KR102731274B1 - 1d-1h nmr 분석을 통한 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 1D-1H NMR 분석을 통해 젤라틴 및 알지네이트를 캡슐의 주벽재물질로 사용하는 복합 코아세르베이션 접근을 통해 합성한 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘을 예측하는 방법 등에 관한 것으로서, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 마이크로캡슐 내부의 개별 성분 변화를 평가하여 분해 경로를 제시할 수 있다. 또한, 효소의 종류에 따라 다른 분해 패턴을 나타내므로 특정 화학적 및 생분해성 환경에 노출된 고분자 복합체의 분해 과정에 대한 자세한 정보를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 1D-1H NMR 분석을 통한 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법 등에 관한 것이다.
마이크로캡슐(microcapsule)은 외부 요인으로부터 취약한 물질을 조심스럽게 전달하고 목표 지점까지 보호할 수 있어 화장품, 세제, 식품 첨가물, 약물 전달 시스템 등 다양한 형태로 널리 사용된다. 인구 성장과 활용도 증가의 영향으로, 시간과 비용면에서 경제적이고 보존성이 좋고 안정성이 우수한 미세플라스틱(microplastic) 기반의 제품을 생산하고 있다. 그러나, 미세플라스틱 기반의 제품들은 해양과 육지 시스템에 광범위한 오염을 일으킨다는 점에서 심각한 문제가 된다. 유럽화학물질청(European Chemicals Agency, ECHA)은 2019년 의도적으로 생산된 미세플라스틱에 대한 엄격한 제한을 제안하였다. 이러한 환경 규제에 대비하고 마이크로비드 관련 오염을 완화하기 위해 지속가능성과 녹색 화학을 갖춘 새로운 기술 솔루션이 필요하다. 이에 따라 최근 생분해성을 가진 천연 고분자 기반 마이크로캡슐이 현재 사용되고 있는 미세플라스틱을 대체할 친환경 소재로 각광받고 있다. 높은 생분해성과 무독성을 가진 천연 고분자는 다양한 생물의학 및 산업분야에 활용될 수 있다.
알지네이트(alginate)는 캡슐 벽재물질에 활용되기 좋은 천연 고분자이며, 생체적합성과 제어 가능한 겔화 특성을 가져 농업, 세포공학, 의약, 화장품 등 광범위한 분야에서 사용된다. 또한, 온화한 조건에서 가교에 의한 겔 형성이 진행됨에 따라 효소 및 항체를 포함한 생리활성 물질을 효과적으로 포획하는 것으로 보고된 바 있다. 한편 젤라틴(gelatin)은 식품 및 생물 의학 분야에서 일반적으로 사용되는 일종의 변성 콜라겐으로서, 산 조건에서 반대 전하 특성에 따라 상 분리를 통해 알지네이트와 결합될 수 있다.
복합 코아세르베이션(complex coacervation)은 반대 전하를 띤 두 콜로이드 간의 정전기적 상호작용을 이용하여 콜로이드 시스템에서 자발적인 액체/액체 상 분리를 활용하는 것으로서, 고유하고 확실하면서도 손쉬운 마이크로캡슐화 기술이다. 코아세르베이션을 위한 두 가지 생체 고분자는 일반적으로 단백질과 다당류 분자이므로, 본 발명에서는 젤라틴과 알지네이트를 벽재물질로 선택하였다.
젤라틴과 알지네이트가 조합된 복합 코아세르베이트에 대한 여러 연구가 수행되었지만 균일한 모양, 작은 크기(<50 μm) 및 좁은 크기 분포를 가진 마이크로캡슐에 대한 연구는 거의 보고되지 않았다. 특히, 10 ~ 50 μm 크기의 단분산 마이크로캡슐은 제약 및 퍼스널 케어 산업에서 큰 관심을 받고 있으며, 마이크로캡슐의 형태학적 특성은 응용 분야와 직접적인 관련이 있기 때문에, 코아세르베이트 형성에서 중합체의 점도와 표면 전하를 주의깊게 제어하여 규칙적인 구형 모양의 마이크로캡슐을 만드는 것이 중요하다.
특정 응용 분야에서 마이크로캡슐을 성공적으로 사용하려면 적절한 조건에 맞게 물리화학적 특성을 조정해야 하며, 이를 위해서는 고분자 시스템의 분해 거동을 자세히 이해하고, 다양한 혼합 고분자를 통합해야 한다. 또한, 생물의학 응용분야에서 원치 않는 부작용을 피하기 위해 생리학적 조건에서 고분자 단편화 과정에 대한 정보를 조사해야 한다. 이러한 정보는 기계적 속성 향상 및 분해가능한 특성 제어 측면에서 합성 고분자 기반 제품을 대체할 신규한 고도의 생분해성 재료를 개발하는데 상당한 도움이 될 수 있다.
고분자 및 마이크로캡슐의 해중합(depolymerization) 특성을 조사하기 위해 질량분석법(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight, MALDI-TOF), 시차주사열량법(differential scanning calorimetry), 열중량 분석(thermogravimetric analysis) 및 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC)를 포함한 다양한 분석법을 이용한 연구들이 보고되었다. 그러나 일반적으로 전체 샘플의 중량 손실에 초점을 맞추기 때문에 하나 이상의 고분자를 포함하는 구조에서 각 구성 요소의 분해 패턴을 추적하는 것은 어렵다. 또한, 이러한 접근 방식은 샘플을 레이저로 조사하거나 고온에 노출시켜 이온화 및 분해를 유도하기 때문에, 효소 또는 생리학적 조건에서 분산된 샘플의 실시간 변화를 관찰하는데 적합하지 않다.
한편, 푸리에 변환 적외선 분석(Fourier-transform infrared(FT-IR) analysis)이 고분자의 분해 전후를 IR로 분석하여 메커니즘을 예측하는 것으로서, 고분자 분해 검사에 널리 사용되나, 복잡한 구조를 가진 고분자 혼합물에서는 광범위한 피크 중첩으로 인해 신뢰할 수 있는 데이터를 수득하기 어렵다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 천연 소재의 장점을 바탕으로 복합 코아세르베이션을 통해 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐을 합성하고, 상기 마이크로캡슐의 기능적 특성을 최적화하였다.
또한, 상기 마이크로캡슐에 핵자기 공명 분광법(proton nuclear magnetic resonance, 1H NMR)을 활용한 효소 실험을 적용하여 다양한 분해 조건에서 마이크로캡슐의 생분해 특성을 결정하고 분해 메커니즘을 제안함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법을 제공할 수 있다.
마이크로캡슐의 수소핵자기공명분광분석(1D-1H-NMR) 스펙트럼을 수득하는 단계(S1);
S1 단계 후, 마이크로캡슐에 분해효소를 처리한 후 1D-1H-NMR 스펙트럼을 수득하는 단계(S2);
마이크로캡슐이 완전히 분해된 후 1D-1H-NMR 스펙트럼을 수득하는 단계(S3);
상기 S1 단계의 스펙트럼 내지 S3 단계의 스펙트럼으로부터, 벽재물질의 피크를 선정하는 단계(S4);
상기 S1 단계의 스펙트럼에서 선정된 벽재물질의 피크의 강도를 0으로, 상기 S3 단계의 스펙트럼에서 선정된 피크의 강도를 1이라 할 때, 상기 S2 단계의 스펙트럼에서 선정된 피크의 강도를 계산하는 단계(S5); 및
상기 계산된 벽재물질의 피크의 강도를 비교하여 벽재물질의 화학결합이 끊어지는 순서를 결정하는 단계(S6).
본 발명의 일 구현예로서, 상기 S6 단계는 상기 S5 단계에서 계산된 벽재물질의 피크의 강도가 클수록 화합결합이 끊어지는 순서가 빠른 것으로 결정하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 예측방법은 상기 S2 단계의 스펙트럼에서 선정된 피크가 관찰되는 시간을 측정하여 화학결합이 끊어지는 속도를 계산하는 단계(S7)를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 마이크로캡슐은 코어물질 및 벽재물질로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 코어물질은 오일 상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 벽재물질은 젤라틴; 알지네이트; 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 골격 영역; 젤라틴, 알지네이트, 및 글루타르알데히드(GTA)를 포함하는 가교결합 영역; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 분해효소는 콜라게나제, 알지네이트 리아제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 다당류 기반 물질을 분해할 수 있는 대표적인 탄수화물 활성 효소인 셀룰라아제와 아밀라아제는 포함되지 않는다. 상기 콜라게나제, 알지네이트 리아제는 기질 특이성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 S2 단계는 중성 환경, 바람직하게는 pH 6 ~ 9, 더욱 바람직하게는 pH 7 ~ 8, 더욱 바람직하게는 pH 7.4에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 S2 단계는 1주 ~ 4주 동안 반응시켜 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 S4 단계는 스펙트럼의 3.4 ~ 4.0 ppm, 바람직하게는 3.57 ppm 또는 3.96 ppm은 젤라틴의 피크인 것으로 선정하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 S4 단계는 스펙트럼의 3.5 ~ 3.8 ppm, 바람직하게는 3.6 ~ 3.7 ppm 또는 3.56 ~ 3.70 ppm은 젤라틴, 알지네이트, 및 글루타르알데히드(GTA)를 포함하는 가교결합 영역의 피크인 것으로 선정하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 S4 단계는 스펙트럼의 3.5 ~ 4.5 ppm, 바람직하게는 4.0 ~ 4.5 ppm 또는 3.76 ~ 4.06 ppm은 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 골격 영역의 피크인 것으로 선정하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 S4 단계는 스펙트럼의 5.5 ~ 6.0 ppm, 바람직하게는 5.22 ppm 또는 5.77 ~ 5.93 ppm은 알지네이트의 피크인 것으로 선정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법은 핵자기 공명 분광법(NMR)을 이용하는 것으로서, 원자 수준에서 거대분자에 대한 상세한 구조적, 동적 정보를 제공할 수 있고, 피크 변화를 통해 생성물의 구조를 설명할 수 있으며, 정량적 접근이기 때문에 반응 역학 및 분해 거동을 감지할 수 있다. 특히, 분해 과정에서 NMR 스펙트럼상 새롭게 형성된 신호 강도 변화를 통해 분해 메커니즘을 예측할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 예측방법은 여러 고분자 유형과 혼합된 마이크로캡슐 시스템에서 분자 수준의 생분해 메커니즘을 규명하기 위해 마이크로캡슐 내부의 개별 성분 변화를 평가하고 분해 경로를 제시할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 예측방법은 효소의 종류에 따라 다른 분해 패턴을 나타내므로 특정 화학적 및 생분해성 환경에 노출된 고분자 복합체의 분해 과정에 대한 자세한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로캡슐은 젤라틴-알지네이트를 이용하여 복합 코아세르베이션 접근을 통해 제조된 것으로서, 좁은 크기 분포(20 ~ 30 μm)를 가지고, 생체적합성이 우수하다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 예측방법은 1H NMR 분광법을 이용하여 상기 마이크로캡슐의 분해 메커니즘을 자세히 조사할 수 있으며, 산업 및 제약 분야에서 새로운 생분해성 고분자 및 복합재 개발을 위한 분해율을 조절하는데 활용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 젤라틴-알지네이트(GEL-ALG) 마이크로캡슐의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 2a는 건조된 마이크로캡슐 및 오일-추출 건조된 마이크로캡슐의 이미지를 나타낸 것이다. 도 2b는 올리브 오일, 마이크로캡슐(MC) 및 오일-추출 마이크로캡슐의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다. MC 오일로 추출한 샘플에서는 올리브 오일 신호가 관찰되지 않았으며, 추출 단계에서 모든 올리브 오일이 회수되었음을 확인하였다.
도 3은 540 nm에서 DNS 테스트로 얻은 포도당의 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐의 물리화학적 특성을 나타낸 것이다. 도 4a 및 도 4b는 형광 특성 및 입자 형태를 확인하는 형광 현미경과 SEM 이미지이다. 도 4c는 입자 크기 분포 분석 결과를 나타낸 것으로서, 분석 결과 합성된 샘플의 평균 크기는 24.6 μm이고 크기 분포가 좁은 것을 확인하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 젤라틴-알지네이트(GEL-ALG) 마이크로캡슐의 물리화학적 특성을 나타낸 것이다. 도 5a 및 도 5b는 가교시스템을 확인하는 광학 현미경 이미지와 FT-IR 스펙트럼이다. 아미드 I기가 1,631 cm-1에서 1,650 cm-1로 이동하고, 아미드 II기가 1,529 cm-1에서 1,525 cm-1로 이동했다는 점을 통해 가교 속성을 식별할 수 있다.
도 6은 가교 마이크로캡슐(a) 및 비가교 마이크로캡슐(b)의 브라이트 필드 및 형광 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 가교되지 않은 마이크로캡슐과 가교된 마이크로캡슐 모두에서 청색 형광 신호가 관찰되며, 이러한 현상은 티로신-젤라틴 잔류물 때문에 발생하였다. 녹색 및 적색 형광 신호는 젤라틴과 글루타르알데히드(GTA, 링커) 사이에 새롭게 형성된 시프 염기(C=N)를 할당하는 가교 마이크로캡슐에서 관찰되었다.
도 7은 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐의 1H NMR 스펙트럼과 피크 할당을 나타낸 것으로서, 1 ~ 2.7 ppm은 코어 오일(녹색)을 나타내며 벽재물질은 주로 3.0 ~ 4.5 ppm 사이에 존재하였다. 두 벽재물질의 중심적인 화학적 이동 영역은 알지네이트(빨강)와 젤라틴(노란색)으로 표시하였다.
도 8은 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐 합성에 사용된 벽 및 코어 재료에 대한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 샘플을 D2O 용매에 샘플을 분산시켜 측정을 수행하였다. 알지네이트 나트륨의 경우, 점도가 높아 70 ℃의 프로브 온도에서 NMR 스펙트럼을 수득하였다.
도 9는 콜라게나제와 함께 젤라틴을 24시간 동안 배양한 후 수득한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 3.96 ppm의 Gly 잔기 피크에서 Hyp, Pro, Met, Ala 및 Val, Leu, Ile와 같은 중성 아미노산 잔기를 각각 3.90 ppm, 3.65 ppm, 2.03 ppm, 1.41 ppm, 및 0.93 ppm의 피크에 할당하였다.
도 10은 M/G 비율이 1.54인 알지네이트 나트륨 샘플의 3.5%(w/v) 용액의 1H NMR 스펙트럼(80 ℃)을 나타낸 것으로서, 각 신호 영역은 HG-1(A1), HM-1 + HGM-5(A2) 및 HG-5(A3)을 나타내며, 알지네이트의 구조는 Grasdalen 방정식에 따라 다음과 같이 특성화하였다: FG=0.39; FM=0.60; FGG=GG/(M+G)=0.17; FMM=MM/(M+G)=0.39; FGM=FMG=MG/(M+G)=0.21; M/G=1.54
도 11은 알지네이트 리아제와 함께 알지네이트를 24시간 동안 배양한 후 수득한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 5.93 ~ 5.94 ppm(H4△G(dp2)), 5.88 ~ 5.90 ppm(H4△G) 및 5.76 ~ 5.77 ppm(H4△M)의 알지네이트 잔기 피크를 통해 효소에 의한 마이크로캡슐 분해를 관찰하였으며, 효소의 영향으로 골격 부분(3.75~4.25ppm)에서 추가 피크를 감지하였다.
도 12a는 콜라게나제와 함께 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐을 24시간 동안 배양한 후 수득한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 새롭게 형성된 글리신 피크의 공명 신호는 3.96 ppm에서 관찰되었다. 또한, 다른 아미노 잔기에 대한 강도 증가가 확인되었다. 도 12b는 24시간 동안 샘플의 구조적 변화를 나타내는 대표적인 형광 이미지를 나타낸 것으로서, 효소 처리된 마이크로캡슐에서 작은 조각이 발견되었다는 점에서 콜라게나제에 의한 캡슐 분해를 확인할 수 있다.
도 13은 콜라게나제 없이 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐을 24시간 동안 배양한 후 수득한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 효소가 존재하는 스펙트럼과 달리 0.5 ~ 4.5 ppm 영역에서는 잔기 피크가 발견되지 않았으며, 고분자 영역에서는 24시간 후에도 마이크로캡슐 자체의 피크만 확인되었다.
도 14는 다양한 pH 조건에서 콜라게나제를 함유한 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐의 현미경 이미지를 나타낸 것으로서, 도 14a는 pH 4, 도 14b는 pH 7.4, 도 14c는 pH 11 조건이다. 콜라게나제가 pH 7.4 조건에서 반응하므로 마이크로캡슐은 pH 4 및 11에서 안정하고, pH 7.4 조건에서 분해됨을 알 수 있다. 이 때, 크기 바는 50 μm이다.
도 15a는 알지네이트 리아제와 함께 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐을 24시간 동안 배양한 후 수득한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 알지네이트 분해와 마찬가지로 3개의 G-잔기(H4△G(dp2)), H4△G 및 H4△M이 관찰되었다. 또한 3.60 ~ 4.25 ppm 범위에서 고분자 골격이 느슨해짐에 따라 추가적인 날카로운 피크가 관찰되었다. 도 15b는 24시간 동안 샘플의 구조적 변화를 나타내는 대표적인 형광 이미지를 나타낸 것으로서, 효소 처리된 마이크로캡슐에서 작은 조각이 발견되었다는 점에서 알지네이트 리아제에 의한 캡슐 분해를 확인할 수 있다.
도 16은 효소 없이 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐을 24시간 동안 배양한 후 수득한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 효소가 존재하는 스펙트럼과 달리 5.70 ~ 6 ppm 영역에서 잔기 피크가 발견되지 않았으며, 고분자 영역에서는 24시간 후에도 마이크로캡슐 자체의 피크만 확인되었다.
도 17는 다양한 pH 조건에서 알지네이트 리아제를 함유한 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐의 현미경 이미지를 나타낸 것으로서, 도 17a는 pH 4, 도 17b는 pH 7.4, 도 17c는 pH 11 조건이다. 알지네이트 리아제가 pH 7.4 조건에서 반응하므로 마이크로캡슐은 pH 4 및 11에서 안정하고, pH 7.4 조건에서 분해됨을 알 수 있다. 이 때, 크기 바는 50 μm이다.
도 18은 다양한 pH 조건에서 콜라게나제를 사용한 경우, 5.79 ~ 8 ppm 범위의 1H NMR 스펙트럼 및 고분자 영역을 나타낸 것이다. pH 7.4에서만 캡슐 자체에 나타나는 아미노 잔기(Phe, Tyr)의 신호와 3.96 ppm에서 글리신 피크가 확인되어 젤라틴 생분해의 증거를 나타낸다.
도 19는 다양한 pH 조건에서 알지네이트 리아제를 사용한 경우, 5.50 ~ 6.20 ppm 범위의 1H NMR 스펙트럼 및 고분자 영역을 나타낸 것이다. 알지네이트 리아제 활성이 높은 pH 7.4 조건에서 생분해의 증거인 G-잔류 피크가 확인되었으며, 시간이 지남에 따라 강도가 증가하였다. 또한 3.5 ~ 4.5 ppm 범위에서 추가로 나타나는 피크는 pH 7.4에서만 관찰되며, 이는 효소에 의한 고분자 부분의 변화를 나타낸다.
도 20은 최적의 pH와 온도가 유사한 다양한 다당류 효소(셀룰라아제, 아밀라아제, 알지네이트 리아제) 및 콜라게나제의 분해 실험에 대한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 12시간 배양 후, 알지네이트 리아제 처리된 샘플만 G-잔기로부터 이중선 신호를 나타냈으며, 콜라게나제 처리된 샘플만 3.96 ppm에서 글리신 피크를 나타냈다는 점에서 생분해의 명확한 증거를 보여준다. 또한, 해당 효소만 3 ~ 4 ppm 영역에서 벽재물질 골격의 변화를 나타내었다.
도 21은 12시간 배양 후 마이크로캡슐의 현미경 이미지를 나타낸 것으로서, 도 21a는 대조군 샘플, 도 21b는 셀룰라아제를 처리한 마이크로캡슐, 도 21c는 아밀라아제를 처리한 마이크로캡슐, 도 21d는 알지네이트 리아제를 처리한 마이크로캡슐, 도 21e는 콜라게나제를 처리한 마이크로캡슐의 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 도 21f는 DNS 테스트를 통해 확인된 알지네이트 분해에 대한 이미지를 나타낸 것이다. 상기 결과들은 현미경 및 DNS 테스트에서 확인한 바와 같이, 알지네이트 리아제 및 콜라게나제를 처리한 경우 깨진 마이크로캡슐을 수득할 수 있으나, 마이크로캡슐이 셀룰라아제 및 아밀라아제에서 안정함을 입증한다. 이 때, 크기 바는 50 μm이다.
도 22a는 정규화된 NMR 강도를 기반으로 생성된 콜라게나제(빨강 구, 짧은 대시 선형) 및 알지네이트 리아제(검정 구, 실선 선형)에 의한 마이크로캡슐의 다단계 분해 운동 모델을 나타낸 것이다. 도 22b는 정규화된 NMR 강도(검정 구, 실선 선형) 및 정규화된 UV 강도(파랑 구, 짧은 점 선형)를 기반으로 생성된 알지네이트 리아제에 의한 마이크로캡슐의 다단계 분해 운동 모델을 나타낸 것이다. 이를 통해 두 효소에 의한 마이크로캡슐의 분해 패턴의 차이가 입증되었으며, NMR 측정에서 얻은 분해 데이터는 UV 결과와 일치하였다.
도 23a는 0.233 g 젤라틴(빨강 구), 2 g 마이크로캡슐(파랑 구) 및 1 g 마이크로캡슐(검정 구)의 반응 시간과 NMR(글리신) 피크 강도 간의 관계를 나타낸 것이다. 도 23b는 정규화된 NMR 강도를 기반으로 생성된 콜라게나제에 의한 젤라틴(적색 구, 실선 선형) 및 마이크로캡슐의 다단계 분해 운동 모델(파랑 구, 짧은 점 선형)을 나타낸 것이다. 도 23c는 다양한 농도에서 콜라게나제에 의한 마이크로캡슐의 정규화된 NMR 강도를 기반으로 생성된 다단계 분해 운동 모델의 비교를 나타낸 것이다: 2 g(파랑 구, 짧은 점 선형) 및 1 g 마이크로캡슐(검정 구, 대시 선형).
도 24a는 DMMB-알지네이트 분석에서 수득한 유리 DMMB, 알지네이트, 및 마이크로캡슐의 흡광도 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 24b는 알지네이트의 표준 곡선을 나타낸 것이다. 이는 알지네이트-마이크로캡슐이 DMMB 방법을 통해 높은 정확도로 정량화될 수 있음을 나타낸다.
도 25는 마이크로캡슐(MC, 검정 구) 및 알지네이트(SA, 파랑 구)의 반응 시간과 (a) NMR 피크 강도 및 (b) 환원당 농도간의 관계를 나타낸 것이다. 정규화된 NMR(검정 구, 실선 선형) 및 UV 강도(파랑 구, 짧은 점 선형)을 기반으로 알지네이트 리아제에 의한 다단계 분해 알지네이트 역학 모델을 생성하였다. 도 25c는 정규화된 NMR 강도를 기반으로 생성된 알지네이트 리아제에 의한 아미크로캡슐의 다단계 분해 운동 모델(검정 구, 실선 선형) 및 알지네이트 리아제에 의한 순수 알지네이트의 다단계 분해 운동 모델(파랑 구, 점 선형)을 나타낸 것이다. 도 25d는 정규화된 NMR(검정 구, 실선 선형) 및 UV 강도(파랑 구, 짧은 점 선형)를 기반으로 생성된 알지네이트 리아제에 의한 다단계 분해 알지네이트 운동 모델을 나타낸 것이다.
도 26은 생분해 메커니즘을 확인하기 위해 콜라게나제로 처리하고 2주 후의 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 캡슐 구성요소의 피크 할당은 알지네이트(MM1, 파랑), 폴리머 골격(빨강), 분해된 젤라틴(글리신, 녹색) 및 가교결합 영역(주황색)으로 표시하였다. 시간이 샘플이 수집되고 시간이 지남에 따라 전반적으로 피크가 더 날카로워진다는 점에서 관찰에 따라 시간이 지날수록 강도가 증가함을 알 수 있다.
도 27은 1H NMR 스펙트럼에서 가교결합 영역 피크 할당을 위한 간단한 혼합 및 분해 실험을 나타낸 것이다. 3.56 ~ 3.70 ppm에서 나타나는 가교결합 영역은 GTA, 알지네이트, 젤라틴이 혼합된 경우에만 발생하여 합성된 마이크로캡슐이 넓은 피크 형태를 나타냄을 알 수 있다. 그러나 효소 처리 후 추가적인 날카로운 피크가 나타났으며, 이는 가교 부분의 변화를 시사한다.
도 28은 정규화된 강도로 표현된 콜라게나제의 생분해 메커니즘 프로파일을 나타낸 것이다. 특이성으로 인해 젤라틴과 알지네이트-젤라틴 골격이 가장 빠른 생분해율을 나타내었다. 이어서, 가교결합 영역과 젤라틴도 분해되어 캡슐이 완전히 붕괴되는 4단계에 도달하였다.
도 29는 장기 실험을 위한 현미경 이미지를 나타낸 것으로서, 도 29a는 대조군 샘플의 마이크로캡슐 형태이고, 도 29b는 4주 동안 배양한 알지네이트 리아제를 처리한 마이크로캡슐의 형태이다. 현미경 결과에 따르면, 마이크로캡슐은 2주 후에 터지기 시작했고 3주 및 4주 배양 후에는 거의 사라졌다. 이 때, 크기 바는 50 μm이다.
도 30은 생분해 메커니즘을 확인하기 위해 알지네이트 리아제를 처리한 후 1개월 뒤의 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 캡슐 구성요소의 피크 할당은 알지네이트 잔기(파랑), 폴리머 골격(빨강), 가교결합 영역(녹색) 및 젤라틴(프롤린)과 같이 표시하였다. 매주 샘플을 채취하여 관찰한 결과, 전체 피크가 날카로워졌으며, 시간이 지날수록 강도가 증가함을 알 수 있다.
도 31은 알지네이트 리아제 처리 전후의 젤라틴의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 프롤린 피크는 3.57 ppm에서 나타나며 변화를 쉽게 식별할 수 있을 정도로 다른 화학적 이동 범위에 비해 중첩되는 작은 피크를 가졌다. 프롤린에 의해 나타나는 변화가 젤라틴과 마이크로캡슐 모두에서 동일하게 나타난다는 점에서, 이는 알지네이트 리아제 처리로 인한 것임을 알 수 있다.
도 32는 정규화된 강도로 표현된 알지네이트 리아제의 생분해 메커니즘 프로필을 나타낸 것이다. 효소 특이성으로 인해 알지네이트 및 알지네이트 폴리머의 G-잔기는 가장 빠른 생분해율을 나타내며, 이어서 가교결합 영역과 젤라틴도 분해되어 완전분해인 4단계로 진행되었다.
도 33은 (a) 대조군 샘플의 마이크로캡슐 형태, 및 (b) 4주 배양한 콜라게나제를 처리한 마이크로캡슐을 사용한 장기 실험에 대한 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 그 결과 마이크로캡슐이 빠르게 분해되고 1주 배양 후 모든 입자가 사라짐을 알 수 있다. 이 때, 크기 바는 50 μm이다.
도 2a는 건조된 마이크로캡슐 및 오일-추출 건조된 마이크로캡슐의 이미지를 나타낸 것이다. 도 2b는 올리브 오일, 마이크로캡슐(MC) 및 오일-추출 마이크로캡슐의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다. MC 오일로 추출한 샘플에서는 올리브 오일 신호가 관찰되지 않았으며, 추출 단계에서 모든 올리브 오일이 회수되었음을 확인하였다.
도 3은 540 nm에서 DNS 테스트로 얻은 포도당의 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐의 물리화학적 특성을 나타낸 것이다. 도 4a 및 도 4b는 형광 특성 및 입자 형태를 확인하는 형광 현미경과 SEM 이미지이다. 도 4c는 입자 크기 분포 분석 결과를 나타낸 것으로서, 분석 결과 합성된 샘플의 평균 크기는 24.6 μm이고 크기 분포가 좁은 것을 확인하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 젤라틴-알지네이트(GEL-ALG) 마이크로캡슐의 물리화학적 특성을 나타낸 것이다. 도 5a 및 도 5b는 가교시스템을 확인하는 광학 현미경 이미지와 FT-IR 스펙트럼이다. 아미드 I기가 1,631 cm-1에서 1,650 cm-1로 이동하고, 아미드 II기가 1,529 cm-1에서 1,525 cm-1로 이동했다는 점을 통해 가교 속성을 식별할 수 있다.
도 6은 가교 마이크로캡슐(a) 및 비가교 마이크로캡슐(b)의 브라이트 필드 및 형광 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 가교되지 않은 마이크로캡슐과 가교된 마이크로캡슐 모두에서 청색 형광 신호가 관찰되며, 이러한 현상은 티로신-젤라틴 잔류물 때문에 발생하였다. 녹색 및 적색 형광 신호는 젤라틴과 글루타르알데히드(GTA, 링커) 사이에 새롭게 형성된 시프 염기(C=N)를 할당하는 가교 마이크로캡슐에서 관찰되었다.
도 7은 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐의 1H NMR 스펙트럼과 피크 할당을 나타낸 것으로서, 1 ~ 2.7 ppm은 코어 오일(녹색)을 나타내며 벽재물질은 주로 3.0 ~ 4.5 ppm 사이에 존재하였다. 두 벽재물질의 중심적인 화학적 이동 영역은 알지네이트(빨강)와 젤라틴(노란색)으로 표시하였다.
도 8은 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐 합성에 사용된 벽 및 코어 재료에 대한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 샘플을 D2O 용매에 샘플을 분산시켜 측정을 수행하였다. 알지네이트 나트륨의 경우, 점도가 높아 70 ℃의 프로브 온도에서 NMR 스펙트럼을 수득하였다.
도 9는 콜라게나제와 함께 젤라틴을 24시간 동안 배양한 후 수득한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 3.96 ppm의 Gly 잔기 피크에서 Hyp, Pro, Met, Ala 및 Val, Leu, Ile와 같은 중성 아미노산 잔기를 각각 3.90 ppm, 3.65 ppm, 2.03 ppm, 1.41 ppm, 및 0.93 ppm의 피크에 할당하였다.
도 10은 M/G 비율이 1.54인 알지네이트 나트륨 샘플의 3.5%(w/v) 용액의 1H NMR 스펙트럼(80 ℃)을 나타낸 것으로서, 각 신호 영역은 HG-1(A1), HM-1 + HGM-5(A2) 및 HG-5(A3)을 나타내며, 알지네이트의 구조는 Grasdalen 방정식에 따라 다음과 같이 특성화하였다: FG=0.39; FM=0.60; FGG=GG/(M+G)=0.17; FMM=MM/(M+G)=0.39; FGM=FMG=MG/(M+G)=0.21; M/G=1.54
도 11은 알지네이트 리아제와 함께 알지네이트를 24시간 동안 배양한 후 수득한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 5.93 ~ 5.94 ppm(H4△G(dp2)), 5.88 ~ 5.90 ppm(H4△G) 및 5.76 ~ 5.77 ppm(H4△M)의 알지네이트 잔기 피크를 통해 효소에 의한 마이크로캡슐 분해를 관찰하였으며, 효소의 영향으로 골격 부분(3.75~4.25ppm)에서 추가 피크를 감지하였다.
도 12a는 콜라게나제와 함께 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐을 24시간 동안 배양한 후 수득한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 새롭게 형성된 글리신 피크의 공명 신호는 3.96 ppm에서 관찰되었다. 또한, 다른 아미노 잔기에 대한 강도 증가가 확인되었다. 도 12b는 24시간 동안 샘플의 구조적 변화를 나타내는 대표적인 형광 이미지를 나타낸 것으로서, 효소 처리된 마이크로캡슐에서 작은 조각이 발견되었다는 점에서 콜라게나제에 의한 캡슐 분해를 확인할 수 있다.
도 13은 콜라게나제 없이 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐을 24시간 동안 배양한 후 수득한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 효소가 존재하는 스펙트럼과 달리 0.5 ~ 4.5 ppm 영역에서는 잔기 피크가 발견되지 않았으며, 고분자 영역에서는 24시간 후에도 마이크로캡슐 자체의 피크만 확인되었다.
도 14는 다양한 pH 조건에서 콜라게나제를 함유한 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐의 현미경 이미지를 나타낸 것으로서, 도 14a는 pH 4, 도 14b는 pH 7.4, 도 14c는 pH 11 조건이다. 콜라게나제가 pH 7.4 조건에서 반응하므로 마이크로캡슐은 pH 4 및 11에서 안정하고, pH 7.4 조건에서 분해됨을 알 수 있다. 이 때, 크기 바는 50 μm이다.
도 15a는 알지네이트 리아제와 함께 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐을 24시간 동안 배양한 후 수득한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 알지네이트 분해와 마찬가지로 3개의 G-잔기(H4△G(dp2)), H4△G 및 H4△M이 관찰되었다. 또한 3.60 ~ 4.25 ppm 범위에서 고분자 골격이 느슨해짐에 따라 추가적인 날카로운 피크가 관찰되었다. 도 15b는 24시간 동안 샘플의 구조적 변화를 나타내는 대표적인 형광 이미지를 나타낸 것으로서, 효소 처리된 마이크로캡슐에서 작은 조각이 발견되었다는 점에서 알지네이트 리아제에 의한 캡슐 분해를 확인할 수 있다.
도 16은 효소 없이 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐을 24시간 동안 배양한 후 수득한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 효소가 존재하는 스펙트럼과 달리 5.70 ~ 6 ppm 영역에서 잔기 피크가 발견되지 않았으며, 고분자 영역에서는 24시간 후에도 마이크로캡슐 자체의 피크만 확인되었다.
도 17는 다양한 pH 조건에서 알지네이트 리아제를 함유한 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐의 현미경 이미지를 나타낸 것으로서, 도 17a는 pH 4, 도 17b는 pH 7.4, 도 17c는 pH 11 조건이다. 알지네이트 리아제가 pH 7.4 조건에서 반응하므로 마이크로캡슐은 pH 4 및 11에서 안정하고, pH 7.4 조건에서 분해됨을 알 수 있다. 이 때, 크기 바는 50 μm이다.
도 18은 다양한 pH 조건에서 콜라게나제를 사용한 경우, 5.79 ~ 8 ppm 범위의 1H NMR 스펙트럼 및 고분자 영역을 나타낸 것이다. pH 7.4에서만 캡슐 자체에 나타나는 아미노 잔기(Phe, Tyr)의 신호와 3.96 ppm에서 글리신 피크가 확인되어 젤라틴 생분해의 증거를 나타낸다.
도 19는 다양한 pH 조건에서 알지네이트 리아제를 사용한 경우, 5.50 ~ 6.20 ppm 범위의 1H NMR 스펙트럼 및 고분자 영역을 나타낸 것이다. 알지네이트 리아제 활성이 높은 pH 7.4 조건에서 생분해의 증거인 G-잔류 피크가 확인되었으며, 시간이 지남에 따라 강도가 증가하였다. 또한 3.5 ~ 4.5 ppm 범위에서 추가로 나타나는 피크는 pH 7.4에서만 관찰되며, 이는 효소에 의한 고분자 부분의 변화를 나타낸다.
도 20은 최적의 pH와 온도가 유사한 다양한 다당류 효소(셀룰라아제, 아밀라아제, 알지네이트 리아제) 및 콜라게나제의 분해 실험에 대한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 12시간 배양 후, 알지네이트 리아제 처리된 샘플만 G-잔기로부터 이중선 신호를 나타냈으며, 콜라게나제 처리된 샘플만 3.96 ppm에서 글리신 피크를 나타냈다는 점에서 생분해의 명확한 증거를 보여준다. 또한, 해당 효소만 3 ~ 4 ppm 영역에서 벽재물질 골격의 변화를 나타내었다.
도 21은 12시간 배양 후 마이크로캡슐의 현미경 이미지를 나타낸 것으로서, 도 21a는 대조군 샘플, 도 21b는 셀룰라아제를 처리한 마이크로캡슐, 도 21c는 아밀라아제를 처리한 마이크로캡슐, 도 21d는 알지네이트 리아제를 처리한 마이크로캡슐, 도 21e는 콜라게나제를 처리한 마이크로캡슐의 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 도 21f는 DNS 테스트를 통해 확인된 알지네이트 분해에 대한 이미지를 나타낸 것이다. 상기 결과들은 현미경 및 DNS 테스트에서 확인한 바와 같이, 알지네이트 리아제 및 콜라게나제를 처리한 경우 깨진 마이크로캡슐을 수득할 수 있으나, 마이크로캡슐이 셀룰라아제 및 아밀라아제에서 안정함을 입증한다. 이 때, 크기 바는 50 μm이다.
도 22a는 정규화된 NMR 강도를 기반으로 생성된 콜라게나제(빨강 구, 짧은 대시 선형) 및 알지네이트 리아제(검정 구, 실선 선형)에 의한 마이크로캡슐의 다단계 분해 운동 모델을 나타낸 것이다. 도 22b는 정규화된 NMR 강도(검정 구, 실선 선형) 및 정규화된 UV 강도(파랑 구, 짧은 점 선형)를 기반으로 생성된 알지네이트 리아제에 의한 마이크로캡슐의 다단계 분해 운동 모델을 나타낸 것이다. 이를 통해 두 효소에 의한 마이크로캡슐의 분해 패턴의 차이가 입증되었으며, NMR 측정에서 얻은 분해 데이터는 UV 결과와 일치하였다.
도 23a는 0.233 g 젤라틴(빨강 구), 2 g 마이크로캡슐(파랑 구) 및 1 g 마이크로캡슐(검정 구)의 반응 시간과 NMR(글리신) 피크 강도 간의 관계를 나타낸 것이다. 도 23b는 정규화된 NMR 강도를 기반으로 생성된 콜라게나제에 의한 젤라틴(적색 구, 실선 선형) 및 마이크로캡슐의 다단계 분해 운동 모델(파랑 구, 짧은 점 선형)을 나타낸 것이다. 도 23c는 다양한 농도에서 콜라게나제에 의한 마이크로캡슐의 정규화된 NMR 강도를 기반으로 생성된 다단계 분해 운동 모델의 비교를 나타낸 것이다: 2 g(파랑 구, 짧은 점 선형) 및 1 g 마이크로캡슐(검정 구, 대시 선형).
도 24a는 DMMB-알지네이트 분석에서 수득한 유리 DMMB, 알지네이트, 및 마이크로캡슐의 흡광도 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 24b는 알지네이트의 표준 곡선을 나타낸 것이다. 이는 알지네이트-마이크로캡슐이 DMMB 방법을 통해 높은 정확도로 정량화될 수 있음을 나타낸다.
도 25는 마이크로캡슐(MC, 검정 구) 및 알지네이트(SA, 파랑 구)의 반응 시간과 (a) NMR 피크 강도 및 (b) 환원당 농도간의 관계를 나타낸 것이다. 정규화된 NMR(검정 구, 실선 선형) 및 UV 강도(파랑 구, 짧은 점 선형)을 기반으로 알지네이트 리아제에 의한 다단계 분해 알지네이트 역학 모델을 생성하였다. 도 25c는 정규화된 NMR 강도를 기반으로 생성된 알지네이트 리아제에 의한 아미크로캡슐의 다단계 분해 운동 모델(검정 구, 실선 선형) 및 알지네이트 리아제에 의한 순수 알지네이트의 다단계 분해 운동 모델(파랑 구, 점 선형)을 나타낸 것이다. 도 25d는 정규화된 NMR(검정 구, 실선 선형) 및 UV 강도(파랑 구, 짧은 점 선형)를 기반으로 생성된 알지네이트 리아제에 의한 다단계 분해 알지네이트 운동 모델을 나타낸 것이다.
도 26은 생분해 메커니즘을 확인하기 위해 콜라게나제로 처리하고 2주 후의 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 캡슐 구성요소의 피크 할당은 알지네이트(MM1, 파랑), 폴리머 골격(빨강), 분해된 젤라틴(글리신, 녹색) 및 가교결합 영역(주황색)으로 표시하였다. 시간이 샘플이 수집되고 시간이 지남에 따라 전반적으로 피크가 더 날카로워진다는 점에서 관찰에 따라 시간이 지날수록 강도가 증가함을 알 수 있다.
도 27은 1H NMR 스펙트럼에서 가교결합 영역 피크 할당을 위한 간단한 혼합 및 분해 실험을 나타낸 것이다. 3.56 ~ 3.70 ppm에서 나타나는 가교결합 영역은 GTA, 알지네이트, 젤라틴이 혼합된 경우에만 발생하여 합성된 마이크로캡슐이 넓은 피크 형태를 나타냄을 알 수 있다. 그러나 효소 처리 후 추가적인 날카로운 피크가 나타났으며, 이는 가교 부분의 변화를 시사한다.
도 28은 정규화된 강도로 표현된 콜라게나제의 생분해 메커니즘 프로파일을 나타낸 것이다. 특이성으로 인해 젤라틴과 알지네이트-젤라틴 골격이 가장 빠른 생분해율을 나타내었다. 이어서, 가교결합 영역과 젤라틴도 분해되어 캡슐이 완전히 붕괴되는 4단계에 도달하였다.
도 29는 장기 실험을 위한 현미경 이미지를 나타낸 것으로서, 도 29a는 대조군 샘플의 마이크로캡슐 형태이고, 도 29b는 4주 동안 배양한 알지네이트 리아제를 처리한 마이크로캡슐의 형태이다. 현미경 결과에 따르면, 마이크로캡슐은 2주 후에 터지기 시작했고 3주 및 4주 배양 후에는 거의 사라졌다. 이 때, 크기 바는 50 μm이다.
도 30은 생분해 메커니즘을 확인하기 위해 알지네이트 리아제를 처리한 후 1개월 뒤의 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 캡슐 구성요소의 피크 할당은 알지네이트 잔기(파랑), 폴리머 골격(빨강), 가교결합 영역(녹색) 및 젤라틴(프롤린)과 같이 표시하였다. 매주 샘플을 채취하여 관찰한 결과, 전체 피크가 날카로워졌으며, 시간이 지날수록 강도가 증가함을 알 수 있다.
도 31은 알지네이트 리아제 처리 전후의 젤라틴의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 프롤린 피크는 3.57 ppm에서 나타나며 변화를 쉽게 식별할 수 있을 정도로 다른 화학적 이동 범위에 비해 중첩되는 작은 피크를 가졌다. 프롤린에 의해 나타나는 변화가 젤라틴과 마이크로캡슐 모두에서 동일하게 나타난다는 점에서, 이는 알지네이트 리아제 처리로 인한 것임을 알 수 있다.
도 32는 정규화된 강도로 표현된 알지네이트 리아제의 생분해 메커니즘 프로필을 나타낸 것이다. 효소 특이성으로 인해 알지네이트 및 알지네이트 폴리머의 G-잔기는 가장 빠른 생분해율을 나타내며, 이어서 가교결합 영역과 젤라틴도 분해되어 완전분해인 4단계로 진행되었다.
도 33은 (a) 대조군 샘플의 마이크로캡슐 형태, 및 (b) 4주 배양한 콜라게나제를 처리한 마이크로캡슐을 사용한 장기 실험에 대한 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 그 결과 마이크로캡슐이 빠르게 분해되고 1주 배양 후 모든 입자가 사라짐을 알 수 있다. 이 때, 크기 바는 50 μm이다.
본 발명자들은 젤라틴 및 알지네이트를 캡슐의 주벽재물질로 사용하는 복합 코아세르베이션 접근을 통해 생분해성 마이크로캡슐을 합성하고, 1H NMR에서 스펙트럼 변화를 관찰함으로써 효소 유도 분해 메커니즘을 예측하였다.
보다 구체적으로, 수많은 분석 기술을 통해 합성된 캡슐의 화학적 구조, 형태, 크기 분포를 확인했으며, 표면이 매끄러운 구형의 마이크로캡슐(20 ~ 30 μm)이 잘 합성된 것으로 확인하였다. 특성화 외에도 표적 효소(콜라게나제(collagenase) 및 알지네이트 리아제(alginate lyase))를 이용한 동역학 및 장기간 분해 실험을 수행하여 마이크로캡슐 생분해 특성을 상세히 조사하였다. 그 결과, 젤라틴(글리신 사슬 말단)과 알지네이트(H4△잔기)의 분해산물 신호를 통해 생분해를 확인하고, 캡슐 내 주요 성분의 분해 속도 상수(k) 결정이 가능함을 확인하였으며, 장기간 1H NMR 측정에서 피크 변화를 면밀히 조사함으로써 효소 유형에 따른 분해 메커니즘을 제안하였다
또한, 1H NMR 분석과 함께 추가적인 현미경 관찰을 통해 효소에 의한 형태학적 손상을 규명함으로써 데이터 해석의 신뢰성을 높였으며, 대조군 실험을 통해 마이크로캡슐의 생분해 과정이 특정 기질 선택성을 갖는 표적 효소에서만 유래한다는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법을 제공한다.
마이크로캡슐의 수소핵자기공명분광분석(1D-1H-NMR) 스펙트럼을 수득하는 단계(S1);
S1 단계 후, 마이크로캡슐에 분해효소를 처리한 후 1D-1H-NMR 스펙트럼을 수득하는 단계(S2);
마이크로캡슐이 완전히 분해된 후 1D-1H-NMR 스펙트럼을 수득하는 단계(S3);
상기 S1 단계의 스펙트럼 내지 S3 단계의 스펙트럼으로부터, 벽재물질의 피크를 선정하는 단계(S4);
상기 S1 단계의 스펙트럼에서 선정된 벽재물질의 피크의 강도를 0으로, 상기 S3 단계의 스펙트럼에서 선정된 피크의 강도를 1이라 할 때, 상기 S2 단계의 스펙트럼에서 선정된 피크의 강도를 계산하는 단계(S5);
상기 계산된 벽재물질의 피크의 강도를 비교하여 벽재물질의 화학결합이 끊어지는 순서를 결정하는 단계(S6); 및
상기 S2 단계의 스펙트럼에서 선정된 피크가 관찰되는 시간을 측정하여 화학결합이 끊어지는 속도를 계산하는 단계(S7).
상기 방법에 대하여, 하기에서 단계별로 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서, S1 단계는 분석의 대상이 되는 마이크로캡슐의 1D-1H-NMR 스펙트럼을 수득하는 단계이다. 본 발명에서 “1D-1H NMR 분석”은 고분자에 분해 처리 후, 시간에 따라 어떠한 변화를 보이는지 확인하는 NMR 분석법으로서 원자 수준에서 거대분자에 대한 상세한 구조적, 동적 정보를 제공할 수 있고, 피크 변화를 통해 생성물의 구조를 설명할 수 있으며, 정량적 접근이기 때문에 반응 역학 및 분해 거동을 감지할 수 있다. 본 발명에서 1D-1H NMR 분석은 400 MHz 분광기로 수행되었으나, 예측하고자 하는 마이크로캡슐의 종류에 따라 선택하여 사용할 수 있다. 상기 S1 단계 이전에, 상기 벽개물질만의 1D-1H NMR 스펙트럼을 수득하여 피크를 분석하는 단계(S0)을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, “마이크로캡슐”은 1 μm ~ 1000 μm의 다양한 크기를 가지며, 한 가지 종류 혹은 여러가지 종류의 천연 고분자를 벽재물질로 사용한 마이크로캡슐을 말한다. 상기 마이크로캡슐은 코어물질 및 벽재물질로 이루어지는 것이다. 상기 코어물질은 오일 상의 물질일 수 있으나, 통상적으로 마이크로캡슐 내에 포함될 수 있는 물질이라면 오일 상의 물질에 제한되지 않고 포함이 가능하다.
상기 벽재물질은 젤라틴; 알지네이트; 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 골격 영역; 젤라틴, 알지네이트, 및 글루타르알데히드(GTA)를 포함하는 가교결합 영역; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 실시예에서는 상기 벽재물질로 생분해성을 가진 것을 사용하였으나, 본 발명의 예측방법은 생분해성 고분자 외에 합성 고분자 등 다양한 물질의 생분해 메커니즘을 규명 또는 예측하는데 활용될 수 있다.
본 발명에서, S2 단계는 마이크로캡슐에 분해효소를 처리한 후, 1D-1H NMR 스펙트럼을 수득하는 단계이다. 분해효소 처리를 통해 고분자, 특히 벽재물질을 분해할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 콜라게나제, 알지네이트 리아제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 1주 ~ 4주 동안 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, S2 단계는 1주 ~ 4주 동안 수행되므로, S2 단계의 스펙트럼은 분해효소 처리 직후(S2-1), 1주 후(S2-2), 2주 후(S2-3), 3주 후(S2-4)에 수득된 것일 수 있다.
본 발명에서, S3 단계는 마이크로캡슐이 완전히 분해된 후, 1D-1H NMR 스펙트럼을 수득하는 단계이다. 마이크로캡슐이 완전히 분해된 경우 현미경 이미지상 fiber 모양을 나타내며, NMR 스펙트럼상 벽재물질의 피크가 가장 높은 수치를 나타낸다. 상기 S2 단계 및 S3 단계에서 스펙트럼을 수득하는 방법은 S1 단계에서 수행한 조건과 모두 동일하다.
본 발명에서, S4 단계는 상기 S1 단계 내지 S3 단계의 스펙트럼으로부터, 벽재물질의 피크를 선정하는 단계이다. 본 발명의 예측방법을 수행하기 전에 상기 벽재물질만의 1D-1H NMR 스펙트럼을 수득하여 그 피크를 선정할 수도 있고, 공시의 화합물이라면 미리 알려진 스펙트럼으로부터 선정할 수도 있으며, 벽재물질의 피크를 선정하기 위한 방법에는 제한이 없다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 스펙트럼의 3.4 ~ 4.0 ppm은 젤라틴의 피크일 수 있고, 스펙트럼의 3.5 ~ 3.8 ppm은 젤라틴, 알지네이트, 및 글루타르알데히드(GTA)를 포함하는 가교결합 영역의 피크일 수 있고, 스펙트럼의 3.5 ~ 4.5 ppm은 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 골격 영역의 피크일 수 있고, 스펙트럼의 5.0 ~ 6.0 ppm은 알지네이트의 피크일 수 있다.
본 발명에서, S5 단계는 선정된 피크의 강도를 측정하고 정규화하는 단계이다. 강도는 스펙트럼 피크의 높이를 의미하는 것으로, 일반적으로 상기 강도의 계산은 NMR 데이터의 분석에 사용되는 프로그램을 통해 간단하게 수행될 수 있다. S1 단계의 스펙트럼에서 선정된 벽재물질의 피크의 강도를 0으로, S3 단계의 스펙트럼에서 선정된 피크의 강도를 1로 하여(normalized intensity comparison, intmax=1), S2 단계의 스펙트럼에서 선정된 벽재물질의 피크의 강도를 계산하였다. 구체적으로, 분해효소 처리 직후(S2-1), 1주 후(S2-2), 2주 후(S2-3), 3주 후(S2-4)에 수득한 스펙트럼에서 벽재물질의 피크의 강도를 정규화하였다.
본 발명에서, S6 단계는 벽재물질의 피크의 강도를 비교하여 벽재물질의 화학결합이 끊어지는 순서를 결정하여 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘을 예측하는 단계이다. 이 때, 벽재물질의 피크의 강도가 클수록 화학결합이 끊어지는 순서가 빠른 것으로 결정할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 알지네이트 리아제를 처리한 마이크로캡슐에 대한 1D-1H NMR 스펙트럼의 각 벽재물질의 피크의 강도를 정규화한 결과가 하기 표 1과 같은 경우, 분해효소 처리 직후(S2-1) 가장 먼저 알지네이트가 분해되고, 골격 영역에서 약간의 변화가 감지되었다. 1주 후(S2-2), 가교결합 영역이 골격 영역보다 더 큰 변화를 나타냈으며, 2주 후(S2-3), 젤라틴도 빠르게 분해를 시작하여, 3주가 지나면(S2-4) 알지네이트, 골격 영역, 가교결합 영역의 분해가 80% 이상 진행되고, 4주째(S3)에 마이크로캡슐이 완전히 분해된다는 것을 예측할 수 있다.
| 알지네이트 | 골격 영역 | 젤라틴 | 가교결합 영역 | |
| w/o | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Just after | 0.208377971 | 0.045157965 | 0 | 0.004823913 |
| 1week | 0.557327591 | 0.224852449 | 0.147607352 | 0.427540044 |
| 2week | 0.826032199 | 0.780211039 | 0.350102647 | 0.776693798 |
| 3week | 0.865760648 | 0.890105519 | 0.93548019 | 0.888346899 |
| 4week | 1 | 1 | 1 | 1 |
본 발명에서, S7 단계는 상기 S2 단계의 스펙트럼에서 선정된 피크가 관찰되는 시간을 측정하여 화학결합이 끊어지는 속도를 계산하는 단계이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 마이크로캡슐의 각 벽재물질은 처음에 빠르게 분해되고, 점진적으로 분해되다가, 이후 완만하게 분해되는 경향을 나타낼 수 있다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
실시예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제1, 제2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다. 어떤 구성 요소가 다른 구성요소에 "연결", "결합" 또는 "접속"된다고 기재된 경우, 그 구성 요소는 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되거나 접속될 수 있지만, 각 구성 요소 사이에 또 다른 구성 요소가 "연결", "결합" 또는 "접속"될 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
실험예 1. 재료
젤라틴 유형 A(돼지 피부로부터 수득, 겔 강도 90 ~ 110 g bloom)는 Sigma Aldrich(MO, 미국)에서 공급했으며, 알지네이트 나트륨은 Junsei Chemicals(도쿄, 일본)에서 수득하였다. 가교제 글루타르알데히드(25%)는 대정화금(서울, 한국)에서 구매하였고, 올리브 오일과 아세트산(>99.5%)은 삼전화학(경기도, 한국)에서 구매하였다. 염화나트륨(Merck, NJ, 미국), 염화칼륨(99.5%)(Tokyo Chemical Industry, 도쿄, 일본), 이염기성 인산나트륨(99.0%)(삼전화학), 인산일칼륨(>99.0%)(대정화금)을 이용하여 인산완충식염수(PBS)를 제조하였다. 자외선(UV) 실험을 위해 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS, 99.0%)를 대정화금에서 구매하였고, Potassium sodium tartrate tetrahydrate(99.0%)를 Sigma Aldrich에서 구매하였다. 생분해제로서 콜라게나제 유형 I(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, 미국), 인간 α-아밀라아제 유형 XIII-A, 및 알지네이트 리아제(A1603)은 Sigma Aldrich에서 구매하였고, 셀룰로오스(75,000 cellulase units/g을 함유하는 고체)는 Biozoa Biological Supply(한국, 서울)에서 구매하였다.
실험예 2. 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐 제작
다음의 세 가지 일반적인 방법론적인 단계를 포함하는 복합 코아세르베이션을 통해 올리브 오일을 포함하는 생분해성 마이크로캡슐을 제조하였다(도 1): 수중유(oil-in-water, O/W) 에멀젼, 상 분리, 및 마이크로캡슐 안정성 향상.
첫 번째 단계로, 500 mL 2구 플라스크에 올리브 오일 7.5 g과 3.0%(w/v) 젤라틴 용액 100 mL를 45 ℃에서 1500 rpm으로 30분간 격렬히 교반하여 에멀젼을 형성하였다. 이어서, 1.5%(w/v) 알지네이트 나트륨 용액 100 mL를 O/W 현탁액에 천천히 적가하였다. 교반 속도를 1200 rpm으로 조정하고 45 ℃에서 30분 동안 유지하여 탁한 백색 용액을 수득하였다. 다음으로, pH 변화에 의한 상 분리를 유도하기 위해 2.5 wt% 아세트산을 반응 용액에 첨가하여 pH를 3.75로 조정하였다. 생성된 현탁액을 45 ℃에서 30분 동안 계속 교반하여 마이크로캡슐을 생성하였다. 상 분리가 완료되면 반응 용액이 포함된 500 mL 2구 플라스크를 마이크로캡슐 경화를 위해 얼음 욕조로 옮기고 1시간 동안 교반하였다. 마지막으로 944 μL의 글루타르알데히드(GTA)를 반응 시스템에 첨가하여 마이크로캡슐 가교를 확립한 후 45 °C에서 3시간 동안 유지하였다. 반응이 완료된 후, 최종 마이크로캡슐을 포함하는 용액을 실온으로 냉각시켰다. 수집된 마이크로캡슐을 탈이온수(D.I. water)로 5회 세척하고, 동결건조하고, 유리 바이알에 담아 냉장고에 보관하였다.
실험예 3. 마이크로캡슐의 특성화
형태학적 특성화를 위해 광학현미경(Nikon Eclipse Ti2-U, 미국)을 사용하여 합성된 마이크로캡슐을 평가하였다. 다음으로, 탈이온수에 분산된 마이크로캡슐을 유리 슬라이드에 올려놓고, 브라이트 필드 및 형광 이미지를 모두 관찰하였다. 또한, 15 kV의 가속 전압에서 주사 전자 현미경(SEM, S-4800, Hitachi, 일본)으로 관찰한 마이크로캡슐의 단면 형태를 관찰하였다. 실리콘 웨이퍼에 샘플 용액을 떨어뜨리고 주위 온도에서 건조하여 SEM 샘플을 제조하였다. SEM 측정 전에 샘플을 백금으로 스퍼터(sputter) 코팅하였다. 마이크로캡슐의 구성요소의 내부 분자간 상호작용은 FT-IR 분광기(PerkinElmer, USA)를 통해 연구하였다. 샘플의 FT-IR 스펙트럼은 4 cm-1의 분해능으로 4,000 ~ 500 cm-1 범위에서 기록하였다.
실험예 4. 마이크로캡슐 구성요소의 함량 평가
실험예 4.1. 캡슐의 알지네이트 함량 평가
다양한 부피의 0.5% w/v 알지네이트 용액(PBS 완충액 pH 7.4)을 사용하여 0.6 ~ 2.0 mg/ml 범위의 알지네이트 표준 곡선을 작성하였다. PBS 완충액(pH 7.4) 2 mL에서 표준체의 부피를 완성하였다. 이어서 샘플을 2 mL NaOH 0.4 N으로 알칼리화하고 와동시켰다. 다음으로, 80 μL의 1 mM DMMB를 샘플에 통합한 다음 즉시 와류시켰다. 실온에서 5분 배양하여 착색하였다. 두 파장 520 및 650 nm 사이의 흡광도 비율을 측정하였다. 한편, 마이크로캡슐의 경우 12시간 배양 후 2 g의 촉촉한 마이크로캡슐을 20 mL의 PBS 완충액 pH 12.5에 용해시켰다. 이어서, 2 mL의 생성된 용액을 2 mL PBS(pH 12.5) 및 80 μL 1 mM DMMB와 사전 처리 없이 합하였다.
실험예 4.2. 캡슐의 올리브 오일 함량 평가
마이크로캡슐의 올리브 오일 함량을 평가하기 위해 오일 추출 전후의 마이크로 캡슐 무게를 비교하였다. 먼저, 정확한 중량의 촉촉한 마이크로캡슐을 페트리 접시에 담고 오븐(70℃에서 밤새 건조시켰다. 건조된 마이크로캡슐의 질량을 기록하였다. 다음으로, 건조된 샘플을 헥산으로 5회 추출하여 캡슐화된 올리브 오일을 모두 방출하였다. 추출물(추출 올리브유)과 추출 잔여물(오일 추출-건조된 MC)를 별도로 회수하여 건조(증발)하여 최종 중량을 측정하였다. 또한 추출된 잔류물을 FT-IR 분광기를 이용하여 추출 완료 여부를 확인하였다(도 2). 캡슐화된 올리브 오일 함량은 다음 식을 사용하여 계산하였다.
Coil,% : 마이크로캡슐 내 올리브유 함량(%)
M1: 추출된 올리브 오일의 질량(g)
M2: 오일 추출-건조된 MC의 질량(g)
실험예 4.3. 캡슐의 젤라틴 함량 평가
마이크로캡슐에 존재하는 젤라틴의 백분율은 다음 식을 이용하여 계산하였다.
%GEL: 젤라틴의 백분율
%ALG: 알지네이트의 백분율
%오일: 마이크로캡슐에 함유된 올리브 오일의 비율
실험예 5.
1
H NMR 분광법을 사용한 마이크로캡슐의 효소 분해
실험예 5.1. 캡슐 벽재물질의 생분해 특성
콜라게나제와 알지네이트 리아제를 이용하여 합성된 마이크로캡슐의 생분해성을 평가하기 전에 주 벽재물질의 분해 패턴을 조사하였다. 젤라틴 분해 패턴은 처음에 0.3 mg의 콜라게나제 유형 I을 PBS 완충액 중 20 mL의 젤라틴 용액(1.0% w/v)에 통합하여 모니터링하였다. 알지네이트 분해 실험을 위해 PBS 완충액(10x, pH 7.4)을 기질로 사용하여 0.5% w/v 알지네이트 나트륨 용액을 제조하고 효소 반응을 위해 알지네이트 리아제 2 mg을 첨가하였다. 이어서, 효소적 절단 생성물의 형성을 시간 분해 1H NMR 분광법을 통해 검증하였다. 최적의 효소 조건을 위해 모든 실험은 37 ℃에서 진행하였으며, 대조군으로 효소가 없는 혼합물을 동시에 제조하였다. 1H NMR 분석을 위해 200 μL의 샘플(표적 효소가 있는 벽재물질)과 350 μL의 D2O를 혼합하고 최종 샘플을 5 mm NMR 튜브에 옮겼다. 모든 1D 1H NMR 스펙트럼은 27 ℃에서 3개의 펄스 필드 구배(Bruker Biospin, Billerica, MA)를 포함하는 광대역 프로브가 장착된 Bruker 400 MHz NMR 분광기에서 용매 전포화(pre-saturation)가 있는 단일 펄스 시퀀스를 사용하여 측정하였다. 각 스캔에 대해 2.04초의 수집 시간 동안 32,768개의 데이터 포인트를 수집하였다. 총 128개의 과도(transient) 상태를 획득하였으며, 각 과도 상태 사이의 시간 지연은 5초였다. 로우 데이터는 65,536개의 복소수 데이터 포인트로 0으로 채웠고, 푸리에 변환 전에 0.30 Hz 라인 확장이 있는 지수 창 함수를 적용하였다. NMR 데이터는 TOPSPIN 3.5 프로그램(Bruker Biospin, Billerica, MA)을 사용하여 처리하였다. 1H 화학적 이동은 내부 표준 TMSP-d4(0 ppm에서 트리메틸실릴 프로피온산 신호)를 사용하여 보정하였다.
실험예 5.2. 다양한 조건에서의 마이크로캡슐 생분해성
마이크로캡슐 생분해 연구를 위해 0.3 mg의 콜라게나제와 2 mg의 알지네이트 리아제를 20 mL PBS 완충 용액에 분산된 2 g의 촉촉한 캡슐에 별도로 첨가하였다. 다양한 배양 시간에 반응 용기에서 작은 부분 표본을 선택적으로 수집하고 운동 및 기계 연구를 위해 1H NMR 분광기를 사용하여 조사하였다.
pH 4.0, 7.4, 및 11.0에서 분해 시험을 수행하여 다양한 pH 조건에서 효소 활성 및 캡슐 안정성을 광범위하게 조사하였다.
표적 기질에 대한 효소적 선택성을 확인하기 위해, 대조군으로 최적의 pH 및 온도 조건에서 무관한 다당류 표적 효소(1 mL 셀룰라아제 및 2 mg 아밀라아제)를 사용하여 동일한 분해 실험을 수행하였다.
추가적으로, 다당류의 모양과 화학적 결합 절단의 실질적인 변화를 확인하기 위해 현미경 이미지와 디니트로살리실산(dinitrosalicylic acid, DNS) 테스트를 수행하였다. 먼저 샘플 500 μL와 DNS 시약을 유리관 시험용액에 넣고 잘 섞어 90 ℃에서 끓였다. 5분간 방치한 후 얼음욕조에서 5분간 냉각시켰다. 이어서, 혼합물을 증류수로 5회 희석하고 UV 분광기를 통해 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 샘플의 환원 말단당 값은 0.2 ~ 1.0 g/L 범위에서 구축된 포도당의 표준 곡선을 기반으로 계산하였다(도 3).
효소 동역학의 경우, 짧은 측정 간격으로 48시간 동안 분해 실험을 모니터링하였다(2시간 동안 15 ~ 30분마다, 이후에는 60 ~ 180분).
장기 분해 관찰의 경우, 1주 측정 간격으로 1개월 동안 NMR 스펙트럼에서 분해 패턴을 기록하였다. 배양 동안 광학 및 형광 현미경을 사용하여 전체 마이크로캡슐 형태를 조사하였다.
실험결과 1. 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐의 구조
균일한 젤라틴-알지네이트 기반 마이크로캡슐을 제조하기 위해 복합 코아세르베이션 접근법을 사용하였다: 상기 접근법에서 고분자 비율, pH 조정, 및 교반 속도를 포함한 몇 가지 합성 매개변수들을 변경하였다.
도 4에 도시한 바와 같이, 마이크로캡슐의 형태 및 크기 분포를 형광/광학 현미경 및 SEM을 이용하여 평가하였다. 그 결과, 상기 마이크로캡슐은 매끄러운 표면을 갖는 균일한 크기의 구형인 것을 확인하였다. 입자 크기와 분포는 24.6 μm ± 3.9 μm로 결정되었다(도 5a).
방향족 아미노산(젤라틴의 티로신 및 페닐알라닌)에서 유래하는 청색 자가형광 신호(여기 파장(λ)=375 nm, 방출 파장(λ)=460 nm)를 갖는 형광 이미지를 통해 전체 마이크로캡슐의 형태를 확인하였다.
또한, 마이크로캡슐의 내부 분자 구조, 특히 젤라틴과 글루타르알데히드(GTA; 가교제)간의 가교결합 형태를 FT-IR 분광기를 사용하여 평가하였다. 널리 알려진 바와 같이, 젤라틴의 견고한 가교결합은 GTA와 젤라틴의 양성자화되지 않은 ε아미노기 사이에 형성된다. 도 5b에 도시한 바와 같이, 젤라틴의 아미드 I기(1,631 cm-1, C=O, C-N 신축(stretching)) 및 아미드 II기(1,529 cm-1, N-H 굽힘(bending))의 진동 밴드는 가교결합의 이민을 형성하면서 각각 1,650 cm-1 및 1,525 cm-1로 이동하였다. 또한, 녹색(여기 λnm, 방출 λnm) 및 적색(여기 λnm, 방출 λnm) 이미지의 형광 특성은 젤라틴과 GTA 사이에 새로 형성된 시프 염기(Schiff base, C=N)의 특성을 나타낸다(도 6). 즉, 원료 사이의 안정적인 가교결합을 가리킨다.
또한, 이들의 생분해성을 이해하기 위해 1H NMR 분광법을 사용하여 캡슐의 벽재물질에 대한 보다 자세한 분자정보를 수득하였다. 도 7는 마이크로캡슐의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 0.5 ~ 2.8 ppm 범위의 캡슐화된 코어 오일에서 중첩된 공명 신호를 포함하여 0.5 ~ 7.5 ppm 범위에서 젤라틴과 알지네이트의 광범위한 클러스터 신호가 관찰되었다. 마이크로캡슐의 1H 화학적 이동 할당은 제조 공정에 사용된 각 원료의 1H NMR 스펙트럼을 기반으로 결정하였다(도 8).
실험결과 2.
1
H NMR 분광법을 사용한 캡슐 벽재물질 및 마이크로캡슐의 효소적 분해
효소 존재 하에서 각 재료에서 일어난 특정 공명 피크의 변화를 이해하는 것은 효소 처리된 마이크로캡슐의 1H NMR 스펙트럼을 효과적으로 해석하는데 중요하다. 마이크로캡슐의 생분해성을 철저히 조사하기 위해 젤라틴 또는 알지네이트를 표적 효소인 콜라게나제 또는 알지네이트 리아제와 함께 24시간 동안 배양하고, 1H NMR 분석을 통해 캡슐 벽재물질의 효소적 분해를 먼저 연구하였다.
실험결과 2.1. 콜라게나제에 의한 젤라틴의 효소적 분해
콜라겐에서 파생된 젤라틴의 펩티드 결합은 반복되는 Proline-X-Glycine-Proline 서열(여기서 X는 중성 아미노산임)에서 콜라게나제에 의해 절단될 수 있다(도 9). 분해 반응이 계속 진행됨에 따라 염기 서열에서 중성 아미노산(X)과 글리신 사이의 특정 절단으로 인해 3.96 ppm(글리신 사슬 말단에 해당)에서 뚜렷한 단일항 피크가 증가하였다. 글리신 잔기의 명백한 변화는 1H NMR 접근법을 사용하여 콜라게나제에 의한 젤라틴 생분해를 검증할 수 있음을 시사한다.
실험결과 2.2. 알지네이트 리아제에 의한 알지네이트의 효소적 분해
다음으로, 캡슐의 상세한 생분해 과정을 해석하기 위해 1H NMR을 통해 알지네이트 리아제에 의한 알지네이트 분해를 관찰하였다.
분해 실험에 앞서 효과적인 효소 시스템을 구축하기 위해 알지네이트 구조와 최적의 알지네이트 리아제 유형을 조사하였다. 일반적으로 알지네이트는 만유론산(mannuronic acid, M 잔기)와 글루론산(guluronic acid, G 잔기)으로 구성되며, 특정 잔기를 인식하는 능력에 따라 3가지 종류의 알지네이트 리아제(M-리아제, G-리아제, MG-리아제)가 존재하는 것으로 알려져 있다. 절단을 가장 효율적으로 수행하기 위해 알지네이트의 M 및 G 블록 사이의 특정 비율(M/G)을 결정하였다(도 10). 정량적 1H NMR 측정 결과, M-블록 농도가 G-블록의 농도보다 1.5배 더 높다는 것을 확인했으며, 결과적으로 생분해 실험을 위해 M-특이적 알지네이트 리아제를 선택하였다. 특히, 알지네이트 리아제는 글리코시드 결합의 β제거에 의해 기질을 촉매할 수 있고, 이어서 비환원 사슬 말단에서 불포화 4-deoxy-L-erythro-hex-4-enepyranosyluronate(D)를 생성할 수 있다.
도 11에 도시한 바와 같이, 효소와 반응 후 비환원 말단(D)에서 유래한 새롭게 생성된 5.93(H4△G(dp2)), 5.89(H4△G), 및 5.76 ppm(H4△M)의 신호는 1H NMR 스펙트럼에서 뚜렷하게 관찰되었다. 새로 형성된 H4△G의 신호 강도는 H4△M의 신호 강도보다 높았으며, 이는 알지네이트 리아제가 더 많은 △G 단편을 선택적으로 생성했음을 시사한다. 또한, 반응 시간이 증가함에 따라 3.75 ~ 4.25 ppm 범위의 추가 피크(알지네이트 주쇄에 있는 헥수론산(hexuronic acid) 잔기의 메틴으로부터의 양성자 신호)가 관찰되었다. 따라서 알지네이트 골격 사슬은 효소에 의해 영향을 받는다는 점을 알 수 있다. 1H NMR 분석을 통해 알지네이트 고분자의 효소적 분해를 종합적으로 검출함으로써, 마이크로캡슐을 이용한 분해 실험에서도 유사한 현상이 발생할 수 있음을 예측하였다.
실험결과 2.3. 콜라게나제에 의한 마이크로캡슐의 효소적 분해
각 벽재물질을 사용하여 효소 분해에서 검출의 실제 적용 가능성을 확인한 후, 1H NMR을 사용하여 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐의 생분해 패턴을 평가하였다. 실험결과 2.1과 동일한 맥락에서 콜라게나제를 사용하여 배양된 마이크로캡슐의 1H NMR 스펙트럼을 배양 시간에 걸쳐 먼저 측정하였다. 젤라틴 벽재물질에서 얻은 분해 결과와 유사하게 젤라틴 골격의 유사한 신호 변경이 특히 3.96 ppm의 글리신 사슬 말단 잔기에서 확인되었다(도 12). 0.5 ~ 4.5 ppm 범위에서 나타나는 X-잔기의 신호 증가는 마이크로캡슐의 광범위한 분해를 나타내며, 알지네이트(MM1), 젤라틴-알지네이트 골격 및 가교결합에 해당하는 추가 피크가 각각 5.2 ~ 5.3 ppm, 4.0 ~ 4.5 ppm 및 3.6 ~ 3.7 ppm 범위에서 확인되었다. 이는 콜라게나제가 젤라틴과 벽 성분을 포함하는 가교 영역 모두에 영향을 미치므로 전체 마이크로캡슐 구조 안정성이 약화됨을 의미한다. 반대로, 효소가 없는 대조군 샘플에서는 24시간 배양 후에도 시간 분해 1H NMR 데이터에서 상당한 스펙트럼 변화가 관찰되지 않았다(도 13).
효소로 인한 캡슐의 형태학적 변화를 확인하고 NMR 데이터 분석에 대한 신뢰성을 제공하기 위해 배양 시간 동안 광학 및 형광 현미경 이미지를 획득하였다. 효소에 의한 캡슐 형태의 변화를 명확하게 나타내는 대표적인 형광 이미지를 도 12b에 나타내었고, 모든 시점에서 얻어진 총 데이터를 도 14b에 나타내었다. 형광 이미지에 따르면, 반응 시간에 따라 효소에 의해 캡슐이 부서졌으며, 12시간 배양 후 마이크로캡슐은 분해가 매우 진행되어 거의 관찰되지 않았다. 전체 데이터를 기반으로 NMR 스펙트럼의 변화를 살펴본 결과, 마이크로캡슐의 분해가 효소 반응에 의한 것이라는 점을 확인하였다.
실험결과 2.4. 알지네이트 리아제에 의한 마이크로캡슐의 효소적 분해
유사하게, 24시간 동안 알지네이트 리아제와 함께 배양된 마이크로캡슐의 시간 분해 1H NMR 스펙트럼을 측정하였으며, 알지네이트 절단에 의해 유도된 새롭게 생성된 H4△ 신호가 상당히 검출됨을 확인하였다. 구체적으로 도 15에 나타난 바와 같이, H4△G(dp2), H4△G, H4△M에 해당하는 3개의 이중선 신호가 5.75 ~ 5.95 ppm 범위에서 관찰되었으며, 이는 대조군 실험에서는 나타나지 않았다(도 16). 또한, 폴리머 블렌드 조각(젤라틴 + 알지네이트)에서 발생하는 3.0 ~ 4.0 ppm 범위의 상당한 신호의 증가가 감지되었다. 이러한 신호의 출현은 주요 중합체의 골격이 알지네이트의 효소적 절단이 진행됨에 따라 효소에 더 쉽게 노출된다는 것을 나타낸다. 상술한 결과는 스펙트럼의 경향성이 특정 효소 반응에 기인함을 시사하고, 따라서 이들 효소를 사용하는 기계론적 연구의 실용성을 나타낸다.
그 후, 현미경 분석을 통해 효소에 의해 유도된 캡슐의 형태학적 붕괴를 관찰하였다(도 15 및 도 17b). 도 15의 하단에 제시된 대표적인 이미지는 알지네이트가 반응 동안 마이크로캡슐에 뚜렷한 구조적 손상을 일으키고 대부분의 캡슐이 12시간 배양 후 심각하게 파손되었음을 도시한 것이다. 대조적으로, 효소 처리를 하지 않은 대조군 샘플은 반나절 배양 후에도 여전히 안정적인 형태를 나타내어 구조적 변형이 효소에 의해 선택적으로 개시되었음을 증명하였다. 1H NMR 분석 및 현미경 데이터를 통해 효소 분해 패턴의 차이가 명확하게 관찰하였으며, 이후 다양한 pH 조건 및 관련 없는 효소를 적용하여 특정 기질에 대한 생분해 과정 및 효소 선택성을 추가로 조사하였다.
실험결과 2.5. 다양한 pH 조건에서 마이크로캡슐의 효소적 분해
합성된 캡슐벽은 pH 변화에 따른 정전기적 상호작용에 의해 형성되기 때문에 다양한 pH 조건에서 캡슐의 안정성을 확인하였다. 앞서 언급한 모든 생분해 실험은 pH 7.4에서 수행되었으므로 pH 변화에 따른 마이크로캡슐 효소 활성 및 안정성을 확인하기 위해 pH 4 및 pH 11에서 분해 패턴 및 형태학적 변화를 추가로 조사하였다. 이론적으로 콜라게나제와 알지네이트 리아제는 pH 6.3 ~ 8.8 부근에서 최적의 활성을 나타낸다. 따라서 나열된 pH 조건에서 약한 생분해 활성이 예상되었다.
1H NMR 스펙트럼(도 18 및 도 19)에 나타난 바와 같이, 이 두 효소는 중성 pH에서만 마이크로캡슐의 표적 화학 결합을 강력하게 촉매하였다. 구체적으로, 펩티드 결합은 0.5 ~ 4.5 ppm 범위이고, H4△ 신호는 5.74 ~ 5.94 ppm 범위에서 관찰되었다. 다른 pH 범위에서는 눈에 띄는 효소 활성이 감지되지 않았다. 전반적인 1H NMR 결과는 높은 pH에서 가교 젤라틴의 용해 속도가 가속화됨에 따라 pH 11에서 팽윤 효과가 관찰된 것을 제외하고 광학 현미경 데이터 관찰과 일치하였다(도 14 및 도 17).
실험결과 2.6. 효소의 종류에 따른 마이크로캡슐의 효소적 분해
효소의 기질 특이성을 확인하기 위해, 다당류 기반 물질을 분해할 수 있는 대표적인 탄수화물 활성 효소인 셀룰라아제와 아밀라아제를 최적 pH 범위(아밀라아제, pH 7.4, 셀룰라아제, pH 5.5)에서 사용하여 상보적 분해 시험을 수행하였다.
도 20에 나타난 바와 같이, 위에서 관찰된 새롭게 형성된 신호는 다른 두 효소를 처리한 샘플에서는 검출되지 않았으며, 이는 콜라게나제 및 알지네이트 리아제가 특정 펩타이드 또는 화학 결합에 선택성을 가진다는 점을 의미한다.
추가적으로, 다당류의 모양과 화학적 결합 절단의 실질적인 변화를 확인하기 위해 현미경 이미지와 디니트로살리실산(dinitrosalicylic acid, DNS) 테스트를 수행하고, 그 결과를 도 21에 도시하였다.
현미경 검사 결과, 콜라게나제와 알지네이트 리아제를 포함하는 마이크로캡슐은 심하게 손상된 반면, 다른 효소를 처리한 샘플은 매우 좋은 상태를 나타내었다.
또한, 분해된 다당류의 환원당을 식별하는 DNS 테스트에서는 알지네이트 리아제를 포함하는 마이크로캡슐이 짙은 주황색만을 나타내는 것을 관찰하였다. 이는 분해된 알지네이트 환원당과 DNS 시약이 반응하여 형성된 3-아미노-5-니트로살리실산에 의한 색 변화이다. 따라서, 알지네이트 리아제는 기질 특이성을 가지며, 본 발명의 마이크로캡슐은 셀룰라아제 및 아밀라아제와 같이 다른 효소에 대해서는 안정성을 유지함을 알 수 있다.
실험결과 3.
1
H NMR 분광법을 사용한 효소 역학
1H NMR을 이용하여 복잡한 고분자 시스템의 효소적 분해를 효율적으로 관찰하고 연구할 수 있다. 배양 시간에 따라 생분해된 생성물에 의해 새롭게 형성된 공명 피크의 신호 증가는 마이크로캡슐 생분해 메커니즘을 제안하는데 사용되는 효소 동역학에 대한 정보를 제공할 수 있다.
실험결과 3.1. 콜라게나제를 처리한 마이크로캡슐의 효소 역학
본 발명은 콜라게나제 활성에 의한 1H NMR 신호 흐름의 분석을 통해 마이크로캡슐의 분해 역학을 제안할 수 있다. 젤라틴 사슬의 효소적 절단에 의해 유발된 3.96 ppm(글리신 잔기)에서 NMR 신호의 급격한 변화를 기반으로 마이크로캡슐을 포함한 운동 모델을 탐구하였다. 적절한 동역학 조사를 위해 마이크로캡슐의 분해율을 제조 공정에 사용된 동일한 중량의 순수 젤라틴의 분해율과 직접 비교하였다.
마이크로캡슐의 젤라틴 조성은 1,9-디메틸 메틸렌 블루(DMMB) 분석 및 추출 방법을 통해 남아있는 함량(알지네이트 및 오일)을 결정하여 하기 표 2와 같이 계산하였다.
| 촉촉한 마이크로캡슐 2 g | ||
| 올리브 오일 | 26.40% | |
| 알지네이트 | 24.04% | 0.113 mg |
| 젤라틴 | 49.58% | 0.233 mg |
콜라게나제가 포함된 마이크로캡슐(2 g)과 순수 젤라틴(0.233 g)의 시간 분해 1H NMR 스펙트럼을 폐쇄 시간 간격으로 48시간 동안 기록하고, 동역학 데이터에서 글리신 잔기의 신호 강도를 정량적으로 결정하였다(도 229a, 도 23a, 및 도 23b). 마이크로캡슐 및 젤라틴의 분해 패턴을 기반으로 물질의 3단계 0차 동역학 모델을 제안하였다(표 3): 처음 120분 동안 급격한 증가 단계(k1, 1단계), 120분에서 540분까지 점진적 성장 단계(k2, 2단계), 540분 이후 완만한 증가 단계(k3, 3단계).
| k 1 X 10-3(min-1) | k 2 X 10-4(min-1) | k 3 X 10-5(min-1) | |
| 젤라틴(Gel), 0.233 g | 4.30 | 8.39 | 3.39 |
| 마이크로캡슐(MC), 2 g | 4.29 | 7.04 | 5.73 |
| 마이크로캡슐(MC), 1 g | 4.72 | 6.37 | 5.59 |
1단계에서 마이크로캡슐은 풍부한 공격 부위로 인해 높은 k1 값으로 빠른 기질 분해를 나타내었다. 젤라틴은 캡슐의 주요 벽재물질이기 때문에 콜라게나제는 캡슐 벽에 쉽게 접근할 수 있고 초기에 빠르게 분해되었다. 그러나 2단계에서 얻은 k2 값은 1단계에서 얻은 값보다 현저히 낮았으며, 이는 절단 위치가 크게 감소했음을 의미한다. 한편, 3단계의 마이크로캡슐 분해율은 매우 낮아 거의 평형에 도달하였다. 따라서 마이크로캡슐은 3단계에서 콜라게나제에 의해 거의 완전히 분해되었음을 알 수 있다. 순수한 젤라틴의 효소적 분해에서도 유사한 경향이 관찰되었는데, 기질은 1단계에서는 빠르게 분해되고 2단계에서는 완만하게 분해되고 3단계에서는 거의 분해되었다.
그럼에도 불구하고 마이크로캡슐과 순수 젤라틴에서 얻은 운동학적 값, 특히 k2 및 k3 값은 수치적 차이를 나타내며, 이는 이들 사이의 구조적 차이 때문이다. 순수한 젤라틴의 분해 속도는 2단계에서 마이크로캡슐보다 빠르지만 3단계에서 마이크로캡슐보다 느렸는데, 이는 젤라틴 효소 분해가 마이크로캡슐보다 빠르게 평형상에 도달할 수 있음을 의미한다. 따라서, 콜라게나제에 의한 마이크로캡슐 및 순수 젤라틴의 분해는 동일한 젤라틴 질량을 가지더라도 다양한 비율을 가지며, 이는 이들 사이의 구조적 차이를 설명한다.
또한, 초기 농도를 변화시켜 콜라게나제에 의한 마이크로캡슐 분해 패턴을 확인하였다. 상기 표 1과 도 23c에 제시된 동역학 분해 특성은 다양한 기질 농도에 따른 마이크로캡슐의 분해가 큰 차이를 나타내지 않는다는 점을 시사한다.
실험결과 3.2. 알지네이트 리아제를 처리한 마이크로캡슐의 효소 역학
알지네이트 리아제를 이용하여 실험결과 3.1과 동일한 실험을 수행했으며, 시간 분해 1H NMR 스펙트럼에서 3개의 독특한 신호(H4△G(dp2), H4△G 및 H4△M)를 선택적으로 관찰하였습니다. 비환원 말단 피크 강도의 합은 마이크로캡슐의 효소 동역학을 설명하는데 사용하였다.
각 단계의 운동 상수는 0차 반응 모델을 따르는 것으로 가정했으며, 기울기는 각 세그먼트의 가수분해 속도(k)로 간주하였다. 알지네이트 리아제에 의한 마이크로캡슐과 순수한 알지네이트의 생분해는 처음 90분 동안 빠르게 분해되고(1단계), 540분까지 점진적으로 증가하고(2단계), 그 이후 천천히 증가하는(3단계) 경향을 나타내었다. 마이크로캡슐은 공격 부위가 많기 때문에 1단계에서 높은 k1 값으로 급격한 분해를 나타내어 좋은 효소 접근성을 시사하였다. 그러나 1단계의 빠른 기질 분해는 절단 부위의 수를 크게 감소시켰고, 이후 단계에서 마이크로캡슐의 분해 속도를 감소시켰다. 2단계에서 관찰된 마이크로캡슐의 분해율을 상대적으로 낮았다; 즉 k1보다 약 20배 작았다. 마찬가지로, k3(4.84 x 10-5 min-1)은 매우 작은 값을 나타냈으며, 이는 3단계에서 분해물의 느린 성장에 대응된다.
그러나 마이크로캡슐과 순수 알지네이트에서 얻은 분해 역학을 비교했을 때, 두 기질의 분해 속도는 일치하지 않았으며(표 4 및 도 25b), 1단계에서 차이가 뚜렷하게 관찰되었다.
| k 1 x 10-3(min-1) | k 2 x 10-4(min-1) | k 3 x 10-5(min-1) | ||||
| MC | SA | MC | SA | MC | SA | |
| NMR | 6.34 | 5.08 | 3.04 | 4.28 | 4.84 | 4.26 |
| UV | 6.24 | 5.07 | 3.89 | 4.94 | 4.76 | 4.79 |
| Error* | 1.60 | 0.20 | 21.85 | 13.54 | 1.78 | 11.06 |
| *NMR에서 얻은 k 값과 UV에서 얻은 k 값의 차이 | ||||||
특히, 마이크로캡슐의 k 값은 순수 알지네이트보다 1단계에서 높았으나 2단계에서 낮았다. 이러한 차이점은 재료 간의 점도, 강도 및 구조의 차이로 설명할 수 있다.
또한, 비환원성 말단당의 신호강도 변화를 기반으로 구축된 마이크로캡슐의 효소적 분해의 동역학적 매개변수를 검증하기 위해 유사한 방식으로 UV 분석을 이용한 분해 실험을 수행하고, 이에 기초하여 환원 말단당의 농도 증가를 고려하여 기질의 효소 분해 동역학 모델을 구축하였다.
도 22b는 두 가지 접근 방식이 동일한 운동 매개변수를 가지고 있음을 나타낸다. 따라서 효소에 의한 마이크로캡슐의 분해 역학은 NMR 신호의 변화를 기반으로 쉽게 설명할 수 있다. 구축된 생분해 동역학 모델은 콜라게나제 또는 알지네이트 리아제에 의한 마이크로캡슐 분해가 뚜렷한 속도로 3단계 모델을 따른다는 것을 나타내며, 여기서 절단 반응은 주로 1단계에서 발생하고 이후 단계에서 느려진다. 또한 고분자 프레임워크의 영향으로 인해 마이크로캡슐과 순수 물질의 분해율 차이에 대해 조사하였다.
실험결과 4. 마이크로캡슐의 제안된 생분해 메커니즘
본 발명자들은 1H NMR 접근법을 통해 효소를 이용한 마이크로캡슐 생분해를 효과적으로 연구할 수 있음을 확인하였다. 이하 합성된 젤라틴-알지네이트 마이크로캡슐의 분해 메커니즘을 설명하고 생분해 과정을 제안하였다.
일반적으로 1H NMR을 사용한 벌크 물질의 분해 거동은 반응 시간에 따른 선폭, 모양 및 피크 강도의 변화에 의해 결정된다. 마이크로캡슐의 생분해 시나리오를 예측하기 위해 NMR 스펙트럼에서 영역별 신호를 생성하는 각 원시 폴리머를 식별하고 피크 강도를 시간의 함수로 조사하였다. 또한, 완전한 캡슐 분해를 모니터링하기 위해 이전에 수행된 실험과 비교하여 더 긴 기간(2주 이상) 동안 분해를 관찰하였다.
실험결과 4.1. 콜라게나제를 처리한 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘
콜라게나제에 의한 캡슐의 전체 분해 과정을 확인하기 위해 1H NMR 실험을 수행하였다. 이에 따라 2주 동안 얻은 1H NMR 스펙트럼 변화 패턴을 분석하고, 15분, 1일, 2일에서의 스펙트럼을 측정하여 초기 단계에서 빠르게 생성된 젤라틴 분해 생성물(글리신)을 검출하였다(2주 이후의 NMR 데이터는 도시되지 않음). 도 26은 장기간의 콜라게나제 실험에 대한 스펙트럼 데이터를 나타내며, 다양한 시점에서의 신호 강도 변화는 이전의 NMR 결과로부터 명확하게 확인할 수 있다.
분해 패턴의 순서를 결정하기 위해 각 벽재물질에서 NMR 신호의 정확한 할당을 수행하였으며, 4개의 대표적인 화학적 이동 영역, 즉 알지네이트 고분자(MM1, 5.22 ppm), 알지네이트 + 젤라틴 골격(4.0 ~ 4.5 ppm)이 분해되었다. 젤라틴(글리신 잔기, 3.96 ppm) 및 가교결합 영역(3.6 ~ 3.7 ppm)이 선택되었다. 도 10의 NMR 스펙트럼은 알지네이트의 분해 패턴을 나타내며, 5.22 ppm(MM1 잔기)에서 공명 신호를 사용하여 집중적으로 평가되었다. 알지네이트 골격의 화학적 이동 범위는 일반적으로 4.0 ~ 4.5 ppm에서 관찰되며 대부분 1.0 ~ 4.5 ppm의 넓은 영역에서 감지된 젤라틴 피크와 중첩된다. 결과적으로 두 고분자가 동시에 발현될 수 있고, 캡슐에서의 피크 변화가 가장 명확한 영역을 NMR 스펙트럼의 골격 범위로 선택하였다. 또한, 가교결합 영역을 나타내는 화학적 이동 범위는 알지네이트, 젤라틴 및 GTA(3.66 ppm)와 혼합된 샘플의 NMR 데이터에서 3.56 ~ 3.70 ppm으로 예상하였다(도 27). 스펙트럼의 모든 영역은 2주 동안 계속 변경되었으며 캡슐의 폴리머 네트워크가 느슨해지고 약해지면서 시간이 지남에 따라 더 높은 강도의 날카로운 추가 피크가 관찰되었다. 콜라게나제 유도 절단에 따라 짧은 사슬 펩타이드(글리신)의 피크가 빠르게 생성되었고, 하루 만에 고분자 골격에서 알지네이트를 비롯한 숨겨진 피크가 드러났다. 마찬가지로, 알지네이트의 MM1 잔기(5.22 ppm)에서도 극적인 변화가 관찰되었으며, 급속한 젤라틴 생분해는 알지네이트 약화에 연속적인 영향을 미칠 것으로 예상되었다. 또한, 가교영역의 선폭이 크게 좁아지고 뾰족한 피크가 관찰되어 해당 부분에 포함된 젤라틴의 파손으로 인해 가교밀도가 취약함을 알 수 있다. 1주 인큐베이션 후 모든 영역에서 일관되게 관찰된 날카로운 피크를 통해 효소에 완전히 노출된 젤라틴을 포함한 골격 영역으로 인해 전체 구조가 약화되고 분해가 가속화되었음을 확인하였다.
명확한 비교를 위해, 젤라틴-알지네이트 마이크로 캡슐의 메커니즘 개요를 구성하고 분해 경로를 평가하기 위해, 각 구성 요소에 대한 NMR 신호의 강도 값을 도 28에 도시하였다. 단일항에서 얻거나 분할된 영역(다중항)에서 합산된 강도 값을 데이터 정규화 후 표현하였다. 그래프의 강도 점 패턴을 통해 4단계 마이크로캡슐 생분해 상황을 예측할 수 있다.
1단계는 젤라틴 잔기가 콜라게나제에 의해 주로 영향을 받으면서 시작하고; 이어서 골격 영역 및 알지네이트 중합체를 효소에 순차적으로 노출하였다. 가교결합 영역에서는 변화가 관찰되지 않았기 때문에, 가교결합된 젤라틴은 캡슐 벽의 안쪽에 위치하여 초기 단계의 효소로부터 보호될 수 있었다. 2단계에서는 캡슐 내 대부분의 영역이 효소적 조건에 노출되어 골격 영역이 본격적으로 분해되고, 알지네이트 및 폴리머 사슬이 약해졌다. 젤라틴 잔기(글리신)의 변화는 유의하지 않았으며, 시료의 젤라틴은 24시간 후에 거의 완전히 생분해되었다. 초기 단계까지 불충분한 변화율을 보였던 가교결합 영역은 3단계에서 알지네이트보다 더 큰 변화를 나타냈다. 이는 가교결합 영역이 효소의 영향을 받는데 가장 오랜 시간이 걸린다는 것을 의미한다. 또한 골격의 경우 이미 2단계와 비교하여 큰 변화 없이 최대값에 도달하였기 때문에, 1차 젤라틴 효소 절단이 고분자 구조의 전반적인 열화(deterioration)에 크게 기여한 것을 알 수 있다. 2주 후(4단계), 모든 분할 영역이 최대값에 도달하여 완전한 캡슐 붕괴를 나타내었다.
위의 관찰 결과를 종합하면, 캡슐 내 콜라게나제의 영향을 받는 영역의 순서는 (i) 젤라틴, (ii) 골격 영역, (iii) 알지네이트 영역, (iv) 가교결합 영역이었다. 상기 제안된 메커니즘은 젤라틴과 콜라게나제 간의 효소 반응이 가장 빠르게 진행되고 결과적으로 골격의 분해가 전체 시스템의 완전한 생분해를 촉진한다는 것을 의미한다. 또한 장기 실험에서 샘플의 형태학적 열화를 확인하고 현미경 이미지를 관찰하여 NMR 데이터 해석에 대한 신뢰성을 확보하였다(도 29). 콜라게나제를 처리한 마이크로캡슐 샘플은 1일 이내에 현저한 파단 현상을 나타냈으며, 이는 콜라게나제 생분해가 짧은 기간 내에 빠르게 진행되었음을 나타낸다. 샘플은 1주 후에 거의 완전히 분해되었으며, 이는 NMR 분석 및 예측된 메커니즘과 일치하였다. 이 결과는 1H NMR을 통한 분해 과정에 대한 연구가 매우 정확하며 향후 다양한 생분해 물질 개발에 성공적으로 활용될 수 있음을 시사한다.
실험결과 4.2. 알지네이트 리아제를 처리한 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘
알지네이트 리아제 함유 샘플의 생분해 메커니즘을 평가하기 위해 또 다른 장기 실험을 수행하였다. 이전 연구의 현미경 관찰에서 알지네이트 리아제 처리 샘플이 콜라게나제 처리 캡슐에 비해 분해 경향이 상대적으로 느리다는 것이 밝혀졌다는 점을 감안할 때 완전한 분해를 감지하려면 4주의 배양 시간이 필요하였다. 또한, 반응 1분에 해당하는 스펙트럼을 평가하여 높은 속도로 생성된 알지네이트 잔기를 검출하기 위해 예비 결과에 따라 결정하였다. 장기 열화 실험의 스펙트럼 결과를 도 30에 도시하고, 각 성분을 나타내는 특정 화학적 이동 영역은 각각 다른 색상으로 표시하였다. 이전 실험에서와 같이, 주로 메커니즘 제안에 대해 가장 편리하게 구별되는 4개의 대표적인 화학적 이동 영역을 결정하였다. 이질적인 효소 유형을 적용하여 다른 생성물과 골격 사슬 부분의 신호가 관찰됨에 따라 초점을 맞추는 각 구성 요소의 화학적 이동 범위를 새로 정의하였다. 알기네이트 잔기(5.77 ~ 5.93 ppm, H4△ 신호), 알지네이트 + 젤라틴 골격(3.76 ~ 4.06 ppm), 젤라틴 내 프롤린(3.57 ppm) 및 가교결합 영역(3.56 ~ 3.70 ppm)으로 나누어 할당하였다. 알지네이트 리아제 처리 전후의 젤라틴 1H NMR 스펙트럼의 피크 할당을 통해 젤라틴 영역의 약화 과정은 3.57 ppm 피크에 의존하는 것으로서, 뚜렷한 구별이 있는 프롤린 영역임이 입증되었다(도 31).
도 30에 도시된 4주 스펙트럼은 벌크 폴리머 합성물에 의해 생성된 넓은 NMR 신호가 시간이 지남에 따라 날카롭고 높은 강도의 피크로 변한다는 것을 보여주었다. 특히, 가장 빠른 속도로 검출된 알지네이트 잔류물의 H4△ 신호로 시작하여 3주 후에도 광범위한 화학적 이동에서 연속적인 선폭 축소 및 급격한 피크가 관찰되었다. 이를 통해 생분해된 알지네이트가 주로 전체 골격 사슬의 취약성을 유발한다는 것을 예측할 수 있었다. 1개월 배양 후 완전히 붕괴된 고분자 시스템으로 인해 대부분의 피크는 작은 분자의 속성인 좁은 스펙트럼 선폭을 갖는 것을 확인하였다.
이어서, 본 실험에서 알지네이트 리아제를 이용한 생분해 메커니즘을 제안하기 위해 마이크로캡슐의 각 대표 성분에 대한 강도 변화를 도 32에 나타내었다. 콜라게나제 효소 시스템과의 비교를 위해 분해 경향을 4단계로 지정하였다.
1단계에서는 알지네이트 리아제와의 직접적인 효소 반응에 의해 알지네이트 잔기가 먼저 생성되었고, 알지네이트 영역에 대한 효소 선택성으로 인해 골격에서 약간의 변화가 감지되었다. 1주 후(2단계), 가교결합 영역은 골격 중합체 영역과 비교하여 상당한 변화를 보였고, 젤라틴은 뚜렷한 강도 변화를 나타내기 시작했다. 이러한 결과는 1차 분해된 알지네이트 영역으로 인해 구조적 안정성이 약화되고 가교된 매트릭스가 느슨해짐을 시사한다. 3단계에서는 알지네이트, 골격 중합체, 가교결합 영역의 손상이 80% 이상 진행되었음을 확인하였다. 대조적으로, 프롤린 영역(젤라틴)은 캡슐의 알지네이트 기반 영역이 바람직하게는 효소와 상호작용하고 중합체 네트워크 생분해성에 크게 기여하기 때문에 다른 성분에 비해 여전히 작은 변화를 나타냈다. 이후, 4단계에서는 대부분의 강도 도트가 최대로 축적되어, 샘플이 작은 조각으로 완전히 분해되었음을 나타내었다.
궁극적으로, 캡슐에서 알지네이트 리아제에 의해 가장 우세하게 영향을 받는 영역의 서열은 (i) 알지네이트, (ii) 가교결합 및 (iii) 골격 중합체, (iv) 젤라틴이었다. 흥미롭게도, 이 결과는 콜라게나제 실험과 다른 분해 패턴을 보여주었다. 콜라게나제가 첨가된 시스템에서 본격적인 분해가 시작된 후, 골격 영역은 가교결합 영역에 비해 강도의 상당한 변화를 나타냈다. 이 거동은 젤라틴이 캡슐 벽의 가장 큰 부분을 차지하기 때문에 가교 네트워크보다 골격 구조에 대한 분해 효과가 더 우수한 것으로 해석하였다. 대조적으로, 알지네이트 리아제 시스템의 독특한 관찰은 알지네이트의 1차 분해가 샘플의 가교 영역 분해에 주로 기여한다는 것을 보여주었다.
제안된 메커니즘을 확립한 후 장기간 배양된 샘플의 현미경 이미지를 통해 마이크로캡슐의 형태적 변화를 확인하였다(도 33). 그 결과, 광학 이미지와 형광 이미지는 서로 다른 시점에서 분명하게 캡슐의 점진적인 분해를 보여주었다. 또한, 상당한 수의 캡슐이 1주 배양 후에 손상되었으며, 이는 제안된 분해 메커니즘에서 언급된 가교 네트워크의 큰 효소적 영향과 일치하였다. 즉, 현미경 관찰 결과는 NMR 분석에서 달성된 분해 시나리오에 대한 확신을 제공하였다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
본 연구는 천연고분자 복합체 기반의 친환경 / 다기능성 전달체 소재 개발 연구과제로서 한국생산기술연구원에서 주관하는 안산시 강소기업 육성 지원사업 / 안산시 강소기업 육성 지원사업 / 안산시 강소기업 육성 지원사업의 지원에 의하여 수행된 것이다.
Claims (13)
- 하기 단계를 포함하는 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법:
마이크로캡슐의 수소핵자기공명분광분석(1D-1H-NMR) 스펙트럼을 수득하는 단계(S1);
S1 단계 후, 마이크로캡슐에 분해효소를 처리한 후 1D-1H-NMR 스펙트럼을 수득하는 단계(S2);
마이크로캡슐이 완전히 분해된 후 1D-1H-NMR 스펙트럼을 수득하는 단계(S3);
상기 S1 단계의 스펙트럼 내지 S3 단계의 스펙트럼으로부터, 벽재물질의 피크를 선정하는 단계(S4);
상기 S1 단계의 스펙트럼에서 선정된 벽재물질의 피크의 강도를 0으로, 상기 S3 단계의 스펙트럼에서 선정된 피크의 강도를 1이라 할 때, 상기 S2 단계의 스펙트럼에서 선정된 피크의 강도를 계산하는 단계(S5); 및
상기 계산된 벽재물질의 피크의 강도를 비교하여 벽재물질의 화학결합이 끊어지는 순서를 결정하는 단계(S6).
- 제1항에 있어서,
상기 S6 단계는 상기 S5 단계에서 계산된 벽재물질의 피크의 강도가 클수록 화합결합이 끊어지는 순서가 빠른 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는, 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법.
- 제1항에 있어서,
상기 예측방법은 상기 S2 단계의 스펙트럼에서 선정된 피크가 관찰되는 시간을 측정하여 화학결합이 끊어지는 속도를 계산하는 단계(S7)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법.
- 제1항에 있어서,
상기 마이크로캡슐은 코어물질 및 벽재물질로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법.
- 제4항에 있어서,
상기 코어물질은 오일 상인 것을 특징으로 하는, 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법.
- 제1항에 있어서,
상기 벽재물질은 젤라틴; 알지네이트; 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 골격 영역; 젤라틴, 알지네이트, 및 글루타르알데히드(GTA)를 포함하는 가교결합 영역; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법.
- 제1항에 있어서,
상기 분해효소는 콜라게나제, 알지네이트 리아제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법.
- 제1항에 있어서,
상기 S2 단계는 중성 환경에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법.
- 제1항에 있어서,
상기 S2 단계는 1주 ~ 4주 동안 반응시켜 수행되는 것을 특징으로 하는, 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법.
- 제1항에 있어서,
상기 S4 단계는 스펙트럼의 3.4 ~ 4.0 ppm은 젤라틴의 피크인 것으로 선정하는 것을 특징으로 하는, 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법.
- 제1항에 있어서,
상기 S4 단계는 스펙트럼의 3.5 ~ 3.8 ppm은 젤라틴, 알지네이트, 및 글루타르알데히드(GTA)를 포함하는 가교결합 영역의 피크인 것으로 선정하는 것을 특징으로 하는, 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법.
- 제1항에 있어서,
상기 S4 단계는 스펙트럼의 3.5 ~ 4.5 ppm은 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 골격 영역의 피크인 것으로 선정하는 것을 특징으로 하는, 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법.
- 제1항에 있어서,
상기 S4 단계는 스펙트럼의 5.0 ~ 6.0 ppm은 알지네이트의 피크인 것으로 선정하는 것을 특징으로 하는, 마이크로캡슐의 생분해 메커니즘의 예측방법.
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| KR1020210176038 | 2021-12-09 | ||
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|---|---|---|---|---|
| KR101655407B1 (ko) | 2015-09-02 | 2016-09-08 | 주식회사 아미코스메틱 | 마이크로 캡슐, 및 마이크로 캡슐을 포함하는 화장료 조성물 |
| JP2017062239A (ja) | 2011-07-13 | 2017-03-30 | ティー２ バイオシステムズ，インコーポレーテッド | 血餅形成をモニタリングするためのｎｍｒ法 |
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