내로 통합을 가능케하는 역전사 시스템(역 전사효소 및 프라이머 결합 자리와 양립가능한) 및 통합 시스템(인테그라제 및 삽입 자리와 양립가능한)을 가질 필요가 있다. 부가하여 상기 벡터 게놈은 포장 신호를 포함할 필요가 있다. 이들 시스템 및 신호는 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술되며, 일반적으로 벡터가 기초로된 제1 레트로바이러스에 의해 제공될 것이다. 본 발명에 의한 벡터가 특정 제1 레트로바이러스에 기초한다 하더라도, 이는 유전적으로 혹은 그렇지 않다면(예를 들면, 세포 시스템을 포장하는 특이한 선택에 의해) 레트로바이러스의 변형판일 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들면, 포장하려는 능력을 필요로 하는 것없이, 역전사 및 통합을 수행하는 제1 레트로바이러스 게놈의 분획은 배제될 수 있다. 또한 벡터 시스템은 예를 들면 다른 env 유전자를 사용하여 벡터 숙주 범위 및 감염되거나 혹은 형질도입된 세포 타입을 바꿈으로써 변경될 수 있다. 벡터를 기초로한 레트로바이러스의 또다른 요소를 포함하는 것이 이로울 수 있다. HIV에 대하여, 이것은 핵으로부터 표적 세포의 세포질로 벡터 게놈의 RNA전사체를 함유하는 RRE를 효과적으로 수출할 수 있도록, 기능성 rev 및 RRE 서열을 포함할 수 있다.

프로바이러스 5' LTR내에서 촉진제의 존재하에 선택된 유전자 혹은 유전자들은 달성하고자 하는 효과에 따라 선택된다. 유전자 치료 목적을 위하여, 처리 혹은 방지하기에 바람직한 조건에 대하여 활성있는 최소 하나의 치료 유전자 엔코딩 유전자 산물이 있을 것이다. 대체하거나 혹은 부가하여, 검출가능한 산물을 엔코딩함으로써 마커로서 기능하는 선택된 유전자일 수 있다. 치료 유전자는 예를 들어 항-감응성 RNA, 리보짐(ribozyme), 표적 단백질의 트란스우세(transdominant) 음성 돌연변이주(mutant), 독소, 잠정적인 독소, 항체 혹은 헬퍼 T-세포 혹은 세포독성 T-세포를 포함하는 항원, 단일쇄 항체 혹은 종양 억제 단백질을 엔코드할 수 있다.

DNA 프로바이러스내 LTR사이에서 선택된 유전자 혹은 유전자들은 5' LTR내에서 촉진제의 전자 제어하에 있거나, 혹은 벡터로부터 어떠한 다른 촉진제에 실시가능하게 결합된다. 따라서 선택된 유전자 혹은 유전자들의 발현은 단일 전사 유니트내에 있다. 그러나 하기 기술된 바와 같이, 벡터 게놈내에 추가 전사 유니트가 있을 수 있다. 선택된 유전자 혹은 유전자들을 함유하는 전사 유니트를 간섭하지 않아야 한다.

2이상의 유전자가 존재하고, 5' LTR 촉진제의 전사 제어하에 있을 때, 양 유전자가 단일 전사체로부터 개별적으로 해독되도록 하게끔, 예를 들어 피코르나바이러스의 RNA로부터 내부 리보좀 장입 자리(IRES)가 있을 수 있다. IRES 서열을 편입하는 레트로바이러스는 나머지에 의해 구조화되어 진다.

또다른 유전자 혹은 유전자들이 또한 별개의 촉진제 제어하에 존재할 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들면, 선별가능한 마커, 혹은 나아가 상기 열거된 치료제중에 있을 수 있는 또다른 치료제를 엔코드할 수 있다. 이러한 유전자의 발현은 조직적일 수 있으며; 선별가능한 마커의 경우에는 이는 연속적으로 형질감염된 포장 세포, 또는 레트로바이러스 벡터 입자의 특히 높은 역가를 생성하는 포장 세포를 선택하는데 유용할 수 있다. 대체하거나 부가하여, 상기 선별가능한 마커는 레트로바이러스 벡터로 연속적으로 감염되어지고, 그 자체 게놈내로 통합된 프로바이러스를 갖는 세포를 선별하는데 유용할 것이다.

유전자 치료를 수행하는 일 방법은 환자로부터 세포를 추출하고, 추출된 세포를 레트로바이러스 벡터로 감염시키고, 그 세포를 환자한테 도로 도입하는 것이다. 선별가능한 마커가 감염되거나 혹은 형질도입된 세포를 풍부하게 하거나 혹은 환자내로 세포를 재도입하기 전에 감염되거나 형질도입된 이들 세포만을 양성적으로 선별하기 위한 수단을 제공하려는데 사용될 수 있다. 이 절차는 성공적인 치료 기회를 증대시킬 수 있다. 선별가능한 마커는 예를 들면, 약 저항성 유전자, 물질대사 효소 유전자 혹은 다른 이 기술 분야에서 알려진 어떠한 선별가능한 마커일 수 있다.

그러나 레트로바이러스 벡터의 많은 유전자 치료 적용처에 대하여, 마커 유전자의 발현을 위한 선별은 가능하지 않거나 필요하지 않다는 것이 명백할 것이다. 시험관내(in vitro) 연구에 알맞은, 선별 마커의 실제 발현은, 외부 마커 단백질에 대하여 직접적인 세포독성 T 임파구(CTLs)의 부적절한 유도때문에 생체내(in vivo)에서는 유해하게 될 것이다. 또한 생체내 적용처에 대하여, 어떠한 내부 촉진제없는 벡터가 바람직할 것이다. 내부 촉진제의 존재는 예를 들면 포장 세포계로부터 얻어질 수 있는 형질도입 역가 및 통합된 벡터의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 따라서 이중-시스트론성(bi-cistronic) 혹은 다중-시스트론성(poly-cistronic)일 수 있는 단일 전사 유니트 벡터는 하나 혹은 2이상의 치료 유전자에 대하여 코딩하는 것이 생체내 사용처에 대하여 고안된 바람직한 벡터일 수 있다.

용어 "유전자"는 본 명세서에서 넓게 사용되며, 바람직한 폴리펩티드로 코딩된 어떠한 헥산을 포함하는 것이 명백할 것이다. 보통 본 발명에 의한 벡터에 의해 전달될 유전자는 cDNAs일 것이다.

레트로바이러스 벡터 게놈은 어떠한 불필요한 폴리펩티드, 즉 벡터가 계획된 효과를 얻는데 필요로 하지 않는 어떠한 폴리펩티드를 엔코드하지 않는 유전자 치료 목적에 바람직하다. 어떠한 경우에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터는 복제 결손일 것이다. 따라서 벡터 게놈 최대 길이로부터 gag-pol 혹은 env 코딩 영역 혹은 바람직하게는 양자 모두를 배제할 필요가 있다. 이는 외부 바이러스 단백질에 대하여 정해진 원치않는 면역 반응을 피하려는 목적과, 재조합에 의해 생성되는 복제 적격 레트로바이러스의 가능성을 줄인다는 이중 목적을 갖는다.

본 발명에 의한 레트로바이러스 벡터 입자로는 또한 서서히 분열되는 감염 및 형질도입 세포가 가능할 수 있으며, 이는 MLV와 같은 비-렌티바이러스가 효과적으로 감염 및 형질도입할 수 없을 것이다. 서서히 분열하는 세포는 약 3-4일마다 한번씩 분열한다. 포유류 분열하지 않고 서서히 분열하는 세포로는 뇌세포, 간세포, 말단 상이한 거식세포(마크로파지), 허파 상피성(epithelial) 세포 및 여러 다른 세포 타입을 포함한다. 또한 특정 종양 세포를 포함한다. 비록 종양이 신속하게 분열하는 세포를 포함한다고 하더라도, 종양내의 중심내에 있는 특히 몇몇 종양 세포는 자주 분열한다.

본 명세서내에 기재된 벡터 게놈을 엔코딩하는 DNA 구조는 CMV 촉진제와 같은 고 효율성 촉진제에 결합되는 것이 바람직하다. 다른 고효율성 촉진제가 알려져 있다. 이는 레트로바이러스 벡터 입자를 제조하는 숙주 세포내에 벡터 RNA의 높은 수준의 발현을 일으킨다.

본 발명에서 사용하기에 적절한 숙주 혹은 생산물 세포가 이 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 많은 레트로바이러스가 이미 복제 결손 게놈과 포장 성분으로 분할되어졌다. 이 기술을 갖지 않는 것에 대하여 이렇게 하도록 하는 것이 가능하다. 상기 생산물 세포는 gag, pol 및 env 단백질과 같은 벡터 게놈에 의해 엔코드되지 않는 바이러스 성분들을 엔코드한다. 상기 gag, pol 및 env 유전자는 생산물 세포내로 도입될 수 있으며, 포장 세포계를 얻도록 세포 게놈내로 안전하게 통합될 수 있다. 그런 다음 상기 레트로바이러스 벡터 게놈은 레트로바이러스 벡터 입자를 제조하는데 필요한 모든 DNA 서열을 갖는 안정한 세포계를 생성하도록 형질감염 내지는 형질도입에 의해 포장 세포계내로 도입된다. 또다른 접근법으로는 예를 들어 env 코딩 서열, gag-pol 코딩 서열 및 결손 레트로바이러스 게놈을 일시적인 삼중 형질도입에 의해 세포내로 동시에 레트로바이러스 벡터 입자를 제조하는데 필요한 다른 DNA 서열을 도입하는 것이다.(Landau & Littman 1992 J. Virol. 66, 5110; Soneoka등 1995).

본 발명에 의한 방법은 이미 기술된 것에 부가하여 여러가지 잇점을 갖는다. 첫째로, 치료 전사 유니트에 대한 발현 신호로서 5' LTR을 사용함으로써, 이들 벡터 게놈을 형질도입된 세포내에 생성과 발현 모두를 위한 단일 전사 유니트 게놈으로 제조할 수 있다. 이는 LTRs사이에 내부 촉진제에 대한 필요성을 없앤다. 이 레트로바이러스 LTR 전사 유니트내에 부가 촉진제를 배치하는 예측하지 못한 성과가 잘 기재되어 있다(Bowtell등, 1988 J.Virol. 62, 2464; Correll등, 1994 Blood 84, 1812; Emerman and Temin 1984 Cell 39, 459; Ghattas등, 1991 Mol. Cell. Biol. 11, 5848; Hantzopoulos등, 1989 PANS 86, 3519; Hatzoglou등, 1991 J.Biol. Chem 266, 8416; Hatzoglou등, 1988 J.Biol.Chem 263, 17798; Li등, 1992 Hum. Gen.Ther.3,381; McLachlin등, 1993 Virol. 195, 1; Overell등, 1988 Mol. Cell Biol.8,1803; Scharfman등, 1991 PNAS 88, 4626; Vile등, 1994 Gene Ther 1, 307; Xu등, 1989 Virol. 171, 331; Yee등, 1987 PNAS 84, 5197). 포함되는 인자는 2개의 촉진제의 상대 위치 및 배향, 촉진제 및 발현된 유전자의 성질 및 채택될 수 있는 어떠한 선별 절차를 포함하는 것으로 나타난다. 내부 촉진제의 존재는 포장 세포계 로 부터 달성될 수 있는 형질도입 역가 및 통합된 벡터의 안정성 모두에 영향미칠 수 있다. 형질 도입에 따른 유전자 발현 손실은 촉진제 정지의 프로바이러스 결손 및 가역가능한 유전자외적(epigenetic) 메카니즘 모두에 의해 야기될 수 있다. 추가로, 조직 배양 연구로부터의 데이터는 종종 생체내에서 벡터의 성능에 영향을 주지 않을 수 있다. 이러한 요건은 단일 LTR 촉진제를 함유하는 간단한 레트로바이러스 벡터가 유전자 치료용 벡터를 기대할 수 있다는 것을 제시한다(Correll등 1994 Blood 84, 1812). 부가하여, 하나의 촉진제만을 사용하여 이중-시스트론성 벡터(Adam등, 1991 J.Virol 65, 4985)를 개발함과 함께, 2이상의 치료 유전자에 대한 단일 전사 유니트 벡터 코딩을 부합하여 보다 큰 효력으로 또한 제조할 수 있다.

U3 및 R영역내에 HIV 발현 신호를 제거하는 제2 이점은 이들 신호가 그 활성에 있어서 다수의 외적 영향에 지배받다는 점이다. HIV 촉진제는 제어하기 어려운 벡터 게놈의 전사 상태를 만드는 UV, 스트레스, 다른 바이러스등과 같은 다수의 제제에 의해 활성화될 수 있는 것으로 알려져 있다(Peterlin 1992 in Human Retroviruses ed. Cullen. IRL Press). 이들 서열의 제거는 치료 유전자에 대한 보다 큰 제어를 확고히 할 것이다.

첨부된 도면에서 도 1은 본 발명에 의한 벡터에 대한 일반적인 도식도이며;

도 2는 본 발명에 의해 보편화된 HIV-기초 벡터 게놈을 도시한 도면이며;

도 3은 실시예 1에 기술된 HIV-기초 벡터 게놈을 도시한 도면이며;

도 4는 도 3내 벡터에 대한 3' LTR의 구조를 상세화한 상세도이며;

도 5는 포장 성분의 구조 다이아그램이며;

도 6은 본 발명에 의한 벡터의 원리를 도시한 도면이다.

본 발명은 도 1에 개략화하였다. 벡터 시스템은 Lentiviral LTR-Deleted(LLD) 벡터를 고안하였다. 이는 CMV 혹은 다른 고효율성 촉진제가 생산물 세포내에 벡터 RNA의 발현을 유도하는데 사용되는 DNA 분자로 이루어진다. 이 방법은 HIT 벡터 시스템에 대한 구조 유사체(analogous)이다(Soneoka등, 1995 Nucl. Acids Res. 23, 628). 생산물 세포는 양립가능한 렌티바이러스 구조 단백질 및 효소를 제조하도록 계획될 것이다. 따라서 이는 벡터 포장 세포로서 알려진 것일 것이다. 생산물 DNA는 복제되거나 되지 않거나간에 혹은 생산물 세포 게놈내로 통합될 수 있는 자율적 플라스미드로서 사용될 수 있다. 이들 모든 방법은 이 기술 분야에서 알려져 있다(Soneoka등, 1995 Nucl. Acids Res. 23, 628; Miller and Rossman 1989 BioTech.7,980; Miller 1990 Hum. Gene Ther.1,5). 벡터 게놈에 대한 생산물 DNA는 하기 연속된 성분을 최소한 포함할 수 있다: 고효율성 촉진제, 다른 레트로바이러스로부터 발생하거나 혹은 완전하게 합성인 비-렌티바이러스 R 부위, 렌티바이러스 인테그라제에 의한 통합을 위해 필요로 하는 서열 및 효과적인 역전사를 위해 필요로 하는 서열을 함유하는 모든 혹은 부분적인 렌티바이러스 U5 영역, 생산물 세포의 포장 성분에 의해 인지되는 포장 신호, 치료 혹은 보고자(reporter) 유전자 혹은 선별가능한 마커 및 연관된 발현 신호를 포함하는 유전자를 함유할 수 있는 내부 영역(부가하여 상기 내부 영역은 효율적인 RNA 절단 및 이송을 확고히 하기 위한 시스템의 성분을 함유할 수 있다), 렌티바이러스로부터의 제2 스트랜드 프라이머 자리, 렌티바이러스 인테그라제에 의한 효과적인 통합을 위해 필요로 하는 렌티바이러스 U3 영역으로부터의 30-100 뉴클레오티드의 짧은 서열, 유전자 치료가 적당하게 발현될 수 있도록 외인성 신호에 의해 유전자 발현 혹은 조절의 조직 특이성을 부여할 수 있는 이종 촉진제, 전사 말단과 함께 1차 R 영역과 동일한 R 영역 및 말단 R 영역을 갖는 벡터 RNA를 제조하는데 필요한 폴리아데닐화 신호.

상기 생산물 DNA는 렌티바이러스 포장 시스템에 의해 포장된 RNA 분자를 제조한다. 결과 벡터 입자는 RNA를 감수성 세포로 배달할 것이며, 상기 RNA는 렌티바이러스 역전사효소에 의해 DNA로 전환될 수 있으며, 렌티바이러스 인테그라제에 의해 세포 게놈내로 통합될 것이다. 결과 프로바이러스는 렌티바이러스 U3 영역의 말단으로부터 짧은 렌티바이러스 서열로 대체된 생산물 DNA의 CMV 촉진제 성분 및 조직 특이하거나 조절된 유전자 발현을 부여할 수 있는 이종 촉진제를 갖을 것이다. 렌티바이러스 R 영역이 완전히 대체되기 때문에, 통합된 벡터 게놈내에 억제 TAR 서열은 없다.

실시예 1

MLV U3 촉진제와 MLV R 영역을 갖는 HIV-기초 LLD 벡터

일반적인 HIV LLD 벡터 시스템의 구조가 도 2에 도시되었다. 본 실시예는 도 3 및 4에 도시되어 있다. 다음과 같은 구조로 되어 있다. HIV 역전사효소에 대한 최소 요건은 음성 스트랜드 DNA 합성을 개시하기 위한 프라이머 결합 자리(PBS), 양성 DNA 합성을 개시하기 위한 폴리퓨린 트랙(PPT), 및 제1 주형 전환하도록 동일한 5' 및 3' R 서열이다. 따라서 HIV-1로부터 벡터내로 PBS 및 PPT의 편입과 MLV로부터 양쪽 LTR내로의 R 서열의 편입이 필요시된다. 5' U5 영역내에 2차 구조는 역전사에 중요하기 때문에, 상기 5' LTR내 U5영역은 HIV-1로부터이다. 3' LTR에서 U5 영역을 위하여, HIV-1로부터의 U5가 R-U5 경계면에서 일어난 전사의 정확한 말단을 확고히 하는데 사용되었다. 그러나 어떠한 말단 신호가 사용될 수 있다. 효과적인 통합을 위하여, 3' LTR에서 HIV-1 U3의 5' 말단에서 30뉴클레오티드가 편입되었다.

역전사후 MLV U3요소가 5' LTR내에서 나타나도록, 이는 바이러스 RNA의 3' LTR내에 있어야만 한다. 5' 말단의 30bps를 제외한 모든 MLV U3가 HIV-1 U3를 대체하였다. 벡터의 3' LTR은 여러 편리한 억제 자리를 포함하도록 계획되어, 그 결과 MLV U3는 쉽게 다른 이종 촉진제에 의해 대체될 수 있다(도 4). 어떠한 이종 촉진제는 각 말단에서 Stul 및 Narl 자리를 포함하는 프라이머를 갖는 PCR에 의해 증폭될 것이고 MLV U3를 대체하는데 사용될 것이다. Stul뿐만 아니라 Nhel 및 Aflll은 촉진제 카셋트의 5' 말단에서 사용될 수 있다. Narl(GGCGCC)는 촉진제와 R사이에 결합상에 위치되며, 그 결과 이종 촉진제로부터의 전사 개시 자리가 보존될 수 있다. Xbal 및 Narl간에 MLV U3결합서열은 TATA 박스, GC 박스 및 CAAT 박스를 포함하는 염기성 촉진제 요소를 포함한다. 따라서 MLV 증진제는 Stul(혹은 Nhel 혹은 Aflll)-Xbal 카셋트와 같은 어떠한 다른 증진제에 의해 대체될 수 있다.

효과적으로 포장하기 위해서 gag의 353뉴클레오티드가 적합한 것으로 알려져 있다(Srinivasakumar등, 1996 CHS Retrovirus Meeting abstract). gag서열의 353 뉴클레오티드는 790∼1144까지의 서열에 해당하며, 그 내부에서 3가지 ATG's(790, 834, 894)는 돌연변이에 의해 제거된다. 부가하여 다중 유전자 조작 자리가 gag의 하방에 위치된다.

HIV 게놈에 의해 엔코드된 RNA종의 효과적인 수출을 얻기 위하여, rev 및 RRE가 필요시된다. 이는 LLD벡터내에 포함되며, HIV-1(HXB2)로부터 서열 5861 ∼6403 및 7621∼9085에 해당한다. Tat 코팅 서열은 상기 벡터내에 존재하지 않는다.

생산된 DNA 구조에 대한 상세한 설명:

A. 5'구조(모든 HIV-1 동격(coordinate)은 Loa Alamos Sequence Database로부터의 HXB로부터 이며 MoMLV 서열은 Shinnick등, 1981 Nature 293, 543으로부터이다)

벡터의 5' 절반은 하이브리드 5' LTR(CMV 촉진제-MLV R-HIV-1 U5), HIV-1 PBS 및 HIV-1 포장 신호를 포함한다. 이는 재조합 PCR에 의해 구조화될 것이다. PCR을 위한 주형중 하나는 pHIVdge2가 Clal 자리(831)에서 채움(filling-in) 및 퇴거(relegation) 및 Ndel(6403) 및 Bglll(7621)간에 결실에 의해 제조된 돌연변이를 갖는 HIV-1 프로바이러스 DNA이다. MLV R과 HIV-1 U5간 결합은 1차 PCR 반응(프라이머 NIT 1 및 NIT2; NIT 3 및 NIT4를 사용함) 및 2차 PCR 반응(프라이머 NIT 1 및 NIT 4를 사용함)의 2가지 반응에 의해 생성된다. PCR 생성물은 Kpnl 및 Xhol 자리(Construct A1)에서 pBluesriptKS+(STRATAGEN)내로 삽입된다. gag영역내에서 3가지 ATGs를 돌연변이시키기 위해, 프라이머는 돌연변이된 코돈을 포함한다.

NIT 1: 5'-ccgggtacccgtattcccaataaagcctcttgctgtttgca-3'(SEQ ID NO:1)

NIT 2: 5'-ctacgatctaattctcccccgcttaatactgacgctctcgcacctatctc-3'(SEQ ID NO 2)

NIT 3: 5'-gcgggggagaattagatcgtagggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaa

tataaattaaaacatatagtttggg-3'(SEQ ID NO:3)

NIT 4:5'-gaattctcgaggcgtgctgtgcttttttctatc-3'(SEQ ID NO:4)

CMV 촉진제-MLV R 분획은 pRV109로부터의 PCR(Soneoka등, 1995)에 의해 증폭되어 PCR 프라이머 NIT5 및 NIT 6을 사용하는 양 말단에서 Kpnl 자리를 포함하며, Construct A1내로 삽입되어 Construct A2를 제조한다.

NIT 5: 5'-gtaggtacccgttacataacttacggtaaatg-3'(SEQ ID NO:5)

NIT 6: 5'-agaggctttattgggaatacg-3'(SEQ ID NO:6)

B:3' 구조

벡터 게놈의 3' 절반은 HIV-1 rev 코딩 영역 및 RRE, PPT, HIV-1 U3의 5'말단 36bp 및 5' 말단의 30bp를 제외한 모든 MLV LTR을 포함한다. 상기 서열(5861∼6000)은 pHIVdge2(NIT7 및 NIT 8을 사용함)로부터 증폭된 PCR이며, BamHi 및 Sacl 자리(Construct B1)에서 pSP64(PROMEGA)내로 소 유전자 조작된다.

NIT 7:5'-cacggatccactagttggaagcatccaggaagtcagc-3'(SEQ ID NO:7)

NIT 8:5'-ctctgactgttctgatgagc-3'(SEQ ID NO:8)

상기 pHIVdge2로부터의 Sacl-Sacl분획(6000∼6403 및 7621∼9572)는 Construct B2를 제조하기 위해 상기 구조내로 삽입된다. 최종적으로 HIV-1-MLV 하이브리드 LTR은 2가지 주요한 PCRs(주형으로서 pHIVdge2를 갖는 NIT 9 및 NIT 10을 사용함; 주형으로서 pLXSN을 갖는 NIT11및 NIT 12)(Accession number M28248; Miller등, 1989) 및 하나의 2차 PCR 반응(NIT 9 및 NIT 12를 사용함)에 의해 제조될 것이다. 상기 PCR 생성물은 Construct B3를 제조하도록 Construct B2내에 Xhol 및 EcoRl 자리에서 삽입될 것이다.

NIT 9:5'-gagcagcatctcgagacctgg-3'(SEQ ID NO:9)

NIT 10:5'-tggcgttacttaagctagcaggcctgtcttctttgggagtgttttagc-3'(SEQ ID No:10)

NIT 11:5'-cccaaagaagacaggcctgctagcttaagtaacgccatttttcc-3'(SEQ ID:11)

NIT 12:5'-cctgaattccgcggaatgaaagacccccgctgacg-3'(SEQ ID NO:12)

C:완전한 벡터

Construct B3로부터 Construct A2내로 Spel-Sacll분획을 삽입함으로써 벡터의 2가지 절반이 조합된다. 결과 Construct, C1은 다중-유전자 조작 자리를 갖는다; Xhol-Sall-Clal-Hindlll-EcoRV-EcoRl-Pstl-Saml-BamHl-Spel(줄친 자리는 벡터내에 유일하다). 이 플라스미드는 pLLD1을 계획하며, 이것이 제조하는 레트로바이러스 벡터는 LLD1이다.

그런 다음-갈락톡시다제 유전자를 pSP72-lacZ(Xhol-BamHI)로부터 취하고, Sall 및 BamHI에서 Construct C1내로 삽입하여 LLD1-lacZ를 제조하였다. 이는 HIV gag 및 pol 성분(pRV664, 도 5) 및 HIV로부터 gp160을 발현하는 플라스미드(pRV438 또는 pSynp 160mn, 도 5) 또는 VSVG 단백질을 발현하는 플라스미드(pRV 67, 도 5)중 어느 하나를 제공하는 플라스미드를 갖는 293T 세포를 형질감염하는데 사용되었다. 동일한 단백질을 엔코딩하는 어떠한 플라스미드가 동일하게 잘 기능할 것이다. 제조된 결과 바이러스는 gp160을 함유하는 바이러스의 경우에 CD4+ Hela 세포로 그리 고 VSVG 지지 바이러스의 경우에 CD4- Hela 세포로 lacZ 유전자를 형질도입한다. 부가하여 상기 VSVG 지지 바이러스는 유사분열후 뉴런에 lacZ를 운반한다. 각 경우에 Xgal 염색으로 측정시 lacZ 유전자의 발현은 매우 크며, Tat에 독립적이다.

실시예 2

다른 LLD 벡터

실시예 1에 기술한 것과 유사한 시스템이 다른 렌티바이러스로부터 제조될 수 있다. 이들 시스템은 HIV를 사용하여 유전자 전달 시스템에서의 연관된 인지된 손상을 극복한다. 예를 들어 구조는 FIV(Talbott등, 1989 PANS 86, 5743), EIAV(Payne등, 1994 J. Gen.Virol. 75, 425), Visna 바이러스(Sonigo등 1985 Cell 42, 369; Querat등, 1990 Virology 175, 434), BIV Garvey등, 1990 Virology 175, 391) 및 SIV(Los Alamos 서열 데이터베이스)로부터 서열 정보를 사용하여 고안될 수 있다.

도면 설명

도 2. 실시예: HIV-기초 LLD 벡터

윗첨자 H = HIV-유도된 서열(어떠한 렌티바이러스로부터일 수 있다)

윗첨자 M = MLV-유도된 서열

= 포장 자리(gag 영역을 포함한다)

PBS= 2차 스트랜드 준비 자리

INTERNAL = 유전자, 선별가능한 마커, 다른 촉진제 혹은 HIV RRE 및 Rev 코딩 서열과 같은 RNA 취급 시스템을 포함하는 영역

도 3. NIT 벡터 게놈(3789bp + 백본 2929bp=6718bp을 삽입):

pRV109로부터의 HCMV 촉진제(-521∼-1).

HXB2로부터의 HIV서열(552∼1144; 5861∼6403; 7621∼9085).

유전자 타입;gag-;pol-; env-;rev+;RRE:vif-;vpu-;vpr-;tat-;nef-.

돌연변이:

.ATG를 제거하기 위한 3지점 돌연변이(790,834,894)(@)

.2가지 염기 삽입에 의한 프레임이동 돌연변이(831)(*)

.Ndel(6403) 및 Bglll(7621)간의 결실()

다중 유전자 조작 자리(X); Xhol-Sall-Clal-EcoRV-EcoRI-Pstl-Smal-BamHI-Spel; 밑줄친 자리는 유일함.

다중 유전자 조작 자리내로 최대 삽입 자리: 5997bp.

백본; pBluescriptKS+.

도 5. 포장 성분의 도식 다이아그램.

pRV664는 HIV-1 HXB2 gagpol(637∼5748)을 엔코드하고 RRE(7720∼8054)를 포함하고 그 백본은 pCl-neo(PROMEGA)이다.

pRV438은 CMC 촉진제를 갖는 포유류 발현 플라스미드인 pSA91내에 HXB2(5955∼8902)로부터 rev 및 env 양자를 갖는다. pSYngp 160mn(B.Seed로부터)는 포유류 세포내에 최적화된 코돈 사용처를 갖도록 변형된 HIV-1 MN막에 대한 발현 플라스미드이다. pRV67은 pSA91내에 VSV G 발현 플라스미드이다.

본 발명에 의하면, 분열하지 않는 포유류 표적 세포를 감염시키고 형질도입할 수 있으며, HIV와 같은 렌티바이러스에 기초할 수 있고, DNA 프로바이러스내에서 프로바이러스의 5' LTR내에 비-렌티바이러스 발현 제어 요소를 제공하도록 구조화된 RNA 게놈을 갖는 레트로바이러스 벡터 입자가 제공될 수 있다.

Claims

분열하지 않는 포유류 표적 세포를 감염 및 형질도입할 수 있으며,

DNA 프로바이러스의 형태일 때, 표적 세포 게놈내로 삽입될 수 있는 포장가능한 RNA 게놈을 포함하여 이루어지며,

상기 RNA 게놈은 DNA 프로바이러스내에서 제공하는 서열;

a)제1 레트로바이러스의 촉진제 기능을 대신하여 프로바이러스의 5' 긴 말단 반복(long terminal trpeat, LTR)내에 위치된 비-렌티바이러스 발현 제어 요소; 및

b) a)내에 비-렌티바이러스 발현 제어 요소의 전사 제어하에 LTR사이에 위치된, 선택된 유전자 또는 유전자들;을 포함하여 이루어지는,

제1 레트로바이러스에 기초한 레트로바이러스 벡터 입자
제1항에 있어서, 상기 제1 레트로바이러스는 통상 DNA 프로바이러스내에서 5' 렌티바이러스-단백질 의존 촉진제 기능을 제공하는 렌티바이러스 서열 혹은 서열들이 부재(不在)하는 렌티바이러스임을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 입자
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 벡터가 기초로 하는 렌티바이러스는 HIV이며, 기능성 TAR 서열은 부재함을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 입자
제3항에 있어서, 나아가 상기 벡터 게놈은 표적 세포의 핵으로부터 세포질로 게놈의 RRE-함유 RNA 전사체의 수출을 가능하게 하는, 기능성 rev 및 RRE 서열을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 입자
제2항 내지 제4항중 어느 한항에 있어서, 상기 렌티바이러스 R 부위는 비-렌티바이러스 R영역으로 대체됨을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 입자
제1항 내지 제5항중 어느 한항에 있어서, 상기 비-렌티바이러스 발현 제어 요소는 비-렌티바이러스 조절 인자에 의해 유도가능한 조절된 촉진제임을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 입자
제6항에 있어서, 상기 조절된 촉진제는 비-바이러스 조절 인자에 의해 유도가능함을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 입자
제1항에 있어서, 상기 발현 제어 요소는 MLV LTR 촉진제를 포함함을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 입자
제1항 내지 제8항중 어느 한항에 있어서, 상기 비-렌티바이러스 발현 제어 요소는 비-렌티바이러스, 레트로바이러스 U3 및 R 영역, 혹은 그 기능부를 포함함을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 입자
제2항 내지 제9항중 어느 한항에 있어서, 상기 RNA 게놈은 제1 비-렌티바이러스 R영역, 통합 및 역전사하기에 충분한 렌티바이러스 U5 영역의 분획, 제1 스트랜드 역전사를 위한 프라이머 결합 자리, 포장 신호, 최소 하나의 선택된 유전자를 포함하는 내부 영역, 제2 스트랜드 역전사를 위한 프라이머 결합 자리, 통합하기에 충분한 렌티바이러스 U3 영역의 짧은 결합서열, 비-렌티바이러스 촉진제, 및 상기 제1 R 영역과 실질적으로 동일한 제2 R 영역을 포함함을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 입자
촉진제와 실시가능하게 결합된, 제1항 내지 제10항중 어느 한항에 의한 레트로바이러스 벡터 입자에 대하여 포장가능한 RNA 게놈을 엔코딩하는 DNA 구조
제11항에 있어서, 상기 촉진제는 고효율성 촉진제임을 특징으로 하는 DNA 구조
제11항 내지 제12항에 있어서, 상기 선택된 유전자는 부재(不在)하고, 상기 구조는 선택된 유전자 혹은 유전자들이 삽입될 수 있는 삽입 자리를 갖음을 특징으로 하는 DNA 구조
제11항 내지 제13항중 어느 한항에 의한 DNA구조로 형질감염되거나 형질도입된 숙주 세포를 포함하며, 제1항 내지 제10항중 어느 한항에 의한 레트로바이러스 벡터 입자를 생성할 수 있는 레트로바이러스 벡터 입자 생성 시스템
제1항 내지 제10항중 어느 한항에 의한 레트로바이러스 벡터 입자의 성분을 엔코딩하는 헥산 서열 셋트를 포함하는 레트로바이러스 벡터 입자 생성 시스템
표적 세포를 감염 및 형질도입하도록 하여 유전자 치료에 사용되는 제1항 내지 제10항중 어느 한항에 의한 레트로바이러스 벡터 입자
유전자 치료에 사용하기 위한 의약품 조제시 사용되는 제1항 내지 제10항중 어느 한항에 의한 레트로바이러스 벡터 입자
제1항 내지 제10항중 어느 한항에 의한 레트로바이러스 벡터 입자를 갖는 표적 세포를 감염 및 형질도입함을 특징으로 하는 표적 세포상에서의 유전자 치료 수행 방법
제16항 내지 제18항중 어느 한항에 따른 사용이나 방법에서의 결과물인 표적 세포