KR19980703109A - 신규한 살충 조성물 및 바실러스 투링기엔시스 균주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis)의 바실러스 발효상등액중에 상기 균주의 실질적으로 모든 살충 활성이 존재하는 신규의 바실러스 투링기엔시스 균주에 관한 것이다. 이 균주는 콜레옵테라목 해충(들)에 대한 활성을 갖고, 바실러스 관련 살충제의 살충 활성을 강화시키는 물질을 생산한다. 추가로 본 발명은 상기 물질과 살충성 담체 또는 물질과 바실러스 관련 살충제, 화학 살충제 및/또는 살충 특성을 갖는 바이러스를 포함하는 살충 조성물 및 해충을 방제하기 위해 살충 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 출원인 본원중 참조로서 인용되고, 1994년 3월 14일 출원된 제08/212,462호의 부분 연속 출원인 1995년 3월 14일 출원도니 제08/404,076호의 부분 연속 출원이다.
매년 만연한 해충으로 식품, 섬유 및 다양한 국내의 식물을 포함하는 상업적으로 중요한 다량의 농경 작물을 손실함으로써 수만 달러를 손실한다. 이와 같은 해충을 방제하기 위한 시도로 다양한 방책이 사용되어 왔다.
한 방책으로 광범위한 스펙트럼의 살충제, 예를 들면 다양한 활성의 화학 살충제를 사용한다. 그러나 이와 같은 화학 살충제의 사용에는 다수의 불이익이 있다. 특히, 광범위한 스펙트럼의 활성 때문에 살충제는 이로운 곤충 및 해충의 기생충과 같은 비목적 미생물을 박멸할 수 있다. 또한 화학 살충제는 종종 인축에게 유독하고, 이러한 물질에 반복적으로 노출될 경우 목적 해충을 내성을 갖게 된다.
다른 방책은 농작물에 만연한 곤충, 진균 및 잡초를 방제하기 위한 천연적으로 발생하는 병원균을 이용하는 생물 살충제를 사용하는 것이다. 생물학적 살충제는 독성물질, 즉 해충에 대해 유독한 물질을 생성하는 세균을 포함한다. 일반적으로 생물학적 살충제는 화학 살충제 보다 비목적 미생물과 모든 환경에 덜 유해하다.
가장 다양하게 사용되는 생물학적 살충제는 바실러스 투링기엔시스(B.t.)이다. B.t.는 널리 분포되었고, 막대 모양, 호기성 및 포자 형성 미생물이다. 포자 형성 주기 동안 B.t.는 곤충 유충을 죽이는 결정성 델타-엔도톡신으로 공지된 단백질을 생성한다. 그러므로 B.t.는 농업용 살충제로 유용하다.
일부 균주, 예를 들면 바실러스 투링기엔시스 아종 쿠르스타키(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki)와 바실러스 투링기엔시스 아종 아이자와이(aizawai)는 레피돕테라에 대해 특이적이라고 밝혀졌다. 바실러스 투링기엔시스 아종 이스라엘렌시스(israelensis)는 디프테리아(Goldberg, U.S. Patent No. 4,166,112)에 대해 특이적이라고 밝혀졌다. 다른 균주, 예를 들면 바실러스 투링기엔시스 아종 테네브리오니스(tenebriones, Krieg et al., 1988, U.S. Patent No. 4,766,203)는 콜레옵테라에 대해 특이적이라고 밝혀졌다. 다른 콜라옵테라에 유독한 바실러스 투링기엔시스 균주의 동정은 1986년에 문헌(참조; Hernnstadt et al. Bio/Thechnology vol. 4,305-308, 1986, US patent 4,764,372, 1988)에 보고되었다. 바실러스 투링기엔시스 아종 산디에고(san diego)로 지정된 이 균주 M-7은 수탁번호 NRRL B-15939로 NRRL(Nothern Regional Research Laboratory, U.S.A.)에 수탁되었다. 그러나 '372 특허의 양수인 마이코겐, 코포레이션(Mycogen, Corp.)은 바실러스 투링기엔시스 아종 산디에고가 바실러스 투링기엔시스 아종 테네브리오니스임을 공개적으로 인정하였다. 추가로 '372 특허는 노보 노르디스크 A/S(Novo Nordisk A/S)로 양도하였다. 또한 레피돕테라와 콜레옵테라에 대해 유독한 B.t. 균주가 기술되어 있다(PCT Application No. WO 90/13651). PCT 특허원 제 WO 90/13651호에서 기술된 독성물질은 분자량 81kd이다.
포자 형성 주기 동안 B.t.는 분자량 27 내지 140kd인 결정성의 델타-엔도톡신으로 공지된 결정형 단백질을 생성하고, 이의 섭취로 인해 유충을 사멸시킨다. 독성 활성은 주어진 B.t. 균주에서의 하나 이상의 이러한 델타-엔도톡신이 있다. 대부분의 델타-엔도톡신은 표적 곤충의 중장에서 단백질 가수분해로 더 작은 독성 폴리펩티드(잘려진)로 전환되는 프로톡신이다(참조; Hofte and Whiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255). 델타-엔도톡신은 cry(결정성 단백질) 유전자에 의해 암호화 된다. cry 유전자는 구조적 유사성과 살충적 특이성을 근거로 6부류와 몇종의 아류로 나뉘어진다. 주요 부류는 레피돕테라-특이성(cry I), 레피돕테라-와 디프테라-특이성(cyrII), 콜레옵테라-특이성(cryIII), 디프테라 특이성(cryIV)(참조; Hofte and Whiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255), 콜레옵테라- 및 레피돕테라-특이성(참조; cryV 유전자 by Taylor et al., 1992, Molecular Microbiology 6:1211-1217) 및 네마토드-특이성(참조; cryV와 cryVI by Feitelson et al., 1992 Bio/Thechnology 10:271-275) 유전자이다.
델타-엔도톡신은 재조합 DNA 법에 의해서 생성된다. 재조합 DNA 법에 의해서 생성된 델타-엔도톡신은 결정형이거나 아닐 수 있다.
B.t. 델타-엔도톡신은 알칼리 pH 이외에서를 제외하고 비수용성이고, 거의 언제나 플라스미드 암호화된다. 일부 바실러스 투링기엔시스 균주는 열 안정성 살충성 아데닌 뉴클레오타이드 동족체, 즉 그 자체로 살충성인 β-엑소톡신 또는 투링기엔신으로 공지된 물질을 생성한다고 밝혀졌다(참조; sebesta et al., in H.D. Burges(ed.), Microbial Control of Pests and Plant Disease, Academic Press, New York p. 249-281, 1981). β-엑소톡신은 바실러스 투링기엔시스 배양 상등액에서 발견된다. 분자량 789이고, 아데노신, 글루코스 및 알라르산으로 구성된다(참조; Luthy et al., in Kurstak(ed.), Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, pp. 35-72). 이의 숙주범위는 무스카 도메스티카(Musca domestica), 마메스트라 콘피규라타 워커(Mamestra configurata Walker), 테트라니쿠스 울티카(Tetranychus urticae), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 및 테트라니쿠스 신나바리너스(Tetranichus cinnabarinus)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. β-엑소톡신의 독성은 ATP와의 경쟁으로 인한 DNA-유도 RNA 폴리머라제의 억제에 의한 것으로 생각된다. β-엑소톡신은 5가지 바실러스 투링기엔시스(B.t.) 균주내에서 Cry 플라스미드에 의해 암호화되고, β-엑소톡신은 타입 I 또는 타입 II β-엑소톡신으로 분류될 수 있다고 문헌(참조; Levinson et al., 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3170)에 밝혔다. β-엑소톡신 타입 I은 B.t. 아종 투링기엔시스 혈청형 1, B.t. 아종 톨월티 혈청형 9 및 B.t. 아종 담스타디엔시스 혈청형 10에 의해 생성된다고 밝혀졌다. β-엑소톡신 타입 II는 B.t. 아종 모리소니 혈청형 8ab에 의해 생성되고, 렙티노타르사 디셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata, colorado potato beetle)에 대한 활성이 있다. B.t.로부터 분리된 다른 수용성 물질은 무스카 도메스티카의 유충에 대해 유독한 α-엑소톡신(참조; Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8:1-7), 레시티네이즈, 키티네이즈 및 프로테이즈를 포함하는 다양한 가단백 분해성 효소인 γ-엑소톡신[이들의 독성 효과는 β-엑소톡신 또는 δ-엑소톡신과 배합하는 경우에만 나타낸다(참조; Forsberg et al., 1976, 바실러스 투링기엔시스: Its effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittee on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena)], β-엑소톡신과 유사한 구조를 갖고 렙티노타르사 디셈리네아타에 대해서도 활성이 있는 σ-엑소톡신(참조; Argauer et al., 1991, J. Entomol. Sci. 26:206-213), 및 무수투링기엔신(참조; Coll, Czechoslovak Chem. Comm. 40, 1775, 1975)이 포함된다.
WO 94/09630에서는 바실러스 투링기엔시스 변종 쿠르스타기 및 바실러스 투링기엔시스 변종 아이자와이의 활성을 강화하는 수용성 물질을 기술한다.
스토나드등은 문헌(참조;Stonard et al. 1994, In Natural and Engineered Pest Management Agents, Paul A. Mann, Robert M. Hollingworth, eds., ACS, Washington, D.C., pp. 25-36)에서 하기 화학식 1 또는 2의 구조를 갖는 디아브로티신(diabroticin)을 기술한다.
화학식 1인 경우 R, R1, R2= H, R3= OH (디아브로티신 A)
화학식 2의 경우 R, R1, R2, R3= H (디아브로티신 B)
디아브로티신은 바실러스 서브틸리스로부터 분리되고, 디아브로티카 운데심펀크타타(Diabrotica undecimpunctata), 렙티노타르사 디셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata), 안토머스그란디스 보헤만(Anthomus grandis Boheman), 모기 유충, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 마이크로코커스 루티아(Micrococcus lutea)에 대한 활성이 있으나 유럽의 옥수수 보러(borer), 에스케리챠 콜라이(Escherchia coli), 바실러스 서브틸리스 및 슈도모나스 에루기노사(pseudomonas aeruginosa)에 대한 활성이 있다. 스토날드(Stonard et al.)에서 기술하지 않은 디아브로티신 A의 다른 해충에 대한 활성은 또한 바실러스 세레우스(B. cereus)의 발효 배양액으로부터 분리한다.
당해 분야에서는 B.t. 제제의 증가된 치사율을 달성하기 위해 고심하고 있다. 이를 위한 수단은 치사율을 증가시키는 신규의 균주를 탐색하고, 이러한 균주를 조작하고 B.t. 포자 및/또는 결정을 신규한 살충성 담체 또는 화학 살충제와 배합하여 더욱 효과적인 제제를 고안하는 것을 포함한다.
본 발명의 목적은 공지된 B.t. 제제의 살충 활성을 개선하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 살충제의 살충 활성을 강화하는 것외에도 공지된 살충성 생성물의 신규한 용도를 발견하는 것이다.
신규한 물질을 생성하는 신규한 바실러스 투링기엔시스 균주를 분리함으로써 어떠한 해당 해충에 대한 더 넓은 스펙트럼의 생물학적 살충제가 존재하는 이점이 있다.
[발명의 요약]
본 발명은 바실러스 투링기엔시스 균주의 모든 실질적인 살충 활성이 상기 균주의 발효 상등액에 존재하는 신규한 바실러스 투링기엔시스 균주에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 투링기엔시스 균주의 발효로부터 수득한 단백질 결정과 포자는 어떤 살충 활성도 갖지 않는다. 특별한 양태에 있어서, 균주는 NRRL B-21090과 동일한 특성을 갖는 EMCC-0077 또는 실질적으로 EMCC-0077과 동일 성질의 이의 돌연변이체, NRRL B-21091과 동일한 특성을 갖는 EMCC-0078 또는 실질적으로 EMCC-0078과 동일 성질의 이의 돌연변이체, NRRL B-21092와 동일한 특성을 갖는 EMCC-0079 또는 실질적으로 EMCC-0079와 동일 성질의 이의 돌연변이체, NRRL B-21093과 동일한 특성을 갖는 EMCC-0080 또는 실질적으로 EMCC-0080과 동일 성질의 이의 돌연변이체, NRRL B-21094와 동일한 특성을 갖는 EMCC-0081 또는 실질적으로 EMCC-0081과 동일 성질의 이의 돌연변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
콜레옵테라목 해충에 대한 살충 활성을 갖고, 해충에 대해 다른 바실러스 관련 살충제와 함께 예를 들면 약효 증가제 또는 상승제로서 작용하는 물질은 상기 균주의 발효 상등액으로부터 수득한다. 바람직한 양태에 있어서, 상기 물질은 렙티노타르사 텍사나(Leptinotarsa texana)에 대해 126㎍(활성성분/총 물질g)의 LC50(LC50은 해충 50%를 죽이기 위해 필요한 살충제 물질의 농도)을 갖는다. 상기 균주의 발효액의 펠렛의 LC50은 생물학적 검정에 의해서 약 3000㎍ 활성성분/총물질g 이상이다.
다른 양태에 있어서, 상기 물질은 콜레옵테라목 해충에 대한 살충 활성을 갖는다. 대부분의 특정 양태에 있어서, 상기 물질은 디아브로티카 운데심펀크타타, 렙티노타르사 텍사나, 안토머스 그란디스(Anthomus grandis)의 콜레롭테라 해충 종에 대해 살충 활성이 있고, 놀랍게도 입스 칼리그라푸스(Ips calligraphus), 폽필리아 자포니쿠스(Popillia japonicus), 에필라크나 바리바스티스(Epilachna varivastis), 렙티노타르사 디셈리네아타 및 덴드목토너스 프론탈리스(Dendroctonus frontalis) 콜레옵테라 해충 종에 대해 활성이 있다.
특정 양태에 있어서, 상기 물질은 해충에 대해 바실러스 투링기엔시스 결정 델타-엔도톡신의 살충 활성을 강화한다. 특정 양태에 있어서, 상기 물질은 콜레옵테라목의 해충에 대한 바실러스 투링기엔시스 아종 테네브리오니스 결정성 델타-엔도톡신의 살충 활성을 강화한다.
본원에서 정의한 바실러스 관련 살충제는 바실러스(예; 바실러스 투링기엔시스 또는 바실러스 서브틸리스) 균주 또는 포자이다. 바실러스 관련 살충제는 또한 바실러스로부터 유도된 물질; 예를 들면 해충을 죽이거나 이러한 활성을 갖는 이의 단백질 또는 단편; 식물 보호를 제공하는 물질; 예를 들면 앤티피딩(antifeeding) 물질; 또는 해충을 죽이거나 이러한 활성을 갖는 바실러스의 단백질 또는 이의 단편(예; 바실러스 투링기엔시스 델타-엔도독신)을 암호화 하는 바실러스 유전자를 발현할 수 있는 미생물 및 허용되는 담체(조성물에 대해서는 하기 부분을 참조)일 수 있다. 해충은 예를 들면 곤충, 선충류, 진드기 또는 달팽이일 수 있다. 필로플란(phylloplane, 식물잎의 표면) 및/또는 리조스피어(rhyzosphere, 식물 뿌리 주변의 토양), 및/또는 수중 환경에서 서식하는 해충을 죽이거나 이러한 해충에 대해 살충 활성을 갖는 바실러스의 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 바실러스 유전자를 발현할 수 있는 미생물은 특정한 환경(작물과 다른 곤충 서식처)에서 야생형 미생물과 성공적으로 경쟁할 수 있고, 해충을 죽이거나 이러한 활성을 갖는 바실러스의 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 바실러스 유전자의 발현과 안정한 유지를 제공한다. 이와 같은 미생물의 예는 세균, 예를 들면 바실러스, 슈도모나스, 어위니아(Erwinia), 세라티아(Serratia), 크렙셀라(Krebshella), 잔토모나스(Xanthomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 라이조비움(Rhizobium), 로도슈도모나스(Rhodopeudomonas), 메틸로필러스(Methylophilus), 아그로박터(Agrobacter), 아세토박터(Acetobacter), 락토바실러스(Lactobacillus), 아르트로박터(Arthrobacter), 아조토박터(Azotobacter), 류코노스톡(Leuconostoc), 알칼리제네스(Alcaligenes) 및 클로스트리듐(Clostridium) 속, 조류, 예를 들면 시아노피세아(Cyanophyceae), 프로클로로피세아(Prochlorophyaceae), 로도피세아(Rhodophyacease), 디노피세아(Dianophyaceae), 크리소피세아(Chrysophyaceae), 프림네시오피세아(Prymnesiophyaceae), 으글레노피세아(Euglenophyaceae), 프라지노피세아(Prasinophyaceae) 및 클로로피세아(Chlorophyaceae) 종, 진균등, 특히 효모, 예를 들면 사카로마이세스(Saccharomyces), 크립토코커스(Cryptpcoccus), 클루베로마이세스(Kluveromyces), 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces), 로도토룰라(Rhodotorula) 및 아우레오바시디움(Aureobasidium) 속을 포함하나 이에 제한되진 않는다.
본 원에서 정의한 바대로, 살충 활성은 해충을 죽이거나 성장을 억제하거나 만연한 해충으로부터 식물을 보호하는, 해충에 대한 활성 양을 의미한다.
추가로 본 발명은 특정 물질과 바실러스 관련 살충제를 포함하는 살충 조성물 및 해충을 방제하기 위하여 살충 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로;
(a) 바실러스 투링기엔시스 균주를 적당한 성장 배지에서 배양하고,
(b) (a)의 상등액을 회수하고,
(c) 단계 (b)의 상등액을 칼럼 크로마토그래피하여 물질을 정제하는 단계를 포함하여 본 발명의 실질적으로 순수한 물질을 수득하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 원에서 정의한 바대로, 실질적으로 순수한 물질은 5% 이하의 오염물질을 함유하는 물질 예를 들면 델타-엔도톡신 단백질을 의미한다.
본 발명은 실질적으로 모든 살충 활성이 발효 상등액에 있는 신규한 균주 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis)에 관한 것이다. 균주는 콜레옵테라목의 해충에 대한 활성이 있고, 바실러스 관련 살충제의 살충 활성을 강화시키는 물질을 생성한다. 추가로 본 발명은 상기 물질과 살충성 담체 또는 물질과 바실러스 관련 살충제, 화학 살충제 및/또는 살충 특성을 갖는 바이러스를 포함하는 살충 조성물 및 이러한 조성물을 사용하여 해충을 방제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 특징, 양태 및 이점은 하기 설명, 첨부된 청구항 및 수반되는 도면과 관련하여 더 잘 이해하게 된다.
도 1은 화학식 1을 수득하기 위한 합성도를 나타낸 것이다.
도 2는 렙티노타르사 디셈리네아타에 대한 Ia/Ib와 노보도르(NOVODORTM) 상승작용의 효과를 나타낸다.
[물질의 수득]
물질은 NRRL B-21090과 동일한 특성을 갖는 B.t. 균주 EMCC-0077 또는 실질적으로 EMCC-0077과 동일 성질의 이의 돌연변이체, NRRL B-21091과 동일한 특성을 갖는 B.t. 균주 EMCC-0078 또는 실질적으로 EMCC-0078과 동일 성질의 이의 돌연변이체, NRRL B-21092와 동일한 특성을 갖는 B.t. 균주 EMCC-0079 또는 실질적으로 EMCC-0079와 동일 성질의 이의 돌연변이체, NRRL B-21093과 동일한 특성을 갖는 B.t. 균주 EMCC-0080 또는 실질적으로 EMCC-0080과 동일 성질의 이의 돌연변이체, NRRL B-21094와 동일한 특성을 갖는 B.t. 균주 EMCC-0081 또는 실질적으로 EMCC-0081과 동일 성질의 이의 돌연변이체를 포함하는 바실러스 투링기엔시스의 발효 상등액으로부터 수득할 수 있으나 이에 제한하지 않는다.
물질은 콜레옵테라목 해충에 대한 활성을 갖고, 예를 들면 약효 증가제 또는 상승제로서 바실러스 관련 살충제와 함께 작용한다. 특정 양태에 있어서, 물질은 하기 화학식 I의 화합물이다.
[화학식 1]
상기식에서,
R1은 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴(예: 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일)에스테르, 할로겐, C1-5알콕시 또는 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소류시닐, 페닐알라닐, 글리시닐 및 페닐글리시닐을 포함하나 이에 제한되지 않는 아미노산이고;
R2는 아미노 또는 알킬(C1-10)이고,
R3은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴(예: 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일)에스테르, 할로겐, C1-5알콕시, 메틸 아민, 디메틸 아민, 티오닐, 메틸 티오닐, 시아노 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이고;
R4는 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴(예: 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일)에스테르, 할로겐, C1-5알콕시 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이고;
R5는 수소, 메톡시, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴(예: 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일)에스테르, 할로겐 또는 C1-5알콕시이고;
R6은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬, 에스테르, 할로겐 또는 C1-5알콕시이고;
R7은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴(예: 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일)에스테르, 할로겐, C1-5알콕시 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이고;
R8은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴(예: 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일)에스테르, 할로겐, C1-5알콕시, 메틸 아민, 디메틸 아민, 티오닐, 메틸 티오닐, 시아노 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이고;
R9는 아미노 또는 알킬(C1-10)이고, 및;
R10은 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴(예: 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일)에스테르, 할로겐, C1-5알콕시 또는 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소류시닐, 페닐알라닐, 글리시닐 및 페닐글리시닐을 포함하는 아미노산이다.
피라진 질소는 임의로 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르,아릴(예: 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일)에스테르 또는 산소로 치환될 수 있다.
본 발명은 화학식 I의 화합물의 각각의 입체 이성질체형 라세미체로 넓혀서 이해할 수 있다.
대부분의 특정 양태에 있어서, 물질은 화학식 Ia, 이후에는 Ia로 간주하거나, Ib, 이후에는 Ib로 간주한다.
Ia : R, R1, R2, R3=H
Ib : R, R1, R2=H, R3=OH
바실러스 투링기엔시스는 당해 분야에서 공지된 배지와 발효 기술을 사용하여 배양될 수 있다(참조; Rogoff et al., 1969, J. Invertebrate Path. 14:122-129; Dulmage et al., 1971, J. Invertebrate Path. 18:353-358; Dulmage et al., in Microbial Control of Pests and Plant Diseases H.D. Burges, ed., Academic Press, N.Y., 1980). 발효 주기가 완료되면, 당해 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들면 원심분리 및/또는 초고속 원심분리로 발효액으로부터 B.t.의 포자와 결정을 분리하여 상등액을 회수할 수 있다. 상기 물질은 당해 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들면 초고속원심분리, 증발 및 분사 건조로 회수될 수 있는 상등액에 함유된다.
또한 본 발명의 물질은 당해 기술분야에서 공지된 방법을 사용하는 화학적 합성에 의해 수득된다.
화학식 I의 화합물을 수득하기 위하여, 다수의 반응, 예를 들면 알파-아미노카보닐 화합물의 자발적 축합반응으로 적합한 치환체와 보호 그룹을 갖는 단순 피라진 환을 형성한다. 디하이드로피라진 중간물질이 형성되나 산소에 의해 쉽게 산화되어, 피라진이 된다. 이 방법에 의한 단일 알파-아미노카보닐 화합물의 이합체화 반응은 단일 피라진을 생성시키고, 반면 두가지 상이한 알파-아미노카보닐 화합물과의 반응으로 3가지 생성물이 유도되고, 상기 물질은 크로마토그래피 분리(참조: 도 1)로 분리한다. 후자의 반응은 환의 각각의 면에 상이한 치환체를 갖는 피라진을 합성하게 한다.
물질의 정제는 당해 기술분야에서 공지된 다양한 방법, 예를 들면 크로마토그래피(예: 이온 교환, 흡착, 및 크기 배척 칼럼 크로마토그래피), 전기영동법, 용해도 분별, 추출 또는 당해 기술 분야에서 공지된 다른 표준 기술로 수행될 수 있으나 이에 제한되지 않는다(참조; Protein Purification, eds. J-C. Janson and Lars Ryden, VCH Publisher, New York, 1989).
상기 물질의 활성은 당해 기술분야에서 공지된 방법, 예를 들면 인공 식이 협조, 인공 식이 오버레이, 관엽에 도포, 관엽 침액 및 관엽에 분사를 사용하여 생물학적 검정을 수행할 수 있다. 이러한 생물학적 검정의 특정 실시예는 하기의 실시예 부분에서 기술한다.
[물질을 포함하는 조성물]
상기 물질을 단독으로, 상기 정의된 바대로 해충을 죽이거나 해충에 대해 이러한 활성을 갖는 바실러스 균주, 포자, 단백질 또는 이의 단편인 바실러스 관련 살충제 및 임의로 허용되는 담체와 함께 예를 들면 현탁액, 용액, 유액, 살포성 분말, 분산성 과립, 습윤성 분말, 유화성 농축물, 에어로졸 또는 함침된 과립으로 제형화될 수 있다. 이와 같은 바실러스 균주의 예는 바실러스 투링기엔시스 아종 쿠르스타키(구입: DIPELTMfrom Abbott laboratories, Inc., JAVELINTMfrom Sandoz, BIOTTTMfrom Novo Nordisk A/S, FORAYTMfrom Novo Nordisk A/S, MVPTMfrom Mycogen, BACTOSPEINETMfrom Nove Nordisk A/S, THURICIDETMfrom sandoz), 바실러스 투링기엔시스 아종 아이자와이(구입: FLORBACTMfrom Novo Nordisk A/S 및 XENTARITMfrom Abbott Laboratories, Inc.), 바실러스 투링기엔시스 아종 테네브리오니스(구입: NOVODORTMfrom Novo Nordisk A/S, TRIDENTTMfrom sandoz, M-TRAKTM및 M-ONETMfrom Mycogen), 바실러스 투링기엔시스 아종 이스라엘렌시스(구입:BACTIMOSTM또는 SKEETALTMfrom Novo Nordisk A/S, TEKNARTMfrom sandoz, 및 VECTOBACTMfrom Abbott Laboratories, Inc.), 바실러스 스파에리쿠스(구입: SPHERIMOSTMfrom Novo Nordisk A/S), 바실러스 투링기엔시스 아종 쿠르스타키/테네브리오니스(구입: FOILTMfrom Ecogen), 바실러스 투링기엔시스 아종 쿠르스타키/아이자와이(구입: CONDORTMfrom Ecogen 및 AGREETMfrom Ciba-Geigy) 및 바실러스 투링기엔시스 아종 쿠르스타키/쿠르스타키(구입: CUTLASSTMfrom Ecogen)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바실러스 관련 단백질은 CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV 및 CryVI을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 물질은 또한 다른 요인 또는 엑소톡신 및/또는 본원의 참조한 문헌(참조; application serial no. 08/095,240, filed July 20, 1993.)에서 기술한 강화 요인을 포함하는 바실러스 상등액으로부터 수득한 물질과 함께 제형화될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 임의로 제제는 또한 바실러스 관련 살충제, 화학 살충제 및/또는 살충제 성질을 갖는 바이러스 및 허용되는 담체를 포함한다.
특정 양태에 있어서, 상기 조성물의 성분은 상승작용을 할 수 있다. 그 결과 상기 조성물은 각각의 성분이 달성할 수 있는 것보다 더 많은 효능을 가질 수 있다. 상승작용은 또한 각각의 개개 성분에 대해 요구되는 것보다 더 적고/거나 덜 빈번한 복용 회수로 동량 또는 더 많은 효능을 내는 것으로 구체화 될 수 있다. 또한 상기 물질은 바실러스 관련 살충제를 강화시키는 작용을 한다.
물질 및 바실러스 관련 살충제를 포함하는 조성물에 있어서, 물질은 약 0.001 내지 300g/LTU 양으로 존재한다. 본원에서 정의한 바대로, LTU는 생물학적 검정으로 결정된 렙티노타르사 텍사나 단위이다. 생물학적 검정은 샘플을 기준시험 미생물로서 렙티노타르사 텍사나 또는 다른 해충을 사용하는 기준 바실러스 참조 물질과 비교하는 방법이다. 효능은 참조 표준 LC50을 나누고난 후 참조 표준 효능을 곱하므로 결정된다.
다른 양태에 있어서, 조성물은 실질적으로 순수한 형태 또는 바실러스로부터의 상등액의 건조, 농축 또는 액체 형태 및 적합한 살충성 담체를 포함할 수 있고, 이의 예는 하기에서 기술된다. 이 조성물은 단독으로 식물, 예를 들면 유전자 변이 식물에 적용될 수 있다. 특히, 조성물은 이미 바실러스 투링기엔시스 유전자를 함유하는 식물에 적용될 수 있다. 다른 양태에 있어서, 조성물은 바실러스 투링기엔시스 조성물에 이미 노출된 식물에 적용될 수 있다. 물질은 약 0.001% 내지 60%(w/w)의 농도의 조성물로 존재한다.
상기 기술한 이러한 조성물은 표면 활성화제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급 촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, U.V. 보호제, 완충제, 흐름제 또는 특정 목적 해충에 대해 생성물을 다루고 적용하기 용이한 다른 성분을 부가함으로 수득할 수 있다.
적합한 표면 활성화제는 음이온성 화합물, 예를 들면 카복실레이트(예: 장쇄 지방산의 금속 카복실레이트), N-아실살코시네이트, 지방산 알콜 에톡실레이트 또는 이와 같은 에스테르의 염을 갖는 인산 모노 또는 디-에스테르, 지방산 알콜 설페이트(예: 나트륨 도데실 설페이트, 나트륨 옥타데실 설페이트 또는 나트륨 세틸 설페이트), 에톡실레이트 지방산 알콜 설페이트, 에톡실레이트 알킬페놀 설페이트, 리그닌 설포네이트, 페트롤럼 설포네이트, 알킬 아릴 설포네이트, 예를 들면 알킬 벤젠 설포네이트 또는 저급 알킬나프탈렌 설포네이트(예: 부틸-나프탈렌 설포네이트), 염 또는 설폰화된 나프탈렌-포름알데하이드 축합물, 설폰화된 페놀-포름알데하이드 축합물의 염, 또는 더 많은 복합 설포네이트, 예을 들면 아미드 설포네이트(예: 올레산과 N-메틸-타우린의 설폰화된 축합 생성물 또는 디알킬 설포석시네이트(예: 나트륨 설포네이트 또는 디옥틸석시네이트)를 포함하나 이에 제한하지 않는다. 비이온성 물질은 지방산 에스테르, 지방산 알콜, 지방산 아미드 또는 에틸렌 옥사이드로 지방-알킬- 또는 알케닐-치환된 페놀, 폴리하이드릭 알콜 에테르의 지방산 에스테르(예: 솔비탄 지방산 에스테르), 이러한 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물(예: 폴리옥시에틸렌 솔비톨 지방산 에스테르), 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드의 블록 공중합체, 아세틸렌계 알콜(예: 2,4,7,9-테트라에틸-5-데신-4,7-디올) 또는 에톡시화된 아세틸렌계 글리콜을 포함하나 이에 제한하지 않는다. 양이온 표면 활성화제의 예는 지방족 모노-, 디- 또는 폴리아민(예; 아세테이트, 나프테네이트 또는 올레에이트), 산소-함유 아민(예: 폴리옥시에틸렌 알킬아민의 이민 옥사이드), 카복실산과 디 또는 폴리아민의 축합으로 제조된 아미드 결합 아민 또는 4 기로된 암모늄 염을 포함하나 이에 제한하지 않는다.
비활성 물질의 예는 무기 미네랄(예: 카올린, 미카, 짚섬, 비료, 필로실리케이트, 카보네이트, 설페이트 또는 포스페이트), 유기 물질(예: 당, 전분 또는 사이클로덱스트린) 또는 식물성 물질(예; 나무 생성물, 코르크, 분말 옥수수 속대, 쌀 외피, 땅콩 외피 및 호도 껍질)을 포함하나 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 조성물은 적용하기 전에 적당한 양의 물 또는 다른 희석제로 희석을 필요로하는 직접 적용하기에 적합한 형태 또는 농축액 또는 1차 조성물일 수 있다. 살충성 농도는 특히 농축 또는 직접 사용하거나 하는 것은 특정 제제의 성질에 따라 다양하다. 조성물은 고체 또는 액체의 비활성 담체의 1 내지 98중량%, 0 내지 50중량%, 바람직하게는 계면 활성제의 0.1 내지 50중량%를 함유한다. 이러한 조성물은 상업적 생성물의 명기된 양으로, 바람직하게는 무수형일 경우 약 0.01 내지 5.0 punds/acre이고, 액체형일 경우 0.01 내지 25 pints/acre를 투여한다.
추가의 양태에 있어서, 바실러스 관련 살충제 및/또는 물질은 목적 해충의 환경에서 적용될 경우, 전처리가 바실러스 관련 살충제 또는 물질에 유해하지 않는 한 살충 활성을 지연시키기 위해 미리 처리할 수 있다. 이러한 처리는 조성물의 성질에 유해한 영향을 미치지 않는 한 화학식 및/또는 물리적 수단에 의할 수 있다. 화학 시약의 예로는 할로겐화제, 알데히드(예; 포름알데히드 및 글루타르알데히드화), 항-감염제(예; 제피란클로라이드), 알콜(예; 이소프로판올 및 에탄올) 및 조직학적 매염제(예; Bouin's 매염제 및 Helly's 매염제, 참조; Houmason Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Co., 1967)을 포함하나 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 조성물은, 식물에 해충이 나타나기 시작하거나 해충이 나타나기 전 보호 조치로, 예를 들어 분사 또는 살포로 한 번에 식물에 직접 적용할 수 있다. 본 발명의 범위 내로 보호되는 식물은 곡물(예; 밀, 보리, 호밀, 귀리, 쌀, 사탕수수 및 관련 작물), 사탕무(예; 사탕무 및 사료 사탕무), 핵과, 이과 및 연과일(예; 사과, 배, 자두, 복숭아, 알몬드, 체리, 딸기, 라즈베리 및 블랙베리), 콩과 식물(예; 알팔파, 강낭콩, 렌즈콩, 완두콩, 대두), 유성 식물(예; 평지씨, 겨자씨, 양귀비, 올리브, 해바라기씨, 코코넛, 카스터 오일 식물, 코코아씨, 땅콩), 오이 식물(예; 오일, 서양호박, 멜론), 섬유 식물(예; 면화, 아마, 대마, 황마), 감귤류 과일(예; 오렌지, 레몬, 자몽, 중국종 귤), 야채(예; 시금치, 상추, 아스파라거스, 양배추 및 브라시카, 당근, 양파, 토마토, 감자), 라우라세(예; 아보카도, 계피, 캄퍼), 낙엽성 나무와 침엽수(예; 린덴나무, 주목나무, 밤나무, 오리나무, 포플라, 자작나무, 전나무, 낙엽송, 소나무) 또는 식물(예; 옥수수, 잔디 식물, 담배, 견과, 커피, 사탕 수수, 차나무, 포도나무, 홉, 바나나 및 천연 고무나무) 및 장식물을 포함하나 이에 제한하지 않는다. 물질은 관엽모양, 도랑, 과립 살포기, 정선소 또는 토양에 사용할 수 있다. 일반적으로 식물이 가장 혹독하게 손상당할 경우, 식물의 성장 초기단계에서 해충의 우수한 방제를 수득한다. 분사 또는 더스트는 필요한 경우 편리하게 다른 살충제를 함유할 수 있다. 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 조성물은 식물에 직접 적용한다.
본 발명의 조성물은 해충 콜레옵테라 성충, 예를 들면 렙티노타르사 종(예; 렙티노타르사 텍사나, 렙티노타르사 디셈니네아타), 디아브로티카 운데심펀크타타, 덴드록토너스 프로탈리스(Dentroctonus frontalis), 안토머스 그란디스, 아스칸토셀리데스 옵텍터스(Ascantoscelides obtectus), 칼로소부루커스 키넨시스(Callosobruchus chinensis), 에필라크나 바리베스티스(Epilachnas varivestis), 피르할타 루테올라(Pyrrhalta luteola), 실라스 포르미칼리우스 엘레간투러스(Cylas formicarius elegantulus), 리스트로노터스 오레고넨시스(Listronotus oregonensis), 시토필러스 종(Sitophilus sp.), 시클로세팔라 보레알리스(Cyclocephala borealis), 시클로세팔라 아마쿨라타(Cyclocephala immaculata), 마크로닥틸러스 서브스피노서스(Macrodactylus subspinosis), 포필리아 자포니카(Popillia japonica), 리조트로거스 마잘리스(Rhizotrogus majalis), 알피토블러스 디아페리너스(Alphitoblus diaperinus), 팔로러스 라트제부르기(Palorus ratzeburgi), 테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor), 테네브리오 오브스크러스(T. obscurus), 트리볼리움 카스타늄(Tribolium castaneum), 트리볼리움 콘푸섬(T. confusum), 트리볼리움 데스트럭터(T. destructor)에 대해 효과적일 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 레피돕테라 성충[예; 아크로이아 그리셀라(Achroia grisella), 아클러리스 그롤베라나(Acleris gloverana), 아클러리스 바리아나(A. variana), 아독소피스 오라나(Adoxophyes orana), 아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon), 알라바마 아르질라세(Arabama argillacea), 알소필라 포메타리아(Alsophila pometaria), 아미엘로이스 트랜시텔라(Amyelois transitella), 아나가스타 쿠에니엘라(Anagasta Kuehniella), 아나르시아 리네아텔라(Anarsia lineatella), 아니소타 세나토리아(Anisota senatoria), 안데라에 페르니이(Antheraea pernyi), 안티카르시아 게마탈리스(Anticarsia gemmatalis), 아르킵스 종(Archips sp.), 아르기오타에니아 종(Argyotaenia sp.), 아테티스 민다라(Athetis mindara), 봄빅스 모리(Bombix mori), 브쿨라트릭스 투르베리엘라(Bucculatrix thurberiella), 카드라 카우텔라(Cadra cautella), 코리스토뉴라 종(Choristoneura sp.), 코킬스 호스페스(Chochylls hospes), 콜리아스 유리테므(Colias eurytheme), 코르시라 세팔로니카(Corcyra cephalonica), 시디아 라티페레아너스(Cydia latiferreanus), 시디아 포모넬라(C. pomonella), 다타나 인테게리마(Datana integerrima), 덴드롤리머스 시베리쿠스(Dendrolimus sibericus), 데스미아 푸네랄리스(Desmia funeralis), 디아파니아 히아리나타(Diaphania hyalinata), 디아파니아 니티달리스(D. nitidalis), 디아트라에 그란디오셀라(Diatraea grandiosella), 디아트라에 사카랄리스(D. saccharalis), 엔노모스 서브시그나리아(Ennomos subsignaria), 에오류마 로프티니(Eoreuma loftini), 에페스티아 엘루텔라(Ephestia elutella), 에란니스 틸라리아(Elannis tilaria), 에스티그메네 아크레아(Estigmene acrea), 율리아 살루브리콜라(Eulia salubricola), 유포코엘리아 앰비그엘라(Eupocoellia ambiguella), 유포에실리아 앰비그엘라(Eupoecilia ambiguella), 유프록티스 크리솔로아(Euproctis chrisorrhoea), 육소아 메소리아(Euxoa messoria), 갈렐리아 멜로넬라(Galleria mellonella), 그라폴리타 몰레스타(Grapholita molesta), 해리시나 아메리카나(Harrisina mericana), 헬리코벌파 서브플렉사(Helicoverpa subflexa), 헬리코벨파 제아(H. zea), 헬리오티스 비레센스(Helliothis virescens), 헤밀류카 올리비아(Hemileuca oliviae), 호모에오소마 엘렉텔럼(Homoeosoma electellum), 히판트리아 쿠네아(Hyphantria cunea), 케이페리아 리코펄시셀라(Keiferia lycopersicella), 람디나 피셀라리아 피셀라리아(Lambdina fiscel laria fiscellaria), 람디아 피셀라리아 루구브로사(L. fiscellaria lugubrosa), 류코마 살리시스(Leucoma salicis), 로베시아 보트라나(Lobesia botrana), 록소스테게 스틱티칼리스(Loxostrge sticticalis), 리만트리아 디스팔(Limatria dispar), 마칼라 틸시살리스(Macalla thyrsisalis), 말라코소마 종(Malacosoma sp.), 마메스트라 브라시카(Mamestra brassicae), 마메스트라 콘피그라타(M. configurata), 만듀카 퀸크마쿨라타(Manduca quinquemaculata), 만두카 섹타(M. sexta), 마류카 테스툴라리스(Maruca testulalis), 멜란크라 픽타(Melanchra picta), 오페로프테라 브루마타(Operophtera brumata), 오르기이아 종(Orgyia sp.), 오스트리니아 누빌랄리스(Ostrinia nubilalis), 팔레아크리타 베르나타(Paleacrita vernata), 파필리오 크레스폰테스(Papilio cresphontes), 펙티노포라 고시피엘라(pectinophora gossypiella), 프리가니디아 칼리포르니카(Phryganidia californica), 필로노릭터 블란카르델라(Phyllonorycter blancardella), 피에리스 나피(Pieris napi), 피에리스 라파(Pieris rapae), 플라티페나 스카브라(P. scabra), 플라티노타 플로우엔타나(Platynota flouendana), 플라티노타 스툴타나(P. stultana) 플라팁틸라 칼두이드아크틸라(Ptyptilia carduidactyla), 플로디아 인텔펀크틸라(Plodia interpunctella), 플루텔라 크실로스텔라(Plutella xylostella), 폰티아 프로토디스(Pontia protodice), 슈달레티아 우니펀크타(Pseudaletia unipuncta), 슈도플라시아 인클루덴스(Pseudoplasia includens), 사블로데스 아에그로타타(Sabulodes aegrotata), 시줄라 콘신나(Schizura concinna) 시토트로가 세레알렐라(Sitotroga cerealella), 스필로노타 오셀라나(Spilonota ocellana), 스포돕테라 종(Spodoptera sp.), 타우른스토포에 피티오캄파(Taurnstopoea pityocampa), 티네올라 비셀리엘라(Tineola bisselliella), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 우데아 루비갈리스(Udea rubigallis), 크실로미제스 쿠리알리스(Xylomyges curialis), 입포노뮤타 파델라(Yponomeuta padella)], 딥테라[예; 아에데스 종(Aedes sp.), 아에데스 비타터스(A. vitatus), 아나스트레파 루덴스(Anastreoha ludens), 아나스트레파 서스펜사(A. suspensa), 아노펠레스 바르베리(Anopheles barberi), 아노펠레스 쿠아드리마 쿨라터스(A. quadrimaculatus), 아르미제레스 서발바터스(Armigeres subalbatus), 칼리포라 스티지아(Calliphora stygia), 칼리포라 비시나(C. Vicina), 세라티티스 카피타타(Ceratitis capitata), 키로노머스 텐탄스(Chironomus tentans), 크립소미아 루피파시에스(Chrypsomya rufifaciens), 코크리오미이아 마셀라리아(Cochliomyia macellaria), 쿨렉스 종(Culex sp.), 쿨리세타 미노르나타(Culiseta inornata), 다쿠스 올레아(Dacus oleae), 델리아 안티구아(Delia antigua), 델리아 플란투라(D. plantura), 델리아 란디쿰(D. randicum), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 유페오데스 코롤라(Eupeodes corollae), 글로시나 아우스테니(Glossina austeni), 글로시나 브레비팔피스(G. brevipalpis), 글로시나 푸시페스(G. fuscipes), 글로시나 모리스탄스 센트랄리스(G. morsitans centralis), 글로시나 모리스탄스 모리스탄스(G. morsitans morsitans), 글로시나 모리스탄스 서브모리스탄스(G. morsitans submorsitans), 글로시나 팔리디페스(G. pallidipes), 글로시나 팔파리스 감비엔시스(G. palpalis gambiensis), 글로시나 팔파리스 팔파리스(G. palpalis palpalis), 글로시나 타키노 이데스(G. tachinoides), 해마고거스 에퀴너스(Haemagogus equinus), 해마토비우스 일리탄스(Haematobius irritans), 히포덜마 보비스(Hypoderma bovis), 히포덜마 리네아텀(H. lineatum), 류코피아 니나(Leucopis ninae), 루실리아 쿠프리나(Lucilia cuprina), 루실리아 세리카타(L. seritaca), 루조미이드 롱글파이피스(Lutzomyia longlpapis), 루조미이드 샨노니(L. shannoni), 리코리엘라 말리(Lycoriella mali), 마이에티올라 데스트럭터(Mayetiola destructor), 무스카 아우텀날리스(Musca autumnalis), 무스카 도메스티카(M. domestica), 네오벨리에리아 종(Neobellieria sp.), 네프로토마 서터랄리스(Nephrotoma suturalis), 오피라 아네네센스(Ophyra aenescens), 파에니샤 세리카타(Phaenicia sericata), 플레보토머스 종(Phlebotomus sp.), 포르미아 레지나(Phormia resina), 사베테스 사아누스(Sabethes cyaneus), 살코파가 블라타(Sarcophaga bullata), 스카토파가 스텔코라리아(S. stercoraria), 스토마시스 칼시트란스(Stomaxys calcitrans), 톡솔힌키테스 암보이넨시스(Toxorhynchites amboinensis), 트립테로이데스 밤부사(Tripteroides bambusa), 아카리[예; 올리고니커스 프라텐시스(Oligonichus prantensis), 파노니커스 울리(Panonychus ulmi), 테트라니커스 울티카(Tetranychus urticae)], 히메놉테라[예; 이리도밀멕스 후밀리스(Iridomyrmex humilis), 솔레놉시스 인빅타(Solenopsis invucta), 이솝테라[예; 레티쿨리테르메스 헤스페러스(Reticulitermes hesperus), 레티쿨리테르메스 플라비페스(R. flavipes), 콥토테르메스 폴모사너스(Coptotermes formosanus), 주테르몹시스 안구스티콜리스(Zootermopsis angusticollis), 네어테르메스 코넥서스(Neotermes connexus), 인시스테르메스 미너(Incisitermes minor), 인시스테르메스 이미그란스(I. immigrans)], 시포납테라[예; 세라토필러스 갈리나(Ceratophyllus gallinae), 세라토필러스 니거(C. niger), 노소필러스 파시아터스(Nosophyllus fasciatus), 렙톱실라 세그니스(Leptopsylla segnis), 크테노세팔리데스 카니스(Ctenocephalides canis), 크테노세팔리데스 펠리스(C. felis), 에키노파가 갈리나세(Echicnophaga gallinacea), 플렉스 일리탄스(Pulex irritans), 제놉실라 케오피스(Xenopsylla cheopis), 제놉실라 벡사빌리스(X. Vexabilis), 툰가 페네트란스(Tunga penetrans) 및 틸렌키다[예; 멜로디도진 인코그니타(Melodidogyne incognita), 프라틸렌커스 페네트란스(Pratylenchus penetrans)]에 대해 유효할 수 있다.
하기 실시예는 예시의 방법으로 나타내나 이에 제한하지 않는다.
실시예 1 : 다양한 B.t. 분리물의 배양
뉴트리언트 브로스 한천 사면배지에서 유지된 EMCC-0077, EMCC-0078, EMCC-0079, EMCC-0080 및 EMCC-0081의 계대 배양은 하기의 조성의 배지 50㎖을 함유하는 250㎖의 배플 진탕 배양기에 접종하여 사용한다.
옥수수 침지액15g/L
말트린-10040g/L
감자 전분30g/L
KH2PO41.77g/L
K2HPO44.53g/L
10N NaOH를 사용하여 배지의 pH를 7로 조절한다.
접종후 진탕 배양기를 30℃, 250rpm의 회전식 배양기에서 72시간동안 배양한다. 모든 배양액은 디아브로티카 운데심펀크타에 대한 시험용으로 사용한다.
실시예 2 : 다양한 B.t. 분리물로 부터의 총 배양액중에서 디아브로티카 운데심펀크타타의 활성
상기 발효액으로부터 수득한 모든 배양액 2.5㎖을 진탕 배양기로부터 50㎖의 폴리프로필렌 생물학적 검정 튜브로 옮긴다. 디아브로티카 운데심펀크타타의 먹이를 각각의 튜브에 가하고, 최종 부피 25㎖이 되게 한다. 그 후 먹이와 시험 물질을 격렬하게 혼합하고, 생물학적 검정을 위해 생물학적 검정 트레이로 분배한다. 디아브로티카 운데심펀크타타의 6개 유충중 3개를 먹이의 표면에 적용한다. 마일라(Mylar)를 생물학적 검정용 트레이에 입하고, 트레이를 빛에 노출시키지 않고 28℃에서 배양한다. 평가는 7일째 수행된다. 배양 후 7일에 사멸수를 평가한다. SS7=7일째의 산 유충과 비교했을 때 죽은 유충의 크기, 같은 날의 대조 유충의 SS7은 4이다. SS7=3, SS7=2 및 SS7=1은 각각 산 대조 유충 4의 75%, 50% 및 25%의 유충 크기를 나타낸다.
그 결과를 하기 표 1에 나타낸다. 그 결과는 시험된 총 5 균주에 있어서 100% 사멸율을 보인다. 추가로 죽은 유충은 산 대조 유충 크기의 12.5%이다.
[표 1]
실시예 3 : 디아브로티카 운데심펀크타타의 활성의 편재화
디아브로티카 운데심펀크타타 활성이 델타-엔도톡신/포자 또는 상등액과 결합되어 있는지를 시험하기 위해서 EMCC-0077, EMCC-0080, EMCC-0081 및 NB125(동일한 조건하에서 성장한 바실러스 투링기엔시스 아종 테네브리오니스)를 Sorvall RC-5B 원심 분리기에서 15000rpm(Sorvall SS34 rotor)으로 15분 동안 원심분리하여, 상등액과 펠렛을 분리한다. 결정 델타-엔도톡신+포자를 펠렛에서 회수한다. 디아브로티카 운데심펀크타타-활성 B.t. 동정 EMCC-0077에 의해 생성된 델타-엔도톡신은 SDS-PAGE로 결정된 분자량 66kD, 29kD 및 12kD을 갖는다. 디아브로티카 운데심펀크타타-활성 B.t. 동정 EMCC-0078에 의해 생성된 델타-엔도톡신은 SDS-PAGE로 결정된 분자량 153kD, 77kD, 67kD, 61kD, 50kD, 42kD, 34kD, 30kD 및 24kD를 갖는다. 디아브로티카 운데심펀크타타-활성 B.t. 동정 EMCC-0079에 의해 생성된 델타-엔도톡신은 SDS-PAGE로 결정된 분자량 135 내지 145D을 갖는다. 디아브로티카 운데심펀크타타-활성 B.t. 동정 EMCC-0080에 의해 생성된 델타-엔도톡신은 SDS-PAGE로 결정된 분자량 94kD와 40kD을 갖는다. 디아브로티카 운데심펀크타타-활성 B.t. 동정 EMCC-0081에 의해 생성된 델타-엔도톡신은 SDS-PAGE로 결정된 분자량 129kD 및 32kD을 갖는다.
상기 원심분리로부터 수득한 각 상등액(2.5㎖)을 50㎖ 프로필렌생물학적 검정 튜브로 옮긴다. 그 후 펠렛을 살균수 2.5㎖로 재현탁시키고, 분리 50㎖ 프로필렌 생물학적 검정 튜브로 옮긴다. 그 후 디아브로티카 운데심펀크타타 먹이를 상등액 또는 재현탁 펠렛을 함유하는 생물학적 검정 튜브를 가하고 최종 부피, 25㎖이 되게 한다. 생물학적 검정의 나머지 단계는 상기 기술된 단계와 동일하다. 평가는 또한 상기 기술한 바와 동일하다.
표 2에 나타낸 결과는 EMCC-0077, EMCC-0080 및 EMCC-0081로부터의 디아브로티카 운데심펀크타타-활성이 모든 상등액에 존재하는 반면, 공지된 바실러스 투링기엔시스 아종 테네브리오니스로부터의 디아브로티카 운데심펀크타타의 약한 활성은 펠렛(포자+결정)에 활성 물질이 농축되었음을 나타낸다.
[표 2]
실시예 4 : 렙티노타르사 텍사나에 대한 활성
0.2μ 막을 통해서 여과한 후, 실시예 1로부터 수득한 EMCC-0080의 상등액을 곤충 활성 분석용으로 사용한다.
여과된 상등액을 20GPA(gallon per acre) 부피로 유충나무 관엽에 적용한다. 0, 1:1, 1:4, 1:8(상등액:탈이온수, v/v)으로 희석한다.
렙티노타르사 텍사나 유충을 하기의 기준 방법 처리한 관엽에 노출시킨다. 각각의 나무에 렙티노타르사 텍사나의 유충 20개를 놓는다.
EMCC-0080의 여과된 상등액의 렙티노타르사 텍사나에 대한 활성을 하기 표 3에 나타낸다.
[표 3]
실시예 5 : EMCC-0080과 노보도르TM의 상승효과
상기 표 3에 나타낸 결과는 EMCC-0080의 상등액은 1:8(v/v)에서는 활성이 없음을 나타낸다. 그러나 유충나뭇잎을 10배 농축한 EMCC-0080 상등액 1.25% 또는 2.5% + 노보도르TM(Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark) 200㎍/㎖로 처리할 경우, 노보도르TM의 LC50및 LC90의 급격한 감소로 나타난 바대로 상승 효과를 수득한다. 데이타를 하기 표 4에 나타낸다.
[표 4]
실시예 6 : B.t. 균주 EMCC-0080에 의해 생성된 콜레옵테란-활성 물질의 정제
B.t. 균주 EMCC-0080을 하기 조성을 갖는 배지(g/l)에서 30℃, 24시간 동안 배양한다.
말토덱스트린40g
콩 단백질40g
KH2PO41.8g
K2HPO44.5g
MgSO4-7H2O0.3g
미량 금속0.2㎖
B.t. 균주 EMCC-0080의 모든 배양액으로부터 균체와 다른 불용성 물질들을 원심분리하여 제거하고 이로써 수득한 상등액을 셀라이트와 2μ 얇은막을 통해서 후속적으로 여과한다. 그 후 이로써 수득한 액체를 증발시켜 10배 농축한다.
10배 농축한 액체로부터 콜레옵테란-활성 물질의 정제는 4단계 정제 과정을 사용하여 달성한다. 정제하는 동안 활성을 하기 기술한 바대로 디아브로티카 운데심펀크타타 표면 생물학적 검정을 통해서 모니터하고 순도를 실시예 8에서 기술한 바대로 모세관 전기영동으로 결정한다. 모든 크로마토그래피 단계는 226nm에서 검색한다.
특히, 표면의 생물학적 검정을 하기에 기술한 바대로 수행한다. 10배 농축액체 샘플을 웰당 200㎕의 고화된 인공 곤충 먹이를 함유하는 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 적용하고 난 후 공기 건조한다. 디아브로티카 운데심펀크타타(corn rootworm, CRW) 4마리 중 2마리를 조심스럽게 그림붓으로 각각의 웰에 놓는다. 마이크로 타이터 플레이트를 마이라로 봉하고 난 후, 공기 교환을 위해 구멍을 내고, 30℃, 80% 습도로 배양한다. % 사멸율의 값은 5일동안 수행된다.
1단계에서, 10배 농축 액체를 먼저 파마시아 SP SephadexRC-25(양이온 교환수지) 칼럼 크로마토그래피(5×30cm)로 정제한다. 10배 농축 액체 샘플 450㎖을 탈이온수로 18ℓ로 희석하고, 20mM 암모늄 아세테이트 완충액, pH 5.0으로 미리 평형화된 칼럼으로 로딩한다. 칼럼을 pH 5.0, 20mM에서 0.5M 암모늄 아세테이트 완충액 5.0ℓ의 연속 농도구배로 18㎖/분으로 용출한다. 10㎖의 분획을 모으고 생물학적 검정하고 순도를 실험한다. 활성 분획을 모으고(약 150㎖), 동결 건조하고, 탈이온수로 재 용해시켜 원 부피의 약 1/5이 되게 한다.
2단계에서, 1단계의 샘플 25㎖을 탈이온수로 전 평형화시킨 바이오 래드 P2(extra fine) 크기 구매 칼럼(5×100cm)으로 로딩한다. 칼럼을 1㎖/분의 용출속도로 탈이온수로 용출한다. 10㎖의 분획을 모으고 생물학적 검정하고 모세관 전기영동으로 순도를 실험한다. 활성 분획을 모은다(약 400㎖).
3단계에서, 2단계의 샘플 400㎖을 탈이온수 16ℓ로 희석한다. 용액을 pH 5.0, 20mM 암모늄 아세테이트 완충액으로 전 평형화 시킨 파마시아 S SepharoseR Fast Flow(강한 양이온 교환수지) 칼럼(5×30cm)에 로딩한다. 칼럼을 pH 5.0, 20mM에서 0.5M 암모늄 아세테이트 완충액 5.0ℓ의 연속 농도구배로 17㎖/분으로 용출한다. 20㎖의 분획을 모아 생물학적 검정하고 순도를 실험한다. 활성 분획을 모은 후(약 250㎖), 동결 건조하여 증발성 암모늄 아세테이트 완충액을 제거하여 건조한다.
4단계에서, 3단계로부터 동결 건조된 용액을 400㎖ 탈이온수에 용해시킨다. 용액을 pH 4.0의 20mM 암모늄 포르메이트 완충액으로 전 평형화 시킨 바이오래드 ChelexR100컬럼(0.9×30cm)에 로딩한다. 칼럼을 용출속도 5㎖/분, pH 4.0의 0.02→0.1→0.2→0.35→0.5→1.0M의 농도 구배 암모늄 포르메이트 완충액 2.4ℓ로 용출한다. 200㎖의 분획을 모으고 생물학적 검정하고 순도를 실험한다. 활성 분획을 모으고(약 300㎖) 난 후 동결건조하고 증발 암모늄 포르메이트 완충액을 제거 건조한다.
모세관 전기영동은 두 화합물 Ia와 Ib를 포함하는 정제된 콜레옵테란 활성 물질을 나타낸다.
실시예 7 : 콜레옵테란 활성 물질의 구조 설명
화합물 Ia와 Ib의 구조는 이의 아세틸화된 유도체(유도체 A와 B)에서 모아진 분광학적 데이터로 설명된다.
Ia와 Ib의 혼합물 114mg을 피리딘 5.0㎖중에서 촉매로서 아세트산 무수물 5.0㎖과 4-디메틸아미노피리딘 결정을 사용하여 실온에서 24시간 아세틸화한 후, 반-예비 RP-C18HPLC로 정제한다. 25㎕중의 샘플 5mg을 칼럼에 로딩하고, 4㎖/분의 용출속도의 80% 물-20% 아세토니트릴로 용출한다. 254nm에서 검색한다.
유도체 A에서 수득한 NMR 분광학적 데이터는 탄소 14%, 양자(H+) 17%의 존재를 나타낸다. 그러나 질량 분광적 데이터는 분자량 652와 화학식 C28H40N6O12(exact mass, 653.2801, MH+, calc. 653.2782)를 제시한다. 그러므로 화합물은 기호의 반만이 NMR로 관찰된 대칭적 화합물로 결정된다.
NMR에 의해서 소수의 스핀 체계가 관찰된다. 2번과 5번 위치에 치환된 중앙 피라진 환은 8.6ppm(H-3과 H-6)에서 하이 필드 프로톤 싱글렛에 의해 나타나고, 여기서 환의 모든 탄소와 측쇄(C-7)의 첫 번째 탄소와의 긴 범위의 커플링을 보인다. 측쇄의 3개의 환은 7번과 8번 위치에서 9번 위치의 메틸렌과 아세틸화 된다. 9번 탄소는 카보닐의 에스테르와 긴 범위의 상관관계를 갖는다고 밝혀졌고, 에스테르는 아미노 그룹에서 아세틸화된 알라닌부로 결정된다.
유도체 B의 구조는 유조체 A의 한 위치에서 상이하다. 유도체 B의 한 측쇄에서 C-7 탄소는 더 이상 아세틸화 되거나 산소가 붙지 못하고 메틸렌된 것이 밝혀졌다. 다른 측쇄는 유도체 A의 그것과 동일하다. 단지 수소 하나의 차이점은 또한 질량 분석 데이터에서 관찰된다. 질량 분석 데이터에는 유도체 B가 화학식 C28H38N6O10인 595.2722의 확실한 질량(MH+, calc. 595.2727)으로 수득된다. 유도체 A와 B의 탁도는 하기와 같다. 유도체 A[α]D 27=-6.9와 유도체 B[α]D 27=+32℃.1H와13C NMR 데이터의 모든 할당은 탈커플링 실험, COSY, HMQC와 HMBC를 기준으로 하여 수행된다. 결과는 표 5에 나타난다.
[표 5]
화합물 Ia와 Ib의 혼합물의 질량 분석 데이터에는 두 개의 분자 이온 400과 384을 낸다. 이 데이터로부터 화합물 Ia의 화학분자식은 C16H28N6O6이고 화합물 Ib는 C16H28N6O5로 결정된다. 화합물 Ia와 Ib의 구조는 유도체 A와 유도체 B의 NMR 데이터와 Ia와 Ib의 혼합물의 NMR 데이터를 비교하므로 결정된다. Ia와 Ib의 구조는 하기에 나타낸다.
Ia : R, R1, R2, R3= H
Ib : R, R1, R2= H, R3= OH
화합물 Ia와 Ib의 성질과 아세틸화된 유도체를 하기에 요약한다.
유도체 A :
분자량 652
실험식C28H40N6O12
UV(MeOH) :275, 310nm
MS (FAB) : (M+H) m/z 653.2801, calc. 653.2782
유도체 B :
분자량 594
실험식C26H38N6O10
UV(MeOH) :275, 310nm
MS (FAB) : (M+H) m/z 595.2722, calc. 595.2727
Ia :
분자량 400
실험식C16H28N6O6
UV(MeOH) :275, 310nm
MS (FAB) : (M+H) 401
Ib :
분자량 384
실험식C16H28N6O6
UV(H2O) :275, 310nm
MS (FAB) : (M+H) 385
실시예 8 : 발효액 중의 화합물 Ia와 Ib의 정량화
B.T. 균주 EMCC-0080은 실시예 1에서 기술한 바대로 배양한다. 발효액중의 화합물 Ia와 Ib의 농도는 모세관 전기영동에 의해 결정된다.
특히, 질량을 측정하기 위해 uncoated 모세관 (50㎛×50cm), Ph 2.5의 0.1M 인산 완충용액, 20KV에서 전압, 양극에서 음극의 극성 및 200nm 검색으로 구비된 바이오래드 바이오포커스 3000 모세관 전기영동 시스템을 사용한다. 5psi 초로 샘플 용적 30㎕을 주입한다. 분석 시간을 10분이고, 콜레옵테란 활성 화합물 Ia와 Ib는 각각 6.0과 5.9분에서 용출된다.
또한 질량을 측정하기 위해 탈각된 모세관(50㎛×47cm), pH 2.5의 0.1M 인산 완충용액, 20KV에서 전압, 양극에서 음극의 극성 및 200nm 검색으로 구비된 벡맨 P/ACE 2100 모세관 전기영동 시스템을 사용한다. 10초 압력 주입으로 샘플 용적 30㎕을 주입한다. 분석 시간을 10분이고, 콜레옵테란 활성 화합물 Ia와 Ib는 각각 7.0과 6.7분에서 용출된다.
B.t. 균주 EMCC-0080의 모든 배양액으로부터 균체와 다른 불용성 물질들을 원심분리하여 제거하고 이로써 수득한 상등액을 셀라이트와 0.2 얇은막을 통해서 후속적으로 여과한다. 그 후 이로써 수득한 상등액을 상기 기술한 바대로 모세관 전기영동으로 분석한다. 그 결과 콜레옵테란 활성 화합물 Ia와 Ib는 배양액 ℓ당 약 90mg의 수준으로 각각 존재한다.
실시예 9 : 화합물 Ia와 Ib의 효능 결정
화합물 Ia와 Ib(약 1:1 w/w)의 조 혼합물의 상대적 유효량은 시험 곤충으로 렙티노타르사 텍사나를 사용하고, 바실러스 투링기엔시스 아종 테네브리오니스의 내부의 기준 방법과 관련된 사멸율과 비교해서 결정한다.
관엽의 생물학적 검정을 렙티노타르사 텍사나에 대한 화합물 Ia와 Ib의 조혼합물의 유효량을 결정하기 위해 수행된다. 관엽의 생물학적 검정을 수행하기 위해 시험 물질과 기준을 50㎖ 원심분리 튜브에서 칭량하고, 0.1% TweenR20을 함유하는 탈이온수로 현탁한다. 바실러스 투링기엔시스 아종 테네브리오니스 기준 1,200mg을 칭량하고 현탁하여 최종 농도 12,000㎍/g이 되게 한다. 생물학적 검정속도가 복용된 복용량이 너무 높거나 낮아서 이로써 수득한 결과가 다수의 충분한 유효 데이터 값이 아닐 경우를 제외하고는 시험 샘플(즉, 노보도르TM과 화합물 Ia와 Ib를 갖는 노보도르TM)을 유사한 방법으로 처리한다. 이러할 경우, 1차 스톡용액의 농도는 스톡 용액에 부가할 희석량의 변화로 증가시키거나 감소시킨다. 그 후 각 샘플을 Virtis 균질화기를 사용하여 30초 동안 균질화하고, 브루노소닉 1510 초음파 균질화기를 사용하여 100 왓트에서 20초 동안 초음파 분쇄한다. 그 후 각각의 이 스톡용액을 해밀톤 마이크로랩 1000을 사용하여 희석하여 3000, 2000, 1333, 857, 545, 364 및 245㎍/㎖을 포함하는 7개의 연속 희석물을 수득한다. 이 각각 16㎖의 용액을 20갤론/에이커로 보정한 Devries Linear Track sprayer를 사용하여 유충나무 관엽의 약 28인치 제곱으로 적용한다. 대조 나뭇잎에는 탈 이온수 16㎖을 분무한다. 나뭇잎을 공기 건조한 후 5초 렙티노타르사 텍사나 유충을 함유하는 1온스 투명 플라스틱 컵의 주변에 놓는다. 그 후 판지 뚜껑을 관엽위에 놓고, 안으로 누르고, 관엽을 4cm 디스크 형태로 자르고, 그것을 컵안으로 넣고 봉쇄한다. 그 후 컵을 뒤집고, 유충을 표면 처리된 관엽위로 적하시킨다. 8컵을 7개의 연속 희석물중 각 하나를 위해 준비한다. 컵을 모두 표지하여 사용하고, 랙위에 놓고, 3일 동안 30℃에서 65%의 상대습도에서 배양한다. 이 56 실험 컵과 8개의 대조구 컵은 한 번의 생물학적 검정으로 이루어진다.
3일 후 곤충 사멸율을 평가한다. 각 컵은 움직이지 않는 사멸한 유충을 수득한다. % 사멸율을 계산하고, 데이터를 평행 프로빗 분석을 통해서 LC50S, LC90S, 리그레션 라인의 기울기, 변수의 계수를 분석하고, 효능을 측정한다.
효능을 측정하기 위해서, 화합물 1a와 1b의 조 혼합물을 희석하고, 생물학적 검정하고, 효능 20,000 LTU/g(렙티노다르사 텍사나 단위/g)으로 인정된 바실러스 투링기엔시스 아종 테네브리오니스 기준과 비교한다.
효능의 결과를 표 6에 나타내고, 화합물 1a와 1b의 조 혼합물이 70㎍/ml의 LC50을 갖는 활성 성분 75,555 LTU/g 효능(총 활성 성분 1.8mg/ml)을 갖음을 하기에 표기한다.
[표 6]
실시예 10 : 화합물 1a와 1b를 갖는 바실러스 투링기엔시스 아종 테네브리오니스 결정 델타-엔도톡신의 효력 증진
렙티노다르사 텍사나에 대한 바실러스 투링기엔시스 아종 테네브리오니스로부터 결정 델타-엔도톡신의 살충 활성을 증가시키기 위한 화합물 1a와 1b의 능력은 노보도르TM에 화합물 1a와 1b 조 혼합물을 가하므로 결정하고, 평형 프로빗 분석을 통해서 LC50S를 측정한다.
화학식 9에서 정의된 바대로 렙티노다르사 텍사나에 대해 수행된 관엽 모양의 생물학적 검정은 노보도르TM에 화합물 1a와 1b 조 혼합물을 가하므로 수득한 효력 증진 수준을 결정한다. 용액은 해밀튼 마이크로랩 1000을 사용하여 연속 희석하므로 노보도르TM1000.0, 666.7, 444.4, 285.7, 181.8, 121.2 및 80.0㎍/g을 함유하는 스톡 용액을 수득한다. 화합물 1a와 1b 혼합물의 두 개의 상이한 희석액은 7개의 연속 희석으로 72.0, 48.0, 32.0, 20.6, 13.1, 8.7 및 5.8㎍/g(1000㎍/g 노보도르TM2.5% v/v)와 36.0, 24.0, 16.0, 10.3, 6.5, 4.4 및 2.9㎍/g(1000㎍/g 노보도르TM1.25% v/v)을 함유하여 제조된다. 니트 샘플(화합물 1a와 1b 부제)과 참조물질은 또한 제조된다. 복합 니트 샘플의 LC50S은 증진된 LC50값에 의해 나뉘어 지므로 화합물 1a와 1b 혼합물과 관련된 LC50에 있어서 배의 감소로 수득된다.
그 결과를 표 7에 나타내고, 화합물 1a와 1b 조 혼합물은 렙티노다르사 텍사나에 대해 노보도르TM의 살충 활성을 증진시킴을 하기에 표기한다.
[표 7]
실시예 11 : 바퀴벌레 입스 칼라그라퍼스와 덴드록터너스 프론탈리스에 대한 화합물 Ia와 Ib 혼합물의 활성
화합물 Ia와 Ib 조 혼합물의 독성은 바퀴벌리 입스 칼라그라퍼스와 덴드록터너스 프론탈리스에 대해 결정한다. 화합물 Ia와 Ib 조 용액 3㎖(1.8mg의 활성 성분/㎖)을 동결 건조된 로볼리 파인 플로엠 5g과 증류수 7㎖에 가한다. 대조 먹이를 물 10㎖중에 제조한다. 먹이를 3개의 페트리 접시에 나누고, 5 내지 10의 캘로우 성충 입스 또는 취근에 나타낸 성충 덴드록토너스 바퀴벌레를 각 접시에 놓는다. 처리도니 먹이과 배조 먹이의 3개의 상이한 뱃치를 10 내지 20 곤충에게 나누어준다. 페트리 접시를 25℃의 암실에서 배양하고, 먹이를 놓은 후 4, 7 및 10 내지 12일에 사멸한 곤충의 수를 센다. 나타낸 데이터는 각 곤충종에 대한 2 나 3의 명백히 반복된 연구의 평균이다.
입스 칼리그라퍼스의 결과를 하기의 표 8에 나타내고, 화합물 Ia와 Ib의 조 혼합물이 살충성이 있음을 나타낸다.
[표 8]
덴드록토너스 프론탈리스 생물학적 검정에 대한 결과를 하기 표 9에 나타내고, 화합물 Ia와 Ib의 조 혼합물이 살충성이 있음을 나타낸다.
[표 9]
실시예 12 : 포필리아 이아포니카(일본 바퀴벌레)에 대한 활성
화합물 Ia와 Ib 조 혼합물을 3차 포필리아 자포니카 유충에 대한 살충 활성을 시험한다. 다년생 잔디 뿌리(11일 성장)를 화합물 Ia와 Ib 조 혼합물(1a와 1b의 1.8mg/ml)에 담그고, 부분적으로 건조한다. 포필리아 자포니카 유충 1/3을 처리된 소수의 뿌리와 주석위에 놓는다. 24시간 후 뿌리와 유충은 우스터 실 롬으로 싸인다. 대조 뿌리를 물에 담그고, 유충을 포함하는 비처리 대조구를 1일 동안 롬에 직접 놓는다. 주석을 25℃의 암실에서 배양하고, 사멸한 유충의 수는 7, 10, 21, 28 및 36일 후 첵크하고, 대조구에 의해 수정된 사멸율을 보고한다{(대조구 생존-처리구 생존)/대조구 생존)×100%}, 총 25개의 유충을 처리에 사용한다. 표 10에 나타낸 바대로, 그 결과는 화합물 1a와 1b의 조 혼합물이 3차 포필리아 자포니카 유충에 대해 효과적임을 나타낸다.
[표 10]
실시예 13 : 에필라크나 바리베스티스(멕시코 콩 바퀴벌레)에 대한 활성
화합물 Ia와 Ib 조 혼합물(1.8mg/ml)을 3차 에필라크나 바리베시스 유충에 대한 살충 활성을 시험한다. 80℉, 50% 상대습도의 16:8의 사진 크기의 성장 체임버 안에서 버피의 부쉬 리마 빈의 에필라크나 바리베시스 성충의 케이지 콜로니를 유지한다. 2일 후 2차 영 유충 은 에그 매스를 수집하고, 젖은 솜 위크와 리마 빈 유충을 함유하는 페트리 디쉬안에서 부화한다. 생물학적 검정을 수행하기 위해서 빈 유충을 수거하고, 단일 관엽의 꼭지를 4ml의 물을 함유하는 프로리스트의 튜브의 고무 막을 통해서 민다. 그 후 유충은 화합물 Ia와 Ib를 함유하는 조 물질 0 내지 12% v/v 범위의 연속 희석액에 담근다. 일단 유충을 건조하고, 8 내지 10초 영 유충을 각 관엽에 놓는다. 곤충, 관엽 및 플로리스트 튜브를 22온스 종이컵에 놓고 미세 망을 씌운다. 컵을 동일한 성장 방에서 시작해서 바퀴벌레 콜로니를 기르는데 사용한다. 매 2일째 컵을 성장 방 롬에서 치우고, 유충을 수거하고, 유충을 처리한 유충으로 대치한다. 표 11에 나타낸 바대로 그 결과는 화합물 Ia와 Ib 조 혼합물이 에필라크나 바리베시스에 대해 활성이 있음을 보인다.
[표 11]
실시예 14 : 렙티노타르사 디셈리네아타(콜로라도 감자 바퀴벌레)에 대한 야외 시도
본 시험은 대조구로 렙티노타르사 디셈리네아타에 대해 화합물 1a와 1b 조 혼합물을 50, 100, 150 및 300g/acre을 노보도르TM0.5와 1.0 quarts/acre와 조합으로, 또한 노보도르TM0.5, 1.0 및 2.0 quarts/acre만을 감자(variety Katahdin)에 적용하여 수행한다. 3분사 시스템 TXVX-12 호로우 콘 노즐/줄로 장비된 백팩 CO2분사기와는 별도로 14일 동안 이 처리를 적용하고 3mph와 56psi에서 32GPA를 움직여 조정한다. 각 처리는 무질서하게 블록 디자인한 2줄(34인치 넓이)×25피트의 플롯에서 4회 반복한다. 렙티노타르사 디셈리네아타 성충과 유충수를 상기로부터 줄/플롯 50피트 이상이 관엽을 흔들지 않고 센다.
도 3에 나타낸 바대로 결과를 화합물 Ia와 Ib의 조 혼합물이 감자에서 노보도르TM과 중요한 상승작용 활성을 제공한다. 화합물 1a와 1b 조 혼합물 50g/acre에서, 13% 대조구를 수득하는 동안 노보도르TM0.5 quarts/acre에서, 21% 대조구를 관찰한다. 그러나 노보도르TM과 화합물 1a와 1b 조 혼합물을 이 비율로 함께 적용할 경우, 대조구 %는 81%로 증가한다. 유사하게 노보도르TM0.5quarts/acre에서, 21% 대조구를 나타내는 동안 화합물 1a와 1b 조 혼합물 50g/acre에서, 13% 대조구를 수득하나 노보도르TM과 화합물 1a와 1b 조 혼합물을 이 비율로 함께 적용할 경우, 대조구 %는 81%로 증가한다. 추가로 50g/acre의 화합물 1a와 1b 조 혼합물과 0.1 quart/acre의 노보도르TM을 함께 적용할 경우 % 대조구는 88%로 증가한다.
[미생물 기탁]
하기 바실러스 투링기엔시스 균주를 부다페스트 조약에 따라 기탁기관[Agricultural Research Service Patent Culture Collection Northern Resional Research Center(NRRL), 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, U.S.A.]에 기탁하였다.
균주수령번호기탁일
EMCC-0077NRRL B-210901993. 5. 10
EMCC-0078NRRL B-210911993. 5. 10
EMCC-0079NRRL B-210921993. 5. 10
EMCC-0080NRRL B-210931993. 5. 10
EMCC-0081NRRL B-210941993. 5. 10
본 균주는 37 C.F.R. §1.14와 35 U.S.C. §122하에서 권한을 부여받은 특허 및 상표청장에 의해 결정된 특허 공보되는 동안 허용될 수령을 확인하는 조건하에서 기탁한다. 기탁은 각 기탁 균주의 실질적인 순수 배양을 나타낸다. 기탁은 주공보 또는 이 결과의 부본을 문서화하는 국가에서 외국 특허법의 필요에 따라 허용된다. 그러나 기탁의 유용성은 정부 조치에 의해 인정되는 특허권이 손상시 본 발명을 실행하는 허가의 구성요소가 되지 않는다.
본 원에서 기술되고 청구되는 발명은 본원에서 상술한 특정 양태, 이러한 양태는 본 발명의 몇가지 관점의 예이므로 이의 범위에 제한되지 않는다. 어떤 동등한 양태에 있어서, 본 발명의 범위 내에 있다. 사실상 본 원에서 나타내고 보여진 것외에 본 발명의 다양한 변형은 앞으로의 기술로부터 당해 기술분야에서 숙련된 사람들에게는 명백하다. 또한 이러한 변형은 청구된 청구한의 범위내에 있다.
본원에서 다양한 문헌을 인용하고, 이들 전체가 본원중 참조로서 인용된다.
Claims (14)
- 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주의 발효 상등액에 상기 균주의 모든 살충 활성이 실질적으로 존재하는 바실러스 투링기엔시스 균주.
- 제1항에 있어서, NRRL B-21090과 동일한 특성을 갖는 균주 EMCC-0077 또는 실질적으로 EMCC-0077과 동일 성질의 이의 돌연변이종, NRRL B-21091과 동일한 특징을 갖는 균주 EMCC-0078 또는 실질적으로 EMCC-0078과 동일 성질을 갖는 이의 돌연변이종, NRRL B-21092와 동일한 특징을 갖는 균주 EMCC-0079 또는 실질적으로 EMCC-0079와 동일 성질을 갖는 이의 돌연변이종, NRRL B-21093과 동일한 특징을 갖는 균주 EMCC-0080 또는 실질적으로 EMCC-0080과 동일 성질을 갖는 이의 돌연변이종, NRRL B-21094와 동일한 특징을 갖는 균주 EMCC-0081 또는 실질적으로 EMCC-0081과 동일 성질을 갖는 이의 돌연변이종으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 바실러스 투링기엔시스 균주.
- 제1항에 있어서, 콜레옵테라목의 해충에 대해 살충 활성을 갖고, 해충에 대한 다른 바실러스 관련 살충제와 함께 작용하는 물질이 당해 균주의 발효 상등액으로부터 수득되는 균주.
- 제3항에 있어서, 물질이 하기 화학식 I의 구조를 갖는 균주.[화학식 I]상기식에서,R1은 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시 또는 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소류시닐, 페닐알라닐, 글리시닐 및 페닐글리시닐을 포함하나 이에 제한되지 않는 아미노산이고,R2는 아미노 또는 알킬(C1-10)이며,R3은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시, 메틸 아민, 디메틸 아민, 티오닐, 메틸 티오닐, 시아노 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이고,R4는 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테프(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이며,R5는 수소, 메톡시, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐 또는 C1-5알콕시이고,R6은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐 또는 C1-5알콕시이며,R7은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이고,R8은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시, 메틸 아민, 디메틸 아민, 티오닐, 메틸 티오닐, 시아노 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이며,R9는 아미노 또는 알킬(C1-10)이고,R10은 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일로 이루어진 그 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시 또는 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소류시닐, 페닐알라닐, 글리시닐 및 페닐글리시닐을 포함하는 아미노산이다.
- 제4항에 있어서, R1이 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소류시닐, 페닐알라닐, 글리시닐 및 페닐글리시닐로 이루어진 그룹중에서 선택되는 아미노산인 균주.
- 제4항에 있어서, R10이 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소류시닐, 페닐알라닐, 글리시닐 및 페닐글리시닐로 이루어진 그룹중에서 선택되는 아미노산인 균주.
- 제4항에 있어서, 물질이 화학식 Ia 또는 Ib의 구조를 갖는 균주.상기식에서,화학식 Ia의 R, R1, R2및 R3는 H이고,화학식 Ib의 R, R1및 R2는 H이며, R3는 OH이다.
- (a) 콜레옵테라목의 해충에 대해 살충 활성을 갖고, 해충에 대해 다른 바실러스 관련 살충제와 함께 작용하며, 바실러스 균주의 모든 살충 활성이 바실러스의 발효 상등액중에 실질적으로 존재하는 바실러스 균주의 발효 상등액으로부터 수득된 물질 및 (b) 살충적으로 효과적인 담체를 포함하는 살충 조성물의 해충-방제 유효량을 해충에 노출시킴을 포함하여, 렙티노타르사 데셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata), 입스 칼리그라푸스(Ips calligraphus), 덴드로크토너스 프론탈리스(Dendroctonus frontalis), 에필라크나 바리바스티스(Epilachra varivestis), 및 폽필리아 자포니카(Popillia japonica)로 이루어진 그룹중에서 선택되는 콜레옵테라목의 해충 종을 방제하는 방법.
- 제1항에 있어서, 하기 화학식 I의 물질 및 (b) 바실러스 관련 살충제인 방법.[화학식 I]상기식에서,R1은 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시 또는 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소류시닐, 페닐알라닐, 글리시닐 및 페닐글리시닐을 포함하나 이에 제한되지 않는 아미노산이고,R2는 아미노 또는 알킬(C1-10)이며,R3은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시, 메틸 아민, 디메틸 아민, 티오닐, 메틸 티오닐, 시아노 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이고,R4는 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테프(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이며,R5는 수소, 메톡시, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐 또는 C1-5알콕시이고,R6은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐 또는 C1-5알콕시이며,R7은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이고,R8은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시, 메틸 아민, 디메틸 아민, 티오닐, 메틸 티오닐, 시아노 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이며,R9는 아미노 또는 알킬(C1-10)이고,R10은 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시 또는 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소류시닐, 페닐알라닐, 글리시닐 및 페닐글리시닐을 포함하는 아미노산이다.
- 제1항에 있어서, 물질이 화학식 Ia 또는 Ib의 구조를 갖는 방법.상기식에서,화학식 Ia의 R, R1, R2및 R3는 H이고,화학식 Ib의 R, R1및 R2는 H이며, R3는 OH이다.
- (a) 콜레옵테라목의 해충에 대해 살충 활성을 갖고, 해충에 대해 다른 바실러스 관련 살충제와 함께 작용하며, 바실러스 균주의 모든 살충 활성이 이 균주의 발효 상등액중에 실질적으로 실질적으로 존재하는 바실러스 균주의 발효 상등액으로부터 수득된 물질과 (b)바실러스 관련 살충제의 살충 활성을 증가시키기에 충분한 양의 살충적으로 효과적인 담체를 포함하는 살충 조성물에 해충을 노출시킴을 포함하여, 바실러스 관련 살충제의 살충 활성을 증진시키는 방법.
- (a) 바실러스 투링기엔시스 균주의 모든 실질적인 살충 활성이 상기 균주의 발효 상등액중에 존재하는 바실러스 투링기엔시스 균주를 적합한 성장 배지에서 배양하고,(b) (a)의 상등액을 회수하며,(c) 단계 (b)의 상등액으로부터 물질을 분리하여 실질적으로 순수한 물질을 수득함을 포함하여, 클레옵테라목의 해충에 대해 살충 활성을 갖고, 해충에 대해 다른 바실러스 관련 살충제와 함께 작용하며, 바실러스 투링기엔시스 균주의 실질적인 모든 살충 활성이 상기 균주의 발효 상등액중에 존재하는 바실러스 투링기엔 시스 균주의 발효 상등액으로부터 수득되는 실질적으로 순수한 물질을 수득하기 위한 방법.
- 제1항에 있어서, 물질이 화학식 I의 화합물 및 (b) 바실러스 관련 살충제인 제1항에 따르는 방법.[화학식 I]상기식에서,R1은 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시 또는 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소류시닐, 페닐알라닐, 글리시닐 및 페닐글리시닐을 포함하나 이에 제한되지 않는 아미노산이고,R2는 아미노 또는 알킬(C1-10)이며,R3은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시, 메틸 아민, 디메틸 아민, 티오닐, 메틸 티오닐, 시아노 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이고,R4는 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테프(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이며,R5는 수소, 메톡시, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐 또는 C1-5알콕시이고,R6은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐 또는 C1-5알콕시이며,R7은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이고,R8은 수소, 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시, 메틸 아민, 디메틸 아민, 티오닐, 메틸 티오닐, 시아노 또는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 카보네이트 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 염이며,R9는 아미노 또는 알킬(C1-10)이고,R10은 아미노, 하이드록시, 알킬(C1-10), 알킬(C1-10)에스테르, 아릴 에스테르(이때 아릴은 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일 및 할로벤조일로 이루어진 그 그룹중에서 선택된다), 할로겐, C1-5알콕시 또는 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소류시닐, 페닐알라닐, 글리시닐 및 페닐글리시닐을 포함하는 아미노산이다.
- 제1항에 있어서, 물질이 하기의 화학식 Ia 또는 Ib의 구조를 갖는 방법.상기식에서,화학식 Ia의 R, R1, R2및 R3는 H이고,화학식 Ib의 R, R1및 R2는 H이며, R3는 OH이다.
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