KR20000010881A

KR20000010881A - 치료 방법

Info

Publication number: KR20000010881A
Application number: KR1019980709025A
Authority: KR
Inventors: 마이클 제라드 토베이
Original assignee: 레이스 로버트; 파마 퍼시픽 프로프라이어테리 리미티드
Priority date: 1996-05-09
Filing date: 1997-05-05
Publication date: 2000-02-25
Also published as: KR100399500B1; AR007057A1

Abstract

본 발명은 포유동물에서 숙주 방어 메카니즘 또는 면역 반응을 자극시키기 위해 숙주 방어 메카니즘 또는 면역 반응을 자극하는 양의 인터페론과 구강점막을 접촉시키기 위한 인터페론 조성물, 이러한 조성물로 치료하는 방법 및 이러한 구강점막 조성물의 제조시 인터페론의 용도에 관한 것이다.

Description

치료 방법

α-인터페론은 모양(毛樣)세포성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 저급 림프종, 피부 T-세포 림프종을 비롯한 다양한 악성 혈액 종양 및 고형 종양, 예컨대, 신장세포 암종, 흑색종, 카르시노이드 종양 및 AIDS-관련된 카포시(Kaposi)의 육종 등의 치료에 널리 사용된다[구터만(Gutterman J. U.), 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 1994 91:1198-1205 참조]. 비경구적 주사로 투여된, 인터페론-α(IFN-α)의 높은 투여량, 종종 수 십 밀리온 단위의 투여량 수준에서 항종양 효과가 통상적으로 나타난다. 인터페론-β(IFN-β)는 재발성-완화성 다발성경화증, 및 만성 B형 간염 및 C형 간염의 치료에 임상적으로 사용할 수 있도록 허가되어 있다.

인터페론-α 및 인터페론-β는 둘다 I형 인터페론이다. I형 인터페론은 IFN-α, IFN-β 및 IFN-ω의 약 16개의 아군을 포함하는 천연-발생 사이토킨의 큰 부류이다. I형 인터페론은 단일 세포 표면 수용체에 결합하고, 복합적인 순서의 신호 변환을 자극하여, 궁극적으로는 항-바이러스, 항-증식 및 기타 면역조절 효과, 사이토킨 유도, 및 I부류 HLA와 II부류 HLA 조절을 유도한다[페스카(Pestka) 등, 문헌 "Annu. Rev. Biochem.", 1987 56:727 참조]. I형 IFN의 개개의 아형은 활성이 다양하다. 각 위치에서 매우 빈번하게 관찰되는 아미노산은 IFN-α의 다수의 대립유전자 아형들을 주사함으로써 확인되었고, 콘센서스(consensus) 서열을 갖는 합성 I형 인터페론이 합성되었다[알톤(Alton) 등, 문헌 "The Biology of the Interferon System", 드 메이어(E. de Maeyer) 및 쉘레켄스(H. Schellekens) 편집, Elsevier(1983) 1991-128 참조]. 이러한 콘센서스 인터페론은 상업적으로 이용가능하고[인터겐(Infergen); 암겐 인코포레이티드(Amgen, Inc.) 제품], 최근에는 IFN-α2a 또는 IFN-α2b보다 높은 활성(중량/중량)을 갖는 것으로 제시되었고; 콘센서스 IFN은 개개의 천연 아형의 IFN에 비해 임상적으로 우수할 것으로 제안되었다[블라트(Blatt) 등, "J. Interferon and Cytokine Reserch", 1996 16:489-499 참조].

정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 국소적 주사 및 병변내 주사를 비롯한 다수의 투여 경로가 I형 인터페론의 투여에 통상 사용되지만, 경구 투여는 일반적으로 사용되지 않았는데, 이는 인터페론이 단백질분해 효소에 의해 불활성화되는 것으로 고려되고, 위장관내에서 네이티브(native) 형태로는 잘 흡수되지 않는 단백질이기 때문이다. 실제로, 경구 투여후 혈액에서 인터페론을 검출하려는 다수의 연구가 실패하였다[칸텔(Cantell) 및 피핼라(Phyhala), 문헌 "J. Gen. Virol." 1973 20:97-104; 윌스(Wills) 등, 문헌 "J. IFN Res.", 1984 4:399-409; 길슨(Gilson) 등, 문헌 "J. IFN Res.", 1985 5:403-408 참조].

최대의 치료 효과를 수득하기 위해서는 가능한한 가장 높은 투여량으로 인터페론을 사용해야 하는 것은 널리 인지되어 있다. 재조합 물질의 이용가능성은 매우 높은 투여량 수준이 실행될 수 있음을 의미하지만, 실제로는 인터페론 투여의 부작용에 의해 사용될 수 있는 인터페론의 투여량과 치료 기간은 심각하게 한정되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 부작용은 일부 경우 심지어 자살까지 유발시키는 심각한 권태감 및 우울증을 포함한다. 문헌 "New England Journal of Medicine"에서 후프나글(Hoofnagle, J. H.)에 의한 최근의 논문에 이러한 문제점이 요약되어 있다[후프나글 및 라우(Lau, D.), 문헌 "New Eng. J. Medicine" 1996, 334; 1470-1471 참조]. B형 간염 항원-양성의 만성 B형 간염을 앓는 환자에서 인터페론-α의 치료 효과를 메타-분석한 결과, 3 내지 6개월 동안 매일 5밀리온IU로, 또는 1주당 10밀리온IU로 3회 치료된 전형적인 만성 B형 간염을 앓는 환자에서 완화율은 25 내지 40%임을 알 수 있었다. 그러나, 이는 대부분의 환자가 간염 표면 항원에 대해 양성이고 폴리머레이스 쇄 반응에 의해 시험될 때 바이러스성 DNA가 잠복해 있는 경우, 치료가 부족하게 된다. 추가로, 인터페론의 이러한 투여량은 내약성이 불량하고, 환자중 10 내지 40%는 불내약성 부작용에 기인하여 투여량을 감소시켜야 한다. 그러나, 매일 1밀리온IU의 양호한 내약성 투여량에서, 완화율은 단지 17%이다[페릴로(Perrillo) 등, 문헌 "New Eng. J. Medicine", 1990, 323:295-301 참조]. 만성 C형 간염을 앓는 환자의 경우, 지속적인 장기간의 개선은 HCV RNA의 감소와 관련되는데, 이는 6개월 동안 1주당 3밀리온IU의 투여량으로 3회 치료된 환자중의 10 내지 20%의 환자에서 발생한다[후프나글 및 라우, 상기 문헌 참조]. 암을 앓는 환자의 경우, 상당한 반응율은 인터페론-α의 가장 높은 내약성 투여량에서만 통상 나타난다. 따라서, 다발성골수종을 앓는 환자에서, 예컨대 반응율은 매일 20 내지 30밀리온IU로 치료된 환자의 경우 50%, 3밀리온IU로 치료된 환자의 경우 단지 15 내지 20%이다. 그러나 극히 소수의 환자만이 어느 정도의 기간 동안의 고투여량 섭생에 견뎌낼 수 있다[아레(Ahre) 등, 문헌 "Eur. J. Hematol", 1988, 41:123-130 참조]. 따라서, 심각한 부작용을 유발시키지 않으면서 인터페론을 높은 투여량으로 투여할 수 있는 방법이 당해분야에 요구된다.

많은 바이러스성 질병, 특히 인플루엔자의 치료시 비측 스프레이 또는 경구 액체 제형물로서 낮은 용량으로 투여된 인터페론의 효능에 대한 일화가 담긴 보고들이 많이 있다. 그러나, 이들 보고의 대부분의 경우, 사용된 인터페론 제제는 비교적 조야하였다. 라이노바이러스(rhinovirus) 감염 치료를 위한 비교적 높은 투여량의 비측내 인터페론의 위약-조절된 시험에 따라, 치료는 효과적이었지만 상당한 부작용이 발생하였음을 알 수 있었다[헤이든(Hayden) 등, 문헌 "J. Infect. Dis.", 1983 148:914-921 참조]. 유사하게, 두가지 무작위적인 임상적 이중 맹검을 비롯한 다수의 연구[더글라스(Douglas) 등, 문헌 "New Engl. J. Med.", 1986 314:65-80; 헤이든 등, 문헌 "New Engl. J. Med.", 1986 314:71-75]가 라이노바이러스 감염증에 노출된 대상을 보호하는데에 비측 투여된 높은 투여량의 재조합 인터페론-α2가 효능이 있음을 입증하였지만, 이러한 연구는 전신 효과에 대해서는 어떠한 증거도 제공하지 않았다.

보다 최근에, 일련의 특허원에는 소에서 감염성 라이노기관염("선적열병")의 치료, 및 고양이의 백혈병 치료; 백신의 효능 향상을 위한 기타 질병의 치료; 식품 이용 효율의 개선; 및 소의 타일레리아증(theileriosis)의 방지를 위해 이종성 기원의 인터페론을 낮은 투여량으로 경구 투여하여 사용함이 기재되어 있다. 미국 특허 제 4,462,985호, 오스트레일리아 특허 제 608519호, 오스트레일리아 특허 제 583332호 및 미국 특허 제 5,215,741호를 각각 참조한다. 또한, 미국 특허 제 5,017,371호에는 암의 화학치료법 또는 방사선치료법의 부작용을 치료하기 위해 상기 방식으로 인터페론을 사용함이 개시되어 잇다. 이들 특허 명세서에서, 사용된 인터페론은 체중 1파운드당 0.01 내지 5IU의 투여량으로, 포스페이트 완충된 염수에 용해되어 투여된, 칸텔(Cantell)의 방법에 의해 제조된 인간 인터페론-α였다. 이러한 명세서에는 구강인두 점막에, 바람직하게는 구강 점막과 장기간 접촉되도록 채택된 형태로 투여된 인터페론의 이러한 낮은 투여량은 암을 비롯한 매우 다양한 질병의 치료에 효과적일 수 있는 것으로 제안되어 있는데, 선적열병, 고양이 백혈병, 개의 파라보바이러스 타일레리아증 이외의 기타 질병에 대한 실험적 증거는 일화에 불과하다. 특히, 인간 암을 위한 임의의 동물 모델에서 이러한 치료가 적절하게 조절된 시도는 존재하지 않는다.

경구 또는 구강인두 점막을 통해 투여된 인터페론의 매우 낮은 투여량의 효과에 대한 보다 최근의 연구가 조사되어 있다[보시(Bocci) 등, 문헌 "Clin. Pharmacokinet.", 1991, 21:411-417; 크리틱(Critic), 문헌 "Rev. Therap. Drug Carrier Systems," 1992, 9:91-133; 쿠민스(Cummins) 및 조지아데스(Georgiades), 문헌 "Archivum Immun. Therap. Exp.," 1993, 41:169-172 참조]. 이러한 유형의 치료는 특히 HIV 감염의 치료에 유용하고, AIDS 환자의 경우 적어도 삶의 질을 개선시킬 수 있다[카이저(Kaiser) 등, 문헌 "AIDS", 1992 6:563-569; 코에치(Koech) 등, 문헌 "Mol. Biol. Ther.", 1990 2:91-95 참조]. 그러나, 다른 보고에 따르면, 이러한 치료는 임상적 이점을 전혀 제공하지 않는다. B형 간염을 치료하기 위해 낮은 투여량으로 인터페론을 함유하는 경구 로젠지의 사용에 대한 Phase I 연구가 또한 보고되어 있다[지엘린스카(Zielinska) 등, 문헌 "Archiv. Immunol. Therap. Exp.", 1993, 41:241-252].

대조적으로, 브라이엄(Brigham) 및 우먼스 하스피털(Women's Hospital)의 국제 특허원 제 WO95/27499호에 따르면, 위장 삽관에 의해 투여된 인터페론-β는, 항원 도입 전에 제공된다면, 인지된 동물 모델에서 I형 당뇨병, 다발성경화증 및 자가면역 관절염 등의 자가면역 질환의 진행을 적어도 부분적으로 억제할 수 있었다. 이러한 경로로 제공되거나 위장내 "방관자" 항원과 함께 복강내로 투여된 인터페론-β는 내약성의 유도에 보다 효과적이었다. 이는 인터페론-β가 외인성 항원에 대한 체액 반응 또는 세포 반응을 유발시키는데 효과적이기 보다는 경구 내약성의 유발을 증진시키는데 효과적임을 제안한다.

오스트레일리아 특허원 제 PN 9765호에는, 구강점막 경로에 의해 구강인두 공동(空洞)으로 투여된 낮은 투여량의 인터페론이 매우 전이성이 큰 종양 세포에 의한 항원투여에 대해 마우스를 보호하는데 효과적인 것으로 제시되어 있다. 극소수의 물질들이 매우 공격적인 이들 종양에 대해 활성을 나타낸다는 사실과 함께, 상기 결과의 꽤 예외적인 성질은 구강인두 공동에 인터페론을 투여하는 것이 암의 치료에 유용하다는 것을 나타낸다. 인터페론의 낮은 구강점막 투여량은, 중추신경계 침습 및 뇌염을 특징으로 하는 신속하게 진행되는 치명적인 질환을 일반적으로 일으키는 뇌심근염 바이러스(EMCV)가 복강내로 주사된 마우스를 치료하는데에도 효과적이였다. 이러한 시스템은 항바이러스 활성에 대한 매우 엄격한 시험이지만, 인터페론의 투여를 위한 구강점막 경로는 복강내 투여에 비해 효과적이었다.

발명의 요약

본 발명은 경구적으로 투여될 때 병리학적 반응을 유발시키는 투여량에 비해 높은 투여량으로, 일반적으로는 남성의 경우 동종성 인터페론-α의 약 20×10⁶IU 보다 큰 투여량으로 인터페론을 구강점막을 통해 투여함으로써 포유동물에서 숙주 방어 메카니즘을 자극하는 방법을 제공한다. 또다른

유형의 인터페론의 경우, 병리학적 반응을 유발시키는 투여량은 남성의 경우 동종성 인터페론-α에 의해 유발된 투여량과 상이할 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명은 면역 자극량(이 양은 경구적으로 투여될 때 병리학적 반응을 유발시키는 투여량과 동일한 인터페론의 투여량보다 더 많은 양이다)의 인터페론을 구강점막 접촉을 통해 포유동물에게 투여함으로써, 포유동물에서 면역 반응을 자극시키는 방법으로서 고려될 수 있다.

다르게는, 본 발명은 인터페론을 구강점막을 통해 투여하여 인터페론의 치료 지수를 증가시키는 방법을 제공한다.

구강점막 투여는 인터페론의 효과적인 투여량을 단일 투여량으로 투여함을 포함할 수 있거나, 또는 효과 투여량은 단일 투여량의 면역 자극에 해당하는 면역 자극을 이끌어내기에 충분한 기간에 걸쳐 보다 작은 투여량으로 다수회 투여될 수 있다. 이와 유사하게, 인터페론의 투여량은 단일 투여량의 효과에 해당하는 효과를 유도하기에 충분한 기간에 걸쳐 연속적으로 투여될 수 있다.

적용된 양태에서, 본 발명은 구강점막 접촉을 통해 효과량(이 양은 비경구적으로 투여될 때 병리학적 반응을 유발시키는 동일한 인터페론의 투여량보다 더 많은 양이다)의 인터페론을 포유동물에게 투여함으로써 자가면역질환, 마이코박테리아 질환, 신경퇴화 질환, 신생물질 질병 및 바이러스 감염증을 치료하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 관절염, I형 당뇨병, 루푸스 및 다발성 경화증 등의 자가면역 질환, 나병 및 결핵 등의 마이코박테리아 질환, 해면형 뇌염 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob)병 등의 신경퇴화 장애, 말라리아 등의 기생충 질환, 및 경부암, 생식기 포진, B형 간염, C형 간염, HIV, HPV, HSV-1 및 HSV-2 등의 바이러스성 질환을 치료하는 방법을 제공한다..

또한, 본 발명은 다발성골수종, 모양세포성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 저급 림프종, 피부 T-세포 림프종, 카르시노이드 종양, 경부암, 카포시 육종을 비롯한 육종, 신장 종양, 신장세포 암종, 간세포 암종, 비인두 암종을 비롯한 암종, 악성 혈액 종양, 결장직장암, 신경교아세포종, 후두 유두종, 폐암, 결장암, 악성 흑색종, 및 악성 뇌종양을 비롯한 뇌종양을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 비-바이러스성 병인의 종양을 치료하는데 일반적으로 적용될 수 있다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 치료 효과량(이 양은 비경구적으로 투여될 때 병리학적 반응을 이끌어내는 양보다 더 많은 양이다)의 하나 이상의 인터페론, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 구강점막 투여용 약학 조성물을 제공한다. 이 조성물은 용액, 정제, 로렌지, 젤, 시럽, 페이스트 또는 방출량이 조절되는 구강점막 전달 시스템으로서 제공될 수 있다. 선택적으로, 이 조성물은 완충제, 안정화제, 농후제, 흡수 및 점도 증진제 등을 함유할 수 있다.

한 실시태양에서, 약학 조성물은 약 20×10⁶IU 내지 약 1000×10⁶IU, 바람직하게는 약 20×10⁶IU 내지 약 500×10⁶IU, 보다 바람직하게는 약 50×10⁶IU 내지 약 500×10⁶IU의 인터페론을 포함하는 단위 투여형으로 제공된다.

본 방법은 유일한 치료적 접근 방안으로서, 또는 방사선치료법, 화학치료법에 대한 보조방법으로서, 또는 인터류킨-2, 12 또는 15 등의 기타 사이토킨과 함께, 또는 IFN-유도물질과 함께 실행될 수 있다.

본 방법은 바람직하게는 α, β, γ, ω 및 콘센서스 인터페론으로부터 선택된 I형 또는 II형 IFN을 사용하여 수행되고, 재조합 IFN-α를 사용하여 수행되는 것이 가장 바람직하다.

본 발명은 인터페론을 높은 투여량으로 구강점막을 통해 투여함으로써 포유동물에서 병리학적 질병에 대한 숙주 방어 메카니즘을 자극시키는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 자가면역 질환, 신생물질 질환, 신경퇴화 질환, 기생충 질환 및 바이러스 질환을 치료하는 방법에 적용될 수 있다.

본 발명은 단지 참고할 목적으로 하기 정의 및 실시예를 사용하여 상세히 기술될 것이다. 본원에 언급된 모든 특허 및 간행물은 참고로 본원에 명백히 인용되어 있다.

정의

본원에서 "인터페론"이란 통상 α, β, γ 및 ω, 및 이들의 혼합물(콘센서스 서열을 포함함)로 통상 표시되는 인터페론을 포함하는 I형 또는 II형 인터페론을 지칭한다. 인터페론은 다양한 상업적인 원료로부터 입수할 수 있고, 다양한 전조(前兆)의 치료에 대해 인가되어 있다. 인터페론은 천연 원료로부터 얻어질 수 있지만, 재조합 생성물이 바람직하다. 본 발명에 있어서, "인터페론"이란 용어는 인터페론 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 이들의 단편, 및 예컨대 인터페론의 생물학적 활성의 성질에는 영향을 주지 않으면서 안정성을 향상시키기 위해 서열 변화가 도입된 인터페론의 키메라 또는 돌연변이 형태(예컨대, 미국 특허 제 5,582,824호, 제 5,593,667호 및 제 5,594,107호에 개시된 형태)를 또한 포함한다.

"높은 투여량"이란 용어는 정맥내 또는 복강내 투여 등의 비경구적 경로에 의해 제공될 때 동일한 인터페론에 대해 일반적으로 내약성인 최대 투여량보다 큰 투여량을 의미한다. 현재 계획되는 바로서, 인터페론의 높은 투여량은 70kg의 성인에 대해 동종성 인터페론-α의 약 20×10⁶IU보다 더 많은 양이다. 바람직하게는, 투여량은 약 30×10⁶IU이다. 본 발명의 특히 바람직한 형태에서, 총 투여량은 약 50×10⁶IU 내지 약 1000×10⁶IU이고, 보다 바람직하게는 약 50×10⁶IU 내지 500×10⁶IU이다. 본원에서, "높은 투여량"이란 일반적으로 구강점막을 통해 투여될 때의 치료 효과량으로 고려되고, 이는 비경구적으로 제공될 경우에는 허용할 수 없는 부작용의 발생 또는 독성의 대리 마커에 의해 나타나는 병리학적 반응을 유발시킬 수 있다. 높은 투여량에 대한 정의는 필수적으로 가변적인데, 이는 투여량이 특히 환자 개개의 감수성, 신체 크기, 체중 및 연령, 치료될 질병의 성질 및 위중성, 사용될 특정 인터페론 및 투여용 특정 비히클에 따라 달라지기 때문이다. 특정 인터페론으로 환자를 치료하는 의사는 치료될 환자에 적합한 높은 투여량 범위를 쉽게 인지할 수 있을 것이다.

선택적으로, 인터페론은 인터페론 합성 및 방출의 유도물질과 공동으로 투여될 수 있다. 유도물질은 인터페론과 함께 투여될 수 있거나, 또는 별도로 투여될 수 있다. 인터페론의 유도물질로는, 예컨대 폴리I:C 등의 폴리누클레오티드가 포함되고, 바람직하게는 경구적으로 투여가능한 저분자량의 인터페론 유도물질이 사용된다. 적합한 유도물질은 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 틸로론(Tilorone)[미국 특허 제 3592819호; 알브레츠트(Albrecht) 등, 문헌 "J. Med. Chem.", 1974, 17:1150-1156] 및 퀴놀론 유도체인 이미퀴모드(Imiquimod)[새비지(Savage) 등, 문헌 "Brit. J. Cancer", 1996, 74:1482-1486]가 있다.

본 발명의 방법 및 조성물은 선택적으로 특정 질병에 대한 하나 이상의 다른 치료제 및 치료방법과 함께 사용될 수 있고, 담당의사 또는 수의사는 그 상황에 적절할 수 있는 다른 치료제 및 치료 방법을 쉽게 선택할 수 있을 것이다.

한 실시태양에서, 본 발명은 상술된 바와 같은 인터페론의 투여 단계를 포함하는, 포유동물에서 신생물질 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 신생물질 질병은 전이성 암일 수 있다.

본 발명의 방법은 다른 제제와 함께 동시에 치료되지 않으면서 사용될 수 있지만, 본 발명의 이러한 실시태양은 특히 하기의 경우에 유용할 것으로 생각된다:

a) 표준 프로토콜에 의해 제공되는 수술, 화학치료법 또는 방사선치료법 이후의 보조 치료법으로서 이용된다;

b) 인터페론-감수성 신생물질 형성의 치료를 위해, 본 발명의 방법은 단독으로, 또는 통상의 화학치료법 또는 방사선치료법과 함께 이용된다.

c) 인터페론-내성 신생물질 형성의 치료를 위해, 본 발명의 방법은 단독으로, 또는 가장 바람직하게는 통상의 화학치료법 또는 방사선치료법과 함께 이용된다.

상기 방법은 질환의 완화를 유도하고/하거나 유지하도록 지향된다. "다른 치료와 함께"란 인터페론이 방사선치료법 또는 다른 화학치료법을 사용하기 전, 그 동안 및/또는 그 후에 투여됨을 의미한다. 가장 적합한 프로토콜은 후술되는 바와 같이 다양한 인자에 따라 달라진다.

특히, 본 발명의 방법은 바람직하게는 세포증식억제 약제, 하나 이상의 다른 사이토킨(이는 항암 활성을 갖지만 인터페론과는 상이한 메카니즘을 갖는다), 맥관형성억제제, 및 인터페론의 활성을 강화시키는 제제를 사용하는 화학치료법들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 치료 방법과 함께 사용될 것이다. 두번째의 2 사이토킨은 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-12(IL-12) 또는 인터류킨-15(IL-15)가 바람직하고; 맥관형성 억제제는 AGM-1470이 바람직하고; 인터페론-강화 치료제는 고체온유발제 또는 아르기닌 부티레이트가 바람직하다.

인터페론과 함께 투여될 수 있는 바람직한 세포증식억제 약제로는 사이클로포스파미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 카르무스틴(BCNU; N,N-비스(2-크로로에틸)-N-니트로소우레아), 메토트렉세이트, 아드리아마이신, α-디플루오로메틸오르니틴 및 5-플루오로우라실이 있지만, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 영향을 받는 신생물질 질병으로는 높은 투여량의 IFN-α의 비경구 투여에 반응하는 암, 예컨대 악성 혈액 종양, 다발성골수종, 모양세포성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 저급 림프종, 피부 T-세포 림프종, 및 고형 종양(예컨대, 신장세포 암종, 흑색종, 카르시노이드 종양 및 AIDS-관련된 카포시(Kaposi)의 육종), 특히 비바이러스성 병인의 악성 종양이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바이러스성 질병은 예컨대 라이노바이러스, 인플루엔자, 허피스 바리셀라(herpes varicella), 허피스 조스터(herpes zoster), 뎅그열병(dengue fever) 등의 급성 또는 전격성 감염, 또는 홍역 바이러스 뇌염, 무레이 밸리(Murray Valley) 뇌염, 일본 B형 뇌염, 진드기-매개 뇌염 및 허피스 뇌염(이에 한정되지 않는다)을 비롯한 바이러스성 뇌염; 에볼라(Ebola) 바이러스, 마르버그(Marburg) 바이러스, 라사(Lassa) 열병 등의 출혈성 열병; 한타(Hanta) 바이러스 감염증 및 동물로부터 인간으로 전염되는 것으로 생각되는 기타 바이러스성 감염, 예컨대 말의 모르빌리바이러스(morbillivirus) 등일 수 있다. 이러한 질병중 많은 질병에 있어서, 현재 이용될 수 있는 치료법 및/또는 백신이 없고, 도움이 되는 치료법이 부적절할 수 있다. 다르게는, 바이러스성 질병은 예컨대 B형 간염, C형 간염, D형 간염 또는 바이러스성 간염의 다른 형태, 및 CMV, HIV, HPV, HSV I 및 II 감염 등의 만성 감염의 결과일 수 있다. B형 간염 및 C형 간염은 둘다 현재 비경구적 인터페론에 의해 치료되고; AIDS로 진행되는 HIV 감염에 대한 장기간의 인터페론 치료는 임상 시험중에 있다.

제 2 실시태양에서, 치료될 질환은 말라리아이고, I형 또는 II형 인터페론은 상술된 바와 같이 투여된다. 말라리아의 원인 유기체는 플라스모디움 말라리아에(Plasmodium malariae), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 또는 플라스모디움 오발레(Plasmodium ovale)일 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 말라리아의 뇌성 형태로의 진행을 보호할 것이다.

제 3 실시태양에서, 본 발명은 상술된 바와 같이 인터페론을 투여하는 단계를 포함하는, 재발성-완화성인지 또는 만성 진행 유형인지와는 무관한 HIV, 류마티스 관절염 및 다발성경화증, 또는 AIDS 등의 면역결핍증 등의 자가면역 장애의 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 방법 및 투여 형태는 다른 치료와 함께 사용될 수 있다. 예컨대, 허피스 바이러스 감염증의 경우, 아시클로비르 또는 간시클로비르가 사용될 수 있다. HIV 감염의 경우, 아지도티미딘(지도부딘) 또는 하나 이상의 다른 HIV 역전 트란스크립테이스(transcriptase) 억제제, 및/또는 HIV 프로테이스(protease) 억제제가 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 제조에 있어서, IFN를 위한 다양한 비히클 및 부형제가 사용될 수 있고, 이는 당해 분야의 숙련가에게는 자명할 것이다. 대표적인 제형 기법은 특히 문헌[레밍턴(Remington), "The Science and Practice of Pharmacy", 제 19 판, Mack Publishing Co, Easton, PA, 1995 및 그의 선행판]에 교시되어 있다. IFN 제형은 미국 특허 제 4,496,537호에 기술된 바와 같이 글리신 또는 알라닌 등의 안정성 증진제, 및/또는 담체 단백질 등의 하나 이상의 담체를 포함할 수 있다. 예컨대, 인간 약학적 등급의 치료를 위해 선택적으로 포스페이트-완충된 염수를 희석제로 함께 사용한 인간 혈청 알부민이 통상적으로 사용된다. IFN용 부형제가 인간 혈청 알부민인 경우, 인간 혈청 알부민은 인간 혈청으로부터 유도될 수 있거나, 또는 재조합체 기원일 수 있다. 혈청 알부민이 사용될 때, 이는 정상적으로는 동종 기원일 것이다.

IFN은 수여자의 구강점막 공동과 IFN의 접촉을 제공하는 임의의 수단에 의해 투여될 것이다. 따라서, 본 발명이 임의의 특정 유형의 제형에 한정되지 않음을 분명히 이해할 것이다. 본 명세서에는 구강점막 공동내로 IFN를 깊이 투여함이 기재되어 있고; 이는 액체, 고체 또는 에어로졸 뿐만 아니라 비측 드롭 또는 스프레이로 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 액체, 스프레이, 시럽, 로젠지, 협측(頰側) 정제 및 분무 제형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당해 분야의 숙련가라면 에어로졸 또는 분무 제형의 경우, 제제의 입자 크기가 중요할 수 있음을 인식할 것이고, 이러한 입자 크기를 변형시킬 수 있는 적합한 방법을 잘 알 것이다.

한 양태에서, 인터페론은 단일 투여량으로 투여된다. 다르게는, 인터페론은 순수 효과가 보다 높은 단일 투여량의 투여에 상응하도록 보다 적은 투여량으로 분포된 기간에 걸쳐 다수회 투여된다. 상기 전달 방식에 대한 하나의 접근 방안은 구강점막 공동에 부착되거나 이에 이식되고, 높은 단일 투여량에 상응하는 양으로 일정 기간에 걸쳐 인터페론을 방출하도록 고안된 서방성 장치 또는 방출 속도가 조절된 장치를 준비하는 것이다.

구강점막을 통해 사용하는 인터페론의 대표적인 제형은 다음과 같다(모든 %는 중량/중량이다):

정제는 덱스트로즈 BP 45%; 젤라틴 BP 30%; 밀전분 BP 11%; 카멜로즈 나트륨 BP 5%; 달걀 알부민 BPC 4%; 류우신 USP 3%; 프로필렌 글리콜 BP 2%; 및 50×10⁶IU IFN-α2를 포함한다. 정제는 구강내에서 천천히 용해되고 용해되도록 허용되거나, 또는 물에 용해되고 필요에 따라 구강점막과 접촉시 구강내에 유지될 수 있다.

인터페론 페이스트는, 미국 특허 제 4,675,184호에 기재된 바와 같이, 글리신 45%, 소듐 CMC 2%, 시트레이트 완충액(pH 4.5) 25%, 100%가 되도록 하는 양의 증류수로부터 50×10⁶IU의 IFN-α2로 제조될 수 있다. 인터페론 페이스트는 구강 점막에 부착될 수 있다.

유사하게, 가글 또는 시럽은 원하는 양의 인터페론을 시판되는 구강세척액 또는 기침약 시럽 제형에 첨가함으로써 제조될 수 있다.

상기를 참조한 특정 투여량 범위내에서, 임의의 개별적인 경우에서의 최적 치료법은 관련된 질병 성질, 질환 단계, 이전의 치료법, 지속되는 다른 치료법, 포유동물의 건강에 대한 일반 상태, 인터페론에 대한 대상의 감수성 등에 따라 달라질 것이고, 따라서, 이러한 모든 상황을 염두에 두고 의사 또는 수의사의 결정에는 차이가 있을 것이다. 치료 기간은 물론 치료될 질병에 따라 달라질 것이고, 예컨대 전립선암 등의 천천히 성장하는 암의 치료는 간세포 암종 등의 신속하게 성장하는 암의 치료와는 상이한 치료 경로를 포함할 것으로 예상된다. 유사하게, 에볼라 바이러스에 의해 발생되는 감염과 같은 급성 감염은 간염 등의 만성 질병과는 다른 치료 경로를 포함할 것으로 예상된다.

본원에 개시된 효과적인 투여량은 경구적으로 투여될 때는 포유동물에서 병리학적 반응을 발생시킬 수 있지만, 구강점막을 통해 투여할 때는 효과적이나 무독성이거나 덜 독성인 용량이다. 병리학적 반응은 급성, 만성 또는 누적성일 수 있고, 예컨대 백혈구감소증, 골수 저하 등의 혈액 화학성의 변화 또는 병력적인 변수에 의해 나타날 수 있다. 본원에서, 병리학적 반응으로는 발열, 권태감, 또는 유행성감기 유사 증후 등의 부작용이 포함된다. 이러한 반응은 인터페론에 대한 감수성이 개별적으로 차이가 있으므로 환자들 사이에서 상당히 다를 것이다.

많은 환자의 경우, 구강점막 투여량은 현존하는 인가된 비경구적 프로토콜에서 내약성인 것으로 공지된 투여량보다 더 많은 양이다. 한 실시태양에서, 총 투여량은 일정 시간에 걸쳐 보다 낮은 투여량이 수회 투여될 수 있거나, 구강점막에 부착되거나 이에 이식된, 방출속도가 조절된 장치로부터 연속적으로 또는 맥동적으로 전달될 수 있다.

인터페론 및 인터페론 제형

마우스 IFN-α/β

마우스 IFN-α/β(Mu IFN-α/β)는 이미 기재된 바와 같이 뉴캐슬(Newcastle) 질환 바이러스(NDV)에 의해 유도된 C243-3 세포의 배양물로부터 제조되고 정제되었다(토베이 등, 문헌 "Proc. Soc. Exp. Biol. and Med.", 1974 146:809-815). 이 연구에서 사용된 제제는, 소포성 구내염 바이러스(VSV)로 항원투여된 마우스 929 세포에 대해 검정될 경우 4×10⁶국제 단위(IU)/㎖의 역가 및 단백질 1㎎당 5×10⁷IU의 비활성을 가졌다(토베이 등, 문헌 "Proc. Soc. Exp. Biol. and Med.", 1974 146:809-815). 제제는 국립위생연구소(NIH)의 뮤린 IFN-α/β의 국제 기준 제제(G-002-9004-5411)에 대해 표준화되었다.

인간 IFN-α-1-8

재조합 인간 IFN-α 1-8[Hu IFN-α 1-8; BDBB 롯트 번호: CGP 35269-1, 스위스 바즐 소재의 시바 가이기(Ciba-Geigy) 제품]은 이전에 기재된 바와 같이 제조되고 정제되었다[마이스터(Meister) 등, 문헌 "J. Gen. Virol.", 1986 67:1633-1643]. 이 연구에서 사용된 제제는 이미 기재된 바와 같이(토베이 등, 문헌 "Nature", 1977 267:455-457) VSV로 항원투여된 동종성 인간 WISH 세포에 대해 70×10⁶IU/㎖의 역가를 가졌고, 이종성 마우스 L929 세포에 대해 1×10⁶IU/㎖의 역가를 가졌다. 제제는 NIH 인간 IFN-α 국제 기준 제제(G-023-901-527) 및 NIH 뮤린 IFN-α/β 표준(G-002-9004-5411) 둘다에 대해 표준화되었다. IFN 제제의 비활성은 단백질 1mg당 2×10⁸IU였다.

재조합 뮤린 인터페론-α

재조합 뮤린 인터페론-α는 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드(Life Technologies Inc.)로부터 구입되었다. 이 연구에서 사용된 제제(롯트 번호: HKK 404)는 VSV로 항원투여된 마우스 L929 세포에 대해 검정될 경우 6×10⁶IU/㎖의 역가 및 단백질 1mg당 6×10⁸IU의 비활성을 가졌다(토베이 등, 문헌 "Proc. Seoc. Exp. Biol Med.", 1974, 146:406-415).

재조합 뮤린 인터페론 β

재조합 뮤린 인터페론 β는 알 앤드 디 시스템스 인코포레이티드(R&D Systems Inc.)로부터 구입되었다. 이 연구에서 사용된 제제(롯트 번호: 1976-01S)는 VSV로 항원투여된 마우스 L929 세포에 대해 검정될 경우 3.2×10⁴IU/㎖의 역가 및 단백질 1mg당 8×10⁶IU의 비활성을 가졌다(토베이 등, 문헌 "Proc. Seoc. Exp. Biol Med.", 1974, 146:406-415).

재조합 뮤린 인터페론 γ

재조합 뮤린 인터페론 γ는 알 앤드 디 시스템스 인코포레이티드로부터 구입되었다. 이 연구에서 사용된 제제(롯트 번호: 2580-03SA)는 VSV로 항원투여된 마우스 L929 세포에 대해 검정될 경우 2×10⁵IU/㎖의 역가 및 단백질 1mg당 1×10⁷IUg의 비활성을 가졌다(토베이 등, 문헌 "Proc. Seoc. Exp. Biol Med.", 1974, 146:406-415).

모든 인터페론 제제는 동일한 검정에서 동시에 역가검정되었고, 미국의 국립위생연구소의 뮤린 인터페론 α/β의 국제 기준 제제(G-002-9004-5411)에 대해 표준화되었다.

뮤린 인터페론 α/β 및 재조합 뮤린 인터페론 둘다는 투여 전에 페리뮨(Ferimmune, 상표명) 부형제내에 넣었다.

부형제

인터페론 제제는 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 포스페이트 완충된 염수내에 또는 후술되는 특허받은 부형제내에 희석되었다. 소혈청 알부민 분획 V[RIA 등급; 면역글로불린이 없음; 목록 번호 A7888; 미국의 시그마(Sigma) 제품]을 PBS(pH 7.4) 1㎖당 100㎍의 최종 농도로 용해시키고, 여과하여 멸균시켰다[0.2μ, 밀렉스(Millex)-GV, 미국의 밀리포어(Millipore) 제품].

본원에 기재된 실험에서, 인터페론 제제는 특허받은 부형제내에 희석되었다. 사용된 부형제는 하기와 같이 정제 형태로 공급되었다[페리뮨, 파마 퍼시픽(Pharma Pacific) 제품]:

	중량/중량%	mg/정제
덱스트로즈(글루코즈)BP^**	44.67^***	55.84
젤라틴 BP^**	30.06	37.58
밀전분 BP^**	11.31	14.14
카멜로즈 나트륨 BP^**	4.96	6.20
달걀 알부민 BPC^**	4.03	5.04
류우신 USP	3.00	3.75
프로필렌 글리콜 BP	1.88	2.35
덱스트란 40^**(덱스트란 40 주사 BP로서)	0.06	0.08
인산나트륨 BP	0.03	0.04
염화나트륨 BP	0.01	0.01
나트륨산 포스페이트 BP	0.01	0.01
총계	100.02	125.04
무수물을 기준으로 계산됨* 하기로부터 유도됨:덱스트로즈(글루코즈) BP (무수물) 44.64%글루코즈 BP(덱스트란 40 주사 BP로서) 0.03%

단일 정제를 1.5㎖ 포스페이트 완충된 염수에 용해시키고, 16,000g에서 15분 동안 원심분리하고, 이어 멸균 여과(0.2μ, 밀렉스-GV, 미국의 밀리포어 제품)시키고, 사용 전에 4℃에서 저장하였다. 부형제는 사용 전에 매일 제조하였다.

인터페론 전달 시스템

예비 실험에 따라, P20 에펜도르프 마이크로파이펫을 사용하여 다 자란 정상 마우스의 각각의 외비공(外鼻孔)에 크리스탈 바이올렛 5㎕를 적용한 결과 구강인두 공동의 전체 표면에 걸쳐 염료가 거의 즉시 분포됨을 알 수 있었다. 구강인두 공동의 염색은 염료를 적용한 후 거의 30분째에도 분명하였다. 동일한 방식으로 적용된¹²⁵I-표지된 재조합 인간 IFN-α 1-8을 사용하여 본질적으로 유사한 결과를 얻었다. 따라서, 이러한 투여 방법을 모든 후속적인 실험에서 사용하였다.

본원에 기재된 동물 실험에 있어서, IFN의 투여 경로에 관한 "구강점막" 또는 "구강인두" 또는 "비측내/경구" 또는 "비측내 및 경구" 또는 "in/or"이란 표현은, 구강점막 공동, 즉 수여 포유동물의 구강 및 인후내로 IFN 제제가 신속하게 분포되어 상기 공동을 둘러산 점막과 접촉되도록 비측 공동내로 상기 제제를 깊게 투여함을 의미하는 것으로 분명히 이해될 것이다.

EMCV(뇌심근염 바이러스)

배치: 롯트 번호 095001

만료일: 1997년 12월

제조: 이전에 기재된 방법[Gresser I. Bourali C, Thomas MT, FalcoffE. 뇌심근염 바이러스에 의한 마우스의 감염에 미치는 인터페론 제제의 반복 접종 효과. 문헌 "Proc Soc Exp Biol Med", 1968 2월, 127:491-6]을 사용하여 EMCV 균주 JH를 마우스 L-929 세포에서 증식시켰다.

특징: 상기 연구에서 사용된 바이러스 스톡은 마우스 L929 세포에 대해 5×10^8.62TCID₅₀의 역가를 가졌다.

저장: 스톡 EMCV는 -70℃에서 저장되었다. 바이러스 역가측정 1일째 전력 중단에 의해 거의 동일한 온도에서 일시적으로 대리 저장하도록 이동되어야 했다. 물질은 항상 동결된채였다. 바이러스 역가측정 8일째, -70℃ 동결기의 온도를 -60℃로 승온시켰다. 희석된 EMCV는 사용 직전에 즉시 제조되었고, 사용할 때까지 얼음 또는 동물용 냉장실에 넣어두었다.

프렌드(friend) 적백혈증 세포

프렌드 적백혈증 세포의 IFN-α/β-내성 클론을 로마의 아파브리스(E. Affabris)로부터 얻었고, 이는 아파브리스 등에 의해 상세히 기재되어 있다[문헌 "Virology", 120:441-452(1982) 참조]. 이후, 이들 세포를 생체내 계대접종하여 보유하였다. 간단히, DBA/2 마우스에 3C18 세포를 약 100LD₅₀으로 복강내 주사하여 접종하고, 1주 후 종양 세포를 마우스의 복강으로부터 수거하고, 계수하고, 다른 마우스에 다시 3C18 세포를 100 LD₅₀으로 접종시켰다. 이 절차를 60 내지 100회 계대접종하여 반복하였다. 60번째 내지 100번째 계대접종에 사용된 3C18 세포는 간 및 비장에 매우 전이성이 높은 것으로 나타났다[그리서(Gresser) 등, 문헌 "Int. J. Cancer" 1987 39:789-792]. IFN 내성의 표현형은 IFN-α/β의 존재하에 생체내 계대접종된 세포를 시험관내에서 배양함으로써 통상적으로 확인되었다[벨라르델리(Belardelli) 등, 문헌 "Int. J. Cancer" 1982 30:813-820].

L1210R6 클론 및 EL4 이식가능한 종양

L1210 림프종 세포의 인터페론-α/β-내성 클론인 L1210R6은 실험실에서 단리되었다[그레서 등, 문헌 "Interferon and cell division"(1974). IX; 인터페론-내성 L1210 세포: 문헌 "Characteristics and Origin. J. Nat. Cancer Inst.", 52:553-559].

EL4 이식가능한 종양을 화학 발암물질인 1,2-디메틸 벤즈안트레인으로 접종된 마우스로부터 유도하였다[고러(Gorer, P.A.), 문헌 "Br. J. Cancer", 1950 4:372-381].

L1210 림프종 세포는 특정 병원체가 없는 DBA/2 마우스에서 생체내 연속 계대접종하여 보유되었다.

EL4 종양은 특정 병원체가 없는 C57BL/6마우스에서 생체내 연속 계대접종하여 보유되었다.

B16 흑색종

B16 흑색종은 C57BL/6마우스로부터 유도된 자연적 기원의 이식가능한 종양이다[피들러(Fidler I.J.) 및 크리플(Kriple, M.L.), 문헌 "Science 197", 1977 893-897]. B16 흑색종은 신속히 성장하고, 매우 퇴행성이며, 폐에 주로 전이되는 멜라닌 생성 종양이다. B16 흑색종은 신속히 성장하는, 매우 공격적인 인간 종양의 좋은 모델로 간주된다.

B16 흑색종 세포는 특정-병원체가 없는 C57BL/6 마우스에서 생체내 연속계대접종되어 보유되었다.

동물

본 연구에 사용된 마우스는 특정 병원체가 없는 콜로니로부터 수득되었다[프랑스의 이파 크레도(IFFA CREDO) 제품]. 이들은 EEC 표준 방법에 따라 빌레주이프 소재의 인스티튜트 페데라티프(Institut Federatif) CNRS에서 특정 병원체가 없는 동물 사육 장치내에서 사육되었다.

인터페론의 생물학적 검정

인터페론은 통상의 방법에 따라 검정되었다. 요약하면, 샘플(20㎕)을 2% 열-불활성화된 태내 송아지 혈청(FCS)[프랑스의 기브코(Gibco) 제품]이 함유된 이글의 최소 필수 배지(Eagle's Minimal Essential Medium; MEM)(프랑스의 기브코 제품) 80㎕내에 희석시키고, 다관 마이크로파이펫(Finnpipette, Labsystem, 50-300㎕)을 사용하여 마이크로적정 플레이트[팔콘(Falcon)제품, 목록 번호: 3072]의 각 웰에 첨가하였다. WISH 또는 L929 세포(2×10⁴세포/웰)를 2% FCS가 함유된 MEM 100㎕에 첨가하고, 공기중 5% CO₂분위기하에 37℃에서 하룻밤 배양하였다[포마(Forma) 3029 CO₂항온배양기]. 이어, 10배 대물렌즈가 구비된 올림푸스(Olympus) IM GLDW 반전 현미경을 사용하여 세포를 임의의 독성 표시에 대해 검사하였다. 이어, 검출가능한 독성을 나타내지 않은 샘플을, 2% FCS가 함유된 신선한 이글의 배지 100㎕를 각 웰당 함유한 마이크로플레이트에서 다관 마이크로파이펫에 의해 100㎕의 희석된 물질을 넣음으로써, 2% FCS가 함유된 이글의 MEM 200㎕의 총 부피에서 처음 1:10 희석배율로부터 출발하여 연속으로 2배 희석하였다. NIH 인간 IFN-α 기준 표준물(G-023-901-527) 또는 NIH Mu IFN-α/β 기준 표준물(G-002-9004-5411)의 적절한 연속적인 2배 희석물을 또한 제조하였다. 이어, 2% FCS가 함유된 이글의 MEM 100㎕중 WISH 또는 L929(2×10⁴세포/웰)를 적절한 각각의 플레이트에 첨가하고, 공기중 5% CO₂의 분위기하에 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 이어, 임의의 독성 표시를 나타내는지와 임의의 현성(顯性) 독성이 없는지에 대하여 세포 단층을 검사하고, 배양물을 흡인시키고, VSV의 100 TCID₅₀(WISH 세포의 경우 2×10⁴VSV₂₃, 또는 L929 세포의 경우 10^-5VSV₂₃)을 포함한 2% FCS가 함유된 이글의 MEM 200㎕로 대체하였다. 이어 플레이트를 공기중 5% CO₂의 분위기하에 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 이어, 올림푸스 IM ULWD 반전 현미경을 사용하여 특정 바이러스 세포변성 효과에 대하여 세포 단층을 검사하였다. 인터페론 역가는 특정 바이러스성 세포변성 효과에 대해 50% 보호하는 희석치 역수로부터 결정되었고, 이는 국제 기준 단위/㎖(IU/㎖)로 표시된다.

실시예 1. EMCV(뇌심근염 바이러스)에 의한 치사 항원투여후 생존에 미치는 높은 투여량의 인터페론의 효과

구강점막 경로에 의해 제공된 1,000, 10,000 및 100,000IU의 IFN-α 투여량의 효과를 EMCV의 치사 투여량이 주사된 수컷 및 암컷 마우스에서 시험하였다. 상이한 유형의 IFN-α를 시험하였고, 구강점막 경로에 의한 투여 효과를 복강내(ip) 경로에 의해 투여한 효과와 비교하였다. 치사 항원투여후의 생존을 모니터할 뿐만 아니라, IFN 치료의 독성을 다양한 임상 화학 및 혈액학적 변수를 사용하여 모니터하였다.

바이러스 감염후 치료를 시작할 때, 4일 동안 1일 1회 구강점막 경로를 통해 10⁵IU의 IFN-α로 마우스를 치료한 결과 모든 동물에서 완전히 보호되었다. IFN 치료된 동물은, 모든 바이러스-감염된 치료되지 않은 대조 동물이 7일이내에 죽었던 조건하에서 EMCV의 치사 투여량(100 LD₅₀)으로 감염된지 100일째에도 100%가 생존하였고, 양호하였다.

체중을 기준으로, 구강점막 경로에 의해 10⁵IU로 마우스를 치료한 것은 240밀리온IU의 인간에 대한 투여량과 대등하고, 이는 통상의 지식으로는 인간에서 투여되는 투여량에 비해 상당히 높다.

비측내/경구 경로에 의해 10⁵IU의 IFN-α로 마우스를 치료하면 10⁴IU의 INF-α로 동물을 치료한 경우에 비해 보다 많이 보호하는 것처럼, 보다 큰 효과(보다 큰 바이러스 적재 또는 보다 많은 량의 종양에 대한 효과)가 보다 높은 투여량의 IFN-α에 의해 수득될 것이다. 이제까지, 투여량-반응 곡선에서 고평부는 관찰되지 않았다.

본 결과는 또한 비측내/경구 경로에 의한 높거나 매우 높은 투여량의 IFN이 매우 보호적인 항바이러스 효과를 갖고, 상기 경로에 의해 제공된 10⁵IU의 IFN-α는 사용된 EMCV의 투여량에 대해 완전히 치유함을 입증한다. 사용된 투여량이 인간에 투여되는 것에 비해 체중 기준으로 매우 높지만(240×10⁶IU에 해당), 독성에 대한 임상적, 생물화학적, 혈액학적 증거는 전혀 관찰되지 않았다. 이와 대조적으로, 임상적인 실행에서 비경구적인 IFN의 최대 내약성 투여량은 1일당 20 내지 30×10⁶IU의 범위이다.

실시예 2. 높은 전이성 종양 세포에 의해 항원투여된 마우스에 미치는 높은 투여량의 IFN-α의 효과

10마리의 6주 자란 DBA/2 마우스로 이루어진 군들에 인터페론-내성 클론 3CI8의 10⁵프렌드 적백혈증 세포 또는 10⁵L1210 림프종 세포(인터페론-내성 L1210R 세포)를 0일째 정맥내로 항원투여하였다. 접종후, 마우스를 치료하지 않거나, 부형제 10㎕ 부피중 10⁵IU의 마우스 IFN-α/β로, 또는 부형제 10㎕만으로(대조군) 20일 동안 비측내/경구 경로에 의해 1일 2회 치료하였다.

비측내/경구 경로에 의해 IFN으로 치료된 동물은 매우 전이성이 큰 프렌드 적백혈증 세포에 의해 접종된지 100일째 50%가 생존하였고, 양호하였다. 비측내/경구 경로에 의해 IFN으로 치료된 동물은 L1210 림프종 세포에 의해 항원투여된지 100일째 30%가 생존하였고, 양호하였다. 임상적인 실험은, IFN-치료된 모든 동물이 100일째에도 생존한 것은 죽이지 않는 다면 정상적인 수명 동안 생존될 것임을 제안한다. 기관의 병력 검사 결과 잔류하는 종양은 존재하지 않았다. 대조적으로, 모든 치료되지 않은 동물 및 대조군의 동물은 프렌드 적백혈증 세포에 의해 항원투여된지 13일 이내 및 L1210 림프종 세포에 의해 항원투여된지 14일 이내에 각각 죽었다.

이들 결과는, 사용된 종양 세포주는 둘다 매우 공격적이고, 사용된 항원투여 투여량은 약 20,000배의 LD₅₀에 해당하기 때문에 매우 의미있다. 더욱이, 프렌드 적백혈증 및 L1210 림프종은 꽤 상이한 종양 유형들로서, 프렌드 적백혈증 세포는 레트로바이러스인 프렌드 백적혈증 바이러스를 수반하는 반면, L1210 림프종은 임의의 공지된 바이러스성 병인과는 관련이 없다. L1210 림프종으로 접종된 동물의 비측내/경구 IFN-α 치료법에 의해 수득된 결과는 상기 모델에서 전신성 IFN-α 치료법에 의해 수득된 결과와 동일하거나 심지어 이에 비해 월등한 것으로 나타났다(그레서의 미공개된 결과). 오스테레일리아 임시 특허 출원 번호 PN 9765호에 보고된 이전 연구에서, 프렌드 적백혈증 세포에 의해 접종되고 100 또는 1,000IU의 IFN-α로 치료된 마우스중 어느 것도 생존하지 않았고, 10,000IU의 투여량에서 단지 10 내지 20%의 동물들이 치료된 것으로 간주되었다.

실시예 3. 매우 전이성이 높은 B16 흑색종 세포 또는 EL4 종양 세포에 의해 항원투여된 마우스에 미치는 높은 투여량의 IFN-α의 효과

10마리의 6주 자란 C57B1/6 마우스로 이루어진 군들에 10⁵B6 흑색종 세포, 또는 10⁵EL4 종양 세포를 정맥내로 항원투여하였다. 접종후, 마우스를 치료하지 않거나, 부형제 10㎕ 부피중 10⁵IU의 마우스 IFN-α/β로, 또는 부형제 10㎕만으로(대조군) 20일 동안 비측내/경구 경로에 의해 1일 2회 치료하였다.

비측내/경구 경로에 의해 IFN으로 치료된 동물은 매우 전이성이 높은 B16 흑색종 세포 또는 EL4 종양 세포에 의해 접종된지 100일째 30%가 생존하였고, 양호하였다. 대조적으로, 모든 치료되지 않은 동물 및 대조 동물은 B16 흑색종 세포로 항원투여된지 20일 이내에, 그리고 L4 종양 세포로 항원투여된지 22일 이내에 각각 죽었다. 임상적인 실험에 따라, IFN-치료된 모든 동물이 100일째 생존한 것은 20일째 인터페론 치료를 중단할 지라도 죽이지 않는 다면 생존될 것으로 제안된다. 기관을 병력 검사한 결과 100일째 죽인 인터페론 치료된 동물에서 잔류된 종양이 발견되지 않았다.

실시예 4. 소포성 구내염 바이러스에 대한 구강점막 투여된 인터페론의 효과

특정 병원체가 없는 육종 콜로니로부터 10마리의 6주자란 마우스로 이루어진 군들에 부형제 10㎕ 부피중 소포성 구내염 바이러스(VSV)를 100 LD₅₀으로 비측내 감염시켰다[토베이 등, "Proc. Soc. Exp. Biol. Med.", 1974, 146:406-415]. 바이러스 감염후 7시간 째, 마우스를 치료하지 않거나, 부형제 10㎕부피중 뮤린 인터페론 α/β의 소정의 투여량으로, 또는 부형제 10㎕만으로(대조군) 4일 동안 비측내/경구 경로에 의해 1일 1회 치료하였다.

다 자란 마우스를 뮤린 인터페론 α/β으로 치료한 결과, 치사 투여량의 VSV의 감염에 의해 생존한 동물의 백분율이 현저히 증가하였다. 따라서, 인터페론 α/β10,000IU로 치료된 동물은, 모든 치료되지 않거나 부형제 대조 치료된 바이러스-감염된 동물이 10일째 죽는 조건하에서 치사 투여량의 VSV로 감염된지 21일째 30%가 생존하였다. 임상적인 관찰에 따라, 21일째 생존한 인터페론-치료된 동물의 대부분이 생존할 것으로 제안된다.

실시예 5. 세포 단백질 발현에 대한 구강점막 인터페론의 효과

IFN-α는 단백질을 단백질 세포 표면 수용체에 결합시킨 후 다수의 세포 단백질의 발현을 유도하는 것으로 공지되었다. 이들 단백질은 IFN 작용의 유용한 마커를 제공하는 것으로 생각된다.

본 출원인은 3개의 IFN-유도 단백질인 MHC 클라스 I 항원, Ly 6A/E 항원 및 2'-5'-올리고아데닐레이트 신테테이스의 발현에 대한, 비측내/경구 경로로 투여된 IFN-α의 작용 효과를 평가했다.

복강내로 투여된 20IU 만큼 적은양의 Mu IFN-α가 말초 혈액 단핵구 및 과립구 둘다에서 DBA-2-마우스 항원(H-2-K^d)의 발현을 현저히 증가시키는 조건하에서, 비측내/경구 경로로 H-2K^d에 대한 20,000IU이하의 Mu IFN-α로 H-2K^d를 처리하는 것은 말초 혈액 림프구, 단핵구 또는 과립구에서 H-2-K^d발현을 상당히 증가시키지 않았다.

유사하게, 비측내/경구 경로로 20,000IU 이하의 IFN-α를 마우스에게 처리하는 것은 Ly6 A/E 항원의 발현에 상당한 효과를 미치지 못했으며, 그러나, 이들의 발현은 I 유형 IFN을 비경구 처리한 후 다양한 림프양 세포 표면에서 현저히 증대되었다[더몬트(Dumont) 등, "J. Immunol", 1986 137:201-210 참조]. 비측내/경구 경로로 투여한 200 또는 20,000IU의 Mu IFN-α 또는 Hu IFN-α에 의해 유사한 결과를 얻었다.

복강내 주사한 20IU 만큼 적은 양의 Mu IFN-α를 스위스 또는 DBA/2 마우스에 처리하여 말초 혈액 단핵 세포 및 비세포 둘다에서 2',5'-올리고아데닐레이트 신테테이스 활성의 현저한 증가가 야기되었다. 이와는 대조적으로, 비측내/경구 경로로 20,000IU 이하의 Mu IFN-α를 마우스에 처리하는 동일한 실험에서 2',5'-올리고아데닐레이트 신테테이스의 발현은 상당히 증가되지 않았다. 더욱더, 비측내/경구 경로로 200 또는 20,000IU의 Mu IFN-α 또는 Hu IFN-α 1-8을 처리했을 때 IFN 처리를 시작한지 10일까지 시험한 시점중 어느 시점에서도 2',5'-올리고아데닐레이트 신테테이스 활성에 상당한 영향을 미치지 않았다.

실시예 6. 구강점막 투여후 인터페론의 생체이용율

IFN의 생체이용율 및 약력학을 조사하기 위해, 이 연구에 가장 우호적인 약물-혈액 용량비를 갖는 마우스에게¹²⁵I에 가능한 최고 특정 방사능까지 표지한 하나의 고 투여량의 재조합 IFN-α를 처리했다.

70 x 10⁶IU의 Hu IFN-α 1-8의 순수한 제제를 PBS 1.4㎖에 용해시키고, 헌터와 그린우드(Hunter and Greenwood)의 문헌["Nature", 1962 194:495-496]에 개시된 클로르아민-T 방법의 변형된 방법을 이용하여 모겐센(Mogensen) 등의 문헌["Int. J. Cancer", 1981 28: 575-582]에 개시된 바와 같이 요오드화시켰다.

¹²⁵I-표지된 Hu IFN-α 1-8(롯트 번호: CGP35269-1)은 VSV를 항원 투여한 인간 WISH 세포에서 분석했을 때 2 x 10⁷IU/㎖ 및 VSV를 항원 투여한 마우스 L929 세포에서 분석했을 때 1 x 10⁶IU/㎖의 생물학적 활성을 나타냈다.

6 내지 7주된 암컷 스위스 마우스에게 2 x 10⁷IU의¹²⁵I Hu IFN-α 1-8 (1 x 10⁶뮤린IU에 상응함)을 정맥내, 복강내 주사하거나 또는 비측내/경구 처리했다(1.0369 x 10⁷cpm/마우스). 언급한 시기에, 그룹당 3마리의 마우스를 죽이고, 혈액을 수거하여 용량을 측정했다. 신장, 간, 폐, 비장 및 위/식도를 적출하여, 블롯팅하고, ±1.0㎍의 정밀도로 계량했다. 각 샘플의 방사능을 감마 카운터를 사용하여 개별 측정했다. 이어서, 원심분리(800 g x 10분, 4℃)로 전혈을 분리하고, 혈청을 수확하고, 계수하여 -80℃에서 냉동시켰다. 이어서, 전술한 바와 같은 인간 WISH 세포 및 마우스 L929 세포상에서 표준 생검을 이용하여 혈청의 IFN 함량을 분석했다. 이어서, 혈청 샘플에 존재하는 방사능 물질을 친화성 면역침전법으로 분리하여 SDS-PAGE로 분석했다.

정맥내 거환으로¹²⁵I-표지된 Hu IFN-α 1-8을 1.0369 x 10⁷cpm/마우스로 주사한 지 5분후 동물의 말초 혈액에서 매우 다량의 방사능(〉2 x 10⁶cpm/ml)을 검출했다. 이어서 전혈에 존재하는 방사능의 양은 15분 및 30분에 점진적으로 감소했다. 1.0369 x 10⁷cpm의¹²⁵I Hu IFN-α 1-8을 복강내 주사한지 5분후 동물의 말초 혈액에서 검출된 방사능량은 정맥내 거환을 주사한 후 검출된 양보다 약 20 배 적었다. 이어서 방사능의 양은 주사한지 15 및 30분후 점진적으로 증가되었다.¹²⁵I IFN-α 1-8을 비측내/경구 투여한지 5, 10 또는 15분후 동물의 혈액에서 검출된 방사능량은 동량의 방사능 표지된 IFN을 복강내 주사한 후 주어진 시간에 검출된 방사능량보다 상당히 적었다. 3가지 투여 경로 모두에서,¹²⁵I-표지된 IFN-α 1-8을 비측내/경구 투여한 후 전혈에서 보다 혈청에서 더 많은 양의 방사능이 검출되었다. 동일한 용량의 혈청과 비교하여 전혈 ㎖당 검출된 방사능의 양이 적을수록 전혈의 세포 성분을 제거한 후 계수된 혈청의 용량이 효과적으로 더 크다는 것을 의미한다.

이 실험의 모든 마우스에서 얻은 혈청 샘플에 대해 전술한 바와 같은 표준 생검을 이용하여 생물학적으로 활성의 IFN 존재에 대해 검사했으며, 시험한 시점에서 모두¹²⁵I Hu IFN-α 1-8을 정맥내 또는 복강내 주사한 모든 동물의 혈청에서 쉽게 검출가능한 양의 생물학적으로 활성의 IFN이 나타났다. 이와는 대조적으로, 이들 동물의 혈청에서 비교적 다량의 방사능이 존재함에도 불구하고, IFN을 비측내/경구 투여한 후 시험한 시점중 어느 시험에서 어느 동물의 혈청에서도 생물학적으로 활성의 IFN이 검출되지 않았다.

¹²⁵I Hu IFN-α 1-8을 치료한 동물의 혈청에서 검출된 방사능 물질이 실제로 고유한 IFN을 나타내는지를 측정하기 위해, 샘플을 단백질 A-G 아가로즈로 면역침전시키고, 샘플에 존재하는 면역글로블린을 침전시키기 위해, 친화성으로 정제된 폴리클론 안티-IFN-α 항체로 처리하고, 더욱더 면역침전시켰다. 이어서, 샘플을 전술한 바와 같이 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 적용했다.

¹²⁵I Hu IFN-α 1-8을 정맥내 또는 복강내 주사한 후 혈청내의 방사능 물질의 SDS-PAGE 분석은 비주사된¹²⁵I Hu IFN-α 1-8과 동일한 전기영동 이동성으로 이동하는 단일 균질 띠를 나타냈다. 물질의 겉보기 분자량은 약 20000 달톤으로 추정되었으며, 이것은 고유한 Hu IFN-α 1-8의 분자량에 정확히 상응한다. 이와는 대조적으로, 동량의 방사능 물질이 각각의 겔위에 적재되더라도,¹²⁵I IFN-α 1-8을 비측내/경구 처리한 마우스에서 얻은 혈청 샘플중 어느것도 고유한 IFN과 유사한 겉보기 분자량을 갖는 임의의 물질을 함유하지 않았다.

방사능표지된 물질의 조직 분포는¹²⁵I IFN-α 1-8을 정맥내 주사한 지 5분후에 동물의 신장에서 매우 다량의 방사능을, 간, 폐 및 비장에서 다량의 방사능을 나타냈다. 이들 4개의 기관 각각에 존재하는 방사능의 양은 15분 및 30분후에 점진적으로 감소하는 것으로 밝혀졌다. 이와는 대조적으로, 위장의 방사능 수준은 15분 및 30분에 점진적으로 증가하여 정맥내 거환 주사후 30분에 동물의 혈청에 존재하는 양에 필적할 만한 수준에 도달했다.

복강내 주사로 투여한¹²⁵I IFN-α 1-8은 검사한 모든 조직에서 투여후 15분내에 최고 수준의 방사능을 나타냈으며, 30분후 감소되었다. 유사하게,¹²⁵I Hu IFN-α 1-8의 비측내/경구 투여는 투여한지 15분후 시험한 모든 조직에서 최고 수준의 방사능을 나타냈으며, 그후 30분후에 존재하는 방사능 수준이 약간 감소되었다. 위장/식도에 존재하는 방사능의 양은¹²⁵I-표지된 IFN-α 1-8의 비측내/경구 투여후 임의의 다른 기관에서 검출된 양보다 한 자리 수 범위내에서 더 많으며, 이 양은 정맥내 또는 복강내 경로로 동량의 방사능표지된 Hu IFN-α 1-8을 비경구 투여한 후 이들 조직내에 존재하는 양보다 현저히 많은 양이다.

실시예 7. 비측내/경구 투여후 인터페론의 약력학

Hu IFN-α 1-8의 약력학을 정밀 측정하기 위해,¹²⁵I-표지된 Hu IFN-α 1-8 1.0369 x 10⁷cpm/마우스를 마우스에게 정맥내, 복강내 또는 비측내/경구 처리하고, 전혈 및 혈청 둘다에 존재하는 방사능량을 24 시간동안 일련의 시점에서 측정했다.

정맥내 거환 투여후 마우스의 혈액에 존재하는¹²⁵I-표지된 Hu IFN-α 1-8의 약력학 프로파일은 대수 클리어런스 곡선에 밀접하게 따랐다. 이것은 밀접하게 연관된 분자인 재조합 인간 α A/D(Bgl)[보호슬라웨드(Bohoslawed)등, "J. IFN Res.", 1986 6: 207-213 참조]을 이용하여 마우스에서 수행한 결과와 일치했다. 농도 대 시간의 곡선 아래 면적으로부터 계산한 생체이용가능한 물질의 양은 또한 인간 α A/D의 경우와 유사했다.¹²⁵I IFN-α 1-8의 정맥내 거환을 투여한 후 이상성 시간 소비 클리어런스 곡선(biphasic time-consuming clearance curve)이 관측되었으며, 이것은 신장을 통해 제거된 물질의 특징이며 실시예 6의 결과와 일치했다.¹²⁵I-표지된 IFN-α 1-8을 복강내 주사한 후 이 물질의 약력학은 근육내 투여한 IFN에서 앞서 보고된 약력학과 밀접하게 유사했다.

쉽게 검출가능한 양의 생물학적으로 활성의 IFN이¹²⁵I-표지된 IFN-α 1-8을 정맥내 거환 또는 복강내 주사한 후의 모든 동물의 혈청에 존재했다.

1. 항종양 활성에 대한 논의

프렌드 적백혈병은 매우 악성이며, 정맥내로 주사할 때 간 및 비장 모두에 전이되기 때문에, 프렌드 적백혈병 모델이 항종양 활성의 매우 엄격한 임상전 시험으로 선정되었다. 실제로, 상기 모델을 이용하여 얻은 결과는 인간 암 치료를 위해 IFN-α를 비경구 주사하는 채택 기준이 되었다. 따라서, 상기 실험에서 수행한 모든 시험에서 비처리 동물 및 대조 제제로 처리한 동물은 모두 10 내지 11일내에 죽었다. 처리하지 않는다면 4 또는 5개의 FLC 세포만을 주사하여도 마우스를 죽일것이다. 이와는 대조적으로, 구강점막 경로에 의해 뮤린 IFN-α로 처리한 동물중 일부는 10⁵FLC를 주사한 후 100일 이상 아직도 생존해 있으며, 치료된 것으로 생각할 수 있다.

실제로, 앞선 시험으로부터 판단컨대, 구강점막 경로로 투여한 IFN-α는 FLC를 주사한 동물에서 단지 몇일간만 생존 시간을 증가시킨, 비경구 투여한 사이클로포스프아미드, 5-플루오로우라실 또는 메토크렉세이트보다 더욱 효과적인 것으로 나타났다(그레서 등, "J. Natl. Cancer Inst.", 1988 80: 126-131 참조). 기타 약물, 예컨대 시스플라틴, 빈크리스틴, 독소루비신, 블레오마이신 또는 에토포사이드느느 이 종양에 비효과적이다(그레서 등, "J. Natl. Cancer Inst.", 1988 80: 126-131 참조).

유사하게, 구강점막 경로로 투여한 IFN-α는 전신 투여된 IL-1β, IL-2 및 TNF-α와 같은 기타 사이토킨보다 더 FLC에 대해 효과적인 것으로 나타났다(전신 투여된 IL-1β, IL-2 및 TNF-α는 상기 모델에서 거의 활성을 나타내지 못했다).

이전의 연구에 의하면 비경구적으로 투여된 IFN이 상기 모델에서 가장 활성의 항 종양 약물중 하나이고, 이미 간에서 종양 전이가 존재한 후 시작할 때 조차도 IFN 처리가 효과적이라고 나타났다(그레서 등, "Intl. J. Cancer", 1987 39: 789-792 참조). 본 결과는 구강점막 경로로 투여한 IFN이 비경구 투여와 동등하거나 또는 더한층 효과적이라고 나타낸다.

단일 투여량의 사이클로포스파미드와 함께 제공된 IFN-α을 매일 주사하여 상기 제제중 하나만을 처리한(림프종 진단후 처리를 시작함) 동물에 비해 림프종 함유 AKR 마우스의 생존을 현저히 증가시켰다(그레서 등, "Eur. J. Cancer", 1978 14:97-99 참조]. IFN-αZβ 및 BCNU, 시스-DDP(시스플라틴), 메토트렉세이트, 아드리아마이신 및 α-디플루오로메틸 오르니틴을 이용한 성공적인 조합 치료법이 다양한 임상전 동물 종양 모델에서 또한 보고되었다. 5-(플루오로우라실)(5-FU) 및 IFN과의 조합 치료도 또한 인간의 전이성 결장암 치료에 유익한 것으로 보고되었다[에른스토프(Ernstoff) 등, "Journal of Clinical Oncology", 1989 7: 1764-1765]. 그러나, IFN 치료를 사이클로포스프아미드[마르켓(Marquet) 등, "Int. J. Cancer", 1983 31:223-226; 리(Lee) 등, "Biochem, Pharmacol.", 1984 33:4339-3443], 아드리아마이신[블랙윌(Blackwill) 등, "Cancer Res.", 1984 44: 904-908), 또는 5-FU(마르켓 등, "Int. J. Cancer", 1985 109: 156-158) 즉, 비경구 IFN 치료와 조합 사용할 때 유익한 효과를 발휘하는 것으로 나타낸 약물을 IFN 치료와 조합할 때, 감소된 항 종양 활성이 보고된 다른 실험이 있다. IFN과 기타 화학치료제와의 조합은 본원에 개시된 방법을 사용하여 쉽게 시험할 수 있다.

조합된 인터류킨-1(IL-1) 및 IFN-α/β 치료는 FLC를 주사한 마우스에서 상승작용성 항 종양 효과를 야기한다(Belardelli et al, Int. J. Cancer, 1991 49: 274-278). 동일한 처리가 또한 Eb 림프종의 전이성 변이종(p11-R-Eb)에 대해 현저한 항 종양 효과를 발휘하는데, 이에 반해 상기 제제중 한 제제만을 사용하면 비효적이다[가브리엘(Gabriele)등, "Invasion Metastasis", 1993 13: 147-162 참조]. 시험한 모든 사이토킨중에서, IL-1이 비경구 I 유형 IFN 치료와 조합할 때 가장 효과적인 것으로 밝혀졌다.

IFN-α/β와 함께 제공된 혈관형성 억제제 AGM-1470 [(클로로아세틸)-카밤산(3R-(3α,4α(2R^*,3R^*),5β,6β))-5-메톡시-4-(2-메틸-3-(3-메톡시-2-부테닐)옥시라닐)-1-옥사스피로(2.5)옥트-6-일 에스테르]와의 조합 치료는 어느 한 제제만을 사용했을 때 발견된 것에 비해 현저하게 증가된 항 종양 효과를 야기했다[브렘(Brem) 등, "J. Pediatric Surgery", 1993 28: 1253-1257 참조].

과체온은 루이스 폐암에 대한 IFN-α/β의 항 종양 작용을 증대시키는 것으로 나타났다[예루살미(Yerushalmi) 등, "Proc. Soc. Exp. Biol. Med.", 1982 169:413-415] 참조). 알기닌 부티레이트는 또한 IFN-α의 항종양작용을 강화시키는 것으로 나타났다[샤니 및 세루티(Chany and Cerutti), "Int. J. Cancer", 1982 30:489-493] 참조). 주어진 유형 및 투여량의 IFN을 구강점막 경로로 투여할 때 얻은 보호 수준과 전신 투여(복강내 주사)후 얻은 결과를 비교한 결과 IFN의 비경구 투여가 몇몇 경우에 구강점막 투여보다 약간 더 효과적이며, 다른 경우에는 더 효과적이지 않은 것으로 나타났다.

2. 항바이러스 활성에 대한 논의

항바이러스 활성은¹²⁵I IFN-α 1-8, Mu IFN-α/β 및 Mu IFN-α의 비측내/경구 투여후 동물의 혈청에서 검출되지 않지만, 치사 투여량의 EMCV에 의한 감염에 대해 통계적으로 유의성 있는 정도로 보호되었음이 이들 동물에서 관찰되었다(표 1).

EMCV로 주사된 스위스 마우스의 생존에 미치는¹²⁵I-IFN-α에 의한 단일 치료 효과

1군당 생존동물수(주사후의 날짜)

치료군

용량

경로

3

4

5

6

7

8

9

10

15

30

치료되지 않음

6/6

4/6

2/6

0/6

Hu IFN α 1-8

1.4×10⁵IU

in/or

6/6

5/6

4/6

3/6

1/6

Mu IFN α/β

6.4×10⁴IU

in/or

6/6

5/6

4/6

3/6

2/6

1/6

EMCV로 주사된 스위스 마우스의 생존에 미치는 Mu IFN-α에 의한 단일 치료(4일 동안 1일 1회) 효과

1군당 생존동물수(주사후의 날짜)

치료군

용량

경로

3

4

5

6

7

8

9

10

15

30

치료되지 않음

10/10

9/10

4/10

0/10

Mu IFN α

2×10⁴IU

in/or

10/10

9/10

7/10

급성 바이러스 감염증의 잘-한정된 예비임상적 모델에서 수득된 결과는, 인간에서 급성 전신 바이러스 감염증의 치료를 위해 구강점막을 통해 높은 투여량의 IFN을 사용하는 "원칙에 대한 입증(proof of principle)"을 지지하는 명료한 증거를 제공하였고, 다수의 IFN-α 아형 및 단일 재조합 IFN-α 이소타이프(isotype)(예컨대 Mu IFN-α)는 상기 모델에서 항바이러스 활성에 통계적 유의성을 갖는 것으로 제시한다. 천연 Mu IFN-α/β 및 Hu IFN-α 1-8은 구강점막적으로 투여될 경우 동일하게 효과적인 것으로 보인다. 재조합 Mu IFN-β 및 Mu IFN-γ는 유사한 항바이러스 활성을 나타낸다.

소정의 투여량 및 유형의 IFN을 구강점막 경로를 통해 투여할 때 얻어진 보호 정도를 전신적 투여(복강내 주사)후 수득된 보호 정도와 비교해 보면, IFN의 비경구적 투여는 구강점막 투여에 비해 일부 경우에는 약간 보다 효과적이었고, 다른 경우에는 효과적이지 않았다.

3. 일반 논의

바이오마커 파일롯트 실험 결과에 의하면 시험한 3가지 바이오마커(MHC 클라스 I 항원, Lys6 A/E 항원, 및 2',5'-올리고아데닐레이트 신테테이스 활성)중 어느것도 구강점막 경로로 투여된 IFN-α에 의해 나타난 매우 현저한 항종양 활성을 적절히 나타내고 있지 않는다고 아주 분명하게 나타낸다.

20IU 만큼 적은 양의 IFN-α을 복강내 주사한 후 취한 모든 실험에서 관측된 모든 3가지 IFN-유도 단백질 발현의 매우 현저한 증가와 구강점막 경로로 20,000IU 이하까지의 IFN-α의 투여후 임의의 검출가능한 효과가 없다는 것을 대비하면 놀라운 사실이다.

본 출원인은 초기 또는 중기에 하나의 바이오마커 또는 기타 바이오마커에 대한 효과가 관측될 가능성을 배제할 수 없지만, IFN이 이들 단백질을 암호화하는 유전자의 전사에 작용하므로 IFN 처리후 여러 시간 경과할 때까지 이들 바이오마커중 어느 한 마커에 대한 효과를 예상할 수 없기 때문에 그럴 가능성은 없는듯하다.

다시한번 언급하면, 구강점막 경로로 IFN-α를 처리한 후 기타 많은 IFN-유도 단백질중 하나에 대한 전체 작용이 관측될 가능성을 배제할 수 없지만, 이 작용은 특정 IFN-유도 유전자 발현의 미분 조절을 수반하기 때문에 그럴 가능성은 없는 듯 하다. 그러나, IFN 바이오마커에 대한 효과가 구강점막 경로로 IFN-α을 투여한 후 예를 들면 비측내 림프구내에서 국소적으로 관측될 수 있는 가능성이 있다.

실험한 바이오마커에 대한 검출가능한 효과가 없는 것과 일치하게, 20,000IU 이하의 IFN-α를 처리한 동물에서 조차도 구강점막 IFN 치료시에 관측된 혈액학 또는 혈액 화학적 변수중 어느 것에 대해서도 일치하지 않는 효과가 관측되지 않았다.

약력적-생물활성 연구의 결과는, 이전에 사용된 것에 비해 약 수배 더 감수성인 감지 방법을 사용하여 말초 혈액중에서 IFN의 순환이 전혀 감지될 수 없는 상황하에서 통계적으로 유의성 있는 항바이러스 효과가 방사능표지된 Hu IFN-α 1-8의 단일 용량의 구강점막을 통한 투여을 수행하여 수득될 수 있음을 꽤 명백히 나타낸다. 이러한 결과와 일치하여, 구강점막을 통해 투여된 IFN에 의해 가해진 항바이러스 활성 정도는 고전적인 투여량-반응 관계를 따르는 것으로 나타났다.

¹²⁵I-표지된 IFN-α 1-8의 구강점막 투여후 동물의 전혈 및 혈청 둘다에서 쉽게 관측가능한 양의 방사능표지된 물질이 발견되었다. 이 결과를 다량의 비표지된 IFN를 경구 투여한 후에도 동물의 혈청에서 IFN을 검출하는데 실패한 이전 시험 결과와 비교하였다. 그러나, 구강점막 투여후 전혈 및 혈청 모두에서 검출된 방사능 물질은 생물학적으로 불활성이었다. 더욱더, SDS-PAGE 분석 결과는 상기 물질이 저 분자량을 가졌음을 나타냈으며, 위장 및 소장내에서 IFN이 소화된 후 분해 산물의 흡수를 나타낸다. 구강점막 투여후 방사능 표지 물질의 조직 분포 검사는 시험한 다른 기관중 어느 기관보다 위장에서 현저히 많은 양의 방사능을 나타냈다. 실험 결과는 구강점막 투여후 생물학적 활성의 IFN이 관측되지 않더라도, 상기 처리가 생체내에서 통계학적으로 상당한 항종양 활성을 발휘함을 아주 분명하게 나타낸다.

관측된 유익한 효과에 대해 제안된 임의의 매카니즘에 구속되길 원치않지만, 시험 결과는 구강점막 투여된 IFN이 외부에서 투여된 IFN의 직접 작용, 또는 내재성 IFN의 유도를 수반하지 않는, 현재까지 정립되지 않은 새로운 매카니즘에 의해 종양 세포에 대해 영향을 미친다고 시사하고 있다. 시험한 3가지 바이오마커 또는 순환형 IFN이 검출가능한 양으로 존재하지 않는다는 사실이 상기 제안을 지지한다. 이 기작은 비인두 및 식도를 둘러싸고 있는 풍부한 림프양 조직의 자극에 적어도 부분적으로 작용할 수 있음을 나타낸다. 본 출원인은 구강점막 IFN이 전신 투여된 IFN과 적어도 효능면에서 필적할 만하다고 나타냈기 때문에, 시험 결과는 종양 질환 치료에 구강점막 경로로 IFN을 투여하기 위한 강력한 후원자 역할을 수행한다. 이것은 IFN의 임상 용도에 대한 중요한 암시가 될 수 있다.

명료함 및 이해를 위해 본 발명을 일부에서 상세하게 기술했지만, 당해 분야의 숙련가들은 본 명세서에 개시된 발명의 개념 범위에서 벗어나지 않고 본원에 기술된 태양 및 방법에 대해 다양한 변화를 이룩할 수 있다는 사실을 알것이다.

Claims

인터페론의 숙주 방어 메카니즘 자극량(이 양은 인터페론 약 20×10⁶IU보다 더 많은 양이다)을 구강점막과 접촉시켜 포유동물에게 투여함을 포함하는, 포유동물에서 숙주 방어 메카니즘을 자극시키는 방법.
인터페론의 면역 반응 자극량(이 양은 인터페론 약 20×10⁶IU보다 더 많은 양이다)을 구강점막과 접촉시켜 포유동물에게 투여함을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
제 1 항에 있어서,

인터페론의 효과 투여량을 단일 투여량으로 투여하는 방법.
제 1 항에 있어서,

인터페론의 무독성의 효과 투여량을, 단일 투여량의 면역 자극에 해당하는 면역 자극을 이끌어내기에 충분한 기간에 걸쳐 보다 작은 투여량으로 다수회 투여하는 방법.
제 1 항에 있어서,

인터페론의 면역 자극 투여량을, 단일 투여량의 면역 자극에 해당하는 면역 자극을 이끌어내기에 충분한 기간에 걸쳐 연속적으로 투여하는 방법.
인터페론 효과량(이 양은 비경구적으로 투여되는 동일한 인터페론의 비-병리학적 투여량보다 더 많은 양이다)을 구강점막과 접촉시켜 포유동물에게 투여함을 포함하는, 신생물질 질병을 치료하는 방법.
인터페론 효과량(이 양은 비경구적으로 투여되는 동일한 인터페론의 비-병리학적 투여량보다 더 많은 양이다)을 구강점막과 접촉시켜 포유동물에게 투여함을 포함하는, 바이러스 감염증을 치료하는 방법.
제 1 항에 있어서,

인터페론이 I형 인터페론을 포함하는 방법.
제 8 항에 있어서,

인터페론이 IFN-α, IFN-β, IFN-ω, 콘센서스(consensus) IFN 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제 9 항에 있어서,

IFN-α가 재조합 IFN-α를 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

인터페론이 II형 인터페론을 포함하는 방법.
제 11 항에 있어서,

II형 인터페론이 γ-IFN을 포함하는 방법.
제 6 항에 있어서,

신생물질 질병이 비바이러스성 병인인 방법.
인터페론 치료 효과량(이 양은 약 20×10⁶IU보다 더 많은 양이다)을 구강점막과 접촉시켜 포유동물에게 투여함을 포함하는, 포유동물에서 다발성골수종, 모양(毛樣)세포성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 저급 림프종, 세포 림프종, 카르시노이드 종양, 신장 종양, 신장 세포 암종, 간 세포 암종, 암종, 육종, 악성 혈액 종양, 결장직장암, 신경교아세포종, 폐암, 결장암, 및 악성 뇌종양을 비롯한 뇌종양을 치료하는 방법.
제 14 항에 있어서,

인터페론 효과 투여량을 단일 투여량으로 투여하는 방법.
제 14 항에 있어서,

인터페론 효과 투여량을, 단일 투여량의 치료 반응에 해당하는 치료 반응을 이끌어내기에 충분한 기간에 걸쳐 보다 작은 투여량으로 다수회 투여하는 방법.
제 14 항에 있어서,

인터페론 투여량을, 단일 투여량의 치료 반응에 해당하는 치료 반응을 이끌어내기에 충분한 기간에 걸쳐 연속적으로 투여하는 방법.
제 1 항에 있어서,

인터페론의 총 투여량이 인터페론 약 20×10⁶IU 내지 약 1000×10⁶IU인 방법.
제 1 항에 있어서,

인터페론의 투여량이 인터페론 약 20×10⁶IU 내지 약 500×10⁶IU인 방법.
제 1 항에 있어서,

인터페론의 투여량이 인터페론 약 50×10⁶IU 내지 약 500×10⁶IU인 방법.
제 14 항에 있어서,

결부된 방사선치료법 또는 화학치료법을 추가로 포함하는 방법.
제 14 항에 있어서,

다른 사이토킨 또는 인터페론 유도물질을 투여함을 추가로 포함하는 방법.
제 14 항에 있어서,

인터페론이 I형 인터페론을 포함하는 방법.
제 23 항에 있어서,

인터페론이 IFN-α, IFN-β, IFN-ω, 콘센서스 IFN 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제 24 항에 있어서,

IFN-α가 재조합 IFN-α을 포함하는 방법.
제 14 항에 있어서,

인터페론이 II형 인터페론을 포함하는 방법.
제 26 항에 있어서,

인터페론이 γ-인터페론을 포함하는 방법.
인터페론의 숙주 방어 메카니즘 자극량 또는 면역 반응 자극량(이 양은 인터페론 약 20×10⁶IU보다 더 많은 양이다)을 포함하고, 포유동물에서 구강점막과 접촉하여 숙주 방어 메카니즘 또는 면역 반응을 자극시키기 위한 약제의 제조에 있어서의 인터페론의 용도.
제 28 항에 있어서,

약제가 인터페론의 무독성의 단일 효과 투여량을 포함하는 용도.
제 28 항에 있어서,

약제가 단일 투여량의 숙주 방어 또는 면역 반응 자극에 해당하는 숙주 방어 또는 면역 반응 자극을 이끌어내기에 충분한 다수의 보다 작은 투여량의 인터페론을 포함하는 용도.
제 28 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,

약제가 단일 투여량의 숙주 방어 메카니즘 또는 면역 반응 자극에 해당하는 숙주 방어 메카니즘 또는 면역 반응 자극을 이끌어내기에 충분한 기간에 걸쳐 숙주 방어 또는 면역 반응을 자극시키는 무독성의 투여량을 연속 투여함을 제공하는 용도.
제 28 항 내지 제 31 항중 어느 한 항에 있어서,

약제가 신생물질 질병을 치료 또는 예방하기에 적합하고, 상기 양이 비경구적으로 투여되는 동일한 인터페론의 비-병리학적 투여량을 초과하는 용도.
제 28 항 내지 제 31 항중 어느 한 항에 있어서,

약제가 바이러스 감염증을 치료하거나 예방하기에 적합하고, 상기 양이 비경구적으로 투여되는 동일한 인터페론의 비-병리학적 투여량을 초과하는 용도.
제 28 항 내지 제 33 항중 어느 한 항에 있어서,

약제가 인터페론 및 인터페론-유도물질을 포함하는 용도.
제 28 항 내지 제 34 항중 어느 한 항에 있어서,

단위 투여 형태의 약제가 약 20×10⁶IU 내지 약 1000×10⁶IU의 인터페론을 포함하는 용도.
제 28 항 내지 제 35 항중 어느 한 항에 있어서,

약제가 동시, 별도 또는 순차적 치료를 위한 또다른 치료제를 포함하는 용도.
제 28 항 내지 제 36 항중 어느 한 항에 있어서,

치료제가 세포증식억제제, 항암제, 맥관형성억제제 및 항바이러스제로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
제 28 항 내지 제 37 항중 어느 한 항에 있어서,

인터페론이 I형 인터페론인 용도.
제 38 항에 있어서,

I형 인터페론이 IFN-α, IFN-β, IFN-ω, 콘센서스 IFN 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
제 39 항에 있어서,

I형 인터페론이 IFN-α인 용도.
제 28 항 내지 제 37 항중 어느 항 항에 있어서,

인터페론이 II형 인터페론인 용도.
제 41 항에 있어서,

II형 인터페론이 IFN-γ인 용도.
제 38 항 또는 제 41 항에 있어서,

인터페론이 재조합 물질인 용도.
인터페론의 숙주 방어 메카니즘 자극량 또는 면역 반응 자극량(이 양은 비경구적으로 투여될 때 병리학적 반응을 이끌어낼 수 있는 양보다 더 많은 양이다)을 포함하는, 포유동물에서 구강점막과 접촉하여 숙주 방어 메카니즘 또는 면역 반응을 자극시키기 위한 인터페론 조성물.
제 44 항에 있어서,

인터페론의 무독성의 단일 효과 투여량을 포함하는 조성물.
제 44 항에 있어서,

단일 투여량의 숙주 방어 또는 면역 반응 자극에 해당하는 숙주 방어 또는 면역 반응 자극을 이끌어내기에 충분한 다수의 보다 작은 투여량의 인터페론을 포함하는 조성물.
제 44 항 내지 제 46 항중 어느 한 항에 있어서,

단일 투여량의 숙주 방어 또는 면역 반응 자극에 해당하는 숙주 방어 또는 면역 반응 자극을 이끌어내기에 충분한 기간에 걸쳐 숙주 방어 또는 면역 반응을 자극시키는 무독성의 투여량을 연속 투여함을 제공하는 조성물.
제 44 항 내지 제 47 항중 어느 한 항에 있어서,

신생물질 질병을 치료하는데 적합한 조성물.
제 44 항 내지 제 47 항중 어느 한 항에 있어서,

바이러스 감염증을 치료하는데 적합한 조성물.
제 44 항 내지 제 49 항중 어느 한 항에 있어서,

인터페론 및 인터페론-유도물질을 포함하는 조성물.
제 44 항 내지 제 50 항중 어느 한 항에 있어서,

약 20×10⁶IU 내지 약 1000×10⁶IU의 인터페론을 포함하는 단위 투여 형태인 조성물.
제 44 항 내지 제 51 항중 어느 한 항에 있어서,

동시, 별도 또는 순차적 치료를 위한 또다른 치료제를 포함하는 조성물.
제 44 항 내지 제 52 항중 어느 한 항에 있어서,

치료제가 세포증식억제제, 항암제, 맥관형성억제제 및 항바이러스제로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 44 항 내지 제 53 항중 어느 한 항에 있어서,

인터페론이 I형 인터페론인 조성물.
제 54 항에 있어서,

I형 인터페론이 IFN-α, IFN-β, IFN-ω, 콘센서스 IFN 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 55 항에 있어서,

I형 인터페론이 IFN-α인 조성물.
제 44 항 내지 제 53 항중 어느 항 항에 있어서,

인터페론이 II형 인터페론인 조성물.
제 57 항에 있어서,

II형 인터페론이 IFN-γ인 조성물.
제 54 항 또는 제 57 항에 있어서,

인터페론이 재조합 물질인 조성물.
약 20×10⁶IU 내지 약 1000×10⁶IU의 인터페론 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 구강점막 투여에 적합한 단위 투여 형태의 약학 조성물.
제 60 항에 있어서,

약 20×10⁶IU 내지 약 500×10⁶IU의 인터페론을 포함하는 조성물.
제 61 항에 있어서,

약 50×10⁶IU 내지 약 500×10⁶IU의 인터페론을 포함하는 조성물.