KR102709458B1

KR102709458B1 - 서방출 클로니딘 미립구형 주사제 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR102709458B1
Application number: KR1020210162760A
Authority: KR
Inventors: 신병철; 이주화; 임지향
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2021-11-23
Filing date: 2021-11-23
Publication date: 2024-09-23
Also published as: KR20230075995A

Abstract

본 개시는 유효 성분으로 클로니딘을 포함하는 생분해성 고분자 미립구 함유 서방형 주사제 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 미립구 내에 특정 산을 포함하여 미립구의 클로니딘 함유율 및 봉입 효율을 향상 가능하다. 또한 본 발명의 제제는 초기 약물의 과다방출이 억제될 뿐 아니라 0차 방출의 양상을 띠어 일정시간 동안 약물 방출이 지속적으로 유도된다.

Description

서방출 클로니딘 미립구형 주사제 및 그의 제조방법{Sustained-release clonidine microsphere injection and manufacturing method thereof}

본 개시는 클로니딘을 유효 성분으로 포함하는 서방형 고분자 미립구(microsphere) 제제 및 이의 제조방법에 대한 것이다. 더욱 상세하게는 생분해성 고분자 미립구에 클로니딘이 봉입된 전달체로서, 초기 과다 방출을 억제하고, 일정 기간 동안 0차 방출 양상을 나타내는 서방출 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

틱 장애는 뇌 신경 전달 체계의 이상이나 유전적 요인으로 인해 발생하며, 주의력 결핍 과잉행동장애(ADHD)는 뇌에 존재하는 도파민, 노르에피네프린 등의 신경전달물질 불균형에 의해 발생한다. 틱 장애는 a-2 아드레날린 수용체, 항정신병 약물, 행동요법으로 치료가 이루어지는데, a-2 아드레날린 수용체는 동반성 ADHD를 가진 틱 장애 환자에서 큰 효능을 나타낸다. 클로니딘(Clonidine)은 대표적인 a-2 아드레날린 수용체로 노르에피네프린 분비를 억제한다. 결과적으로 뇌에서 노르에피네프린 분비가 감소하면 과도한 신경 자극이 감소하여 증상이 완화된다.

통상적으로 피하 또는 근육 주사 후 체내에서 약물이 일정하고 지속적으로 방출되도록 설계된 제형을 서방형 주사 제형이라고 한다. 잦은 약물 투여에 대한 부담을 줄여 복약편의성을 향상시키고, 치료 효과를 극대화할 수 있다. 서방형 주사제의 일반적인 제조법으로는 코아세르베이션법, 용융 사출법, 분무 건조법, 용매 증발법 등이 알려져 있다. 이러한 방법 중 이중 유화 용매 증발법(W/O/W emulsion solvent evaporation method)과 단일 유화 용매 증발법(O/W emulsion solvent evaporation method)로 분류되는 용매 증발법이 가장 많이 사용되고 있다. 그러나 이 방법으로 제조한 미립구는 초기 방출률이 높고, 미립구 제조 과정 중 약물을 물 또는 유기용매에 용해시키는 과정에서 약물의 물성 변화, 약효 소실, 낮은 봉입 효율 등의 문제점을 내포한다.

문헌 Gaignaux, Amlie, et al. "Development and evaluation of sustained-release clonidine-loaded PLGA microparticles" International journal of pharmaceutics　437.1-2 (2012): 20-28 및 Gaignaux, Amlie, et al. "Evaluation of the degradation of clonidine-loaded PLGA microspheres." Journal of microencapsulation 30.7 (2013): 681-691에서는 클로니딘을 함유한 서방형 고분자 미립구를 이중 유화 용매 증발법으로 제조하였으며, pH 7.0의 인산염완충액을 내부 수상으로, 외부 수상은 pH 8.0인 인산염 완충액으로 완충된 폴리비닐알코올 용액을 사용하였다. 이 방법에서는 클로니딘의 pKa와 비슷한 pH에서 클로니딘의 프로톤이 떨어져나간 후 고분자와 결합을 생성한다고 가정하여 완충액 사용을 제시하였다. 그러나, 이러한 방법은 제조 과정이 복잡하여 생산화하기 어려운 단점이 있다. 또한 완충액 사용으로 봉입 효율을 향상하였으나 (대략 34%) 여전히 낮은 봉입 효율이 한계로 여겨진다.

Gaignaux, Amlie, et al. "Development and evaluation of sustained-release clonidine-loaded PLGA microparticles" International journal of pharmaceutics　437.1-2 (2012): 20-28 Gaignaux, Amlie, et al. "Evaluation of the degradation of clonidine-loaded PLGA microspheres." Journal of microencapsulation 30.7 (2013): 681-691

따라서 본 개시가 해결하고자 하는 과제는 유효 성분인 클로니딘을 함유하는 고분자 미립구 주사제로서, 클로니딘의 봉입 효율을 양호하고, 높은 로딩조건에서 미립구의 초기 폭발 방출을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 더불어 양호한 0차 방출 양상을 나타내는 서방형 고분자 미립구 제제 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 클로니딘을 함유하는 생분해성 고분자 미립구 함유 서방형 주사제로서, 상기 미립구는 카프르산, 만델산, 및 하이드록시 나프토산(1-hydroxy-2-naphthoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하여 상기 미립구로부터 클로니딘이 서서히 방출되도록 하는 것을 특징으로 하는 서방형 주사제를 제공한다.

바람직하게, 본 발명에 따른 클로니딘을 함유하는 생분해성 고분자 미립구 함유 서방형 주사제는 미립구 내에 하이드록시 나프토산(1-hydroxy-2-naphthoic acid)을 포함한다.

일반적으로 PLGA 등의 생분해성 고분자에 클로니딘을 봉입하여 미립구를 제조하면 초기에 약물의 방출이 급격히 증가하는 초기 폭발 방출(initial burst release) 현상이 문제될 뿐만 아니라, 낮은 봉입 효율, 원하는 기간 동안 일정한 농도의 약물 방출이 지속되지 않는 문제가 있다. 생분해성 고분자 미립구는 가수분해를 거쳐 고분자 매트릭스가 분해됨에 따라 약물이 서서히 방출되는데, 초기의 폭발적인 방출 현상은 혈중 내 약물의 농도를 급격히 증가시켜 독성을 야기할 수 있다. 또한, 초기 폭발 방출 이후 느려진 방출 속도로 인해 약물은 유효 혈중 농도 범위를 벗어나 일정한 약효를 나타내지 못하게 된다.

본 발명자들은 이러한 클로니딘 함유 생분해성 고분자 미립구 내에 카프르산, 만델산, 하이드록시 나프토산 또는 이들의 혼합물인 산(더욱 바람직하게는 하이드록시 나프토산)을 포함시킴으로써 산과 클로니딘이 제조 과정 중에 또한 제조 후에 미립구 내에서 물리적인 결합을 형성하여 상기 언급한 문제들을 효과적으로 해소할 수 있다는 점을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명에 따른 미립구들은 클로니딘 봉입 효율이 높을 뿐만 아니라, 초기 폭발 방출을 억제하고 지속적인 0차 방출이 가능하게 한다. 이러한 효과는 미립구 제조 중 고형화 과정에서 특정 산이 클로니딘과 소수성 결합 형성을 통해 달성될 수 있는 것으로 추측되나, 본 발명은 이러한 기전에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른, 미립구 내에 추가적으로 포함되는 소수성 산 중 가장 바람직한 물질은 하이드록시 나프토산이다. 하이드록시 나프토산을 사용할 경우에는 봉입 효율이 향상된 미립구를 제조할 뿐만 아니라, 일정한 방출 패턴을 보이는 0차 방출 모델에 적합한 미립구를 제조할 수 있다.

클로니딘 및 하이드록시 나프토산을 포함하는 미립구의 체내 투여 후, 생분해성 고분자(바람직하게는 PLGA)는 시간이 지남에 따라 체내의 전해질을 흡수하여 수화가 일어나 팽윤되며 내부의 유효성분인 클로니딘이 서서히 방출된다.

본 발명에 따른 미립구에 있어 사용 가능한 생분해성 고분자로는, 폴리락타이드(PLA), 폴리글리콜라이드(PGA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA), 폴리(락타이드-코-글리코라이드)글루코즈 등이 있다.

본 발명의 다른 측면은 또한 (S1) 생분해성 고분자; 클로니딘; 및 카프르산, 만델산, 하이드록시 나프토산 또는 이들의 혼합물인 산을 포함하는 용액을 제조하는 단계, 및 (S2) 상기 용액을 수용액(바람직하게는, 폴리비닐알코올 수용액)에 첨가(예를 들어, 적하)하면서 교반하여 O/W 유제를 형성하면서 미립구를 형성하는 단계를 포함하는, 클로니딘을 포함하는 생분해성 고분자 미립구 함유 서방형 주사제의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법에 있어, 상기 O/W 유탁액에서 공용매가 상기 수성매질로 확산 및/또는 증발되면서 미립구가 생성될 수 있다. 즉, 본 발명은 또한 O/W 유화 용매 증발법을 이용해 생분해성 고분자 미립구형 서방출 제제의 제조 방법을 제공한다. 이러한 본 발명의 방법은 미립구 내 클로니딘의 봉입량 및 봉입 효율을 극대화하고 약물을 지속적이고 균일하게 방출을 유도하는 서방출 제제를 제조할 수 있게 한다.

본 발명의 일 측면에서, 본 발명에 따른 제조 방법은 (S2)단계에서 형성된 O/W 유제에서 유제의 용매 증발을 통해 미립구를 고형화하는 단계(S3)를 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명에 따른 제조 방법은 상기 (S3) 단계에서 생성된 미립구를 건조, 바람직하게는 동결 건조하는 단계(S4)를 더 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 제조 방법은 아래와 같은 단계들을 통해 제조될 수 있다.

(S1 단계) 클로니딘, 생분해성 고분자 및 특정 산을 강하게 혼합 교반하여 용해시키는 단계

본 단계에서 용액을 제조하기 위해 사용되는 비수성 용매는 생분해성 고분자를 용해할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 일 실시 양태에 따르면 상기 비수성 용매로 비등점이 낮은, 예를 들어 비등점이 25℃ 내지 85℃인, 비수성 용매를 사용할 수 있다. 비수성 용매의 비등점이 상기 범위에 포함되는 경우, 미립구의 생성 후 이의 증발 및 건조의 측면에서 유리하다. 본 발명에 있어서, 상기 비수성 용매의 비제한적인 예로, 디클로로메테인, 디메틸설폭시드, 디메틸포름아마이드, 아세토나이트릴, 에틸아세테이트, 클로로포름 등을 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 생분해성 고분자는 미립구 제조시 이용되는 통상의 고분자로 약물 전달체로서 사용될 수 있으며, 생체적합성을 갖고 스스로 생체 내에서 분해되는 것이다. 본 발명에 있어서, 폴리글리코라이드(PGA), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-글리코라이드)(PLGA), 폴리(락타이드-코-글리코라이드)글루코즈 등의 생분해성 합성 고분자를 하나 이상 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 양태에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 중량 평균 분자량이 60,000 이하인 것이 사용될 수 있다. 예를 들면, 분자량 약 13,000인 폴리(락타이드-코-글리코라이드)(50:50), 분자량 약 33,000인 폴리(락타이드-코-글리코라이드)(50:50), 분자량 약 52,000인 폴리(락타이드-코-글리코라이드)(50:50), 분자량 약 20,000인 폴리(락타이드-코-글리코라이드)(75:25), 분자량 약 16,000인 폴리(락타이드)(100:0) 등을 사용할 수 있다. 이와 같은 생분해성 고분자는 예를 들면, 베링거인겔하임사의 Resomer RG502H, RG503H, RG504H, RG752H, R202H 등을 들 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 양태에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 0.16 내지 0.6 dL/g의 고유점도를 가질 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 생분해성 고분자의 점도가 0.1 dL/g 미만이면 약물 분말 입자를 봉입하는 미립구가 제대로 형성되지 않거나 약물 봉입률이 현저히 감소하게 되며, 0.6 dL/g 를 초과하는 경우에는 미립구의 크기가 과도하게 크게 형성될 수 있고, 약물방출량이 적어 소망하는 수준의 약효가 나타나지 않을 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 양태에 따르면, 상기 단계에서 생분해성 고분자는 제1 혼합액 1 ml 당 10 mg 내지 150 mg의 농도, 바람직하게는 25mg 내지 125 mg의 농도, 더욱 바람직하게는 50 mg내지 125 mg의 농도로 용해된다. 생분해성 고분자의 농도가 적은 경우 고분자 용액의 점도가 낮아져서 균질기로 분산시 입자의 크기가 작아지는 경향이 있으나, 미립구 형성 전 미세 방울 내 고분자의 비율이 작아 입자형성 시 성긴 구조를 나타낼 수 있으며, 그에 따라 약물의 봉입량 및 봉입효율도 낮아지는 것으로 보인다. 반면 상기 농도가 150 mg/ml를 초과하는 경우에는 고분자 용액의 점도가 높아짐에 따라서 미립구의 크기가 커지는 경향이 있다.

산으로는 카프르산, 만델산, 하이드록시 나프토산 또는 이들의 혼합물이 사용되며, 특히 하이드록시 나프토산이 바람직하다.

(S2 단계) 상기 용액을 수용 매질에 적하하면서 서서히 혼합 교반하여 O/W 유탁액을 제조하는 단계

본 발명의 상기 수성 매질은 유화제를 포함할 수 있다. 상기 유화제의 함량은 수성 용매 1 L 당 0.1 g 내지 10 g, 또는 3 g 내지 7 g의 범위, 즉, 0.1 (w/v)% 내지 10 (w/v)% 또는 3 (w/v)% 내지 7 (w/v)%인 것이 바람직하다. 상기 유화제로는 폴리소르베이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴록사머, 스판80 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게, 본 발명에 있어 상기 유화제는 폴리비닐알콜이다.

본 발명의 구체적인 일 양태에 있어서, 본 단계에서 유탁액은 S1 단계의 용액과 상기 수성 매질이 부피비를 기준으로 1:5 내지 1:50의 비율로 혼합되어 제조된다. 상기 혼합 비율은 바람직하게는 1:10 내지 1:20이다. 상기 S1 단계의 용액과 수성 매질의 부피비가 1:5 미만일 경우에는 O/W 유탁액 중 미세 방울 간의 간격이 좁아 충돌할 가능성이 커지며, 이로 인해 공용매 및 비수성용매의 확산 및 증발 전에 미세 방울들이 뭉쳐져 크기가 균일한 미립구 형성이 어려워질 수 있다. 또한, 상기 비율이 1:50을 초과할 경우에는 첨가되는 유화제의 양이 많아져서 비용적 측면에서 불리하다.

(S3 단계) 상기 O/W 유탁액에서 상기 공용매가 상기 수성매질로 확산 및/또는 증발되면서 미립구가 생성되는 경화단계

상기 S2 단계에서 공용매가 수성 매질로 확산 및/또는 증발되면서 1차적인 고분자 경화가 유도되며 그에 따라서 약물 입자들이 미립구 내에 봉입된다. 즉, 상기 O/W 유탁액 중 분산된 미세 방울 내의 공용매가 수성용매 상으로 급격히 확산 및/또는 추출되면서 생분해성 고분자가 빠르게 고형화되어 미립구를 형성한다. 본 발명의 구체적인 일 양태에 있어, 이 과정에서 미세방울들이 서로 뭉치지 않도록 자력식 교반기로 강하게 교반하는 것이 바람직하다. 미립구의 형성시간은 1 내지 10분으로 할 수 있다. 상기 미립구 형성시간이 1분 미만일 경우에는 미립구의 생분해성 고분자가 덜 경화되어 입자간에 뭉침 현상이 나타날 수 있다. 반면, 10분을 초과하는 경우에는 약물의 봉입 효율이 낮아질 수 있다.

미립구 생성 후 상기 O/W 유탁액에서 수성 매질 및 용매를 제거하고 미립구를 수득한다.

(S4 단계) 생성된 미립구를 (동결) 건조하는 단계

(동결) 건조 과정을 통해 미립구의 구조가 견고해지며 약물이 생분해성 고분자에 완전히 봉입된다. 본 발명의 구체적인 일 양태에 따르면, 상기 건조는 미립구 내에 잔류하는 용매를 완전히 제거하기 위하여 동결 건조 단계가 바람직할 수 있다. 상기 동결 단계는 -45℃ 내지 -55℃의 온도조건에서 수행될 수 있으며, 건조 시간은 12 내지 24시간일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 양태에 따르면 상기 동결 건조 단계는 진공 조건에 하에서 수행될 수 있다. 상기 건조 시간이 12시간 미만의 온도 조건에서 수행되는 경우 잔류 용매가 완전히 제거되지 않을 수 있으며, 반면, 건조 시간이 24시간을 초과하게 되면, 생산성이 낮아질 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 있어, 미립구 내 클로니딘의 봉입 효율 (유효성분 봉입량/첨가한 유효성분 중량 × 100(%))이 55 내지 70 중량%이며, 바람직하게는 60 내지 70 중량%이다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 미립구는 생분해성 고분자가 미립구 100 중량% 대비 30 내지 95 중량%, 바람직하게는 45 내지 75 중량%가 포함될 수 있다. 만일 생분해성 고분자가 40 중량% 미만으로 포함되는 경우에는 미립구의 표면 및 내부에 다공상의 특성을 나타나는 경향이 있어 약물이 초기에 과다 방출되거나 짧은 방출 시간을 나타내는 문제점이 있다. 반면, 95 중량%를 초과하는 경우에는 환자 또는 동물체에 투여되는 미립구의 양이 지나치게 많아져 투여가 힘들거나, 투여 자체가 불가능해질 수 있다.

본 발명은 클로니딘의 높은 봉입량, 장기간 동안 지속적인 약물의 0차 방출 양상을 나타낼 수 있는 클로니딘 함유 미립구 서방형 제제(바람직하게는 주사제) 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법은 클로니딘을 봉입한 생분해성 고분자 입자를 O/W 유화 용매 증발법을 이용하여 제조함으로써 최소한의 공정과 에너지를 사용해 미립구를 제조할 수 있다. 특히, 미립구 내에 클로니딘을 서방화시킬 수 있는 특정 산을 포함시킴으로써 0차 방출 양상뿐 아니라 미립구의 내부 구조를 균일하게 하여 약물 방출을 효율적으로 제어할 수 있다.

본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 제한되어 해석되어서는 안된다.
도 1은 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1-2에서 제조된 클로니딘 미립구의 전자현미경 사진이다. 좌측 사진은 미립구의 전체 모양 및 표면을 관찰한 사진이고 우측 사진은 미립구의 단면의 모습을 보여주는 사진이다. 실시예 1-2에서 제조된 미립구는 표면이 모두 매끄럽게 형성된 모습을 보이고 동결 건조 후 입자가 깨어지거나 변형된 형태가 관찰되지 않았다.
도 2는 생분해성 고분자와 클로니딘으로 구성된 미립구인 비교예 2와 하이드록시 나프토산을 이용하고 함량을 달리한 미립구인 실시예 1-1 및 1-2에 대한 실험 결과이며, 시간에 따른 PBS용액 내 입자의 팽창과 응집 현상을 관찰한 광학 현미경 사진이다. 시간이 지날수록 모든 미립구가 팽윤되고, 종국에는 응집 또는 분해가 일어나 미립구의 형태가 변형되는 것을 알 수 있다. 특히 하이드록시 나프토산의 함량이 증가할수록 미립구의 뭉침과 붕괴가 42일 정도 까지 지연됨을 알 수 있었다. 이 결과는 미립구에서 클로니딘의 방출이 지연될 수 있다는 것을 의미한다.
도 3은 생분해성 고분자와 클로니딘으로 구성된 미립구인 비교예 2와 하이드록시 나프토산의 함량을 달리하여 제조한 미립구인 실시예 1-1 및 1-2를 실험예 3에 따라 실험한 in vitro 약물 방출 거동을 보여주는 그래프이다. 도 3에서는 시간에 따른 PBS용액 내 클로니딘의 서방출 특성을 확인할 수 있다.
도4는 생분해성 고분자, 클로니딘 및 하이드록시 나프토산으로 구성된 미립구인 실시예 1-2와 다른 산인 카프르산 또는 말론산으로 구성된 미립구인 비교예 3-3 및 3-6을 실험예 3에 따라 실험한 in vitro 약물 방출 거동을 보여주는 그래프이다. 시간에 따른 PBS용액 내 클로니딘의 서방출 특성을 확인할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1-3 및 비교예 2: 생분해성 고분자 PLGA, 클로니딘 및 하이드록시 나프토산을 사용한 O/W형 미립구 제조

생분해성 고분자 PLGA 750 mg(제조원: EVONIK, 제품명: RESOMER®RG753H) 및 클로니딘 30 mg과 하이드록시 나프토산(1-hydroxy-2-naphthoic acid) 각각 0 mg(비교예 2), 12.3 mg, 24.5 mg 및 36.8 mg을 디클로로메테인 1.5 mL에 첨가하고 강하게 교반하여 15분 동안 용해시켰다. 균일하게 용해된 용액을 1% (w/v) 폴리비닐알코올 (제조원: 시그마알드리치, 87~90% hydrolyzed MW: 30,000~70,000) 250 ml 수용액상에 넣어 주면서 균질기(IKA, ULTRA-TURRAX T8)를 이용하여 3,000 rpm으로 분산시켜 1분에 걸쳐 O/W 유탁액을 얻었다. 그 후 상기 유탁액을 냉장 (4 ℃), 상압 하에 4시간 자력교반기(450 rpm)로 강하게 저어주면서 미립구를 형성시켰다. 그 후, 체를 이용해 미립구를 채취하고 증류수로 3~5회 세척하였다. 세척한 미립구는 24간 동안 -50℃에서 동결 건조하여 미립구 내 용매를 완전히 제거하였다.

실시예 1-3 중 대표적인 예는 실시예 1-2이다.

	비교예 1	비교예 2	실시예 1-1	실시예 1-2	실시예 1-3
클로니딘 하이드로클로라이드	30 mg	-	-	-	-
클로니딘	-	30 mg	30 mg	30 mg	30 mg
하이드록시나프토산	-	-	12.3 mg	24.5 mg	36.8mg
PLGA(RG753H)	750 mg	750 mg	750 mg	750 mg	750 mg

비교예 1: 생분해성 고분자 PLGA 및 클로니딘 하이드로클로라이드를 사용한 W/O/W형 미립구 제조

클로니딘 하이드로클로라이드 30 mg을 pH 7.0인 인산염 완충액(내부 수상) 0.35 ml에 첨가하고, 생분해성 고분자 PLGA 1000 mg(제조원: EVONIK, 제품명: RESOMER®RG753H)를 디클로로메테인(유기상) 5 ml에 첨가하였다. 이후 이들을 각각 강하게 교반하여 15분 동안 용해시켰다. 균질하게 용해된 내부 수상을 유기상에 넣어주면서 초음파발생기(Sonic Dismembrator-Model 500, Fisher Scientific, Inc. NH, USA)를 이용하여 20% power로 1분에 걸쳐 W/O 유탁액을 얻었다. 그 후 W/O 유탁액을 pH 8.0인 인산염 완충액으로 완충된 1% (w/v) 폴리비닐알코올 (제조원: 시그마알드리치, 87~90% hydrolyzed MW: 30,000~70,000) 200 ml 수용액상에 넣어 주면서 균질기(IKA, ULTRA-TURRAX T8)를 이용하여 2,000 rpm으로 분산시켜 1분에 걸쳐 W/O/W 유탁액을 얻었다. 그 후 상기 유탁액을 냉장 (4 ℃), 상압 하에 3시간 자력교반기(450 rpm)로 강하게 저어주면서 미립구를 형성시켰다. 이 후, 체를 이용해 미립구를 채취하고 증류수로 3~5회 세척하였다. 세척한 미립구는 24시간 동안 -50℃에서 동결 건조하여 미립구 내 용매를 완전히 제거하였다.

비교예 2: 생분해성 고분자 PLGA와 클로니딘을 사용한 O/W 형 미립구 제조

생분해성 고분자 PLGA 750 mg(제조원: EVONIK, 제품명: RESOMER®RG753H) 및 클로니딘 30 mg을 디클로로메테인 1.5ml에 첨가하고 강하게 교반하여 15분동안 용해시켰다. 그 후, 실시예 1-1과 동일하게 진행하여 미립구를 제조하였다.

비교예 3: 생분해성 고분자 PLGA, 클로니딘 및 약제학적 허용 가능한 산을 사용한 미립구 제조

생분해성 고분자 PLGA 750 mg(제조원: EVONIK, 제품명: RESOMER®RG753H) 및 클로니딘 30 mg과 소수성 고형화제인 각각 약학적으로 허용 가능한 산 0.13 mol을 디클로로메테인 1.5 mL 에 첨가하고 강하게 교반하여 15분 동안 용해시켰다. 그 후, 실시예 1과 동일하게 진행하여 미립구를 제조하였다. 사용한 약학적 허용 가능한 산은 하기 표 2와 같았다.

	실시예 1-2	비교예 3-1	비교예 3-2	비교예 3-3	비교예 3-4	비교예 3-5	비교예 3-6
클로니딘	30 mg	30 mg	30 mg	30 mg	30 mg	30 mg	30 mg
소수성 고형화제 (0.13 mol)	하이드록시 나프토산 24.5 mg	벤조산 15.9 mg	캄포술폰산 30.3 mg	카프르산 22.5 mg	카프로산 15.1 mg	글리콜산 9.9 mg	만델산 13.6 mg
PLGA (RG753H)	750 mg	750 mg	750 mg	750 mg	750 mg	750 mg	750 mg

실험예 1: 미립구의 형태 측정

상기 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1-2에서 얻어진 미립구 형태를 전자현미경과 광학현미경을 사용하여 확인하였다. 전자현미경으로 미립구의 단면을 관찰하기 위한 시료는 미립구 10 mg를 액체질소로 처리한 뒤 절삭하였다. 제조된 미립구 약 10 mg을 코팅기(Quorum A 150 TES, 10 mA)를 이용하여 약 2분간 백금 코팅하였다. 이후, 주사형 전자현미경(Tescan Mira 3, LMU FEG-SEM)을 통해 미립구의 단면 및 표면을 각각 관찰하였다.

측정 결과를 도 1 및 2에 나타내었다. 측정 결과에 따르면 실시예 1-1, 실시예 1-2, 비교예 1 및 비교예 2에서 약 38~125 μm 크기의 미립구가 확인되었다.

도 1은 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1-2에서 제조한 클로니딘 함유 미립구의 전자현미경 사진이다. 비교예 1에서 제조된 미립구는 표면과 단면에서 미세 다공성 구조를 확인할 수 있다. 비교예 2에서 제조된 미립구는 매끄러운 표면과 밀도 있는 매트릭스를 단면에서 확인할 수 있었다. 실시예 1-2는 방향족산인 하이드록시 나프토산을 함유한 클로니딘 미립구로 표면이 매끄러운 형태를 보였다. 실시예 1-2에서는 표면과 미립구 내부에는 약간의 구멍이 관찰되었으나 주사제로 사용하기에 큰 문제는 없는 것으로 보였다. 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1-2에서 제조된 미립구 모두 동결 건조 후 입자가 깨어지거나 변형된 형태가 관찰되지 않았다.

실험예 2: 미립구의 클로니딘 함유율 및 봉입 효율 측정

상기 실시예 1, 비교예 2 및 비교예 3에서 제조된 미립구 약 10 mg을 각각 디클로로메테인 (Honeywell) 2 ml에 넣어 완전히 용해시킨 후, 이를 검액으로 사용하였다. HPLC 측정기를 이용해 측정된 흡광도값을 환산하여 미립구 내에 봉입되어 있는 클로니딘의 함량을 계산하였다. 봉입률은 약물의 투입량 대비 봉입량으로 계산하였다.

상기 비교예 1에서 제조된 미립구 약 10 mg을 각각 디클로로메테인 (Honeywell) 2 ml에 넣어 완전히 용해시킨 후, 이동상을 넣어 이를 검액으로 사용하였다. 그 후, 실시예 1, 비교예 2 및 비교예 3과 동일하게 진행하였다.

HPLC 분석 조건은 다음과 같았다. 이동상은 Acetonitrile:Buffer = 8:2 비율로 제조하였다. UV 검출기는 242 nm, 분리용 컬럼은 4.6 mm × 25 cm, packing L10이었으며, injection size는 10 μL, 유속은 0.8 mL/min, 분석 시간은 8 min, 분석 범위는 1000 μg/ml ~ 5.0576 μg/ml의 농도 범위에서 측정하였다.

아래의 표 3에 미립구의 클로니딘 함유율 및 봉입 효율 측정결과를 나타내었다.

	클로니딘 함유율(%) (약물봉입량/미립구중량) × 100(%)	이론적 클로니딘 함유율 (약물투입량/미립구중량) × 100(%)	클로니딘 봉입 효율(%) (약물봉입량/약물투입량)×100%
실시예 1-1	2.28 ± 0.05	3.79	60.16 ± 1.40
실시예 1-2	2.49 ± 0.06	3.73	66.66 ± 1.73
실시예 1-3	2.08 ± 0.13	3.67	56.61 ± 3.44
비교예 1	1.01 ± 0.10	2.91	34.63 ± 1.82
비교예 2	2.14 ± 0.10	3.85	55.71 ± 2.60

실시예 1-1, 1-2 및 1-3에서의 클로니딘의 봉입효율은 57-67% 정도로 나왔다. 실시예 1-3은 하이드록시 나프토산의 함량이 높기 때문에 미립구 형성이 잘되지 않았고 60% 이하의 봉입효율을 보였다. 또한 소수성 방출지연제인 하이드록시 나프토산이 함유되지 않은 비교예 2는 제조과정에서 약물이 외부수상으로 빠져나가 약물 손실율이 커졌고 봉입 효율이 상대적으로 낮았다. 비교예 1은 두 번의 용매 확산과정으로 인한 약물 누출로 봉입 효율이 가장 낮았다.

한편, 아래 표 4에는 비교예 3에서 제조된 미립구 내 클로니딘의 함유율과 봉입효율을 측정한 결과를 각각 나타내었다.

	클로니딘 함유율(%) (약물봉입량/미립구중량)×100(%)	이론적 클로니딘 함유율 (약물투입량/미립구중량) ×100(%)	클로니딘 봉입 효율(%) (약물봉입량/약물투입량)×100%
실시예1-2 하이드록시 나프토산	2.49 ± 0.06	3.73	66.66 ± 1.73
비교예 3-1 벤조익산	1.34 ± 0.02	3.77	36.03 ± 0.43
비교예 3-2캄포술폰산	1.37 ± 0.04	3.70	36.46 ± 1.11
비교예 3-3카프르산	2.22 ± 0.05	3.74	60.09 ± 1.44
비교예 3-4카프로산	1.49 ± 0.05	3.77	39.91 ± 1.44
비교예 3-5글리콜산	1.84 ± 0.02	3.80	48.30 ± 0.62
비교예 3-6만델산	2.54 ± 0.03	3.78	67.18 ± 0.70

대부분의 첨가된 산들은 미립구 제조과정에서 클로니딘과 염을 형성하게 되는데, 이는 제조과정에서 O/W형의 미립구가 고형화 될 때 클로니딘이 외부수상으로 빠져나가 약물이 소실하게 되는 원인이 되는 것으로 예상된다. 즉, 첨가된 산들이 클로니딘과 염을 형성하면 수상과 접촉할 때 이온화되면서 외부수상으로 빠르게 이동하는 것으로 추정된다. 이러한 이유로 미립구 내 클로니딘 함유율과 봉입율이 감소하는 것으로 생각된다. 비교예 3-3의 카프르산과 비교예 3-6인 만델산을 첨가한 미립구는 탄소수가 8개 이상인 구조로 클로니딘과 소수성 결합을 증가시켜 고형화 과정에서 외부수상으로 클로니딘의 누출을 효율적으로 방지하여 미립구내의 클로니딘 함유율과 봉입효율이 높았다.

마찬가지로 실시예 1-2에서 첨가된 하이드록시 나프토산은 클로니딘과 염을 형성한 후에 클로니딘과 하이드록시 나프토산의 소수성 결합이 증가시킨다. 이러한 이유로 미립구 제조과정에서 수상으로 클로니딘을 소실되는 것을 막아주는 역할을 하는 것으로 생각되어 높은 함유율을 나타내는 것으로 판단된다.

실험예 3: 미립구의 in vitro 약물 방출 거동 측정

클로니딘 약물의 방출 거동을 측정하기 위하여 실시예 1-1, 실시예 1-2, 비교예 2, 비교예 3-3 및 비교예 3-6에서 제조된 각 미립구를 150.0 mg 칭량하였다. 이후 각각 50 ml의 PBS(phosphate buffer saline, pH 7.4)에 넣고 37℃ 등온기에 보관하였다. 이후 날짜별로 1 ml씩 추출한 뒤, HPLC 측정기를 사용하여 방출된 약물의 양을 분석하였다. 측정된 흡광도 값을 환산하여 날짜별로 방출된 약물의 농도를 각각 구하였고, 이를 누적 백분율로 계산하여 나타내었다. 본 실험의 대조군으로 클로니딘 용액을 사용하였다. 도 3과 4에 측정결과를 나타내었다.

도 3는 본 발명에 따른 실시예 1-1, 실시예 1-2 및 비교예 2에서 제조된 미립구를 실험예 3에 따라 실험하여 얻어진 in vitro 약물 방출 거동 측정 결과를 보여주는 그래프이다. 비교예 2과 비교하여 하이드록시 나프토산을 함유한 실시예 1의 경우 초기방출 억제뿐 아니라 시간에 따른 약물 방출지연 효과가 높게 나타났다. 또한 하이드록시 나프토산의 함량이 증가할수록 방출지연효과가 향상 되었을 뿐 아니라 더 개선된 0차 방출의 양상을 보였다. 이는 하이드록시 나프토산이 첨가됨으로써 반데르발스 힘이 작용해 미립구 내부에서 클로니딘과 생분해성 고분자의 결합을 더 강하게 하여 외부 수상으로 약물이 빠르게 누출되는 것을 막아줘 약물의 방출을 지연시킨다고 생각된다.

도 4는 본 발명에 따른 실시예 1-2, 비교예 3-3 및 비교예 3-6에서 제조된 미립구를 실험예 3에 따라 실험하여 얻어진 in vitro 약물 방출 거동 측정 결과를 보여주는 그래프이다. 소수성 고형화제인 하이드록시 나프토산을 함유한 실시예 1-2의 경우 비교예 3-3과 비교예 3-6에 비해 초기방출이 눈에 띄게 지연되었을 뿐 아니라 약물 방출지연 효과가 높게 나타났다. 또한 실시예 1-2에서 더 나은 0차 방출의 양상을 보였다. 이는 소수성 고형화제로 하이드록시 나프토산이 첨가된 경우 카프르산과 만델산이 비해 반데르발스 힘이 더 강하게 작용하기 때문인 것으로 생각되나, 본 발명은 이러한 기전에 한정되는 것은 아니다. 그 결과 미립구 내부에서 클로니딘과 생분해성 고분자의 결합이 보다 더 강해지고 약물의 방출을 지연시킨다고 판단된다.

Claims

클로니딘을 함유하는 생분해성 고분자 미립구 함유 서방형 주사제로서, 상기 미립구는 하이드록시 나프토산을 포함하여 상기 미립구로부터 클로니딘이 서서히 방출되도록 하는 것을 특징으로 하는 서방형 주사제.
삭제
제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리락타이드(PLA), 폴리글리코라이드(PGA), 폴리(락타이드-코-글리코라이드)(PLGA) 및 폴리(락타이드-코-글리코라이드)글루코즈로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 서방형 주사제.
생분해성 고분자; 클로니딘; 및 하이드록시 나프토산을 포함하는 용액을 제조하는 단계, 및
상기 용액을 수용액에 첨가하면서 교반하여 O/W 유제를 형성하면서 미립구를 형성하는 단계를 포함하는,
클로니딘을 포함하는 생분해성 고분자 미립구 함유 서방형 주사제의 제조 방법.
삭제
제4항에 있어서, 상기 제조 방법은 미립구 내 클로니딘의 봉입 효율 (유효성분 봉입량/첨가한 유효성분 중량 × 100(%))이 55 내지 70 중량%인 것을 특징으로 하는 제조 방법.