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KR19990008197A - 면역화된 제노마우스 유래의 인체 항체 - Google Patents

면역화된 제노마우스 유래의 인체 항체 Download PDF

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Publication number
KR19990008197A
KR19990008197A KR1019970707722A KR19970707722A KR19990008197A KR 19990008197 A KR19990008197 A KR 19990008197A KR 1019970707722 A KR1019970707722 A KR 1019970707722A KR 19970707722 A KR19970707722 A KR 19970707722A KR 19990008197 A KR19990008197 A KR 19990008197A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
human
antigen
immunoglobulin
analog
antibody
Prior art date
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Ceased
Application number
KR1019970707722A
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English (en)
Inventor
라주쿠쉐르라파티
아야자코보비츠
수클라폴쯔
다니엘지.브레너
다니엘제이.캐폰
Original Assignee
레이몬드 엠. 위티
아브제닉스,인코오포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 레이몬드 엠. 위티, 아브제닉스,인코오포레이티드 filed Critical 레이몬드 엠. 위티
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Abstract

본 발명은 특정 항원에 대한 완전한 인간 항체를 항원성 챌린지에 대한 응답반응으로 생성하도록 변이되어 있으나, 그 내인성 좌는 작용할 수 없는 돌연변이 동물에게 상기 항원을 투여하여 생성할 수 있는 완전 인간 항체에 관한 것이다. 항체 자체나 그 유사체를 수득하기 위해 다양한 연속 조작법을 수행할 수 있다.

Description

면역화된 제노마우스 유래의 인체 항체
본원에 참고문헌으로 포함되는 1994년 2월 3일 공개된 PCT 출원 WO 94/02602호에는 항원 챌린지에 대한 응답 반응으로 내인성 항체 보다는 완전한 인체 가변부를 가진 항체를 생성하도록 변이된 인간을 제외한 돌연변이 동물의 생성 방법을 상세히 기술하고 있다. 개략해 보면, 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 암호하는 내인성 좌는 돌연변이 숙주내에서는 작용할 수 없고 인간의 중쇄와 경쇄 단백질을 암호하는 유전자 좌가 게놈내에 삽입되어 있다. 일반적으로, 필요한 수사를 모두 포함하는 동물은 수사의 완전한 보체보다 적은 수를 함유하는 교잡 육종한 중간체 동물에 의해 얻어진다. 이 문헌에 기재된 인간을 제외한 동물의 바람직한 양태는 마우스이다. 구체적으로는, 면역원을 투여했을 때 이 항원에 면역특이적인 쥐의 항체보다는 오히려 완전한 인간 항체를 비롯한 인간 가변부를 가진 항체를 생산하는 마우스를 기재하고 있다.
이러한 돌연변이 동물의 사용가능성은 완전한 인간 항체의 생성법에 대한 새로운 시도를 가능하게 해 준 것이다. 다양한 면역특이성을 가진 항체는 치료용 및 진단용으로 바람직하다. 특히, 인간 치료용 및 생체내 진단용으로 필요한 항체는, 이러한 항체들에 대한 종래 기술의 공급물들이 비인체 숙주가 생성하는 항체의 특징적인 구조를 가진 면역글로불린을 생성하기 때문에 문제가 되어 왔다. 이러한 항체는 인간에게 사용될 때 면역원 유발성인 경향이 있다.
전술한 WO 94/02602호에 기재된 인간을 제외한 면역원 응답성 돌연변이 동물의 사용가능성은 인간을 숙주로 이용하지 않아도 인간의 항체를 편리하게 생성할 수 있게 한 것이다.
본 발명은 면역학 분야, 특히 항체 생산에 관한 것이다. 구체적으로는, 요구되는 항체에 대한 항원으로 돌연변이 동물을 면역화하는 단계를 포함하는 방법으로 상기 항체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 상기 돌연변이 동물은 내인성 항체가 아닌 인간 항체를 생성하도록 변이된 것이다.
도 1은 인간 IL-6으로 면역화된 XenoMouseTM로부터 수득된 항-IL-6 항체의 혈청 역가를 도시한 것이고, 이 항체는 인간 κ 경쇄 및/또는 인간 μ 중쇄를 함유한다.
도 2는 인체 IL-8로 면역화된 XenoMouseTM로 부터 생성되는 항-IL-8 항체의 혈청 역가를 도시한 것이고, 이 항체는 인간 κ 경쇄 및/또는 인간 μ 중쇄를 함유한다.
도 3은 인간 TNF-α로 면역화된 XenoMouseTM로 부터 생성되는 항-TNFα 항체의 혈청 역가를 도시한 것이고, 이 항체는 인간 κ 경쇄 및/또는 인간 μ 중쇄를 함유한다.
도 4는 인간 CD4로 면역화된 XenoMouseTM로 부터 생성되는 항-CD4 항체의 혈청 역가를 도시한 것이고, 이 항체는 인간 κ 경쇄 및/또는 인간 μ 중쇄를 함유한다.
도 5는 표면에서 L-셀렉틴을 발현하는 300.19 세포로 면역화된 XenoMouseTM의 혈청 역가를 도시한 것이다. 사용된 ELISA 분석에서 이 항체들은 인체 μ 불변부 중쇄를 갖고 있는 경우 검출될 수 있다.
도 6은 표면에서 L-셀렉틴을 발현하는 300.19 세포로 면역화된 XenoMouseTM의 혈청 역가를 도시한 것이다. 사용된 ELISA 분석에서 이 항체들은 인체 κ 경쇄를 갖고 있는 경우 검출될 수 있다.
도 7은 L-셀렉틴을 발현하는 300.19 세포로 면역화된 XenoMouseTM의 혈청 역가를 도시한 것이다. 이 ELISA에서 이 항체들은 인체 κ 경쇄 및/또는 쥐의 γ 불변부를 갖고 있기만 하다면 검출할 수 있다.
도 8은 인체 L-셀렉틴으로 면역화되고, 쥐의 중쇄 γ 불변부와 면역반응성인 항체로 표지된 XenoMouseTM유래의 혈청에 결합된 인체 호중구의 FACS 분석을 도시한 것이다.
도 9는 인체 L-셀렉틴으로 면역화되고, 인체 경쇄 κ 영역과 면역반응성인 항체로 표지된 XenoMouseTM(A195-2) 유래의 혈청과 항온처리된 인체 호중구의 FACS 분석을 도시한 것이다.
도 10은 인체 단백질 gp39의 생성이 유효하도록 포유류 세포를 형질감염시키는데 사용된 플라스미드의 모식도이다.
도 11은 인체 gp39를 발현하는 CHO 세포로 면역된 마우스의 혈청 역가측정 곡선을 도시한 것이다. 이 ELISA에서 검출된 항체는 gp39와 면역반응성인 바, 인체 κ 경쇄나 인체 중쇄 μ 불변부를 함유해야만 한다.
도 12는 활성화된 인체 T 세포와 반응하는 인체 gp39로 면역화된 XenoMouseTM(A247-4로 표지됨) 유래의 항체를 FACS 분석한 결과를 도시한 것이다. 도 12A 는 CD4+및 CD4-모집단으로의 인체 활성화된 T 세포의 분리를 도시한 것이다. 패널 B는 쥐의 중쇄 γ 불변부를 함유하는 gp39로 면역화된 XenoMouseTM유래의 항체로 활성화된 CD4+T 세포의 FACS 분석 결과를 도시한 것이고; 패널 C는 CD4-모집단에 대한 상응하는 결과를 도시한 것이다.
도 13은 하이브리도마 클론 D5.1에 의해 분비된 모노클로널 항체에 대한 역가측정 곡선이다. 이 클론은 파상풍 독소 C(TTC)로 면역화된 XenoMouseTM로부터 수득된 것으로, 중쇄중에 인체 μ 불변부와 인체 κ 경쇄를 함유한다.
도 14는 클론 K4.1 유래의 하이브리도마 상청액에 대한 역가측정 곡선이다. 이 하이브리도마 클론은 TTC로 면역화된 XenoMouseTM로부터 수득되고 인체 κ 경쇄와 쥐의 γ 불변부를 가진 중쇄를 함유한다.
도 15는 BIAcore 기구중에서 K4.1 모노클로널 항체와 이의 항원과의 친화도 측정시, 상기 모노클로널 항체의 여러 농도에 대한 결합 곡선을 도시한 것이다.
도 16은 K4.1에 의해 분비된 항체의 중쇄를 서열 분석한 완전한 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
도 17은 K4.1에 의해 분비된 항체의 경쇄를 서열 분석한 완전한 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
도 18은 D5.1에 의해 분비된 항체의 중쇄를 서열 분석한 완전한 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
도 19는 D5.1에 의해 분비된 항체의 경쇄를 서열 분석한 완전한 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
발명의 수행 양태
개괄적으로 본 발명의 방법은 내인성이 아닌 인간 항체를 생성할 수 있도록 유전자적으로 수사(modify)시킨 인간을 제외한 돌연변이 동물에게, 면역특이적인 시약의 인체 형태가 요구되는 항원을 투여하는 것을 포함한다. 일반적으로, 상기 동물은 그 게놈에 있는 내인성 중쇄 및/또는 카파 경쇄좌가 작용할 수 없도록 수사되어, 이러한 내인성 좌는 항원에 대한 응답으로 면역글로불린을 암호하는 유전자를 생성하는데 필요한 재배열을 할 수 없다. 또한, 동물은 그 게놈내에 1종 이상의 인체 중쇄좌와 1종 이상의 인체 경쇄좌를 갖고 있어, 투여된 항원에 대한 응답으로 인체좌는 재배열하여 항원에 면역특이적인 인체 가변부를 암호하는 유전자를 제공할 수 있다.
이와 같은 본 발명의 방법에 유용한 동물을 작제하는데에 대한 상세한 설명은 상기 문헌 WO94/02602에 기재되어 있다.
목적 항체를 생성하는데 있어서, 제 1 단계는 항원을 투여하는 것이다. 이러한 투여 기법은 통상적인 것으로, 항원 자체의 성질에 따라 달라지는 적합한 면역 프로토콜과 제제를 포함한다. 또한, 면역원성을 향상시키고(또는) 보조제를 함유하는 제제를 포함하며(또는) 복수 주입액으로 투여하고(또는) 면역 경로를 변화시키는 등의 이유로 담체와 함께 항원을 제공하는 것이 필요할 수도 있다. 이러한 기법은 일반적인 것으로, 이 기법의 최적화는 요구되는 면역특이적 시약에 대한 특정 항원의 특징에 따라 달라질 것이다.
본원에 사용된, 면역특이적 시약이란 용어는 면역글로불린과 그 유사체를 포함한다. 유사체란 용어는 본원에서 특정한 의미를 갖고 있다. 이것은 면역특이성을 나타내는 완전한 인체 유래의 면역글로불린 부를 포함하는 성분을 의미한다. 특히, 적절한 입체적 형태를 산출하기 위해 프레임워크 영역(FR)의 충분한 부위와 함께 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변부를 필요로 한다. 항체의 전형적인 면역특이적 유사체로는 F(ab')2, Fab', 및 Fab 영역을 포함한다. 예컨대, 적절한 면역특이성을 가진 일본쇄 Fv유사체를 수득하기 위한 가변부의 수사 형태는 공지되어 있다. 이러한 Fv작제에 대한 설명은 예컨대, 문헌[Tibtech(1991) 9: ]에 기재되어 있다. 또한, 다양한 특이성을 가진 항체들 유래의 인체 가변부를 결합시켜 다중 면역특이성을 가진 항체 유사체를 작제하는 것도 가능하다.
또한, 완전한 인체 특성을 가진 가변부는 독성, 생물학적 작용성, 다른 결합 특이성등을 제공할 수 있는 다양한 부가 물질에 결합시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 완전한 인체 가변부를 함유하는 부는 일본쇄 융합 단백질, 펩티드 결합과 관련된 분자 이외에 다른 공유 방법으로 결합된 분자 및 응집 분자를 포함한다. 부가 분자에 공유 또는 비공유적으로 결합된 가변부를 포함하는 유사체의 예로는 다음과 같은 것들을 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다. 문헌[Traunecker, A. et al. Int.J.Cancer Supp(1992) Supp 7:51-52]은 CD3에 대해 지향성인 Fv영역이 가용성 CD4나 다른 리간드, 예컨대 OVCA 및 IL-7에 결합되어 있는 이중특이적 시약인 야누신(janusin)에 대해 개시하고 있다. 이와 유사하게, 본 발명의 방법으로 생성된 완전한 인체 가변부는 Fv분자내에 작제할 수 있고 인용 문헌에 예시된 바와 같은 대안적인 리간드에 결합시킬 수 있다. 문헌[Higgins, P.J. et al, J.Infect Disease(1992) 166:198-202]은 GP120 또는 V3 영역내의 특정 서열에 대해 지향성인 항체에 가교된 OKT3으로 구성된 이종접합체 항체를 기재하고 있다. 또한, 이러한 이종접합체 항체는 본 발명의 방법에 의해 생성된 면역글로불린내에 함유되어 있는 최소한의 인체 가변부를 사용하여 작제할 수 있다. 이중특이 항체의 또다른 예는 문헌[Fanger, M.W. et al., Cancer Treat Res(1993) 68:181-194] 및 [Fanger, M.W. et al. Crit Rev Immunol(1992) 12:101-124]에 기재된 것을 포함한다. 통상적인 항체를 포함하는 면역독소인 접합체는 당해 기술분야에 널리 개시되어 있다. 독소는 통상적인 결합 기법으로 항체에 결합시킬 수 있거나 단백질 독소부를 함유하는 면역독소를 융합 단백질로서 생성할 수 있다. 본 발명의 유사체는 이러한 면역독소를 수득하기 위한 해당 방법에 사용할 수 있다. 이러한 면역독소의 예는 [Byers, B.S. et al. Seminars Cell Biol(1991) 2:59-70 및 Fanger, M.W. et al. Immnuol Today(1991) 12:51-54]에 기재된 것이다.
또한, 본 발명의 면역글로불린과 유사체중 일부는 항원이 신호 도입 기능을 수행하는 경우에 있어서 면역특이적인 항원에 대해 작동물질의 활성을 갖는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 제조된, 예컨대 세포 표면 수용체에 대해 면역특이성인 항체나 유사체의 아군은 천연 리간드에 의해 유인된 것에 상응하는 상기 수용체를 함유하는 세포로부터 응답반응으로 유인할 수 있을 것이다. 더우기, 화학 반응의 전이 상태를 모방하는 물질에 대해 면역특이적인 항체 또는 유사체도 촉매 활성을 가질 것이다. 그러므로, 본 발명의 항체 및 유사체의 아군은 촉매 항체로서 작용할 것이다.
간단히 말하면, 본 발명의 돌연변이 동물에 의해 생성되는 면역글로불린을 암호하는 유전자를 검색하여, 완전한 인체 가변부를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 공지의 기법에 따라 조작하여 전술한 것과 같은 다양한 유사체를 제공할 수 있다. 또한, 인체 가변부를 함유하는 면역글로불린 자체를 표준 결합 기법으로 수사시켜 면역특이적 영역에 완전한 인체 특성과 면역특이성을 보유하는 접합체를 제공할 수 있다.
따라서, 면역글로불린 유사체는 인체 특성과 그 면역특이성을 보유하는 본 발명의 항체의 일부를 함유하는 부를 의미한다. 즉, 유사체는 바람직한 특이성을 제공하기에 충분한 인체 가변부를 보유할 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 모두 돌연변이 동물에게 적절한 항원을 투여하는 것을 포함한다. 항체 자체의 생성이나 회수는 각종 방법으로 실시할 수 있다.
먼저, 가장 간단한 방법으로서, 동물에 의해 생성되어 혈류로 분비되는 폴리클로널 항체는 공지 기법으로 회수할 수 있다. 이러한 항체의 정제 형태는 물론 표준 정제 기법, 바람직하게는 특정 항원이나, 또는 특이성이 요구되는 항원의 특정 에피토프에 대한 친화성 크로마토그래피등으로 용이하게 제조할 수 있다. 면역화의 성공을 모니터하기 위해서는 어떤 경우든지 혈청내의 항원에 대한 항체량을 ELISA, RIA등과 같은 표준 기법을 사용하여 모니터하면 된다.
하기 실시예는, 수득된 폴리클로널 항혈청의 일부가 그 가변부는 완전한 인체 유래이지만, 내인성의 중쇄 불변부는 숙주 유래인 것을 포함할 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 상황하에서, 완전한 인체 항체를 필요로 하는 범위에 대해 폴리클로널 항혈청을 직접적으로 사용하는 것은 불적절한 것이다. 하지만, 문헌[Gerstein et al. Cell(1990) 63:537]에 기재된 바와 같이 생체내 아이소타입의 전환을 초래하는 것으로 사료되는 이러한 키메라의 존재는, 종래의 정제법과 수사법의 측면에서, 그리고 필요하다면 하기 문단에 기재된 바와 같은 완전한 인체 항체를 회수하는 대안적인 방법의 사용가능성의 측면에서 문제가 되지는 않는다.
먼저, 가장 간단하게는 폴리클로널 항혈청을 적합한 분리 기법으로 처리하여 완전한 인체 면역글로불린만을 함유하는 조성물을 제공할 수 있다. 숙주종의 특징을 나타내는 혈청 부는 예컨대, 적당한 항 숙주 종의 면역글로불린이나 이의 면역특이적 부분과의 친화성 시약을 사용하여 제거할 수 있다. 또한, 항체의 가변부만이 필요한 용도의 경우에는 Fab, Fab', 또는 F(ab')2부를 생성하기에 적합한 시약으로 폴리클로널 항혈청을 처리하면 완전한 인체 특성을 함유하는 조성물이 생성된다. 이러한 단편들은, 예컨대 방사성동위원소와 같은 검출 시약에 면역글로불린의 면역특이적 부를 결합시키는 것을 포함하는 면역진단법에 사용하기에 충분한 것이다. 따라서, 일부 용도에서는 폴리클로널 항혈청을 적절히 처리하여 바람직한 특징을 가진 조성물, 예컨대, 주로 완전한 인체 항체로 이루어진 조성물 및 면역특이적 부가 완전한 인체 유래의 것인 면역글로불린 유사체를 포함하는 조성물을 제공할 수 있다.
대안적으로, 바람직한 특징을 가진 면역글로불린과 유사체는 본 발명의 방법에 사용된 돌연변이 동물에서 유래된 무한증식성 B 세포나 면역화에 대한 응답반응으로 상기 동물에 의해 제공된 재배열 유전자로부터 생성할 수 있다. 면역화된 동물의 B 세포로부터 유래된 하이브리도마는 완전한 인체 항체를 분비하는 것만을 선택하도록 선별할 수 있고, 이 하이브리도마나 또는 면역화된 동물의 비장, 혈액 또는 림프절중에 존재하는 림프구로부터 그 유전자 물질을 회수하고 모든 내인성의 불변부를 인체 불변부로 치환시키거나 바람직한 유사체를 생성하도록 통상적인 기법을 사용하여 조작할 수 있다.
따라서, 동물로부터 항체를 직접 회수할 수 있는 대안 방법으로서, 먼저, B 세포를 일반적으로 비장, 바람직하다면 말초 혈액 림프구나 림프절로부터 채취하고, 각종 다양한 기법, 가장 일반적으로는 쾰러 및 밀스타인에 의해 개시된 융합 방법을 사용하여 무한증식시킬 수 있다. 그 다음 생성되는 하이브리도마(또는 무한 증식성 B 세포)를 단일 콜로니로서 배양하고 목적 특이성을 가진 항체 분비에 대하여 선별한다. 전술한 바와 같이, 선별은 또한 항체가 완전한 인체 특성을 갖고 있는지에 대한 확인을 포함한다. 예컨대, 하기 실시예에 기재되는 바와 같이, 하이브리도마 상청액중의 모노클로널이 항원과 항인체 불변부에 모두 결합되어 있는 샌드위치 ELISA를 사용할 수 있다. 이와 반대로, 면역화된 동물종에 대해 지향성인 항종 항체와 면역반응성인 항체를 분비하는 하이브리도마는 분류해 제거할 수 있다. 적절한 하이브리도마를 선택한 후, 목적 항체를 또한 통상의 기법으로 수거할 수 있다. 이것은 통상의 방법을 사용하여 무한증식성 B 세포를 시험관내에서 또는 생체내에서 배양하여 복수액을 생성하므로써 정량적으로 제조할 수 있다. 이와 같이 생성되는 모노클로널 항체 제조물의 정제는 각각의 무한증식성 콜로니가 1종류의 항체만을 분비하기 때문에 혈청을 사용하는 경우보다도 용이하다. 모든 경우마다, 배양액중의 기타 다른 단백질로부터 항체를 분리하는 표준 정제 기법을 사용할 수 있다.
동물 유래의 무한증식성 B 세포 배양물로부터 인체 면역글로불린을 직접 수득하는 대안적인 방법으로서, 무한증식성 세포를 잇따른 발현 및/또는 유전자 조작의 재배열된 중쇄 및 경쇄 좌의 공급원으로서 사용할 수 있다. 이러한 항체-생산 세포 유래의 유전자의 분리는 해당 mRNA가 다량으로 생성되어 cDNA 라이브러리의 생성이 용이하기 때문에 간단한 것이다. 복원된 재배열화는 필요한 경우 추가 조작될 수 있다. 예를 들면, 불변부는 다른 아이소타입의 것이나 인체 항체의 것으로 전술한 바와 같이 교환하거나 함께 제거할 수 있다. 이 가변부는 일본쇄 Fv영역을 암호하도록 결합시킬 수 있다. 또한 1개 이상의 표적 또는 키메라 중쇄 및 경쇄 복합체에 대해 결합성을 부여하기 위해 다수의 Fv영역을 결합시켜 이용할 수 있다. 유전자 물질이 일단 사용이 용이하다면, 목적 표적에 결합하는 성질과 인간 특징을 모두 보유하는 전술한 바와 같은 유사체의 디자인은 간단하다.
또한, 적절한 유전자 물질을 수득하고, 필요한 경우 유사체를 암호하도록 수사시키면, 최소한 인체 중쇄와 경쇄의 가변부를 암호하는 서열을 비롯한 암호 서열을, 표준 재조합 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있는 벡터상에 함유된 발현계에 삽입시킬 수 있다. 하기 기술되는 바와 같이, 상기 숙주 세포로서 각종 숙주 세포를 사용할 수 있는데, 효과적인 프로세싱을 위해서는 포유류 세포가 바람직하다. 이러한 목적에 유용한 통상적인 포유류 세포주로는 CHO 세포, 293 세포 또는 NSO-GS 세포를 포함한다.
그 다음 항체 또는 유사체의 제조는 숙주 세포의 성장과 암호 서열의 발현에 적당한 배양 조건하에 수사된 재조합 숙주를 배양하여 수행한다. 그 다음 배양물로부터 항체를 회수한다. 이와 같이 생성되는 항체가 배지로 분비되도록 발현계는 신호 펩티드를 포함하게 고안하는 것이 바람직하나, 또한 세포내 생산도 가능하다.
또한, 유사체를 생성하기 위해 면역글로불린 유전자의 수사 형태를 디자인하는데에는 목적 항원에 대해 다양한 친화성을 가진 일군의 항체를 함유하는 라이브러리를 제공하는 파아지 디스플레이 기법을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 일군을 생성하기 위하여 면역화된 동물 유래의 B 세포를 무한증식하는 것은 불필요하며, 오히려 DNA 공급원으로서 1차 B 세포를 직접 사용할 수 있다. 예컨대, 비장 유래의 B 세포로부터 수득된 cDNA의 혼합물을 사용하여 발현 라이브러리, 예컨대 이.콜리로 형질감염된 파아지 디스플레이 라이브러리를 제조한다. 이와 같이 생성되는 세포를 목적 항원에 대한 면역반응성에 대해 시험한다. 이러한 라이브러리로부터 높은 친화성의 인체 항체를 동정하는 기법은 문헌[Griffiths, A.D. et al., EMBO J(1994) 13:3245-3260; Nissim, A., et al., 동문헌, 692-698 및 Griffiths, A.D., et al., 동문헌, 12:725-734]에 기재되어 있다. 궁극적으로, 상기 항원에 대해 바람직한 크기의 결합 친화성을 생성하는 라이브러리중의 클론을 확인하고, 이러한 결합에 주요 역할을 하는 생성물을 암호하는 DNA를 검색하여 표준 재조합 발현 기법으로 조작한다. 또한, 이와 같이 조작된 뉴클레오티드 서열을 사용하여 파아지 디스플레이 라이브러리를 작제하고 유사 방식으로 선별할 수 있다. 일반적으로, 중쇄 및 경쇄를 암호하는 cDNA는 각각 공급하거나, 함께 결합시켜 파아지 라이브러리중에서 생성되는 Fv유사체를 형성할 수 있다.
그 다음, 파아지 라이브러리중에서 적절한 클론으로 부터 회수된 유전자 물질과 항원에 대해 최고의 친화성을 가진 항체를 선별한다. 추가의 선별 작업은 분리된 본래의 항체가 가진 친화성을 증가시킬 수 있다. 그 다음 항체의 재조합 생성이나 목적 유사체를 형성하기 위한 수사법에 대해 전술한 조작법을 사용할 수 있다.
상기와 같이, 수사되거나 수사되지 않은 재배열된 좌는 바람직한 숙주 세포, 예컨대 통상적으로 중국 햄스터 난소 세포중에서 작동할 수 있는 발현계를 작제하여 표준 재조합 기법으로 조작하고, 바람직한 면역글로불린이나 유사체는 표준 재조합 발현 기법을 사용하여 생성하고 통상적인 방법을 사용하여 회수 및 정제한다.
항체 생산에 대한 전술한 방법을 사용하면, 종래까지 사용이 용이하지 않았던 인체 항체에 대한 항원을 가진 면역특이적 시약을 제조할 수 있다. 전술한 방법으로 생성되는 면역글로불린과 이로부터 제조가능한 유사체는 분석, 진단, 연구 및 치료에 사용할 수 있는 신규 조성물을 제공한다. 물론 특정 용도는 제조된 면역글로불린이나 유사체에 따라 다를 것이다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 동일한 항원에 대해 지향성인 비인체 항체에 기인하는 것과 유사한 유용성을 갖고 있을 것이다. 이러한 유용성으로는 예를 들면, 정제용 친화성 리간드, 면역분석법중의 시약, 면역접합체의 성분 및 적절한 증상에 대한 치료제로서의 용도를 포함한다.
특히, 생체내에서 사용하기 위한 치료제 또는 진단제인 경우에, 완전한 인체 특성을 가진 항체 또는 이의 유사체를 이용하는 것이 매우 바람직하다. 이러한 시약은 비인체 종 유래의 특징을 가진 항체나 유사체가 일으키는 바람직하지 않은 면역반응을 나타내지는 않는다. 항체를 인체화하기 위한 다른 시도들로는 완전한 인체 특성을 가진 시약을 만들 수 없다. 예를 들면, 쥐의 가변부와 인간의 불변부를 가진 키메라 항체는 쉽게 만들어지며, 물론 가변부에 쥐의 특성을 보유하게 된다. 또한, 일반적으로 비인간 기원의 CDR들은 면역특이성을 파괴시키지 않고는 조작할 수 없기 때문에 프레임워크 영역을 형성하는 아미노산 서열을 암호하는 유전자를 조작하여 가변부를 인체화하는 훨씬 어려운 절차를 통해서라도 바람직한 결과를 얻을 수는 없다. 따라서, 본 발명의 방법은, 우선 완전한 인체 특성을 가진 면역특이 영역을 함유하는, 완전한 인간 유래의 면역글로불린이나 유사체를 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있는 인체 항체 및 그 유사체에 대한 항원에는 다수의 종류가 있다. 그 예로는 다음을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
백혈구 마커인 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD11a,b,c, CD13, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27 및 이의 리간드, CD28과 이의 리간드, B7.1, B7.2, B7.3, CD29 및 이의 리간드, CD30 및 이의 리간드, CD40 및 이의 리간드 gp39, CD44, CD45 및 이소형태, CDw52(캠패스 항원), CD56, CD58, CD69, CD72, CTLA-4, LFA-1 및 TCR;
조직화합성 항원인 MHC 제 I 군 또는 제 II 군, 루이스 Y 항원, SLex, SLey, SLea 및 SLeb;
VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-4, VLA-5, VLA-6, LFA-1, Mac-1, 및 p150, 95와 같은 인테그린을 함유하는 유착 분자;
셀렉틴인 L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴과 이들의 대응 수용체 VCAM-1, ICAM-1, ICAM-2 및 LFA-3;
인터루킨인 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 및 IL-15;
인터루킨 수용체인 IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-11R, IL-12R, IL-13R, IL-14R 및 IL-15R;
케모킨인 PF4, RANTES, MIP1α, MCP1, NAP-2, Groα, Groβ 및 IL-8;
성장 인자인 TNFα, TGFβ, TSH, VEGF/VPF, PTHrP, EGF군, FGF, PDGF군, 엔도텔린, 가스트린 방출 펩티드(GRP);
성장 인자 수용체인 TNFαR, RGFβR, TSHR, VEGFR/VPFR, FGFR, EGFR, PTHrPR, PDGFR군, EPO-R, GCSF-R 및 다른 조혈 수용체;
인터페론 수용체인 IFNαR, IFNβR 및 IFNγR;
Ig 및 그 수용체인 IgE, FceRI 및 FceRII;
종양 항원인 her2-neu, 뮤신, CEA 및 엔도시알린;
알레르기성 물질인 집먼지진드기 항원, lol p1(목초) 항원, 및 우루시올;
바이러스 단백질인 CMV 당단백질 B, H 및 gCIII, HIV-1 엔벨로프 당단백질, RSV 엔벨로프 당단백질, HSV 엔벨로프 당단백질, EBV 엔벨로프 당단백질, VZV 엔벨로프 당단백질, HPV 엔벨로프 당단백질, 간염류의 표면 항원;
독소인 슈도모나스 내독소 및 오스테오폰틴/유로폰틴, 뱀독 및 벌독;
혈액인자인 보체 C3b, 보체 C5a, 보체 C5b-9, Rh 인자, 피브리노겐, 피브린, 및 미엘린 결합된 성장 억제제;
효소인 콜레스테롤 에스테르 전이 단백질, 막결합된 기질 메탈로프로테아제 및 글루탐산 탈탄산효소(GAD); 및
미셀형 항원인 강글리오사이드 GD3, 강글리오사이드 GM2, LMP1, LMP2, 호산구 주요 염기성 단백질, PTHrp, 호산구 양이온 단백질, pANCA, 아마도리 단백질, 제 IV 형 콜라겐, 당화된 지질, γ-인터페론, A7, P-당단백질, Fas(AFO-1) 및 산화된-LDL.
특히 바람직한 면역글로불린과 유사체는 인체 IL-6, 인체 IL-8, 인체 TNFα, 인체 CD4, 인체 L-셀렉틴, 인체 PTHrp 및 인체 gp39에 대해 면역특이적인 것이다. IL-8에 대한 인체 항체는 천식 및 재관류 손상과 같은 염증 상태와 종양 전이상태를 예방하는데 특히 유용하다. 인체 TNFα 및 인체 IL-6과 면역반응성인 항체와 유사체는 자가면역 질환 뿐만아니라 악액질과 패혈증 쇼크를 치료하는데 효과적이다. 또한, gp39나 L-셀렉틴과 면역반응성인 항체 및 유사체도 또한 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는데 효과적이다. 또한, 항-gp39는 이식편 대 숙주 질환을 치료하고, 기관 이식 거부반응을 방지하며, 사구체신염을 치료하는데 도움을 준다. L-셀렉틴에 대한 항체와 유사체는 재관류 손상과 관련된 허혈증을 치료하는데 유용하다.
전술한 항체와 유사체를 사용하여 치료할 수 있는 일반적인 자가면역 질환으로는 전신 홍반성 루푸스, 류마티스양 관절염, 건선, 쇼그렌증, 공피증, 복합 결합 조직 질환, 피부근염, 다발성근염, 라이터 증후군, 베세트 질환, 당뇨병 제1형, 하시모토 갑상선염, 그레이브 질환, 다발성 경화증, 중증근무력증 및 천포창을 포함한다.
하기 실시예는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예시하는 것이다.
본 실시예에서는, 1차 면역화에 제노마우스라고 하는 마우스를 사용하고 있다. 이러한 제노마우스의 상세한 설명은 상기 언급한 PCT 출원 WO 94/02602에 기재되어 있다. 각 항원에 적합한 면역화 프로토콜은 하기 구체적인 실시예들에 기재한다. 면역화된 제노마우스의 혈청(또는 무한증식성 B 세포의 상청액)은 각 경우마다 표준 ELISA 방식을 사용하여 항원 특이적 인체 항체에 대해 역가측정하였다. 이 방법에서, 면역화에 사용된 항원은 미량역가 평판의 웰 상에 고정시켜 두었다. 이 평판을 세정하고 차단시킨 뒤 혈청(또는 상청액)을 일련의 희석물로서 첨가하여 1 내지 2시간동안 항온처리하였다. 그 다음 이것을 세정한 후, 인체 특성을 가진 결합된 항체를, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 결합된 적절한 항종(antispecies) Ig(일반적으로 항인체 κ쇄 항체 또는 항인체 μ쇄 항체)을 1시간동안 첨가하여 검측하였다. 일부 경우에는, 항쥐 항체, 일반적으로 항쥐 γ쇄 항체를 사용하여 결합된 항체가 쥐의 특성을 갖고 있는지에 대해 시험하였다. 이것을 다시 세정한 후, 발색 시약인 o-페닐렌 디아민(OPD) 기질과 과산화 수소를 첨가한 뒤, 30분 후에 미량역가 판독기를 사용하여 492nm 에서 평판을 판독하였다.
별다른 표시가 없는 한, 항원은 평판 코팅 완충액(0.1M 탄산염 완충액, pH 9.6)을 사용하여 피복하였고; 사용된 분석 차단 완충액은 PBS중의 0.5% BSA, 0.1% Tween 20 및 0.01% 티메로살이며; 발색에 사용된 기질 완충액은 구연산 7.14g/l; 이염기성 인산 나트륨 17.96g/l이고; 발색 용액(사용전 즉시 제조됨)은 10ml의 기질 완충액; 10mg OPD + 5ml 과산화수소이며; 종지 용액(발색 종지에 사용됨)은 2M 황산이다. 세정 용액은 PBS 중의 0.05% Tween 20이다.
발명의 개요
본 발명은 인간을 제외한 돌연변이 동물을 목적 항원으로 면역화하는 단계를 1단계 이상 포함하는 방법에 의해 인간 항체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 변이된 동물은 내인성 항체는 생성하지 못하지만 그 대신에 완전한 인체 가변부를 가진 면역글로불린을 분비하는 B-세포를 생성한다. 생성된 항체는 완전한 인체 항체를 포함하며 동물로부터 직접 수득할 수 있거나 동물 유래의 무한증식성 B-세포로부터 수득할 수 있다. 대안적으로, 인간의 가변부를 가진 면역글로불린을 암호하는 유전자를 찾아서, 이것을 발현시키므로써 항체를 직접 수득하거나 항체를 수사하여, 예컨대 일본쇄 Fv분자와 같은 항체의 유사체를 수득할 수 있다.
따라서, 일 양태로서 본 발명은 면역 반응을 자극하는 조건하에서 특정 항원에 대해 완전한 인체 가변부를 가진 면역글로불린을 생성하는 방법 또는 상기 항원으로 인간을 제외한 동물을 면역화하는 것을 포함하는 공정에 의해 상기 면역글로불린의 유사체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 완전한 인체 면역글로불린은 이 군에 속하는 것으로 바람직한 것이다. 인간을 제외한 동물은 내인성의 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄는 실질적으로 생성할 수 없으나 인간의 가변부와 불변부나 완전한 인체 가변부 또는 그 양자를 모두 가진 면역글로불린은 생성할 수 있는 것을 특징으로 한다. 이와 같이 생성되는 면역반응에서 이 동물은 상기 항원에 특이적이고 완전한 인간 유래인 가변부를 최소한 함유하는 면역글로불린을 분비하는 B 세포를 생성한다. 바람직한 특이성을 가진 인간의 면역글로불린은, 예컨대 혈청으로부터 동물에게서 직접 회수하거나 동물로부터 1차 B 세포를 수득하여 무한증식시킬 수 있다. 무한증식성의 B 세포는 인간 항체원으로서 직접 사용하거나, 대안적으로 항체를 암호하는 유전자를 무한증식성의 B 세포나 면역화된 동물의 혈액이나 림프양 조직(비장, 편도선, 림프절, 골수)의 1차 B 세포로부터 제조하여 수사하거나 수사시킴이 없이 재조합 숙주내에서 발현시켜 면역글로불린이나 그 유사체를 생성할 수 있다. 또한, 면역화된 동물에 의해 생성된 면역글로불린들을 암호하는 유전자는 면역글로불린의 라이브러리를 만들어 목적하는 친화성을 제공하는 가변부에 대해 선별할 수 있다. 그 다음 라이브러리중에서 선별된 바람직한 특성을 가진 클론을 필요한 가변부를 암호하는 뉴클레오티드 서열원으로서 사용하여 표준 재조합 기법으로 이러한 특성을 가진 항체 또는 유사체를 생성하는 추가 조작을 할 수 있다.
또다른 양태로서, 본 발명은 전술한 동물로부터 유래된 무한증식성의 비인체 B 세포주에 관한 것이다. 또 다른 양태로서, 본 발명은 목적하는 특이성을 가진 인간 면역글로불린이나 이와 동일한 특이성을 나타내는 그 유사체를 암호하는 유전자를 함유하도록 변이된 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 전술한 방법으로 제조한 항체 또는 항체 유사체 및 이들을 생산하는 재조합 물질에 관한 것이다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 기술된 특정 항원에 대해 면역특이성인 완전한 인체 항체를 비롯하여, 완전한 인체 가변부를 가진 항체 및 이와 유사한 면역특이성이 있는 유사체, 뿐만 아니라 이러한 항체 생산에 유용한 재조합 물질에 관한 것이다.
실시예 1
인체 IL-6에 대한 인체 항체
8 내지 20 주령의 XenoMouseTM3 내지 5 마리를 연령별로 모아서, 1차 면역시에는 완전 프로인트 보조액중에 유화시키고 이후 주입시에는 불완전 프로인트 보조액중에 유화시킨 인체 IL-6 50㎍을 복강내로 투여하여 면역화시켰다. 2 내지 3주 간격으로 6회의 주입액을 마우스에게 투여하였다. 2차 투여후와 그 이후의 각 투여후 혈청 역가를 측정하였다. 주입한지 6 내지 7일 후 안구후 신경총으로부터 채혈하였다. 이 혈액을 실온에서 약 2시간 동안 응괴시키고 그 다음 4℃에서 2시간 이상동안 항온처리한 후 혈청을 분리하여 수거하였다.
ELISA는 피복 완충액중에 함유된 2㎎/㎖의 재조합 인체 IL-6 100㎕/웰을 첨가하여 전술한 바와 같이 수행하였다. 그 다음 평판을 4℃에서 하룻밤동안 항온처리하거나 37℃에서 2시간동안 항온처리한 다음 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 그 다음 차단 완충액 100㎕/웰를 첨가한 후 실온에서 2시간동안 항온처리하고 추가 3회 세정하였다.
그 다음, 평판에 희석된 혈청 시료(및 양성 대조군과 음성 대조군) 50㎕/웰을 첨가하였다. 그 다음 평판을 실온에서 2시간동안 항온처리하고 다시 3회 세정하였다.
세정한 후, 차단 완충액중에 1/2,000로 희석한 HRP에 결합된 마우스 항인체 μ쇄 항체 또는 1/2,000로 희석한 HRP에 결합된 마우스 항인체 κ쇄 항체를 100㎕/웰를 첨가하였다. 실온에서 1시간동안 항온처리한 후, 평판을 3회 세정하고 OPD 기질로 10 내지 25분간 발색시켰다. 그 다음 종지 용액 50㎕/웰를 첨가하고 ELISA 평판 판독기로 492nm에서 그 결과를 판독하였다. 6회 주입후 XenoMouseTMA40-7 혈청의 역가를 측정하여 제작한 희석 곡선을 도 1에 도시하였다. 도 1의 데이터는 항인체 κ 및 항인체 μ와 면역반응성인 항-IL-6의 생성이 1:1,000이상의 혈청 희석율에서도 검출된다는 것을 나타내고 있다.
실시예 2
인체 IL-8에 대한 인체 항체
면역원으로서 인체 재조합 IL-8을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 면역화 및 혈청 제조를 실시하였다.
또한, 피복 완충액중에 함유된 0.5mg/ml의 재조합 인체 IL-8을 100㎕/웰 사용하여 ELISA 평판을 1차 피복한다는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 똑같이 회수한 혈청에 대해 ELISA 분석을 수행하였다. 6회 주입후 XenoMouseTMA260-5에서 얻은 여러 혈청 희석물에 대해 수득된 결과는 도 2에 도시하였다. 또한, 인체 항-IL-8 결합성은 1:1,000 희석율에서 나타나는 것보다 더 높은 농도를 가진 혈청 희석율에서 나타났다.
실시예 3
인체 TNFα에 대한 인체 항체
인체 IL-6 대신에 인체 재조합 TNFα를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 면역화 및 혈청 제조를 수행하였다. ELISA는 이 ELISA 평판의 초기 피복에, 피복 완충액중에 함유된 1㎎/㎖의 재조합 인체 TNFα 100㎕/웰를 사용한다는 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.
6회 유도후 XenoMouseTMA210-8로부터 채취한 혈청의 희석 곡선을 도 3에 도시하였다. 또한, 인체 항-TNFα 결합의 상당한 역가가 관찰되었다.
실시예 4
인체 CD4에 대한 인체 항체
인체 CD4 항원은 다음과 같이 형질감염된 재조합 세포상에서 인체 CD4ζ를 사용하여 표면 단백질로서 제조하였다. 인체 CD4ζ는 성숙 ζ 쇄의 CD4의 세포외 도메인, CD4의 경막 도메인, 및 잔기 31 내지 142에 상응하는 세포질 도메인으로 이루어져 있다. 문헌[Roberts et al., Blood(1994) 84:2878]에 기재된 바와 같은 인체 CD4 제타(F15 LTR)는 문헌[Finer et al., Blood(1994) 83:43]에 기재된 바와 같은 Kat 고효율 형질도입 시스템을 사용하여 문헌[Callan, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1993) 90:10454]에 기재된 바와 같은 래트 호염기구 백혈병 세포주 RBL-2H3내로 도입시켰다. 간략히 요약하면, 106세포/웰의 RBL-2H3 세포를 750㎖의 DMEMlow+ 20% FBS(Gibco) 및 폴리브렌 16㎍/㎖중에서 동등 부피의 프로바이러스 상청액과 37℃, 5% CO2하에 2시간동안 배양하였다. 이 배지 1ml를 취하고, 감염 배지 750㎕와 레트로바이러스 상청액을 각 웰에 첨가하고 이 배양물을 하룻밤동안 항온배양하였다. 이 세포를 세정하고, 이 세포의 분류가 용이해질 정도의 충분한 세포가 얻어질 때까지 DMEMlow+ 10% FBS중에서 증식시켰다. CD4-제타 형질도입된 RBL-2H3 세포는 FACSTAR 플러스(Becton Dickinson)를 사용하여 분류하였다. 이 세포를 마우스 항인체 CD4-PE 항체를 사용하여 인체 CD4에 대해 염색하고 최상의 2 내지 3%의 발현 세포를 선별하였다.
면역화는 1차 주입액을 목의 기저부를 통해 경피적으로 투여한다는 것을 제외하고는 마우스당 1 x 106세포를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이 마우스에게 6회의 주입액을 2 내지 3주 간격으로 투여하였다. 혈청을 제조하고, 피복 완충액중에 함유된 2㎍/㎖의 재조합 가용성 CD4를 100㎕/웰로 이용하여 ELISA 평판을 1차 피복하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 ELISA로 분석하였다. 6회 주입 후 XenoMouseTMA207-1에서 얻은 혈청의 역가 측정 곡선을 도 4에 도시하였다. 인체 항-CD4 반응성의 역가는 1:1,000 희석율보다 높은 농도에서 나타났다.
실시예 5
인체 L-셀렉틴에 대한 인체 항체
항원은 마우스 예비-B 세포 300.19를 LAM-1 cDNA로 형질감염시키거나(LAM-1은 L-셀렉틴을 암호하는 유전자임)(Tedder, et al., J.Immunol(1990) 144:532), 또는 유사하게 형질감염된 CHO 세포로 형질감염시켜 유도된 발현율이 높은 클론인 C51 세포중에서 표면에 나타나는 단백질로서 제조하였다. 이와 같이 형질감염된 세포를 표식으로서 항-Leu-8 항체를 사용하여 형광 활성화된 세포 분류기로 분류하였다.
C51 및 형질감염된 CHO 세포는 100mm 접시중에 10% FCS와 G418 1mg/ml와 함께 글루코스 4.5 g/l을 함유하는 DME 중에서 증식시켰다. 음성 대조군 세포, 3T3-P317(몰로니 바이러스의 gag/pol/env 유전자로 형질감염됨)은 G418을 함유하지 않은 동일 배지중에서 증식시켰다.
1차 면역화는 목의 기저부를 통해 경피적으로 주입하여 실시하고; 그 다음에는 복강내 주입하여 실시하였다. 주입액당 70 내지 100 x 106의 C51 또는 형질감염된 CHO 세포를 사용하여 총 5회의 주입액으로 2 내지 3주 간격으로 주입하였다.
혈청을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수집하여 실시예 1에 기재된 것과 유사한 프로토콜의 ELISA로 분석하였다.
ELISA를 위해, 형질감염된 세포는 96 웰 평판에서 평판배양하고 세포 단층을 세포수에 따라 1 내지 2일동안 증식시킨 뒤, 융합성일 때 ELISA에 이용하였다. 이 세포를 저온의 1xPBS로 1차 세정하여 고정시키고 그 다음 고정 용액(5% 빙초산, 95% 에탄올)을 첨가하였다. 이 평판을 -25℃에서 5분동안 항온처리하고, 이것을 평판 밀봉제로 밀봉한다면 이 온도에서 보관할 수 있다.
이 평판을 실온에 꺼내어 고정 용액을 털어없애고 10% FCS를 함유하는 DMEM 배지를 200㎕/웰로 사용하여 5회 세정하므로써 ELISA를 시작하였다.
이 웰을 여러 혈청 희석물이나 양성 대조군 또는 음성 대조군으로 처리하였다. 양성 대조군 웰은 인체 L-셀렉틴에 대한 쥐의 IgG1 모노클로날 항체를 함유하였다.
이 웰을 45분동안 항온 처리하고 현미경으로 단층의 보전성을 검사하였다. 그 다음 이 웰을 실시예 1에 기재된 바와 같은 HRP가 결합된 항인체 κ쇄 항체 또는 항인체 μ쇄 항체 결합체 또는 항마우스 IgG(1/1000)와 항온처리하였다. 이 평판을 1% BSA/PBS로 세정하고 다시 PBS로 세정한 후 단층의 보전성을 검사하였다. 이 평판을 전술한 바와 같이 발색한 뒤, 발색 종지시킨 다음 판독하였다. XenoMouseTMA303-3에서 얻은 혈청에 대한 결과는 도 5 및 도 6에 도시하였다; L-셀렉틴과 대조군인 3T3 세포에 대한 인체 항체를 수득하였다. 그러나, 혈청 역가는 모세포인 3T3 세포에 비해 L-셀렉틴-발현 세포에서 더 높게 나타났다. 이 결과는 XenoMouseTMA303-3이 인체 μ 중쇄 영역 및/또는 인체 κ 경쇄와 함께 L-셀렉틴에 특이적인 항체를 생성한다는 것을 나타낸다.
또한, 인체 IgG1의 불변부 도메인에 융합된 인체 L-셀렉틴의 세포외 도메인으로 이루어진 융합 단백질을 고정 항원으로 사용하여 ELISA를 수행하였다(Guo et al., Cell Immunol(1994) 154:202). L-셀렉틴 융합 단백질은 인산 칼슘 형질감염법을 사용하여 인체 293 세포를 일시적으로 형질감염시켜 제조하였다(Wigler, M., Cell(1979) 16:777). 혈청 제조는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. ELISA는 실시예 1에 기재된 바와 같이 주로 수행하였으나, 단 ELISA 평판의 1차 피복에 L-셀렉틴-Ig 융합 단백질을 함유하는 형질감염된 293개의 세포 배양물 상청액 100㎕를 이용하였다. 검출에는 HRP-마우스 항인체 κ 및 HRP-염소 항마우스 IgG를 이용하였다.
도 7은 XenoMouseTMA195-2에서 얻은 결과를 도시한 것이다; 인체 κ 경쇄 및/또는 쥐의 중쇄 γ 영역을 함유한 인체 불변부를 가진, L-셀렉틴에 대해 특이적인 항체들이 이 혈청중에 존재한다.
또한, 면역화된 제노마우스에서 수득한 항혈청을, L-셀렉틴을 발현하는 인체 호중구의 염색에 대해 시험하였다. 인체 호중구는 다음과 같이 제조하였다: 말초 혈액을 100 단위/ml의 헤파린으로 정상인 지원자로부터 채취하였다. 약 3.5ml의 혈액을 동등 부피의 One-step Polymorph Gradient(뉴욕 웨스트베리에 소재하는 어큐레이트 케미칼)상에 층적하고 20℃하에 450 x g로 30분동안 회전시켰다. 호중구 분획을 분리하고 DPBS/2% FBS로 2회 세정하였다.
그 다음 호중구를 (1) C51 세포(L-셀렉틴 발현)로 면역화된 XenoMouseTMA195-2에서 채취한 항혈청; (2) 양성 대조군으로서 마우스 모노클로널 항체 LAM 1-3(L-셀렉틴에 대해 생성됨); 및 (3)음성 대조군으로서 인체 gp39를 발현하는 세포로 면역화된 XenoMouseTM에서 채취한 항혈청으로 염색시켰다.
염색한 뒤 세정한 호중구를 FACS로 분석하였다. XenoMouseTMA195-2에서 채취한 항혈청에 대한 결과는 도 8 및 도 9에 도시하였다.
이 결과는 L-셀렉틴과 면역반응성인 완전한 인체 가변부를 함유하는 면역화된 XenoMouseTM혈청중의 항체의 존재를 나타내고 있다. 음성 대조군인 gp39로 면역화된 마우스에서 채취한 항혈청은 인체 호중구에 대해 반응성인 항체를 함유하지 않는다. A195-2(L-셀렉틴-발현 세포로 면역화됨) 유래의 혈청은, 완전한 인체 가변부와 마우스 γ 불변부로 이루어진 중쇄 단백질에 결합하는, 염소 항마우스 IgG 항체로 검출되는 인체 호중구에 대해 결합하는 항체를 함유한다(도 8). 인체 κ쇄 항체에 대한 마우스 모노클로널 항체로 검출된 항 L-셀렉틴 XenoMouseTM항혈청을 사용한 염색 결과는 도 9에 나타내며, 이로부터 완전한 인체 κ 경쇄의 존재를 확인할 수 있다.
전술한 바와 같이, 인체 가변부를 함유하는 상기 항체들은 완전한 인체 항체로 용이하게 전환시킬 수 있다. 예를 들면, 이러한 항체를 분비하는 하이브리도마를 사용하여 이 항체를 암호하는 cDNA를 수득할 수 있다. 완전한 인체 항체를 암호하는 유전자는, 인체 V 영역을 암호하는 유전자를 제한 효소 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 증폭시키고 이 유전자를, 문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1989) 86:10029]에 기재된 바와 같은 인체 불변부에 대한 암호 서열을 함유하는 플라스미드에 클로닝하므로써 재조합 생성을 위해 수득할 수 있다.
실시예 6
인체 gp39에 대한 인체 항체
gp39(CD40에 대한 리간드)는 활성화된 인체 CD4+T 세포에서 발현된다. 본 실시예에 따른 재조합 gp39로 면역화된 제노마우스의 혈청은 완전한 인체 가변부를 가진 gp39에 대해 면역특이적인 항체를 함유하고 있었다; 이 혈청은 완전한 인체 IgM 항체 및 인체 가변부와 쥐의 불변부 중쇄 γ영역을 함유하는 키메라 IgG 항체를 함유하였다.
항원은 도 10에 도시한 바와 같은 포유류 발현 벡터 P1K1.HUgp39/IRES NEO에 클로닝된 gp39 cDNA를 발현하는 CHO 세포 또는 300.19 세포의 안정한 형질감염체로 구성된다. CHO 세포는 형질감염시키기 전에, 글리신, 히포크산틴 및 티미딘이 추가 보강된 4.5g/l 글루코스, 10% PBS, 2mM 글루타민, MEM, NEAA를 함유하는 DMEM중에 1:10으로 희석하였다. 이 세포를 칼슘 포스페이트 형질감염법을 사용하여 9㎍/평판10㎝(6×105세포)의 gp39 벡터 및 1㎍/평판 10cm의 DHFR 발현 벡터 pSV2DHFR (Subranani et al., Mol Cell Biol(1981) 9:854)로 동시형질감염시켰다. 24시간 후 이 세포를, G418 0.6mg/ml를 함유하는 모배지에 1:10으로 희석하였다. gp39를 생성하는 세포는 항-gp39 항체를 사용하여 FACS로 분류하였다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 그룹화한 마우스를 목의 기저부를 통해 경피적으로 1차 면역하고 2차 복강내 주입액은 2 내지 3주 간격으로 투여하여 gp39를 발현하는 300.19 세포로 면역화하였다. ELISA 분석을 위해 실시예 1에 기재된 바와 같이 혈청을 수집하였다. ELISA 절차는 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다: 4.5g/l 글루코스, 10% FCS, 4mM 글루타민 및 MEM에 대한 비필수 아미노산(NEAA) 용액(100X)으로 이루어진 DMEM 배지를 함유하는 100mm 접시중에서 증식시킨 gp39를 발현하는 CHO 세포로 미량역가 평판을 피복하였다. ELISA 분석을 하기 이전 날에, 세포를 트립신 처리하고 96웰 여과 평판에 105세포/200㎕웰을 평판배양하고 37℃에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 양성 대조군은 마우스 항인체 gp39이고; 음성 대조군은 gp39이외의 다른 항원으로 면역화된 마우스로부터 채취한 항혈청이다. 각 분석에 시료 50㎕를 사용하였다. 이 분석에 있어서 나머지 단계들은 실시예 1에서와 같이 실시하였다.
gp39로 면역화된 마우스로부터 4회 주입액을 CHO 세포에서 발현시킨 후 수득된 혈청에 대한 희석 곡선은 도 11에 도시하였다. 도시된 바와 같이, 이 혈청은 HRP에 결합된 인체 κ 및 인체 μ쇄의 항체로 검출할 수 있는 항인체 gp39 면역특이성을 함유하고 있었다.
또한, 혈청을 FACS 분석을 사용하여 PBMC중에 함유된 활성화된 인체 T 세포와 반응하는 작용에 대해 시험하였다. PBMC를 제조하기 위하여, 인체 말초 혈액은 정상인 지원자로부터 100 유니트/ml 의 헤파린을 사용하여 회수하였다. PBMC는 Ficoll 구배로 분리하고 3㎍/ml PHA, IMDM + 10% PBS + 25μM의 2-머캅토에탄올중의 1㎍/ml PMA를 사용하여 4시간동안 활성화시켰다. 이것을 세정한 후, PBMC는 FITC로 표지된 인체 CD4에 대하여 생성된 마우스 Mab로 염색하여 CD4+및 CD4-인체 T 세포를 분리하였다.
그 다음 활성화된 CD4+및 CD4-T 세포를 다음중 어느 한 물질로 염색하여 FACS로 분석하였다:
1) gp39를 생성하는 300.19 세포로 면역화된 XenoMouseTM유래의 항혈청;
2) 양성 대조군으로서, α-CD40L(인체 gp39)에 대해 지향성인 마우스 Mab; 및
3) 음성 대조군으로서, TNF로 면역화된 XenoMouseTM유래의 항혈청.
FACS 분석중의 검출 항체는 염소 항마우스 IgG(PE)였다. 그 결과는 도 12에 도시한다.
도 12A에 도시한 바와 같이, FACS 분석을 하기 이전에 CD4+(R2) 및 CD4-(R3) 세포를 분리하였다. 패널 B는 CD4+세포에 대한 결과로서, gp39로 면역화된 마우스 유래의 혈청(도면에서 A247-4로 표지함)이 상기 활성화된 CD4+T 세포와 반응한다는 것을 보여주고 있으며; 패널 C는 이 혈청이 CD4-세포와 반응하지 않는다는 것을 나타낸다. 이 항체들은 쥐의 중쇄 γ 불변부를 운반한다. 또한, 패널 B 및 C의 결과는 TNF-주입된 XenoMouseTM가 gp39에 대한 항체를 만들지 않는다는 것을 확인시켜 주고 있다.
실시예 7
파상풍 독소에 대한 고친화성 인체 Mab들의 제법
본 실시예에서 제조한 항체는 파상풍 독소로 면역화된 제노마우스 유래의 무한증식성 B 세포로 수득한 하이브리도마에 의해 분비되었다. 면역화 프로토콜은 실시예 1에 기재된 바와 유사하나, 복강내 1차 면역화에 완전 프로인트 보조제중에 유탁화시킨 50㎍ 파상풍 독소를 사용한 다음, 그 이후의 복강내 주입액에는 불완전 프로인트 보조제중에 함유된 항원을 사용하였다. 이 마우스에게 총 4회의 주입액을 2 내지 3주 간격으로 투여하였다.
항파상풍 독소 C(항-TTC)의 유효 혈청 역가를 수득한 후, PBS 중에 항원의 최종 면역화 투여량을, 동물을 죽이기 전 4일전에 투여하고, 융합에 사용하기 위해 비장을 회수하였다.
이 비장 세포를 문헌[Galfre, G. and Milstein, C. Methods in Enzymology(1981) 73:3-46]에 기재된 바와 같이 골수종 세포 P3X63-Ag8.653과 융합시켰다.
융합 후, 세포를 배양하기 위해, 글루타민, pen/strep을 보강한 HAT를 함유하는 15% FCS로 이루어진 DMEM 중에 재현탁시켜 37℃ 및 10% CO2하에 처리하였다. 이 세포를 미량역가 평판에 주입하고 HAT-보강 배지중에서 2주 동안 유지시킨 다음, HAT-보강 배지로 전이시켰다. 하이브리도마를 함유하는 웰로부터 수득한 상청액을 수집하여 ELISA를 사용하여 1차 선별하였다.
ELISA는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였고, 항원 코팅물은 피복 완충액중에 함유된 2㎎/ml의 파상풍 독소 C(TTC) 단백질 100㎕/웰를 첨가한 다음, 4℃에서 하룻밤동안 항온처리하거나 37℃에서 2시간동안 항온처리하였다. 1차 ELISA에는 실시예 1에 기재된 바와 같이 HRP-결합된 마우스 항인체 IgM을 사용하였다. ELISA 분석에 따라 항-TTC를 분비하는 2개의 하이브리도마, 클론 D5.1 및 클론 K4.1을 사용하여 추가 분석하였다.
도 13에 도시된 바와 같이, 클론 D5.1은 HRP-결합된 항인체 μ쇄 항체 및 HRP-결합된 항인체 κ쇄 항체를 사용하여 검출가능한 완전한 인체 항-TTC를 분비한다. 이것은 도 18 및 19에서 확인된다. 도 14는 클론 K4.1이 항쥐 γ 및 항인체 κ HRP-결합된 항체와 면역반응성인 항-TTC를 분비한다는 것을 나타낸다. 따라서, 클론 K4.1은 도 16 및 도 17에 확인되는 바와 같은 인체 가변부 및 쥐의 불변부 중쇄 γ 영역을 가진 항-TTC를 완전하게 제공한다.
D5.1 및 K4.1에 의해 분비되는 항체는, 양성 대조군(각각 TNFα, IL-6 및 IL-8로 면역화된 제노마우스 유래의 혈청)이 양성 ELISA 결과를 나타내는 조건하에서 고정화된 항원으로서 TNFα, IL-6 또는 IL-8을 사용한 ELISA중에서는 면역반응하지 않았다.
TTC 항원에 대해 K4.1에 의해 분비되는 모노클로널 항체의 친화성은 시판용 시약과 기구를 사용하여 측정하였다. BIAcore 기구, CM5 센서 칩, 계면활성제 P20 및 아민 결합 키트는 파마시아 바이오센서(뉴저지 피스카타웨이 소재)에서 구입하였다. TTC는 제조업자의 지시에 따라 센서 칩의 표면상에 2가지 항원 농도로 고정시켰다. 간략히 설명하면, 기구를 계면활성제를 함유하는 완충액으로 세정 및 평형화한 후, 표면을 활성화시키고 TTC를 고정시킨다.
항원 농도가 높은 경우, 표면은 동등 부피의 0.1M NHS와 0.1M EDC 35㎕를 표면을 따라 주입한 다음, 10mM 아세트산 나트륨 완충액 pH5.0중에 함유된 100㎍/ml의 TTC 단편을 30㎕ 주입하여 활성화시켰다. 이 표면에 1M 에탄올아민 35㎕를 주입하여 표면을 차단시키고 0.1M HCl 5㎕로 세정하여 비공유결합된 TTC를 제거하였다. 전체 고정화 절차는 5㎕/분의 완충액 연속류를 사용하여 수행하였다. 그 결과 칩당 약 7500 내지 8500 응답 단위(RU)의 TTC를 산출하였다(1000 RU는 1㎟당 단백질 약 1ng에 상응한다).
항원 농도가 낮은 칩의 경우에 있어서, 상기 방법에는 30㎕의 TTC보다는 15㎕를 사용하여 생성되는 칩에는 550 내지 950 RU를 함유하게 된다.
칩은 단독 측정에 사용된 후 10㎕ 포르말이나 MgCl2를 주입하여 재생시킬 수 있다.
이 칩은 고정화된 TTC에 대한 항체의 Ka및 Kb(결합 및 해리 속도 상수)를 측정하여 결합 친화성을 결정하는데 사용하였다. 결합 속도 상수는 2.16nm 내지 69.33nm 범위의 다양한 K4.1 Mab 농도에서 5㎕/분의 유속으로 6분간에 걸쳐 측정한다. 해리속도 상수는 항체 주입 완료후 5㎕/분의 일정한 완충액 유속하에 측정한다. 산출되는 원 데이터는 도 15에 그래프로 도시하였고, 계산된 결과는 표 1에 나타낸다.
2가지 다른 표면에 대해 BIAcore를 사용하여 측정한 K4.1의 속도 상수
고정화된 파상풍 독소C K4.1 농도 범위 nM 결합 속도 Ka(105M-1s-1) 해리 속도 Kd(105s-1) 결합 상수 KA(M-1) = ka/kd 해리 상수 KD(M) = kd/ka
931 RU 4.3 - 34.7 6.47±1.05 4.02±1.42 1.6 x 1010 0.62 x 10-10
868 RU 4.3 - 34.7 7.19±2.18 2.02±1.01 3.5 x 1010 0.28 x 10-10
상기 나타낸 바와 같이, K4.1 항체는 1010M-1보다 다소 큰 TTC에 대한 결합 상수(Ka)를 갖고 있다.
K4.1 및 D5.1 모노클로널의 중쇄 및 경쇄를 암호하는 cDNA들의 완전한 뉴클레오티드 서열은 도 16 내지 도 19에 도시한 바와 같이 결정되었다. 폴리A mRNA는 약 106하이브리도마 세포로부터 분리하고 프라이머로서 랜덤 6량체를 사용하여 cDNA를 생성하는데 이용하였다. 생성물의 일부를 적절한 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.
상기 두 세포주는 인체 κ 경쇄를 제공하는 것으로 나타났다; 경쇄를 암호하는 cDNA의 PCR 증폭을 위해 사용한 프라이머는 불변부 말단을 개시시키는데 사용된 HKP1(5'-CTCTGTGACACTCTCCTGGGAGTT-3') 및 가변 단편을 개시시키는데 동량으로 사용된 2개의 올리고, 즉 B3(5'-CCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCA-3') 및 B2/B1(5'-GAAA CGACACTCACGCAGTCTCCAGC-3')이다.
K4.1 유래의 중쇄(쥐의 γ1 불변부를 함유함)를 증폭시키는데 있어서, 프라이머는 인체 가변부에 대한 MG-24Vi, 즉 5'-CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCiGG-3'로서, 이것은 나타낸 바와 같이 이노신과 함께 인체 가변부 VH1-2, VH1-3, VH4, 및 VH6을 인식하고, 불변부에 대해서는 이노신을 함유하는 MG-25, 즉 5'-GCACACCGCTGGACAGGGATCCAiGTTTC-3'는 쥐의 γ1, γ2A, γ2B 및 γ3을 인식한다.
클론 D5.1 유래의 항체의 중쇄(인체 μ 불변부를 함유)를 증폭시키는데 있어서, 가변부를 개시시키는데에는 MG-24VI를 사용하였고, 불변부 영역의 말단을 개시시키는데에는 μP1(5'-TTTTCTTTGTTGCCGTTGGGGTGC-3')을 사용하였다.
먼저, K4.1에 의해 분비된 Mab의 중쇄를 나타내는 도 16에 도시된 서열을 살펴보면, 이 서열은 인체 가변부 단편 VH6, 인체 다변성 영역 DN1과 쥐의 γ1 불변부에 연결된 인체 결합 단편 JH4의 존재를 보여주고 있다. 공지된 배선(germline) 서열과 상이한 9개의 염기쌍 돌연변이가 가변부에 존재하는 것으로 나타났으며, 이중 2개는 CDR2내에 존재하였다. 이중 1개의 돌연변이는 D 단편에서 관찰되었다. 또한, DH-JH결합부에 비배선 유래의 3개의 부가 뉴클레오티드가 존재하였다.
K4.1 항체의 경쇄를 나타내는 도 17을 살펴보면, 인체 κ 가변부 B3과 결합부 JK4의 존재를 나타낸다. VK-JK결합부에서는 B3으로부터 8개의 뉴클레오티드가 결실되어 있고, 가변부에서는 4개의 돌연변이가 관찰되었다. 비배선 유래의 5개의 부가 뉴클레오티드가 VK-JK결합부에 존재하였다.
클론 D5.1에 의해 분비된 항체의 중쇄 서열을 기재한 도 18을 살펴보면, 중쇄는 인체 가변부 단편 VH6, 인체 다변성 영역 DN1과 인체 μ 불변부에 결합된 인체 결합 단편 JH4의 존재를 보여주고 있다. 배선 서열과 상이한 2개의 염기쌍 돌연변이가 가변부에 존재하는 것으로 나타났으며, 둘다 CDR내에 존재하였다. 2개의 부가 돌연변이는 D 단편에서 관찰되었고, DH-JH결합부에는 비배선 유래의 6개의 부가 뉴클레오티드가 존재하였다.
마지막으로, D5.1에 의해 분비되는 항체의 경쇄를 나타내는 도 19에서는 인체 κ 가변부 B3과 인체 κ 결합부 JK3을 도시하고 있다. 배선 서열과는 9개의 염기쌍의 차이가 있고, 3개는 CDR1에 포함되어 있다.
실시예 8
IgE에 대한 인체 항체의 생산
A. 마우스의 면역화
면역글로불린 좌 유래의 통합된 인체 DNA를 함유하는 배선 키메라 마우스에게 보조제중에 함유된 인체 IgE/λ를 15 내지 20㎍ 주입하여 면역화시켰다. 이 마우스를 1차 면역화한 후 14일 마다 인체 IgE/λ 15 내지 20㎍으로 추가항원자극하였다. 이와 같이 면역화된 동물로부터 채혈하여 인체 IgE/λ에 대한 혈청 항체의 역가를 시험하였다. 최고 역가를 가진 마우스를 죽이고 비장을 분리하였다.
B. 비장세포의 융합
비장 세포의 융합 파트너로서 사용한 골수종 세포, 주 P3X63-Ag8.653은 융합에 사용하기 6일전에 해동시켜 조직 배양으로 증식시켰다. 융합하기 1일 전에는 세포를 10% 태내 송아지 혈청(FCS)을 함유하는 새로운 배지중에 1:3의 비로 희석시켰다.
마우스를 죽인 후 비장은 무균적으로 분리하여 무혈청 배지를 함유하는 배양접시중에 놓았다. 2개의 냉동 현미경 슬라이드사이에 비장을 놓고 이를 부드럽게 연마하여 단세포 현탁액을 만들었다. 이 세포를 새로운 무혈청 배지로 세정하고, 적혈구 세포를 용해시킨 다음 파편은 여과제거하였다.
비장세포는 무혈청 배지중에서 원심분리하여 추가 2회 세정하였다. 이 때, 골수종 세포도 또한 무혈청 배지로 세정하였다. 각 세포를 계수하고 1:3(골수종 대 비장세포)의 비율로 혼합한 뒤, 천천히 혼합하고 이것을 함께 1회 원심분리하였다.
생성되는 세포 펠릿에 40% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 용액을 서서히 첨가하여 세포를 1분 이상에 걸쳐 부드럽게 재현탁시켰다. 세포를 PEG 용액중에서 1분동안 실온하에 항온처리하고 그 다음 5ml의 무혈청 배지중에 5분간에 걸쳐 서서히 희석하였다. 다음 90초에 걸쳐 5ml 이상을 첨가하였다. 세포를 5분동안 실온에서 항온처리하였다. 이 세포를 저속으로 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 세포를 다시 10% FCS, 1X OPI, 1X NE 아미노산과 10 mM HEPES를 함유하는 하이브리도마액 5ml에 서서히 매우 완만하게 재현탁시켰다. 세포를 1X HAT 용액(히포크산틴, 아미노프테린과 티미딘)을 함유하는 하이브리도마 액으로 최종 100ml 부피로 추가 희석하였다. 이와 같이 제조한 융합 세포를 96-2311 평판에 100㎕/웰씩 주입하여 37℃ 및 10% CO2에서 항온처리하였다. 세포를 융합후 10일째 1X HT(히포크산틴 및 티미딘)를 함유하는 하이브리도마액 100㎕/웰에 첨가하여 선별하기 전에 세포가 융합성이 될때까지 증식시켰다.
상청액을 각각의 증식 웰로부터 무균적으로 취하고 완전한 인체 항체의 존재에 대해 시험하였다. 양성 웰은 인체 IgE/λ 특이성에 대해 추가 시험하였다. 양성 웰을 확인하였을 때, 세포를 96-웰의 평판으로부터 48웰 평판에 포함된 1X HT를 함유하는 하이브리도마 액 0.5ml로 전이시켰다. 이 단계에서 세포를 한계 희석법으로 96웰 평판으로 서브클로닝시켜 단일 항체 생산 세포를 배양물중에 생성시켰다. 배양물이 응집성이 되었을 때, 세포를 1ml, 3ml, 5ml등으로 증량시키고, 그 일정량을 동결시켜 액체 질소중에 저장하여 세포 모액으로서 보존하였다.
전술한 절차를 사용하여 전술한 항원에 특이적인 항체를 제조하였다.
전술한 절차에 따라서, 인체 IgE/λ에 대한 인체 항체를 생산하는 마우스 하이브리도마를 수득하였다.
전술한 절차에 따라서, 면역원에 대해 특이적인 인체 항체 또는 유사체를 생산하도록 면역화될 수 있는 키메라 비인체 숙주, 특히 쥐 숙주를 생산할 수 있다. 이 방법을 사용하면, 돌연변이 숙주가 인체 숙주에 대해서는 사용할 수 없는 면역원으로도 면역화시킬 수 있기 때문에 인체 모노클로널 항체를 수득하는데 있어서의 문제점을 피할 수 있다. 또한, 인체 숙주에는 허용되지 않는 보조제와 추가 항원 자극 주입액을 사용할 수도 있다. 그 다음 생성되는 B 세포를 무한증식화하는데 사용하여 목적 항체를 연속 생산할 수 있다. 이와 같은 무한증식성 세포는 면역글로불린이나 유사체를 암호하는 유전자를 분리하는데 사용할 수 있으며, 시험관내 돌연변이 유발법이나 다른 기법등의 방법으로 추가로 분자적 수사시켜 항체의 성질을 변화시킬 수 있다. 이와 같이 수사된 유전자를 사용하여 그 다음 무한증식성의 세포를 형질감염시켜 목적 항체를 연속 생산하는 포유류 세포원을 제공할 수 있다. 본 발명은 편리한 인체 항체원을 제공하며, 여기에서 인체 항체는 인체 숙주중에서 항체를 생산하는 것과 유사한 방식으로 생성된다. 동물 숙주 세포는 편리하게는 인체 항체를 생산하는 숙주 세포내에서 인체 DNA를 활성화시키고 재배열한다.
본 발명에 따르면, 인체 항체는 인체 면역원으로 당해 숙주 포유류를 면역화키므로써, 예컨대, 단백질과 같은 인체 면역원으로 생산할 수 있다. 생성되는 항혈청은 인체 면역원에 특이적인 것으로, 숙주의 혈청으로부터 수거할 수 있다. 면역화된 숙주 B 세포는 예컨대, 골수종 세포 융합, 형질감염등의 방법으로 무한증식화하는데 사용하여 모노클로널 항체를 생산하는 하이브리도마와 같은 무한증식 세포를 제공할 수 있다. 항체를 생성하는 세포종에 따라 항체, 항혈청 및 모노클로널 항체를 글리코실화할 수 있다. Ig좌의 희귀 가변부는 항체를 생산하는데 보충으로 보강하여 희귀 가변부를 가진 항체를 생성할 수도 있다.
본원에 인용된 모든 공보와 특허 출원 명세서는 그 개개의 공보와 출원명세서가 각각 참고적으로 포함되는 것으로 나타냈지만 모두 본원의 참고문헌에 속하는 것이다.

Claims (49)

  1. 면역 반응을 자극하는 조건하에서 목적 항원이나 이의 면역원성 부를 인간을 제외한 동물에게 투여하여, 상기 항원에 특이적인 면역글로불린을 분비하는 B 세포를 상기 동물이 생성하도록 하며, 이 때 상기 인간을 제외한 동물이 내인성의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변부는 실질적으로 생성할 수 없으나, 인체 면역글로불린 가변부는 생성할 수 있는 것을 특징으로 하는 단계;
    상기 면역글로불린이나 그 유사체를 회수하는 단계로 구성되어, 목적 항원에 특이적인 완전한 인체 가변부를 가진 면역글로불린이나 이의 유사체를 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 회수 단계가 상기 동물로부터 폴리클로날 면역글로불린이나 이의 유사체를 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 회수 단계가 상기 항원으로 면역화된 동물로부터 유래된 B 세포를 무한증식시키는 단계, 산출되는 무한증식성 세포를 상기 항원에 특이적인 면역글로불린을 분비하는 지에 대해 선별하는 단계, 및 1) 상기 무한증식성 B 세포에 의해 분비된 면역글로불린을 회수하는 단계, 또는 2) 상기 무한증식성 B 세포로부터 최소한 상기 면역글로불린의 가변부를 암호하는 유전자를 회수하여, 이 유전자를 임의적으로 수사(modify)시키는 단계; 이 유전자 또는 이의 수사된 형태를 발현시켜 면역글로불린이나 이의 유사체를 생성하는 단계; 및 생성된 면역글로불린이나 이의 유사체를 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 회수 단계가 상기 항원으로 면역화된 동물의 1차 B 세포로부터 최소한 면역글로불린의 가변부를 암호하는 유전자를 회수하는 단계; 이 가변부를 발현하는 유전자의 라이브러리를 제조하는 단계; 항원에 바람직한 친화성을 가진 가변부를 라이브러리중에서 선별하는 단계; 상기 가변부를 암호하는 유전자를 복원하고 이 유전자를 임의적으로 수사시키는 단계; 이와 같이 복원된 유전자를 발현시켜 상기 가변부를 함유하는 면역글로불린이나 이의 유사체를 제조하고 이 면역글로불린이나 유사체를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 면역글로불린이 완전한 인체 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항의 방법으로 생성된 면역글로불린이나 이의 유사체를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  7. 목적 항원이나 이의 면역원성 부를, 면역반응을 자극하는 조건하에서 인간을 제외한 동물에게 투여하여, 이 동물에 의해 상기 항원에 특이적인 면역글로불린을 분비하는 B 세포를 생성하는 단계로서, 이 때 인간을 제외한 상기 동물이 인체 면역글로불린 가변부는 생성할 수 있으나, 내인성의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변부는 실질적으로 생성할 수 없는 것을 특징으로 하는 단계;
    상기 항원으로 면역화된 상기 동물 유래의 B 세포를 무한증식시키고, 생성되는 무한증식화된 세포를 상기 항원에 특이적인 면역글로불린의 분비에 대해 선별하는 단계; 및
    상기 면역글로불린의 가변부를 최소한 암호하는 유전자를 무한증식성의 B 세포로부터 복원시켜 이 유전자를 임의적으로 수사시키는 단계로 구성된 방법으로 제조된 유전자에 상응하는 암호 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자.
  8. 목적 항원이나 이의 면역원성 부를, 면역반응을 자극하는 조건하에서 인간을 제외한 동물에게 투여하여, 이 동물에 의해 상기 항원에 특이적인 면역글로불린을 분비하는 B 세포를 생성하는 단계로서, 이 때 인간을 제외한 상기 동물이 인체 면역글로불린 가변부는 생성할 수 있으나, 내인성의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변부는 실질적으로 생성할 수 없는 것을 특징으로 하는 단계;
    상기 항원으로 면역화된 동물의 1차 B 세포로부터 상기 면역글로불린의 가변부를 최소한 암호하는 유전자를 복원시키는 단계;
    상기 가변부를 발현하는 유전자의 라이브러리를 제조하는 단계;
    이 라이브러리중에서 상기 항원에 대해 바람직한 친화성을 가진 가변부를 선별하는 단계; 및
    상기 가변부를 암호하는 유전자를 회복시켜 그 유전자를 임의적으로 수사시키는 단계로 구성되는 방법에 의해 제조된 유전자에 상응하는 암호 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암호하는 뉴클레오티드 서열이 그 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
  10. 제9항의 DNA 분자를 함유하도록 수사된 세포 또는 세포주.
  11. 제10항의 세포를 일정 조건하에서 배양하여 암호 뉴클레오티드 서열의 발현으로 완전한 인체 가변부를 가진 면역글로불린이나 그 유사체를 생성시키는 단계; 및 이 면역글로불린이나 그 유사체를 회수하는 단계로 구성되어, 상기 면역글로불린이나 그 유사체를 생성하는 방법.
  12. 목적 항원이나 이의 면역원성 부를, 면역반응을 자극하는 조건하에서 인간을 제외한 동물에게 투여하여, 이 동물에 의해 상기 항원에 특이적인 면역글로불린을 분비하는 B 세포를 생성하는 단계로서, 이 때 인간을 제외한 상기 동물이 인체 면역글로불린 가변부는 생성할 수 있으나, 내인성의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변부는 실질적으로 생성할 수 없는 것을 특징으로 하는 단계;
    상기 항원으로 면역화된 상기 동물 유래의 B 세포를 무한증식시키고, 생성되는 무한증식화된 세포를 상기 항원에 특이적인 면역글로불린의 분비에 대해 선별하는 단계; 및
    상기 무한증식성의 B 세포를 회수하는 단계로 구성되는 방법에 의해 제조된 목적 항원에 대해 완전한 인체 가변부를 가진 면역글로불린을 분비하는 무한증식성 B 세포.
  13. 제12항에서 회수한 세포를 배양하여 생성된 면역글로불린이나 그 유사체를 회수하는 단계로 구성되어 면역글로불린이나 이의 유사체를 생성하는 방법.
  14. 제1항의 방법으로 생성되는 완전한 인체 가변부를 가진 면역글로불린 또는 그 유사체.
  15. 제14항에 있어서, 완전한 인체 유래인 것을 특징으로 하는 면역글로불린 또는 그 유사체.
  16. 제14항에 있어서, 면역글로불린이 작동물질 또는 촉매이거나, 키메라성인 것을 특징으로 하는 면역글로불린 또는 그 유사체.
  17. 제14항에 있어서, 목적 항원이 전이 상태 모사체; 백혈구 마커; 조직화합성 항원; 유착 분자; 인터루킨; 인터루킨 수용체; 케모킨; 성장 인자; 성장 인자 수용체; 인터페론 수용체; Ig 및 이의 수용체; 종양 항원; 알레르기 물질; 바이러스 단백질; 독소; 혈액 인자; 효소; 및 미셀형 항원 강글리오사이드 GD3, 강글리오사이드 GM2, LMP1, LMP2, 호산구 주요 염기성 단백질, 호산구 양이온 단백질, pANCA, 아마도리 단백질, 제 IV 형 콜라겐, 당화된 지질, λ-인터페론, A7, P-당단백질, Fas(AFO-1) 및 산화된-LDL로 구성된 군중에서 선택되는 것인 면역글로불린 또는 그 유사체.
  18. 제17항에 있어서, 백혈구 마커가 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD11a,b,c, CD13, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27 과 이의 리간드, CD28과 이의 리간드인 B7.1, B7.2, B7.3, CD29 와 이의 리간드, CD30 과 이의 리간드, CD40 과 이의 리간드인 gp39, CD44, CD45 및 이소형태, CDw52(캠패스 항원), CD56, CD58, CD69, CD72, CTLA-4, LFA-1 및 TCR로 구성된 군중에서 선택되고; 조직화합성 항원이 MHC 제 I 군 또는 제 II 군, 루이스 Y 항원, SLex, SLey, SLea 및 SLeb로 구성된 군중에서 선택되며; 유착분자가 VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-4, VLA-5, VLA-6, LFA-1, L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴과 이들의 대응 수용체 VCAM-1, ICAM-1, ICAM-2 및 LFA-3; Mac-1 및 p150, 95로 구성된 군중에서 선택되고; 인터루킨이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 및 IL-15로 구성된 군중에서 선택되며; 인터루킨 수용체가 IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-11R, IL-12R, IL-13R, IL-14R 및 IL-15R로 구성된 군중에서 선택되고; 케모킨이 PF4, RANTES, MIP1α, MCP1, NAP-2, Groα, Groβ 및 IL-8로 구성된 군중에서 선택되며; 성장 인자가 TNFα, TGFβ, TSH, VEGF/VPF, PTHrP, EGF군, FGF, PDGF군, 엔도텔린, 및 가스트린 방출 펩티드(GRP)로 구성된 군중에서 선택되고; 성장 인자 수용체가 TNFαR, RGFβR, TSHR, VEGFR/VPFR, FGFR, EGFR, PTHrPR, PDGFR군, EPO-R, GCSF-R 및 다른 조혈 수용체로 구성된 군중에서 선택되며; 인터페론 수용체가 IFNαR, IFNβR 및 IFNγR로 구성된 군중에서 선택되며; Ig 및 그 수용체가 IgE, FceRI 및 FCERII로 구성된 군중에서 선택되며; 종양 항원이 her2-neu, 뮤신, CEA 및 엔도시알린로 구성된 군중에서 선택되며; 알레르기성 물질이 집먼지진드기 항원, lol p1(목초) 항원, 및 우루시올로 구성된 군중에서 선택되며; 바이러스 단백질이 CMV 당단백질 B, H 및 gCIII, HIV-1 엔벨로프 당단백질, RSV 엔벨로프 당단백질, HSV 엔벨로프 당단백질, HPV 엔벨로프 당단백질, EBV 엔벨로프 당단백질, VZV 엔벨로프 당단백질, 간염류의 표면 항원로 구성된 군중에서 선택되며; 독소가 슈도모나스 내독소 및 오스테오폰틴/유로폰틴, 뱀독, 및 벌독으로 구성된 군중에서 선택되며; 혈액인자가 보체 C3b, 보체 C5a, 보체 C5b-9, Rh 인자, 피브리노겐, 피브린, 및 미엘린 결합된 성장 억제제로 구성된 군중에서 선택되며; 및 효소가 콜레스테롤 에스테르 전이 단백질, 막결합된 기질 메탈로프로테아제 및 글루탐산 탈탄산효소(GAD)로 구성된 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 또는 그 유사체.
  19. 제14항에 있어서, 목적 항원이 인체 IL-6, 인체 IL-8, 인체 TNFα, 인체 CD4, 인체 L-셀렉틴, 인체 gp39, 인체 IgE 및 파상풍 독소 C(TTC)로 구성된 군중에서 선택되는 면역글로불린 또는 그 유사체.
  20. 제15항 내지 제19항중 어느 하나의 항에 기재된 면역글로불린이나 이의 유사체를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자.
  21. 제20항에 있어서, 암호 뉴클레오티드 서열이 그 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
  22. 제21항의 DNA 분자를 함유하도록 수사된 세포 또는 세포주.
  23. 제22항의 세포 또는 세포주를 일정 조건하에서 배양하여 그 뉴클레오티드 서열의 발현으로 목적 항원에 특이적인 면역글로불린이나 이의 유사체를 생성하는 단계; 및 이 면역글로불린이나 이의 유사체를 회수하는 단계로 구성되어, 목적 항원에 특이적인 면역글로불린이나 이의 유사체를 생성하는 방법.
  24. 전이 상태 모사체; 백혈구 마커; 조직화합성 항원; 유착 분자; 인터루킨; 인터루킨 수용체; 케모킨; 성장 인자; 성장 인자 수용체; 인터페론 수용체; Ig 및 이의 수용체; 종양 항원; 알레르기 물질; 바이러스 단백질; 독소; 혈액 인자; 효소; 및 미셀형 항원 강글리오사이드 GD3, 강글리오사이드 GM2, LMP1, LMP2, 호산구 주요 염기성 단백질, 호산구 양이온 단백질, pANCA, 아마도리 단백질, 제 IV 형 콜라겐, 당화된 지질, γ-인터페론, A7, P-당단백질, Fas(AFO-1) 및 산화된-LDL로 구성된 군중에서 선택된 항원과 특이적으로 면역반응성인 완전한 인체 가변부를 함유하는 항체 또는 그 유사체.
  25. 제24항에 있어서, 백혈구 마커가 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD11a,b,c, CD13, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27 과 그 리간드, CD28과 그 리간드 B7.1, B7.2, B7.3, CD29 와 그 리간드, CD30과 그 리간드, CD40과 그 리간드 gp39, CD44, CD45 및 이소형태, CDw52(캠패쓰 항원), CD56, CD58, CD69, CD72, CTLA-4, LFA-1 및 TCR로 구성된 군중에서 선택되고; 조직화합성 항원이 MHC 제 I 군 또는 제 II 군, 루이스 Y 항원, SLex, SLey, SLea 및 SLeb로 구성된 군중에서 선택되며; 유착 분자는 VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-4, VLA-5, VLA-6, L-셀렉틴, P-셀렉틴, 및 E-셀렉틴과 이들의 대응수용체 VCAM-1, ICAM-1, ICAM-2 및 LFA-3; Mac-1 과 p150, 95로 구성된 군중에서 선택되고; 인터루킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 및 IL-15로 구성된 군중에서 선택되며; 인터루킨 수용체는 IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-11R, IL-12R, IL-13R, IL-14R 및 IL-15R로 구성된 군중에서 선택되고; 케모킨은 PF4, RANTES, MIP1α, MCP1, NAP-2, Groα, Groβ 및 IL-8로 구성된 군중에서 선택되며; 성장 인자는 TNFα, TGFβ, TSH, VEGF/VPF, PTHrP, EGF군, FGF, PDGF군, 엔도텔리아, 및 가스트린 방출 펩티드(GRP)로 구성된 군중에서 선택되고; 성장 인자 수용체는 TNFαR, RGFβR, TSHR, VEGFR/VPFR, FGFR, EGFR, PTHrPR, PDGFR군, EPO-R, GCSF-R 및 다른 조혈 수용체로 구성된 군중에서 선택되며; 인터페론 수용체는 IFNαR, IFNβR 및 IFNγR로 구성된 군중에서 선택되고; Ig 및 그 수용체는 IgE, FceRI 및 FceRII로 구성된 군중에서 선택되며; 종양 항원은 her2-neu, 뮤신, CEA 및 엔도시알린으로 구성된 군중에서 선택되고; 알레르기성 물질은 집먼지진드기 항원, lol p1(목초) 항원, 및 우루시올로 구성된 군중에서 선택되며; 바이러스 단백질은 CMV 당단백질 B, H 및 GCIII, HIV-1 엔벨로프 당단백질, RSV 엔벨로프 당단백질, HSV 엔벨로프 당단백질, EBV 엔벨로프 당단백질, VZV 엔벨로프 당단백질, HPV 엔벨로프 당단백질, 간염류의 표면 항원으로 구성된 군중에서 선택되고; 독소는 슈도모나스 내독소 및 오스테오폰틴/유로폰틴, 뱀독 및 벌독으로 구성된 군중에서 선택되며; 혈액인자는 보체 C3b, 보체 C5a, 보체 C5b-9, RH 인자, 피브리노겐, 피브린, 및 미엘린 결합된 성장 억제제로 구성된 군중에서 선택되고; 효소는 콜레스테롤 에스테르 전이 단백질, 막결합된 기질 메탈로프로테아제 및 글루탐산 탈탄산효소(GAD)로 구성된 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 유사체.
  26. 제24항에 있어서, 목적 항원이 인체 IL-6, 인체 IL-8, 인체 TNFα, 인체 CD4, 인체 L-셀렉틴, 인체 gp39, 인체 IgE 및 파상풍 독소 C(TTC)로 구성된 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 유사체.
  27. 제19항 또는 제26항에 있어서, 목적 항원이 인체 IL-6인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 유사체.
  28. 제19항 또는 제26항에 있어서, 목적 항원이 인체 IL-8인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 유사체.
  29. 제19항 또는 제26항에 있어서, 목적 항원이 인체 TNFα인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 유사체.
  30. 제19항 또는 제26항에 있어서, 목적 항원이 인체 CD4인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 유사체.
  31. 제19항 또는 제26항에 있어서, 목적 항원이 인체 L-셀렉틴인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 유사체.
  32. 제19항 또는 제26항에 있어서, 목적 항원이 인체 gp39인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 유사체.
  33. 제19항 또는 제26항에 있어서, 목적 항원이 파상풍 독소 C(TTC)인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 유사체.
  34. 제19항 또는 제26항에 있어서, 목적 항원이 인체 IgE인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 유사체.
  35. 제19항 또는 제26항에 있어서, 일본쇄 Fv인 것을 특징으로 하는 항체 유사체.
  36. 제24항에 있어서, 완전한 인체 유래인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 유사체.
  37. 제24항에 있어서, 항체 또는 유사체가 작동물질 또는 촉매이거나, 면역글로불린이 키메라성인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 유사체.
  38. 제26항 내지 제37항중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 그 유사체를 암호하는 재조합 DNA 분자.
  39. 제26항 내지 제37항중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 그 유사체를 생성하는 발현 시스템을 포함하고, 이 발현 시스템은 상기 항체 또는 그 유사체를 암호하는 뉴클레오티드 서열이 그 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 결합되어 있는 것인 재조합 DNA 분자.
  40. 제39항의 DNA 분자를 함유하도록 수사된 재조합 숙주 세포.
  41. 제40항의 세포를 일정 조건하에서 배양하여 암호 서열을 발현시키는 단계; 및 이로써 생성되는 항체 또는 그 유사체를 회수하는 것으로 구성되어, 항체 또는 그 유사체를 생성하는 방법.
  42. 인체를 생체내 예방, 치료 또는 진단하는데 있어서 제36항에 기재된 항체 또는 그 유사체의 용도.
  43. 포유류내의 자가면역 질환을 치료하는데 있어서, 제27항, 제29항, 제30항, 제31항 또는 제32항에 기재된 항체 또는 그 유사체의 용도.
  44. 제43항에 있어서, 자가면역 질환이 전신 홍반성 루푸스, 류마티스양 관절염, 건선, 쇼그렌 증후군, 공피증, 복합 결합 조직 질환, 피부근염, 다발성근염, 라이터 증후군, 베세트 질환, 당뇨병 제1형, 하시모토 갑상선염, 그레이브 질환, 다발성 경화증, 중증근무력증 또는 천포창인 것을 특징으로 하는 용도.
  45. 포유류내의 이식편 대 숙주 질환을 예방하거나, 기관 이식 거부 반응을 방지하거나, 또는 사구체 신염을 치료하는데 있어서의 제32항에 기재된 항체의 용도.
  46. 포유류내의 재관류 허혈을 치료하는데 있어서 제31항에 기재된 항체의 용도.
  47. 포유류내의 악액질, 패혈증 쇼크, 골수종, 신세포 종양, 골다공증 또는 파제트 질환을 치료하는데 있어서 제27항에 기재된 항체의 용도.
  48. 포유류내의 패혈증 쇼크, 악액질, 골다공증 또는 전신성 경화증을 치료하는데 있어서 제29항에 기재된 항체의 용도.
  49. 포유류내의 종양 전이상태를 예방하거나, 천식, 류마티스양 관절염, 사구체신염, 재관류 손상, 성인 호흡 곤란증 또는 전신성 경화증을 치료하는데 있어서 제28항에 기재된 항체의 용도.
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