KR20000004990A - 알의 항염증성 조성물, 그의 단리 방법 및용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 1종 이상의 항원, 특히 세균성 항원으로 고도 면역화된 조류의 알로부터 얻어진 항염증성 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유효량의 항염증성 조성물을 함유하는 알 또는 알 생성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항염증성 조성물을 단리하는 방법에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 항염증성 조성물 및(또는) 항염증성 조성물의 유효량을 함유하는 알 또는 알 생성물을 사용하여 염증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

알의 항염증성 조성물, 그의 단리 방법 및 용도

다양한 치료 효과를 갖는 우유가 보고되어 있다. 미국 특허 제4324782호에는 충치 억제 효과를 갖는, 스트렙토코커스 변이주에 대한 항체를 함유하는 우유가 개시되어 있다. 이 우유는 2 단계로 스트렙토코커스 변이주 항원으로 소를 면역화하여 얻는다. 미국 특허 제4284623호에는 항염증성을 갖는 우유가 개시되어 있다. 미국 특허 제4879110호에는 고혈압 억제성을 갖는 우유가 개시되어 있다. 미국 특허 제3128230호에는 항원 혼합물을 소에 접종함으로써 얻어지는 알파, 베타 및 감마 성분의 글로불린을 함유하는 우유가 개시되어 있다. 미국 특허 제3376198호, 캐나다 특허 제587849호 및 영국 특허 제1211876호에는 또한 항체 함유 우유가 기재되어 있다. 미국 특허 제4897265호 및 미국 특허 제4636384 (재발행 제33403호)에는 다가 세균 항원을 주입함으로써 고도 면역 상태로 유지된 소로부터의, 동물 항체 함유 우유를 동물에게 공급함으로써 혈액 지질 농도를 낮추는 방법이 개시되어 있다.

조류계의 다양한 속, 예를 들어 닭 (갈루스 도메스티쿠스 (Gallus domesticus)), 칠면조 및 오리는 혈액 및 알에 조류 질병을 일으키는 항원 및 다른 항원에 대한 항체를 생성한다. 예를 들어, 르바끄-베르헤이덴(LeBacq-Verheyden) 등의 문헌 (Immunology 27: 683 (1974)) 및 레슬리(Leslie, G.A.) 등의 문헌 (J. Med. 130: 1337 (1969))에서는 닭의 면역글로불린을 정량적으로 분석하였다. 폴슨(Polson, A.) 등의 문헌(Immunological Communications 9: 495-514 (1980))에서는 암탉을 수종의 단백질 및 천연 단백질 혼합물에 대해 면역화하고, 난황에서 IgY 항체를 검출하였다. 페르텔(Fertel, R.) 등의 문헌(Biochemical and Biophysical Research Communications 102: 1028-1033 (1981))에서는 암탉을 프로스타글란딘에 대해 면역화하고 난황에서 항체를 검출하였다. 젠세니우스(Jensenius) 등의 문헌(Journal of Immunological Methods 46: 63-68 (1981))에서는 면역진단에 사용하기 위한 난황 IgG를 단리하는 방법을 제공한다. 폴슨(Polson) 등의 문헌(Immunological Communications 9: 475-493 (1980))에서는 다양한 식물 바이러스로 감염된 암탉의 난황으로부터 단리된 항체를 기재하고 있다.

미국 특허 제4357272호에는 고도 면역화(hyperimmune)된 암탉으로부터 유도된 난황으로부터의 항체의 단리를 개시하고 있다. 고도 면역화는 식물 바이러스, 인간 IgG, 파상풍 항독소, 뱀의 항베닌 및 세라메바로부터 유도된 항원을 반복적으로 주입하여 유발되었다. 미국 특허 제4550019호에는 30,000 이상의 분자량 또는 입자량을 갖는 면역원으로 고도 면역화된 암탉에서 생성된 항체의 난황으로부터의 단리를 개시하고 있다. 닭을 고도 면역화하는데 사용된 항원은 식물 바이러스, 인간 면역글로불린, 파상풍 독소 및 뱀의 베놈 중에서 선택되었다.

또한, 임상 연구 및 계획된 감염 시험을 통해 장독성 이. 콜리에 대한 항체성 난황 동결건조물 및 면역성 알 전체 동결건조물의 보호 효과가 입증되었다 (Wiedermann 등, J. Vet. Med. B. 38: 283-291 (1991)). K-99-섬모를 갖는 장독소원 이. 콜리로부터 가열 살생된 항원으로 백신 처치한 암탉으로부터 제조된, 경구적으로 투여되는 난황 분말은 신생 송아지를 이. 콜리 유발성 설사에 대해 보호하였다 (Ikemori 등, Am. J. Vet. Res. 53: 2005-2008 (1992)).

또한 로타바이러스에 감염된 생쥐에게 항로타바이러스 IgY를 주입하여서 완전한 보호를 제공하는 것도 입증된 바 있다 (Ebina 등, Microbiol. Immunol. 34: 617-629 (1990)). 또한, 항에드워드시엘라 타르다(anti-Edwardsiella tarda) 항체를 함유하는 난황이 일본 뱀장어에서의 에드워드시엘로시스를 예방하는데 효과적임이 발견되었다 (Gutierrez 등, J. Fish Disease 16: 113-122 (1993)).

미국 특허 제4748018호에서는 상응하는 항원에 대해 면역화된 조류의 알로부터 얻어진 정제된 항체를 비경구적으로 투여하는 것을 포함하는, 알을 섭취한 적이 있는 포유 동물의 수동 면역법을 개시하고 있다. 미국 특허 제4748018호에 개시된 발명은 미국 특허 제4748018호에 개시된 개념을 알 항체의 투여가 비경구적인 것 뿐만 아니라 임의의 적절한 경로에 의해서도 가능하다는 점에서 확대하였다.

디씨브이-바이올로직스(DCV-Biologics)에 양도된 미국 출원 번호 제08/688.576호에서는 고도 면역화된 알 및(또는) 우유 또는 그의 분획물을 투여 대상에 투여함으로써 투여 대상에서 만성 위장 질환 또는 비스테로이드계 항염증제 유발성 (NSAID 유발성) 위장 손상의 예방, 저지 또는 경감 방법을 개시하고 있다.

특정 세균 항원에 대해 면역화된 닭의 알은 미국 특허 제5215746호에서 포유동물의 항동맥경화증에 효과를 제공한다고 개시되어 있다.

스트렙토코커스 변이주에 대한 항체를 함유하는 알을 스트렙토코커스 변이주로 면역화된 닭으로부터 얻었고(Otake 등, J. Dental Research 70: 162-166 (1991)) 충치 진행을 억제하였다.

그러나, 어떠한 문헌도 동물에 투여되어서 염증을 예방하거나 또는 경감시킬 수 있는 조성물 및(또는) 인자를 생성할 수 있는 알을 개시하거나 또는 제안하지 않았다. 어떠한 문헌도 조류를 처치함으로써 알에서 이러한 조성물 및(또는) 인자를 생성할 수 있다는 합리적인 기대를 제공하는 방법을 개시하거나 또는 제안하지 않았다. 어떠한 문헌도 바람직한 치료 효과를 제공하는 알의 항염증 성분의 정체를 제안하거나 또는 개시하지 않았다.

발명의 요약

본 발명은 알 및 알 생성물, 특히 고도 면역화된 조류로부터 얻어진 알 생성물에서 항염증 활성이 있고, 투여 대상, 특히 포유동물에 투여되는 경우 투여 대상의 염증을 예방 또는 경감시킨다는 발명자의 발견을 토대로 한다.

특히, 본 발명은 조류의 알로부터 얻은 고순도의 항염증성 조성물에 관한 것이다. 항염증 활성은 난황 및 난백에서 단리된 분획물 모두에서 발견되었다.

또한, 본 발명은 조류에 1종 이상의 항원, 특히 세균성 항원을 투여함으로써 조류를 고도 면역화하고, 고도 면역화된 조류로부터 알을 수거하고, 그로부터 고순도의 항염증성 조성물을 단리하는 것을 포함하는 방법에 의해 생성되는 고순도의 항염증성 조성물에 관한 것이다.

고도 면역화 방법은 정상 초과 수준의 고순도의 항염증성 조성물을 조류의 알로부터 생산한다. 놀랍게도, 항염증성 조성물의 수준은 고도 면역화 방법에 의해 난황 및 난백 모두에서 증가될 수 있다.

또한, 본 발명은 실질적으로 순수한 항염증성 조성물 또는 실질적으로 순수한 항염증성 조성물을 함유하는 조성물을 투여 대상에 투여하는 것을 포함하는, 투여 대상, 특히 포유동물에서 염증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이는 항염증성 알 전체 및(또는) 그의 분획물을 투여하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 림프구 및 호중구가 소정맥의 내피에 접착하는 것을 방지하거나, 또는 이미 소정맥의 내피 세포 내막벽에 접착된 림프구 및 호중구를 분리시키고, 림프구 및 호중구의 이동을 감소시켜서 과잉 부종 및 유동물 형성을 감소시키는 항염증성 조성물 및(또는) 고순도 항염증성 인자를 함유하는 알을 사용하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에서, 이 조성물은 염증 반응과 관련된 조직 손상을 감소시키는데 사용된다.

마지막으로 본 발명은 포유동물에서 항염증 활성을 보이는 실질적으로 순수한 항염증성 조성물을 포함한다.

도면의 간단한 설명

도 1은 분자량 30,000 미만의 알의 항염증성 조성물을 DEAE 세파로즈 이온 교환 크로마토그램에 의해 분리하는 것을 도시한 크로마토그램.

도 2는 분자량 30,000 미만의 알의 항염증성 조성물에 의한 흉부 백혈구 이동의 억제를 도시한 그래프.

도 3은 헥산-에탄올로 탈지된 난황으로부터의 내독소가 없는 항염증성 조성물에 의한 래트의 흉부 백혈구 이동의 억제를 도시한 그래프.

도 4는 난황으로부터의 30,000 미만의 분자량의 항염증성 조성물 제조의 공정도.

도 5는 난백으로부터의 30,000 미만의 분자량의 항염증성 조성물 제조의 공정도.

도 6은 초임계 CO₂추출에 의해 탈지된 S-100 난황으로부터의 내독소가 없는 30,000 미만의 분자량의 항염증성 조성물에 의한 래트의 흉부 백혈구의 억제를 도시한 그래프.

도 7은 건조된 난황 분말로부터의 30,000 미만의 분자량의 알의 항염증성 조성물 제조의 공정도.

도 8은 분말상 난황으로부터의 3,000 미만의 분자량의 항염증성 조성물의 정제의 공정도.

도 9는 분말상 난백으로부터의 3,000 미만의 분자량의 항염증성 조성물의 정제의 공정도.

도 10은 DEAE 다공성 이온 교환 크로마토그래피에 의한 3,000 미만의 분자량의 알의 항염증성 조성물의 분리의 크로마토그램.

도 11은 난황 및 난백으로부터의 3,000 미만의 분자량의 고도로 정제된 분획물에 의한 백혈구 이동의 억제를 도시한 그래프.

도 12는 고도 면역 난황으로부터의 DEAE 피크 2, 3,000 미만의 분자량 및 10,000 미만의 분자량의 한외여과물에 의한 백혈구 이동의 억제를 도시한 그래프.

도 13은 알로부터의 고도로 정제된 3,000 미만의 분자량의 항염증성 조성물과 항염증 약제 (NSAIDS) (인도메타신 및 아스피린)를 비교한 그래프.

도 14는 고도 면역 난황으로부터 3,000 미만의 분자량의 항염증성 조성물의 HPLC 분리의 크로마토그램.

도 15는 고도 면역 난황으로부터 DEAE 분획물의 HPLC 분리의 크로마토그램.

본 발명은 천연 식료품에서 생성되는 항염증성 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 알의 항염증성 조성물, 그의 실질적으로 정제된 형태 및 고도로 정제된 형태로의 생성 방법 및 염증 치료에 사용하기 위한 방법에 관한 것이다.

도르랜드(Dorland)의 의학 사전에 정의된 바대로, 염증이란 조직의 상해 또는 파괴에 의해 유발되는 국소 보호 반응으로, 이는 상해 유발 물질과 상해된 조직 모두를 파괴하거나, 약화시키거나 또는 차폐하는 작용을 한다. 염증의 특징은 미세혈관이 천공되고, 혈액 성분이 틈새 공간으로 누출되고, 백혈구가 염증 조직으로 이동한다는 것이다. 거시적 측면으로는, 이는 통상적으로 홍반, 부종, 통각과민(민감성) 및 통증 등의 친숙한 임상적 증상을 수반한다.

이러한 복합적인 반응을 하는 동안, 히스타민, 5-히드록시트립타민, 다양한 화학주성 조성물, 브래디키닌, 로이코트리엔 및 프로스타글란딘과 같은 화학적 매개 물질들이 국소적으로 유리된다. 식세포가 이 영역으로 이동하고, 세포의 라이소좀막이 파괴되어서 분해 효소를 방출하게 된다. 이러한 모든 작용은 염증 반응의 원인이 될 수 있다.

류마티스성 관절염을 앓는 환자에서의 염증은 아마도 백혈구를 유인하는 화학주성 및 화학활성화 조성물의 국소 방출을 일으키는, 항체 보체와 항원의 복합체가 관여할 것이다. 백혈구는 항원-항체와 보체의 복합체에 대해 식작용을 하며, 또한 그의 라이소좀 내에 함유된 많은 효소를 방출한다. 이어서, 이 라이소좀 내의 효소는 연골 조직 및 다른 조직에 상해를 일으키고, 이는 염증의 정도를 심화시킨다. 또한 세포 매개된 면역 반응도 수반될 수 있다. 세포 기능의 중요한 세포내 조절자인 프로스타글란딘도 이 과정 동안 방출된다.

아더스(Arthus) 반응은 항원이 그의 항체와 복합체를 이루는 피하 위치에서 면역 복합체를 형성함으로써 야기되는 염증 반응이다. 호중구가 피하 주사 위치에 형성되는 면역글로불린 복합체의 Fc 영역에 특징적으로 결합하고, 여기서 소화 효소를 방출하여서 가시적 급성 염증을 일으킨다. 따라서, 이 반응은 우선 호중구에 의해 매개되고, 반응을 진행시키는 작용물질은 이 세포에 대한 효능에 의해 매개된다.

소정 작용물질을 통해 혈관으로부터 염증 부위로의 호중구의 이동을 방해하는 몇가지 경로가 있다. 하나의 가능한 경로는 변연추향(margination), 즉 혈관벽의 내피 세포 내막에 대한 염증 세포의 가역적 접착 또는 "부착"을 억제하는 것이다. 이 접착은 백혈구세포 및 혈관 내막에 대해 "벨크로(velcro)"로서 작용하는 접착 및 인터그린 분자의 질 및 양에 의해 정확하게 조절된다. 정상 상태에서는, 호중구의 약 50%가 가역적으로 접착하나, 급성 염증 반응이 일어나는 동안 접착은 더욱 강해지고 호중구 이동 과정에서의 중요한 단계가 된다. 프로스타글란딘은 화학주성 반응에 직접 관여하지 않는 반면, 아라키돈산의 다른 대사산물인 로이코트리엔은 매우 효능있는 화학주성 물질이다.

염증 반응은 상기 정의된 바와 같이 염증에 의해 특징지워 지는 임의의 반응이다. 염증 반응이 상이한 질병 및 상해와 관련되어 나타나는 많은 물리적 불편함 (즉, 통증 및 기능의 손실)을 일으킨다는 것은 의학 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 염증 반응의 물리적 불편함을 감소시키는 제약학적 제제를 투여하는 것은 통상적인 의료 관례이다. 이러한 특성을 갖는 작용 물질은 항염증성으로 분류된다. 항염증성 약제는 광범위한 질병의 치료에 사용되고, 동일한 약제가 종종 상이한 질병의 치료에 사용된다. 항염증성 약제를 사용하는 치료는 질병에 대한 것이 아니라 대부분 증상 (즉, 염증)에 대한 것이다.

항염증제, 진통제 및 해열제는 흔히 화학적으로 관련이 없는 다른 군의 화합물들이나, 특정 치료 작용 및 부작용을 공유한다. 코르티코스테로이드는 염증 치료에 가장 광범위하게 사용되는 부류의 화합물이다. 단백질 분해 효소는 항염증 효과를 갖는 것으로 생각되는 또 다른 부류의 화합물이다. 직접 또는 간접적으로 부신피질이 스테로이드를 생산하고 분비하게하는 호르몬은 또 다른 부류의 항염증성 화합물이다.

불행히도, 천연 및 합성 코르티코스테로이드 제제는 혈압 상승, 염 및 물의 정체, 신장 손상, 및 칼륨 및 칼슘 분비의 증가를 비롯한 수많은 심각한 부작용을 일으킨다. 더욱이, 코르티코스테로이드는 감염 증상을 은폐하여 감염성 미생물의 전파를 증가시킬 수 있다. 이 호르몬은 임산부에게 안전하지 못한 것으로 여겨지며, 장기간의 코르티코스테로이드 치료는 위산과다 및(또는) 소화 궤양과 연관된다. 코르티코스테로이드를 사용하는 치료도 다량의 인슐린 투여를 요하는 당뇨병을 더욱 악화시킬 수 있고, 정신병을 일으킬 수 있다. 내인성 코르티코스테로이드의 생산을 간접적으로 증가시키는 호르몬계 항염증성 작용 물질도 동일한 부작용 가능성을 갖는다.

수많은 비스테로이드계 항염증성 작용물질 (NSAID's)가 기재되어 있다. 이들 중, 가장 광범위하게 사용되는 것은 살리실산염이다. 아세틸살리실산 또는 아스피린은 가장 널리 규정된 진통-해열 및 항염증성 작용 물질이다. 스테로이드계 및 비스테로이드계 항염증성 작용 물질의 예는 내과의사의 데스크 참고자료에 목록화되어 있다.

NSAID's는 광범위한 바람직하지 못한 부작용으로 인해 다량 투여시에서 독성이 될 수 있는 합성 생화학적 화합물이다. 예를 들어, 살리실산염은 이러한 부류의 화합물에 의한 중독을 특징짓는 심각한 산-염기 균형 파괴를 일으킨다. 살리실산염은 간접적으로 그리고 직접적으로 호흡을 촉진시킨다. 살리실산염의 독성 투여량은 중추 호흡 마비 및 혈관 운동신경의 저하에 버금가는 순환계 붕괴를 일으킨다. 살리실산의 섭취는 상복부 통증, 메스꺼움 및 구토를 일으킬 수 있다. 살리실산염 유발성 위장 출혈은 공지되어 있다. 살리실산염은 간 손상을 일으키며 혈액응고 시간을 지연시킬 수 있다. 따라서, 살리실산염에 의한 혈소판 지혈의 저해로 인해 출혈을 초래할 수 있기 때문에, 아스피린은 심각한 간 손상, 저프로트롬빈증, 비타민 K 결핍증 또는 혈우병을 지닌 환자에 사용되지 말아야 한다. 살리실산염의 중독은 통상적이고, 10,000건 이상의 심각한 살리실산염 중독의 사례가 미국에서 해마다 나타나고, 이들 중 일부는 치명적이며 많은 사례들이 어린이들에서 나타난다. 굿맨(Goodman) 및 길만(Gilman)의 문헌[The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed., 1985]을 참조.

따라서, 다수의 항염증성 작용 물질이 현재 사용되고 있음에도 불구하고, 부작용 및 역효과가 없는 안전하고 효과적인 항염증성 생성물이 여전히 요구되고 있다.

항염증 효과를 갖는 천연 식품을 얻을 수 있다면, 쉽게 투여되고 쉽게 이용되며 안전한 치료 조성물을 제공하게 될 것이다.

정의

용어 "알 생성물"이란 본 명세서에 기재된 바대로 항염증성 알 또는 알의 분획물을 함유하는 임의의 생성물을 의미한다.

용어 "항염증성 알 또는 알의 분획물"이란 본 명세서에 개시된, 특히 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생성된 항염증성 조성물을 함유하는 알 또는 알의 분획물을 의미한다.

용어 "항염증성 조성물"이란 염증 과정을 저지하거나 또는 억제하는 조성물을 의미한다.

용어 "실질적으로 순수한 알의 항염증성 조성물"이란 실시예 3 및 예시적 재료 및 도면에 기재된 순도 이상의 항염증성 조성물을 의미한다.

용어 "고순도의 항염증성 조성물"이란 실시예 4 및 예시적 재료 및 도면에 기재된 순도 이상의 항염증성 조성물을 의미한다.

용어 "항염증성 인자"란 실시예 7에 기재된 순도 이상의 항염증성 조성물에 존재하는, 염증 과정에 저지하거나 또는 억제하는 실질적으로 순수한 작용 물질을 의미한다.

용어 "조합적으로 유래된 항원"이란 조합적 합성 방법에 의해 항원 중 분자량의 다양성을 유발하는 신규한 방법을 말한다.

용어 "생물공학적 항원"이란 항원적 특성을 갖는 단백질의 삽입 및 번역을 가능하게 하는 유전자 클로닝 기술 및 유전적 재배열 방법을 통해 얻어진 항원을 말한다.

용어 "유전공학적 백신"이란 재조합 기술에 의해 일반적으로 생성되고 면역 반응을 일으킬 수 있는 핵산 백신을 말한다.

용어 "고도 면역화된 알"이란 고도 면역 상태로 유지된 알을 낳는 동물로부터 얻어진 알 전체 또는 그로부터 유래된 생성물을 의미한다.

용어 "정상 초과 수준"이란 고도 면역 상태로 유지되지 않은 알을 낳는 동물의 알에서 발견되는 양을 초과하는 수준을 의미한다.

용어 "테이블 알"이란 고도 면역화되지 않은 알을 의미한다.

용어 "염증"이란, 당업계에서는 조직의 상해 또는 파괴에 의해 유발되는 국소 보호 반응을 의미하고, 이는 상해 인자 및 상해된 조직 모두를 파괴하거나, 약화시키거나 또는 차폐하는 작용을 하며, 전형적으로 통증, 발열, 적열, 팽윤 및 기능의 손실의 순서에 의한 부적절하고 비조절된 형태에 의해 특징지워지고, 투과성 및 혈액 유동성의 증가와 함께 동맥, 모세혈관 및 소정맥의 팽창, 혈장 단백질을 함유한 유체의 삼출 및 염증 병소로의 백혈구의 이동을 비롯한 일련의 복합적 증상을 조직학적으로 수반한다.

용어 "치료"란 질병의 증상 및(또는) 병인적 기원을 예방하고, 개선하거나 또는 완전히 제거하는 것을 의미한다. 예를 들어, 항염증성 조성물은 인간 및 다른 포유동물에서 염증 증상을 억제할뿐 아니라, 수용 대상에게서 예상되는 염증 유발 물질의 존재에 대항하는 예방제로서 작용함으로써 염증을 치료한다.

용어 "투여하다"란 경구적으로, 비강 내로, 비경구적으로(정맥내로, 근육내로 또는 피하로) 또는 직장으로 투여하는 것을 비롯한, 소정 물질을 소정의 대상에 공급하는 임의의 방법을 의미한다.

용어 "투여 대상"란 염증 반응을 일으킬 수 있고, 염증성 질병 및 손상으로 해를 입는, 인간 및 다른 동물을 포함하는 임의의 생존 동물을 의미한다.

본 발명

하나의 실시 양태에서, 본 발명은 조류의 알, 그의 단리 및 정제로부터 얻어진 고순도의 항염증성 조성물, 및 염증 치료를 위한 투여 대상에의 조성물 투여를 포함한다. 또한, 본 발명은 1종 이상의 항원, 특히 세균성 항원 또는 그의 합성 등가물로 고도 면역화된 조류의 알로부터 얻어진 고도로 정제된 항염증성 조성물을 포함한다. 고순도의 항염증성 조성물은 투여 대상에 항염증 활성을 제공하는 정상 초과 수준으로 고도 면역화된 알에 존재한다.

고순도의 항염증성 조성물이 임의의 테이블 알의 난황 및 난백의 수용성 분획물에서도 발견됨에도 불구하고, 고도 면역화된 알로부터 단리되는 경우, 항염증성 조성물은 투여 대상에서 염증을 치료하는데 효과적인 정상 초과 수준으로 발견된다.

또한 본 발명은 조류의 알로부터 얻어진 실질적으로 순수한 항염증성 조성물, 그의 단리 및 정제, 및 염증 치료를 위한 투여 대상에의 조성물 투여를 포함한다. 또한, 본 발명은 1종 이상의 항원, 특히 세균성 항원, 또는 그의 합성 등가물로 고도 면역화된 조류의 알로부터 얻어진 실질적으로 정제된 항염증성 조성물을 포함한다. 실질적으로 순수한 항염증성 조성물은 투여 대상에서 항염증성 활성을 제공하는 정상 초과 수준으로 고도 면역화된 알에 존재한다.

본 발명의 항염증성 조성물은 항염증 활성을 제공하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 비경구적, 피하적, 정맥내, 근육내, 복막내, 비강내 또는 경구적일 수 있다. 경구 투여를 위한 고체 투여 형태는 캡슐, 정제, 알약, 분말제 및 과립을 포함한다.

또한, 본 발명은 항염증성 조성물 내에서 발견되는 실질적으로 순수한 항염증성 인자를 포함한다. 이 인자는 항염증성 조성물에 대해 상기된 것과 동일한 수단에 의해 투여 대상에 투여될 수 있다.

본 발명의 상세한 설명은 하기되어 있다.

고도로 정제된 항염증성 조성물의 특징

고순도의 항염증성 조성물은 하기와 같은 특징을 갖는다.

1) 투여 대상, 특히 포유동물에서 항염증 활성을 갖고,

2) 조류 알의 난황 및 난백 모두에 존재하고,

3) 난황으로부터 단리되는 경우가 난백에서 단리되는 경우보다 항염증 활성이 더 크고,

4) 약 3000 달톤 미만의 분자량을 갖고,

5) 단백질을 분해하는 효소에 의해 분해되지 않고,

6) 비단백질계 및 비스테로이드계이고.

7) 일반적인 조건 하에서 음 전하를 갖고,

8) 100℃에서 30분 이상 동안 열안정적이고,

9) 경구로 투여가능하고 소화 효소에 의해 분해되지 않으며,

10) 내산성 및 내염기성으로, pH 4 내지 pH 9.0의 조건으로 치료한 후에도 활성 형태로 돌아온다.

3,000 달톤의 분자량은 3,000 달톤을 초과하는 분자종을 통과시키지 않는 한외여과막을 사용하는 조성물의 단리 및 정제 방법으로부터 귀결된다. 이 조성물은 크기가 작고 단백질을 분해시키는 효소에 의해 분해되지 않기 때문에, 비단백질계 및 비스테로이드계로 판단된다. 더욱이, 조성물은 경구로 투여가능하고 소화 효소에 의해 분해되지 않는다. 조성물의 작고 안정한 형태 (이보다 훨씬 큰 단백질과 구별됨)는 소화관으로부터 그의 흡수를 용이하게 한다.

조성물은 내산성 및 내염기성이고, pH 9.0의 조건으로 치료한 후에도 활성 형태로 돌아온다. 또한, 조성물은 100℃에서 30분 이상 동안 열안정적이고, 중성 pH에서 음 전하를 갖는다.

고도로 정제된 알의 항염증성 조성물은 알 전체, 난황 및 난백으로부터 단리될 수 있다. 난황으로부터 단리된 항염증성 조성물은 난백으로부터 정제된 항염증성 조성물보다 높은 항염증 활성을 보인다.

고도로 정제된 항염증성 조성물의 정상 초과 수준은 고도 면역화된 조류의 알 전체, 난황 및 난백으로부터 단리될 수 있다.

실질적으로 순수한 항염증성 조성물의 특성

실질적으로 순수한 항염증성 조성물은 포유동물에서 항염증 활성을 보인다. 실질적으로 순수한 항염증성 조성물은 약 30,000 달톤 미만의 분자량의 분자를 함유하는 분획물의 난황 및 난백의 수용성 분획물에서 발견된다. 조성물은 음 전하를 갖고, 90℃에서 1시간 이상 동안 열안정적이고, 도 1에 도시된 알로부터의 용출 프로파일을 갖는다. 더욱이, 난황으로부터 단리된 조성물은 난백에서 단리된 인자보다 포유동물에서 더 큰 항염증 활성을 갖는다.

상기된 방법에 의해 달걀로부터 제조된 알의 항염증성 조성물의 분자량은 30,000 달톤 미만이다. 이는 난황 및 난백으로부터의 인자를 단리시키는 제1 단계가 30,000 달톤을 초과하는 분자량 종을 통과시키지 않는 막을 사용하는 한외여과에 의한 것이라는 사실로부터 추론된다. 이 조성물은 알의 30 K 한외여과물을 DEAE 세파로즈 이온 교환 칼럼에 가하여 측정된 바와 같이, 일반적인 조건 하에서 음 전하를 갖는다. 항염증성 조성물은 물을 사용해서는 칼럼으로부터 용출되지 않는다. 융출 매질을 NH₄OAc 용액으로 바꾸어서 알의 항염증성 조성물을 용출시킨다. 한외여과물을 DEAE 세파로즈 칼럼에 가하는 경우, 다양한 단백질 및 염이 비결합 분획물을 형성한다.

알을 낳는 동물의 고도 면역화

본 발명은 조류와 같은 알을 낳는 동물이 고도 면역화의 특정 상태에 있는 경우, 동물이 정상 초과 수준의 매우 이로운 항염증성 조성물을 갖고 보다 높은 항염증 효과를 제공하는 알을 생성할 것이라는 발견에 부분적 토대를 두고 있다.

고도 면역화된 알 생성은 알을 낳는 동물에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게, 동물은 조류계의 일원일 수 있다. 조류계 내에서, 가금류가 바람직하나, 이 계의 다른 구성원, 예를 들어 칠면조, 오리 및 거위는 고도 면역화된 알 생성물의 적절한 공급원이다.

이러한 알을 낳는 동물이 예를 들어, 항원의 주기적 추가 항원 자극 투여에 의해 고도 면역화의 특정 상태에 있는 경우, 동물은, 투여 대상에 투여되는 경우에 염증 치료에 이로운 특성을 갖게 될, 정상 초과 수준의 항염증성 조성물을 함유하는 알을 생성할 것이다.

조류가 조류 질병에 대해 정상 면역화되고 환경 인자에 정상 노출되는 동안 다양한 항원에 대해 감작화됨에도 불구하고, 정상 조류의 알, 다시 말해 "테이블 알"이 정상 초과 수준을 함유하지 않는다는 사실에 의해 나타나는 바와 같이, 면역 감수성의 유도만으로는 알에서 알 중의 항염증성 조성물의 정상 초과 수준으로 생산하기에는 충분하지 않다. 특정 고도 면역화 상태만이 알이 바람직한 정상 초과 수준을 갖게 한다.

알이 보다 높은 수준의 항염증성 조성물을 함유하게 되는 고도 면역화의 특정 상태는 초기 면역화를 투여한 후, 특정 항원 또는 항원들의 혼합물의 충분히 높은 투여량으로 주기적 추가 항원 자극함으로써 얻어진다. 바람직한 추가 항원 자극 투여량은 조류의 초기 면역화를 이루는데 필요한 투여량의 50% 이상이어야 한다. 따라서, 역치 추가 항원 자극 투여량이 존재하며, 이에 미치지 못하면 조류가 소위 정상적으로 면역 상태에 있음에도 불구하고, 특성이 조류의 알에서 생성되지 않는다. 고도 면역화 상태를 발전시키고 유지시키기 위한 요건을 알고 있는 당업자들에게는 투여될 항원의 양은 동물을 고도 면역 상태로 유지하기 위해 사용된 알을 낳는 동물의 속 및 종에 따라 변화된다.

항염증성 조성물의 수준이 상기된 바와 같이 증가되는 경우, 자연스럽게 항염증성 인자도 상응하게 증가된다는 것이 이해되야 한다.

고도 면역 조성물은 항원 또는 항원들의 조합물에 의해 생성될 수 있다. 고도 면역화는 다중 항원에 대한 다중 노출, 단일 항원에 대한 다중 노출 또는 면역원의 라이브러리에 대한 단일 노출에 의해 얻어질 수 있다. 거의 모든 항원은 고도 면역 상태를 유도하는데 사용될 수 있고, 여기에는 세균, 바이러스, 원생동물, 알레르겐, 진균 또는 세포 물질 등이 포함되나 이에 한정되지는 않는다.

천연 발생 항원으로의 면역화 외에, 면역화는 또한 조합적 화학법에 의해 합성적으로 유도된 항원을 사용하여 얻을 수 있다. 기본 전략은 다양성을 지닌 분자의 집단을 생성하기 위한 화학적 빌딩 블록의 다중 조합을 집합시키는 것이다. 최근 올리고머 (Fodor, S. 등, Science 251: 767 (1991); Houghton, R. 등, Nature 354: 82 (1991)) 및 작은 유기 분자 (Bunin, B. & Ellman, J., J. Am. Chem. Soc. 114:10997 (1992))의 라이브러리의 고상 및 액상 조합적 합성에 대한 수가지 방법이 개발되어 왔다. 신속한 다중 펩티드 및 올리고머 합성은 조합적으로 유도된 항원에 대한 공급원으로서 작용할 수 있다. 또한, 다른 전략은 개선된 항원성을 위해 골격 분자에 조합적 방식으로 유기 빌딩 블록을 첨가시키는 것이다.

알을 낳는 동물을 고도 면역화시키는 다른 방식은 유전공학적 백신 또는 생물공학적 항원을 사용하는 것이다. 특히, 임의의 DNA 작제물은 (일반적으로 프로모터 영역과 항원 코딩 서열로 구성됨) 항체 방출을 일으킬 것이다. 항원 코딩 벡터, 네이키드 DNA, 플라스미드 DNA, DNA-RNA 항원, DNA-단백질 컨쥬게이트, DNA-리포좀 컨쥬게이트, DNA 발현 라이브러리, 및 바이러스와 세균의 DNA의 단편으로 구성된 유전공학적 백신은 수송되어 면역 반응을 일으킨다.

특히, DNA가 면역조절적이며 또한 면역원적이라는 증거가 존재한다. 항원 코딩 벡터, 네이키드 DNA의 단편, 플라스미드 DNA, DNA-RNA 항원, DNA-단백질 컨쥬게이트, DNA-리포좀 컨쥬게이트, DNA 발현 라이브러리의 수송은 생존 및 가열 살생된 세균 및 바이러스 백신과 효과에 있어서 유사할 수 있다. DNA 백신의 잇점 중 하나는 체액 및 세포독성 면역 반응을 유도하기 위한 유리 항원을 공급하는 각 세포로부터 항원을 생성 및 방출하는 것이다. 세포독성 반응은 효과 증진의 원인이 된다 (Ada, G.L., Lancet 335: 523-526 (1990)). 다른 잇점은 적절한 3차원 형태를 갖는 외래 단백질을 생성하는 유전공학적 백신의 능력이다.

유전공학적 면역화는 생/약독화 병원균의 많은 잇점을 가지나 감염의 위험은 없는 백신 생성 방법에 대한 새로운 접근 방법이다. 수개의 공급원으로부터의 DNA를 포함하는 발현 라이브러리는 고도 면역 상태를 생성하기 위한 백신으로 사용될 수 있다.

DNA 수송 방법에는 입자 충격법 (bombardment), 직접 주입법. 리포좀, 제트 주입법이 포함되나 이에 한정되지는 않는다 (Fynan, E.F. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11478-11482 (1993)). 공지되거나 또는 공지되지 않은 면역원을 코딩하는핵산, 프로모터 영역 (특히 CMV 양배추 모자이크 바이러스) 및 SV40 세균성 오리진은 세균 내에서 복제되어서 DNA 주입에 사용되는 플라스미드 DNA를 생성할 수 있다. DNA의 비경구적 투여의 수가지 경로가 닭에서 효과적이나, 바람직한 방법은 흉근에 근육내 주사하는 것이다. 백신 시험은 알을 낳는 조류, 바람직하게는 닭에서 수행한다. 면역화는 1 내지 2주 간격으로 6개월까지 반복한다.

사용되는 DNA의 양은 일반적으로 직접 주입을 위해 염수 중의 DNA 50 내지 300 ㎍이 바람직하다. 입자 충격법에서는 2.5M CaCl₂의 첨가로 금구슬 상에 공침전되는 DNA 4 내지 100 ㎍이 바람직하다. 반복 면역화는 생존 동물에 DNA 코팅된 입자를 가속화하는 방법에 의해 피부내로 투여될 수 있다.

하기는 알을 낳는 동물이 높은 상태의 면역성을 갖게 하는데 사용되는 바람직한 방법의 상세한 설명으로, 여기서 생성된 고도 면역화된 알 또는 알 생성물은 투여 대상에 투여될 수 있다.

1. 1종 이상의 항원을 선별하는 단계,

2. 1차 면역화에 의해 알을 낳는 동물에서 면역 반응을 유발하는 단계,

3. 고도 면역화 상태를 유도하고 유지하기 위하여 적절한 투여량의 항원을 지닌 추가 항원 자극 백신을 투여하는 단계,

4. 고도 면역화된 알을 항염증 활성 수준에 대해 시험하는 단계, 및

5. 알을 수거 및 처리하는 단계.

하기는 본 발명의 더욱 상세한 설명이다.

단계 1: 임의의 항원 또는 항원들의 조합을 사용할 수 있다. 항원은 세균, 바이러스, 원생동물, 진균, 세포, 알레르겐 또는 알을 낳는 동물의 면역계가 반응을 일으키도록 하는 임의의 다른 물질일 수 있다. 이 단계에서 중요한 점은 항원(들)이 알을 낳는 조류에서 면역 및 고도 면역 상태를 유도할 뿐만 아니라, 알에서 항염증성 조성물의 생성을 유도할 수 있다는 점이다. 하나의 바람직한 백신은 다가의 세균 항원의 혼합물, 일명 시리즈 100 (S-100) 백신이다. S-100 백신에 포함된 세균은 실시예 1의 표 1에 목록화되어 있다. 이 백신은 미국 특허 제5106618호 및 동 제5215746호 (모두 스톨 리써치 앤드 디벨롭먼트 코포레이션에 양도됨)에 선행 기재되어 있다.

단계 2: 백신은 면역 반응을 유발하는 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 면역화는 항원을 근육내 주사를 통해 투여함으로써 수행될 수 있다. 조류에서 주입에 바람직한 근육은 흉근이다. 투여량은 항원 백신 0.5 내지 5 ㎎이 바람직하다. 사용될 수 있는 다른 투여 방법은 정맥내 주입, 복막내 주입, 직장 좌약 및 경구 투여 등이 포함된다. DNA 기술이 고도 면역화 방법에 사용되는 경우, 훨씬 소량이 요구되며, 일반적으로 1 내지 300 ㎍이다.

면역학 분야의 숙련가에게 공지된 수많은 방법을 통하여 백신이 알을 낳는 동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는지를 측정할 수 있다. 이러한 예에는 효소결합 면역결정법 (ELISA), 촉진 항원에 대한 항체 존재에 대한 시험법 및 숙주의 면역 세포가 항원에 반응하는 능력을 평가하기 위해 고안된 시험법이 포함된다. 일반적으로, 백신으로의 면역화 후에 알에서 항체가 나타나는 것은 면역 반응의 징후이다. 면역 반응을 유도하기 위한 항원의 최소 투여량은 사용되는 항원의 유형 및 숙주로서 사용되는 알을 낳는 동물의 유형을 포함하는 백신화 방법에 의존한다.

단계 3: 고도 면역 상태는 바람직하게는 고정된 시간 간격으로 적절한 투여량을 반복적 추가 항원 자극 투여함으로써 유도되고 유지된다. 시간 간격은 바람직하게는 6개월 동안 2주 간격이다. 추가 항원 자극 투여는 내면역성을 초래하지 않는 것이 필수적이다.

다른 고도 면역화 유지 방법 또는 방법들의 조합, 예를 들어, 1차 면역화를 위한 근육내 주입 및 추가 항원 자극 주입을 위한 정맥내 주입 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한 방법에는 1차 면역화를 위한 마이크로캡슐화된 액체 항원의 동시 투여 또는 근육내 주입, 및 경구 투여 또는 마이크로캡슐화 수단에 의한 비경구 투여에 의한 추가 항원 자극 투여가 포함된다. 1차 및 고도 면역화의 수가지 조합은 당업자에게 공지되어 있다.

단계 4: 알을 항염증 활성 수준에 대해 시험하는 것이 요구된다. 이는 고도 면역화 알 또는 그로부터 유도된 생성물의 염증에 대한 효과를 시험하는 임의의 임상적 및 예비 임상적 평가에 의해 수행될 수 있다. 래트의 화학적으로 유도된 염증은 항염증 약제에 대한 표준 분석물이다 (실시예 6a, b, c).

단계 5: 이 단계는 항염증성 조성물을 함유하는 알의 수거 및 처리에 관한 것이다. 알은 통상적인 방법에 의해 수거될 수 있다. 항염증성 조성물을 단리하고 정제하기 위한 알의 처리 방법은 하기와 같다.

단리 및 정제

알의 항염증성 조성물의 단리 및 정제는 알 전체, 난황 또는 난백을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 방법의 예는 다음과 같다.

1. 알로부터 수용성 분획물을 제조하는 단계,

2. 수용성 분획물의 한외여과하는 단계,

3. 역상 고압 액상 크로마토그래피에 의한 분획물을 분리하는 단계, 및

4. 항염증 활성에 대해 분리된 분획물을 생물검사하는 단계.

하기는 본 방법의 더욱 상세한 설명이다.

단계 1:

항염증성 조성물은 알 전체, 난황 또는 난백으로부터 단리될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조성물은 난백으로부터 이 방법에 의해 단리된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 조성물은 난황으로부터 단리된다. 지질 부분은 알 전체 또는 난황으로부터 당업자에게 공지된 방법에 의해 제거된다. 예를 들어, 분무 건조된 난황 분말의 경우에, 탈지는 용매 (프로판, 부탄 또는 핵산 또는 2상 용매), 초임계 CO₂효소 등을 사용하여 수행될 수 있고, 액상 난황의 경우에 탈지는 리(Lee)의 문헌(미국 특허 제5367054호)에 개시된 카프릴산 분리법 (CAPS)에 의해 수행될 수 있다. 난백에서는 지방 제거가 필요하지 않으므로 난백의 액상 또는 분말 형태가 통상의 방법에 의해 직접 가열 또는 용해될 수 있고 하기 실시예에 기재되어 있다. 이어서, 알 전체, 난황 또는 난백은 바람직하게는 액상 또는 분말 형태로 처리되고, 더 나아가 수용성 분획물을 얻도록 처리된다 (실시예 참조).

단계 2:

알 전체, 난황 또는 난백으로부터의 생성된 수용성 분획물을 분자량 3,000으로 제한하는 막을 구비한 한외여과계를 사용하여 한외여과한다. 한외여과법은 3,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 분자를 3,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것으로부터 분리시킨다. 여과한 후, 생성된 3,000 달톤 미만의 분자량의 분자를 함유하는 한외여과물을 동결건조시키고, 칭량하고, 생물검사법을 위해 제조하였다. 특정 개시된 실시 양태에서, 바람직한 한외여과는 아미콘 RA1000 (3K MWCO) 및 DEAE 이온 교환 크로마토그래피에 의한다. 그러나, 등가 기술 및 재료가 조성물을 단리하는데 사용될 수 있고, 이는 당업계의 숙련가에 의해 이용될 수 있다는 것을 이해하자.

단계 3:

3,000 달톤 미만의 한외여과물로부터의 분획물은, 예를 들어 역상 고압 액상 크로마토그래피에 의해 분리되어서 고순도의 항염증성 조성물을 단리할 수 있다. 별법의 또는 추가의 방법으로, 한외여과물 중 알의 항염증성 조성물은 추가로 음이온 DEAE-세파로즈 크로마토그래피에 의해 특징지워질 수 있다. 이러한 분리 방법은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다.

단계 4:

조성물의 항염증 활성은 항염증 활성을 측정하는 임의의 생물검사법에 의해 시험될 수 있다. 몇몇 예로는 백혈구 이동의 억제, 쥐의 발 부종 시험, 보조약 유도성 관절염, 콜라겐 유도성 관절염 및 생존 중의 현미경 검사 등이 포함된다. 알의 항염증성 조성물과 아스피린 및 인도메타신과 같은 공지된 항염증 약제의 비교가 또한 수행될 수 있다. 마지막으로, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염 및 상해 유도성 관절염에 대한 임상 시험이 항염증 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.

고순도의 알의 항염증성 조성물의 항염증 작용은 생물검사법에 의해 측정된다. 바람직한 생물검사법은 문헌[Vinegar 등, "Some Quantitative Characteristics of Carrageenan Induced Pleurisy in the Rat", Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 143: 711-714 (1973); Ammendola, G. 등, "Leukocyte Migration and Lysozomal Enzymes Release in Rat Carrageenan Pleurisy", Agents and Actions 5: 250-255 (1975); Vinegar, R. 등, "Quantitative Studies of the Pathway to Acute Carrageenan Inflammation", Fed. Proc. 35: 2447-2456 (1976)]에 기재된 흉부 백혈구 이동 억제 분석법이다 (실시예 7, 7a, 7b, 7c 및 9, 도 3, 5 및 6 참조).

백혈구 이동 억제 분석법은 일반적으로 하기와 같이 수행된다.

항염증성 조성물을 함유하는 시료를 1% 카라기난 용액으로 인위적으로 염증을 일으킨 성인 암컷 쥐에 투여한 후, 각 투여량에서 시료의 항염증 효과를 치료되는 쥐의 흉부 삼출물에서 백혈구 수가 대조구 쥐에서 보다 감소하는 것에 의해 측정한다 (자동 화상 분석법을 사용).

별법으로, 실질적으로 순수한 항염증성 조성물의 항염증 작용을 쥐의 풋패드(footpad)에 카라기난을 주입함으로써 유발된 부종에 대해 시험할 수 있다 (Winter, C.A., Risley, G.A., Nuss, A.W., "Carrageenan-Induced Edema in the Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-Inflammatory Drugs." Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 3: 544 (1967)).

다양한 다른 시험을 사용할 수 있다 (Wetnick, A.S. and Sabin, C. "The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis and Experimental Allergic Encephalomyelitis in Rats." Jap. J. Pharm. 22: 741 (1972) 참조).

치료를 위한 투여 대상에의 투여

본 발명은 또한 알, 알 생성물 및(또는) 본 발명의 항염증성 조성물을 투여 대상에 투여하는 것을 포함하는, 투여 대상에서 염증의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 항염증성 조성물은 항염증 활성을 제공하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 비경구적, 피하적, 정맥내, 근육내, 복막내, 비강내 또는 경구적일 수 있다.

경구 투여는 바람직하게는 캡슐, 정제, 알약, 분말 및 과립 등을 포함하는 고체 제형을 통해 수행된다. 고형 제형에서, 항염증성 조성물은 1종 이상의 불활성 희석제, 예를 들어 수크로즈, 락토즈 또는 분말과 혼합된다. 이러한 제형은 또한 통상적으로 불활성 희석제 이외의 부가 물질도 함유할 수 있다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우에, 제형은 또한 완충제, pH 민감성 중합체, 또는 통상적으로 식품 및 약제 산업에서 캡슐화제 조성물로 사용되는 임의의 다른 서방형 캡슐화제를 포함할 수 있다. 정제 및 알약은 또한 장용 코팅을 사용하여 제조될 수 있다.

경구 투여를 위한 항염증성 조성물의 액상 제형에는 제약 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제를 포함하는, 제약학적으로 허용가능한 에멀젼제, 용액제, 현탁액제, 시럽제 및 엘릭시르제가 포함된다. 불활성 희석제 외에도, 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 및 감미제를 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 항염증성 조성물의 제제에는 멸균 수용액 또는 비수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼이 포함된다. 비수성 용매 또는 비히클의 예로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름 및 에틸올리에이트와 같은 주입 가능한 유기 에스테르가 있다.

활성 성분의 투여량은 변화될 수 있으나, 활성 성분의 양은 적절한 제형이 얻어지는 것이어야 한다. 선택된 제형은 바람직한 치료 효과, 투여 경로 및 치료 기간에 의존한다는 것이 인지되야 할 것이다.

항염증성 조성물을 함유하는 알 그자체가 식품 생성물에 혼입되어서 알 생성물을 형성하는 것이 바람직하다. 식품 생성물에 혼입될 알을 제조하는 하나의 바람직한 방법은 알을 알 분말로 건조시키는 것이다. 알을 건조시키기 위한 다양한 방법이 알려져 있으나, 분무 건조법이 바람직한 방법이다. 140 ℉ (60℃) 이하의 온도가 바람직하게 사용된다. 시료는 바람직한 임의의 견고성을 갖는 최종 생성물을 얻기 위하여 건조 과정 동안 수분 함유에 대해 모니터링된다. 건조된 알 분말은 드링크제, 단백질 보충제 및 임의의 다른 영양제, 스포츠 관련 생산품에 사용될 수 있다. 또한, 알 분말은 베이크 혼합물, 분말 바, 캔디, 쿠키 등에 사용될 수 있다. 알의 가공법의 다른 예로는 오믈렛 만들기, 알을 부드럽게 또는 단단하게 삶기, 알 굽기가 포함되며, 또는 원한다면, 알을 날로 먹을 수 있다.

투여량 및 투여 횟수는, 부작용의 가능성을 고려하여, 환자의 연령 및 일반적인 건강 상태에 의존할 것이다. 투여는 또한 다른 약제를 사용한 동시 치료 및 투여 약제에 대한 환자의 내성에 의존할 것이다.

이온 교환 단계 후의 제제의 바람직한 보관 방식은 동결건조 분말이다. 제1 정제 단계에서 수거된 여과물을 사용할 때까지 냉장 보관할 수 있다. 정제로부터 생성된 항염증성 조성물의 활성은 상기된 쥐의 흉부 백혈구 이동 시험법을 사용하여 측정된다.

알, 알 생성물 및(또는) 본 발명의 항염증성 조성물의 투여에 의해 치료될 수 있는 염증 질환에는 급성 및 아급성 활액낭염, 급성 비특이적 건염, 전신적 홍반성 낭창, 전신적 피부근염, 급성 류마티스성 심장염, 천포창, 수포성 피부염, 포진, 심각한 홍반, 다중형 박락성 피부염, 경변, 계절 다년성 비염, 기관지 천식, 전위성 피부염, 혈청병, 각막염, 홍채염, 산재성 요도염, 성대염, 시신경염, 교감성 안염, 증후성 사르코이도증, 뢰플러 증후군, 베릴륨 중독, 용혈성 빈혈증, 유방염, 유양돌기염, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 급성 통풍성 관절염, 대상포진, 류마티스성 관절염, 골관절염, 임의의 다른 퇴행성 관절염, 및 임의의 다른 관련 자가면역 질병이 포함된다. 또한, 단리되고 정제된 알 생성물은 알레르간과 같은 잠재성 염증 유발제에 노출되는 개체를 치료하는데 사용될 수 있다.

유효량:

투여 대상에 고도 면역화된 알 또는 알 생성물을 투여하는 것에 있어서, 하기 실시예에 상세화되어 있으며, 투여 대상에 제공되는 고도 면역화된 알 또는 알 생성물의 바람직한 투여 범위는 투여 대상 체중의 ㎏ 당 1 내지 40 g으로 측정되었다.

고도로 정제된 항염증성 조성물 자체에 대해서, 고도 면역화된 알의 알 전체, 난황 및 난백으로부터 정제되고 단리된, 고도로 정제된 조성물의 바람직한 투여 범위는 항염증성 조성물 1㎎ 내지 40 ㎎으로 측정되었다.

항염증성 인자:

항염증성 조성물이 단리되고 정제된 후, 활성 분획물은 더욱 특이적이고 활성인 항염증 화합물의 특징들을 결정하기 위하여 구조 및 활성 모두에 대해 추가로 정제되고 검진될 수 있다. 특히, 고압 액상 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 항염증 활성을 보이는 단일 초순도의 피크를 확인하였다. 이 단일 초순도의 피크는 기초적 화학 구조를 갖는 단일 화합물을 나타낸다고 믿어진다. 이 화합물은 알의 "항염증성 인자"로 표시되었다.

지금까지 본 발명을 일반적으로 기술하였고, 더 나아가서 상기한 것을 특정 실시예로 기재할 것이고, 이는 다른 언급이 없는한 단지 예시의 목적으로 제공되는 것일뿐 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

실시예 1

S-100 백신의 제조

미국 특허 제5215746호에 개시되어 있고, 표 1에 기재된 세균(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 얻음)을 포함하는, "시리즈 100" 또는 "S-100"으로 공지된 다가 백신을 배지 15 ㎖에서 재구성하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 양호한 증식을 얻은 후, 세균 현탁액의 거의 절반을 액체 배지 1 ℓ에 접종한 후 37℃에서 인큐베이션하였다. 잔류 현탁액을 멸균 글리콜 튜브로 옮겨서 6개월 동안 -20℃에서 보관하였다.

양호한 증식이 배양물에서 가시화된 후, 세균을 원심분리하여 수확하였다. 세균 펠릿을 멸균 염수용액에 재현탁시키고, 세균 시료를 3회 원심분리하여 세포를 세척하였다. 3회 세척한 후, 얻은 펠릿을 소량의 2차 증류수에 재현탁시켰다.

배지가 제거된 세균 현탁액을 유리 플라스크에 넣고 80℃의 수조 중에서 밤새 놓아 두어서 가열 살생하였다. 액체 배양물의 생존도를 소량의 가열 살생된 세균에 대해 시험하였다. 세균이 백신에 사용되기 위하여 살생되야 하므로, 가열 살생된 세균으로 액체 배지를 접종하고, 37℃에서 5일 동안 인큐베이션하고, 1일 증식을 확인하였다.

가열 살생된 세균을 건조될 때까지 동결건조시켰다. 이어서, 건조 세균을 멸균 염수용액과 혼합하여 2.2×10⁸세균 세포/염수 ㎖의 농도가 되게 하였다 (660 nm에서 판독시 1.0 광학 밀도).

S-100 백신에서의 항원

명칭	배지	명칭	배지
스태필로코커스 시뮬란스(Staphylococcus simulans)	BH1	슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)	BH1
스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)	BH1	크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae)	BH1
스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes),A 유형 1	APT	살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)	BH1
스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes),A 유형 3	APT	헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)	BH1
스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes),A 유형 5	APT	스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis)	APT
스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes),A 유형 8	APT	프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)	BH1
스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes),A 유형 12	APT	시겔라 디센테리아(Shigella dysenteriae)	BH1
스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes),A 유형 14	APT	디플로코커스 뉴모니에(Diplococcus pneumoniae)	APT
스트렙토코커스 피오제네스 (Streptococcus pyogenes),A 유형 18	APT	프로피오니박터 아크네(Propionibacter acnes)	액체배지
스트렙토코커스 피오제네스 (Streptococcus pyogenes),A 유형 22	APT	스트렙토코커스 산구이스(Streptococcus sanguis)	APT
에로박터 에로게네스(Aerobacter aerogenes)	BH1	스트렙토코커스 살리바루스(Streptococcus salivarus)	APT
에쉐리키아 콜리(Escherichia coli)	BH1	스트렙토코커스 뮤턴츠(Streptococcus mutants)	BH1
살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)	BH1	스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae)	APT

실시예 2

고도 면역화된 알의 항염증 효과

본 실시예는 실시예 1에 기재된, 고도 면역화된 알을 함유하는 음식을 섭취하는 개에서 카라기난 유도성 피부 부종에 대한 고도 면역화된 알의 항염증 효과를 나타내고 있다. 결과는 고도 면역화된 알이 염증을 감소시키는 것으로 입증되었다. 이 시험에서 염증에 대한 효과는 10 ㎎/㎏, ED₅₀투여량의 비스테로이드계 항염증 약제 이부프로펜에서 얻은 결과와 비교할만 하다.

20마리의 화이트 이글 비글(각 5마리인 4개의 군)에게 시판되는 새끼양 고기 및 쌀로 만든 개밥 350 g을 기본 식사로 공급하였다. 표 2에 기재된 바와 같이, 5마리의 2개의 군 (군 1 및 2)은 약 100일간의 조절 기간 동안 기본 식사만을 받았다. 또한, 군 2의 개는 카라기난을 사용한 염증성 항원투여 전에, 비스테로이드계 항염증 약제, 이부프로펜을 사용하여 치료하였다. 동일한 기간 동안, 나머지 2개의 군 (3 및 4)에게는 고도 면역화된 알 (HIE)를 기본 식사와 같이 공급하였다. 기본 식사 외에, 군 3은 고도 면역화된 알 3.5 g을 받은 반면, 군 4는 고도 면역화된 알 35 g을 받았다. 식이 요법의 종말점에서, 개에게 2% 카라기난을 피부내로 항원투여하여서, 염증 반응을 유발하였다.

항원투여 과정은 다음과 같다. 각 군에서 개 1마리를 항원투여를 위해 무작위로 선발하여 각각 시험하였다. 이 과정을 모든 군으로부터의 모든 개가 시험될 때까지 5일 동안 매일 반복하였다. 항원투여하기 15분 전에, 군 2로부터의 개에게 이부프로펜 10 ㎎/㎏을 경구적으로 공급하였다. 모든 개들을 정맥 주사로 마취시키고 좌측면을 면도하였다 (약 6×8 인치). 3개의 표시 중 2 줄을 면도 영역에 표시하고 1-6으로 숫자를 매겼다. 염수 0.1 ㎖을 표지 1에 음성 대조군로서 피부내 주입하였다. 표지 2-6에, 2% 카라기난 용액 0.1 ㎖을 피부내 주입하였다. 주입은 연구 기간 동안 동일한 사람에 의해 투여되었다. 상기 농도의 카라기난의 피부내 주입이 100%의 동물에서 측정가능한 종창을 일으키고 10 ㎎/㎏ 이부프로펜에 의해 감소될 수 있다는 것은 이미 측정되어 있다. 카라기난의 마지막 주입을 완결한 후, 마이크로미터를 사용하여 각 종창을 측정하였고, 그 수를 기록하였다. 마취된 쥐를 회복시키고, 6시간 후에 반복 측정하고 기록하였다. 염증 반응의 평균 크기를 각 군에 대해 측정하였다.

군	치료	군 당 동물의 수	평균 염증 반응	대조군와의 평균차	유의성p 값
1	기본 식사	5	4.41	-	-
2	이부프로펜 (10 ㎎/㎏) + 기본 식사	5	2.25	2.2	p〈0.01
3	HIE 알 3.5 g + 기본 식사	5	2.8	1.6	p〈0.05
4	HIE 알 35 g + 기본 식사	5	2.38	2.0	p〈0.05

이 결과는 고도 면역화된 알 (기본 식사에 3.5 g 추가 및 기본 식사에 35 g 추가)이 공급된 동물에서 종창의 유의적 감소를 보였고, 이는 고도 면역화된 알이 경구적으로 공급되는 경우 염증에 대한 예방 효과를 의미한다. 더욱이 이 결과는 고도 면역화된 알의 항염증 활성이 항염증 약제 이부프로펜에서 나타나는 효과와 필적할만했음을 보이고 있다. p〈 0.05 수준의 유의성의 차이는 치료된 군과 대조군 간에 나타났다.

실시예 3

고도 면역화된 조류 알로부터 30,000 달톤 미만의 알의 항염증성 조성물의 단리

단계 1: 알로부터 수용성 여과물의 제조

액상 난황, 액상 난백 및 분말 난황을 처리하여서 수용성 분획물을 얻었다. 액상 난황을 본 실시예에 기재된 바와 같이 리(Lee)의 문헌(미국 특허 제5367054호)에 개시된 카프릴산 상분리법 (CAPS)를 사용하여 탈지시켰다. 액상 난백을 본 실시예에 기재된 특정 시간 동안 가열하였다. 난황 분말을 본 실시예에 기재된 바와 같이, 2상 용매, 초임계 CO₂또는 효소를 사용하여 탈지시켰다.

단계 2: 수용성 분획물의 한외여과

수용성 분획물을 나선형으로 권취된 30K MWCO 한외여과막을 구비한 아미콘 DC10L 한외여과계에서 농축하였다. 한외여과 카트리지는 10 ft²(9.29㎝²)면적의 막을 갖고, 10.4 ℓ/분의 재순환 유속 및 2.3 ℓ/분의 환류 유속으로 거의 40 psi(2.72 atm)의 주입구압력 및 33psi(2.25 atm)의 출구압력 (7 psi (0.48 atm) 트랜스막 압력)으로 가동되었다.

단계 3: 이온 교환 크로마토그래피

수용성 분획물의 DC10L 한외여과로부터의 여과물을 추가로 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 처리하였다. 이 과정에서, DEAE-세파로즈 패스트 플로우 겔 (파르마시아사)를 사용하여 3×15 ㎝ 유리 칼럼에 충전시키고, 멸균 2차 증류수 (pH 7.0)으로 균등화시켰다.

0.2 미크론 필터를 통해 예비여과한 여과물 (30,000 달톤 미만) 500 ㎖을 분당 10 ㎖의 유속으로 멸균 2차 증류수 (pH 7.0) 500 ㎖로 세척된 칼럼에 가하였다. 알의 항염증성 조성물을 함유하는 것으로 여겨지는 결합 분획물을 0.15 M NH₄OAc 250 ㎖로 용출시켰다. 분획물을 수거하고, LKB 유비코드 2138 모니터에서 280 nm에서 모니터링하였고, 광학밀도는 연결된 기록기에서 출력되었다. 내독소가 없는 실질적으로 순수한 알의 항염증성 조성물의 용출 프로파일은 도 1에 도시되어 있다. 알의 항염증성 조성물 분획물을 추가의 과정을 위해 동결건조시켰다.

액상 난황 및 난백으로부터 30,000 달톤 미만의 알의 항염증성 조성물의 제조

고도 면역 난황 2 ℓ를 리(Lee)의 문헌(미국 특허 제5367054호)에 개시된 카프릴산 상분리법 (CAPS)에 의해 탈지시켰다. 다시 말해, S-100 난황을 0.02M 아세테이트 중 1% 카프릴산 및 0.06M 염화나트륨 (pH 5.0)의 완충 용액에서 15배 희석하였다. 수상을 여과에 의해 응집된 상으로부터 분리하고, 0.5M NaOH로 pH 7.0으로 조절하였다. 수상을 보유액 2 ℓ가 남을 때까지 한외여과하였다. 한외여과물을 DEAE 세파로즈 칼럼에 가하였다. DEAE 칼럼 크로마토그래피한 후 난황 2 ℓ로부터 난황 항염증성 조성물 46.6 g을 얻었다 (도 4 참조).

고도 면역 난백 1 ℓ를 탈이온수 3 ℓ로 희석하였다. 혼합물을 90℃로 1시간 동안 가열하고, 냉각하고, 원심분리하였다. 상등액을 40 미크론 여과지를 통해 여과하고, 보유액 약 64 ㎖을 얻을 때 까지 한외여과하였다. 한외여과물 500 ㎖를 DEAE 세파로즈 칼럼에 가하였다. 난백 1 ℓ로부터 항염증성 조성물 4.4 g을 DEAE 세파로즈 칼럼 크로마토그래피한 후 얻었다 (도 5 참조).

난황 분말로부터 30,000 달톤 미만의 알의 항염증성 조성물의 제조

이 방법은 난황 분말을 탈지시킨 후, 알의 항염증성 조성물을 탈지된 분말 난황으로부터 단리하는데 사용하였다.

방법 1: 2상 용매 추출법

고도 면역화된 난황 분말을 무수 에탄올 및 헥산으로 구성된 혼합물과 혼합하여서 난황으로부터 지질을 제거한 후, 항염증성 조성물 분획물의 수성 분리를 하였다. 요약하여, 고도 면역화된 난황 분말 400 g을 2상 용매 (25% 무수 에탄올-75% 헥산 또는 25% 이소프로판올-75% 헥산) 2ℓ와 혼합하였다. 용매 상등액을 제거하고, 2개의 추가의 용매 추출을 총 3회의 지질 추출에 대해 수행하였다. 최종 추출 혼합물을 최종 분리를 위해 원심분리하였다. 탈지된 난황 물질을 건조시키고, 4000 ㎖의 탈이온수와 혼합하고, 0.5M NaOH를 사용하여 pH를 7로 조절하였다. 이어서 아미콘 DC10L 한외여과계에서 농축하여 500 ㎖이 되게 하였다.

한외여과물(30,000 달톤 미만)에서 알의 항염증성 조성물을 DEAE-세파로즈 크로마토그래피에 의해 추가로 단리하고, 알의 항염증성 조성물 분획물을 추가의 공정을 위해 동결건조시켰다. DEAE-세파로즈 크로마토그래피한 후, 항염증성 조성물 0.45 g을 한외여과물으로부터 회수하고, 활성에 대해 시험하였다 (도 3).

방법 2: 초임계 CO₂추출법

건조 고도 면역화된 난황 분말을 초임계 조건 하에 놓고 난황으로부터 지질 부분을 제거한 후, 알의 항염증성 조성물 분획물의 수성 분리를 하였다. 요약하여, 건조 면역 난황 분말 약 400 g을 오토클레이브 엔지니어스 (등록상표) SCE 유닛에 넣고, 약 5400 psi(367.4 atm), 32.2℃에서 20시간 동안 일정 CO₂추출시켰다. 부분적으로 탈지된 난황을 탈이온수 400 ㎖로 균질화시키고, 10,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 수성 상등액을 분리시킨 후, 아미콘 DC10L 한외여과계에서 500 ㎖로 농축시켰다. 투과물 (30,000 달톤 미만)에서의 알의 항염증성 조성물을 추가로 DEAE-세파로즈 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 단리하였다.

알의 항염증성 조성물 분획물을 추가의 공정을 위하여 동결건조시키고, 알의 항염증성 조성물 1.86 g을 DEAE 크로마토그래피한 후 한외여과물으로부터 얻었다. 도 6은 초임계 CO₂추출법, 한외여과법 및 DEAE 크로마토그래피에 의해 탈지시킨 후 실질적으로 순수한 조성물의 생물검사 활성을 도시하고 있다.

단계 3: 효소 처리 추출법

고도 면역 난황 분말을 락테이트 완충액 중 뉴라제(Newlase) F로 구성된 혼합물과 인큐베이션하여서 난황으로부터 지질을 분리시킨 후, 항염증성 조성물 분획물을 수성 분리하였다. 요약하여, 건조 S-100 난황 분말 300 g을 0.05M 락테이트 완충액 (pH 4.0) 6 ℓ 및 뉴라제 F (시그마사 #P-5027) 27 g과 혼합하고, 균질화하였다. 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 바닥 수성상을 여과하였다. 생성된 수성상을 0.5M NaOH로 중화시킨 후, 아미콘 DC10L (30K MWCO)에서 투과물 3 ℓ를 회수할 때까지 농축하였다. 투과물 276 ㎖를 DEAE 세파로즈 칼럼에 가하였다. DEAE 크로마토그래피한 후, 30,000 분자량의 투과물을 항염증 활성에 대해 분석하였다.

30,000 달톤 미만의 알의 항염증성 조성물 단리물의 발열원 제거 및 내독소 함량 분석

발열원 제거

알의 항염증성 조성물 단리물에서 발열원을 제거하여서 항염증성 조성물 활성을 모방하는 내독소를 제거한다. 요약하여, 알의 항염증 분말 60 ㎎을 멸균 생리적 염액 15 ㎖에 용해시켰다. 혼합물을 3K MWCO 센트리플러스 콘센트레이터 (아미콘사)에서 초원심분리하여 발열원을 제거하였다. 센트리플러스 콘센트레이터는 층류 하에 무균 기술을 사용하는 Pyro CLEAN (AlerCHECK, Inc.)를 사용하여 미리 발열원을 제거하였다. 내독소는 또한 당업자에 의해 사용될 수 있는 표준 방법에 의해 제거될 수 있고, 분자량 분리법에 기초할 필요는 없다.

분석법

확인하기 위하여, 발열원이 제거된 알의 항염증성 조성물을 종양 괴사 인자 (TNF) 효소결합 면역결정법 (ELISA)에 의해 내독소 함량을 분석하였다. 요약하여, 생리적 염수로 희석된 알의 항염증성 조성물의 분취액을 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (RPMI) 배지에서 대식 세포 증식된 J774를 함유하는 플레이트에 가하였다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, 상등액을 단일클론 항-TNF 항체로 코팅되고 인산염 완충염액(PBS) 중 2% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단된 플레이트에 가하였다. 실온에서 플레이트를 밤새 인큐베이션한 후, 비오티닐화 항체 및 스트렙타비딘 퍼옥시다제를 가하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) 기질을 착색화를 위해 플레이트에 가하였다. 플레이트 웰의 함유물의 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 알의 항염증 시료 중 TNF 농도를 표준 곡선으로부터 외삽하여 측정하였다. 알의 항염증성 조성물의 TNF 함유물을 발열원 제거가 거의 끝난 후 단리하였다 (표 3 참조).

TNF 분석법에 의한 알의 항염증성 조성물의 분획물의 내독소 함량
분획물	pg/㎖
S100 난황 항염증성 조성물	98.08a
S100 난백 항염증성 조성물	42.00a
고도 면역화되지 않은 난황 항염증성 조성물	66.43a
고도 면역화되지 않은 난백 항염증성 조성물	52.90a
헥산:에탄올 추출된 건조 난황 항염증성 조성물	92.70b
초임계 CO2추출된 난황 항염증성 조성물	〈18b
a배지가 46.5 pg TNF/㎖만을 지님b배지가 TNF를 지니지 않음

30,000 달톤 미만의 내독소가 없는 항염증성 조성물의 백혈구 이동에 대한 효과

실질적으로 순수한 30,000 달톤 미만의 알의 항염증성 조성물의 각 투여량에서의 효과를 실질적으로 순수한 알의 항염증성 조성물로 치료된 쥐의 흉막 삼출액 중 백혈구 수가 대조군 쥐에서의 수와 비교하여 감소됨에 의해 측정하였다 (표 4, 도 2 참조). 도 2 및 표 4는 실질적으로 순수한 고도 면역화된 난황 및 난백 분획물의 효과를 정상적인 테이블의 알로부터 얻어진 것과 비교하였다. 실질적으로 순수한 고도 면역 항염증성 조성물의 모든 투여량은 흉부 삼출액으로 이동하는 백혈구수를 감소시켰다. 가장 큰 효과는 난황으로부터 실질적으로 순수한 조성물 2 ㎎이 제공된 투여 대상에서 관찰되었다.

상이한 알의 항염증성 조성물 투여량에서 흉부 삼출물로의 백혈구 이동의 억제

	억제도 (%)
알의 항염증성 조성물	난황의 항염증성 조성물	난백의 항염증성 조성물
투여량㎎/쥐	S100고도 면역화됨	고도 면역화되지 않음	S100고도 면역화됨	고도 면역화되지 않음
0.5	45.64	18.49	22.0	8.22
1.0	59.50	17.12	18.0	16.90
2.0	67.20	18.72	54.4	28.31
4.0	61.50	26.94	46.7	23.74
8.0	61.00	29.68	54.9	37.44

알의 항염증성 조성물의 특성화

상기된 방법으로 제조된 실질적으로 순수한 알의 항염증성 조성물의 분자량은 30,000 달톤 미만인 것으로 밝혀졌다. 이는 난황 및 난백으로부터 조성물의 단리의 첫단계에서 30,000 달톤 미만의 분자량 종을 통과시키지 않는 막을 사용하는 한외여과에 의해 추론되었다.

조성물은 일반적인 조건 하에서 음전하를 갖고, 이 겔의 pKa 값은 9.5이다. 이는 알의 한외여과물을 DEAE 세파로즈 이온 교환 칼럼에 가하여 측정하였다. 항염증성 조성물은 물을 사용하는 경우 칼럼으로부터 용출되지 않았다. 용출 매체를 NH₄OAc 용액 또는 임의의 염 용액 또는 pH가 9.5를 초과하는 완충액으로 변경하는 경우 알의 항염증성 조성물이 용출되었다. 한외여과물을 DEAE 칼럼에 가하는 경우, 다양한 단백질 및 염이 비결합 분획물을 이루었다 (피크 1, 도 1). 칼럼을 NH₄OAc 용액 (피크 2) 그리고 NaCl 용액 (피크 3)로 세척하는 경우 피크를 기록하였다. 피크 2로부터 단리된 분획물은 쥐의 분석법에서 항염증 활성을 보였다. 3번째 피크는 거의 활성을 보이지 않았다. 난백 항염증성 조성물은 90℃에서 1시간 동안 열 안정적이었다.

더욱이, 알의 항염증성 조성물은 난황 및 난백에서 단리될 수 있다. 난황으로부터의 알의 항염증성 조성물은 난백으로부터의 알의 항염증성 조성물 보다 높은 활성을 보였다 (도 2, 표 4).

실시예 4

알로부터 고도로 정제된 항염증성 조성물 제조의 바람직한 방법

하기 실시예는 조류의 알로부터 항염증성 조성물을 고순도의 저분자량의 비응집 형태로 얻기 위한 (큰 규모의 정제에 적절한) 방법을 기재하고 있다. 알 전체, 고도 면역화된 알 및 대조군 테이블 알을 부수고, 난백을 난황으로부터 분리하고, 모두를 분무 건조시켰다. 고도 면역화된 알을 실시예 1에 기재된 바와 같이 얻었다. 난백 분말을 별도로 처리하여 한외여과를 위한 수성 분획물을 얻었다.

모든 정제 단계를 수행하여 세균 또는 발열원에 의한 가능한 오염을 최소화하였다. 멸균수를 사용하여 용액을 제조하고, 모든 유리기구는 발열원을 제거하였다. 또한, 용액을 멸균 여과하였다.

실시예 4a

난황 분말로부터 알의 항염증성 조성물의 제조

용매 추출법

건조된 난황을 프로판 또는 부탄을 사용하여 액체 용매 추출시켜서 항염증성 조성물을 함유하는 수성 난황 분획물로부터 지질을 분리시켰다. 요약하여, 건조 난황 분말 500 g을 칼럼에 놓고, 여기에 액체 프로판 용매 4 ℓ를 가하였다. 용매 상등액 및 추출된 지질을 제거하였다. 추가의 6회의 용매 추출법을 총 6회 지질 추출법에 사용하였다.

한외여과법

건조 탈지된 난황 400 g을 멸균 증류수 4 ℓ로 희석하고, 비리티스 (전단기)를 사용하여 균질화하였다. 난황 혼합물을 24 RPM에서 원심분리하거나 또는 용해되지 않은 난황 입자가 침전될 때까지 냉장되도록 방치시켰다. 생성된 수성 분획물을 3,000 분자량으로 제한하는 나선 권취형막이 구비된 아미콘 RA1000 한외여과계를 사용하여 한외여과시켰다. 펌프 속도는 20 psi (1.36 atm)의 주입구압력 및 15 psi (1.02 atm)의 출구압력으로 유지되었다. 3,000 미만의 분자량 투과물을 0.45 ㎛ 멸균 1회용 날겐 필터를 사용하여 멸균 여과하고, 보관, 생물검사법 또는 추가의 정제를 위해 동결건조 또는 동결시켰다. 도 8은 정제 공정의 공정도를 도시하고 있다.

난황으로부터 3,000 달톤 미만의 분자량종은 저분자량의 비응집된 형태의 항염증성 조성물을 함유하였다. 출발 물질 400 g으로부터의 항염증성 조성물의 수율은 약 12 g 또는 총량 중 3%였다. 이 3K 분획물의 항염증 활성에 대한 생물검사법은 높은 수준의 활성을 보여주었다 (실시예 6a).

실시예 4b

난백 분말로부터 알의 항염증성 조성물의 제조

실시예 1에 기재된 바대로 고도 면역화된 알 및 대조군 테이블의 알 모두에서 단리된 난백 4 g을 탈이온수 4 ℓ로 희석하였다. 혼합물을 균질화하고, 40 ㎍ 필터로 여과하고, 3K MWCO 한외여과계를 통해 한외여과하였다 (도 9). 난백 분말 400 g으로부터, 항염증성 조성물 8.6 g 또는 21.5%를 수거하였다. 이 물질은 상해 유도 부위로의 쥐의 백혈구 이동을 억제시키는 생물검사 활성을 보였다 (실시예 6a).

본 실시예는 고도 면역화된 알 및 대조군 테이블의 알 모두에서의 난백 물질로부터 활성 항염증성 조성물의 제조를 보였다.

실시예 5

DEAE 이온 교환 크로마토그래피

알의 항염증성 조성물은 또한 이온 교환 DEAE 크로마토그래피에 의해 더욱 특징지워졌다. 본 실시예는 항염증성 조성물이 중성 pH에서 음성적으로 대전되는 것을 입증하였다.

난백 및 난황 물질 모두로부터의 10K 한외여과물을 10,000 분자량 막을 3000분자량 막 대신 사용한 점을 제외하고는 실시예 4a에 기재된 방법과 동일한 방법으로 얻었다.

DEAE 포로스 50 칼럼 (10/50 mm)를 멸균 2차 증류되고 발열원이 제거된 물 (시그마사), pH 7.0으로 균등화하였다. 멸균되고 발열원이 없는 2차 증류수 100 ㎖ 중에 용해된 한외여과물 (10,000 분자량 미만) 10 ㎎을 BioCad 700 상의 DEAE 포로스 칼럼 (바이오시스템)에 가하였다. 10 ㎖/분의 유속으로 물질을 칼럼에 가하였다. 칼럼에 결합되지 않는 물질의 초기 용출물은 증류수로 제거하고 수거하였다. 아세트산암모늄의 선형 구배 (0%-100%)를 사용하여 칼럼에 결합된 물질을 용출시키고 280 nm 및 254 nm에서 UV 흡광으로 분획물을 모니터링하고, 10 ㎖의 분획물을 아반텍 분획물 수집기에 의해 수거하였다. 0.15M NaCl를 사용하여 칼럼에 결합된 잔류 물질을 제거하였다. 칼럼을 280 nm 및 254 nm 흡광도가 기저부로 돌아올 때 까지 물로 희석하였다.

도 10은 통상적인 크로마토그램을 도시하고 있다. 화살표는 활성 항염증 분획물 (피크 2)를 나타낸다. NH₄아세테이트를 사용한 통상의 용출 프로파일은 화살표 방향에 의해 표시되는 용출 완충액의 변경에 의해 나타내고 있다. 용출물은 0.45 ㎛ 멸균 필터를 사용하여 멸균 여과하고, 동결건조로 건조시키고 칭량하였다. 각 피크의 생물검사법은 활성을 갖는 피크가 피크 2에서 발견됨을 나타냈다 (실시예 6b). DEAE 이온 교환 크로마토그래피에 의해 단리된 분획물은 항염증성 조성물이 음성적으로 대전되는 것을 입증하였다.

실시예 6

항염증 활성 분석

테이블 알 및 고도 면역화된 알로부터의 난황 및 난백의 실질적으로 순수한 분획물의 결합 시험은 항염증 활성에 대해 분석하였다. 이 시험 분석은 쥐의 흉부강에서 소정맥으로부터 유도된 상해 부위로 백혈구 이동의 억제를 측정하였다.

120 내지 150 g의 암컷 쥐 (챨스 리버, 매사츄세츠주산)의 흉부강에 생리적 염수 중 1% 카라기난 (상해제) 2 ㎖을 주입하였다. 이어서, 쥐에 생리적 염수 중 각 시험 분획물의 투여량 0.5 ㎖을 선별된 농도로 복막내 투여하였다. 2마리의 쥐에 각 농도를 주입하였다. 염수 주입을 대조군로 사용하였다. 주입한지 4시간 후, 동물을 동물 복지 조항에 따른 방법을 사용하여 희생시켰다. 흉부 삼출물을 제거하고, 백혈구를 측정하기 위해 고정시켰다. 삼출물 50 ㎕를 상응하는 표지된 슬라이드와 시토스핀 상에 로딩하였다. 시토스핀 사이클을 종결한 후, 슬라이드를 시토프렙 고정액 (피셔 사이언티픽 코포레이션, 아틀란타 소재)으로 분무하고, 헤마톡실린으로 염색하였다. 각 슬라이드의 5개의 대표적 부위를 평가하고, 백혈구 수를 바이오스캔 최적 화상 분석 프로그램을 사용하여 계수하였다. 5번의 계수 평균을 각 쥐에 대한 총 평균 백혈구 계수로 사용하였다. 대조군 염수 주입과 비교한 억제도를 각 시료 농도에 대해 계산하였다.

실시예 6a

난백, 난황, 고도 면역화된 알 및 테이블 알로부터의 항염증 활성의 비교

실시예 4에 기재된 바와 같이, 테이블 알 및 고도 면역화된 알로부터의 분무 건조되고 탈지된 난황 및 난백으로부터 정제된 분획물을 항염증 활성에 대해 시험하였다. 테이블 난백, 고도 면역화된 난황 및 고도 면역화된 난백으로부터 3,000 미만의 분자량 투과물을 실시예 4 및 5에 기재된 바와 같이 한외여과한 후 얻었다. 실시예 6에 기재된 바와 같이, 각 시료에 대해 2개의 동물에 염수, 시험 분획물 1 ㎎, 5 ㎎, 10 ㎎ 또는 20 ㎎을 복막내 주입하고, 평가하였다.

도 11은 고도 면역화된 닭으로부터 3,000 미만의 분자량의 고도로 정제된 난황 분획물이 1 ㎎/쥐의 투여량에서 백혈구 이동을 65% 억제함을 보였다. 이 고도 면역 난황 분획물은 또한 동일한 투여량에서 고도 면역 난백으로부터 얻은 분획물 (38%) 보다 높은 수준의 활성 (1 ㎎/쥐의 투여량에서 65% 억제)을 보였다. 대조군 난백은 더 낮은 항염증 활성 (1 ㎎/쥐의 투여량에서 25% 억제)을 보였다. 고도 면역화되지 않은 알 분획물도 항염증 활성을 지녔는데, 이는 모든 암탉이 백신화되고 환경 중 존재하는 미생물 및 알레르겐으로부터 자연 면역화되었기 때문이다. 그러나 놀랍게도 항염증성 조성물의 수준은 난황 및 난백 모두에서 고도 면역화에 의해 증가되었다. 알의 성분들이 일반적으로 지질이 풍부한 난황 또는 난백으로 나눠지기 때문에, 놀랍게도 항염증 활성은 난황 및 난백 모두에서 3,000 미만의 분자량 분획물에서 발견되었다.

본 실시예는 항염증성 조성물이 3,000 달톤 미만임을 보여주었고, 난황 및 난백에서 발견되고, 대조군 테이블 알보다는 고도 면역화된 알 분획물에서 더욱 높고 효과적인 양으로 발견되었다. 실제로, 고순도의 항염증성 조성물은 고도 면역화된 알에서 염증 치료에 효과적인 양으로 발견된다.

실시예 6b

음성적으로 대전된 DEAE 분획물의 백혈구 이동에 대한 효과

항염증 생물검사법 이후에, 음성적으로 대전된 DEAE 피크 2를 NH₄OAc로 용출시키고, 고도 면역 난황으로부터의 3K 및 10K 한외여과물의 활성을 시험하였다. 각 시료를 소정의 투여량에서 시험하였다.

도 12는 음성적으로 대전된 DEAE 분획물을 도시하고 있고, 고도 면역화된 닭으로부터의 알의 3K 및 10K 한외여과물은 염수 대조군과 비교하여 높은 수준의 항염증 활성을 보였다.

실시예 6c

항염증 약제와의 비교

항염증 약제, 인도메타신 및 아스피린을 생체 내에서 백혈구 이동의 억제에 대해 알의 3K 한외여과물과 비교하였다. 이 분석에서. 인도메타신, 아스피린 및 고도 면역화된 알로부터의 3K 알의 항염증성 조성물을 1000 ㎍, 100 ㎍, 10 ㎍, 1 ㎍의 투여량으로 복막내 주입하였다.

도 13은 3K 한외여과물 및 아스피린은 유사한 수준의 항염증 활성을 보이는 것을 도시하고 있다. 인도메타신에 의한 백혈구 이동의 억제 수준은 낮은 투여량 (1 내지 100 ㎍/쥐)에서는 감소하는 것으로 나타났다.

본 실시예는 알로 부터의 항염증 분획물이 공지된 항염증 약제와 비교하여 백혈구 이동 분석에서 효과를 갖는 것으로 나타났다.

실시예 7

역상 고압 액상 크로마토그래피 (HPLC)에 의한 항염증성 인자의 정제

실질적으로 순수한, 난황으로부터의 3K, 10K 미만의 DEAE 분획물 및 난백으로부터의 30K DEAE 분획물을 워터스 C8 대칭 역상 칼럼 (3.9 × 250 mm) 상에서 분리하였다. 10% 내지 80% 메탄올과 H₂O의 선형 구배를 717 플러스 자동 시료 채취기 및 996 광디오드 어레이 검출기를 구비한 워터스 모델 2010 HPLC 상에서 이동상으로서 사용하였다. 동결건조된 시료를 멸균 2차 증류수 100 내지 200 ㎖로 희석하였다. 칼럼을 분당 2 ㎖의 유속으로 용출시키고, 용출 디오드 어레이 자료를 200 내지 300 nm의 모든 파장에서 보관하였다.

도 14는 3K 투과물 분리의 MAX 플롯 크로마토그램을 도시하고 있다. 크로마토그램은 고도로 정제된 알의 항염증성 조성물을 초래하는 3K 분자량 미만의 2개의 주요 피크를 도시하고 있다. 도 15는 실시예 5에 개요된 바와 같이 DEAE 이온 교환 칼럼 상에서 분리된 10K 투과물로부터 조성물의 분리를 예시하고 있다. 3K 한외여과물 분획물에서 관찰된 바와 유사한 2개의 피크를 얻었다. 이 결과는 항염증 활성(실시예 7)을 보이는 2개의 분획물, 3K 미만 및 DEAE를 사용하여 고도로 정제되고 음성적으로 대전된 성분을 얻을 수 있음을 나타내고 있다.

3K 난황 분획물의 조성물 분석은 1 내지 2분에서 용출되는 초기 일련의 피크 및 10 내지 20분에서 용출되는 3개의 피크들의 존재를 나타내고 있다. 본 실시예는 항염증성 조성물이 3,000 미만의 분자량이고, 이 방법에 의해 비교적 순수한 피크로 분리될 수 있음을 보여주고 있다.

예비적 HPLC

한외여과후 다량의 항염증성 인자를 얻기 위한 바람직한 단계는 고도로 정제된 3,000 미만의 분자량의 조성물을 예비적 HPLC 칼럼 상에서 분리하는 것이다. 따라서, 5.08×20 ㎝컬럼을 조르박스(Zorbox) C8 충전 물질로 충전하고, 3,000 미만의 분자량의 한외여과물 4 g을 각각 러닝시키면서 정제하였다. 0.05% TFA를 함유하는 80/20의 H₂O/메탄올의 이동상을 사용하여 분당 90 ㎖의 유속으로 투과물을 고도로 정제된 조성물로 분리하고, 회수하고, 동결건조시켰다. 이어서, 회수된 피크를 분석용 C8 칼럼 상에서 재시험하였다. 상기된 방법으로, 다량의 고순도의 피크를 예비적 HPLC에 의해 얻고, 생물검사 활성, 기본 조성 및 화학적 구조에 대해 분석하였다. 질량 분광법, 기초 분석법, 적외선 분광법 및 핵자기 분광법 (NMR)은 인자의 구조를 결정하는데 사용되었다.

실시예 8

알로부터의 항염증성 조성물의 물리적 특성

본 실시예는 열에 대한 안정성, 산 및 염기에서의 변화, 프로테인아제 처리를 설명한다.

3,000 미만의 분자량의 한외여과물 4 ㎎을 멸균수에서 희석하고 100℃에서 30분 동안 처리하였다. 3K 미만의 한외여과물의 시료를 산성 HCl (pH 2.0), 중성 (pH 7.4) 또는 염기성 NaOH (pH 9.0)에 대해 중화하기 전에 30분 동안 처리하였다. 또한 3K 분획물을 프로테인아제 효소 1 유닛으로 1시간 동안 처리하였다. 모든 시료를 멸균 여과하고, 동결건조시키고, 칭량하고 생물학적 활성에 대해 시험하였다.

처리된 분획물 (고열, pH의 변화 및 프로테인아제 소화)의 생물검사 활성을 비처리된 대조군 및 염수 주입된 동물과 비교한 결과 상기 처리에 대한 놀라운 안정성을 보였다. 작은 크기 (3,000 미만의 분자량)외에, 고열, pH의 변화 및 프로테인아제 처리에 대한 안정성은 항염증성 조성물이 단백질이 아님을 암시하였다.

고순도의 항염증성 조성물이 하기의 특징을 갖는다는 것을 측정하였다. 이 조성물은 3,000 달톤 미만의 분자량을 갖는데, 이러한 특성은 단리 및 정제 방법이 3,000 달톤을 초과하는 분자종을 통과시키지 않는 한외여과막을 사용하는, 조성물의 단리 및 정제로부터 결론지어진다. 이 조성물은 비단백질계 및 비스테로이드계로 측정되는데 그 이유는 크기가 작고 단백질을 분해하는 효소에 의해 분해되지 않는다는 점 때문이다. 더욱이, 이 조성물은 경구로 투여가능하고, 소화 효소에 의해 분해되지 않는다. 조성물의 작고 안정한 형태(크기가 훨씬 큰 단백질과 차별화됨)는 소화 경로로부터 그의 흡수를 용이하게 한다.

이 조성물은 내산성 및 내염기성이고, pH 9.0의 조건 하에 처리한 후에도 활성 형태로 복귀한다. 또한, 이 조성물은 100℃에서 30분 동안 열안정적이고 중성 pH에서 음 전하를 갖는다.

알의 항염증성 조성물은 알 전체, 난황 및 난백으로부터 단리될 수 있다. 난황으로부터 단리된 항염증성 조성물은 난백으로부터 정제된 항염증성 조성물보다 높은 항염증 활성을 보였다.

정상 초과 수준의 항염증성 조성물은 고도 면역화된 알 전체, 고도 면역화된 난황 및 고도 면역화된 난백으로부터 단리될 수 있다.

Claims (40)

1. (1) 알을 낳는 동물에 의해 생성된 알의 난백 및 난황에 존재하고,

   (2) 100℃에서 30분 이상 동안 열 안정적이고,

   (3) 중성 pH에서 음이온성 전하를 갖고,

   (4) pH 4.0 내지 pH 9.0의 조건에서 내산성 및 내염기성이고,

   (5) 경구로 투여가능하고,

   (6) 3,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것에 의해 특징지워지는,

   고도로 정제된 형태의 항염증성 조성물.
2. 제1항의 항염증성 조성물의 유효량을 투여 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 투여 대상에서의 염증을 예방, 저지 또는 경감시키는 방법.
3. 제2항에 있어서, 항염증성 조성물의 유효량의 범위가 5㎎ 내지 300 ㎎인 방법.
4. 제1항의 조성물을 백혈구 이동을 억제시키기에 충분한 투여량으로 투여 대상에 투여하는 것을 포함하는, 투여 대상에서 백혈구 이동의 억제 방법.
5. (1) 알 전체, 난황 또는 난백으로부터 수용성 분획물을 단리하는 단계,

   (2) 수용성 분획물로부터 3,000 달톤 미만의 투과물을 분리하는 단계,

   (3) 생물학적으로 활성인 분획물을 회수하기 위하여 상기 3,000 달톤 미만의 투과물을 분별하는 단계를 포함하는,

   알을 낳는 동물의 알로부터 항염증성 조성물을 고도로 정제하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 분별 단계가 3,000 달톤 미만의 투과물의 역상 고압 액상 크로마토그래피를 추가로 포함하는 방법.
7. 제5항에 있어서, 단계 (1) 전에, 알 전체 또는 난황을 탈지시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
8. 제5항에 있어서, 상기 단계 (2)의 3,000 달톤 미만의 투과물을 동결건조시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
9. 제5항에 있어서, 분리 단계가 3,000 달톤의 분자량으로 제한하는 필터를 통해 수용성 분획물을 한외여과시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
10. 제5항에 있어서, 알을 낳는 동물을 고도 면역 상태로 유지시키는 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 고도 면역화된 상태가 항원적, 유전공학적 또는 생물공학적 백신에 의해 유도되는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 유전공학적 백신이 네이키드 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, DNA 발현 라이브러리, DNA-RNA 항원, DNA-단백질 컨쥬게이트 및 DNA 리포좀 컨쥬게이트의 단편 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 항원 코딩 DNA 작제물을 포함하는 것인 방법.
13. 제11항에 있어서, 항원적 백신이 세균, 바이러스, 원생동물, 진균 및 세포 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 항원을 포함하는 것인 방법.
14. (1) 알 전체, 난황 또는 난백으로부터 수용성 분획물을 단리하는 단계,

    (2) 수용성 분획물로부터 3,000 달톤 미만의 투과물을 분리하는 단계,

    (3) 생물학적으로 활성인 분획물을 수거하기 위하여 상기 3,000 달톤 미만의 투과물을 분별하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는,

    고도로 정제된 형태의 항염증성 조성물.
15. 제14항에 있어서, 알을 낳는 동물이 고도 면역화된 상태로 유지되는 것인 항염증성 조성물.
16. 제14항에 있어서, 고도 면역화된 상태가 항원적, 유전공학적 또는 생물공학적 백신에 의해 유도되는 것인 항염증성 조성물.
17. 제16항에 있어서, 유전공학적 백신이 네이키드 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, DNA 발현 라이브러리, DNA-RNA 항원, DNA-단백질 컨쥬게이트 및 DNA 리포좀 컨쥬게이트의 단편 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 항원 코딩 DNA 작제물을 포함하는 것인 항염증성 조성물.
18. 제16항에 있어서, 항원적 백신이 세균, 바이러스, 원생동물, 진균 및 세포 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 항원을 포함하는 것인 항염증성 조성물.
19. 제14항의 항염증성 조성물의 유효량을 투여 대상에 투여하는 것을 포함하는, 투여 대상에서 염증을 예방, 저지 또는 경감시키는 방법.
20. 제19항에 있어서, 항염증성 조성물의 유효량의 범위가 5㎎ 내지 300 ㎎인 방법.
21. 제14항의 알의 항염증성 조성물을 백혈구 이동을 억제시키기에 충분한 양으로 투여 대상에 투여하는 것을 포함하는, 투여 대상에서 백혈구 이동의 억제 방법.
22. 알을 낳는 동물을 고도 면역화시키는 것에 의해 제조된 항염증성 알 또는 알의 분획물.
23. 제22항에 있어서, 알을 낳는 동물이 항원적, 유전공학적 또는 생물공학적 백신에 의해 고도 면역화되는 항염증성 알 또는 알의 분획물.
24. 제23항에 있어서, 유전공학적 백신이 네이키드 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, 세균 DNA, DNA 발현 라이브러리, DNA-RNA 항원, DNA-단백질 컨쥬게이트 및 DNA 리포좀 컨쥬게이트의 단편 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 항원 코딩 DNA 작제물을 포함하는 것인 항염증성 알 또는 알의 분획물.
25. 제23항에 있어서, 항원적 백신이 세균, 바이러스, 원생동물, 진균 및 세포 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 항원을 포함하는 것인 항염증성 알 또는 알의 분획물.
26. 제22항에 있어서, 투여 대상의 염증을 치료하기에 유효한 정상 초과 수준으로 존재하는 항염증성 조성물을 1종 이상 함유하는 것인 항염증성 알 또는 알의 분획물.
27. 제26항에 있어서, 항염증성 조성물이

    (1) 항염증성 알의 난백 및 난황에 존재하고,

    (2) 100℃에서 30분 이상 동안 열 안정적이고,

    (3) 중성 pH에서 음이온성 전하를 갖고,

    (4) pH 4.0 내지 pH 9.0의 조건에서 내산성 및 내염기성이고,

    (5) 경구로 투여가능하고,

    (6) 3,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것에 의해 특징지워지는,

    항염증성 알 또는 알의 분획물.
28. 제26항에 있어서, 항염증성 조성물이

    (1) 알 전체, 난황 또는 난백으로부터 수용성 분획물을 단리하는 단계,

    (2) 수용성 분획물로부터 3,000 달톤 미만의 투과물을 분리하는 단계,

    (3) 생물학적으로 활성인 분획물을 수거하기 위하여 상기 3,000 달톤 미만의 투과물을 분별하는 단계

    를 포함하는 방법에 의해 항염증성 알 또는 알 생성물로부터 고도로 정제되는 것인 항염증성 알 또는 알의 분획물.
29. 제22항의 항염증성 알 또는 알 생성물의 유효량을 투여 대상에 투여하는 것을 포함하는, 소정 체중의 투여 대상에게서 염증을 예방, 저지 또는 경감시키는 방법.
30. 제29항에 있어서, 항염증성 알 또는 알 생성물의 유효량의 범위가 투여 대상의 체중의 ㎏ 당 1 내지 40 g인 것인 방법.
31. 제22항의 항염증성 알 또는 알 생성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 투여 대상에서 백혈구 이동의 억제 방법.
32. (1) 알을 낳는 동물에 의해 생성된 알로부터 수용성 분획물을 단리하는 단계,

    (2) 생물학적으로 활성인 투과물을 수거하기 위하여 수용성 분획물로부터 30,000 달톤 미만의 투과물을 분리하는 단계

    를 포함하는 방법에 의해 생성되는, 실질적으로 정제된 형태의 항염증성 조성물.
33. 제32항에 있어서, 30,000 달톤 미만의 여과물을 이온 교환 크로마토그래피하는 것을 추가로 포함하는 것인 항염증성 조성물.
34. 제33항에 있어서, 분리 단계가 30,000 달톤의 분자량으로 제한하는 필터를 통해 수용성 분획물을 한외여과시키는 것을 추가로 포함하는 것인 항염증성 조성물.
35. 제32항에 있어서, 상기 30,000 달톤 미만의 투과물로부터 내독소를 제거하는 것을 추가로 포함하는 것인 항염증성 조성물.
36. 제35항에 있어서, 알을 낳는 동물이 고도 면역화된 상태로 유지되는 것인 항염증성 조성물.
37. 제36항에 있어서, 알을 낳는 동물이 항원적, 유전공학적 또는 생물공학적 백신에 의해 고도 면역화되는 것인 항염증성 조성물.
38. 제37항에 있어서, 항원적 백신이 세균, 바이러스, 원생동물, 진균 및 세포 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 항원을 포함하는 것인 항염증성 조성물.
39. 제37항에 있어서, 유전공학적 백신이 네이키드 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, 세균 DNA, DNA 발현 라이브러리, DNA-RNA 항원, DNA-단백질 컨쥬게이트 및 DNA 리포좀 컨쥬게이트의 단편 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 항원 코딩 DNA 작제물을 포함하는 것인 항염증성 조성물.
40. 제32항에 있어서, 단계 (1) 전에 알을 탈지시키는 것을 추가로 포함하는 것인 항염증성 조성물.