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KR102760553B1 - 아미노노보란 유도체 및 이의 제조방법과 응용 - Google Patents

아미노노보란 유도체 및 이의 제조방법과 응용 Download PDF

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KR102760553B1
KR102760553B1 KR1020217011382A KR20217011382A KR102760553B1 KR 102760553 B1 KR102760553 B1 KR 102760553B1 KR 1020217011382 A KR1020217011382 A KR 1020217011382A KR 20217011382 A KR20217011382 A KR 20217011382A KR 102760553 B1 KR102760553 B1 KR 102760553B1
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KR
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mmol
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amino
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롱야오 천
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트랜스테라 사이언시즈 (난징), 인크.
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Publication date
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Abstract

본 발명은 식I 구조의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 활성 대사산물, 다형성 물질, 에스테르, 광학 이성질체 또는 프로드러그에 관한 것이고, 식I 구조의 화합물을 포함한 약물 조성물 및 이의 BTK(C481S) 돌연변이체에 대해 높은 선택성을 갖는 브루톤 타이로신 키나제 억제제는 이종 면역성 질환, 자가면역 질환 또는 암을 예방 또는 치료하는 약물의 제조에 사용된다.

식I

Description

아미노노보란 유도체 및 이의 제조방법과 응용
본 발명은 의약 분야에 속하며, 구체적으로는 C481S 돌연변이체에 대해 높은 선택성을 갖는 브루톤 타이로신 키나제 억제제로써의 아미노노보란(Aminonorbornane) 유도체, 이의 약물 조성물, 제조방법 및 약물 제조에서의 용도에 관한 것이다.
B세포 수용체(B-cell receptor, BCR) 신호 경로는 B세포의 성숙, 분화와 성장 단계에서 관건적인 역할을 한다. 비정상 BCR이 매개하는 신호 전달은 탈 조절된(deregulated) B세포 활성화 및/또는 병원성 자가항체를 형성할 수 있고, 암, 자가면역 질환과 이종 면역성 질환을 포함하는 여러 가지 질병을 일으킬 수 있다. 자가면역 질환에는 홍반성 루푸스, 만성 림프구성 림프종, 미만성 거대세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 림프구 백혈병이 포함되며, 이종 면역성 질환에는 염증성 질환, 천식 등이 포함된다.
브루톤 타이로신 키나제(bruton tyrosine kinase, BTK)는 비수용체형 타이로신 키나제 TEC 가족의 일원으로서, BCR 신호 경로 활성화 과정에서 관건적인 역할을 하며, 조기 B세포 형성 및 성숙 B세포 활성화와 생존에 있어서 관건적인 조절제(Khan등, Immunity 1995 3:283; Ellmeier등, J Exp Med 2000 192:1611)이다. Btk는 B세포 증식과 사멸 조절에서 중요한 역할을 하기에(Islam와 Smith, Immunol Rev 2000 178:49；Davis등, Nature 2010 463：88-94), Btk의 이러한 억제 작용을 일부 B세포 림프종과 백혈병의 치료에 사용할 수 있다(Feldhahn등, J Exp Med 2005 201:1837).
자가면역 질환과 염증성 질환에서 Btk의 작용은 이미 Btk-결손형 작은 쥐 모델을 통해 입증되었다. 전신 홍반성 루푸스(SLE)를 앓는 임상전 마우스 모델에서, Btk-결손형 작은 쥐는 질병 진행에서 뚜렷한 개선을 보였다. 이외, Btk-결손형 작은 쥐는 콜라겐 단백질 유도 관절염에 대해 내성을 가지는 것으로 나타났다(Jansson와 Holmdahl, Clin Exp Immunol 1993 94:459). 선택성 Btk 억제제는 작은 쥐 관절염 모델에서 뚜렷한 용량-반응 관계를 가진다(Pan등, Chem.Med.Chem. 2007 2:58-61). 현재 Btk 억제제로 관절염을 치료하는 임상적 연구가 진행 중이다.
이브루티닙(Ibrutinib, 상품명 Imbruvica)은 최초로 시장에 출시된 브루톤 타이로신 키나제(BTK) 억제제로서 큰 성공을 거뒀으며, 2017년 총 판매액은 26억 달러에 달했다. 그러나 수많은 다른 항암 약물과 마찬가지로, 일부 환자들은 해당 약물에 대한 내성을 보였다. 연구에 따르면, BTK키나제의 C481S 돌연변이는 약물 내성 발생의 주요 원인이다. 이브루티닙은 BTK 키나제의 C481 트립토판 잔기와의 비가역 공유 결합을 통해 약효를 발휘한다. C481S 돌연변이가 발생하면 트립토판은 세린으로 전환되어, 트립토판 잔기는 이브루티닙과 공유 결합하는 능력을 잃게 된다.
임상적 통계에 따르면, 재발성 만성림프구성백혈병(CLL) 환자 중 87%에서 BTK(C481S) 돌연변이가 일어났으며(Woyach등, J Clin Oncol 2017 35:1437-1443), 재발성 외투세포림프종(MCL) 환자 중 80%에서 BTK(C481S) 돌연변이가 일어났다(Chiron등,Cancer Discovery 2014 4(9): 1-14). BTK(C481S) 돌연변이체에 유효한 BTK 억제제 개발은 C481S 돌연변이로 인한 이브루티닙의 약물 내성 문제를 해결할 수 있을 것으로 전망된다.
본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 문제는, 참신하고 문헌에서 보고된 바 없는, BTK(C481S) 돌연변이체에 대해 높은 선택성을 갖는 브루톤 타이로신 키나제 억제제 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 활성 대사산물, 다형성 물질, 에스테르, 광학 이성질체 또는 프로드러그, 상기 화합물이 약물 제조에서의 용도 및 본 발명의 화합물을 사용하여 사람과 포유동물에서 Btk의 과도 활성화와 관련된 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명에서 제공하는 기술적 방안은 다음과 같다:
식(I)의 화합물
(I)
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 활성 대사산물, 다형성 물질, 에스테르, 광학 이성질체 또는 프로드러그에 있어서,
고리 A는 다음과 같은 구조 중 하나에서 선택되며:
R5은 수소, 할로겐, 시아노, 히드록시, 알키닐, 아미노, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, C1-3할로알킬, C1-3 할로알콕시, C1-3 할로알킬아미노 , C3-7 시클로알킬, C3-7 시클로알콕시, C3-7 시클로알킬아미노에서 선택되며;
고리 B는 치환 또는 비치환된 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리이고; 고리 C는 치환 또는 비치환된 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리이며;
L은 단일 결합 또는 다음과 같은 구조 중 하나로 되어 있고:
R1은 R3 또는 다음과 같은 구조 중 하나에서 선택되며,
여기서, R3은 수소, 치환 또는 비치환된 C1-6 알킬, 치환 또는 비치환된 C1-6 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-6 알케닐, 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴, 치환 또는 비치환된 C1-9헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-7 헤테로시클로알킬아미노에서 선택되고;
R4은 수소, 치환 또는 비치환된 C1-6 알킬, 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴,치환 또는 비치환된 C1-9 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-7 헤테로시클로알킬에서 선택되며;
R2은 H, 치환 또는 비치환된 C1-3 알킬, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-7 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴 또는 치환 또는 비치환된 C1-9 헤테로아릴에서 선택된다.
R1, R2 및 이와 연결된 N이 치환 또는 비치환된 C2-7 헤테로 고리를 형성하고, R3, R4 및 이와 연결된 N이 C3-7 헤테로사이클 아미노 또는 C3-9 헤테로아릴아미노를 형성 또는 형성하지 않는다.
바람직하게는, 상기 R3에서 치환된 C1-6 알킬, 치환된 C1-6 알키닐, 치환된 C1-6 알케닐, 치환된C6-10 아릴, 치환된 C1-9 헤테로아릴, 치환된 C3-7 시클로알킬, 치환된 C2-7 헤테로사이클 알킬 중의 치환기는 할로겐, 시아노, 히드록시, 아미노, 치환 또는 비치환된 아실아미노, 치환 또는 비치환된 아미노아실, 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알콕시, 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬아미노, II[치환 또는 비치환된 C1-4 알킬]아미노, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알킬아미노, 치환 또는 비치환된 C3-7 헤테로시클로알킬아미노, 치환 또는 비치환된 C1-3 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알콕시, 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴 또는 치환 또는 비치환된 C3-7 헤테시클로알킬 중의 한 개 또는 여러 개에서 선택된다.
바람직하게는, 상기 R4에서 치환된 C1-6 알킬, 치환된 C6-10 아릴, 치환된 C1-9 헤테로아릴, 치환된 C3-7 시클로알킬, 치환된 C3-7 헤테로시클로알킬에서 치환기는 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, 치환 또는 비치환된 C1-4 알케닐, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알콕시, 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬아미노, II[치환 또는 비치환된 C1-4 알킬] 아미노, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알킬아미노, 치환 또는 비치환된 C3-7 헤테로시클로알킬아미노, 치환 또는 비치환된 C1-3 알콕시, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알콕시, 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴 또는 치환 또는 비치환된 C3-7 헤테로시클로알킬 중의 한 개 또는 여러 개에서 선택된다.
바람직하게는, 상기 고리 A는 다음에 표시된 식과 같은 구조를 가지며:
R5은 수소, 할로겐, 시아노, 히드록시, 알키닐, 아미노, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, C1-3 할로알킬, C1-3 할로알콕시, C1-3 할로알킬아미노 , C3-7 시클로알킬, C3-7 시클로알콕시, C3-7 시클로알킬아미노에서 선택되며;
바람직하게는, 상기 고리 B에서 치환된 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리에서 치환기는 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, C1-3 할로알킬, C1-3 할로알콕시 중의 한 개 또는 여러 개에서 선택된다.
바람직하게는, 상기 고리 B는 다음에 표시된 식과 같은 구조를 가지며:
바람직하게는, 상기 고리 C 중 치환된 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리에서 치환기는 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, C1-3 할로알킬, C1-3 할로알콕시 중의 한 개 또는 여러 개에서 선택된다.
바람직하게는, 상기 고리 C는 다음에 표시된 식과 같은 구조를 가지며:
바람직하게는, R2은 H에서 선택되고, R1은 에서 선택되고, 여기서 R3은 수소, 치환 또는 비치환된 C1-6 알킬, 치환 또는 비치환된 C1-6 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-6 알케닐, 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴, 치환 또는 비치환된 C1-9 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-7 헤테로시클로알킬아미노에서 선택된다.
가장 바람직하게는, 상기 화합물은 다음에 표시된 임의의 한 개 구조로부터 선택된다:
상기 임의의 한 항에 따른 화합물이 이종 면역성 질환, 자가면역 질환 또는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 제조하는데 있어서의 용도를 제시한다.
여기서, 상기 이종 면역성 질환, 자가면역 질환 또는 암은 브루톤 타이로신 키나제 억제제의 과도한 활성과 관련되어 있다.
여기서, 상기 이종 면역성 질환, 자가면역 질환 또는 암은 이상 B세포 증식과 관련되어 있다.
보다 구체적으로, 상기 이종 면역성 질환은 염증성 질환 또는 천식이다.
보다 구체적으로, 상기 자가면역 질환은 홍반성 루푸스, 만성 림프구성 림프종, 미만성 거대세포 림프종, 여포성 림프종 또는 만성 림프구 백혈병이다.
상기 임의의 한 항에 따른 한 개 또는 여러 개의 화합물을 포함하는 약물 조성물을 제공한다.
치료 유효량 이상의 상기 임의의 한 항에 따른 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약물 제제를 제공한다.
상기 약물 제제는 경구 투여, 비경구 투여, 구강 투여, 비강 투여, 국소 투여 또는 직장 투여로부터 선택된 투여 경로에 사용되도록 제조한다.
상기 약물 제제는 브루톤 타이로신 키나제의 과도한 활성과 관련된 질환 또는 증상을 치료하는데 사용되며, 그 방식에는 필요한 사람 또는 포유동물에 상기 약물 제제를 투여하는 것이 포함되며; 상기 브루톤 타이로신 키나제의 과도한 활성과 관련된 질환은 이종 면역성 질환, 자가면역 질환 또는 암이며; 상기 이종 면역성 질환은 염증성 질환, 천식이며; 상기 자가면역 질환은 홍반성 루푸스, 만성 림프구성 림프종, 미만성 거대세포 림프종, 여포성 림프종 또는 만성 림프구 백혈병이다.
본 발명에는 상기 약물 제제와 Btk의 접촉 단계가 포함되며, 상기 접촉 단계에는 체외 또는 체내 시험이 포함된다.
상기 화합물의 제조방법 1: 화합물 IIIA와 붕산 또는 붕산에스테르 II의 Suzuki 결합 반응을 통해 화합물 IV를 얻는 단계 (S1); 화합물 IV를 트리플루오로아세트산으로 처리하여 벤질옥시카르보닐을 제거한 후 화합물 V의 염산염으로 전환시키는 단계 (S2); 화합물 V와 유기산의 결합 반응을 통해 상기 화합물 I를 얻는 단계 (S3)를 포함하며;
여기서 X=할로겐, R2, R3, L, 고리 A, 고리 B와 고리 C는 상술한 바와 같다.
상기 화합물 I의 제조방법 2는 화합물 IIIA를 트리플루오로아세트산으로 처리하여 벤질옥시카르보닐을 제거한 후 화합물 VI의 염산염으로 전환시키는 단계 (A1); 화합물 VI와 유기산의 결합 반응을 통해 화합물 VII를 얻는 단계 (A2); 화합물 VII와 붕산 또는 붕산에스테르 II의 Suzuki 결합 반응을 통해 상기 화합물 I를 얻는 단계 (A3)를 포함하며;
여기서 X=할로겐, R2, R3, L, 고리 A, 고리 B와 고리 C는 상술한 바와 같다.
상기 화합물 I의 제조방법 3은 화합물 IIIB와 붕산 II를 아세트산 구리 촉매작용 하에서 Chan-Lam-Evans 결합 반응을 통해 화합물 VIII를 얻는 단계 (B1); 화합물 VIII를 트리플루오로아세트산으로 처리하여 벤질옥시카르보닐을 제거한 후 화합물 IX의 염산염으로 전환시키는 단계 (B2); 화합물 IX와 유기산의 결합 반응을 통해 상기 화합물 I을 얻는 단계 (B3)를 포함하며;
여기서, R2, R3, L, 고리 A, 고리 B와 고리 C는 상술한 바와 같다.
방법 1, 2 및 3의 반응을 통해 얻은 각 산물은 종래의 분리 기술을 통해 얻을 수 있으며, 이러한 종래 기술에는 여과, 증류, 결정, 크로마토그래피 분리가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 합성에 필요한 원재료는 자체로 합성하거나, Adrich 또는 Sigma를 포함하되 이에 국한되지 않는 업체에서 구매할 수 있다. 이러한 원재료는 물리적 상수, 스펙트럼 데이터와 같은 일반적인 방식으로 특성화할 수 있다. 본 발명에서 서술한 화합물은 합성을 통해 단일 광학이성질체 또는 광학 이성질체 혼합물을 얻을 수 있다.
본 발명에서 자모의 위첨자는 원자단의 부호를 표시하며, 아래첨자는 해당 원자의 개수를 표시한다. 예를 들어, R1, R2, R3은 1개 내지 3개의 R 원자단을 표시하며, C1-4 알킬은 1개 내지 4개 C원자의 알킬이 포함되어 있음을 나타낸다. 치환기의 C 원자 수는 메인 사슬에 포함시키지 않는다.
도 1은 OCI-LY10 이종이식 종양 모델이다.
도 2는 TMD-8 이종이식 종양 모델이다.
하기 실시예에 따라 본 발명을 보다 구체적으로 이해할 수 있다. 단, 당업자는 실시예에서 설명한 내용은 단지 본 발명을 설명하기 위함이며, 권리청구서에서 구체적으로 설명한 본 발명을 제한하기 위함이 아니고 또 제한해서도 안된다는 점을 이해할 수 있을 것이다.
중간체 I-5의 합성
중간체 I-5의 합성 경로
4-(벤질옥시카르보닐아미노)바이시클로[2.2.1]헵테인-1-카르복실산메틸에스테르I-2
4-(메톡시카르보닐)바이시클로[2.2.1]헵테인-1-카르복시산I-1(3.5g, 17.7mmol)과 TEA(1.78g, 17.7mmol)의 톨루엔(30mL) 용액에 DPPA(5.34g, 19.5mmol)를 추가한다. 혼합물을 90℃까지 가열한 후 2시간 동안 유지한다. 실온으로 냉각한 후 BnOH(1.9g, 17.7mmol)를 추가한다. 반응물을 90℃에서 4일간 교반한다. 실온으로 냉각한 후, 아세트산에틸로 희석한 다음 NaHCO3 수용액으로 세척하여 유기상을 분리한 다음 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:4를 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여 원하는 화합물 I-2를 3g 얻었다. 수율은 56％였다.
4-(벤질옥시카르보닐아미노)바이시클로[2.2.1]헵테인-1-카르복시산 I-3
4-(벤질옥시카르보닐아미노)바이시클로[2.2.1]헵테인-1-카르복실산메틸에스테르 I-2(3g, 9.9mmol) 용액에 NaOH(792mg,19.8mmol)를 추가하고, 혼합물을 60℃까지 가열한 후, 10시간 유지한다. 농축 후, 물(50mL)을 추가하고, 1N HCl 수용액으로 pH를 4까지 조절한다. 아세트산에틸(3Х20mL)로 추출한 다음 유기상을 분리하여 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 원하는 화합물 I-3을 2.2g 얻었다. 수율은 77%였다. 이 화합물은 정제 과정 없이 다음 단계에 직접 사용한다.
4-카르바모일바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트I-4
화합물 I-3(2g, 6.9mmol)과 Et3N(1g, 10mmol)의 DCM(20mL) 용액에 0℃의 클로로이소부틸에스테르(1.36g, 10mmol)를 적가한다. 0℃에서 혼합물을 20분간 교반하고, NH4OH(10mL)를 적가한 후 실온에서 10분간 교반한다. 이 혼합물을 물(30mL)에 부어 넣은 후, 유기상을 분리하고, DCM(2x15mL)으로 수용액을 추출한 후, 혼합된 유기상을 Na2SO4으로 건조, 여과 및 농축한다. 이를 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, EA/PE(1:1)-EA/MeOH(10:1)로 용리한다. 원하는 화합물 I-4를 1.7g 얻었다. 수율은 85%였다.
4-아미노바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 I-5
화합물 I-4(1.6g, 5.55mmol)와 히드록시기(톨루엔설폰실록시)요오드벤젠(2.17g, 5.55mmol) 용액을 ACN(20mL)에서 1시간 동안 가열 및 회류시킨다. 용매가 증발된 후 이에 1M NaOH(12mL)를 추가하고, EA(2x15mL)로 이를 추출한 후, Na2SO4으로 유기상을 건조, 여과 및 농축한다. 이를 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = (10:1)로 용리한다. 원하는 화합물 I-5를 920mg 얻었다. 수율은 64％였다. LC-MS m/z = 261.1[M+1]+.
중간체 붕산 II의 합성
중간체 II-1의 합성 경로
4-브롬-N-(피리딘-2-일)벤즈아미드
빙욕에서 4-브로모벤조산(5g, 24.8mmol)과 피리딘-2-아민(4.68g, 49mmol)의 피리딘(30mL) 혼합물에 POCl3(11.4g, 74mmol)를 적가한다. 실온에서 현탁액을 20분간 교반한다. 반응물을 물(100mL)에 부어 넣고 아세트산에틸(3x40mL)로 추출한다. 포화 NaCl 수용액(2x50mL)으로 유기상을 세척한다. 무수 Na2SO4으로 유기상을 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 아세트산에틸/석유 = 1:9~1:1로 정제하여, 산물 4-브롬-N-(피리딘-2-일)벤즈아미드(3.28g, 48％)를 얻었다. LC-MS m/z = 277.0[M+1]+.
N-(피리딘-2-일)-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미드
4-브롬-N-(피리딘-2-일)벤즈아미드(2g, 7.22mmol), 4,4,5,5-테트라(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-1,3,2-디옥사보롤란(2.75g, 10.83mmol), PdCl2(dppf)(527mg, 0.72mmol)과 KOAc(235mg, 2.4mmol)를 벤젠(30mL) 혼합물에서 110℃까지 가열하여 6시간 유지한다. 반응액을 증발한 후 물(100mL)을 추가한다. 이를 아세트산에틸(2x40mL)로 추출한다. 유기상을 분리한 후, 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 아세트산에틸/석유 = 1:4~1:1로 정제하여, 산물 N-(피리딘-2-일)-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미드(2g, 85％)를 얻었다.
4-((피리딘-2-일카르바모일)페닐)붕산 II-1
N-(피리딘-2-일)-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미드(2g, 6.2mmol)의 THF:H2O(24mL:6mL) 혼합 용매 용액에 NaIO4(3.27g, 18.6mmol)를 추가하고, 실온에서 30분간 교반한다. 2N HCl 수용액(1.65mL)을 추가한다. 이 혼합물을 실온에서 3시간 교반한다. 아세트산에틸로 혼합물을 희석한 다음 염수로 세척한다. 유기상을 분리한 후, 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 농축한다. MeOH/DCM = 1:10 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여 산물 (피리딘-2-일-카르바모일)페닐붕산 II-1(1.4g, 93％)을 얻었다. LC-MS m/z = 243.1[M+1]+.
중간체 II-2의 합성 경로
4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)염화벤조일
빙욕에서 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조산(10g, 40mmol)과 1방울의 DMF의 DCM(100mL) 용액에 옥살릴클로라이드(10.2g, 80mmol)를 적가한다. 이 혼합물을 0℃에서 30분간 교반한 후, 실온으로 가열하여 3시간 동안 유지한다. 농축 후의 이 산물은 정제 과정 없이 다음 단계에 직접 사용한다.
N-(4-플루오로피리딘-2-일)-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미드
4-플루오로피리딘-2-아민(421mg,3.76mmol)의 피리딘(3mL) 용액에 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리딘-2-일)염화벤조일(1g, 3.76mmol)의 DCM(6mL) 용액을 넣은 후 현탁액을 0℃에서 30분간 교반한다. 이를 물에 부어 넣고 DCM (2Х20mL)으로 추출하여, 포화 NaCl 수용액으로 유기상을 세척하고, 분리 후에 무수 Na2SO4으로 건조한다. 증발 후 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 아세트산에틸/석유 = 1:9로 정제하여, 산물(1.04g, 81%)을 얻었다. LC-MS m/z = 343.2[M+1]+.
4-((4-플루오로피리딘-2-일)카르바모일)페닐붕산 II-2
N-(4-플루오로피리딘-2-일)-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미드(1.04g, 3.04mmol)의 THF:H2O(24mL:6mL) 혼합 용매 용액에 NaIO4(1.9g, 9.12mmol)를 추가하고, 실온에서 30분간 교반한다. HCl 수용액(1.65mL)을 추가한다. 이 혼합물을 실온에서 3시간 교반한다. 아세트산에틸로 혼합물을 희석한 다음 염수로 세척한다. 유기상을 분리한 후, 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 농축한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 MeOH/DCM = 1:10으로 정제한다. 산물 II-2(648mg, 82％)를 얻었다. LC-MS m/z = 261.1[M+1]+.
4-((4-트리플루오로메틸)피리딘-2-일)카르바모일)페닐붕산 II-3
4-(트리플로오로메틸)피리딘-2-아민(609mg, 3.76mmol)과 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리딘-2-일)염화벤조일(1 g, 3.76 mmol)을 원료로, II-2와 동일한 합성방법으로 원하는 화합물 607mg을 얻었다. LC-MS m/z = 311.1[M+1]+.
4-((4-메틸 피리딘-2-일)카르바모일)페닐붕산 II-4
4-메틸-피리딘-2-아민(406mg, 3.76mmol)과 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리딘-2-일)염화벤조일(1g, 3.76 mmol)을 원료로, II-2와 동일한 합성방법으로 원하는 화합물 589mg을 얻었다. LC-MS m/z = 257.1[M+1]+.
4-((4-시아노피리딘-2-일)카르바모일)페닐붕산 II-5
4-시아노-피리딘-2-아민(447mg, 3.76mmol)과 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리딘-2-일)염화벤조일(1g, 3.76 mmol)을 원료로, II-2와 동일한 합성방법으로 원하는 화합물 465mg을 얻었다. LC-MS m/z = 268.0[M+1]+.
중간체 II-6의 합성 경로
4-브롬-2-플루오린-N-(피리딘-2-일)벤즈아미드
빙욕에서 4-브롬-2-플루오로벤조산(1g, 4.56mmol)의 DCM(30mL) 용액에 옥살릴클로라이드(1.16g, 9.13mmol)를 추가한 다음 1방울의 DMF를 적가한다. 실온에서 혼합물을 3시간 동안 교반한다. 이를 농축한 후 DCM(6mL)에 용해시켜, 0℃에서 해당 용액을 피리딘-2-아민(428mg, 4.56mmol)이 추가된 피리딘(3mL) 용액에 첨가한 후 현탁액을 0℃에서 30분간 교반한다. 이를 물에 부어 넣고 DCM(2Х20mL)으로 추출하여, 포화 NaCl 수용액으로 유기상을 세척하고, 분리 후에 무수 Na2SO4으로 건조한다. 증발 후 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 아세트산에틸/석유 = 1:9로 정제하여, 산물(1.05g, 78%)을 얻었다. LC-MS m/z = 295.0[M+1]+.
2-플루오린-N-(피리딘-2-일)-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미드
4-브롬-2-플루오린-N-(피리딘-2-일)벤즈아미드(1.05g, 3.55mmol), (4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-1,3,2-디옥사보롤란(1.36g, 5.3mmol), PdCl2(dppf)(260mg, 0.36mmol)과 KOAc(1.04g, 10.65mmol)의 벤젠(30mL) 용액을 110℃까지 가열하여 6시간 유지한다. 반응물을 증발시킨 후 물(100mL)을 추가한다. 이를 아세트산에틸(2Х40mL)로 추출한다. 유기상을 분리한 후, 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 아세트산에틸/석유에테르 = 1:4~ 1:1로 정제하여, 원하는 산물(971mg, 80%)을 얻었다.
3-플루오린-4(피리딘-2-일-카르바모일)페닐붕산 II-6
2-플루오린-N-(피리딘-2-일)-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미드(970mg, 2.84mmol)의 THF:H2O(24mL:6mL) 혼합 용매 용액에 NaIO4(1.8g, 8.52mmol)를 추가하고, 실온에서 30분간 교반한다. HCl 수용액(1.65mL)을 추가한다. 이 혼합물을 실온에서 3시간 교반한다. 아세트산에틸로 혼합물을 희석한 다음 염수로 세척한다. 유기상을 분리한 후, 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 농축한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 MeOH/DCM = 1:10으로 정제한다. 산물 II-6(605mg, 82％)을 얻었다. LC-MS m/z = 261.1[M+1]+.
(4-(티아졸-2-일-카르바모일)페닐)붕산 II-7
티아졸-2-아민(376mg, 3.76mmol)과 4-((4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리딘-2-일)염화벤조일(1g, 3.76mmol)을 원료로, II-2와 동일한 합성방법으로 원하는 화합물II-7을 580mg 얻었다. LC-MS m/z = 249.1[M+1]+.
2-플루오린-4(피리딘-2-일-카르바모일)페닐붕산 II-8
4-브롬-3-플루오린-벤조산과 피리딘-2-아민을 원료로, II-1과 동일한 합성방법을 사용하여 원하는 화합물 II-8을 138mg 얻었다. LC-MS m/z = 261.0[M+1]+.
2-플루오린-4-((4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)카르바모일)페닐붕산 II-9
4-브롬-3-플루오린-벤조산과 4-(트리플루오로메틸)-피리딘-2-아민을 원료로, II-1과 동일한 합성방법을 사용하여 원하는 화합물 II-9를 130mg 얻었다. LC-MS m/z = 329.0[M+1]+.
2-메톡시-4-((4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)카르바모일)페닐붕산 II-10
4-브롬-3-메톡시벤조산(1g, 4.36mmol)과 4-(트리플루오로메틸)-피리딘-2-아민(706mg, 4.36mmol)을 원료로, II-6과 동일한 합성방법을 사용하여 원하는 화합물 II-10을 440mg 얻었다. LC-MS m/z =341.0[M+1]+ .
중간체 붕산에스테르 II-11의 합성 경로
N-(4-브로모벤질)-2-메톡시벤즈아미드
4-브로모벤질아민(1g, 5.38mmol), 2-메톡시벤조산(818mg, 5.38mmol), HATU(2.45g, 6.46mmol)와 DIEA(1.39g, 10.76mmol)는 DMF(20mL), 실온에서 2시간 교반한다. 이를 물(50mL)에 부어 넣고 여과한다. 물(2Х30mL)로 세척 후 건조한다. 정제할 필요 없이 다음 단계에 직접 사용할 수 있다. 원하는 화합물 1.6g을 얻었다. 수율은 93%였다.
N-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질)-2-메톡시벤즈아미드 II-11
N-(4-브로모벤질)-2-메톡시벤즈아미드(1.6g, 5mmol), 4,4,5,5-테트라메틸-2-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3-디옥솔란-2-일)-1,3,2-디옥사보롤란(1.9g, 7.5mmol), PdCl2dppf(365mg, 0.5mmol)과 KOAc(1.47g, 15mmol)의 다이옥세인(30mL) 용액을 100℃까지 가열하고, 6시간 유지한다. 혼합물을 농축하여, 물(100mL)을 추가하고, 이를 아세트산에틸(2Х 20mL)로 추출한다. 유기상을 분리하고, Na2SO4으로 건조, 여과, 농축한 다음, 아세트산에틸/석유 = 1:9를 사용해 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제한다. 원하는 화합물 II-11을 1.5g 얻었다. 수율은 82%였다.
N-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질)-5-플루오린-2-메톡시벤즈아미드 II-12
5-브롬-2-메톡시벤조산(915mg, 5.38mmol)과 4-브로모벤질아민(1g, 5.38mmol)을 원료로, II-11과 동일한 합성방법을 사용하여 원하는 화합물 II-12를 900mg 얻었다.
N-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질)-4-플루오린-2-메톡시벤즈아미드 II-13
4-플로오린-2-메톡시벤조산(915mg, 5.38mmol)과 4-브로모벤질아민(1g, 5.38mmol)을 원료로, II-11과 동일한 합성방법을 사용하여 원하는 화합물 II-13을 1g 얻었다.
중간체 A-4의 합성 경로
4-(((3-클로로피라진-2-일)메틸)카르바모일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일벤질 카바메이트 A-1
4-(벤질옥시카르보닐)바이시클로[2.2.1]헵테인-1-카르복시산(2g, 6.9mmol), HATU(2.89g, 7.6mmol), DIEA(3.56g, 27.6mmol)와 (3-클로로피라진-2-일)메틸아민의 염산염(1.3g, 7.24mmol) DMF(20mL) 용액을 실온에서 6시간 교반한다. 물(100mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2Х30mL)로 추출한다. 포화 NaCl 수용액으로 유기상을 세척한다. 유기상을 분리한 후, Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1~1:0을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-1을 2g 얻었다. 수율은 70%였다. LC-MS m/z = 414.9[M+1]+.
4-(8-클로로이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 A-2
4N-(((3-클로로피라진-2-일)메틸)벤질 카바메이트)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 A-1(2g, 4.83mmol)의 ACN(30mL) 용액에 피리딘(381mg,4.83mmol)과 PCl5(4g, 19.32mmol)을 추가한 후, 혼합물을 56℃까지 가열하여, 1시간 유지한다. 실온까지 냉각한 후 100mL 얼음의 포화 NaHCO3 수용액에 천천히 부어 넣는다. pH를 9로 조정한 후 아세트산에틸(2Х30mL)로 추출한다. 포화 NaCl 수용액으로 유기상을 세척한다. 유기상을 분리한 후, Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-2를 1.5g 얻었다. 수율은 78%였다.
4-(8-클로로-1-요오드이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 A-3
4-(8-클로로이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 A-2(1.5g, 3.79mmol)와 NIS(1.13g, 5.04mmol)의 DMF(10mL) 혼합 용액을 N2 상태에서 60℃까지 가열하고, 10시간 교반한다. 실온으로 냉각한 후 물(100mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2Х30mL)로 추출한다. 포화 NaCl 수용액으로 유기상을 세척한다. 유기상을 분리한 후, Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 2:3을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여 원하는 화합물 A-3을 1.52g 얻었다. 수율은 77％였다.
4-(8-아미노-1-요오드이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 A-4
화합물 A-3(1.5g, 2.87mmol)의 IPA(15mL) 현택액에 NH4OH(3mL)를 추가하여, 혼합물을 110℃까지 가열한 후 6시간 유지한다. 농축한 후 20mL 포화 NaHCO3 수용액을 추가한다. 아세트산에틸(2Х30mL)로 추출한다. 포화 NaCl 수용액으로 유기상을 세척한다. 유기상을 분리한 후, Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-4를 1.1g 얻었다. 수율은 77%였다.
중간체 B-3의 합성 경로
4-(4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 B-1
2-(4,6-디클로로피리미딘-5-일)아세트알데히드(735mg, 3.8mmol), 4-아미노바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트(1g, 3.8mmol)와 Et3N(389mg, 3.8mmol)의 EtOH(20mL) 용액을 80℃까지 가열하여, 16시간 유지한다. 이를 농축하고 물(20mL)을 추가한 후, 아세트산에틸(2Х20mL)로 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 그런 다음 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 EA/PE = 1: 4로 정제하여, 원하는 화합물 B-1을 1.25g 얻었다. 수율은 83％였다. LC-MS m/z = 397.1[M+1]+.
4-(4-클로로-5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 B-2
화합물 B-1(1.25g, 3.16mmol)의 DMF(10mL) 현택액에 NIS(950mg, 4.2mmol)을 추가하고, 혼합물을 60℃까지 가열하여, 6시간 유지한다. 이에 물(20mL)을 추가한 후, 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 그런 다음 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 EA/PE = 1:4로 정제하여, 원하는 화합물 1.09g을 얻었다. 수율은 66%였다. LC-MS m/z = 523.1[M+1]+.
4-(4-아미노-5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 B-3
4-(4-클로로-5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트B-2(1.09g, 2.08mmol)의 IPA(10mL) 용액에 NH4OH(2mL)를 넣고 혼합물을 110℃까지 가열하여 6시간 유지한다. 혼합물을 농축한 후 NaHCO3 수용액에 부어 넣고, DCM(2Х20mL)으로 추출한다. 유기상을 분리하여, 건조 및 여과시킨 후, 이를 농축시켜 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 MeOH/DCM = 1:20으로 정제하여 원하는 화합물 B-3을 900mg 얻었다. 수율은 86％였다.
중간체 C-4의 합성 경로
4-(6-클로로-5-니트로피리미딘-4-일 아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 C-1
4,6-디클로로-5-니트로피리미딘(518mg, 2.68mmol), 4-아미노바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 I-5(698mg, 2.68mmol)와 Et3N(1.1g, 10.72mmol)의 DCM(20mL) 용액을 실온에서 4시간 교반한다. 용매를 제거하고 잔류물을 아세트산에틸(50mL)로 처리하고, 포화 NaCl 수용액으로 세척한다. 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 EA/PE = 1: 4로 정제한다. 원하는 화합물 C-1을 633mg 얻었다. 수율은 57％였다.
4-(5-아미노-6-니트로피리미딘-4-일-아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 C-2
화합물 C-1(400mg,0.96mmol)의 혼합 용매(EtOH/H 2 O = 20mL/4mL) 용액에 Fe 분말(268mg, 4.8mmol)과 NH4Cl(254mg, 4.8mmol)을 추가한다. 혼합물을 회류할 때까지 1시간 가열한다. 실온까지 냉각한 후, MeOH(10mL)로 세척하고, 액체를 농축 및 여과하고, 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 EA/PE = 1:4로 정제한다. 원하는 화합물 C-2를 292mg 얻었다. 수율은 79%였다.
4-(6-클로로-8-옥소-7,8-디히드로푸린-9-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 C-3
0℃에서, 화합물 C-2(290mg, 0.75mmol)의 DCM(10mL) 용액에 Et3N(166mg, 1.5mmol)과 트리포스겐(291mg, 0.9mmol)을 추가한 다음 0℃에서 교반한다. 2시간 유지한다. 이를 물(20mL)에 부어 넣은 후, 유기상을 분리하고, DCM(2Х10mL)으로 수용액을 추출한 후 분리한다. Na2SO4로 혼합된 유기상을 건조, 여과 및 농축시켜 C-3 조제물 316mg을 얻었다. 이 산물은 정제 과정 없이 다음 단계에 직접 사용한다.
4-(6-아미노-8-옥소-7,8-디히드로푸린-9-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 C-4
화합물 C-3(310mg, 0.75mmol)의 IPA(10mL) 용액에 NH4OH(2mL)를 넣고 혼합물을 150℃까지 가열하여 24시간 유지한다. 농축한 후 NaHCO3 수용액에 부어 넣고, DCM(2Х20mL)으로 추출하고, 유기상을 분리하여, 건조 및 여과한다. 이를 농축시켜 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 MeOH/DCM = 1:20으로 정제하여 원하는 화합물 C-4를 100mg 얻었다. 수율은 34%였다. LC-MS m/z = 395.1[M+1]+.
중간체 D-5의 합성 경로
벤질 4-(6-클로로-5-포름알데히드피리미딘-4-일-아미드)바이시클로[2.2.1]헵테인-1-일-카바메이트 D-1
I-5(1.47g, 5.65mmol), 4,6-디클로로피리미딘-5-포름알데히드(1g, 5.65mmol), 트리에틸아민(1.15g, 11.4mmol)의 DCM(20mL) 혼합 용액을 실온에서 하룻 밤 동안 교반한다. EA(50mL)으로 반응액을 희석하고, 물(2x30mL)로 세척한다. 무수 Na2SO4로 유기상을 건조, 여과 및 농축한다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용해 석유에테르/아세트산에틸(1:1)로 잔류물을 용리하여, 원하는 산물 D-1(1.24g, 55%)을 얻었다. LC-MS m/z = 401.0 [M + 1] +.
(E)-벤질 4-(6-클로로-5-(히드록시이미도)메틸)피리미딘-4 일아미드)바이시클로[2.2.1]헵테인-1-일-카바메이트 D-2
D-1(1.2g, 3.0mmol), 히드록실아민-O-술폰산(0.41g, 3.6mmol)의 DCM/ACN(50mL/50mL) 혼합 용액을 실온에서 16시간 교반한 다음 50oC에서 6시간 교반한다. 냉각 후, 10mL로 농축시키고, 고체를 여과하여 ACN(2mL)으로 세척하여, 원하는 산물 D-2(1.0g, 81%)를 얻었다. LC-MS m/z = 416.0 [M + 1] +.
벤질 4-(4-클로로-1H-피라조로[3,4-d-]피리미딘-1-일)바이시클로[2.2.1]헵테인-1-일-카바메이트 D-3
D-2(1.0g, 2.41mmol)의 DCM(100mL) 용액에 DIEA(4mL)를 추가한다. 그런 다음 TsCl(0.23mL, 2.9mmol)을 적가한다. 혼합물을 실온에서 3시간 교반한다. 물(100mL)로 반응 혼합물을 처리한다. 염수(2x30mL)를 사용하여 유기상을 세척하고, 무수 Na2SO4를 사용하여 건조, 여과 및 농축한다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 방법으로 잔류물을 정제하고, 아세트산에틸/석유에테르(1:6)로 용리하여, 원하는 산물 D-3(400mg, 42%)을 얻었다. LC-MS m/z = 398.1 [M + 1] +.
벤질 4-(4-아미노-1H-피라조로[3,4-d-]피리미딘-1-일)바이시클로[2.2.1]헵테인-1-일-카바메이트 D-4
D-3(400mg, 1.0mmol), 암모니아(30%, 5mL)의 이소프로필알코올(20mL) 혼합물을 마개로 막은 튜브에서 120oC까지 가열한 후 6시간 교반한다. 용매를 증발 및 건조시키고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 방법으로 잔류물을 정제하고, PE/EA(2:1)로 용리하여, 원하는 산물 D-4(280mg, 73.4%)를 얻었다.
벤질 4-(4-아미노-3-요오드-1H-피라조로[3,4-d-]피리미딘-1-일)바이시클로[2.2.1]헵테인-1-일-카바메이트 D-5
D-4(190mg, 0.5mmol), NIS(400mg, 1.78mmol), HBF4(50%, 19.6mmol, 4mL)의 ACN(2.5mL) 혼합물을 마개로 막은 튜브에서 85oC까지 가열한 후 6시간 교반한다. 냉각 후, 포화 NaHCO3로 퀀칭하고, EA(2x50mL)로 추출한다. 무수 Na2SO4로 유기상을 건조, 여과 및 농축한다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 방법으로 잔류물을 정제하고, EA/PE(1:1-1:0)로 용리하여, 원하는 산물 D-5(96mg, 38.1%)을 얻었다. LC-MS m/z = 505.0 [M + 1] +.
실시예1
화합물 A-7-n의 합성 경로
3-(4-아미노바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-1-요오드이미다조[1,5-a]피라진-8-아민 A-5
화합물 A-4(1g, 1.99mmol)의 TFA/DCM(10mL/10mL) 혼합 용매 용액을 60℃까지 가열하여, 6시간 유지한다. 농축 후 DCM(2Х20mL)을 추가한다. 다시 농축 후 DCM(20mL)에 용해한 후 5mL HCl의 다이옥세인 용액을 추가하여 실온에서 10분간 교반한다. 이를 증발하여 DCM(2Х20mL)을 추가하고, 증발한 후에 DME(20mL)를 추가한다. 실온에서 30분간 교반한다. 여과 후 DME(2Х10mL)로 세척한다. 얻은 화합물 A-5을 정제할 필요 없이 다음 단계에 직접 사용할 수 있다. LC-MS m/z = 370.1[M+1]+.
N-(4-(8-아미노-1-요오드이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)부틸-2-아세틸렌알킬아미드 A-6
화합물 A-5(1.35g, 2.8mmol), DIEA(3.28g, 25.2mmol), 부틸-2-아세텔렌산(235mg, 2.8mmol)과 HATU(1.06g, 2.8mmol)의 DMF(20mL) 용액을 실온에서 30분간 교반한다. 이를 물(30mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2Х30mL)로 추출한다. 포화 NaCl 수용액으로 유기상을 세척한다. 유기상을 분리한 후, Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 2:3을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여 원하는 화합물 A-6을 800mg 얻었다. 수율은 65％였다.
4-(8-아미노-3-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-부틸-일)-N-(피리딘-2-일)벤즈아미드 A-7-1
화합물 A-6(30mg, 0.069mmol), 4-(피리딘-2-일카르바모일)페닐보론산 II-1(20mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL)의 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열한 후 3시간 유지한다. 농축하고, 물(20mL)을 추가한 후, 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-7-1을 10mg 얻었다. 수율은 30%였다. LC-MS m/z = 506.2[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-부틸-일)-N-(4-플루오로피리딘피리딘-2-일)벤즈아미드 A-7-2
화합물 A-6(30mg, 0.069mmol), 4-((4-플루오로피리딘-2-일)카르바모일)페닐붕산 II-2(22mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL) 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열하여 3시간 유지한다. 농축 후, 물(20mL)을 추가한다. 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-7-2를 15mg 얻었다. 수율은 34％였다. LC-MS m/z = 524.0[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1--일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-7-3
화합물 A-6(30mg, 0.069mmol), 4-((4-트리플루오로메틸)피리딘-2-일)카르바모일)페닐붕산 II-3(26mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL)의 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열하여 3시간 유지한다. 농축 후, 물(20mL)을 추가한다. 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-7-3을 12mg 얻었다. 수율은 31％였다. LC-MS m/z =574.2[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-메틸피리딘피리딘-2-일)벤즈아미드 A-7-4
화합물A-6(30mg, 0.069mmol), 4-((4-메틸피리딘-2-일)카르바모일)페닐붕산II-4(22mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL)의 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열하여 3시간 유지한다. 농축 후, 물(20mL)을 추가한다. 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-7-4를 14mg 얻었다. 수율은 39％였다. LC-MS m/z = 520.2[M+1]+.
4-(8-아미노-3(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-시아노피리딘-2-일)벤즈아미드 A-7-5
화합물 A-6(30mg, 0.069mmol), 4-((4-시아노피리딘-2-일)카르바모일)페닐붕산II-5(23mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL)의 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열하여 3시간 유지한다. 농축 후, 물(20mL)을 추가한다. 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르=1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-7-5를 12mg 얻었다. 수율은 33%였다. LC-MS m/z = 531.0[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-2-플루오린-N-(피리딘-2-일)벤즈아미드 A-7-6
화합물 A-6(30mg, 0.069mmol), 3-플루오린-4(피리딘-2-일카르바모일)페닐붕산 II-6(22mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL)의 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열하여 3시간 유지한다. 농축 후, 물(20mL)을 추가한다. 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-7-6을 15mg 얻었다. 수율은 42％였다. LC-MS m/z = 524.2[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(티아졸-2-일)벤즈아미드 A-7-7
화합물 A-6(30mg, 0.069mmol), (티아졸-2-일-카르바모일)페닐붕산 II-7(28mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL)의 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열하여 3시간 유지한다. 농축 후, 물(20mL)을 추가한다. 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-7-7을 13mg 얻었다. 수율은 37%였다. LC-MS m/z = 512.0[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-3-플루오린-N-(피리딘-2-일)벤즈아미드 A-7-8
화합물 A-6(30mg, 0.069mmol), 2-플루오린-4(피리딘-2-일카르바모일)페닐붕산 II-8(22mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL)의 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열하여 3시간 유지한다. 농축 후, 물(20mL)을 추가한다. 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물A-7-8을 14mg 얻었다. 수율은 39%였다. LC-MS m/z = 524.0[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)3-플루오린-N-(4-트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-7-9
화합물 A-6(30mg, 0.069mmol), 2-플루오린-4-((4-(트리플루오로메틸-2-일)카르바모일)페닐붕산 II-9(28mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL)의 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열하여 3시간 유지한다. 농축 후, 물(20mL)을 추가한다. 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-7-9를 19mg 얻었다. 수율은 47％였다. LC-MS m/z = 592.0[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-3-메톡시-N-(4-트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-7-10
화합물 A-6(30mg, 0.069mmol), 2-메톡시-4-((4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)카르바모일)페닐붕산 II-10(29mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL)의 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열하여 3시간 유지한다. 농축 후, 물(20mL)을 추가한다. 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-7-10를 16mg 얻었다. 수율은 38%였다. LC-MS m/z = 604.0[M+1]+.
N-((4-(8-아미노-3-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)페닐)메틸-2-메톡시벤즈아미드 A-7-11
화합물 A-6(30mg, 0.069mmol), N-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질-2-메톡시벤즈아미드 II-11(31mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL)의 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열하여 3시간 유지한다. 농축 후, 물(20mL)을 추가한다. 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-7-11을 21mg 얻었다. 수율은 50%였다. LC-MS m/z = 549.3[M+1]+.
N-((4-(8-아미노-3-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)페닐)메틸)-5-플루오린-2-메톡시벤즈아미드 A-7-12
화합물 A-6(30mg, 0.069mmol), N-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질)-5-플루오린-2-메톡시벤즈아미드 II-12(33mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL)의 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열한다. 3시간 유지한다. 농축 후, 물(20mL)을 추가한다. 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 무수 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여 원하는 화합물 A-7-12를 24mg 얻었다. 수율은 56%였다. LC-MS m/z = 567.0[M+1]+.
N-((-(8-아미노-3-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)페닐)메틸)-4-플루오린-2-메톡시벤즈아미드 A-7-13
화합물 A-6(30mg, 0.069mmol), N-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질)-4-플루오린-2-메톡시벤즈아미드 II-13(33mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL)의 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열한다. 3시간 유지한다. 농축 후, 물(20mL)을 추가한다. 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여 원하는 화합물 A-7-13을 26mg 얻었다. 수율은 60%였다. LC-MS m/z = 567.1[M+1]+.
N-(4-(8-아미노-1-(-4-페녹시페닐)이미다조[1,5-a] 피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)부틸-2-아세틸렌알킬아미드 A-7-14
화합물 A-6(30mg, 0.069mmol), 4-페녹시페닐붕산(18mg, 0.085mmol), Pd[PPh3]4(8mg, 0.0069mmol)와 Cs2CO3(45mg, 0.138mmol)을 DME/H2O(1.5mL/0.3mL)의 혼합 용매 용액에서 80℃까지 가열하여 3시간 유지한다. 농축 후, 물(20mL)을 추가한다. 아세트산에틸(2Х20mL)을 사용하여 추출한 다음 유기상을 분리하고 Na2SO4을 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 아세트산에틸/석유에테르 = 1:1을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여, 원하는 화합물 A-7-14를 19mg 얻었다. 수율은 49%였다. LC-MS m/z = 478.0[M+1]+.
화합물 A-10-n의 합성 경로
4-(1-(4-((4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)카르바모일)페닐)8-아미노이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵테인벤질-1-일카바메이트 A-8
4-(8-아미노-1-요오드이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 A-4(300mg, 0.6mmol), 4-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)카르바모일)페닐붕산 II-3(229mg, 0.738mmol), Pd[PPh3]4(69mg, 0.06mmol)와 Cs2CO3(239mg, 0.738mmol)을 DME:H2O(2.5mL: 0.5mL)의 혼합 용매에서 80oC까지 가열하여 하룻 밤 동안 교반한다. 농축하고, 메틸알코올/DCM(1:30)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제한다. 원하는 화합물 A-8을 265mg 얻었다. 수율은 69%였다.
4-(8-아미노-3-(4-아미노바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-9
화합물 A-8(265mg, 0.42mmol)을 DCM/TFA(10mL:10mL) 혼합 용매 용액에서 60oC까지 가열하여, 18시간 교반한다. 증발 및 건조 후 DCM(2x20 mL)을 추가하여 농축한다. 잔류물을 DCM(30mL)에 용해시키고, HCI 다이옥세인 용액에 넣어 증발 및 건조한다. DCM(2x20mL)을 넣고 농축한 후 이소프로필에테르(30mL)를 추가하여 2시간 교반하고 여과 후, 이소프로필에테르(2x10mL)로 세척한다. 원하는 산물 A-9 염산염을 196mg 얻었다. 이 산물은 정제 과정 없이 직접 다음 단계에 사용한다.
(E)-4-(8-아미노-3-(4-(4-메톡시-부틸-2-에노일아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-10-1
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 (E)-4-메톡시부틸-2-에노산(2.8mg, 0.024mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하고, 이를 물(5mL)에 부어 넣고 아세트산에틸(2x5mL)을 사용하여 추출하고, 포화 NaCl 수용액으로 유기상을 세척하여 분리한다. 무수 Na2SO4를 사용하여 건조, 여과 및 증발한다. 그런 다음 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여, 원하는 산물 A-10-1을 5mg 얻었다. 수율은 35％였다. LC-MS m/z = 606.1[M+1]+.
(E)-4-(8-아미노-3-(4-(4-(테트라하이드로피롤로-1-일)부틸-2-에노일아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-10-2
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg,0.12mmol)와 (E)-4-(테트라하이드로피롤로-1-일)-부틸-2-에노산(4mg, 0.024mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(5mL)에 부어 넣은 다음 아세트산에틸(2x5mL)을 사용하여 추출한다. 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하여 분리한다. 그런 다음 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 이를 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-2를 6mg 얻었다. 수율은 38%였다. LC-MS m/z = 645.0[M+1]+.
4-(-3-(4-아크릴아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-8-아미노이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-10-3
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 아크릴산(2mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣는다. 그런 다음 아세트산에틸(2x5mL)을 사용하여 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 유기상을 세척하여 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-3을 5mg 얻었다. 수율은 38%였다. LC-MS m/z = 562.0[M+1]+.
4-(-3-(4-아세트아미노바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-8-아미노이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-10-4
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 아세트산(1.5mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣는다. 그런 다음 아세트산에틸(2x5mL)을 사용하여 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하여 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과, 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-4를 4mg 얻었다. 수율은 31%였다. LC-MS m/z =550.0 [M+1]+.
N-(4-(1-(4-(4-(트리플루오로메틸)-피리딘-2-일)--카르바모일페닐)-8-아미노이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-3-메틸프로필렌옥사이드-3-포름아미드 A-10-5
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 3-메틸프로필렌옥사이드-3-카르복시산(3mg, 0.024mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(5mL)에 부어 넣는다. 그런 다음 아세트산에틸(2x5mL)을 사용하여 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하여 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-5를 6mg 얻었다. 수율은 40%였다. LC-MS m/z = 606.1[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-(2-히드록시-2-메틸프로판아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-10-6
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 2-히드록시-2-메틸프로피온산(2.5mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-6을 6mg 얻었다. 수율은 41%였다. LC-MS m/z =594.1 [M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-(2-메톡시아세트아미도)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-10-7
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 2-메톡시아세트산(2mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-7을 5mg 얻었다. 수율은 36%였다. LC-MS m/z = 580.1[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-(3-메톡시프로피온아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-10-8
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 3-메톡시프로피온산(2.5mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하여 분리한다. 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-8을 5mg 얻었다. 수율은 35%였다. LC-MS m/z = 594.1[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-(1-히드록시시클로프로판벤즈아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-10-9
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 1-히드록시시클로프로판포름산(2.5mg, 0.024mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(5mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-9을 5mg 얻었다. 수율은 36%였다. LC-MS m/z =592.0 [M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-(2-모르폴린아세트아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-10-10
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 2-모르폴린아세트산(3.5mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-10을 7mg 얻었다. 수율은 47%였다. LC-MS m/z = 635.0[M+1]+.
N-(4-(1-(4-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)-카르바모일페닐)-8-아미노이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-테트라히드로푸란-2-포름아미드 A-10-11
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 테트라히드로푸란-2-포름산(2.8mg, 0.024mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(5mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-11을 5mg 얻었다. 수율은 35%였다. LC-MS m/z = 606.0[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-(1-시아노시클로프로판포름아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-10-12
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 1-시아노시클로프로판포름산(2.7mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-12를 6mg 얻었다. 수율은 42%였다. LC-MS m/z = 601.3[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-(2-시아노아세트아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-10-13
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 2-시아노아세트산(2mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-13을 6mg 얻었다. 수율은 44%였다. LC-MS m/z = 575.2[M+1]+.
4-(8-아미노-3-(4-(2-시아노프로피온아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 A-10-14
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 2-시아노프로피온산(2.4mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-14를 5mg 얻었다. 수율은 36%였다. LC-MS m/z = 589.3[M+1]+.
N-(4-(1-(4-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)-카르바모일페닐)-8-아미노이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-4-시아노테트라히드로-2H-파이란-4-포름아미드 A-10-15
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 4-시아노테트라히드로-2H-파이란-4-카르복시산(3.7mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-15를 6mg 얻었다. 수율은 39%였다. LC-MS m/z =645.0 [M+1]+.
1-(4-(1-(4-(4-(트리플루오로메틸)-피리딘-2-일)-카르바모일페닐)-8-아미노이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)카르바모일)시클로프로판포름산 A-10-16
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 시클로프로판-1,1-다이카복실산(3mg, 0.024mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하여 분리한다. 무수 Na2SO4으로 건조, 여과, 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-16을 6mg 얻었다. 수율은 40%였다. LC-MS m/z =555.3 [M+1]+.
N-(4-(1-(4-(4-트리플루오로메틸)피리딘-2-일)-카르바모일페닐)-8-아미노이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)벤즈아미드 A-10-17
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 벤조산(3mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-17을 8mg 얻었다. 수율은 53%였다. LC-MS m/z = 612.2[M+1]+.
N-(4-(1-(4-(4-트리플루오로메틸)피리딘-2-일)-카르바모일페닐)-8-아미노이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-피리딘-2-포름산암모늄 A-10-18
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 2-피리딘포름산(3mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-18을 9mg 얻었다. 수율은 60%였다. LC-MS m/z = 613.2[M+1]+.
N-(4-(1-(4-(4-트리플루오로메틸)피리딘-2-일)-카르바모일페닐)-8-아미노이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)니코틴아미드 A-10-19
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 나이아신(3mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-19을 8mg 얻었다. 수율은 54%였다. LC-MS m/z = 613.2[M+1]+.
N-(4-(1-(4-(4-트리플루오로메틸)피리딘-2-일)-카르바모일페닐)-8-아미노이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-2-메톡시벤즈아미드 A-10-20
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 2-메톡시벤조산(3.6mg, 0.024mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-20을 8mg 얻었다. 수율은 52%였다. LC-MS m/z = 642.3[M+1]+.
N-(4-(1-(4-(4-트리플루오로메틸)피리딘-2-일)-카르바모일페닐)-8-아미노이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-파이란-2-포름아미드 A-10-21
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 파이란-2-카르복시산(2.7mg, 0.024mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(5mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하여 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-21을 6mg 얻었다. 수율은 43%였다. LC-MS m/z = 602.2[M+1]+.
N-(4-(1-(4-(4-트리플루오로메틸)피리딘-2-일)-카르바모일페닐)-8-아미노이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-티아졸-2-포름아미드 A-10-22
화합물 A-9(15mg, 0.024mmol), HATU(9.12mg, 0.024mmol), DIEA(16mg, 0.12mmol)와 티아졸-2-카르복시산(3mg, 0.024mmol)의 DMF(1mL)을 실온에서 1시간 교반하여 물(5mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하여 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-10-22를 6mg 얻었다. 수율은 40%였다. LC-MS m/z = 619.2[M+1]+.
화합물 A-13-n의 합성 경로
벤질 4-(8-아미노-1-(4-페녹시페닐)이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-카바메이트 A-11
4-(8-아미노-1-요오드이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 A-4(300mg, 0.6mmol), 4-페녹시벤조산(158mg, 0.738mmol), Pd[PPh3]4(69mg, 0.06mmol)와 Cs2CO3(239mg, 0.738mmol)을 DME:H2O(2.5mL: 0.5mL)의 혼합 용매에서 80oC까지 가열하여 하룻 밤 동안 교반한다. 농축 후 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제하고, 원하는 화합물 A-11을 268mg 얻었다. 수율은 82%였다.
3-(4-아미노바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-1-(4-페녹시페닐)이미다조[1,5-a]피라진-8-아민 A-12
화합물 A-11(260mg, 0.48mmol)을 DCM/TFA(10mL:10mL) 혼합 용액에서 60℃까지 가열하여, 18시간 교반한다. 증발 및 건조 후 DCM(2x20mL)을 추가하여 농축한다. 잔류물을 DCM(30mL)에 용해시키고 HCI 다이옥세인 용액을 추가하여, 증발 및 건조한 후 DCM(2x20mL)을 추가한다. 농축시킨 후 이소프로필에테르(30mL)를 추가하여 2시간 교반하고 여과한 후 이소프로필에테르(2x10mL)로 세척하여 원하는 산물 A-12의 염산염을 200mg 얻었다. 이 산물은 정제 과정 없이 직접 다음 단계에 사용한다.
N-(4-(8-아미노-1-(4-페녹시페닐)이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-2-히드록시-2-메틸프로판아미드 A-13-1
화합물 A-12(15mg, 0.025mmol), HTAU(9.3mg, 0.025mmol), DIEA(19mg, 0.15mmol)와 2-히드록시-2-프로피온산(3mg, 0.029mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-13-1을 8mg 얻었다. 수율은 57%였다. LC-MS m/z = 498.4[M+1]+.
N-(4-(8-아미노-1-(4-페녹시페닐)이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-3-메톡시프로판아미드 A-13-2
화합물 A-12(15mg, 0.025mmol), HTAU(9.3mg, 0.025mmol), DIEA(19mg, 0.15mmol)와 3-메톡시프로피온산(3mg, 0.029mmol)을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-13-2를 6mg 얻었다. 수율은 40%였다. LC-MS m/z = 498.7[M+1]+.
N-(4-(8-아미노-1-(4-페녹시페닐)이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-3-메틸프로필렌옥사이드-3-포름아미드 A-13-3
화합물 A-12(15mg, 0.025mmol), HTAU(9.3mg, 0.025mmol), DIEA(19mg, 0.15mmol)와 3-메틸프로필렌옥사이드-3-카르복시산(3.4mg, 0.029mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-13-3을 8mg 얻었다. 수율은 53%였다. LC-MS m/z = 510.2[M+1]+.
N-(4-(8-아미노-1-(-4-페녹시페닐)이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-2-모르폴린아세트아미드 A-13-4
화합물 A-12(15mg, 0.025mmol), HTAU(9.3mg, 0.025mmol), DIEA(19mg, 0.15mmol)와 2-모르폴린아세트산(4.2mg, 0.029mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-13-4를 9mg 얻었다. 수율은 58%였다.
화합물 A-16-n의 합성 경로
벤질 4-(8-아미노-1-(4-(5-플루오린-2-메톡시벤즈아미드)메틸)페닐)이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 A-14
4-(8-아미노-1-요오드이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-벤질 카바메이트 A-4(300mg, 0.6mmol), N-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질)-5-플루오린-2-메톡시벤즈아미드 II-12(284mg, 0.738mmol), Pd[PPh3]4(69mg, 0.06mmol)와 Cs2CO3(239mg, 0.738mmol)을 DME:H2O(2.5mL: 0.5mL)의 혼합 용매에서 80oC까지 가열하여 하룻밤 동안 교반한다. 농축 후 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여 원하는 화합물 A-14를 285mg 얻었다. 수율은 75%였다.
N-4-(8-아미노-3-(4-아미노바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)페닐)메틸)-5-플루오린-2-메톡시벤즈아미드 A-15
화합물 A-14(280mg, 0.44mmol)을 DCM/TFA(10mL:10mL) 혼합 용매 용액에서 60oC까지 가열하여, 18시간 교반한다. 증발 및 건조 후 DCM(2x20mL)을 추가하여 농축한다. 잔류물을 DCM(30mL)에 용해시키고 HCI 다이옥세인 용액(10mL)을 추가하여, 증발 및 건조한 후 DCM(2x20mL)을 추가한다. 농축시킨 후 이소프로필에테르(30mL)를 추가하여 2시간 교반하고 여과한 후, 이소프로필에테르(2x10mL)로 세척하여 원하는 산물 A-15의 염산염을 180mg 얻었다. 이 산물은 정제 과정 없이 직접 다음 단계에 사용한다.
N-4-(8-아미노-3-(4-(2-히드록시-2-메틸프로판아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)페닐)메틸)-5-플루오린-2-메톡시벤즈아미드 A-16-1
화합물 A-15(15mg, 0.025mmol), HTAU(9.3mg, 0.025mmol), DIEA(19mg, 0.15mmol)와 2-히드록시-2-프로피온산(2.6mg, 0.025mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-16-1을 6mg 얻었다. 수율은 40%였다. LC-MS m/z = 587.3[M+1]+.
N-4-(8-아미노-3-(4-(3-메톡시프로피온아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)벤질)-5-플루오린-2-메톡시벤즈아미드 A-16-2
화합물 A-15(15mg, 0.025mmol), HTAU(9.3mg, 0.025mmol), DIEA(19mg, 0.15mmol)와 3-메톡시프로피온산(2.6mg, 0.025mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-16-2를 8mg 얻었다. 수율은 40%였다. LC-MS m/z =587.3 [M+1]+.
N-(4-(8-아미노-1-(4-(5-플루오린-2-메톡시벤즈아미드)메틸)페닐)이미다조[1,5-a]피라진-3-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-3-메틸프로필렌옥사이드-3-포름아미드 A-16-3
화합물 A-15(15mg, 0.025mmol), HTAU(9.3mg, 0.025mmol), DIEA(19mg, 0.15mmol)와 3-메틸프로필렌옥사이드-3-카르복시산(2.9mg, 0.025mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(5mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-16-3을 10mg 얻었다. 수율은 66%였다. LC-MS m/z =599.3 [M+1]+.
N-4-(8-아미노-3-(4-(2-모르폴린아세트아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)이미다조[1,5-a]피라진-1-일)벤질)-5-플루오린-2-메톡시벤즈아미드 A-16-4
화합물 A-15(15mg, 0.025mmol), HTAU(9.3mg, 0.025mmol), DIEA(19mg, 0.15mmol)와 2-모르폴린아세트산(3.6mg, 0.025mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 A-16-4를 9mg 얻었다. 수율은 57%였다. LC-MS m/z =628.3 [M+1]+.
화합물 B-6-n의 합성 경로
벤질 4-(5-(4-(4-트리플루오로메틸)피리딘-2-일)카르바모일페닐)-4-아미노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일-카바메이트 B-4
화합물 B-3(200mg, 0.4mmol), 4-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)카르바모일)페닐붕산 II-3(152mg, 0.49mmol), Pd[PPh3]4(46mg, 0.04mmol)와 Cs2CO3(159mg, 0.49mmol)을 DME/H2O(2.5mL: 0.5mL)의 혼합 용매에서 80oC까지 가열하여 하룻 밤 동안 교반한다. 농축하고 잔류물은 메틸알코올/DCM(1:40)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제한다. 원하는 화합물 B-4를 187mg 얻었다. 수율은 73%였다.
4-(4-아미노-7-(4-아미노바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 B-5
화합물 B-4(187mg, 0.29mmol)을 DCM/TFA(10mL:10mL) 혼합 용매에서 60℃까지 가열하여, 18시간 교반한다. 증발 및 건조 후 DCM(2x20mL)을 추가하여 농축한다. 잔류물에 다시 DCM(30mL)을 추가하고, 염산다이옥세인 용액(10mL)을 추가하여, 증발 및 건조한 후 다시 DCM(2x20mL)을 추가하여, 다시 증발한다. 이소프로필에테르(30mL)를 추가하여 2시간 교반하고 여과 후, 이소프로필에테르(2x10mL)로 세척하여 원하는 산물 B-5의 염산염을 얻었다. 이 산물은 정제 과정 없이 직접 다음 반응 단계에 사용한다.
4-(4-아미노-7-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 B-6-1
화합물 B-5(19mg, 0.031mmol), HTAU(12mg, 0.031mmol), DIEA(24mg, 0.19mmol)와 부틸-2-아세텔렌산(2.6mg, 0.031mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 B-6-1을 11mg 얻었다. 수율은 59%였다. LC-MS m/z =574.3 [M+1]+.
4-(4-아미노-7-(4-(2-히드록시-2-메틸프로판아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 B-6-2
화합물 B-5(19mg, 0.031mmol), HTAU(12mg, 0.031mmol), DIEA(24mg, 0.19mmol)와 2-히드록시-2-메틸프로피온산(3.2mg, 0.031mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 B-6-2를 9mg 얻었다. 수율은 49%였다. LC-MS m/z =594.2 [M+1]+.
4-(4-아미노-7-(4-(3-메톡시프로피온아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 B-6-3
화합물 B-5(19mg, 0.031mmol), HTAU(12mg, 0.031mmol), DIEA(24mg, 0.19mmol)와 3-메톡시프로피온산(3.2mg, 0.031mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 B-6-3을 12mg 얻었다. 수율은 66%였다. LC-MS m/z =594.2 [M+1]+.
N-(4-(5-(4-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)카르바모일페닐)-4-아미노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-3-메틸프로필렌옥사이드-3-포름아미드 B-6-4
화합물 B-5(19mg, 0.031mmol), HTAU(12mg, 0.031mmol), DIEA(24mg, 0.19mmol)와 3-메틸프로필렌옥사이드-3-카르복시산(3.6mg, 0.031mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 B-6-4를 12mg 얻었다. 수율은 64%였다. LC-MS m/z =606.3 [M+1]+.
4-(4-아미노-7-(4-(-2-모르폴린아세트아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 B-6-5
화합물 B-5(19mg, 0.031mmol), HTAU(12mg, 0.031mmol), DIEA(24mg, 0.19mmol)와 2-모르폴린아세트산(4.5mg, 0.031mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 B-6-5를 11mg 얻었다. 수율은 58%였다. LC-MS m/z =635.2 [M+1]+.
화합물 C-7-n의 합성 경로
벤질 4-(6-아미노-8-옥소-7-(4-((4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)카르바모일)페닐)-7,8-디히드로-9H-푸린-9-일)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)카바메이트 C-5
화합물 C-4(100mg, 0.25mmol), 4-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)카르바모일페닐)페닐붕산 II-3(160mg, 0.5mmol), 구리아세테이트(60mg, 0.3mmol)와 Et3N(30mg, 0.3mmol)의 DCM(10mL) 용액을 실온에서 24시간 교반한다. 물(20mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2Х10mL)로 추출한다. 유기상을 분리한 후, 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발하고, 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하고 EA/PE=1:1~EA로 용리한다. 원하는 화합물 C-5를 47mg 얻었다. 수율은 29%였다. LC-MS m/z =657.3 [M-1]-.
4-(6-아미노-9-(4-아미노바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-8-옥소-8,9-디히드로-7H-푸린-7-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 C-6
화합물 C-5(45mg, 0.09mmol)을 DCM/TFA(10mL:10mL) 혼합 용매에서 60℃까지 가열하여, 18시간 교반한다. 증발 및 건조 후 DCM(2x20mL)을 추가하여 농축한다. 잔류물을 DCM(30mL)에 용해시키고, 염산다이옥세인 용액(10mL)에 넣어, 증발 및 건조하고, DCM(2x20mL)을 넣어 농축한 후 이소프로필에테르(30mL)를 추가하여 2시간 교반하고 여과 후, 이소프로필에테르(2x10mL)로 세척하여 원하는 산물 C-6의 염산염을 얻었다. 이 산물은 정제 과정 없이 직접 다음 단계에 사용한다.
4-(6-아미노-9-(4-부틸-2-아세틸렌알킬아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-8-옥소-8,9-디히드로-7H-푸린-7-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 C-7-1
화합물 C-6(13mg, 0.022mmol), HTAU(9mg, 0.022mmol), DIEA(16.8mg, 0.13mmol)와 부틸-2-아세텔렌산(1.8mg, 0.022mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후 DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 C-7-1을 5mg 얻었다. 수율은 38%였다. LC-MS m/z =591.2 [M+1]+.
4-(6-아미노-9-(4-(2-모르폴린아세트아미드)바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)-8-옥소-8,9-디히드로-7H-푸린-7-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 C-7-2
화합물 C-6(13mg, 0.022mmol), HTAU(9mg, 0.022mmol), DIEA(16.8mg, 0.13mmol)와 2-모르폴린아세트산(3.2mg, 0.022mmol)의 DMF(1mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하여 물(1mL)에 부어 넣고, 아세트산에틸(2x5mL)로 추출하고, 유기상은 포화 NaCl 수용액으로 세척하고 분리한다. 그런 다음 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 증발한다. 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 정제한 후, DCM/MeOH = 20:1로 용리하여 원하는 산물 C-7-2를 6mg 얻었다. 수율은 42%였다. LC-MS m/z =652.2 [M+1]+.
화합물 D-8-n의 합성 경로
벤질 4-(3-(4-(4-트리플루오로메틸)피리딘-2-일)카르바모일페닐)-4-아미노-1H-피라조로[3,4-d]피리미딘-1-일)바이시클로[2.2.1]헵테인-1-일-카바메이트 D-6
D-5(96mg, 0.19mmol), II-3(73mg, 0.234mmol), Pd [PPh3]4(22mg, 0.019mmol), Cs2CO3(76.4mg, 0.234mmol)의 DME/H2O(9mL/1mL) 혼합 용액에서 N2로 1분간 산소를 제거한 후, 밀봉된 튜브에서 80oC까지 가열하고, 12시간 교반한다. 냉각 후, 염수(20mL)로 반응을 퀀칭하고, EA(2x50mL)로 추출한다. 무수 Na2SO4를 사용하여 유기상을 건조, 여과 및 농축한다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 방법으로 잔류물을 정제하고 PE/EA(1:1)로 용리하여, 원하는 산물 D-6(42mg, 34.4%)을 얻었다. LC-MS m/z =643.2 [M+1]+.
4-(4-아미노-1-(4-아미노바이시클로[2.2.1]헵테인-1-일)-1H-피라조로[3,4-d]피리미딘-3-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일)벤즈아미드 D-7
D-6(42mg, 0.065mmol)을 TFA/DCM(1mL/1mL) 혼합 용매에서 60℃까지 가열하여, 12시간 교반한다. 냉각 후, 용매를 증발 및 건조하고, 다이옥세인(2mL)의 HCl 용액을 추가하여, 10분간 교반하고 농축한다. 잔류물에 이소프로필에테르(10mL)를 추가하고, 교반 후, 다시 농축한다. 상술한 절차를 두 번 반복한다. 여과하여 얻은 고체를 이소프로필에테르로 세척한 후 건조시켜, 원하는 산물 D-7의 HCl 염(30mg, 75%)을 얻었다.
4-(4-아미노-1-(4-부틸-2-알키닐아미노바이시클로[2.2.1]헵테인-1-일)-1H-피라조로[3,4-d]피리미딘-3-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 D-8-1
D-7(15mg, 0.025mmol), 부틸-2-아세텔렌산(2mg, 0.024mmol), HATU(9.1mg, 0.024mmol)와 DIEA(0.041mL, 0.241mmol)의 DMF(1mL) 혼합 용액을 실온에서 4시간 교반한다. EA(30mL)로 반응액을 희석하고, 염수로 세척하고, 유기상은 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 농축한다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 방법으로 잔류물을 정제하고 PE/EA(1:1)로 용리하여, 원하는 산물 D-8-1(12mg, 86%)을 얻었다. LC-MS m/z =575.1 [M+1]+.
4-(4-아미노-1-(4-(-2-모르폴린아세트아미드)바이시클로[2.2.1]헵테인-1-일)-1H-피라조로[3,4-d]피리미딘-3-일)-N-(4-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)벤즈아미드 D-8-2
D-7(15mg, 0.025mmol), 2-모르폴린아세트산(3.5mg, 0.024mmol), HATU(9.1mg, 0.024mmol)와 DIEA(0.041mL, 0.241mmol)의 DMF(1mL) 혼합 용액을 실온에서 4시간 교반한다. EA(30mL)로 반응물을 희석하고, 염수로 세척하고, 유기상은 무수 Na2SO4으로 건조, 여과 및 농축한다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 방법으로 잔류물을 정제하고 PE/EA(1:1)로 용리하여, 원하는 산물 D-8-2(8.5mg, 56%)를 얻었다. LC-MS m/z =636.3 [M+1]+.
1. BTK(wt)/BTK(C481S)의 체외 억제 활성(IC50 값 측정)
(1)실험 방법
기질 용액은 폴리머(Glu, Tyr)나트륨염 기질(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)을 기질 반응 완충액(20mM Hepes(pH 7.5), 10mM MgCl2, 1mM EGTA, 0.02％Brij35, 0.02mg/mL BSA, 0.1mM Na3VO4, 2mM DTT와 1％DMSO)에 추가하는 것으로 제조한다. 반응액에서 기질의 최종 농도는 0.2uM이다. 테스트 화합물와 100％ DMSO로 10mM 농도의 저장 용액을 준비하고, 384-well cyclic olefin copolymer LDV microplate에서 10개 용량의 3배 연속 희석을 한다. BTK(WT) 또는 BTK(C481S) 키나제(재조합 인간 유래 전장 단백질, 히스티딘 라벨, 곤충 세포에서 발현, Invitrogen, Carlsbad, Ca)를 기질 용액에 추가하여 천천히 혼합한다(반응액에서 BTK의 최종 농도는 8nM). 그런 다음 음향 액적 배출 기술(acoustic liquid transfer technology, Echo550; 나노리터 범위)(Labcyte Inc, Sunnyvale, CA)을 통해 100％ DMSO 용액의 테스트 화합물을 키나제 반응 혼합물에 추가하여, 실온에서 20분간 배양한다. 33P-ATP(특정 활성 10μCi/μl)를 반응 혼합물에 추가하여 반응시키고, 실온에서 2시간 배양한다. 소량의 반응액을 취해 P-81 이온 교환여과지(Whatman)에 묻힌다. 0.75％ 인산 완충액으로 결합되지 않은 인산염을 여과지에서 씻어낸 다음(3회) 건조해, 여과지에 남은 방사성을 측정한다. 키나제 활성화 데이터는 테스트 샘플에 남은 키나제 활성과 운반체(다이메틸 설폭사이드) 공백 반응의 백분율로 표시한다. Prism(GraphPad Software) 소프트웨어에서 획득한 데이터에 곡선 피팅을 적용해 IC 50 값을 계산한다.
(2)실험 결과
본 발명에서 서술한 대부분 화합물은 2세대 BTK 억제제인 아칼라브루티닙보다 강한 BTK(WT, 야생형) 효소활성 억제 능력을 보였다. 더욱 중요한것은, 대부분의 화합물이 BTK(C481S) 돌연변이체에 대해 향상된 억제 활성을 보였으며, 심지어 0.1nM보다 낮았다.
BTK(wt)/BTK(C481S) 효소활성 억제 결과: A≤0.1M; 0.1nM<B≤1nM; 1nM<C≤10nM; 10nM<D≤50nM;
화합물
번호		 IC50
BTK(WT)		 IC50
BTK(C481S)		 화합물 번호 IC50
BTK(WT)		 IC50
BTK(C481S)
A-7-2 C B A-7-3 B B
A-7-5 C B A-7-9 C B
A-7-12 C B A-7-14 C B
A-10-1 C B A-10-3 C B
A-10-5 C A A-10-6 C A
A-10-7 C B A-10-8 C A
A-10-10 C A A-10-11 C B
A-10-12 C B A-10-13 C A
A-10-14 C B A-10-15 C B
A-10-17 D C A-10-18 D C
A-10-19 D C A-10-20 D C
A-10-21 C C A-10-22 C C
A-13-1 C C A-13-2 C B
A-13-3 C C A-13-4 D C
A-16-1 D C A-16-2 C C
A-16-3 C C A-16-4 C C
B-6-1 C C B-6-2 D C
B-6-3 C C B-6-4 C C
B-6-5 C C C-7-1 C C
C-7-2 C B 아칼라브루티닙 18.6nM 815nM
2. 체외 종양세포 증식 억제 실험
(1)실험 방법
·종양세포계(TMD-8/OCY-LY10)를 RPMI1640+FBS 10%에 현탁시켜, 37℃, 5% CO2의 배양 장치에서 배양한다. 세포를 정기적으로 계대배양하여, 대수성장기의 세포를 취해 플레이팅한다.
·트리판 블루로 세포를 염색한 후 생존 세포를 통계한다.
·배지에서 세포 농도를 7000/웰로 조절한다.
·90μL세포 현탁액을 96웰 플레이트에 넣고 공백 대조군에 세포를 포함하지 않은 배양액을 추가한다.
·96웰 플레이트의 세포를 37℃, 5％ CO2 및 100% 상대 습도의 배양 장치에 넣어 하룻 밤 동안 배양한다.
·400X 화합물 저장 플레이트의 준비: 측정할 화합물과 참조 약물을 DMSO에 용해시키고, 최고 농도(400uM)3X에서 최저 농도(0.61uM)로 희석한다.
·10X 화합물 작업 용액의 준비: V형 96웰 플레이트에 78μL 세포 배양액을 추가하고, 400X 화합물 저장 플레이트에서 2μL 화합물을 취해 96웰 플레이트의 세포 배양액에 추가한다. 용매 대조군과 공백 대조군에 2μL DMSO를 추가한다. 화합물 또는 DMSO를 추가한 후 피펫으로 혼합 용액을 충분히 저어 혼합한다.
·약품 추가: 10μL의 10X 화합물 작업 용액을 취해 표1에 표시된 바와 같이 세포 배양 플레이트에 넣는다. 용매 대조군과 공백 대조군에 10μL DMSO-세포 배양 혼합액을 추가한다. DMSO 농도는 0.25%이다.
·96웰 세포배양 플레이트를 배양 장치에 넣고 72시간 배양한다.
·CellTiter-Glo 완충액을 녹여 실온에 둔다.
·CellTiter-Glo 완충액이 실온이 될 때까지 기다린다.
·한 병의 CellTiter-Glo 기질에 CellTiter-Glo 완충액을 추가하여 기질을 용해하여, CellTiter-Glo 작업 용액을 만든다.
·완만하게 볼텍싱 처리하여 기질을 충분히 용해시킨다.
·세포 배양 플레이트를 꺼내 실온이 될 때까지 30분간 기다린다.
·각 웰에 CellTiter-Glo 작업 용액 50μL(각 웰의 세포 배양액 용량의 절반)를 추가한다. 알루미늄 포일로 세포배양 플레이트를 둘러싸 빛을 차단한다.
·배양 플레이트를 회전 진탕기에서 2분간 진탕시켜 세포 용해를 유도한다.
·배양 플레이트를 실온에서 10분간 그대로 두어 발광 신호가 안정화되기를 기다린다.
·2104 EnVision 플레이트 리더에서 발광 신호를 측정한다.
·데이터 분석: 다음 공식으로 화합물의 억제율(Inhibition rate, IR)을 계산한다. IR (%) = (1-(RLU 화합물-RLU 공백 대조군) / (RLU 용매 대조군-RLU 공백 대조군))*100%. Excel에서 여러 농도 화합물의 억제율을 계산한 다음 GraphPad Prism 소프트웨어로 억제 곡선을 그려 IC50을 계산한다.
(2)실험 결과
B세포 림프종 세포 TMD-8 및 OCI-LY10 증식 억제 실험에서, 화합물 A-10-10과 이브루티닙은 매우 강한 종양세포 증식 억제 활성을 보였다.
화합물 A-10-10/이브루티닙 종양세포 증식 억제 활성 결과:
화합물 번호 IC50(nM)
TMD-8 OCI-LY10
A-10-10 2.9 10.3
이브루티닙 0.4 1.7
3. 약동학(pharmacokinetic) 연구
(1)실험 방법
수컷 SD 큰 쥐를 시험 전에 밤새 금식시킨다. 시험 약물을 탈이온수로 만든 0.5% 메틸셀룰로오스(MC), 0.1% SDS(w/w/v)에 혼합하며, 현탁액 농도를 각각 1mg/mL로 한다. 5mL/kg의 약물을 위내 투여한다. 투약 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간 후에 안와정맥총 채혈 방식으로 0.4mL의 전혈을 수집한 후, 전혈을 헤파린 항응고제가 담긴 튜브에 넣는다. 각 시간대에 세 마리 시험동물로부터 채혈을 실시한 후 해당 동물을 처분한다. 각 샘플은 서로 다른 개체에서 수집한다. 전혈 샘플을 취한 15분 이내에, 4℃/4200 rpm에서 5분간 원심분리한다. 모든 혈장 샘플은 분석을 위해 -80±15℃로 설정된 냉장 장치에 보관한다. 샘플을 분석하기 전에 화합물을 측정하기 위한 LC-MS/MS(Waters I Class UPLC-Xevo TQD tandem 질량 분석) 측정 방법을 구성한다. 채집한 혈장을 정량 분석한다. 동물의 혈장 농도-시간 테이터는 WinNonlin(퍼스널 버전, 5.2) 소프트웨어로 분석한다. 비구획 모델로 농도를 측정한다. 측정 대상 화합물의 약동학(pharmacokinetic) 파라미터를 계산한다.
성년 수컷 비글(3마리)을 시험 전에 밤새 금식시킨다. 시험 약물을 탈이온수로 만든 0.5% 메틸셀룰로오스(MC), 0.1% SDS(w/w/v)에 혼합하며, 현탁액 농도를 각각 1mg/mL로 한다. 5mL/kg의 약물을 위내 투여한다. 투약한 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간 후에 채열한다. 클로랄수화물로 시험동물을 가볍게 마취시키고, 유리 채혈관으로 앞다리 정맥에서 약 0.5mL의 전혈을 채취하여 헤파린 항응고제가 담긴 튜브에 넣는다. 샘플은 4oC/4200 rpm에서 5분간 원심분리한다. 모든 혈장 샘플은 분석을 위해 -80±15°C로 설정된 냉장 장치에 보관한다. 샘플을 분석하기 전에 화합물을 측정하기 위한 LC-MS/MS(Waters I Class UPLC-Xevo TQD tandem 질량 분석) 측정 방법을 구성한다. 채집한 혈장을 정량 분석한다. 동물의 혈장 농도-시간 테이터는 WinNonlin(퍼스널 버전, 5.2) 소프트웨어로 분석한다. 비구획 모델로 농도를 측정한다. 측정 대상 화합물의 약동학(pharmacokinetic) 파라미터를 계산한다.
(2) 실험 결과
화합물 A-10-10을 위내 투여한다(5mg/kg). 큰 쥐와 비글에서 화합물 A-10-10의 Cmax는 각각 8323ng/mL와 641ng/mL로 양호한 흡수성을 나타냈으며, 동시에 매우 높은 혈액 노출량(AUC0-inf = 73318hr*ng/mL 및 14867hr*ng/mL)을 보였다.
큰 쥐/비글(수컷)에 대한 위내 투약(5mg/kg)의 약동학(pharmacokinetic) 데이터(t1/2: 반감기; Tmax: 피크 시간; Cmax: 최대 혈중 농도; AUC0-INF: 0-INF 시간-농도 곡선에서의 면적)
PK 파라미터 단위 화합물 A-10-10(경구 투여: 5mg/kg)
큰 쥐 개
t 1/2 시간 3.74 14.2
T max 시간 2.00 8.00
C max ng/mL 8323 641
AUC 0-INF hr*ng/mL 73318 14867
4. BTK(wt) 및 BTK(C481S) 형질주입 세포 HEK293의 pBTK 억제 실험
이브루티닙이 임상에서 내성을 보이는 주요 원인은 BTK 키나제에서 C481S 돌연변이가 일어났기 때문이다. BTK (C481S)변이 세포를 효과적으로 억제할 수 있는 BTK 억제제의 개발은 이브루티닙의 약물 내성을 극복하는데 중요한 의미를 가진다.
(1)실험 방법
·인간 유래 전장 BTK 또는 BTK[C481S] 운반체로 사람 태아 신장 세포 HEK293를 순식간에 형질감염시킨다.
·세포를 사전에 정한 밀도로 96웰 플레이트에 분배한다.
·100％ DMSO로 각 측정 대상 화합물에 대해 8회 3배 연속 희석을 진행한다.
·그런 다음 화합물을 조직 배양 배지에서 최종 측정 농도가 10Х, 5％ DMSO가 되게 희석한다.
·화합물을 96웰 플레이트의 세포에 추가하고(배지에서 10배 희석)최종 농도가 1X, 0.5％ DMSO가 되게 한다. 양성(높은 신호) 대조군 세포는 0.5％ DMSO로 별도 처리한다. 음성(낮은 신호) 대조군 세포는 20uM 이브루티닙으로 처리하여 최종 농도가 0.5％ DMSO가 되도록 한다.
·세포와 화합물을 37℃에서 2시간 배양한다.
·세포를 용해시켜 그 용해물을 ELISA 플레이트로 옮긴다. 플레이트에는 미리 기질을 포획하는 항체(인간 유래 BTK 또는 BTK[C481S])를 도포한다.
·플레이트를 세척한 후 HRP에 연결된 항체를 배양해 총 타이로신 인산화 정도를 측정한다.
·플레이트를 세척한 다음 HRP 기질을 추가한다. 450nm에서 흡광도를 읽는다.
·음성 대조군과 양성 대조군의 값의 흡광도에 기반해 다음 공식으로 %억제값을 계산한다. (％INH = ((양성 대조군-샘플)/(양성 대조군-음성 대조군))*100.
·Z' 값은 아래 공식으로 계산한다. 1-[(3*양성 대조군의 표준편차+ 3*음성 대조군의 표준편차)/(양성 대조군의 평균-음성 대조군의 평균)].
·GraphPad Prism 소프트웨어로 %억제값 vs 화합물 농도 로그의 그래프를 그린다.
·S형 용량-반응 곡선을 이용하여 피팅한 후 IC50 값을 측정한다.
(2)실험 결과
C481S 돌연변이는 이브루티닙의 HEK293 세포 BTK 인산화에 대한 억제 능력을 0.021μM에서 1.58μM로 낮추었다. 본 발명의 화합물 A-10-10은 BTK(WT) 형질감염 HEK293 세포에 대해 강한 억제 능력(0.077μM)을 보이는 외에, BTK(C481S) 형질감염 HEK293 세포에서 더 강한 억제 능력(0.066μM)을 보였다.
BTK(WT)및 BTK(C481S) 형질감염 HEK293 세포의 pBTK 억제값(IC50)
억제제 형질감염된 HEK293 세포
BTK(wt) pBTK IC50(μM) BTK(C481S) pBTK IC50(μM)
A-10-10 0.077 0.063
이브루티닙 0.021 1.58
5. 약력학(pharmacodynamic) 실험 1
(1) 실험 방법
심각한 면역기능 장애를 가진 암컷 CB17/SCID 작은 쥐는 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에서 구매하여, SPF 실험동물실에서 사양한다. 인간 유래 OCI-LY10 세포(Shanghai Junrui-UFBN0102)는 10% 소태아 혈청, 100U/mL 페닐실린과 100μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 RPMI 1640 배지, 37℃, 5% CO2 배양 장치에서 배양한다. 주 2회마다 정기적으로 세포를 계대배양한다. 세포 포화도가 80%-90%이고, 요구되는 양에 도달할 경우, 세포를 수집하여 세포 수를 계수한다. 0.2mL(1Х107개) OCI-LY10 세포(Matrigel 추가, 용적비 1:1)를 각 작은 쥐의 오른쪽 등뒤 피하에 주입한다. 주입 약 일주일 후부터 종양 크기를 측정할 수 있다. 버니어 캘리퍼(Vernier Caliper)를 사용하여 종양 크기를 측정하고, 아래 공식으로 종양 용적을 계산한다. 종양 용적 = (길이Х너비2)/2. 종양의 평균 용적이 109mm3에 도달할 때 작은 쥐를 용매 대조군(5% DMSO+20% HP-β-CD), 이브루티닙 위내 투약군(25mg/kg, 1회/일)과 화합물 A-10-10 위내 투약군(25mg/kg, 50mg/kg, 2회/일)의 4조(조당 8마리)로 나누어 투약한다. 이브루티닙 또는 화합물을 5% DMSO+20% HP-β-CD에 용해시키고, 10mL/kg의 용량으로 28일 연속 위내 투약한다.
(2) 실험 결과
화합물 A-10-10과 이브루티닙은 OCI-LY10 이종이식 종양 모델에서 매우 강한 항종양 활성을 보였다(도 1). 화합물 A-10-10 위내 투약(용량 25mg/kg, bid; 50mg/kg, bid)은 미만성 거대B세포 림프종 세포주 OCI-LY10의 성장을 유의하게 억제한다(TGI = 110%, 110%; p <0.001, p <0.001). 투약 21일 후, 50mg/kg 투여군에서 모든 OCI-LY10 이식종양이 전부 사라졌다. 투약 28일 후, 25mg/kg 투여군에서 모든 OCI-LY10 이식종양도 전부 사라졌다. 대조 화합물 이브루티닙의 25mg/kg 투여군에서 투약 28일 후 TGI 값은 94%(p <0.001)였다.
시험 약물이 종양 베어링 쥐의 체중 변화에 대한 영향은 도면 1과 같다. 종양 베어링 쥐는 시험 약물 A-10-10의 모든 용량군에서 양호한 내약성을 보였고, 모든 치료군에서 뚜렷한 체중 감량을 보이지 않았다.
6. 약력학(pharmacodynamic) 실험 2
(1) 실험 방법
심각한 면역기능 장애를 가진 암컷 CB17/SCID 작은 쥐는 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에서 구매하여, SPF 실험동물실에서 사양한다. 인간 유래 TMD-8 세포(Shanghai Junrui-UFBN1682)는 10%소태아 혈청, 100U/mL 페닐실린과 100μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 RPMI 1640 배지, 37℃, 5% CO2 배양 장치에서 배양한다. 주 2회마다 정기적으로 세포를 계대배양한다. 세포 포화도가 80%-90%이고, 요구되는 양에 도달할 경우, 세포를 수집하여 세포 수를 계수한다. 0.2mL(1Х107개) TMD-8 세포(Matrigel 추가, 용적비 1:1)를 각 작은 쥐의 오른쪽 등뒤 피하에 접종한다. 이식 후 약 일주일부터 종양 크기를 측정할 수 있다. 버니어 캘리퍼(Vernier Caliper)를 사용하여 종양 크기를 측정하고, 아래 공식으로 종양 용적을 계산한다. 종양 용적 = (길이Х너비2)/2. 종양의 평균 용적이 107mm3에 도달할 때 작은 쥐를 용매 대조군(5% DMSO+20% HP-β-CD), 이브루티닙 위내 투약군(25mg/kg, 1회/일)과 화합물 A-10-10 위내 투약군(25mg/kg, 50mg/kg, 2회/일)의 4조(조당 8마리)로 나누어 투약한다. 이브루티닙 또는 화합물을 5% DMSO+20% HP-β-CD에 용해시키고, 10mL/kg의 용량으로 27일 연속 위내 투약한다.
(2) 실험 결과
화합물 A-10-10과 이브루티닙은 TMD-8 이종이식 종양 모델에서 매우 강한 항종양 활성을 보였다(도 2). 화합물 A-10-10 위내 투약(용량 25mg/kg, bid; 50mg/kg, bid)은 미만성 거대B세포 림프종 세포주 TMD-8의 성장을 유의하게 억제한다(TGI = 94%, 104%; p <0.001, p <0.001). 투약 27일 후, 50mg/kg 투여군의 5/8에서 TMD-8 이식종양이 전부 사라졌다. 대조 화합물 이브루티닙의 25mg/kg 투여군에서 TGI 값은 90%(p <0.001)였다.
시험 약물이 종양 베어링 쥐의 체중 변화에 대한 영향은 도면 2와 같다. 종양 베어링 쥐는 시험 약물 A-10-10의 모든 용량군에서 양호한 내약성을 보였고, 모든 치료군에서 뚜렷한 체중 감량을 보이지 않았다.

Claims (22)

  1. 식I의 화합물

    I
    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물로서,
    여기서 고리 A는 다음과 같은 구조 중의 하나에서 선택되고:

    R5은 수소, 할로겐, 시아노, 히드록시, 알키닐, 아미노, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, C1-3 할로알킬, C1-3 할로알콕시, C1-3 할로알킬아미노 , C3-7 시클로알킬, C3-7 시클로알콕시, C3-7 시클로알킬아미노에서 선택되며;
    고리 B는 다음과 같은 구조 중의 하나에서 선택되고;

    고리 C는 다음과 같은 구조 중의 하나에서 선택되며;

    L은 단일 결합이거나 다음과 같은 구조 중 하나로 되어 있으며:

    R1은 R3 또는 다음과 같은 구조 중의 하나에서 선택되며:

    여기서, R3은 수소, 치환 또는 비치환된 C1-6 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-6 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-6 알케닐, 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴, 치환 또는 비치환된 C1-9 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-7 헤테로시클로알킬에서 선택되고;
    R4은 수소, 치환 또는 비치환된 C1-6 알킬, 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴,치환 또는 비치환된 C1-9 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-7 헤테로시클로알킬에서 선택되며;
    R2은 H이며;
    상기 R3 가 치환되는 경우, 치환기는, 할로겐, 시아노, 히드록시, 아미노, 아실아미노, 아미노아실, C1-4 알킬, C3-7 시클로알킬, C3-7 시클로알콕시, C1-4 알킬아미노, II[C1-4 알킬]아미노, C3-7 알킬시클로아미노, C3-7 헤테로시클로알킬아미노, C1-3 알콕시, C3-7 시클로알콕시, C6-10 아릴 또는 C3-7 헤테로시클로알킬 중의 한 개 또는 여러 개에서 선택되고,
    상기 R4가 치환되는 경우, 치환기는, 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, C2-4 알케닐, C3-7 시클로알킬, C3-7 시클로알콕시, C1-4 알킬아미노, II[C1-4 알킬]아미노, C3-7 시클로알킬아미노, C3-7 헤테로시클로알킬아미노, C1-3 알콕시, C3-7 시클로알콕시, C6-10 아릴 또는 C3-7 헤테로시클로알킬 중의 한 개 또는 여러 개에서 선택되는,
    화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 다음과 같은 구조 중의 하나에서 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물:
  3. 제1항에 있어서,
    R1은 이며,
    여기서 R3은 수소, 치환 또는 비치환된 C1-6 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-6 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-6 알케닐, 치환 또는 비치환된 C6-10 아릴, 치환 또는 비치환된 C1-9 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C3-7 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-7 헤테로시클로알킬에서 선택되고,
    상기 R3가 치환되는 경우, 치환기는 할로겐, 시아노, 히드록시, 아미노, 아실아미노, 아미노아실, C1-4 알킬, C3-7 시클로알킬, 3-7 시클로알콕시, C1-4 알킬아미노, II[C1-4 알킬]아미노, C3-7 알킬시클로아미노, C3-7 헤테로시클로알킬아미노, C1-3 알콕시, C3-7 시클로알콕시, C6-10 아릴 또는 C3-7 헤테시클로알킬 중의 한 개 또는 여러 개에서 선택되는,
    화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 다음에 표시된 구조 중 임의의 하나에서 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물:

  5. 이종 면역성 질환, 자가면역 질환 또는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 제조하는데 사용되는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물.
  6. 제5항에서, 상기 이종 면역성 질환, 자가면역 질환 또는 암은 브루톤 타이로신 키나제 억제제의 과도한 활성과 관련되는 것인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물.
  7. 제5항에서, 상기 이종 면역성 질환, 자가면역 질환 또는 암은 이상 B세포 증식과 관련되는 것인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물.
  8. 제5항에서, 상기 이종 면역성 질환은 염증성 질환 또는 천식인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물.
  9. 제5항에서, 상기 자가면역 질환은 홍반성 루푸스, 만성 림프구성 림프종, 미만성 거대세포 림프종, 여포성 림프종 또는 만성 림프구 백혈병인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 한 개 또는 여러 개 포함하는, 이종 면역성 질환, 자가면역 질환 또는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약물 조성물.
  11. 치료 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 이종 면역성 질환, 자가면역 질환 또는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약물 제제.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 제조방법에 있어서,
    화합물 IIIA와 붕산 또는 붕산에스테르 II의 Suzuki 결합 반응을 통해 화합물 IV를 얻는 단계(S1); 화합물 IV를 트리플루오로아세트산으로 처리하여 벤질옥시카르보닐을 제거한 후 화합물 V의 염산염으로 전환시키는 단계(S2); 화합물 V와 유기산의 결합 반응을 통해 상기 식 I의 화합물을 얻는 단계(S3);를 포함하고,:

    여기서, X=할로겐, R1, R2, L, 고리 A, 고리 B 및 고리 C는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 설명을 따르는, 화합물의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 제조방법에 있어서,
    화합물 IIIA를 트리플루오로아세트산으로 처리하여 벤질옥시카르보닐을 제거한 후 화합물 VI의 염산염으로 전환시키는 단계(A1); 화합물 VI와 유기산의 결합 반응을 통해 화합물 VII를 얻는 단계(A2); 화합물 VII와 붕산 또는 붕산에스테르 II의 Suzuki 결합 반응을 통해 상기 식 I의 화합물을 얻는 단계(A3);를 포함하고,:

    여기서, X=할로겐, R1, R2, L, 고리 A, 고리 B 및 고리 C는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 설명을 따르는, 화합물의 제조방법.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 제조방법에 있어서,
    화합물 IIIB와 붕산 II를 아세트산 구리의 촉매작용 하에서 Chan-Lam-Evans 결합 반응을 통해 화합물 VIII를 얻는 단계(B1); 화합물 VIII를 트리플루오로아세트산으로 처리하여 벤질옥시카르보닐을 제거한 후 화합물 IX의 염산염으로 전환시키는 단계(B2); 화합물 IX와 유기산의 결합 반응을 통해 상기 식 I의 화합물을 얻는 단계(B3);를 포함하고,:

    여기서, X=할로겐, R1, R2, L, 고리 A, 고리 B 및 고리 C는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 설명을 따르는, 화합물의 제조방법.
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